CN102643901A - 一种检测甲型副伤寒沙门菌的rt-lamp试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种检测甲型副伤寒沙门菌(S.Paratyphi A)的RT-LAMP试剂盒，所述试剂盒包含有六条RT-LAMP引物，与RT-LAMP反应液一起构成检测体系，本发明的六条RT-LAMP引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1-6所示。本发明的试剂盒可快速、灵敏地检测目前流行的甲型副伤寒沙门菌，在对纯菌总RNA检测中，本发明试剂盒的最低检测限为50pg/反应。其操作简单，反应结果易于观察，特异性好，非常适用于出口检疫、食品卫生以及临床标本的检测，易于大范围推广应用。

Description

一种检测甲型副伤寒沙门菌的RT-LAMP试剂盒

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体的说涉及一种检测甲型副伤寒沙门菌的逆转录-环介导等温扩增技术(RT-LAMP)试剂盒。

背景技术

甲型副伤寒沙门菌(S.Paratyphi A)是引起甲型副伤寒的病原菌，甲型副伤寒与伤寒在临床症状上非常相似，难以区分，均以急起高热为主要症状，是一种急性全身系统性传染病。该病传染性强，病程长，可反复发作，患者需住院隔离治疗，是我国《传染病防治法》中规定报告的乙类传染病之一，也是全球特别是发展中国家共同面临的公共卫生问题。

目前，甲型副伤寒沙门菌的传统检测方法为血分离培养及血清学诊断。血分离培养需时较长，约3-5天，且检出率易受病程，采血量及患者是否服用抗生素等因素的影响，难以达到快速的要求；血清学诊断存在特异性、准确性差的问题，临床上，单凭症状难以区分伤寒和副伤寒。因此有必要开发灵敏的早期检测方法。目前，随着抗生素的广泛应用和病原体本身耐药、变异等诸多因素的影响，近年甲型副伤寒的复发率增高，临床表现很不典型，给早期临床诊断和治疗带来很大的困难。

随着分子生物学的发展，目前已有多种PCR方法用于甲型副伤寒沙门菌的检测，虽在灵敏度方面有所改进，但由于需要精密仪器的配套使用，同样也无法满足基层和现场检测的需求。

环介导等温核酸扩增技术(loop-mediated isothermamplification，LAMP)是由Notomi于2000年开发的一种新型的恒温核酸扩增方法，其原理是利用一种链置换DNA聚合酶(BstDNApolymerase)和两对特殊的引物，特异地识别靶序列上的6个独立区域，在等温条件下(65℃左右)保温几十分钟，即可完成核酸扩增反应。

近年来，国外已将该技术广泛应用于病原体检测。Hong TC等人(2004)根据LAMP的原理设计了实时定量RT-LAMP方法，以快速检测SARS-CoV，结果RT-LAMP的灵敏度是RT-PCR的100倍；MasakiImai等人(2007)建立了快速诊断H5N1禽流感病毒的RT-LAMP检测体系。

LAMP还可以检测细菌、真菌等病原微生物，其灵敏度和特异性都有很好的体验。但目前尚未见该方法在甲型副伤寒沙门菌检测中的应用。

发明内容

本发明的目的是提供用于检测甲型副伤寒沙门菌(S.Paratyphi A)的特异性RT-LAMP引物组。

本发明另一目的在于提供一种具有高灵敏度、高特异性、操作简单的LAMP检测试剂盒。

为实现上述目的，通过对分离到的48株甲型副伤寒沙门菌hsdM基因和NCBI已报道的hsdM基因序列比对，通过BLAST软件进行序列同源性分析，找到特异性的保守靶序列，其核苷酸序列如SEQ IDNO.7所示。此外，本领域技术人员应当理解，该序列的特异性片段也可以作为检测甲型副伤寒沙门菌的靶序列。

进一步，本发明还提供用于特异性扩增上述靶序列的引物组合。

本发明提供用于检测甲型副伤寒沙门菌的特异性RT-LAMP引物组合，包括以下6条引物：

F3：5’-CCTGTTAGAAGTGTTTACAACTT-3’；

B3：5’-GCTAAACCACCAAATTGTGT-3’；

FIP：5’-CCAATAGAAATCCTCGGCCAG-

     CCGAGTTTTGATAAGGATGATTG-3’；

RIP：5’-A ACCCTTCAAAACTACCAAGTCC-

    GAATCTTTAACACGCAACTTTC-3’；

LF：5’-TGAGGTTGGATTCCAT-3’

LB：5’-ATTGAGTGGGTTAACAAA-3’

本发明提供了上述引物组在制备甲型副伤寒沙门菌的检测试剂盒或检测试剂中的应用。

本发明提供了一种含有上述6条引物的检测试剂。

本发明提供了一种含有上述6条引物的甲型副伤寒沙门菌的RT-LAMP检测试剂盒。

本发明的试剂盒还包含RT-LAMP反应液，与RT-LAMP引物共同构成LAMP检测体系；25μL RT-LAMP检测体系的具体配置为10μM的F3、B3各0.25μL；10μM的FIP、BIP各2μL；10μM的LF、LB各1μL；2×反应混合buffer 12.5μL，其含40mM Tris-HCl，pH 8.8，20mM KCl，16mM MgSO₄，20mM(NH₄)₂SO₄，0.2％Tween20，1.6M甜菜碱和2.8mM dNTPs，1μl的Bst DNA聚合酶和AMV逆转录酶混合物，5μL的模板RNA。

所述试剂盒的检测反应条件为：65℃恒温1h，然后终止反应。

本发明还提供了一种检测甲型副伤寒沙门菌(S.Paratyphi A)的方法，用上述6条引物进行RT-LAMP反应，将比浊度≥0.1的扩增结果判定为RT-LAMP反应阳性

其中，RT-LAMP反应条件为：65℃恒温1h。

结果判定方法为：对于比浊度≥0.1的扩增结果判定为RT-LAMP反应阳性。

本发明的甲型副伤寒沙门菌的RT-LAMP检测试剂盒利用35个血清型的纯培养甲型副伤寒和非伤寒沙门菌菌株、常见非沙门致腹泻病原菌以及发热为主要症状常见病原菌RNA评价该方法的特异性及敏感性，同时对甲型副伤寒沙门菌全血模拟标本及粪便模拟标本进行检测下限确定。结果显示，利用该方法检测48株甲型副伤寒沙门菌均阳性，其余34种非伤寒沙门菌血清型、致腹泻的其他5种肠道致病菌以及发热为主要症状的8种常见非沙门菌均扩增阴性，说明该方法的特异性良好，达100％。在对纯菌总RNA检测中，RT-LAMP的最低检测限为50pg/反应，约为19000个拷贝/反应。在以全血模拟样品提取核酸为模板的检测中，最低检测限达80cfu/mL。对粪便模拟标本的检测中，对增菌前样品即原始样品检测下限为500cfu/g；增菌后样品检测下限为0.8cfu/g，说明本发明的检测试剂盒具有很高的灵敏度。

本发明RT-LAMP检测试剂盒检测甲型副伤寒沙门菌整个试验只需要1h左右即可，相对于常规PCR反应要4～5h才能完成检测，大大缩短了检测时间；在特异性和重复性检验中，该方法有很高的可靠性，并且操作简单。

利用发明的甲型副伤寒沙门菌RT-LAMP快速检测试剂盒对甲型副伤寒沙门菌进行了检测，检测阳性率达到100％，在设计引物时候特别选取了甲型副伤寒沙门菌hsdM基因的保守区，所以该试剂盒可快速、灵敏地检测出甲型副伤寒沙门菌，其操作简单，反应结果易于观察，特异性好，非常适用于出口检疫、食品卫生以及临床标本的检测，易于大范围推广应用。

附图说明

图1为：不同引物浓度下RT-LAMP扩增曲线图；其中a：F3和B3各5pmol，FIP和BIP各40pmol；b：F3和B3各5pmol，FIP和BIP各20pmol；c：F3和B3各10pmol，FIP和BIP各40pmol；d：F3和B3各10pmol，FIP和BIP各20pmol；e：F3和B3各5pmol，FIP和BIP各10pmol；NC：阴性对照。

图2为：RT-LAMP检测纯菌RNA扩增曲线图；模板浓度分别为a：5000pg/反应；b：500pg/反应；c：50pg/反应；d：5pg/反应；e：0.5pg反应；NC：阴性对照。

图3为：RT-LAMP检测模拟血标本扩增曲线图；模板浓度分别为a：1.6×10⁴cfu/ml；b：1.6×10³cfu/ml；c：1.6×10²cfu/ml；d：8×10¹cfu/ml；e：4×10¹cfu/ml；f：2×10¹cfu/ml；NC：阴性对照。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

本发明所用的菌种：沙门菌属菌株、霍乱弧菌、金黄色葡萄球菌、副溶血弧菌均为本实验室保存，其中甲型副伤寒沙门菌48株，伤寒沙门菌、乙型和丙型副伤寒沙门菌以及其他31种非伤寒沙门菌血清型共57株(表1)，所有血清型均使用丹麦SSI(Statens Serum Institut)沙门菌抗血清(购自北京兰伯瑞生物技术有限公司)进行血清型鉴定。另外，其他肠道常见病原菌及引起发热并可在血液标本中分离到的肺炎链球菌、伯氏疏螺旋体、钩端螺旋体、嗜肺军团菌、脑膜炎奈瑟菌、立克次体、布鲁氏菌等菌株作为检测甲型副伤寒沙门菌的特异性及敏感性评价对比菌株，来自中国疾病预防控制中心传染病预防控制所。

实施例1 引物的设计

1、特异性DNA序列查找

从GenBank检索获得多株甲型副伤寒沙门菌基因组序列，通过BLAST软件进行序列同源性分析找到hsdM因的特异性的保守靶序列进行RT-LAMP引物设计，该特异性保守靶序列如SEQ ID No.7所示的核苷酸序列。

2、引物的设计

针对靶序列设计六条引物，包括两条内引物(FIP和BIP)和两条外引物(F3和B3)和两条环引物(LF和LB)，其核苷酸序列如下：

F3：5’-CCTGTTAGAAGTGTTTACAACTT-3’；

B3：5’-GCTAAACCACCAAATTGTGT-3’；

FIP：5’-CCAATAGAAATCCTCGGCCAG-

     CCGAGTTTTGATAAGGATGATTG-3’；

BIP：5’-AACCCTTCAAAACTACCAAGTCC-

     GAATCTTTAACACGCAACTTTC-3’；

LF：5’-TGAGGTTGGATTCCAT-3’

LB：5’-ATTGAGTGGGTTAACAAA-3’

实施例2 甲型副伤寒沙门菌RT-LAMP检测方法的建立

1、血模拟标本的制备及RNA提取

取新鲜培养4-6小时细菌(最终菌落计数为8.0×10⁸cfu/ml)，10倍梯度系列稀释为10⁶～10¹cfu/ml，取各稀释度菌液3.3毫升分别与同体积新鲜人抗凝血混匀，室温放置30分钟后，作为全血模拟标本。利用QIAamp UCP PurePathogen Blood fieldtest Kit(QIAGEN公司)对上述模拟标本进行甲型副伤寒沙门菌RNA的提取，具体操作步骤严格按照说明书进行。同时以不加菌的血液作为阴性对照平行进行RNA提取。最终提取的RNA溶解到50μl不含RNase的无菌纯水中，取其中5μl作模板，进行RT-LAMP。同时，取系列稀释菌液进行菌落计数，测定模拟标本中准确细菌含量。

2、粪便模拟标本制备及RNA提取

2.1取新鲜培养4-6小时细菌(最终菌落计数为8.0×10⁸cfu/ml)，梯度系列稀释为10⁴～10¹，5，1，0.5，0.25，0.125cfu/ml。然后取以上菌液各500ul与3g健康人粪便混匀。

2.2取2.1项中的混合样品0.2g，加入200ul TE(10mmol/LTris-HCl(pH 8.0)，1mmol/L EDTA，pH 8.0)，蜗旋震荡，1000rpm离心1分钟，去掉沉淀，上清8000rpm离心5分钟，弃上清，沉淀用1ml TE重悬，震荡，8000rpm 5分钟，弃上清，保留沉淀，用100ulTE悬菌，水煮10分钟，8000rpm 5分钟，保留上清，去沉淀。此上清为增菌前样品粗提核酸。

2.3在2.1项中的样品中各加入SC增菌液(亚硒酸盐增菌液)5ml，混匀，37℃培养过夜。第2天取增菌后样品1ml，如步骤2.2中，制备增菌后样品核酸粗提品。

3、纯培养细菌RNA提取

纯菌RNA提取使用RNeasy Minikit(QIAGEN公司)，操作步骤均严格按照说明书进行。

4、RT-LAMP反应

分别在不同的温度(61℃至65℃)反应1h，终止反应，最终通过扩增阳性结果出现的时间，获得最佳反应参数。由于在65℃反应1h的条件下扩增最快，优选在此条件下进行反应。

在65℃反应1h对不同浓度的内外引物的反应体系进行优化反应，通过扩增阳性结果出现的时间作为反应的最终浓度，结果两条外引物F3、B3浓度各为5pmol，两条内引物FIP、BIP浓度各为40pmol的条件下，扩增最快。可参见图1。

因此，得到优化的检测体系(25μL)如下：

10μM的F3、B3各0.25μL；10μM的FIP、BIP各2μL；10μM的LF、LB各1μL；2×反应混合buffer 12.5μL，其含40mM Tris-HCl，pH8.8，20mM KCl，16mM MgSO₄，20mM(NH₄)₂SO₄，0.2％Tween20，1.6M甜菜碱和2.8mM dNTPs，1μl的Bst DNA聚合酶和AMV逆转录酶混合物，5μL的模板RNA 1μL酶，5μL模板。

检测反应条件：65℃恒温1h，终止反应。

使用

RNA Amplification Kit(日本荣研公司)试剂进行RT-LAMP反应体系的设立，总反应体系为25μl，其中2×reactionmix buffer 12.5μl(含40mM Tris-HCl[pH 8.8]，20mM KCl，16mMMgSO₄，20mM(NH4)₂SO₄，0.2％Tween20，1.6M甜菜碱和2.8mMdNTPs)，两条外引物F3、B3各5pmol，两条内引物FIP、BIP各40pmol，两条环引物各20pmol，1μl的Bst DNA聚合酶和AMV逆转录酶混合物，5μl的模板RNA。

在日本荣研公司的Realtime Turbidimeter LA-320C仪器上进行等温扩增反应并记录结果，本研究甲型副伤寒沙门菌RT-LAMP反应条件为65℃，60分钟，对于比浊度≥0.1的扩增结果判定为RT-LAMP反应阳性。

实施例3 RT-LAMP检测试剂盒特性评价

1、RT-LAMP扩增特异性和敏感性

利用本发明的试剂盒共进行了48种136株细菌的RT-LAMP检测(见表1)，其中48株甲型副伤寒沙门菌均阳性。沙门菌属其他34种血清型均扩增阴性。对其他常见腹泻病原(霍乱弧菌、副溶血弧菌、志贺菌、致泻性大肠埃希菌)亦扩增阴性。而且，临床其他常见发热病原菌包括金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、伯氏疏螺旋体、钩端螺旋体、嗜肺军团菌、脑膜炎奈瑟氏菌、立克次体、布鲁氏菌均扩增阴性，说明本研究筛选到的RT-LAMP引物以及由这些引物组装的检测试剂盒具有较高的菌种和血清型特异性及敏感性，均达100％。

表1  甲型副伤寒沙门菌RT-LAMP特异性及敏感性检

注：括号内数字为测试菌株数量。

2、甲型副伤寒沙门菌RT-LAMP反应检测下限

2.1纯菌样本检测下限

提取甲型副伤寒沙门菌标准株ATCC9150培养物的总RNA作为阳性模板，对模板进行10倍系列稀释，检测反应的灵敏性，结果(图2)显示，该RT-LAMP反应最低可检测50pg/反应，约为19000拷贝/反应。本实验进行了3次独立重复实验，结果一致。

2.2血模拟标本检测下限

自血模拟标本中提取的RNA作为模板进行RT-LAMP检测，结果(图3)显示RT-LAMP对血液样本的最低检测限度相当于80cfu/ml。本实验进行了3次重复实验，结果一致。

2.3粪便模拟标本检测下限

自粪便模拟标本中粗取的核酸作为模板进行RT-LAMP检测，结果(表2)显示RT-LAMP对增菌前样本的最低检测限度为500cfu/g，对增菌后样品的最低检测限为0.8cfu/g。本实验进行了3次独立重复实验，结果一致。

表2  RT-LAMP检测粪便模拟标本结果

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (9)

1.一种用于检测甲型副伤寒沙门菌(S.Paratyphi A)的靶序列，其具有SEQ ID NO.7所示的序列或其特异性片段。

2.用于扩增权利要求2所述靶序列的特异性引物组合。

3.如权利要求2所述的引物组合，其为特异性RT-LAMP引物组，包括以下6条引物：

F3：5’-CCTGTTAGAAGTGTTTACAACTT-3’；

B3：5’-GCTAAACCACCAAATTGTGT-3’；

FIP：5’-CCAATAGAAATCCTCGGCCAG-

CCGAGTTTTGATAAGGATGATTG-3’；

BIP：5’-AACCCTTCAAAACTACCAAGTCC-

GAATCTTTAACACGCAACTTTC-3’；

LF：5’-TGAGGTTGGATTCCAT-3’；

LB：5’-ATTGAGTGGGTTAACAAA-3’。

4.权利要求3所述的引物组合在制备甲型副伤寒沙门菌的检测试剂盒或检测试剂中的应用。

5.一种含有权利要求3所述引物组合的检测试剂。

6.一种含有权利要求3所述引物组合的甲型副伤寒沙门菌的RT-LAMP检测试剂盒。

7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，还包含RT-LAMP反应液，与RT-LAMP引物共同构成LAMP检测体系；25μL RT-LAMP检测体系的具体配置为：10μM的F3、B3各0.25μL；10μM的FIP、BIP各2μL；10μM的LF、LB各1μL；2×反应混合buffer12.5μL，其含40mM Tris-HCl，pH 8.8，20mM KCl，16mM MgSO₄，20mM(NH₄)₂SO₄，0.2％Tween20，1.6M甜菜碱和2.8mM dNTPs，1μl的BstDNA聚合酶和AMV逆转录酶混合物，5μL的模板RNA。

8.一种检测甲型副伤寒沙门菌(S.Paratyphi A)的方法，其特征在于，用权利要求3所述的引物组进行RT-LAMP反应，将比浊度≥0.1的扩增结果判定为RT-LAMP反应阳性。

9.如权利要求8所述的检测方法，其特征在于，RT-LAMP反应条件为：65℃恒温1h。

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