CN116479150A - 单管一步法RPA-Cas12a/Cas13a快速检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及单管一步法RPA‑Cas12a/Cas13a快速检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌，包括：RPA扩增引物对、CRISPR探针、crRNA、Cas12a/Cas13a蛋白等；所述crRNA为mecA‑crRNA和clfA‑crRNA。用Cas12a系统识别常规引物对扩增mecA基因的保守片段，用T7聚合酶介导的Cas13a系统识别包含T7启动子序列的引物对扩增clfA基因的保守片段。本发明优点如下：第一：快速、恒温反应，更适合即时检测；二：整个反应无需开盖，减少了气溶胶污染；三：RPA的扩增与CRISPR的高特异性检测相结合，检测系统更准确灵敏；四：检测双基因，既可以检测金黄色葡萄球菌，又可以鉴定菌株是否耐药。
Description
技术领域
本发明属于分子生物领域，特别涉及单管一步法RPA-Cas12a/Cas13a快速检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
CRISPR-Cas系统广泛存在于细菌和古细菌中，构成了针对外来入侵核酸的获得性免疫系统，其防御过程包括三个阶段：间隔序列获取，合成crRNA和靶标干扰。通常，CRISPR-Cas系统由CRISPR RNA(crRNA)和Cas蛋白组成，crRNA与靶序列互补，可引导Cas蛋白进行序列特异性识别和切割。
CRISPR/Cas12a和Cas13a系统都表现出非特异性的反式切割机制，这种机制通过不同序列的探针用于核酸检测。例如，在Cas12a系统中可以用短单链DNA(ssDNA)反式切割底物用于荧光检测，在Cas13a系统中，这种通用反式切割底物可以是单链聚(U)RNA探针。
当Cas12a/Cas13a识别靶标DNA/RNA后，Cas12a(Cas13a)/crRNA/DNA(RNA)形成三元复合物被激活切割体系内的ssDNA(RNA)。三元复合物在33℃下非常稳定。该技术具有操作简单、高灵敏性、高特异性和无需大型仪器设备等优点，在病原检测方面有很大的发展潜力。
众所周知，Cas12a和Cas13a顺式识别触发的反式切割活动是非特异性的，这就意味着在单管检测中其多重检测能力有限，为解决这个问题，周小明等人建立了RPA-Cas12a/Cas13a系统，将Cas12a和T7聚合酶介导的Cas13a检测结合起来检测RNA病毒双基因，但是需要反转录过程。
另一方面，金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,SA)是多种严重人类感染的主要原因，包括皮肤和烧伤感染、手术部位感染、呼吸道感染、食物中毒和菌血症。随着抗生素的出现，金黄色葡萄球菌感染得到了很好的治疗。然而，由于抗生素的大规模和高频使用以及各种人类活动的影响，如农业施肥和集约化动物饲养场，金黄色葡萄球菌耐药性的问题逐渐显现。葡萄球菌染色体盒mec(Staphylococcal cassette chromosomal mec，SCCmec)等可移动遗传元件的转移是金葡菌获得耐药性的重要途径之一。SCCmec包含mecA基因复合体(导致甲氧西林耐药性)和一组负责其移动性的位点特异性重组酶基因，mecA基因编码一种替代的青霉素结合蛋白(PBP2a或PBP2’)，PBP2a与大多数半合成青霉素亲和力较低，因此防止了β-内酰胺类抗生素破坏细菌细胞壁，从而显示出耐药性。近年来金葡菌获得耐药基因的能力进一步增强，不断出现新的克隆，使金葡菌成为超级细菌，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)中也逐渐出现了对常用抗菌药物几乎全部耐受的菌株。同时，MRSA存活能力很强，传播速度快，感染后治疗困难，且耐甲氧西林菌株引起的金葡菌感染比甲氧西林敏感菌株引起的感染的死亡率更高。MRSA感染导致住院时间延长也会增加医院内交叉感染的机会。为了更有效地应对MRSA感染，研发一种快速准确的检测方法对感染MRSA的感染情况进行精准检测是非常重要的。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供一种单管一步法RPA-Cas12a/Cas13a快速检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的系统和方法。本发明选择粘附素聚集因子(clfA)作为金黄色葡萄球菌特异性检测的基因，选择mecA基因作为鉴定金黄色葡萄球菌是否对甲氧西林耐药的特异性基因。用Cas12a系统识别常规引物对扩增mecA基因的保守片段，用T7聚合酶介导的Cas13a系统识别包含T7启动子序列的引物对扩增clfA基因的保守片段，整个反应过程在33℃下完成。整个检测过程分为两部分：第一部分RPA扩增，第二部分Cas12a/Cas13a检测，这两个部分在一个管子里进行。
以下为本发明的技术方案：
本发明的第一个方面，提供了一种单管一步法RPA-Cas12a/Cas13a快速检测MRSA的系统，所述系统包括：RPA扩增引物对、CRISPR探针、crRNA、Cas12a/Cas13a蛋白、Buffer、T7聚合酶、NTP、RNase-free水、RNase抑制剂；
所述crRNA为mecA-crRNA和clfA-crRNA；
所述CRISPR探针包括：FAM-TTTTTT-BHQ1探针、ROX-UUUUU-BHQ2探针。
本发明研究认为RPA-Cas12a/Cas13a系统更适合检测细菌，因为目标片段为DNA，不需要再进行反转录。同时本发明把RPA反应和CRISPR反应在一管中一步反应完成，无需开盖，减少了气溶胶污染。
本发明的第二个方面，提供了一种单管一步法RPA-Cas12a/Cas13a快速检测MRSA的方法，包括：
以待测菌的基因组DNA为模板，配制RPA反应混合液，所述RPA混合液包括：RPA扩增引物对、DNA模板、Buffer及其干粉重悬液，并将混合液加入到管的底部进行RPA扩增，以得到RPA扩增产物；
配制CRISPR-Cas12a/Cas13a混合液，所述CRISPR-Cas12a/Cas13a混合液包括：探针、crRNA、T7聚合酶、NTP、RNase-free水、RNase抑制剂、Cas12a/Cas13a蛋白和Buffer，并将混合液加入管的盖子中。用Cas12a系统识别常规引物对扩增的mecA基因保守片段，用T7聚合酶介导的Cas13a系统识别T7启动子标记的引物对扩增的clfA基因保守片段；
RPA反应15分钟后通过离心将CRISPR Cas12a/Cas13a混合液与RPA扩增产物充分混合，最后对荧光强度进行检测，15分钟内收集荧光信号，即得。
本发明的第三个方面，提供了一种检测MRSA的试剂盒，包括：上述的系统。
本发明的第四个方面，提供了上述的系统在检测金黄色葡萄球菌和/或鉴定是否为MRSA中的应用。
本发明的有益效果
(1)单管一步法RPA-Cas12a/Cas13a检测MRSA具有以下4个优点：
第一：快速、恒温反应，整个反应过程在30min之内，33℃下完成，更适合即时检测；
第二：整个反应一步完成，无需开盖，减少了气溶胶污染；
第三：RPA的扩增与CRISPR的高特异性检测相结合，使检测系统更准确灵敏；
第四：检测双基因，既可以检测金黄色葡萄球菌，又可以鉴定菌株是否耐药。
(2)本发明操作步骤简单，更适于结合手持荧光检测仪器在现场便捷检测。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示例性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为本发明RPA-Cas12a/Cas13系统检测原理图；
图2为本发明mecA-crRNA和clfA-crRNA筛选结果图；
图3为本发明探针特异性图；
图4中A为RPA-Cas12a/Cas13a对MRSA标准模板检测限的测定；B为RPA-Cas12a/Cas13a对MRSA标准模板特异性的测定：
图5为本发明RPA-Cas12a/Cas13a检测临床样本荧光热图。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本发明使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
一种单管一步法RPA-Cas12a/cas13a快速检测MRSA的系统，所述系统包括：RPA扩增引物对、CRISPR探针、crRNA、Cas12a/Cas13a蛋白、Buffer、T7聚合酶、NTP、RNase-free水、RNase抑制剂；
所述crRNA为mecA-crRNA和clfA-crRNA；
所述探针包括：FAM-TTTTTT-BHQ1探针、ROX-UUUUU-BHQ2探针。
在一些实施例中，所述mecA-crRNA的序列如SEQ ID NO:1所示。
在一些实施例中，所述clfA-crRNA的序列如SEQ ID NO:2所示。
一种单管一步法RPA-Cas12a/cas13a快速检测MRSA的方法，包括：
以待测菌的基因组DNA为模板，配制RPA反应混合液，所述RPA混合液包括：RPA扩增引物对、DNA模板、Buffer及其干粉重悬液，并将混合液加入到管的底部进行RPA扩增，以得到RPA扩增产物；
配制CRISPR-Cas12a/Cas13a混合液，所述CRISPR-Cas12a/Cas13a混合液包括：探针、crRNA、T7聚合酶、NTP、RNase-free水、RNase抑制剂、Cas12a/Cas13a蛋白和Buffer，并将混合液加入管的盖子中。用Cas12a系统识别常规引物对扩增的mecA基因保守片段，用T7聚合酶介导的Cas13a系统识别T7启动子标记的引物对扩增的clfA基因保守片段；
RPA反应15分钟后通过离心将CRISPR Cas12a/Cas13a混合液与RPA扩增产物充分混合，最后对荧光强度进行检测，15分钟内收集荧光信号，即得。
在一些实施例中，所述RPA体系的用量为20～25μl。
在一些实施例中，CRISPR-Cas12a/Cas13a混合液的用量为20～25μl。
在一些实施例中，将RPA反应体系33℃反应15分钟后通过离心与CRISPR-Cas12a/Cas13a混合液混合。
在一些实施例中，用Roche在33℃下每分钟同时收集动态FAM和ROX荧光信号。
下面结合具体的实施例，对本发明做进一步的详细说明，应该指出，所述具体实施例是对本发明的解释而不是限定。
以下实施例中，各试剂皆为市售产品。
实施例1
用Cas12a系统识别常规引物对扩增mecA基因的保守片段，用T7聚合酶介导的Cas13a系统识别T7启动子标记的引物对扩增clfA基因的保守片段，整个反应过程在33℃下完成，整个检测过程分为两部分:第一部分RPA扩增，第二部分Cas12a/Cas13a检测。这两个部分在一个管子里进行。具体包括：
将20μl RPA体系加到离心管的底部，20μl的CRISPR-Cas12a/Cas13a混合液加到离心管盖上密封。将试管置于33℃的热循环器或水浴中培养15分钟，然后短暂离心将盖内的CRISPR-Cas12a/13a混合物与RPA反应产物结合，用Roche在33℃下每分钟同时收集动态FAM和ROX荧光信号。既可以检测金黄色葡萄球菌又可以鉴定是否为MRSA(图1)。其中，RPA体系和CRISPR-Cas12a/Cas13a混合液的组成如表1所示：
表1RPA体系和CRISPR-Cas12a/Cas13a混合液组成
1.crRNA的选择和优化
本发明需要通过仔细选择crRNA来优化Cas12a/Cas13a的激活，为本发明的检测开发灵敏且高效的实时检测系统优化好基础条件。针对MRSA的mecA、clfA片段分别设计三条crRNA并进行筛选(图2)，CRISPR荧光实验筛选后得到表现较好的crRNA(mecA-crRNA,clfA-crRNA)(表2)。
表2基因相关信息
2探针特异性验证及体系优化
本发明使用FAM-TTTTTT-BHQ1探针用于Cas12a检测，ROX-UUUUU-BHQ2探针用于Cas13a检测，两种Cas对各自的探针切割具有显著的特异性(图3)。为了降低实验成本，本发明尝试减少RPA反应系统的体积，通过设计体积梯度进行测试，发现在不同的RPA反应体积中，阳性样品和阴性样品的荧光强度有显著差异。当反应体系缩小到20μL时，仍能稳定地产生荧光强度。因此，随后的实验使用了20μL的RPA反应系统。
3.RPA-Cas12a/Cas13a单管一步法检测体系的敏感性、特异性评价
在对pET-32a-MRSA标准质粒进行梯度稀释后，以5×106～5×100copies/μL的浓度为模板，RPA-Cas12a/RPA-Cas13a方法可以同时检测低至5copies/μL的mecA和clfA基因，八次独立重复实验显示出良好的重复性(图4中A)。为了确认其分析特异性，本发明使用其他致病菌(沙门氏菌Salmonella,SM、铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa,PA、木糖葡萄球菌Staphylococcus xylosus,SX、沃式葡萄球菌Staphylococcus warneri,SW)进行了RPA-Cas12a/RPA-Cas13a的正交检测，没有出现交叉反应(图4中B)。
4实际样本检测
为了评价RPA-Cas12a/Cas13a检测系统在临床标本中的检测效果，对30株临床分离的疑似MRSA样本进行了qPCR和RPA-Cas12a/Cas13a检测系统的检测。用qPCR方法对这30份样本进行mecA和clfA检测，结果表明，21株样本中均含有mecA和clfA基因。证明21株为MRSA阳性，另3份临床样本为阴性。同时，用RPA-Cas12a/Cas13a检测系统对这30份样本进行检测，其中21株样本被检测到mecA和clfA基因，证明21株都是MRSA,另3株为阴性样本(图5和表3)。结果表明，基于RPA-Cas12a的MRSA检测与qPCR检测结果一致。表明该方法与RPA和qPCR完全可比。
表3 RPA-Cas12a/Cas13a和qPCR检测临床样本检测结果
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种单管一步法RPA-Cas12a/Cas13a快速检测MRSA的系统，其特征在于，所述系统包括：RPA扩增引物对、CRISPR探针、crRNA、Cas12a/Cas13a蛋白、Buffer、T7聚合酶、NTP；
所述crRNA为mecA-crRNA和clfA-crRNA；
所述探针包括：FAM-TTTTTT-BHQ1探针、ROX-UUUUU-BHQ2探针。
2.如权利要求1所述的单管一步法RPA-Cas12a/Cas13a快速检测MRSA的系统，其特征在于，所述mecA-crRNA的序列如SEQ ID NO:1所示。
3.如权利要求1所述的单管一步法RPA-Cas12a/cas13a快速检测MRSA的系统，其特征在于，所述clfA-crRNA的序列如SEQ ID NO:2所示。
4.一种单管一步法RPA-Cas12a/cas13a快速检测MRSA的方法，其特征在于，包括：
以待测菌的基因组DNA为模板，配制RPA反应混合液，所述RPA混合液包括：RPA扩增引物对、DNA模板、Buffer及其干粉重悬液，并将混合液加入到管的底部进行RPA扩增，以得到RPA扩增产物；
配制CRISPR-Cas12a/Cas13a混合液，所述CRISPR-Cas12a/Cas13a混合液包括：探针、crRNA、T7聚合酶、NTP、RNase-free水、RNase抑制剂、Cas12a/Cas13a蛋白和Buffer，并将混合液加入管的盖子中；用Cas12a系统识别常规引物对扩增的mecA基因保守片段，用T7聚合酶介导的Cas13a系统识别T7启动子标记的引物对扩增的clfA基因保守片段；
RPA反应15分钟后通过离心将CRISPR Cas12a/Cas13a混合液与RPA扩增产物充分混合，最后对荧光强度进行检测，15分钟内收集荧光信号，即得。
5.如权利要求4所述的单管一步法RPA-Cas12a/Cas13a快速检测MRSA的方法，其特征在于，所述RPA体系的用量为20～25μl。
6.如权利要求4所述的单管一步法RPA-Cas12a/Cas13a快速检测MRSA的方法，其特征在于，CRISPR-Cas12a/Cas13a混合液的用量为20～25μl。
7.如权利要求4所述的单管一步法RPA-Cas12a/Cas13a快速检测MRSA的方法，其特征在于，将RPA体系与CRISPR-Cas12a/Cas13a混合液混合后于33℃培养15min，再进行离心。
8.如权利要求4所述的单管一步法RPA-Cas12a/Cas13a快速检测MRSA的方法，其特征在于，用Roche36在33℃下每分钟同时收集动态FAM和ROX荧光信号。
9.一种检测MRSA的试剂盒，其特征在于，包括：权利要求1-3任一项所述的系统。
10.权利要求1-3任一项所述的系统在检测金黄色葡萄球菌和/或鉴定是否为MRSA中的应用。
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| CN202310477935.8A CN116479150A (zh) | 2023-04-25 | 2023-04-25 | 单管一步法RPA-Cas12a/Cas13a快速检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 |
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|---|---|---|---|---|
| CN117305484A (zh) * | 2023-10-25 | 2023-12-29 | 四川省畜牧科学研究院 | 一种同时检测多杀性巴氏杆菌和溶血性曼氏杆菌的检测体系和方法 |
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2023
- 2023-04-25 CN CN202310477935.8A patent/CN116479150A/zh active Pending
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