CN116144811B - 用于检测脑脊液病原的多重引物组、方法和试剂盒 - Google Patents

用于检测脑脊液病原的多重引物组、方法和试剂盒 Download PDF

Info

Publication number
CN116144811B
CN116144811B CN202211648059.2A CN202211648059A CN116144811B CN 116144811 B CN116144811 B CN 116144811B CN 202211648059 A CN202211648059 A CN 202211648059A CN 116144811 B CN116144811 B CN 116144811B
Authority
CN
China
Prior art keywords
cerebrospinal fluid
multiplex
multiplex primer
kit
primer set
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202211648059.2A
Other languages
English (en)
Other versions
CN116144811A (zh
Inventor
邵阳
刘佳
赵忞超
那成龙
刘思思
崔月利
郭垚
吴卫卫
蒋文
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Nanjing Difei Medical Laboratory Co ltd
Difei Medical Technology Nanjing Co ltd
Original Assignee
Nanjing Difei Medical Laboratory Co ltd
Difei Medical Technology Nanjing Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nanjing Difei Medical Laboratory Co ltd, Difei Medical Technology Nanjing Co ltd filed Critical Nanjing Difei Medical Laboratory Co ltd
Priority to CN202211648059.2A priority Critical patent/CN116144811B/zh
Publication of CN116144811A publication Critical patent/CN116144811A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN116144811B publication Critical patent/CN116144811B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/6893—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for protozoa
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C12Q1/705—Specific hybridization probes for herpetoviridae, e.g. herpes simplex, varicella zoster
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/21—Haemophilus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/22—Klebsiella
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/32—Mycobacterium
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/36—Neisseria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/38—Pseudomonas
    • C12R2001/385—Pseudomonas aeruginosa
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/44—Staphylococcus
    • C12R2001/445—Staphylococcus aureus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/46—Streptococcus ; Enterococcus; Lactococcus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
    • C12R2001/66—Aspergillus
    • C12R2001/67—Aspergillus flavus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
    • C12R2001/66—Aspergillus
    • C12R2001/68—Aspergillus fumigatus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
    • C12R2001/72—Candida
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
    • C12R2001/72—Candida
    • C12R2001/725—Candida albicans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/90—Protozoa ; Processes using protozoa
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Abstract

本发明公开了一种用于检测脑脊液病原微生物的多重引物组、方法、试剂盒及其应用，属于微生物检测技术领域。该发明特异性检测脑脊液样本中40种重要的病原，包括13种细菌、6种真菌、15种寄生虫和6种DNA病毒，精准覆盖中枢神经系统感染的常见病原，提高了脑脊液样本中病原微生物检测的灵敏度和特异性，实现病原体更为精准的广谱检测。

Description

用于检测脑脊液病原的多重引物组、方法和试剂盒
技术领域
本发明涉及基因检测技术领域，特别是涉及一种用于检测脑脊液病原微生物的多重引物组、方法、试剂盒及其应用。
背景技术
中枢神经系统(CNS)感染表现为中枢神经系统或周围神经系统共同或分别遭到不同生物性病原体的入侵，从而引发的一系列神经组织损伤与临床症状，包括脑膜炎、脑炎和精髓炎等疾病。除了死亡率高，中枢神经系统感染会导致永久性残疾，严重影响患者的生活质量和生命安全。包括细菌、病毒，真菌和寄生虫在内的多种微生物，都会引起脑膜炎和脑炎，且许多感染的临床表现都是非特异性的。而传统诊断方法，如血清和脑脊液的培养及涂片染色等检测的阳性率仅有10％左右，无法满足临床需求。而早期快速准确的诊断病原体对于中枢神经系统感染的及时治疗、降低病死率和致残率十分重要。因此，亟需一种新的技术以提高中枢神经系统感染的诊断。
近几年来，基于宏基因组技术的病原检测正在加速临床应用与转化，将感染性疾病的诊断带入了“测序”时代。宏基因组学下一代测序(mNGS)技术的出现，为人体活检样本和体液(血液、脑脊液、尿液等)中病原微生物的研究提供了重要的数据信息。mNGS可以同时对数十亿个DNA片段进行独立测序,能够通过一次测定即可识别鉴定出潜在原因的全面微生物，包括病毒、细菌、真菌和寄生虫。与临床上传统培养方法相比，mNGS具有更高的敏感性，且大大缩短了样本的检测时间。虽然mNGS在临床样本的病原检测具有众多的优势，但其技术仍面临着一些挑战：1)临床样本中的人源核酸背景高，会干扰病原微生物的检出；2)对于胞内菌与真菌等微生物，其检测的灵敏性较低；3)检测成本较高。
病原靶向测序通过超多重引物扩增(mPCR)与高通量测序两种技术的结合，在降低实验成本的基础上，能够对临床待测样本中几十种至几百种已知病原微生物进行检测且不受人源背景的干扰，可提高产品的时效性和灵敏度，是解决目前临床病原体诊断领域诸多问题的一种非常有效的补充手段。
发明内容
本发明提供一种用于检测脑脊液病原微生物的多重引物组与方法，能够精准覆盖40种可导致中枢神经系统感染的常见病原，靶向扩增目标序列，放大病原体的信号，具有较高的灵敏度与特异性，可实现病原体更为精准的广谱检测。
用于检测脑脊液病原的多重引物组，包括用于特异性扩增以下病原微生物基因组编码区序列：铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、脑膜炎奈瑟球菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、流感嗜血杆菌、金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、肺炎链球菌、粪肠球菌、屎肠球菌、单核细胞增多性李斯特菌、结核分枝杆菌复合群、黄曲霉、新型隐球菌、白色念珠菌、近平滑假丝酵母菌、格特隐球菌、烟曲霉、克氏锥虫、蓝氏贾第鞭毛虫、卡氏棘阿米巴、溶组织阿米巴、福氏耐格里属阿米巴、小隐孢子虫、刚地弓形虫、恶性疟原虫、间日疟原虫、三日疟原虫、猪肉绦虫、马来丝虫、班氏丝虫、广州管圆线虫、卫氏并殖吸虫、人疱疹病毒1、人疱疹病毒2、人疱疹病毒3、人巨细胞病毒、人疱疹病毒6型、EB病毒。
多重引物组如SEQ ID NO:1-272所示序列工，或者具有相同功能的序列。
所述的具有相同功能的序列是指具有90％以上的碱基序列相同。
检测脑脊液病原微生物的方法，包括如下步骤：
获得脑脊液样本，并采用上述的多重引物组进行多重PCR反应；
反应产物经过末端修复、加A、加接头处理后，获得检测文库，并进行NGS测序。
所述的多重PCR反应中的反应体系包括：DNA模板9μL，包含多重引物组的工作液6μL， HG Multiplex PCR Master Mix 15μL，总体积30μL。
有益效果
本发明的用于检测脑脊液病原微生物的方法，通过设计特定病原微生物基因片段的特异性引物，靶向扩增物种的目标序列，能够实现病原体的信号放大，有效降低背景核酸对于后续NGS检测结果的影响。该方法可操作性高，能够在同一个反应体系中一次性检测覆盖中枢神经系统感染的40种常见病原，提高mNGS对于脑脊液中病原微生物的灵敏度和特异性，具有良好的应用价值。
附图说明
图1为多重引物文库的质控图。
图2为测序数据的质控图。
具体实施方式
为了便于更好地理解本发明，下面将结合相关附图和实施例对本发明进行进一步的阐述，应该说明的是，下述说明仅是为了对本发明作进一步解释，不对其内容进行限定。
本发明提供的一种用于检测脑脊液病原微生物的试剂盒，其中包括有用于检测脑脊液病原微生物的多重引物组，所述的引物组包括：
多重引物组特异性扩增以下病原微生物基因组编码区序列：铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、脑膜炎奈瑟球菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、流感嗜血杆菌、金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、肺炎链球菌、粪肠球菌、屎肠球菌、单核细胞增多性李斯特菌、结核分枝杆菌复合群、黄曲霉、新型隐球菌、白色念珠菌、近平滑假丝酵母菌、格特隐球菌、烟曲霉、克氏锥虫、蓝氏贾第鞭毛虫、卡氏棘阿米巴、溶组织阿米巴、福氏耐格里属阿米巴、小隐孢子虫、刚地弓形虫、恶性疟原虫、间日疟原虫、三日疟原虫、猪肉绦虫、马来丝虫、班氏丝虫、广州管圆线虫、卫氏并殖吸虫、人疱疹病毒1、人疱疹病毒2、人疱疹病毒3、人巨细胞病毒、人疱疹病毒6型、EB病毒。
多重引物组包括引物组1和引物组2。引物组1如SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:96所示序列，引物组2如SEQ ID NO:97至SEQ ID NO:272所示序列。
检测脑脊液病原微生物的方法，包括如下步骤：
获得样本，并采用上述的多重引物组进行多重PCR反应；
反应产物经过末端修复、加A、加接头处理后，获得检测文库，并进行NGS测序。
所述的多重PCR反应中的反应体系包括：
所述的方法中，还包括多重扩增反应的步骤。DNA模板9μL，包含多重引物组的工作液6μL， HG Multiplex PCR Master Mix 15μL，总体积30μL。
多重扩增试剂包括：15μLHG Multiplex PCR Master Mix、3μL引物组1、3μL引物组2、9μLDNA模板，整个反应体系总体积为30μL。
多重引物组扩增的反应程序为95℃预变性3min；95℃变性20s；60℃退火2min；扩增40个循环；72℃延伸5min。
本发明中所用实验材料、试剂仪器如下：
实验材料：临床感染患者脑脊液样本。
实验试剂：HG Multiplex PCR Master Mix、多重PCR病原特异性引物、VAHTS DNA Clean Beads、/>Universal DNA Library Prep Kit for MGI、无水乙醇、Pico488dsDNA quantification reagent。
实验仪器：涡旋混匀仪(IKA；MS2S9)；Biorad C1000Touch PCR仪(Bio-Rad；C1000Touch)；Qubit4.0荧光定量仪(Thermo Fisher)。
实施例1
一种用于检测脑脊液病原微生物的试剂盒，用于靶向扩增病原微生物的目标序列，通过以下方法设计得到。
多重引物组的设计与合成
根据申请人既往中枢神经系统感染临床样本的检出，并结合感染疾病相关指南、专家共识、市场上检测产品，最终确定40种病原微生物，包括13种细菌、6种真菌、15种寄生虫和6种DNA病毒。下载物种的全部基因组序列，筛选出其共有序列，在基因组序列上滑动窗口，按照参数引物设计模板窗口长度100-500bp、窗口滑动长度10-50bp，生成物种的备选引物设计模板序列；并将其与其它物种的基因组序列进行比对，以评估引物设计模板序列的特异性。
本发明提供了所包含的最高效特意的多重引物组所涉及的病原微生物及其对应的多重引物序列如下所示：
实施例2
一种脑脊液病原微生物检测方法，采用实施例1所述的引物组，包括以下步骤：
1、多重PCR
1.1将引物组1、引物组2工作液、多重扩增试剂盒分别放置冰上解冻，溶解后的引物涡旋混匀待用。
1.2取的0.2mL PCR管中，按照表1配制多重PCR反应Mix。
表2多重PCR反应体系
1.3在涡旋震荡仪上简单混匀后离心，放入PCR仪中进行反应。反应程序如下：
表3多重PCR反应程序
2、磁珠纯化
2.1向多重PCR反应产物内加入21μL已平衡混匀好的纯化磁珠，室温孵3min。
2.2将0.2mL PCR管置于磁力架上2min，待上清澄清后小心移除上清。
2.3保持0.2mL PCR管置于磁力架上并向其中加入200μL 80％乙醇，室温孵育30s，去除上清。
2.4重复2.3步骤，简短离心后置于磁力架上，使用移液器去除所有残留的乙醇。室温晾干约2min。
2.5向0.2mL PCR管中加入32μL无酶水，移液器吹吸混匀，室温静置孵育3min。
2.6将0.2mL PCR管置于磁力架上1min，溶液澄清后转移30μL上清至新的已标记的1.5mL低吸附管中。
2.7从1.5mL管内取1μL，进行Qubit定量。
3、末端修复、加A
3.1将End Prep Mix 4放置冰上解冻，颠倒混匀后简短离心，取7.5μL加入到0.2mLPCR管中。
3.2向含有7.5μL End Prep Mix 4的PCR管中加入25μL mPCR产物。
3.3用移液器吹吸混匀并简短离心，放入PCR仪中进行反应。反应程序如下：
表4末端修复、加A PCR反应程序
4、接头连接
4.1取出接头连接的试剂，按下表配制连接反应Mix：
表5接头连接反应体系
4.2在含有DNA末端修复产物的PCR管内加入20μL连接反应Mix，混匀简短离心后，置于PCR仪上进行连接反应，反应程序如下：
表6接头连接反应程序
5、磁珠纯化
5.1在含有连接产物的PCR管中，加入30μL已平衡混匀好的纯化磁珠，充分混匀，室温孵育3min。
5.2将PCR管置于磁力架上2min，上清澄清后小心去除上清。
5.3保持PCR管位于磁力架上，并向其中加入200μL 80％乙醇，室温孵育30s，小心去除上清。
5.4重复5.3步骤，简短离心后置于磁力架上，使用移液器去除所有残留的80％乙醇。室温晾干约2min。
5.5向PCR管中加13μL无酶水，移液器吹吸混匀，室温静置孵育3min。
5.6将PCR管置于磁力架上磁吸1min，溶液澄清后转移10μL上清至新的已标记的0.2mL PCR管中。
6、PCR扩增
6.1向含有10μL纯化后产物的0.2mL PCR管中加入PCR扩增试剂，反应体系如下表：
表7PCR扩增反应体系
成分 体积(μL)
接头连接纯化后产物 10
VAHTS HiFi Amplification Mix 12.5
Primer X(10μM) 2.5
总体积 25
6.2用移液器吹吸混匀简短离心后，按如下程序进行PCR反应。
表8PCR扩增反应程序
7、磁珠纯化
7.1在含有扩增产物的PCR管中，加入17.5μL纯化磁珠，充分混匀，室温孵育3min。
7.2将PCR管置于磁力架上2min，上清澄清后小心去除上清。
7.3保持PCR位于磁力架上，并向其中加入200μL 80％乙醇，室温孵育30s，小心去除上清。
7.4重复7.3步骤，简短离心后置于磁力架上，使用移液器去除所有残留的80％乙醇。室温晾干约2min。
7.5向PCR管中加24μL无酶水，移液器吹吸混匀，室温静置孵育3min。
7.6将PCR管置于磁力架上磁吸1min，溶液澄清后转移20μL终文库到已标记好的1.5mL灭菌离心管内。并从中取1μL进行Qubit定量。
8、高通量测序及生信分析
按照Illumina测序试剂盒的操作说明将构建好的文库在Illumina NextSeq550Dx(Illumina)仪器上进行单端75bp测序。使用生信分析流程对下机的数据进行分析，得到病原微生物的检测结果。
实施例3
分别配制8种检测靶标病原的菌液(铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、肺炎链球菌、单核细胞增多性李斯特菌、流感嗜血杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、格特隐球菌)，利用PBS缓冲液对上述菌液进行梯度稀释，每种病原取7个浓度梯度的菌液(2×107CFU/mL，2×106CFU/mL，2×105CFU/mL，2×104CFU/mL，2×103CFU/mL，2×102CFU/mL，20CFU/mL)进行后续实验。分别对上述菌液进行核酸提取、建库以及mNGS测序，所有病原微生物在2×102CFU/mL浓度均可检出，证明本专利的方法具有较高的灵敏性。
实施例4
混合阳性的脑脊液样本常规mNGS检测和本发明多重扩增法检测对比实验
分别取5例混合阳性的脑脊液样本，具体样本与病原信息如下：
表9样本病原信息与浓度
1、核酸提取
分别取1ml脑脊液样本与NTC样本，采用商品化的DNA提取试剂盒进行核酸提取，具体操作步骤可见试剂盒说明书。
2、文库构建
参照实施例2中的方式对提取好的DNA进行文库构建，文库质控结果见图1。
3、高通量测序与生信分析
对构建好的文库进行NGS平台上机测序，并对下机数据进行生信分析，下机数据质控见图2。并得到以下结果。
表10混合阳性脑脊液样本中病原微生物检测结果
/>
注：“/”表示未检出。
从上表中可以看出，在对混合阳性的脑脊液样本的检测中，与常规的mNGS检测结果相比，多重引物测序的检测灵敏度更高。
实施例5
脑脊液临床样本中病原微生物检测
随机选取临床怀疑中枢神经系统感染患者的脑脊液样本，按照与实施例2、3相同的实验流程进行核酸提取、文库构建、上机测序及生信分析。统计常规mNGS、多重引物测序的检出序列数，以及富集比例。具体结果见表11。
表11脑脊液临床样本中病原微生物检测结果
从上表中可以看出，对于脑脊液临床样本的检测，本发明具有较好的富集效果，能够显著提高了脑脊液样本的检测灵敏度。
以上所述实施例仅为本发明的几种优选实施方式，并不能因此理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (2)

1.用于检测脑脊液病原的多重引物组，其特征在于，是由用于特异性扩增以下病原微生物基因组编码区序列的引物所组成：铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、脑膜炎奈瑟球菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、流感嗜血杆菌、金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、肺炎链球菌、粪肠球菌、屎肠球菌、单核细胞增多性李斯特菌、结核分枝杆菌复合群、黄曲霉、新型隐球菌、白色念珠菌、近平滑假丝酵母菌、格特隐球菌、烟曲霉、克氏锥虫、蓝氏贾第鞭毛虫、卡氏棘阿米巴、溶组织阿米巴、福氏耐格里属阿米巴、小隐孢子虫、刚地弓形虫、恶性疟原虫、间日疟原虫、三日疟原虫、猪肉绦虫、马来丝虫、班氏丝虫、广州管圆线虫、卫氏并殖吸虫、人疱疹病毒1、人疱疹病毒2、人疱疹病毒3、人巨细胞病毒、人疱疹病毒6型、EB病毒；
所述的多重引物组是由如SEQ ID NO:1- 272所示序列的引物所组成。
2.一种试剂盒，其特征在于，其中包含有权利要求1所述的多重引物组。
CN202211648059.2A 2022-12-21 2022-12-21 用于检测脑脊液病原的多重引物组、方法和试剂盒 Active CN116144811B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202211648059.2A CN116144811B (zh) 2022-12-21 2022-12-21 用于检测脑脊液病原的多重引物组、方法和试剂盒

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202211648059.2A CN116144811B (zh) 2022-12-21 2022-12-21 用于检测脑脊液病原的多重引物组、方法和试剂盒

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN116144811A CN116144811A (zh) 2023-05-23
CN116144811B true CN116144811B (zh) 2024-02-20

Family

ID=86372760

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202211648059.2A Active CN116144811B (zh) 2022-12-21 2022-12-21 用于检测脑脊液病原的多重引物组、方法和试剂盒

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN116144811B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117385105A (zh) * 2023-12-06 2024-01-12 首都医科大学附属北京地坛医院 一种pcr检测试剂及方法和应用

Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101541979A (zh) * 2007-06-01 2009-09-23 科学与工业研究委员会 同时检测和鉴别眼睛和中枢神经系统的细菌、真菌、寄生虫和病毒感染的新方法
CN103074448A (zh) * 2013-01-25 2013-05-01 海尔施生物医药股份有限公司 一种同步检测二十三种脑炎脑膜炎病原体的试剂盒及其检测方法
CN105349664A (zh) * 2015-11-27 2016-02-24 首都医科大学宣武医院 检测中枢神经系统细菌性感染者脑脊液中病原菌的基因芯片及试剂盒
KR101717181B1 (ko) * 2015-09-30 2017-03-17 주식회사 디앤피바이오텍 뇌수막염 진단용 프라이머 세트 및 이의 이용
CN111269995A (zh) * 2018-12-04 2020-06-12 深圳华大因源医药科技有限公司 用于检测病原体的引物组、试剂盒和检测方法
CN111455115A (zh) * 2020-05-27 2020-07-28 宁波海尔施基因科技有限公司 一种基于rt-pcr及毛细电泳的同步检测19种脑炎脑膜炎病原体的试剂盒及检测方法
CN111763767A (zh) * 2020-06-04 2020-10-13 上海捷诺生物科技有限公司 中枢神经系统感染病原体检测试剂盒及其应用
CN112813196A (zh) * 2020-12-31 2021-05-18 广州微远基因科技有限公司 用于检测病原微生物的捕获探针组、方法、试剂盒及应用
CN112831604A (zh) * 2021-02-05 2021-05-25 美格医学检验所(广州)有限公司 基于靶向测序的病原微生物检测引物组、试剂盒及方法
CN114990260A (zh) * 2022-06-01 2022-09-02 昆明理工大学 用于检测中枢神经系统感染性病原体的多重荧光定量pcr检测试剂

Patent Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101541979A (zh) * 2007-06-01 2009-09-23 科学与工业研究委员会 同时检测和鉴别眼睛和中枢神经系统的细菌、真菌、寄生虫和病毒感染的新方法
CN103074448A (zh) * 2013-01-25 2013-05-01 海尔施生物医药股份有限公司 一种同步检测二十三种脑炎脑膜炎病原体的试剂盒及其检测方法
KR101717181B1 (ko) * 2015-09-30 2017-03-17 주식회사 디앤피바이오텍 뇌수막염 진단용 프라이머 세트 및 이의 이용
CN105349664A (zh) * 2015-11-27 2016-02-24 首都医科大学宣武医院 检测中枢神经系统细菌性感染者脑脊液中病原菌的基因芯片及试剂盒
CN111269995A (zh) * 2018-12-04 2020-06-12 深圳华大因源医药科技有限公司 用于检测病原体的引物组、试剂盒和检测方法
CN111455115A (zh) * 2020-05-27 2020-07-28 宁波海尔施基因科技有限公司 一种基于rt-pcr及毛细电泳的同步检测19种脑炎脑膜炎病原体的试剂盒及检测方法
CN111763767A (zh) * 2020-06-04 2020-10-13 上海捷诺生物科技有限公司 中枢神经系统感染病原体检测试剂盒及其应用
CN112813196A (zh) * 2020-12-31 2021-05-18 广州微远基因科技有限公司 用于检测病原微生物的捕获探针组、方法、试剂盒及应用
CN112831604A (zh) * 2021-02-05 2021-05-25 美格医学检验所(广州)有限公司 基于靶向测序的病原微生物检测引物组、试剂盒及方法
CN114990260A (zh) * 2022-06-01 2022-09-02 昆明理工大学 用于检测中枢神经系统感染性病原体的多重荧光定量pcr检测试剂

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Applying the pathogen-targeted next-generation sequencing method to pathogen identification in cerebrospinal fluid;Daiquan Gao等;Ann Transl Med.;1-7 *
宏基因组二代测序技术在中枢神经系统感染性疾病病原诊断中的应用及发展;张梦瑶;中国临床神经科学;86-90 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN116144811A (zh) 2023-05-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN113512602B (zh) 血流感染病原体多重基因检测体系及其试剂盒和应用
CN114381538B (zh) 用于检测鼻疽诺卡菌的lamp引物组和检测试剂盒
CN113249499B (zh) 一种伤寒沙门氏菌的检测试剂盒、其制备方法及其应用
CN111647654A (zh) 用于检测血色病及肝豆状核变性易感基因突变的引物组合物、试剂盒及方法
CN116144811B (zh) 用于检测脑脊液病原的多重引物组、方法和试剂盒
WO2021179469A1 (zh) 检测病原体的组合物、试剂盒及方法
CN113265452A (zh) 一种基于Nanopore宏基因组RNA-seq的生物信息学检测病原体的方法
CN110656037B (zh) 一种用于病原体核酸检测的微流控芯片及检测方法
CN110423835B (zh) 用于下呼吸道病原微生物检测的引物组合物
CN114134218B (zh) 一种基于CRISPR-Cas12a的荧光检测方法
CN105256041B (zh) 对亲水气单胞菌o44，o24，o25和o28特异的核苷酸及应用
WO2021039777A1 (ja) 関節リウマチを検査する方法
CN110029179B (zh) 一组核苷酸分子及在纹带棒状杆菌鉴定中的应用
CN111349718A (zh) 用于病原核酸扩增的引物组、病原核酸检测文库构建方法和病原检测方法
CN105256042B (zh) 对亲水气单胞菌o13，o36，o16和o19特异的核苷酸及应用
RU2762759C1 (ru) Способ пробоподготовки образцов изолятов коронавируса SARS-CoV-2 и олигонуклеотидные праймеры для его реализации
CN117467803B (zh) 一种检测玉米夜蛾HzNV-1病毒的引物和探针组合及其应用
CN117126920B (zh) 基于纳米孔测序平台的中枢神经感染病原体建库和检测方法
CN116121409B (zh) 一种多重qPCR检测细菌的探针引物组、试剂盒以及检测方法
CN105255871B (zh) 对亲水气单胞菌o7，o8，o9和o10特异的核苷酸及应用
JP2004290171A (ja) 微生物の分子生物学的同定技術
CN105256043B (zh) 对亲水气单胞菌o29，o30，o33和o35特异的核苷酸及应用
CN116411053A (zh) Kpc型碳青霉烯酶基因检测试剂盒、组合物及其应用
CN115896316A (zh) 一种结核病的检测方法
CN116855634A (zh) 一种一体化快速检测中枢神经系统感染性疾病病原的核酸检测试剂盒

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant