CN117467803B - 一种检测玉米夜蛾HzNV-1病毒的引物和探针组合及其应用 - Google Patents

一种检测玉米夜蛾HzNV-1病毒的引物和探针组合及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种检测玉米夜蛾HzNV‑1病毒的引物和探针组合及其应用，所述引物和探针组合包括检测玉米夜蛾HzNV‑1病毒pag1基因的引物和探针组合；所述引物和探针组合包括：正向引物、反向引物和探针；所述正向引物的核苷酸序列包括SEQ ID NO:1所示，所述反向引物的核苷酸序列包括SEQ ID NO:2所示；所述探针的核苷酸序列包括SEQ ID NO:3所示。本发明针对所有不同类型玉米夜蛾HzNV‑1病毒，设计对应的正反向引物、探针以及反应程序，建立一种具有良好专一性、灵敏性以及变异株高度覆盖性等优点的实时定量PCR法，且该检测方法适用于生物制品大批量生产的繁复检测。

Description

一种检测玉米夜蛾HzNV-1病毒的引物和探针组合及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种检测玉米夜蛾HzNV-1病毒的引物和探针组合及其应用。
背景技术
新兴的抗体发现技术加速了抗体的开发，会将更多的抗体候选物领向临床开发，未来全球抗体治疗产业及其市场将大幅扩大。大部分生物药（如单克隆抗体）以注射方式应用于疾病治疗，这些生物药的质量与患者的用药安全密切相关。各国监管机构出台了一系列法规来确保生物药的生物安全性，如法规中明确要求对生产用种子库细胞，对细胞培养结束时混悬液，动物组织原材料匀浆做病毒检测，即采用各种适宜的方法检测污染的病毒。
目前很多重组蛋白类生物制品以昆虫细胞系作为表达宿主。这些昆虫细胞主要包括了鳞翅目（Lepidoptera）的Sf和Tn细胞系，双翅目（Diptera）的S2细胞系等。另外，Bombyxmori（Bm）以及一些来自其他鳞翅目物种的细胞系也被偶尔使用。其中一个细胞系Hz-AM1，其来源于 Helicothis zea （Hz）也被用于重组蛋白类生物制品的开发及生产。研究表明，一种名为HzNV-1病毒除了可以在Hz-AM1细胞中建立感染，还可以在IPLB-Ld652（Lymantria dispar）， IPLB-Hz-1075 （Helicoverpa zea）， IPLB-SF-21 （Spodopterafrugiperda）和 TN368 （Tricoplusia ni） 等昆虫细胞中建立持续感染。此外，叙利亚幼地鼠肾细胞（BHK）也可被HzNV-1病毒感染。这说明了哺乳动物也存在着被HzNV-1病毒感染的风险。因此，生物安全检测机构需要开发一种方便、快捷、灵敏、特异性强的检测HzNV-1病毒的方法。
目前，指导原则中推荐的用于生物安全检测的病毒检测方法包含了体外法，体内法，动物抗体产生试验，电镜，ELISA，PCR，RT检测等。其中，体外法采用敏感细胞系进行共培养检测，在适宜的培养时间点（通常为28天）取样检测感染性病毒。在没有可靠的体外试验方法时，可采用适宜动物进行接种盲传试验，采用体内法检测有无感染性病毒。对于尚没有合适的体内和体外病毒检测方法时，可采用不同的动物，观察种特异病毒的抗体产生情况。以上方法由于检测周期较长，实验操作繁琐，实验动物伦理等原因，在一定程度上限制了其应用范围。核酸检测技术检测周期短，操作便利，无需动物，因此适用范围较广，且灵敏度较高，检测周期短，是HzNV-1病毒检测的一种较好的选择。
聚合酶链式反应（PCR）是检测目标核酸片断的有力工具，PCR通过热循环驱动扩增。从1981年发明该技术以来，多种改进程序被引入以满足分子生物学领域的科研需求。定量PCR（qPCR, Q-PCR）被广泛用于细胞中核酸的定量以及检测目标蛋白的表达水平。该技术已被开发应用于病毒检测以及病毒清除研究。qPCR主要的方法学是通过实时监测荧光强度来检测PCR产物的含量。而在常规PCR中，扩增产物通过电泳进行分离和可视化。qPCR中使用的DNA聚合酶具有5’至3’的核酸内切酶活性，通过水解标记有荧光素和淬灭染料的寡核苷酸探针，产生荧光信号。将qPCR和荧光素标记探针相结合，理论上可以检测单个病毒DNA/RNA，在实际应用中qPCR可以检测到样品中个位数的病毒DNA/RNA，无论病毒的活性如何。目前，将qPCR用于外源性因子检测的例子是进行外源病毒因子检测，例如检测一些用于生产生物制品的工程细胞系的主细胞库（MBC），工作细胞库（WBC）是否存在特定的病毒。中国药典规定，针对人源细胞系，应考虑检测人EB病毒，人巨细胞病毒（HCMV），人逆转录（HIV-1/2，HTLV1/2，人肝炎病毒（HAV，HBV，HCV），人细小病毒B19，人乳头瘤病毒，人多瘤病毒，难培养的人腺病毒和人疱疹病毒-6/7/8等。另外，2020版中国药典增加了PCR（qPCR）检查方法，为荧光定量技术在病毒检测和生物制品安全评价的应用提供了法规依据。
因此，亟需提供一种具有良好专一性、高灵敏性的检测玉米夜蛾HzNV-1病毒的引物和探针组合。
发明内容
针对现有技术的不足和实际需求，本发明的目的在于提供一种检测玉米夜蛾HzNV-1病毒的引物和探针组合及其应用。本发明针对玉米夜蛾HzNV-1病毒，设计对应的正反向引物、探针以及反应程序，建立一种具有良好专一性、高灵敏性等优点的实时定量PCR法，且该检测方法适用于生物制品大批量生产的繁复检测。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种检测玉米夜蛾HzNV-1病毒的引物和探针组合，所述引物和探针组合包括检测玉米夜蛾HzNV-1病毒pag1基因的引物和探针组合；
所述引物和探针组合包括：正向引物、反向引物和探针；
所述正向引物的核苷酸序列包括如SEQ ID NO:1所示的序列，所述反向引物的核苷酸序列包括如SEQ ID NO:2所示的序列；
所述探针的核苷酸序列包括如SEQ ID NO:3所示的序列；
SEQ ID NO:1：GAGGTTCAATGCAATCCGGC；
SEQ ID NO:2：TCTGACCAACGGTAGCGAAC；
SEQ ID NO:3：FAM-CGAAACGGCCGTGCACACCGATGACG-BHQ1。
本发明中，通过对NCBI数据库中HzNV-1所有分离株（包括Accession: NC_074969.1和Accession: AF451898.1）共2条完整的HzNV-1基因序列（全基因组碱基数为228089bp）做同源性比对，设计出1组实时定量PCR的正反向引物以及探针，所述引物和探针组合能够高效、准确地检测出所有类型的HzNV DNA，并且不受大量背景细胞DNA的影响，特别适用于检测生物制药原料和产品，尤其是细胞库中的HzNV-1病毒污染。
优选地，所述探针的5’端含有荧光基团，3’端含有淬灭基团。
优选地，所述荧光基团包括FAM、VIC或HEX中任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述淬灭基团包括MGB、BHQ1或TAMRA中任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述正向引物和反向引物扩增的目的片段的序列包括如SEQ ID NO:4所示的序列；
SEQ ID NO:4：
CTCAACGAAAAGTATCCATTCTTGGCGTCGCACTTGAAAGTCAACGTCAGAGCGGCCACCGATGCCGATTATTACATTCCACCGGCAATGGCCTCCGAGGCCATATTCGTAGAGGCAGAGATTACAAAACAATTGTGCGAGAGCATTTCGTGCAACTCGTCCGGTGTGCACGGACCCTGCAAAAAGACGGATGCGGCCAGCTACTATAGATTGGGCGAGAGTGAAAACTTTGAGGTTCAATGCAATCCGGCCTGCTTCCACTTGTTCGAAACGGCCGTGCACACCGATGACGGTACCGACAAGCCACACAACGTTCGCTACCGTTGGTCAGAGACTAGCAACACTTGCAATATCGTACCTTTTGCAGCCACCTGGATGGAGATTCCCCGGTATCGGTCCAGTGAACTGTACGCGCCTAGGCTAAACGATCTCGACACCGGCTTTGACTATGAGCCGTCCACGGACACGTATCACTTTAACAAATACTATTGCGACGTTTA。
第二方面，本发明提供一种检玉米夜蛾HzNV-1病毒的试剂盒，所述试剂盒包括第一方面所述的检测玉米夜蛾HzNV-1病毒的引物和探针组合。
优选地，所述试剂盒还包括病毒核酸标准品和荧光定量PCR反应试剂。
优选地，所述病毒核酸标准品包括目的片段的DNA片段，所述目的片段的DNA片段的序列包括如SEQ ID NO:4所示的序列。
优选地，所述荧光定量PCR反应试剂包括酶液和反应缓冲液，所述酶液包括DNA聚合酶。
第三方面，本发明提供一种以非疾病诊断和/或治疗为目的的检测玉米夜蛾HzNV-1病毒的方法，所述方法包括以下步骤：
（1）采集并处理待测样品，配制荧光定量PCR体系；
（2）对待测样品和病毒核酸标准品进行荧光定量PCR反应，得到待测样品和病毒核酸标准品的荧光信号，对荧光信号进行数据处理，得到Ct值及扩增曲线，所述荧光定量PCR反应的反应体系包括第一方面所述的检测玉米夜蛾HzNV-1病毒的引物和探针组合；
（3）根据病毒核酸标准品的浓度和Ct值，绘制荧光定量标准曲线，根据荧光定量标准曲线对待测样品进行定性和定量检测。
优选地，所述荧光定量PCR体系按终浓度计包括：1×的Taqman Universal PCRMaster Mix、800-900 nM的正向引物、800-900 nM的反向引物和220-250 nM的探针；
所述荧光定量PCR反应的程序包括：步骤1：94-96℃，8-12 min；步骤2：94-96℃，13-17 sec；步骤3：58-62℃，0.8-1.2 min；步骤2和步骤3，40-42个循环。
上述800-900 nM中的具体点值可以选择800 nM、820 nM、840 nM、860 nM或900 nM等。
上述220-250 nM中的具体点值可以选择220 nM、230nM、240 nM、245 nM或250 nM等。
上述94-96℃中的具体点值可以选择94℃、95℃或96℃等。
上述8-12 min中的具体点值可以选择8 min、9 min、10 min、11 min或12 min等。
上述13-17 sec中的具体点值可以选择13 sec、14 sec、16 sec或17 sec等。
上述58-62℃中的具体点值可以选择58℃、59℃、60℃、61℃或62℃等。
上述0.8-1.2 min中的具体点值可以选择0.8 min、0.9 min、1.0 min、1.1 min或1.2 min等。
上述40-42个循环中的具体点值可以选择40个循环、41个循环或42个循环等。
第四方面，本发明提供一种检测玉米夜蛾HzNV-1病毒的系统，所述系统包括样品制备模块、检测模块和分析模块；
所述样品制备模块用于执行包括：
采集并处理待测样品，配制荧光定量PCR体系，所述PCR体系包括第一方面所述的检测玉米夜蛾HzNV-1病毒的引物和探针组合；
所述荧光定量PCR体系按终浓度计包括：1×的Taqman Universal PCR MasterMix、800-900 nM的正向引物、800-900 nM的反向引物和220-250 nM的探针；
所述荧光定量PCR反应的程序包括：步骤1：94-96℃，8-12 min；步骤2：94-96℃，13-17 sec；步骤3：58-62℃，0.8-1.2 min；步骤2和步骤3，40-42个循环；
所述检测模块用于执行包括：
对荧光定量PCR体系进行荧光定量PCR反应；
所述分析模块用于执行包括：根据荧光定量标准曲线，对待测样品进行定性和定量检测。
第五方面，本发明提供第一方面所述的检测玉米夜蛾HzNV-1病毒的引物和探针组合、第二方面所述的检测玉米夜蛾HzNV-1病毒的试剂盒或第四方面所述的检测玉米夜蛾HzNV-1病毒的系统中的任意一种或至少两种的组合在制备检测玉米夜蛾HzNV-1病毒的产品中的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
（1）本发明通过对NCBI数据库中HzNV-1所有分离株（包括Accession: NC_074969.1和Accession: AF451898.1）共2条完整的HzNV-1基因序列（全基因组碱基数为228089bp）做同源性比对，设计出1组实时定量PCR的正反向引物以及探针，本发明的检测方法能够检测出NCBI数据库中现有的所有HzNV-1病毒分离株（包括Accession: NC_074969.1和Accession: AF451898.1），本发明选择的扩增检测区域是HzNV-1基因组中非常保守的区域，对于将来新出现的变异株被本发明所述方法检测到的几率很高；
（2）本发明的检测方法用时2.0 h，与病毒细胞培养检测相比，时间缩短较大，降低了人工和物料成本；
（3）本发明的检测方法可以检测出HzNV-1（包括Accession: NC_074969.1和Accession: AF451898.1）低至10个病毒基因组拷贝，该方法的高灵敏度和高覆盖率能够更好地保证生物制品的安全性；
（4）细胞库的生物安全检测需要检测到大量细胞中的微量病毒污染，用PCR方法做检测时，检测样本DNA中也包含大量的细胞DNA与微量的病毒DNA（如果病毒污染存在），大量的细胞DNA常常会抑制PCR反应，而本发明的检测方法不会被细胞总DNA所干扰，特别适合于检测含细胞的样品中的病毒污染。
附图说明
图1为病毒核酸标准品的检测结果图。
图2为实施例1的引物探针的扩增结果图。
图3为对比例1的引物探针的扩增结果图。
图4为实施例5的引物探针扩增效果图。
图5为实施例6的引物探针扩增效果图。
图6为实施例7的引物探针扩增效果图。
图7为实施例8的引物探针扩增效果图。
图8为实施例9的引物探针扩增效果图。
图9为实施例10的引物探针扩增效果图。
具体实施方式
为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
实施例1
本实施例提供一种检测玉米夜蛾HzNV-1病毒的引物和探针组合。本实施例通过对NCBI数据库中HzNV-1所有分离株（包括Accession: NC_074969.1和Accession:AF451898.1）共2条完整的的基因序列做同源性比对，设计出1组实时定量PCR的正反向引物以及探针，所述引物和探针组合能够高效、准确地检测出所有类型的HzNV DNA，并且不受大量背景细胞DNA的影响。
引物和探针如下所示：
（正向引物1）SEQ ID NO:1：GAGGTTCAATGCAATCCGGC；
（反向引物1）SEQ ID NO:2：TCTGACCAACGGTAGCGAAC；
（探针1）SEQ ID NO:3：FAM- CGAAACGGCCGTGCACACCG ATGACG-MGB；
所述正向引物和反向引物扩增的目的片段的序列为SEQ ID NO:4所示；
SEQ ID NO:4：
CTCAACGAAAAGTATCCATTCTTGGCGTCGCACTTGAAAGTCAACGTCAGAGCGGCCACCGATGCCGATTATTACATTCCACCGGCAATGGCCTCCGAGGCCATATTCGTAGAGGCAGAGATTACAAAACAATTGTGCGAGAGCATTTCGTGCAACTCGTCCGGTGTGCACGGACCCTGCAAAAAGACGGATGCGGCCAGCTACTATAGATTGGGCGAGAGTGAAAACTTTGAGGTTCAATGCAATCCGGCCTGCTTCCACTTGTTCGAAACGGCCGTGCACACCGATGACGGTACCGACAAGCCACACAACGTTCGCTACCGTTGGTCAGAGACTAGCAACACTTGCAATATCGTACCTTTTGCAGCCACCTGGATGGAGATTCCCCGGTATCGGTCCAGTGAACTGTACGCGCCTAGGCTAAACGATCTCGACACCGGCTTTGACTATGAGCCGTCCACGGACACGTATCACTTTAACAAATACTATTGCGACGTTTA。
对比例1
本对比例提供一种检测猴玉米夜蛾HzNV-1病毒的引物和探针组合。所述引物和探针如下所示：
正向引物2（SEQ ID NO:5）：GTTCAATGCAATCCGGCCTG；
反向引物2（SEQ ID NO:6）：CATCCAGGTGGCTGCAAAAG；
正向引物3（SEQ ID NO:7）：TCACGTTCTGGGATCCGTTG；
反向引物3（SEQ ID NO:8）：AGGAACGAGCACACGTAGTC；
正向引物4（SEQ ID NO:9）：ACTGCTCACGTTCTGGGATC；
反向引物4（SEQ ID NO:10）：ACCGGTCGATTGGTCTTGAG；
探针2（SEQ ID NO:11）：FAM- CACGCCCGACTACCTGCACCAGCTG- MGB；
迷你基因2（SEQ ID NO:12）:
GAACTAGTGTTGGGTGCATCGTTCAAAGTGGCCGTACGAGACTTGGTGGTACCGTTGACGGTGCGCAGTCTGGGCACGATCGGCGTCTACCTGACCAAGAGTCTGGCCATGGCCTCGACCGGTGTGGGTGTAGTCTTGCTGATAACGCAACTCTTTAGCATACTGCTCACGTTCTGGGATCCGTTGGGTTTCAACAACATGTACACGCCCGACTACCTGCACCAGCTGTACGAAAACTCAAAGATGGCGTTGCGCTCTCAGCTCAAGACCAATCGACCGGTGCTGACGTTCGACTACGTGTGCTCGTTCCTATTGACCGAGGAGGATTTGTTCGATGCCAGCATAGAATCGTACACATACACGTATCGCTACTTGGACGCCCTAGAAGTCAACTCGGACGGAGCTCGAATCAACAAGGGCAACGTGATCGATGTGGGCTCGATAGAGTTT。
实施例2
本实施例提供一种检测玉米夜蛾HzNV-1病毒的试剂盒，所述试剂盒包括实施例1所述的检测玉米夜蛾HzNV-1病毒的引物和探针组合、病毒核酸标准品和荧光定量PCR反应试剂。
所述荧光定量PCR反应试剂包括：Taqman Universal PCR Master Mix （2X）、sdH2O（DNAse&RNAse for free）。
所述病毒核酸标准品为包含靶序列的DNA，在使用时梯度稀释后成为每5 μL含有1×105，1×104，1×103，1×102及10个靶序列拷贝的标准样品。
实施例3
本实施例使用实施例2所述的检测玉米夜蛾HzNV-1病毒的试剂盒对玉米夜蛾HzNV-1病毒核酸进行检测。检测的具体步骤如下所示：
（1）采集并处理待测样品，配制荧光定量PCR体系；荧光定量PCR体系如下表1所示。
表1
所述病毒核酸标准品的浓度梯度：每5 μL含有1×105，1×104，1×103，1×102及10个靶序列拷贝的标准样品。
待测样品中包含包括100 拷贝病毒核酸标准品。
同步配制干扰实验的PCR体系。在干扰实验中，组1为背景检测，0.5 μg HEK293，0.5 μg Sf9和0.5 μg Vero细胞总DNA作为背景DNA加入反应体系中。组2为干扰检测，0.5 μg HEK293，0.5 μg Sf9和0.5 μg Vero细胞总DNA与100拷贝病毒核酸标准品一同加入反应体系中。
（2）采用ABI 7500实时PCR系统对待测样品和病毒核酸标准品进行荧光定量PCR反应，得到待测样品和病毒核酸标准品的荧光信号，对荧光信号进行数据处理，得到Ct值及扩增曲线。荧光定量PCR反应程序如下所示：
步骤1：95℃，10 min；步骤2：95℃，15 sec；步骤3：60℃，1 min；步骤2和步骤3，40个循环。
（3）根据病毒核酸标准品的浓度和Ct值，绘制荧光定量标准曲线，根据荧光定量标准曲线对待测样品进行定性和定量检测。
病毒核酸标准品的检测结果如图1所示，图中数字（10-105）为模板拷贝数，结果表示检测体系可检测到10拷贝的模板。
试验结果：（标准曲线的方程：Y=-3.143391lgX+35.571888），（R2：0.997486）。
结果分析：标准曲线显示检测体系可检测到10拷贝的模板。在干扰实验中，0.5 μgHEK293，0.5 μg SF9和0.5 μg Vero细胞总DNA作为背景DNA加入反应体系中，没有检测到荧光信号；将100拷贝的病毒核酸标准品掺入到0.5 μg HEK293，0.5 μg SF9和0.5 μg Vero细胞总DNA中，可以正常检出。
实施例4
本实施例分别使用实施例1和对比例1中的引物探针进行检测，对比不同引物探针的检测效果。检测的具体步骤参照实施例3。
荧光定量PCR体系参照实施例3所示，待测样品为掺入100拷贝病毒核酸标准品的0.5 μg HEK293、0.5 μg SF9和0.5 μg Vero细胞总DNA。分别用实施例1和对比例1中的引物探针进行检测。
荧光定量PCR反应的扩增程序如下所示：
步骤1：95℃，10 min；步骤2：95℃，15 sec；步骤3：60℃，1 min；步骤2和步骤3，40个循环。
试验结果：如图2和图3所示，使用实施例1中的引物探针进行检测，产物荧光强度平均为约3.60单位，而使用对比例1中的引物探针进行检测，产物荧光强度只有约2.75单位，说明对比例1中的引物探针对目的序列的扩增被细胞DNA背景所抑制。
实施例5
本实施例与实施例3的区别仅在于正，反引物终浓度改为700 nM。
试验结果：如图2和图4所示，使用实施例3中的正，反引物终浓度进行检测，产物荧光强度平均为约3.60单位，而使用实施例5中的正，反引物终浓度进行检测，产物荧光强度只有约3.40单位。说明实施例3中的正，反引物终浓度优于实施例5中的正，反引物终浓度。
实施例6
本实施例与实施例3的区别仅在于正，反引物终浓度改为1000 nM。
试验结果：如图2和图5所示，使用实施例3中的正，反引物终浓度进行检测，产物荧光强度平均为约3.60单位，而使用实施例6中的正，反引物终浓度进行检测，产物荧光强度只有约3.40单位。说明实施例3中的正，反引物终浓度优于实施例6中的正，反引物终浓度。
实施例7
本实施例与实施例3的区别仅在于探针终浓度改为200 nM。
实验结果：如图2和图6所示，使用实施例3中探针终浓度进行检测，产物荧光强度平均为约3.60单位，而使用实施例7中探针终浓度进行检测，产物荧光平均强度只有约2.50单位。说明实施例3中的探针浓度优于实施例7中的探针浓度。
实施例8
本实施例与实施例3的区别仅在于探针终浓度改为300 nM。
实验结果：如图2和图7所示，使用实施例3中探针终浓度进行检测，产物荧光强度平均为约3.60单位，而使用实施例7中探针终浓度进行检测，产物荧光平均强度有约3.60单位。然而，实施例8中的直线方程为：Y = -2.976840X+35.021656；R2 = 0.978916。说明实施例3中的探针浓度优于实施例8中的探针浓度。
实施例9
本实施例与实施例3的区别仅在于荧光定量PCR反应的程序改为步骤3：55℃，1min。
实验结果：如图2和图8所示，使用实施例3中的荧光定量PCR反应程序进行检测，产物荧光强度平均为约3.60单位，而使用实施例9中的荧光定量PCR反应程序进行检测，产物荧光平均强度只有约1.50单位。说明实施例3中的荧光定量PCR反应的程序优于实施例9中的荧光定量PCR反应的程序。
实施例10
本实施例与实施例3的区别仅在于荧光定量PCR反应的程序改为步骤3：65℃，1min。
实验结果：如图2和图9所示，使用实施例3中的荧光定量PCR反应程序进行检测，产物荧光强度平均为约3.60单位，而使用实施例10中的荧光定量PCR反应程序进行检测，产物荧光平均强度只有约2.60单位。说明实施例3中的荧光定量PCR反应的程序优于实施例10中的荧光定量PCR反应的程序。
综上所述，本发明提供了一种检测猴玉米夜蛾HzNV-1病毒的引物探针组合，采用所述引物探针组合能够对多种玉米夜蛾HzNV-1病毒进行检测，检测效率高，准确度高。本发明提供的检测HzNV-1病毒的方法可以检测出低至10个病毒基因组拷贝的样品，具有高灵敏度和高覆盖率。而且本发明的检测方法不会被细胞总DNA所干扰，特别适合于检测含细胞的样品中的病毒污染，在生物药物开发的质量控制中具有重要的应用前景。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (10)

1.一种检测玉米夜蛾HzNV-1病毒的引物和探针组合，其特征在于，所述引物和探针组合为检测玉米夜蛾HzNV-1病毒pag1基因的引物和探针组合；
所述引物和探针组合为：正向引物、反向引物和探针；
所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的序列，所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的序列；
所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示的序列。
2.根据权利要求1所述的检测玉米夜蛾HzNV-1病毒的引物和探针组合，其特征在于，所述探针的5’端含有荧光基团，3’端含有淬灭基团；
所述荧光基团为FAM、VIC或HEX中任意一种或至少两种的组合；
所述淬灭基团为MGB、BHQ1或TAMRA中任意一种或至少两种的组合；
所述正向引物和反向引物扩增的目的片段的序列如SEQ ID NO:4所示的序列。
3.一种检测玉米夜蛾HzNV-1病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1或2所述的检测玉米夜蛾HzNV-1病毒的引物和探针组合。
4.根据权利要求3所述的检测玉米夜蛾HzNV-1的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括病毒核酸标准品和荧光定量PCR反应试剂。
5.根据权利要求4所述的检测玉米夜蛾HzNV-1病毒的试剂盒，其特征在于，所述病毒核酸标准品包括目的片段的DNA片段，所述目的片段的DNA片段的序列如SEQ ID NO:4所示的序列。
6.根据权利要求4所述的检测玉米夜蛾HzNV-1病毒的试剂盒，其特征在于，所述荧光定量PCR反应试剂包括酶液和反应缓冲液，所述酶液包括DNA聚合酶。
7.一种以非疾病诊断和/或治疗为目的的检测玉米夜蛾HzNV-1病毒的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
（1）采集并处理待测样品，配制荧光定量PCR体系；
（2）对待测样品和病毒核酸标准品进行荧光定量PCR反应，得到待测样品和病毒核酸标准品的荧光信号，对荧光信号进行数据处理，得到Ct值及扩增曲线，所述荧光定量PCR反应的反应体系包括权利要求1或2所述的检测玉米夜蛾HzNV-1病毒的引物和探针组合；
（3）根据病毒核酸标准品的浓度和Ct值，绘制荧光定量标准曲线，根据荧光定量标准曲线对待测样品进行定性和定量检测。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述荧光定量PCR体系按终浓度计包括：1×的Taqman Universal PCR Master Mix、800-900 nM的正向引物、800-900 nM的反向引物和220-250 nM的探针；
所述荧光定量PCR反应的程序包括：步骤1：94-96℃，8-12 min；步骤2：94-96℃，13-17sec；步骤3：58-62℃，0.8-1.2 min；步骤2和步骤3，40-42个循环。
9.一种检测玉米夜蛾HzNV-1病毒的系统，其特征在于，所述系统包括样品制备模块、检测模块和分析模块；
所述样品制备模块用于执行包括：
采集并处理待测样品，配制荧光定量PCR体系，所述PCR体系包括权利要求1或2所述的检测玉米夜蛾HzNV-1病毒的引物和探针组合；
所述荧光定量PCR体系按终浓度计包括：1×的Taqman Universal PCR Master Mix、800-900 nM的正向引物、800-900 nM的反向引物和220-250 nM的探针；
所述荧光定量PCR反应的程序包括：步骤1：94-96℃，8-12 min；步骤2：94-96℃，13-17sec；步骤3：58-62℃，0.8-1.2 min；步骤2和步骤3，40-42个循环；
所述检测模块用于执行包括：
对荧光定量PCR体系进行荧光定量PCR反应；
所述分析模块用于执行包括：根据荧光定量标准曲线，对待测样品进行定性和定量检测。
10.权利要求1或2所述的检测玉米夜蛾HzNV-1病毒的引物和探针组合、权利要求3-6中任一项所述的检测玉米夜蛾HzNV-1病毒的试剂盒或权利要求9所述的检测玉米夜蛾HzNV-1病毒的系统中的任意一种或至少两种的组合在制备检测玉米夜蛾HzNV-1病毒的产品中的应用。
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