RU2795016C1

RU2795016C1 - Олигонуклеотиды для определения мутации S:delVYY143-145 SARS-CoV-2

Info

Publication number: RU2795016C1
Application number: RU2022126130A
Authority: RU
Inventors: Анна Сергеевна Есьман; Константин Олегович Миронов; Анна Сергеевна Черкашина; Светлана Андреевна Саламайкина; Анна Геннадьевна Голубева; Василий Геннадьевич Акимкин
Filing date: 2022-10-06
Publication date: 2023-04-27

Abstract

Изобретение относится к биотехнологии. Описан набор праймеров и зонда для определения мутации S:delVYY143-145 SARS-CoV-2, имеющий следующий состав: прямой праймер del9-F - SEQ ID NO: 1; обратный праймер del9-R - SEQ ID NO: 2; флуоресцентный зонд del9-Z3 - SEQ ID NO: 3. Синтезированные олигонуклеотиды SEQ ID NO NO: 1-3 не дают перекрестных реакций с другими протестированными образцами, амплифицируют заданный участок со 100% специфичностью и позволяют определять наличие или отсутствие в образцах биологического материала значимой мишени S:delVYY143-145. 2 з.п. ф-лы, 1 табл., 5 пр.

Description

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к определению мутации S:delVYY143-145 SARS-CoV-2 с использованием полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (ПЦР-РВ) и может применяться для идентификации геновариантов S ARS-CoV-2 при эпидемиологических исследованиях.

Коронавирусная инфекция (COVID-19) это инфекционное заболевание, вызванное SARS-CoV-2. Вирус передается от человека к человеку воздушно-капельным путем. Изменения в структуре генома SARS-CoV-2 приводят к возникновению вариантов, которые ВОЗ обозначила как вызывающие интерес (VOIs, Variants of Interest), вызывающие озабоченность (VOCs, Variants of Concern) и линии VOC под мониторингом (VOC lineages under monitoring (VOC-LUM). Определение мутаций в геноме SARS-CoV-2 и их классификация на VOIs и VOCs и VOC-LUM является важным элементом молекулярно-генетического мониторинга штаммов новой коронавирусной инфекции. Мутации, детекция которых необходима, перечислены в докладах Технической консультативной группы по эволюции вируса SARS-CoV-2 (TAG-VE) ВОЗ [https://www.who.int/publications/m/item/terms-of-reference-for-the-technical-advisory-group-on-sars-cov-2-virus-evolution-(tag-ve)].

Для определения геновариантов вируса и проведения молекулярно-генетического мониторинга SARS-CoV-2 используются методы полногеномного и фрагментного секвенирования, которые являются дорогостоящими и трудоемкими. С целью выявления SARS-CoV-2 Всемирной организацией здравоохранения предложено выделение РНК возбудителя с последующим проведением полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) [https://www.who.int/emergencies/diseases/novel-coronavirus-2019/technical-guidance/laboratory-guidance].

Известны протоколы исследования направлены на выявление специфических нуклеотидных последовательностей в генах и межгенных промежутках:

- ORF 1ab, N [http://ivdc.chinacdc.cn/kyjz/202001/t20200121_211337.html];

- RdRP, Е, N [https://www.who.int/docs/default-source/coronaviruse/protocol-v2-1.pdf?sfvrsn=a9ef618 с_2];

- ORF 1b-nsp14, N [https://www.who.int/docs/default-source/coronaviruse/peiris-protocol-16-1-20.pdf?sfvrsn=af1aac73_4];

- S, N [https://www.who.int/docs/default-source/coronaviruse/method-niid-20200123-2.pdf?sfvrsn=fbf75320_7];

- N [https://www.who.int/docs/default-source/coronavimse/conventional-rt-pcr-followed-by-sequencing-for-detection-of-ncov-rirl-nat-inst-health-t.pdf?sfvrsn=42271c6d_4];

- N [https://www.fda.gov/media/134922/download, https://www.who.int/docs/default-source/coronaviruse/uscdcrt-pcr-panel-primer-probes.pdf?sfvrsn=fa29cb4b_2];

- RdRP [https://www.who.int/docs/default-source/coronaviruse/real-time-rt-pcr-assays-for-the-detection-of-sars-cov-2-institut-pasteur-paris.pdf?sfvrsn=3662fcb6_2].

При этом, проведенный анализ полногеномных нуклеотидных последовательностей SARS-CoV-2 показал частое наличие мутаций (в особенности делеций) в геномах данного коронавируса. В связи с этим основным недостатком приведенных выше аналогов является риск получения ложно отрицательных результатов ОТ-ПЦР, обусловленных блокированием реакции при наличии мутаций в области амплифицируемого участка.

Также из уровня техники известны мультиплексные наборы реагентов для определения геновариантов SARS-CoV-2 методом ПЦР, разработаны несколькими компаниями-производителями. Предложенная компанией ThermoFisher Scientific методика основана на использовании зондов типа TaqMan для определения сразу нескольких мутаций, специфичных для разных геновариантов [SARS-CoV-2 Variants Detection Using TaqMan SARS-CoV-2 Mutation Panel Molecular Genotyping Assays. Puja Neopane, Jerome Nypaver, Rojeet Shrestha, Safedin Sajo Beqaj, https://doi.org/10.2147/IDR.S335583]. Наборы, в которых предусмотрена мультиплексная ПЦР-РВ после проведения обратной транскрипции отличаются удобством для пользователя. Известны тест-системы и наборы реагентов для выявления для выявления SARS-CoV-2 геномов линии В. 1.1.529 (Omicron), например: патент RU 2772362, дата подачи 31.12.2021, дата публикации 19.05.2022; патент IN202221016568, дата подачи 24.03.2022, дата регистрации 08.04.2022. Однако, использование данных наборов не предполагает быстрой возможности замены мишеней для детекции новых геновариантов, содержащих миссенс мутации или замены.

Детекция дополнительных специфичных для возникающих геновариантов мишеней, так же, как и исключение из анализа мишеней для циркулирующих геновариантов позволяет повысить эффективность лабораторного исследования в целом. В связи с этим существует потребность в разработке олигонуклеотидов для выявления мутации S:delVYY143-145 в биологических образцах с подтвержденным наличием РНК SARS-CoV-2: праймеров и флуоресцентно-меченого зонда для проведения ПЦР-РВ.

Технический результат заявляемого изобретения направлен на выявление мутации S:delVYY143-145 в биологических образцах с подтвержденным наличием РНК SARS-CoV-2 с высокой степенью специфичности в образцах биологического материала посредством таких олигонуклеотидов - праймеров и флуоресцентно-меченого зонда, которые позволяют эффективно определять геновариант SARS-CoV-2 с использованием широко доступных методик и доступных материалов.

Технический результат достигается за счет применения химически-синтезированных олигонуклеотидов для определения наличия мутации S:delVYY143-145 в биологическом образце с подтвержденным наличием РНК SARS-CoV-2, имеющих следующий олигонуклеотидный состав:

Прямой праймер del9-F - SEQ ID NO: 1,

Обратный праймер del9-R - SEQ ID NO: 2,

Флуоресцентный зонд del9-Z3 - SEQ ID NO: 3.

Праймеры представляют собой последовательности олигонуклеотидов для амплификации фрагмента, содержащего мутацию S:delVYY143-145 в биологических образцах с подтвержденным наличием РНК SARS-CoV-2, флуоресцентно-меченый конформационно-блокированный зонд является олигонуклеотидом, содержащим флуорофор и гаситель флуоресценции, позволяющим детектировать амплифицированный фрагмент.

Заявляемые олигонуклеотиды разработаны на основе проведенного анализа последовательностей S-гена SARS-CoV-2, (взятых из базы данных NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/), в результате выбран фрагмент для детекции мутации S:delVYY143-145 к которому выбраны праймеры и зонд для амплификации 208/211 пар оснований: прямой праймер del9-F - SEQ ID NO: 1; обратный праймер del9-R - SEQ ID NO: 2 и флуоресцентный зонд del9-Z3- SEQ ID NO: 3.

Заявляемое изобретение является результатом работы в рамках совершенствования молекулярно-генетического мониторинга вариантов SARS-CoV-2, проведенной в ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора (Москва, Россия).

Для подбора целевых последовательностей - мест посадки олигонуклеотидов, используют фрагменты референсных геномов из базы данных NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/), как SARS-CoV-2 дикого типа, так и тех геновариантов, в которых встречается мутация S:delVYY143-145 (Omicron (B.1.1.529)). Для поиска консервативных последовательностей применяют современные алгоритмы in silico анализа нуклеотидных последовательностей и программы, находящиеся в открытом доступе, включая AlignX, SnapGene Viewer, MEGA, Unipro UGENE. Составляют перечень мутаций, характерных для геновариантов. Затем подбирают олигонуклеотидные последовательности прямого и обратного праймеров, а также флуоресцентно-меченого зонда. Для детекции образцов, содержащих мутацию S:delVYY143-145 используют канал для детекции флуорофора FAM. Упомянутые олигонуклеотидные последовательности приведены в Таблице 1.

Анализ заявляемых последовательностей с использованием ресурса Primer BLAST продемонстрировал, что прямой праймер del9-F (SEQ ID NO: 1) и обратный праймер del9-R (SEQ ID NO: 2) амплифицируют участок, в котором располагается мутация S:delVYY143-145 со 100% специфичностью.

В качестве биологического материала используются мазки/отделяемое носоглотки и ротоглотки, с подтвержденным наличием РНК SARS-CoV-2 (например, после проведения анализа на наборе реагентов АмплиСенс® COVID-19-FL).

Выделение РНК из биологического материала проводят в соответствии с МУ 1.3.2569-09 «Организация работ лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности». Выделение РНК из биологического материала производят с помощью комплекта реагентов в соответствии с инструкцией производителя. Для выделения РНК может быть использован комплект реагентов «РИБО-преп» (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия) или любой аналогичный набор для выделения РНК. Оптимальная концентрация РНК - 10³ - 10⁵ копий в 10 мкл. Реакцию обратной транскрипции (ОТ) проводят с помощью комплекта реагентов в соответствии с инструкцией производителя. Для проведения реакции ОТ может быть использован комплект реагентов «РЕВЕРТА-L» (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Москва, Россия) или любой аналогичный набор. Готовый препарат кДНК может храниться при температуре от 2 до 8°С в течение недели, при температуре от минус 24 до минус 16°С в течение 6 мес.и при температуре не выше минус 68°С в течение года.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) - это эффективный способ получения in vitro большого числа копий специфических нуклеотидных последовательностей. Их амплификация осуществляется в ходе трехэтапного циклического процесса.

Процесс ПЦР-амплификации заключается в многократном повторении процессов денатурации, ренатурации и синтеза. Денатурация (95°С) - термическое воздействие на молекулу ДНК с целью получения одноцепочечной структуры. Ренатурация (55-60°С)-праймеры, добавленные в реакцию спариваются с разделенными цепями. Синтез (70-75°С) - синтез второй цепи ДНК. Каждый цикл длится 3-5 мин.

Анализ данных проводится на основе детекции амплификатором уровня флуоресцентного сигнала испускаемого интеркалирующим красителем. При увеличении числа копий анализируемого участка детектируется экспоненциальный рост флуоресцентного сигнала. В результате наблюдается S-образная кривая в случае наличия специфичного флуоресцентному зонду сигнала, или ее отсутствие, в случае неспецифичной для зонда последовательности. Анализ кривых позволяет судить об отсутствии или наличии мутации в исследуемых образцах.

ПЦР-РВ проводится с применением заявляемых, представленных в Таблице 1, олигонуклеотидов праймеров и зонда, для детекции мутации S:delVYY143-145 SARS-CoV-2.

ПЦР-РВ проводят при следующих условиях: Общий объем реакционной смеси - 25 мкл. Компоненты ПЦР смешиваются следующим образом:

(a) 10 мкл смеси, содержащей:

- олигонуклеотидные праймеры SEQ ID NO NO: 1, 2 - по 0,7 мМ;

- флуоресцентный зонд SEQ ID NO: 3 - 0,25 мМ;

- dNTPs - 0,44 мМ.

(b) реактив, содержащий рекомбинантный фермент Taq ДНК-полимеразу, например, 0,5 мкл «Полимераза TaqF» (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Москва, Россия) или любой аналогичный коммерческий набор в соответствии с инструкцией производителя.

(c) ПЦР-буфер, содержащий MgCl₂, например, 5,0 мкл ПЦР-буфера «ОТ-ПЦР-смесь-2 FEP/FRT» (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Москва, Россия) или любого аналогичного коммерческого набора в соответствии с инструкцией производителя.

(d) полученная методом обратной транскрипции кДНК - 10 мкл. Амплификацию проводят на приборе с возможностью флуоресцентной детекции, например, «Rotor-Gene Q» («Qiagen», Германия) или на любом другом приборе с 2-5 каналами детекции в соответствии с инструкцией производителя.

Амплификацию проводят по следующей программе: 1 цикл 95°С в течение 15 минут, 45 циклов при температуре 95°С - 10 секунд / 60°С - 20 секунд. Детекция флуоресценции проводится на этапе 60°С по каналу для флуорофора FAM.

Для анализа результатов задают пороговую линию, соответствующую величине 10% от среднего сигнала флуоресценции образца с наличием мутации S:delVYY143-145. Образцы, для которых кривые флуоресценции пересекают пороговую линию, и, при этом кинетика накопления флуоресцентного сигнала является экспоненциальной, являются положительными, то есть содержат мутацию S:delVYY143-145 SARS-CoV-2.

Реализация заявляемого изобретения поясняется следующими примерами:

Пример 1. Получение олигонуклеотидов для определения мутации S:delVYY143-145 SARS-CoV-2.

Для подбора последовательностей-мишеней - мест посадки олигонуклеотидов использованы фрагменты референсных геномов из базы данных NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) как SARS-CoV-2 дикого типа, так и тех геновариантов, в которых встречается мутация S:delVYY143-145 (Omicron (В. 1.1.529), refseq OL672836 (NCBI)). Для поиска мутаций использованы современные алгоритмы in silico анализа нуклеотидных последовательностей и программы, находящиеся в открытом доступе, включая AlignX, Unipro UGENE, олигокалькулятор (Oligo Calculators) Integrated DNA Technologies, Inc. (Oligo Analyzer (idtdna.com)), на основании которых подобраны олигонуклеотидные последовательности прямого del9-F и обратного del9-R праймеров, а также флуоресцентный зонд del9-Z3.

Анализ упомянутых последовательностей с использованием ресурса Primer BLAST показал, что прямой del9-F и обратный del9-R праймеры амлифицируют участок с мутацией S:delVYY143-145 со 100% специфичностью.

Олигонуклеотиды для определения мутации S:delVYY143-145 SARS-CoV-2 прямой праймер del9-F, обратный праймер del9-R, флуоресцентный зонд del9-Z3, представлены уникальными последовательностями SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 3 соответственно.

Пример 2. Детекция мутации S:delVYY143-145 SARS-CoV-2 методом ПЦР-РВ.

Определение мутации S:delVYY143-145 SARS-CoV-2 проводят методом ПЦР-РВ при следующих условиях:

Общий объем реакционной смеси - 25 мкл. Компоненты ПЦР смешиваются следующим образом:

(a) 10 мкл смеси, содержащей:

- олигонуклеотидные праймеры: SEQ ID NO:1, SEQ ID NO: 2 - по 0,7 мМ;

- флуоресцентный зонд: SEQ ID NO: 3 - 0,25 мМ;

- dNTPs - 0,44 мМ.

(b) 0,5 мкл реактива «Полимераза TaqF» (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия), содержащего рекомбинантный фермент Taq ДНК-полимеразу.

(c) 5,0 мкл ПЦР-буфера «ОТ-ПЦР-смесь-2 FEP/FRT» (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия), содержащего MgCl₂.

(d) полученная после реакции обратной транскрипции («РЕВЕРТА-L» ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия) кДНК 10 мкл.

ПЦР-РВ проводили с флуоресцентной детекцией на приборе с 5 каналами детекции - «Rotor-Gene Q» («Qiagen», Германия).

Подготовленный описанным способом материал, содержащий уникальные олигонуклеотидные последовательности S-гена, используют для определения мутации S:delVYY143-145 SARS-CoV-2 в образцах биологического материала.

Пример 3. Обнаружение мутации S:delVYY143-145 SARS-CoV-2 в образцах биологического материала.

Для определения мутации S:delVYY143-145 SARS-CoV-2 выбрано 95 образцов, с подтвержденным наличием РНК SARS-CoV-2.

Для исследования использовали клинический материал - мазки/отделяемое носоглотки и ротоглотки, содержащие РНК SARS-CoV-2.

Выделение РНК из биологического материала проводили в соответствии с МУ 1.3.2569-09 «Организация работ лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности».

Выделение РНК осуществляли методом нуклеопреципитации с применением набора реагентов «РИБО-преп» (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Москва, Россия) в соответствии с инструкцией к набору.

Обратную транскрипцию проводили с применением набора реагентов «РЕВЕРТА-L» (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Москва, Россия) в соответствии с инструкцией к набору.

Наличие РНК вируса SARS-CoV-2 подтверждено лабораторно с применением набора реагентов АмплиСенс® COVID-19-FL (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Москва, Россия). Чувствительность данного набора в отношении мазков/отделяемых носоглотки и ротоглотки, согласно инструкции, составляет 1*10⁴. Специфичность- 100%.

ПЦР-РВ проводили в условиях, описанных в Примере 2, с использованием уникальных олигонуклеотидных последовательностей SEQ ID NO: 1-3.

Амплификацию проводили на приборе «Rotor-Gene Q» («Qiagen», Германия) по следующей программе: 1 цикл 95°С в течение 15 минут, 45 циклов при температуре 95°С -10 секунд / 60°С - 20 секунд. Детекция флуоресценции проводилась на этапе 60°С по каналу для флуорофора FAM. Для анализа результатов задали пороговую линию, соответствующую величине 10% от среднего сигнала флуоресценции образца с наличием мутации S:delVYY143-145. Для 57 образцов кривая флуоресценции пересекла пороговую линию и, при этом кинетика накопления флуоресцентного сигнала была экспоненциальной, что свидетельствует о том, что данные образцы содержат мутацию S:delVYY143-145 SARS-CoV-2.

Для данных 57 образцов наличие мутации S:delVYY143-145 SARS-CoV-2 подтверждено фрагментным секвенированием с использованием метода секвенирования по Сэнгеру. Фрагментное секвенирование выполнялось на генетическом анализаторе ABI 3500xL (Applied Biosystems, США), выравнивание и анализ полученных последовательностей выполнялось с помощью программы AlignX («Thermo Fisher Scientific», США). Отсутствие мутации в 38 образцах без флуоресцентного сигнала также подтверждено фрагментным секвенированием.

Таким образом, из всей выборки выявлено 57 образцов, содержащих мутацию S:delVYY143-145 SARS-CoV-2.

Пример 4. Обнаружение мутации S:delVYY143-145 SARS-CoV-2 в образцах биологического материала.

Для определения мутации S:delVYY143-145 SARS-CoV-2 выбрано 96 образцов, с подтвержденным наличием РНК SARS-CoV-2.

Амплификацию проводили на приборе «Real-time CFX96 Touch» («Bio-Rad», США) по следующей программе: 1 цикл 95°С в течение 15 минут, 45 циклов при температуре 95°С - 10 секунд / 60°С - 20 секунд. Детекция флуоресценции проводилась на этапе 60°С по каналу для флуорофора FAM. Для анализа результатов задали пороговую линию, соответствующую величине 10% от среднего сигнала флуоресценции образца с наличием мутации S:delVYY143-145. Для 81 образца кривая флуоресценции пересекла пороговую линию и, при этом кинетика накопления флуоресцентного сигнала была экспоненциальной, что свидетельствует о том, что данные образцы содержат мутацию S:delVYY143-145 SARS-CoV-2

Для указанного 81 образца наличие мутации S:delVYY143-145 SARS-CoV-2 подтверждено фрагментным секвенированием с использованием метода секвенирования по Сэнгеру. Фрагментное секвенирование выполнялось на генетическом анализаторе ABI 3500xL (Applied Biosystems, США), выравнивание и анализ полученных последовательностей выполнялось с помощью программы AlignX («Thermo Fisher Scientific», США). Отсутствие мутации в 15 образцах без флуоресцентного сигнала также подтверждено фрагментным секвенированием.

Таким образом, из всей выборки выявлено 81 образец, содержащих мутацию S:delVYY143-145 SARS-CoV-2.

Пример 5. Обнаружение мутации S:delVYY143-145 SARS-CoV-2 в образцах биологического материала.

Для определения мутации S:delVYY143-145 SARS-CoV-2 выбрано 7 образцов, с подтвержденным наличием РНК SARS-CoV-2.

Наличие РНК вируса SARS-CoV-2 подтверждено лабораторно с применением набора реагентов АмплиСенс® COVID-19-FL (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Москва, Россия). Чувствительность данного набора в отношении мазков/отделяемых носоглотки и ротоглотки, согласно инструкции, составляет 1*10⁴ копий/мл. Специфичность - 100%.

Амплификацию проводили на приборе «Rotor-Gene Q» («Qiagen», Германия) по следующей программе: 1 цикл 95°С в течение 15 минут, 45 циклов при температуре 95°С -10 секунд / 60°С - 20 секунд. Детекция флуоресценции проводилась на этапе 60°С по каналу для флуорофора FAM. Для анализа результатов задали пороговую линию, соответствующую величине 10% от среднего сигнала флуоресценции образца с наличием мутации S:delVYY143-145. Кривая флуоресценции не пересекла пороговую линию, что свидетельствовало о том, что в выборке отсутствуют образцы, содержащие мутацию S:delVYY143-145 SARS-CoV-2.

Наличие других мутаций SARS-CoV-2 в данных 7 образцах, а также отсутствие мутации S:delVYY143-145 подтверждено фрагментным секвенированием с использованием метода секвенирования по Сэнгеру. Фрагментное секвенирование выполнялось на генетическом анализаторе ABI 3500xL (Applied Biosystems, США), выравнивание и анализ полученных последовательностей выполнялось с помощью программы AlignX («Thermo Fisher Scientific», США).

Заявляемое изобретение позволяет выявлять мутацию S:delVYY143-145 в биологических образцах с подтвержденным наличием РНК SARS-CoV-2. Синтезированные олигонуклеотиды SEQ ID NO NO: 1-3 не дают перекрестных реакций с другими протестированными образцами, амлифицируют заданный участок со 100% специфичностью и позволяют определять наличие или отсутствие в образцах биологического материала значимой мишени S:delVYY143-145.

Claims

1. Набор праймеров и зонда для определения мутации S:delVYY143-145 SARS-CoV-2, имеющий следующий состав:

прямой праймер del9-F - SEQ ID NO: 1;

обратный праймер del9-R - SEQ ID NO: 2;

флуоресцентный зонд del9-Z3 - SEQ ID NO: 3.

2. Набор праймеров и зонда для определения мутации S:delVYY143-145 SARS-CoV-2 по п. 1, где для создания прямого и обратного праймеров, флуоресцентного зонда используют фрагменты референсных геномов SARS-CoV-2 дикого типа, Omicron (B.1.1.529).

3. Набор праймеров и зонда для определения мутации S:delVYY143-145 SARS-CoV-2 по п. 1, где флуоресцентный зонд является олигонуклеотидом, содержащим флуорофор FAM и гаситель флуоресценции BHQ1, позволяющий детектировать амплифицированный фрагмент.