RU2795018C1 - Олигонуклеотиды для определения мутации S:L452R SARS-CoV-2 - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к области биотехнологии. Описаны олигонуклеотиды для определения мутации S:L452R SARS-CoV-2 - прямой праймер 452F2, обратный праймер 452R2, флуоресцентный зонд S452Z, представлены уникальными последовательностями SEQ ID NO: 1-3 соответственно. При этом для создания прямого и обратного праймеров, флуоресцентного зонда используют фрагменты референсных геномов SARS-CoV-2 дикого типа, Delta (B.l.617.2), Kappa (В.1.617.1), (В.1.617.3), (С.36.3), Omicron (В.1.1.529). Синтезированные олигонуклеотиды SEQ ID NO NO: 1-3 не дают перекрестных реакций с другими протестированными образцами, амплифицируют заданный участок со 100% специфичностью и позволяют определять наличие или отсутствие в образцах биологического материала значимой мишени S:L452R. Изобретение используется для определения мутаций S:L452R SARS-CoV-2 методом полимеразной цепной реакции, проводимой в режиме реального времени, и может применяться для идентификации геновариантов SARS-CoV-2 при эпидемиологических исследованиях. 2 з.п. ф-лы, 1 табл., 5 пр.

Description

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к определению мутации S:L452R SARS-CoV-2 с использованием полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (ПЦР-РВ) и может применяться для идентификации геновариантов S ARS-CoV-2 при эпидемиологических исследованиях.

Коронавирусная инфекция (COVID-19) это инфекционное заболевание, вызванное SARS-CoV-2. Вирус передается от человека к человеку воздушно-капельным путем. Изменения в структуре генома SARS-CoV-2 приводят к возникновению вариантов, которые ВОЗ обозначила как вызывающие интерес (VOIs, Variants of Interest), вызывающие озабоченность (VOCs, Variants of Concern) и линии VOC под мониторингом (VOC lineages under monitoring (VOC-LUM). Определение мутаций в геноме SARS-CoV-2 и их классификация на VOIs и VOCs и VOC-LUM является важным элементом молекулярно-генетического мониторинга штаммов новой коронавирусной инфекции. Мутации, детекция которых необходима, перечислены в докладах Технической консультативной группы по эволюции вируса SARS-CoV-2 (TAG-VE) ВОЗ [https://www.who.int/publications/m/item/terms-of-referenct-for-the-technical-advisory-group-on-sars-cov-2-virus-evolution-(tag-ve)].

Для определения геновариантов вируса и проведения молекулярно-генетического мониторинга SARS-CoV-2 используются методы полногеномного и фрагментного секвенирования, которые являются дорогостоящими, трудоемкими методами. С целью выявления SARS-CoV-2 Всемирной организацией здравоохранения предложено выделение РНК возбудителя с последующим проведением полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) [https://www.who.int/emergencies/diseases/novel-coronavirus-2019/technical-guidance/laboratory-guidance].

Известны протоколы исследования направлены на выявление специфических нуклеотидных последовательностей в генах и межгенных промежутках:

- ORF1ab, N [http://ivdc.chinacdc.cn/kyjz/202001/t20200121_211337.html];

- RdRP, Е, N [https://www.who.int/docs/default-source/coronaviruse/protocol-v2-1.pdf?sfvrsn=a9ef618c_2];

- ORF1b-nspH, N [https://www.who.int/docs/default-source/coronaviruse/peiris-protocol-16-1-20.pdf?sfvrsn=af1aac73_4];

- S, N [https://www.who.int/docs/default-source/coronaviruse/method-niid-20200123-2.pdf?sfvrsn=fbf75320_7];

- N [https://www.who.int/docs/default-source/coronavimse/conventional-rt-pcr-followed-by-sequencing-for-detection-of-ncov-rirl-nat-inst-health-t.pdf?sfvrsn=42271c6d_4];

- N [https://www.fda.gov/media/134922/download, https://www.who.int/docs/default-source/coronaviruse/uscdcrt-pcr-panel-primer-probes.pdf?sfvrsn=fa29cb4b_2];

- RdRP [https://www.who.int/docs/default-source/coronaviruse/real-time-rt-pcr-assays-for-the-detection-of-sars-cov-2-institut-pasteur-paris.pdf?sfvrsn=3662fcb6_2].

При этом, проведенный анализ полногеномных нуклеотидных последовательностей SARS-CoV-2 показал частое наличие мутаций (в особенности делеций) в геномах данного коронавируса. В связи с этим основным недостатком приведенных выше аналогов является риск получения ложно отрицательных результатов ОТ-ПЦР, обусловленных блокированием реакции при наличии мутаций в области амплифицируемого участка.

Из уровня техники известен набор для обнаружения нового коронавируса и его варианта [Патент CN 113817868, 08.07.2021, 21.12.2021]. Описание содержит специфические праймеры и зонды, направленные на ген ORF1ab, ген N и эталонный ген S ARS-CoV-2, а также содержит специфические праймеры и зонды, направленные на один или несколько мутационных сайтов 69-70Del, L452R, E484K, E484Q и N501Y мутационных сайтов гена S SARS-CoV-2, 106/107/108del мутационных сайтов reHaNSP6, сайты мутаций P71L гена Е, сайты мутаций V82A гена ORF7A и сайты мутаций S253P гена ORF3A.

Также из уровня техники известен реагент обнаружения нуклеиновых кислот, комплект и метод обнаружения для нового варианта Delta коронавируса 2019 года [Патент CN 113774169, 18.09.2021, 10.12.2021]. Способ определяет применение специфических праймеров и зондов, которые предназначены для детекции Delta-варианта (Delta (В. 1.617.2)) S-белка, кодирующего гены T19R, L452R, T478K и P681R, а также может содержать одностадийный метод ОТ-ПЦР, положительный и отрицательный контрольные образцы.

Известен метод петлевой изотермической амплификации (LAMP) [Detection of S ARS-CoV-2 and the L452R spike mutation using reverse transcription loop-mediated isothermal amplification plus bioluminescent assay in real-time (RT-LAMP-BART). Takahiro Iijima, Shinnosuke Ando, Dai Kanamori, Kazumichi Kuroda, Tsutomu Nomura, Laurence Tisi, Paul E Kilgore, Neil Percy, Hikaru Kohase, Satoshi Hayakawa, Mitsuko Seki, Tomonori Hoshino. PMID: 35312732 PMCID: PMC8936440 DOI: 10.1371/journal.pone.0265748].

Также представлен метод детекции мутации S-белка S:L452R с использованием анализа плавления с высоким разрешением (HRM) [A screening strategy for identifying the dominant variant of SARS-COV-2 in the fifth peak of Kurdistan- Iran population using HRM and Probe-based RT-PCR assay. Mohammad Moradzad, Hasan Soltani, Hamid Salehi, Khaled Rahmani, Dariush Khateri, Mohammad Zaid Rahimi, Diman Az, Shohreh Fakhari. https://doi.org/10.1016/j.jviromet.2022.1145141.

При практической реализации описанных выше технических решений чувствительность была значительно ниже заявленной.

Мультиплексные наборы реагентов для определения геновариантов вируса SARS-CoV-2 методом ПЦР, разработаны несколькими компаниями-производителями. Предложенная компанией ThermoFisher Scientific методика основана на использовании зондов типа TaqMan для определения сразу нескольких мутаций, специфичных для разных геновариантов [Identifying SARS-CoV-2 Variants of Concern through saliva-based RT-qPCR by targeting recurrent mutation sites. Rachel E Ham, Austin R Smother, Rui Che, Keegan J Sell, Congyue Annie Peng, Delphine Dean. DOI: 10.1101/2022.03.02.22271785; Comparative Analysis of Five Multiplex RT-PCR Assays in the Screening of SARS-CoV-2 Variants. Vanessa De Pace, Bianca Bruzzone, Andrea Orsi, Valentina Ricucci, Alexander Domnich, Giulia Guarona, Nadia Randazzo, Federica Stefanelli, Enrico Battolla, Pier Andrea Dusi, Flavia Lillo, Giancarlo Icardi. https://doi.org/10.3390/microorganisms10020306; Emergency SARS-CoV-2 Variants of Concern: Novel Multiplex Real-Time RT-PCR Assay for Rapid Detection and Surveillance. Hsing-Yi Chung, Ming-Jr Jian, Chih-Kai Chang, Jung-Chung Lin, Kuo-Ming Yeh, Chien-Wen Chen, Shan-Shan Hsieh, Kuo-Sheng Hung, Sheng-Hui Tang, Cherng-Lih Perng, Feng-Yee Chang, Chih-Hung Wang, Hung-Sheng Shang. DOI: 10.1128/spectrum.02513-21; Realtime PCRmethod for simultaneous detection, quantitation and differentiation of capripoxviruses. Charles Euloge Lamien, Mamadou Lelenta, Wilfried Goger, Roland Silber, Eeva Tuppurainen, Mirta Matijevic, Antony George Luckins, Adama Diallo. DOI: 10.1016/j.jviromet.2010.10.014]. Наборы, в которых предусмотрена мультиплексная ПЦР-РВ после проведения обратной транскрипции отличаются удобством для пользователя. Однако, использование данных наборов не предполагает быстрой возможности замены мишеней для детекции новых геновариантов, содержащих миссенс мутации или замен.

Детекция дополнительных специфичных для возникающих геновариантов мишеней, так же, как и исключение из анализа мишеней для циркулирующих геновариантов позволяет повысить эффективность лабораторного исследования в целом. В связи с этим существует потребность в разработке олигонуклеотидов для выявления мутации S:L452R как уникальной и значимой в эволюции вируса в биологических образцах с подтвержденным наличием РНК SARS-CoV-2. Разработка осуществляется за счет подбора праймеров и флуоресцентно-меченого зонда для проведения ПЦР-РВ.

Технический результат заявляемого изобретения направлен на выявление мутации S:L452R в биологических образцах с подтвержденным наличием РНК SARS-CoV-2 с высокой степенью специфичности в образцах биологического материала посредством таких олигонуклеотидов праймеров и флуоресцентно-меченого зонда, которые позволяют эффективно определять мутацию S:L452R SARS-CoV-2 с использованием широко доступных методик и доступных материалов.

Технический результат достигается за счет применения химически-синтезированных олигонуклеотидов для определения наличия мутации S:L452R в биологическом образце с подтвержденным наличием РНК SARS-CoV-2, имеющих следующий олигонуклеотидный состав:

прямой праймер 452F2- SEQ ID NO: 1,

обратный праймер 452R2- SEQ ID NO: 2,

флуоресцентный зонд S452Z - SEQ ID NO: 3.

Праймеры представляют собой последовательности олигонуклеотидов для амплификации фрагмента, содержащего мутацию S:L452R в биологических образцах с подтвержденным наличием РНК SARS-CoV-2, флуоресцентно-меченый конформационно-блокированный зонд является олигонуклеотидом, содержащим флуорофор и гаситель флуоресценции, позволяющим детектировать амплифицированный фрагмент.

Заявляемые олигонуклеотиды разработаны на основе известных последовательностей гена, кодирующего S-белок SARS-CoV-2, взятых из базы данных NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/), в результате выбран фрагмент для детекции мутации S:L452R. К выбранному фрагменту подобраны праймеры и зонд для амплификации 85 пар оснований: прямой праймер 452F2 - SEQ ID NO: 1, обратный праймер 452R2- SEQ ID NO: 2 и флуоресцентный зонд S452Z - SEQ ID NO: 3.

Заявляемое изобретение является результатом работы в рамках совершенствования молекулярно-генетического мониторинга вариантов SARS-CoV-2, проведенной в ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора (Москва, Россия).

Для подбора целевых последовательностей - мест посадки олигонуклеотидов, используют фрагменты референсных геномов из базы данных NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/), как SARS-CoV-2 дикого типа, так и тех геновариантов, в которых встречается мутация S:L452R (Delta (B.1.617.2), Kappa (В. 1.617.1), (B.1.617.3), (C.36.3), Omicron (B.l. 1.529). Для поиска консервативных последовательностей применяют современные алгоритмы in silico анализа нуклеотидных последовательностей и программы, находящиеся в открытом доступе, включая AlignX, SnapGene Viewer, MEGA, Unipro UGENE. Составляют перечень мутаций, характерных для геновариантов. Затем подбирают олигонуклеотидные последовательности прямого и обратного праймеров, а также флуоресцентно-меченого зонда. Для детекции образцов, содержащих мутацию S:L452R, используют канал для детекции флуорофора R6G. Упомянутые олигонуклеотидные последовательности приведены в Таблице 1.

Анализ заявляемых последовательностей с использованием ресурса Primer BLAST продемонстрировал, что прямой праймер 452F2 (SEQ ID NO: 1) и обратный праймер 452R2 (SEQ ID NO: 2) амплифицируют участок, в котором располагается мутация S:L452R со 100% специфичностью.

В качестве биологического материала используются мазки/отделяемое носоглотки и ротоглотки, с подтвержденным наличием РНК SARS-CoV-2 (например, после проведения анализа на наборе реагентов АмплиСенс® COVID-19-FL).

Выделение РНК из биологического материала проводят в соответствии с МУ 1.3.2569-09 «Организация работ лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности». Выделение РНК из биологического материала производят с помощью комплекта реагентов в соответствии с инструкцией производителя. Для выделения РНК может быть использован комплект реагентов «РИБО-преп» (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия) или любой аналогичный набор для выделения РНК. Оптимальная концентрация РНК - 10³ - 10⁵ копий в 10 мкл. Реакцию обратной транскрипции (ОТ) проводят с помощью комплекта реагентов в соответствии с инструкцией производителя. Для проведения реакции ОТ может быть использован комплект реагентов «РЕВЕРТА-L» (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Москва, Россия) или любой аналогичный набор. Готовый препарат кДНК может храниться при температуре от 2 до 8°С в течение недели, при температуре от минус 24 до минус 16°С в течение 6 мес. и при температуре не выше минус 68°С в течение года.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) - это эффективный способ получения in vitro большого числа копий специфических нуклеотидных последовательностей. Их амплификация осуществляется в ходе трехэтапного циклического процесса.

Процесс ПЦР-амплификации заключается в многократном повторении процессов денатурации, ренатурации и синтеза. Денатурация (95°С) - термическое воздействие на молекулу ДНК с целью получения одноцепочечной структуры. Ренатурация (55-60°С)-праймеры, добавленные в реакцию спариваются с разделенными цепями. Синтез (70-75°С) - синтез второй цепи ДНК. Каждый цикл длится 3-5 мин.

Анализ данных проводится на основе детекции амплификатором уровня флуоресцентного сигнала испускаемого интеркалирующим красителем. При увеличении числа копий анализируемого участка детектируется экспоненциальный рост флуоресцентного сигнала. В результате наблюдается S-образная кривая в случае наличия специфичного флуоресцентному зонду сигнала, или ее отсутствие, в случае неспецифичной для зонда последовательности. Анализ кривых позволяет судить об отсутствии или наличии мутации в исследуемых образцах.

ПЦР-РВ проводится с применением заявляемых представленных в Таблице 1 олигонуклеотидов - праймеров и зонда, для детекции мутации S:L452R SARS-CoV-2.

ПЦР-РВ проводят при следующих условиях:

Общий объем реакционной смеси - 25 мкл.

Компоненты ПЦР смешиваются следующим образом:

(a) 10 мкл смеси, содержащей:

- олигонуклеотидные праймеры SEQ ID NO NO: 1, 2 - по 0,7 мкМ;

- флуоресцентный зонд SEQ ID NO: 3 - 0,3 мкМ;

- dNTPs - 0,44 мМ.

(b) реактив, содержащий рекомбинантный фермент Taq ДНК-полимеразу, например, 0,5 мкл «Полимераза TaqF» (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Москва, Россия) или любой аналогичный коммерческий набор в соответствии с инструкцией производителя.

(c) ПЦР-буфер, содержащий MgCl₂, например, 5,0 мкл ПЦР-буфера «ОТ-ПЦР-смесь-2 FEP/FRT» (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Москва, Россия) или любого аналогичного коммерческого набора в соответствии с инструкцией производителя.

(d) полученная методом обратной транскрипции кДНК 10 мкл.

Амплификацию проводят на приборе с возможностью флуоресцентной детекции, например, «Rotor-Gene Q» («Qiagen», Германия) или на любом другом приборе с 2-5 каналами детекции в соответствии с инструкцией производителя.

Амплификацию проводят по следующей программе: 1 цикл 95°С в течение 15 минут, 45 циклов при температуре 95°С - 10 секунд / 60°С - 20 секунд. Детекция флуоресценции проводится на этапе 60°С по каналу для флуорофора R6G.

Для анализа результатов задают пороговую линию, соответствующую величине 10% от среднего сигнала флуоресценции образца с наличием мутации S:L452R. Образцы, для которых кривые флуоресценции пересекают пороговую линию, и, при этом кинетика накопления флуоресцентного сигнала экспоненциальная, являются положительными, то есть содержат мутацию S:L452R SARS-CoV-2.

Реализация заявляемого изобретения поясняется следующими примерами: Пример 1. Получение олигонуклеотидов для определения мутации S:L452R SARS-CoV-2.

Для подбора целевых последовательностей - мест посадки олигонуклеотидов, используют фрагменты референсных геномов из базы данных NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/), как вируса SARS-CoV-2 дикого типа, так и тех геновариантов, в которых встречается мутация S:L452R (Delta (В. 1.617.2), refseq MZ359841 (NCBI)); Kappa (В. 1.617.1) EPIIS LI 544071 (GISAID (https://gisaid.org/); Omicron (B. 1.1.529), refseq OL672836 (NCBI). Для поиска мутаций использованы современные алгоритмы in silico анализа нуклеотидных последовательностей и программы, находящиеся в открытом доступе, включая AlignX, Unipro UGENE, олигокалькулятор (Oligo Calculators) Integrated DNA Technologies, Inc. (Oligo Analyzer (idtdna.com)). Составляют перечень мутаций, характерных для геновариантов. Затем подбирают олигонуклеотидные последовательности прямого и обратного праймеров, а также флуоресцентно-меченый зонд. Для детекции образцов, содержащих мутацию S:L452R SARS-CoV-2, используют канал для детекции флуоресценции R6G. Упомянутые олигонуклеотидные последовательности приведены в Таблице 1.

Анализ упомянутых последовательностей с использованием ресурса Primer BLAST показал, что прямой 452F2 и обратный 452R2 праймеры амлифицируют участок с мутацией S:L452R со 100% специфичностью.

Олигонуклеотиды для определения мутации S:L452R SARS-CoV-2 прямой праймер 452F2, обратный праймер 452R2, флуоресцентный зонд S452Z, представлены уникальными последовательностями SEQ ID NO:l, SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 3 соответственно.

Пример 2. Детекция мутации S:L452R SARS-CoV-2 методом ПЦР-РВ.

Определение мутации S:L452R SARS-CoV-2 проводят методом ПЦР-РВ при следующих условиях:

Общий объем реакционной смеси - 25 мкл.

Компоненты ПЦР смешиваются следующим образом:

(a) 10 мкл смеси, содержащей:

- олигонуклеотидные праймеры: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 no 0,7 мМ;

- флуоресцентный зонд: SEQ ID NO: 3 - 0,3 мМ;

- dNTPs - 0,44 мМ.

(b) 0,5 мкл реактива «Полимераза TaqF» (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия), содержащего рекомбинантный фермент Taq ДНК-полимеразу.

(c) 5,0 мкл ПЦР-буфера «ОТ-ПЦР-смесь-2 FEP/FRT» (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия), содержащего MgCl₂.

(d) полученная после реакции обратной транскрипции («РЕВЕРТА-L» ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия) кДНК 10 мкл.

ПЦР-РВ проводили с флуоресцентной детекцией на приборе с 5 каналами детекции - «Rotor-Gene Q» («Qiagen», Германия).

Подготовленный описанным способом материал, содержащий уникальные олигонуклеотидные последовательности SEQ ID NO NO: 1-3, используют для определения мутации S:L452R SARS-CoV-2 в образцах биологического материала.

Пример 3. Обнаружение мутации S:L452R SARS-CoV-2 в образцах биологического материала.

Для определения мутации S:L452R SARS-CoV-2 выбрано 94 образца, с подтвержденным наличием РНК SARS-CoV-2.

Для исследования использовали клинический материал - мазки/отделяемое носоглотки и ротоглотки, с подтвержденным наличием РНК SARS-CoV-2 набором реагентов АмплиСенс® COVID-19-FL (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Москва, Россия). Выделение РНК из биологического материала проводили в соответствии с МУ 1.3.2569-09 «Организация работ лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности». Выделение РНК осуществляли методом нуклеопреципитации с применением набора реагентов «РИБО-преп» (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Москва, Россия) в соответствии с инструкцией к набору. Обратную транскрипцию проводили с применением набора реагентов «РЕВЕРТА-L» (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Москва, Россия) в соответствии с инструкцией к набору.

ПЦР-РВ проводили в условиях, описанных в Примере 2, с использованием уникальных олигонуклеотидных последовательностей SEQ ID NO NO: 1-3.

Амплификацию проводили на приборе «ДТ-96» («ДНК-Технология», Россия) по следующей программе: 1 цикл 95°С в течение 15 минут, 45 циклов при температуре 95°С -10 секунд / 60°С - 20 секунд. Детекция флуоресценции проводилась на этапе 60°С по каналу для флуорофора R6G. Для анализа результатов задали пороговую линию, соответствующую величине 10% от среднего сигнала флуоресценции образца с наличием мутации S:L452R. Для 86 образцов кривая флуоресценции пересекла пороговую линию и, при этом кинетика накопления флуоресцентного сигнала была экспоненциальной, что свидетельствует о том, что данные образцы содержат мутацию S:L452R SARS-CoV-2.

Для данных 86 образцов наличие мутации S:L452R SARS-CoV-2 подтверждено фрагментным секвенированием с использованием метода секвенирования по Сэнгеру. Фрагментное секвенирование выполнялось на генетическом анализаторе ABI 3500xL (Applied Biosystems, США), выравнивание и анализ полученных последовательностей выполнялось с помощью программы AlignX («Thermo Fisher Scientific», США). Отсутствие мутации в 8 образцах без флуоресцентного сигнала также подтверждено фрагментным секвенированием.

Таким образом, из всей выборки выявлено 94 образцов, содержащих мутацию S:L452R SARS-CoV-2.

Пример 4. Обнаружение мутации S:L452R SARS-CoV-2 в образцах биологического материала.

Для определения мутации S:L452R SARS-CoV-2 выбрано 23 образца, с подтвержденным наличием РНК SARS-CoV-2.

Выделение РНК из биологического материала проводили в соответствии с МУ 1.3.2569-09 «Организация работ лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности». Выделение РНК осуществляли методом нуклеопреципитации с применением набора реагентов «РИБО-преп» (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Москва, Россия) в соответствии с инструкцией к набору. Обратную транскрипцию проводили с применением набора реагентов «РЕВЕРТА-L» (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Москва, Россия) в соответствии с инструкцией к набору.

ПЦР-РВ проводили в условиях, описанных в Примере 2, с использованием уникальных олигонуклеотидных последовательностей SEQ ID NO NO: 1-3.

Амплификацию проводили на приборе «ДТ-96» («ДНК-Технология», Россия) по следующей программе: 1 цикл 95°С в течение 15 минут, 45 циклов при температуре 95°С -10 секунд / 60°С - 20 секунд. Детекция флуоресценции проводилась на этапе 60°С по каналу для флуорофора R6G. Для анализа результатов задали пороговую линию, соответствующую величине 10% от среднего сигнала флуоресценции образца с наличием мутации S:L452R. Для 11 образцов кривая флуоресценции пересекла пороговую линию и, при этом кинетика накопления флуоресцентного сигнала была экспоненциальной, что свидетельствует о том, что данные образцы содержат мутацию S:L452R SARS-CoV-2.

Для данных 11 образцов наличие мутации S:L452R SARS-CoV-2 подтверждено фрагментным секвенированием с использованием метода секвенирования по Сэнгеру. Фрагментное секвенирование выполнялось на генетическом анализаторе ABI 3500xL (Applied Biosystems, США), выравнивание и анализ полученных последовательностей выполнялось с помощью программы AlignX («Thermo Fisher Scientific)), США). Отсутствие мутации в 12 образцах без флуоресцентного сигнала также подтверждено фрагментным секвенированием.

Таким образом, из всей выборки выявлено 11 образцов, содержащих мутацию S:L452R SARS-CoV-2.

Пример 5. Обнаружение мутации S:L452R SARS-CoV-2 в образцах биологического материала.

Для определения мутации S:L452R SARS-CoV-2 выбрано 12 образцов, с подтвержденным наличием РНК SARS-CoV-2.

В работе исследовали пробы клинического материала, мазки/отделяемое носоглотки и ротоглотки, с подтвержденным наличием РНК SARS-CoV-2 набором реагентов АмплиСенс® COVID-19-FL (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Москва, Россия). Выделение РНК из биологического материала проводили в соответствии с МУ 1.3.2569-09 «Организация работ лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности». Выделение РНК осуществляли методом нуклеопреципитации с применением набора реагентов «РИБО-преп» (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Москва, Россия) в соответствии с инструкцией к набору. Обратную транскрипцию проводили с применением набора реагентов «РЕВЕРТА-L» (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Москва, Россия) в соответствии с инструкцией к набору.

ПЦР-РВ проводили в условиях, описанных в Примере 2, с использованием уникальных олигонуклеотидных последовательностей SEQ ID NO NO: 1-3.

Амплификацию проводили на приборе «Rotor-Gene Q» («Qiagen», Германия) по следующей программе: 1 цикл 95°С в течение 15 минут, 45 циклов при температуре 95°С -10 секунд / 60°С - 20 секунд. Детекция флуоресценции проводилась на этапе 60°С по каналу для флуорофора R6G. Для анализа результатов задали пороговую линию, соответствующую величине 10% от среднего сигнала флуоресценции образца с наличием мутации S:L452R. Кривая флуоресценции не пересекла пороговую линию, что свидетельствовало о том, что в выборке отсутствуют образцы, содержащие мутацию S:L452R SARS-CoV-2.

Наличие других мутаций SARS-CoV-2, а также отсутствие мутации S:L452R в данных 12 образцах подтверждено фрагментным секвенированием с использованием метода секвенирования по Сэнгеру. Фрагментное секвенирование выполнялось на генетическом анализаторе ABI 3500xL (Applied Biosystems, США), выравнивание и анализ полученных последовательностей выполнялось с помощью программы AlignX («Thermo Fisher Scientific)), США).

Заявляемое изобретение позволяет выявлять мутацию S:L452R в биологических образцах с подтвержденным наличием РНК SARS-CoV-2. Синтезированные олигонуклеотиды SEQ ID NO NO: 1-3 не дают перекрестных реакций с другими протестированными образцами, амлифицируют заданный участок со 100% специфичностью и позволяют определять наличие или отсутствие в образцах биологического материала значимой мишени S:L452R.

Claims (6)

1. Набор праймеров и зонда определения мутации S:L452R SARS-CoV-2, имеющий следующий состав:

прямой праймер 452F2 - SEQ ID NO: 1;

обратный праймер 452R2 - SEQ ID NO: 2;

флуоресцентный зонд S452Z - SEQ ID NO: 3.

2. Набор праймеров и зонда определения мутации S:L452R SARS-CoV-2 по п. 1, где для создания прямого и обратного праймеров, флуоресцентного зонда используют фрагменты референсных геномов SARS-CoV-2 дикого типа, Delta (B.1.617.2), Kappa (B.1.617.1), (B.1.617.3), (C.36.3), Omicron (B.1.1.529).

3. Набор праймеров и зонда определения мутации S:L452R SARS-CoV-2 по п. 1, где флуоресцентный зонд является олигонуклеотидом, содержащим флуорофор R6G и гаситель флуоресценции BHQ1, позволяющий детектировать амплифицированный фрагмент.