KR102578751B1 - 이질아메바와 동형아메바 감별용 프라이머 세트 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 이질아메바(Entamoeba histolytica)와 동형아메바(Entamoeba dispar) 감별용 프라이머 세트 및 이를 포함하는 아메바증 진단용 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 ITS2 gene을 타켓으로 하는 특정 염기서열로 이루어진 프라이머 및 프로브가 이질아메바와 동형아메바 감별에 사용되며, 이 프라이머 및 프로브를 포함하여 최적화된 Real-time RT-PCR 시약 조성물을 이용함으로써 신속 정확한 진단이 가능하다.
Description
본 발명은 이질아메바(Entamoeba histolytica)와 동형아메바(Entamoeba dispar)를 구분하여 검출할 수 있는 프라이머 세트 및 이를 포함하는 조성물 또는 검출방법에 관한 것이다.
아메바증(Amoebiasis)은 단일 세포 원생동물 기생충 이질아메바(Entamoeba histolytica)에 의해 유발되는 대장 및 간 등에 대한 감염증이다. 아메바증은 주로 위생이 불량한 지역에서 발생하며 사람과 사람 간에 음식 또는 물을 통해 확산될 수 있으며, 감염자는 증상이 없을 수도 있고 설사, 변비, 복부 경련 통증, 상복부 압통 및 발열이 있을 수 있다. 매년 전 세계적으로 4 ~ 5천만 명이 아메바증에 감염되고 이 중 약 4 ~ 7만 명이 사망에 이르고 있으며, 국내에서는 이질아메바(E. histolytica)를 법정 감염병 중의 하나로 지정하고 있으므로 진단 및 감시를 위한 정확한 검사법 확립이 필요하다.
현재 사용되는 진단법으로는 검체(대변)에서 이질아메바에 특징적인 영양형 또는 포낭형을 확인하는 방법, 항원검사(효소면역분석법, 간접면역형광항체법), 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)법을 이용한 분자생물학적 동정이 많이 사용되고 있다. 병원성인 이질아메바(E. histolytica)와 비병원성인 동형아메바(E. dispar)의 포낭은 형태학적으로 구분이 불가능하여 종 감별에 관한 논란이 있기 때문에 그 감별이 더욱 중요하게 되었다. 가장 좋은 감별 방법은 항원 검사 또는 PCR 기술을 이용한 감별이며, 특히 PCR 기술은 아메바의 유전물질에 대한 여러 복제본을 생성하여 아메바를 보다 쉽게 식별하도록 만들기 때문에 종종 확정적이지 않은 현미경 검사법보다 더 유용하다. 특히, 병원성 아메바는 다른 아메바들과 외형적으로 구분이 힘들기 때문에 정확한 진단 및 감시를 위한 검사법으로써 유전물질을 이용한 PCR 기술 방법이 적합하다고 알려져 있다.
실시간 중합효소연쇄반응(Real-time PCR)은 기존의 PCR과는 달리 유전자의 증폭산물에 결합된 형광물질로부터 방출되는 형광량을 실시간을 측정하는 원리이다. 검출을 위하여 형광이 표지된 probe를 이용하는데 프로브의 5' 말단에는 서로 다른 파장을 나타내는 FAM, VIC, TET, HEX 등의 reporter dye르르 부착하며 3' 말단에는 quencher dye를 표지한다. TaqManTMprobe는 annealing step에서 주형 DNA에 특이적으로 결합하지만, 프로브의 quencher에 의해 형광 발색이 억제되며 Extension 반응 시에 Taq. DNA polymerase가 갖는 5'->3' exonuclease 활성으로 주형 DNA에 결합한 프로브가 분해되어 형광색소가 프로브에서 유리되면서 quencer에 의한 억제가 해제되어 형광을 나타낸다. 실시간 중합효소연쇄반응은 전기영동이 필요 없어 신속하고 간편하게 결과를 해석할 수 있으며, 검출 특이도와 민감도가 매우 높고 교차 오염의 위험성이 적어 질병의 진단검사법으로 유용하게 사용될 수 있다.
한국등록특허 제1316899호는 람블편모충, 작은와포자충 및 이질아메바 검출용 키트에 관한 것으로, 이질아메바 검출용 프라이머 및 프로브에 관해 개시하고 있고, 한국등록특허 제1925768호는 장내 기생충 검출용 키트 및 이를 이용한 검출 방법에 관한 것으로, 이질아메바를 포함하는 장내 기생충 검출용 키트에 관해 개시하고 있다.
하지만, 본 발명의 특정 서열을 갖는 이질아메바와 동형아메바 감별용 프라이머 세트에 대해서는 아직까지 개시된 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 이질아메바(Entamoeba histolytica)와 동형아메바(Entamoeba dispar) 감별용 프라이머 세트 및 이를 이용한 감별 방법을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1을 포함하는 정방향 프라이머; 서열번호 2를 포함하는 역방향 프라이머; 및 서열번호 3을 포함하는 프로브를 포함하는 이질아메바(Entamoeba histolytica) 검출용 프라이머 세트, 서열번호 4를 포함하는 정방향 프라이머; 서열번호 5를 포함하는 역방향 프라이머; 및 서열번호 6을 포함하는 프로브를 포함하는 동형아메바(Entamoeba dispar) 검출용 프라이머 세트 또는 상기 프라이머 세트를 모두 포함하는 이질아메바(Entamoeba histolytica)와 동형아메바(Entamoeba dispar) 감별용 프라이머 세트를 제공한다.
다른 예로서, 본 발명은 서열번호 1 및 2의 프라이머와 서열번호 3의 프로브를 포함하는 이질아메바(Entamoeba histolytica) 검출용 조성물, 서열번호 4 및 5의 프라이머와 서열번호 6의 프로브를 포함하는 동형아메바(Entamoeba dispar) 검출용 조성물 또는 상기 프라이머 세트를 모두 포함하는 이질아메바(Entamoeba histolytica)와 동형아메바(Entamoeba dispar) 감별용 조성물을 제공한다.
상기 조성물에서 사용하는 시료는 분변, 혈액, 뇌척수액, 혈청, 객담, 소변 또는 생체 조직으로부터 분리된 것일 수 있다.
또 다른 예로, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 개별적으로 또는 모두 포함하는 아메바증 진단용 조성물을 제공한다.
상기 아메바증은 이질, 간농양, 복부 경련 통증, 설사, 변비, 상복부 압통, 발열, 잔변감 및 혈변으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것일 수 있다.
추가적으로, 본 발명은 분리된 DNA 시료를 준비하는 단계; 서열번호 1 및 2의 프라이머와 서열번호 3의 프로브 및 서열번호 4 및 5의 프라이머와 서열번호 6의 프로브를 사용하여 실시간 역전사 중합효소 연쇄반응으로 증폭하는 단계; 및 실시간 증폭 결과를 형광으로 획득하는 단계;를 포함하는 이질아메바(Entamoeba histolytica)와 동형아메바(Entamoeba dispar) 감별방법을 제공한다.
본 발명의 이질아메바(Entamoeba histolytica) 및/또는 동형아메바(Entamoeba dispar)의 검출 또는 감별용 프라이머 세트와 이를 이용한 조성물 또는 방법은 기존의 이질아메바만을 단일 검출할 수 있는 시스템에 비하여 한 번의 반응으로 이질아메바와 동형아메바를 동시에 확인할 수 있으므로 신속하고 정확한 진단이 가능한 장점이 있다. 본 발명을 통하여 이질아메바 감염이 의심되는 검체로부터 이질아메바와 동형아메바 감별검사에 대한 가치 있는 진단방법을 제공하여 유사 증상을 보이는 장관감염 질환으로부터 정확한 감별 진단을 수행할 수 있고, 불필요한 치료 및 조사 활동을 사전에 방지함으로써 효과적인 방역 대책 마련에 기여할 수 있을 것으로 사료된다.
도 1은 본 발명의 일 구현 예에 따른 SSU rRNA gene의 구조를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일 구현 예에 따른 이질아메바 18S rRNA gene의 염기 구성을 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 일 구현 예에 따른 이질아메바 유사종간 염기서열 상동성 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 일 구현 예에 따른 이질아메바, 동형아메바 및 E. nuttalli의 18S rRNA gene 서열 정렬 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 일 구현 예에 따른 이질아메바 ITS2의 프로브 설계 영역(region)을 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 일 구현 예에 따른 이질아메바 검출용 프라이머 및 프로브 시퀀스를 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 일 구현 예에 따른 동형아메바 ITS2의 프로브 설계를 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명의 일 구현 예에 따른 동형아메바 검출용 프라이머 및 프로브 시퀀스를 나타낸 것이다.
도 9는 본 발명의 일 구현 예에 따른 이질아메바 검출용 프라이머 및 프로브의 in silico cross-reactivity 확인 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 본 발명의 일 구현 예에 따른 동형아메바 검출용 프라이머 및 프로브의 in silico cross-reactivity 확인 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 본 발명의 일 구현 예에 따른 이질아메바(a) 및 동형아메바(b) 검출용 프라이머 및 프로브의 성능 확인 결과를 나타낸 것이다.
도 12는 본 발명의 일 구현 예에 따른 확립된 프라이머 및 프로브의 농도 조건을 나타낸 것이다.
도 13은 본 발명의 일 구현 예에 따른 프라이머 및 프로브 세트의 multiplex 효율 확인 시험 결과를 나타낸 것이다.
도 14는 본 발명의 일 구현 예에 따른 프라이머 및 프로브 세트의 multiplex 효율 확인 시험 결과를 나타낸 것이다.
도 15는 본 발명의 일 구현 예에 따른 최종 결정된 Multiplex Real-time PCR 반응액 조성을 나타낸 것이다.
도 16은 본 발명의 일 구현 예에 따른 양성 시료를 이용한 MasterMix 별 검출 효율 비교 테스트 결과를 나타낸 것이다(red plot: Real-time PCR MasterMix 1, blue plot: Real-time PCR MasterMix 2).
도 17은 본 발명의 일 구현 예에 따른 클로닝 벡터 정보를 나타낸 것이다.
도 18은 본 발명의 일 구현 예에 따른 Restriction enzyme을 나타낸 것이다.
도 19는 본 발명의 일 구현 예에 따른 Enzyme digestion을 나타낸 것이다.
도 20은 본 발명의 일 구현 예에 따른 이질아메바 (a) 및 동형아메바(b)의 프라이머 및 프로브 세트의 Plasmid DNA 확인 결과를 나타낸 것이다.
도 21은 본 발명의 일 구현 예에 따른 교차반응 시험 결과를 나타낸 것이다.
도 22는 본 발명의 일 구현 예에 따른 이질아메바의 linearity test Ct 측정값을 나타낸 것이다.
도 23은 본 발명의 일 구현 예에 따른 ATCC 30459 시료를 이용한 standard curve 작성 결과를 나타낸 것이다(단위: cells/㎖).
도 24는 본 발명의 일 구현 예에 따른 ATCC 30459DQ genomic DNA를 이용한 standard curve 작성 결과를 나타낸 것이다(단위: genome copies/㎖).
도 25는 본 발명의 일 구현 예에 따른 합성 oligo DNA 이용한 standard curve 작성 결과를 나타낸 것이다(단위: target copies/㎖).
도 26은 본 발명의 일 구현 예에 따른 세포내에 존재하는 타겟 유전자의 카피수 검증을 위해 사용한 프라이머 정보를 나타낸 것이다.
도 27은 본 발명의 일 구현 예에 따른 Reference primer를 이용한 세포 수에 따른 검출 시험 결과를 나타낸 것이다.
도 28은 본 발명의 일 구현 예에 따른 동형아메바의 linearity test Ct 측정값을 나타낸 것이다.
도 29는 본 발명의 일 구현 예에 따른 세포수를 측정한 시료의 standard curve 작성 결과를 나타낸 것이다(단위: cells/㎖).
도 30은 본 발명의 일 구현 예에 따른 합성 oligo DNA를 이용한 standard curve 작성 결과를 나타낸 것이다(단위: target copies/㎖).
도 31은 본 발명의 일 구현 예에 따른 이질아메바의 LOD test 결과를 나타낸 것이다.
도 32는 본 발명의 일 구현 예에 따른 동형아메바의 LOD test 결과를 나타낸 것이다.
도 33은 본 발명의 일 구현 예에 따른 이질아메바의 LOD 산출 결과를 나타낸 것이다.
도 34는 본 발명의 일 구현 예에 따른 이질아메바의 LOD test 농도 별 Ct 측정값 결과를 나타낸 것이다.
도 35는 본 발명의 일 구현 예에 따른 동형아메바의 LOD 산출 결과를 나타낸 것이다.
도 36은 본 발명의 일 구현 예에 따른 동형아메바의 LOD test 농도 별 Ct 측정값 결과를 나타낸 것이다.
도 37은 본 발명의 일 구현 예에 따른 정밀도 시험 결과를 나타낸 것이다.
도 38은 본 발명의 일 구현 예에 따른 반복성 시험의 Ct 측정값을 나타낸 것이다.
도 39는 본 발명의 일 구현 예에 따른 양성시료를 이용한 개발 시스템의 성능 확인 시험 결과를 나타낸 것이다.
도 40은 본 발명의 일 구현 예에 따른 이질아메바의 ROC curve 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 41은 본 발명의 일 구현 예에 따른 동형아메바의 ROC curve 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일 구현 예에 따른 이질아메바 18S rRNA gene의 염기 구성을 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 일 구현 예에 따른 이질아메바 유사종간 염기서열 상동성 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 일 구현 예에 따른 이질아메바, 동형아메바 및 E. nuttalli의 18S rRNA gene 서열 정렬 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 일 구현 예에 따른 이질아메바 ITS2의 프로브 설계 영역(region)을 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 일 구현 예에 따른 이질아메바 검출용 프라이머 및 프로브 시퀀스를 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 일 구현 예에 따른 동형아메바 ITS2의 프로브 설계를 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명의 일 구현 예에 따른 동형아메바 검출용 프라이머 및 프로브 시퀀스를 나타낸 것이다.
도 9는 본 발명의 일 구현 예에 따른 이질아메바 검출용 프라이머 및 프로브의 in silico cross-reactivity 확인 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 본 발명의 일 구현 예에 따른 동형아메바 검출용 프라이머 및 프로브의 in silico cross-reactivity 확인 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 본 발명의 일 구현 예에 따른 이질아메바(a) 및 동형아메바(b) 검출용 프라이머 및 프로브의 성능 확인 결과를 나타낸 것이다.
도 12는 본 발명의 일 구현 예에 따른 확립된 프라이머 및 프로브의 농도 조건을 나타낸 것이다.
도 13은 본 발명의 일 구현 예에 따른 프라이머 및 프로브 세트의 multiplex 효율 확인 시험 결과를 나타낸 것이다.
도 14는 본 발명의 일 구현 예에 따른 프라이머 및 프로브 세트의 multiplex 효율 확인 시험 결과를 나타낸 것이다.
도 15는 본 발명의 일 구현 예에 따른 최종 결정된 Multiplex Real-time PCR 반응액 조성을 나타낸 것이다.
도 16은 본 발명의 일 구현 예에 따른 양성 시료를 이용한 MasterMix 별 검출 효율 비교 테스트 결과를 나타낸 것이다(red plot: Real-time PCR MasterMix 1, blue plot: Real-time PCR MasterMix 2).
도 17은 본 발명의 일 구현 예에 따른 클로닝 벡터 정보를 나타낸 것이다.
도 18은 본 발명의 일 구현 예에 따른 Restriction enzyme을 나타낸 것이다.
도 19는 본 발명의 일 구현 예에 따른 Enzyme digestion을 나타낸 것이다.
도 20은 본 발명의 일 구현 예에 따른 이질아메바 (a) 및 동형아메바(b)의 프라이머 및 프로브 세트의 Plasmid DNA 확인 결과를 나타낸 것이다.
도 21은 본 발명의 일 구현 예에 따른 교차반응 시험 결과를 나타낸 것이다.
도 22는 본 발명의 일 구현 예에 따른 이질아메바의 linearity test Ct 측정값을 나타낸 것이다.
도 23은 본 발명의 일 구현 예에 따른 ATCC 30459 시료를 이용한 standard curve 작성 결과를 나타낸 것이다(단위: cells/㎖).
도 24는 본 발명의 일 구현 예에 따른 ATCC 30459DQ genomic DNA를 이용한 standard curve 작성 결과를 나타낸 것이다(단위: genome copies/㎖).
도 25는 본 발명의 일 구현 예에 따른 합성 oligo DNA 이용한 standard curve 작성 결과를 나타낸 것이다(단위: target copies/㎖).
도 26은 본 발명의 일 구현 예에 따른 세포내에 존재하는 타겟 유전자의 카피수 검증을 위해 사용한 프라이머 정보를 나타낸 것이다.
도 27은 본 발명의 일 구현 예에 따른 Reference primer를 이용한 세포 수에 따른 검출 시험 결과를 나타낸 것이다.
도 28은 본 발명의 일 구현 예에 따른 동형아메바의 linearity test Ct 측정값을 나타낸 것이다.
도 29는 본 발명의 일 구현 예에 따른 세포수를 측정한 시료의 standard curve 작성 결과를 나타낸 것이다(단위: cells/㎖).
도 30은 본 발명의 일 구현 예에 따른 합성 oligo DNA를 이용한 standard curve 작성 결과를 나타낸 것이다(단위: target copies/㎖).
도 31은 본 발명의 일 구현 예에 따른 이질아메바의 LOD test 결과를 나타낸 것이다.
도 32는 본 발명의 일 구현 예에 따른 동형아메바의 LOD test 결과를 나타낸 것이다.
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도 37은 본 발명의 일 구현 예에 따른 정밀도 시험 결과를 나타낸 것이다.
도 38은 본 발명의 일 구현 예에 따른 반복성 시험의 Ct 측정값을 나타낸 것이다.
도 39는 본 발명의 일 구현 예에 따른 양성시료를 이용한 개발 시스템의 성능 확인 시험 결과를 나타낸 것이다.
도 40은 본 발명의 일 구현 예에 따른 이질아메바의 ROC curve 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 41은 본 발명의 일 구현 예에 따른 동형아메바의 ROC curve 분석 결과를 나타낸 것이다.
이하, 본 발명의 바람직한 구현예에 대하여 상세히 설명한다. 또한, 하기의 설명에서는 구체적인 구성요소 등과 같은 많은 특정 사항들이 도시되어 있는데, 이는 본 발명의 보다 전반적인 이해를 돕기 위해서 제공된 것일 뿐 이러한 특정 사항들 없이도 본 발명이 실시될 수 있음은 이 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게는 자명하다 할 것이다. 그리고, 본 발명을 설명함에 있어서, 관련된 공지 기능 혹은 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1을 포함하는 정방향 프라이머; 서열번호 2를 포함하는 역방향 프라이머; 및 서열번호 3을 포함하는 프로브를 포함하는 이질아메바(Entamoeba histolytica) 검출용 프라이머 세트, 서열번호 4를 포함하는 정방향 프라이머; 서열번호 5를 포함하는 역방향 프라이머; 및 서열번호 6을 포함하는 프로브를 포함하는 동형아메바(Entamoeba dispar) 검출용 프라이머 세트 또는 상기 프라이머 세트를 모두 포함하는 이질아메바(Entamoeba histolytica)와 동형아메바(Entamoeba dispar) 감별용 프라이머 세트를 제공한다.
다른 예로서, 본 발명은 서열번호 1 및 2의 프라이머와 서열번호 3의 프로브를 포함하는 이질아메바(Entamoeba histolytica) 검출용 조성물, 서열번호 4 및 5의 프라이머와 서열번호 6의 프로브를 포함하는 동형아메바(Entamoeba dispar) 검출용 조성물 또는 상기 프라이머 세트를 모두 포함하는 이질아메바(Entamoeba histolytica)와 동형아메바(Entamoeba dispar) 감별용 조성물을 제공한다.
실시간 중합효소연쇄반응(real-time PCR)은 기존의 PCR과는 달리 유전자의 증폭산물에 결합된 형광물질로부터 방출되는 형광량을 실시간으로 측정하는 원리이다. 이는 전기영동이 필요 없어 신속하고 간편하게 결과를 해석할 수 있으며, 검출 특이도와 민감도가 매우 높고 교차 오염의 위험성이 적어 질병의 진단검사법으로 유용하게 사용될 수 있다.
프로브는 이 분야에 알려진 실시간 중합효소연쇄반응용 모든 프로브를 포함하고, 바람직하게는 5‘ 및 3’ 말단에는 검출이 가능한 형광 표지인자 및 소광자가 결합되어 있는 프로프를 사용한다. 일반적으로 5‘ 및 3’ 말단에는 검출이 가능한 형광 표지인자 (Reporter) 및 소광자 (Quencher)가 결합되어 있으므로, 사용가능한 모든 형광 표지인자 및 소광자를 사용할 수 있다. 형광 표지 인자의 예로는 FAM, VIC, TAMRA, JOE, ROX, HEX, Cy3, Cy5, Texas Red 등이 있으며 종류에 따라 emission 및 exitation 파장이 다르므로 각각의 파장 간 중첩을 최소로 하는 형광표지자를 선택하여 한 번의 반응에서 다양한 병원체의 특이 유전자 검출을 가능케 하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
형광검출법으로는 인터킬레이팅(interchelating) 방법, TaqMan™ 프로브법 및 분자비콘(Molecular becon) 방법 등이 있다. 이들은 각각 다른 원리를 이용하여 형광의 증가를 검출하는데, 바람직하게는 TaqMan™ 프로브법을 사용할 수 있다. TaqMan™ 프로브법은 5'말단을 형광 표지인자(FAM 등)로 3'말단을 quencher 물질(TAMRA, Blacke hole chencher 등)로 수식한 올리고뉴클레오티드(TaqManTM probe)를 PCR 반응액에 첨가하는 방법으로, TaqManTM probe가 어닐링 단계에서 주형 DNA에 특이적으로 혼성화하지만, 프로브상의 quencher에 의해 형광 발생이 억제되고, 연장 단계에서 Taq DNA 중합효소가 갖는 5'→ 3'엑소뉴클레아제 활성으로 주형에 혼성화한 TaqMan™ 프로브만 분해되어 형광색소가 프로브에서 유리되므로서 quencher에 의한 억제가 해제되어 형광을 발하게 된다.
상기 프라이머 또는 프로브의 농도는 실험 조건에 따라 통상의 기술자가 다양하게 선택하여 사용할 수 있고, 바람직하게는 각각 1 내지 1000 nM일 수 있고, 더욱 바람직하게는 각각 100 내지 500 nM일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 실시간 중합효소 연쇄반응을 실시하는 단계는 30 내지 50 사이클, 30 내지 46 사이클, 30 내지 44 사이클, 33 내지 50 사이클, 33 내지 46 사이클, 33 내지 44 사이클, 36 내지 50 사이클, 36 내지 46 사이클, 36 내지 44 사이클, 38 내지 50 사이클 또는 38 내지 46 사이클, 예를 들어, 38 내지 44 사이클 조건으로 수행되는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 프라이머 세트는 통상적인 실시간 PCR 방법 및 장치를 사용하여 실시할 수 있다. PCR 종료시, 실시간 PCR 기기의 레이저는 증폭된 PCR 산물의 프로브에 표지된 형광 표지인자를 감지하여 피크를 구현한다. 이때, 전기영동 과정 없이 기기에 내장된 프로그램을 실행시켜 자동으로 결과를 분석할 수 있다. 분석된 결과는 Ct (Threshold cycle)로 나타나 비숙련자라도 분석된 결과를 쉽게 알 수 있다.
상기 조성물에서 사용하는 시료는 분변, 혈액, 뇌척수액, 혈청, 객담, 소변 또는 생체 조직으로부터 분리된 것일 수 있다.
또 다른 예로, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 개별적으로 또는 모두 포함하는 아메바증 진단용 조성물을 제공한다.
상기 아메바증은 이질, 간농양, 복부 경련 통증, 설사, 변비, 상복부 압통, 발열, 잔변감 및 혈변으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것일 수 있다.
추가적으로, 본 발명은 분리된 DNA 시료를 준비하는 단계; 서열번호 1 및 2의 프라이머와 서열번호 3의 프로브 및 서열번호 4 및 5의 프라이머와 서열번호 6의 프로브를 사용하여 실시간 역전사 중합효소 연쇄반응으로 증폭하는 단계; 및 실시간 증폭 결과를 형광으로 획득하는 단계;를 포함하는 이질아메바(Entamoeba histolytica)와 동형아메바(Entamoeba dispar) 감별방법을 제공한다.
본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다
<실시예 1> 이질아메바(
E. histolytica
) 검출용 프라이머 및 프로브 설계
이질아메바의 PCR 분석 기술에 관한 선행 연구들을 조사한 결과 임상 시료에서 이질아메바 검출에는 18S rRNA 부위를 일반적으로 표적 유전자로 사용하고 있으며 ITS2와 병원성 관련 유전자로 알려진 episomal repeats, HLY6 및 cystein protease도 확인되었다. 이 중 small subunit ribosomal RNA 및 ITS(internal transcribed spacer) gene은 nucleus 내 multicopy로 존재해 single copy로 존재하는 염기서열 부위에 비해서 좋은 민감도 결과를 도출할 수 있으므로 타겟 유전자로 주로 많이 사용한다고 알려져 있다. 또한, SSU rRNA gene 및 ITS가 기타 유전자들에 비해서 NCBI Genbank에 등록된 시퀀스가 많아 특이적인 프라이머 및 프로브를 디자인하는데 용이할 것으로 예측되었으며, episomal repeats, HLY6 및 cystein proteinase 유전자는 수집할 수 있는 시퀀스 정보의 양이 현저히 적으므로 타겟 병원체인 이질아메바의 분리주에 대한 대표성을 확보하기 어렵다는 한계점이 있었다. 따라서, small subunit ribosomal RNA gene (SSU rRNA) gene과 ITS를 목표 유전자로 설정하고 프라이머 및 프로브 설계를 위한 염기서열 분석을 수행하였다.
이질아메바를 특이적으로 검출하기 위해서 NCBI에 등록된 Reference sequence를 선정한 뒤, 이들의 multiple alignment 결과의 consensus sequence를 BLAST하여 database를 확장하였다. 18S rRNA gene의 염기서열을 수집하여 alignment를 수행한 결과 이질아메바의 염기서열과 가장 상동성이 높은 종은 E. nuttalli인 것으로 분석되었으며, E. nuttalli 뿐만 아니라 동형아메바와도 구분이 가능한 region이 한정적이며 AT rich하여 최적의 Tm 값을 확보할 수 있는 TaqMan probe를 제작이 불가능하였다(도 2 내지 4 참조).
ITS2 부위의 consensus sequence를 BLAST한 결과로 이질아메바 sequence와 유전적으로 상동성이 가장 높은 E. nuttalli와 E. dispar의 sequence를 multiple alignment한 결과 특이적 검출이 가능하며, 최적의 Tm 값이 확보될 수 있는 region이 발견되었으므로 이 구간에 프로브를 설계하였다(도 5 참조).
TaqMan probe 제작 시 일반적으로 고려해야 할 사항으로 oligonucleotide 길이, GC contents 및 dimer의 형성 여부를 확인하였으며 5' 말단에 G 염기가 있는 것은 프로브 선정에서 제외하였다.
프라이머의 Tm (melting temperature) 값은 55~60℃, 길이는 18~29 mers, 프로브의 Tm은 68~70℃, 길이는 34 mers 이하의 범위로 디자인하였으며 Primer Express Software for Real-time PCR (Ver. 3.0.1)을 이용하여 Tm을 확인하였다(도 6 참조).
<실시예 2> 동형아메바(
E. dispar
) 검출용 프라이머 및 프로브 설계
이질아메바와 동일한 방식으로 동형아메바 및 유사종들 간의 18S rRNA 유전자를 검토한 결과 최적의 성능을 위한 TaqMan probe의 위치를 확보할 수가 없었으므로 상대적으로 종간 특이적 검출이 가능할 것으로 예상된 ITS2에 프로브 및 프라이머 세트를 설계하였다.
동형아메바의 ITS2 부위의 consensus sequence를 BLAST한 결과로 유전적으로 상동성이 가장 높은 E. nuttalli 및 E. histolytica의 sequence를 multiple alignment한 결과 특이적 검출이 가능하며, 최적의 Tm 값이 확보될 수 있는 region이 발견되었으므로 이 구간에 프로브를 설계하였다(도 7 참조).
이때 PCR 타겟 부위는 이질아메바와 유사한 region을 공유하므로 프라이머에서 서로 교차반응이 일어날 시, 멀티플렉스 효율이 감소할 수 있으므로 각 프라이머 세트도 특이성 있는 부위에 설계하였으며 이때, 프라이머의 Tm을 높일 목적으로 5'-end에 인위적 시퀀스를 첨가하였으며 최종 시퀀스는 도 8과 같다.
<실시예 3> 프라이머 및 프로브의
in silico
분석
장관 감염 원충과 장내 상재 가능한 세균 및 바이러스들과의 교차 반응성을 확인하기 위하여 이질아메바와 동형아메바의 특이적 검출을 목적으로 설계한 프라이머 및 프로브들과의 서열 일치도를 분석하였다. 선정한 원충과 박테리아 및 바이러스들과 프라이머 및 프로브 시퀀스의 일치율이 낮아 다른 종과의 비특이적 증폭 시그널이 발생하지 않을 것으로 예측되었다(도 9, 10 참조).
<실시예 4> 이질아메바와 동형아메바의 동시검출을 위한 Multiplex Real-time RT-PCR 조건 최적화
4-1. 제작된 프라이머 및 프로브 세트의 성능 확인
이질아메바와 동형아메바 및 internal control 검출용 프라이머 및 프로브의 oligo를 합성하였으며 이 때, multiplex를 구성하기 위한 TaqMan probe의 reporter dye는 이질아메바에 FAM, 동형아메바에 JOE 및 internal control에 Cy5를 사용하였다.
합성된 프라이머 및 TaqMan probe 세트를 이용해 각 양성 시료에 대한 실시간 증폭곡선을 확인한 결과 각각 검출 타겟인 genomic DNA에서만 정상적인 amplification plot을 나타내었다(도 11 참조).
Real-time PCR 반응액은 10 pmol/㎕로 희석한 forward 및 reverse 프라이머 각 1 ㎕와 2 pmol/㎕로 희석한 TaqMan probe 1 ㎕, 2X Real-time PCR MasterMix(Kogenebiotech) 10 ㎕에 template DNA 5 ㎕ 및 TE buffer를 첨가하여 최종 볼륨을 20 ㎕로 맞추었다. 이때 사용한 template DNA는 질병관리청에서 제공받은 이질아메바 및 동형아메바의 세포에서 추출한 DNA를 사용하였다.
PCR 조건은 50℃에서 2분간 carryover contamination 방지를 위한 UDG 처리 과정을 진행하고 95℃에서 10분간 Taq polymerase를 활성화시킨 후, 95℃ 15초 및 60℃ 1분은 1 cycle로 하여 총 40 cycle을 수행하였다. 사용한 Real-time PCR 장비는 AppliedBiosystems 7500 Real-time PCR system (Life technologies, USA)였다.
4-2. 프라이머 및 프로브 농도조건 확립
Multiplex를 위한 조건 최적화 시 고려할 사항으로 각 target 별 amplification plot의 △Rn 값 및 linear phase의 기울기를 유사하게 조절하고, 각 TaqMan probe의 형광 dye들의 cross talk 현상을 최소화하기 위해서 probe 농도를 조절할 것, single 프라이머 및 프로브 조건에서와 증폭 효율을 유사하게 맞출 것 등이 있다.
최적화된 프라이머 및 프로브의 농도 조건 및 inhibition 확인 시험 데이터는 도 12 내지 14와 같으며, singleplex 반응액과 multiplex 반응액에서의 각 Target DNA 검출 Ct 값에 큰 차이가 없으며 plot shape에도 유의미한 차이점이 없었다. 이질아메바 및 동형아메바의 단일 프라이머 및 프로브 세트 반으앵ㄱ과 두 가지의 프라이머 및 프로브 세트와 internal control이 혼합된 멀티플렉스 반응액 간에 증폭 곡선의 효율을 Ct value와 plot shape을 통해서 비교하였다.
4-3. Real-time PCR MasterMix 선정
최적의 성능을 확보할 수 있는 Real-time PCR MasterMix를 선정하기 위해서 동일한 프라이머 및 프로브 혼합 조건을 이용해 두 가지의 MasterMix 간의 성능 비교 테스트를 수행하였다.
두 가지의 Real-time PCR MasterMix 반응액은 각 농도로 혼합한 프라이머 및 프로브 시약 5 ㎕, 2X Real-time MasterMix 10 ㎕와 단계적으로 희석한 DNA 5 ㎕를 첨가하여 최종 볼륨을 20 ㎕로 맞추었다(도 15 참조).
PCR 조건은 50℃에서 2분간 carryover contamination 방지를 위한 UDG 처리 과정을 진행하고 95℃에서 10분간 Taq polymerase를 활성화시킨 후, 95℃ 15초 및 60℃ 1분은 1 cycle로 하여 총 40 cycle을 수행하였다. 사용한 Real-time PCR 장비는 AppliedBiosystems 7500 Real-time PCR system (Life technologies, USA)였다.
이질아메바 양성 시료를 이용한 MasterMix 별 성능 비교 시험에서는 1번 MasterMix와 2번 시약 사용 조건에서의 Ct 값이 유사하게 검출이 되었으나 amplification plot의 △Rn 값에서 근소한 차이가 나타났다.
동형아메바 양성 시료를 이용한 MasterMix 별 성능 비교 시험에서는 2번 시약 사용시 급격하게 plot의 기울기가 감소하면서 민감의 큰 차이가 발생하였으므로, 1번 MasterMix 사용 시 성능이 현저한 우수한 것을 확인하였다.
MasterMix 별 성능 비교 결과를 종합하였을 때, 이질아메바와 동형아메바 타겟 모두에서 우수한 성능을 나타낸 Real-time PCR MasterMix 1번 시약을 본 발명의 주 성분으로 최종 결정하였다(도 16 참조).
<실시예 5> 양성표준물질 제작
확립된 이질아메바와 동형아메바의 동시 검출용 Multiplex Real-time PCR 시스템의 양성표준시료를 제작하였으며 사용 목적은 검출한계 등 분석적 성능 시험에 표준물질로 사용하고, 키트 제작 시 프라이머와 프로브 염기서열 및 enzyme 등의 시약 구성물들이 정상적으로 작동하는지 여부를 확인하는 양성 대조군으로써 활용하고자 하는 것이다.
양성표준시료의 성상은 각 프라이머의 증폭 시퀀스를 포함한 plasmid DNA이며 이의 제조 방법은 다음과 같다. 양성시료를 본 키트의 프라이머로 증폭시켜 생성된 각 target의 PCR product를 삽입 유전자로 활용하였다. 삽입 유전자의 증폭산물을 벡터와 함께 클로닝 서비스 전문 업체에 의뢰하여 유전자 클로닝을 진행하였다(도 17 참조).
클로닝이 완료된 플라스미드 DNA를 시퀀싱 전문 업체에 의뢰하여 M13 프라이머로 양방향 시퀀스 분석을 진행한 후 NCBI (National center for Biotechnology information)의 Global Align tool을 또는 Geneious 프로그램을 이용하여 삽입된 프라이머 및 프로브 사이트의 매치 여부를 확인하였다.
Enzyme digestion 단계로서, 염기서열 분석이 완료된 플라스미드는 제한효소를 처리하여 linearization 시켰고, NanoDrop Spectrophotometer를 이용하여 플라스미드의 농도를 측정하였다. 사용하는 제한 효소 제품 및 조성은 도 18 및 19와 같다. 37℃에서 overnight incubation 한 뒤, 65℃에서 20분간 방치하여 효소를 불활성시켰다. Enzyme 처리한 DNA를 1% agarose gel에 전기영동하여 linear화 여부를 확인한 뒤, Qiaquick PCR purification kit(Qiagen, Germany)를 사용하여 DNA purification을 제품 매뉴얼에 따라서 수행하였다.
DNA 정량은 purification이 완료된 DNA는 NanoDrop Spectrophotometer를 이용하여 플라스미드의 농도를 측정하였고, 측정된 DNA 농도와 시퀀스 길이를 이용하여 copy number를 계산하였다.
DNA copy number = (DNA 농도 X 6.022 X 1023) / {Plasmid size (Vector size + PCR product size) X 1 X 109 X 650}
합성된 양성표준 플라스미드 DNA stock을 Real-time PCR로 확인하였고, amplification plot을 확인하였다(도 20 참조).
<실시예 6> 성능평가
6-1. 분석적 특이도(Analytical specificity)
개발한 multiplex Real-time PCR 시스템의 특이성을 교차반응시험을 통해 평가하였다. 임상 검체에 오염 가능한 상재균, 유사한 증상의 원인이 될 수 있는 다른 장관 감염 원충과 장내 상재 가능한 세균, 바이러스 및 human genomic DNA를 포함한 다양한 생물종의 핵산을 이용하여 Real-time PCR을 수행한 후 각각의 시료에 대한 검출 결과를 분석하였다.
시험에 사용한 물질은 질병관리청, NCCP 국가병원체자원은행, KCTC 생물자원센터 (Korean Collection for Type cultures), ATCC (American Type Culture Collection)에서 분양 받거나 Vircell S.L (Santafe, Spain)에서 핵산을 구입하여 사용하였다.
교차반응 시험 결과 target인 이질아메바와 동형아메바에서만 각각의 형광 채널에서 검출반응이 일어났고 다른 종의 핵산에서는 검출반응이 일어나지 않았다(도 21 참조).
6-2. 직선성(Linearity) 확인
시험법에 있어서 직선성이란 검체 중에 함유되어 있는 분석 대상물질(target analyte)의 양에 정비례하는 결과를 제공할 수 있는 능력을 말하며 시험 기준은 최소 5 농도 이상 단계 희석한 시험물질을 이용하며 standard curve를 작성하여 R2값이 0.99 이상일 경우 유효하다고 판단한다.
이질아메바의 직선성은 세포수를 측정한 시료(ATCC 30459, 2.2 X 105 cells/㎖)에서 추출한 DNA와 18S rRNA gene의 카피수를 정량한 DNA(ATCC 30459DQ, 3.4X105 genome copies/㎕) 및 합성 oligo DNA(106 target copies/㎕) 총 3가지의 양성시료를 이용해 측정하였다.
각 시료를 TE buffer를 이용해 10배씩 순차적으로 희석한 뒤, template DNA로 사용하여 PCR을 수행, 측정 Ct 값과 농도를 이용해 standard curve를 작성한 결과 모두 R2값이 0.99이상이었고, slope로부터 계산된 PCR 효율도 100%에 근접한 것으로 나타나 시스템의 직선성과 효율성을 확인하였다(도 22 내지 25 참조).
[계산식] PCR Efficiency = 10(-1/slope)-1
이질아메바의 직성선 확인 시험에서 세포수와 카피 수에 따른 Ct 측정값에 차이가 발생한 점은 본 발명의 시스템에서 이질아메바의 검출을 위해 사용한 표적 유전자가 핵 내에 multicopy로 존재할 수 있음에서 기인한 것으로 사료되나 결과의 타당성을 입증하기 위해서 reference primer를 이용한 검증 시험을 수행하였다(도 26 참조).
해당 시험에서도 10-1 cells까지 PCR 증폭 band가 확인되어 본 발명의 시스템을 이용한 결과와 일치함을 확인하였다(도 27 참조).
동형아메바의 직선성은 세포수를 측정한 시료(질병관리청 제공, 105 cells/㎖)에서 추출한 DNA와 본 합성 oligo DNA(106 target copies/㎕)를 이용해 시험하였다.
각 시료를 TE buffer를 이용해 10배씩 순차적으로 희석한 뒤, template DNA로 사용하여 PCR을 수행, 측정 Ct 값과 농도를 이용해 standard curve를 작성한 결과 모두 R2값이 0.99이상이었고, slope로부터 계산된 PCR 효율도 100%에 근접한 것으로 나타나 시스템의 직선성과 효율성을 확인하였다(도 28 내지 30 참조).
6-3. 분석적 민감도(Analytical sensitivity)
본 발명의 시약의 분석적 민감도는 양성표준물질을 이용해 시험하였으며, 각 타겟의 추정되는 검출 한계 근처를 4개의 농도로 희석하여 제조한 시료를 24회 반복시험하였으며, 총 시험 건수 중 95% 이상 양성으로 판정될 수 있는 농도를 최소 검출한계(Limit of detection, LOD)로 결정하였다(도 31 및 32 참조).
이질아메바와 동형아메바의 표준물질로 제작한 plasmid DNA를 10, 5, 2.5, 1 copies/㎕로 순차적으로 희석한 뒤, 각 농도별 24회 반복 시험한 결과로부터 산출한 95% 이상 검출 가능한 최소 농도가 이질아메바 및 동형아메바 모두 1 copy/㎕로 분석되었다(도 33 내지 36 참조).
6-4. 정밀도(Precision)
정밀도는 규정된 조건 하에서는 얻어진 독립적인 검사 결과를 가운데 일치도의 근접성을 측정하는 것으로써 시험법의 정밀성을 표준편차(standard deviation, SD) 또는 변동계수(coefficient of variation, CV)로 표시하며 CV 5% 미만일 경우 정밀성이 확보된다고 판단할 수 있다.
본 발명의 시약의 정밀도는 날짜 간(between day), 시험 간(between run) 반복성으로 평가하였다. 각 target 별 3 가지 농도의 표준시료를 시험하였으며 분석적 민감도 시험 결과를 바탕으로 저농도(low positive), 중간 농도(moderate positive) 및 고농도(high positive)를 각각 LOD, 3 X LOD 및 5 X LOD로 설정하였다(CLSI EP5-A2). 타겟 별 시료를 10일 동안 1일 1회, 시료의 농도 당 2반복 시험하였다.
반복성 시험 결과 산출된 검사 날짜 간(between-day), 검사 간(between-run) CV (%)는 5% 미만으로 산출되어 본 발명의 시약 시스템의 정밀성을 입증하였다(도 37 및 38 참조).
6-5. 양성 시료를 이용한 성능 확인
질병청으로부터 제공받은 양성 시료를 이용해 개발된 멀티플렉스 시약의 성능을 확인 시험을 수행하였다. 100건의 DNA 시료 중 개발시약에서 이질아메바로 확인된 것은 42건, 동형아메바로 확인된 건은 8건으로 확인되었으며 복합감염은 2건으로 확인되었다(도 39 참조).
100건의 DNA 시료에 대한 양성/음성 분석결과 제공받은 정보와 개발시약의 분석결과가 동일함을 확인하였으며 해당 데이터를 이용한 최적의 cut-off 설정을 위해 MedCalc program을 이용해 receiver-operating characteristic (ROC) curve를 작성하였다. 분석 결과 이질아메바의 cut-off는 32.8로 이때의 민감도 및 특이도는 100%로 확인되었고 동형아메바의 cut-off는 37.6으로 이때의 민감도 및 특이도는 100%였다(도 40 및 41 참조).
또한, 테스트의 진단 능력을 평가하는 척도인 ROC curve의 아래 면적(AUC)이 1.0으로 나타나 본 발명의 시약 키트의 정확성을 확인할 수 있었다. 하지만, 통계적으로 더욱 신뢰도를 높이기 위해서 양성 및 음성 필드 시료를 더 확보하여 데이터를 축적할 필요성이 있을 것으로 사료된다.
<110> KCDC
<120> Primer set for differentiating entamoeba histolytica and
entamoeba dispar
<130> M21-0000
<160> 6
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> E. histolytica ITS2 F-primer
<400> 1
gccgataaat gagagaagaa gtaaagag 28
<210> 2
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> E. histolytica ITS2 R-primer
<400> 2
gcgatactca aatctttatt tattggtc 28
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 3
ttaaccaaat atcaatagac agacc 25
<210> 4
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> E. dispar ITS2 F-primer
<400> 4
aataaatcat aaaaaagcaa atattagtag aagtg 35
<210> 5
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> E. dispar ITS2 R-primer
<400> 5
aataaatcat aactcaaatc tttatttatt aactcac 37
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> E. dispar ITS2 Probe
<400> 6
tagtgggtaa aagagagaag a 21
Claims (12)
- 삭제
- 삭제
- 서열번호 1을 포함하는 정방향 프라이머; 서열번호 2를 포함하는 역방향 프라이머; 및 서열번호 3을 포함하는 프로브, 및
서열번호 4를 포함하는 정방향 프라이머; 서열번호 5를 포함하는 역방향 프라이머; 및 서열번호 6을 포함하는 프로브를를 포함하는 이질아메바(Entamoeba histolytica)와 동형아메바(Entamoeba dispar) 감별용 프라이머 세트 - 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 제3항의 프라이머 세트를 포함하는 이질아메바(Entamoeba histolytica)와 동형아메바(Entamoeba dispar) 감별용 조성물
- 제8항에 있어서, 시료는 분변, 혈액, 뇌척수액, 혈청, 객담, 소변 또는 생체 조직으로부터 분리된 것을 특징으로 하는 이질아메바(Entamoeba histolytica)와 동형아메바(Entamoeba dispar) 감별용 조성물
- 제3항의 프라이머 세트를 포함하는 아메바증 진단용 조성물
- 제10항에 있어서, 상기 아메바증은 이질, 간농양, 복부 경련 통증, 설사, 변비, 상복부 압통, 발열, 잔변감 및 혈변으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 아메바증 진단용 조성물
- 제10항에 있어서, 시료는 분변, 혈액, 뇌척수액, 혈청, 객담, 소변 또는 생체 조직으로부터 분리된 것을 특징으로 하는 아메바증 진단용 조성물
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|---|
| GENEBANK ACCESSION NO.AB282661.1 |
| GENEBANK ACCESSION NO.X65163.1 |
| SRIVASTAVA ET AL., EXPERIMENTAL PARASITOLOGY., 110(3), 303~308, 2005.04.01 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR20230005450A (ko) | 2023-01-10 |
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