JP2017501733A - エントアメーバの核酸の検出 - Google Patents
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Abstract
本明細書で提供されるものは、エントアメーバの核酸を検出する組成物、方法、及びキットである。いくつかの実施態様は、E.ヒストリチカ（E. histolytica）の検出に関連するが、E.ジスパー（E. dispar）の検出には関係しない。いくつかの実施態様は、E.ヒストリチカのレベルの定量に関する。
Description
（関連出願）本出願は、米国仮特許出願61/923086（2014年1月2日出願）（前記は参照によりその全体が本明細書に含まれる）に関し優先権を主張する。
（配列表、表又はコンピュータプログラム表）本出願は、電子形式の配列表とともに出願されている。前記配列表は、GENOM123WOSEQUENCE.TXTの表題のファイルとして提供されている（前記ファイルは2014年12月22日に作成及び最新保存され、サイズは7,503バイトである）。前記情報は参照によりその全体が本明細書に含まれる。
（技術分野）
本明細書の実施態様は、概してエントアメーバの核酸の存在を検出するために有用な方法及び組成物に関する。
（配列表、表又はコンピュータプログラム表）本出願は、電子形式の配列表とともに出願されている。前記配列表は、GENOM123WOSEQUENCE.TXTの表題のファイルとして提供されている（前記ファイルは2014年12月22日に作成及び最新保存され、サイズは7,503バイトである）。前記情報は参照によりその全体が本明細書に含まれる。
（技術分野）
本明細書の実施態様は、概してエントアメーバの核酸の存在を検出するために有用な方法及び組成物に関する。
アメーバ症は、原生動物エントアメーバ・ヒストリチカ（Entamoeba histolytica）の感染によって引き起こされうる疾患である。E.ヒストリチカ感染は典型的には腸管内で生じ、大腸炎及びアメーバ赤痢を引き起こしうる。E.ヒストリチカ感染はまた、他の器官（肝、肺又は中枢神経系を含む）にも分散しうる。E.ジスパー（E. dispar）は非病原性種であり、病原性E.ヒストリチカと形態学的に区別できない（Verweij et al., J. Clin. Microbiol. 42: 1220-23, 2004）。さらにまた、E.ジスパー及びE.ヒストリチカのゲノムは高度の核酸配列相同性を有する。E.ヒストリチカ及び/又はE.ジスパーは世界の人口の10％に寄生していると概算されている（Verweij et al., J. Clin. Microbiol. 42: 1220-23, 2004）。しかしながら、これらのエントアメーバ感染の約10％のみが病原性であり（例えばE.ヒストリチカによる感染）、治療を要する（Gonin et al., J. Clin. Microbiol. 41: 237-42, 2003）。したがって、E.ジスパー感染とE.ヒストリチカ感染の識別は臨床判断の助言に有用である。
定量的な核酸の増幅反応は、サンプルに存在する標的核酸配列の相対量及び/又は絶対量の定量に有用でありうる。定量的核酸増幅反応の高度に鋭敏な性質のために、偽陽性、偽陰性、標的若しくは生成物の量の過大評価、又は標的若しくは生成物の量の過小評価を回避するために、定量核酸増幅のための試薬及び方法の選択には甚大な注意を払わなければならない。リボソームDNA（rDNA）遺伝子は高度に保存されている。rDNAの高度な保存は同じ種の異なる生物間では極めて低い変動性しかもたらさず、所望の種の検出を目的とする核酸系検出アッセイでrDNA遺伝子を有用にすることができる。しかしながら、E.ヒストリチカとE.ジスパーのrDNA遺伝子の高度な相同性は、様々な種を特異的に検出する定量的核酸増幅を複雑にすることがある。例えば、多重鋳型PCR増幅又はrDNA遺伝子は偏向を生じやすく多様な人工産物をもたらしうることが報告された（Kanagawa, J. Bioscience and Bioengineering 96: 317-23, 2003；Wang et al., Microbiology 142: 1107-14, 1996）。
定量的な核酸の増幅反応は、サンプルに存在する標的核酸配列の相対量及び/又は絶対量の定量に有用でありうる。定量的核酸増幅反応の高度に鋭敏な性質のために、偽陽性、偽陰性、標的若しくは生成物の量の過大評価、又は標的若しくは生成物の量の過小評価を回避するために、定量核酸増幅のための試薬及び方法の選択には甚大な注意を払わなければならない。リボソームDNA（rDNA）遺伝子は高度に保存されている。rDNAの高度な保存は同じ種の異なる生物間では極めて低い変動性しかもたらさず、所望の種の検出を目的とする核酸系検出アッセイでrDNA遺伝子を有用にすることができる。しかしながら、E.ヒストリチカとE.ジスパーのrDNA遺伝子の高度な相同性は、様々な種を特異的に検出する定量的核酸増幅を複雑にすることがある。例えば、多重鋳型PCR増幅又はrDNA遺伝子は偏向を生じやすく多様な人工産物をもたらしうることが報告された（Kanagawa, J. Bioscience and Bioengineering 96: 317-23, 2003；Wang et al., Microbiology 142: 1107-14, 1996）。
いくつかの実施態様にしたがえば、サンプル中のE.ヒストリチカポリヌクレオチドの存在を検出する方法が提供される。前記方法は、本質的に配列番号:1（GTACAAAATGGCCAATTCATTCAATG）から成る第一のプライマーとサンプルを接触させる工程を含むことができる。前記方法は、本質的に配列番号:2（ACTACCAACTGATTGATAGATCAG）から成る第二のプライマーとサンプルを接触させる工程を含むことができる。前記方法は、第一及び第二のプライマーを伸長させ、それによってE.ヒストリチカポリヌクレオチド配列がサンプルに存在する場合には少なくとも1つのアンプリコンを生成する工程を含むことができる。前記方法は、本質的に配列番号:3（ATTGTCGTGGCATCCTAACTCA）又はその相補物から成るポリヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドプローブと当該サンプルを接触させる工程を含むことができる。いくつかの実施態様では、前記プローブは、それが実質的に相補的な核酸と結合するときに検出可能なシグナルを提供するが、それが一本鎖であるときは検出可能なシグナルを提供しない。前記方法は、アンプリコンが存在する場合にはシグナルを検出する工程を含むことができる。いくつかの実施態様では、標準的な増幅条件下で用いられる場合には、第一のプライマー及び第二のプライマーはE.ヒストリチカポリヌクレオチド配列を増幅するが、いずれのE.ジスパーポリヌクレオチド配列も実質的に増幅しない。いくつかの実施態様では、第一のプライマーは、E.ヒストリチカポリヌクレオチド配列と下記括弧内の条件下（5mM MgCl2、100 mMトリス、10 mM NaOH、0.019% プロクリン300（ProClin300）、0.010%トウィーン-20、1.96%トレハロース、0.6mg/ml BSA中で少なくとも約50℃の温度）で接触する場合にはE.ヒストリチカポリヌクレオチド配列とハイブリダイズするが、いずれかのE.ジスパーポリヌクレオチド配列と下記括弧内の条件下（5mM MgCl2、100mMトリス、10mM NaOH、0.019%プロクリン300、0.010%トウィーン-20, 1.96%トレハロース、0.6mg/ml BSA中で少なくとも約60℃の温度）で接触する場合にはいずれのE.ジスパーポリヌクレオチド配列ともハイブリダイズしない。いくつかの実施態様では、第二のプライマーは、E.ヒストリチカポリヌクレオチド配列と下記括弧内の条件下（5mM MgCl2、100 mMトリス、10 mM NaOH、0.019% プロクリン300、0.010%トウィーン-20、1.96%トレハロース、0.6mg/ml BSA、1.96%トレハロース、0.6mg/ml BSA中で少なくとも約60℃の温度）で接触する場合にはE.ヒストリチカポリヌクレオチド配列とハイブリダイズし、さらにE.ジスパーポリヌクレオチド配列と下記括弧内の条件下（5mM MgCl2、100mMトリス、10mM NaOH、0.019%プロクリン300、0.010%トウィーン-20, 1.96%トレハロース、0.6mg/ml BSA、1.96%トレハロース、0.6mg/ml BSA中で少なくとも約60℃の温度）で接触する場合にはE.ジスパーポリヌクレオチド配列とハイブリダイズする。いくつかの実施態様では、第一のプライマー及び第二のプライマーの各々は、E.ヒストリチカポリヌクレオチド配列と下記括弧内の条件下（5mM MgCl2、100 mMトリス、10 mM NaOH、0.019% プロクリン300、0.010%トウィーン-20、1.96%トレハロース、0.6mg/ml BSA、1.96%トレハロース、0.6mg/ml BSA中で少なくとも約60℃の温度）で接触する場合にはE.ヒストリチカポリヌクレオチド配列とハイブリダイズするが、第二のプライマーは、いずれかのE.ジスパーポリヌクレオチド配列と下記括弧内の条件下（5mM MgCl2、100mMトリス、10mM NaOH、0.019%プロクリン300、0.010%トウィーン-20, 1.96%トレハロース、0.6mg/ml BSA中で少なくとも約60℃の温度）で接触する場合にはいずれのE.ジスパーポリヌクレオチド配列ともハイブリダイズしない。いくつかの実施態様では、サンプルはE.ヒストリチカ及びE.ジスパーを含む。いくつかの実施態様では、サンプルはヒトの糞便材料を含む。いくつかの実施態様では、サンプルは固定材料を含む。いくつかの実施態様では、サンプルは固定されない。いくつかの実施態様では、E.ヒストリチカの95％検出限界は、1ミリリットルにつき約17を超えないE.ヒストリチカゲノムを含む。いくつかの実施態様では、標準的な増幅条件下で用いられる場合、該プライマー及びプローブは、以下の生物のいずれとも（それらが当該サンプルに存在していても）交差反応しない：
アビオトロフィア・デフェクチバ（Abiotrophia defectiva）、アシネトバクター・バウマンニー（Acinetobacter baumannii）、アシネトバクター・イウォッフィー（Acinetobacter Iwoffii）、アエロモナス・ヒドロフィラ（Aeromonas hydrophila）、アルカリゲネス・ファエカリス亜種ファエカリス（Alcaligenes faecalis subsp. Faecalis）、アナエロコッカス・テトラジウス（Anaerococcus tetradius）、アルコバクター・ブツレリ（Arcobacter butzleri）、アルコバクター・クリアエロフィルス（Arcobacter cryaerophilus）、バシルス・セレウス（Bacillus cereus）、バクテロイデス・カッカエ（Bacteroides caccae）、バクテロイデス・メルダエ（Bacteroides merdae）、バクテロイデス・ステルコリス（Bacteroides stercoris）、ビフィドバクテリウム・アドレッセンチス（Bifidobacterium adolescentis）、ビフィドバクテリウム・ロングム（Bifidobacterium longum）、カムプリロバクター・コリ（Camplylobacter coli）、カンピロバクター・コンシスス（Campylobacter concisus）、カンピロバクター・クルブス（Campylobacter curvus）、カンピロバクター・フェツス亜種フェツス（Campylobacter fetus subsp. Fetus）、カンピロバクター・フェツス亜種ベネレアリス（Campylobacter fetus subsp. Venerealis）、カンピロバクター・グラシリス（Campylobacter gracilis）、カンピロバクター・ホミニス（Campylobacter hominis）、カンピロバクター・ジェジュニ（Camplylobacter jejuni）、カンピロバクター・ラリ（Campylobacter lari）、カンピロバクター・レクツス（Campylobacter rectus）、カンピロバクター・ウプサリエンシス（Campylobacter upsaliensis）、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）、カンジダ・カテヌラテ（Candida catenulate）、セデセア・ダビサエ（Cedecea davisae）、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）、シトロバクター・アマロナチクス（Citrobacter amalonaticus）、シトロバクター・フルエンジイ（Citrobacter fruendii）、シトロバクター・コセリ（Citrobacter koseri）、シトロバクター・セドラキイ（Citrobacter sedlakii）、クロストリジウム・ジッフィシレ17858（Clostridium difficile 17858）、クロストリジウム・ジッフィシレ43598、クロストリジウム・ジッフィシレCCUG 8864-9689、クロストリジウム・ジッフィシレ43255、クロストリジウム・ジッフィシレBAA-1805、クロストリジウム・ジッフィシレ43593、クロストリジウム・パーフリンゲンス（Clostridium perfringens）、コリンセラ・アエロファシエンス（Collinsella aerofaciens）、コリネバクテリウム・ゲニタリウム（Corynebacterium genitalium）、デスルホビブリオ・ピガー（Desulfovibrio piger）、エドワルドシエラ・タルダ（Edwardsiella tarda）、エッゲルテーラ・レンタ（Eggerthella lenta）、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）、エンテロバクター・クロアカエ（Enterobacter cloacae）、エンテロコッカス・カッセリフラブス（Enterococcus casseliflavus）、エンテロコッカス・セコルム（Enterococcus cecorum）、エンテロコッカス・ジスパー（Enterococcus dispar）、エンテロコッカス・ファエカリス（Enterococus faecalis）、エンテロコッカス・ガリナルム（Enterococcus gallinarum）、エンテロコッカス・ヒラエ（Enterococcus hirae）、エンテロコッカス・ラッフィノスス（Enterococcus raffinosus）、大腸菌（Escherichia coli）、エシェリキア・フェルグソニイ（Escherichia fergusonii）、エシェリキア・ヘルマンニイ（Escherichia hermannii）、エシェリキア・ブルネリス（Escherichia vulneris）、フソバクテリウム・バリウム（Fusobacterium varium）、ガルドネレラ・バギナリス（Gardnerella vaginalis）、ゲメラ・モルビロルム（Gemella morbillorum）、ハフニア・アルベイ（Hafnia alvei）、ヘリコバクター・フェンネリアエ（Helicobacter fennelliae）、ヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pylori）、クエブシエラ・オキシトカ（Klebsiella oxytoca）、クレブシエラ・ニューモニア（Klebsiella pneumonia）、ラクトバシルス・アシドフィルス（Lactobacillus acidophilus）、ラクトバシルス・レウテリ（Lactobacillus reuteri）、ラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）、レミノレラ・グリモンチイ（Leminorella grimontii）、リステリア・グライイ（Listeria grayi）、リステリア・インノキュア（Listeria innocua）、リステリア・モノシトゲネス（Listeria monocytogenes）、モルガネラ・モルガニイ（Morganella morganii）、ペプトニフィルス・アサッカロリチクス（Peptoniphilus asaccharolyticus）、ペプトストレプトコッカス・アナエロビウス（Peptostreptococcus anaerobius）、プレシオモナス・シゲロイデス（Plesiomonas shigelloides）、ポルフィロモナス・アサッカロリチカ（Porphyromonas asaccharolytica）、プレボテラ・メラニノゲニカ（Prevotella melaninogenica）、プロテウス・ミラビリス（Proteus mirabilis）、プロテウス・ペンネリ（Proteus penneri）、プロテウス・ブルガリス（Proteus vulgaris）、プロビデンシア・アルカリファシエンス（Providencia alcalifaciens）、プロビデンシア・レットゲリ（Providencia rettgeri）、プロビデンシア・スチュアルチイ（Providencia stuartii）、シュードモナス・アエルギノーザ（Pseudomonas aeruginosa）、シュードモナス・フルオレセンス（Pseudomonas fluorescens）、ルミノコッカス・ブロミイ（Ruminococcus bromii）、ネズミチフス菌（Salmonella typhimurium）、サルモネラ・エンテリジチス（Salmonella enteriditis）、セラチア・リケファシエンス（Serratia liquefaciens）、セラチア・マルセッセンス（Serratia marcescens）、シゲラ・ソンネイ（Shigella sonnei）、シゲラ・フレキシネリ（Shigella flexneri）、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、スタフィロコッカス・エピデルミジス（Staphylococcus epidermidis）、ステノトロフォモナス・マルトフィリア（Stenotrophomonas maltophilia）、ストレプトコッカス・アガラクチアエ（Streptococcus agalactiae）、ストレプトコッカス・ジスガラクチアエ（Streptococcus dysgalactiae）、ストレプトコッカス・インテルメジウス（Streptococcus intermedius）、ストレプトコッカス・ウベリス（Streptococcus uberis）、トラブルシエラ・グアメンシス（Trabulsiella guamensis）、ベイロネラ・パルブラ（Veillonella parvula）、コレラ菌（Vibrio cholera）、ビブリオ・パラハエモリチクス（Vibrio parahaemolyticus）、エルシニア・ベルコビエリ（Yersinia bercovieri）、エルシニア・エンテロコリチカ（Yersinia enterocolitica）、エルシニア・ローデイ（Yersinia rohdei）、アデノウイルス2型、アデノウイルス14型、アデノウイルス40型、アデノウイルス41型、コクサッキーA9、コクサッキーB1、HHV-5、サイトメガロウイルス、エンテロウイルス69型、ヒトパピローマウイルス16型、ヒトパピローマウイルス18型、単純疱疹ウイルスI、単純疱疹ウイルスII、ノロウイルスI、ノロウイルスII、ロタウイルス、ブラストシスチス・ホミニス（Blastocystis hominis）、エンセファリトゾーン・インテスチナリス（Encephalitozoon intestinalis）、エンセファリトゾーン・ヘルム（Encephalitozoon hellum）、エンセファリトゾーン・クニクリ（Encephalitozoon cuniculi）、ペンタトリコモナス・ホミニス（Pentatrichomonas hominis）、エントアメーバ・バーレッテ（Entamoeba barrette）、エントアメーバ・ジスパー、エントアメーバ・ギギバリス（Entamoeba gigivalis）、エントアメーバ・インバデンス（Entamoeba invadens）、エントアメーバ・モシュコフスキー（Entamoeba moshkovskii）、エントアメーバ・ラナルム（Entamobea ranarum）、シトロバクター・フルエンジイ（Citrobacter fruendii）（rpt）、エンテロバクター・クロアカエ（Enterobacter cloacae）（rpt）、クリプトスポリジウム・パルブム（Cryptosporidium parvum）、ギアルジア・ランブリア（Giardia lamblia）、又はクリプトスポリジウム・メレアグリジス（Cryptosporidium meleagridis）。いくつかの実施態様では、標準的な増幅条件下で用いられる場合、プライマー及びプローブは、以下の生物のいずれとも（それらが当該サンプルに存在していても）交差反応しない：エントアメーバ・コリ（Entamoeba coli）、エントアメーバ・ジスパー、エントアメーバ・ポレッキ（Entamoeba polecki）、エントアメーバ・ムリス（Entamoeba muris）、エントアメーバ・ヌッタリイ（Entamoeba nuttalli）、エントアメーバ・ハルトマンニ（Entamoeba hartmanni）、及びエントアメーバ・ボビス（Entamoeba bovis）。いくつかの実施態様では、標準的な増幅条件下で用いられる場合、プライマー及びプローブは、E.ヒストリチカを含まないサンプルについて1600につき1つより少ない偽陽性を生じる。いくつかの実施態様では、E.ヒストリチカポリヌクレオチド配列が当該サンプルに存在するならば、E.ジスパーは存在していても、アンプリコンの生成を阻害しない。いくつかの実施態様では、E.ジスパーは存在していても、E.ヒストリチカの有無の決定を阻害しない。
アビオトロフィア・デフェクチバ（Abiotrophia defectiva）、アシネトバクター・バウマンニー（Acinetobacter baumannii）、アシネトバクター・イウォッフィー（Acinetobacter Iwoffii）、アエロモナス・ヒドロフィラ（Aeromonas hydrophila）、アルカリゲネス・ファエカリス亜種ファエカリス（Alcaligenes faecalis subsp. Faecalis）、アナエロコッカス・テトラジウス（Anaerococcus tetradius）、アルコバクター・ブツレリ（Arcobacter butzleri）、アルコバクター・クリアエロフィルス（Arcobacter cryaerophilus）、バシルス・セレウス（Bacillus cereus）、バクテロイデス・カッカエ（Bacteroides caccae）、バクテロイデス・メルダエ（Bacteroides merdae）、バクテロイデス・ステルコリス（Bacteroides stercoris）、ビフィドバクテリウム・アドレッセンチス（Bifidobacterium adolescentis）、ビフィドバクテリウム・ロングム（Bifidobacterium longum）、カムプリロバクター・コリ（Camplylobacter coli）、カンピロバクター・コンシスス（Campylobacter concisus）、カンピロバクター・クルブス（Campylobacter curvus）、カンピロバクター・フェツス亜種フェツス（Campylobacter fetus subsp. Fetus）、カンピロバクター・フェツス亜種ベネレアリス（Campylobacter fetus subsp. Venerealis）、カンピロバクター・グラシリス（Campylobacter gracilis）、カンピロバクター・ホミニス（Campylobacter hominis）、カンピロバクター・ジェジュニ（Camplylobacter jejuni）、カンピロバクター・ラリ（Campylobacter lari）、カンピロバクター・レクツス（Campylobacter rectus）、カンピロバクター・ウプサリエンシス（Campylobacter upsaliensis）、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）、カンジダ・カテヌラテ（Candida catenulate）、セデセア・ダビサエ（Cedecea davisae）、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）、シトロバクター・アマロナチクス（Citrobacter amalonaticus）、シトロバクター・フルエンジイ（Citrobacter fruendii）、シトロバクター・コセリ（Citrobacter koseri）、シトロバクター・セドラキイ（Citrobacter sedlakii）、クロストリジウム・ジッフィシレ17858（Clostridium difficile 17858）、クロストリジウム・ジッフィシレ43598、クロストリジウム・ジッフィシレCCUG 8864-9689、クロストリジウム・ジッフィシレ43255、クロストリジウム・ジッフィシレBAA-1805、クロストリジウム・ジッフィシレ43593、クロストリジウム・パーフリンゲンス（Clostridium perfringens）、コリンセラ・アエロファシエンス（Collinsella aerofaciens）、コリネバクテリウム・ゲニタリウム（Corynebacterium genitalium）、デスルホビブリオ・ピガー（Desulfovibrio piger）、エドワルドシエラ・タルダ（Edwardsiella tarda）、エッゲルテーラ・レンタ（Eggerthella lenta）、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）、エンテロバクター・クロアカエ（Enterobacter cloacae）、エンテロコッカス・カッセリフラブス（Enterococcus casseliflavus）、エンテロコッカス・セコルム（Enterococcus cecorum）、エンテロコッカス・ジスパー（Enterococcus dispar）、エンテロコッカス・ファエカリス（Enterococus faecalis）、エンテロコッカス・ガリナルム（Enterococcus gallinarum）、エンテロコッカス・ヒラエ（Enterococcus hirae）、エンテロコッカス・ラッフィノスス（Enterococcus raffinosus）、大腸菌（Escherichia coli）、エシェリキア・フェルグソニイ（Escherichia fergusonii）、エシェリキア・ヘルマンニイ（Escherichia hermannii）、エシェリキア・ブルネリス（Escherichia vulneris）、フソバクテリウム・バリウム（Fusobacterium varium）、ガルドネレラ・バギナリス（Gardnerella vaginalis）、ゲメラ・モルビロルム（Gemella morbillorum）、ハフニア・アルベイ（Hafnia alvei）、ヘリコバクター・フェンネリアエ（Helicobacter fennelliae）、ヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pylori）、クエブシエラ・オキシトカ（Klebsiella oxytoca）、クレブシエラ・ニューモニア（Klebsiella pneumonia）、ラクトバシルス・アシドフィルス（Lactobacillus acidophilus）、ラクトバシルス・レウテリ（Lactobacillus reuteri）、ラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）、レミノレラ・グリモンチイ（Leminorella grimontii）、リステリア・グライイ（Listeria grayi）、リステリア・インノキュア（Listeria innocua）、リステリア・モノシトゲネス（Listeria monocytogenes）、モルガネラ・モルガニイ（Morganella morganii）、ペプトニフィルス・アサッカロリチクス（Peptoniphilus asaccharolyticus）、ペプトストレプトコッカス・アナエロビウス（Peptostreptococcus anaerobius）、プレシオモナス・シゲロイデス（Plesiomonas shigelloides）、ポルフィロモナス・アサッカロリチカ（Porphyromonas asaccharolytica）、プレボテラ・メラニノゲニカ（Prevotella melaninogenica）、プロテウス・ミラビリス（Proteus mirabilis）、プロテウス・ペンネリ（Proteus penneri）、プロテウス・ブルガリス（Proteus vulgaris）、プロビデンシア・アルカリファシエンス（Providencia alcalifaciens）、プロビデンシア・レットゲリ（Providencia rettgeri）、プロビデンシア・スチュアルチイ（Providencia stuartii）、シュードモナス・アエルギノーザ（Pseudomonas aeruginosa）、シュードモナス・フルオレセンス（Pseudomonas fluorescens）、ルミノコッカス・ブロミイ（Ruminococcus bromii）、ネズミチフス菌（Salmonella typhimurium）、サルモネラ・エンテリジチス（Salmonella enteriditis）、セラチア・リケファシエンス（Serratia liquefaciens）、セラチア・マルセッセンス（Serratia marcescens）、シゲラ・ソンネイ（Shigella sonnei）、シゲラ・フレキシネリ（Shigella flexneri）、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、スタフィロコッカス・エピデルミジス（Staphylococcus epidermidis）、ステノトロフォモナス・マルトフィリア（Stenotrophomonas maltophilia）、ストレプトコッカス・アガラクチアエ（Streptococcus agalactiae）、ストレプトコッカス・ジスガラクチアエ（Streptococcus dysgalactiae）、ストレプトコッカス・インテルメジウス（Streptococcus intermedius）、ストレプトコッカス・ウベリス（Streptococcus uberis）、トラブルシエラ・グアメンシス（Trabulsiella guamensis）、ベイロネラ・パルブラ（Veillonella parvula）、コレラ菌（Vibrio cholera）、ビブリオ・パラハエモリチクス（Vibrio parahaemolyticus）、エルシニア・ベルコビエリ（Yersinia bercovieri）、エルシニア・エンテロコリチカ（Yersinia enterocolitica）、エルシニア・ローデイ（Yersinia rohdei）、アデノウイルス2型、アデノウイルス14型、アデノウイルス40型、アデノウイルス41型、コクサッキーA9、コクサッキーB1、HHV-5、サイトメガロウイルス、エンテロウイルス69型、ヒトパピローマウイルス16型、ヒトパピローマウイルス18型、単純疱疹ウイルスI、単純疱疹ウイルスII、ノロウイルスI、ノロウイルスII、ロタウイルス、ブラストシスチス・ホミニス（Blastocystis hominis）、エンセファリトゾーン・インテスチナリス（Encephalitozoon intestinalis）、エンセファリトゾーン・ヘルム（Encephalitozoon hellum）、エンセファリトゾーン・クニクリ（Encephalitozoon cuniculi）、ペンタトリコモナス・ホミニス（Pentatrichomonas hominis）、エントアメーバ・バーレッテ（Entamoeba barrette）、エントアメーバ・ジスパー、エントアメーバ・ギギバリス（Entamoeba gigivalis）、エントアメーバ・インバデンス（Entamoeba invadens）、エントアメーバ・モシュコフスキー（Entamoeba moshkovskii）、エントアメーバ・ラナルム（Entamobea ranarum）、シトロバクター・フルエンジイ（Citrobacter fruendii）（rpt）、エンテロバクター・クロアカエ（Enterobacter cloacae）（rpt）、クリプトスポリジウム・パルブム（Cryptosporidium parvum）、ギアルジア・ランブリア（Giardia lamblia）、又はクリプトスポリジウム・メレアグリジス（Cryptosporidium meleagridis）。いくつかの実施態様では、標準的な増幅条件下で用いられる場合、プライマー及びプローブは、以下の生物のいずれとも（それらが当該サンプルに存在していても）交差反応しない：エントアメーバ・コリ（Entamoeba coli）、エントアメーバ・ジスパー、エントアメーバ・ポレッキ（Entamoeba polecki）、エントアメーバ・ムリス（Entamoeba muris）、エントアメーバ・ヌッタリイ（Entamoeba nuttalli）、エントアメーバ・ハルトマンニ（Entamoeba hartmanni）、及びエントアメーバ・ボビス（Entamoeba bovis）。いくつかの実施態様では、標準的な増幅条件下で用いられる場合、プライマー及びプローブは、E.ヒストリチカを含まないサンプルについて1600につき1つより少ない偽陽性を生じる。いくつかの実施態様では、E.ヒストリチカポリヌクレオチド配列が当該サンプルに存在するならば、E.ジスパーは存在していても、アンプリコンの生成を阻害しない。いくつかの実施態様では、E.ジスパーは存在していても、E.ヒストリチカの有無の決定を阻害しない。
いくつかの実施態様にしたがえば、キットが提供される。キットは第一のプライマーを含むことができる。キットは第二のプライマーを含むことができる。いくつかの実施態様では、標準的な増幅条件下で用いられる場合、第一のプライマー及び第二のプライマーはE.ヒストリチカポリヌクレオチド配列を増幅し、それによってアンプリコンを生成するが、E.ジスパーポリヌクレオチド配列は実質的に全く増幅しない。キットはプローブを含むことができ、該プローブは実質的にある配列から成り、ここで、該配列又はその相補物は、当該アンプリコン、E.ヒストリチカのポリヌクレオチド配列、及びE.ジスパーのポリヌクレオチド配列の各々に存在する。いくつかの実施態様では、プローブは蛍光色素分子及び消光分子を含む。いくつかの実施態様では、プライマー及びプローブは、1ミリリットルにつき約17個のE.ヒストリチカを超えない95％検出限界でE.ヒストリチカポリヌクレオチド配列を増幅する。いくつかの実施態様では、標準的な増幅条件下で用いられる場合、該プライマー及びプローブは、以下の生物のいずれとも（それらが当該サンプルに存在していても）交差反応しない：アビオトロフィア・デフェクチバ、アシネトバクター・バウマンニー、アシネトバクター・イウォッフィー、アエロモナス・ヒドロフィラ、アルカリゲネス・ファエカリス亜種ファエカリス、アナエロコッカス・テトラジウス、アルコバクター・ブツレリ、アルコバクター・クリアエロフィルス、バシルス・セレウス、バクテロイデス・カッカエ、バクテロイデス・メルダエ、バクテロイデス・ステルコリス、ビフィドバクテリウム・アドレッセンチス、ビフィドバクテリウム・ロングム、カムプリロバクター・コリ、カンピロバクター・コンシスス、カンピロバクター・クルブス、カンピロバクター・フェツス亜種フェツス、カンピロバクター・フェツス亜種ベネレアリス、カンピロバクター・グラシリス、カンピロバクター・ホミニス、カンピロバクター・ジェジュニ、カンピロバクター・ラリ、カンピロバクター・レクツス、カンピロバクター・ウプサリエンシス、カンジダ・アルビカンス、カンジダ・カテヌラテ、セデセア・ダビサエ、クラミジア・トラコマチス、シトロバクター・アマロナチクス、シトロバクター・フルエンジイ、シトロバクター・コセリ、シトロバクター・セドラキイ、クロストリジウム・ジッフィシレ17858、クロストリジウム・ジッフィシレ43598、クロストリジウム・ジッフィシレCCUG 8864-9689、クロストリジウム・ジッフィシレ43255、クロストリジウム・ジッフィシレBAA-1805、クロストリジウム・ジッフィシレ43593、クロストリジウム・パーフリンゲンス、コリンセラ・アエロファシエンス、コリネバクテリウム・ゲニタリウム、デスルホビブリオ・ピガー、エドワルドシエラ・タルダ、エッゲルテーラ・レンタ、エンテロバクター・アエロゲネス、エンテロバクター・クロアカエ、エンテロコッカス・カッセリフラブス、エンテロコッカス・セコルム、エンテロコッカス・ジスパー、エンテロコッカス・ファエカリス、エンテロコッカス・ガリナルム、エンテロコッカス・ヒラエ、エンテロコッカス・ラッフィノスス、大腸菌、エシェリキア・フェルグソニイ、エシェリキア・ヘルマンニイ、エシェリキア・ブルネリス、フソバクテリウム・バリウム、ガルドネレラ・バギナリス、ゲメラ・モルビロルム、ハフニア・アルベイ、ヘリコバクター・フェンネリアエ、ヘリコバクター・ピロリ、クエブシエラ・オキシトカ、クレブシエラ・ニューモニア、ラクトバシルス・アシドフィルス、ラクトバシルス・レウテリ、ラクトコッカス・ラクチス、レミノレラ・グリモンチイ、リステリア・グライイ、リステリア・インノキュア、リステリア・モノシトゲネス、モルガネラ・モルガニイ、ペプトニフィルス・アサッカロリチクス、ペプトストレプトコッカス・アナエロビウス、プレシオモナス・シゲロイデス、ポルフィロモナス・アサッカロリチカ、プレボテラ・メラニノゲニカ、プロテウス・ミラビリス、プロテウス・ペンネリ、プロテウス・ブルガリス、プロビデンシア・アルカリファシエンス、プロビデンシア・レットゲリ、プロビデンシア・スチュアルチイ、シュードモナス・アエルギノーザ、シュードモナス・フルオレセンス、ルミノコッカス・ブロミイ、ネズミチフス菌、サルモネラ・エンテリジチス、セラチア・リケファシエンス、セラチア・マルセッセンス、シゲラ・ソンネイ、シゲラ・フレキシネリ、黄色ブドウ球菌、スタフィロコッカス・エピデルミジス、ステノトロフォモナス・マルトフィリア、ストレプトコッカス・アガラクチアエ、ストレプトコッカス・ジスガラクチアエ、ストレプトコッカス・インテルメジウス、ストレプトコッカス・ウベリス、トラブルシエラ・グアメンシス、ベイロネラ・パルブラ、コレラ菌、ビブリオ・パラハエモリチクス、エルシニア・ベルコビエリ、エルシニア・エンテロコリチカ、エルシニア・ローデイ、アデノウイルス2型、アデノウイルス14型、アデノウイルス40型、アデノウイルス41型、コクサッキーA9、コクサッキーB1、HHV-5、サイトメガロウイルス、エンテロウイルス69型、ヒトパピローマウイルス16型、ヒトパピローマウイルス18型、単純疱疹ウイルスI、単純疱疹ウイルスII、ノロウイルスI、ノロウイルスII、ロタウイルス、ブラストシスチス・ホミニス、エンセファリトゾーン・インテスチナリス、エンセファリトゾーン・ヘルム、エンセファリトゾーン・クニクリ、ペンタトリコモナス・ホミニス、エントアメーバ・バーレッテ、エントアメーバ・ジスパー、エントアメーバ・ギギバリス、エントアメーバ・インバデンス、エントアメーバ・モシュコフスキー、エントアメーバ・ラナルム、シトロバクター・フルエンジイ（rpt）、エンテロバクター・クロアカエ（rpt）、クリプトスポリジウム・パルブム、ギアルジア・ランブリア、又はクリプトスポリジウム・メレアグリジス。いくつかの実施態様では、第一のプライマーは、配列番号:1（GTACAAAATGGCCAATTCATTCAATG）と少なくとも約90％の同一性を有するポリヌクレオチド又はその相補物を含む。いくつかの実施態様では、第一のプライマーは、本質的に配列番号:1（GTACAAAATGGCCAATTCATTCAATG）又はその相補物から成る。いくつかの実施態様では、第二のプライマーは、配列番号:2（ACTACCAACTGATTGATAGATCAG）と少なくとも約90％の同一性を有するポリヌクレオチド又はその相補物を含む。いくつかの実施態様では、第二のプライマーは、配列番号:2（ACTACCAACTGATTGATAGATCAG）の配列又はその相補物を有するポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施態様では、プローブは、配列番号:3（ATTGTCGTGGCATCCTAACTCA）と少なくとも約90％の同一性を有するポリヌクレオチド又はその相補物を含む。いくつかの実施態様では、プローブは、配列番号:3（ATTGTCGTGGCATCCTAACTCA）の配列又はその相補物を有するポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施態様では、標準的な増幅条件下で用いられる場合、プライマー及びプローブは、以下の生物のいずれとも（それらが当該サンプルに存在していても）交差反応しない：エントアメーバ・コリ、エントアメーバ・ジスパー、エントアメーバ・ポレッキ、エントアメーバ・ムリス、エントアメーバ・ヌッタリイ、エントアメーバ・ハルトマンニ、及びエントアメーバ・ボビス。いくつかの実施態様では、標準的な増幅条件下で用いられる場合、プライマー及びプローブは、E.ヒストリチカを含まないサンプルについて1600につき1つより少ない偽陽性を生じる。いくつかの実施態様では、E.ヒストリチカポリヌクレオチド配列が当該サンプルに存在するならば、E.ジスパーは存在していても、アンプリコンの生成を阻害しない。いくつかの実施態様では、E.ジスパーは存在していても、E.ヒストリチカの有無の決定を阻害しない。
いくつかの実施態様にしたがえば、キットが提供される。キットは、配列番号:1（GTACAAAATGGCCAATTCATTCAATG）と少なくとも約90％の同一性を有するポリヌクレオチドを含む第一のプライマーを含むことができる。キットは、配列番号:2（ACTACCAACTGATTGATAGATCAG）と少なくとも約90％の同一性を有するポリヌクレオチドを含む第二のプライマーを含むことができる。キットは、配列番号:3（ATTGTCGTGGCATCCTAACTCA）と少なくとも約90％の同一性を有するポリヌクレオチド又はその相補物、蛍光色素分子及び消光分子を含むプローブを含むことができる。いくつかの実施態様では、第一のプライマーは、本質的に配列番号:1（GTACAAAATGGCCAATTCATTCAATG）から成る。いくつかの実施態様では、第二のプライマーは、本質的に配列番号:2（ACTACCAACTGATTGATAGATCAG）から成る。いくつかの実施態様では、プローブは、本質的に配列番号:3（ATTGTCGTGGCATCCTAACTCA）又はその相補物から成るポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施態様では、標準的な増幅条件下で用いられる場合、プライマー及びプローブは、以下の生物のいずれとも（それらが当該サンプルに存在していても）交差反応しない：エントアメーバ・コリ、エントアメーバ・ジスパー、エントアメーバ・ポレッキ、エントアメーバ・ムリス、エントアメーバ・ヌッタリイ、エントアメーバ・ハルトマンニ、及びエントアメーバ・ボビス。いくつかの実施態様では、標準的な増幅条件下で用いられる場合、プライマー及びプローブは、E.ヒストリチカを含まないサンプルについて1600につき1つより少ない偽陽性を生じる。いくつかの実施態様では、E.ヒストリチカポリヌクレオチド配列が当該サンプルに存在するならば、E.ジスパーは存在していても、アンプリコンの生成を阻害しない。いくつかの実施態様では、E.ジスパーは存在していても、E.ヒストリチカの有無の決定を阻害しない。
いくつかの実施態様では、サンプル中のE.ヒストリチカポリヌクレオチド配列の存在を検出する方法が提供される。前記方法は、当該サンプルを第一のプライマーと接触させる工程を含むことができる。前記方法は、当該サンプルを第二のプライマーと接触させる工程を含むことができる。いくつかの実施態様では、標準的な増幅条件下で用いられる場合には、第一のプライマー及び第二のプライマーはE.ヒストリチカポリヌクレオチド配列を増幅するが、いずれのE.ジスパーポリヌクレオチド配列も実質的に増幅しない。前記方法は、第一及び第二のプライマーを伸長させ、それによってE.ヒストリチカポリヌクレオチド配列がサンプルに存在する場合には少なくとも1つのアンプリコンを生成する工程を含むことができる。前記方法は、サンプルをオリゴヌクレオチドプローブと接触させる工程を含むことができる。いくつかの実施態様では、前記プローブは、それが実質的に相補的な核酸と結合するときに検出可能なシグナルを提供するが、前記プローブが一本鎖であるときは検出可能なシグナルを提供しない。いくつかの実施態様では、前記プローブはあるポリヌクレオチドを含み、前記ポリヌクレオチドは本質的に、E.ヒストリチカポリヌクレオチド配列、E.ジスパーのポリヌクレオチド配列、及びアンプリコンの配列の部分である配列から成る。前記方法は、アンプリコンが存在する場合にシグナルを検出する工程を含むことができる。いくつかの実施態様では、第一のプライマーは、E.ヒストリチカポリヌクレオチド配列と下記括弧内の条件下（5mM MgCl2、100 mMトリス、10 mM NaOH、0.019% プロクリン300、0.010%トウィーン-20、1.96%トレハロース、0.6mg/ml BSA中で少なくとも約50℃の温度）で接触する場合にはE.ヒストリチカポリヌクレオチド配列とハイブリダイズするが、いずれかのE.ジスパーポリヌクレオチド配列と下記括弧内の条件下（5mM MgCl2、100mMトリス、10mM NaOH、0.019%プロクリン300、0.010%トウィーン-20, 1.96%トレハロース、0.6mg/ml BSA中で少なくとも約60℃の温度）で接触する場合にはいずれのE.ジスパーポリヌクレオチド配列ともハイブリダイズしない。いくつかの実施態様では、第二のプライマーは、E.ヒストリチカポリヌクレオチド配列と下記括弧内の条件下（5mM MgCl2、100 mMトリス、10 mM NaOH、0.019% プロクリン300、0.010%トウィーン-20、1.96%トレハロース、0.6mg/ml BSA中で少なくとも約60℃の温度）で接触する場合にはE.ヒストリチカポリヌクレオチド配列とハイブリダイズし、さらにE.ジスパーポリヌクレオチド配列と下記括弧内の条件下（5mM MgCl2、100mMトリス、10mM NaOH、0.019%プロクリン300、0.010%トウィーン-20, 1.96%トレハロース、0.6mg/ml BSA中で少なくとも約60℃の温度）で接触する場合にはE.ジスパーポリヌクレオチド配列とハイブリダイズする。いくつかの実施態様では、第一のプライマー及び第二のプライマーの各々は、E.ヒストリチカポリヌクレオチド配列と下記括弧内の条件下（5mM MgCl2、100 mMトリス、10 mM NaOH、0.019% プロクリン300、0.010%トウィーン-20、1.96%トレハロース、0.6mg/ml BSA中で少なくとも約60℃の温度）で接触する場合にはE.ヒストリチカポリヌクレオチド配列とハイブリダイズするが、第二のプライマーは、いずれかのE.ジスパーポリヌクレオチド配列と下記括弧内の条件下（5mM MgCl2、100mMトリス、10mM NaOH、0.019%プロクリン300、0.010%トウィーン-20, 1.96%トレハロース、0.6mg/ml BSA中で少なくとも約50℃の温度）で接触する場合にはいずれのE.ジスパーポリヌクレオチド配列ともハイブリダイズしない。いくつかの実施態様では、第一のプライマーは、配列番号:1（GTACAAAATGGCCAATTCATTCAATG）と少なくとも約90％の同一性を有するポリヌクレオチド配列又はその相補物を含む。いくつかの実施態様では、第一のプライマーは、本質的に配列番号:1（GTACAAAATGGCCAATTCATTCAATG）又はその相補物から成る。いくつかの実施態様では、第二のプライマーは、配列番号:2（ACTACCAACTGATTGATAGATCAG）と少なくとも約90％の同一性を有するポリヌクレオチド又はその相補物を含む。いくつかの実施態様では、第二のプライマーは、配列番号:2（ACTACCAACTGATTGATAGATCAG）の配列又はその相補物を有するポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施態様では、プローブは、配列番号:3（ATTGTCGTGGCATCCTAACTCA）と少なくとも約90％の同一性を有するポリヌクレオチド又はその相補物を含む。いくつかの実施態様では、プローブは、配列番号:3（ATTGTCGTGGCATCCTAACTCA）の配列又はその相補物を有するポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施態様では、アンプリコンは、配列番号:7（GTACAAAATGGCCAATTCATTCAATGAATTGAGAAATGACATTCTAAGTGAGTTAGGATGCCACGACAATTGTAGAACACACAGTGTTTAACAAGTAACCAATGAGAATTTCTGATCTATCAATCAGTTGGTAGT）と少なくとも約95％の同一性を有するポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施態様では、サンプルはE.ヒストリチカ及びE.ジスパーを含む。いくつかの実施態様では、サンプルはヒトの糞便材料を含む。いくつかの実施態様では、サンプルは固定材料を含む。いくつかの実施態様では、サンプルは固定されない。いくつかの実施態様では、E.ヒストリチカの95％検出限界は、1ミリリットルにつき約17を超えないE.ヒストリチカゲノムを含む。いくつかの実施態様では、標準的な増幅条件下で用いられる場合、該プライマー及びプローブは、以下の生物のいずれとも（それらが当該サンプルに存在していても）交差反応しない：アビオトロフィア・デフェクチバ、アシネトバクター・バウマンニー、アシネトバクター・イウォッフィー、アエロモナス・ヒドロフィラ、アルカリゲネス・ファエカリス亜種ファエカリス、アナエロコッカス・テトラジウス、アルコバクター・ブツレリ、アルコバクター・クリアエロフィルス、バシルス・セレウス、バクテロイデス・カッカエ、バクテロイデス・メルダエ、バクテロイデス・ステルコリス、ビフィドバクテリウム・アドレッセンチス、ビフィドバクテリウム・ロングム、カムプリロバクター・コリ、カンピロバクター・コンシスス、カンピロバクター・クルブス、カンピロバクター・フェツス亜種フェツス、カンピロバクター・フェツス亜種ベネレアリス、カンピロバクター・グラシリス、カンピロバクター・ホミニス、カンピロバクター・ジェジュニ、カンピロバクター・ラリ、カンピロバクター・レクツス、カンピロバクター・ウプサリエンシス、カンジダ・アルビカンス、カンジダ・カテヌラテ、セデセア・ダビサエ、クラミジア・トラコマチス、シトロバクター・アマロナチクス、シトロバクター・フルエンジイ、シトロバクター・コセリ、シトロバクター・セドラキイ、クロストリジウム・ジッフィシレ17858、クロストリジウム・ジッフィシレ43598、クロストリジウム・ジッフィシレCCUG 8864-9689、クロストリジウム・ジッフィシレ43255、クロストリジウム・ジッフィシレBAA-1805、クロストリジウム・ジッフィシレ43593、クロストリジウム・パーフリンゲンス、コリンセラ・アエロファシエンス、コリネバクテリウム・ゲニタリウム、デスルホビブリオ・ピガー、エドワルドシエラ・タルダ、エッゲルテーラ・レンタ、エンテロバクター・アエロゲネス、エンテロバクター・クロアカエ、エンテロコッカス・カッセリフラブス、エンテロコッカス・セコルム、エンテロコッカス・ジスパー、エンテロコッカス・ファエカリス、エンテロコッカス・ガリナルム、エンテロコッカス・ヒラエ、エンテロコッカス・ラッフィノスス、大腸菌、エシェリキア・フェルグソニイ、エシェリキア・ヘルマンニイ、エシェリキア・ブルネリス、フソバクテリウム・バリウム、ガルドネレラ・バギナリス、ゲメラ・モルビロルム、ハフニア・アルベイ、ヘリコバクター・フェンネリアエ、ヘリコバクター・ピロリ、クレブシエラ・オキシトカ、クレブシエラ・ニューモニア、ラクトバシルス・アシドフィルス、ラクトバシルス・レウテリ、ラクトコッカス・ラクチス、レミノレラ・グリモンチイ、リステリア・グライイ、リステリア・インノキュア、リステリア・モノシトゲネス、モルガネラ・モルガニイ、ペプトニフィルス・アサッカロリチクス、ペプトストレプトコッカス・アナエロビウス、プレシオモナス・シゲロイデス、ポルフィロモナス・アサッカロリチカ、プレボテラ・メラニノゲニカ、プロテウス・ミラビリス、プロテウス・ペンネリ、プロテウス・ブルガリス、プロビデンシア・アルカリファシエンス、プロビデンシア・レットゲリ、プロビデンシア・スチュアルチイ、シュードモナス・アエルギノーザ、シュードモナス・フルオレセンス、ルミノコッカス・ブロミイ、ネズミチフス菌、サルモネラ・エンテリジチス、セラチア・リケファシエンス、セラチア・マルセッセンス、シゲラ・ソンネイ、シゲラ・フレキシネリ、黄色ブドウ球菌、スタフィロコッカス・エピデルミジス、ステノトロフォモナス・マルトフィリア、ストレプトコッカス・アガラクチアエ、ストレプトコッカス・ジスガラクチアエ、ストレプトコッカス・インテルメジウス、ストレプトコッカス・ウベリス、トラブルシエラ・グアメンシス、ベイロネラ・パルブラ、コレラ菌、ビブリオ・パラハエモリチクス、エルシニア・ベルコビエリ、エルシニア・エンテロコリチカ、エルシニア・ローデイ、アデノウイルス2型、アデノウイルス14型、アデノウイルス40型、アデノウイルス41型、コクサッキーA9、コクサッキーB1、HHV-5、サイトメガロウイルス、エンテロウイルス69型、ヒトパピローマウイルス16型、ヒトパピローマウイルス18型、単純疱疹ウイルスI、単純疱疹ウイルスII、ノロウイルスI、ノロウイルスII、ロタウイルス、ブラストシスチス・ホミニス、エンセファリトゾーン・インテスチナリス、エンセファリトゾーン・ヘルム、エンセファリトゾーン・クニクリ、ペンタトリコモナス・ホミニス、エントアメーバ・バーレッテ、エントアメーバ・ジスパー、エントアメーバ・ギギバリス、エントアメーバ・インバデンス、エントアメーバ・モシュコフスキー、エントアメーバ・ラナルム、シトロバクター・フルエンジイ（rpt）、エンテロバクター・クロアカエ（rpt）、クリプトスポリジウム・パルブム、ギアルジア・ランブリア、又はクリプトスポリジウム・メレアグリジス。いくつかの実施態様では、標準的な増幅条件下で用いられる場合、プライマー及びプローブは、以下の生物のいずれとも（それらが当該サンプルに存在していても）交差反応しない：エントアメーバ・コリ、エントアメーバ・ジスパー、エントアメーバ・ポレッキ、エントアメーバ・ムリス、エントアメーバ・ヌッタリイ、エントアメーバ・ハルトマンニ、及びエントアメーバ・ボビス。いくつかの実施態様では、標準的な増幅条件下で用いられる場合、プライマー及びプローブは、E.ヒストリチカを含まないサンプルについて1600につき1つより少ない偽陽性を生じる。いくつかの実施態様では、E.ヒストリチカポリヌクレオチド配列が当該サンプルに存在するならば、E.ジスパーは存在していても、アンプリコンの生成を阻害しない。いくつかの実施態様では、E.ジスパーは存在していても、E.ヒストリチカの有無の決定を阻害しない。
いくつかの実施態様では、サンプル中のE.ヒストリチカの核酸配列の有無を決定する方法が提供される。前記方法は、サンプルで核酸増幅反応を実施する工程を含み、前記核酸増幅は第一のオリゴヌクレオチドプライマー及び第二のオリゴヌクレオチドプライマーを含む。ここで前記第一のオリゴヌクレオチドプライマーは、15−75ヌクレオチドの長さを有し、標準的な条件下で配列番号:10又はその相補物とそれらが存在する場合にはハイブリダイズするが、標準的な条件下で配列番号:11又はその相補物とはそれらが存在していてもハイブリダイズしない。さらにここで、第二のオリゴヌクレオチドプライマーは15−75ヌクレオチドの長さを有し、標準的な条件下で配列番号:10又はその相補物とそれらが存在する場合にはハイブリダイズし、さらに第二のオリゴヌクレオチドプライマーは標準的な条件下で配列番号:11又はその相補とそれらが存在する場合にはハイブリダイズする。前記方法は、シグナルが存在する場合にシグナルを検出する工程を含み、前記シグナルは、第一及び第二のオリゴヌクレオチドプライマーのアンプリコンと当該アンプリコンが存在する場合に標準的なハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする、検出できるように標識されたプローブに由来し、ここでシグナルはアンプリコンの有無の指標であり、アンプリコンは75−350ヌクレオチドの長さを有する。場合によって第一のオリゴヌクレオチドプライマーは、配列番号:1の連続する少なくとも10ヌクレオチドを含み、さらに第一のオリゴヌクレオチドプライマーは、配列番号:10の標的配列又はその相補物と少なくとも80％の同一性を有する。場合によって、第二のオリゴヌクレオチドプライマーは、配列番号:2の連続する少なくとも10ヌクレオチドを含み、さらに第二のオリゴヌクレオチドプライマーは、配列番号:10の標的配列又はその相補物と少なくとも80％の同一性を有する。場合によって、第一のオリゴヌクレオチドプライマーは、配列番号:1の連続する少なくとも12ヌクレオチドを含む。場合によって、第一のオリゴヌクレオチドプライマーは、配列番号:1の連続する少なくとも15ヌクレオチドを含む。場合によって、第一のオリゴヌクレオチドプライマーは、配列番号:1の連続する少なくとも20ヌクレオチドを含む。場合によって、第一のオリゴヌクレオチドプライマーは、配列番号:10の標的配列又はその相補物と少なくとも85％の同一性を有する。場合によって、第一のオリゴヌクレオチドプライマーは、配列番号:10の標的配列又はその相補物と少なくとも90％の同一性を有する。場合によって、第一のオリゴヌクレオチドプライマーは、配列番号:10の標的配列又はその相補物と少なくとも95％の同一性を有する。場合によって、第一のオリゴヌクレオチドプライマーは、配列番号:10の標的配列又はその相補物と100％の同一性を有する。場合によって、第二のオリゴヌクレオチドプライマーは、配列番号:2の連続する少なくとも12ヌクレオチドを含む。場合によって、第二のオリゴヌクレオチドプライマーは、配列番号:2の連続する少なくとも15ヌクレオチドを含む。場合によって、第二のオリゴヌクレオチドプライマーは、配列番号:2の連続する少なくとも20ヌクレオチドを含む。場合によって、第二のオリゴヌクレオチドプライマーは、配列番号:10の標的配列又はその相補物と少なくとも85％の同一性を有する。場合によって、第二のオリゴヌクレオチドプライマーは、配列番号:10の標的配列又はその相補物と少なくとも90％の同一性を有する。場合によって、第二のオリゴヌクレオチドプライマーは、配列番号:10の標的配列又はその相補物と少なくとも95％の同一性を有する。場合によって、第二のオリゴヌクレオチドプライマーは、配列番号:10の標的配列又はその相補物と100％の同一性を有する。場合によって、プローブは、配列番号:3の連続する少なくとも10ヌクレオチドを含み、さらにプローブは、配列番号:10の標的配列又はその相補物と少なくとも80％の同一性を有する。場合によって、プローブは、配列番号:3の連続する少なくとも12ヌクレオチドを含む。場合によって、プローブは、配列番号:3の連続する少なくとも15ヌクレオチドを含む。場合によって、プローブは、配列番号:3の連続する少なくとも20ヌクレオチドを含む。場合によって、プローブは、配列番号:10の標的配列又はその相補物と少なくとも85％の同一性を有する。場合によって、プローブは、配列番号:10の標的配列又はその相補物と少なくとも90％の同一性を有する。場合によって、プローブは、配列番号:10の標的配列又はその相補物と少なくとも95％の同一性を有する。場合によって、プローブは、配列番号:10の標的配列又はその相補物と100％の同一性を有する。場合によって、第一のオリゴヌクレオチドプライマーは長さが約20−50ヌクレオチドである。場合によって、第一のオリゴヌクレオチドプライマーは長さが約23−45ヌクレオチドである。場合によって、第二のオリゴヌクレオチドプライマーは長さが約20−50ヌクレオチドである。場合によって、第二のオリゴヌクレオチドプライマーは長さが約23−45ヌクレオチドである。場合によって、検出できるように標識されたプローブは長さが約15−75ヌクレオチドである。場合によって、検出できるように標識されたプローブは長さが約20−45ヌクレオチドである。場合によって、プローブは、標準的なハイブリダイゼーション条件下で配列番号:10及び配列番号:11とハイブリダイズできる。場合によって、プローブは、標準的なハイブリダイゼーション条件下で配列番号:10とハイブリダイズできるが、配列番号:11とはハイブリダイズできない。場合によって、プローブは蛍光色素分子又は消光分子を含む。場合によって、アンプリコンは100−150ヌクレオチドの長さを有する。場合によって、アンプリコンは配列番号:7を含む。いくつかの実施態様では、上記に記載の第一のオリゴヌクレオチドプライマー、第二のオリゴヌクレオチドプライマー、及び検出できるように標識されたプローブのいずれかを含むキットが提供される。いくつかの実施態様では、サンプル中にE.ヒストリチカポリヌクレオチド配列が存在する場合は、E.ジスパーは存在していても、アンプリコンの生成を阻害しない。いくつかの実施態様では、E.ジスパーは存在していても、E.ヒストリチカの有無の決定を阻害しない。
E.ヒストリチカの検出、及びE.ヒストリチカの相対的レベルの定量は、臨床判断の助言に有用でありうる。定量的核酸増幅（例えば核酸増幅を含む定量的アッセイ、例えばポリメラーゼ連鎖反応（qPCR））は強度に鋭敏で核酸の定量に有用であり、したがって前記を用いて、核酸定量を土台にE.ヒストリチカの相対量を推論することができる。しかしながら、E.ジスパーの存在は、E.ヒストリチカを検出するいくつかのqPCR試薬の特異性及び有効性に干渉し、交差反応、シグナル抑制、または偽陰性すら引き起こしうることが本明細書では理解されていた。したがって、本明細書のいくつかの実施態様は、E.ジスパーの存在による実質的な干渉を示さない、E.ヒストリチカを検出及び定量する方法及び試薬を提供する。本明細書のいくつかの実施態様は、PCRによってE.ヒストリチカ核酸を検出する方法を提供する。本明細書のいくつかの実施態様は、E.ジスパーの存在による実質的な干渉を示さない、E.ヒストリチカを検出する試薬及びキットを提供する。
前述の一般的記述及び下記の詳細な記述は双方とも例示及び解説であり、本教示の範囲を制限する意図ではないことは理解されるべきである。本出願で、単数形の使用は特段の説明がなければ複数形を含む。さらにまた、“comprise（含む）”、“contain（含む）”及び“include（含む）”又はこれらの語根の変型（例えば“comprises”、“contained”及び“including”）は限定を意図しない。“又は”の使用は特段の記載がなければ“及び/又は”を意味する。“及び/又は”という用語は、前後の用語が一緒に取り入れられるか又は別々に取り入れられることを意味する。限定としてではなく例示を目的とすれば、“X及び/又はY”は“X”又は“Y”又は“X及びY”を意味し得る。
ある範囲の値が本明細書で提供されるときはいつでも、当該範囲は最初の値及び最後の値、並びに特段の記載がなければその間の任意の値又は値の範囲を含むことを意味する。例えば、“0.2から0.5”は、0.2、0.3、0.4、0.5；その間の範囲、例えば0.2−0.3、0.3-0.4、0.2−0.4；その間の数の増加、例えば0.25、0.35、0.225、0.335、0.49；その間の範囲の増加、例えば0.26−0.39などを意味する。
本明細書で用いられるセクションの見出しは単に編成を目的とし、記述される主題を限定しようとすると解されるべきではない。本明細書に引用される全ての文献及び同様な資料（特許、特許出願、記事、書籍、論文、及びインターネットウェブページ）を含むがただしこれらに限定されない）は、そのような文献及び同様な資料の形式に関わらず、任意の目的のために参照によりその全体が本明細書に含まれる。本明細書に含まれる当該文献及び同様な資料の1つ以上が、ある用語を本出願の用語の定義と矛盾する態様で定義するか又は使用する場合には本出願が統制する。本教示は多様な実施態様と一緒に記載されるが、本教示をそのような実施態様に限定することは意図されない。反対に、本教示は、当業者には理解されるように多様な代替型、修正及び等価物を包含する。
ある範囲の値が本明細書で提供されるときはいつでも、当該範囲は最初の値及び最後の値、並びに特段の記載がなければその間の任意の値又は値の範囲を含むことを意味する。例えば、“0.2から0.5”は、0.2、0.3、0.4、0.5；その間の範囲、例えば0.2−0.3、0.3-0.4、0.2−0.4；その間の数の増加、例えば0.25、0.35、0.225、0.335、0.49；その間の範囲の増加、例えば0.26−0.39などを意味する。
本明細書で用いられるセクションの見出しは単に編成を目的とし、記述される主題を限定しようとすると解されるべきではない。本明細書に引用される全ての文献及び同様な資料（特許、特許出願、記事、書籍、論文、及びインターネットウェブページ）を含むがただしこれらに限定されない）は、そのような文献及び同様な資料の形式に関わらず、任意の目的のために参照によりその全体が本明細書に含まれる。本明細書に含まれる当該文献及び同様な資料の1つ以上が、ある用語を本出願の用語の定義と矛盾する態様で定義するか又は使用する場合には本出願が統制する。本教示は多様な実施態様と一緒に記載されるが、本教示をそのような実施態様に限定することは意図されない。反対に、本教示は、当業者には理解されるように多様な代替型、修正及び等価物を包含する。
本開示の多様な実施態様は、エントアメーバの核酸の検出及び/又は識別又は同定で使用される組成物、及びキット、及び前記を用いる方法を記載する。したがって、いくつかの実施態様は、核酸検出アッセイ（例えば増幅アッセイ）で使用される核酸配列を提供する。いずれの核酸配列についても逆相補物を容易に入手できること、及び核酸配列の開示はまた当該配列の逆相補物の開示を提供することは当業者には理解されよう。本明細書に開示するいずれのDNA配列についても対応するRNA配列を容易に入手できること、及びいずれのRNA配列についても対応するDNAを例えば逆転写によって容易に入手できることは当業者には理解されよう。本明細書に開示する核酸配列の部分配列を容易に入手できることは当業者には理解されよう。“上流”は核酸配列上のある位置の5'側1つ以上の位置を指し、“下流”は核酸配列上のある位置の3'側1つ以上の位置を指す。
本明細書で提供される核酸は多様な形態でありうる。例えば、いくつかの実施態様では、核酸は、（単独で又は多様な他の核酸と組み合わされて）溶液（例えば緩衝液）中で溶解される。いくつかの実施態様では、核酸は、単独で又は他の核酸と組み合わされて、塩として提供される。いくつかの実施態様では、核酸は再構成することができる凍結乾燥形で提供される。例えば、いくつかの実施態様では、本明細書に開示される単離核酸は、単独の凍結乾燥ペレットで、又は、他の単離核酸と一緒に凍結乾燥ペレットで提供されうる。いくつかの実施態様では、核酸は固体物質（例えばビーズ、膜など）に固定されて提供される。いくつかの実施態様では、核酸は、宿主細胞中で（例えばプラスミドを保持する細胞株、又は安定的に組み込まれた配列を保有する細胞株として）提供される。いくつかの実施態様では、核酸は、宿主細胞（例えば1つ以上のエントアメーバ細胞）から単離される。いくつかの実施態様では、核酸は例えば化学的に又は無細胞系で合成される。
本明細書で提供される核酸は多様な形態でありうる。例えば、いくつかの実施態様では、核酸は、（単独で又は多様な他の核酸と組み合わされて）溶液（例えば緩衝液）中で溶解される。いくつかの実施態様では、核酸は、単独で又は他の核酸と組み合わされて、塩として提供される。いくつかの実施態様では、核酸は再構成することができる凍結乾燥形で提供される。例えば、いくつかの実施態様では、本明細書に開示される単離核酸は、単独の凍結乾燥ペレットで、又は、他の単離核酸と一緒に凍結乾燥ペレットで提供されうる。いくつかの実施態様では、核酸は固体物質（例えばビーズ、膜など）に固定されて提供される。いくつかの実施態様では、核酸は、宿主細胞中で（例えばプラスミドを保持する細胞株、又は安定的に組み込まれた配列を保有する細胞株として）提供される。いくつかの実施態様では、核酸は、宿主細胞（例えば1つ以上のエントアメーバ細胞）から単離される。いくつかの実施態様では、核酸は例えば化学的に又は無細胞系で合成される。
核酸増幅
いくつかの実施態様では、核酸増幅は定量的核酸増幅を含み、前記は例えば、ある核酸（例えばE.ヒストリチカ特異的又はE.ジスパー特異的核酸配列）がサンプルに存在するか否かを決定することができる。いくつかの実施態様では、核酸増幅は定量的核酸増幅を含み、前記は例えば、サンプルに存在する核酸の相対量又は絶対量を測定することができる。いくつかの実施態様では、核酸増幅は定量的及び定性的核酸増幅を含み、前記は例えば、ある核酸がサンプルに存在するか否かを決定し、存在する場合は当該サンプルに存在する核酸配列の相対量又は絶対量を測定することができる。いくつかの実施態様では、増幅の方法は多重アッセイを含み、前記は、2つ以上の寄生生物（例えばE.ヒストリチカ、E.ジスパー、ギアルジア・ランブリア、クリプトスポリジウム・パルブム、クリプトスポリジウム・ホミニス（Cryptosporidium hominis）などの少なくとも2つ以上）の存在をサンプル（例えばヒト糞便サンプル）で同定する。
いくつかの実施態様では、核酸増幅は定量的核酸増幅を含み、前記は例えば、ある核酸（例えばE.ヒストリチカ特異的又はE.ジスパー特異的核酸配列）がサンプルに存在するか否かを決定することができる。いくつかの実施態様では、核酸増幅は定量的核酸増幅を含み、前記は例えば、サンプルに存在する核酸の相対量又は絶対量を測定することができる。いくつかの実施態様では、核酸増幅は定量的及び定性的核酸増幅を含み、前記は例えば、ある核酸がサンプルに存在するか否かを決定し、存在する場合は当該サンプルに存在する核酸配列の相対量又は絶対量を測定することができる。いくつかの実施態様では、増幅の方法は多重アッセイを含み、前記は、2つ以上の寄生生物（例えばE.ヒストリチカ、E.ジスパー、ギアルジア・ランブリア、クリプトスポリジウム・パルブム、クリプトスポリジウム・ホミニス（Cryptosporidium hominis）などの少なくとも2つ以上）の存在をサンプル（例えばヒト糞便サンプル）で同定する。
核酸増幅の方法は以下を含むことができる（ただしこれらに限定されない）：ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）、鎖置換増幅（SDA）、例えば多重置換増幅（MDA）、ループ媒介等温増幅（LAMP）、リガーゼ連鎖反応（LCR）、免疫増幅、及び多様な転写系増幅方法（転写媒介増幅（TMA）、核酸配列依拠増幅（NASBA）、自家持続配列複製（3SR）及びローリングサークル増幅を含む）。例えば以下を参照されたい：Mullis,“Process for Amplifying, Detecting, and/or Cloning Nucleic Acid Sequences,”U.S. Pat. No. 4,683,195；Walker,“Strand Displacement Amplification,”U.S. Pat. No. 5,455,166；Dean et al,“Multiple displacement amplification,”U.S. Pat. No. 6,977,148；Notomi et al.,“Process for Synthesizing Nucleic Acid,”U.S. Pat. No. 6,410,278；Landegren et al. U.S. Pat. No. 4,988,617“Method of detecting a nucleotide change in nucleic acids”；Birkenmeyer,“Amplification of Target Nucleic Acids Using Gap Filling Ligase Chain Reaction,”U.S. Pat. No. 5,427,930；Cashman,“Blocked-Polymerase Polynucleotide Immunoassay Method and Kit,”U.S. Pat. No. 5,849,478；Kacian et al.,“Nucleic Acid Sequence Amplification Methods,”U.S. Pat. No. 5,399,491；Malek et al.,“Enhanced Nucleic Acid Amplification Process,”U.S. Pat. No. 5,130,238；Lizardi et al., BioTechnology, 6:1197 (1988)；Lizardi et al., U.S. Pat. No. 5,854,033“Rolling circle replication reporter systems.”。いくつかの実施態様では、列挙した核酸増幅方法の2つ以上が例えば連続的に実施される。いくつかの実施態様では、標的RNA配列が増幅される。いくつかの実施態様では、標的RNA配列は逆転写され、当該逆転写物は本明細書に記載の核酸増幅方法を用いて増幅されるDNAを含む。
いくつかの実施態様では、核酸増幅は定量的である。定量的核酸増幅は生成されたアンプリコンの量の検出を含むことができる。検出は持続的に又は周期的に実施できる。例えば、検出は、ある一定の時点で、例えばN回目のサイクルの最後に又はその部分で実施でき、ここでNは1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、21、23、24、25、26、27、28、29、30、21、32、32、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、75、80、85、95、100などの1つである。いくつかの実施態様では、検出は、蛍光の測定、例えば本明細書に記載のプローブに結合された蛍光色素分子の発光波長での、又はプローブに結合された蛍光色素分子の発光波長を含む波長範囲での電磁波放射線の強度の測定を含むことができる。本明細書に特記するように、例示的プローブには、分子ビーコン、SCORPIONSTMプローブ（Sigma）、TAQMANTMプローブ（Life Technologies）などが含まれる。いくつかの実施態様では、検出はFRETの検出を含むことができる。いくつかの実施態様では、検出は、非特異的な検出可能マーカー（dsDNAに結合するがssDNAには結合しない）の強度の検出を含むことができる。そのような非特異的色素の例にはインターカレート剤、例えばSYBRグリーンI（Molecular Probe）、ピコグリーン（PicoGreen, Molecular Probes）などが含まれる。
本明細書で用いられるように、“実質的（substantial）”増幅及びこれらの語根の修正（例えば“実質的に増幅する（substantially amplify、amplify substantially）”など）は、指数関数的収量のアンプリコンを標準的増幅条件下で生成する増幅を指す。例えば、増幅及びLAMPのPCR誘導形は別々の二本鎖アンプリコンを生成でき、それに対して各鎖は連続する増幅ラウンドで鋳型として働くことができ、したがって指数関数的増幅が可能になる。本明細書では鋳型は、当該鋳型と100%未満の相補性を有するポリヌクレオチド（例えば1つ以上の位置に縮退ヌクレオチド、イノシンなどを有するプライマー及び/又はプローブ）によって実質的に増幅されかつ検出されうることが意図される。他方、フォワードプライマーが非特異的に標的とアニールする場合、又は対向鎖上のリバースプライマー結合部位とフランキングしない領域とアニールする場合には、3'方向のフォワードプライマーの伸長による低レベルの増幅があり新規な一本鎖を生成するが、この新規な一本鎖は連続する増幅のための鋳型として働くことができないので、非指数関数的な（例えば直線状の）非実質的増幅しか生じ得ない。
本明細書で開示する組成物を、本明細書で開示する多様なタイプの核酸増幅反応で用いることができることは当業者には理解されよう。いくつかの実施態様では、本明細書で開示する組成物はポリメラーゼ連鎖反応（PCR）で用いることができる。PCR技術の概括（臨床微生物学に応用される増幅条件を含む）については以下を参照されたい；DNA Methods in Clinical Microbiology, Singleton P., published by Dordrecht ; Boston: Kluwer Academic, (2000) Molecular Cloning to Genetic Engineering White, B.A. Ed. in Methods in Molecular Biology 67: Humana Press, Totowa (1997) and “PCR Methods and Applications”, from 1991 to 1995（Cold Spring Harbor Laboratory Press）（前記文献の各々は参照によりその全体が本明細書に含まれる）。本明細書で用いられるように、“標準的増幅条件”は以下を指す：5mM MgCl2、100mMトリス、10mM NaOH、0.019%プロクリン300、0.010% トウィーン-20、1.96%トレハロース、0.6mg/ml BSAで変性温度は97℃、アニーリング温度は62℃である。“標準的増幅条件”は参照の目的で本明細書に記載されるが、一方、本明細書のいくつかの実施態様に関連するオリゴヌクレオチドは他の“増幅条件”（そのような“標準的増幅条件”の修正及び変型を含むがただしそれらに限定されない）でも容易に用いることができる。“増幅条件”の非限定的な例には本明細書に引用した参考文献に開示されている条件が含まれ、例えば以下のとおりである：5mM MgCl2、100mMトリス、10mM NaOH、0.019%プロクリン300、0.010%トウィーン-20、1.96%トレハロース、0.6mg/ml BSAに72℃のアニーリング温度；5mM MgCl2、100mMトリス、10mM NaOH、0.019%プロクリン300、0.010%トウィーン-20、1.96%トレハロース、0.6mg/ml BSAに62℃のアニーリング温度；5mM MgCl2、100mMトリス、10mM NaOH、0.019%プロクリン300、0.010%トウィーン-20、1.96%トレハロース、0.6mg/ml BSAに60℃のアニーリング温度；5mM MgCl2；5mM MgCl2、100 mMトリス、10mM NaOH、0.019%プロクリン300、0.010%トウィーン-20、1.96%トレハロース、0.6mg/ml BSAに55℃のアニーリング温度；50mM KCl、10mMトリス-HCl（pH9.0）、0.1%トリトンX-100、2.5mM MgCl2に72℃のアニーリング温度；又は4mM MgCl2、100mMトリス（pH8.3）、10mM KCl、5mM (NH4)2SO4、0.15mg BSA、4%トレハロースに62℃のアニーリング温度；4mM MgCl2、100mMトリス（pH8.3）、10mM KCl、5mM (NH4)2SO4、0.15mg BSA、4%トレハロースに60℃のアニーリング温度；又は50mM KCl、10mMトリス-HCl（pH9.0）、0.1%トリトンX-100、2.5mM MgCl2に55℃のアニーリング温度など。いくつかの実施態様では、本明細書に記載のアニーリング温度は、例えば少なくとも約50℃、例えば50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃、70℃、71℃、72℃、73℃、74℃、又は75℃に修正される。
いくつかの実施態様では、少なくとも1つのポリメラーゼが提供される。ポリメラーゼは定量的PCRに用いることができる。種々の核酸ポリメラーゼが使用のために入手可能であり、以下が含まれる（ただしそれらに限定されない）：FASTSTARTTM Taq DNAポリメラーゼ（Roche）、KlenTaq1（AB peptides Inc.）、HOTGOLDSTARTM DNAポリメラーゼ（Eurogentec）、KAPATAQTM HotStart DNAポリメラーゼ又はKAPA2GTM Fast HotStart DNAポリメラーゼ（Kapa Biosystemss）、及びPHUSIONTM Hot Start（Finnzymes）。
いくつかの実施態様では、少なくとも1つのポリメラーゼが提供される。ポリメラーゼは定量的PCRに用いることができる。種々の核酸ポリメラーゼが使用のために入手可能であり、以下が含まれる（ただしそれらに限定されない）：FASTSTARTTM Taq DNAポリメラーゼ（Roche）、KlenTaq1（AB peptides Inc.）、HOTGOLDSTARTM DNAポリメラーゼ（Eurogentec）、KAPATAQTM HotStart DNAポリメラーゼ又はKAPA2GTM Fast HotStart DNAポリメラーゼ（Kapa Biosystemss）、及びPHUSIONTM Hot Start（Finnzymes）。
サーマルサイクリング
サーマルサイクリング条件は、種々の工程の各々について温度と同様に時間も変動させることができ、用いるサーマルサイクラーの他に増幅性能を修正しうる他の可変要件に左右される。いくつかの実施態様では、二工程プロトコルが実施され、前記では、プロトコルはアニーリング工程及び伸長工程を共通温度で一体化し、前記温度は、プライマー及びプローブのアニーリングの他に伸長工程についても最適である。いくつかの実施態様では、三工程プロトコルが実施され、前記では、変性工程、アニーリング工程及び伸長工程が実施される。
いくつかの実施態様では、本明細書に開示する組成物は、例えば以下のリアルタイム増幅反応のための装置に関連して用いることができる：BD MAX(商標)（Becton Dickinson and Co., Franklin Lakes, NJ）、VIPER(商標)（Becton Dickinson and Co., Franklin Lakes, NJ）、VIPER LT(商標)（Becton Dickinson and Co., Franklin Lakes, NJ）、SMARTCYLCER(商標)（Cepheid, Sunnyvale, CA）、ABI PRISM 7700(商標)（Applied Biosystems, Foster City, CA）、ROTOR-GENETM（Corbett Research, Sydney, Australia）、LIGHTCYCLER(商標)（Roche Diagnostics Corp, Indianapolis, IN）、ICYCLER(商標)（BioRad Laboratories, Hercules, CA）、IMX4000(商標)（Stratagene, La Jolla, CA）、CFX96TMリアルタイムPCR 系（Bio-Rad Laboratories Inc）など。
サーマルサイクリング条件は、種々の工程の各々について温度と同様に時間も変動させることができ、用いるサーマルサイクラーの他に増幅性能を修正しうる他の可変要件に左右される。いくつかの実施態様では、二工程プロトコルが実施され、前記では、プロトコルはアニーリング工程及び伸長工程を共通温度で一体化し、前記温度は、プライマー及びプローブのアニーリングの他に伸長工程についても最適である。いくつかの実施態様では、三工程プロトコルが実施され、前記では、変性工程、アニーリング工程及び伸長工程が実施される。
いくつかの実施態様では、本明細書に開示する組成物は、例えば以下のリアルタイム増幅反応のための装置に関連して用いることができる：BD MAX(商標)（Becton Dickinson and Co., Franklin Lakes, NJ）、VIPER(商標)（Becton Dickinson and Co., Franklin Lakes, NJ）、VIPER LT(商標)（Becton Dickinson and Co., Franklin Lakes, NJ）、SMARTCYLCER(商標)（Cepheid, Sunnyvale, CA）、ABI PRISM 7700(商標)（Applied Biosystems, Foster City, CA）、ROTOR-GENETM（Corbett Research, Sydney, Australia）、LIGHTCYCLER(商標)（Roche Diagnostics Corp, Indianapolis, IN）、ICYCLER(商標)（BioRad Laboratories, Hercules, CA）、IMX4000(商標)（Stratagene, La Jolla, CA）、CFX96TMリアルタイムPCR 系（Bio-Rad Laboratories Inc）など。
等温増幅
いくつかの実施態様では、本明細書に開示する組成物は核酸の等温増幅を含む方法で用いることができる。等温増幅の条件は、可変要件（例えば用いられる方法、酵素、鋳型及び１つ又は複数のプライマー）に応じて、温度と同様に時間を変動させることができる。等温条件下で実施できる増幅方法の例には、LAMP、SDAなどのいくつかの変型が含まれるが、ただしこれらに限定されない。
等温増幅は、最適な変性工程とそれに続く等温インキュベーション（ここで核酸が増幅される）を含むことができる。いくつかの実施態様では、等温インキュベーションは最初の変性工程無しで実施される。いくつかの実施態様では、等温インキュベーションは、少なくとも約25℃、例えば約25℃、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74又は75℃（列挙した値の任意の間の範囲を含む）で実施される。いくつかの実施態様では、等温インキュベーションは約37℃で実施される。いくつかの実施態様では、等温インキュベーションは約64℃で実施される。いくつかの実施態様では、等温インキュベーションは180分以下、例えば約180、165、150、135、120、105、90、75、60、45、30又は15分（列挙した値の任意の2つの間の範囲を含む）実施される。
いくつかの実施態様では、本明細書に開示する組成物は核酸の等温増幅を含む方法で用いることができる。等温増幅の条件は、可変要件（例えば用いられる方法、酵素、鋳型及び１つ又は複数のプライマー）に応じて、温度と同様に時間を変動させることができる。等温条件下で実施できる増幅方法の例には、LAMP、SDAなどのいくつかの変型が含まれるが、ただしこれらに限定されない。
等温増幅は、最適な変性工程とそれに続く等温インキュベーション（ここで核酸が増幅される）を含むことができる。いくつかの実施態様では、等温インキュベーションは最初の変性工程無しで実施される。いくつかの実施態様では、等温インキュベーションは、少なくとも約25℃、例えば約25℃、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74又は75℃（列挙した値の任意の間の範囲を含む）で実施される。いくつかの実施態様では、等温インキュベーションは約37℃で実施される。いくつかの実施態様では、等温インキュベーションは約64℃で実施される。いくつかの実施態様では、等温インキュベーションは180分以下、例えば約180、165、150、135、120、105、90、75、60、45、30又は15分（列挙した値の任意の2つの間の範囲を含む）実施される。
オリゴヌクレオチド
いくつかの実施態様では、オリゴヌクレオチド（例えばプライマー及び/又はプローブ）が提供される。本明細書で用いられるように、“プライマー”及び“プローブ”という用語にはオリゴヌクレオチドが含まれるが、ただし前記に限定されない。好ましくは、本明細書に開示するオリゴヌクレオチドプライマー及び/又はプローブは長さが8から45ヌクレオチドでありうる。例えば、プライマー及び/又はプローブは、長さが少なくとも8、9、10、 11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45又はそれより大きいヌクレオチドでありうる。プライマー及び/又はプローブは任意の適切な形態で（例えば固相に結合させて、液体で及び凍結乾燥させて）提供できる。本明細書に開示するプライマー及びプローブは、5'又は3'末端に又はその両方に追加のヌクレオチドを含むように修正することができる。しかしながら、増幅プライマー（必ずしもプローブではない）の3'末端へ追加される塩基は一般的には鋳型配列に相補的であることは当業者には理解されよう。本明細書に開示するプライマー及びプローブはまた修正して5'又は3'末端のヌクレオチドを除去することができる。
いくつかの実施態様では、オリゴヌクレオチド（例えばプライマー及び/又はプローブ）が提供される。本明細書で用いられるように、“プライマー”及び“プローブ”という用語にはオリゴヌクレオチドが含まれるが、ただし前記に限定されない。好ましくは、本明細書に開示するオリゴヌクレオチドプライマー及び/又はプローブは長さが8から45ヌクレオチドでありうる。例えば、プライマー及び/又はプローブは、長さが少なくとも8、9、10、 11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45又はそれより大きいヌクレオチドでありうる。プライマー及び/又はプローブは任意の適切な形態で（例えば固相に結合させて、液体で及び凍結乾燥させて）提供できる。本明細書に開示するプライマー及びプローブは、5'又は3'末端に又はその両方に追加のヌクレオチドを含むように修正することができる。しかしながら、増幅プライマー（必ずしもプローブではない）の3'末端へ追加される塩基は一般的には鋳型配列に相補的であることは当業者には理解されよう。本明細書に開示するプライマー及びプローブはまた修正して5'又は3'末端のヌクレオチドを除去することができる。
オリゴヌクレオチドプライマー及びプローブは、はアニーリング温度でそれらの標的と結合できる（アニーリング温度は融解温度（Tm）未満の温度である）。本明細書で用いられるように、“Tm”及び“融解温度”は互換可能な用語であり、当該温度で二本鎖ポリヌクレオチド分子の集団の50%が一本鎖に解離する温度を指す。ポリヌクレオチドのTmを計算する式は当業界で周知である。例えば、Tmは以下の等式で計算できる：Tm＝69.3＋0.41ｘ(G＋C)％−6−50/L（式中Lはヌクレオチドによるプローブの長さである）。ハイブリッドポリヌクレオチドのTmはまた、1Mの塩でのハイブリダイゼーションアッセイから採用されPCRプライマーのためのTmの計算に一般的に用いられる以下の式を用いて概算される：
[(A＋Tの数)ｘ2℃＋(G＋Cの数)ｘ4℃]（例えば以下を参照されたい：C. R. Newton et al. PCR, 2nd Ed., Springer-Verlag（New York, 1997）、p.24）。さらに複雑な他の計算が当業界に存在し、前記は、Tmの計算の説明に配列の特徴と同様に構造の特徴を考慮する。オリゴヌクレオチドの融解温度は、オリゴヌクレオチドプライマー又はプローブと結合配列との間の相補性及び塩の状態に左右されうる。いくつかの実施態様では、本明細書で提供するオリゴヌクレオチドプライマー又はプローブは、50mM KCl、10mMトリス-HCl緩衝液中で約90℃未満（例えば約89℃、88、87、86、85、84、83、82、81、80、79、78、77、76、75、74、73、72、71、70、69、68、67、66、65、64、63、62、61、60、59、58、57、56、55、54、53、52、50、49、48、47、46、45、44、43、42、41、40、39℃又は前記未満（前記列挙した値の任意の2つの間の範囲を含む））のTmを有する。いくつかの実施態様では、本明細書で提供するオリゴヌクレオチドプライマー又はプローブは、5mM MgCl2、100mMトリス、10mM NaOH、0.019%プロクリン300、0.010%トウィーン-20、1.96%トレハロース、0.6mg/ml BSA中で約90℃未満（例えば約89℃、88、87、86、85、84、83、82、81、80、79、78、77、76、75、74、73、72、71、70、69、68、67、66、65、64、63、62、61、60、59、58、57、56、55、54、53、52、50、49、48、47、46、45、44、43、42、41、40、39℃又は前記未満（前記列挙した値の任意の2つの間の範囲を含む））のTmを有する。下記でさらに詳細に考察するように、いくつかの実施態様では、本明細書に開示するプライマーは増幅プライマーセット（例えばフォワードプライマー及びリバースプライマーを含む）として提供される。好ましくは、フォワードプライマー及びリバースプライマーは10℃を超えて相違しない（例えば10℃未満の相違、9℃未満の相違、8℃未満の相違、7℃未満の相違、6℃未満の相違、5℃未満の相違、4℃未満の相違、3℃未満の相違、2℃未満の相違、又は1℃未満の相違の）Tmを有する。
[(A＋Tの数)ｘ2℃＋(G＋Cの数)ｘ4℃]（例えば以下を参照されたい：C. R. Newton et al. PCR, 2nd Ed., Springer-Verlag（New York, 1997）、p.24）。さらに複雑な他の計算が当業界に存在し、前記は、Tmの計算の説明に配列の特徴と同様に構造の特徴を考慮する。オリゴヌクレオチドの融解温度は、オリゴヌクレオチドプライマー又はプローブと結合配列との間の相補性及び塩の状態に左右されうる。いくつかの実施態様では、本明細書で提供するオリゴヌクレオチドプライマー又はプローブは、50mM KCl、10mMトリス-HCl緩衝液中で約90℃未満（例えば約89℃、88、87、86、85、84、83、82、81、80、79、78、77、76、75、74、73、72、71、70、69、68、67、66、65、64、63、62、61、60、59、58、57、56、55、54、53、52、50、49、48、47、46、45、44、43、42、41、40、39℃又は前記未満（前記列挙した値の任意の2つの間の範囲を含む））のTmを有する。いくつかの実施態様では、本明細書で提供するオリゴヌクレオチドプライマー又はプローブは、5mM MgCl2、100mMトリス、10mM NaOH、0.019%プロクリン300、0.010%トウィーン-20、1.96%トレハロース、0.6mg/ml BSA中で約90℃未満（例えば約89℃、88、87、86、85、84、83、82、81、80、79、78、77、76、75、74、73、72、71、70、69、68、67、66、65、64、63、62、61、60、59、58、57、56、55、54、53、52、50、49、48、47、46、45、44、43、42、41、40、39℃又は前記未満（前記列挙した値の任意の2つの間の範囲を含む））のTmを有する。下記でさらに詳細に考察するように、いくつかの実施態様では、本明細書に開示するプライマーは増幅プライマーセット（例えばフォワードプライマー及びリバースプライマーを含む）として提供される。好ましくは、フォワードプライマー及びリバースプライマーは10℃を超えて相違しない（例えば10℃未満の相違、9℃未満の相違、8℃未満の相違、7℃未満の相違、6℃未満の相違、5℃未満の相違、4℃未満の相違、3℃未満の相違、2℃未満の相違、又は1℃未満の相違の）Tmを有する。
プライマー及びプローブの配列は、当該オリゴヌクレオチド内にヌクレオチド置換（標的核酸配列に関して）をもつことによって修正可能であるが、ただし当該オリゴヌクレオチドが標的核酸配列と特異的にハイブリダイズするために十分な相補性を含むことを条件とする。この態様では、少なくとも1つ、2つ、3つ、4つ又は約5つまでのヌクレオチドを置換できる。本明細書で用いられるように、“相補的”という用語は、2つのポリヌクレオチド鎖の領域間又は同じポリヌクレオチド鎖の領域間の配列相補性を指す。あるポリヌクレオチドの2つの領域をアンチパラレルの態様で並べたとき、第一の領域の少なくとも1つのヌクレオチドが第二の領域の1つの塩基と塩基対を形成できるとき、当該ポリヌクレオチドの第一の領域は同じ又は別のポリヌクレオチドの第二の領域と相補的である。したがって、2つの相補的なポリヌクレオチドがヌクレオチドの位置毎に塩基対を形成することは要求されない。“完全に相補的”とは、第二のポリヌクレオチドと100%又は“完全に”相補的であり、したがって全てのヌクレオチドの位置で塩基対を形成する第一のポリヌクレオチドを指す。“部分的に相補的”とはまた、100%相補的ではなく（例えば90%又は80%又は70%相補的である）、1つ以上のヌクレオチドの位置でミスマッチのヌクレオチドを含む第一のポリヌクレオチドを指す。いくつかの実施態様では、オリゴヌクレオチドはユニバーサル塩基を含む。
本明細書で用いられるように、“ハイブリダイゼーション”という用語は、相補的な（部分的に相補的を含む）ポリヌクレオチド鎖の対合に関連して用いられる。ハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションの強度（すなわちポリヌクレオチド鎖間の結合の強度）は当業界で周知の多くの要件によって影響を受け、それら要件には、ポリヌクレオチド間の相補性の程度、塩濃度のような条件によって影響される関与条件のストリンジェンシー、形成されたハイブリッドの融解温度、他の成分の存在（例えばポリエチレングリコールの有無）、ハイブリダイズする鎖のモル濃度、及びポリヌクレオチド鎖のG:C含量が含まれる。いくつかの実施態様では、プライマーは、セット中の一方のプライマーのTmがセット中の他方のプライマーのTmの2℃以内であるように設計される。核酸のハイブリダイゼーションの広範囲の手引きは以下で見出される：Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology - Hybridization with Nucleic Acid Probes, Part I, Chapter 2 (Elsevier, New York)；及びAusubel et al, eds. (1995) Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 2（Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York）；Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual（2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York）。本明細書でさらに考察されるように、“特異的ハイブリダイゼーション”又は“特異的にハイブリダイズする”という用語は、核酸増幅のために典型的に用いられる条件下での、ポリヌクレオチド（例えばオリゴヌクレオチドプライマー又はプローブなど）と標的配列（例えばサンプル中の定量されるべき配列、陽性コントロールの標的配列などであり、無関係の配列ではない）のハイブリダイゼーションを指す。
いくつかの実施態様では、プライマー及び/又はプローブはオリゴヌクレオチドを含み、前記オリゴヌクレオチドは当該オリゴヌクレオチドの全長にわたって標的核酸配列とハイブリダイズする。そのような配列は、互いに関して“完全に相補的”ということができる。あるオリゴヌクレオチドが、ある核酸に関して“実質的に相補的”と本明細書でいう場合は、当該2つの配列は完全に相補的であるか、又はそれらはハイブリダイゼーションに際してミスマッチを形成するが、下記で考察するストリンジェントな条件下若しくは標準的なPCR条件下でハイブリダイズする能力を保持することができる。本明細書で用いられるように、“実質的に相補的”という用語は、2つの核酸（例えばオリゴヌクレオチドと標的配列の相補的領域）間の相補性を指す。相補性は完全とは限らず、2つの核酸間で任意の数の塩基対ミスマッチが存在しうる。しかしながら、最低のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件下ですらハイブリダイゼーションが生じ得ないほどミスマッチの数が大きい場合、前記配列は実質的に相補的な配列ではない。本明細書で2つの配列が“実質的に相補的”と称される場合、当該配列は選択した反応条件下で互にハイブリダイズするために十分に相補的であることを意味する。核酸の相補性と特異性を達成するために十分なハイブリダイゼーションのストリンジェンシーとの関係は当業界で周知であり、配列の同一性に関連して下記でさらに述べる。したがって、実質的に相補的な配列を本明細書に開示する任意の検出方法で用いることができる。そのようなプローブは、例えば完全に相補的であるか、又は1つから多くのミスマッチを含むことができるが、ただしハイブリダイゼーションの条件が、例えば標的配列と非標的配列間の区別を可能にするために十分であることを条件とする。したがって、実質的に相補的な配列は、参照配列と比較して100%、99、98、97、96、95、94、93、92、91、90、89、88、87、86、85、84、83、82、81、80、75、70%若しくはそれより低い、又はその間の任意の数字のパーセント同一性の範囲にある配列に該当しうる。例えば、本明細書に開示するオリゴヌクレオチドは、標的配列（前記に対して当該オリゴヌクレオチドがハイブリダイズする）と比較して、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ又は5つより多いミスマッチ及び/又は縮退塩基（例えば“変種オリゴヌクレオチド”）を含むことができるが、ただし当該オリゴヌクレオチドが、例えば標準的な核酸増幅条件下で標的配列と特異的にハイブリダイズできることを条件とする。
本明細書に記載するプライマーは、当業界で公知の技術（適切な配列のクローニング及び消化並びに直接的化学合成を含むが、ただしこれらに限定されない）を用いて調製できる。本明細書に記載するプライマーを作製するために用いることができる化学合成の方法には以下が含まれる（ただしこれらに限定されない）：ホスホトリエステル方法（Narangらが記載：Narang et al. (1979) Methods in Enzymology 68:90）、ホスホジエステル方法（Brownらが開示：Brown et al. (1979) Methods in Enzymology 68:109）、ジエチルホスホルアミデート方法（Beaucageらが開示：Beaucage et al. (1981) Tetrahedron Letters 22:1859）及び固相法（米国特許4,458,066号に記載）。本明細書に記載する合成オリゴヌクレオチドプライマーを調製するために自動オリゴヌクレオチド合成装置を使用することもまた本明細書で意図される。加えて、所望の場合には、プライマーを当業界で公知の下記に記載する技術を用いて標識してもよい。
プライマーセット
いくつかの実施態様では、増幅プライマーセットが提供される。増幅プライマーセットは1つ以上、例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15又はそれより多いプライマー対を含むことができる。本明細書で用いられるように、“プライマー対”という用語は、標的核酸配列（例えばE.ヒストリチカの配列、E.ジスパーの配列、又はE.ヒストリチカ及びE.ジスパーの双方で見出される配列）の対向する鎖と個々にハイブリダイズする2つの増幅プライマーを指すことができる（前記配列で、各プライマーはその3'末端で伸長して標的増幅生成物を例えばPCRで形成することができる）。標的増幅生成物はアンプリコンを含むことができる。プライマー対はフォワードプライマー及びリバースプライマーを含むことができる。“フォワードプライマー”及び“リバースプライマー”という用語は、例えばどちらの鎖を標的核酸配列の“＋”鎖又は“上部”鎖と認定するかに関して、プライマー対の各プライマーの認定でしばしば便利に用いられるが、特段の規定がなければ、それ以上の限定は“フォワード”又は“リバース”によって付与されないことは当業者には理解されよう。
いくつかの実施態様では、増幅プライマーセットが提供される。増幅プライマーセットは1つ以上、例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15又はそれより多いプライマー対を含むことができる。本明細書で用いられるように、“プライマー対”という用語は、標的核酸配列（例えばE.ヒストリチカの配列、E.ジスパーの配列、又はE.ヒストリチカ及びE.ジスパーの双方で見出される配列）の対向する鎖と個々にハイブリダイズする2つの増幅プライマーを指すことができる（前記配列で、各プライマーはその3'末端で伸長して標的増幅生成物を例えばPCRで形成することができる）。標的増幅生成物はアンプリコンを含むことができる。プライマー対はフォワードプライマー及びリバースプライマーを含むことができる。“フォワードプライマー”及び“リバースプライマー”という用語は、例えばどちらの鎖を標的核酸配列の“＋”鎖又は“上部”鎖と認定するかに関して、プライマー対の各プライマーの認定でしばしば便利に用いられるが、特段の規定がなければ、それ以上の限定は“フォワード”又は“リバース”によって付与されないことは当業者には理解されよう。
いくつかの実施態様では、プライマーセットは以下の増幅プライマーを含む： E.ヒストリチカの配列とアニールし、標準的増幅条件下でこれを増幅するが、E.ジスパーの配列とはアニールしないもの、又はE.ジスパーの配列とアニールするが、同じ若しくは同様な増幅条件下でE.ジスパーのこの配列を実質的に増幅しないもの。したがって、いくつかの実施態様では、プライマーセットを用いてE.ヒストリチカの存在を検出するが、E.ジスパーの存在を検出しない。E.ヒストリチカとE.ジスパーとの間の高度な相同性のために、E.ヒストリチカ配列の定量的増幅のための代替アプローチは、E.ヒストリチカ及びE.ジスパーの双方で見出されるポリヌクレオチド配列（例えば相同な配列）を増幅するプライマーセットを選択し、続いてE.ヒストリチカのポリヌクレオチド配列のみとハイブリダイズするプローブを用いてE.ヒストリチカ生成物の増幅を検出することであろう（以下を参照されたい：Verweij, et al., Clin. Microbiol. 42: 1220-23, 2004）。予想に反して、そのようなアプローチの遂行は、特にE.ジスパー標的核酸配列の用量が増加するとき、E.ヒストリチカの予期される増幅シグナルの低下をもたらすことができる。E.ヒストリチカ及びE.ジスパーは双方とも同じ個体に感染できるので、以前のアプローチ（例えば上掲書（Verweij, et al., Clin. Microbiol. 42: 1220-23, 2004）のアプローチ）は偽陰性を生じた可能性があると考えられる。実施例1及び図3で示されるように、E.ヒストリチカ及びE.ジスパー核酸の双方を増幅するプライマーセットを用いたとき、既知コピー数のE.ヒストリチカ標的核酸配列は、E.ジスパー標的核酸配列の高コピー数の存在でほとんど検出不能となった。いずれの理論にも拘束されないが、E.ヒストリチカ及びE.ジスパーの増幅生成物間でのホモ-及びヘテロ-重鎖形成は、当該反応でE.ジスパーアンプリコンの割合が増加するので、利用可能なE.ヒストリチカプローブ結合配列を遮断することができると考えられる。本明細書のいくつかの実施態様によるE.ヒストリチカの定量的核酸増幅の実施は、E.ジスパー核酸の干渉作用を最小限にするか又は排除することができる。したがっていくつかの実施態様では、E.ジスパーによるE.ヒストリチカシグナルの抑制を最小限にすることができる。いくつかの実施態様では、E.ジスパーによるE.ヒストリチカシグナルの抑制を効果的に排除することができる。いくつかの実施態様では、プライマーは、標準的増幅条件下でE.ヒストリチカ標的核酸配列を実質的に増幅し、いずれのE.ジスパー核酸配列も実質的に増幅しないように設計される。
いくつかの実施態様では、プライマーセットのプライマーは、標準的増幅条件下でE.ヒストリチカの標的核酸の対向鎖と個々にハイブリダイズし、標的増幅生成物を明確に示す。いくつかの実施態様では、それらの対応する3'末端で伸長されるとき、プライマーは標的増幅生成物を生成するであろう。したがって、いくつかの実施態様では、伸長されるときにプライマーはE.ヒストリチカ標的核酸配列を実質的に増幅するであろう。いくつかの実施態様では、プライマー対のどちらのプライマーも標準的増幅条件下でE.ジスパーの鎖とハイブリダイズせず、したがってE.ジスパーのいずれの配列も実質的に増幅しないであろう。いくつかの実施態様では、プライマー対の一方のプライマーのみが標準的増幅条件下でE.ジスパーの核酸鎖とハイブリダイズし、一方、他方のプライマーはこれらの条件下でいずれのE.ジスパー核酸ともハイブリダイズせず、したがって当該プライマー対はいずれのE.ジスパー配列も実質的に増幅できないであろう。いくつかの実施態様では、プライマー対の各プライマーは標準的増幅条件下でE.ジスパー核酸とハイブリダイズするが、これらのプライマーは、各プライマーがその3'末端で伸長されるときに増幅生成物を形成する向きでハイブリダイズしないであろう（例えばプライマーは同じ鎖にハイブリダイズするか、又はあまりにも遠く離れてハイブリダイズして、伸長されるときに増幅生成物を形成できないか、又はその3'末端で伸長されるときに少なくとも一方のプライマーが他方のプライマーから “遠ざかりつつ”伸長するような向きでハイブリダイズする）。したがって、いくつかの実施態様では、プライマー対のプライマーはE.ジスパーのいずれの核酸配列も実質的に増幅しないであろう。
いくつかの実施態様では、E.ヒストリチカの配列を信頼できるように増幅するがE.ジスパーは増幅しないプライマーセットの設計で、E.ヒストリチカの株間の多様性による偽陰性を最小限にするためにE.ヒストリチカの保存領域を増幅するが、E.ジスパーの存在によって引き起こされうる偽陽性を最小限にするためにE.ジスパーの保存領域を増幅しないプライマーを選択することは有用でありうる。例えば、E.ジスパーとE.ヒストリチカ間の先祖の相違を有する高度に保存された配列は、標的増幅配列のための標的核酸（例えば“鋳型”）の選択に有用な領域でありうる。いくつかの実施態様では、標的増幅配列はrDNA遺伝子又はその部分を含む。いくつかの実施態様では、遺伝子生成物（例えばrRNA又はその部分）は逆転写され、定量的及び/又は定性的核酸増幅のための標的核酸配列として用いられる。小リボソームサブユニットは高度に保存されているが、一方、図2Aに示されるように、E.ヒストリチカ及びE.ジスパーの小リボソームサブユニット遺伝子配列間には明らかにいくつかの先祖からの相違が存在する。これらの相違を用いて、E.ヒストリチカの標的増幅配列を生成するがE.ジスパーの標的増幅配列は生成できないプライマーセットを設計することができる。いくつかの実施態様では、プライマー対は、E.ヒストリチカ小サブユニットリボソームRNAをコードする遺伝子（GenBankアクセッション番号AB608092.1）（配列番号:10）の少なくとも一部分を含むポリヌクレオチド配列を増幅する。E.ヒストリチカ小サブユニットリボソームRNA遺伝子の注釈付き図表は図2Bに示されている。いくつかの実施態様では、標的配列は配列番号:7を有するポリヌクレオチドを含む（例えば配列番号:10の191−325位）（GTACAAAATGGCCAATTCATTCAATGAATTGAGAAATGACATTCTAAGTGAGTTAGGATGCCACGACAATTGTAGAACACACAGTGTTTAACAAGTAACCAATGAGAATTTCTGATCTATCAATCAGTTGGTAGT）。いくつかの実施態様では、標的増幅生成物は、配列番号:7の連続する少なくとも約30ヌクレオチド、例えば、配列番号:7の連続する少なくとも約30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134又は135のヌクレオチド（列挙した値の任意の2つの間の範囲を含む）を含む。いくつかの実施態様では、標的増幅配列は、配列番号:7の少なくとも約30−135、例えば、配列番号:7の連続する約30-100、30-110、30-115、30-120、30-125、30-130、30-135、40-100、40-110、40-115、40-120、40-125、40-130、40-135、50-100、50-110、50-115、50-120、50-125、50-130、50-135、60-100、60-110、60-115、60-120、60-125、60-130、60-135、70-100、70-110、70-115、70-120、70-125、70-130、70-135、80-100、80-110、80-115、80-120、80-125、80-130、80-135、90-100、90-110、90-115、90-120、90-125、90-130、90-135、100-110、100-115、100-120、100-125、100-130、100-135、110-115、110-120、110-125、110-130、110-135、115-120、115-125、115-130、115-135、120-125、120-130、120-135、125-130、125-135又は130-135のヌクレオチドを含む。いくつかの実施態様では、標的増幅生成物は、配列番号:7に対して少なくとも70%のnt-nt同一性、例えば少なくとも約70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%,、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%又は99.2%（列挙した値の任意の2つの間の範囲を含む）のnt-nt同一性を有する。いくつかの実施態様では、標的増幅配列は、配列番号:7の配列及び配列番号:7の5'末端又は3'末端の上流及び/又は下流に少なくとも1つの追加のポリヌクレオチドを含む（例えば配列番号:10の191−325位）。いくつかの実施態様では、標的増幅配列は、配列番号:10（図2B参照）に示されるように配列番号:7の5'末端の上流に少なくとも約1つのヌクレオチド、例えば少なくとも約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190又は200ヌクレオチドを上流に含む。いくつかの実施態様では、標的増幅配列は、配列番号:10（図2B参照）に示されるように配列番号:7の3'末端の下流に少なくとも約1つのヌクレオチド、例えば少なくとも約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190又は200ヌクレオチドを上流に含む。いくつかの実施態様では、標的増幅配列は、本明細書に記載するように、配列番号:7の末端の上流及び下流の双方に（配列番号:10に示すように）ヌクレオチドを含む。いくつかの実施態様では、プライマー対は、標準的増幅条件下でE.ジスパー小サブユニットrRNAを増幅しない。例示すれば、E.ジスパー小サブユニットrRNAの配列は、Genbankアクセッション番号AB282661で見出すことができ、前記は本明細書で配列番号:11として提供される（TGGATATAAATACAAAAGAGAAGTAAGAATAAAGAATCCTTCCTTTTAAAAAGGAAGAAGAATAAAATATCTGGTTGATCCTGCCAGTATTATATGCTGATGTTAAAGATTAAGCCATGCATGTGTAAGTATAAAGACCAAGTAGGATGAAACTGCGGACGGCTCATTATAACAGTAATAGTTTCTTTGGTTAGTAAAGTACAAGGATAGCTTTGTGAATGATAAAGATAATACTTGAGACGATCCAATTTGTATTAGTACAAAGTGGCCAATTTATGTAAGTAAATTGAGAAATGACATTCTAAGTGAGTTAGGATGCCACGACAATTGTAGAACACACAGTGTTTAACAAGTAACCAATGAGAATTTCTGATCTATCAATCAGTTGGTAGTATCGAGGACTACCAAGATTATAACGGATAACGAGGAATTGGGGTTCGACATCGGAGAGGGAGCTTTACAGATGGCTACCACTTCTAAGGAAGGCAGCAGGCGCGTAAATTACCCACTTTCGAATTGAAGAGGTAGTGACGACACATAACTCTAGAGTTGAGTAAAATCAATTCTTGAAGGAATGAGTAGGAGGTAAATTCTCCTACGAAATCAATTGGAGGGCAAGTCTGGTGCCAGCAGCCGCGGTAATTCCAGCTCCAATAGTGTATATTAAAGTTGCTGTGATTAAAACGCTCGTAGTTGAATTAAAATGTGATTTTATACATTTTGAAGACTTTACATTAAGTGAAGTTTCTAGAAATGTTAAATTAAAATCAAAGAAGGAGACAATTCAAGTAATTGAGTTGTCATTACTTTGAATAAAATAAGGTGTTTAAAGCAAAACATTATGTTAATGAATATTCAAGCATGGGACAATGCTGAGGAGATGTCAATTAGACATTTCGAGAGAAGGATTAAAAGGAACAATTGGGGTGATTCAGAAAATAACGGGAGAGGTGAAAATCCATGATCGCTATAAGATGCACGAGAGCGAAAGCATTTCACTCAACTGGGTCCATTAATCAAGAACGAAAGTTAGGGGATCGAAGACGATCAGATACCGTCGTAGTCCTAACTATAAACGATGTCAACCAAGGATTGGATGAAATTCAGATGTACAAAGATGAAGAAACATTGTTTCTAAATCCAAGTATATCAATACTACCTTGTTCAGAACTTAAAGAGAAATCTTGAGTTTATGGACTTCAGGGGGAGTATGGTCACAAGGCTGAAACTTAAAGGAATTGACGGAAGGGCACACCAGGAGTGGAGCCTGCGGCTTAATTTGACTCAACACGGGAAAACTTACCAAGACCGAACAGTAGAAGGAATGACAGATTAAGAGTTCTTTCATGATTTATTGGGTAGTGGTGCATGGCCGTTCTTAGTTGGTGGAGTGATTTGTCAGGTTAATTCCGGTAACGAACGAGACTGAAACCTATTAATTAGTTTTCTGCCTATAAGACAGAAATGTTCGCAAGAACAGGTGCGTAAGTACCACTTCTTAAAGGGACACATTTCAATTGTCCTATTTTAATTGTTAGTTATCTAATTTCGATTAGAACTCTTTTAACGTGGGAAAAAGAAAAAGGAAGCATTCAGCAATAACAGGTCTGTGATGCCCTTAGACATCTTGGGCCGCACGCGCGCTACAATGGAGTTACTAGAGAGCATTTTATCATTTACACCTTATTTATTAGGCTATGTCTAATAGGTAGGGATAGTAAGTGGTGTACCGAGATTGAAATAGTTAAGGAAAACTCAAAAGAACGTACATGACAGGGATAAATGATTGGAATTATTTGTTTTGAACGAGGAATTCCTTGTAATATCGAGTCATTAACTCGAGATGAATACGTCCCTGCCCTTTGTACACACCGCCCGTCGCTCCTACCGATTGAATAAAGAGGTGAAATTCTAGGATTCTGTCTTATAGATAGAAAAATGGATTTAAATCTCCTTATTTAGAGGAAGGAGAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTAAAAGAAAAGAAATAATCTTTTAAAATAAAACAAGAAATTTATAGAATAAGATAATCTACAAAGAAAATAATAAAAGTAAGAATAAAAGGA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いくつかの実施態様では、プライマーセットは、配列番号:1（GTACAAAATGGCCAATTCATTCAATG）を含む第一のプライマーを含む。いくつかの実施態様では、プライマーセットは、配列番号:2（ACTACCAACTGATTGATAGATCAG）を含む第二のプライマーを含む。図2Aに示されるように、配列番号:1を含むプライマーはE.ヒストリチカ小サブユニットrRNAをコードする配列と高い（100%までの）同一性を有することができるが、一方、E.ジスパーゲノムの相同な領域とは低い同一性を有する。したがって、いくつかの実施態様では、配列番号:1を含むプライマーはE.ヒストリチカゲノムDNAとハイブリダイズするが、標準的増幅条件下でE.ジスパーゲノムDNAとはハイブリダイズしない。配列番号:2を含むプライマーは、E.ヒストリチカ及びE.ジスパーの双方の小サブユニットrRNA遺伝子の領域内のゲノムDNAとハイブリダイズすることができる。したがって、いくつかの実施態様では、配列番号:1を含む第一のプライマー及び配列番号:2を含む第二のプライマーを含むプライマーセットは、E.ヒストリチカ核酸の標的配列を増幅するが、E.ジスパー核酸を増幅できない。いくつかの実施態様では、核酸はゲノムDNAを含む。いくつかの実施態様では、核酸は、遺伝子生成物（例えばmRNA又はrRNA）から逆転写された核酸を含む。
いくつかの実施態様では、第一のプライマーは、配列番号:1の連続する少なくとも約10ヌクレオチド、例えば、配列番号:1又はその相補物の連続する少なくとも約10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25又は26のヌクレオチドを含む。いくつかの実施態様では、第一のプライマーは、配列番号:1と少なくとも約38%同一、例えば、配列番号:1と少なくとも約38%、42、46、50、53、57、61、65、69、73、76、80、84、88、92又は96%同一であるポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施態様では、第一のプライマーは、配列番号:1及び配列番号:1の5'末端の5'に少なくとも1つの追加のヌクレオチド、例えば、配列番号:1の5'末端の5'に約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19又は20ヌクレオチドを含む。いくつかの実施態様では、配列番号:1の5'の1つ以上のヌクレオチドは、図2Bに示されるように、配列番号:10の 鋳型鎖と相補的である。
本明細書のいくつかの実施態様にしたがえば、多数の代替案がプライマーについて意図される。
本明細書のいくつかの実施態様にしたがえば、多数の代替案がプライマーについて意図される。
代替案1にしたがえば、第一のプライマーは、15−50ヌクレオチドの長さを有し、配列番号:1の連続する少なくとも約10ヌクレオチド、例えば、配列番号:1又はその相補物の連続する少なくとも約10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25又は26のヌクレオチド（列挙された値の任意の2つの間の範囲、例えば10-15、10-20、15-20、10-26、15-26又は20-26の連続するヌクレオチドを含む）を含む。第一のプライマーは配列番号:10の標的配列とハイブリダイズし、当該標的配列と少なくとも約80%の同一性を有することができる。
代替案2にしたがえば、第一のプライマーは、15−50ヌクレオチドの長さを有し、配列番号:1の連続する少なくとも約10ヌクレオチド、例えば、配列番号:1又はその相補物の連続する少なくとも約10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25又は26のヌクレオチド（列挙された値の任意の2つの間の範囲、例えば10-15、10-20、15-20、10-26、15-26又は20-26の連続するヌクレオチドを含む）を含む。第一のプライマーは配列番号:10の標的配列とハイブリダイズし、当該標的配列と少なくとも約85%の同一性を有することができる。
代替案3にしたがえば、第一のプライマーは、15−50ヌクレオチドの長さを有し、配列番号:1の連続する少なくとも約10ヌクレオチド、例えば、配列番号:1又はその相補物の連続する少なくとも約10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25又は26のヌクレオチド（列挙された値の任意の2つの間の範囲、例えば10-15、10-20、15-20、10-26、15-26又は20-26の連続するヌクレオチドを含む）を含む。第一のプライマーは配列番号:10の標的配列とハイブリダイズし、当該標的配列と少なくとも約90%の同一性を有することができる。
代替案2にしたがえば、第一のプライマーは、15−50ヌクレオチドの長さを有し、配列番号:1の連続する少なくとも約10ヌクレオチド、例えば、配列番号:1又はその相補物の連続する少なくとも約10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25又は26のヌクレオチド（列挙された値の任意の2つの間の範囲、例えば10-15、10-20、15-20、10-26、15-26又は20-26の連続するヌクレオチドを含む）を含む。第一のプライマーは配列番号:10の標的配列とハイブリダイズし、当該標的配列と少なくとも約85%の同一性を有することができる。
代替案3にしたがえば、第一のプライマーは、15−50ヌクレオチドの長さを有し、配列番号:1の連続する少なくとも約10ヌクレオチド、例えば、配列番号:1又はその相補物の連続する少なくとも約10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25又は26のヌクレオチド（列挙された値の任意の2つの間の範囲、例えば10-15、10-20、15-20、10-26、15-26又は20-26の連続するヌクレオチドを含む）を含む。第一のプライマーは配列番号:10の標的配列とハイブリダイズし、当該標的配列と少なくとも約90%の同一性を有することができる。
代替案4にしたがえば、第一のプライマーは、15−50ヌクレオチドの長さを有し、配列番号:1の連続する少なくとも約10ヌクレオチド、例えば、配列番号:1又はその相補物の連続する少なくとも約10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25又は26のヌクレオチド（列挙された値の任意の2つの間の範囲、例えば10-15、10-20、15-20、10-26、15-26又は20-26の連続するヌクレオチドを含む）を含む。第一のプライマーは配列番号:10の標的配列とハイブリダイズし、当該標的配列と少なくとも約95%の同一性を有することができる。
代替案5にしたがえば、代替案1−4のいずれかの第一のプライマーは第二のプライマーと対になることができる。第二のプライマーは、15−50ヌクレオチドの長さを有し、配列番号:2の連続する少なくとも約10ヌクレオチド、例えば、配列番号:2又はその相補物の連続する少なくとも約10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25又は26のヌクレオチド（列挙された値の任意の2つの間の範囲、例えば10-15、10-20、15-20、10-26、15-26又は20-26の連続するヌクレオチドを含む）を含むことができる。第二のプライマーは配列番号:10の標的配列とハイブリダイズし、当該標的配列と少なくとも約80%の同一性を有することができる。
代替案6にしたがえば、代替案1−4のいずれかの第一のプライマーは第二のプライマーと対になることができる。第二のプライマーは、15−50ヌクレオチドの長さを有し、配列番号:2の連続する少なくとも約10ヌクレオチド、例えば、配列番号:2又はその相補物の連続する少なくとも約10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25又は26のヌクレオチド（列挙された値の任意の2つの間の範囲、例えば10-15、10-20、15-20、10-26、15-26又は20-26の連続するヌクレオチドを含む）を含むことができる。第二のプライマーは配列番号:10の標的配列とハイブリダイズし、当該標的配列と少なくとも約85%の同一性を有することができる。
代替案5にしたがえば、代替案1−4のいずれかの第一のプライマーは第二のプライマーと対になることができる。第二のプライマーは、15−50ヌクレオチドの長さを有し、配列番号:2の連続する少なくとも約10ヌクレオチド、例えば、配列番号:2又はその相補物の連続する少なくとも約10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25又は26のヌクレオチド（列挙された値の任意の2つの間の範囲、例えば10-15、10-20、15-20、10-26、15-26又は20-26の連続するヌクレオチドを含む）を含むことができる。第二のプライマーは配列番号:10の標的配列とハイブリダイズし、当該標的配列と少なくとも約80%の同一性を有することができる。
代替案6にしたがえば、代替案1−4のいずれかの第一のプライマーは第二のプライマーと対になることができる。第二のプライマーは、15−50ヌクレオチドの長さを有し、配列番号:2の連続する少なくとも約10ヌクレオチド、例えば、配列番号:2又はその相補物の連続する少なくとも約10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25又は26のヌクレオチド（列挙された値の任意の2つの間の範囲、例えば10-15、10-20、15-20、10-26、15-26又は20-26の連続するヌクレオチドを含む）を含むことができる。第二のプライマーは配列番号:10の標的配列とハイブリダイズし、当該標的配列と少なくとも約85%の同一性を有することができる。
代替案7にしたがえば、代替案1−4のいずれかの第一のプライマーは第二のプライマーと対になることができる。第二のプライマーは、15−50ヌクレオチドの長さを有し、配列番号:2の連続する少なくとも約10ヌクレオチド、例えば、配列番号:2又はその相補物の連続する少なくとも約10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25又は26のヌクレオチド（列挙された値の任意の2つの間の範囲、例えば10-15、10-20、15-20、10-26、15-26又は20-26の連続するヌクレオチドを含む）を含むことができる。第二のプライマーは配列番号:10の標的配列とハイブリダイズし、当該標的配列と少なくとも約90%の同一性を有することができる。
代替案8にしたがえば、代替案1−4のいずれかの第一のプライマーは第二のプライマーと対になることができる。第二のプライマーは、15−40ヌクレオチドの長さを有し、配列番号:2の連続する少なくとも約10ヌクレオチド、例えば、配列番号:2又はその相補物の連続する少なくとも約10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25又は26のヌクレオチド（列挙された値の任意の2つの間の範囲、例えば10-15、10-20、15-20、10-26、15-26又は20-26の連続するヌクレオチドを含む）を含むことができる。第二のプライマーは配列番号:10の標的配列とハイブリダイズし、当該標的配列と少なくとも約95%の同一性を有することができる。場合によって、第二のプライマーは当該標的配列と100%の同一性を有することができる。
代替案8にしたがえば、代替案1−4のいずれかの第一のプライマーは第二のプライマーと対になることができる。第二のプライマーは、15−40ヌクレオチドの長さを有し、配列番号:2の連続する少なくとも約10ヌクレオチド、例えば、配列番号:2又はその相補物の連続する少なくとも約10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25又は26のヌクレオチド（列挙された値の任意の2つの間の範囲、例えば10-15、10-20、15-20、10-26、15-26又は20-26の連続するヌクレオチドを含む）を含むことができる。第二のプライマーは配列番号:10の標的配列とハイブリダイズし、当該標的配列と少なくとも約95%の同一性を有することができる。場合によって、第二のプライマーは当該標的配列と100%の同一性を有することができる。
いくつかの実施態様では、第一のプライマーは、図2Aに示すアラインメントにしたがって設計され、したがって第一のプライマーは、標準的増幅条件下でE.ヒストリチカの配列とアニールするが、E.ジスパーの相同な配列とはアニールしない。いくつかの実施態様では、第一のプライマーは、典型的なPCR条件下（例えば、50mM KCl、10mMトリス-HCl緩衝液（pH8.0）にて50℃、又は、例えば5mM MgCl2、100mMトリス、10mM NaOH、0.019%プロクリン300、0.010%トウィーン-20、1.96%トレハロース、0.6mg/ml BSAにて60℃）でE.ヒストリチカの配列とアニールするが、E.ジスパーの相同な配列とはアニールしない。いくつかの実施態様では、第一のプライマーの少なくとも3'直近ヌクレオチドは、保存された位置のE.ヒストリチカヌクレオチドと相補的で（E.ジスパーとは相違する）、したがって、第一のプライマーは、ハイブリダイズするとき典型的にはE.ヒストリチカの3'末端から伸長するが、典型的にはE.ジスパーではそうではない。いくつかの実施態様では、第二のプライマーは、配列番号:2の連続する少なくとも約10ヌクレオチド、例えば、配列番号:2の約10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23又は24の連続するヌクレオチドを含む。いくつかの実施態様では、第二のプライマーは、配列番号:2と少なくとも約41%同一、例えば、配列番号:2と少なくとも約41、45、50、54、58、62、66、70、75、79、83、87、91又は95%同一のポリヌクレオチド配列を含む。
プローブ
いくつかの実施態様では、配列特異的プローブが提供される。プローブには本明細書に記載するオリゴヌクレオチドが含まれるが、ただし前記に限定されない。いくつかの実施態様では、本明細書に開示する配列特異的プローブは標的核酸配列と特異的にハイブリダイズする。いくつかの実施態様では、配列特異的プローブは、E.ヒストリチカ及びE.ジスパーの双方で見出される配列とハイブリダイズできる。いくつかの実施態様では、配列特異的プローブは、E.ヒストリチカで見出される配列とハイブリダイズできるが、E.ジスパーで見出される配列とはハイブリダイズできない。いくつかの実施態様では、配列特異的プローブは、本明細書に開示する増幅プライマー対の結合部位にフランキングするヌクレオチド配列と特異的にハイブリダイズし、さらに前記に対して完全に又は実質的に相補的である。いくつかの実施態様では、配列特異的プローブは、E.ヒストリチカを増幅するプライマーセットの標的増幅配列と標準的増幅条件下で特異的にハイブリダイズし、さらに前記に対して完全に又は実質的に相補的であるが、E.ジスパーに対してはそうではない。いくつかの実施態様では、配列特異的プローブは、配列番号:3（ATTGTCGTGGCATCCTAACTCA）のポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施態様では、配列特異的プローブは、配列番号:3の連続する少なくとも約5ヌクレオチド、例えば、配列番号:3の約5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21又は22ヌクレオチドを含む。いくつかの実施態様では、配列特異的プローブは、配列番号:3と少なくとも約22%同一、例えば、配列番号:3と少なくとも約22%、27、31、36、40、45、54、59、63、68、72、77、81、86、90又は95%同一の配列を含む。いくつかの実施態様では、配列特異的プローブは、本明細書に開示する増幅プライマーの結合部位とオーバーラップする。
本明細書のいくつかの実施態様にしたがえば、プローブについて多数の代替案が意図される。
いくつかの実施態様では、配列特異的プローブが提供される。プローブには本明細書に記載するオリゴヌクレオチドが含まれるが、ただし前記に限定されない。いくつかの実施態様では、本明細書に開示する配列特異的プローブは標的核酸配列と特異的にハイブリダイズする。いくつかの実施態様では、配列特異的プローブは、E.ヒストリチカ及びE.ジスパーの双方で見出される配列とハイブリダイズできる。いくつかの実施態様では、配列特異的プローブは、E.ヒストリチカで見出される配列とハイブリダイズできるが、E.ジスパーで見出される配列とはハイブリダイズできない。いくつかの実施態様では、配列特異的プローブは、本明細書に開示する増幅プライマー対の結合部位にフランキングするヌクレオチド配列と特異的にハイブリダイズし、さらに前記に対して完全に又は実質的に相補的である。いくつかの実施態様では、配列特異的プローブは、E.ヒストリチカを増幅するプライマーセットの標的増幅配列と標準的増幅条件下で特異的にハイブリダイズし、さらに前記に対して完全に又は実質的に相補的であるが、E.ジスパーに対してはそうではない。いくつかの実施態様では、配列特異的プローブは、配列番号:3（ATTGTCGTGGCATCCTAACTCA）のポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施態様では、配列特異的プローブは、配列番号:3の連続する少なくとも約5ヌクレオチド、例えば、配列番号:3の約5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21又は22ヌクレオチドを含む。いくつかの実施態様では、配列特異的プローブは、配列番号:3と少なくとも約22%同一、例えば、配列番号:3と少なくとも約22%、27、31、36、40、45、54、59、63、68、72、77、81、86、90又は95%同一の配列を含む。いくつかの実施態様では、配列特異的プローブは、本明細書に開示する増幅プライマーの結合部位とオーバーラップする。
本明細書のいくつかの実施態様にしたがえば、プローブについて多数の代替案が意図される。
代替案9にしたがえば、プローブは15−75ヌクレオチドの長さを有し、配列番号:3、配列番号:1の少なくとも10ヌクレオチド、例えば、配列番号:3又はその相補物の連続する少なくとも約10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25又は26のヌクレオチド（列挙された値の任意の2つの間の範囲、例えば10-15、10-20、15-20、10-26、15-26又は20-26の連続するヌクレオチドを含む）を含む。プローブは、配列番号:10の標的配列とハイブリダイズし、さらに当該標的配列と少なくとも約80%の同一性を有することができる。プローブは、代替案5−8のプライマー対のいずれかと一緒に用いることができる。場合によって、プローブはまた配列番号:11とハイブリダイズできる。
代替案10にしたがえば、プローブは15−75ヌクレオチドの長さを有し、配列番号:3、配列番号:1の少なくとも10ヌクレオチド、例えば、配列番号:3又はその相補物の連続する少なくとも約10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25又は26のヌクレオチド（列挙された値の任意の2つの間の範囲、例えば10-15、10-20、15-20、10-26、15-26又は20-26の連続するヌクレオチドを含む）を含む。プローブは、配列番号:10の標的配列とハイブリダイズし、さらに当該標的配列と少なくとも約85%の同一性を有することができる。プローブは、代替案5−8のプライマー対のいずれかと一緒に用いることができる。場合によって、プローブはまた配列番号:11とハイブリダイズできる。
代替案10にしたがえば、プローブは15−75ヌクレオチドの長さを有し、配列番号:3、配列番号:1の少なくとも10ヌクレオチド、例えば、配列番号:3又はその相補物の連続する少なくとも約10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25又は26のヌクレオチド（列挙された値の任意の2つの間の範囲、例えば10-15、10-20、15-20、10-26、15-26又は20-26の連続するヌクレオチドを含む）を含む。プローブは、配列番号:10の標的配列とハイブリダイズし、さらに当該標的配列と少なくとも約85%の同一性を有することができる。プローブは、代替案5−8のプライマー対のいずれかと一緒に用いることができる。場合によって、プローブはまた配列番号:11とハイブリダイズできる。
代替案11にしたがえば、プローブは15−75ヌクレオチドの長さを有し、配列番号:3、配列番号:1の少なくとも10ヌクレオチド、例えば、配列番号:3又はその相補物の連続する少なくとも約10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25又は26のヌクレオチド（列挙された値の任意の2つの間の範囲、例えば10-15、10-20、15-20、10-26、15-26又は20-26の連続するヌクレオチドを含む）を含む。プローブは、配列番号:10の標的配列とハイブリダイズし、さらに当該標的配列と少なくとも約90%の同一性を有することができる。プローブは、代替案5−8のプライマー対のいずれかと一緒に用いることができる。場合によって、プローブはまた配列番号:11とハイブリダイズできる。
代替案12にしたがえば、プローブは15−75ヌクレオチドの長さを有し、配列番号:3、配列番号:1の少なくとも10ヌクレオチド、例えば、配列番号:3又はその相補物の連続する少なくとも約10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25又は26のヌクレオチド（列挙された値の任意の2つの間の範囲、例えば10-15、10-20、15-20、10-26、15-26又は20-26の連続するヌクレオチドを含む）を含む。プローブは、配列番号:10の標的配列とハイブリダイズし、さらに当該標的配列と少なくとも約95%の同一性を有することができる。プローブは、代替案5−8のプライマー対のいずれかと一緒に用いることができる。場合によって、プローブはまた配列番号:11とハイブリダイズできる。
代替案13にしたがえば、プローブは15−75ヌクレオチドの長さを有し、配列番号:3、配列番号:1の少なくとも10ヌクレオチド、例えば、配列番号:3又はその相補物の連続する少なくとも約10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25又は26のヌクレオチド（列挙された値の任意の2つの間の範囲、例えば10-15、10-20、15-20、10-26、15-26又は20-26の連続するヌクレオチドを含む）を含む。プローブは、配列番号:10の標的配列とハイブリダイズし、さらに当該標的配列と100%の同一性を有することができる。プローブは、代替案5−8のプライマー対のいずれかと一緒に用いることができる。場合によって、プローブはまた配列番号:11とハイブリダイズできる。
代替案12にしたがえば、プローブは15−75ヌクレオチドの長さを有し、配列番号:3、配列番号:1の少なくとも10ヌクレオチド、例えば、配列番号:3又はその相補物の連続する少なくとも約10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25又は26のヌクレオチド（列挙された値の任意の2つの間の範囲、例えば10-15、10-20、15-20、10-26、15-26又は20-26の連続するヌクレオチドを含む）を含む。プローブは、配列番号:10の標的配列とハイブリダイズし、さらに当該標的配列と少なくとも約95%の同一性を有することができる。プローブは、代替案5−8のプライマー対のいずれかと一緒に用いることができる。場合によって、プローブはまた配列番号:11とハイブリダイズできる。
代替案13にしたがえば、プローブは15−75ヌクレオチドの長さを有し、配列番号:3、配列番号:1の少なくとも10ヌクレオチド、例えば、配列番号:3又はその相補物の連続する少なくとも約10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25又は26のヌクレオチド（列挙された値の任意の2つの間の範囲、例えば10-15、10-20、15-20、10-26、15-26又は20-26の連続するヌクレオチドを含む）を含む。プローブは、配列番号:10の標的配列とハイブリダイズし、さらに当該標的配列と100%の同一性を有することができる。プローブは、代替案5−8のプライマー対のいずれかと一緒に用いることができる。場合によって、プローブはまた配列番号:11とハイブリダイズできる。
増幅生成物の検出のために、種々のタイプの検出可能な部分が記載されている。検出可能部分の１つの種類はインターカレート剤であり、前記は非特異的に二本鎖核酸と結合する。インターカレート剤は、結合しないときは比較的弱い蛍光を有し、二本鎖核酸と結合したときに比較的強い蛍光を有する。したがって、インターカレート剤を用いて、核酸増幅反応時の二本鎖核酸の蓄積を追跡監視することができる。そのような非特異的色素の例には、例えばSYBRグリーンI（Molecular Probes）、ピコグリーン（PicoGreen, Molecular Probes）、 TOTO、YOYO、ヨウ化プロピジウム、臭化エチジウムなどのようなインターカレート剤が含まれる。検出可能部分の他のタイプは、配列特異的核酸プローブの誘導体を利用する。例えば、鋳型核酸とのハイブリダイゼーション時に検出可能な蛍光の変化が発生するように、オリゴヌクレオチドプローブを1つ以上の色素で標識することができる。いくつかの応用では非特異的色素が所望されうるが、配列特異的プローブはより正確な増幅測定を提供できる。配列特異的プローブの1つの構造は、蛍光色素分子につながれたプローブの一方の端及び消光分子につながれたプローブの他方の端を含むことができる。プローブがハイブリダイズしていないとき、プローブはステムループ構造を維持でき、その構造では蛍光は当該消光分子によって消光され、したがって蛍光色素分子は発光を妨げられる。プローブが鋳型核酸とハイブリダイズするとき、プローブは線状化して蛍光色素分子を消光分子から離し、したがって蛍光色素分子の発光を許容にする。配列特異的プローブの別の構造は、FRET対の第一の蛍光色素分子とつながれた第一のプローブ及びFRET対の第二の蛍光色素分子につながれた第二のプローブを含むことができる。第一のプローブ及び第二のプローブはアンプリコンの配列とハイブリダイズできるように配置され、それらは、第一のプローブ及び第二のプローブが同じアンプリコンとハイブリダイズするとき、FRETによるエネルギー転移を可能にするために十分に近接している。
いくつかの実施態様では、配列特異的プローブは、蛍光色素分子に連結された本明細書に開示するオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施態様では、プローブは2つ以上の蛍光色素分子に連結される。蛍光色素分子の例には以下が含まれる：キサンテン色素、例えばフルオレセイン及びローダミン色素、例えばフルオレセインイソチオシアネート（FITC）、2-[(エチルアミン)-3-(エチルイミノ)-2-7-ジメチル-3H-キサンテン-9-イル]安息香酸エチルエステルモノヒドロクロリド（R6G）（約500から560nmの範囲の波長で応答発光を放出する）、1,1,3,3,3',3'-ヘキサメチルインドジカルボシアニンヨウ化物（HIDC）（約600から660nmの範囲の波長で応答発光を放出する）、6-カルボキシフルオレセイン（一般にはFAM及びFの略語で知られている）、6-カルボキシ2',4',7',4,7-ヘキサクロロフルオレセイン（HEX）、6-カルボキシ-4',5'-ジクロロ-2',7'-ジメトキシフルオレセイン（JOE又はJ）、N,N,N',N'-テトラメチル-6-カルボキシローダミン（TAMRA又はT）、6-カルボキシ-X-ローダミン（ROX又はR）、5-カルボキシローダミン-6G（R6G5又はG5）、6-カルボキシローダミン-6G（R6G6又はG6）、及びローダミン110；シアニン色素、例えば、Cy3、Cy5及びCy7色素；クマリン、例えば、ウンベリフェロン；ベンズイミド色素、例えばHoechst 33258；フェナントリジン色素、例えばテキサスレッド；エチジウム色素；アクリジン色素 ；カルバゾール色素；フェノキサジン色素；ポルフィリン色素；ポリメチン色素、例えばシアニン色素、例えばCy3（約540から580nmの範囲の波長で応答発光を放出する）、Cy5（約640から680nmの範囲の波長で応答発光を放出する）など；BODIPY色素及びキノリン色素。問題の特異的な蛍光色素分子には以下が含まれる：ピレン、クマリン、ジエチルアミノクマリン、FAM、フルオレセインクロロトリアジニル、フルオレセイン、R110、エオシン、JOE、R6G、HIDC、テトラメチルローダミン、TAMRA、リッサミン、ROX、ナプトフルオレセイン、テキサスレッド、ナプトフルオレセイン、Cy3及びCy5、カルフルオルオレンジ（CalFluorOrange）など。
いくつかの実施態様では、プローブは消光分子に連結される。消光分子は電磁放射線を吸収してそれを熱として消散させ、したがって暗黒を維持することができる。例えば消光分子には、ダブシル、NFQ、例えばBHQ-1又はBHQ-2（Biosearch）、IOWA BLACK FQ（IDT）及びIOWA BLACK RQ（IDT）が含まれる。いくつかの実施態様では、消光分子は、蛍光色素分子から放出される電磁放射線を吸収するために当該蛍光色素分子と対となるように選択される。本明細書に開示する組成物及び方法で有用な蛍光色素分子/消光分子対は当業界で周知であり、例えば以下で見出すことができる：S. Marras, “Selection of Fluorophore and Quencher Pairs for Fluorescent Nucleic Acid Hybridization Probes”（下記世界的ウェブサイトで入手できる：molecular-beacons.org/download/marras,mmb06%28335%293.pdf）。いくつかの実施態様では、蛍光色素分子/消光分子対はカルフルオルオレンジ及びBHQ-1を含む。
いくつかの実施態様では、蛍光色素分子はプローブの第一の末端に付加され、消光分子は当該プローブの第二の末端に付加される。付加には共有結合が含まれ、場合によって少なくとも1つのリンカー分子を含み、前記リンカー分子はプローブと蛍光色素分子又は消光分子との間に位置する。いくつかの実施態様では、蛍光色素分子はプローブの5'末端に付加され、消光分子はプローブの3'末端に付加される。いくつかの実施態様では、蛍光色素分子はプローブの3'末端に付加され、消光分子はプローブの5'末端に付加される。定量的核酸増幅で用いることができるプローブの例には、分子ビーコン、SCORPIONSTMプローブ（Sigma）及びTAQMANTMプローブ（Life Technologies）が含まれる。
いくつかの実施態様では、蛍光色素分子はプローブの第一の末端に付加され、消光分子は当該プローブの第二の末端に付加される。付加には共有結合が含まれ、場合によって少なくとも1つのリンカー分子を含み、前記リンカー分子はプローブと蛍光色素分子又は消光分子との間に位置する。いくつかの実施態様では、蛍光色素分子はプローブの5'末端に付加され、消光分子はプローブの3'末端に付加される。いくつかの実施態様では、蛍光色素分子はプローブの3'末端に付加され、消光分子はプローブの5'末端に付加される。定量的核酸増幅で用いることができるプローブの例には、分子ビーコン、SCORPIONSTMプローブ（Sigma）及びTAQMANTMプローブ（Life Technologies）が含まれる。
本明細書の実施態様のプライマー及びプローブは、E.ヒストリチカを（前記が存在する場合は）検出するが、他の多数の病原体のいずれかがサンプルに存在するときはこれと交差反応しない（例えば実施例4及び6を参照されたい）。本明細書で用いられるように、“交差反応”は、表示の生物（例えば下記に列挙する非E.ヒストリチカ生物）の鋳型に由来する検出可能なシグナルを生じることを指す。例えば実施例6に示すように、表4に列挙する生物の存在は、本明細書のいくつかの実施態様のプライマー及びプローブを用いるとき検出可能な増幅シグナルをもたらさない。いくつかの実施態様では、表示の生物に由来する鋳型が存在するとき、交差反応はさらにE.ヒストリチカシグナルの抑制を含むことがある。例えば実施例4及び6に示すように、クリプトスポリジウム・パルブム、ギアルジア・ランブリア、又はエントアメーバ・E.ジスパー（たとえ高力価でも）の存在は、検出可能なシグナルを生じることはなく、また本明細書のいくつかの実施態様のプライマー及びプローブに対してE.ヒストリチカ由来の検出可能なシグナルを実質的に抑制することもない。いくつかの実施態様では、当該プライマー及びプローブは以下の生物のいずれとも交差反応しない：アビオトロフィア・デフェクチバ、アシネトバクター・バウマンニー、アシネトバクター・イウォッフィー、アエロモナス・ヒドロフィラ、アルカリゲネス・ファエカリス亜種ファエカリス、アナエロコッカス・テトラジウス、アルコバクター・ブツレリ、アルコバクター・クリアエロフィルス、バシルス・セレウス、バクテロイデス・カッカエ、バクテロイデス・メルダエ、バクテロイデス・ステルコリス、ビフィドバクテリウム・アドレッセンチス、ビフィドバクテリウム・ロングム、カムプリロバクター・コリ、カンピロバクター・コンシスス、カンピロバクター・クルブス、カンピロバクター・フェツス亜種フェツス、カンピロバクター・フェツス亜種ベネレアリス、カンピロバクター・グラシリス、カンピロバクター・ホミニス、カンピロバクター・ジェジュニ、カンピロバクター・ラリ、カンピロバクター・レクツス、カンピロバクター・ウプサリエンシス、カンジダ・アルビカンス、カンジダ・カテヌラテ、セデセア・ダビサエ、クラミジア・トラコマチス、シトロバクター・アマロナチクス、シトロバクター・フルエンジイ、シトロバクター・コセリ、シトロバクター・セドラキイ、クロストリジウム・ジッフィシレ17858、クロストリジウム・ジッフィシレ43598、クロストリジウム・ジッフィシレCCUG 8864-9689、クロストリジウム・ジッフィシレ43255、クロストリジウム・ジッフィシレBAA-1805、クロストリジウム・ジッフィシレ43593、クロストリジウム・パーフリンゲンス、コリンセラ・アエロファシエンス、コリネバクテリウム・ゲニタリウム、デスルホビブリオ・ピガー、エドワルドシエラ・タルダ、エッゲルテーラ・レンタ、エンテロバクター・アエロゲネス、エンテロバクター・クロアカエ、エンテロコッカス・カッセリフラブス、エンテロコッカス・セコルム、エンテロコッカス・ジスパー、エンテロコッカス・ファエカリス、エンテロコッカス・ガリナルム、エンテロコッカス・ヒラエ、エンテロコッカス・ラッフィノスス、大腸菌、エシェリキア・フェルグソニイ、エシェリキア・ヘルマンニイ、エシェリキア・ブルネリス、フソバクテリウム・バリウム、ガルドネレラ・バギナリス、ゲメラ・モルビロルム、ハフニア・アルベイ、ヘリコバクター・フェンネリアエ、ヘリコバクター・ピロリ、クエブシエーラ・オキシトカ、クレブシエラ・ニューモニア、ラクトバシルス・アシドフィルス、ラクトバシルス・レウテリ、ラクトコッカス・ラクチス、レミノレラ・グリモンチイ、リステリア・グライイ、リステリア・インノキュア、リステリア・モノシトゲネス、モルガネラ・モルガニイ、ペプトニフィルス・アサッカロリチクス、ペプトストレプトコッカス・アナエロビウス、プレシオモナス・シゲロイデス、ポルフィロモナス・アサッカロリチカ、プレボテラ・メラニノゲニカ、プロテウス・ミラビリス、プロテウス・ペンネリ、プロテウス・ブルガリス、プロビデンシア・アルカリファシエンス、プロビデンシア・レットゲリ、プロビデンシア・スチュアルチイ、シュードモナス・アエルギノーザ、シュードモナス・フルオレセンス、ルミノコッカス・ブロミイ、ネズミチフス菌、サルモネラ・エンテリジチス、セラチア・リケファシエンス、セラチア・マルセッセンス、シゲラ・ソンネイ、シゲラ・フレキシネリ、黄色ブドウ球菌、スタフィロコッカス・エピデルミジス、ステノトロフォモナス・マルトフィリア、ストレプトコッカス・アガラクチアエ、ストレプトコッカス・ジスガラクチアエ、ストレプトコッカス・インテルメジウス、ストレプトコッカス・ウベリス、トラブルシエラ・グアメンシス、ベイロネラ・パルブラ、コレラ菌、ビブリオ・パラハエモリチクス、エルシニア・ベルコビエリ、エルシニア・エンテロコリチカ、エルシニア・ローデイ、アデノウイルス2型、アデノウイルス14型、アデノウイルス40型、アデノウイルス41型、コクサッキーA9、コクサッキーB1、HHV-5、サイトメガロウイルス、エンテロウイルス69型、ヒトパピローマウイルス16型、ヒトパピローマウイルス18型、単純疱疹ウイルスI、単純疱疹ウイルスII、ノロウイルスI、ノロウイルスII、ロタウイルス、ブラストシスチス・ホミニス、エンセファリトゾーン・インテスチナリス、エンセファリトゾーン・ヘルム、エンセファリトゾーン・クニクリ、ペンタトリコモナス・ホミニス、エントアメーバ・バーレッテ、エントアメーバ・ジスパー、エントアメーバ・ギギバリス、エントアメーバ・インバデンス、エントアメーバ・モシュコフスキー、エントアメーバ・ラナルム、シトロバクター・フルエンジイ（rpt）、エンテロバクター・クロアカエ（rpt）、クリプトスポリジウム・パルブム、ギアルジア・ランブリア、又はクリプトスポリジウム・メレアグリジス。
上記に列挙した多数の生物が典型的にはヒトの糞便中に見出されるが、列挙したいくつかの生物はそうではないことを特記する。したがって、本明細書のいくつかの実施態様のプローブ、プライマー及び検出方法は付加的病原体の存在に全く影響されないと考えられる。
さらにまた、実施例5及び8に示すように、本明細書の実施態様のプライマーとプローブのセットは、固定及び非固定サンプルタイプの双方について確固とした結果を提供し、E.ヒストリチカ検出のための市販のELISAキットの結果と一致する結果を提供した。したがって、本明細書の実施態様のプライマーとプローブのセットは、多様なサンプルタイプ（例えば固定及び非保存又は非固定サンプル）にわたって確固とした、かつE.ヒストリチカの有無を決定する他の方法と一致する結果を提供すると考えられる。
実施例7に示すように、本明細書の実施態様のいくつかのプライマー及びプローブのための95%検出限界（LoD）は、サンプル1ミリリットルにつき約17のE.ヒストリチカ生物体である。本明細書で用いられるように、“95%LoD”、又は特段の説明がない“LoD”は、その時の陽性結果の95%をもたらす濃度を指す。したがって、いくつかの実施態様では、プライマー及びプローブは、E.ヒストリチカが少なくとも95%検出限界（LoD）の量で増幅反応中に存在する場合に陽性シグナルを生じるが（例えばカットオフ未満のCtスコア）、上記に列挙した1つ以上の非E.ヒストリチカ生物だけが存在する場合には陽性シグナルを生じないであろう。いくつかの実施態様では、E.ヒストリチカのLoDは、サンプル1ミリリットルにつき約17個のE.ヒストリチカ生物体（又は17個のE.ヒストリチカ生物体に一致する鋳型配列量）である。いくつかの実施態様では、LoDは、反応1ミリリットルにつき約50生物体を超えない、例えば1ミリリットルにつき約50、49、48、47、46、45、44、43、42、41、40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2又は1個のE.ヒストリチカ生物体（又はそのゲノム）を超えない。いくつかの実施態様では、LoDは固定及び非固定サンプルの双方について類似することを特記する（実施例8及び表6−7を参照されたい）。したがって、本明細書のいくつかの実施態様のプライマー及びプローブは、固定及び非固定サンプルの双方について類似するE.ヒストリチカ検出特性（例えば類似するLoD値）をもたらすことは理解される。
さらにまた、実施例5及び8に示すように、本明細書の実施態様のプライマーとプローブのセットは、固定及び非固定サンプルタイプの双方について確固とした結果を提供し、E.ヒストリチカ検出のための市販のELISAキットの結果と一致する結果を提供した。したがって、本明細書の実施態様のプライマーとプローブのセットは、多様なサンプルタイプ（例えば固定及び非保存又は非固定サンプル）にわたって確固とした、かつE.ヒストリチカの有無を決定する他の方法と一致する結果を提供すると考えられる。
実施例7に示すように、本明細書の実施態様のいくつかのプライマー及びプローブのための95%検出限界（LoD）は、サンプル1ミリリットルにつき約17のE.ヒストリチカ生物体である。本明細書で用いられるように、“95%LoD”、又は特段の説明がない“LoD”は、その時の陽性結果の95%をもたらす濃度を指す。したがって、いくつかの実施態様では、プライマー及びプローブは、E.ヒストリチカが少なくとも95%検出限界（LoD）の量で増幅反応中に存在する場合に陽性シグナルを生じるが（例えばカットオフ未満のCtスコア）、上記に列挙した1つ以上の非E.ヒストリチカ生物だけが存在する場合には陽性シグナルを生じないであろう。いくつかの実施態様では、E.ヒストリチカのLoDは、サンプル1ミリリットルにつき約17個のE.ヒストリチカ生物体（又は17個のE.ヒストリチカ生物体に一致する鋳型配列量）である。いくつかの実施態様では、LoDは、反応1ミリリットルにつき約50生物体を超えない、例えば1ミリリットルにつき約50、49、48、47、46、45、44、43、42、41、40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2又は1個のE.ヒストリチカ生物体（又はそのゲノム）を超えない。いくつかの実施態様では、LoDは固定及び非固定サンプルの双方について類似することを特記する（実施例8及び表6−7を参照されたい）。したがって、本明細書のいくつかの実施態様のプライマー及びプローブは、固定及び非固定サンプルの双方について類似するE.ヒストリチカ検出特性（例えば類似するLoD値）をもたらすことは理解される。
実施例4に示すように、E.ヒストリチカの検出量は、高力価のクリプトスポリジウム・パルブム、ギアルジア・ランブリア、及びエントアメーバ・ジスパーによって実質的に変化せず、これらの生物との実質的な交差反応も存在しなかった。したがって、いくつかの実施態様では、E.ヒストリチカ生物のLoDは、サンプルに別の病原生物が高力価で存在しても実質的に変化しない。いくつかの実施態様では、E.ヒストリチカ生物の検出は（例えばCtスコアによって測定される）、サンプルに別の病原生物が高力価で存在しても実質的に変化しない。いくつかの実施態様では、高力価は、サンプル1mLにつき少なくとも1ｘ106の生物体を含み、例えば約1ｘ106生物/mL、1ｘ106、2ｘ106、3ｘ106、4ｘ106、5ｘ106、6ｘ106、7ｘ106、8ｘ106、9ｘ106、1ｘ107、1.5ｘ107、2ｘ107、3ｘ107、4ｘ107、5ｘ107、6ｘ107、7ｘ107、8ｘ107、9ｘ107、1ｘ108、１ｘ109、又は1ｘ1010生物体/mLサンプルを含む。
キット
いくつかの実施態様はキットを含む。キットは本明細書に記載する少なくとも1つのプライマー対を含むことができる。いくつかの実施態様では、プライマー対は、標準的増幅条件下でE.ヒストリチカの標的配列を増幅できるが、本明細書で記載するように、標準的増幅条件下ではE.ジスパーの標的配列を増幅できない。キットは本明細書に記載するプローブを含むことができる。いくつかの実施態様では、プローブは、E.ヒストリチカ及びE.ジスパーの双方に存在する核酸配列に特異的である。いくつかの実施態様では、プライマーセットは、配列番号:1の配列を有するオリゴヌクレオチド又はその変種を含むフォワードプライマー、配列番号:2の配列を有するオリゴヌクレオチド又はその変種を含むリバースプライマー、及び配列番号:3の配列を有するオリゴヌクレオチド又はその変種を含むプローブを含む。いくつかの実施態様では、プローブは本明細書に記載する蛍光色素分子/消光分子対を含む。いくつかの実施態様では、キットはサンプル、例えば陽性コントロールを含み、前記はE.ヒストリチカ又は本明細書に記載するE.ヒストリチカDNAを含む。キットはさらに陰性コントロールを含み、例えば、前記はE.ジスパー又はE.ジスパーDNAのみを含む。キットはさらに包装及び/又は指示物を含むことができる。
いくつかの実施態様では、キットはさらに、ヒト糞便由来の他の少なくとも1つの寄生生物（例えばギアルジア・ランブリア、クリプトスポリジウム・パルブム、クリプトスポリジウム・ホミニスなどの少なくとも1つ）を検出するための多重アッセイ用試薬を含む。
いくつかの実施態様はキットを含む。キットは本明細書に記載する少なくとも1つのプライマー対を含むことができる。いくつかの実施態様では、プライマー対は、標準的増幅条件下でE.ヒストリチカの標的配列を増幅できるが、本明細書で記載するように、標準的増幅条件下ではE.ジスパーの標的配列を増幅できない。キットは本明細書に記載するプローブを含むことができる。いくつかの実施態様では、プローブは、E.ヒストリチカ及びE.ジスパーの双方に存在する核酸配列に特異的である。いくつかの実施態様では、プライマーセットは、配列番号:1の配列を有するオリゴヌクレオチド又はその変種を含むフォワードプライマー、配列番号:2の配列を有するオリゴヌクレオチド又はその変種を含むリバースプライマー、及び配列番号:3の配列を有するオリゴヌクレオチド又はその変種を含むプローブを含む。いくつかの実施態様では、プローブは本明細書に記載する蛍光色素分子/消光分子対を含む。いくつかの実施態様では、キットはサンプル、例えば陽性コントロールを含み、前記はE.ヒストリチカ又は本明細書に記載するE.ヒストリチカDNAを含む。キットはさらに陰性コントロールを含み、例えば、前記はE.ジスパー又はE.ジスパーDNAのみを含む。キットはさらに包装及び/又は指示物を含むことができる。
いくつかの実施態様では、キットはさらに、ヒト糞便由来の他の少なくとも1つの寄生生物（例えばギアルジア・ランブリア、クリプトスポリジウム・パルブム、クリプトスポリジウム・ホミニスなどの少なくとも1つ）を検出するための多重アッセイ用試薬を含む。
マスターミックス
いくつかの実施態様では、マスターミックスが提供される。マスターミックスはアッセイのために少なくとも2つの試薬を含み、それらは、定量的核酸増幅アッセイにおける試薬の対応濃度に比例する対応濃度で提供される。したがって、単一量のマスターミックスを反応に添加して2つ以上の試薬の適切な対応濃度を提供できる。いくつかの実施態様では、マスターミックスは以下のうちの少なくとも2つを含むことができる：ポリメラーゼ、緩衝剤、塩（例えばマグネシウム）、ヌクレオチド三リン酸、プライマーセット及び水。いくつかの実施態様では、マスターミックスを反応で使用されるよりも高い濃度で提供できる。いくつかの実施態様では、マスターミックスを凍結乾燥形で提供し、反応で使用されるより高い濃度で再構成できる。いくつかの実施態様では、マスターミックスは、反応濃度よりも少なくとも約2x、例えば2x、2.5x、3x、4x、5x、6x、7x、8x、9x、10x、15x、20x、25x、40x、50x、100x、200x、250x又は500xの濃度の試薬を含む。
いくつかの実施態様では、マスターミックスが提供される。マスターミックスはアッセイのために少なくとも2つの試薬を含み、それらは、定量的核酸増幅アッセイにおける試薬の対応濃度に比例する対応濃度で提供される。したがって、単一量のマスターミックスを反応に添加して2つ以上の試薬の適切な対応濃度を提供できる。いくつかの実施態様では、マスターミックスは以下のうちの少なくとも2つを含むことができる：ポリメラーゼ、緩衝剤、塩（例えばマグネシウム）、ヌクレオチド三リン酸、プライマーセット及び水。いくつかの実施態様では、マスターミックスを反応で使用されるよりも高い濃度で提供できる。いくつかの実施態様では、マスターミックスを凍結乾燥形で提供し、反応で使用されるより高い濃度で再構成できる。いくつかの実施態様では、マスターミックスは、反応濃度よりも少なくとも約2x、例えば2x、2.5x、3x、4x、5x、6x、7x、8x、9x、10x、15x、20x、25x、40x、50x、100x、200x、250x又は500xの濃度の試薬を含む。
サンプル
本明細書で提供されるサンプルは、エントアメーバの核酸を含むか又は含まない可能性がある物質を含む。いくつかの実施態様では、サンプルはヒトの糞便材料又はその部分若しくは誘導物を含む。いくつかの実施態様では、サンプルは、生検材料、例えば、エントアメーバに感染している可能性があるヒトの組織（例えば胃腸、肝、肺又は中枢神経系の組織）を含む。いくつかの実施態様では、サンプルは、細胞培養（例えばヒト糞便材料から誘導される培養）を含む。いくつかの実施態様では、サンプルは、例えば他の物質から核酸を単離するために、又はサンプルから非核酸物質を除去するために（例えば脂質、タンパク質、細胞屑などを除去するために）処理されてある。いくつかの実施態様では、サンプルはプロテアーゼで処理されてある。本明細書の実施態様のプライマー及びプローブは固定サンプル及び非保存サンプルについて類似の検出特性を達成することが示された（例えば実施例8及び表6−7を参照されたい）。いくつかの実施態様では、サンプルは一定量の固定剤（例えばホルマリン）で固定される。いくつかの実施態様では、サンプルは非保存状態である（例えば“非固定”）。
いくつかの実施態様では、サンプルがE.ヒストリチカ及び/又はE.ジスパーの核酸を含むか否かは不明である。いくつかの実施態様では、サンプルがE.ヒストリチカ又はE.ジスパーの少なくと1つを含むことは判明しているが、どちらをサンプルが含むか、又はサンプルが両方を含むか否かは不明である。いくつかの実施態様では、サンプルはE.ヒストリチカ及びE.ジスパーの両方を含む。
本明細書で提供されるサンプルは、エントアメーバの核酸を含むか又は含まない可能性がある物質を含む。いくつかの実施態様では、サンプルはヒトの糞便材料又はその部分若しくは誘導物を含む。いくつかの実施態様では、サンプルは、生検材料、例えば、エントアメーバに感染している可能性があるヒトの組織（例えば胃腸、肝、肺又は中枢神経系の組織）を含む。いくつかの実施態様では、サンプルは、細胞培養（例えばヒト糞便材料から誘導される培養）を含む。いくつかの実施態様では、サンプルは、例えば他の物質から核酸を単離するために、又はサンプルから非核酸物質を除去するために（例えば脂質、タンパク質、細胞屑などを除去するために）処理されてある。いくつかの実施態様では、サンプルはプロテアーゼで処理されてある。本明細書の実施態様のプライマー及びプローブは固定サンプル及び非保存サンプルについて類似の検出特性を達成することが示された（例えば実施例8及び表6−7を参照されたい）。いくつかの実施態様では、サンプルは一定量の固定剤（例えばホルマリン）で固定される。いくつかの実施態様では、サンプルは非保存状態である（例えば“非固定”）。
いくつかの実施態様では、サンプルがE.ヒストリチカ及び/又はE.ジスパーの核酸を含むか否かは不明である。いくつかの実施態様では、サンプルがE.ヒストリチカ又はE.ジスパーの少なくと1つを含むことは判明しているが、どちらをサンプルが含むか、又はサンプルが両方を含むか否かは不明である。いくつかの実施態様では、サンプルはE.ヒストリチカ及びE.ジスパーの両方を含む。
いくつかの実施態様では、サンプルは陽性コントロールを含み、例えばE.ヒストリチカ、E.ジスパーの核酸又はE.ヒストリチカ若しくはE.ジスパーの核酸の組み合わせがサンプルに添加される。いくつかの実施態様では、E.ジスパー標的増幅配列の少なくとも1000（“1K”）コピー、例えば少なくとも約1Kコピー、2K、3K、4K、5K、6K、7K、8K、9K、10K、20K、30K、40K、50K、60K、70K、80K、90K、100K、150K、200K、250K、300K、350K、400K、450K、500K、550K、600K、650K、700K、750K、800K、850K、900K、1000K、1100K、1200K、1300K、1400K、1500K、1600K、1700K、1800K、1900K又は2000Kコピーがサンプルに添加される。いくつかの実施態様では、E.ヒストリチカ標的増幅配列の少なくとも100コピー、例えば少なくとも約100、200、300、400、500、600、700、800、900、1Kコピー、2K、3K、4K、5K、6K、7K、8K、9K、10K、20K、30K、40K、50K、60K、70K、80K、90K、100K、150K、200K、250K、300K、350K、400K、450K、500K、550K、600K、650K、700K、750K、800K、850K、900K、1000K、1100K、1200K、1300K、1400K、1500K、1600K、1700K、1800K、1900K又は2000Kコピーがサンプルに添加される。いくつかの実施態様では、E.ヒストリチカ及びE.ジスパー標的核酸がサンプルに添加される。
いくつかの実施態様では、サンプルは上記の1つ以上から単離された核酸を含む。核酸は、当業者が周知の標準的技術を用いて単離できる。
いくつかの実施態様では、サンプルは上記の1つ以上から単離された核酸を含む。核酸は、当業者が周知の標準的技術を用いて単離できる。
追加の実施態様
いくつかの実施態様にしたがえば、プライマーとプローブのセット及び前記を用いる方法が、E.ヒストリチカの検出のために提供される。いくつかの実施態様では、プライマーとプローブのセット及び方法は、非病原性E.ジスパーを検出しない。いくつかの実施態様では、プライマーとプローブのセット及び方法は確固とした結果を生じ、それらの結果はE.ヒストリチカ及びE.ジスパーの偽似混合感染の場合に阻害又は干渉を受けない。いくつかの実施態様では、プライマーとプローブのセット及び方法は、伝統的な顕微鏡による方法によって同定されるヒト臨床標本のエントアメーバ・ヒストリチカを検出する（前記方法は本出願時にはその当時の標準治療である）。いくつかの実施態様では、プライマーとプローブのセット及び方法は、市場で入手可能な適切な標本タイプのためのFDA基準を満たすELISAアッセイと一致する結果を、臨床標本を用いて生じる。いくつかの実施態様では、プライマーとプローブのセット及び方法は、糞便で見出される可能性が高い他の生物又は他の多様な病原体と交差反応しない。いくつかの実施態様では、プライマーとプローブのセット及び方法は、種々のエントアメーバ・ヒストリチカ単離株と反応する。いくつかの実施態様では、プライマーとプローブのセット及び方法は、サンプル緩衝液チューブ中の1mLにつき17生物（又は17生物と一致する一定量の鋳型配列）以下を検出する感度を有する。
いくつかの実施態様にしたがえば、プライマーとプローブのセット及び前記を用いる方法が、E.ヒストリチカの検出のために提供される。いくつかの実施態様では、プライマーとプローブのセット及び方法は、非病原性E.ジスパーを検出しない。いくつかの実施態様では、プライマーとプローブのセット及び方法は確固とした結果を生じ、それらの結果はE.ヒストリチカ及びE.ジスパーの偽似混合感染の場合に阻害又は干渉を受けない。いくつかの実施態様では、プライマーとプローブのセット及び方法は、伝統的な顕微鏡による方法によって同定されるヒト臨床標本のエントアメーバ・ヒストリチカを検出する（前記方法は本出願時にはその当時の標準治療である）。いくつかの実施態様では、プライマーとプローブのセット及び方法は、市場で入手可能な適切な標本タイプのためのFDA基準を満たすELISAアッセイと一致する結果を、臨床標本を用いて生じる。いくつかの実施態様では、プライマーとプローブのセット及び方法は、糞便で見出される可能性が高い他の生物又は他の多様な病原体と交差反応しない。いくつかの実施態様では、プライマーとプローブのセット及び方法は、種々のエントアメーバ・ヒストリチカ単離株と反応する。いくつかの実施態様では、プライマーとプローブのセット及び方法は、サンプル緩衝液チューブ中の1mLにつき17生物（又は17生物と一致する一定量の鋳型配列）以下を検出する感度を有する。
E.ヒストリチカ及びE.ジスパープラスミド配列の存在下での増幅
以前に記載したプライマーセットとプローブの組み合わせ（以下を参照されたい：Verweij et al., J. .Clin. Microbiol. 42: 1220-23, 2004）を用いて、BD MAXTM系による定量的PCR反応で用いた。前記組み合わせは、配列番号:4（ATTGTCGTGGCATCCTAACTCA）のフォワードプライマー、配列番号:5（GCGGACGGCTCATTATAACA）のリバースプライマー、及び配列番号:6（TCATTGAATGAATTGGCCATTT）のプローブを含み、前記プローブはカルフルオルオレンジ蛍光色素分子及びBHQ-1消光分子を含んでいた（図1参照）。配列番号:4及び配列番号:5のプライマーセットは、E.ヒストリチカ及びE.ジスパーの双方のrDNA配列を増幅することを特記する。配列番号:6のプローブは、E.ヒストリチカの標的増幅配列（配列番号:4及び5のプライマーセットによって明示される）と100%の相同性を有するが、E.ジスパーとはそうではない。
以前に記載したプライマーセットとプローブの組み合わせ（以下を参照されたい：Verweij et al., J. .Clin. Microbiol. 42: 1220-23, 2004）を用いて、BD MAXTM系による定量的PCR反応で用いた。前記組み合わせは、配列番号:4（ATTGTCGTGGCATCCTAACTCA）のフォワードプライマー、配列番号:5（GCGGACGGCTCATTATAACA）のリバースプライマー、及び配列番号:6（TCATTGAATGAATTGGCCATTT）のプローブを含み、前記プローブはカルフルオルオレンジ蛍光色素分子及びBHQ-1消光分子を含んでいた（図1参照）。配列番号:4及び配列番号:5のプライマーセットは、E.ヒストリチカ及びE.ジスパーの双方のrDNA配列を増幅することを特記する。配列番号:6のプローブは、E.ヒストリチカの標的増幅配列（配列番号:4及び5のプライマーセットによって明示される）と100%の相同性を有するが、E.ジスパーとはそうではない。
反応にはE.ヒストリチカ及び/又はE.ジスパーの標的rDNA遺伝子配列を含む鋳型プラスミドが供給される。低レベルの交差反応性がE.ヒストリチカのDNA配列とE.ジスパーのDNA配列との間で観察された。さらにまた、E.ジスパー標的核酸を含むプラスミドが、E.ヒストリチカ核酸を含むプラスミドよりも高い割合でPCR反応に添加されるとき、E.ヒストリチカ由来の特異的シグナルは劇的に減少した（図3参照）。E.ヒストリチカ鋳型による定量的PCR反応は検出可能なシグナルを生じるが、一方、定常レベルのE.ヒストリチカ鋳型に加えて、E.ジスパー鋳型プラスミドの5,000（“5K”）、25,000（“25K”）、50,000（“50K”）、75,000（75K）、及び100,000（“100K”）コピーの存在は、検出可能なシグナル量を用量依存態様で減少させた（図3）。図1に要約するように、この実施例のプライマー/プローブ組み合わせはE.ヒストリチカシグナルの抑制をもたらした。
いずれの理論によっても制限を受けないが、E.ヒストリチカDNA及びE.ジスパーDNAの双方を増幅するプライマーの使用及びE.ヒストリチカ配列特異的プローブへの依存は、E.ジスパーの存在下における交差反応性及びシグナル抑制の両方をもたらしたと考えられる。前記は、おそらくE.ヒストリチカプローブの結合部位の利用可能性を遮断する、E.ヒストリチカ及びE.ジスパーの増幅生成物との間のホモ-及びヘテロ-重鎖形成のためであろう。
いずれの理論によっても制限を受けないが、E.ヒストリチカDNA及びE.ジスパーDNAの双方を増幅するプライマーの使用及びE.ヒストリチカ配列特異的プローブへの依存は、E.ジスパーの存在下における交差反応性及びシグナル抑制の両方をもたらしたと考えられる。前記は、おそらくE.ヒストリチカプローブの結合部位の利用可能性を遮断する、E.ヒストリチカ及びE.ジスパーの増幅生成物との間のホモ-及びヘテロ-重鎖形成のためであろう。
E.ヒストリチカ及びE.ジスパープラスミド配列の存在下でのE.ヒストリチカの検出
本明細書の実施態様のプライマー-プローブセットをBD MAXTMプラットフォームで実施される定量的PCR増幅反応で用いた。PCR混合物を97℃で10分間加熱してDNAポリメラーゼを活性化させた。続いて二工程熱サイクルを以下のように45サイクル実施した:97℃の15秒変性工程及びその後に続く62℃で64.5秒のアニーリング/伸長工程。プライマーセットは、配列番号:1のフォワードプライマー、配列番号:2のリバースプライマー、及び配列番号:3のプローブを含み、前記プローブはカルフルオルオレンジ蛍光色素分子及びBHQ-1消光分子を含んでいた（図1参照）。配列番号:1のプライマーはE.ヒストリチカとアニールするが、標準的増幅条件下では、小リボソームサブユニット遺伝子のE.ジスパー標的核酸配列とはアニールせず（図2参照）、一方、配列番号:2のプライマーは、E.ヒストリチカ及びE.ジスパーのどちらの小リボソームサブユニット遺伝子の標的核酸配列ともアニールすることを特記する。したがって、配列番号:1及び配列番号:2のプライマーセットは、実質的にE.ヒストリチカを増幅するが、E.ジスパー標的増幅配列は増幅しない。配列番号:3のプローブは、E.ヒストリチカ又はE.ジスパーの小リボソームサブユニット遺伝子のDNA配列のどちらとも100%の相補性を有する。
本明細書の実施態様のプライマー-プローブセットをBD MAXTMプラットフォームで実施される定量的PCR増幅反応で用いた。PCR混合物を97℃で10分間加熱してDNAポリメラーゼを活性化させた。続いて二工程熱サイクルを以下のように45サイクル実施した:97℃の15秒変性工程及びその後に続く62℃で64.5秒のアニーリング/伸長工程。プライマーセットは、配列番号:1のフォワードプライマー、配列番号:2のリバースプライマー、及び配列番号:3のプローブを含み、前記プローブはカルフルオルオレンジ蛍光色素分子及びBHQ-1消光分子を含んでいた（図1参照）。配列番号:1のプライマーはE.ヒストリチカとアニールするが、標準的増幅条件下では、小リボソームサブユニット遺伝子のE.ジスパー標的核酸配列とはアニールせず（図2参照）、一方、配列番号:2のプライマーは、E.ヒストリチカ及びE.ジスパーのどちらの小リボソームサブユニット遺伝子の標的核酸配列ともアニールすることを特記する。したがって、配列番号:1及び配列番号:2のプライマーセットは、実質的にE.ヒストリチカを増幅するが、E.ジスパー標的増幅配列は増幅しない。配列番号:3のプローブは、E.ヒストリチカ又はE.ジスパーの小リボソームサブユニット遺伝子のDNA配列のどちらとも100%の相補性を有する。
実施例1のように、反応には、E.ヒストリチカ及び/又はE.ジスパーの標的rDNA遺伝子配列鋳型を含むプラスミドが供給される。実施例1とは異なり、E.ジスパー鋳型との交差反応は認められなかった。さらにまた、E.ジスパー鋳型の存在は増幅シグナルを抑制しなかった（図4参照）。定常量のE.ヒストリチカ鋳型の存在下で、0、250,000（“250K”）、500,000（“500K”）、750,000（“750K）、及び1,000,000（“1e6”）コピーのE.ジスパー鋳型含有プラスミドの存在は、E.ヒストリチカ由来増幅シグナルを減少させなかった（図4）。鋳型を含まない陰性コントロール（“NTC”）を実施し、予想どおりシグナルは検出されなかった。図1に要約したように、本実施例のプライマー/プローブ組み合わせは、認識可能などのようなE.ヒストリチカシグナルの抑制も引き起こさなかった。
したがって、高コピー数のE.ジスパー鋳型が存在しても、実施例2のプライマーセット及びプローブは確固でかつ一貫したE.ヒストリチカシグナルレベルを生じた。いずれの理論にも拘束されないが、E.ヒストリチカに特異的であるがE.ジスパーには特異的ではない配列を増幅するように設計されたプライマーセットは、E.ジスパー配列と干渉することなくE.ヒストリチカ特異的シグナルの検出を可能にすることができると考えられる。
〔実施例3−13〕
したがって、高コピー数のE.ジスパー鋳型が存在しても、実施例2のプライマーセット及びプローブは確固でかつ一貫したE.ヒストリチカシグナルレベルを生じた。いずれの理論にも拘束されないが、E.ヒストリチカに特異的であるがE.ジスパーには特異的ではない配列を増幅するように設計されたプライマーセットは、E.ジスパー配列と干渉することなくE.ヒストリチカ特異的シグナルの検出を可能にすることができると考えられる。
〔実施例3−13〕
E.ヒストリチカ配列の検出
以下の方法が実施例3−13で用いられた。
糞便標本を患者から収集し、清浄な容器に非保存状態で（非保存）又は固定状態（10%ホルマリン）で実験室に輸送した。
糞便標本のDNA抽出を以下のように実施した:標本をボルテックスした。10μLのループをループの深さまで各標本に挿入し、続いて回転運動を用いてサンプル緩衝液（50mMトリス-HCl（pH7.0）、1%トリトンX-100、1mM EDTA（pH 8.0）、20mM H3BO3、20mM Na3C6H5O7.2H2O）を有するBD MAXTMサンプル緩衝液チューブ（SBT）中に押し出した。このSBTをセプタムキャップで閉じ、続いてBDプレウォームヒーター上で約110℃に20分間加熱して生物の溶解を加速した。SBTをBDプレウォームヒーターによって室温に冷却して、ざっとボルテックスし、続いてBD MAXTM系に移した。BD MAXTM系で0.5μg/μLのPAMAM結合磁性ビーズの存在下で、12ユニットのプロテイナーゼK、0.12%のトレハロース、及び104コピーの内部コントロールDNAを用いて、各サンプルにつき500μL体積のサンプル緩衝液を75℃で10分間抽出した。結合核酸を有する前記ビーズを500μLの洗浄緩衝液（12.5mMトリス（pH6.8）、0.03%プロクリン300、0.1%トゥイーン-20）で洗浄した。続いて12.5μLの溶出緩衝液（20mM NaOH）中にて80℃で3分間前記ビーズを加熱して核酸を溶出させた。溶出核酸を22.5μLの中和緩衝液（7.78mM MgCl2、155.6mMトリス（pH8.0）、4.44mM NaOH、0.03%プロクリン300、0.016%トゥイーン-20）の添加によって中和した。
以下の方法が実施例3−13で用いられた。
糞便標本を患者から収集し、清浄な容器に非保存状態で（非保存）又は固定状態（10%ホルマリン）で実験室に輸送した。
糞便標本のDNA抽出を以下のように実施した:標本をボルテックスした。10μLのループをループの深さまで各標本に挿入し、続いて回転運動を用いてサンプル緩衝液（50mMトリス-HCl（pH7.0）、1%トリトンX-100、1mM EDTA（pH 8.0）、20mM H3BO3、20mM Na3C6H5O7.2H2O）を有するBD MAXTMサンプル緩衝液チューブ（SBT）中に押し出した。このSBTをセプタムキャップで閉じ、続いてBDプレウォームヒーター上で約110℃に20分間加熱して生物の溶解を加速した。SBTをBDプレウォームヒーターによって室温に冷却して、ざっとボルテックスし、続いてBD MAXTM系に移した。BD MAXTM系で0.5μg/μLのPAMAM結合磁性ビーズの存在下で、12ユニットのプロテイナーゼK、0.12%のトレハロース、及び104コピーの内部コントロールDNAを用いて、各サンプルにつき500μL体積のサンプル緩衝液を75℃で10分間抽出した。結合核酸を有する前記ビーズを500μLの洗浄緩衝液（12.5mMトリス（pH6.8）、0.03%プロクリン300、0.1%トゥイーン-20）で洗浄した。続いて12.5μLの溶出緩衝液（20mM NaOH）中にて80℃で3分間前記ビーズを加熱して核酸を溶出させた。溶出核酸を22.5μLの中和緩衝液（7.78mM MgCl2、155.6mMトリス（pH8.0）、4.44mM NaOH、0.03%プロクリン300、0.016%トゥイーン-20）の添加によって中和した。
PCRマスターミックスを以下のように調製した:中和核酸（35μL）を用いて乾燥マスターミックスを再水和させた。再水和後のPCRマスターミックス中の成分の最終濃度は以下のとおりであった：5mM MgCl2、100mMトリス、10mM NaOH、0.019%プロクリン300、0.010%トゥイーン-20、1.96%トレハロース、0.5mM dNTP（各々について）、0.6mg/mL BSA、0.04 U/μLのホットゴールドスターDNAポリメラーゼ。マスターミックスはまたPCRプライマー及びTaqMan(商標)二重標識加水分解プローブを含んでいた。エントアメーバ・ヒストリチカのためのプライマー及びプローブは、フォワードプライマー及びリバースプライマーについては900nMで、プローブについては550nMでインキュベートした。E.ヒストリチカの検出のためのプライマーセット及びプローブセットは、配列番号:1の核酸配列を有するフォワードプライマー、配列番号:2の核酸配列を有するリバースプライマー、及び配列番号:3の核酸配列を有するプローブを含んでいた。エントアメーバ・ヒストリチカのためにプローブをカルフルオルオレンジ560及びブラックホール消光分子-1で標識した。内部コントロールのためのプライマー及びプローブは各々300nMで含まれていた。内部コントロールプローブは、クォーサー（Quasar）705及びブラックホール消光分子-3で標識した。クリプトスポリジウム・パルブム/ホミニス及びギアルジア・ランブリアのためのプライマー及びプローブは、フォワードプライマー及びリバースプライマーについては200nMで、プローブについては550nMで含まれていた。クリプトスポリジウム・パルブム/ホミニスのためのプローブをカルフルオルレッド610及びブラックホール消光分子-2で標識した。ギアルジア・ランブリアのためのプローブをFAM及びブラックホール消光分子-1で標識した。
再水和の後で、BD MAXTM系は約12μLのPCRレディー溶液をBD MAXTMマイクロフリューディックカートリッジ（Microfluidic Cartridge）に分配した。BD MAXTMマイクロフリューディックカートリッジのマイクロバルブは増幅混合物を収納するためにPCR開始前に当該系によって密閉され、したがって蒸発及び夾雑物混入が防止される。このPCR混合物を10分間97℃で加熱し、DNAポリメラーゼを活性化させた。二工程熱サイクルを以下のように45サイクル実施した:97℃の15秒変性工程及びその後に続く62℃で64.5秒のアニーリング/伸長工程。BD MAXTM系は各サイクルで蛍光シグナルを追跡監視し、プログラムの終了時にデータを解釈し、最終結果を報告する。結果判定はCt.Score基づく（前記は、各標的チャネルについて初期静的エンドポイント閾値及び二次動的QC閾値（Ctとは逆に変化する）を含む）。陽性と考えるためには、エンドポイント蛍光は両閾値を超えなければならず、最終Ctは42未満でなければならない。過剰変動PCR曲線についての追加のチェックを用い、PCRチャンバーで不十分な体積を有する反応を排除した。内部コントロールの増幅の失敗は、Ct.Score閾値を陽性性に適合させることができない各標的チャネルの未解析結果に当該系を戻らせる。
2ロットのエントアメーバ・ヒストリチカ栄養型を記載のBD MAXTMアッセイによって検出した。BD MAXTMアッセイは低力価（標本の1mLにつき2,550の栄養型）又は高力価（標本の1mLにつき1.5e6の栄養型）のエントアメーバ・ジスパーを検出しない。結果は表1に示されている。
表1
BD MAXTMは、高力価のクリプトスポリジウム・パルブム、ギアルジア・ランブリア、及びエントアメーバ・ジスパーを含む偽似多重感染標本で、検出限界（LoD）近くのE.ヒストリチカを検出した。
表2
BD MAXTM系を用いて、非保存及び10%ホルマリン固定標本タイプの双方を代表する伝統的な方法によって検出される、実際のヒト臨床標本中に排出されるエントアメーバ・ヒストリチカ生物型を検出した。比較のために市場で入手できるELISA（TechLab E.ヒストリチカII）を同じサンプルで実施した。
BD MAXTMアッセイの結果は非保存サンプルにおいて市場で入手できるELISA（TechLab E.ヒストリチカII）の結果と緊密に一致する（非保存サンプルについてELISAは認可されている）。TechLab ELISAアッセイは固定標本については認可されてなく、したがって固定標本について陰性結果はTechLab ELISAアッセイの特性と合致することを特記する。
BD MAXTMアッセイの結果は非保存サンプルにおいて市場で入手できるELISA（TechLab E.ヒストリチカII）の結果と緊密に一致する（非保存サンプルについてELISAは認可されている）。TechLab ELISAアッセイは固定標本については認可されてなく、したがって固定標本について陰性結果はTechLab ELISAアッセイの特性と合致することを特記する。
表3
BD MAXTMアッセイが他の生物と交差反応するか否かを決定するために、他の生物の鋳型の存在下でE.ヒストリチカ配列を検出した（他の生物には、糞便で見いだされる蓋然性の高い生物の他に糞便で見いだされる蓋然性の低い典型的な生物が含まれる）。チャレンジ生物は糞便マトリックスを含まないSBTに添加した。各生物は三重に試験した。
結果は表4に示される。BD MAXTMアッセイは、糞便に見出される蓋然性の高い（又は蓋然性が高くない）他の生物と交差反応しない。
結果は表4に示される。BD MAXTMアッセイは、糞便に見出される蓋然性の高い（又は蓋然性が高くない）他の生物と交差反応しない。
表4
異なる多数のエントアメーバ・ヒストリチカ単離株を用い、各試験で非保存糞便マトリックスの10μLの存在下でBD MAXTMアッセイをLODアッセイで試験した。各単離株について24組で試験した。BD MAXTMアッセイは多様なエントアメーバ・ヒストリチカの種々の単離株を検出した。結果は表5に示されている。
表5
10μLの適切な糞便マトリックスでサンプル緩衝液中のエントアメーバ・ヒストリチカ栄養型を直線的に希釈することによって、各標本タイプについて95%LoDを決定した。各試験レベルにつき最小限36組で実施した。LoDはサンプル緩衝液チューブ中で約17生物/mLである。結果は表6（非保存サンプル）及び表7（サンプルは10%ホルマリンで固定）に示されている。
表6（非保存サンプル）
表7（10%ホルマリン固定サンプル）
混合感染でのE.ヒストリチカの検出
2つ以上の生物の混合物を含むサンプルでE.ヒストリチカの検出を立証した（前記混合物は多重感染標本を模倣する）。高レベルの他の生物（高レベル）を含む非保存糞便に、低レベルの1つの標的（低標的）を添加した。
表8に示すように、BD MAXTMアッセイは、高力価のクリプトスポリジウム・パルブム、ギアルジア・ランブリア、及びエントアメーバ・ジスパーを含む偽似多重感染標本でLoD近くのE.ヒストリチカを検出した。高レベルミックスのE.ジスパーを接種し、E.ジスパーの存在がE.ヒストリチカの増幅を遮断しないことを確認した。
2つ以上の生物の混合物を含むサンプルでE.ヒストリチカの検出を立証した（前記混合物は多重感染標本を模倣する）。高レベルの他の生物（高レベル）を含む非保存糞便に、低レベルの1つの標的（低標的）を添加した。
表8に示すように、BD MAXTMアッセイは、高力価のクリプトスポリジウム・パルブム、ギアルジア・ランブリア、及びエントアメーバ・ジスパーを含む偽似多重感染標本でLoD近くのE.ヒストリチカを検出した。高レベルミックスのE.ジスパーを接種し、E.ジスパーの存在がE.ヒストリチカの増幅を遮断しないことを確認した。
表8
表8に示すように、BD MAXTMアッセイは、低レベル及び高レベルのE.ヒストリチカの存在を検出した。さらにまた、高レベルのE.ジスパーの存在はE.ヒストリチカの検出を妨げなかった。したがって、本明細書のいくつかの実施態様のE.ヒストリチカを検出する方法は、非常に低レベルのE.ヒストリチカに対して感度が高く、高レベルのE.ジスパーの存在によって損なわれない。
BD MAXTMアッセイを検証済みの代替PCR及び双方向性シークェンシングアプローチと比較した。これまでに蓄積されてきた糞便標本（非保存及び10%ホルマリン固定糞便タイプの両方を占める）を用いて臨床的模擬試験を実施した。BD MAXTMアッセイを前記標本で実施した。検証済み代替PCR及び双方向性シークェンシングアッセイもまた前記標本で実施した。標本は、それらの最高BLASTヒットがE.ヒストリチカである場合に、代替PCR及び双方向性シークェンシングアッセイについて陽性と考えた。代替PCR/双方向性シークェンシングの結果が最初の現場の参照方法と一致する標本のみを性能計算に加えた。結果は表9.1、9.2及び9.3に要約されている。
表9.1
表9.2
表9.3
非保存標本及び10%ホルマリン固定標本の双方が、BD MAXTMアッセイと代替PCR及びシークェンシング方法との間で100%の一致を示した。さらにまた、多数の標本が非病原性エントアメーバ種を含むことが見出され、BD MAXTME.ヒストリチカアッセイはそれらを正確に“陰性”と報告した。したがって、本明細書のいくつかの実施態様のE.ヒストリチカ核酸を検出する方法は、他の生物との交差反応性を最小限にし、かつ偽陰性及び偽陽性の双方を最小限にすることを特徴とする、高度に正確な結果を提供すると考えられる。
表9.1−9.3の未加工データは表10.1−10.2に示されている。
表9.1−9.3の未加工データは表10.1−10.2に示されている。
表10.1
表10.2
模擬臨床実験
E.ヒストリチカ陽性サンプルでE.ヒストリチカを検出するBD MAXTMアッセイの能力をさらに確認するために、細工した模擬臨床実験を実施した。スクリーニングでエントアメーバ・ヒストリチカ陰性とされた個々の非保存及び10%ホルマリン固定糞便標本に、アッセイLOD近くのE.ヒストリチカを添加した。内容を知らされていない実施者によって、細工済み標本がBD MAXTM腸内寄生生物パネルを用いて試験された。この模擬臨床実験の結果は表11に示されている。
E.ヒストリチカ陽性サンプルでE.ヒストリチカを検出するBD MAXTMアッセイの能力をさらに確認するために、細工した模擬臨床実験を実施した。スクリーニングでエントアメーバ・ヒストリチカ陰性とされた個々の非保存及び10%ホルマリン固定糞便標本に、アッセイLOD近くのE.ヒストリチカを添加した。内容を知らされていない実施者によって、細工済み標本がBD MAXTM腸内寄生生物パネルを用いて試験された。この模擬臨床実験の結果は表11に示されている。
表11
添加済み標本の100%が陽性であり、非添加標本の100%が陰性であった。したがって、本明細書のいくつかの実施態様のE.ヒストリチカ核酸検出方法は、正確にE.ヒストリチカを検出し、併せて偽陰性を最小限にする。
BD MAX TM アッセイと参照方法との比較
BD MAXTMアッセイの結果を多様な参照方法と比較した。“最終参照方法（RM）の結果”（本明細書では“混成RM”とも称する）は、三色エントアメーバ属種アッセイ並びに代替PCR及びシークェンシングアプローチに由来する混合入力により得られた。E.ヒストリチカについては、混成参照方法（RM）は、1）PVA固定糞便の三色染色の顕微鏡試験を、2）分析的に検証されたまた別のPCR及び双方向性シークェンシングと並行して含んでいた。この試験では全部で5箇所の米国臨床検査センター（US investigational Clinical Center）が含まれ、前記で日常的な患者の看護の部分として標本が収集され、当該試験に登録され、BD MAXTM腸内寄生生物パネルに関して試験された。3つの標本収集センター及び別の標本周旋業者によって臨床検査センターに標本が送られた。
予測用サンプルについては、内包基準は以下のとおりであった。標本は急性胃腸炎又は大腸炎が疑われる小児又は成人患者から入手された（前記について標的寄生生物診断検査が医療提供者により指示されている）。糞便標本は非保存又は10%ホルマリン固定で収集された。単一患者から収集された各標本タイプ（固定であれ非保存であれ）で1つの標本だけが受け入れられた。当該試験は適切な参照方法の試験に利用可能であるためには十分な体積の糞便を必要とし（各臨床センターの標準手順に左右される）、BD MAXTMアッセイに利用しうるためには最小限0.5mL又は0.5グラムの糞便が必要であった。
遡及用サンプルについては、内包基準は以下のとおりであった。日常的検査方法の最初の結果が利用可能な（3つのEPP標的のうち少なくとも1つについて）非保存及び固定標本であった。各標本は収集日が判明していた。各標本は、非保存の場合は-20℃以下で、ホルマリン保存の場合は2−8℃で全保存期間を通して保存された。
表12.1に要約されているように、“最終RM結果”は、三色エントアメーバ属種アッセイ並びに代替PCR及びシークェンシングの両方が陽性である場合にスコアを陽性とし、これら方法どちらか又は両方が陰性である場合には陰性とした。表12.2に要約されているように、結果は、BD MAXTMアッセイ及び最終RM結果が共に陽性である場合にスコアを“真の陽性”とし、BD MAXTMアッセイ及び最終RM結果が共に陰性である場合にスコアを“真の陰性”とした。BD MAXTMアッセイが陽性で最終RM結果が陰性である場合には結果のスコアを“偽陽性”とし、BD MAXTMアッセイが陰性で最終RM結果が陽性である場合には結果のスコアを“偽陰性”とした（表12.2参照）。
使用略語は以下を含む：P＝陽性、N＝陰性、LB＝下限、UB＝上限、PPA＝陽性パーセント一致（感度）、NPA＝陰性パーセント一致（特異性）。
BD MAXTMアッセイの結果を多様な参照方法と比較した。“最終参照方法（RM）の結果”（本明細書では“混成RM”とも称する）は、三色エントアメーバ属種アッセイ並びに代替PCR及びシークェンシングアプローチに由来する混合入力により得られた。E.ヒストリチカについては、混成参照方法（RM）は、1）PVA固定糞便の三色染色の顕微鏡試験を、2）分析的に検証されたまた別のPCR及び双方向性シークェンシングと並行して含んでいた。この試験では全部で5箇所の米国臨床検査センター（US investigational Clinical Center）が含まれ、前記で日常的な患者の看護の部分として標本が収集され、当該試験に登録され、BD MAXTM腸内寄生生物パネルに関して試験された。3つの標本収集センター及び別の標本周旋業者によって臨床検査センターに標本が送られた。
予測用サンプルについては、内包基準は以下のとおりであった。標本は急性胃腸炎又は大腸炎が疑われる小児又は成人患者から入手された（前記について標的寄生生物診断検査が医療提供者により指示されている）。糞便標本は非保存又は10%ホルマリン固定で収集された。単一患者から収集された各標本タイプ（固定であれ非保存であれ）で1つの標本だけが受け入れられた。当該試験は適切な参照方法の試験に利用可能であるためには十分な体積の糞便を必要とし（各臨床センターの標準手順に左右される）、BD MAXTMアッセイに利用しうるためには最小限0.5mL又は0.5グラムの糞便が必要であった。
遡及用サンプルについては、内包基準は以下のとおりであった。日常的検査方法の最初の結果が利用可能な（3つのEPP標的のうち少なくとも1つについて）非保存及び固定標本であった。各標本は収集日が判明していた。各標本は、非保存の場合は-20℃以下で、ホルマリン保存の場合は2−8℃で全保存期間を通して保存された。
表12.1に要約されているように、“最終RM結果”は、三色エントアメーバ属種アッセイ並びに代替PCR及びシークェンシングの両方が陽性である場合にスコアを陽性とし、これら方法どちらか又は両方が陰性である場合には陰性とした。表12.2に要約されているように、結果は、BD MAXTMアッセイ及び最終RM結果が共に陽性である場合にスコアを“真の陽性”とし、BD MAXTMアッセイ及び最終RM結果が共に陰性である場合にスコアを“真の陰性”とした。BD MAXTMアッセイが陽性で最終RM結果が陰性である場合には結果のスコアを“偽陽性”とし、BD MAXTMアッセイが陰性で最終RM結果が陽性である場合には結果のスコアを“偽陰性”とした（表12.2参照）。
使用略語は以下を含む：P＝陽性、N＝陰性、LB＝下限、UB＝上限、PPA＝陽性パーセント一致（感度）、NPA＝陰性パーセント一致（特異性）。
表12.1
表12.2
総合的な実施結果は表12.3に要約されている。スクリーニングした1660について、11の“真の陽性”、1649の“真の陰性”、0の“偽陽性”及び0の“偽陰性”があった。
表12.3
したがって、表12.3に要約された結果は、BD MAXTMアッセイと参照方法との間の高度の一致を示した。1660サンプルで偽陽性又は偽陰性はなかった。したがって、本明細書のいくつかの実施態様のE.ヒストリチカ核酸検出方法は、正確にE.ヒストリチカを検出し、併せて偽陰性を最小限にし、かつ偽陽性を最小限にすると考えられる（例えば1660中で偽陰性は1例未満で、1660中で偽陰性は1例未満である）。
総合的な実施結果を予測的及び遡及的標本起源について本明細書に記載したようにさらに分析した。これらの分析結果は表12.4に要約されている。
総合的な実施結果を予測的及び遡及的標本起源について本明細書に記載したようにさらに分析した。これらの分析結果は表12.4に要約されている。
表12.4
表12.4に示されているように、BD MAXTMアッセイは予測的及び遡及的標本の両方について正確な結果をもたらした。したがって、本明細書のいくつかの実施態様のE.ヒストリチカ核酸検出方法は、E.ヒストリチカを正確に検出し、併せて偽陰性を最小限にすると考えられる。
総合的な実施結果を非保存標本及び10%ホルマリン固定標本についてさらに分析した。この分析結果は表12.5に要約されている。
総合的な実施結果を非保存標本及び10%ホルマリン固定標本についてさらに分析した。この分析結果は表12.5に要約されている。
表12.5に示すように、BD MAXTMアッセイは、ホルマリン固定及び非保存標本の両方について正確な結果をもたらした。したがって、本明細書のいくつかの実施態様のE.ヒストリチカ核酸検出方法は、多様なサンプル様式（非保存サンプル及び固定サンプルを含むが、ただしこれらに限定されない）のために適切であると考えられる。したがって、本明細書のいくつかの実施態様の方法は、臨床現場、現場を離れた検査センター（サンプルの固定及び/又はサンプル収集と検査の間の実質的時間差を要求しうる）でのサンプルのスクリーニングに適切でありうる。
分析的に検証されたまた別のPCR及び双方向性シークェンシングによって同定された具体的な配列特性（例えば生物の遺伝子及び/又はその部分）は、BD MAXTMアッセイの結果と一致した。下記表12.6に要約されるように、非E.ヒストリチカシークェンシング結果をもたらしたサンプルはBD MAXTMアッセイによって陰性と確認され、E.ヒストリチカシークェンシング結果に特徴的な配列をもたらすサンプルはBD MAXTMアッセイによって陽性と確認された。
分析的に検証されたまた別のPCR及び双方向性シークェンシングによって同定された具体的な配列特性（例えば生物の遺伝子及び/又はその部分）は、BD MAXTMアッセイの結果と一致した。下記表12.6に要約されるように、非E.ヒストリチカシークェンシング結果をもたらしたサンプルはBD MAXTMアッセイによって陰性と確認され、E.ヒストリチカシークェンシング結果に特徴的な配列をもたらすサンプルはBD MAXTMアッセイによって陽性と確認された。
表12.6
したがって、本明細書のいくつかの実施態様のE.ヒストリチカ核酸検出方法は高度に正確であり、試験されたサンプルの具体的な配列特性と一致する結果をもたらすと考えられる。
本試験のための基準に適合しないサンプルは除外された。例示として、この試験から除外されたサンプルの三色、シークェンシング及びBD MAXTMアッセイの結果を表12.7に提供する。
本試験のための基準に適合しないサンプルは除外された。例示として、この試験から除外されたサンプルの三色、シークェンシング及びBD MAXTMアッセイの結果を表12.7に提供する。
表12.7
表12.7に示された不適合サンプルのシークェンシングの結果は、BD MAXTMアッセイが他のエントアメーバ配列（例えば、エントアメーバ・ジスパー、エントアメーバ・ポレッキイ、エントアメーバ・ムリス、エントアメーバ・ヌッタリー、エントアメーバ・ハルトマンニ及びエントアメーバ・ボビス）と交差反応しないことを示したことを特記する。したがって、本明細書のいくつかの実施態様のE.ヒストリチカ核酸検出方法は、エントアメーバ・コリ、エントアメーバ・ジスパー、エントアメーバ・ポレッキイ、エントアメーバ・ムリス、エントアメーバ・ヌッタリー、エントアメーバ・ハルトマンニ及び/又はエントアメーバ・ボビスと交差反応しないと考えられる。
E.ヒストリチカ感染は比較的稀であり、この希少性に合致して、多数の臨床試験が陽性結果より多くの陰性結果を生じたことを特に記す。BD MAXTMアッセイについてさらに追加される陽性結果の特徴を知るために、細工を加えた補足臨床試験を設計し実施した（前記では多数の標本にE.ヒストリチカ栄養型が添加された）。
特に、E.ヒストリチカについて陰性とスクリーニングされた個々の非保存及び10%ホルマリン固定糞便標本に、E.ヒストリチカ栄養型が全アッセイ範囲に及ぶレベルで添加された。内容を知らされていない実施者によって、細工済み標本がBD MAXTM腸内寄生生物パネル（EPP）を用いて試験された。この細工した臨床試験の結果は表13に示されている。
特に、E.ヒストリチカについて陰性とスクリーニングされた個々の非保存及び10%ホルマリン固定糞便標本に、E.ヒストリチカ栄養型が全アッセイ範囲に及ぶレベルで添加された。内容を知らされていない実施者によって、細工済み標本がBD MAXTM腸内寄生生物パネル（EPP）を用いて試験された。この細工した臨床試験の結果は表13に示されている。
表13
表13に示されているように、添加された標本の100%が陽性であり、非添加標本の100%が陰性であった。したがって、本明細書のいくつかの実施態様のE.ヒストリチカ核酸検出方法は、E.ヒストリチカを含まないサンプルと同様にE.ヒストリチカを含むサンプル間で揺るぎなくかつ正確である。
本明細書の実質的に任意の複数形及び単数形の用語の使用に関しては、当業者は、文脈及び/又は適用に対して適切なように複数から単数、及び/又は単数から複数に転換できる。明確さを期すために、本明細書では多様な単数/複数の交換を明示的に示すことができる。
一般的に当業者の理解するところであるが、本明細書及び特に添付の特許請求の範囲（例えば添付の特許請求の範囲の本体）で用いられる用語は、一般的に“開放”用語として意図される（例えば“含む（including）”という用語は“〜を含むが前記に制限されない”と解釈されるべきであり、“有する（having）”という用語は“少なくとも〜を有する”と解釈されるべきであり、“含む（includes）”という用語は“〜を含むが前記に制限されない”と解釈されるべきである）。さらにまた当業者には理解されるところであるが、導入された請求項の列挙で特定の数字が意図される場合、そのような意図は当該請求項で明確に記載され、そのような記載がなければそのような意図は存在しない。例えば、理解を助けるものとして、以下の添付の特許請求の範囲は、 請求項で列挙を導入するために“少なくとも１つの”及び“1つ以上の”という導入語句の使用を含むことができる。しかしながら、そのような語句の使用は、不定冠詞“a”又は“an”による請求項での列挙の導入は、そのような導入された列挙を含む一切の個々の請求項をそのようなただ1つの列挙を含む実施態様に限定することを示唆するものと解されるべきではない。前記は、同じ請求項が導入語句“1つ以上”又は“少なくとも1つ”及び不定冠詞“a”又は“an”含むときでも同じである（例えば“a”及び/又は“an”は“少なくとも1つ”又は“1つ以上”を意味すると解釈されるべきである）。同じことが、請求項で列挙を導入するために用いられる定冠詞の使用についてもいえる。加えて、導入された請求項の列挙で指定の数字が明示されていたとしても、そのような列挙は少なくとも当該列挙された数字のみを意味すると解されるべきではない（例えば、他の修飾語を伴わない“2つの列挙物”の裸の列挙は、少なくとも2つの列挙物又は2つ以上の列挙物を意味する）。さらにまた、“A、B及びCなどの少なくとも1つ”と同様な常套句が用いられる事例では、一般的に、そのような構文は当業者が当該常套句で理解する意味を意図する（例えば、“A、B及びCの少なくとも1つを有する系”は、Aのみ、Bのみ、Cのみ、A及びBをともに、A及びCをともに、B及びCをともに、及び/又はA、B及びCをともになどを有する系を含むが、ただしこれらに限定されない）。“A、B又はCなどの少なくとも1つ”と同様な常套句が用いられる事例では、一般的に、そのような構文は当業者が当該常套句で理解する意味を意図する（例えば、“A、B又はCの少なくとも1つを有する系”は、Aのみ、Bのみ、Cのみ、A及びBをともに、A及びCをともに、B及びCをともに、及び/又はA、B及びCをともになどを有する系を含むが、ただしこれらに限定されない）。さらにまた当業者には理解されるところであるが、2つ以上の代替用語を提示する実質的に離接的な語及び/又は句はいずれも（本文、特許請求の範囲又は図面に関わらず）、当該用語の1つ、当該用語のどちらか、又は両用語を含む可能性を意図すると理解されるべきである。例えば、“A又はB”という句は“A”又は“B”又は“A及びB”の可能性を含むことは理解されよう。
一般的に当業者の理解するところであるが、本明細書及び特に添付の特許請求の範囲（例えば添付の特許請求の範囲の本体）で用いられる用語は、一般的に“開放”用語として意図される（例えば“含む（including）”という用語は“〜を含むが前記に制限されない”と解釈されるべきであり、“有する（having）”という用語は“少なくとも〜を有する”と解釈されるべきであり、“含む（includes）”という用語は“〜を含むが前記に制限されない”と解釈されるべきである）。さらにまた当業者には理解されるところであるが、導入された請求項の列挙で特定の数字が意図される場合、そのような意図は当該請求項で明確に記載され、そのような記載がなければそのような意図は存在しない。例えば、理解を助けるものとして、以下の添付の特許請求の範囲は、 請求項で列挙を導入するために“少なくとも１つの”及び“1つ以上の”という導入語句の使用を含むことができる。しかしながら、そのような語句の使用は、不定冠詞“a”又は“an”による請求項での列挙の導入は、そのような導入された列挙を含む一切の個々の請求項をそのようなただ1つの列挙を含む実施態様に限定することを示唆するものと解されるべきではない。前記は、同じ請求項が導入語句“1つ以上”又は“少なくとも1つ”及び不定冠詞“a”又は“an”含むときでも同じである（例えば“a”及び/又は“an”は“少なくとも1つ”又は“1つ以上”を意味すると解釈されるべきである）。同じことが、請求項で列挙を導入するために用いられる定冠詞の使用についてもいえる。加えて、導入された請求項の列挙で指定の数字が明示されていたとしても、そのような列挙は少なくとも当該列挙された数字のみを意味すると解されるべきではない（例えば、他の修飾語を伴わない“2つの列挙物”の裸の列挙は、少なくとも2つの列挙物又は2つ以上の列挙物を意味する）。さらにまた、“A、B及びCなどの少なくとも1つ”と同様な常套句が用いられる事例では、一般的に、そのような構文は当業者が当該常套句で理解する意味を意図する（例えば、“A、B及びCの少なくとも1つを有する系”は、Aのみ、Bのみ、Cのみ、A及びBをともに、A及びCをともに、B及びCをともに、及び/又はA、B及びCをともになどを有する系を含むが、ただしこれらに限定されない）。“A、B又はCなどの少なくとも1つ”と同様な常套句が用いられる事例では、一般的に、そのような構文は当業者が当該常套句で理解する意味を意図する（例えば、“A、B又はCの少なくとも1つを有する系”は、Aのみ、Bのみ、Cのみ、A及びBをともに、A及びCをともに、B及びCをともに、及び/又はA、B及びCをともになどを有する系を含むが、ただしこれらに限定されない）。さらにまた当業者には理解されるところであるが、2つ以上の代替用語を提示する実質的に離接的な語及び/又は句はいずれも（本文、特許請求の範囲又は図面に関わらず）、当該用語の1つ、当該用語のどちらか、又は両用語を含む可能性を意図すると理解されるべきである。例えば、“A又はB”という句は“A”又は“B”又は“A及びB”の可能性を含むことは理解されよう。
加えて、開示の特色又は特徴がマーカッシュ群表現で記載される場合には、当該開示はまたマーカッシュ群の任意の個々のメンバー又はサブグループのメンバーに関して記載されていることは当業者には理解されよう。
当業者には理解されるところであるが、任意のかつ全ての目的について、例えば書面による説明の提供に関して、本明細書に開示される範囲の全てはまた、任意のかつ全ての可能な一部範囲及びその一部範囲の組み合わせを包含する。いずれの列挙範囲も、十分に説明しかつ同じ範囲を少なくとも均等な半分、1/3、1/4、1/5、1/10などに分解することを可能にするので容易に理解することができよう。非限定的な例として、本明細書で考察される各範囲は、下の三等分、中央の三等分及び上の三等分などに容易に分解できる。さらにまた当業者には理解されるところであるが、例えば“まで”、“少なくとも”、“より大きい”、“未満”など のような言葉はいずれも、列挙された数字を含み、上記に考察した一部範囲にその後分解できる範囲を指す。最後に、当業者には理解されるところであるが、範囲は個々のメンバーの各々を含む。したがって、例えば、1−3個の物を有する群は1、2又は3個の物を有する群を指す。同様に、1−5個の物を有する群は1、2、3、4又は5個の物を有する群を指す。
多様な特徴及び実施態様を本明細書で開示してきたが、他の特徴及び実施態様も当業者には明白であろう。本明細書に開示された多様な特徴及び実施態様は例示を目的とし、下記の特許請求の範囲によって示される真の範囲及び趣旨を限定しようとするものではない。
本発明は明確さ及び理解のためにある程度詳細に記載してきたが、形態及び詳細に関する多様な変更が本発明の真の範囲を外れることなく為しうることは当業者には理解されよう。
本明細書で用いられる“含む（comprising）”という用語は、“含む（including）”、“含む（containing）”、又は“〜を特徴とする（characterized by）”と同義語であり、包括的であるか又は制約がなく、追加される未列挙の成分又は方法の工程を排除しない。
本明細書で用いられる成分、反応条件などの量を表す全ての数字は、全事例において“約”という用語によって修正されると理解されるべきである。したがって、矛盾がなければ、本明細書に示される数字のパラメーターは概数であり、前記は取得しようとする所望の特性にしたがって変更できる。最低限でも、かつ本出願の優先権の主張が適用される一切の請求項への均等論の適用を制限しようとするものでもないが、数字のパラメーターはそれぞれ有効数字及び通常の四捨五入的アプローチを考慮して解釈されるべきである。
上記の説明は本発明のいくつかの方法及び材料を開示する。本発明は、製作方法及び装置と同様に方法及び材料の修正に敏感である。そのような修正は、本開示の熟考又は本明細書に開示した本発明の実施によって当業者には明白となろう。したがって、本発明は本明細書に開示した特定の実施態様に限定されるものではなく、その真の範囲及び趣旨に含まれる全ての修正及び改変をカバーすることが意図される。
上述の記載及び実施例は一定の実施態様を詳述する。しかしながら、上述の記載が本文中でどのように詳細であろうとも、本発明は多くの態様で実施することが可能であり、本発明は添付の特許請求の範囲及び任意のその等価物にしたがって解釈されるべきであることは理解されよう。
当業者には理解されるところであるが、任意のかつ全ての目的について、例えば書面による説明の提供に関して、本明細書に開示される範囲の全てはまた、任意のかつ全ての可能な一部範囲及びその一部範囲の組み合わせを包含する。いずれの列挙範囲も、十分に説明しかつ同じ範囲を少なくとも均等な半分、1/3、1/4、1/5、1/10などに分解することを可能にするので容易に理解することができよう。非限定的な例として、本明細書で考察される各範囲は、下の三等分、中央の三等分及び上の三等分などに容易に分解できる。さらにまた当業者には理解されるところであるが、例えば“まで”、“少なくとも”、“より大きい”、“未満”など のような言葉はいずれも、列挙された数字を含み、上記に考察した一部範囲にその後分解できる範囲を指す。最後に、当業者には理解されるところであるが、範囲は個々のメンバーの各々を含む。したがって、例えば、1−3個の物を有する群は1、2又は3個の物を有する群を指す。同様に、1−5個の物を有する群は1、2、3、4又は5個の物を有する群を指す。
多様な特徴及び実施態様を本明細書で開示してきたが、他の特徴及び実施態様も当業者には明白であろう。本明細書に開示された多様な特徴及び実施態様は例示を目的とし、下記の特許請求の範囲によって示される真の範囲及び趣旨を限定しようとするものではない。
本発明は明確さ及び理解のためにある程度詳細に記載してきたが、形態及び詳細に関する多様な変更が本発明の真の範囲を外れることなく為しうることは当業者には理解されよう。
本明細書で用いられる“含む（comprising）”という用語は、“含む（including）”、“含む（containing）”、又は“〜を特徴とする（characterized by）”と同義語であり、包括的であるか又は制約がなく、追加される未列挙の成分又は方法の工程を排除しない。
本明細書で用いられる成分、反応条件などの量を表す全ての数字は、全事例において“約”という用語によって修正されると理解されるべきである。したがって、矛盾がなければ、本明細書に示される数字のパラメーターは概数であり、前記は取得しようとする所望の特性にしたがって変更できる。最低限でも、かつ本出願の優先権の主張が適用される一切の請求項への均等論の適用を制限しようとするものでもないが、数字のパラメーターはそれぞれ有効数字及び通常の四捨五入的アプローチを考慮して解釈されるべきである。
上記の説明は本発明のいくつかの方法及び材料を開示する。本発明は、製作方法及び装置と同様に方法及び材料の修正に敏感である。そのような修正は、本開示の熟考又は本明細書に開示した本発明の実施によって当業者には明白となろう。したがって、本発明は本明細書に開示した特定の実施態様に限定されるものではなく、その真の範囲及び趣旨に含まれる全ての修正及び改変をカバーすることが意図される。
上述の記載及び実施例は一定の実施態様を詳述する。しかしながら、上述の記載が本文中でどのように詳細であろうとも、本発明は多くの態様で実施することが可能であり、本発明は添付の特許請求の範囲及び任意のその等価物にしたがって解釈されるべきであることは理解されよう。
Claims (81)
- サンプル中のE.ヒストリチカ（E. histolytica）ポリヌクレオチドの存在を検出する方法であって、
本質的に配列番号:1（GTACAAAATGGCCAATTCATTCAATG）から成る第一のプライマーとサンプルを接触させる工程；
本質的に配列番号:2（ACTACCAACTGATTGATAGATCAG）から成る第二のプライマーとサンプルを接触させる工程；
第一及び第二のプライマーを伸長させ、それによってE.ヒストリチカポリヌクレオチド配列がサンプルに存在する場合には少なくとも1つのアンプリコンを生成する工程；
本質的に配列番号:3（ATTGTCGTGGCATCCTAACTCA）又はその相補物から成るポリヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドプローブと当該サンプルを接触させる工程（この場合、該プローブは、実質的に相補的な核酸と結合するときには検出可能なシグナルを提供するが、それが一本鎖であるときは検出可能なシグナルを提供しない）；及び
アンプリコンが存在する場合にシグナルを検出する工程；
を含む、前記ポリヌクレオチドの存在を検出する方法。 - 標準的増幅条件下で用いられる場合、第一のプライマー及び第二のプライマーはE.ヒストリチカポリヌクレオチド配列を増幅するが、いずれのE.ジスパー（E. dispar）ポリヌクレオチド配列も実質的には増幅しない、請求項1に記載の方法。
- 第一のプライマーが、E.ヒストリチカポリヌクレオチド配列と5mM MgCl2、100 mMトリス、10 mM NaOH、0.019% プロクリン300、0.010%トウィーン-20、1.96%トレハロース、0.6mg/ml BSA中で少なくとも約50℃の温度にて接触する場合には、E.ヒストリチカポリヌクレオチド配列とハイブリダイズするが、いずれかのE.ジスパーポリヌクレオチド配列と5mM MgCl2、100mMトリス、10mM NaOH、0.019%プロクリン300、0.010%トウィーン-20, 1.96%トレハロース、0.6mg/ml BSA中で少なくとも約60℃の温度にて接触する場合には、いずれのE.ジスパーポリヌクレオチド配列ともハイブリダイズしない、請求項1−2のいずれか1項に記載の方法。
- 第二のプライマーが、E.ヒストリチカポリヌクレオチド配列と5mM MgCl2、100 mMトリス、10 mM NaOH、0.019% プロクリン300、0.010%トウィーン-20、1.96%トレハロース、0.6mg/ml BSA中で少なくとも約60℃の温度にて接触する場合には、E.ヒストリチカポリヌクレオチド配列とハイブリダイズし、さらにE.ジスパーポリヌクレオチド配列と5mM MgCl2、100mMトリス、10mM NaOH、0.019%プロクリン300、0.010%トウィーン-20, 1.96%トレハロース、0.6mg/ml BSA中で少なくとも約60℃の温度にて接触する場合には、E.ジスパーポリヌクレオチド配列とハイブリダイズする、請求項1−3のいずれか1項に記載の方法。
- 第一のプライマー及び第二のプライマーの各々が、E.ヒストリチカポリヌクレオチド配列と5mM MgCl2、100 mMトリス、10 mM NaOH、0.019% プロクリン300、0.010%トウィーン-20、1.96%トレハロース、0.6mg/ml BSA中で少なくとも約60℃の温度にて接触する場合には、E.ヒストリチカポリヌクレオチド配列とハイブリダイズするが、第二のプライマーは、いずれかのE.ジスパーポリヌクレオチド配列と5mM MgCl2、100mMトリス、10mM NaOH、0.019%プロクリン300、0.010%トウィーン-20, 1.96%トレハロース、0.6mg/ml BSA中で少なくとも約60℃の温度にて接触する場合には、いずれのE.ジスパーポリヌクレオチド配列ともハイブリダイズしない、請求項1−3のいずれか1項に記載の方法。
- サンプルがE.ヒストリチカ及びE.ジスパーを含む、請求項1−5のいずれか1項に記載の方法。
- サンプルがヒトの糞便材料を含む、請求項1−6のいずれか1項に記載の方法。
- サンプルが固定材料を含む、請求項1−7のいずれか1項に記載の方法。
- サンプルが固定されない、請求項1−7のいずれか1項に記載の方法。
- E.ヒストリチカの95％検出限界が、1ミリリットルにつき約17を超えないE.ヒストリチカゲノムを含む、請求項1−9のいずれか1項に記載の方法。
- 標準的増幅条件下で用いられる場合、該プライマー及びプローブが、以下の生物のいずれとも（それらが当該サンプルに存在していても）交差反応しない、請求項1−10のいずれか1項に記載の方法：
アビオトロフィア・デフェクチバ（Abiotrophia defectiva）、アシネトバクター・バウマンニー（Acinetobacter baumannii）、アシネトバクター・イウォッフィー（Acinetobacter Iwoffii）、アエロモナス・ヒドロフィラ（Aeromonas hydrophila）、アルカリゲネス・ファエカリス亜種ファエカリス（Alcaligenes faecalis subsp. Faecalis）、アナエロコッカス・テトラジウス（Anaerococcus tetradius）、アルコバクター・ブツレリ（Arcobacter butzleri）、アルコバクター・クリアエロフィルス（Arcobacter cryaerophilus）、バシルス・セレウス（Bacillus cereus）、バクテロイデス・カッカエ（Bacteroides caccae）、バクテロイデス・メルダエ（Bacteroides merdae）、バクテロイデス・ステルコリス（Bacteroides stercoris）、ビフィドバクテリウム・アドレッセンチス（Bifidobacterium adolescentis）、ビフィドバクテリウム・ロングム（Bifidobacterium longum）、カムプリロバクター・コリ（Camplylobacter coli）、カンピロバクター・コンシスス（Campylobacter concisus）、カンピロバクター・クルブス（Campylobacter curvus）、カンピロバクター・フェツス亜種フェツス（Campylobacter fetus subsp. Fetus）、カンピロバクター・フェツス亜種ベネレアリス（Campylobacter fetus subsp. Venerealis）、カンピロバクター・グラシリス（Campylobacter gracilis）、カンピロバクター・ホミニス（Campylobacter hominis）、カンピロバクター・ジェジュニ（Camplylobacter jejuni）、カンピロバクター・ラリ（Campylobacter lari）、カンピロバクター・レクツス（Campylobacter rectus）、カンピロバクター・ウプサリエンシス（Campylobacter upsaliensis）、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）、カンジダ・カテヌラテ（Candida catenulate）、セデセア・ダビサエ（Cedecea davisae）、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）、シトロバクター・アマロナチクス（Citrobacter amalonaticus）、シトロバクター・フルエンジイ（Citrobacter fruendii）、シトロバクター・コセリ（Citrobacter koseri）、シトロバクター・セドラキイ（Citrobacter sedlakii）、クロストリジウム・ジッフィシレ17858（Clostridium difficile 17858）、クロストリジウム・ジッフィシレ43598、クロストリジウム・ジッフィシレCCUG 8864-9689、クロストリジウム・ジッフィシレ43255、クロストリジウム・ジッフィシレBAA-1805、クロストリジウム・ジッフィシレ43593、クロストリジウム・パーフリンゲンス（Clostridium perfringens）、コリンセラ・アエロファシエンス（Collinsella aerofaciens）、コリネバクテリウム・ゲニタリウム（Corynebacterium genitalium）、デスルホビブリオ・ピガー（Desulfovibrio piger）、エドワルドシエラ・タルダ（Edwardsiella tarda）、エッゲルテーラ・レンタ（Eggerthella lenta）、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）、エンテロバクター・クロアカエ（Enterobacter cloacae）、エンテロコッカス・カッセリフラブス（Enterococcus casseliflavus）、エンテロコッカス・セコルム（Enterococcus cecorum）、エンテロコッカス・ジスパー（Enterococcus dispar）、エンテロコッカス・ファエカリス（Enterococus faecalis）、エンテロコッカス・ガリナルム（Enterococcus gallinarum）、エンテロコッカス・ヒラエ（Enterococcus hirae）、エンテロコッカス・ラッフィノスス（Enterococcus raffinosus）、大腸菌（Escherichia coli）、エシェリキア・フェルグソニイ（Escherichia fergusonii）、エシェリキア・ヘルマンニイ（Escherichia hermannii）、エシェリキア・ブルネリス（Escherichia vulneris）、フソバクテリウム・バリウム（Fusobacterium varium）、ガルドネレラ・バギナリス（Gardnerella vaginalis）、ゲメラ・モルビロルム（Gemella morbillorum）、ハフニア・アルベイ（Hafnia alvei）、ヘリコバクター・フェンネリアエ（Helicobacter fennelliae）、ヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pylori）、クレブシエラ・オキシトカ（Klebsiella oxytoca）、クレブシエラ・ニューモニア（Klebsiella pneumonia）、ラクトバシルス・アシドフィルス（Lactobacillus acidophilus）、ラクトバシルス・レウテリ（Lactobacillus reuteri）、ラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）、レミノレラ・グリモンチイ（Leminorella grimontii）、リステリア・グライイ（Listeria grayi）、リステリア・インノキュア（Listeria innocua）、リステリア・モノシトゲネス（Listeria monocytogenes）、モルガネラ・モルガニイ（Morganella morganii）、ペプトニフィルス・アサッカロリチクス（Peptoniphilus asaccharolyticus）、ペプトストレプトコッカス・アナエロビウス（Peptostreptococcus anaerobius）、プレシオモナス・シゲロイデス（Plesiomonas shigelloides）、ポルフィロモナス・アサッカロリチカ（Porphyromonas asaccharolytica）、プレボテラ・メラニノゲニカ（Prevotella melaninogenica）、プロテウス・ミラビリス（Proteus mirabilis）、プロテウス・ペンネリ（Proteus penneri）、プロテウス・ブルガリス（Proteus vulgaris）、プロビデンシア・アルカリファシエンス（Providencia alcalifaciens）、プロビデンシア・レットゲリ（Providencia rettgeri）、プロビデンシア・スチュアルチイ（Providencia stuartii）、シュードモナス・アエルギノーザ（Pseudomonas aeruginosa）、シュードモナス・フルオレセンス（Pseudomonas fluorescens）、ルミノコッカス・ブロミイ（Ruminococcus bromii）、ネズミチフス菌（Salmonella typhimurium）、サルモネラ・エンテリジチス（Salmonella enteriditis）、セラチア・リケファシエンス（Serratia liquefaciens）、セラチア・マルセッセンス（Serratia marcescens）、シゲラ・ソンネイ（Shigella sonnei）、シゲラ・フレキシネリ（Shigella flexneri）、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、スタフィロコッカス・エピデルミジス（Staphylococcus epidermidis）、ステノトロフォモナス・マルトフィリア（Stenotrophomonas maltophilia）、ストレプトコッカス・アガラクチアエ（Streptococcus agalactiae）、ストレプトコッカス・ジスガラクチアエ（Streptococcus dysgalactiae）、ストレプトコッカス・インテルメジウス（Streptococcus intermedius）、ストレプトコッカス・ウベリス（Streptococcus uberis）、トラブルシエラ・グアメンシス（Trabulsiella guamensis）、ベイロネラ・パルブラ（Veillonella parvula）、コレラ菌（Vibrio cholera）、ビブリオ・パラハエモリチクス（Vibrio parahaemolyticus）、エルシニア・ベルコビエリ（Yersinia bercovieri）、エルシニア・エンテロコリチカ（Yersinia enterocolitica）、エルシニア・ローデイ（Yersinia rohdei）、アデノウイルス2型、アデノウイルス14型、アデノウイルス40型、アデノウイルス41型、コクサッキーA9、コクサッキーB1、HHV-5、サイトメガロウイルス、エンテロウイルス69型、ヒトパピローマウイルス16型、ヒトパピローマウイルス18型、単純疱疹ウイルスI、単純疱疹ウイルスII、ノロウイルスI、ノロウイルスII、ロタウイルス、ブラストシスチス・ホミニス（Blastocystis hominis）、エンセファリトゾーン・インテスチナリス（Encephalitozoon intestinalis）、エンセファリトゾーン・ヘルム（Encephalitozoon hellum）、エンセファリトゾーン・クニクリ（Encephalitozoon cuniculi）、ペンタトリコモナス・ホミニス（Pentatrichomonas hominis）、エントアメーバ・バーレッテ（Entamoeba barrette）、エントアメーバ・ジスパー、エントアメーバ・ギギバリス（Entamoeba gigivalis）、エントアメーバ・インバデンス（Entamoeba invadens）、エントアメーバ・モシュコフスキー（Entamoeba moshkovskii）、エントアメーバ・ラナルム（Entamobea ranarum）、シトロバクター・フルエンジイ（Citrobacter fruendii）（rpt）、エンテロバクター・クロアカエ（Enterobacter cloacae）（rpt）、クリプトスポリジウム・パルブム（Cryptosporidium parvum）、ギアルジア・ランブリア（Giardia lamblia）、又はクリプトスポリジウム・メレアグリジス（Cryptosporidium meleagridis）。 - 第一のプライマー、第二のプライマー、及びプローブを含むキットであって、ここで、標準的増幅条件下で用いられる場合、該第一のプライマー及び該第二のプライマーは、E.ヒストリチカポリヌクレオチド配列を増幅しそれによってアンプリコンを生成するが、いずれのE.ジスパーポリヌクレオチド配列も実質的には増幅せず、該プローブは本質的にある配列から成るポリヌクレオチドを含み、前記配列又はその相補物は、アンプリコン、E.ヒストリチカのポリヌクレオチド配列、及びE.ジスパーのポリヌクレオチド配列の各々に存在する、前記キット。
- プローブが蛍光色素分子及び消光分子を含む、請求項12に記載のキット。
- プライマー及びプローブが、95％検出限界で1ミリリットルにつき約17を超えないE.ヒストリチカ生物体のE.ヒストリチカポリヌクレオチド配列を増幅する、請求項12−13のいずれか1項に記載のキット。
- 標準的増幅条件下で用いられる場合、該プライマー及びプローブが、以下の生物のいずれとも（それらが当該サンプルに存在していても）交差反応しない、請求項12−14のいずれか1項に記載のキット：
アビオトロフィア・デフェクチバ、アシネトバクター・バウマンニー、アシネトバクター・イウォッフィー、アエロモナス・ヒドロフィラ、アルカリゲネス・ファエカリス亜種ファエカリス、アナエロコッカス・テトラジウス、アルコバクター・ブツレリ、アルコバクター・クリアエロフィルス、バシルス・セレウス、バクテロイデス・カッカエ、バクテロイデス・メルダエ、バクテロイデス・ステルコリス、ビフィドバクテリウム・アドレッセンチス、ビフィドバクテリウム・ロングム、カムプリロバクター・コリ、カンピロバクター・コンシスス、カンピロバクター・クルブス、カンピロバクター・フェツス亜種フェツス、カンピロバクター・フェツス亜種ベネレアリス、カンピロバクター・グラシリス、カンピロバクター・ホミニス、カンピロバクター・ジェジュニ、カンピロバクター・ラリ、カンピロバクター・レクツス、カンピロバクター・ウプサリエンシス、カンジダ・アルビカンス、カンジダ・カテヌラテ、セデセア・ダビサエ、クラミジア・トラコマチス、シトロバクター・アマロナチクス、シトロバクター・フルエンジイ、シトロバクター・コセリ、シトロバクター・セドラキイ、クロストリジウム・ジッフィシレ17858、クロストリジウム・ジッフィシレ43598、クロストリジウム・ジッフィシレCCUG 8864-9689、クロストリジウム・ジッフィシレ43255、クロストリジウム・ジッフィシレBAA-1805、クロストリジウム・ジッフィシレ43593、クロストリジウム・パーフリンゲンス、コリンセラ・アエロファシエンス、コリネバクテリウム・ゲニタリウム、デスルホビブリオ・ピガー、エドワルドシエラ・タルダ、エッゲルテーラ・レンタ、エンテロバクター・アエロゲネス、エンテロバクター・クロアカエ、エンテロコッカス・カッセリフラブス、エンテロコッカス・セコルム、エンテロコッカス・ジスパー、エンテロコッカス・ファエカリス、エンテロコッカス・ガリナルム、エンテロコッカス・ヒラエ、エンテロコッカス・ラッフィノスス、大腸菌、エシェリキア・フェルグソニイ、エシェリキア・ヘルマンニイ、エシェリキア・ブルネリス、フソバクテリウム・バリウム、ガルドネレラ・バギナリス、ゲメラ・モルビロルム、ハフニア・アルベイ、ヘリコバクター・フェンネリアエ、ヘリコバクター・ピロリ、クエブシエラ・オキシトカ、クレブシエラ・ニューモニア、ラクトバシルス・アシドフィルス、ラクトバシルス・レウテリ、ラクトコッカス・ラクチス、レミノレラ・グリモンチイ、リステリア・グライイ、リステリア・インノキュア、リステリア・モノシトゲネス、モルガネラ・モルガニイ、ペプトニフィルス・アサッカロリチクス、ペプトストレプトコッカス・アナエロビウス、プレシオモナス・シゲロイデス、ポルフィロモナス・アサッカロリチカ、プレボテラ・メラニノゲニカ、プロテウス・ミラビリス、プロテウス・ペンネリ、プロテウス・ブルガリス、プロビデンシア・アルカリファシエンス、プロビデンシア・レットゲリ、プロビデンシア・スチュアルチイ、シュードモナス・アエルギノーザ、シュードモナス・フルオレセンス、ルミノコッカス・ブロミイ、ネズミチフス菌、サルモネラ・エンテリジチス、セラチア・リケファシエンス、セラチア・マルセッセンス、シゲラ・ソンネイ、シゲラ・フレキシネリ、黄色ブドウ球菌、スタフィロコッカス・エピデルミジス、ステノトロフォモナス・マルトフィリア、ストレプトコッカス・アガラクチアエ、ストレプトコッカス・ジスガラクチアエ、ストレプトコッカス・インテルメジウス、ストレプトコッカス・ウベリス、トラブルシエラ・グアメンシス、ベイロネラ・パルブラ、コレラ菌、ビブリオ・パラハエモリチクス、エルシニア・ベルコビエリ、エルシニア・エンテロコリチカ、エルシニア・ローデイ、アデノウイルス2型、アデノウイルス14型、アデノウイルス40型、アデノウイルス41型、コクサッキーA9、コクサッキーB1、HHV-5、サイトメガロウイルス、エンテロウイルス69型、ヒトパピローマウイルス16型、ヒトパピローマウイルス18型、単純疱疹ウイルスI、単純疱疹ウイルスII、ノロウイルスI、ノロウイルスII、ロタウイルス、ブラストシスチス・ホミニス、エンセファリトゾーン・インテスチナリス、エンセファリトゾーン・ヘルム、エンセファリトゾーン・クニクリ、ペンタトリコモナス・ホミニス、エントアメーバ・バーレッテ、エントアメーバ・ジスパー、エントアメーバ・ギギバリス、エントアメーバ・インバデンス、エントアメーバ・モシュコフスキー、エントアメーバ・ラナルム、シトロバクター・フルエンジイ（rpt）、エンテロバクター・クロアカエ（rpt）、クリプトスポリジウム・パルブム、ギアルジア・ランブリア、又はクリプトスポリジウム・メレアグリジス。 - 以下を含むキット：
配列番号:1（GTACAAAATGGCCAATTCATTCAATG）と少なくとも約90％の同一性を有するポリヌクレオチドを含む第一のプライマー；
配列番号:2（ACTACCAACTGATTGATAGATCAG）と少なくとも約90％の同一性を有するポリヌクレオチドを含む第二のプライマー；並びに
配列番号:3（ATTGTCGTGGCATCCTAACTCA）又はその相補物と少なくとも約90％の同一性を有するポリヌクレオチド、蛍光色素分子、及び消光分子を含むプローブ。 - 請求項16に記載のキットであって、
第一のプライマーが本質的に配列番号:1（GTACAAAATGGCCAATTCATTCAATG）から成り、
第二のプライマーが本質的に配列番号:2（ACTACCAACTGATTGATAGATCAG）から成り、さらに
プローブが本質的に配列番号:3（ATTGTCGTGGCATCCTAACTCA）又はその相補物から成る、前記キット。 - サンプル中のE.ヒストリチカポリヌクレオチド配列の存在を検出する方法であって、
前記方法が、該サンプルを第一のプライマーと接触させる工程；該サンプルを第二のプライマーと接触させる工程；第一及び第二のプライマーを伸長させ、それによってE.ヒストリチカポリヌクレオチド配列がサンプルに存在する場合には少なくとも1つのアンプリコンを生成する工程;該サンプルをオリゴヌクレオチドプローブと接触させる工程；及びアンプリコンが存在する場合にはシグナルを検出する工程を含み、ここで、標準的増幅条件下で用いられる場合には、第一のプライマー及び第二のプライマーはE.ヒストリチカポリヌクレオチド配列を増幅するが、いずれのE.ジスパーポリヌクレオチド配列も実質的には増幅せず、該プローブは、それが実質的に相補的な核酸と結合するときには検出可能なシグナルを提供するが、前記プローブが一本鎖であるときは検出可能なシグナルを提供せず、さらに該プローブはあるポリヌクレオチドを含み、前記ポリヌクレオチドは本質的に、E.ヒストリチカポリヌクレオチド配列、E.ジスパーのポリヌクレオチド配列、及びアンプリコンの配列の部分である配列から成る。 - 第一のプライマーが、E.ヒストリチカポリヌクレオチド配列と5mM MgCl2、100 mMトリス、10 mM NaOH、0.019% プロクリン300、0.010%トウィーン-20、1.96%トレハロース、0.6mg/ml BSA中で少なくとも約50℃の温度にて接触する場合には、E.ヒストリチカポリヌクレオチド配列とハイブリダイズするが、いずれかのE.ジスパーポリヌクレオチド配列と5mM MgCl2、100mMトリス、10mM NaOH、0.019%プロクリン300、0.010%トウィーン-20, 1.96%トレハロース、0.6mg/ml BSA中で少なくとも約60℃の温度にて接触する場合には、いずれのE.ジスパーポリヌクレオチド配列ともハイブリダイズしない、請求項18に記載の方法。
- 第二のプライマーが、E.ヒストリチカポリヌクレオチド配列と5mM MgCl2、100 mMトリス、10 mM NaOH、0.019% プロクリン300、0.010%トウィーン-20、1.96%トレハロース、0.6mg/ml BSA中で少なくとも約60℃の温度にて接触する場合には、E.ヒストリチカポリヌクレオチド配列とハイブリダイズし、さらにE.ジスパーポリヌクレオチド配列と5mM MgCl2、100mMトリス、10mM NaOH、0.019%プロクリン300、0.010%トウィーン-20, 1.96%トレハロース、0.6mg/ml BSA中で少なくとも約60℃の温度にて接触する場合には、E.ジスパーポリヌクレオチド配列とハイブリダイズする、請求項18−19のいずれか1項に記載の方法。
- 第一のプライマー及び第二のプライマーの各々が、E.ヒストリチカポリヌクレオチド配列と5mM MgCl2、100 mMトリス、10 mM NaOH、0.019% プロクリン300、0.010%トウィーン-20、1.96%トレハロース、0.6mg/ml BSA中で少なくとも約60℃の温度にて接触する場合には、E.ヒストリチカポリヌクレオチド配列とハイブリダイズするが、第二のプライマーが、いずれかのE.ジスパーポリヌクレオチド配列と5mM MgCl2、100mMトリス、10mM NaOH、0.019%プロクリン300、0.010%トウィーン-20, 1.96%トレハロース、0.6mg/ml BSA中で少なくとも約50℃の温度にて接触する場合には、いずれのE.ジスパーポリヌクレオチド配列ともハイブリダイズしない、請求項18−20のいずれか1項に記載の方法。
- 第一のプライマーが、配列番号:1（GTACAAAATGGCCAATTCATTCAATG）と少なくとも約90％の同一性を有するポリヌクレオチド又はその相補物を含む、請求項18−21又は40−75のいずれか1項に記載の方法。
- 第一のプライマーが、本質的に配列番号:1（GTACAAAATGGCCAATTCATTCAATG）又はその相補物から成る、請求項18−22のいずれか1項に記載の方法。
- 第二のプライマーが、配列番号:2（ACTACCAACTGATTGATAGATCAG）と少なくとも約90％の同一性を有するポリヌクレオチド又はその相補物を含む、請求項18−23のいずれか1項に記載の方法。
- 第二のプライマーは、配列番号:2（ACTACCAACTGATTGATAGATCAG）の配列又はその相補物を有するポリヌクレオチドを含む、請求項18−24のいずれかに記載の方法。
- プローブが、配列番号:3（ATTGTCGTGGCATCCTAACTCA）と少なくとも約90％の同一性を有するポリヌクレオチド又はその相補物を含む、請求項18−25又は40−75のいずれかに記載の方法。
- プローブが、配列番号:3（ATTGTCGTGGCATCCTAACTCA）の配列を有するポリヌクレオチド又はその相補物を含む、請求項18−26又は40−75のいずれかに記載の方法。
- アンプリコンが、配列番号:7（GTACAAAATGGCCAATTCATTCAATGAATTGAGAAATGACATTCTAAGTGAGTTAGGATGCCACGACAATTGTAGAACACACAGTGTTTAACAAGTAACCAATGAGAATTTCTGATCTATCAATCAGTTGGTAGT）と少なくとも約95％の同一性を有するポリヌクレオチドを含む、請求項18−27又は40−75のいずれかに記載の方法。
- アンプリコンが、配列番号:7（GTACAAAATGGCCAATTCATTCAATGAATTGAGAAATGACATTCTAAGTGAGTTAGGATGCCACGACAATTGTAGAACACACAGTGTTTAACAAGTAACCAATGAGAATTTCTGATCTATCAATCAGTTGGTAGT）の配列を有するポリヌクレオチドを含む、請求項18−28又は40−75のいずれかに記載の方法。
- サンプルがE.ヒストリチカ及びE.ジスパーを含む、請求項18−29又は40−75のいずれかに記載の方法。
- サンプルがヒトの糞便材料を含む、請求項18−30又は40−75のいずれかに記載の方法。
- サンプルが固定材料を含む、請求項18−31又は40−75のいずれかに記載の方法。
- サンプルが固定されない、請求項18−32又は40−75のいずれかに記載の方法。
- E.ヒストリチカの95％検出限界が、1ミリリットルにつき約17を超えないE.ヒストリチカゲノムを含む、請求項18−33又は40−75のいずれかに記載の方法。
- 標準的増幅条件下で用いられる場合、プライマー及びプローブが、以下の生物のいずれとも、それらの生物がサンプル中に存在していたとしても交差反応しない、請求項18−34又は40−75のいずれかに記載の方法：
アビオトロフィア・デフェクチバ、アシネトバクター・バウマンニー、アシネトバクター・イウォッフィー、アエロモナス・ヒドロフィラ、アルカリゲネス・ファエカリス亜種ファエカリス、アナエロコッカス・テトラジウス、アルコバクター・ブツレリ、アルコバクター・クリアエロフィルス、バシルス・セレウス、バクテロイデス・カッカエ、バクテロイデス・メルダエ、バクテロイデス・ステルコリス、ビフィドバクテリウム・アドレッセンチス、ビフィドバクテリウム・ロングム、カムプリロバクター・コリ、カンピロバクター・コンシスス、カンピロバクター・クルブス、カンピロバクター・フェツス亜種フェツス、カンピロバクター・フェツス亜種ベネレアリス、カンピロバクター・グラシリス、カンピロバクター・ホミニス、カンピロバクター・ジェジュニ、カンピロバクター・ラリ、カンピロバクター・レクツス、カンピロバクター・ウプサリエンシス、カンジダ・アルビカンス、カンジダ・カテヌラテ、セデセア・ダビサエ、クラミジア・トラコマチス、シトロバクター・アマロナチクス、シトロバクター・フルエンジイ、シトロバクター・コセリ、シトロバクター・セドラキイ、クロストリジウム・ジッフィシレ17858、クロストリジウム・ジッフィシレ43598、クロストリジウム・ジッフィシレCCUG 8864-9689、クロストリジウム・ジッフィシレ43255、クロストリジウム・ジッフィシレBAA-1805、クロストリジウム・ジッフィシレ43593、クロストリジウム・パーフリンゲンス、コリンセラ・アエロファシエンス、コリネバクテリウム・ゲニタリウム、デスルホビブリオ・ピガー、エドワルドシエラ・タルダ、エッゲルテーラ・レンタ、エンテロバクター・アエロゲネス、エンテロバクター・クロアカエ、エンテロコッカス・カッセリフラブス、エンテロコッカス・セコルム、エンテロコッカス・ジスパー、エンテロコッカス・ファエカリス、エンテロコッカス・ガリナルム、エンテロコッカス・ヒラエ、エンテロコッカス・ラッフィノスス、大腸菌、エシェリキア・フェルグソニイ、エシェリキア・ヘルマンニイ、エシェリキア・ブルネリス、フソバクテリウム・バリウム、ガルドネレラ・バギナリス、ゲメラ・モルビロルム、ハフニア・アルベイ、ヘリコバクター・フェンネリアエ、ヘリコバクター・ピロリ、クレブシエラ・オキシトカ、クレブシエラ・ニューモニア、ラクトバシルス・アシドフィルス、ラクトバシルス・レウテリ、ラクトコッカス・ラクチス、レミノレラ・グリモンチイ、リステリア・グライイ、リステリア・インノキュア、リステリア・モノシトゲネス、モルガネラ・モルガニイ、ペプトニフィルス・アサッカロリチクス、ペプトストレプトコッカス・アナエロビウス、プレシオモナス・シゲロイデス、ポルフィロモナス・アサッカロリチカ、プレボテラ・メラニノゲニカ、プロテウス・ミラビリス、プロテウス・ペンネリ、プロテウス・ブルガリス、プロビデンシア・アルカリファシエンス、プロビデンシア・レットゲリ、プロビデンシア・スチュアルチイ、シュードモナス・アエルギノーザ、シュードモナス・フルオレセンス、ルミノコッカス・ブロミイ、ネズミチフス菌、サルモネラ・エンテリジチス、セラチア・リケファシエンス、セラチア・マルセッセンス、シゲラ・ソンネイ、シゲラ・フレキシネリ、黄色ブドウ球菌、スタフィロコッカス・エピデルミジス、ステノトロフォモナス・マルトフィリア、ストレプトコッカス・アガラクチアエ、ストレプトコッカス・ジスガラクチアエ、ストレプトコッカス・インテルメジウス、ストレプトコッカス・ウベリス、トラブルシエラ・グアメンシス、ベイロネラ・パルブラ、コレラ菌、ビブリオ・パラハエモリチクス、エルシニア・ベルコビエリ、エルシニア・エンテロコリチカ、エルシニア・ローデイ、アデノウイルス2型、アデノウイルス14型、アデノウイルス40型、アデノウイルス41型、コクサッキーA9、コクサッキーB1、HHV-5、サイトメガロウイルス、エンテロウイルス69型、ヒトパピローマウイルス16型、ヒトパピローマウイルス18型、単純疱疹ウイルスI、単純疱疹ウイルスII、ノロウイルスI、ノロウイルスII、ロタウイルス、ブラストシスチス・ホミニス、エンセファリトゾーン・インテスチナリス、エンセファリトゾーン・ヘルム、エンセファリトゾーン・クニクリ、ペンタトリコモナス・ホミニス、エントアメーバ・バーレッテ、エントアメーバ・ジスパー、エントアメーバ・ギギバリス、エントアメーバ・インバデンス、エントアメーバ・モシュコフスキー、エントアメーバ・ラナルム、シトロバクター・フルエンジイ（rpt）、エンテロバクター・クロアカエ（rpt）、クリプトスポリジウム・パルブム、ギアルジア・ランブリア、又はクリプトスポリジウム・メレアグリジス。 - 標準的増幅条件下で用いられる場合、プライマー及びプローブが、以下の生物のいずれとも、それらの生物がサンプル中に存在していたとしても交差反応しない、請求項1−11又は18−35又は40−75のいずれか1項に記載の方法：エントアメーバ・コリ（Entamoeba coli）、エントアメーバ・ジスパー、エントアメーバ・ポレッキ（Entamoeba polecki）、エントアメーバ・ムリス（Entamoeba muris）、エントアメーバ・ヌッタリイ（Entamoeba nuttalli）、エントアメーバ・ハルトマンニ（Entamoeba hartmanni）、及びエントアメーバ・ボビス（Entamoeba bovis）。
- 標準的増幅条件下で用いられる場合、プライマー及びプローブが、E.ヒストリチカを含まないサンプルについて1600につき1つより少ない偽陽性を生じる、請求項1−11又は18−36又は40−75のいずれか1項に記載の方法。
- 標準的増幅条件下で用いられる場合、プライマー及びプローブが、以下の生物のいずれとも（それらが当該サンプルに存在していても）交差反応しない、請求項12−17のいずれか1項に記載のキット：エントアメーバ・コリ、エントアメーバ・ジスパー、エントアメーバ・ポレッキ、エントアメーバ・ムリス、エントアメーバ・ヌッタリイ、エントアメーバ・ハルトマンニ、及びエントアメーバ・ボビス。
- 標準的増幅条件下で用いられる場合、プライマー及びプローブが、E.ヒストリチカを含まないサンプルについて1600につき1つより少ない偽陽性を生じる、請求項12−17又は38のいずれか1項に記載のキット。
- サンプル中のE.ヒストリチカの核酸配列の有無を決定する方法であって、サンプルで酸増幅反応を実施する工程、シグナルが存在する場合にシグナルを検出する工程を含み、前記核酸増幅が第一のオリゴヌクレオチドプライマー及び第二のオリゴヌクレオチドプライマーを含み、
ここで、第一のオリゴヌクレオチドプライマーは、15−75ヌクレオチドの長さを有し、標準的な条件下で配列番号:10又はその相補物とそれらが存在する場合にはハイブリダイズするが、標準的条件下で配列番号:11又はその相補物とはそれらが存在していてもハイブリダイズせず、
さらに第二のオリゴヌクレオチドプライマーは15−75ヌクレオチドの長さを有し、標準的条件下で配列番号:10又はその相補物が存在する場合にはそれらとハイブリダイズし、さらに第二のオリゴヌクレオチドプライマーは標準的条件下で配列番号:11又はその相補物が存在する場合にはそれらとハイブリダイズし、
前記シグナルは、第一及び第二のオリゴヌクレオチドプライマーのアンプリコンと標準的ハイブリダイゼーション条件下で当該アンプリコンが存在する場合にハイブリダイズする、検出できるように標識されたプローブに由来し、
ここでシグナルはアンプリコンの有無の指標であり、アンプリコンは75−350ヌクレオチドの長さを有する、前記方法。 - 第一のオリゴヌクレオチドプライマーが、配列番号:1の連続する少なくとも10ヌクレオチドを含み、さらに第一のオリゴヌクレオチドプライマーが、配列番号:10の標的配列又はその相補物と少なくとも80％の同一性を有する、請求項40に記載の方法。
- 第二のオリゴヌクレオチドプライマーが、配列番号:2の連続する少なくとも10ヌクレオチドを含み、さらに第二のオリゴヌクレオチドプライマーが、配列番号:10の標的配列又はその相補物と少なくとも80％の同一性を有する、請求項40又は請求項41に記載の方法。
- 第一のオリゴヌクレオチドプライマーが、配列番号:1の連続する少なくとも12ヌクレオチドを含む、請求項41又は請求項42に記載の方法。
- 第一のオリゴヌクレオチドプライマーが、配列番号:1の連続する少なくとも15ヌクレオチドを含む、請求項41又は請求項42に記載の方法。
- 第一のオリゴヌクレオチドプライマーが、配列番号:1の連続する少なくとも20ヌクレオチドを含む、請求項41又は請求項42に記載の方法。
- 第一のオリゴヌクレオチドプライマーが、配列番号:10の標的配列又はその相補物と少なくとも85％の同一性を有する、請求項41−45のいずれか1項に記載の方法。
- 第一のオリゴヌクレオチドプライマーが、配列番号:10の標的配列又はその相補物と少なくとも90％の同一性を有する、請求項41−45のいずれか1項に記載の方法。
- 第一のオリゴヌクレオチドプライマーが、配列番号:10の標的配列又はその相補物と少なくとも95％の同一性を有する、請求項41−45のいずれか1項に記載の方法。
- 第一のオリゴヌクレオチドプライマーが、配列番号:10の標的配列又はその相補物と100％の同一性を有する、請求項41−45のいずれか1項に記載の方法。
- 第二のオリゴヌクレオチドプライマーが、配列番号:2の連続する少なくとも12ヌクレオチドを含む、請求項42−49のいずれか1項に記載の方法。
- 第二のオリゴヌクレオチドプライマーが、配列番号:2の連続する少なくとも15ヌクレオチドを含む、請求項42−49のいずれか1項に記載の方法。
- 第二のオリゴヌクレオチドプライマーが、配列番号:2の連続する少なくとも20ヌクレオチドを含む、請求項42−49のいずれか1項に記載の方法。
- 第二のオリゴヌクレオチドプライマーが、配列番号:10の標的配列又はその相補物と少なくとも85％の同一性を有する、請求項42−52のいずれか1項に記載の方法。
- 第二のオリゴヌクレオチドプライマーが、配列番号:10の標的配列又はその相補物と少なくとも90％の同一性を有する、請求項42−52のいずれか1項に記載の方法。
- 第二のオリゴヌクレオチドプライマーが、配列番号:10の標的配列又はその相補物と少なくとも95％の同一性を有する、請求項42−52のいずれか1項に記載の方法。
- 第二のオリゴヌクレオチドプライマーが、配列番号:10の標的配列又はその相補物と100％の同一性を有する、請求項42−52のいずれか1項に記載の方法。
- プローブが配列番号:3の連続する少なくとも10ヌクレオチドを含み、さらにプローブが配列番号:10の標的配列又はその相補物と少なくとも80％の同一性を有する、請求項40−56のいずれか1項に記載の方法。
- プローブが配列番号:3の連続する少なくとも12ヌクレオチドを含む、請求項57に記載の方法。
- プローブが配列番号:3の連続する少なくとも15ヌクレオチドを含む、請求項57に記載の方法。
- プローブが配列番号:3の連続する少なくとも20ヌクレオチドを含む、請求項57に記載の方法。
- プローブが配列番号:10の標的配列又はその相補物と少なくとも85％の同一性を有する、請求項57−60のいずれか1項に記載の方法。
- プローブが配列番号:10の標的配列又はその相補物と少なくとも90％の同一性を有する、請求項57−60のいずれか1項に記載の方法。
- プローブが配列番号:10の標的配列又はその相補物と少なくとも95％の同一性を有する、請求項57−60のいずれか1項に記載の方法。
- プローブが配列番号:10の標的配列又はその相補物と100％の同一性を有する、請求項57−60のいずれか1項に記載の方法。
- 第一のオリゴヌクレオチドプライマーは長さが約20−50ヌクレオチドである、請求項40−64のいずれか1項に記載の方法。
- 第一のオリゴヌクレオチドプライマーは長さが約23−45ヌクレオチドである、請求項40−64のいずれか1項に記載の方法。
- 第二のオリゴヌクレオチドプライマーは長さが約20−50ヌクレオチドである、請求項40−66のいずれか1項に記載の方法。
- 第二のオリゴヌクレオチドプライマーは長さが約23−45ヌクレオチドである、請求項40−66のいずれか1項に記載の方法。
- 検出できるように標識されたプローブは長さが約15−75ヌクレオチドである、請求項40−68のいずれか1項に記載の方法。
- 検出できるように標識されたプローブは長さが約20−45ヌクレオチドである、請求項40−68のいずれか1項に記載の方法。
- 検出できるように標識されたプローブが、標準的ハイブリダイゼーション条件下で配列番号:10及び配列番号:11とハイブリダイズできる、請求項40−70のいずれか1項に記載の方法。
- 検出できるように標識されたプローブが、標準的ハイブリダイゼーション条件下で配列番号:10とハイブリダイズできるが、配列番号:11とはハイブリダイズできない、請求項40−70のいずれか1項に記載の方法。
- 検出できるように標識されたプローブが蛍光色素分子又は消光分子を含む、請求項40−72のいずれか1項に記載の方法。
- アンプリコンが100−150ヌクレオチドの長さを有する、請求項40−73のいずれか1項に記載の方法。
- アンプリコンが配列番号:7を含む、請求項40−74のいずれか1項に記載の方法。
- E.ジスパーは存在していてもE.ヒストリチカの有無の決定を阻害しない、請求項18−26又は請求項40−75のいずれかに記載の方法。
- サンプル中にE.ヒストリチカポリヌクレオチド配列が存在する場合は、E.ジスパーは存在していてもアンプリコンの生成を阻害しない、請求項18−26のいずれかに記載の方法。
- E.ジスパーは存在していても第一及び第二のオリゴヌクレオチドプライマーのアンプリコンの生成を阻害しない、請求項40−75のいずれかに記載の方法。
- 請求項40−77のいずれか1項に記載の第一のオリゴヌクレオチドプライマー、第二のオリゴヌクレオチドプライマー、及び検出できるように標識されたプローブを含む、キット。
- E.ジスパーは、存在していても、E.ヒストリチカの有無の決定を阻害しない、請求項12−17、38、又は79のいずれかに記載のキット。
- サンプル中にE.ヒストリチカポリヌクレオチド配列が存在する場合は、E.ジスパーは存在していてもアンプリコンの生成を阻害しない、請求項12−17、38、又は79のいずれかに記載のキット。
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