JPH0799998A - ナイセリア・ゴノレエの検出方法、並びにそのための試薬およびキット - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 各細菌種に特異的なプライマーとプローブを
使って、液体試料中のナイセリア・ゴノレエを検出する
ための方法、試薬およびキット、並びにナイセリア・ゴ
ノレエおよび／またはクラミジア・トラコマチスを検出
するための方法、試薬およびキットが開示される。 【効果】 本発明は、試料の培養富化および／または微
視的評価を必要とせずに同一生物学的試料においてＣ．
トラコマチスとＮ．ゴノレエの両方の同時増幅および検
出を可能にする。本発明の方法は、従来技術の検出方法
によって以前可能であったものよりもずっと迅速に、疑
いのある標的生物の存否の決定を可能にする。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は一般的に、淋病の原因物
質である細菌ナイセリア・ゴノレエ〔淋菌（Neisseria
gonorrhoeae）；Ｎ．ゴノレエ〕を同定および検出する
ための方法および試薬に関する。

【０００２】

【従来の技術および発明が解決しようとする課題】淋病
は米国において最も頻繁に報告されている細菌感染の１
つである。300 万を越える症例が毎年報告されている。
Morello ら、"Neisseria and Branhamella", Manual of
Clinical Microbiology（第５版，1991年）, 258-276
頁を参照のこと。

【０００３】細菌、例えばナイセリア・ゴノレエにより
引き起こされる病気を上手く治療するためには、迅速且
つ正確な病原菌の検出および同定が要求される。検出お
よび同定は、慣例的には試料源、増殖条件、目に見える
（コロニー）増殖特徴、微視的形態、染色反応および生
化学的性質の知識を利用する純培養単離および測定操作
によって行われている。

【０００４】淋病の原因物であるＮ．ゴノレエを検出お
よび同定する従来法としては、グラム染色、選択寒天培
地上での培養、およびチトクロムオキシダーゼと炭化水
素の利用試験が挙げられる。Ｎ．ゴノレエの検出のため
の共同凝集および蛍光抗体染色を含む血清学的アッセイ
もまた報告されている。Morello ら（前掲）を参照のこ
と。最近、Ｎ．ゴノレエの診断用のＤＮＡプローブの利
用もMorello ら（前掲）により報告された。グラム染色
および抗体に基づく試験は迅速である（＜１時間）が、
感度が低い〔１mlあたり少なくとも10⁴ CFU （コロニー
形成単位）の細菌を必要とする〕。培養法は約2 CFU/ml
に対して感受性であるが、一晩のインキュベーションを
必要とする。

【０００５】感染物質の認識のためのプローブとして特
定のポリヌクレオチド配列を使用することは、不確かな
免疫学的鑑定アッセイに代わる有効な代替法となってき
ている。例えば、1984年７月19日に発行されたＰＣＴ公
報第W0 84/02721 号は、標的核酸配列を検出するための
ハイブリダイゼーション操作においてリボソームＲＮ
Ａ、転移ＲＮＡまたは他のＲＮＡから成る標的核酸配列
に相補的な核酸プローブの使用を記載している。

【０００６】同様に、Miyada, C.G.およびBorn, T.L.
(1991), Molecular and Cellular Probes 5:327-35 は
プローブを使ってＮ．ゴノレエを検出した。該アッセイ
は既知のＤＮＡハイブリダイゼーションアッセイよりも
大きい感度と特異性を提供することができる一方で、相
補的プローブの使用を必要とするハイブリダイゼーショ
ン法は一般に試験生物の培養および／または富化に頼っ
ており、従って迅速な診断には不適当である。ＤＮＡま
たはＲＮＡ標的を増幅せしめる手段が得られれば、プロ
ーブを臨床試料に直接利用することができる。

【０００７】臨床試料中のＮ．ゴノレエの検出のための
単純で、迅速で、高感度で且つ特異的な診断技術への要
求が引き続き存在している。加えて、Ｎ．ゴノレエに感
染した患者はしばしばクラミジア・トラコマチス（Chla
mydia trachomatis）にも感染する。患者が受けなけれ
ばならない診断操作の数を最少にするために、また診断
の総費用を最少にするために、単一試験法におけるＮ．
ゴノレエとＣ．トラコマチスの同時検出および同定のた
めの単純で、迅速で、高感度な診断技術を持つことは非
常に望ましいだろう。Ｎ．ゴノレエとＣ．トラコマチス
を同時に検出できるようにする本発明の新規プローブお
よび新規技術は、本発明の追加の特徴である。

【０００８】ポリメラーゼ連鎖反応（“ＰＣＲ”）は、
多種多様な細菌、真菌、ウイルスおよび寄生生物病原体
の検出に大変革を引き起こした。病原体の富化および試
験管内培養が不要であり、しかも比較的粗製の臨床試料
でも検出および診断用の核酸源となることができる。Ｐ
ＣＲは、検出のためにコピー数を大幅に増加させ、それ
と同時に分析しようとする核酸の複雑さを減少させると
いう特定核酸配列の標的増幅を成し遂げる。

【０００９】Ｎ．ゴノレエＤＮＡの1044塩基対断片(ORF
1) の配列はMiyadaおよびBorn（前掲）により発表され
ている。このORF 1 配列に基づいたプローブは、染色体
ドットブロット方式を使って試験したＮ．ゴノレエ株 1
06株のうちの105 株にハイブリダイズすることが示され
た。他のナイセリア種に対する交差反応性はＮ．ムコー
サにのみ観察されたが、この交差反応性は高緊縮性洗浄
によって排除された。ORF 1 によってコードされるタン
パク質は、Ｎ．ゴノレエのシトシンＤＮＡメチルトラン
スフェラーゼ遺伝子（M. Ngo PII）に対して有意な相同
性を有するものと同定された。

【００１０】

【課題を解決するための手段】本発明は、細菌Ｎ．ゴノ
レエの迅速な検出および同定のための方法と試薬に関す
る。より詳しくは、本発明は単一アッセイにおいてＣ．
トラコマチスの同時検出と両立できるＮ．ゴノレエの検
出のための方法および試薬に関する。この検出は、限定
された種に存在するが他の種には存在しないヌクレオチ
ド配列へのヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーシ
ョンに基づいている。

【００１１】

【具体的説明】本発明では、生物学的試料中のＮ．ゴノ
レエＤＮＡの存在を検出するＰＣＲ法を使ったアッセイ
を開発し、そして標的としてＮ．ゴノレエのシトシンメ
チルトランスフェラーゼ（ＣＭＴ）遺伝子配列を使って
試験した。加えて、Ｎ．ゴノレエの検出に必要な試薬を
Ｃ．トラコマチス検出用の試薬と組み合わせて、独立的
に、同時に且つ特異的に両生物体を増幅し検出する単一
混合反応を開発した。ＰＣＲ法の最適化並びに両生物体
の同時増幅および検出の条件を一度決定した後、該アッ
セイの感度と特異性を確立した。

【００１２】様々な地理的場所から多様なＮ．ゴノレエ
単離物並びにＮ．ゴノレエとＣ．トラコマチスの混合単
離物を入手し、分析した。更に、本発明は、試料の培養
富化および／または微視的評価を必要とせずに同一生物
学的試料においてＣ．トラコマチスとＮ．ゴノレエの両
方の同時増幅および検出を可能にする。現在の血清学的
試験は単に感染に対する抗体応答を測定するに過ぎず、
従って療法または病気再発を監視するための良い指標と
は言えない。

【００１３】好ましい態様では、Ｎ．ゴノレエのゲノム
ＤＮＡからの標的領域が定義された条件下で定義された
プライマーを使ってＰＣＲにより増幅される。その結果
得られた増幅されたＤＮＡが定義されたプローブにより
検出される。かくして本発明は、細菌Ｎ．ゴノレエを同
定するための特異的プローブおよびそれらの相補体に関
する。本発明はまた、そのような特異的プローブが誘導
されたユニークオリゴヌクレオチド配列、それの変異
体、断片および部分配列にも関し、そして同定されたい
ずれかの特異的配列に対するアンチセンス配列を包含す
る。加えて、ＰＣＲにおいて使用することができるプラ
イマーのユニーク配列、並びにそのための条件が本明細
書中に記載される。

【００１４】本発明は更に、Ｎ．ゴノレエＤＮＡの特定
の標的領域を増幅せしめるための増幅方法、Ｎ．ゴノレ
エＤＮＡの特定の標的領域を増幅せしめるための細菌プ
ライマーを含有するキット用の関連試薬、および該標的
領域中のＮ．ゴノレエに特徴的であるヌクレオチド配列
にハイブリダイズするプローブを提供する。その上、本
発明は、Ｎ．ゴノレエとＣ．トラコマチスの両方の同時
増幅方法、およびそのための関連試薬、並びにＮ．ゴノ
レエＤＮＡとＣ．トラコマチスＤＮＡの両方の同時増幅
用のプライマーを含有するキット、並びに両方の種の増
幅標的領域中に特異的にハイブリダイズするプローブも
提供する。

【００１５】本発明は、細菌Ｎ．ゴノレエに特徴的であ
る増幅されたヌクレオチド配列にプローブをハイブリダ
イズさせることによって、細菌Ｎ．ゴノレエの存否を決
定しそして同定するための方法に関する。本発明は更
に、同時増幅により単一試料からＮ．ゴノレエとＣ．ト
ラコマチスの両方の存否を決定する方法も提供する。

【００１６】定義 本明細書中で使用する下記の用語は次のように定義され
る。同時増幅 ：複数の標的領域からプライマーによって開始
される合成の過程。全ての潜在的標的配列からのプライ
マー伸長生成物の合成に好ましい条件において複数のプ
ライマーセットが組み合わされる（しばしば「マルチプ
レックス」系と呼称される）。

【００１７】相補的：一対の一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ
分子の塩基配列が、それらの一本鎖が各鎖上のワトソン
−クリック塩基対の間の水素結合を介してハイブリッド
または二本鎖ＤＮＡ：ＤＮＡ、ＲＮＡ：ＲＮＡまたはＤ
ＮＡ：ＲＮＡを形成できるような配列であることを意味
する。アデニン（Ａ）は通常チミン（Ｔ）またはウラシ
ル（Ｕ）と対を成し、そしてグアニン（Ｇ）は通常シト
シン（Ｃ）と対を成す。

【００１８】ハイブリッド：相補的塩基対の間のワトソ
ン−クリック塩基対合によりまたは非標準的塩基対合に
より２つの一本鎖核酸配列の間で形成された複合体。ハイブリダイゼーション ：核酸の２本の相補的鎖が結合
して二本鎖分子（ハイブリッド）を形成する過程。核酸プローブ（またはただのプローブ） ：相補的な一本
鎖標的核酸配列と結合して二本鎖分子（ハイブリッド）
を形成するであろう一本鎖核酸配列。核酸プローブはオ
リゴヌクレオチドまたはヌクレオチドポリマーであるこ
とができる。

【００１９】ヌクレオチド：リン酸基、５′炭素糖およ
び窒素含有塩基から成る核酸のサブユニット。ＲＮＡで
は５′炭素糖がリボースである。ＤＮＡではそれが２−
デオキシリボースである。この用語はそのようなサブユ
ニットの類似体も包含する。オリゴヌクレオチド ：通常は長さ約10〜約100 ヌクレオ
チドであるが、長さ100 ヌクレオチドより長い場合もあ
るヌクレオチドポリマー。

【００２０】プライマー：精製された制限消化物中に天
然に存在するにせよ合成的に製造されるにせよ、核酸鎖
に相補的であるプライマー伸長生成物の合成が行われる
条件下、即ちヌクレオチドとＤＮＡポリメラーゼなどの
重合剤の存在下並びに適当な温度およびpH条件下に置い
たときに、合成の開始点として作用することができる一
本鎖核酸配列。

【００２１】該プライマーは最大の増幅効率には一本鎖
が好ましいが、あるいは二本鎖であってもよい。二本鎖
である場合には、伸長生成物を調製するのに使用する前
に、まずプライマーを処理してその鎖を分離する。好ま
しくはプライマーはオリゴデオキシリボヌクレオチドで
ある。プライマーは該分子の５′末端に修飾、例えばビ
オチン化を有してもよい。

【００２２】ストリンジェンシー：ストリンジェンシー
(stringency) は一本鎖核酸のハイブリダイゼーション
を促進するのに使われる条件（および形成されたハイブ
リッドを洗浄するのに使われる条件）に関する。ストリ
ンジェンシーの程度は、２本の一本鎖核酸の配列が安定
なハイブリッドを形成するためにどれ位相補的でなけれ
ばならないかを決定する。高ストリンジェンシー条件を
使用すると、密接に関連した核酸（すなわちそれらの配
列がほとんど完全に相補的である一本鎖核酸）だけが安
定なハイブリッドを形成する。低ストリンジェンシーハ
イブリダイゼーション条件は、より遠縁の核酸（すなわ
ちそれらの配列が部分的にのみ相補的である一本鎖核
酸）の間でのハイブリッド形成を許容する。

【００２３】本発明に従って、文献中に発表されたＮ．
ゴノレエの種々様々な株のＤＮＡの比較分析を通して
Ｎ．ゴノレエの標的領域を決定した。当該分析の結果と
して、該標的配列がMiyadaおよびBorn（前掲）中に記載
された1044塩基対のORF 1 断片中の 201塩基対の領域で
あると決定づけた。該標的配列は図３に示される。

【００２４】更に本発明に従って、この標的配列の一部
分にハイブリダイズすることができるように、標的配列
の一部分に十分に相補的なオリゴヌクレオチドプライマ
ーおよびそれの相補体をデザインした（図３参照）。本
発明に従って、標的配列用のまたはそれらの相補的配列
用のプライマーをデザインした。こうして、それらのプ
ライマーは、Ｎ．ゴノレエＤＮＡの各鎖のうちの一方に
ハイブリダイズするように十分に相補的である。前記プ
ライマーの各々は別々のＤＮＡ鎖にハイブリダイズする
ようにデザインされる。

【００２５】こうして、様々な株のＮ．ゴノレエＤＮＡ
の標的ヌクレオチド配列の同定を通して、ポリメラーゼ
連鎖反応（ＰＣＲ）にそれらのプライマーを利用して
Ｎ．ゴノレエを含む疑いのある試料においてＮ．ゴノレ
エＤＮＡの標的核酸配列を増幅せしめることができる。
本発明に従って、この反応を実施するのに少なくとも10
ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドプライマーを利
用できることを発見した。一般に、該ヌクレオチドプラ
イマーは約10〜30ヌクレオチドを含む。

【００２６】本発明によれば、プライマーは、Ｎ．ゴノ
レエＤＮＡの分離鎖にハイブリダイズするのに十分な位
相補的であり、そして前記ポリメラーゼ連鎖反応によっ
て増幅されると、標的ＤＮＡ配列を含む伸長生成物を形
成するだろう。標的ＤＮＡ配列は、少なくとも14ヌクレ
オチドを含み且つ前記標的領域のポリヌクレオチド配列
に実質上相補的である適当なオリゴヌクレオチドプロー
ブへのハイブリダイゼーションにより検出することがで
きる。一般に、それらのオリゴヌクレオチドプローブは
約14〜約30ヌクレオチドを含む。

【００２７】本発明に従って、図１に示したような配列
SS01（配列番号１）、SS02（配列番号２）およびSS06−
T5（配列番号３）を含むオリゴヌクレオチドを調製し
た。それらのオリゴヌクレオチドを使って本発明のプラ
イマーおよびプローブをデザインした。

【００２８】本発明の重要な特徴は、本発明でプライマ
ーとして機能するオリゴヌクレオチドがＮ．ゴノレエ用
に特別に選んだだけでなく、ＰＣＲに基づくＣ．トラコ
マチスアッセイに使用するプライマーと両立できる物理
的性質（例えば融解温度）も有することである。よっ
て、本出願人らのＮ．ゴノレエオリゴヌクレオチドは
Ｎ．ゴノレエに特異的であり、Ｃ．トラコマチスと相互
作用したりあるいはまた交差反応したりせず、単一ＰＣ
Ｒ反応においてＮ．ゴノレエとＣ．トラコマチスの同時
増幅を可能にするように、Ｃ．トラコマチスプライマー
オリゴヌクレオチドと両立することができる。

【００２９】本発明によれば、試料中のＮ．ゴノレエの
存在についての試験は、Ｎ．ゴノレエＤＮＡの別々の鎖
にハイブリダイズするほど十分に相補的であるオリゴヌ
クレオチドプライマーを含有する水溶液で試料を処理す
ることによって行われる。試料を処理するのに使われる
溶液は、補助溶剤として不活性有機極性溶剤を含むこと
ができる。

【００３０】任意の常用の不活性有機極性溶剤を該水溶
液の一成分として使用することができる。本発明の好ま
しい態様によれば、補助溶剤として使用する極性溶剤は
グリセロール、ジメチルスルホキシドもしくはホルムア
ミド、またはそれらの混合物であることができる。更
に、本発明の好ましい態様によれば、該補助溶剤は、試
験すべき試料を処理するのに使用する溶液の約１容量％
〜約20容量％を構成するだろう。

【００３１】本発明において使用するプライマーのユニ
ーク配列、並びに好ましいまたは必須ＰＣＲ条件を下記
に記載する。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、試験
管内培養が難しいかまたは時間がかかるような少数の病
原体の検出のために、あるいは検出に生存試料の存在を
必要とする他の方法の代替法として利用することができ
る有効な技術である。

【００３２】最も単純な形式では、ＰＣＲは、反対の鎖
にハイブリダイズし且つ標的ＤＮＡ中の着目の領域に隣
接する２つのオリゴヌクレオチドプライマーを使った、
特定のＤＮＡ配列の酵素的合成のための試験管内方法で
ある。鋳型変性、プライマーアニーリング、およびＤＮ
Ａポリメラーゼによるアニールしたプライマーの伸長を
含む一連の反復サイクルは、プライマーの５′末端によ
り末端が限定される特異的断片の指数的蓄積をもたら
す。

【００３３】ＰＣＲは報告上は10¹²の係数まで特異的Ｄ
ＮＡ配列の選択的富化を引き起こすことができる。ＰＣ
Ｒ法はSaiki ら、Science 230:1350 (1985)において記
載されており、そして特に米国特許第 4,683,195号、同
第 4,683,202号、同第 4,800,159号および同第 4,965,1
88号の主題である。この方法は、鎌状赤血球貧血〔Saik
i ら (1985) 前掲〕に関連するβグロブリン遺伝子中の
異常配列の存在およびヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）
ＲＮＡ〔Byrne ら、Nucl. Acids Res. 16:4165(1988)
〕の存在を検出するのに使われている。

【００３４】本発明は、Ｎ．ゴノレエ（N. gonorrhoea
e）を含む疑いのある液体試料中のＮ．ゴノレエＤＮＡ
の存在の決定方法であって、 (a) 前記ＤＮＡの別々の鎖にハイブリダイズするほど十
分に相補的である少なくとも２つのオリゴヌクレオチド
プライマーを含有する水溶液で前記試料を処理し、ここ
で前記溶液は補助溶剤として不活性有機極性溶剤を含有
し； (b) 前記プライマーの各々の伸長生成物（伸長生成物は
標的ＤＮＡ配列を含む）を合成し、そしてもし存在する
のであれば前記標的配列を検出可能なレベルに増幅せし
め；

【００３５】(c) 意図する増幅の後、増幅された標的領
域中の配列と実質上相補的である少なくとも14ヌクレオ
チドを含むオリゴヌクレオチドプローブで前記試料を処
理し； (d) もし存在すれば増幅された標的領域を、前記プロー
ブと前記標的領域とのハイブリダイゼーション（ハイブ
リッド二本鎖の特異性）を可能にする条件下で前記オリ
ゴヌクレオチドプローブと共にインキュベートし、；そ
して (e) もし存在すれば前記増幅された標的領域と前記オリ
ゴヌクレオチドプローブとの間で形成されたハイブリッ
ドを検出する；ことを含んで成る方法を提供する。

【００３６】好ましい有機極性溶剤としては、グリセロ
ール、ジメチルスルホキシドまたはホルムアミドが挙げ
られ、最も好ましくはグリセロールが挙げられる。前記
補助溶剤は典型的には前記溶液中に約１容量％〜約20容
量％存在する。好ましくは、診断法として使用する時、
上記段階(d) において、プローブは高ストリンジェンシ
ー条件下で標的領域に特異的にハイブリダイズする。加
えて、Ｎ．ゴノレエに特異的なプライマーもまた、特定
の増幅条件下でＮ．ゴノレエの増幅に対してユニークに
選択的である。

【００３７】本発明はまた、Ｎ．ゴノレエ（N. gonorrh
oeae）および／またはＣ．トラコマチス（C. trachomat
is）を含む疑いのある液体試料中のＮ．ゴノレエＤＮＡ
とＣ．トラコマチスＤＮＡの一方または両方の存否の決
定方法であって、 (a) 前記ＤＮＡの別々の鎖にハイブリダイズするほど十
分に相補的である２組のオリゴヌクレオチドプライマー
（１組はＮ．ゴノレエに特異的であり、もう１組はＣ．
トラコマチスに特異的である）を含む水溶液で前記試料
を処理し； (b) 前記プライマーの各々の伸長生成物（伸長生成物は
標的ＤＮＡ配列を含む）を合成し、そしてもし存在する
のであれば前記標的配列を検出可能なレベルに増幅せし
め；

【００３８】(c) 意図する増幅の後、各々が少なくとも
14ヌクレオチドを含む２つのオリゴヌクレオチドプロー
ブで前記試料を処理し、ここで第一のプローブはＮ．ゴ
ノレエの増幅領域中の配列に相補的な特有の配列を含
み、そして第二のプローブはＣ．トラコマチスの増幅領
域中の配列に相補的な特有の配列を含み； (d) もし存在すれば増幅された標的領域を、前記プロー
ブの各々と前記プローブの標的領域とのハイブリダイゼ
ーションを考慮した条件下で、好ましくは別々の容器中
で、前記オリゴヌクレオチドプローブの各々と共にイン
キュベートし；そして (e) もし存在すれば前記増幅された標的領域と前記オリ
ゴヌクレオチドプローブとの間で形成されたハイブリッ
ドを検出する；ことを含んで成る方法も提供する。

【００３９】好ましくは、診断アッセイとして使用する
時、上記段階(d) は、部分的にのみ相補的であるそれら
の標的配列とプローブとのハイブリッド形成を排除する
ために、高ストリンジェンシー条件下で実施される。本
発明の方法は、従来技術の検出方法によって以前可能で
あったものよりもずっと迅速に、疑いのある標的生物の
存在の決定を可能にする。基本的ＰＣＲ法は下記のよう
にして実施される。

【００４０】着目の特定核酸配列である「標的配列」を
含む疑いのある試料を用意する。当業者に既知である物
理的、化学的または酵素的手段を含む任意の適当な変性
法を使って試料中に含まれる核酸を変性せしめる。鎖分
離のための好ましい物理的手段は、核酸が完全に（＞99
％）変性されるまでそれを加熱することを伴う。典型的
な熱変性は、現在の技術を使って約80〜約105 ℃の範囲
の温度と約５秒〜10分間の範囲の時間を必要とする。

【００４１】次いで変性したＤＮＡ鎖をハイブリダイゼ
ーション条件（単一核酸鎖へのプライマーの結合を可能
にする条件）下で特定のオリゴヌクレオチドプライマー
と共にインキュベートする。当業界において既知のよう
に、プライマーは、二本鎖配列に沿ったそれぞれの相対
的位置が、一方のプライマーから合成される伸長生成物
がその相補体から分離された時に他方のプライマーの伸
長のための鋳型として働き、限定された長さの複製鎖を
生成するような位置であるように選択される。

【００４２】プライマーは、重合剤の存在下で伸長生成
物の合成を開始させるのに十分な長さでなければならな
い。プライマーの正確な長さは、温度、プライマー源お
よび方法の使用目的といった多数の因子に依存するだろ
う。例えば、標的配列の複雑さに依存して、オリゴヌク
レオチドプライマーは典型的には約15〜30ヌクレオチド
を含むが、より多数または少数のヌクレオチドを含んで
もよい。短いプライマーは通常、鋳型と十分に安定なハ
イブリッドを形成するのに低温を必要とする。プライマ
ーはそれらの各鎖と選択的にハイブリダイズするほど十
分に相補的でなければならない。

【００４３】本明細書中で使用するプライマーは、増幅
する予定の各々の特定核酸配列の別々の鎖に「実質上」
相補的でなければならない。これは、プライマーが鋳型
の正確な配列を反映する必要はなく、それらのそれぞれ
の鎖と選択的にハイブリダイズするほど十分に相補的で
なければならず、即ち、与えられた増幅条件下では、
Ｎ．ゴノレエＤＮＡの鎖とハイブリダイズするが他のナ
イセリア種からの他のＤＮＡの鎖とはハイブリダイズし
ないことを意味する。

【００４４】この性質は、プライマーの「特異性」と呼
ばれる。プライマー中に非相補的塩基またはより長い配
列を点在させることができるが、ただし該プライマー
が、それと特異的にハイブリダイズし、その結果重合手
段によって伸長せしめることができる二本鎖構造を形成
する一方の鎖の配列に十分に相補的であることを前提と
する。プライマーの非相補的ヌクレオチド配列は制限酵
素部位を含むことができる。標的配列の末端に制限酵素
部位を付加することには、その後の標的配列のクローニ
ングに特に役に立つ。

【００４５】本発明のプライマーは、Ｎ．ゴノレエに特
異的であるが他のナイセリア種には特異的でない標的配
列の一部に「実質上」相補的であるだけでなく、その上
さらに、それらを単一アッセイにおけるＣ．トラコマチ
スの同時増幅および／または検出（即ち２つの異なる種
の一試験管増幅）に有用な別のプライマーセットと両立
できるようにする物理的性質を有する。この同時増幅の
ために選ばれるプライマーは、各々の種に独特に特異的
であり、類似した融解温度を有し、互いに相補的でな
く、そして類似したサイズの増幅生成物をもたらす。

【００４６】本発明のオリゴヌクレオチドプライマーお
よびプローブは、任意の適当な方法により調製すること
ができる。特定配列のオリゴヌクレオチドの調製方法は
当業界において公知であり、例えば、適当な配列のクロ
ーニングと制限消化、および直接化学合成が挙げられ
る。検出を容易にするため、該プライマーまたはプロー
ブは、所望により、分光学的、光化学的、生化学的、免
疫化学的または化学的手段により検出可能な化合物を組
み込むことによって標識することができる。

【００４７】オリゴヌクレオチドプライマーの鋳型依存
性伸長は、適当な塩、金属カチオンおよびpH緩衝系から
成る反応媒質中で適当量の４種のデオキシリボヌクレオ
シド三リン酸（dATP, dGTP, dCTP, およびdTTP）の存在
下で重合剤によって触媒される。適当な重合剤は、プラ
イマーおよび鋳型依存性ＤＮＡ合成を触媒することが知
られている酵素である。

【００４８】既知のＤＮＡポリメラーゼとしては、例え
ば、Ｅ．コリＤＮＡポリメラーゼＩもしくはそれのクレ
ノウ断片、Ｔ₄ ＤＮＡポリメラーゼ、Taq ＤＮＡポリメ
ラーゼ、テルムス・テルモフィルス（Thermus thermoph
ilus）からのTth ＤＮＡポリメラーゼ、およびテルモコ
ッカス・リトラリス（Thermococcus litoralis）からの
ＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。それらのＤＮＡポリ
メラーゼを使ってＤＮＡ合成を触媒するための反応条件
は当業界において公知である。

【００４９】合成生成物は、鋳型鎖とプライマー伸長鎖
から成る二本鎖分子であり、標的配列を含む。それらの
生成物は、次いで、別の回の複製のための鋳型として働
く。第２回の複製では、第一サイクルのプライマー伸長
鎖がそれの相補的プライマーとアニールされ、５′末端
と３′末端の両方においてそれらの相補体のプライマー
配列により結合された「短い」生成物が合成される。変
性、プライマーアニーリング、および伸長の繰り返しサ
イクルは、プライマーにより限定された標的領域の指数
的蓄積をもたらす。

【００５０】核酸の標的領域を含む所望量のポリヌクレ
オチドを獲得するのに十分なサイクルが繰り返される。
所望量は異なることができ、ポリヌクレオチド生成物が
果たすであろう機能によって決定される。ＰＣＲ法は多
数の時間的順序において実施することができる。例え
ば、各段階の後に新試薬を添加するという段階法で、ま
たは全試薬を同時に添加する形式で、または一定数の段
階の後で新試薬を添加するという部分段階形式で、実施
することができる。

【００５１】好ましい方法では、ＰＣＲ反応は耐熱性酵
素を使用する自動化法として実施される。この方法で
は、反応混合物が変性段階、プライマーアニーリング段
階および反応段階を通して循環される。耐熱性酵素との
使用に合わせて特別に改造されたＤＮＡ熱循環器を使用
することができ、これは液体処理系を使わずに温度循環
を利用し、それによって各段階ごとに酵素を添加する必
要性を排除する。

【００５２】ＰＣＲによる増幅後、標的ＤＮＡが効率的
に増幅され、そして該プライマーが増幅する予定の標的
領域に高度に特異的であるならば、標的ポリヌクレオチ
ドをゲル分析により直接検出することができる。ＰＣＲ
効率を保証するために、グリセロールまたは他の関連溶
剤、例えばジメチルスルホキシドを使って増幅レベルで
のＰＣＲの感度を増加させ、そして強度な二次構造を有
するＤＮＡの領域に関係する問題を回避することができ
る。

【００５３】それらの問題としては(1) 重合剤によって
十分に伸長されない鋳型の頻度が高いことによるＰＣＲ
の低効率、または(2) 高ＧＣ含量による、高温での二本
鎖ＤＮＡの不完全な変性を挙げることができる。そのよ
うな溶剤の使用は、増幅レベルでのアッセイの感度を約
数フェントグラムのＤＮＡにまで（これは１細菌細胞に
相当すると思われる）増加させることができる。

【００５４】あるいは、低ストリンジェンシーハイブリ
ダイゼーションおよび洗浄条件下で標的配列のポリヌク
レオチドと安定なハイブリッドを形成するポリヌクレオ
チドプローブとのハイブリダイゼーションにより、標的
ポリヌクレオチドを検出することができる。プローブが
標的配列に完全に（即ち約99％以上）相補的であろうと
予想される場合、ストリンジェンシー条件が使われるだ
ろう。

【００５５】幾らかミスマッチが予想される場合、例え
ばプローブが完全に相補的でないだろうという結果によ
り変異株が予想される場合、ハイブリダイゼーションの
ストリンジェンシーは低下されるだろう。しかしなが
ら、診断適用の状況下では、部分的にのみ相補的である
標的（即ち、他の種からの関連ＤＮＡ配列）への該プロ
ーブのハイブリダイゼーションを除外するために、十分
にストリンジェントな条件が選択される。

【００５６】ハイブリダイゼーションに影響を及ぼす条
件および部分的に相補的な配列とのハイブリダイゼーシ
ョンに対して選択する条件は当業界において公知であ
る。例えば、ストリンジェンシーは温度、塩濃度、プロ
ーブの長さ、プローブのＧＣ含量、およびハイブリダイ
ゼーション緩衝液中のカオトロピック剤の濃度の関数で
あることが知られている。与えられたプローブについ
て、特定の条件設定から出発して、塩濃度を減少させる
か、温度を上昇させるかまたはカオトロピック剤濃度を
増加させることにより、ストリンジェンシーの増加が得
られる。

【００５７】本発明の好ましい態様では、約35℃〜約40
℃、好ましくは約37℃〜約39℃の温度で、約2.5 Ｍ〜約
4.5 Ｍ、好ましくは約3.8 Ｍ〜約4.2 Ｍ、最も好ましく
は約4.0 Ｍの濃度のイソチオシアン酸ナトリウムを有し
それによってハイブリダイゼーション中の高ストリンジ
ェンシーを考慮した緩衝液の存在下で、標的ポリヌクレ
オチドをオリゴヌクレオチドプローブと共にインキュベ
ートする。

【００５８】標的配列用のプローブは、増幅される二本
鎖のいずれの鎖から誘導してもよい。プローブは塩基
Ａ，Ｇ，ＣもしくはＴまたは類似体（イノシンと５−メ
チルシトシンを含む）から成ることができる。プローブ
は、標的領域の一部に及び、ただしプライマーを除外
し、そして標的領域への特異的ハイブリダイゼーション
を可能にする、任意の適当な長さのものであることがで
きる。

【００５９】一般に、プローブは、相補的ＤＮＡ鎖のい
ずれかの少なくとも14ヌクレオチド、好ましくは少なく
とも18ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも20〜30
ヌクレオチドを有するだろう。プローブは、好ましくは
標的領域の一部に対して少なくとも75％の相補性を有す
るように選択される。完全な相補性が存在するならば、
即ち株がプローブの配列と全く同じ配列を含むならば、
二本鎖はストリンジェンシー条件下でさえも比較的安定
であり、該プローブは短くてもよく、即ち約10〜30塩基
対の範囲であってもよい。

【００６０】或る程度プローブとのミスマッチが予想さ
れるならば、即ちプローブが変異形領域にハイブリダイ
ズする疑いがあるならば、長さがミスマッチの効果の幾
らかを相殺すると思われるので、プローブはより長い長
さを有するだろう。プローブは標的領域のサブセットか
ら形成せしめることができ、従って標的領域全体に及ぶ
必要はない。標的領域のいずれのサブセットも標的領域
を特異的に同定する可能性を有する。

【００６１】所望であれば、プローブを標識してもよ
い。適当である様々な標識、並びにプローブ中へのそれ
らの包含方法は当業界において公知であり、そのような
標識としては、例えば、放射性元素、例えば³²Ｐ、また
は他の認識可能な官能基、例えばビオチン（好ましくは
スペーサーアームを使う）、蛍光色素、高電子密度試
薬、容易に検出可能な反応生成物を形成することのでき
る酵素（例えばアルカリホスファターゼ、および西洋ワ
サビペルオキシダーゼ）、または特異的な抗血清もしく
はモノクローナル抗体が入手可能である抗原が挙げられ
る。

【００６２】該プローブはＢＳＡのようなタンパク質に
共有結合的に取り付けることもでき、プラスチック製マ
イクロウエルプレート、ナイロン膜または常磁性微小球
のような表面に取り付けることもできる。本明細書に記
載のＰＣＲアッセイに使用することができるプローブを
得るために、標的領域のヌクレオチド配列が十分に既知
でなければならない。

【００６３】標的領域のヌクレオチド配列の分析は、Gy
llenstenおよびErlich, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
7652 (1988) において記載されたようなＰＣＲ増幅生成
物の直接分析であることができる。この方法の変形は、
標的領域のＤＮＡ二本鎖を分離し、そして配列決定反応
に使用する一本鎖ＤＮＡ鋳型を作製することを含む。あ
るいは、単離したＰＣＲ増幅済ＤＮＡ断片をベクター中
にクローニングし、次いで挿入断片を含むベクターＤＮ
Ａにより形質転換された細菌から得られた生成ＤＮＡを
配列決定してもよい。

【００６４】本発明では、ＰＣＲを使った推定ＣＭＴ遺
伝子の一部分の試験管内増幅により、細菌Ｎ．ゴノレエ
を検出する。この方法は高い分析感度を有し、精製した
核酸を使った時の検出限界は１生物体のＤＮＡ当量であ
る。オリゴヌクレオチドプローブとのハイブリダイゼー
ションはＮ．ゴノレエに対して追加のレベルの特異性を
有するアッセイを提供する。

【００６５】好ましい態様では、Ｎ．ゴノレエについて
の診断アッセイは次の段階を含んで成る： 1) Ｎ．ゴノレエの推定ＣＭＴ遺伝子に特異的なビオチ
ン標識プライマーを用いて処理済の臨床試料を増幅せし
める。好ましいプライマーSS01とSS02はＣＭＴ遺伝子中
の高度保存領域に相当する。得られた増幅生成物は201
塩基であり、1044塩基対遺伝子〔MiyadaおよびBorn（前
掲）を参照のこと〕の塩基対 773〜974に相当する；そ
して

【００６６】2) 増幅された試料を、固体支持体に結合
させたオリゴヌクレオチドプローブとの緊縮ハイブリダ
イゼーションにかける。好ましいプローブである20塩基
対プローブ（SS06−T5）は 201塩基対標的配列中の一領
域に特異的であり、これはMiyadaおよびBorn（前掲）に
より試験されたプローブ配列の各々を使った時に観察さ
れたＮ．ムコーサとの交差反応性を取り除くために選択
された。

【００６７】本発明の別の好ましい態様では、Ｎ．ゴノ
レエに特異的な２つのプライマーとＣ．トラコマチスに
特異的な更に２つのプライマーを使う単一ＰＣＲアッセ
イが実施される。それらの２組のプライマーは、互いに
干渉しない（交差反応しない）ように選択される。増幅
後、２つの異なる固体支持体に結合された２つの異なる
プローブに別々に標的試料をハイブリダイズせしめる。
一方のプローブがＮ．ゴノレエの増幅標的配列に特異的
であり、他方のプローブがＣ．トラコマチスの増幅標的
配列に特異的である。

【００６８】上述したＮ．ゴノレエ／Ｃ．トラコマチス
ＰＣＲアッセイの増幅効率および全体の感度は、２組の
プライマーの適合性に大きく依存する。本発明のために
デザインされたプライマーは、上述の種の各々に独特に
特異的であるということの他に、更に４つの重要な基準
を満たす（図１及び２参照）：(1) それらのプライマー
は類似した長さとＧＣ含量を有し、従って類似した融解
温度を有する；(2) プライマーにより指令される増幅が
類似したMgCl₂ 最適値を有する；(3) それらのプライマ
ー間に全く相補性がない；および(4) それらのプライマ
ーが類似したサイズの増幅生成物をもたらす。

【００６９】生物学的試料中の標的配列の存在は、ＰＣ
Ｒ増幅技術にかけられたプローブと核酸との間でハイブ
リッドが形成されたかどうかを決定することにより検出
される。プローブと核酸配列との間で形成されたハイブ
リッドを検出する方法は当業界において既知である。例
えば、未標識試料を固体母材に移してそれに結合させ、
そして結合した試料を、標識プローブとの特異的ハイブ
リダイゼーションを可能にする条件にかけ；次いでその
固体母材を標識プローブの存在について調べる。

【００７０】あるいは、試料が標識されている場合、未
標識のプローブを該母材に結合させ、そして適当なハイ
ブリダイゼーション条件に暴露した後、該母材を標識の
存在について調べる。Saiki ら、Proc. Natl. Acad. Sc
i. USA 86:6230-6234 (1989)は、多数のプローブを固体
支持体に固定化し、ハイブリダイゼーションを使って着
目の増幅された標的ポリヌクレオチドを検出する方法を
記載している。

【００７１】後の２つの方法は、単一の臨床試料におけ
る複数の病原体の同時同定を提供することができるプロ
ーブのパネルの使用に非常に適している。別法では、標
識ポリヌクレオチドプローブを用いる液相サンドイッチ
アッセイを使うことができ、そのようなプローブの調製
方法は米国特許公報第4,820,630 号に記載されている。

【００７２】本明細書に記載されるプローブは、好まし
くはＮ．ゴノレエとＣ．トラコマチスの検出に適用され
る。下記のプローブ全部、並びに任意の追加のプローブ
を、マイクロウエルプレートの表面に固定化することが
できる。各プローブをマイクロタイタープレートの別々
のウエル上に固定化する。そして標識され増幅されたＤ
ＮＡを水溶液中で各プローブにハイブリダイズせしめ
る。

【００７３】各ウエルからのシグナル（即ちプローブ）
のパターンが標的ＤＮＡの同一性を指摘する。かくし
て、標的領域を増幅し（例えばＰＣＲにより）、そして
本明細書に記載のプローブを適用すると、該プローブの
一方または両方へのハイブリダイゼーションがＮ．ゴノ
レエおよび／またはＣ．トラコマチスの陽性シグナルお
よび陽性同定をもたらすだろう。

【００７４】上述のＰＣＲ増幅および／または検出方法
のいずれかを実施するのに使われるＰＣＲキットも本発
明の範囲内に含まれる。診断用キットは、本明細書に記
載のオリゴヌクレオチドプローブとプライマーを含む。
該プライマーとプローブは、例えばビオチンにより標識
されてもよい。プライマーが標識されている場合、プロ
ーブをマイクロウエルプレートに固定化することができ
る。該キットは、他の適当に包装された試薬や特定のア
ッセイプロトコールに必要な他の材料、例えば対照、重
合剤、並びに試験を実施するための取扱説明書を含んで
もよい。

【００７５】使用時、ＰＣＲキットの成分は、核酸試料
に適用すると標的核酸配列の増幅と検出を可能にする試
薬混合物を形成する。この試薬混合物は、キット成分並
びに着目のポリヌクレオチド鎖を含む核酸試料を含んで
成る。このアプローチの変形は、増幅された標的領域を
生成せしめるのに別法を用いることである。

【００７６】例えば、ＴＡＳ増幅系〔Kwohら、"Transcr
iption-based amplification system and detection of
amplified human immunodeficiency virus type I wit
h abead-based sandwich hybridization format", Pro
c. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173-1177 (1989) 〕およ
びその変形であるＳＳＳＲ〔Guatelliら、"Isothermal,
in vitro Amplification of Nucleic Acids by a Mult
i-Enzyme Reaction Modeled After Retroviral Replica
tion," Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874-1878 (19
90) 〕は、鋳型のｃＤＮＡコピーを生成するｃＤＮＡ段
階とｃＤＮＡ鋳型のコピー数を増加させるＲＮＡ転写段
階とから成るサイクルを使ってＲＮＡまたはＤＮＡを増
幅せしめる方法である。

【００７７】この方法は、ＰＣＲと同様に、標的領域の
反対側の鎖にハイブリダイズし且つ該標的領域に隣接す
る２つのオリゴヌクレオチドプライマーを使用する。本
明細書中に記載のプライマーは、わずかな変更（一方の
プライマーの５′末端へのＲＮＡポリメラーゼプロモー
ター配列の付加）を伴って、ＴＡＳまたはＳＳＳＲ増幅
系において使うことができる。該アッセイの次の段階で
ある本明細書に記載のオリゴヌクレオチドプローブによ
る検出は、本質的にはＰＣＲアッセイについて上述した
通りに実施することができ、またはビーズを基剤とした
サンドイッチハイブリダイゼーション系（Kwohら、前
掲）を使って行うことができる。

【００７８】別の例としては、本明細書に記載のプロー
ブをＱ−βレプリカーゼ系〔KramerおよびLizardi, "Re
plicatable RNA Reporters, " Nature 339:401-402 (19
89)並びにLomeliら、"Quantitative Assays Based on t
he Use of Replicatable Hybridization Probe," Clin.
Chem. 35:1826-1831 (1989) 〕のようなシグナル増幅
系のプローブの一成分として使うことができる。

【００７９】この系は、Ｑ−βＲＮＡゲノムのMDV-1 変
異体中に挿入された特異的プローブ配列を含有するＲＮ
Ａプローブを必要とする。該ＲＮＡプローブはＱ−βレ
プリカーゼを使って複製され、アッセイしようとする試
料への該プローブのハイブリダイゼーション後、反応あ
たり10¹²分子までになる。

【００８０】更なる明確化のため、次のプローブおよび
プライマーヌクレオチド配列データが提供される。プラ
イマーSS01（配列番号１）（図１）は、MiyadaおよびBo
rn（前掲）において特定されたＮ．ゴノレエのシトシン
ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ遺伝子であるM.NgO PI
I のヌクレオチド塩基番号773-796 に相当する。

【００８１】プライマーSS02（配列番号２）（図１）
は、MiyadaおよびBorn（前掲）において特定されたＮ．
ゴノレエのシトシンＤＮＡメチルトランスフェラーゼ遺
伝子であるM.NgO PII 中のヌクレオチド塩基番号952-97
4 の相補体に相当する。プライマーSS06−T5（配列番号
３）（図１）は、MiyadaおよびBorn（前掲）において特
定されたＮ．ゴノレエのシトシンＤＮＡメチルトランス
フェラーゼ遺伝子であるM.NgO PII 中のヌクレオチド塩
基番号851-870 の相補体に相当する（本出願人の図３中
の塩基番号79-98 に相当する）。

【００８２】

【実施例】実施例１ ：アッセイ性能および感度の評価 Ｎ．ゴノレエとＣ．トラコマチスの検出用に設計された
同時増幅アッセイは２組のプライマーを使用する：１）
Ｎ．ゴノレエ用のSS01，SS02；および２）Ｃ．トラコマ
チス用のCP24，CP27。４つのプライマー全てをそれらの
５′末端のところでビオチン(bio) により標識し、ＰＣ
Ｒ後の増幅生成物の検出を容易にする。アッセイの性能
および感度を測定するために、次の実験を実施した。

【００８３】Ａ．精製ＤＮＡのＰＣＲ増幅 Ｎ．ゴノレエ染色体ＤＮＡとＣ．トラコマチスプラスミ
ドＤＮＡの精製抽出物を0.2% SDS, 10% Tween-20, 10mM
Tris (pH 8.5), 3mM MgCl₂ および0.05% NaN₃の溶液
(ＳＴＭ＋試料希釈剤、実施例３参照）中に系列希釈し
た。該ＤＮＡ試料を希釈して希釈液50μl 中所望のコピ
ー数にした。２コピー／50μl ほど少数から100 コピー
／50μl までに及ぶアリコートを50μl の２×ＰＣＲ混
合物と混合した。反応液成分の最終濃度は次のようであ
った：

【００８４】10mM Tris pH 8.5 50mM KCl 1.5mM MgCl₂ 50μM EDTA 10% グリセロール 0.05% NaN₃ 50μM dGTP, 50μM dCTP, 50μM dATP, 150 μM dUTP 0.25μM bio-SS01, 0.25μM bio-SS02 0.25μM bio-CP24, 0.25μM bio-CP27 反応あたり５単位のTaq ポリメラーゼ 反応あたり２単位のAMPERASE^TM（滅菌用酵素、Roche, B
asel, Switzerlandから入手可能）

【００８５】各 100μl 反応液をＰＣＲ MicroAmp 試験
管中にアリコートに分け、試料トレー中に乗せ、熱循環
器（TC-9600 Perkin-Elmer, Norwalk, Conn, USA）中に
入れた。次の増幅パラメーターを使った： サイクル１： 50℃，２分 １サイクル サイクル２： 95℃，５分 １サイクル サイクル３〜37： 95℃，20秒 35サイクル 62℃，20秒 72℃，20秒 サイクル38 72℃で10分間維持 １サイクル （使用者の判断で停止することができる）

【００８６】Ｂ．増幅生成物の検出 両標的のためのプライマーをビオチン化したので、標識
された増幅生成物の比色検出のための捕捉ハイブリダイ
ゼーションアッセイを実施することが可能であった。

【００８７】ウシ血清アルブミンへのチオエーテル結合
によってＣ．トラコマチスに特異的な捕捉プローブCP35
をマイクロタイタープレートのウエルの底に固定した
（Baroneら、"Microtiter plate detection of Chlamyd
ia trachomatis employing PCR." Abstracts for the g
eneral meeting of the American Society of Microbio
logy, 1991, p.361 ）。Ｎ．ゴノレエ用の捕捉プローブ
SS06-T5も同様にして別のプレートのウエルに固定し
た。

【００８８】同時増幅後、各反応液を100 μl の0.4N N
aOH, 80mM EDTAで変性させた。第１の25μl アリコート
をCP35プレート上のウエルに添加した。第２の25μl ア
リコートをSS06-T5 プレート上のウエルに添加した。各
ウエルは、2.5M NaSCN, 80mMNaH₂PO₄, 10mM Na₂HPO₄お
よび0.125% Tween-20 から成る 100μl のハイブリダイ
ゼーション／中和溶液を含んだ。

【００８９】両プレートを37℃で１時間インキュベート
した。次いでウエルを 350μl の150mM NaCl, 7mM Na₂H
PO₄, 3mM NaH₂PO₄, 0.125% Tween-20, 0.05% Proclin 3
00 (Rohm & Haas, Pa, USA) および1mM EDTA, pH 7.5で
５回洗浄した。

【００９０】各ウエルに100 μl のアビジン−ＨＲＰ接
合体を添加し、37℃にて15分間インキュベートした。上
記と同様にしてウエルを５回洗浄した。100 μl の３，
３′，５，５′−テトラメチルベンジジン（“ＴＭ
Ｂ”）と過酸化水素基質を各ウエルに添加し、そして遮
光下で10分間発色反応を生じさせた。ウエルあたり100
μl のH₂SO₄ 停止試薬を使って反応を停止させた。プレ
ートをマイクロウエルプレートリーダー中で450 nmにて
読み取った。0.25より大きい読みを陽性とした。

【００９１】この精製ＤＮＡ滴定の増幅から得られた結
果は、マイクロウエルプレートリーダーの直線領域（0
〜3.0 OD単位）よりも十分大きいシグナルを与えた。そ
の結果は示してない。38サイクルの増幅後、２投入コピ
ーほどの少数の「純粋標的（clean target）」ＤＮＡ
が、プレート捕捉ハイブリダイゼーションアッセイによ
り直線的に評価することができる量よりも多い増幅生成
物を生じた。それらの結果は非常に高レベルのアッセイ
性能と感度を示した。

【００９２】実施例２：ナイセリア・ゴノレエ用プライ
マーおよびプローブの特異性の測定 Ａ．ＰＣＲ増幅 15株のＮ．ゴノレエ、32株の他のナイセリア種および13
の他の関連生物についてＰＣＲ増幅を実施した。特定の
生物および株は下記の表１に要約される。各ＤＮＡ抽出
物50μl （ＳＴＭ＋試料希釈剤中、実施例３参照）を50
μl の２×ＰＣＲ混合物と混合し、実施例１に記載の通
り増幅せしめた。

【００９３】Ｂ．増幅生成物の検出 増幅反応が終了した後、各100 μl 反応液の５μl を１
×ＴＢＥ（45mM Tris-ホウ酸, 1mM EDTA）および５μg/
mlの臭化エチジウム中の２％アガロースゲル上に負荷し
た。ゲル中に流した後、ゲルをＵＶ光下で写真撮影し
た。適当なサイズ（201 bp）のバンドの存在（＋）また
は不在（−）として表した結果を表１に示す。

【００９４】Ｃ．ナイロン膜への増幅ＤＮＡの移行 ゲルの撮影後、ゲルを周囲温度において0.25N HCl 中に
10分間浸漬した。次いでゲルを0.5N NaOH, 1.5M NaClの
溶液中に30分間浸漬し、その後 1M Tris (pH 7.5), 1.5
M NaClの溶液中に30分間浸漬した。１×ＴＢＥ中で40℃
にて１時間電気ブロッティングすることにより、ＤＮＡ
をナイロン膜に移行せしめた。次いでその膜を１×ＴＢ
Ｅ中ですすぎ、風乾し、そしてStratagene Stratalinke
r 中でＵＶ光を使ってＤＮＡの架橋形成を行った。

【００９５】Ｄ．オリゴプローブSS06-T5 の放射能標識 次のようにしてＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを使って
プローブSS06-T5 （20マー）を標識した： ³²Ｐ−γ−ＡＴＰ 6.0 μl 10×キナーゼ緩衝液 2.5 μl 10ピコモルのSS06-T5 1.0 μl Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ 1.0 μl dH₂O 14.5 μl 計 25.0 μl 10×キナーゼ緩衝液： 500mM Tris pH 8.0 100mM MgCl₂ 50mM DTT

【００９６】キナーゼ反応液を37℃で30分間インキュベ
ートした。反応を停止させるために4.0 μl の0.5M EDT
A と70μl のdH₂Oを添加した。反応混合物を1200 rpmに
て1.0 mlのBiogel P4 カラム上に２回負荷し、取り込ま
れなかった放射能標識から標識オリゴヌクレオチドを分
離した。溶出液１μl をシンチレーションカウンター中
でカウントし、放射能取り込みレベルを測定した。各ブ
ロットについて20,000cpmをその後のハイブリダイゼー
ションにおいて使った。

【００９７】Ｅ．移行されたＤＮＡとSS06-T5 とのハイ
ブリダイゼーション ６つのＤＮＡブロットを５×SSPE, 0.5% SDSの混合物中
で55℃にて30分間予備ハイブリダイズさせた（１×SSPE
＝0.18M NaCl, 10mM NaPO₄, pH 7.4, 1mM EDTA）。標識
オリゴヌクレオチドプローブを 10 ml（ブロットあた
り）の５×SSPE,0.5% SDSに添加した。この溶液を、予
め浸漬させておいたブロットの入ったプラスチック袋に
添加した。ハイブリダイゼーションを55℃にて１時間行
った。

【００９８】プラスチック袋からブロットを取り出し、
５×SSPE, 0.5% SDSの溶液中で１回すすいだ。次いでブ
ロットを２×SSPE, 0.1% SDSの溶液中で10分間洗浄し
た。ブロットをサランラップ中に包み、映像強化膜を付
けた一枚のKodax XAR-5 Ｘ線フィルムを有するＸ線フィ
ルムホルダー中に入れ、−70℃にて16時間露出させた。

【００９９】ハイブリダイゼーションの結果を下記の第
１表に要約する。第１表から明らかなように、試験した
５つの異なる種の非ゴノレエナイセリア菌からの計10株
は、Ｎ．ゴノレエプライマーにより陽性増幅を示した
（例えばATCC 14685およびATCC25296）。しかしなが
ら、それらの生成物はＮ．ゴノレエ特異的プローブSS06
-T5 とのハイブリダイゼーションを全く示さなかった。
従って、該プローブは、ＰＣＲを単独で使った時に他の
方法では持たないであろう必要な特異性をこの系に提供
する。

【０１００】実施例３：臨床試料の評価 本発明の好ましい態様を使って、同時増幅を用いてＮ．
ゴノレエとＣ．トラコマチスについて 960の臨床試料を
試験した。 Ａ．試料収集 １）子宮頸内膜スワブ 分析用実験室への輸送のために子宮頸内膜スワブを1.0
mlの試料輸送媒質（ＳＴＭ）（0.4% SDS, 10mM Tris, p
H 8.0 を含む）中に入れた。

【０１０１】２）尿 男性の尿 8.0 ml を収集し、3000 rpmで遠心分離した。
ペレットを2.0 mlの0.4% SDS, 190mM Tris, pH 8.5中に
再懸濁した。

【０１０２】Ｂ．試料の同時増幅 増幅前に、全ての試料に等量（子宮頸内膜スワブについ
ては1.0 ml、尿ペレットについては2.0 ml）の試料希釈
剤（20% Tween-20, 6mM MgCl₂, 0.05% NaN₃, 10mM Tri
s, pH 8.5）を入れた。各試料50μl を２×ＰＣＲ混合
物50μl に添加した。反応条件および循環パラメーター
は実施例１Ａに記載した通りであった。

【０１０３】Ｃ．増幅生成物の検出 実施例１Ｂに記載した通りに増幅生成物を検出した。そ
の結果を子宮頸内膜スワブについては第２表にそして尿
試料については第３表に示す。子宮頸内膜試料と尿試料
の両方について、標準的培養法による検出感度に対して
ＰＣＲによる検出感度が増加したため、Ｎ．ゴノレエと
Ｃ．トラコマチスについて培養（−），ＰＣＲ（＋）の
試料の数が多いのは当然のことである。

【０１０４】実施例４：最大特異性のためのハイブリダ
イゼーション緩衝液組成の最適化 実施例１および２に記載の系は、診断アッセイにおいて
実施すると、約99％の正確率を有した。時折、Ｃ．トラ
コマチスおよびＮ．ゴノレエ特異的プライマーオリゴヌ
クレオチドの存在下で、しかし試料ＤＮＡを添加せずに
同時増幅を実施した時、Ｎ．ゴノレエに対する非特異的
シグナルが得られた（Ｃ．トラコマチスについては得ら
れなかった）。

【０１０５】それらの稀な非特異的シグナル（Ａ₄₅₀ ＞
0.25）はAMPERASE^TMの存在下でも不在下でも観察され、
前に増幅されたdUTP含有ＤＮＡによる汚染から生じたの
ではなかった。本発明者らは、ハイブリダイゼーション
緩衝液のストリンジェンシーを増加させることによりそ
れらの非特異的シグナルを排除することができるかどう
かを調べた。緩衝液中のカオトロープNaSCN の濃度を増
加させることによりストリンジェンシーを増加させた。

【０１０６】ハイブリダイゼーション緩衝液のストリン
ジェンシーの増加が非特異的Ｎ．ゴノレエシグナルを減
少および／または排除することができたかどうかを決定
するために、５つの独立した同時増幅実験（各々は数百
回の増幅反応から成る）を実施した。各増幅反応の生成
物を、低（2.5M NaSCN）および高（4.0M NaSCN）ハイブ
リダイゼーション緩衝液を使った固定化Ｎ．ゴノレエ特
異的プローブへのハイブリダイゼーションによりアッセ
イした。ハイブリダイゼーション後、結合した生成物を
アビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼ接合体（これは
増幅生成物中に取り込まれたビオチン残基に結合する）
を使って検出した。それらのデータを表４に要約する。

【０１０７】高ストリンジェンシーハイブリダイゼーシ
ョン緩衝液を使って生成物をアッセイすると、非特異的
シグナルの頻度は減少した。更に、残余の非特異的読み
のシグナルも大きく減少した。低ストリンジェンシー緩
衝液を使ってＡ₄₅₀ ＞1.0 であった多くのシグナルが、
高ストリンジェンシー緩衝液を使ってＡ₄₅₀ ＜0.6 に減
少した（第４表中に^* で示された結果）。少数の非特異
的読みはどちらの緩衝液を使った時にも強いシグナルを
生じた（第４表中に^**で示された結果）。

【０１０８】それらの非特異的読みは、環境からの真正
Ｎ．ゴノレエＤＮＡによる汚染から引き起こされたと思
われる。他の陽性シグナルとは異なり、それらは第二の
Ｎ．ゴノレエ特異的プローブ（SS08）にハイブリダイズ
する。この第二のプローブと元の（SS06-T5 ）プローブ
は、Ｎ．ゴノレエ特異的プライマーにより増幅されたＤ
ＮＡのセグメント中に含まれる非重複配列に相補的であ
る。

【０１０９】よって、ハイブリダイゼーション緊縮性を
増加させることによってシグナルが減少する陽性結果
は、真正Ｎ．ゴノレエＤＮＡと限定配列を共有している
（即ち、SS06-T5 プローブに部分的に相補的である）。
対比して、緊縮性の増加により影響を受けない非特異的
シグナルは、Ｎ．ゴノレエＤＮＡによる汚染が起こった
とすれば予想されるように、２つの異なるＮ．ゴノレエ
特異的配列を含む（即ち、１配列はSS06-T5 に相補的で
あり、１配列はSS08に相補的である）。

【０１１０】

【表１】

【０１１１】

【表２】

【０１１２】

【表３】

【０１１３】

【表４】

【０１１４】

【表５】

【０１１５】

【表６】

【０１１６】

【表７】

【０１１７】

【表８】

【０１１８】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：23 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA ハイポセティカル配列：No アンチセンス：No フラグメント型：Ｎ末端フラグメント 起源 生物名：ナイセリア・ゴノレエ（Neisseria gonorrhoe
ae） 配列 TAGCCACGTT TATCGTCGTA TGC 23

【０１１９】配列番号：２ 配列の長さ：23 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA ハイポセティカル配列：No アンチセンス：No フラグメント型：Ｎ末端フラグメント 配列 AACAGCATTA CCAATCTGGC GAC 23

【０１２０】配列番号：３ 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA ハイポセティカル配列：No アンチセンス：No フラグメント型：Ｎ末端フラグメント 配列 GCGGTTCAGG GAAGTGATAG 20

【０１２１】配列番号：４ 配列の長さ：25 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA ハイポセティカル配列：No アンチセンス：No フラグメント型：Ｎ末端フラグメント 配列 GGGATTCCTG TAACAACAAG TCAGG 25

【０１２２】配列番号：５ 配列の長さ：26 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA ハイポセティカル配列：No アンチセンス：No フラグメント型：Ｎ末端フラグメント 配列 CCTCTTCCCC AGAACAATAA GAACAC 26

【０１２３】配列番号：６ 配列の長さ：26 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA ハイポセティカル配列：No アンチセンス：No フラグメント型：Ｎ末端フラグメント 配列 CATAGCACTA TAGAACTCTG CAAGCC 26

【０１２４】配列番号：７ 配列の長さ：202 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA ハイポセティカル配列：No アンチセンス：No フラグメント型：Ｎ末端フラグメント 配列 TAGCCACGTT TATCGTCGTA TGCATCGGAA CGAGCCATCA AAAACAATTA 50 TTGCAGCAGG TGGCGGTGGT ACTTGGGGCT ATCACTTCCC TGAACCGCGT 100 GCTTTTACTA ATAGAGAACG AGCAAGGCTT CAAAGTTTTC CTGATGATTT 150 TGAGTTTGTC GGATCAACAA CTGAAGTACG TCGCCAGATT GGTAATGCTG 200 TT 202

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、Ｎ．ゴノレエ由来のシトシンＤＮＡメ
チルトランスフェラーゼ（ＣＭＴ）遺伝子中の標的領域
をＰＣＲにより増幅せしめるのに使ったプライマーSS01
とSS02のヌクレオチド配列データを示す。プローブSS06
-T5 は、 201塩基対増幅配列を有する領域に特異的であ
る。

【図２】図２は、Ｃ．トラコマチス由来の陰性プラスミ
ドＤＮＡ中の標的領域をＰＣＲにより増幅せしめるのに
使ったプライマーCP24とCP27のヌクレオチド配列データ
を示す。プローブCP35は、 207塩基対増幅配列中の領域
に特異的である。

【図３】図３は、上記プライマー（図１）が特異的であ
るＮ．ゴノレエ由来のＣＭＴ遺伝子中の 201塩基対標的
領域のヌクレオチド配列を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 シェリル ベス シルバー アメリカ合衆国，ニュージャージー 07652，パラマス，ウォルナット ストリ ート 745

Claims (32)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 Ｎ．ゴノレエ（N. gonorrhoeae）を含む
   疑いのある流体試料中のＮ．ゴノレエＤＮＡの存否の決
   定方法であって、 (a) 約15〜約30ヌクレオチドを有する少なくとも２つの
   オリゴヌクレオチドプライマーを含有する水溶液で前記
   試料を処理し、ここで前記プライマーの一方は標的配列
   を含むＮ．ゴノレエＤＮＡの２本の相補的鎖のうちの一
   方と選択的にハイブリダイズすることができ、そして前
   記プライマーの他方は鋳型として標的配列を含む伸長生
   成物を形成するように前記鎖のもう一方とハイブリダイ
   ズすることができ、前記溶液は補助溶剤として不活性有
   機極性溶剤を含有し； (b) 前記プライマーの各々の、標的ＤＮＡ配列を含む伸
   長生成物を合成し、そしてもし存在すれば前記標的配列
   を検出可能なレベルに増幅せしめ； (c) 意図する増幅の後、増幅された標的領域中の配列と
   実質上相補的である少なくとも14ヌクレオチドを含むオ
   リゴヌクレオチドプローブで前記試料を処理し； (d) もし存在すれば増幅された標的領域を、前記プロー
   ブと前記標的領域との選択的ハイブリダイゼーション
   （ハイブリッド二本鎖の特異性）を可能にするストリン
   ジェント条件下で前記オリゴヌクレオチドプローブと共
   にインキュベートし、；そして (e) もし存在すれば前記増幅された標的領域と前記オリ
   ゴヌクレオチドプローブとの間で形成されたハイブリッ
   ドを検出する；ことを含んで成る方法。
2. 【請求項２】 前記補助溶剤がグリセロールである、請
   求項１に記載の方法。
3. 【請求項３】 前記溶液が２つのプライマーを含有し、
   前記プライマーの一方が配列番号１のオリゴヌクレオチ
   ド配列を含み、そして前記プライマーの他方が配列番号
   ２のオリゴヌクレオチド配列を含む、請求項１または２
   に記載の方法。
4. 【請求項４】 段階(d) が緩衝液の存在下で実施され
   る、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
5. 【請求項５】 前記緩衝液が約3.8 M 〜約4.2 M の濃度
   のNaSCN を含む、請求項４に記載の方法。
6. 【請求項６】 前記緩衝液が約4.0 M の濃度のNaSCN を
   含む、請求項５に記載の方法。
7. 【請求項７】 Ｎ．ゴノレエの標的核酸配列を含むＮ．
   ゴノレエＤＮＡの２本の相補的鎖のうちの一方に選択的
   にハイブリダイズすることができ、且つ前記標的配列を
   含む伸長生成物を形成することにより前記標的配列を増
   幅するのに有用である、約15〜約30ヌクレオチドを含む
   オリゴヌクレオチド。
8. 【請求項８】 配列番号１の配列から成る、請求項７に
   記載のオリゴヌクレオチド。
9. 【請求項９】 配列番号２の配列から成る、請求項７に
   記載のオリゴヌクレオチド。
10. 【請求項１０】 Ｎ．ゴノレエ用のハイブリダイゼーシ
    ョンアッセイプローブであって、少なくとも14ヌクレオ
    チドを含むオリゴヌクレオチドを含んで成り、そして高
    ストリンジェンシー条件下で前記Ｎ．ゴノレエに特有の
    核酸配列の少なくとも１領域に実質上相補的である、ハ
    イブリダイゼーションプローブ。
11. 【請求項１１】 前記オリゴヌクレオチドが前記１領域
    に少なくとも75％相補的である、請求項１０に記載のハ
    イブリダイゼーションプローブ。
12. 【請求項１２】 前記Ｎ．ゴノレエ領域に特有の核酸が
    配列番号３の配列またはそれの相補体である、請求項１
    １に記載のハイブリダイゼーションプローブ。
13. 【請求項１３】 Ｎ．ゴノレエの検出用のＰＣＲキット
    であって、(1) 配列番号１と配列番号２を有するプライ
    マーを含む水溶液を含有し、前記水溶液が補助溶剤とし
    て有機極性溶剤を更に含有している容器、および(2) 前
    記容器とは別々に、Ｎ．ゴノレエに特有の核酸配列が配
    列番号３の配列またはそれの相補体を有するハイブリダ
    イゼーションオリゴヌクレオチドプローブ、を含んで成
    るキット。
14. 【請求項１４】 緩衝液を更に含んで成る、請求項１３
    に記載のキット。
15. 【請求項１５】 前記緩衝液がNaSCN を含む、請求項１
    ４に記載のキット。
16. 【請求項１６】 前記プローブが固定化されている、請
    求項１３〜１５のいずれか一項に記載のキット。
17. 【請求項１７】 前記プローブがマイクロタイタープレ
    ート上に固定化されている、請求項１６に記載のキッ
    ト。
18. 【請求項１８】 前記プライマーが標識されている、請
    求項１３〜１７のいずれか一項に記載のキット。
19. 【請求項１９】 前記プライマーがビオチンで標識され
    ている、請求項１８に記載のキット。
20. 【請求項２０】 前記補助溶剤がグリセロールである、
    請求項１３〜１９のいずれか一項に記載のキット。
21. 【請求項２１】 Ｎ．ゴノレエ（N. gonorrhoeae）と
    Ｃ．トラコマチス（C.trachomatis）の片方または両方
    を含む疑いのある液体試料中のＮ．ゴノレエおよび／ま
    たはＣ．トラコマチスの存否の決定方法であって、 (a) 約15〜約30ヌクレオチドを有する少なくとも４つの
    オリゴヌクレオチドプライマーを含む水溶液で前記試料
    を処理し、ここで前記プライマーの１つは標的配列を含
    むＮ．ゴノレエＤＮＡの２本の相補的鎖のうちの一方と
    選択的にハイブリダイズすることができるが別のナイセ
    リア種にはハイブリダイズせず、前記プライマーのもう
    １つは鋳型として標的Ｎ．ゴノレエ配列を含む伸長生成
    物を形成するように前記ＤＮＡ鎖の他方とハイブリダイ
    ズすることができ、前記プライマーのもう１つは標的配
    列を含むＣ．トラコマチスＤＮＡの２本の相補的鎖のう
    ちの一方と選択的にハイブリダイズすることができ、そ
    して前記プライマーの残りの１つは鋳型として標的Ｃ．
    トラコマチス配列を含む伸長生成物を形成するように前
    記Ｃ．トラコマチスＤＮＡ鎖の他方とハイブリダイズす
    ることができ、前記水溶液は補助溶剤として不活性有機
    極性溶剤を含有し； (b) 前記プライマーの各々の、標的ＤＮＡ配列を含む伸
    長生成物を合成し、そしてもし存在すれば前記標的配列
    を増幅せしめ； (c) 意図する増幅の後、各々が少なくとも14ヌクレオチ
    ドを含む２つのオリゴヌクレオチドプローブで前記試料
    を処理し、ここで第一のプローブはＮ．ゴノレエの増幅
    領域中の配列に特有の相補的な配列を含み、そして第二
    のプローブはＣ．トラコマチスの増幅領域中の配列に特
    有の相補的な配列を含み； (d) もし存在すれば増幅された標的領域をストリンジェ
    ント条件下で前記オリゴヌクレオチドプローブの各々と
    共にインキュベートし、そして前記プローブの各々と前
    記プローブの標的領域とのハイブリダイゼーションを可
    能にし；そして (e) もし存在すれば前記増幅された標的領域と前記オリ
    ゴヌクレオチドプローブとの間で形成されたハイブリッ
    ドを検出する；ことを含んで成る方法。
22. 【請求項２２】 前記溶液が４つのプライマーを含有
    し、該プライマーの２つがＮ．ゴノレエに特異的にハイ
    ブリダイズすることができ且つ配列番号１と配列番号２
    のヌクレオチド配列を有し、そして他の２つのプライマ
    ーがＣ．トラコマチスに特異的にハイブリダイズするこ
    とができ且つ配列番号４と配列番号５の配列を有する、
    請求項２１に記載の方法。
23. 【請求項２３】 前記段階(d) が緩衝液の存在下で実施
    される、請求項２１または請求項２２に記載の方法。
24. 【請求項２４】 前記緩衝液が約4.0 M の濃度のNaSCN
    を含んで成る、請求項２３に記載の方法。
25. 【請求項２５】 生物学的試料中のＮ．ゴノレエ配列と
    Ｃ．トラコマチス配列の同時増幅用の組成物であって、
    ４つのオリゴヌクレオチドプライマーを含有する水溶液
    を含んで成り、ここで前記プライマーの各々は長さ約15
    〜約30ヌクレオチドであり、前記プライマーのうちの１
    つ目はＮ．ゴノレエの標的核酸配列を含むＮ．ゴノレエ
    の２本の相補的鎖の一方とハイブリダイズすることがで
    き、前記プライマーの２つ目はＮ．ゴノレエの前記鎖の
    他方とハイブリダイズすることができ、前記プライマー
    の３つ目はＣ．トラコマチスの標的核酸配列を含むＣ．
    トラコマチスの２本の相補的鎖の一方とハイブリダイズ
    することができ、そして前記プライマーの４つ目はＣ．
    トラコマチスの前記鎖の他方とハイブリダイズすること
    ができ、それにより前記プライマーは前記鎖とのハイブ
    リダイゼーションとその後の伸長を通して前記標的配列
    を増幅せしめるための鋳型として働くことができ、そし
    て前記溶液は補助溶剤として不活性有機極性溶剤を含有
    する、前記組成物。
26. 【請求項２６】 前記溶液が約１容量％〜約20容量％の
    前記補助溶剤を含有する、請求項２５に記載の組成物。
27. 【請求項２７】 Ｎ．ゴノレエに特異的な前記プライマ
    ーが配列番号１と配列番号２の配列を有する、請求項２
    ５または２６に記載の組成物。
28. 【請求項２８】 Ｃ．トラコマチスに特異的な前記プラ
    イマーが配列番号４と配列番号５の配列を有する、請求
    項２５〜２７のいずれか一項に記載の組成物。
29. 【請求項２９】 Ｎ．ゴノレエとＣ．トラコマチスの一
    方または両方の検出用のＰＣＲキットであって、配列番
    号１、配列番号２、配列番号４および配列番号５の配列
    を有するオリゴヌクレオチドプライマーを含有し、補助
    溶剤として有機極性溶剤を更に含有する水溶液の入った
    容器；および前記容器とは別々に、配列番号３の配列を
    有するＮ．ゴノレエ用のオリゴヌクレオチドプローブと
    配列番号６の配列を有するＣ．トラコマチス用のプロー
    ブ、を含んで成るキット。
30. 【請求項３０】 前記プローブがマイクロタイタープレ
    ート上に固定化されている、請求項２９に記載のキッ
    ト。
31. 【請求項３１】 前記オリゴヌクレオチドプライマーが
    標識されている、請求項２９または請求項３０に記載の
    キット。
32. 【請求項３２】 前記プライマーがビオチンで標識され
    ている、請求項３１に記載のキット。