FI106213B - Mykobakteerien alukkeita ja koettimia - Google Patents

Mykobakteerien alukkeita ja koettimia Download PDF

Info

Publication number
FI106213B
FI106213B FI923660A FI923660A FI106213B FI 106213 B FI106213 B FI 106213B FI 923660 A FI923660 A FI 923660A FI 923660 A FI923660 A FI 923660A FI 106213 B FI106213 B FI 106213B
Authority
FI
Finland
Prior art keywords
seq
sequence
nucleic acid
probes
species
Prior art date
Application number
FI923660A
Other languages
English (en)
Swedish (sv)
Other versions
FI923660A0 (fi
FI923660A (fi
Inventor
Karen K Y Young
Original Assignee
Hoffmann La Roche
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=27114638&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=FI106213(B) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Priority claimed from US07/915,922 external-priority patent/US5422242A/en
Application filed by Hoffmann La Roche filed Critical Hoffmann La Roche
Publication of FI923660A0 publication Critical patent/FI923660A0/fi
Publication of FI923660A publication Critical patent/FI923660A/fi
Application granted granted Critical
Publication of FI106213B publication Critical patent/FI106213B/fi

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/166—Oligonucleotides used as internal standards, controls or normalisation probes

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)
  • Analysing Materials By The Use Of Radiation (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Description

106213
Mykobakteerien alukkeita ja koettimia Tämä keksintö koskee reagensseja ja menetelmiä my-kobakteerin nukleiinihapon läsnäolon havaitsemiseksi ja 5 sen mykobakteerilajin, josta mykobakteerin nukleiinihappo näytteessä on peräisin, identifioimista. Erityisesti tämä keksintö koskee oligonukleotidialukkeiden paria, joka pystyy amplifioimaan mykobakteerilajin 16S ribosomaalisen RNA:n geenin tai vastaavan RNA:n kohdealueen, joka ensim-10 mäisten aluke koostuu sekvenssistä KY18 (SEQ ID NO. 1) ja toinen aluke koostuu sekvenssistä KY75 (SEQ ID NO. 2) . Erityisemmin tämä keksintö koskee menetelmää näytteen sisältämän mykobakteerin nukleiinihapon osoittamiseksi tai luokittelemiseksi amplifioimalla 16S ribosomaalisen RNA-15 geenin tai mykobakteerilajin vastaavan RNA:n kohdealue, sekoittamalla amplifioitu nukleiinihappo koettimen kanssa ja havaitsemalla tai identifioimalla mainitun nukleiinihapon ja mainitun koettimen välillä muodostuneet hybridit, ja jossa tarjotaan spesifisiä koettimia. Edelleen keksintö 20 koskee testipakkausta näytteessä olevan mykobakteerin nukleiinihapon osoittamiseksi ja mahdolliseksi identifioimiseksi .
Mykobakteerit ovat hitaasti kasvavia, haponkestä-viä, aerobisia basilleja. Ainakin 19 Mycobacterium-lajia 25 on tähän mennessä liitetty ihmisten sairauksiin, huomat-tavimmin M. tuberculosis, M. bovis ja M. leprae. Jotkut lajit, sellaiset kuten M. avium, M. intracellulare ja M. kansasii, vaikka normaalisti ne eivät ole patogeenisiä terveille yksilöille, voivat aiheuttaa sairauden yksilöis-30 sä, joiden immuniteetti on heikentynyt, kuten esimerkiksi sellaiset, jotka ovat infektoituneet AIDS-viruksella. Lisäksi useat lajit harvoin aiheuttavat sairautta ihmisissä, mutta voivat esiintyä kliinisissä näytteissä saprofyyttei-nä. Menetelmät Mycobacterium-lajien havaitsemiseksi ja 35 indentifioimiseksi käsittävät bakteeriviljelyn, vasta-ai- 2 106213 neiden havaitsemisen ja viime aikoina rRNA:n havaitsemisen hybridisoimalla radioaktiivisesti merkityn nukleiinihappo-koettimen kanssa. Jokaiseen näistä menetelmistä liittyy huomattavia ongelmia.
5 Osoittaminen basilleja viljelemällä on hidasta, vaatien jopa kaksi kuukautta, ja tyypillisesti se vaatii lisää biokemiallisia kokeita lajien identifioimiseksi. Vasta-aineiden osoittamiselta puuttuu spesifisyys mykobak-teerilajien välisen ristireaktiivisuuden takia, ja siltä 10 puuttuu myös herkkyys. Edelleen, tämän hetkisen ja aikaisemmin olleen infektion erottaminen on vaikeaa. Havaitsemiselta käyttäen radioaktiivisesti merkittyjä DNA-fragmentteja koettimina, jotka hybridisoituvat pieneen riboso-maaliseen RNA-alayksikköön (16S RNA) puuttuu herkkyys ja 15 silti se vaatii vähintään usean päivän kestävän viljely-jakson (ks. PCT/WO 84/02 721).
Polymeraasiketjureaktion (PCR), menetelmän spesifisten nukleiinihappojen sekvenssien amplifioimiseksi, keksiminen mahdollistaa soluissa olevien nukleiinihappojen 20 nopean osoittamisen määränä, joka oli aikaisemmin liian matala havaittavaksi. Käyttämällä PCR-amplifikaatiota voidaan havaita jopa kohdenukleiinihapon yksittäinen kopio. Suora osoittaminen hybridisoimalla havaittavissa olevalle tasolle amplifioidun nukleiinihapposekvenssin sekvenssi-: 25 spesifisen oligonukleotidikoettimen kanssa mahdollistaa diagnostiset kokeet, jotka ovat tarpeeksi spesifisiä osoittamaan yksittäiset nukleotidimuutokset sekvenssissä. Kaikki alukeparit ja koettimet eivät kuitenkaan ole käyttökelpoisia. Alukkeiden valinta, ja tästä johtuen ampli-30 fioitava alue, yhdessä koettimien valinnan kanssa, määrää suurelta osalta saavutettavan spesifisyyden ja herkkyyden.
Amplifikaatiota PCR:llä on käytetty mykobakteerin nukleiinihapon sekvensoinnissa, mykobakteerin nukleiinihappojen havaitsemisessa näytteessä ja mykobakteerilajien 35 · identifioinnissa. Erilaisia bakteerigenomin alueita on 3 106213 käytetty havaitsemaan ja identifioimaan mykobakteerin nukleiinihappoja näytteissä. Useimmat näistä diagnostisista kokeista suunniteltiin havaitsemaan vain yksi laji tai pieni määrä lajeja, ja vain rajoittuneita spesifisyystar-5 kistuksia, jos ollenkaan, suoritettiin ei-mykobakteeri-DNA:ta vastaan.
Chia et ai., 1990, J. Clin. Microbiol. 28(9):1877 -1880; Brisson-Noel et ai., 1989, Lancet 334:1069 - 1071; Hackel et ai., 1990, Molecular and Cellular Probes 4:205 -10 210; Woods ja Cole, 1989, FEMS Microbiology Letters 65:305 - 310 ja Hance et ai., 1989, Molecular Microbiology 3(7):843 - 849 kuvasivat geenin sen alueen, joka koodittaa 65 kilodaltonin antigeeniä, osoittamisen. Ei enempää kuin kolme sarjaa mykobakteerilajeja erotettiin jokaisessa ko-15 keessa, joka perustui 65 kilodaltonin antigeenin geeniin.
Thierry et ai., 1990, J. Clin. Microbiol. 28(12):2668 - 2673 ja Eisenach et ai., 1990, J. Infectious Disease 161:977 - 981 raportoivat toistuvan DNA-elementin, IS6110, amplifioimisen. IS6110:n amplifikaatio toimii poh-20 jimmiltaan vain testattaessa tiettyjen mykobakteerilajien läsnäoloa, vaikka M. tuberculosis ja M. bovis voidaan erottaa kopiomäärän perusteella (Plikaytis et ai., 1991, Molecular and Cellular Probes 5:215-219).
M. lepraen 36 kilodaltonin antigeeniä käytettiin 25 diagnostisessa kokeessa, Hartskeerl et ai., 1989, J. Gen.
Microbiol. 135:2357 - 2364. Vaikka kokeen oli tarkoitus olla spesifinen M. lepraelle, havaittiin heikosta kohtalaiseen hybridisoitumista muista mykobakteereista peräisin olevaan DNA:hän.
30 Sjobring et ai., 1990, J. Clin. Microbiol.
28(10):2200 - 2204, käyttivät proteiiniantigeeniä b koodattavaa geenisekvenssiä valmistaessaan koetta M. tuber-culosis/bovisille perustuen amplifioidun tuotteen läsnäoloon tai puuttumiseen.
4 106213
Testin pelkästään M. tuberculosisin läsnäolon havaitsemiseen perustuen geenisekvenssiin, joka koodittaa MPB 64-proteiinia, kuvasivat Shankar et ai., 1990, Lancet 335:423.
5 Patel et ai., 1990, J. Clin. Microbiol. 28(3):513 - 518 ja Fries et ai., 1990, Molecular and Cellular Probes 4:87 - 105 kuvasivat koettimia, jotka oli konstruoitu kloonatuista DNA-fragmenteista. Koetinspesifisyys saatiin aikaan valintamenetelmän kautta ennemmin kuin sekvenssi-10 analyysillä koettimen suunnittelun aikana.
Eräs mykobakteerin genomin alueista, joka on analysoitu ja kohdistettu käytettäväksi diagnostisessa kokeessa, on ribosomaalisen RNA:n pieni alayksikkö (16S rRNA). Edwards et ai., (1989) Nucl. Ac. Res. 17, 19: 7843-15 7853 kuuvaavat Mycobacteriumin kansasiin 16S rRNA:ta koo- daavan geenin eristämisen ja lähes täydellisen nukleotidien määrittämisen käyttäen amplifiointi- ja sekvensoin-tialukkeita, jotka oli valittu vastaamaan prokaryootti- ja eukaryoottilajien fylogeettisesti konservoituneita aluei-20 ta. EP 395 292 kuvaa menetelmän mykobakteerien väliseksi tunnistamiseksi käyttäen Mycobacterium hovisin 16S ri-bosomaalista RNA:ta koodaavan geenin varioivalla alueella V2 sijaitsevista 73 nukleotidistä johdettua DNA-koetinta.
Bottger, 1989, FEMS Microbiology Letters 65:171 -: 25 176 amplifioi 16S rRNA-geenejä erilaisista organismeista
käyttämällä "universaaleja" alukkeita, jotka oli suunniteltu amplifioimaan nukleiinihappoa laajasta joukosta organismeja, jonka jälkeen ne sekvensoitiin suoraan. Rogall et ai., 1990, J. Gen. Micro. 136:1915 - 1920 tutkivat my-30 kobakteerilajien fylogeneettista suhdetta vertaamalla 16S
• rRNA-geenisekvenssejä. Boddinghaus et ai., 1990, J. Clin.
Microbiol. 28(8):1751 - 1759, esittivät todisteita koskien määrityksiä, joita voidaan tehdä käyttämällä sekvenssispe-sifisiä oligonukleotidejä amplifioimiseksi ja hybridisoi-35 miseksi 16S rRNA-sekvenssin alueisiin. Kolmesta mykobak- 5 106213 teerilajista tutkittiin suuresti muuntelevaa 16S rRNA-sek-venssin aluetta. Suvulle spesifisiä alukkeita käytettiin amplifioimaan alue, joka sisälsi muuntelevan alueen, jota käytettiin lajispesifisen koettimen hybridisoimiseen.
5 Pientä rRNA-alayksikköä suuresta joukosta organis meja, jotka olivat sekä läheisesti että kaukaisemmin sukua mykobakteereille, on tutkittu ja sekvensoitu. Neefs et ai., 1990, Nuc. Acids Res. Supplement 18:2237 - 2317, ovat esittäneet kokoelman pienen alayksikön rRNA-sekvensseistä 10 suuresta joukosta organismeja.
On yhä olemassa tarve nopealle ja herkälle testille, jolla identifioidaan mykobakteerin DNA:n läsnäolo ja laji, josta DNA on peräisin.
Tämä keksintö tarjoaa nopean ja herkän PCR:ään pe-15 rustuvan kokeen mykobakteereiden havaitsemiseksi ja lajien identifioimiseksi. Tarjotaan alukkeita ja koettimia, jotka ovat spesifisiä 16S ribosomaalisille RNA-geenisekvensseil-le. Mykobakteerien osoittaminen suoritetaan amplif ioimalla suvulle spesifisillä alukkeilla, jota seuraa seulonta su-20 vulle spesifisillä koettimilla "dot blot" -hybridisointi-kokeessa. Jos havaitaan mykobakteereita, lajien identifiointi määritetään amplifioidusta DNA:sta, tavallisesti samasta amplifikaatioreaktiosta, käyttämällä lajispesifisiä koettimia käänteis-"dot blot"-kokeessa.
: 25 16S ribosomaalista RNA:ta (RNA) koodittavien sek venssien amplifikaatiolla on useita etuja. Tätä keksintöä voidaan käyttää osoittamaan ja erottamaan toisistaan enemmän kuin 30 mykobakteerilajia ja lukuisia muita organismeja, joita saattaisi olla kliinisessä näytteessä. Tässä 30 keksinnössä käytettävät koettimet ja alukkeet tarjoavat • suurimman mahdollisen spesifisyyden minimoiden näin toden näköisyyden virheelliseen positiiviseen tulokseen, jonka läheisen organismin, jolla on samankaltainen sekvenssi, läsnäolo aiheuttaa. Keksinnön mukaiselle oligonukleoti-35 dialukkeiden parille, joka pystyy amplifioimaan mykobak- 6 106213 teerilajin 16S ribosomaalisen RNA:n geenin tai vastaavan RNT:n kohdealueen, on tunnusomaista se, mitä patenttivaatimuksessa 1 esitetään. 16S RNA-geeni sisältää suuresti konservoituneita alueita. Tässä kuvatun suvulle spesifiset 5 alukkeet ja koettimet hybridisoituvat tällaisiin konser-voituneisiin alueisiin ja ne pystyvät hybridisoitumaan melkein kaikista suvun lajeista peräisin olevien sekvenssien kanssa; alukkeet amplifioivat nukleiinihappoa 14:sta 15:sta testatusta mykobakteerilajista ja näistä 14:sta 10 amplifioidusta mykobakteeri-DNA-sekvenssistä suvulle spe sifiset koettimet hybridisoituvat 12:ta. 16S rRNA sisältää myös suuresti muuntelevia alueita amplifioidun alueen sisällä. Tässä kuvatut lajispesifiset koettimet hybridisoituvat muuntelevaan alueeseen, jossa jokaisen mielenkiinnon 15 kohteena olevan lajin sekvenssi on ainutlaatuinen.
Lisäetu alukkeiden ja koettimien valitsemisesta 16S rRNArsta on se, että RNA on läsnä kasvavassa solussa korkeina kopiomäärinä (103 - 104) . Geenisekvenssien lukumäärä RNA:n muodossa tietyssä kliinisessä näytteessä olisi tästä 20 syystä jopa 104 kertaa suurempi kuin vastaavien DNA-sekvenssien lukumäärä. Jos tarvitaan lisää osoitusherkkyyttä, RNA:ta itsessään voidaan käyttää amplifikaatiokohteena.
Toisessa keksinnön näkökohdassa suoritetaan toinen amplifikaatioreaktio vahvistavana kokeena. Toinen amplifi-ί 25 kaatioreaktio perustuu sellaisten kohdesekvenssien läsnä oloon, jotka eivät suoraan liity ensimmäiseen kohteeseen, eli 16S ribosomaalisiin RNA-nukleiinihappoihin. Sopivat kohdesekvenssit ovat edullisesti konservoituneita Mycobac-terium-lajien joukossa, ja ne eivät liity ei-Mycobacte-30 rium-lajeihin. Sopiva kohdegeeni voi olla esimerkiksi gee-·; ni, joka koodittaa 65 kDa:n proteiinin geeniä. Pao et ai. , 1989, FEMS Micro. Letters 65:305 - 310, Hartskeerl et ai., 1989, J. Gen. Micro. 135:2357 - 2364 ja Hackel et ai., 1990, Mol. Cel. Probes 4:205 - 210. Samalla kun toisen 35 kohdesekvenssin amplifikaatio on käyttökelpoinen ensimmäi- 7 106213 1990, Mol. Cel. Probes 4:205 - 210. Samalla kun toisen kohdesekvenssin amplifikaatio on käyttökelpoinen ensimmäisen amplifikaatioreaktion tulosten vahvistamisessa, se on erityisen tarkoituksenmukainen selvitettäessä ristiriitai-5 siä tuloksia, joita voi aiheutua vertailukokeista, varsinkin PCR:n ja viljelymenetelmien vertailusta.
Tässä kuvataan myös uusia koostumuksia käytettäviksi positiivisina kontrolleina Mycobacteriumia osoitettaessa sellaisen kokeen tulosten vahvistamiseksi, jossa käyte-10 tään suvulle spesifisiä koettimia sekä lajispesifisiä My-cobacterium-koettimia.
Tässä kuvataan myös koettimia, jotka kykenevät osoittamaan Mycobacteriumin nukleiinihapon läsnäolon (suvulle spesifiset koettimet) ja määrittämään sen lajin 15 identiteetin, josta nukleiinihappo on peräisin (lajispesifiset koettimet).
Tässä kuvataan myös konsensuskoettimia Mycobacterium- isolaattien erilaisten lajien amplifioimiseksi ja osoittamiseksi. Konsensusoligonukleotidikoettimet eivät 20 hybridisoidu ei-Mycobacterium-lajien kanssa, jotka ovat läheisesti sukua mykobakteereille.
Konsensuskoettimet sopivat laajalti kohdespesifi-seen havaitsemiseen käyttämällä yhtä oligonukleotidikoe-tinta. Konsensuskoetin, tässä käytettynä, on oligonukle-25 otidikoetin, joka ei ole sekvenssiltään samanlainen minkään osoitettavan mykobakteerinukleiinihapposekvenssin kanssa. Konsensuskoettimet ovat hybridioligonukleotidi-koostumuksia, jotka käsittävät ei-luonnollisia nukleiini-happosekvenssejä. Konsensuskoettimia, kuten niitä tässä 30 keksinnössä kuvataan, voidaan käyttää poistamaan sekä si-' · säilyttämään valittuja lajeja osoituskokeeseen. Tässä ku vataan oligonukleotidikoettimia, jotka käsittävät uusia sekvenssejä. Samalla kun nämä koettimet laajasti havaitsevat mykobakteerilajeja, ne eivät havaitse läheisiä ei-my-35 kobakteerilajeja, esimerkiksi Corynebacterista.
3 106213
Keksintö koskee edellä kuvattua alukkeiden paria mykobakteerien nukleiinihapon spesifisen alueen amplifioi-miseksi. Tämä alue sisältää sekä alueen, joka on konser-voitunut Mycobacterium-lajien joukossa että muuntelevan 5 alueen, jolla on riittävästi heterogeenisyyttä lajien joukossa, jotta kohdenukleiinihapon alkuperä on mahdollista määrittää käyttämällä sekvenssille spesifisiä oligonukle-otidikoettimia.
Eräs keksinnön näkökohta koskee havaitsemismenetel-10 miä ja lajin identifioimismenetelmiä. Kohdenukleiinihapon amplifioiminen PCRrllä käyttämällä keksinnön mukaista alukkeiden paria mahdollistaa mykobakteerien nukleiinihapon läsnäolon havaitsemisen sekoittamalla amplifioitu nukleiinihappo suvulle spesifisten koettimien kanssa ja ha-15 vaitsemalla, tapahtuuko hybridisoituminen, kun taas lajien identifiointi suoritetaan määrittämällä hybridisoitumista-pa lajispesifisiin koettimiin. Menetelmälle näytteen sisältämän mykobakteerin nukleiinihapon osoittamiseksi on tunnusomaista se, mitä patenttivaatimuksessa 8 esitetään. 20 Menetelmälle mykobakteerin luokittelemiseksi on tunnusomaista se, mitä patenttivaatimuksessa 10 esitetään.
Eräs keksinnön näkökohta koskee testipakkauksia. Testipakkaukselle näytteessä olevan mykobakteerin nukleiinihapon osoittamiseksi ja mahdolliseksi identifioimiseksi j 25 on tunnusomaista se, mitä patenttivaatimuksessa 2 esitetään. Näillä testipakkauksilla on useita erilaisia muotoja, ja ne käsittävät yhden tai useampia koettimia, sekä vaaditun alukkeiden parin ja, eräässä suoritusmuodossa, käsittävät koetinpaneelin, joka riittää määrittämään in-30 fektoivan Mycobacteriumin identiteetin lajitasolla, ja · ohjeita testipakkauksen aineiden käyttämiseksi. Testipak kaukset voivat myös käsittää yhden tai useampia amplifi-ointireagensseja, esim. suvulle spesifisiä alukkeita, po-lymeraasia, puskureita ja nukleosiditrifosfaatteja.
106213
Vielä eräässä suoritusmuodossa testipakkaus voi myös käsittää positiivisia ja negatiivisia kontrolleja. Edullinen positiivinen kontrolli kuvataan tässä.
Keksinnön ymmärtämisen helpottamiseksi alla määri-5 tellään useita termejä.
Termi "oligonukleotidi" viittaa molekyyliin, joka muodostuu kahdesta tai tavallisesti useammasta deoksiri-bonukleotidistä tai ribonukleotidistä, sellaiset kuten alukkeet, koettimet, osoitettavat nukleiinihappofragmentit 10 ja nukleiinihappokontrollit. Oligonukleotidin tarkka koko riippuu monista tekijöistä ja oligonukleotidin lopullisesta funktiosta tai käytöstä. Oligonukleotidejä voidaan valmistaa millä tahansa sopivalla menetelmällä, käsittäen esimerkiksi sopivien sekvenssien kloonauksen ja restrik-15 tion ja suoran kemiallisen synteesin sellaisella menetelmällä kuten Narang et ai., 1979, Meth. Enzymol. 68:90 - 99 fosfotriesterimenetelmä, Brown et ai., 1979, Meth. Enzymol. 68:109 - 151 fosfodiesterimenetelmä, Beaucage et ai., 1981, Tetrahedron Lett. 22:1859 - 1862 dietyylifosforami-20 diittimenetelmä ja US-patenttijulkaisun nro 4 458 066 mukainen kiinteän kantajan menetelmä.
Termi "aluke" viittaa oligonukleotidiin, olipa se luonnollinen tai synteettinen, joka kykenee toimimaan DNA-synteesin aloituskohtana olosuhteissa, joissa alukkeen ; 25 pidennystuotteen, joka on komplementaarinen nukleiinihap- posäikeelle, synteesi indusoituu, eli neljän erilaisen deoksiribonukleosiditrifosfaatin ja polymerisointiaineen (eli DNA-polymeraasin tai käänteistranskriptaasin) läsnäollessa sopivassa puskurissa ja sopivassa lämpötilassa. 30 Aluke on edullisesti yksisäikeinen oligodeoksiribonukleo- • f tidi. Alukkeen sopiva pituus riippuu alukkeen tarkoitetusta käytöstä, mutta se on tavallisesti 15 - 25 nukleotidiä. Lyhyet alukemolekyylit vaativat tavallisesti viileämpiä lämpötiloja muodostaakseen riittävän stabiileja hybridi-35 komplekseja templaatin kanssa. Alukkeen ei tarvitse ref- « 10 106213 lektoida templaatin tarkkaa sekvenssiä, mutta sen tulee olla riittävän komplementaarinen hybridisoituakseen templaatin kanssa ja toimimaan DNA-synteesin aloituksessa.
Keksinnön suoritusmuodoissa tarjotaan sekvenssil-5 tään spesifisiä alukkeita, kuten edellä on kuvattu ja koettimia. Alan ammattimiehelle on ilmeistä mainittujen suoritusmuotojen pohjalta, että sekvenssiltään spesifisiä koettimia voidaan modifioida esimerkiksi lisäämällä nukleotidejä joko 5'- tai 3'-päihin, jotka nukleotidit ovat 10 komplementaarisia kohdesekvenssille tai ei-komplementaarisia kohdesekvenssille.
Termi "aluke" voi viitata useampaan kuin yhteen alukkeeseen, erityisesti sellaisessa tapauksessa, jossa esiintyy hiukan epäselvyyttä informaatiossa, joka koskee 15 amplifioitavan kohdealueen toista tai kumpaakin päätä. Jos "konservoitunut" alue osoittaa merkittäviä polymorfismita-soja populaatiossa, voidaan valmistaa alukeseoksia, jotka amplifioivat tällaisia sekvenssejä, tai alukkeet voidaan suunnitella amplifioimaan jopa sekvenssejä, jotka eivät 20 ole yhteensopivia. Aluke voidaan merkitä haluttaessa liittämällä spektroskopisesti, fotokemiallisesti, biokemialli-sesti, immunokemiallisesti tai kemiallisesti osoitettavissa oleva merkki. Käyttökelpoiset merkit käsittävät esimerkiksi 32P:n, fluoresoivat värit, elektronitiheät reagens- . 25 sit, entsyymit (tavallisesti ELISA:ssa käytettävät), bio- tiinin tai hapteenit ja proteiinit, joille on saatavilla antiseerumia tai monoklonaalisia vasta-aineita. Merkkiä voidaan myös käyttää "sieppaamaan" aluke, näin helpottamaan joko alukkeen tai alukkeen pidennystuotteen, sellai-30 sen kuten amplifioidun DNA:n, immobilisoitumista kiinteäl- • le kantajalle.
Termit "sekvenssille spesifinen oligonukleotidi" ja "SSO" viittavat oligonukleotideihin, joilla on sekvenssi, jota kutsutaan "hybridisoituvaksi alueeksi", joka on komp-35 lementaarinen osoitettavalle sekvenssille, ja joka "sek- • 106213 venssille spesifisissä, ankarissa hybridisointiolosuhteis-sa" hybridisoituu vain siihen täysin komplementaariseen kohdesekvenssiin. Hybridisaatio-olosuhteiden ankaruuden lieventäminen sallii sekvenssien välisen epäparisuuden; 5 epäparisuusastetta, joka sallitaan, voidaan kontrolloida hybridisointiolosuhteiden sopivalla säätelyllä. Termejä "koetin" ja "SSO-koetin" käytetään vaihtelevasti SSO:n kanssa.
Termi "kohdealue" viittaa analysoitavaan nukleiini-10 happoalueeseen.
Termi "lämpöstabiili polymeraasientsyymi" viittaa entsyymiin, joka on suhteellisen stabiili lämmölle ja katalysoi nukleosiditrifosfaattien polymerisaatiota muodostettaessa alukkeen pidennystuotteita, jotka ovat komple-15 mentaarisia kohdesekvenssin toiselle nukleiinihapposäi- keelle. Entsyymi aloittaa synteesin alukkeen 3'-päässä ja etenee templaatin 5'-päätä kohti, kunnes synteesi päättyy. Puhdistettu lämpöstabiili polymeraasientsyymi on kuvattu täydellisemmin US-patenttijulkaisussa 4 889 818.
20 Termi "käänteistranskriptaasi" viittaa entsyymiin, joka katalysoi nukleosiditrifosfaattien polymerisaatiota muodostettaessa alukkeen pidennystuotteita, jotka ovat komplementaarisia ribonukleiinihappotemplaatille. Entsyymi aloittaa synteesin alukkeen 3'-päässä ja etenee templaatin . 25 5’-päätä kohti, kunnes synteesi päättyy. Esimerkkejä sopi vista polymerisoivista aineista, jotka muuntavat RNA-kohdesekvenssin komplementaariseksi, kopio-DNA-sekvenssiksi (cDNA), ovat linnun myeloblastosisviruksen käänteistranskriptaasi ja Thermus thermophilus DNA-polymeraasi, lämpö-30 stabiili DNA-polymeraasi, jolla on käänteistranskriptaasi- ' aktiivisuutta.
Kuva 1 esittää hybridisaatiotestien tulokset, joissa käytetään keksinnön mukaisia sekä suvulle spesifisiä että lajispesifisiä koettimia. Koettimien spesifisyys tes 106213 tattiin DNA:11a kolmestatoista erilaisesta Mycobacterium-lajista.
Tämä keksintö tarjoaa nopean ja herkän PCR:ään perustuvan kokeen Mycobacteriumien osoittamiseksi ja lajien 5 identifioimiseksi. Tarjotaan alukkeita ja koettimia, jotka ovat spesifisiä mykobakteerien 16S ribosomaalisille RNA-geenisekvensseille. Mykobakteerien osoittaminen suoritetaan amplifioimalla suvulle spesifisillä alukkeilla, jota seuraa seulonta suvulle spesifisillä koettimilla "dot 10 blot" -hybridisointikokeessa. Jos mykobakteereita havai taan, lajien identifiointi suoritetaan samasta amplifikaa-tioreaktiosta peräisin olevasta DNA:sta käyttäen lajispesifisiä koettimia käänteis-"dot blot"-kokeessa. Sekä etenevät että käänteis-"dot blot"-kokeet voidaan suorittaa 15 erittäin tarkoituksenmukaisesti mikrotiitterilevyllä.
Suvulle spesifiset alukkeet ja koettimet hybridi-soituvat 16S rRNA-geenin konservoituneisiin alueisiin ja lajispesifiset koettimet hybridisoituvat 16S rRNA-geenin muunteleviin alueisiin. Koska synteesi alkaa alukkeen 20 3'-päästä, epäparisuus 3'-päässä on kriitillisempää. Tyrni - diini on kestävämpi epäparisuuden suhteen kuin muut emäkset; näin ollen suunniteltiin alukkeita välttäen tymidii-niemästä 3'-päässä. Oligonukleotidin emäspitoisuus vaikuttaa denaturoitumislämpötilaan. Alukkeen tai koettimen si- . 25 toutumisen ankaruus ja spesifisyys kasvaa lämpötilan nous tessa. Koska kaikki koettimet kuitenkin hybridisoidaan samanaikaisesti käänteis-"dot blot"-formaatissa, optimaaliset koettimen hybridisointiolosuhteet ovat samanlaiset kaikille koettimille.
30 Keksinnön mukaiset alukeparit toimivat tehokkaasti * kaikkien mielenkiinnonkohteena olevien mykobakteerilajien 16S rRNA-geenin sekvenssin amplifioinnissa, mutta ne eivät amplifioi useimmista muista lähteistä peräisin olevaa vastaavaa DNA:ta. Edelleen amplifikaatio-olosuhteet ja tehok- 35 · kuus näille alukkeille ovat kohtalaisen samanlaiset lajien • 106213 13 välillä niin, että lähes kaikki mykobakteerilajit ovat havaittavissa käyttämällä yhtä koetta. Taulukossa 1 esitetään tämän keksinnön mukaisten alukkeiden hybridisoituvat sekvenssit.
5
Taulukko 1
Aluke Sekvenssilistaus Hybridisoituva sekvenssi KY18 SEQ ID NO: 1 5 ' CACATGCAAGTCGAACGGAAAGG3 ' KY75 SEQ ID NO:2 5' GCCCGTATCGCCCGCACGCTCACA3 ' 10 Käyttämällä E. colin numerointijärjestelmää ylävirran aluke KY18 käsittää 16S rRNA-geenin emästen 52 - 74 välin ja alavirran aluke KY75 käsittää emästen 624 - 647 välin. Yhdessä nämä alukkeet spesifioivat pituudeltaan 15 noin 583 emäsparin pituisen tuotteen synteesin; tarkka koko riippuu lajista.
Alkuseulonta mykobakteeri-DNA:n läsnäolon toteamiseksi suoritetaan kahdella suvulle spesifisellä koettimel-la, joita käytetään samanaikaisesti seoksena.
20
Taulukko 2
Koetin Sekvenssilistaus Hybridisoituva sekvenssi KY101 SEQ ID NO:3 5'TCGCGTTGTTCGTGAAATCTCACgGCTTAA3' KY102 SEQ ID NO:4 5'TCGCGTTGTTCGTGAAAaCTCACAGCTTAA3' ; 25 KY165 SEQ ID NO:13 5'TCGCGTTGTTCGTGAAATCTCACAGCTTAA3' KY166 SEQ ID NO:14 5'TCGCGTTGTTCGTGgAATCTCACAGCTTAA3' M.xenopi SEQ ID NO:15 5'TCGCGTTGTTCGTGgAATgcCACAGCTTAA3'
Syy koetinseoksille on se, että useimmat mykobak-30 teerilajit voidaan jakaa kahteen ryhmään suhteessa sek-:: vensseihin KY101:n (SEQ ID NO.3) ja KY102:n (SEQ ID NO.4) alueella. Nämä kaksi koetinta osoittavat DNA:n 12:ta testatun Mycobacterium-suvun 14:sta lajista.
Vaihtoehtoisessa suoritusmuodossa KY165 (SEQ ID NO. 35 13) korvaa koettimet KY101 (SEQ ID NO.3) ja KY102 (SEQ ID
NO.4). Koettimien KY101 (SEQ ID NO.3), KY102 (SEQ ID
« 14 106213 NO.4), KYI65 (SEQ ID NO.13) ja KY166 (SEQ ID NO.14) sekvenssit on esitetty taulukossa 2. KY165 (SEQ ID NO.13) on konsensuskoetin käsittäen sekä KY101:n (SEQ ID NO.3) että KY102:n (SEQ ID NO.4) sekvenssit. KY101 (SEQ ID NO.3) ja 5 KY102 (SEQ ID NO.4) eroavat toisistaan kahdella emäksellä.
KY165 (SEQ ID NO. 13) ei ole identtinen kummankaan KY101 (SEQ ID NO.3) tai KY102 (SEQ ID NO.4) kanssa, vaan eroaa kummastakin yhdellä emäksellä. Tämä konsensus saavutettiin "suosimalla" KY101:tä (SEQ ID NO. 3) yhdessä epäparisuus-10 asemista ja KY102:ta (SEQ ID NO.4) muissa epäparisuus-asemissa. KY165 (SEQ ID NO. 13) pystyy hybridisoitumaan riittävästi kaikkiin KY101- (SEQ ID NO.3) ja KY102-spesifisiin (SEQ ID NO.4) mykobakteerilajeihin. KY165 (SEQ ID NO.13) ei hybridisoidu M. xenopiin (SEQ ID NO.15) hyvin ankarissa 15 olosuhteissa johtuen lisäepäparisuuden läsnäolosta.
KY166 (SEQ ID NO.14) on laajempi konsensuskoetin mykobakteerilajien, käsittäen M. xenopi (SEQ ID NO.15), osoittamiseksi. KY166:sta (SEQ ID NO.14) sekvenssi, kuten KY165:n (SEQ ID NO.13) sekvenssi, ei vastaa mitään ei-my-20 kobakteerilajia. Koetin on suunniteltu olemaan yhtälailla erilainen KYlOlslle (SEQ ID N0.3), KY102:lle (SEQ ID NO. 4) ja M. xenopin vastaavalle sekvenssille (SEQ ID NO.15) (GenBank hankintanumero X52929, saatavilla Intelligene-ticsin kautta). KY166 (SEQ ID NO.14) eroaa KY101:stä (SEQ : 25 ID NO.3), KY102:sta (SEQ ID NO.4) ja M. xenopista (SEQ ID
NO.15) kahdella emäksellä jokaisesta. KY166 (SEQ ID NO.14) hybridisoituu tehokkaasti kaikkiin KY101- (SEQ ID NO.3) ja KY102-spesifisiin (SEQ ID NO.4) lajeihin ja M. xenopiin (SEQ ID NO.15). Lisäksi KY166 (SEQ ID NO.14) ei hyb-30 ridisoidu Corynebacter pseudodiphtheriticumiin tai C.
' diphtheriaeseen, kahteen ei-mykobakteerilajiin, jotka ovat läheisesti sukua Mycobacteriumille. M. xenopin vastaava sekvenssi (SEQ ID NO.15) sisältyy taulukkoon 2. Taulukossa epäparisuus suhteessa KY166:een (SEQ ID NO.14) on allevii 15 106213 vattu. Epäparisuus suhteessa KY165:een (SEQ ID NO.13) on esitetty pienillä kirjaimilla.
Jos näyte sisältää mykobakteerinukleiinihappoa, se laji, josta nukleiinihappo on peräisin, voidaan määrittää 5 hybridisoimalla lajispesifisten koettimien paneeliin. Lajien identifiointivaiheessa käytetyt koettimet on esitetty taulukossa 3.
16 106213
Taulukko 3
Koetin Sekvenssilistaus Spesifisyys KY21 SEQ ID Να 5 M. tubcrculosis/bovis/tb 5 5' ACGGGATGCATGTCTTGTGOTGGAAAGCXjCTTTAGC 3* . KY25 SEQIDNO:6 M. kansasii/gastri/scrofulaceum 5* ACTTGGCGCATGCCTTGTGGTGGAAAGCTT 3’ KY26 SEQ ID Να 7 M. intacellulare
5’ TTTAGGCGCATGTCTTTAGGTGGAAAGCTT
10 KY63 SEQ ID NO: 8 M aviunVmarinum/microti 5’ TCAAGACGCATGTCTTCTOGTGGAAAGCTTTTGC 3' KY151 SEQ ID NO: 9 M. marinum/M microti 5’ TCCCGAAGTGCAGGCCAGATTGCCCACX5TG 3* 15 KY 106 SEQ ID NO: 10 M. scrofulaccum 5’ GAAGGCTCACTTTGTGGGTTGACGGTAGGT 3’ KY 126 SEQ ID Να 11 M kansasii/gastri 5' GCAATCTGCCTGCACACCGGGATAAGCCTG 3’ KY139 SEQ ID NO: 12 M. gordonae 20 5’ GGGTCTAATACCGAATAGGACCACAGGACACATG 3’ KY 157 SEQ ID Να 16 M. xenopi 5’ ATAGGACCATTCTGCGCATGTGGTGTGGTG 3’ KY 167 SEQ ID NO: 17 M. avium/marinum/microti 5' ACCTCAAGACGCATGTCTTCTGGT 3’ 25 KY168 SEQ ID Να 18 M. gordonae 5’ CCGAATAGGACCACAGGACACATG 3’ KY 169 SEQ ID NO: 19 M intracellularc 5' ACCTTTAGGCXjCATGTCTTTAGGT 3’ KY 170 SEQ ID NO: 20 M. kansasii/gastri/scrofulaceum 3 0 5’ AACACTTGGCGCATGCCTTGTGGT 3* KY 171 SEQ ID NO: 21 M. scrofulaceum 5’ GAAGGCTCACTTTGTGGGTTGACG 3’ KY 172 SEQ ID NO: 22 M.bovis/tb 5’ TGTGGTGGAAAGCGCTTTAGCGGT 3’ 3 5 KY 173 SEQ ID NO: 23 M. xenopi 5’ AGGACCATTCTGCGCATGTGGTGT 3' 17 106213
Kliinisesti eniten kiinnostavat lajit ovat M.
, tuberculosis, M. kansasii, M. xenopi, M. intracellulare ja M. avium. M. gordonae ei tavallisesti liity sairauteen, mutta se esiintyy säännöllisesti ihmisnäytteissä. Tästä 5 johtuen mykobakteerinukleiinihapon havaitsemisen suvulle spesifisillä koettimilla oletetaan usein johtuvan kliinisesti merkityksettömästä M. gordonaesta. Esimerkki 6 sisältää lisätietoa lajispesifisten koettimien spesifisyydestä.
10 Tämän keksinnön tärkeä näkökohta on 16S rRNA-geenin alueen amplifiointi. Niiden, jotka käyttävät tätä keksintöä, tulisi huomata, että vaikka polymeraasiketjureaktio on edullinen amplifiointimenetelmä, näytteen kohdesekvens-sien amplifiointi voidaan suorittaa millä tahansa tunne-15 tulla menetelmällä, sellaisella kuten ligaasiketjureaktio (LCR), transkriptioamplifikaatio ja itsestään jatkuva sekvenssin replikaatio, joista jokainen tarjoaa riittävän amplifikaation, niin että kohdesekvenssi voidaan havaita nukleiinihapon hybridisoitumisena SSO-koettimeen. Vaihto-20 ehtoisesti, menetelmiä, jotka amplifioivat koettimen havaittavissa oleville tasoille, voidaan käyttää, sellaisia kuten QP-replikaasiamplifikaatio. Termi "koetin" käsittää sekvenssille spesifiset oligonukleotidit, joita käytetään edellä esitetyissä menetelmissä; esimerkiksi LCRrssä käy-; 25 tetyt kaksi tai useampi oligonukleotidi ovat "koettimia" tämän keksinnön tarkoituksiin, vaikka LCR tarvitsee vain koettimien ligaation osoittamaan sekvenssin läsnäolon.
Vaikka PCR-menetelmä tunnetaan alalla hyvin (ks. US-patenttijulkaisut nrot 4 683 195, 4 683 202 ja 30 4 965 188), alla esitetään jotakin yleistä informaatiota PCR:stä keksinnön selvyyden ja täyden ymmärtämisen vuoksi niille, jotka eivät tunne PCR-menetelmää.
Näytteen kohdenukleiinihapposekvenssin amplifioimi-seksi PCR:llä sekvenssin tulee olla amplifikaatiojärjes-35 telmän komponenttien saavutettavissa. Yleisesti tämä saa- is 106213 vutettavuus varmistetaan eristämällä nukleiinihapot näyt-, teestä. Alalla tunnetaan useita erilaisia menetelmiä nuk leiinihappojen uuttamiseksi biologisista näytteistä. Katso esimerkiksi sellaiset, jotka Higuchi et ai., 1989, teok-5 sessa PCR Technology (toim. Erlich, Stockton Press, New York) ovat kuvanneet. Vaihtoehtoisesti, jos näyte on kohtalaisen helposti hajotettavissa, nukleiinihappoa ei tarvitse puhdistaa ennen amplifiointia PCR-menetelmällä, eli jos näyte koostuu soluista, erityisesti ääreisverilymfo-10 syyteistä tai aminiosyyteistä, solunsisäisten komponenttien lyysaus ja dispersoiminen voidaan suorittaa pelkästään suspendoimalla solut hypotoniseen puskuriin.
PCR:n jokainen kierros käsittää alukkeen pidentämisellä muodostuneen nukleiinihappodupleksin erottamisen.
15 PCR-menetelmän edullisessa suoritusmuodossa säikeen erottaminen saavutetaan kuumentamalla reaktioseosta riittävän korkeaan lämpötilaan vaikuttavaksi ajaksi dupleksin dena-turoitumisen aikaansaamiseksi, mutta joka ei aiheuta poly-meraasin irreversiibeliä denaturoitumista (ks. US-patent-20 tijulkaisu nro 4 965 188) . Tyypillinen lämpödenaturoiminen käsittää lämpötilat, jotka ovat välillä noin 80 - 105 °C, sellaisen ajanjakson ajan, joka on välillä sekunneista minuutteihin. Säikeen erottaminen voidaan kuitenkin suorittaa millä tahansa sopivalla denaturointimenetelmällä ; 25 käsittäen fysikaaliset, kemialliset tai entsymaattiset menetelmät. Säikeen erottaminen voidaan indusoida esimerkiksi helikaasilla tai entsyymillä, joka pystyy osoittamaan helikaasiaktiivisuutta. Esimerkiksi entsyymillä RecA on helikaasiaktiivisuutta ATPtn läsnäollessa. Säikeen 30 erottamiseen helikaaseilla sopivat reaktio-olosuhteet tun-*_ netaan alalla (ks. Kuhn Hoffmann-Berling, 1978, CSH-Quan- titative Biology 43:63 - 67 ja Radding, 1982, Ann. Rev. Genetics 16:405 - 436).
Riippumatta siitä, kuinka säikeiden erottaminen on 35 aikaansaatu, sen jälkeen kun säikeet on erotettu, seuraava 19 106213 vaihe PCR:ssä kuitenkin käsittää erotettujen säikeiden hybridisoimisen sellaisten alukkeiden kanssa, jotka reunustavat kohdesekvenssiä. Alukkeet pidennetään sitten muodostamaan kohdesäikeille komplementaarisia kopioita. On-5 nistunutta PCR-amplifikaatiota varten alukkeet suunnitellaan niin, että se kohta, johon kukin aluke hybridisoituu dupleksisekvenssissä, on sellainen, että pidennystuote, joka syntetisoidaan yhdestä alukkeesta, kun se on erotettu templaatista (komplementista), toimii templaattina toisen 10 alukkeen pidennykselle. Denaturoinnin, hybridisoinnin ja pidennyksen käsittävää sykliä toistetaan niin monta kertaa kuin on tarpeen, jotta saadaan haluttu määrä amplifioitua nukleiinihappoa.
Templaatista riippuvaista alukkeiden pidentämistä 15 PCRrssä katalysoidaan polymerisoivalla aineella riittävien määrien neljää deoksiribonukleosiditrifosfaattia (dATP, dGTP, dCTP ja dTTP; dUTPrtä käytetään dTTP:n tilalla tai lisäksi, jos UNG-sterilointijärjestelmä, joka kuvataan alla, käytetään) läsnäollessa reaktioväliaineessa, joka 20 muodostuu sopivista suoloista, metallikationeista ja pH-puskurijärjestelmästä. Sopivia polymerointiaineita ovat entsyymit, joiden tiedetään katalysoivan templaatista riippuvaista DNA-synteesiä. Esimerkkejä polymeraaseista, jotka sopivat käytettäviksi DNA-templaatin kanssa, kä-: 25 sittävät E. coli-DNA-polymeraasi I:n tai sen entsyymin
Klenowin fragmentin, T4-DNA-polymeraasin ja Taq-polymeraa-sin, lämpöstabiilin DNA-polymeraasin, joka on eristetty Thermus aquaticusista. Viimeksimainittua entsyymiä käytetään laajalti nukleiinihappojen amplifioinnissa ja sekven-30 soinnissa. Reaktio-olosuhteet Taq-polymeraasien käyttä miseksi tunnetaan alalla, ja Gelfand on kuvannut ne teoksessa PCR Technology, 1989, supra. Polymerisointiaineet, jotka sopivat komplementaarisen, kopio-DNA-sekvenssin (cDNA) syntetisointiin RNA-templaatista, ovat käänteis-35 transkriptaasi (RT), sellainen kuten linnun myeloblasto- 20 106213 sisvirus-RT tai Thermus thermophilus-DNA-polymeraasi, läm-pöstabiili DNA-polymeraasi, jolla on käänteistranskriptaa-siaktiivisuutta. Tyypillisesti RNA-templaatti hajotetaan lämmöllä ensimmäisen denaturointivaiheen aikana alkukään-5 teistranskriptiovaiheen jälkeen jättäen vain DNA-templaa-tin sen jälkeen suoritettavaa amplifiointia varten.
Jos on tarkoitus amplifioida 16S rRNAtta, alku-käänteistranskriptiovaihe (RT) suoritetaan muodostamaan RNA:nDNA-kopio (cDNA). PCT-patenttihakemusjulkaisu nro 10 WO 91/09944 kuvaa korkeassa lämpötilassa tapahtuvan kään-teistranskription lämpöstabiililla polymeraasilla, joka myös toimii PCR-amplifikaatiossa. Korkean lämpötilan RT tarjoaa suuremman alukespesifisyyden ja parantuneen tehokkuuden. Samat alukkeet ja polymeraasi voivat toimia sekä 15 käänteistranskriptio- että PCR-amplifikaatiovaiheissa, ja reaktio-olosuhteet optimoidaan niin, että molemmat reaktiot tapahtuvat ilman reagenssien vaihtamista. Thermus thermophilus-DNA-polymeraasia, lämpöstabiilia DNA-polyme-raasia, joka voi toimia käänteistranskriptaasina, käyte-20 tään kaikissa alukkeen pidennysvaiheissa, templaatista riippumatta. Molemmat menetelmät voidaan suorittaa ilman, että putkea tarvitsee aukaista reagenssien vaihtamisen tai lisäämisen takia; vain lämpötilaprofiilia säädetään ensimmäisen syklin (RNA-templaatti) ja muiden amplifikaatiosyk-; 25 lien (DNA-templaatti) välillä.
PCR-menetelmä voidaan suorittaa vaiheittain, jossa jokaisen vaiheen jälkeen lisätään uudet reagenssit, tai tavalla, jossa kaikki reagenssit lisätään samanaikaisesti, tai osittain vaiheittaisella tavalla, jossa tuoreita tai 30 erilaisia reagensseja lisätään tietyn vaiheiden määrän jälkeen. Esimerkiksi jos säikeiden erottaminen indusoidaan lämmöllä ja polymeraasi on lämmölle herkkä, polymeraasia täytyy tällöin lisätä jokaisen säikeen erottamiskierroksen jälkeen. Jos kuitenkin esimerkiksi käytetään helikaasia 35 denaturointiin tai jos lämpöstabiilia polymeraasia käyte- 106213 tään pidentämiseen, tällöin kaikki reagenssit voidaan lisätä alussa tai vaihtoehtoisesti, jos reagenssien molaari-silla suhteilla on merkitystä reaktiolle, reagensseja voidaan täydentää aika ajoin samalla kun niitä kuluu syntee-5 sireaktiossa.
Alan ammattimies tietää, että PCR-menetelmä suoritetaan tavallisimmin automatisoituna menetelmänä käyttäen lämpöstabiilia entsyymiä. Tässä menetelmässä reaktioseok-sen lämpötilaa kierrätetään denaturointialueen, alukkeen 10 liittämisalueen ja reaktioalueen kautta. Laite, joka on erityisesti suunniteltu käytettäväksi lämpöstabiilin entsyymin kanssa, on kaupallisesti saatavana Perkin Elmeriltä.
Alan ammattimies on myös tietoinen edellisistä 15 reaktioista peräisin olevan amplifioidun nukleiinihapon aihuttamasta PCR:n kontaminaatio-ongelmasta. Menetelmät tämän ongelman vähentämiseksi mahdollistavat minkä tahansa edellisistä reaktioista peräisin olevan amplifioidun DNA:n entsymaattisen·hajottamisen. PCR-amplifikaatio suoritetaan 20 dUTP:n läsnäollessa dTTP:n sijasta. Näin saatava kaksisäi- keinen, urasiilia sisältävä tuote on altis hajoamiselle urasiili-N-glykosylaasilla (UNG), kun taas normaali tyrni -diiniä sisältävä DNA ei hajoa UNG:llä. UNG:n lisääminen amplifikaatioreaktioseokseen ennen amplifioinnin aloitta-• 25 mistä hajottaa kaikki urasiilia sisältävän DNA:n, joka t saattaisi toimia kohteena. Koska ainoa urasiilia sisältävän DNA:n lähde on amplifioitu tuote edellisestä reaktiosta, tämä menetelmä puhdistaa tehokkaasti reaktioseoksen, eliminoiden edellisistä reaktioista peräisin olevan konta-3 0 minaatio-ongelman (carryover) . UNG muutetaan väliaikaises- ' *( ti lämmöllä inaktiiviseksi, näin denaturointivaiheet amp lif ikaatiomenetelmässä toimivat myös inaktivoiden UNG:n. Tästä syystä muodostuu uusia amplifikaatiotuotteita yhdistämällä urasiilia UNG-vapaassa ympäristössä, ja ne eivät 35 hajoa.
22 106213
Sekvenssille spesifisen koettimen hybridisointi on tärkeä vaihe näiden menetelmien onnistuneessa suorittamisessa. Tämän keksinnön mukaiset sekvenssille spesifiset oligonukleotidikoettimet hybridisoituvat erityisesti myko-5 bakteerigenomin tietyn segmentin kanssa, ja niiden emäksillä tapahtuu vääriä pariutumisia muista organismeista peräisin olevien sekvenssien kanssa suvulle spesifisten koettimien kyseessä ollessa, ja muiden mykobakteerilajien kanssa lajispesifisten koettimien kyseessä ollessa aiheut-10 taen epästabiiliutta. Voidaan valita ankarat hybridisoin-tiolosuhteet, niin että koettimet hybridisoituvat spesifisesti vain täysin komplementaarisiin sekvensseihin. Ampli-fioidun tuotteen osoittaminen käyttää hyväksi tätä sek-venssispesifistä hybridisoitumista varmistamaan, että vain 15 oikea amplifioitu kohde havaitaan, vähentäen virheellisen positiivisen tuloksen mahdollisuutta, jonka aiheuttaa läheisistä organismeista peräisin olevien homologisten sekvenssien läsnäolo.
SSO-koettimien ja nukleiinihapposekvenssien välille 20 muodostuneiden hybridien osoittamista varten olevat koemenetelmät voivat edellyttää, että koettimet sisältävät lisäpiirteitä hybridisoituvan alueen lisäksi. Esimerkiksi "dot blot" -formaatissa koettimet tavallisesti merkitään.
Jos koetin immobilisoidaan ensin, kuten alla kuvatussa : 25 "käänteis-dot blot"-formaatissa, koetin voi myös sisältää pitkiä poly-dT-pidennyksiä, jotka voidaan kiinnittää nai-lonkantajalle säteilyttämällä, menetelmällä, joka on kuvattu yksityiskohtaisemmin PCT-patenttihakemusjulkaisussa nro 89/11 548.
30 Tässä kuvatut koettimet voidaan syntetisoida ja merkitä edellä kuvattuja menetelmiä oligonukleotidien syn-tetisoimiseksi käyttäen. Koetin voidaan esimerkiksi merkitä 5'-päässä 32P:llä inkuboimalla koetinta 32P-ATP:llä ja kinaasilla. Sopiva ei-radioaktiivinen merkki SSO-koetti-35 mille on piparjuuriperoksidaasi (HPR). Menetelmiä tämän 23 106213 merkin sisältävien koettimien valmistamiseksi ja osoittamiseksi on kuvattu US-patenttijulkaisuissa nrot 4 914 210 ja 496 202. Lisäinformaatioksi tällaisten merkittyjen koettimien käytöstä katso US-patenttijulkaisu nro 5 4 789 630, Saiki et ai., 1988, N. Eng. J. Med. 319:537 - 541 ja Bugawan et ai., 1988, Bio/Technology 6:943 - 947. Käyttökelpoiset kromogeenit käsittävät punavalkovärin ja 3,31,5,5'-tetrametyylibentsidiinin (TMB). Helmuth, PCT Protocols, San Diego, California, Academic Press, Inc., 10 1990, ss. 119 - 128, kuvaa menetelmiä PCR-tuotteiden ei-isotooppiseksi osoittamiseksi.
Tässä kuvattuja koettimia voidaan käyttää määritettäessä, onko näytteessä nukleiinihapposekvenssejä, määrittämällä, sitoutuvatko koettimet näytteessä oleviin sek-15 vensseihin. Alalla tunnetaan sopivia koemenetelmiä tämän keksinnön tarkoituksia varten osoitetaessa hybridejä, jotka ovat muodostuneet koettimien ja näytteessä olevien nukleiinihapposekvenssien välille. Esimerkiksi osoittaminen voidaan suorittaa käyttämällä "dot blot" -formaattia, 20 kuten esimerkissä 4 on kuvattu. "Dot blot" -formaatissa merkitsemätön amplifioitu näyte sidotaan kiinteälle kantajalle, sellaiselle kuten membraani, membraania inkuboidaan merkityn koettimen kanssa sopivissa hybridisointiolosuh-teissa, hybridisoitumaton koetin poistetaan pesemällä ja j 25 suodatinta tutkitaan sitoutuneen koettimen läsnäolon ha-vaitsemiseksi. Analysoitaessa useita näytteitä muutamalla koettimella, kuten sellaisessa tapauksessa, jossa näytteitä seulotaan mykobakteerinukleiinihapon läsnäolon havaitsemiseksi käyttämällä suvulle spesifisiä koettimia, "dot 30 blot"-formaatti on hyvin käyttökelpoinen.
Vaihtoehtoinen menetelmä on hyvin käyttökelpoinen silloin kun on määrä käyttää suurta määrää erilaisia koettimia. Tämä menetelmä on "käänteis-dot blot", jossa amplifioitu sekvenssi sisältää merkin ja koetin sidotaan kiin-35 teään kantajaan. Tässä formaatissa merkitsemättömät koet- 106213 timet sidotaan membraaniin ja altistetaan merkitylle näytteelle sopivissa ankarissa hybridisointiolosuhteissa. Hyb-ridisoitumaton merkitty näyte poistetaan sitten pesemällä sopivissa ankarissa olosuhteissa, ja suodatin tutkitaan 5 sen jälkeen sitoutuneiden sekvenssien läsnäolon havaitsemiseksi. Koska lajien määrittäminen vaatii useiden lajispesifisten koettimien käyttöä jokaista amplfioitua näytettä kohti, tämän vaiheen edullinen koeformaatti on kään-teis-"dot blot"-formaatti.
10 Vaihtoehtoisesti voi olla toivottavaa käyttää osoi- tusmenetelmää, jossa on useita koettimen hybridisointi-paikkoja tai -kuopppia. Esimerkiksi kiinteä kantaja, sellainen kuten mikrotiitterilevy, on erityisen käyttökelpoinen näiden menetelmien suuren mittakaavan kliinisissä so-15 vellutuksissa. Menetelmiä PCR-amplifioidun DNA:n hybridi-soimiseksi/sieppaamiseksi tai kiinteitä kantajia tunnetaan. Eräässä näiden menetelmien suoritusmuodossa ampli-fioitu kohde-DNA merkitään (esim. biotiinilla) amplifikaa-tion aikana PCR-reaktiossa. Merkitty DNA siepataan spesi-20 fisesti hybridisoimalla PCR-tuote kohdespesifiseen oligo-nukleotidisieppauskoettimeen, joka on sidottu mikrotiitte-rilevyn kuoppaan. Sitoutunut tuote osoitetaan sopivasti käytetyn merkin tyypin mukaisesti. Esimerkiksi käytettäessä biotiinia merkkinä lisätään avidiini-HRP-kompleksia ja : 25 saatetaan reagoimaan joko (a) vetyperoksidisubstraatin ja O-fenyleenidiamiinikromogeenin (OPD) tai (b) vetyperoksidisubstraatin ja tetrametyylibentsidiinikromogeenin (TMB) kanssa. Kehittyy kolorimetrinen signaali mahdollistaen PCR-amplifioidun DNA:n kvantitatiivisen osoittamisen.
30 Kuten kliinisissä biokemiallisissa laboratorioissa on tehty, osoitusmenetelmät, joissa käytetään mikrotiitte-rilevykokeita, voidaan standardisoida useille erilaisille kohteille. Voi olla edullista käyttää osoituskoettimia, joiden pituus on vähemmän kuin 25 nukleotidiä. Lyhyemmät 35 koettimet minimoivat ristireaktiivisuuden mahdollisuuden 25 106213 ja ne ovat erityisen käyttökelpoisia suuren mittakaavan seulontamenetelmissä. Tämän mukaisesti esimerkissä 8 kuvataan edullinen menetelmä Mycobacterium-lajien osoittamiseksi mikrotiitterilevyformaatilla. Alan ammattimies huo-5 maisi, että koettimet, jotka ovat pitempiä kuin 25 nukleotidiä, sopivat yhtä hyvin mikrotiitterilevyosoitusmenetel-miin; kuitenkin voi olla tarpeen yksilöllisesti määrittää sopivat hybridisointi- ja ankaruusolosuhteet maksimaalisen spesifisyyden varmistamiseksi.
10 Toisessa sopivassa koejärjestelyssä lisätään mer kittyä koetinta PCR-amplifiointimenetelmän aikana. Mikä tahansa koetin, joka hybridisoituu kohde-DNA:han jokaisen synteesivaiheen aikana, hajotetaan sellaisen polymeraasin 5' -3 ' -eksonukleaasiaktiivisuudella, jota käytetään kataly-15 soimaan alukkeen pidennystä. Koettimen hajoamistuote osoitetaan sitten. Näin ollen hajoamistuotteen läsnäolo osoittaa, että hybridisoituminen koettimen ja kohde-DNA:n välillä tapahtui.
Tämä keksintö koskee myös testipakkauksia, useasäi-20 liöisiä yksikköjä, jotka käsittävät edellä kuvatun aluk-keiden parin. Käyttökelpoinen testipakkaus voi sisältää SSO-koettimia mykobakteerinukleiinihapon osoittamiseksi. Joissakin tapauksissa SSO-koettimet voidaan kiinnittää sopivaan kantajamembraaniin. Testipakkaus voi myös sisäl-: 25 tää alukkeita PCR-amplifikaatiota varten. Testipakkauksen muut mahdolliset komponentit käsittävät esimerkiksi kään-teistranskriptaasia tai polymeraasia, substraattinukle-osiditrifosfaatteja, keinoja merkitä (esimerkiksi avidii-ni-entsyymikonjugaatti ja entsyymisubstraatti ja kromogee-30 ni, jos leima on biotiini) tai havaita merkki sekä sopivia puskureita PCR-, käänteistranskriptio- tai hybridisaa-tioreaktioille. Edellä esitettyjen komponenttien lisäksi testipakkaus voi myös sisältää ohjeet keksinnön mukaisten amplifikaatio- ja osoitusmenetelmien suorittamiseksi.
26 106213
Keksinnön edullisessa suoritusmuodossa testipakkaukset mykobakteereiden osoittamiseksi voivat myös sisältää positiivisia ja negatiivisia kontrolleja. Edullisesti positiivinen kontrolli käsittää nukleiinihapposekvenssin, 5 joka on amplifioitavissa käyttämällä samaa alukeparia, jota käytetään amplifioimaan mykobakteerinukleiinihappoja koenäytteessä. Sellaisia menetelmiä positiivisen kontrollin käyttämiseksi tunnetaan, joissa sekä kohde, joka voi olla läsnä tai puuttua, että positiivinen kontrolli käyt-10 tävät samaa alukeparia. Edullisesti positiivinen kontrolli on suunniteltu niin, että tuote-DNA on kooltaan erilainen, helposti erotettavissa kohteen koosta.
Toisena näkökohtana tässä kuvataan positiivinen kontrolli, joka kykynee hybridisoitumaan koettimiin, su-15 vulle spesifisten mykobakteerikoettimien sekä lajispesifisten mykobakteerikoettimien osoittamiseksi. Esimerkissä 9 kuvataan positiivisen kontrollinukleiinihapon konstruoiminen.
Kuten tässä on kuvattu, voi olla toivottavaa käyt- 20 tää hyväksi toista amplifikaatiokohdetta, erityisesti sel vitettäessä epäselviä PCR- ja viljelmätietoja. Jos alan ammattimiehelle esitetään tässä kuvatut tiedot sisäisen positiivisen kontrollivektorin käytöstä, alan ammattimies voisi helposti huomata, että sisäisiä positiivisia kont-25 rolleja voitaisiin konstruoida lisää. Esimerkiksi positii vinen kontrolli voisi liittää alukekohtia sekä primääriseen (16S rRNA) että sekundääriseen kohteeseen (esim. 65 kDa:n proteiinigeeni) positiivisen kontrolli-DNA:n erillisen segmentin hybridisoimiseksi ja sen jälkeiseksi ampli-30 fioimiseksi.
: Alla esitetyt tämän keksinnön mukaiset esimerkit on tarkoitettu ainoastaan havainnollistamaan eikä rajoittamaan keksinnön suojapiiriä.
« .
27 106213
Esimerkki 1 Näytteen valmistus
Nukleiinihapot eristetään yskösnäytteistä käyttäen IsoQuick™-järjestelmää, joka on kaupallisesti saatavil-5 la MicroProbelta. Noin 10 ml yskösnäytettä nesteytetään/-disinfektoidaan, pelletoidaan sentrifugoimalla ja suspen-doidaan uudelleen noin 1 ml:aan puskuria BSA:n kanssa. Tästä näytteestä 200 - 500 μΐ sentrifugoidaan bakteerei-den pelletoimiseksi. Pelletit suspendoidaan uudel-10 leen 100 μΐ:aan näytepuskuria A, liuotetaan sen jälkeen 100 μΐ-.lla. liuotusreagenssia 1. Lysaatit uutetaan sitten 7 tilavuudella reagensseja 2 ja 4 tilavuudella reagenssia 3 (reagenssit 1, 2 ja 3 yhdessä näytepuskurin A kanssa toimitetaan IsoQuick™-järjestelmän mukana). Näyte sent-15 rifugoidaan ja jälkeenpäin lisätään 1/3 tilavuutta 10 M NH4Ac:a vesifaasiin ja DNA saostetaan yhtä suurella tilavuudella isopropanolia. Pelletoitu DNA pestään 70-%:isella EtOH:lla, kuivataan ilmassa ja suspendoidaan uudelleen 100 μΐ^βη TE:tä, pH 8,0. 50 μ1:η tilavuus kutakin 20 DNA-valmistetta käytetään amplifikaatioreaktiossa.
Esimerkki 2
Mykobakteeri-DNA:n amplifikaatio Pääreagenssiseos valmistetaan niin, että jokainen reaktio sisältää seuraavat reagenssit: 25 pmol kuta-25 kin aluketta, 10 nmol kutakin dNTP:tä, 2X PCR-puskuria (10X puskuri = 500 mM KCl, 500 mM Tris-HCl, pH 8,9, 20 mM MgCl2) , 3 yksikköä Taq-polymeraasia, 2 yksikköä UNG:tä ja H20:tä, jotta saadaan 50 μ1:η reaktioseos reaktiota kohti. Tämä pääseos peitetään 50 μ1:11& mineraaliöljyä, ja 30 DNA-näyte lisätään reaktioseokseen öljykerroksen alle. Jos : on tarpeen, lisätään H20:tä 100 μ1:η kokonaisreaktiotila- vuuden saamiseksi.
DNA amplifioidaan Perkin Elmer Thermal Cyclerissä. Thermal Cycler ohjelmoidaan käymään läpi 37 kierrosta de-35 naturointia, alukkeen liittämistä ja alukkeen pidentämis- 28 106213 ta, kaksi kierrosta 98 °C:ssa, 62 °C:ssa ja 72 °C:ssa kussakin yhden minuutin ajan, joita seuraa 35 kierrosta 94 °C:ssa, 62 °C:ssa ja 72 °C:ssa yhden minuutin ajan kussakin. Perkin Elmer Thermal Cycler ohjelmoidaan liuotta-5 maan näytteitä 72 °C:ssa epämääräisen ajan viimeisen kierroksen jälkeen varmistamaan, että lopullinen pidentäminen on mennyt loppuun ja pitämään UNG-entsyymi inaktiivisena, jos käytetään UNG-puhdistusjärjestelmää. Amplifikaatio-tuotteet voidaan sitten analysoida geelielektroforeesilla 10 ja/tai "dot blot" -hybridisaatiolla. Jos suoritetaan analyysi geelielektroforeesilla, lisätään noin 10 μΐ 10X näy-tepuskuria (0,25 % ksyleenisyanolia, 0,25 % bromifenoli-sinistä, 25 % Ficollia) ja mineraaliöljy uutetaan ja Taq-polymeraasi inaktivoidaan 100 ^l:lla kloroformia.
15 Esimerkki 3 "Dot blot"-formaatti
Amplifiodun näytteen alkuseulonta osoittaa Mycobac-teriumin nukleiinihapon läsnäolon. "Dot blot"-formaatissa pieni osa amplifioitua DNA:ta denaturoidaan, laitetaan 20 nailonsuodattimelle ja immobilisoidaan kuten alla kuvataan. Suodatin upotetaan sitten koetinliuokseen hybridi-soitumisen yhteen merkityistä koettimista mahdollistamiseksi. Jokainen koettimista voidaan merkitä radioaktiivi-sesti, mutta voidaan myös käyttää koettimia, jotka on ko-25 valenttisesti konjugoitu piparjuuriperoksidaasiin (HRP) ei-isotooppisen osoittamistavan tarjoamiseksi kromogeeni-sen tai kemiluminesenssisubstraatin läsnäollessa. Immobi-lisoitu kohde-DNA hybridisoidaan kahden suvulle spesifisen koettimen KY101 ja KY102 seokseen. Koska tutkittavien 30 näytteiden lukumäärän oletetaan ylittävän suuresti koetti-: men lukumäärän (kahden koettimen yksi seos), "dot blot" -formaatti on tarkoituksenmukaisin tätä alkuseulontaa varten. Suuri määrä erilaisia näytteitä voidaan hybridisoida erillisille kohdille yksittäisessä kiinteässä kantajassa 29 106213 ja samanaikaisesti altistaa merkityille koettimille upottamalla kantaja koetinlluokseen.
Amplifikaatio suoritetaan kuten esimerkissä 2. PCR-tuote denaturoidaan sitten käsittelemällä alkalilla.
5 5/il:aan PCR-tuotetta lisätään 5 μΐ 0,5 M EDTA:a, pH 8,0, 8 μΐ 5 N NaOH:a ja 82 μΐ H20:tä. Seoksen annetaan seisoa huoneenlämpötilassa 10 minuuttia täydellisen denaturoitu-misen aikaansaamiseksi.
BioDyne™B-nailonsuodattimet (PallCorp., Glen Cove, 10 NY) valmistetaan upottamalla H20:een 5-10 minuutiksi ja edelleen huuhtelemalla 200 μΐ.-lla H20:tä sen jälkeen kun "dot blot"-monistaminen (Bio-Dot™ Bio Radilta, Richmond, CA) on suoritettu. Denaturoinnin jälkeen 100 μΐ näyte-seosta laitetaan vakuumissa nailonmembraanille käyttäen 15 "dot blot" -laitetta. Jokainen kuoppa huuhdellaan sitten 200 μΐ-.lla 0,4 N NaOH:a, sen jälkeen huuhdellaan nopeasti 2X SSCrllä ja kuivataan ilmassa kunnes jäljellä ei ole nestettä. DNA immobilisoidaan ja ristisidotaan nailonsuo-dattimelle ultraviolettisäteilytyksellä 1 200 mJ/cm2:n 20 vuolla Stratalinker™-UV-valolaatikolla (Stratagene, La Jolla, CA) ("autoristisidonta"-asetuksella).
Suodattimet "esihybridisoidaan" upottamalla hybridi saat iopuskur iin (0,5X SSC, 5X Denhardtin liuosta, 0,1 % SDS, 50 μg/ml lohensperman DNA:ta) lämmöllä suljettavissa 25 pakkauksissa 60 °C:ssa (ilmaravistin) vähintään 30 minuutin ajan. Jos käytetään radioaktiivisesti merkittyjä koet-timia, puskuri korvataan tällöin yhtäsuurella määrällä samaa liuosta, joka sisältää 1 x 106 cpm koetinta, ja suodattimen annetaan hybridisoitua 2 tunnista yön yli 30 60 °C:ssa.
: Hybridisoinnin jälkeen suodattimet pestään kolme kertaa 2X SSC/0,1 % SDS:ssa, kahdesti 20 minuutin ajan huoneenlämpötilassa ja sen jälkeen kerran 20 minuutin ajan ankarassa lämpötilassa 71 °C ravistettavassa vesihautees-35 sa. Suodattimet kuivataan sen jälkeen imupaperilla kuivik- 30 106213 si, kääritään muovikääreeseen ja valotetaan röntgenfilmil-le -70 °C:ssa yhden tai kahden vahvistuslevyn avulla.
Toinen mahdollinen tapa näkyväksi tekemiselle on hybridisoida piparjuuriperoksidaasilla konjugoitujen oli-5 gonukleotidikoettimien kanssa, jotka on valmistettu kuten Levenson ja Chang, 1989, teoksessa PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, (toimittajat Innis et ai., Academic Press. San Diego), sivut 92 - 112 ja Saiki et ai., 1988, N. Eng. J. Med. 319:537 - 541 ovat kuvanneet. 10 Hybridisointi suoritetaan 2 pmoolilla HRP-SSO-koetinta 5 ml:aa hybridisointiliuosta kohti.
Pesemisen jälkeen suodattimet, jotka on määrä kehittää kromogeenisella värisubstraatilla, huuhdellaan 100 mM natriumsitraatissa, pH 5,0, laitetaan sen jälkeen 15 100 mM natriumsitraattiin, pH 5,0, joka sisältää 0,1 mg/ml 3,3' ,5,5'-tetrametyylibentsidiiniä millilitraa kohti (Flu-ka) ja 0,0015 prosenttista vetyperoksidia, ja inkuboidaan varovasti sekoittaen 10 - 30 minuuttia huoneenlämpötilassa. Kehitetyt suodattimet huuhdellaan vedessä ja kuvataan 20 välittömästi. TMB-osoitusjärjestelmä valmistetaan ja sitä käytetään olennaisesti kuten AmpliType® DQalpha DNA-tyypitys -testipakkauksessa on kuvattu, jonka on kehittänyt ja valmistanut Hoffman-La Roche ja joka on saatavilla Perkin Elmeriltä. Toisessa suoritusmuodossa suodattimet kehite-25 tään kemiluminesenssiosoitusjärjestelmällä (ECL; Amersham; Arlington Heights, IL). Suodattimet huuhdellaan PBS:ssa 5 minuuttia ja laitetaan ECL-liuokseen 1 minuutiksi varovasti sekoittaen. Suodattimet valotetaan sitten röntgen-filmille huoneenlämpötilassa 1-5 minuuttia.
3 0 Esimerkki 4 : Käänteis-"dot blot"-formaatti
Lajien identifiointi vaatii jokaisen näytteen altistamisen erilaisille lajispesifisille koettimille; identtisyys osoitetaan sillä, mitkä koettimista sitoutuvat 35 näyte-DNA:hän. Koska jokainen näyte altistetaan useille « 31 106213 koettimille, käärit ei s-"dot blot"-formaatti on tarkoituksenmukaisempi. Koettimet kiinnitetään erillisille paikoille membraanilla ja sen jälkeen koko membraani upotetaan liuokseen, joka sisältää amplifioidun kohde-DNA:n, jotta 5 hybridisoituminen membraaniin sitoutuneisiin koettimiin on mahdollista. Käänteis-"dot blot"-menetelmä on kuvattu yhtä aikaa vireillä olevissa hakemuksissa nrot 197 000 ja 347 495, julkaisussa Proc. Natl. Acad. Sei. 86:6230 -6234, 1989, Saiki et ai. ja AmpliTypeR DQalpha DNA-tyypi-10 tys-testipakkauksessa, jonka on kehittänyt ja valmistanut
Hoffmann-La Roche, ja joka on saatavana Perkin Elmerin kautta. Amplifikaatioalukkeet biotinyloidaan, kuten Leven-son ja Chang, 1989, supra, ovat kuvanneet, niin että mikä tahansa amplifioitu DNA, joka hybridisoituu membraaniin 15 sidottuihin koettimiin, voidaan osoittaa helposti.
Eräässä suoritusmuodossa osoittaminen suoritetaan saattamalla streptavidiiniin konjugoitu piparjuuriperoksi-daasi (SA-HRP) reagoimaan minkä tahansa biotinyloidun (alukkeiden kautta), amplifioidun DNA:n kanssa, joka on 20 hybridisoitunut membraaniin sitoutuneeseen koettimeen.
Näin HRP sitoutuu SA-biotiinivuorovaikutuksen välityksellä amplifioituun DNA:hän, ja sitä voidaan käyttää muodostamaan signaali erilaisilla hyvin tunnetuilla menetelmillä, sellaisilla kuten muodostamalla värillinen yhdiste, esim. 25 hapettamalla tetrametyylibentsidiini (ks. US-patenttijul- kaisu nro 4 789 630).
Vaikka koetin voidaan kiinnittää membraaniin millä tahansa menetelmällä, edullinen menetelmä käsittää oligo-nukleotidikoettimen hybridi soi tuvan alueen "hännittämisen" 30 paljon pitemmällä poly-dT-sekvenssillä. Näin saatava poly-: dT-"häntä" voidaan sitten saattaa reagoimaan nailonmemb- raanilla olevien amiiniryhmien kanssa koettimen kiinnittämiseksi kovalenttisesti membraaniin. Tätä reaktiota voidaan helpottaa UV-säteilytyksellä.
32 106213
Terminaalista deoksiribonukleotidyylitransferaasia (TdT, Ratliff Biochemicals, alla esitettyihin reaktioihin käytetään konsentraatiossa, joka on noin 120 yksikköä/μΐ, joka on 100 pmoolia/μΐ) voidaan käyttää muodostamaan poly-5 dT-häntä koettimeen, vaikka hännitetty koetin voidaan myös syntetisoida kaupallisesti saatavalla DNA-syntetisaatto-rilla. Käytettäessä DNA-syntetisaattoria hännitetyn koettimen valmistamiseksi tulisi häntä kuitenkin liittää koettimen 5'-päähän, niin että ei-toivottu ennenaikainen ket-10 jun päättyminen tapahtuu pääasiallisesti hännän alueella.
TdT-reaktiot tulisi suorittaa noin 100 μ1:η tilavuudessa sisältäen IX TdT-suoloja, 200 pmoolia oligo-nukleotidia, 800 μΜ DTT:tä ja 60 yksikköä TdT:tä. 10X TdT-suolat ovat 1 000 mM K-kakodylaattia, 10 mM CoCl2:a, 15 2 mM ditiotreitolia, 250 mM Tris-Cl:a, pH 7,6, ja se val mistetaan kuten Roychoudhury ja Wu-julkaisussa Meth. Enzymol. 65:43 - 62 ovat kuvanneet, ja johon tässä vii tataan. Voidaan valmistaa 8 mM dTTP:n 10X-varastoliuos (neutraloitu pH ihon 7 NaOHilla) mukavuuden vuoksi.
20 TdT-reaktio tulisi suorittaa 37 °C:ssa kaksi tuntia ja sen jälkeen pysäyttää lisäämällä 100 μΐ 10 mM EDTA:a, pH 8. Hännitetyn oligonukleotidin lopullinen konsentraatio on 1 μΜ (1 pmoolia/μΐ) ja homopolymeerihännän pituus on noin 400 tähdettä. Hännän pituutta voidaan muuttaa säätä-25 mällä dTTP:n molaarista suhdetta oligonukleotidiin. Hänni-tettyjä koettimia voidaan varastoida -20 °C:ssa käyttöön asti.
Edullinen nailonmembraani käänteis-"dot blot"-formaattia varten on Biodyne™B-nailonmembraani, 0,45 mikronin 30 huokoskoko, valmistaja Pali ja jota myös myy ICN BioTrans" : ™-nailonmembraanina. Koettimet voidaan spotata membraanil- le erittäin tarkoituksenmukaisesti Bio-Dot™-"dot blot"-laitteella, jota valmistaa BioRad. Jokainen koetin spota-taan ainutkertaiseen, erilliseen kohtaan membraanilla. 35 Noin 2 -10 pikomoolia jokaista hännitettyä koetintä sekoi- • 33 106213 tetaan ensiksi 50 - 100 μ1:η kanssa TE-puskuria, ennen kuin sitä laitetaan "dot blot"-laitteeseen. "Dot blottauk-sen" jälkeen membraani laitetaan lyhyeksi aikaa absorbtio-paperille ylimääräisen liuoksen poisvetämiseksi. Sen jäl-5 keen membraani laitetaan UV-valolaatikon sisälle, sellaisen kuten Stratalinker™-valolaatikko, jota valmistaa Stra-tagene, ja se altistetaan 50 - 60 millijoulea/cm2:n vuolle 254 nm:ssä kiinnittämään hännitetty koetin nailonmembraa-nille. Nopean huuhtomisen jälkeen (noin 15 minuuttia hyb-10 ridisointiliuoksessa) sitoutumattoman koettimen poistamiseksi, membraani on valmis hybridisoitavaksi biotinyloi-dun PCR-tuotteen kanssa.
Amplifioidut PCR-tuotteet denaturoidaan kuumentamalla 95 °C:seen 3-10 minuutiksi, ja 40 μΐ denaturoitu-15 nutta PCR-tuotetta lisätään jokaiseen koetinpaneeliin hyb-ridisointia varten. Hybridisointi suoritetaan 57 °C:ssa 20 minuutin ajan ravistaen vesihauteessa hybridisointi-puskurissa, joka muodostuu 0,5X SSCrstä, 0,25 % SDS:stä ja 5X Denhardtin liuoksesta. Hybridisointipuskuri kor-20 vataan 3 ml :11a liuosta, joka muodostuu 25 μl:sta SA-HRP:a, joka on kaupallisesti saatavana Perkin Elmeriltä, 3,1 mlrssa hybridisointipuskuria, ja inkuboidaan 20 minuuttia 57 °C:ssa ravistaen vesihauteessa.
Peseminen suoritetaan pesupuskurissa, jossa on 25 2X SSC:tä ja 0,1 % SDS:ää. Membraanin nopean huuhtelemisen jälkeen 10 ml:ssa pesupuskuria suoritetaan 12 minuutin voimakas pesu 10 ml:ssa puskuria 57 °C:ssa. Toinen 5 minuutin pesu huoneenlämpötilassa suoritetaan sen jälkeen, jota seuraa 5 minuutin pesu 10 mlrssa 0,1 M natriumsit-30 raattia, pH 5,0.
: Kromogeenin sitominen suoritetaan 5 mlrssa kromo- geeniliuosta, joka muodostuu 5 mlrsta 0,1 M natriumsit-raattia, 5 μlrsta 3-%rista vetyperoksidia ja 0,25 mlrsta kromogeenia (TMB Perkin Elmeriltä) 25-30 minuuttia huo-35 neenlämpötilassa. Kolme 10 minuutin pesua tislatussa ve- • 34 106213 dessä suoritetaan huoneenlämpötilassa. Jälkipesu IX PBS:llä huoneenlämpötilassa 30 minuutin ajan voi voimistaa signaalin laatua. Niiden vaiheiden aikana, joissa kromo-geenia on läsnä, membraanin tulisi olla suojattu valolta 5 aluminiumkalvopäällyksellä. Kehitetty membraani tulisi valokuvata pysyväksi tallenteeksi.
Esimerkki 5
Mykobakteerien DNA:n osoittaminen
Mykobakteerien DNA:n osoittaminen suoritettiin amp-10 lifioimalla suvulle spesifisten alukkeiden KY18 (SEQ ID NO: 1) ja KY75 (SEQ ID NO: 2) biotinyloitujen muotojen kanssa käyttämällä edellä esimerkissä 2 kuvattua menetelmää, jota seurasi hybridisointi suvulle spesifisiin koettimiin KY101 (SEQ ID NO: 3) ja KY102 (SEQ ID NO:4) käyttämällä 15 edellä esimerkissä 3 kuvattua "dot blot"-koetta. Ylävirran alukkeen KY18 (SEQ ID NO:l) ja alavirran alukkeen KY75 (SEQ ID NO:2) hybridisoituvien alueiden sekvenssit on esitetty taulukossa 1 edellä. Suvulle spesifisten alukkeiden KY101 (SEQ ID NO: 3) ja KY102 (SEQ ID NO:4) hybridisoitu-20 vien alueiden sekvenssit on esitetty taulukossa 2 edellä.
Suvulle spesifisiä alukkeita KY18 (SEQ ID NO.l) ja KY75 (SEQ ID NO.2) käytettiin polymeraasiketjureaktioamp-lifikaatioissa (PCR) amplifioimaan nukleiinihappo 15:sta Mycobacterium-lajista. Tulokset on esitetty taulukossa 4. 25 Kuten oletettiin KY18 (SEQ ID NO. D/KY75 (SEQ ID NO. 2) amplifioi DNA:n kaikista muista Mycobacterium-lajeista paitsi M. simiaesta. M. simiaen tai M. chitaen DNA:n amplif ioitumista ei odotettu, koska KY75:n (SEQ ID NO.2) 3'-pään emäksistä neljä viidestä eroaa M. simiaesta 30 ja 3'-pään emäksistä kaksi eroaa M. chitaesta. Koska : M. simiaen liittyminen ihmisen sairauteen on kuitenkin ra portoitu harvoin, osoittaminen ei ole kliinisesti tärkeää. Poikkeuksena M. xenopin ja M. terraen DNA, kaikki hybrid-isoitunut amplifioitu mykobakteerien DNA osoitettiin hyb- 35 106213 ridisoimalla suvulle spesifisiin koettimiin KY101 (SEQ ID NO.3) ja KY102 (SEQ ID NO.4).
Taulukko 4 5 Erilaisista mykobakteerilajeista peräisin olevan DNA.: n amplifikaatio ja hybridisointi suvulle spesifisiin koettimiin
Mykobakteeri Amplifikaatio Hybridisoituminen M. tuberculosis + + M. scrofulaceutn + + M. fortuitum + + M. avium + + M. kansasii . + + M. intracellulare + + M. phlei + + M. smegmatis + + M. marinutn + + M. favescens + + 20 M. xenopi + M. simiae M. chelonae + + M. gordonae + + M. terrae + 25 Näiden alukkeiden spesifisyys testattiin yrittämällä amplifioida DNA 22 erilaisesta ei-mykobakteerila-jista. Amplifikaatiotuotteita saatiin vain Corynebacter Diptheriaen ja Corynebacter xerosisin, Nisseria siccain ja 3 0 Propionibacterium acnesin DNA: sta. Nämä amplifikaatiotuot-: teet eivät kuitenkaan hybridisoituneet suvulle spesifisten koettimien kanssa, niin että ei saatu yhtään vääriä positiivisia tuloksia. Testatut organismit on esitetty taulukossa 5 alla.
36 1 0 6 2 1 3
Taulukko 5
Ei-mykobakteeriorganismeista peräisin olevan DNA:n ampli-fikaatio
Organismi Amplifikaatio Hybridisoituminen 5
Bordatella pertussis Borrelia burgdorferi
Corynebacter diphtheriae +
Corynebacter xerosis + 10 Enterobacter aerogenes
Escherichia coli Haemophilus influenzae Klebsiella pneumoniae Legionella pneumophila 15 Neisseria gonorrhea
Neisseria meningitidis Nisseria sicca +
Propionibacterium acnes +
Psuedomonas aeruginosa 2 0 Salmonella typhimurium
Serratia marcescens Staphylococcus aureus Streptococcus agalactiae Streptococcus pyogenes • 2 5 Streptomyces hygrocopicus
Streptomyces rubiginosis Treponema pallidum
Esimerkki € 30 Lajien identifiointi
Kun mykobakteerien nukleiinihappo on osoitettu kliinisessä näytteessä, se laji, josta nukleiinihappo on peräisin, voidaan määrittää hybridisaatiolla lajille spesifisten koettimien kanssa käyttäen esimerkin 4 mukaista 35 käänteis-"dot blot"-formaattia. Kliinisesti mielenkiintoi- 37 106213 set lajit, jotka on määrä osoittaa tällä järjestelyllä, ovat M. avium, M. intracellulare, M. kansasii ja M. tuberculosis. Lisäksi M. gordonaen osoittaminen on toivottavaa, koska tämä organismi löydetään usein kliinisistä 5 näytteistä.
Kuvassa 1 esitetään taulukossa 3 esitetyistä koet-timista valittujen lajispesifisten koettimien spesifisyys-kokeen tulokset. Jokaisen koettimen hybridisoituvan alueen sekvenssi yhdessä oletetun spesifisyyden kanssa on esitet-10 ty taulukossa 3 edellä. Amplifioituja tuotteita 13 erilaisen Mycobacterium-lajin puhdisteusta DNA:sta käytettiin testaamaan sekä suvulle spesifisten että lajispesifisten koettimien spesifisyyttä. Jokaiselle lajille amplifioitiin 1 pg DNA:ta, joka oli puhdistettu viljellyistä bakteereis-15 ta (noin 300 bakteerigenomin ekvivalentti), kuten esimerkissä 2, käyttäen biotinyloituja alukkeita. Koettimen hyb-ridisoitumisen havaitseminen suoritettiin käyttäen esimerkin 4 mukaista käänteis-"dot blot"-formaattia. Amplifioi-dun DNA:n läsnöolon positiiviseksi kontrolliksi sisälly-20 tettiin suvulle spesifisiä koettimia koeliuskoille yhdessä lajispesifisten koettimien kanssa.
Esimerkki 7
Mykobakteerien 16S rRNA:n amplifikaatio 16S rRNA voidaan amplifioida ensin muodostamalla • 25 cDNA käänteistranskriptiolla ja amplifioimalla cDNA. Käy tetään samoja alukkeita kuin esimerkissä 2 edellä. Tässä esimerkissä sekä korkeassa lämpötilassa tapahtuva kään-teistranskriptio että PCR-amplifikaatio suoritetaan lämpö-stabiilin Tth-polymeraasin kanssa.
30 Käänteistranskriptio suoritetaan 20 μ1:η tilavuu dessa sisältäen seuraavat komponentit: 8 μΐ H20:tä, 2 μΐ 10X RT-reaktiopuskuria (100 mM Tris-HCl, pH 8,3 ja 900 mM KC1) , 2 μΐ 10 mM MnCl2:a, 2 μΐ dNTP-liuosta (2 mM jokaista dATP, dCTP, dGTP ja dTTP H20:ssä, pH 7,0), 2 μΐ "alavirran" 35 aluketta (7,5 mM H20:ssä), 2 μΐ 0,18 μΜ Tth-polymeraasia 38 1 0 6 2 1 3
IX varastopuskurissa (20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM
KC1, 0,1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0,2 % Tween 20 (Pierce Surfactants), 50 % (til./til.) glyseroli) ja 2 μΐ templaatti-RNA-liuosta (<250 ng 10 mM Tris-HCl:ssa ja 1 mM EDTA:ssa).
5 Kaikki liuokset, jotka eivät sisällä Trisiä käsitellään dietyylipyrokarbonaatilla (DEPC) kaiken kontaminoivan ri-bonukleaasin poistamiseksi, kuten Maniatis et ai. teoksessa Molecular Cloning, a Laboratory Manual (Cold Springs Harbor Laboratory, New York), 1982, sivulla 190 ovat ku-10 vanneet. Käänteistranskriptio suoritetaan 72 °C:ssa 5 minuutin ajan termosyklerissä. Reaktio pysäytetään jäähdyttämällä reaktioseos 4 °C:seen jäällä.
PCR-amplifikaatio suoritetaan seuraavilla lisätyillä reagensseilla: 2 μΐ jäljellä olevaa aluketta (7,5 mM
15 H20: ssä) , 2 μΐ dNTP-liuosta (10 mM jokaista dATP, dCTP, dGTP ja dTTP H20:SSä, pH 7,0), 8 μΐ 10X PCR-reaktiopuskuria (100 mM Tris-HCl, pH 8,3, 1 mM KCl, 18,75 mM MgCl2, 7,5 mM EGTA ja 50 % (til./til.) glyseroli) ja 68 μΐ DEPC:llä käsiteltyä H20:tä. Nukleiinihappo amplifioidaan Perkin Elmer 20 Thermal Cyclerissä käyttäen samaa lämpöprofiilia kuin esimerkissä 2. Amplifioitu tuote analysoidaan kuten aikaisemmissa esimerkeissä.
Esimerkki 8
Mikrotiitterilevykoe Mycobacteriumien osoittamisek- * 25 si Tässä keksinnön suoritusmuodossa koetin kiinnitetään mikrotiitterilevyn kuoppaan. Amplifioitu kohde-DNA hybridisoidaan sidottuun koettimeen kuten edellä on kuvattu. Kuten edellisessä esimerkissä amplifikaatioalukkeet 30 biotinyloidaan sidottuihin koettimiin hybridisoituvan amplif ioidun DNA:n osoittamisen mahdollistamiseksi.
BSA:iin konjugoituneiden haluttujen koettimien annettiin ensin adsorboitua yksittäisten kuoppien muovipinnoille. Kuopat blokattiin sitten proteiinilla, sellaisella 39 106213 kuten naudan seerumin albumiini. Edullisesti käytetään 96-kuoppaisia lyvyjä, joita saadaan Corningilta.
Sen jälkeen kun amplifikaatio on suoritettu loppuun, PCR-putket poistettiin termosykleristä (Perkin 5 Elmer). 100 mikrolitraa denaturointiliuosta lisättiin jokaiseen PCR-putkeen. Kutakin putkea varten käytetään uutta pipetin kärkeä. Eräässä suoritusmuodossa osoittamista ei voida suorittaa heti. Siinä tapauksessa PCR-putkia säilytettiin yön yli 2-8 °C:ssa. Denaturoidut amplifikaatio-10 reaktioseokset muuttuvat viskooseiksi varastoitaessa 2 -8 °C:ssa. Putkia lämmitettiin nopeasti 25 - 30 °C:ssa ennen niiden aukaisemista pipetoinnin helpottamiseksi.
Sopiva määrä kahdeksankuoppaisia mikrotiitterilevy-liuskoja (vähintään 2 liuskaa) poistettiin ja asetettiin 15 mikrotiitterilevykehykseen. 100 mikrolitraa hybridisointi-puskuria pipetoitiin mikrotiitterilevyn jokaiseen kuoppaan.
Denaturointiliuos sisältää 0,4 M NaOH:a; 80 mM EDTA:a ja 0,005 % Thymol-sinistä. Hybridisointi/neutra-2 0 lointipuskuri sisältää: 3 M NaSCN:a; 80 mM NaH2P04:a; 10 mM NaH2P04:a ja 0,125 % Tween 20:tä. Ennen käyttöä pH:n tarkastetaan olevan 5,0+/-0,2.
Käyttäen päistään suljettavaa monikanavaista pipettiä 25 μΐ denaturoitunutta amplifikaatioreaktioseosta * 25 jokaisesta tarjottimella olevasta PCR-putkesta pipetoitiin vastaavaan kuoppakohtaan mikrotiitterilevyllä. Levy peitettiin mikrotiitterilevykannella ja sitä kopautettiin varovasti sivulta 10 - 15 kertaa. Ne kuopat, joihin on suoritettu oikea reagenssien pipetointi, muuttuvat väril-30 tään vaalean keltaisiksi. Jollei havaita ollenkaan muutos-.· ta tai havaitaan vain yksittäinen muutos siniseen väriin, on lisätty ylimäärin amplikonia. Koetta jatketaan, niin kauan kuin positiiviset OD-arvot kasvavat, mutta negatiiviset OD-arvot eivät muutu. Levyä inkuboitiin 60 minuuttia 35 37 °C:ssa. Alkuhybridisäätiön jälkeen 37 °C:ssa yhden tun- 40 106213 nin ajan hybridisaatio/neutralointipuskuri poistettiin ja korvattiin samalla puskurilla, ja levyä inkuboitiin lisää 15 minuuttia 37 °C:ssa.
Inkuboinnin jälkeen levyä pestiin viisi kertaa pe-5 suliuoksella. Levyn pesu voidaan suorittaa käsin tai automatisoidulla asianmukaisesti ohjelmoidulla mikrotiitteri-levypesurilla. Pesua varten käytettiin IX PCR-pesupusku-ria. 10X PCR-pesupuskurikonsentraatti valmistettiin seuraavasti: 9,94 grammaa litraa kohti kaksiemäksistä nat- 10 riumfosfaattia; 4,41 grammaa litraa kohti natriumfosfaat-tia (yksiemäksinen); 3,722 grammaa litraa kohti EDTA:a; 87,66 grammaa litraa kohti natriumkloridia; 13,7 grammaa litraa kohti Tween 20:tä ja 10 grammaa litraa kohti Pro Clin 300:aa (Rohm ja Haas; Philadelphia, PA). Liuoksen pH 15 säädetään fosforihapolla (pH 6,5 - 7,1 on edullinen).
Käsin suoritettavaa pesua varten levyn sisältö tyhjennettiin ja ravistettiin kuivaksi. 300 mikrolitraa pesu-liuosta lisättiin levyn jokaiseen testattavaan kuoppaan ja levyn annettiin kuivua 15 - 30 sekuntia. Levy tyhjennet-20 tiin jälleen ja ravistettiin kuivaksi. Tätä pesuprosessia toistettiin neljä kertaa lisää.
Automatisoidussa mikrolevypesurissa käytettiin seu-raavaa menetelmää. Kuoppien sisältö ilmastettiin. Pesuri ohjelmoitiin lisäämään 350 mikrolitraa työpesuliuosta jo-• 25 kaiseen testattavaan levyn kuoppaan ja niitä liuotettiin 30 sekuntia ja ilmastettiin. Vaiheita toistettiin neljä kertaa lisää. Sen jälkeen levy ravistettiin kuivaksi.
100 mikrolitraa konjugaattia lisättiin jokaiseen testattavaan levyn kuoppaan. Avidiini-HRP-konjugaatti val-30 mistetaan seuraavasti. Laimennettu aine sisältää 0,1 mo-, laarista; 0,25 % Emulsit 25:tä (DKS International, Inc.,
Tokio, Japani), 1,0 % Kathon CG:tä (Rohm ja Haas, Philadelphia, PA) , 0,1 % fenolia, 1,0 % naudan gammaglobuliinia. Liuoksen pH säädettiin 7,3 reen konsentroidulla 35 HClrlla. Tähän laimennettuun aineeseen lisättiin 10 nM
41 106213 konjugoitua avidiinia (Vector Labs, Burlingame, CA). Levy peitettiin sen jälkeen ja sitten sitä inkuboitiin 50 minuuttia 37 °C:ssa ja jälleen pestiin kuten edellä on kuvattu. Työsubstraatti valmistettiin sekoittamalla 2,0 ml 5 substraattia A ja 0,5 ml substraattia B jokaista kahden 8-kuoppaisen mikrotiitterilevyliuskan monikertaa (16 koetta) varten. Substraatti A sisältää 3 mM vetyperoksidia, 6,5 mM sitraattia ja 0,1 % Kathon CG:tä. Substraatti B sisältää 4,2 mM 3,3',5,5'-tetrametyylibentsidiiniä ja 40 % 10 dimetyyliformamidia. Työsubstraatti valmistettiin aikaisintaan kolme tuntia ennen käyttöä ja sitä säilytettiin suojassa suoralta auringonvalolta.
100 mikrolitraa työsubstraattia (substraattien Aja B seos) lisättiin jokaiseen testattavaan levyn kuoppaan. 15 Levy peitettiin sen jälkeen ja sitä inkuboitiin pimeässä 10 minuuttia huoneenlämpötilassa (20 - 25 °C). 100 mikro-litraa Stop-reagenssia (5 % H2S04) lisättiin jokaiseen testattavaan kuoppaan. Jokaisen kuopan absorbanssi 450 nm:ssä luettiin yhden tunnin sisällä Stop-reagenssin lisäämises-20 tä. Absorbanssiarvo rekisteröitiin näytteelle ja kontrollille.
Esimerkki 9
Mykobakteerien nukleiinihappojen amplifiointi- ja osoittamismenetelmissä käyttökelpoisen positiivisen kont-* 25 rollivektorin konstruointi
Syntetisoitiin oligonukleotidejä, jotka sisältävät lajispesifisiä koettimeen sitoutuvia sekvenssejä sekä niiden komplementtejä (KY178[SEQ ID NO. 24]-KY181[SEQ ID NO. 27] alla). (Nämä oligonukleotidit sisältävät tunnistuskoh-30 tia restriktioentsyymeille kummassakin päässä helpottamaan kloonausta.) Yksi mikrogramma kumpaakin KY178 (SEQ ID NO. 24) ja KY179 (SEQ ID NO. 25) tai KY180 (SEQ ID NO. 26) ja KY181 (SEQ ID NO. 27) yhdistettiin, kuumennettiin 5 minuuttia 98 °C:ssa, jonka jälkeen inkuboitiin yksi tunti 35 75 °C:ssa komplementaaristen säikeiden toisiinsa liitty- 42 106213 misen mahdollistamiseksi. Toisiinsa liitetyt tuotteet erotettiin jäljelle jääneistä yksisäikeisistä oligonukleoti-deistä elektroforeesilla 3 % Nusieve (FMC Products)/1 % agaroosigeelin läpi. Kaksisäikeisten tuotteiden vyöhykkeet 5 leikataan irti ja DNA eluoidaan. DNA-fragmentit pilkotaan sen jälkeen sopivilla restriktioentsyymeillä ja ligatoi-daan toisiinsa. Ligaatiotuotteet eristetään Nusieve/aga-roosigeelistä kuten edellä on esitetty.
Valmistettiin vastaanottava vektori. Vastaanottava 10 vektori oli plasmidi, johon M. tb 16S rRNA-geenin fragmentti, joka sisälsi alukkeen ja koettimen sitomiskohdat, on insertoitu ja se valmistettiin seuraavasti.
50 pikogrammaa M. tuberculosisin DNA:ta amplifioi-tiin käyttäen alukkeita KY70 (SEQ ID NO. 28) ja CR01 (SEQ 15 ID NO. 29) 50 pmol:n CR01:tä (SEQ ID NO. 29), 80 pmolm KY70:tä (SEQ ID NO. 28), 20 nmol:n kutakin dNTPitä, 2,5 yksikön Taq-polymeraasia ja 1 X PCR-puskuria (50 mM Tris-HCl, pH 8,9; 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl2) läsnäollessa kokonaisreaktiotilavuudessa 100 mikrolitraa. Termiset 20 kierrätysolosuhteet ovat kuten esimerkissä 2 on esitetty. Amplifikaatiotuotteet uutettiin 100 mikrolitralla kloroformia .
Amplifikaatiotuotteet ja vektori pBS(+) (Stratage-ne) pilkottiin molemmat restriktioendonukleaasilla Pst I, • 25 uutettiin kerran fenoli/kloroformilla ja sen jälkeen saos- tettiin etanolilla. (CR01 sisältää Pst I-kohdan 5'-päässä ja amplifikaatiotuote sisältää sisäisen Pst I-kohdan ala-virtaan mykobakteereille spesifisten alukkeiden ja koetti-mien sitoutumiskohdista.) Pst I:llä pilkottu vektori de-30 fosforyloitiin käsittelemällä vasikansuolifosfataasilla (Maniatis), uutettiin fenoli/kloroformilla ja saostettiin etanolilla. Valmistetut amplifikaatiotuotteet ligatoitiin vektoriin standardiolosuhteissa (Maniatis).
Ligatoitu DNA transformoitiin kompetenttiin E. 35 coliin. Pesäkkeet, jotka sisälsivät plasmideja, jotka si- 43 106213 sältävät halutun insertin, identifioitiin pesäke-täplä-hybridisaatiolla tb-spesifiseen koettimeen KY21 (SEQ ID NO. 5) seuraavasti. Bakteerit levitettiin nitroselluloosa-suodatinlevylle, joka oli laitettu ravintoagarlevylle, ja 5 niiden annettiin kasvaa yön yli. Suodatin poistettiin ja laitettiin peräkkäin (bakteeripuoli ylöspäin) 3MM suodatinpapereille, jotka oli kostutettu 10 % SDS:lla (3 minuuttia), 0,5 M NaOH/l,5 M NaClrlla (5 minuuttia), 0,5 M Tris-HCl, pH 8/1,5 M NaCltlla (5 minuuttia) ja 2X SSCrlla 10 (5 minuuttia). Suodattimet kuivattiin ilmassa. DNA risti- sidottiin suodattimelle UV-säteilytyksellä ja sen jälkeen hybridi soi ti in KY21:een (SEQ ID NO. 5) ja pestiin kuten esimerkissä 3 on kuvattu.
15 Oligonukleotidisekvenssit: KY70-SEQ ID NO. 28
5' GCGGTACCTG CACACAGGCC ACAAGGGAA
CR01-SEQ ID NO. 29
5' CGCCTGCAGT TAACACATGC AAGTCGAACG G
20 Tämä vektori, jota kutsutaan pKY5:ksi, pilkottiin restriktioentsyymeillä Sty I ja Xho I 174 emäsparin fragmentin poistamiseksi, joka sisälsi lajispesifisen koettimen sitoutumiskohdan, mutta jättäen alukkeen ja suvulle ·, 25 spesifisen koettimen sitoutumiskohdat koskemattomiksi.
Pilkottu plasmidi erotettiin 174 emäsparin fragmentista elektroforeesilla l,5-%:isen alhaisessa lämpötilassa sulavan agaroosigeelin läpi. Vektorin sisältävä vyöhyke leikattiin irti geelistä ja puhdistettiin kromatografisesti 30 NACS-pylvään läpi (Bethesda Research Lab) ja etanolilla l saostamalla. Inserttifragmentti, joka sisältää tunnistus- kohdat lajispesifisille koettimille, ligatoidaan valmistettuun vektoriin. Ligaatiotuotteet transformoidaan kompe-tentteihin isäntäbakteereihin.
44 106213
Transformantit, jotka sisältävät sopivat insertit, identifioidaan PCR-amplifikaatiolla. Transformanttibaktee-ripesäkkeet suspensoidaan uudelleen 0,5 ml:aan TE-puskuria. 50 mikrolitraa bakteerisuspensiota laitetaan 5 PCR-reaktioputkiin, jotka sisältävät mykobakteeri-DNA:n amplifikaatioon tarvittavat komponentit, ja amplifikaatio suoritetaan, kuten edellä on esitetty. Bakteerit, jotka sisältävät halutun insertin sisältävät plasmidit, tuottavat 640 emäsparin PCR-tuotteita käyttäen alukeparia KY18 10 (SEQ ID NO. 1) ja KY75 (SEQ ID NO. 2) . Bakteereiden, jotka sisältävät alkuperäisen pKY5-plasmidin, amplifikaatio tuottaa 584 emäsparin PCR-tuotteita.
Näin muodostetut amplikonit voidaan hybridisoida mykobakteereiden suvulle spesifisten ja lajispesifisten 15 koettimien kanssa käänteis-"dot blot"-hybridisaatiolla, kuten esimerkissä 4 on kuvattu, esimerkeissä kuvattujen suvulle spesifisten ja lajispesifisten koettimien hybri-disaatiokohtien läsnäolon varmistamiseksi. Positiivinen kontrolliplssmidi voidaan valmistaa samalla tavalla hybri-20 disoitavaksi sukukoettimiin ja lajispesifisten koettimien valittuun alajoukkoon. Esimerkiksi testipakkauksen muodossa voi olla toivottavaa sisällyttää positiivinen kontrol-liplasmidi tuberkuloosin erottamiseksi muista lajeista, sekvenssit KY178-KY181 (SEQ ID NOT 24-27) sisältävän posi-: 25 tiivisen kontrolliplasmidin sisällyttämisen lisäksi.
Oligonukleotidisekvenssit: 30 KY178-SEO.IDNO.24
5’ CCATCGATAG GACCATTCTG CGCATGTGGT
TAGGACCACA GGACACATGA AGGCTCACTT
CACTTGGCGC ATGCCTTGTG GTGGAAAGCT
i 45 106213 KY179 - SEQ. Π> NO. 25
5’ TGCCTTGGAA GCTTTCCACC ACAAGGCATG
CAACCCACAA AGTGAGCCTT CATGTGTCCT
5 ACCCACCACA CCACATGCGC AGAATGGTOC
KYI80 - SEP. ID NO. 26
5’ CCGCTCGAGA CGGGATGCAT GTCTTGTGGT
CTTTAGGCGC ATGTCTTTAG GTGGAAAGCT
10 CTGGTGGAAA GCTTTTGCAT CGATGG 3’ KY181 - SEQ. ID NO. 27
5’ CCATCGATGC AAAAGCTTTC CACCAGAAGA
TTCCACCTAA AGACATGCGC CTAAAGTTAC
15 CAAGACATGC ATCCCGTCTC GAGCGG 3’
Esimerkki 10
Positiivisen kontrolliplasmidin käyttö
Positiivisen kontrolliplasmidin eräs käyttö on amp-20 lifikaation tehokkuuden tarkkailussa missä tahansa spesifisessä kokeessa. Tällaisissa sovellutuksissa valmistetaan positiivisen kontrolliplasmidin sarjalaimennoksia. Plasmi-din tunnettuja kopiomääriä voidaan käyttää templaatteina amplifikaatioreaktioissa. Pienin määrä plasmidin DNA-mole-v 25 kyylejä, joka voidaan amplifioida, antaa mitan amplifikaa-tioreaktion tehokkuudelle. Toinen positiivisen kontrolliplasmidin käyttö on muodostaa tuotteita, joita voidaan käyttää tarkkailtaessa tehokkuutta, jolla suvulle ja lajille spesifiset koettimet osoittavat mykobakteereiden 30 DNA:ta. Edellä kuvatulla tavalla muodostuneet amplifikaa- * tiotuotteet voivat toimia substraattina hybridisaatioreak-tiossa. Sopivien hybridisaatiosignaalien muodostuminen mahdollistaa sen arvionnin, kuinka hyvin koettimet kykenevät osoittamaan mykobakteerien DNA:ta.
• > 46 106213
SEKVENSSILISTAUS
- SEQ ID NO:1:N TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 23 emäsparia 5 (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) SÄIKEISYYS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA (genominen) (ix) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:1: 10 CACATGCAAG TCGAACGGAA AGG 23 - SEQ ID NO:2:N TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 24 emäsparia 15 (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) SÄIKEISYYS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA (genominen) (ix) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:2: 20 GCCCGTATCG CCCGCACGCT CACA 24 - SEQ ID NO:3:N TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 30 emäsparia *. 25 (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) SÄIKEISYYS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA (genominen) (ix) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:3: 30 TCGCGTTGTT CGTGAAATCT CACGGCTTAA 30 - (2) SEQ ID NO:4:N TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 30 emäsparia 35 (B) TYYPPI: nukleiinihappo 47 106213 (C) SÄIKEISYYS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA (genominen) (ix) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:4: 5 TCGCGTTGTT CGTGAAAACT CACAGCTTAA 30 - SEQ ID NO:5:N TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 36 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo 10 (C) SÄIKEISYYS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA (genominen) (ix) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID N0:5: ACGGGATGCA TGTCTTGTGG TGGAAAGCGC TTTAGC 36 15 - SEQ ID NO:6:N TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 30 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo 20 (C) SÄIKEISYYS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA (genominen) (ix) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:6: ACTTGGCGCA TGCCTTGTGG TGGAAAGCTT 30 *- 25 - (2) SEQ ID NO:7:N TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 30 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo 30 (C) SÄIKEISYYS: yksisäikeinen .· (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA (genominen) (ix) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:7: TTTAGGCGCA TGTCTTTAGG TGGAAAGCTT 30 48 106213 - SEQ ID NO:8:N TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 34 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo 5 (C) SÄIKEISYYS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA (genominen) (ix) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:8: TCAAGACGCA TGTCTTCTGG TGGAAAGCTT TTGC 34 10 - SEQ ID NO:9:N TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 30 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo 15 (C) SÄIKEISYYS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA (genominen) (ix) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:9: TCCCGAAGTG CAGGCCAGAT TGCCCACGTG 30 20 - (2) SEQ ID NO:10:N TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 30 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo : 25 (C) SÄIKEISYYS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA (genominen) (ix) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:10: GAAGGCTCAC TTTGTGGGTT GACGGTAGGT 30 30 - SEQ ID NO: 11:N TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 30 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo 35 (C) SÄIKEISYYS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen 49 106213 (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA (genominen) (ix) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:11: GCAATCTGCC TGCACACCGG GATAAGCCTG 30 5 - SEQ ID NO:12:N TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 34 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) SÄIKEISYYS: yksisäikeinen 10 (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA (genominen) (ix) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:12: GGGTCTAATA CCGAATAGGA CCACAGGACA CATG 34 15 - (2) SEQ ID NO:13:N TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 30 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) SÄIKEISYYS: yksisäikeinen 20 (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA (genominen) (ix) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:13: TCGCGTTGTT CGTGAAATCT CACAGCTTAA 30 • 25 - SEQ ID NO:14:N TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 30 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) SÄIKEISYYS: yksisäikeinen 30 (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA (genominen) (ix) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:14: TCGCGTTGTT CGTGGAATCT CACAGCTTAA 30 50 106213 - SEQ ID NO:15:N TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 30 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo 5 (C) SÄIKEISYYS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA (genominen) (ix) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:15: TCGCGTTGTT CGTGGAATGC CACAGCTTAA 30 10 - SEQ ID NO:16:N TIEDOT: (i) SEKVENS SIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 30 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo 15 (C) SÄIKEISYYS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA (genominen) (ix) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:16: • ATAGGACCAT TCTGCGCATG TGGTGTGGTG 30 20 - SEQ ID NO:17:N TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 24 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo 25 (C) SÄIKEISYYS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA (genominen) (ix) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:17: ACCTCAAGAC GCATGTCTTC TGGT 24 30 : ' - SEQ ID NO:18:N TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 24 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo 35 (C) SÄIKEISYYS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen 51 106213 (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA (genominen) (ix) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:18: CCGAATAGGA CCACAGGACA CATG 24 5 - SEQ ID NO:19:N TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 24 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) SÄIKEISYYS: yksisäikeinen 10 (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA (genominen) (ix) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:19: ACCTTTAGGC GCATGTCTTT AGGT 24 15 - SEQ ID NO:20:N TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 24 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) SÄIKEISYYS: yksisäikeinen 20 (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA (genominen) (ix) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:20: AACACTTGGC GCATGCCTTG TGGT 24 25 - SEQ ID NO:21:N TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 24 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) SÄIKEISYYS: yksisäikeinen 30 (D) TOPOLOGIA: lineaarinen : (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA (genominen) (ix) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:21: GAAGGCTCAC TTTGTGGGTT GACG 24 « 52 106213 - SEQ ID NO:22:N TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 24 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo 5 (C) SÄIKEISYYS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA (genominen) (ix) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:22: TGTGGTGGAA AGCGCTTTAG CGGT 24 10 - SEQ ID NO:23:N TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 24 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo 15 (C) SÄIKEISYYS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA (genominen) (ix) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:23: AGGACCATTC TGCGCATGTG GTGT 24 20 - SEQ ID NO:24:N TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 139 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo ; 25 (C) SÄIKEISYYS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA (genominen) (ix) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:24: CCATCGATAG GACCATTCTG CGCATGTGGT GTGGTGGGTC 30 TAATACCGAA TAGGACCACA GGACACATGA AGGCTCACTT TGTGGGTTGA 90 CGGTAGGTAA CACTTGGCGC ATGCCTTGTG GTGGAAAGCT TCCAAGGCA 139 - SEQ ID NO:25:N TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: 35 (A) PITUUS: 139 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo 53 106213 (C) SÄIKEISYYS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA (genominen) (ix) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:25:
5 TGCCTTGGAA GCTTTCCACC ACAAGGCATG CGCCAAGTGT
TACCTACCGT CAACCCACAA AGTGAGCCTT CATGTGTCCT GTGGTCCTAT 90 TCGGTATTAG ACCCACCACA CCACATGCGC AGAATGGTCC TATCGATGG 139 - SEQ ID NO:26:N TIEDOT: 10 (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 126 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) SÄIKEISYYS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen 15 (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA (genominen) (ix) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:26: CCGCTCGAGA CGGGATGCAT GTCTTGTGGT GGAAAGCGCT TTAGCGGTAA CTTTAGGCGC ATGTCTTTAG GTGGAAAGCT TAACTCAAGA 90 CGCATGTCTT CTGGTGGAAA GCTTTTGCAT CGATGG 126 20 - SEQ ID NO:27:N TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 126 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo . 25 (C) SÄIKEISYYS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA (genominen) (ix) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:27: CCATCGATGC AAAAGCTTTC CACCAGAAGA CATGCGTCTT 30 GAGTTAAGCT TTCCACCTAA AGACATGCGC CTAAAGTTAC CGCTAAAGCG 90 CTTTCCACCA CAAGACATGC ATCCCGTCTC GAGCGG 126 - SEQ ID NO:28:N TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: 35 (A) PITUUS: 29 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo 54 106213 (C) SÄIKEISYYS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA (genominen) (ix) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:28: 5 GCGGTACCTG CACACAGGCC ACAAGGGAA 29 - SEQ ID NO:29:N TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 31 emäsparia 10 (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) SÄIKEISYYS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA (genominen) (ix) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:29: 15 CGCCTGCAGT TAACACATGC AAGTCGAACG G 31

Claims (12)

106213
1. Oligonukleotidialukkeiden pari, joka pystyy amp-lifioimaan mykobakteerilajin 16S ribosomaalisen RNA:n gee- 5 nin tai vastaavan RNA:n kohdealueen, tunnettu siitä, että ensimmäinen aluke koostuu sekvenssistä KY18 (SEQ ID NO. 1) ja toinen aluke koostuu sekvenssistä KY75 (SEQ ID NO. 2) .
2. Testipakkaus näytteessä olevan mykobakteerin 10 nukleiinihapon osoittamiseksi ja mahdolliseksi identifioimiseksi, tunnettu siitä, että se käsittää patenttivaatimuksen 1 mukaisen alukeparin.
3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen testipakkaus, tunnettu siitä, että se lisäksi käsittää oligonu- 15 kleotidikoettimen, joka sisältää nukleiinihapposekvenssin, joka kykenee hybridisoitumaan alukkeiden KY18 (SEQ ID NO. 1) ja KY75 (SEQ ID NO. 2) parilla amplifioidun 16S ribosomaalisen RNA:n geenin alueeseen.
4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen testipakkaus, 20 tunnettu siitä, että mainittu koetin ei ole sekvenssiltään identtinen minkään osoitettavan mykobakteerila-jin sekvenssin kanssa.
5. Jonkin patenttivaatimuksista 2-4 mukainen testipakkaus, tunnettu siitä, että se lisäksi kä- 25 sittää vähintään yhden oligonukleotidikoettimen, joka on valittu ryhmästä, joka koostuu alasekvenssistä, joka käsittää vähintään 14 nukleotidiä sekvensseistä KY21 (SEQ ID NO. 5), KY25 (SEQ ID NO. 6), KY26 (SEQ ID NO. 7), KY63 (SEQ ID NO. 8), KY151 (SEQ ID NO. 9), KY106 (SEQ ID NO. 10), KY126 30 (SEQ ID NO. 11), KY139 (SEQ ID NO. 12), KY157 (SEQ ID NO. *; 16), KY167 (SEQ ID NO. 17), KY168 (SEQ ID NO. 18), KY169 (SEQ ID NO. 19), KY170 (SEQ ID NO. 20), KY171 (SEQ ID NO. 21), KY172 (SEQ ID NO. 22) ja KY173 (SEQ ID NO. 23) ja näille komplementaarisista sekvensseistä.
6. Jonkin patenttivaatimuksista 2-4 mukainen tes tipakkaus, tunnettu siitä, että se lisäksi käsit- 106213 tää oligonukleotidikoetinpaneelin, joka käsittää vähintään • kaksi oligonukleotidikoetinta, jotka on valittu ryhmästä, joka koostuu alasekvenssistä, joka käsittää vähintään 14 nukleotidiä sekvensseistä KY21 (SEQ ID NO. 5), KY25 (SEQ ID 5 NO. 6), KY26 (SEQ ID NO. 7), KY63 (SEQ ID NO. 8), KY151 (SEQ ID NO. 9), KY106 (SEQ ID NO. 10), KY126 (SEQ ID NO. 11), KY139 (SEQ ID NO. 12), KY157 (SEQ ID NO. 16), KY167 (SEQ ID NO. 17), KY168 (SEQ ID NO. 18), KY169 (SEQ ID NO. 19), KY17 0 (SEQ ID NO. 20), KY171 (SEQ ID NO. 21), KY172 10 (SEQ ID NO. 22) ja KY173 (SEQ ID NO. 23) ja näille komplementaarisista sekvensseistä.
7. Jonkin patenttivaatimuksista 2-6 mukainen testipakkaus, tunnettu siitä, että se käsittää lisäksi sisäisen kontrollioligonukleotidisekvenssin, jota reu- 15 nustavat ylävirtaan ja alavirtaan sekvenssit, jotka ovat komplementaarisia alukkeille KY18 (SEQ ID NO. 1) ja KY75 (SEQ ID NO. 2).
8. Menetelmä näytteen sisältämän mykobakteerin nukleiinihapon osoittamiseksi, tunnettu siitä, et- 20 tä (a) amplifioidaan 16S ribosomaalisen RNA:n geenin mainitun nukleiinihapon alue käyttäen patenttivaatimuksen 1 mukaista alukeparia, (b) sekoitetaan vaiheessa (a) amplifioitu nukleii- ·.... 25 nihappo Mycobacterium-suvulle spesifisen koettimen kanssa, ja (c) osoitetaan nukleiinihapon ja koettimen välillä muodostuneet hybridit.
9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen menetelmä, 30 tunnettu siitä, että Mycobacterium-suvulle spesifi- nen koetin, on koetin, jonka sekvenssi on valittu ryhmästä, joka koostuu sekvensseistä KY101 (SEQ ID NO. 3), KY102 (SEQ ID NO. 4), KY165 (SEQ ID NO. 13), KY166 (SEQ ID NO. 14) ja näille komplementaarisista sekvensseistä.
10 KY126 (SEQ ID NO. 11), KY139 (SEQ ID NO. 12), KY157 (SEQ ID NO. 16), KY167 (SEQ ID NO. 17), KY168 (SEQ ID NO. 18), KY169 (SEQ ID NO. 19), KY170 (SEQ ID NO. 20), KY171 (SEQ ID NO. 21), KY 172 (SEQ ID NO. 22) ja KY173 (SEQ ID NO. 23) ja näille komplementaarisista sekvensseistä, ja 15 (c) osoitetaan nukleiinihapon ja koettimien välille muodostuneet hybridit.
10. Menetelmä mykobakteerin luokittelemiseksi, tunnettu siitä, että « 106213 (a) amplifioidaan mainitun mykobakteerin 16S ribo-somaalisen RNA:n geenistä peräisin olevan nukleiinihapon alue käyttäen patenttivaatimuksen 1 mukaista alukeparia, (b) sekoitetaan vaiheessa (a) amplifioitu nukleii- 5 nihappo oligonukleotidikoettimien paneelin kanssa, joka sisältää ainakin kaksi oligonukleotidikoetinta, jotka on valittu ryhmästä, joka koostuu sekvensseistä KY21 (SEQ ID NO. 5), KY25 (SEQ ID NO. 6), KY26 (SEQ ID NO. 7), KY63 (SEQ ID NO. 8), KY151 (SEQ ID NO. 9), KY106 (SEQ ID NO. 10),
11. Jonkin patenttivaatimuksista 8-10 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että amplifiointi suoritetaan polymeraasiketjureaktiolla. « € • m 4 106213
FI923660A 1991-08-15 1992-08-14 Mykobakteerien alukkeita ja koettimia FI106213B (fi)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US74670491A 1991-08-15 1991-08-15
US74670491 1991-08-15
US91592292 1992-07-17
US07/915,922 US5422242A (en) 1991-08-15 1992-07-17 Mycobacterium primers and probes

Publications (3)

Publication Number Publication Date
FI923660A0 FI923660A0 (fi) 1992-08-14
FI923660A FI923660A (fi) 1993-02-16
FI106213B true FI106213B (fi) 2000-12-15

Family

ID=27114638

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI923660A FI106213B (fi) 1991-08-15 1992-08-14 Mykobakteerien alukkeita ja koettimia

Country Status (15)

Country Link
EP (1) EP0528306B1 (fi)
JP (1) JP2675723B2 (fi)
CN (1) CN1076397C (fi)
AT (1) ATE186749T1 (fi)
AU (1) AU659657B2 (fi)
CA (1) CA2075847C (fi)
DE (1) DE69230305T2 (fi)
DK (1) DK0528306T3 (fi)
ES (1) ES2140400T3 (fi)
FI (1) FI106213B (fi)
GR (1) GR3032597T3 (fi)
IL (1) IL102765A (fi)
NO (1) NO310884B1 (fi)
NZ (1) NZ243921A (fi)
PT (1) PT528306E (fi)

Families Citing this family (31)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0586112A3 (en) * 1992-08-14 1994-09-14 Pharma Gen S A Control of pcr mediated detection of micro-organisms
CA2121659C (en) * 1993-05-11 2000-11-28 Michael C. Little Sample processing method for mycobacteria
EP0630973A3 (en) * 1993-05-14 1995-04-26 Eastman Kodak Co Diagnostic compositions, elements, methods and kits for amplification and detection tests of two or more DNA's using primers at suitable melting temperatures.
US6136529A (en) * 1993-09-03 2000-10-24 Gen-Probe Incorporated Nucleic acid probes to Mycobacterium avium complex
WO1995031571A2 (en) * 1994-05-13 1995-11-23 Abbott Laboratories Materials and methods for the detection of mycobacteria
US5712095A (en) * 1994-06-16 1998-01-27 Becton Dickinson And Company Rapid and sensitive detection of antibiotic-resistant mycobacteria using oligonucleotide probes specific for ribosomal RNA precursors
FR2721617B1 (fr) * 1994-06-24 1996-09-06 Pasteur Institut Fragments d'acides nucléiques, dérivés du génome de Mycobacterium xenopi et leurs applications.
US5656427A (en) * 1994-08-29 1997-08-12 Gen-Probe Incorporated Nucleic acid hybridization assay probes, helper probes and amplification oligonucleotides targeted to Mycoplasma pneumoniae nucleic acid
CA2163393C (en) * 1994-11-30 2003-04-22 Colleen Marie Nycz Amplification and detection of mycobacteria nucleic acids
US5925518A (en) * 1995-05-19 1999-07-20 Akzo Nobel N.V. Nucleic acid primers for amplification of a mycobacteria RNA template
US5795722A (en) * 1997-03-18 1998-08-18 Visible Genetics Inc. Method and kit for quantitation and nucleic acid sequencing of nucleic acid analytes in a sample
DE19616750A1 (de) * 1996-04-26 1997-11-06 Newlab Diagnostic Systems Gmbh Verfahren zum Nachweis von Mikroorganismen in Gemischen
US5846718A (en) * 1996-05-31 1998-12-08 The Johns Hopkins University Identification of pyrazinamide-resistant mycobacteria and methods for treating mycobacterial infections
ES2129365B1 (es) * 1997-07-18 2000-04-01 Pharmagen S A Metodo para la deteccion de secuencias especificas de acidos nucleicos en presencia de un vector util como control positivo interno.
US5985569A (en) * 1997-09-26 1999-11-16 Becton, Dickinson And Company Primers for amplification of a genus specific sequence of the mycobacterium 16S rRNA gene
WO1999051748A2 (en) * 1998-04-07 1999-10-14 Corixa Corporation Fusion proteins of mycobacterium tuberculosis antigens and their uses
ES2253279T3 (es) 1999-12-15 2006-06-01 Gen-Probe Incorporated Metodos y composiciones para la deteccion de especies del complejo de mycobacterium avium.
US6664081B2 (en) 1999-12-17 2003-12-16 Gen-Probe Incorporated Nucleic acid amplification and detection of mycobacterium species
EP1242633B1 (en) 1999-12-17 2011-01-12 Gen-Probe Incorporated Nucleic acid amplification and detection of mycobacterium species
KR100433260B1 (ko) * 2000-09-15 2004-05-24 주식회사 에스제이하이테크 멀티플렉스 ｐｃｒ 방법 및 이를 이용한 마이코박테리아동정용 키트 및 올리고 뉴클레오티드
CN100523216C (zh) * 2001-03-02 2009-08-05 匹兹堡大学 Pcr方法
DE10215238C1 (de) * 2002-04-06 2003-08-14 Cytonet Gmbh & Co Kg Nachweis von Mykobakterien in klinischem Material
JP4304976B2 (ja) * 2002-12-19 2009-07-29 東ソー株式会社 リボゾームｒｎａを標的とした抗酸菌の検出法
JP4769041B2 (ja) * 2004-07-28 2011-09-07 株式会社ビー・エム・エル 抗酸菌属細菌同定キット
CN1311085C (zh) * 2004-10-19 2007-04-18 中国人民解放军第三○九医院 分枝杆菌分子菌种鉴定试剂盒的制备及其应用
JP2011062088A (ja) * 2009-09-15 2011-03-31 Ihi Corp レジオネラ菌検出方法
JP5663491B2 (ja) * 2009-10-29 2015-02-04 日本碍子株式会社 標的核酸の検出方法
CN102618625B (zh) * 2011-01-27 2013-09-11 博奥生物有限公司 一种检测结核分枝杆菌耐药性的方法和试剂盒
JP6299660B2 (ja) * 2014-05-12 2018-03-28 三菱ケミカル株式会社 菌叢解析方法と菌叢解析用デバイス
CN110095598A (zh) * 2019-04-08 2019-08-06 北京大学 一种基于磁性微球快速检测化学物质内分泌干扰活性的试剂盒及方法
KR20220098246A (ko) 2019-12-18 2022-07-11 후지필름 가부시키가이샤 마이코박테륨·투베르쿨로시스, 마이코박테륨·아비움 및 마이코박테륨·인트라셀룰라레를 검출하기 위한 프라이머 세트 및 이것을 이용한 방법, 및 그를 위한 시약 키트

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IE81145B1 (en) * 1989-04-20 2000-05-03 Thomas Gerard Barry Generation of specific probes for target nucleotide sequences
CA2016553A1 (en) * 1989-05-16 1990-11-16 Dyann F. Wirth Dna hybridization probes for identification of mycobacteria
JPH03164199A (ja) * 1989-08-09 1991-07-16 Shima Kenkyusho:Kk 結核菌の迅速同定方法及び同定用試薬キット

Also Published As

Publication number Publication date
EP0528306B1 (en) 1999-11-17
NO310884B1 (no) 2001-09-10
AU659657B2 (en) 1995-05-25
EP0528306A2 (en) 1993-02-24
CN1071955A (zh) 1993-05-12
CA2075847C (en) 2002-04-23
FI923660A0 (fi) 1992-08-14
ES2140400T3 (es) 2000-03-01
DE69230305D1 (de) 1999-12-23
IL102765A0 (en) 1993-01-31
NO923201L (no) 1993-02-16
IL102765A (en) 1997-03-18
CA2075847A1 (en) 1993-02-16
CN1076397C (zh) 2001-12-19
FI923660A (fi) 1993-02-16
AU2096192A (en) 1993-04-08
DE69230305T2 (de) 2000-07-20
DK0528306T3 (da) 2000-04-25
JP2675723B2 (ja) 1997-11-12
NZ243921A (en) 1994-01-26
JPH06261757A (ja) 1994-09-20
NO923201D0 (no) 1992-08-14
GR3032597T3 (en) 2000-05-31
EP0528306A3 (en) 1993-09-15
ATE186749T1 (de) 1999-12-15
PT528306E (pt) 2000-05-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
FI106213B (fi) Mykobakteerien alukkeita ja koettimia
EP0630971B1 (en) Method, reagents and kits for detecting Neisseria gonorrhoeae and Chlamydia trachomatis
US5422242A (en) Mycobacterium primers and probes
JP2709256B2 (ja) マイコバクテリアプローブ
JPH10500023A (ja) 結核菌検出用材料及び検出方法
EP0687737B1 (en) Detection of Treponema pallidum and Haemophilus ducreyi
KR100434244B1 (ko) 미코박테리움아비움복합체종의증폭및검출방법
WO2011091330A1 (en) Probes for detecting the presence of trichomonas vaginalis in a sample
JP4280788B2 (ja) Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ種用の核酸プローブおよび増幅オリゴヌクレオチド
JP2547517B2 (ja) 鳥型結核菌、ミコバクテリウム・イントラセルレアおよびパラ結核菌に対するプローブ
WO1991014002A2 (en) Method for diagnosis of lyme disease
JP2787017B2 (ja) ミコバクテリア核酸の増幅および検出
US5352580A (en) Selective detection of mycobacteria by nucleicacid probes derived from Mycobacterium kansasii
EP0872561A2 (en) Neisseria gonorrhoae-specific oligonucleotides
JP2004534536A (ja) グラム陽性菌の検出方法
JPH05261000A (ja) ギアルジア・ランブリアの存在を決定するための方法及び試薬

Legal Events

Date Code Title Description
MA Patent expired