JP2011062088A - レジオネラ菌検出方法 - Google Patents

Abstract

【課題】感染性があるレジオネラ菌のすべてを検出することを目的とする。
【解決手段】レジオネラ菌検出方法が、分子生物学的手法を用いてレジオネラ菌を検出するレジオネラ菌検出方法であって、「ｃｔｃ ｃｔｃ ｃｃｃ ａｃｔ ｇａａ ａｇｔ（１８）」の塩基配列を有する第１のポリヌクレオチドと、「ｃｔｃ ｃｔｃ ｃｃｔ ａｃｔ ｇａａ ａｇｔ（１８）」の塩基配列を有する第２のポリヌクレオチドとを用いてレジオネラ菌を検出する。
【選択図】図１

Description

本発明は、試料からレジオネラ菌を検出するレジオネラ菌検出方法に関する。

現在、レジオネラ菌を検出する方法としてＰＣＲ（polymerase chain reaction）法がある。このＰＣＲ法は、レジオネラ菌のみが持つ遺伝子配列だけを増幅して検出する方法であり、非常に高い検出精度を持つ。例えば、下記特許文献１〜１６には、上記ＰＣＲ法を利用した発明が開示されている。しかし、このＰＣＲ法は、定量性に欠けるという欠点がある。そのため、ＰＣＲ法に定量性を持たせたｑ‐ＰＣＲ法が開発されている（下記特許文献１７）。しかし、ｑ‐ＰＣＲ法では、死んだレジオネラ菌も検出してしまうので、試料中の生きたレジオネラ菌を定量することが困難である。
そして、上記問題を解決できる方法としてＦＩＳＨ（Fluorescent in situ hybridization）法がある。ＦＩＳＨ法とは、蛍光標識したプローブを標的微生物の核酸に結合させ、プローブの蛍光に基づいて標的微生物を検出する方法である。このＦＩＳＨ法において、死菌では分解されるリボソームＲＮＡを標的にするプローブを用いると、生きたレジオネラ菌を検出でき、さらに蛍光量からレジオネラ菌を定量することができる。そして、ＦＩＳＨ法におけるプローブとして、例えば、下記非特許文献１には、レジオネラ科内の種を幅広く検出するプローブが開示されており、また、非特許文献２には、レジオネラニューモフィラのみを検出するプローブが開示されている。

特開２００８−９２９４８号公報 特開２００７−２０２５６９号公報 特開２００６−３２０３３４号公報 特開２００６−１７４８３７号公報 特開２００５−２１１０２７号公報 特開２００５−１１０５４５号公報 特開２００４−２０１６０５号公報 特開２００３−２１９８７８号公報 特開２００２−３２０４８６号公報 特開２００２−２２３７６６号公報 特開２００１−６１４８２号公報 特開２０００−２１７６００号公報 特開平９−１０７９９８号公報 特表２００８−５１１３１３号公報 特表２００１−５０５７８１号公報 国際公開第２００３／１０６６７６号パンフレット 特開２００２−５１７８３号公報

Manz W., Amann R., Szewzyk R., Szewzyk U., Stenstroem T.-A., Hutzler P. and Schleifer K.-H. (1995). In situ identification of Legionellaceae using 16S rRNA-targeted oligonucleotide probes and confocal laser scanning microscopy. Microbiol. 141: 29-39. Grimm D., Merkert H., Ludwig W., Schleifer K.-H., Hacker J. and Brand B. C. (1998). Specific detection of Legionella pneumophila: construction of a new 16S rRNA-targeted oligonucleotide probe. Appl. Environ. Microbiol. 64: 2686-2690.

ところで、上記非特許文献１には幅広い種を検出するプローブが、また上記非特許文献２にはレジオネラニューモフィラのみを検出するプローブが開示されている。しかしながら、これらのプローブでは、下記参考文献１の中で挙げられている約４０種類の感染性があるレジオネラ菌すべてを検出することができるわけではない。
（参考文献１） 新版レジオネラ症防止指針 厚生省生活衛生局企画課監修 （財）ビル管理教育センター発行

本発明は、上述した事情に鑑みてなされたものであり、感染性があるレジオネラ菌のすべてを検出することを目的とする。

上記目的を達成するために、本発明では、レジオネラ菌検出方法に係る第１の解決手段として、分子生物学的手法を用いてレジオネラ菌を検出するレジオネラ菌検出方法であって、
「ｃｔｃ ｃｔｃ ｃｃｃ ａｃｔ ｇａａ ａｇｔ（１８）」の塩基配列を有する第１のポリヌクレオチドと、「ｃｔｃ ｃｔｃ ｃｃｔ ａｃｔ ｇａａ ａｇｔ（１８）」の塩基配列を有する第２のポリヌクレオチドとを用いてレジオネラ菌を検出するという手段を採用する。

本発明では、レジオネラ菌検出方法に係る第２の解決手段として、上記第１の解決手段において、前記第１のポリヌクレオチド及び前記第２のポリヌクレオチドを用いてレジオネラ菌を検出し、「ｔｔｃ ｃｔｃ ｃｃｃ ａｃｔ ｇａａ ａｇｔ（１８）」の塩基配列を有する第３のポリヌクレオチドと、「ｔｔｃ ｃｔｃ ｃｃｔ ａｃｔ ｇａａ ａｇｔ（１８）」の塩基配列を有する第４のポリヌクレオチドとを用いてレジオネラ菌以外の微生物の検出を回避するという手段を採用する。

本発明では、レジオネラ菌検出方法に係る第３の解決手段として、上記第１または第２の解決手段において、試料中に添加したプローブをレジオネラ菌に結合させ、当該プローブの蛍光に基づいて試料中のレジオネラ菌を検出するＦＩＳＨ（Fluorescent in situ hybridization）法を用いたレジオネラ菌検出方法であって、前記第１のポリヌクレオチドが蛍光標識された第１のプローブと、前記第２のポリヌクレオチドが蛍光標識された第２のプローブとを試料に添加するプローブ添加工程を具備するという手段を採用する。

本発明では、レジオネラ菌検出方法に係る第４の解決手段として、上記第１〜３いずれかの解決手段において、前記プローブ添加工程において、ＦＩＴＣ（fluorescein isothiocyanate）が３’末端に結合する前記第１のプローブ及び前記第２のプローブを添加するという手段を採用する。

感染性があるすべてのレジオネラ菌のリボソームＲＮＡの塩基配列は、第１のポリヌクレオチドまたは第２のポリヌクレオチドに結合する２系統に分類できる。そのため、第１のポリヌクレオチドまたは第２のポリヌクレオチドが結合し得るレジオネラ菌は、感染性があるレジオネラ菌である。そして、第１のポリヌクレオチド及び第２のポリヌクレオチドが結合した微生物を検出することで、感染性があるレジオネラ菌のすべてを検出することができる。

本発明の一実施形態に係るレジオネラ菌検出方法のフローチャートである。 本発明の一実施形態に係るレジオネラ菌検出方法において蛍光顕微鏡で見える試料の画像の模式図である。

以下、図面を参照して、本発明の一実施形態について説明する。
本実施形態に係るレジオネラ菌検出方法は、ＦＩＳＨ法を用いて試料からレジオネラ菌を検出する方法であり、以下に説明するように第１〜第６の工程を有するものである。また、これら第１〜第６の工程のうち、第４の工程及び第５の工程は、本実施形態におけるプローブ添加工程である。

レジオネラ菌検出方法について、図１を参照して、説明する。
〔第１の工程〕
まず、第１の工程において、レジオネラ菌を含む液体試料に、終濃度が４％になるようにパラホルムアルデヒド溶液を添加し、当該液体試料を４℃の温度の下で一晩保存することでレジオネラ菌の固定標本を作製する（ステップＳ１）。
〔第２の工程〕
上記第１の工程が終了すると、次に第２の工程において、上記液体試料をろ過装置によってろ過することで、レジオネラ菌の固定標本をメンブレンフィルタ上に捕集する（ステップＳ２）。
〔第３の工程〕
上記第２の工程が終了すると、次に第３の工程において、上記メンブレンフィルタを９９．５％のエタノールに１分間入れることで脱水し、その後に常温の空気中で乾燥させる（ステップＳ３）。

〔第４の工程〕
上記第３の工程が終了すると、次に第４の工程（プローブ添加工程）において、「ｃｔｃ ｃｔｃ ｃｃｃ ａｃｔ ｇａａ ａｇｔ（１８）」の塩基配列（第１の塩基配列）を有する第１のポリヌクレオチドをＦＩＴＣ（fluorescein isothiocyanate）で標識した第１のプローブと、「ｃｔｃ ｃｔｃ ｃｃｔ ａｃｔ ｇａａ ａｇｔ（１８）」の塩基配列（第２の塩基配列）を有する第２のポリヌクレオチドをＦＩＴＣで標識した第２のプローブとを作製して上記メンブレンフィルタの試料に添加する（ステップＳ４）。なお、上記塩基配列における、「ａ」はアデニン、「ｔ」はチミン、「ｃ」はシトシン、「ｇ」はグアニンである。「ａ」は「ｔ」と相補的に結合し、「ｃ」は「ｇ」と相補的に結合する。

そして、上記第１のポリヌクレオチド及び第２のポリヌクレオチドでは、左端の塩基「ｃ」に５’末端が結合し、右端の塩基「ｔ」に３’末端が結合している。上記第１のプローブ及び第２のプローブの作製では、その３’末端にＦＩＴＣを結合させる。このようにＦＩＴＣを３’末端に結合させるのは、ＦＩＴＣが５’末端に結合していると「ｃ」と相補的に結合する「ｇ」の影響でその蛍光が弱まってしまうからである。

また、上記第１の塩基配列あるいは第２の塩基配列は、約４０種類の感染性があるレジオネラ菌のリボソームＲＮＡの何れかに対して結合性を有する塩基配列である。つまり、感染性があるレジオネラ菌のリボソームＲＮＡの塩基配列は、第１の塩基配列に対して結合性を有するものと、第２の塩基配列に対して結合性を有するものとの２系統に分類できる。

〔第５の工程〕
そして、第５の工程（プローブ添加工程）において、「ｔｔｃ ｃｔｃ ｃｃｃ ａｃｔ ｇａａ ａｇｔ（１８）」（第３の塩基配列）を有する第３のポリヌクレオチドと、「ｔｔｃ ｃｔｃ ｃｃｔ ａｃｔ ｇａａ ａｇｔ（１８）」（第４の塩基配列）を有する第４のポリヌクレオチドとを作製して、上記メンブレンフィルタの試料に添加する（ステップＳ５）。この第３のポリヌクレオチド及び第４のポリヌクレオチドは、蛍光標識されていない。なお、第３のポリヌクレオチドは、左端の塩基が第１のプローブの第１のポリヌクレオチドとは異なり、第４のポリヌクレオチドは、左端の塩基が第２のプローブの第２のポリヌクレオチドとは異なる。

このような第３のポリヌクレオチド及び第４のポリヌクレオチドを試料に添加するのは、第１のプローブ及び第２のプローブが感染性があるレジオネラ菌以外の微生物に結合することを回避するためである。第１のプローブの第１の塩基配列及び第２のプローブの第２の塩基配列は、１塩基違いで感染性があるレジオネラ菌以外の微生物の塩基配列と相補的関係が成り立ってしまうものであり、当該微生物に結合する可能性がある。この可能性を回避するために、第３のポリヌクレオチド及び第４のポリヌクレオチドを液体試料に添加して、感染性があるレジオネラ菌以外の微生物に第３のポリヌクレオチドあるいは第４のポリヌクレオチドを結合させる。これにより、感染性があるレジオネラ菌以外の微生物に第１のプローブあるいは第２のプローブが結合して、当該微生物をレジオネラ菌として誤検出することを回避することができる。

ここで、上記第４の工程における第１のプローブ及び第２のプローブと、上記第５の工程における第３のポリヌクレオチド及び第４のポリヌクレオチドとを試料に添加する手法について、具体的に説明する。
まず、上記第１のプローブ、第２のプローブ、第３のポリヌクレオチド及び第４のポリヌクレオチドをハイブリダイゼーションバッファに混ぜ、上記第１のプローブ、第２のプローブ、第３のポリヌクレオチド及び第４のポリヌクレオチドのそれぞれの濃度が８０ｐｍｏｌ／μｌになるプローブ溶液を作製する。この際、プローブ（第１のプローブ及び第２のプローブ）と、ポリヌクレオチド（第３のポリヌクレオチド及び第４のポリヌクレオチド）との混合比は、「１０：１」〜「１：１０」にする。なお、上記ハイブリダイゼーションバッファの構成は、ＮａＣｌが０．９％、Ｔｒｉｓ‐Ｃｌが２０ｍＭ、formamideが３５％、Ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｒｅａｇｅｎｔが２％、ＳＤＳ（Sodium Dodecyl sulphate：界面活性剤）が０．０２％である。

そして、上記プローブ溶液をマイクロチューブに入れ、レジオネラ菌を捕集したメンブレンフィルタを適当な大きさに裁断し、裁断したメンブレンフィルタをプローブ溶液の中に入れる。これにより、メンブレンフィルタの試料に第１のプローブ、第２のプローブ、第３のポリヌクレオチド及び第４のポリヌクレオチドが添加される。
さらに、振とう機を使ってマイクロチューブを４６℃の温度下で、約２時間振とうさせる。これにより、上記第１のプローブ、第２のプローブ、第３のポリヌクレオチド及び第４のポリヌクレオチドの添加が促進される。そして、時間の経過とともに試料に含まれるレジオネラ菌と第１のプローブ及び第２のプローブとが結合する。

〔第６の工程〕
上記第５の工程（プローブ添加工程）が終了すると、次に第６の工程において、プローブ溶液から取り出したメンブレンフィルタをスライドガラス上に載せ、スライドガラスまるごとウォッシングバッファに浸し、メンブレンフィルタ上の未反応の第１のプローブ、第２のプローブ、第３のポリヌクレオチド及び第４のポリヌクレオチドを洗浄する（ステップＳ６）。
〔第７の工程〕
上記第６の工程が終了すると、次に第７の工程において、スライドガラスまるごと９９．５％のエタノールに１分間入れることでメンブレンフィルタを脱水し、その後に常温の空気中で乾燥させる（ステップＳ７）。

〔第８の工程〕
上記第７の工程が終了すると、次に第８の工程において、スライドガラス上のメンブレンフィルタにベクターシールドを滴下し、その上に気泡がはいらないようカバーガラスを載せて、密着させる（ステップＳ８）。
〔第９の工程〕
上記第８の工程が終了すると、次に第９の工程において、蛍光顕微鏡にスライドガラスを取り付け、蛍光顕微鏡が波長４９５ｎｍの青色の励起光をスライドガラス上のメンブレンフィルタに対して照射すると、レジオネラ菌に結合した第１のプローブあるいは第２のプローブは波長５２０ｎｍの緑色の蛍光を発光する。
蛍光顕微鏡でメンブレンフィルタを見ると、図２に示すように緑色蛍光を発するレジオネラ菌を見ることができる。そして、蛍光顕微鏡で撮影した試料の画像から、第１のプローブ及び第２のプローブの蛍光に基づいてレジオネラ菌を検出する（ステップＳ９）。

以上のように、本実施形態では、上記第１のプローブ、第２のプローブ、第３のポリヌクレオチド及び第４のポリヌクレオチドをメンブレンフィルタの試料に添加する。
そして、感染性があるレジオネラ菌に第１のプローブあるいは第２のプローブを結合させるとともに、第３のポリヌクレオチド及び第４のポリヌクレオチドを感染性があるレジオネラ菌以外の微生物に結合させる。

感染性があるレジオネラ菌のすべてのリボソームＲＮＡの塩基配列は、第１のプローブあるいは第２のプローブに結合する２系統に分類できるので、第１のプローブまたは第２のプローブが結合したレジオネラ菌は、感染性があるレジオネラ菌である。そして、第１のプローブ及び第２のプローブの蛍光に基づいて検出処理を行うことで、感染性があるレジオネラ菌のすべてを検出することができる。
さらに、第３のポリヌクレオチド及び第４のポリヌクレオチドが感染性があるレジオネラ菌以外の微生物に結合することで、第１のプローブまたは第２のプローブが当該微生物に結合することを防止して、誤検出を防ぐことができる。

以上、本発明の一実施形態について説明したが、本発明は上記実施形態に限定されることなく、例えば以下のような変形が考えられる。
（１）上記実施形態では、ＦＩＴＣを第１のプローブ及び第２のプローブの蛍光色素として使用したが、本発明はこれに限定されない。
例えば、ＦＩＴＣの代わりに、Ｃｙ３を第１のプローブ及び第２のプローブの蛍光色素として使用してもよい。その場合には、Ｃｙ３は「ｇ」の影響で蛍光は弱くならないため、Ｃｙ３を第１のプローブ及び第２のプローブの５’末端に結合してもよい。

（２）上記実施形態では、プローブ溶液の中にメンブレンフィルタを入れることで、メンブレンフィルタの試料に第１のプローブ、第２のプローブ、第３のポリヌクレオチド及び第４のポリヌクレオチドを添加するようにしたが、本発明はこれに限定されない。
例えば、メンブレンフィルタ上の試料に、プローブ溶液をマイクロピペットで滴下して、第１のプローブ、第２のプローブ、第３のポリヌクレオチド及び第４のポリヌクレオチドを添加するようにしてもよい。

（３）上記実施形態では、第１のプローブ、第２のプローブ、第３のポリヌクレオチド及び第4のポリヌクレオチドは、４種類の塩基「ａ（アデニン）」、「ｔ（チミン）」、「ｃ（シトシン）」及び「ｇ（グアニン）」から構成したが、本発明はこれに限定されない。
当然ではあるが、第１のプローブ、第２のプローブ、第３のポリヌクレオチド及び第4のポリヌクレオチドの「ｔ」は、「ｕ（ウラシル）」であってもよい。

（４）上記実施形態では、ＦＩＳＨ法に第１〜４のポリヌクレオチドを用いたが、本発明はこれに限定されない。
例えば、ＰＣＲ（polymerase chain reaction）法、ＦＩＳＨ法以外のハイブリダイゼーション法及びＤＮＡチップに第１〜４のポリヌクレオチドを用いてレジオネラ菌を検出するようにしてもよい。すなわち、本発明は、分子生物学的手法を用いたあらゆるレジオネラ菌検出方法に適用することができる。

Claims (4)

1. 分子生物学的手法を用いてレジオネラ菌を検出するレジオネラ菌検出方法であって、
   「ｃｔｃ ｃｔｃ ｃｃｃ ａｃｔ ｇａａ ａｇｔ（１８）」の塩基配列を有する第１のポリヌクレオチドと、「ｃｔｃ ｃｔｃ ｃｃｔ ａｃｔ ｇａａ ａｇｔ（１８）」の塩基配列を有する第２のポリヌクレオチドとを用いてレジオネラ菌を検出するレジオネラ菌検出方法。
2. 前記第１のポリヌクレオチド及び前記第２のポリヌクレオチドを用いてレジオネラ菌を検出し、「ｔｔｃ ｃｔｃ ｃｃｃ ａｃｔ ｇａａ ａｇｔ（１８）」の塩基配列を有する第３のポリヌクレオチドと、「ｔｔｃ ｃｔｃ ｃｃｔ ａｃｔ ｇａａ ａｇｔ（１８）」の塩基配列を有する第４のポリヌクレオチドとを用いてレジオネラ菌以外の微生物の検出を回避することを特徴とする請求項１に記載のレジオネラ菌検出方法。
3. 試料中に添加したプローブをレジオネラ菌に結合させ、当該プローブの蛍光に基づいて試料中のレジオネラ菌を検出するＦＩＳＨ（Fluorescent in situ hybridization）法を用いたレジオネラ菌検出方法であって、
   前記第１のポリヌクレオチドが蛍光標識された第１のプローブと、前記第２のポリヌクレオチドが蛍光標識された第２のプローブとを試料に添加するプローブ添加工程を具備することを特徴とする請求項１または２に記載のレジオネラ菌検出方法。
4. 前記プローブ添加工程において、ＦＩＴＣ（fluorescein isothiocyanate）が３’末端に結合する前記第１のプローブ及び前記第２のプローブを添加することを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のレジオネラ菌検出方法。
   
   
   

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