JP2022507573A - Ｓｈｅｒｌｏｃｋによる高度に進化するウイルスバリアントの多重化 - Google Patents

Ｓｈｅｒｌｏｃｋによる高度に進化するウイルスバリアントの多重化 Download PDF

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Abstract

病原体標的配列を含み得るサンプルを分析する際に使用するためのプライマー及び／またはプローブを生成するための方法であって、プライマー及び／またはプローブの汎ウイルスセットを同定することを含む、方法が提供される。【選択図】図１

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年１１月１４日出願の米国仮出願第６２／７６７，０７６号の権益を主張する。上述の出願の全内容は、参照により本明細書に完全に組み込まれる。
電子配列表への参照
サイズは６６８７バイトで、２０１９年１１月１４日に作成された電子配列表（ＢＲＯＤ＿３８３０ＷＰ３８２０ＷＰ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ）の内容は、参照によりその全体が本書に組み込まれる。
［技術分野］
本明細書に開示される主題は、概して、病原体標的配列を含み得るサンプルの分析に使用するためのプライマー及び／またはプローブならびにそれらの生成方法に関する。
迅速な時間枠で多数のサンプルに対して高い感度と単一塩基特異性で核酸を迅速に検出する能力は、多くの疾患の診断とモニタリングに革命を起こし、貴重な疫学情報を提供し、一般化可能な科学ツールとして役立ち得る。一度に多数のサンプルを試験できるプラットフォームでは、少量のサンプルを利用することで、現在の最先端技術よりも明確な利点をもたらす。例えば、ｑＰＣＲアプローチは高感度であるが、高価であり、複雑な機器に依存しているため、実験室の環境で高度に訓練されたオペレーターのみが使用できる。等温核酸増幅とポータブルプラットフォームを組み合わせた新しい方法（Ｄｕ ｅｔ ａｌ．，２０１７；Ｐａｒｄｅｅ ｅｔ ａｌ．，２０１６）などの他のアプローチは、ポイントオブケア（ＰＯＣ）環境で高い検出特異性を提供するが、感度が低いため、アプリケーションが幾分制限される。核酸診断が様々なヘルスケアアプリケーションにますます重要になるにつれて、低コストで高い特異性と感度を備えた大規模な多重化を可能にする検出技術は、臨床と基礎研究の両方の環境で非常に有用であり、最終的にサンプルの汎ウイルス、汎細菌、または汎病原体の試験を可能にする。
特定の例示的な実施形態において、病原体標的配列を含み得るサンプルを分析する際に使用するためのプライマー及び／またはプローブを生成するための方法であって、プライマー及び／またはプローブの汎ウイルスセットを同定することを含む、方法が提供される。プローブは、本明細書に記載されるような検出のシステム及び方法において有利に使用することができる。
病原体に対するプローブ及びプライマーを開発する方法は、１つ以上の標的病原体に対する入力ゲノム配列のセットを提供することと、セットカバー解法プロセスを標的配列のセットに適用して、１つ以上の標的増幅配列を同定することであって、前記１つ以上の標的増幅配列は、標的病原体の入力ゲノム配列のセットの間で共有される高度に保存された標的配列である、セットカバー解法プロセスを標的配列のセットに適用して、１つ以上の標的増幅配列を同定することと、前記１つ以上の標的増幅配列に基づいて、１つ以上のプライマー、１つ以上のプローブ、またはプライマー対とプローブの組み合わせを生成することと、を含む。いくつかの実施形態では、入力ゲノム配列のセットが、１０以上のウイルスのセットに由来するゲノム配列を表す。実施形態では、プライマーのセットが、５８～６０℃の標的融解温度によって同定される。実施形態では、推定アンプリコンは、同時設計のアンプリコンプライマー及びガイド配列である。
実施形態において、１つ以上の標的増幅配列を診断設計ガイドに供して、１つ以上のプライマー、１つ以上のプローブ、またはプライマー対とプローブの組み合わせを生成する。入力ゲノム配列のセットが、２以上のウイルス病原体に由来するゲノム配列を表す。生成された１つ以上のプライマー、１つ以上のプローブ、またはプライマー対とプローブの組み合わせは、５つ以上のウイルスの検出のための配列を含むことができる。実施形態において、方法は、汎ウイルス検出を可能にする。
サンプル中のウイルスを検出する方法は、サンプルを、プライマー対及び検出可能な標識を含むプローブと接触させることを含み、１つ以上のプライマー及び／またはプローブが、それぞれがウイルス種またはサブ種を検出するよう構成されている。実施形態では、１つ以上のプローブが、対応する標的分子に結合するよう設計された１つ以上のガイドＲＮＡを含む。実施形態では、１つ以上のガイドＲＮＡは、標的ＲＮＡもしくはＤＮＡ中の一塩基多型、またはＲＮＡ転写物のスプライスバリアントを検出するように設計される。実施形態では、１つ以上のガイドＲＮＡは、疾患状態に特徴的な１つ以上の標的分子に結合するように設計されている。実施形態では、１つ以上のガイドＲＮＡは、１つ以上のウイルス株を区別するように設計されている。実施形態では、１つ以上のガイドＲＮＡは、少なくとも９０のガイドＲＮＡを含む。
例示的な実施形態のこれら及び他の態様、目的、特徴、及び利点は、示された例示的な実施形態の以下の詳細な説明を考慮すれば、当業者には明らかになるであろう。
本発明の特徴及び利点の理解は、本発明の原理が利用され得る例示的な実施形態を説明する以下の詳細な説明、及びその添付の図面を参照することによって得られるであろう。
液滴検出の例示的な方法の概略図を提供する。ＳＨＥＲＬＯＣＫによる病原菌の検出は、マイクロウェルのアレイを備えたチップ上の液滴で検出を実行することにより、大量に多重化できる。増幅反応（ＲＰＡまたはＰＣＲを使用）は、標準のチューブまたはマイクロウェルで実施できる。次いで、検出及び増幅混合物をマイクロウェルに並べる。蛍光色素の比率で構成される独自の蛍光バーコードを、各検出ミックス及び各標的に追加できる。バーコード化された試薬は油中で乳化され、エマルションからの液滴は一緒に１つのチューブにプールされる。液滴プールは、マイクロウェルアレイを搭載したＰＤＭＳチップにロードされる。各マイクロウェルは２つの液滴に対応し、プールされたすべての液滴のペアワイズの組み合わせをランダムに作成する。マイクロウェルをガラスに固定して各ウェルの内容物を隔離し、蛍光顕微鏡を使用してすべての液滴のバーコードを読み取り、各マイクロウェルの内容物を決定する。画像化後、液滴は電場にマージされ、検出ミックスと標的が混合され、検出反応が開始される。チップをインキュベートして反応を進行させ、蛍光顕微鏡を使用してＳＨＥＲＬＯＣＫ（特異的高感度酵素的レポーターｕｎＬＯＣＫｉｎｇ）反応の進行をモニタリングする。
検出試薬と標的が油中で液滴として安定に乳化できることを示す画像を含む。左：油に乳化された標的の水溶液の白色光画像。右：検出試薬と標的のライブラリーがロードされたマイクロウェルチップの蛍光画像。それぞれに一意の蛍光バーコードを有する。各ウェルの内容物は、蛍光バーコードから決定できる。
ＳＨＥＲＬＯＣＫがプレートと液滴で同等に良好に機能することを示すグラフを含む。左：プレート中のジカウイルスに対するＳＨＥＲＬＯＣＫの感度曲線。右：液滴中のジカウイルスに対する同じＳＨＥＲＬＯＣＫアッセイの感度曲線。左側のエラーバーは１つの標準偏差を示す。右側のエラーバーはＳ．Ｅ．Ｍ．である。
ＳＨＥＲＬＯＣＫがプレートと液滴で同等に良好に一塩基多型（ＳＮＰ）を区別することを示すグラフを提供する。左：ジカウイルスが米国に拡散した際に生じたＳＮＰのＳＨＥＲＬＯＣＫによる区別。右：同じＳＮＰの液滴ＳＨＥＲＬＯＣＫ検出。左側のエラーバーは１つの標準偏差を示す。右側のエラーバーはＳ．Ｅ．Ｍ．である。
マイクロウェルアレイ内の液滴中のＳＨＥＲＬＯＣＫ検出によってインフルエンザのサブタイプを区別できることを示すヒートマップを含む。ｃｒＲＮＡプールのバックグラウンド減算後のフォールドターンオンは、ヒートマップに示される。
インフルエンザＨサブタイプの多重検出のヒートマップ結果を含む。２００８年以降に寄託された配列に基づいて、インフルエンザのＨセグメントを標的とする４１のｃｒＲＮＡが設計された。ボックスは、各サブタイプに対して設計されたｃｒＲＮＡのセットを示し、アスタリスクは、０または１のミスマッチを持つ各サブタイプの大多数のコンセンサス配列に整列するｃｒＲＮＡを示す。Ｈ４、Ｈ８、及びＨ１２に対する対照ｃｒＲＮＡプールが示される。
インフルエンザＨサブタイプの多重検出の第２の設計のヒートマップを示す。２００８年以降に寄託された配列に基づき、より新しい配列に優先的な重み付けをして、インフルエンザのＨセグメントを標的とする２８のｃｒＲＮＡが設計された。ボックスは、各サブタイプに対して設計されたｃｒＲＮＡのセットを示し、アスタリスクは、０または１のミスマッチを持つ各サブタイプの大多数のコンセンサス配列に整列するｃｒＲＮＡを示す。Ｈ４、Ｈ８、及びＨ１２に対する対照ｃｒＲＮＡプールが示される。
インフルエンザＮサブタイプの多重検出のヒートマップを含む。２００８年以降に寄託された配列に基づき、より新しい配列に優先的な重み付けをして、インフルエンザのＨセグメントを標的とする３５のｃｒＲＮＡが設計された。ボックスは、各サブタイプに対して設計されたｃｒＲＮＡのセットを示し、アスタリスクは、０または１のミスマッチを持つ各サブタイプの大多数のコンセンサス配列に整列するｃｒＲＮＡを示す。「ｃｒＲＮＡ３６」は、ｃｒＲＮＡを添加していない陰性対照を示す。
液滴ＳＨＥＲＬＯＣＫを使用したＨＩＶ逆転写酵素の６つの変異の多重検出を含む。祖先及び派生配列の両方の合成標的を使用して、祖先及び派生の対立遺伝子を標的とするｃｒＲＮＡの示された変異について、蛍光が様々な時点で示される。合成標的（１０４ｃｐ／μｌ）は、マルチプレックスＰＣＲを使用して増幅され、液滴ＳＨＥＲＬＯＣＫを使用して検出された。エラーバー：Ｓ．Ｅ．Ｍ．
ＨＩＶ由来のｖ０と祖先ｖ１の試験がどのように機能するかを示し、潜在的に一緒に使用できことを示す。
液滴ＳＨＥＲＬＯＣＫを使用したＴＢの薬剤耐性変異の多重検出の結果を含む。両方の対立遺伝子（参照及び薬剤耐性）について、３０分後にバックグラウンドを差し引いた蛍光が示される。
ＳＨＥＲＬＯＣＫとマイクロウェルアレイチップテクノロジーの組み合わせが、これまでの多重検出で最高のスループットを提供することを示すグラフである。
バーコード数とチップサイズの拡張により、いかに大量の多重化が可能になるかを示す。（左）３つの蛍光色素を使用して、現在の６４のバーコードセットが１０５のバーコードに拡張された。第４の色素を追加する可能性は、本発明者らによる既存のシステムと比較してコーディング精度を損なうことなく小規模で実証されており、数百のバーコードの規模に簡単に拡張できる。（右）既存のチップサイズを４倍にすることができ、アッセイ開発に必要なチップ数を４分の１に削減できる。
追加のバーコードと拡張されたチップ寸法の実装により、示されているように、ヒトに関連するすべてのウイルスについて約２０のサンプルを一度に試験できることを示すグラフを含む。
本明細書の図は、例示のみを目的としており、必ずしも縮尺通りには描かれていない。
例示的な実施形態の詳細な説明
一般的な定義
別途定義されない限り、本明細書において使用される技術用語及び科学用語は、本開示の関係する技術分野における当業者によって一般に理解されるものと同一の意味を有する。分子生物学の一般的な用語と技術の定義は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ，ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ）；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，４ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ（２０１２）（Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｓａｍｂｒｏｏｋ）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （１９８７）（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．）；ｔｈｅ ｓｅｒｉｅｓ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）：ＰＣＲ ２：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（１９９５）（Ｍ．Ｊ．ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ，ａｎｄ Ｇ．Ｒ．Ｔａｙｌｏｒ ｅｄｓ．）：Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９８８）（Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，ｅｄｓ．）：Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ ２０１３（Ｅ．Ａ．Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ ｅｄ．）；Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（１９８７）（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．）；Ｂｅｎｊａｍｉｎ Ｌｅｗｉｎ，Ｇｅｎｅｓ ＩＸ，Ｊｏｎｅｓ ａｎｄ Ｂａｒｔｌｅｔにより公開、２００８（ＩＳＢＮ ０７６３７５２２２３）；Ｋｅｎｄｒｅｗ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｔｈｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｔｄ．により公開、１９９４（ＩＳＢＮ ０６３２０２１８２９）；Ｒｏｂｅｒｔ Ａ．Ｍｅｙｅｒｓ （ｅｄ．），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ａ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．により公開、１９９５（ＩＳＢＮ ９７８０４７１１８５７１０）；Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２ｎｄ ｅｄ．，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．１９９４），Ｍａｒｃｈ，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ４ｔｈ ｅｄ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．１９９２）；及びＭａｒｔｅｎ Ｈ．Ｈｏｆｋｅｒ ａｎｄ Ｊａｎ ｖａｎ Ｄｅｕｒｓｅｎ，Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｍｏｕｓｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（２０１１）に見出され得る。
本明細書で使用されるとき、単数形「ａ（不定冠詞）」、「ａｎ（不定冠詞）」、及び「ｔｈｅ（定冠詞）」は、文脈がそうではないと明確に指示しない限り、単数及び複数の指示対象の両方を含む。
「任意選択的な」または「任意選択的に」という用語は、続いて記載された事象、状況、または置換基が起こっても起こらなくてもよいこと、ならびに記載が、当該事象または状況が起こる場合の例及びそれが起こらない場合の例を含むことを意味する。
端点による数値範囲の列挙は、それぞれの範囲内に包含されるすべての数及び分数、ならびに言及された端点を含む。
本明細書で使用されるとき、「約」または「およそ」という用語は、パラメーター、量、時間的持続時間などの測定可能な値を指す場合、特定の値の及び特定の値からの変動を、そのような変動が、開示された本発明において行うために適切である限り、例えば、特定された値の及び特定の値からの＋／－１０％以下、＋／－５％以下、＋／－１％以下、及び＋／－０．１％以下の変動を含むことを意味する。修飾語「約」または「およそ」が指す値自体はまた、具体的であり、かつ好ましくは開示されていることを理解されたい。
本明細書を通して「一実施形態」、「実施形態」、「実施形態の例」への言及は、実施形態に関連して記載された特定の特徴、構造または特性が本発明の少なくとも一つの実施形態に含まれることを意味する。したがって、本明細書全体の様々な場所における「一実施形態では」、「ある実施形態では」、または「実施形態の例」という語句の出現は、必ずしもすべてが同じ実施形態を指しているわけではない。さらに、特定の特徴、構造、または特性は、本開示から当業者には明らかなように、１つ以上の実施形態では、任意の適切な方法で組み合わせられてもよい。さらに、本明細書に記載されるいくつかの実施形態は、他の実施形態に含まれる他の特徴ではなくいくつかを含むが、異なる実施形態の特徴の組み合わせは、本発明の範囲内にあることを意味する。例えば、添付の特許請求の範囲において、特許請求される実施形態のいずれも、任意の組み合わせで使用され得る。
「Ｃ２ｃ２」は現在、「Ｃａｓ１３ａ」と呼ばれ、それらの用語は別段の指示がない限り、本明細書において交換可能に利用される。
本明細書に引用されるすべての刊行物、公開特許文書、及び特許出願は、個々の出版物、公開特許文書、または特許出願が参照により組み込まれると具体的かつ個別に示されるのと同じ程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
概要
本明細書に開示される実施形態は、ＲＮＡ標的エフェクターを利用して、液滴中で検出を実施することにより、大規模に多重化されたアプリケーションに対して堅牢なＣＲＩＳＰＲベースの診断を提供する。本明細書に開示される実施形態は、ＤＮＡとＲＮＡの両方を同等の感度レベルで検出でき、ナノリットル容量での単一塩基対の違いに基づいて、非標的から標的を区別できる。そのような実施形態は、例えば、ウイルス検出、細菌株タイピング、高感度ジェノタイピング、マルチプレックスＳＮＰ検出、マルチプレックス株識別、及び疾患関連無細胞ＤＮＡの検出を含む、ヒトの健康における複数のシナリオで有用である。参照を容易にするために、本明細書に開示される実施形態は、ＳＨＥＲＬＯＣＫ（特異的高感度酵素的レポーターｕｎＬＯＣＫｉｎｇ）とも呼ばれる。これは、いくつかの実施形態では、多重化可能な液滴中で実行され、有利には、少量で高感度の検出を可能にする。
現在開示されている主題は、特定のＲＮＡ感知のためのプラットフォームを提供するＣ２ｃ２を含む、単一エフェクターＲＮＡ誘導ＲＮａｓｅ（Ｓｈｍａｋｏｖ ｅｔ ａｌ．，２０１５；Ａｂｕｄａｙｙｅｈ ｅｔ ａｌ．，２０１６；Ｓｍａｒｇｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１７）を含むプログラム可能なエンドヌクレアーゼを利用する。微生物のクラスター化等間隔短鎖回分リピート（ＣＲＩＳＰＲ）及びＣＲＩＳＰＲ関連（ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ）適応免疫システムからのＲＮＡ誘導ＲＮＡエンドヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）を使用して簡単かつ便利に再プログラムして、標的ＲＮＡを切断できる。Ｃ２ｃ２などのＲＮＡ誘導ＲＮａｓｅは、そのＲＮＡ標的を切断した後も活性を維持し、近接した非標的ＲＮＡの「付随的」切断をもたらす（Ａｂｕｄａｙｙｅｈ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。このｃｒＲＮＡによってプログラムされた付随的ＲＮＡ切断活性は、ＲＮＡ誘導ＲＮａｓｅを使用して、読み出しとして使用できる、インビボでプログラムされた細胞死またはインビトロでの非特異的ＲＮＡ分解を引き起こすことによって、特定のＲＮＡの存在を検出する機会を提供する（Ａｂｕｄａｙｙｅｈ ｅｔ ａｌ．，２０１６；Ｅａｓｔ－Ｓｅｌｅｔｓｋｙ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。現在開示されている主題は、液滴適用における切断活性を利用して、少量のサンプルとの多重反応を可能にする。
一態様では、検出ＣＲＩＳＰＲ系、１つ以上の標的分子の光学バーコード、及びマイクロ流体デバイスを含む多重検出システムが提供される。いくつかの実施形態では、検出ＣＲＩＳＰＲ系は、ＲＮＡ標的エフェクタータンパク質、対応する標的分子に結合するように設計された１つ以上のガイドＲＮＡ、ＲＮＡベースのマスキング構築物、及び光学バーコードを含む。いくつかの実施形態では、マイクロ流体デバイスは、マイクロウェルのアレイと、マイクロウェルの下に少なくとも１つのフローチャネルとを含み、マイクロウェルは、少なくとも２つの液滴を捕捉するサイズである。系は、キットとして提供できる。
一態様では、本明細書に開示される実施形態は、サンプル中の標的核酸を検出する方法を対象とする。本明細書に開示される方法は、いくつかの実施形態において、第１のセットの液滴を生成するステップであって、第１のセットの液滴における各液滴は、少なくとも１つの標的分子及び光学バーコードを含む、ステップと；第２のセットの液滴を生成するステップであって、第２のセットの液滴の各液滴は、ＲＮＡ標的エフェクタータンパク質、及び対応する標的分子に結合するように設計された１つ以上のガイドＲＮＡ、ＲＮＡベースのマスキング構築物、及び光学バーコードを含む検出ＣＲＩＳＰＲ系を含む、ステップと；第１のセットと第２のセットの液滴を組み合わせて液滴のプールにし、組み合わせた液滴のプールを、マイクロウェルのアレイと、マイクロウェルの下の少なくとも１つのフローチャネルとを含むマイクロ流体デバイス上に流すステップであって、マイクロウェルが少なくとも２つの液滴を捕捉するサイズであるステップと；マイクロウェルで液滴を捕捉し、各マイクロウェルで捕捉された液滴の光学バーコードを検出するステップと；各マイクロウェルで捕捉された液滴を、各マイクロウェルで形成されたマージ液滴にマージするステップであって、マージ液滴の少なくともサブセットは、検出ＣＲＩＳＰＲ系及び標的配列を含む、ステップと；検出反応を開始するステップと、を含み得る。次いで、マージ液滴は、１つ以上のガイドＲＮＡを１つ以上の標的分子に結合させるのに十分な条件下で維持される。１つ以上のガイドＲＮＡが標的核酸に結合すると、転じてＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質を活性化する。活性化されると、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質は、例えば、検出可能な陽性シグナルがマスキング解除、放出、または生成されるようにマスキング構築物を切断することにより、マスキング構築物を不活性化する。１つ以上の時間周期で各マージ液滴の検出可能なシグナルの検出及び測定を行うことができ、例えば、陽性の検出可能なシグナルが存在するとき、標的分子の存在を示す。
多重検出システム
多重システムも開示され、ＲＮＡ標的エフェクタータンパク質、及び対応する標的分子に結合するように設計された１つ以上のガイドＲＮＡ、ＲＮＡベースのマスキング構築物、及び１つ以上の標的分子光学バーコードである光学バーコードを含む検出ＣＲＩＳＰＲ系を含み、マイクロ流体デバイスは、マイクロウェルのアレイ及びマイクロウェルの下の少なくとも１つのフローチャネルを含む。実施形態では、マイクロウェルは少なくとも２つの液滴を捕捉するサイズである。
一般に、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ、またはＣＲＩＳＰＲ系とは、本明細書、及びＷＯ２０１４／０９３６２２（ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４６６７）などの文書で使用されているものであり、Ｃａｓ遺伝子をコードする配列、ｔｒａｃｒ（トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ）配列（例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡまたは活性部分ｔｒａｃｒＲＮＡ）、ｔｒａｃｒ－ｍａｔｅ配列（内因性ＣＲＩＳＰＲ系の状況で「ダイレクトリピート」及びｔｒａｃｒＲＮＡで処理された部分的なダイレクトリピートを含む）、ガイド配列（内因性ＣＲＩＳＰＲ系の状況で「スペーサー」とも呼ばれる）、またはその用語が本明細書で使用される「ＲＮＡ（複数可）」（例えば、Ｃａｓ９などのＣａｓをガイドするＲＮＡ（複数可）、例えばＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ及びトランス活性化（ｔｒａｃｒ）ＲＮＡまたはシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）（キメラＲＮＡ））またはＣＲＩＳＰＲ遺伝子座からの他の配列及び転写物を含む、ＣＲＩＳＰＲ関連（「Ｃａｓ」）遺伝子の活性の発現または活性の誘導に関与する転写物及び他の要素を総称的に指す。一般的に、ＣＲＩＳＰＲ系は、標的配列の部位においてＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進する要素（内因性ＣＲＩＳＰＲ系の文脈においてプロトスペーサーとも呼ばれる）によって特徴付けられる。
ＲＮＡ標的タンパク質
ＣＲＩＳＰＲタンパク質がＣ２ｃ２タンパク質である場合、ｔｒａｃｒＲＮＡは必要ない。Ｃ２ｃ２は、Ａｂｕｄａｙｙｅｈ ｅｔ ａｌ．（２０１６）“Ｃ２ｃ２ ｉｓ ａ ｓｉｎｇｌｅ－ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄ ＲＮＡ－ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ ｅｆｆｅｃｔｏｒ”；Ｓｃｉｅｎｃｅ；ＤＯＩ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．ａａｆ５５７３、及びＳｈｍａｋｏｖ ｅｔ ａｌ．（２０１５）“Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｄｉｖｅｒｓｅ Ｃｌａｓｓ ２ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ Ｓｙｓｔｅｍｓ”，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ，ＤＯＩ：ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｍｏｌｃｅｌ．２０１５．１０．００８によって記載され、これらは、参照によりそのすべての内容が本明細書に組み込まれる。Ｃａｓ１３ｂは、Ｓｍａｒｇｏｎ ｅｔ ａｌ．（２０１７）“Ｃａｓ１３ｂ Ｉｓ ａ Ｔｙｐｅ ＶＩ－Ｂ ＣＲＩＳＰＲ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ＲＮＡ－Ｇｕｉｄｅｄ ＲＮａｓｅｓ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ Ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｂｙ Ａｃｃｅｓｓｏｒｙ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ｃｓｘ２７ ａｎｄ Ｃｓｘ２８，”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ．６５，１－１３；ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｍｏｌｃｅｌ．２０１６．１２．０２３に記載され、これらは、参照によりそのすべての内容が本明細書に組み込まれる。ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質は、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０６５４７７号の表１～６、４０～５２ページに記載され、本明細書で開示される方法、システム、及びデバイスにおいて使用することができ、参照により本明細書に具体的に組み込まれる。
特定の実施形態において、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）またはＰＡＭ様モチーフは、本明細書に開示されるエフェクタータンパク質複合体の目的の標的遺伝子座への結合を指示する。いくつかの実施形態では、ＰＡＭは、５’ＰＡＭ（すなわち、プロトスペーサーの５’末端の上流に位置する）であり得る。他の実施形態では、ＰＡＭは、３’ＰＡＭ（すなわち、プロトスペーサーの５’末端の下流に位置する）であり得る。「ＰＡＭ」という用語は、「ＰＦＳ」または「プロトスペーサー隣接部位」または「プロトスペーサー隣接配列」という用語と互換的に使用され得る。
好ましい実施形態において、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質は、３’ＰＡＭを認識し得る。特定の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質は、５’Ｈである３’ＰＡＭを認識し得、ＨはＡ、ＣまたはＵである。特定の実施形態において、エフェクタータンパク質は、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｓｈａｈｉｉのＣ２ｃ２ｐ、より好ましくは、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｓｈａｈｉｉ ＤＳＭ １９７５７のＣ２ｃ２であってよく、３’ＰＡＭは、５’Ｈである。
ＣＲＩＳＰＲ複合体形成の文脈において、「標的配列」は、ガイド配列が相補性を有するように設計される配列を指し、標的配列とガイド配列の間のハイブリダイゼーションがＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進する。標的配列は、ＲＮＡポリヌクレオチドを含み得る。「標的ＲＮＡ」という用語は、標的配列である、または標的配列を含むＲＮＡポリヌクレオチドを指す。換言すると、標的ＲＮＡは、ｇＲＮＡの一部、すなわちガイド配列が相補性を有するように設計され、それに対してＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質とｇＲＮＡを含む複合体によって媒介されるエフェクター機能が指示されるＲＮＡポリヌクレオチドまたはＲＮＡポリヌクレオチドの一部であり得る。いくつかの実施形態において、標的配列は、細胞の核または細胞質に位置する。
ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質、特にＣ２ｃ２をコードする核酸分子は、有利にはコドン最適化ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質である。コドン最適化配列の例は、この場合、真核生物、例えばヒトでの発現のために最適化された配列である（すなわち、ヒトでの発現のために最適化されている）、または本明細書で議論される別の真核生物、動物または哺乳動物のための配列である。例えば、ＷＯ２０１４／０９３６２２（ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４６６７）のＳａＣａｓ９ヒトコドン最適化配列を参照されたい。これは好ましいが、他の例が可能であり、ヒト以外の宿主種に対するコドン最適化、または特定の臓器に対するコドン最適化が知られていることが理解されるであろう。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質をコードする酵素コード配列は、真核細胞などの特定の細胞での発現に最適化されたコドンである。真核生物細胞は、ヒトまたは非ヒト真核生物、あるいは本明細書で議論される動物または哺乳動物、例えば、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、家畜、または非ヒト哺乳動物もしくは霊長類を含むがこれらに限定されない植物または哺乳動物などの特定の生物であり得るか、またはそれに由来し得る。いくつかの実施形態では、人間の生殖細胞系列の遺伝的同一性を改変するプロセス及び／または人間または動物に実質的な医学的利益をもたらすことなく苦痛をもたらす可能性のある動物の遺伝的同一性を改変するプロセス、及びそのようなプロセスから結果として生じる動物が除外され得る。一般に、コドン最適化は、天然の配列の少なくとも１つのコドン（例えば、約１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、５０、またはそれ以上のコドン）を、天然のアミノ酸配列を維持しながら、その宿主細胞の遺伝子でより頻繁にまたは最も頻繁に使用されるコドンと置き換えることによって、目的の宿主細胞における増強された発現のために核酸配列を改変するプロセスを指す。様々な種が、特定のアミノ酸の特定のコドンに対して特定のバイアスを示す。コドンバイアス（生物間のコドン使用頻度の違い）は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の翻訳効率と相関することが多く、これは、同じく、とりわけ、翻訳されるコドンの特性及び特定のトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）分子の利用可能性に依存すると考えられている。細胞内の選択されたｔＲＮＡの優位性は、一般的にペプチド合成で最も頻繁に使用されるコドンを反映している。したがって、コドン最適化に基づいて、特定の生物における最適な遺伝子発現のために遺伝子を調整してもよい。コドン使用表は、例えばｋａｚｕｓａ．ｏｒｊｐ／ｃｏｄｏｎ／にある「Ｃｏｄｏｎ Ｕｓａｇｅ Ｄａｔａｂａｓｅ」で容易に入手可能であり、これらの表は、多数の方法で適合され得る。Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．“Ｃｏｄｏｎ ｕｓａｇｅ ｔａｂｕｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｄａｔａｂａｓｅｓ： ｓｔａｔｕｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｙｅａｒ ２０００”Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２８：２９２ （２０００）を参照されたい。Ｇｅｎｅ Ｆｏｒｇｅ（Ａｐｔａｇｅｎ；Ｊａｃｏｂｕｓ、ＰＡ）など、特定の宿主細胞で発現する特定の配列をコドン最適化するコンピューターアルゴリズムも利用してもよい。いくつかの実施形態では、Ｃａｓをコードする配列中の１つ以上のコドン（例えば、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、５０もしくはそれ以上、またはすべてのコドン）は、特定のアミノ酸で最も頻繁に使用されるコドンに対応する。
特定の実施形態において、本明細書に記載の方法は、Ｃａｓトランスジェニック細胞、特にＣ２ｃ２トランスジェニック細胞を提供することを含んでもよく、ここで、１つ以上のガイドＲＮＡをコードする１つ以上の核酸が、１つ以上の目的の遺伝子のプロモーターを含む調節エレメントと作動可能に接続されて細胞内に提供または導入される。本明細書で使用されるとき、「Ｃａｓトランスジェニック細胞」という用語は、Ｃａｓ遺伝子がゲノム的に組み込まれている真核細胞などの細胞を指す。本発明によれば、細胞の性質、タイプ、または起源は特に限定されない。また、Ｃａｓ導入遺伝子が細胞に導入される方法は様々であり得、当該技術分野で知られている任意の方法であり得る。特定の実施形態において、Ｃａｓトランスジェニック細胞は、Ｃａｓ導入遺伝子を単離細胞に導入することによって得られる。特定の他の実施形態において、Ｃａｓトランスジェニック細胞は、Ｃａｓトランスジェニック生物から細胞を単離することによって得られる。一例として、限定されないが、本明細書で言及されるＣａｓトランスジェニック細胞は、Ｃａｓノックイン真核生物などのＣａｓトランスジェニック真核生物に由来し得る。ＷＯ２０１４／０９３６２２（ＰＣＴ／ＵＳ１３／７４６６７）が参照され、参照により本明細書に組み込まれる。Ｒｏｓａ遺伝子座を標的とすることを目的としたＳａｎｇａｍｏ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．に帰属する米国特許公開第２０１２００１７２９０号及び第２０１１０２６５１９８号の方法は、本発明のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓシステムを利用するように改変され得る。Ｒｏｓａ遺伝子座を標的とすることを目的としたＣｅｌｌｅｃｔｉｓに帰属する米国特許公開第２０１３０２３６９４６号の方法もまた、本発明のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓシステムを利用するように改変され得る。さらなる例として、Ｃａｓ９ノックインマウスを記載する、参照により本明細書に組み込まれる、Ｐｌａｔｔ ｅｔ．ａｌ．（Ｃｅｌｌ；１５９（２）：４４０－４５５（２０１４））が参照される。Ｃａｓ導入遺伝子はさらにＬｏｘ－Ｓｔｏｐ－ｐｏｌｙＡ－Ｌｏｘ（ＬＳＬ）カセットを含むことができ、それによりＣａｓ発現をＣｒｅリコンビナーゼによって誘導可能にする。代替的に、Ｃａｓトランスジェニック細胞は、Ｃａｓ導入遺伝子を単離細胞に導入することによって得ることができる。導入遺伝子の送達システムは当該技術分野で周知である。例として、Ｃａｓ導入遺伝子は、ベクター（例えば、ＡＡＶ、アデノウイルス、レンチウイルス）及び／または粒子及び／またはナノ粒子送達によって、また本明細書のいずこかに記載のように、例えば真核細胞に送達されてもよい。
本明細書で言及されるＣａｓトランスジェニック細胞などの細胞は、組み込まれたＣａｓ遺伝子、またはＣａｓを標的遺伝子座に導くことが可能なＲＮＡと複合体化した場合のＣａｓの配列特異的作用から生じる変異を有することに加えて、さらなるゲノム変化を含み得ることは、当業者によって理解されるであろう。
特定の態様において、本発明は、例えば、Ｃａｓ及び／またはＣａｓを標的遺伝子座に導くことができるＲＮＡ（すなわち、ガイドＲＮＡ）を細胞内に送達または導入するためだけでなく、これらの成分を増殖させるため（例えば、原核細胞内）のベクターを含む。本明細書で使用されるとき、「ベクター」は、ある環境から別の環境への実体の転送を可能にするまたは容易にするツールである。これは、プラスミド、ファージ、またはコスミドなどのレプリコンであり、挿入されたセグメントの複製をもたらすために別のＤＮＡセグメントが挿入されてもよい。一般に、ベクターは適切な制御因子と結合している場合に複製することができる。一般に、「ベクター」という用語は、それが結合している別の核酸を輸送することができる核酸分子を指す。ベクターは、一本鎖、二本鎖、または部分的に二本鎖である核酸分子、１つ以上の自由末端を含む核酸分子、自由末端を含まない（例えば環状）核酸分子、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはその両方を含む核酸分子、及び当該技術分野に公知の他の様々なポリヌクレオチドを含むが、これらに限定されない。他の型のベクターは「プラスミド」であり、それは、標準的な分子クローニング技術などにより、追加的なＤＮＡセグメントを挿入することのできる、環状二重鎖ＤＮＡループを指す。別の型のベクターは、ウイルスベクターであり、ウイルス由来のＤＮＡまたはＲＮＡ配列が、ウイルス（例えば、レトロウイルス、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、複製欠損アデノウイルス、及びアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ））へパッケージ化するためのベクター中に存在する。ウイルスベクターはまた、宿主細胞へと遺伝子導入するためにウイルスによって担持されるポリヌクレオチドを含む。あるベクターは、それらが導入された宿主細胞において自律的複製が可能である（例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクター及びエピソーム哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞への導入の際、宿主細胞のゲノムに組み込まれ、それによって、宿主ゲノムとともに複製される。さらに、あるベクターは、それらが作動可能に連結された遺伝子の発現を駆動し得る。本明細書において、そのようなベクターは、「発現ベクター」と呼ばれる。組換えＤＮＡ技術において有用な一般的な発現ベクターは、しばしばプラスミドの形態である。
組換え発現ベクターは、宿主細胞における核酸の発現に好適な形態で本発明の核酸を含み得、それは、組換え発現ベクターが、発現に使用される宿主細胞に基づいて選択してもよい、発現すべき核酸配列に作動可能に連結される１つ以上の調節エレメントを含むことを意味する。組換え発現ベクターにおいて、「作動可能に連結」は、目的のヌクレオチド配列が調節エレメント（複数可）にヌクレオチド配列の発現（例えば、インビトロ転写／翻訳系、またはベクターが宿主細胞に導入されるとき、宿主内において）を可能とする様式で連結されることを意味することを意図する。組換え及びクローニング方法に関しては、２００４年９月２日にＵＳ２００４－０１７１１５６Ａ１として公開された米国特許出願第１０／８１５，７３０号が参照され、その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。したがって、本明細書に開示される実施形態は、ＣＲＩＳＰＲエフェクターシステムを含むトランスジェニック細胞も含み得る。特定の例示的な実施形態では、トランスジェニック細胞は、個別の別個のボリュームとして機能することができる。換言すると、マスキング構築物を含むサンプルは、例えば適切な送達小胞内の細胞に送達され得、標的が送達小胞中に存在する場合、ＣＲＩＳＰＲエフェクターが活性化され、検出可能なシグナルが生成される。
ベクター（複数可）は、調節エレメント（複数可）、例えばプロモーター（複数可）を含むことができる。ベクター（複数可）は、Ｃａｓをコードする配列、及び／または単一の、しかしおそらくは、少なくとも３または８または１６または３２または４８または５０のガイドＲＮＡ（複数可）（例えば、ｓｇＲＮＡ）をコードする配列、例えば１～２、１～３、１～４、１～５、３～６、３～７、３～８、３～９、３～１０、３～８、３～１６、３～３０、３～３２、３～４８、３～５０のＲＮＡ（複数可）（例えば、ｓｇＲＮＡ）を含むことができる。単一のベクターでは、各ＲＮＡ（例えば、ｓｇＲＮＡ）に対するプロモーターが存在してもよく、最大約１６個のＲＮＡ（複数可）がある場合に有利である。単一のベクターが１６を超えるＲＮＡ（複数可）を提供する場合、１つ以上のプロモーター（複数可）が１を超えるＲＮＡ（複数可）の発現を駆動することができる。例えば、３２のＲＮＡ（複数可）がある場合、各プロモーターは２つのＲＮＡ（複数可）の発現を駆動でき、４８のＲＮＡ（複数可）がある場合、各プロモーターは３つのＲＮＡ（複数可）の発現を駆動できる。単純な算術及び十分に確立されたクローニングプロトコール、及び本開示における教示により、当業者は、ＡＡＶなどの適切な例示的ベクター及びＵ６プロモーターなどの適切なプロモーターに対してＲＮＡ（複数可）について、本発明を容易に実施することができる。例えば、ＡＡＶのパッケージングの制限は約４．７ｋｂである。単一のＵ６－ｇＲＮＡ（及びクローニング用の制限部位）の長さは３６１ｂｐである。したがって、当業者は、約１２～１６個、例えば１３個のＵ６－ｇＲＮＡカセットを単一のベクターに容易に適合させることができる。これは、ＴＡＬＥアセンブリ（ｇｅｎｏｍｅ－ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．ｏｒｇ／ｔａｌｅｆｆｅｃｔｏｒｓ／）に使用されるゴールデンゲート戦略などの任意の適切な手段によって組み立てることができる。当業者はまた、タンデムガイド戦略を使用して、Ｕ６－ｇＲＮＡの数を約１．５倍、例えば１２～１６、例えば１３から約１８～２４、例えば約１９のＵ６－ｇＲＮＡに増やすことができる。したがって、当業者は、単一のベクター、例えばＡＡＶベクターにおいて約１８～２４、例えば約１９のプロモーター－ＲＮＡ、例えばＵ６－ｇＲＮＡに容易に到達することができる。ベクター内のプロモーターとＲＮＡの数を増やすためのさらなる手段は、単一のプロモーター（例えば、Ｕ６）を使用して、切断可能な配列によって隔てられたＲＮＡのアレイを発現することである。また、ベクター内のプロモーター－ＲＮＡの数を増やすためのさらに別の手段は、コード配列または遺伝子のイントロン内の切断可能な配列によって隔てられたプロモーター－ＲＮＡのアレイを発現することである。そして、この場合、発現が増加し、組織特異的な様式で長いＲＮＡの転写を可能にするポリメラーゼＩＩプロモーターを使用することが有利である。（例えば、ｎａｒ．ｏｘｆｏｒｄｊｏｕｍａｌｓ．ｏｒｇ／ｃｏｎｔｅｎｔ／３４／７／ｅ５３．ｓｈｏｒｔ、及びｎａｔｕｒｅ．ｃｏｍ／ｍｔ／ｊｏｕｍａｌ／ｖｌ６／ｎ９／ａｂｓ／ｍｔ２００８１４４ａ．ｈｔｍｌを参照されたい）。有利な実施形態では、ＡＡＶは、最大約５０個の遺伝子を標的とするＵ６タンデムｇＲＮＡをパッケージすることができる。したがって、当業者は、当該技術分野の知識及び本開示における教示から、１つ以上のプロモーターの制御下またはそれに作動的もしくは機能的に連結された複数のＲＮＡまたはガイドを発現するベクター（複数可）、例えば単一のベクターを容易に作成及び使用することができ、特に、本明細書で議論されるＲＮＡまたはガイドの数に関して、過度の実験は必要ない。
ガイドＲＮＡ（複数可）をコードする配列及び／またはＣａｓをコードする配列は、調節エレメント（複数可）に機能的または作動的に連結することができ、したがって調節エレメント（複数可）は発現を駆動する。プロモーター（複数可）は、構成的プロモーター（複数可）及び／または条件的プロモーター（複数可）及び／または誘導性プロモーター（複数可）及び／または組織特異的プロモーター（複数可）であり得る。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼ、ｐｏｌ Ｉ、ｐｏｌ ＩＩ、ｐｏｌ ＩＩＩ、Ｔ７、Ｕ６、Ｈ１、レトロウイルスラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸還元酵素プロモーター、β－アクチンプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、及びＥＦ１αプロモーターからなる群から選択できる。有利なプロモーターはプロモーターＵ６である。
いくつかの実施形態では、核酸標的化システムの１つ以上の要素は、内因性ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ標的系を含む特定の生物に由来する。特定の例示的な実施形態では、エフェクタータンパク質ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ標的系は、本明細書に記載のＨＥＰＮドメイン、当該技術分野で公知のＨＥＰＮドメイン、及びコンセンサス配列モチーフと比較してＨＥＰＮドメインであると認識されるドメインを含むがこれらに限定されない少なくとも１つのＨＥＰＮドメインを含む。そのようなドメインのいくつかが本明細書に提供される。１つの非限定的な例において、コンセンサス配列は、本明細書に提供されるＣ２ｃ２またはＣａｓ１３ｂオルソログの配列に由来し得る。特定の例示的な実施形態では、エフェクタータンパク質は、単一のＨＥＰＮドメインを含む。特定の他の例示的な実施形態では、エフェクタータンパク質は、２つのＨＥＰＮドメインを含む。
１つの例示的な実施形態において、エフェクタータンパク質は、ＲｘｘｘｘＨモチーフ配列を含む１つ以上のＨＥＰＮドメインを含む。ＲｘｘｘｘＨモチーフ配列は、非限定的に、本明細書に記載のＨＥＰＮドメインまたは当該技術分野で既知のＨＥＰＮドメインに由来し得る。ＲｘｘｘｘＨモチーフ配列は、２つ以上のＨＥＰＮドメインの一部を組み合わせることにより作成されたモチーフ配列をさらに含む。前述のように、コンセンサス配列は、「Ｎｏｖｅｌ Ｔｙｐｅ ＶＩ ＣＲＩＳＰＲ Ｏｒｔｈｏｌｏｇｓ ａｎｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ」と題するＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０３８１５４の例えば２５６～２６４ページ及び２８５～３３６ページ、「Ｎｏｖｅｌ ＣＲＩＳＰＲ Ｅｎｚｙｍｅｓ ａｎｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ」と題する米国仮特許出願６２／４７１，７１０、２０１７年３月１５日に出願された「Ｎｏｖｅｌ Ｔｙｐｅ ＶＩ ＣＲＩＳＰＲ Ｏｒｔｈｏｌｏｇｓ ａｎｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ」と題する米国仮特許出願第６２／４８４，７８６号、ならびに２０１７年４月１２日に出願された「Ｎｏｖｅｌ Ｔｙｐｅ ＶＩ ＣＲＩＳＰＲ Ｏｒｔｈｏｌｏｇｓ ａｎｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ」と題する米国仮特許出願第６２／４８４，７８６号に開示されているオルソログの配列に由来し得る。
本発明の一実施形態において、ＨＥＰＮドメインは、Ｒ｛Ｎ／Ｈ／Ｋ｝Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｈの配列を含む少なくとも１つのＲｘｘｘｘＨモチーフを含む。発明の一実施形態において、ＨＥＰＮドメインは、Ｒ｛Ｎ／Ｈ｝Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｈの配列を含むＲｘｘｘｘＨモチーフを含む。本発明の一実施形態において、ＨＥＰＮドメインは、Ｒ｛Ｎ／Ｋ｝Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｈの配列を含む。特定の実施形態では、Ｘ１はＲ、Ｓ、Ｄ、Ｅ、Ｑ、Ｎ、Ｇ、Ｙ、またはＨである。特定の実施形態では、Ｘ２はＩ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、またはＬである。特定の実施形態では、Ｘ３はＬ、Ｆ、Ｎ、Ｙ、Ｖ、Ｉ、Ｓ、Ｄ、Ｅ、またはＡである。
本発明によって使用するための追加のエフェクターは、例えば、ｃａｓｌ遺伝子の開始から２０ｋｂ及びｃａｓｌ遺伝子の最後から２０ｋｂの領域内にあるが、これらに限定されない、ｃａｓｌ遺伝子へのそれらの近接性によって同定することができる。特定の実施形態において、エフェクタータンパク質は、少なくとも１つのＨＥＰＮドメイン及び少なくとも５００のアミノ酸を含み、Ｃ２ｃ２エフェクタータンパク質は、Ｃａｓ遺伝子またはＣＲＩＳＰＲアレイの２０ｋｂ上流または下流内の原核生物ゲノムに自然に存在する。Ｃａｓタンパク質の非限定的な例は、Ｃａｓｌ、ＣａｓｌＢ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（Ｃｓｎｌ及びＣｓｘ１２としても知られる）、Ｃａｓ１０、Ｃｓｙｌ、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅｌ、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃｌ、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒｌ、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂｌ、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆｌ、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、それらのホモログ、またはそれらの改変したものを含む。特定の例示的な実施形態では、Ｃ２ｃ２エフェクタータンパク質は、Ｃａｓ１遺伝子の２０ｋｂ上流または下流内の原核生物ゲノムに自然に存在する。「オルソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇｕｅ）」（本明細書では「オルソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）」とも呼ばれる）及び「ホモログ（ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ）」（本明細書では「ホモログ（ｈｏｍｏｌｏｇ）」とも呼ばれる）という用語は、当該技術分野で周知である。追加のガイダンスとして、本明細書で使用されるタンパク質の「ホモログ」は、ホモログの関係にあるタンパク質と同じまたは同様の機能を発揮する、同じ種のタンパク質である。相同タンパク質は、可能性としてはあり得るが、構造的に関連する必要はなく、またはその構造的な関連性は部分的なものにすぎない。本明細書で使用されるタンパク質の「オルソログ」は、オルソログの関係にあるタンパク質と同じまたは同様の機能を発揮する、異なる種のタンパク質である。オルソロガスタンパク質は、可能性としてはあり得るが、構造的に関連する必要はなく、またはその構造的な関連性は部分的なものにすぎない。
特定の実施形態では、ＶＩ型のＲＮＡ標的Ｃａｓ酵素はＣ２ｃ２である。他の実施形態では、ＶＩ型のＲＮＡ標的Ｃａｓ酵素はＣａｓ１３ｂである。特定の実施形態において、本明細書で言及されるＣ２ｃ２などのＶＩ型タンパク質のホモログまたはオルソログは、Ｃ２ｃ２（（例えば、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｓｈａｈｉｉ Ｃ２ｃ２、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＭＡ２０２０ Ｃ２ｃ２、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＮＫ４Ａ１７９ Ｃ２ｃ２、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｍｉｎｏｐｈｉｌｕｍ（ＤＳＭ １０７１０）Ｃ２ｃ２、Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ（ＤＳＭ ４８４７）Ｃ２ｃ２、Ｐａｌｕｄｉｂａｃｔｅｒ ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｉｇｅｎｅｓ （ＷＢ４）Ｃ２ｃ２、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｗｅｉｈｅｎｓｔｅｐｈａｎｅｎｓｉｓ（ＦＳＬ Ｒ９－０３１７）Ｃ２ｃ２、Ｌｉｓｔｅｒｉａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ（ＦＳＬ Ｍ６－０６３５）Ｃ２ｃ２、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｎｅｗｙｏｒｋｅｎｓｉｓ（ＦＳＬ Ｍ６－０６３５）Ｃ２ｃ２、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｗａｄｅｉ（Ｆ０２７９）Ｃ２ｃ２、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ（ＳＢ １００３）Ｃ２ｃ２、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ（Ｒ１２１）Ｃ２ｃ２、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ（ＤＥ４４２）Ｃ２ｃ２、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｗａｄｅｉ（Ｌｗ２）Ｃ２ｃ２、またはＬｉｓｔｅｒｉａ ｓｅｅｌｉｇｅｒｉ Ｃ２ｃ２）のいずれかの野生型の配列に基づいて）などのＶＩ型タンパク質と、少なくとも３０％、または少なくとも４０％、または少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、例えば、少なくとも９５％の配列相同性または同一性を有する。さらなる実施形態において、本明細書で言及されるＣ２ｃ２などのＶＩ型タンパク質のホモログまたはオルソログは、野生型Ｃ２ｃ２（（例えば、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｓｈａｈｉｉ Ｃ２ｃ２、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＭＡ２０２０ Ｃ２ｃ２、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＮＫ４Ａ１７９ Ｃ２ｃ２、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｍｉｎｏｐｈｉｌｕｍ（ＤＳＭ １０７１０）Ｃ２ｃ２、Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ（ＤＳＭ ４８４７）Ｃ２ｃ２、Ｐａｌｕｄｉｂａｃｔｅｒ ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｉｇｅｎｅｓ（ＷＢ４）Ｃ２ｃ２、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｗｅｉｈｅｎｓｔｅｐｈａｎｅｎｓｉｓ（ＦＳＬ Ｒ９－０３１７）Ｃ２ｃ２、Ｌｉｓｔｅｒｉａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ（ＦＳＬ Ｍ６－０６３５）Ｃ２ｃ２、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｎｅｗｙｏｒｋｅｎｓｉｓ（ＦＳＬ Ｍ６－０６３５）Ｃ２ｃ２、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｗａｄｅｉ（Ｆ０２７９） Ｃ２ｃ２、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ（ＳＢ １００３）Ｃ２ｃ２、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ（Ｒ１２１）Ｃ２ｃ２、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ（ＤＥ４４２）Ｃ２ｃ２、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｗａｄｅｉ（Ｌｗ２）Ｃ２ｃ２、またはＬｉｓｔｅｒｉａ ｓｅｅｌｉｇｅｒｉ Ｃ２ｃ２）のいずれかの野生型の配列に基づいて）と、少なくとも３０％、または少なくとも４０％、または少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、例えば、少なくとも９５％の配列同一性を有する。
特定の他の例示的な実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ系のエフェクタータンパク質はＣ２ｃ２ヌクレアーゼである。Ｃ２ｃ２の活性は、２つのＨＥＰＮドメインの存在に依存していてもよい。これらは、ＲＮａｓｅドメイン、すなわちヌクレアーゼ（特にエンドヌクレアーゼ）切断ＲＮＡであることが示されている。Ｃ２ｃ２ ＨＥＰＮは、ＤＮＡ、または潜在的にＤＮＡ及び／またはＲＮＡを標的とし得る。Ｃ２ｃ２のＨＥＰＮドメインが少なくともＲＮＡに結合でき、野生型ではＲＮＡの切断が可能であることに基づいて、Ｃ２ｃ２エフェクタータンパク質はＲＮａｓｅ機能を有することが好ましい。Ｃ２ｃ２ ＣＲＩＳＰＲ系に関しては、ＴＹＰＥ ＶＩ ＣＲＩＳＰＲ ＯＲＴＨＯＬＯＧＳ ＡＮＤ ＳＹＳＴＥＭＳと題する国際特許公開第ＷＯ／２０１７／２１９０２７号、２０１６年６月１７日に出願された米国仮特許出願第６２／３５１，６６２号、及び２０１６年８月１７日に出願された米国仮特許出願第６２／３７６，３７７号を参照されたい。２０１６年６月１７日に出願された米国仮特許第６２／３５１，８０３号も参照される。また、２０１６年１２月８日に出願された、Ｂｒｏａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ番号１００３５．ＰＡ４及び代理人ドケット番号４７６２７．０３．２１３３の「Ｎｏｖｅｌ Ｃｒｉｓｐｒ Ｅｎｚｙｍｅｓ ａｎｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ」と題する米国仮特許も参照される。さらに、Ｅａｓｔ－Ｓｅｌｅｔｓｋｙ ｅｔ ａｌ．“Ｔｗｏ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ＲＮａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃ２ｃ２ ｅｎａｂｌｅ ｇｕｉｄｅ－ＲＮＡ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ａｎｄ ＲＮＡ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ”Ｎａｔｕｒｅ ｄｏｉ：１０／１０３８／ｎａｔｕｒｅｌ９８０２、及びＡｂｕｄａｙｙｅｈ ｅｔ ａｌ．“Ｃ２ｃ２ ｉｓ ａ ｓｉｎｇｌｅ－ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄ ＲＮＡ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ ｅｆｆｅｃｔｏｒ”ｂｉｏＲｘｉｖ ｄｏｉ：１０．１１０１／０５４７４２も参照される。
ＣＲＩＳＰＲ系におけるＲＮａｓｅ機能は知られており、例えば、ｍＲＮＡ標的は特定のＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系で報告され（Ｈａｌｅ ｅｔ ａｌ．，２０１４，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ，ｖｏｌ．２８，２４３２－２４４３、Ｈａｌｅ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｃｅｌｌ，ｖｏｌ．１３９，９４５－９５６、Ｐｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｒｅｓｅａｒｃｈ，ｖｏｌ．４３，４０６－４１７）、重要な利点を提供する。Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ ＩＩＩ－Ａ型システムでは、標的間の転写は、Ｃａｓ１０－Ｃｓｍリボ核タンパク質エフェクタータンパク質複合体内の独立した活性部位によって媒介される標的ＤＮＡとその転写産物の切断をもたらす（Ｓａｍａｉ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｃｅｌｌ，ｖｏｌ．１５１，１１６４－１１７４を参照されたい）。したがって、本発明のエフェクタータンパク質を介してＲＮＡを標的とするＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系、組成物または方法が提供される。
一実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、以下を含むがこれに限定されない属の生物のＣ２ｃ２オルソログであり得る：Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ、Ｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ、Ｆｉｌｉｆａｃｔｏｒ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｆｌａｖｉｉｖｏｌａ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓｐｈａｅｒｏｃｈａｅｔａ、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ、Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｎｉｔｒａｔｉｆｒａｃｔｏｒ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ、及びＬａｃｈｎｏｓｐｉｒａ。そのような属の生物種はさもなければ、本明細書で議論された通りであり得る。
特定の例示的な実施形態では、本発明のＣ２ｃ２エフェクタータンパク質には、非限定的に以下の２１のオルソログ種が含まれる（複数のＣＲＩＳＰＲ遺伝子座を含む：Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｓｈａｈｉｉ；Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｗａｄｅｉ（Ｌｗ２）；Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｓｅｅｌｉｇｅｒｉ；Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＭＡ２０２０；Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＮＫ４Ａ１７９；［Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ］ａｍｉｎｏｐｈｉｌｕｍ ＤＳＭ １０７１０；Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ ＤＳＭ ４８４７；Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ ＤＳＭ ４８４７（第２のＣＲＩＳＰＲ遺伝子座）；Ｐａｌｕｄｉｂａｃｔｅｒ ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｉｇｅｎｅｓ ＷＢ４；Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｗｅｉｈｅｎｓｔｅｐｈａｎｅｎｓｉｓ ＦＳＬ Ｒ９－０３１７；Ｌｉｓｔｅｒｉａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＦＳＬ Ｍ６－０６３５；Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｗａｄｅｉ Ｆ０２７９；Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ ＳＢ １００３；Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ Ｒ１２１；Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ ＤＥ４４２；Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｂｕｃｃａｌｉｓ Ｃ－１０１３－ｂ；Ｈｅｒｂｉｎｉｘ ｈｅｍｉｃｅｌｌｕｌｏｓｉｌｙｔｉｃａ；［Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ］ｒｅｃｔａｌｅ；Ｅｕｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＣＨＫＣＩ００４；Ｂｌａｕｔｉａ ｓｐ．Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ－Ｐ２３９８；及びＬｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｓｐ．ｏｒａｌ ｔａｘｏｎ ８７９ ｓｔｒ．Ｆ０５５７。１２のさらなる非限定的な例は以下の通りである：Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＮＫ４Ａ１４４；Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ ａｇｇｒｅｇａｎｓ；Ｄｅｍｅｑｕｉｎａ ａｕｒａｎｔｉａｃａ；Ｔｈａｌａｓｓｏｓｐｉｒａ ｓｐ．ＴＳＬ５－１；Ｐｓｅｕｄｏｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ ｓｐ．ＯＲ３７；Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ ｓｐ．ＹＡＢ３００１；Ｂｌａｕｔｉａ ｓｐ．Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ－Ｐ２３９８；Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｓｐ．Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ－Ｐ３００７；Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｉｈｕａｅ；Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＫＨ３ＣＰ３ＲＡ；Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｒｉｐａｒｉａ；及びＩｎｓｏｌｉｔｉｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｐｅｒｅｇｒｉｎｕｍ。
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系酵素のオルソログを特定するいくつかの方法は、対象のゲノム内のｔｒａｃｒ配列を特定することを含み得る。ｔｒａｃｒ配列の特定は、次のステップに関連し得る：データベースでダイレクトリピートまたはｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列を検索して、ＣＲＩＳＰＲ酵素を含むＣＲＩＳＰＲ領域を特定する。センスとアンチセンスの両方向でＣＲＩＳＰＲ酵素に隣接するＣＲＩＳＰＲ領域の相同配列を検索する。転写ターミネーターと二次構造を探す。ダイレクトリピートまたはｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列ではないが、潜在的なｔｒａｃｒ配列として、ダイレクトリピートまたはｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列と５０％を超える同一性を持つ任意の配列を特定する。潜在的なｔｒａｃｒ配列を取得し、それに関連する転写ターミネーター配列を分析する。
本明細書に記載の機能のいずれも、複数のオルソログからの断片を含むキメラ酵素を含む、他のオルソログからのＣＲＩＳＰＲ酵素に操作できることが理解されよう。そのようなオルソログの例は、本明細書のいずこかに記載されている。したがって、キメラ酵素は、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ、Ｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ、Ｆｉｌｉｆａｃｔｏｒ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｆｌａｖｉｉｖｏｌａ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓｐｈａｅｒｏｃｈａｅｔａ、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ、Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｎｉｔｒａｔｉｆｒａｃｔｏｒ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ、及びＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒを含むがこれらに限定されない生物のＣＲＩＳＰＲ酵素オルソログの断片を含み得る。キメラ酵素は、第１の断片及び第２の断片を含むことができ、断片は、本明細書で言及される属または本明細書で言及される種の生物のＣＲＩＳＰＲ酵素オルソログであり得る。有利には、断片は異なる種のＣＲＩＳＰＲ酵素オルソログに由来する。
実施形態において、本明細書で言及されるＣ２ｃ２タンパク質は、Ｃ２ｃ２またはそのホモログもしくはオルソログの機能的バリアントも包含する。本明細書で使用されるとき、タンパク質の「機能的バリアント」は、そのタンパク質の活性を少なくとも部分的に保持する、そのようなタンパク質のバリアントを指す。機能的バリアント」には、多形体などを含む変異体（挿入、欠失、または置換変異体であり得る）が含まれ得る。また、機能的バリアントには、そのようなタンパク質と、通常は無関係な別の核酸、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドとの融合産物も含まれる。機能的バリアントは、天然に存在する場合もあれば、人工的に発生する場合もある。有利な実施形態は、操作された、または天然に存在しないＶＩ型ＲＮＡ標的エフェクタータンパク質を含み得る。
一実施形態において、Ｃ２ｃ２またはそのオルソログもしくはホモログをコードする核酸分子（複数可）は、真核細胞における発現のためにコドン最適化され得る。真核生物は、本明細書で論じられるものであり得る。核酸分子（複数可）は、操作されたものでも、天然に存在しないものでもよい。
一実施形態において、Ｃ２ｃ２またはそのオルソログもしくはホモログは、１つ以上の変異を含み得る（したがって、それをコードする核酸分子（複数可）は変異（複数可）を有し得る）。変異は、人工的に導入された変異であり得、触媒ドメインにおける１つ以上の変異を含み得るが、これらに限定されない。Ｃａｓ９酵素に関する触媒ドメインの例には、ＲｕｖＣ Ｉ、ＲｕｖＣ ＩＩ、ＲｕｖＣ ＩＩＩ及びＨＮＨドメインが含まれ得るが、これらに限定されない。
一実施形態において、Ｃ２ｃ２またはそのオルソログもしくはホモログは、１つ以上の変異を含み得る。変異は、人工的に導入された変異であり得、触媒ドメインにおける１つ以上の変異を含み得るが、これらに限定されない。Ｃａｓ酵素に関する触媒ドメインの例には、ＨＥＰＮドメインが含まれるが、これらに限定されない。
一実施形態において、Ｃ２ｃ２またはそのオルソログもしくはホモログは、機能的ドメインに融合するか、または機能的ドメインに作動可能に連結される一般的な核酸結合タンパク質として使用され得る。例示的な機能ドメインには、翻訳開始剤、翻訳活性化因子、翻訳抑制因子、ヌクレアーゼ、特にリボヌクレアーゼ、スプライソソーム、ビーズ、光誘導可能／制御可能ドメイン、または化学的誘導可能／制御可能ドメインが含まれ得るが、これらに限定されない。
特定の例示的な実施形態において、Ｃ２ｃ２エフェクタータンパク質は、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ、Ｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ、Ｆｉｌｉｆａｃｔｏｒ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｆｌａｖｉｉｖｏｌａ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓｐｈａｅｒｏｃｈａｅｔａ、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ、Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｎｉｔｒａｔｉｆｒａｃｔｏｒ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ、及びＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒからなる群から選択される生物に由来し得る。
特定の実施形態において、エフェクタータンパク質は、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｓｐ．Ｃ２ｃ２ｐ、好ましくはＬｉｓｔｅｒｉａ ｓｅｅｌｉｇｅｒｉａ Ｃ２ｃ２ｐ、より好ましくはＬｉｓｔｅｒｉａ ｓｅｅｌｉｇｅｒｉａ血清型１／２ｂ株ＳＬＣＣ３９５４ Ｃ２ｃ２ｐであり得、ｃｒＲＮＡ配列は、５’の２９ｎｔの直接反復（ＤＲ）及び１５ｎｔ～１８ｎｔのスペーサーを含み、４４～４７ヌクレオチド長であり得る。
特定の実施形態において、エフェクタータンパク質は、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｓｐ．Ｃ２ｃ２ｐ、好ましくはＬｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｓｈａｈｉｉ Ｃ２ｃ２ｐ、より好ましくはＬｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｓｈａｈｉｉ ＤＳＭ １９７５７ Ｃ２ｃ２ｐであり得、ｃｒＲＮＡ配列は、５’直接反復が少なくとも２４ｎｔであり、例えば、５’の２４～２８ｎｔ直接反復（ＤＲ）を含み、少なくとも１４ｎｔのスペーサー、例えば、１４ｎｔ～２８ｎｔのスペーサー、または少なくとも１８ｎｔ、例えば、１９、２０、２１、２２、またはそれ以上のｎｔ、例えば、１８～２８、１９～２８、２０～２８、２１～２８、または２２～２８ｎｔのスペーサーを含み、４２～５８ヌクレオチド長であり得る。
特定の例示的な実施形態において、エフェクタータンパク質は、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｓｐ．、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｗａｄｅｉ Ｆ０２７９、またはＬｉｓｔｅｒｉａ ｓｐ．、好ましくはＬｉｓｔｅｒｉａ ｎｅｗｙｏｒｋｅｎｓｉｓ ＦＳＬ Ｍ６－０６３５であり得る。
特定の実施形態において、本発明によるＣ２ｃ２タンパク質は、オルソログの１つであるか、もしくはそれに由来するか、または本出願に記載のオルソログの２つ以上のキメラタンパク質であるか、またはオルソログの１つの変異体もしくはバリアント（またはキメラ変異体もしくはバリアント）であり、異種／機能ドメインとの融合の有無にかかわらず、本明細書の他の場所で定義される死Ｃ２ｃ２、分割Ｃ２ｃ２、不安定化Ｃ２ｃ２などを含む。
特定の例示的な実施形態では、ＲＮＡ標的エフェクタータンパク質は、Ｃａｓ１３ｂ及びグループ２９またはグループ３０タンパク質などのＶＩ－Ｂ型エフェクタータンパク質である。特定の例示的な実施形態では、ＲＮＡ標的エフェクタータンパク質は、１つ以上のＨＥＰＮドメインを含む。特定の例示的な実施形態では、ＲＮＡ標的エフェクタータンパク質は、Ｃ末端ＨＥＰＮドメイン、Ｎ末端ＨＥＰＮドメイン、またはその両方を含む。本発明に関連して使用できる例示的なタイプＶＩ－Ｂエフェクタータンパク質に関して、２０１６年１０月２１日に出願された、「Ｎｏｖｅｌ ＣＲＩＳＰＲ Ｅｎｚｙｍｅｓ ａｎｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ」と題する米国特許出願第１５／３３１，７９２号、２０１６年１０月２１日に出願された、「Ｎｏｖｅｌ ＣＲＩＳＰＲ Ｅｎｚｙｍｅｓ ａｎｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ」と題する国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０５８３０２号、及びＳｍａｒｇｏｎ ｅｔ ａｌ．“ｃａｓ１３ｂ ｉｓ ａ Ｔｙｐｅ ＶＩ－Ｂ ＣＲＩＳＰＲ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ＲＮＡ－Ｇｕｉｄｅｄ ＲＮａｓｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｂｙ ａｃｃｅｓｓｏｒｙ ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ｃｓｘ２７ ａｎｄ Ｃｓｘ２８” Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ，６５，１－１３（２０１７）；ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｍｏｌｃｅｌ．２０１６．１２．０２３、及び２０１７年３月１５日に出願された、「Ｎｏｖｅｌ ｃａｓ１３ｂ Ｏｒｔｈｏｌｏｇｕｅｓ ＣＲＩＳＰＲ Ｅｎｚｙｍｅｓ ａｎｄ Ｓｙｓｔｅｍ」と題する割り当てられる予定の米国仮出願を参照される。特定の例示的な実施形態では、参照により本明細書に組み込まれる国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０６５４７７号、４０～５２ページの表１～６に記載される、２つのＣａｓ１３ａオルソログ、２つのＣａｓ１３ｂオルソログ、または２つのＣａｓ１３ｃオルソログなど、同じクラスのＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質からの異なるオルソログを使用することができる。特定の他の例示的な実施形態では、異なるヌクレオチド編集選好性を有する異なるオルソログ、例えば、Ｃａｓ１３ａ及びＣａｓ１３ｂオルソログ、またはＣａｓ１３ａ及びＣａｓ１３ｃオルソログ、またはＣａｓ１３ｂオルソログ及びＣａｓ１３ｃオルソログなどを使用することができる。
ＲＮＡ標的エフェクタータンパク質は、いくつかの実施形態では、１つ以上のＨＥＰＮドメインを含むことができ、これは、場合によってはＲｘｘｘｘＨモチーフ配列を含むことができる。場合によっては、ＲｘｘｘＨモチーフはＲ｛Ｎ／Ｈ／Ｋ］Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｈ配列を含み、これは、いくつかの実施形態では、Ｘ１は、Ｒ、Ｓ、Ｄ、Ｅ、Ｑ、Ｎ、Ｇ、またはＹであり、Ｘ２は、独立してＩ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、またはＬであり、Ｘ３は、独立してＬ、Ｆ、Ｎ、Ｙ、Ｖ、Ｉ、Ｓ、Ｄ、Ｅ、またはＡである。いくつかの特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ標的エフェクタータンパク質は、Ｃ２ｃ２である。
ガイド
本明細書に開示される方法を利用して、１つ以上のウイルス株を区別するための１つ以上のガイドＲＮＡを設計することができる。実施形態では、方法は、ウイルス株を区別する、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、またはそれ以上のガイドＲＮＡを設計する。方法論は、１つ以上の標的増幅配列を同定する１つ以上の標的病原体への入力ゲノム配列のセットを可能にする。実施形態では、方法を利用して、１つ以上のガイド配列を生成することができ、これは、少なくとも９０のガイド配列であり得る。
本明細書で使用されるとき、「ガイド配列」、「ｃｒＲＮＡ」、「ガイドＲＮＡ」または「シングルガイドＲＮＡ」または「ｇＲＮＡ」という用語は、標的核酸配列とハイブリダイズし、ガイド配列とＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質とを含むＲＮＡ標的化複合体が標的核酸配列へ配列特異的結合するように差し向けるのに、標的核酸配列と十分な相補性を有する任意のポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを指す。いくつかの例示的な実施形態では、相補性の程度は、適切な整列アルゴリズムを使用して最適にアラインメントされる場合、約５０％、６０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７．５％、９９％、またはそれ以上である。最適なアラインメントは、アラインメント配列に適した任意のアルゴリズムを使用して決定され得るが、その非限定的な例には、Ｓｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム、Ｂｕｒｒｏｗｓ－Ｗｈｅｅｌｅｒ変換に基づくアルゴリズム（例えば、Ｂｕｒｒｏｗｓ Ｗｈｅｅｌｅｒ Ａｌｉｇｎｅｒ）、ＣｌｕｓｔａｌＷ、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｘ、ＢＬＡＴ、Ｎｏｖｏａｌｉｇｎ（Ｎｏｖｏｃｒａｆｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；ｗｗｗ．ｎｏｖｏｃｒａｆｔ．ｃｏｍで入手可能）、ＥＬＡＮＤ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、ＳＯＡＰ（ｓｏａｐ．ｇｅｎｏｍｉｃｓ．ｏｒｇ．ｃｎで入手可能）、及びＭａｑ（ｍａｑ．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔで入手可能）が挙げられる。核酸標的化複合体の標的核酸配列への配列特異的結合を指示するガイド配列（核酸標的化ガイドＲＮＡ内）の能力は、任意の適切なアッセイにより評価され得る。例えば、試験されるガイド配列を含む核酸標的化複合体を形成するのに十分な核酸標的化ＣＲＩＳＰＲ系の構成要素は、核酸標的化複合体の構成要素をコードするベクターを用いるトランスフェクション、続いて、本明細書に記載のＳｕｒｖｅｙｏｒアッセイなどによる、標的核酸配列内の優先的標的化（例えば、切断）の評価などによって、対応する標的核酸配列を有する宿主細胞に提供され得る。同様に、標的核酸配列の切断は、試験管内で、標的核酸配列、試験されるガイド配列及び試験ガイドとは異なる対照ガイド配列を含む核酸標的化複合体の構成要素を、を提供すること、ならびに試験と対照のガイドの配列の反応の間の標的配列での結合または切断速度の比較により評価され得る。他のアッセイもまた可能であり、当業者には明らかであろう。任意の標的核酸配列を標的とするために、ガイド配列、したがって核酸標的ガイドを選択してもよい。標的配列はＤＮＡであってもよい。標的配列は、任意のＲＮＡ配列であってもよい。いくつかの実施形態では、標的配列は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、プレｍＲＮＡ、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、非コードＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）、長非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）、及び低分子細胞質ＲＮＡ（ｓｃＲＮＡ）からなる群より選択されるＲＮＡ分子内の配列であってもよい。いくつかの好ましい実施形態では、標的配列は、ｍＲＮＡ、プレｍＲＮＡ、及びｒＲＮＡからなる群より選択されるＲＮＡ分子内の配列であってもよい。いくつかの好ましい実施形態では、標的配列は、ｎｃＲＮＡ及びｌｎｃＲＮＡからなる群より選択されるＲＮＡ分子内の配列であり得る。いくつかのより好ましい実施形態では、標的配列は、ｍＲＮＡ分子またはプレｍＲＮＡ分子内の配列であってもよい。
いくつかの実施形態では、核酸標的ガイドは、核酸標的ガイド内の二次構造の程度を低下するように選択される。いくつかの実施形態では、核酸標的化ガイドのヌクレオチドのうち、最適にフォールディングされたときの自己相補的な塩基対形成に関与するヌクレオチドの割合は、約７５％以下、約５０％以下、約４０％以下、約３０％以下、約２５％以下、約２０％以下、約１５％以下、約１０％以下、約５％以下、約１％以下、またはそれ未満の％である。最適なフォールディングは、任意の適切なポリヌクレオチドフォールディングアルゴリズムによって決定され得る。いくつかのプログラムは、最小ギブズ自由エネルギーの計算に基づくものである。そのようなアルゴリズムの１つの例は、ｍＦｏｌｄであり、ｍＦｏｌｄは、Ｚｕｋｅｒ ａｎｄ Ｓｔｉｅｇｌｅｒ （Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．９（１９８１），１３３－１４８）によって説明されている。フォールディングアルゴリズムの別の例は、重心構造予測アルゴリズムを使用するオンラインウェブサーバーＲＮＡｆｏｌｄであり、これは、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｔ ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｖｉｅｎｎａで開発されたものである（例えば、Ａ．Ｒ．Ｇｒｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｃｅｌｌ １０６（１）：２３－２４；及びＰＡ Ｃａｒｒ ａｎｄ ＧＭ Ｃｈｕｒｃｈ，２００９，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２７（１２）：１１５１－６２を参照されたい）。包括的ハイブリダイゼーションの標的のコンパクトな集約（ＣＡＴＣＨ）を使用して、多様性を完全にカバーするコンパクトなプローブセットを設計できる。例えば、Ｍｅｔｓｋｙ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｐｔｕｒｉｎｇ ｄｉｖｅｒｓｅ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｗｉｔｈ ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ａｎｄ ｓｃａｌａｂｌｅ ｐｒｏｂｅ ｄｅｓｉｇｎ，ＤＯＩ ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１０１／２７９５７０を参照されたい。本明細書に記載の診断ガイド設計方法は、ソフトウェアツールに実装することができる。ウイルス配列（または他の望ましい標的配列）の場合、ウイルス配列のアライメントの入力が利用され、その目的は、ガイドと標的との間のいくつかのミスマッチ（通常は１）を許容する入力配列のいくつかの所望の画分（例えば、９５％）を検出する、すべてのいくつかの特定のアンプリコン長さ内にあるガイド配列のセットを見つけることである。サブタイピング（または任意の鑑別同定）にとって重要なことは、各コレクションが１つのサブタイプに固有であることを保証する様々なガイドのコレクションを設計することである。この特定のアプローチにより、参照により本明細書に組み込まれる、ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０４８８７４４、例えば、［００５６］～［０１３１］、及びＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０４８４７９に記載されるようなものを含む、他のツール及びアプローチと一緒に、診断ガイド設計（「ｄ－ｇ－ｄ」）を使用して種を同定するためのアンプリコンプライマーとガイド配列を同時に設計することができる。
特定の実施形態では、ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡは、ダイレクトリピート（ＤＲ）配列及びガイド配列またはスペーサー配列を含んでもよいし、本質的にそれらからなってもよいし、またはそれらからなってもよい。特定の実施形態では、ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡは、ガイド配列またはスペーサー配列に融合または連結されたダイレクトリピート配列を含んでもよいし、本質的にそれらからなってもよいし、またはそれらからなってもよい。特定の実施形態では、ダイレクトリピート配列は、ガイド配列またはスペーサー配列の上流（すなわち５’）に位置してもよい。他の実施形態では、ダイレクトリピート配列は、ガイド配列またはスペーサー配列の下流（すなわち、３’）に位置してもよい。
特定の実施形態では、ｃｒＲＮＡは、ステムループ、好ましくは単一のステムループを含む。特定の実施形態では、ダイレクトリピート配列は、ステムループ、好ましくは単一のステムループを形成する。
特定の実施形態では、ガイドＲＮＡのスペーサー長は、１５～３５ｎｔである。特定の実施形態では、ガイドＲＮＡのスペーサー長は、少なくとも１５ヌクレオチドである。特定の実施形態では、スペーサー長は、１５～１７ｎｔ、例えば１５、１６、または１７ｎｔ、１７～２０ｎｔ、例えば１７、１８、１９、または２０ｎｔ、２０～２４ｎｔ、例えば２０、２１、２２、２３、または２４ｎｔ、２３～２５ｎｔ、例えば２３、２４、または２５ｎｔ、２４～２７ｎｔ、例えば２４、２５、２６、または２７ｎｔ、２７～３０ｎｔ、例えば２７、２８、２９、または３０ｎｔ、３０～３５ｎｔ、例えば３０、３１、３２、３３、３４、または３５ｎｔ、または３５ｎｔ以上である。
一般に、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９、またはＣＲＩＳＰＲ系とは、ＷＯ２０１４／０９３６２２（ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４６６７）などの前述の文書で使用されているものであり、Ｃａｓ遺伝子をコードする配列、特にＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９の場合はＣａｓ９遺伝子、ｔｒａｃｒ（トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ）配列（例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡまたは活性部分ｔｒａｃｒＲＮＡ）、ｔｒａｃｒ－ｍａｔｅ配列（内因性ＣＲＩＳＰＲ系の状況で「ダイレクトリピート」及びｔｒａｃｒＲＮＡで処理された部分的なダイレクトリピートを含む）、ガイド配列（内因性ＣＲＩＳＰＲ系の状況で「スペーサー」とも呼ばれる）、またはその用語が本明細書で使用される「ＲＮＡ（複数可）」（例えば、Ｃａｓ９をガイドするＲＮＡ（複数可）、例えばＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ及びトランス活性化（ｔｒａｃｒ）ＲＮＡまたはシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）（キメラＲＮＡ））またはＣＲＩＳＰＲ遺伝子座からの他の配列及び転写物を含む、ＣＲＩＳＰＲ関連（「Ｃａｓ」）遺伝子の活性の発現または活性の誘導に関与する転写物及び他の要素を総称的に指す。一般的に、ＣＲＩＳＰＲ系は、標的配列の部位においてＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進する要素（内因性ＣＲＩＳＰＲ系の文脈においてプロトスペーサーとも呼ばれる）によって特徴付けられる。ＣＲＩＳＰＲ複合体形成の文脈において、「標的配列」は、ガイド配列が相補性を有するように設計される配列を指し、標的配列とガイド配列との間のハイブリダイゼーションがＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進する。標的配列への相補性が切断活性にとって重要であるガイド配列のセクションは、本明細書ではシード配列と呼ばれる。標的配列は、ＤＮＡまたはＲＮＡのポリヌクレオチドのような任意のポリヌクレオチドを含んでよい。いくつかの実施形態では、標的配列は、細胞の核または細胞質に位置し、細胞内に存在するミトコンドリア、オルガネラ、小胞、リポソームまたは粒子の中またはそれに由来する核酸を含んでもよい。いくつかの実施形態では、特に非核用途の場合、ＮＬＳは好ましくない。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ系は、１つ以上の核輸出シグナル（ＮＥＳ）を含む。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ系は、１つ以上のＮＬＳ及び１つ以上のＮＥＳを含む。いくつかの実施形態では、以下の基準のいずれかまたはすべてを満たす反復モチーフを検索することにより、インシリコでダイレクトリピートを同定し得る：１．タイプＩＩＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に隣接するゲノム配列の２Ｋｂのウィンドウで見られる；２．２０～５０ｂｐの範囲；及び３．２０～５０ｂｐの間隔。いくつかの実施形態では、これらの基準のうちの２つ、例えば１と２、２と３、または１と３を使用し得る。いくつかの実施形態では、３つすべての基準を使用してもよい。
本発明の実施形態では、用語ガイド配列及びガイドＲＮＡ、すなわちＣａｓを標的ゲノム遺伝子座にガイドし得るＲＮＡは、ＷＯ２０１４／０９３６２２（ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４６６７）などの前述の引用文献のように交換可能に使用される。一般的に、ガイド配列は、標的配列にハイブリダイズして、標的配列へのＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を導くのに十分な、標的ポリヌクレオチド配列との相補性を有する、任意のポリヌクレオチド配列である。いくつかの実施形態において、ガイド配列とその対応する標的配列との間の相補性の程度は、好適な整列アルゴリズムを用いて最適なアラインメントがなされるとき、約または約５０％、６０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７．５％、９９％以上である。最適なアラインメントは、配列のアラインメントに適した任意のアルゴリズムを使用して決定され得るが、その非限定的な例には、Ｓｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム、Ｂｕｒｒｏｗｓ－Ｗｈｅｅｌｅｒ変換に基づくアルゴリズム（例えば、Ｂｕｒｒｏｗｓ Ｗｈｅｅｌｅｒ Ａｌｉｇｎｅｒ）、ＣｌｕｓｔａｌＷ、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｘ、ＢＬＡＴ、Ｎｏｖｏａｌｉｇｎ（Ｎｏｖｏｃｒａｆｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；ｗｗｗ．ｎｏｖｏｃｒａｆｔ．ｃｏｍで入手可能）、ＥＬＡＮＤ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、ＳＯＡＰ（ｓｏａｐ．ｇｅｎｏｍｉｃｓ．ｏｒｇ．ｃｎで入手可能）、及びＭａｑ（ｍａｑ．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔで入手可能）が挙げられる。
いくつかの実施形態では、ガイド配列は、約５、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、７５、またはそれ以上のヌクレオチド長である。いくつかの実施形態において、ガイド配列は、約７５、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１２未満またはそれ未満のヌクレオチド長である。好ましくは、ガイド配列は、１０ ３０ヌクレオチド長である。ＣＲＩＳＰＲ複合体の標的配列への配列特異的結合を指示するガイド配列の能力は、任意の適切なアッセイにより評価され得る。例えば、試験されるガイド配列を含む、ＣＲＩＳＰＲ複合体を形成するのに十分なＣＲＩＳＰＲ系の構成要素は、ＣＲＩＳＰＲ配列の構成要素をコードするベクターによるトランスフェクションなどにより、続いて、本明細書に記載のＳｕｒｖｅｙｏｒアッセイなどによる、標的配列内の優先的切断の評価などによって、対応する標的配列を有する宿主細胞に提供され得る。同様に、標的ポリヌクレオチド配列の切断は、標的配列、試験すべきガイド配列、試験のガイド配列と異なる対照ガイド配列を含むＣＲＩＳＰＲ複合体の構成要素を提供し、試験及び対照ガイド配列の反応間で標的配列での結合またはその切断速度を比較することによって、試験管内で評価できる。他のアッセイも可能であり、当業者には明らかであろう。
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系のいくつかの実施形態では、ガイド配列とその対応する標的配列との間の相補性の程度は、約５０％、６０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７．５％、９９％、または１００％またはそれ以上であってもよく；ガイドまたはＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、約５、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、７５、またはそれ以上のヌクレオチド長であってもよく；あるいは、ガイドまたはＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、長さが約７５、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１２またはそれ未満のヌクレオチド長であってもよく；有利には、ｔｒａｃｒ ＲＮＡは、３０または５０ヌクレオチド長である。しかし、本発明のある態様は、オフターゲット相互作用を低減すること、例えば、低い相補性を有する標的配列と相互作用するガイドを低減することである。実際、この実施例では、本発明は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系が８０％を超えて約９５％までの相補性、例えば８３％～８４％または８８～８９％または９４～９５％の相補性を有する、標的配列とオフターゲット配列との間を区別し得る変異（例えば、１８ヌクレオチドを有する標的と、１、２または３つのミスマッチを有する１８ヌクレオチドのオフターゲットを区別する）を含むことが示されている。したがって、本発明の状況では、ガイド配列とその対応する標的配列との間の相補性の程度は、９４．５％または９５％または９５．５％または９６％または９６．５％または９７％または９７．５％または９８％または９８．５％または９９％または９９．５％または９９．９％、または１００％より大きい。オフターゲットは、配列とガイドとの間の１００％または９９．９％または９９．５％または９９％または９９％または９８．５％または９８％または９７．５％または９７％または９６．５％または９６％または９５．５％または９５％または９４．５％または９４％または９３％または９２％または９１％または９０％または８９％または８８％または８７％または８６％または８５％または８４％または８３％または８２％または８１％または８０％未満の相補性であり、オフターゲットが配列とガイドとの間で１００％または９９．９％または９９．５％または９９％または９９％または９８．５％または９８％または９７．５％または９７％または９６．５％または９６％または９５．５％または９５％または９４．５％の相補性であることが有利である。
ガイド改変
ある特定の実施形態では、本発明のガイドは、天然には存在しない核酸、及び／または天然には存在しないヌクレオチド、及び／またはヌクレオチドアナログ、及び／または化学的改変を含む。天然には存在しない核酸としては、例えば、天然に存在するヌクレオチド、及び天然には存在しないヌクレオチドの混合物が挙げられる。天然には存在しないヌクレオチド及び／またはヌクレオチドアナログは、リボース部分、リン酸部分、及び／または塩基部分が改変され得る。本発明のある１つの実施形態では、ガイド核酸は、リボヌクレオチド及び非リボヌクレオチドを含む。そのような実施形態の１つでは、ガイドは、１つ以上のリボヌクレオチド及び１つ以上のデオキシリボヌクレオチドを含む。本発明のある１つの実施形態では、ガイドは、１つ以上の天然には存在しないヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、例えば、ホスホロチオエート結合を有するヌクレオチド、ボラノリン酸連結を有する、リボース環の２’と４’炭素との間にメチレン架橋を含むロックド核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチド、または架橋型核酸（ＢＮＡ）を含む。改変ヌクレオチドの他の例としては、２’－Ｏ－メチルアナログ、２’－デオキシアナログ、２’－チオウリジンアナログ、Ｎ６－メチルアデノシンアナログ、または２’－フルオロアナログが挙げられる。改変塩基のさらなる例としては、限定されないが、２－アミノプリン、５－ブロモ－ウリジン、シュードウリジン（Ψ）、Ｎ１－メチルシュードウリジン（ｍｅ１Ψ）、５－メトキシウリジン（５ｍｏＵ）、イノシン、及び７－メチルグアノシンが挙げられる。ガイドＲＮＡの化学改変の例としては、限定するものではないが、２’－Ｏ－メチル（Ｍ）、２’－Ｏ－メチル３’ホスホロチオエート（ＭＳ）、ホスホロチオエート（ＰＳ）、Ｓ－拘束エチル（ｃＥｔ）、または２’－Ｏ－メチル３’チオＰＡＣＥ（ＭＳＰ）を１つ以上の末端ヌクレオチドに組み込むことが挙げられる。化学的に改変されたそのようなガイドは、オンターゲット特異性とオフターゲット特異性との対比結果は予測不可能であるものの、非改変ガイドと比較して安定性の向上、及び活性の増大を含み得る（２０１５年６月２９日にオンラインで公開されたＨｅｎｄｅｌ，２０１５，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３３（９）：９８５－９，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．３２９０；Ｒａｇｄａｒｍ ｅｔ ａｌ．，０２１５，ＰＮＡＳ，Ｅ７１１０－Ｅ７１１１；Ａｌｌｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２００５，４８：９０１－９０４；Ｂｒａｍｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ．Ｇｅｎｅｔ．，２０１２，３：１５４；Ｄｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ，２０１５，１１２：１１８７０－１１８７５；Ｓｈａｒｍａ ｅｔ ａｌ．，ＭｅｄＣｈｅｍＣｏｍｍ．，２０１４，５：１４５４－１４７１；Ｈｅｎｄｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２０１５）３３（９）：９８５－９８９；Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，２０１７，１，００６６ ＤＯＩ：１０．１０３８／ｓ４１５５１－０１７－００６６を参照されたい）。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡの５’末端及び／または３’末端は、様々な機能性部分によって改変され、こうした機能性部分としては、蛍光色素、ポリエチレングリコール、コレステロール、タンパク質、または検出タグが含まれる。（Ｋｅｌｌｙ ｅｔ ａｌ．，２０１６，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２３３：７４－８３を参照されたい）。ある特定の実施形態では、ガイドは、標的ＤＮＡに結合する領域にリボヌクレオチドを含み、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、またはＣ２ｃ１に結合する領域に１つ以上のデオキシリボヌクレオチド及び／またはヌクレオチドアナログを含む。本発明のある１つの実施形態では、デオキシリボヌクレオチド及び／またはヌクレオチドアナログは、操作されたガイド構造、例えば、限定されないが、５’及び／または３’末端、ステムループ領域及びシード領域などに組み込まれる。ある特定の実施形態では、こうした改変は、ステムループ領域の５’ハンドルには存在しない。ガイドのステムループ領域の５’ハンドルを化学的に改変するとガイドの機能が消失し得る（Ｌｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，２０１７，１：００６６を参照されたい）。ある特定の実施形態では、ガイドのヌクレオチドのうちの少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、または７５個のヌクレオチドが化学的に改変される。いくつかの実施形態では、ガイドの３’末端または５’末端のいずれかに位置する３～５ヌクレオチドが化学的に改変される。いくつかの実施形態では、シード領域にごく軽微な改変（２’－Ｆ改変など）が導入される。いくつかの実施形態では、ガイドの３’末端に２’－Ｆ改変が導入される。ある特定の実施形態では、ガイドの５’末端及び／または３’末端に位置する３～５ヌクレオチドが、２’－Ｏ－メチル（Ｍ）、２’－Ｏ－メチル３’ホスホロチオエート（ＭＳ）、Ｓ－拘束エチル（ｃＥｔ）、または２’－Ｏ－メチル３’－チオＰＡＣＥ（ＭＳＰ）で化学的に改変される。そのような改変によってゲノム編集効率が増進し得る（Ｈｅｎｄｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２０１５）３３（９）：９８５－９８９を参照されたい）。ある特定の実施形態では、遺伝子破壊のレベルを増進させるために、ガイドのホスホジエステル結合のすべてがホスホロチオエート（ＰＳ）で置き換えられる。ある特定の実施形態では、ガイドの５’末端及び／または３’末端に位置する５ヌクレオチド超が、２’－Ｏ－Ｍｅ、２’－Ｆ、またはＳ－拘束エチル（ｃＥｔ）で化学的に改変される。化学的に改変されたそのようなガイドでは、媒介する遺伝子破壊のレベルが増進し得る（Ｒａｇｄａｒｍ ｅｔ ａｌ．，０２１５，ＰＮＡＳ，Ｅ７１１０－Ｅ７１１１を参照されたい）。本発明のある１つの実施形態では、ガイドは、その３’末端及び／または５’末端に化学的部分を含むように改変される。そのような部分には、限定されないが、アミン、アジド、アルキン、チオ、ジベンゾシクロオクチン（ＤＢＣＯ）、またはローダミンが挙げられる。ある特定の実施形態では、化学部分は、リンカー（アルキル鎖など）によってガイドに結合される。ある特定の実施形態では、改変ガイドの化学的部分は、ガイドを別の分子（ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、またはナノ粒子など）に付加するために使用され得る。化学的に改変されたそのようなガイドは、ＣＲＩＳＰＲ系によって一般に編集された細胞の同定または富化に使用され得る（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．， ｅＬｉｆｅ，２０１７，６：ｅ２５３１２，ＤＯＩ：１０．７５５４を参照されたい）。
特定の実施形態では、本明細書で提供されるＣＲＩＳＰＲ系は、ガイド配列を含むｃｒＲＮＡまたは類似のポリヌクレオチドを利用することができ、ポリヌクレオチドは、ＲＮＡ、ＤＮＡ、もしくはＲＮＡとＤＮＡの混合物であり、及び／またはポリヌクレオチドは、１つ以上のヌクレオチド類似体を含む。配列は、バルジ、ヘアピン、またはステムループ構造などのネイティブｃｒＲＮＡの構造を含むがこれらに限定されない任意の構造を含むことができる。特定の実施形態において、ガイド配列を含むポリヌクレオチドは、ＲＮＡまたはＤＮＡ配列であり得る第２のポリヌクレオチド配列と二本鎖を形成する。
いくつかの実施形態では、ガイドに対する改変は、化学改変、挿入、欠失、または分割である。いくつかの実施形態では、化学改変には、限定されないが、２’－Ｏ－メチル（Ｍ）アナログ、２’－デオキシアナログ、２－チオウリジンアナログ、Ｎ６－メチルアデノシンアナログ、２’－フルオロアナログ、２－アミノプリン、５－ブロモ－ウリジン、シュードウリジン（Ψ）、Ｎ１－メチルシュードウリジン（ｍｅ１Ψ）、５－メトキシウリジン（５ｍｏＵ）、イノシン、７－メチルグアノシン、２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホロチオエート（ＭＳ）、Ｓ－拘束エチル（ｃＥｔ）、ホスホロチオエート（ＰＳ）、または２’－Ｏ－メチル－３’－チオＰＡＣＥ（ＭＳＰ）を組み込むことが含まれる。いくつかの実施形態では、ガイドは、ホスホロチオエート改変のうちの１つ以上を含む。ある特定の実施形態では、ガイドのヌクレオチドのうちの少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、または２５個が化学的に改変される。ある特定の実施形態では、シード領域における１つ以上のヌクレオチドが化学的に改変される。ある特定の実施形態では、３’末端における１つ以上のヌクレオチドが化学的に改変される。ある特定の実施形態では、５’ハンドルにおけるヌクレオチドはいずれも、化学的に改変されない。いくつかの実施形態では、シード領域における化学改変は、軽微な改変（２’－フルオロアナログの組み込みなど）である。特定の実施形態では、シード領域のヌクレオチドの１ヌクレオチドが、２’－フルオロアナログで置き換えられる。いくつかの実施形態では、３’末端における５または１０個のヌクレオチドが化学的に改変される。Ｃｐｆ１ ＣｒＲＮＡの３’末端をそのように化学的に改変することで、遺伝子切断効率が改善する（Ｌｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，２０１７，１：００６６を参照されたい）。特定の実施形態では、３’末端における５ヌクレオチドが、２’－フルオロアナログで置き換えられる。特定の実施形態では、３’末端における１０のヌクレオチドが、２’－フルオロアナログで置き換えられる。特定の実施形態では、３’末端における５ヌクレオチドが、２’－Ｏ－メチル（Ｍ）アナログで置き換えられる。
いくつかの実施形態では、ガイドの５’ハンドルのループが改変される。いくつかの実施形態では、欠失、挿入、分割、または化学改変を有するように、ガイドの５’ハンドルのループが改変される。ある特定の実施形態では、ループは、ヌクレオチドを３つ、４つ、または５つ含む。ある特定の実施形態では、ループは、ＵＣＵＵ、ＵＵＵＵ、ＵＡＵＵ、またはＵＧＵＵという配列を含む。
任意の標的核酸配列を標的とするために、ガイド配列、したがって核酸標的ガイドＲＮＡを選択してもよい。ＣＲＩＳＰＲ複合体形成の文脈において、「標的配列」は、ガイド配列が相補性を有するように設計される配列を指し、標的配列とガイド配列の間のハイブリダイゼーションがＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進する。標的配列は、ＲＮＡポリヌクレオチドを含んでもよい。「標的ＲＮＡ」という用語は、標的配列であるかまたは標的配列を含むＲＮＡポリヌクレオチドを指す。換言すると、標的ＲＮＡは、ＲＮＡポリヌクレオチドまたはＲＮＡポリヌクレオチドの一部であり得、これに対して、ｇＲＮＡの一部、すなわちガイド配列は、相補性を有するように設計され、そしてエフェクター機能は、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質を含む複合体によって媒介され、ｇＲＮＡが誘導される。いくつかの実施形態において、標的配列は、細胞の核または細胞質に位置する。
標的配列はＤＮＡであってもよい。標的配列は、任意のＲＮＡ配列であってもよい。いくつかの実施形態では、標的配列は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、プレｍＲＮＡ、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、非コードＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）、長非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）、及び低分子細胞質ＲＮＡ（ｓｃＲＮＡ）からなる群より選択されるＲＮＡ分子内の配列であってもよい。いくつかの好ましい実施形態では、標的配列は、ｍＲＮＡ、プレｍＲＮＡ、及びｒＲＮＡからなる群より選択されるＲＮＡ分子内の配列であってもよい。いくつかの好ましい実施形態では、標的配列は、ｎｃＲＮＡ及びｌｎｃＲＮＡからなる群より選択されるＲＮＡ分子内の配列であり得る。いくつかのより好ましい実施形態では、標的配列は、ｍＲＮＡ分子またはプレｍＲＮＡ分子内の配列であってもよい。特定の実施形態では、１つ以上のガイドＲＮＡは、本明細書により詳細に記載されるように、一塩基多型、転写物のスプライスバリアント、または標的ＲＮＡまたはＤＮＡにおけるフレームシフト変異を検出するように設計される。
特定の実施形態では、ガイドＲＮＡのスペーサー長は、２８ヌクレオチド未満である。特定の実施形態では、ガイドＲＮＡのスペーサー長は、少なくとも１８ヌクレオチドであり、かつ２８ヌクレオチド未満である。特定の実施形態では、ガイドＲＮＡのスペーサー長は、１９～２８ヌクレオチドである。特定の実施形態では、ガイドＲＮＡのスペーサー長は、１９～２５ヌクレオチドである。特定の実施形態では、ガイドＲＮＡのスペーサー長は、２０ヌクレオチドである。特定の実施形態では、ガイドＲＮＡのスペーサー長は、２３ヌクレオチドである。特定の実施形態では、ガイドＲＮＡのスペーサー長は、２５ヌクレオチドである。
特定の実施形態では、切断効率の調節は、ミスマッチ、例えば、スペーサー／標的に沿ったミスマッチの位置を含む、スペーサー配列と標的配列の間の１つまたは２つのミスマッチなどの１つ以上のミスマッチの導入によって利用することができる。例えば、二重ミスマッチが中心にある（すなわち、３’または５’ではない）ほど、切断効率が影響を受ける。したがって、スペーサーに沿ったミスマッチ位置を選択することにより、切断効率を調節することができる。例として、標的の１００％未満の切断が望まれる場合（例えば、細胞集団において）、スペーサーと標的配列との間の１つ以上、好ましくは２つのミスマッチをスペーサー配列に導入することができる。ミスマッチ位置がスペーサーに沿って中心にあるほど、切断率は低くなる。
特定の例示的な実施形態では、切断効率を利用して、一塩基多型（ＳＮＰ）、バリエーション、または（点）変異など、単一ヌクレオチドによって変化する２つ以上の標的を区別できるシングルガイドを設計することができる。ＣＲＩＳＰＲエフェクターは、ＳＮＰ（または他の単一ヌクレオチドバリエーション）に対する感受性が低下しており、一定レベルの効率でＳＮＰ標的を切断し続ける可能性がある。したがって、２つの標的または標的のセットについて、ガイドＲＮＡは、標的の１つ、すなわちオンターゲットのＳＮＰに相補的なヌクレオチド配列で設計され得る。ガイドＲＮＡはさらに合成ミスマッチを持つように設計されている。本明細書で使用されるとき、「合成ミスマッチ」は、天然に存在するＳＮＰの上流または下流に、例えば、最大で５ヌクレオチド上流または下流、例えば４、３、２、または１ヌクレオチド上流または下流、好ましくは最大で３ヌクレオチド上流または下流、より好ましくは最大で２ヌクレオチド上流または下流に、最も好ましくは１ヌクレオチド上流または下流に（すなわち、ＳＮＰに隣接して）に導入される、天然に存在しないミスマッチを指す。ＣＲＩＳＰＲエフェクターがオンターゲットＳＮＰに結合すると、単一のミスマッチのみが合成ミスマッチにより形成され、ＣＲＩＳＰＲエフェクターは引き続き活性化され、検出可能なシグナルが生成される。ガイドＲＮＡがオフターゲットＳＮＰにハイブリダイズすると、ＳＮＰからのミスマッチと合成ミスマッチの２つのミスマッチが形成され、検出可能なシグナルは生成されない。したがって、本明細書に開示されるシステムは、集団内のＳＮＰを区別するように設計され得る。例えば、システムは、単一のＳＮＰによって異なる病原性株を区別するために、または非限定的にがん関連ＳＮＰなどの疾患関連ＳＮＰなどであるがそれには限定されない特定の疾患特異的ＳＮＰを検出するために使用され得る。
特定の実施形態では、ガイドＲＮＡは、ＳＮＰがスペーサー配列の（５’末端から開始した）位置１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０に位置するように設計されている。特定の実施形態では、ガイドＲＮＡは、ＳＮＰがスペーサー配列の（５’末端から開始した）位置１、２、３、４、５、６、７、８、または９に位置するように設計されている。特定の実施形態では、ガイドＲＮＡは、ＳＮＰがスペーサー配列の（５’末端から開始した）位置２、３、４、５、６、または７に位置するように設計されている。特定の実施形態では、ガイドＲＮＡは、ＳＮＰがスペーサー配列の（５’末端から開始した）位置３、４、５、または６に位置するように設計されている。特定の実施形態では、ガイドＲＮＡは、ＳＮＰがスペーサー配列の（５’末端から開始した）位置３に位置するように設計されている。
特定の実施形態では、ガイドＲＮＡは、ミスマッチ（例えば、合成ミスマッチ、すなわちＳＮＰ以外の追加の変異）がスペーサー配列の（５’末端から開始した）位置１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０に位置するように設計されている。特定の実施形態では、ガイドＲＮＡは、ミスマッチがスペーサー配列の（５’末端から開始した）位置１、２、３、４、５、６、７、８、または９に位置するように設計されている。特定の実施形態では、ガイドＲＮＡは、ミスマッチがスペーサー配列の（５’末端から開始した）位置４、５、６、または７に位置するように設計されている。特定の実施形態では、ガイドＲＮＡは、ミスマッチがスペーサー配列の（５’末端から開始した）位置５に位置するように設計されている。
特定の実施形態において、ガイドＲＮＡは、ミスマッチがＳＮＰの２ヌクレオチド上流（すなわち、１つの介在ヌクレオチド）に位置するように設計される。
特定の実施形態において、ガイドＲＮＡは、ミスマッチがＳＮＰの２ヌクレオチド下流（すなわち、１つの介在ヌクレオチド）に位置するように設計される。
特定の実施形態では、ガイドＲＮＡは、ミスマッチがスペーサー配列の（５’末端から開始した）位置５に位置し、ＳＮＰがスペーサー配列の（５’末端から開始した）位置３に位置するように設計されている。
本明細書に記載の実施形態は、本明細書に考察されるベクターを細胞に送達することを含む、本明細書に考察される真核細胞（インビトロ、すなわち単離された真核細胞）に１つ以上のヌクレオチド改変を誘導することを包含する。変異（複数可）には、ガイド（複数可）ＲＮＡ（複数可）を介した細胞（複数可）の各標的配列での１つ以上のヌクレオチドの導入、欠失、または置換が含まれ得る。変異は、ガイド（複数可）ＲＮＡ（複数可）を介した当該細胞（複数可）の各標的配列での１～７５ヌクレオチドの導入、欠失、または置換を含み得る。変異には、ガイド（複数可）ＲＮＡ（複数可）を介した、当該細胞（複数可）の各標的配列における１、５、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０または７５ヌクレオチドの導入、欠失、または置換が含まれ得る。変異には、ガイド（複数可）ＲＮＡ（複数可）を介した、当該細胞（複数可）の各標的配列における５、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、または７５ヌクレオチドの導入、欠失、または置換が含まれ得る。変異には、ガイド（複数可）ＲＮＡ（複数可）を介した、当該細胞（複数可）の各標的配列の１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、または７５ヌクレオチドの導入、欠失、または置換が含まれる。変異には、ガイド（複数可）ＲＮＡ（複数可）を介した、当該細胞（複数可）の各標的配列での２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、または７５ヌクレオチドの導入、欠失、または置換が含まれ得る。変異には、ガイド（複数可）ＲＮＡ（複数可）を介した、当該細胞（複数可）の各標的配列での４０、４５、５０、７５、１００、２００、３００、４００または５００ヌクレオチドの導入、欠失、または置換が含まれ得る。
典型的に、内在性ＣＲＩＳＰＲ系の文脈において、ＣＲＩＳＰＲ複合体（標的配列にハイブリダイズして１つ以上のＣａｓタンパク質と複合体形成するガイド配列を含む）の形成は、標的配列内またはその近接（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、５０またはそれ以上の塩基対離れている）の切断を生じるが、特にＲＮＡ標的の場合、例えば二次構造に依存する可能性がある。
一態様では、本明細書に開示される実施形態は、２つ以上のＣＲＩＳＰＲ系、対応する標的分子に結合するように設計された１つ以上のガイドＲＮＡ、マスキング構築物、及びサンプル中の標的核酸分子を増幅するための任意選択の増幅試薬を含む核酸検出系を対象とする。特定の例示的な実施形態では、システムは、１つ以上の検出アプタマーをさらに含み得る。１つ以上の検出アプタマーは、ＲＮＡポリメラーゼ部位またはプライマー結合部位を含み得る。１つ以上の検出アプタマーは、１つ以上の標的ポリペプチドに特異的に結合し、ＲＮＡポリメラーゼ部位またはプライマー結合部位が標的ペプチドへの検出アプタマーの結合時にのみ露出するように構成される。ＲＮＡポリメラーゼ部位の露出は、テンプレートとしてアプタマー配列を使用してトリガーＲＮＡオリゴヌクレオチドの生成を容易にする。したがって、そのような実施形態では、１つ以上のガイドＲＮＡは、トリガーＲＮＡに結合するように構成される。
別の態様では、本明細書に開示される実施形態は、複数の個別の別個のボリュームを含む診断デバイスを対象とする。各々の個別の別個のボリュームは、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と、対応する標的分子に結合するように設計された１つ以上のガイドＲＮＡと、マスキング構築物とを含むＣＲＩＳＰＲ系を含む。個別の別個のボリュームは、光学バーコード、標的分子、及び／または増幅試薬を含んでもよい。光学バーコードを備えたＣＲＩＳＰＲ系を含む個別の別個のボリュームを提供することができる。光学バーコードを含み、任意選択で標的分子及び／または増幅試薬を含む、他の個別の別個のボリュームも提供され得る。特定の例示的な実施形態において、ＲＮＡ増幅試薬は、個別の別個のボリュームに事前にロードされるか、または個別の別個のボリュームへのサンプルまたは標的分子の追加と同時に、その前に、またはその後に個別の別個のボリュームに追加され得る。一態様では、液滴などの個別の別個のボリュームのマージは、マージされた個別の別個のボリュームへの特定の試薬の追加をもたらす。デバイスは、マイクロ流体ベースのデバイス、ウェアラブルデバイス、または個別の別個のボリュームが画定または提供される柔軟な材料基質を含むデバイスであり得る。
別の態様では、本明細書に開示される実施形態は、サンプルまたはサンプルのセット（それら自体の個別の別個のボリュームに含まれ得る）を、各々の個々の個別のボリュームがＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質、１つの標的オリゴヌクレオチドに結合するように設計された１つ以上のガイドＲＮＡ、及びマスキング構築物を含む、個別の別個のボリュームのセットに分配することを含む、サンプル中の標的核酸を検出する方法に関する。特に好ましい実施形態におけるそのような分配は、好ましくは、ランダムな液滴分配によるものである。次いで、サンプルのセットは、１つ以上のガイドＲＮＡを１つ以上の標的分子に結合させるのに十分な条件下で維持される。１つ以上のガイドＲＮＡが標的核酸に結合すると、転じてＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質を活性化する。活性化されると、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質は、例えば、検出可能な陽性シグナルがマスキング解除、放出、または生成されるようにマスキング構築物を切断することにより、マスキング構築物を不活性化する。個別の別個のボリュームにおける陽性の検出可能なシグナルの検出は、標的分子の存在を示す。
さらに別の態様において、本明細書に開示される実施形態は、ポリペプチドを検出するための方法を対象とする。ポリペプチドの検出方法は、上述の標的核酸の検出方法と同様である。しかしながら、ペプチド検出アプタマーも含まれる。ペプチド検出アプタマーは、上述のように機能し、標的ポリペプチドに結合するとトリガーオリゴヌクレオチドの生成を促進する。ガイドＲＮＡはトリガーオリゴヌクレオチドを認識し、それによってＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質を活性化するように設計されている。活性化されたＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質によるマスキング構築物の非活性化は、マスキング解除、放出、または検出可能な陽性シグナルの生成をもたらす。
一態様では、本明細書に開示される実施形態は、２つ以上のＣＲＩＳＰＲ系、対応する標的分子に結合するように設計された１つ以上のガイドＲＮＡ、マスキング構築物、及びサンプル中の標的核酸分子を増幅するための任意選択の増幅試薬を含む核酸検出系を対象とする。特定の例示的な実施形態では、システムは、１つ以上の検出アプタマーをさらに含み得る。１つ以上の検出アプタマーは、ＲＮＡポリメラーゼ部位またはプライマー結合部位を含み得る。１つ以上の検出アプタマーは、１つ以上の標的ポリペプチドに特異的に結合し、ＲＮＡポリメラーゼ部位またはプライマー結合部位が標的ペプチドへの検出アプタマーの結合時にのみ露出するように構成される。ＲＮＡポリメラーゼ部位の露出は、テンプレートとしてアプタマー配列を使用してトリガーＲＮＡオリゴヌクレオチドの生成を容易にする。したがって、そのような実施形態では、１つ以上のガイドＲＮＡは、トリガーＲＮＡに結合するように構成される。
別の態様では、本明細書に開示される実施形態は、複数の個別の別個のボリュームを含む診断デバイスを対象とする。各々の個別の別個のボリュームは、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と、対応する標的分子に結合するように設計された１つ以上のガイドＲＮＡと、マスキング構築物とを含むＣＲＩＳＰＲ系を含む。個別の別個のボリュームは、光学バーコード、標的分子、及び／または増幅試薬を含んでもよい。光学バーコードを備えたＣＲＩＳＰＲ系を含む個別の別個のボリュームを提供することができる。光学バーコードを含み、任意選択で標的分子及び／または増幅試薬を含む、他の個別の別個のボリュームも提供され得る。特定の例示的な実施形態において、ＲＮＡ増幅試薬は、個別の別個のボリュームに事前にロードされるか、または個別の別個のボリュームへのサンプルまたは標的分子の追加と同時に、その前に、またはその後に個別の別個のボリュームに追加され得る。一態様では、液滴などの個別の別個のボリュームのマージは、マージされた個別の別個のボリュームへの特定の試薬の追加をもたらす。デバイスは、マイクロ流体ベースのデバイス、ウェアラブルデバイス、または個別の別個のボリュームが画定または提供される柔軟な材料基質を含むデバイスであり得る。
別の態様では、本明細書に開示される実施形態は、サンプルまたはサンプルのセット（それら自体の個別の別個のボリュームに含まれ得る）を、各々の個々の個別のボリュームがＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質、１つの標的オリゴヌクレオチドに結合するように設計された１つ以上のガイドＲＮＡ、及びマスキング構築物を含む、個別の別個のボリュームのセットに分配することを含む、サンプル中の標的核酸を検出する方法に関する。特に好ましい実施形態におけるそのような分配は、好ましくは、ランダムな液滴分配によるものである。次いで、サンプルのセットは、１つ以上のガイドＲＮＡを１つ以上の標的分子に結合させるのに十分な条件下で維持される。１つ以上のガイドＲＮＡが標的核酸に結合すると、転じてＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質を活性化する。活性化されると、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質は、例えば、検出可能な陽性シグナルがマスキング解除、放出、または生成されるようにマスキング構築物を切断することにより、マスキング構築物を不活性化する。個別の別個のボリュームにおける陽性の検出可能なシグナルの検出は、標的分子の存在を示す。
さらに別の態様において、本明細書に開示される実施形態は、ポリペプチドを検出するための方法を対象とする。ポリペプチドの検出方法は、上述の標的核酸の検出方法と同様である。しかしながら、ペプチド検出アプタマーも含まれる。ペプチド検出アプタマーは、上述のように機能し、標的ポリペプチドに結合するとトリガーオリゴヌクレオチドの生成を促進する。ガイドＲＮＡはトリガーオリゴヌクレオチドを認識し、それによってＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質を活性化するように設計されている。活性化されたＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質によるマスキング構築物の非活性化は、マスキング解除、放出、または検出可能な陽性シグナルの生成をもたらす。
セットカバーアプローチ
特定の実施形態において、例えば、ウイルス及び微生物の定義されたセット内のすべてのウイルス及び／または微生物種を同定できるプライマー及び／またはプローブが設計される。特に有利なアプローチは、インフルエンザなどの急速に進化しているウイルスのためのプライマー及び／またはプローブの設計を可能にする。そのような方法は、特定の例示的な実施形態に記載されている。セットカバー解法は、標的配列全体または標的配列のセット、例えばゲノム配列のセットをカバーするために必要な最小数の標的配列プローブまたはプライマーを識別できる。セットカバーアプローチは、通常２０～５０塩基対の範囲で、プライマー及び／またはマイクロアレイプローブを識別するために以前に使用されている。例えば、Ｐｅａｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，ｃｓ．ｖｉｒｇｉｎｉａ．ｅｄｕ／～ｒｏｂｉｎｓ／ｐａｐｅｒｓ／ｐｒｉｍｅｒｓ＿ｄａｍｌｌ＿ｆｍａｌ．ｐｄｆ、Ｊａｂａｄｏ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２００６ ３４（２２）：６６０５－ｌｌ、Ｊａｂａｄｏ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２００８，３６（ｌ）：ｅ３ ｄｏｉ１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｍｌｌ０６、Ｄｕｉｔａｍａ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２００９，３７（８）：２４８３－２４９２、Ｐｈｉｌｌｉｐｐｙ ｅｔ ａｌ．ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．２００９，１０：２９３ ｄｏｉ：１０．１１８６／１４７１－２１０５－１０－２９３を参照されたい。このようなアプローチでは、一般に、各プライマー／プローブをｋ－ｍｅｒとして扱い、完全一致を検索するか、またはサフィックスアレイを使用して不正確一致を可能にする。さらに、これらの方法は、一般に、各入力配列が１つのプライマーまたはプローブによって結合されることのみを必要とし、配列に沿ったこの結合の位置は無関係であるように、プライマーまたはプローブを選択することにより、ハイブリダイゼーションを検出するためのバイナリアプローチを取る。別の方法では、標的ゲノムを事前定義されたウィンドウに分割し、バイナリアプローチの下で各ウィンドウを個別の入力配列として効果的に扱うことができる。すなわち、特定のプローブまたはガイドＲＮＡが各ウィンドウ内で結合するかどうかを決定し、すべてのウィンドウが、いくつかのプライマーまたはプローブの状態によって結合されている必要がある。事実上、これらのアプローチは、セットカバー問題の「ユニバース」の各要素を入力配列全体または入力配列の事前定義されたウィンドウのいずれかとして扱い、各要素は、プローブまたはガイドＲＮＡの開始が、要素内で結合する場合、「カバーされている」とみなされる。
病原体に対するプローブ及びプライマーを開発するための方法であって、入力ゲノム配列のセットを１つ以上の標的病原体に提供することを含む、方法が提供される。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法は、単一のアッセイで所与のウイルスのすべての変異体、または複数の異なるウイルスを同定するために使用され得る。さらに、本明細書に開示される方法は、セットカバー問題における「ユニバース」の各要素を標的配列のヌクレオチドとして扱い、プローブまたはガイドＲＮＡが、要素を含む標的ゲノムのいくつかのセグメントに結合する限り、各要素は「カバーされている」とみなされる。所与のプライマーまたはプローブが所与のウィンドウに結合するか結合しないかを尋ねるだけでなく、そのようなアプローチを使用してハイブリダイゼーションパターンを検出することができる。すなわち、所定のプライマーまたはプローブが１つの標的配列または複数の標的配列に結合する場合、それらのハイブリダイゼーションパターンから、サンプルからの濃縮とありとあらゆる標的配列の配列決定の両方を可能にするのに十分な程度に標的配列のセットをカバーするために必要なプライマーまたはプローブの最小数を決定する。これらのハイブリダイゼーションパターンは、損失関数を最小限に抑える特定のパラメーターを定義することによって決定でき、これにより、例えば、各種の多様性を反映するように、パラメーターを各種に対して変動させることを可能にする方法で、またプライマーまたはプローブの設計コンテキストで以前に適用されたものなど、セットカバー解法の単純なアプリケーションを使用して達成することができないコンピューター的に効率的な方法で、最小限のプローブまたはガイドＲＮＡのセットの同定が可能となる。開示されるセットカバー解決プロセスを標的配列のセットに適用して、１つ以上の標的増幅配列を同定する。実施形態において、１つ以上の標的増幅配列は、標的病原体の設定された入力ゲノム配列間で共有される高度に保存された標的配列である。そのような標的病原体は、例えば、参照により本明細書に具体的に組み込まれる、国際特許公開ＷＯ２０１８／１７０３４０、［０２８９］～［０３００］、及び［０３４７］～［０３５４］に記載されている通りであり得る。
複数の転写産物の存在量を検出する能力は、特定の表現型を示す独特なウイルスまたは微生物のシグネチャーの生成を可能にできる。様々な機械学習技術を使用して、遺伝子シグネチャーを導き出すことができる。したがって、本発明のプライマー及び／またはプローブを使用して、特定の表現型を検出するために、遺伝子シグネチャーによって定義されるバイオマーカーの相対レベルを同定及び／または定量することができる。特定の例示的な実施形態では、遺伝子シグネチャーは、特定の治療に対する感受性、治療に対する耐性、またはそれらの組み合わせを示す。
本発明の一態様において、方法は、１つ以上の病原体を検出することを含む。このようにして、個々の微生物による対象の感染の区別を得ることができる。いくつかの実施形態では、そのような区別により、臨床医は特定の疾患、例えば、疾患の様々なバリアントを検出または診断することができる。好ましくは、ウイルスまたは病原体配列は、ウイルスもしくは病原体のゲノムまたはその断片である。この方法は、病原体の進化を決定することをさらに含み得る。病原体の進化を決定することは、病原体の変異、例えば、ヌクレオチド欠失、ヌクレオチド挿入、ヌクレオチド置換の同定を含み得る。後者には、非同義、同義、及び非コード置換がある。変異は、アウトブレイク中は非同義であることが多い。この方法は、上述のように分析された２つの病原体配列間の置換率を決定することをさらに含み得る。変異が有害であるか適応性があるかは、機能分析が必要になるが、非同義変異の割合は、この流行の継続的な進行が病原体適応の機会を与える可能性があることを示唆しており、迅速な封じ込めの必要性を強調する。したがって、この方法は、ウイルス適応のリスクを評価することをさらに含むことができ、非同義変異の数が決定される。（Ｇｉｒｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４５，１３６９，２０１４）。この方法は、本明細書のいずこかに記載されている診断ガイド設計を含むことができる。
診断ガイド設計を使用して、１つ以上のプライマー、１つ以上のプローブ、またはプライマー対とプローブの組み合わせを生成すると、サンプル内のウイルスまたはその他の病原体の検出を最適化できる。入力ゲノム配列のセットが、２以上のウイルス病原体に由来するゲノム配列を表し得る。生成された１つ以上のプライマー、１つ以上のプローブ、またはプライマー対とプローブの組み合わせは、５つ以上のウイルスの検出のための配列を含むことができる。実施形態において、方法は、汎ウイルス検出を可能にする。特定の実施形態では、入力ゲノム配列のセットが、５、６、７、８、９、１０、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、またはそれ以上のウイルスのセットに由来するゲノム配列を表す。
国際特許公開ＷＯ／２０１８／０３９６４３及びそこに開示されている、病原体バリアント及び／または病原体種の間で高度に保存された領域を同定する方法、ならびに病原体を検出するための核酸ベースの検出アッセイの開発及び使用のためにそのような領域に向けられたプライマー及びプローブの使用が参照される。本明細書に記載されるように、２つ以上の核酸配列または２つ以上のアミノ酸配列間の同一性／類似性は、同一性パーセンテージ単位で測定された配列間の同一性または類似性に関して表現することができ、パーセンテージが高いほど、配列はより同一性が高い。核酸またはアミノ酸配列の相同体またはオルソログは、標準的な方法を使用して整列させたとき、比較的高い配列同一性／配列類似性を有する。病原性配列のアラインメント及び設計へのアプローチは、参照により具体的に組み込まれる国際特許公開ＷＯ／２０１８／０３９６４３の実施例１にさらに記載されている。
比較のための配列のアライメント方法は、当該技術分野で周知である。様々なプログラム及び整列のアルゴリズムは以下に記載される：Ｓｍｉｔｈ ＆ Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２，１９８１；Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ＆ Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３，１９７０；Ｐｅａｒｓｏｎ ＆ Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４，１９８８；Ｈｉｇｇｉｎｓ ＆ Ｓｈａｒｐ，Ｇｅｎｅ，７３：２３７－４４，１９８８；Ｈｉｇｇｉｎｓ ＆ Ｓｈａｒｐ，ＣＡＢＩＯＳ ５：１５１－３，１９８９；Ｃｏｒｐｅｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：１０８８１－９０，１９８８；Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｐｐｌｓ．ｉｎ ｔｈｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ８，１５５－６５，１９９２；及びＰｅａｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．２４：３０７－３１，１９９４．Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－１０，１９９０（配列アライメント法と相同性計算の詳細な検討事項を提示する）。ＮＣＢＩ Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－１０，１９９０）は、シーケンス分析プログラムｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎ、及びｔｂｌａｓｔｘと関連して使用するために、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌｉｂｒａｒｙ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｂｕｉｌｄｉｎｇ ３８Ａ，Ｒｏｏｍ ８Ｎ８０５，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ ２０８９４）を含むいくつかの提供源またはインターネット上で利用可能である。Ｂｌａｓｔｎは核酸配列を比較するために使用され、ｂｌａｓｔｐはアミノ酸配列を比較するために使用される。さらなる情報はＮＣＢＩのウェブサイトで見つけることができる。参照により組み込まれる、ＷＯ２０１８／０３９６４３の［０１００］も参照されたい。
一旦アラインメントされると、一致の数は、同一のヌクレオチドまたはアミノ酸残基が両方の配列中に存在する位置の数を数えることによって決定される。配列同一性パーセントは、一致の数を、同定された配列に記載された配列の長さ、または連結した長さ（同定された配列に記載された配列からの１００個の連続するヌクレオチドまたはアミノ酸残基など）のいずれかで割り、続いて結果の値に１００を掛けることによって決定される。
プライマーの設計に関しては、ソフトウェアツールに実装された「診断ガイド設計」法を利用して、標的病原体配列に対する方法を利用することができる。ウイルス配列の場合、ウイルス配列のアライメントの入力を利用することができ、その目的は、ガイドと標的との間のいくつかのミスマッチ（通常は１）を許容する入力配列のいくつかの所望の画分（例えば、９５％）を検出する、すべてのいくつかの特定のアンプリコン長さ内にあるガイド配列のセットを見つけることである。サブタイピング（または任意の鑑別同定）にとって重要なことは、各コレクションが１つのサブタイプに固有であることを保証する様々なガイドのコレクションを設計することである。実施形態では、この設計アプローチを使用して、診断ガイド設計（「ｄ－ｇ－ｄ」）と他のツールを使用して、種同定用のアンプリコンプライマーとガイド配列を同時に設計する。追加のプライマーとプローブは、ＰＣＲにおける追加の特異性、競合、及びミスマッチに関して熱力学と動力学を考慮して設計できる（例えば、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ １０，４６７５（２０１９）ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓ４１６７－０１９－１２５９３－９を参照されたい）（例えば、Ｂｕｓｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，ＤＯＩ：１０．１０１６／ｊ．ｂｄｑ．２０１７．１１．００１を参照されたい）。プローブ及びプライマーを設計するための複数のツールが利用可能であり、ゲノム、標的配列、及びアッセイに合わせて調整することができる。例えば、プライマー設計用のオープンソフトウェアビルディングブロック、Ｄ０１：１０．１３７１／ｊｏｕｎａｌ．ｐｏｎｅ．００８０１５６；自動化されたマルチプレックスオリゴヌクレオチド設計ツール；ＤＯＩ：１０．１０９３／ａｒ／ｇｋｙ３１９；ＬＡＭＰ ｐｒｉｍｅｒｓ（ＤＯＩ：１０．７７１７／ｐｅｅｒｊ．６８０１）複数の検索モードを備えたｑＰＣＲツール、例えば、Ｊｅｏｎ ｅｔ ａｌ．，ＤＯＩ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｚ３２３、及びＰｒｉｍｅｒ－ＢＬＡＳＴなどのＮＣＢＩツールを参照されたい。
ＲＮＡベースのマスキング構築物
本明細書で使用されるとき、「マスキング構築物」は、本明細書に記載の活性化されたＣＲＩＳＰＲ系エフェクタータンパク質によって切断またはさもなければ不活性化され得る分子を指す。「マスキング構築物」という用語は、代わりに「検出構築物」と呼ばれ得る。特定の例示的な実施形態において、マスキング構築物は、ＲＮＡベースのマスキング構築物である。ＲＮＡベースのマスキング構築物は、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質によって切断可能なＲＮＡ要素を含む。ＲＮＡ要素の切断は、薬剤を解放するか、検出可能なシグナルが生成されることを可能にする構造変化を生成する。どのようにＲＮＡ要素を使用して検出可能なシグナルの生成を防止またはマスキングできるかを示す例示的な構築物が以下に記載されており、本発明の実施形態は、それらの改変を含む。切断の前、またはマスキング構築物が「活性」状態にある場合、マスキング構築物は、検出可能な陽性シグナルの生成または検出をブロックする。特定の例示的な実施形態では、活性ＲＮＡマスキング構築物の存在下で最小限のバックグラウンドシグナルが生成され得ることが理解されるであろう。陽性の検出可能なシグナルは、光学的、蛍光的、化学発光的、電気化学的、または当該技術分野で公知の他の検出方法を使用して検出できる任意のシグナルであり得る。「検出可能な陽性シグナル」という用語は、マスキング構築物の存在下で検出可能である可能性のある他の検出可能シグナルと区別するために使用される。例えば、特定の実施形態では、マスキング剤が存在するときに第１のシグナルを検出することができ（すなわち、検出可能な陰性シグナル）、これは、次いで、標的分子の検出時及び活性化されたＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質によるマスキング剤の切断または非活性化時に、第２のシグナル（例えば、検出可能な陽性シグナル）に変換される。
したがって、本発明の特定の実施形態において、ＲＮＡベースのマスキング構築物は、検出可能な陽性シグナルの生成を抑制するか、またはＲＮＡベースのマスキング構築物は、検出可能な陽性シグナルをマスキングすることにより、もしくは代わりに検出可能な陰性シグナルを生成することにより、検出可能な陽性シグナルの生成を抑制するか、またはＲＮＡベースのマスキング構築物は、レポーティング構築物によってコードされる遺伝子産物の生成を抑制するサイレンシングＲＮＡを含み、遺伝子産物は、発現時に検出可能な陽性シグナルを生成する。
さらなる実施形態において、ＲＮＡベースのマスキング構築物は、検出可能な陰性シグナルを生成するリボザイムであり、リボザイムが不活性化されると、検出可能な陽性シグナルが生成されるか、またはリボザイムが基質を第１の色に変換し、リボザイムが不活性化されたときに基質が第２の色に変換される。
他の実施形態において、ＲＮＡベースのマスキング剤はＲＮＡアプタマーであるか、またはアプタマーは酵素を隔離し、酵素は基質に作用することによりアプタマーからの放出時に検出可能なシグナルを生成するか、またはアプタマーは、アプタマーから放出されたときに結合して検出可能なシグナルを生成する剤のペアを隔離する。
別の実施形態では、ＲＮＡベースのマスキング構築物は、検出可能なリガンド及びマスキング成分が付着するＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む。別の実施形態では、検出可能なリガンドはフルオロフォアであり、マスキング成分はクエンチャー分子、またはＮＡＳＢＡまたはＲＰＡ試薬などであるがこれらに限定されない標的ＲＮＡ分子を増幅する試薬である。
特定の例示的な実施形態では、マスキング構築物は遺伝子産物の生成を抑制し得る。遺伝子産物は、サンプルに加えられるレポーター構築物によってコードされ得る。マスキング構築物は、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）または低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）など、ＲＮＡ干渉経路に関与する干渉ＲＮＡであり得る。マスキング構築物は、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）も含み得る。マスキング構築物が存在する間、遺伝子産物の発現を抑制する。遺伝子産物は、蛍光タンパク質もしくは他のＲＮＡ転写物、またはさもなければマスキング構築物が存在しない場合は、標識プローブ、アプタマー、または抗体によって検出可能であるタンパク質であり得る。エフェクタータンパク質が活性化されると、マスキング構築物が切断されるか、さもなければサイレンシングされ、遺伝子産物の発現及び検出が検出可能な陽性シグナルとして可能になる。
特定の例示的な実施形態では、マスキング構築物は、検出可能な陽性シグナルを生成するために必要な１つ以上の試薬を隔離し、それによってマスキング構築物からの１つ以上の試薬の放出が検出可能な陽性シグナルの生成をもたらすようにすることができる。１つ以上の試薬を組み合わせて比色シグナル、化学発光シグナル、蛍光シグナル、または他の任意の検出可能なシグナルを生成することができ、そのような目的に適していることが知られている任意の試薬を含むことができる。特定の例示的な実施形態において、１つ以上の試薬は、１つ以上の試薬に結合するＲＮＡアプタマーによって隔離される。標的分子の検出時にエフェクタータンパク質が活性化され、ＲＮＡアプタマーが分解されると、１つ以上の試薬が放出される。
特定の例示的な実施形態では、マスキング構築物は、個別の別個のボリューム（以下でさらに定義される）内の固体基質上に固定化され、単一の試薬を隔離することができる。例えば、試薬は色素を含むビーズであり得る。固定化試薬によって隔離された場合、個々のビーズは拡散しすぎて検出可能なシグナルを生成できないが、マスキング構築物からの放出時に、例えば凝集または溶液濃度の単純な増加によって、検出可能なシグナルを生成できる。特定の例示的な実施形態では、固定化されたマスキング剤は、標的分子の検出時に活性化エフェクタータンパク質によって切断され得るＲＮＡベースのアプタマーである。
特定の他の例示的な実施形態では、マスキング構築物は、溶液中で固定化された試薬に結合し、それにより、溶液中で遊離している別個の標識結合パートナーに試薬が結合する能力をブロックする。したがって、サンプルに洗浄ステップを適用すると、標的分子が存在しない状態で、標識された結合パートナーをサンプルから洗い流すことができる。しかしながら、エフェクタータンパク質が活性化されると、マスキング構築物は、マスキング構築物が試薬に結合する能力を妨害するのに十分な程度に切断され、それにより、標識された結合パートナーが固定化試薬に結合できるようになる。したがって、標識された結合パートナーは、洗浄ステップの後も残存し、サンプル中の標的分子の存在を示す。特定の態様において、固定化試薬に結合するマスキング構築物はＲＮＡアプタマーである。固定化試薬はタンパク質であってもよく、標識された結合パートナーは標識された抗体であってもよい。代替的に、固定化試薬はストレプトアビジンであってもよく、標識結合パートナーは標識ビオチンであってもよい。上述の実施形態で使用される結合パートナー上の標識は、当該技術分野で既知の任意の検出可能な標識であり得る。さらに、本明細書に記載の全体的な設計に従って、他の既知の結合パートナーを使用することができる。
特定の例示的な実施形態では、マスキング構築物はリボザイムを含み得る。リボザイムは、触媒特性を持つＲＮＡ分子である。リボザイムは、天然及び操作されたものであり、本明細書に開示されるエフェクタータンパク質によって標的とされ得るＲＮＡを含むか、またはＲＮＡからなる。リボザイムは、検出可能な陰性シグナルを生成するか、または陽性対照シグナルの生成を防止する反応を触媒するように選択または操作することができる。活性化エフェクタータンパク質によるリボザイムの不活性化により、陰性対照シグナルを生成する反応、または検出可能な陽性シグナルの生成を妨げる反応が除去され、それにより検出可能な陽性シグナルが生成されることを可能にする。１つの例示的な実施形態において、リボザイムは比色反応を触媒し、溶液を第１の色として見せることができる。リボザイムが不活性化されると、溶液は第２の色に変わり、第２の色は検出可能な陽性シグナルになる。比色反応を触媒するためにリボザイムを使用し得る方法の例は、Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．“Ｓｉｇｎａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ－６－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｒｉｂｏｚｙｍｅ ｇｌｍＳ，”Ｂｉｏｓｅｎｓ Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎ．２０１４；１６：３３７－４２に記載され、及びどのようにそのようなシステムが本明細書に開示された実施形態との関連で機能するように変更できるかの例を提供する。代替的に、リボザイムは、存在する場合、例えばＲＮＡ転写物の切断産物を生成することができる。したがって、検出可能な陽性シグナルの検出は、リボザイムの非存在下でのみ生成される非切断ＲＮＡ転写物の検出を含み得る。
特定の例示的な実施形態では、１つ以上の試薬は、比色、化学発光、または蛍光シグナルなどの検出可能なシグナルの生成を促進することのできる、酵素などのタンパク質であり、タンパク質が、１つ以上のＲＮＡアプタマーのタンパク質への結合により、検出可能なシグナルを生成できないように阻害または隔離されている。本明細書に開示されるエフェクタータンパク質の活性化時に、ＲＮＡアプタマーは、検出可能なシグナルを生成するタンパク質の能力をもはや阻害しない程度に切断または分解される。特定の例示的な実施形態では、アプタマーはトロンビン阻害剤アプタマーである。特定の例示的な実施形態では、トロンビン阻害剤アプタマーは、ＧＧＧＡＡＣＡＡＡＧＣＵＧＡＡＧＵＡＣＵＵＡＣＣＣ（配列番号５）の配列を有する。このアプタマーが切断されると、トロンビンが活性化し、ペプチドの比色基質または蛍光基質を切断する。特定の例示的な実施形態では、比色基質は、トロンビンのペプチド基質に共有結合しているパラニトロアニリド（ｐＮＡ）である。トロンビンによって切断されると、ｐＮＡが放出されて黄色になり、目に見えやすくなる。特定の例示的な実施形態では、蛍光基質は、蛍光検出器を使用して検出することができる青色蛍光体である７－アミノ－４－メチルクマリンである。阻害アプタマーは、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、ベータ－ガラクトシダーゼ、または子ウシアルカリホスファターゼ（ＣＡＰ）にも、上述の一般原則の範囲内で使用できる。
特定の実施形態において、ＲＮａｓｅ活性は、酵素阻害アプタマーの切断を介して比色分析的に検出される。ＲＮａｓｅ活性を比色シグナルに変換する１つの潜在的なモードは、ＲＮＡアプタマーの切断と、比色出力を生成できる酵素の再活性化を合わせることである。ＲＮＡ切断がない場合、インタクトなアプタマーは酵素標的に結合し、その活性を阻害する。この読み出しシステムの利点は、酵素が追加の増幅ステップを提供することである：付随活性（例えばＣａｓ１３ａ付随活性）を介してアプタマーから解放されると、比色酵素は比色産物を生成し続け、シグナルの増殖をもたらす。
特定の実施形態では、比色読み出しを持つ酵素を阻害する既存のアプタマーが使用される。トロンビン、プロテインＣ、好中球エラスターゼ、サブチリシンなど、比色読み出しを持ついくつかのアプタマー／酵素のペアが存在する。これらのプロテアーゼは、ｐＮＡに基づく比色基質を持ち、市販されている。特定の実施形態では、一般的な比色酵素を標的とする新規アプタマーが使用される。ベータガラクトシダーゼ、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、または子ウシ腸のアルカリホスファターゼなどの一般的で堅牢な酵素は、ＳＥＬＥＸなどの選択戦略によって設計された操作されたアプタマーの標的となり得る。このような戦略により、ナノモル結合効率のアプタマーをすばやく選択でき、比色読み出し用の追加の酵素／アプタマーペアの開発に使用できる。
特定の実施形態において、ＲＮａｓｅ活性は、ＲＮＡ係留阻害剤の切断を介して比色分析的に検出される。多くの一般的な比色酵素には、競合的で可逆的な阻害剤がある。例えば、ベータガラクトシダーゼはガラクトースによって阻害され得る。これらの阻害剤の多くは弱いが、局所濃度を上げることで効果を高めることができる。阻害剤の局所濃度をＲＮａｓｅ活性に関連付けることにより、比色酵素と阻害剤のペアを操作してＲＮａｓｅセンサーに組み込むことができる。小分子阻害剤に基づく比色ＲＮａｓｅセンサーには、比色酵素、阻害剤、及び阻害剤と酵素の両方に共有結合して阻害剤を酵素に係留する架橋ＲＮＡの３つのコンポーネントが含まれる。切断されていない構成では、酵素は小分子の局所濃度の増加によって阻害される。ＲＮＡが切断されると（例えば、ｃａｓ１３ａ付随切断によって）、阻害剤が放出され、比色酵素が活性化される。
特定の実施形態において、ＲＮａｓｅ活性は、Ｇ四重鎖の形成及び／または活性化を介して比色分析的に検出される。ＤＮＡのＧ四重鎖は、ヘム（鉄（ＩＩＩ）－プロトポルフィリンＩＸ）と複合体を形成して、ペルオキシダーゼ活性を持つＤＮＡザイムを形成することができる。ペルオキシダーゼ基質（例えば、ＡＢＴＳ：（２，２’－アジノビス［３－エチルベンゾチアゾリン－６－スルホン酸］－ジアンモニウム塩））とともに供給される場合、過酸化水素の存在下でＧ四重鎖－ヘム錯体が基質の酸化を引き起こし、これにより溶液中で緑色が形成される。Ｇ四重鎖を形成するＤＮＡ配列の例は、ＧＧＧＴＡＧＧＧＣＧＧＧＴＴＧＧＧＡ（配列番号６）である。このＤＮＡアプタマーにＲＮＡ配列をハイブリダイズさせることにより、Ｇ四重鎖構造の形成が制限される。ＲＮａｓｅ付随的活性化（Ｃ２ｃ２複合体側副活性化など）により、ＲＮＡステープルが切断され、Ｇ四重鎖が形成され、ヘムが結合する。この戦略は特に魅力的である。なぜなら、発色は酵素的であり、ＲＮａｓｅの活性化以外にも追加の増幅があることを意味するためである。
特定の例示的な実施形態では、マスキング構築物は、個別の別個のボリューム（以下でさらに定義される）内の固体基質上に固定化され、単一の試薬を隔離することができる。例えば、試薬は色素を含むビーズであり得る。固定化試薬によって隔離された場合、個々のビーズは拡散しすぎて検出可能なシグナルを生成できないが、マスキング構築物からの放出時に、例えば凝集または溶液濃度の単純な増加によって、検出可能なシグナルを生成できる。特定の例示的な実施形態では、固定化されたマスキング剤は、標的分子の検出時に活性化エフェクタータンパク質によって切断され得るＲＮＡベースのアプタマーである。
１つの例示的な実施形態では、マスキング構築物は、検出剤が溶液中で凝集しているか分散しているかに応じて色を変化させる検出剤を含む。例えば、コロイド金などの特定のナノ粒子は、凝集体から分散粒子に移動するときに、紫から赤への可視的なカラーシフトを受ける。したがって、特定の例示的な実施形態では、そのような検出剤は、１つ以上の架橋分子によって凝集して保持され得る。架橋分子の少なくとも一部はＲＮＡを含む。本明細書に開示されるエフェクタータンパク質の活性化時に、架橋分子のＲＮＡ部分が切断され、検出剤が分散し、対応する色の変化をもたらす。例えば、図４６を参照されたい。特定の例示的な実施形態において、架橋分子はＲＮＡ分子である。特定の例示的な実施形態では、検出剤はコロイド金属である。コロイド金属材料は、液体、ヒドロゾル、または金属ゾル中に分散した水不溶性金属粒子または金属化合物を含むことができる。コロイド金属は、周期表のＩＡ、ＩＢ、ＩＩＢ及びＩＩＩＢ族の金属、ならびに遷移金属、特にＶＩＩＩ族の金属から選択することができる。好ましい金属には、金、銀、アルミニウム、ルテニウム、亜鉛、鉄、ニッケル及びカルシウムが含まれる。他の適切な金属には、様々な酸化状態のすべての次のものも含まれる：リチウム、ナトリウム、マグネシウム、カリウム、スカンジウム、チタン、バナジウム、クロム、マンガン、コバルト、銅、ガリウム、ストロンチウム、ニオブ、モリブデン、パラジウム、インジウム、スズ、タングステン、レニウム、プラチナ、及びガドリニウム。金属は、好ましくは、適切な金属化合物に由来する、イオン形態、例えば、Ａ１３＋、Ｒｕ３＋、Ｚｎ２＋、Ｆｅ３＋、Ｎｉ２＋、及びＣａ２＋のイオンとして提供される。
活性化されたＣＲＩＳＰＲエフェクターによりＲＮＡブリッジが切断されると、前述のカラーシフトが観察される。特定の例示的な実施形態では、粒子はコロイド金属である。特定の他の例示的な実施形態では、コロイド金属はコロイド金である。特定の例示的な実施形態において、コロイドナノ粒子は、１５ｎｍの金ナノ粒子（ＡｕＮＰ）である。コロイド金ナノ粒子の独特の表面特性により、溶液中に完全に分散し、肉眼では赤色に見える場合、５２０ｎｍで最大吸光度が観察される。ＡｕＮＰが凝集すると、最大吸光度において赤方偏移し、色が濃くなり、最終的に溶液から暗紫色の凝集体として沈殿する。特定の例示的な実施形態において、ナノ粒子は、ナノ粒子の表面から伸長するＤＮＡリンカーを含むように修飾される。個々の粒子は、ＲＮＡの各端でＤＮＡリンカーの少なくとも一部にハイブリダイズする一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）ブリッジによって互いに連結される。したがって、ナノ粒子は、連結された粒子と凝集体の網を形成し、暗い沈殿物として現れる。本明細書に開示されるＣＲＩＳＰＲエフェクターの活性化時に、ｓｓＲＮＡブリッジが切断され、連結されたメッシュからＡＵ ＮＰＳが解放され、目に見える赤色が生成される。ＤＮＡリンカーとＲＮＡブリッジ配列の例を以下に示す。ＤＮＡリンカーの末端にあるチオールリンカーは、ＡｕＮＰＳへの表面コンジュゲートに使用できる。他の形態のコンジュゲートが使用されてもよい。特定の例示的な実施形態では、ＡｕＮＰの２つの集団が、各ＤＮＡリンカーに対して１つ生成され得る。これにより、ｓｓＲＮＡブリッジが適切な方向に適切に結合しやすくなる。特定の例示的な実施形態において、第１のＤＮＡリンカーは３’末端によってコンジュゲートされ、第２のＤＮＡリンカーは５’末端によってコンジュゲートされている。
Figure 2022507573000002
特定の他の例示的な実施形態では、マスキング構築物は、検出可能な標識及びその検出可能な標識のマスキング剤が付着するＲＮＡオリゴヌクレオチドを含み得る。このような検出可能な標識／マスキング剤のペアの例は、フルオロフォア及びフルオロフォアのクエンチャーである。フルオロフォアと別のフルオロフォアまたは非蛍光分子との間の非蛍光複合体の形成の結果として、フルオロフォアのクエンチが起こり得る。このメカニズムは、基底状態の複合体形成、静的クエンチング、または接触クエンチングとして知られている。したがって、ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、フルオロフォア及びクエンチャーが接触クエンチングが起こるのに十分近接するように設計され得る。フルオロフォア及びそれらの同種のクエンチャーは当該技術分野で知られており、当業者がこの目的のために選択することができる。特定のフルオロフォア／クエンチャーのペアは、本発明の文脈において重要ではなく、フルオロフォア／クエンチャーのペアの選択のみが、フルオロフォアのマスキングを確実にする。本明細書に開示されるエフェクタータンパク質の活性化時に、ＲＮＡオリゴヌクレオチドが切断され、それにより、接触クエンチング効果を維持するために必要なフルオロフォアとクエンチャーとの間の近接性が切断される。したがって、フルオロフォアの検出は、サンプル中の標的分子の存在を決定するために使用され得る。
特定の他の例示的な実施形態では、マスキング構築物は、金ナノ粒子などの１つ以上の金属ナノ粒子が付着する１つ以上のＲＮＡオリゴヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態では、マスキング構築物は、閉ループを形成する複数のＲＮＡオリゴヌクレオチドによって架橋された複数の金属ナノ粒子を含む。一実施形態では、マスキング構築物は、閉ループを形成する３つのＲＮＡオリゴヌクレオチドによって架橋された３つの金ナノ粒子を含む。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質によるＲＮＡオリゴヌクレオチドの切断は、金属ナノ粒子によって生成される検出可能なシグナルをもたらす。
特定の他の例示的な実施形態では、マスキング構築物は、１つ以上の量子ドットが付着する１つ以上のＲＮＡオリゴヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質によるＲＮＡオリゴヌクレオチドの切断は、量子ドットによって生成される検出可能なシグナルをもたらす。
１つの例示的な実施形態では、マスキング構築物は量子ドットを含み得る。量子ドットは、表面に付着した複数のリンカー分子を有してもよい。リンカー分子の少なくとも一部はＲＮＡを含む。リンカー分子は、量子ドットの一方の端に、及びリンカーの長さに沿ってまたはリンカーの末端で１つ以上のクエンチャーに結合し、量子ドットのクエンチングが発生するのに十分に近接してクエンチャーが維持されるようにする。リンカーは分岐していてもよい。上述のように、量子ドット／クエンチャーのペアは重要ではなく、量子ドット／クエンチャーのペアを選択するだけでフルオロフォアのマスキングが保証される。量子ドット及びそれらの同種のクエンチャーは当該技術分野で知られており、当業者がこの目的のために選択することができる。本明細書に開示されるエフェクタータンパク質の活性化時に、リンカー分子のＲＮＡ部分が切断され、それにより、クエンチング効果を維持するために必要な量子ドットと１つ以上のクエンチャーとの間の近接性が排除される。特定の例示的な実施形態では、量子ドットはストレプトアビジンコンジュゲートである。ＲＮＡはビオチンリンカーを介して結合され、クエンチング分子を配列／５Ｂｉｏｓｇ／ＵＣＵＣＧＵＡＣＧＵＵＣ／３ＩＡｂＲＱＳｐ／（配列番号１０）または／５Ｂｉｏｓｇ／ＵＣＵＣＧＵＡＣＧＵＵＣＵＣＵＣＧＵＡＣＧＵＵＣ／３ＩＡｂＲＱＳｐ／（配列番号１１）で動員し、ここで、／５Ｂｉｏｓｇ／はビオチンタグであり、／３１ＡｂＲＱＳｐ／はアイオワブラッククエンチャーである。切断すると、本明細書に開示される活性化エフェクターにより、量子ドットは目に見える蛍光を発する。
同様に、蛍光エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を使用して、検出可能な陽性シグナルを生成することができる。ＦＲＥＴは、エネルギー的に励起されたフルオロフォア（すなわち、「ドナーフルオロフォア」）からの光子が、別の分子（すなわち、「アクセプター」）の電子のエネルギー状態を励起一重項状態のより高い振動レベルに上げる非放射プロセスである。ドナーフルオロフォアは、そのフルオロフォアに特有の蛍光を発することなく基底状態に戻る。アクセプターは、別のフルオロフォアまたは非蛍光分子であり得る。アクセプターがフルオロフォアである場合、伝達されたエネルギーはそのフルオロフォアの蛍光特性として放出される。アクセプターが非蛍光分子の場合、吸収されたエネルギーは熱として損失する。したがって、本明細書に開示される実施形態の文脈において、フルオロフォア／クエンチャーのペアは、オリゴヌクレオチド分子に結合したドナーフルオロフォア／アクセプターのペアで置き換えられる。インタクトである場合、マスキング構築物は、アクセプターから放出された蛍光または熱によって検出される最初のシグナル（検出可能な陰性シグナル）を生成する。本明細書に開示されるエフェクタータンパク質の活性化により、ＲＮＡオリゴヌクレオチドが切断され、ＦＲＥＴが破壊され、そのためドナーフルオロフォアの蛍光（検出可能な陽性シグナル）が検出される。
特定の例示的な実施形態では、マスキング構築物は、長いＲＮＡの短いヌクレオチドへの切断に応答してそれらの吸光度を変化させる挿入色素の使用を含む。いくつかのそのような色素が存在する。例えば、ピロニン－ＹはＲＮＡと複合体を形成し、５７２ｎｍでの吸光度を有する複合体を形成する。ＲＮＡの切断により、吸光度が失われ、色が変化する。メチレンブルーも同様の方法で使用でき、ＲＮＡ切断時に６８８ｎｍでの吸光度が変化する。したがって、特定の例示的な実施形態では、マスキング構築物は、本明細書に開示されるエフェクタータンパク質によるＲＮＡの切断時に吸光度を変化させるＲＮＡ及び挿入色素複合体を含む。
特定の例示的な実施形態では、マスキング構築物は、ＨＣＲ反応のための開始剤を含み得る。例えば、Ｄｉｒｋｓ ａｎｄ Ｐｉｅｒｃｅ．ＰＮＡＳ １０１，１５２７５－１５７２８（２００４）を参照されたい。ＨＣＲ反応は、２つのヘアピン種の潜在的エネルギーを利用する。ヘアピンの１つの対応する領域に相補的な部分を有する一本鎖の開始剤が、以前に安定していた混合物に放出されると、１つの種のヘアピンが開かれる。このプロセスでは、転じて、他の種のヘアピンを開く一本鎖領域が露出する。転じて、このプロセスにより、元の開始剤と同一の一本鎖領域が露出する。結果として生じる連鎖反応は、ヘアピン供給が枯渇するまで成長する、ニックのある二重らせんの形成をもたらし得る。得られた生成物の検出は、ゲル上または比色的に行うことができる。比色検出方法の例には、例えば、Ｌｕ ｅｔ ａｌ．“Ｕｌｔｒａ－ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ ａｓｓａｙ ｓｙｓｔｅｍ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ－ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ ｅｎｚｙｍｅ ｃａｓｃａｄｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ＡＣＳ Ａｐｐｌ Ｍａｔｅｒ Ｉｎｔｅｒｆａｃｅｓ，２０１７，９（１）：１６７－１７５，Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．“Ａｎ ｅｎｚｙｍｅ－ｆｒｅｅ ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ ａｓｓａｙ ｕｓｉｎｇ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｐｌｉｔ ａｐｔａｍｅｒｓ”Ａｎａｌｙｓｔ ２０１５，１５０，７６５７－７６６２、及びＳｏｎｇ ｅｔ ａｌ．“Ｎｏｎ ｃｏｖａｌｅｎｔ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｌａｂｅｌｉｎｇ ｏｆ ｈａｉｒｐｉｎ ＤＮＡ ｐｒｏｂｅ ｃｏｕｐｌｅｄ ｗｉｔｈ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｆｏｒ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ＤＮＡ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ．”Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ，７０（４）：６８６－６９４（２０１６）に開示されるものが含まれる。
特定の例示的な実施形態では、マスキング構築物は、ＨＣＲ開始剤配列、及び開始剤がＨＣＲ反応を開始するのを妨げる、ループまたはヘアピンなどの切断可能な構造要素を含み得る。活性化されたＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質によって構造要素が切断されると、開始剤が放出されてＨＣＲ反応を引き起こし、その検出はサンプル中の１つ以上の標的の存在を示す。特定の例示的な実施形態において、マスキング構築物は、ＲＮＡループを有するヘアピンを含む。活性化されたＣＲＩＳＲＰエフェクタータンパク質がＲＮＡループを切断すると、開始剤が放出されてＨＣＲ反応が誘発され得る。
光学バーコード、バーコード、及び一意の分子識別子（ＵＭＩ）
本明細書に開示されるシステムは、１つ以上の標的分子の光学バーコード、及び検出ＣＲＩＳＰＲ系に関連する光学バーコードを含み得る。例えば、１つ以上の標的分子及び標的分子を含む目的のサンプルのバーコードを、光学バーコードを含有するＣＲＩＳＰＲ検出システムを含む液滴とマージすることができる。
本明細書で使用されるとき、「バーコード」という用語は、標的分子及び／または標的核酸などの関連分子の識別子として、または起源細胞などの関連分子の供給源の識別子として使用されるヌクレオチドの短い配列（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）を指す。バーコードはまた、核酸断片の起源を特定するために使用され得る、任意の固有の天然に存在しない核酸配列を指し得る。発明のメカニズムを理解する必要はないが、バーコード配列は、単一細胞、ウイルスベクター、標識リガンド（例えば、アプタマー）、タンパク質、ｓｈＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ、またはｃＤＮＡに関連するバーコードの高品質の個別読み取りを提供し、そのため、複数の種を一緒に配列決定できるようにすると考えられている。
バーコード化は、その全体が本明細書に組み込まれる特許公開ＷＯ２０１４０４７５６１ Ａ１，Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｌａｂｅｌｉｎｇ ｏｆ ａｇｅｎｔｓに開示されている組成物または方法のいずれかに基づいて実行することができる。特定の実施形態では、バーコード化ではエラー訂正スキームを使用する（Ｔ．Ｋ．Ｍｏｏｎ，Ｅｒｒｏｒ Ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ Ｃｏｄｉｎｇ：Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｌｇｏｒｉｔｈｍｓ（Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｅｄ．１，２００５））。理論に縛られることなく、単一細胞からの増幅された配列は、各細胞に関連付けられたバーコードに基づいて一緒に配列決定され、決定される。
光学的にコード化された粒子は、各ウェル内の光学的にコード化された粒子のランダムな組み合わせをもたらす個別のボリュームにランダムに送達されてもよいし、または光学的にコード化された粒子の一意の組み合わせが各個別のボリュームに具体的に割り当てられてもよい。次いで、光学的にコード化された粒子の観察可能な組み合わせを使用して、各個別のボリュームを識別することができる。表現型などの光学的評価は、個別のボリュームごとに作成及び記録することができる。場合によっては、バーコードは、光または蛍光顕微鏡で視覚化できる光学的に検出可能なバーコードであり得る。特定の例示的な実施形態では、光学バーコードは、一連の定義された色から区別可能な色のフルオロフォアまたは量子ドットのサブセットを含む。場合によっては、光学的にコード化された粒子は、各ウェル内の光学的にコード化された粒子のランダムな組み合わせをもたらす個別のボリュームにランダムに送達されてもよいし、または光学的にコード化された粒子の一意の組み合わせが各個別のボリュームに具体的に割り当てられてもよい。
例示的な実施形態では、３つの蛍光色素、例えば、様々なレベルのＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５、５９４、６４７で、１０５個のバーコードを生成できる。第４の色素を追加して使用することができ、数百の一意のバーコードの規模に拡張することができる。同様に、５色は、色の比率を変えることで達成できる一意のバーコードの数を増やすことができる。異なる比率の色素で標識することにより、正規化後に色素が対数座標で等間隔になるように色素比率を選択することができる。
一実施形態において、各液滴または個別のボリュームで受け取られるフルオロフォアの割り当てられたまたはランダムなサブセット（複数可）は、各個別のボリュームにおける個別の光学的にコード化された粒子の観察可能なパターンを決定し、それにより、各個別のボリュームが独立して識別されることを可能にする。各個々のボリュームは、光学的にコード化された粒子を検出する適切な画像化技術で画像化される。例えば、光学的にコード化された粒子が蛍光標識されている場合、各個別のボリュームは、蛍光顕微鏡を使用して画像化される。別の例では、光学的にコード化された粒子が比色的に標識されている場合、各個別のボリュームは、各カラーラベルに固有の波長または吸収スペクトルまたは発光スペクトルに一致する１以上のフィルターを備えた顕微鏡を使用して画像化される。使用される光学システムに適合する他の検出方法、例えば、量子ドット、色素などを検出するための当該技術分野で知られている方法が企図される。各個別のボリュームについて観察された個別の光学的にコード化された粒子のパターンは、後の使用のために記録することができる。
光学バーコードは、任意選択で一意のオリゴヌクレオチド配列を含むことができ、生成方法は、例えば、国際特許出願公開第ＷＯ／２０１４／０４７５６１号の［０５０］～［０１１５］に記載されている通りであり得る。１つの例示的な実施形態では、プライマー粒子識別子は標的分子に組み込まれている。当該技術分野で知られている次世代シーケンシング（ＮＧＳ）技術は、１つ以上の標的配列の配列類似性によるクラスタリングを伴うシーケンシングに使用することができる。配列変動によるアライメントは、整列された配列情報に組み込まれた粒子識別子に基づいて、個別のボリュームに送達された光学的にコード化された粒子の識別を可能にする。一実施形態では、整列された配列情報に組み込まれた各プライマーの粒子識別子は、アンプリコンが生成される対応する個別のボリュームで観察可能である光学的にコード化された粒子のパターンを示す。このようにして、核酸配列の変化を元の個別のボリュームに相関させ、さらにその個別のボリュームの核酸を含む標本で作成された表現型などの光学的評価に一致させることができる。
好ましい実施形態では、配列決定は、一意の分子識別子（ＵＭＩ）を使用して実行される。本明細書で使用される「一意の分子識別子」（ＵＭＩ）という用語は、分子タグを使用して一意の増幅産物を検出及び定量化する方法で使用される配列決定リンカーまたは核酸バーコードのサブタイプを指す。ＵＭＩは、単一のクローンによる効果と複数のクローンによる効果を区別するために使用される。本明細書で使用されるとき、「クローン」という用語は、配列決定される単一のｍＲＮＡまたは標的核酸を指し得る。ＵＭＩはまた、増幅産物を生じた転写産物の数、または本明細書に記載の標的バーコードの場合、結合事象の数を決定するために使用され得る。好ましい実施形態では、増幅はＰＣＲまたは多重置換増幅（ＭＤＡ）によるものである。
特定の実施形態では、４～２０塩基対のランダム配列を有するＵＭＩがテンプレートに付加され、増幅され、配列決定される。好ましい実施形態では、ＵＭＩはテンプレートの５’末端に付加される。配列決定により高解像度の読み取りが可能になり、真のバリアントの正確な検出が可能になる。本明細書で使用されるとき、「真のバリアント」は、元のクローンに由来するすべての増幅産物に存在し、すべての産物をＵＭＩと整列させることによって識別される。増幅された各クローンは、増幅された産物がそのクローンに由来することを示す異なるランダムＵＭＩを有する。真のバリアントはすべての増幅された産物に存在し、ランダムエラーを表すバックグラウンドは単一の増幅産物にのみ存在するため、増幅プロセスの忠実度に起因するバックグラウンドは排除できる（例えば、Ｉｓｌａｍ Ｓ．ｅｔ ａｌ．，２０１４．Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｎｏ：１１，１６３－１６６を参照されたい）。理論に縛られることなく、ＵＭＩは、増幅または配列決定中に最大４～７のエラーが発生しても、オリジナルへの割り当てが発生するように設計されている。理論に拘束されるものではなく、ＵＭＩを使用して真のバーコード配列を識別できる。
一意の分子識別子は、例えば、可変増幅効率のサンプルを正規化するために使用できる。例えば、様々な実施形態において、核酸バーコード（例えば、同じ配列を共有する複数のバーコード）が付着する固体または半固体の支持体（例えば、ヒドロゲルビーズ）を特徴とし、バーコードの各々はさらに、特定の固体または半固体支持体上のすべてのバーコードが個別の一意の分子識別子を受け取るように、一意の分子識別子に結合し得る。次いで、例えば、標的分子が核酸バーコードだけでなく、その固体または半固体支持体に由来する識別子の間で一意の識別子も受け取るように、一意の分子識別子を、関連するバーコードとともに標的分子に移すことができる。
核酸バーコードまたはＵＭＩは、例えば、少なくとも４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、または１００ヌクレオチド長であり、一本鎖または二本鎖の形態であり得る。標的分子及び／または標的核酸は、核酸バーコードコンカテマーなどのコンビナトリアル様式で複数の核酸バーコードで標識することができる。典型的には、核酸バーコードを、標的分子及び／または標的核酸を、特定の個別のボリュームに由来するもの、特定の物理的特性（例えば、親和性、長さ、配列など）を有するもの、または特定の治療条件に供されるものとして識別するために使用される。標的分子及び／または標的核酸を複数の核酸バーコードに関連付けて、これらすべての特徴（及びそれ以上）に関する情報を提供できる。一方、ＵＭＩの特定の集団の各メンバーは、通常、同一の特定の（例えば、個別のボリューム、物理的特性、または処理条件固有）核酸バーコードの特定のセットの個々のメンバーと関連付けられている（例えば、同じ分子に共有結合しているかその構成要素である）。したがって、例えば、同一または一致するバーコード配列を有する起源特異的核酸バーコードのセットの各メンバー、または他の核酸識別子またはコネクターオリゴヌクレオチドは、区別できるかまたは異なるＵＭＩと関連付けられていてもよい（例えば、同じ分子に共有結合しているかその構成要素である）。
本明細書に開示されるように、一意の核酸識別子は、標的分子及び／または標的核酸、例えば起源特異的バーコードなどを標識するために使用される。核酸識別子、核酸バーコードは、関連する分子、位置、または状態の識別子として使用できるヌクレオチドの短い配列を含むことができる。特定の実施形態において、核酸識別子は、１つ以上の一意の分子識別子及び／またはバーコード受容アダプターをさらに含む。核酸識別子は、例えば、約４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、または１００塩基対（ｂｐ）またはヌクレオチド（ｎｔ）の長さを有してもよい。特定の実施形態において、核酸識別子は、ランダムに選択されたインデックス（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のインデックス）を組み合わせることにより、コンビナトリアルな様式で構築され得る。そのような各インデックスは、異なる配列を持つヌクレオチドの短い配列（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはそれらの組み合わせ）である。インデックスは、例えば、約４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５ｂｐまたはｎｔの長さを有してもよい。核酸識別子は、例えば、その各々の全体が参照により本明細書に組み込まれる、国際特許公開第ＷＯ２０１４／０４７５５６号及びＷＯ２０１４／１４３１５８号に記載されているもののようなスプリットプール合成方法によって生成することができる。
１つ以上の核酸識別子（例えば、核酸バーコード）を標的分子に付着または「タグ付け」することができる。この結合は、直接的（例えば、標的分子への核酸識別子の共有または非共有結合）または間接的（例えば、追加の分子を介した）であり得る。このような間接的な付着には、例えば、標的分子を認識する特異的結合剤に結合したバーコードが含まれる。特定の実施形態において、バーコードはプロテインＧに付着し、標的分子は抗体または抗体断片である。標的分子（例えば、タンパク質及び他の生体分子）へのバーコードの付着は、当該技術分野で周知の標準的な方法を使用して行うことができる。例えば、バーコードは、システイン残基（例えば、Ｃ末端システイン残基）を介してリンクできる。他の例では、適切な基特異的試薬を使用して、ポリペプチド上の様々な官能基を介して、バーコードをポリペプチド（例えば、抗体）に化学的に導入できる（例えば、ｗｗｗ．ｄｒｍｒ．ｃｏｍ／ａｂｃｏｎを参照されたい）。特定の実施形態では、バーコードタグ付けは、本明細書に記載されるように、標的分子と会合した（例えば、付着した）バーコード受容アダプターを介して起こり得る。
標的分子は、任意選択で複数のバーコードをコンビナトリアルな様式で標識でき（例えば、標的分子を特異的に認識する１つ以上の特異的結合剤に結合した複数のバーコードを使用して）、したがって、特定のバーコードプール内で可能な一意の識別子の数を大幅に拡大する。特定の実施形態において、バーコードは、標的分子に付着した成長中のバーコードコンカテマーに、例えば、一度に１つずつ付加される。他の実施形態では、複数のバーコードが、標的分子に付着する前に組み立てられる。複数のバーコードをコンカテマー化するための組成物及び方法は、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる国際特許公開第ＷＯ２０１４／０４７５６１号に記載されている。
いくつかの実施形態では、核酸識別子（例えば、核酸バーコード）は、増幅及び配列決定を可能にする配列（例えば、ＩｌｌｕｍｉｎａシーケンシングのためのＳＢＳ３及びＰ５要素）に付加されてもよい。特定の実施形態では、核酸バーコードは、バーコードの末端に付着したプライマー（例えば、一本鎖ＤＮＡプライマー）のハイブリダイゼーション部位をさらに含むことができる。例えば、起源特異的バーコードは、バーコード及び特異的プライマーのハイブリダイゼーション部位を含む核酸であり得る。特定の実施形態では、起源特異的バーコードのセットは、例えばランダム化されたオリゴタイプＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮを使用して作成された一意のプライマー特異的バーコードを含む。
核酸識別子は、例えば、核酸識別子の１つ以上が付着する共通の支持体に特異的な一意の分子識別子及び／または追加のバーコードをさらに含むことができる。したがって、標的分子のプールは、例えば、異なる処理条件を表す複数の固体または半固体の支持体（例えば、ビーズ）を含む個別のボリュームに追加することができ（及び／または、例えば、１つ以上の追加の固体または半固体の支持体を、標的分子プールの導入後、個別のボリュームに連続して追加でき）、そのため、特定の標的分子がさらされた条件の正確な組み合わせは続いて、それに関連付けられている一意の分子識別子を配列決定することによって決定できる。
標識された標的分子及び／または標的核酸に関連する起源特異的核酸バーコード（任意選択で、本明細書に記載の他の核酸バーコードと組み合わせて）は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などの当該技術分野で公知の方法によって増幅することができる。例えば、核酸バーコードは、ＰＣＲ増幅及びその後のハイスループット配列決定のためのＰＣＲプライマーが結合できるユニバーサルプライマー認識配列を含むことができる。特定の実施形態では、核酸バーコードは、バーコード及び配列決定アダプター要素が両方とも標的分子に結合するように、配列決定アダプター（例えば、ユニバーサルプライマー認識配列）を含むか、またはそれに結合される。特定の例では、起源特異的バーコードの配列は、例えばＰＣＲを使用して増幅される。いくつかの実施形態では、起源特異的バーコードはさらに配列決定アダプターを含む。いくつかの実施形態では、起源特異的バーコードはさらにユニバーサルプライミング部位を含む。核酸バーコード（またはそのコンカテマー）、標的核酸分子（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子）、標的ペプチドまたはポリペプチドをコードする核酸、及び／または特異的結合剤をコードする核酸は、任意選択で、当該技術分野で既知の任意の方法、例えば、次世代シーケンシングまたはディープシーケンシングとしても知られるハイスループットシーケンシングの方法によって配列決定される。バーコード（例えば、起源特異的バーコード）で標識された核酸標的分子をバーコードで配列決定して、標的分子とバーコードの両方の配列またはその一部を含む単一の読み取り及び／またはコンティグを生成することができる。例示的な次世代シーケンシング技術には、例えば、とりわけ、Ｉｌｌｕｍｉｎａシーケンシング、Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔシーケンシング、４５４シーケンシング、ＳＯＬｉＤシーケンシング、ナノポアシーケンシングなどが含まれる。いくつかの実施形態では、標識された標的分子の配列は非配列決定ベースの方法によって決定される。例えば、可変長のプローブまたはプライマーを使用して、例えば、バーコードの長さ、標的核酸の長さ、または標的ポリペプチドをコードする核酸の長さなどによって、異なる標的分子を標識するバーコード（例えば、起源特異的バーコード）を区別できる。他の例では、バーコードは、例えば、特定の標的分子（例えば、ポリペプチド、核酸、小分子、または脂質）の分子のタイプを識別する配列を含むことができる。例えば、複数のタイプの標的分子を含む標識された標的分子のプールにおいて、ポリペプチド標的分子は１つの識別配列を受け取ることができ、標的核酸分子は異なる識別配列を受け取ることができる。このような識別配列は、例えば、特定の種類の標的分子に特異的な識別配列に特異的なＰＣＲプライマーを使用することにより、特定の種類の標的分子を標識するバーコードを選択的に増幅するために使用することができる。例えば、ポリペプチド標的分子を標識するバーコードをプールから選択的に増幅することができ、それにより標的分子プールのポリペプチドサブセットからバーコードのみを取り出すことができる。
核酸バーコードは、例えば切断後に配列決定されて、標的分子の存在、量、または他の特徴を決定することができる。特定の実施形態において、核酸バーコードは、さらなる核酸バーコードにさらに付着することができる。例えば、核酸バーコードは、特異的結合剤が標的分子またはタグ（例えば、標的分子から切断されたコード化されたポリペプチド識別子要素）に結合した後、特異的結合剤から切断され、次いで、核酸バーコードは、起源特異的バーコードに連結できる。結果として生じる核酸バーコードコンカテマーは、他のそのようなコンカテマーとプールされ、配列決定され得る。配列決定読み取りを使用して、どの標的分子がどの個別ボリュームに元々存在していたかを特定できる。
固体基板に可逆的に結合したバーコード
いくつかの実施形態では、起源特異的バーコードが固体または半固体の基板に可逆的に結合される。いくつかの実施形態では、起源特異的バーコードは、標的核酸に特異的に結合する核酸捕捉配列及び／または標的分子に特異的に結合する特異的結合剤をさらに含む。特定の実施形態では、起源特異的バーコードは起源特異的バーコードの２つ以上の集団を含み、第１の集団は核酸捕捉配列を含み、第２の集団は標的分子に特異的に結合する特異的結合剤を含む。いくつかの例において、起源特異的バーコードの第１の集団は、標的核酸バーコードをさらに含み、標的核酸バーコードは、核酸を標識するものとして集団を識別する。いくつかの例において、起源特異的バーコードの第２の集団は、標的分子バーコードをさらに含み、標的分子バーコードは、標的分子を標識するものとして集団を識別する。
切断部位を有するバーコード
核酸バーコードは、例えば、特異的結合剤が標的分子に結合した後、特異的結合剤から切断可能であり得る。いくつかの実施形態では、起源特異的バーコードはさらに１つ以上の切断部位を含む。いくつかの例において、少なくとも１つの切断部位は、その部位での切断が、それが結合しているビーズ、例えばヒドロゲルビーズなどの基板から起源特異的バーコードを放出するように配向されている。いくつかの例において、少なくとも１つの切断部位は、その部位での切断が標的分子特異的結合剤から起源特異的バーコードを放出するように配向されている。いくつかの例では、切断部位は、特定の核酸配列に存在するエンドヌクレアーゼ部位などの酵素切断部位である。他の実施形態において、切断部位は、特定の酵素がアミノ酸配列を切断できるようなペプチド切断部位である。さらに他の実施形態では、切断部位は化学的切断の部位である。
バーコードアダプター
いくつかの実施形態では、標的分子は、核酸などの起源特異的バーコード受容アダプターに結合される。いくつかの例では、起源特異的バーコード受容アダプターはオーバーハングを含み、起源特異的バーコードはオーバーハングにハイブリダイズできる配列を含む。バーコード受容アダプターは、起源特異的核酸バーコードなどの核酸バーコードを受容または受けるように構成される分子である。例えば、バーコード受容アダプターは、例えば、バーコードに核酸バーコードの一部または全体に相補的な配列を介して、所与のバーコード（例えば、起源特異的バーコード）にハイブリダイズできる一本鎖核酸配列（例えば、オーバーハング）を含むことができる。特定の実施形態では、バーコードのこの部分は、個々のバーコード間で一定に保持される標準配列である。ハイブリダイゼーションにより、バーコード受容アダプターがバーコードに結合する。いくつかの実施形態では、バーコード受容アダプターが標的分子に会合していて（例えば、付着していて）もよい。このように、バーコード受容アダプターは、起源特異的バーコードを標的分子に付着させる手段として機能することができる。バーコード受容アダプターは、当該技術分野で既知の方法に従って標的分子に付着することができる。例えば、バーコード受容アダプターは、システイン残基（例えば、Ｃ末端システイン残基）でポリペプチド標的分子に付着することができる。バーコード受容アダプターを使用して、１つ以上の標的分子に関連する特定の状態、例えば、起源細胞または起源の個別のボリュームなどを識別することができる。例えば、標的分子は、細胞によって発現される細胞表面タンパク質であり得、細胞特異的バーコード受容アダプターを受容する。細胞が１つ以上の条件にさらされると、バーコード受容アダプターを１つ以上のバーコードに結合させることができ、標的分子の元の起源細胞及び細胞がさらされている各々の状態は、その後、バーコード受容アダプター／バーコードコンカテマーの配列を特定することによって決定することができる。
捕捉部分を有するバーコード
いくつかの実施形態では、起源特異的バーコードには、共有結合または非共有結合で結合した捕捉部分がさらに含まれる。したがって、いくつかの実施形態では、捕捉部分を含む、起源特異的バーコード、及びそこに結合または付着したいずれかのものは、捕捉部分に特異的に結合する特異的結合剤で捕捉される。いくつかの実施形態では、捕捉部分が表面に吸着またはさもなければ捕捉される。特定の実施形態では、標的プローブは、例えば、インビトロ転写中にビオチン－１６－ＵＴＰを組み込むことにより、ビオチンで標識され、後でストレプトアビジンによる捕捉が可能になる。起源特異的バーコードを標識、捕捉、及び検出する他の手段には、アミノアリル標識ヌクレオチドの取り込み、スルフヒドリル標識ヌクレオチドの取り込み、アリルまたはアジド含有ヌクレオチドの取り込み、及び参照により本明細書に具体的に組み込まれる、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（２ｎｄ Ｅｄ），Ｇｒｅｇ Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ（２００８）に記載される他の多数の方法が含まれる。いくつかの実施形態では、標的プローブは、サンプルに接触する前に、アミノアリル標識ヌクレオチドの取り込みに続いて１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）のカルボキシ活性化固体支持体へのカップリングなどの方法を使用して、またはＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓに記載される他の方法を使用して、固体支持体または他の捕捉デバイスに共有結合される。いくつかの実施形態では、特異的結合剤が例えば固体支持体に固定化されており、それにより起源特異的バーコードを単離する。
他のバーコード化の実施形態
ＤＮＡバーコード化は、生物のＤＮＡ内の短い遺伝子マーカーを使用して、特定の種に属するものとして識別する分類学的手法でもある。これは、主な目的が分類を決定することではなく、既知の分類に関して未知のサンプルを特定することであるという点で、分子系統発生学とは異なる。Ｋｒｅｓｓ ｅｔ ａｌ．，“Ｕｓｅ ｏｆ ＤＮＡ ｂａｒｃｏｄｅｓ ｔｏ ｉｄｅｎｔｉｆｙ ｆｌｏｗｅｒｉｎｇ ｐｌａｎｔｓ”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０２（２３）：８３６９－８３７４（２００５）。バーコードは、未知の種を識別する、または種を組み合わせるもしくは分離する必要があるかどうかを評価するためにしばしば使用される。Ｋｏｃｈ Ｈ．，“Ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ ａｎｄ ＤＮＡ ｂａｒｃｏｄｉｎｇ ｒｅｓｏｌｖｅｓ ｔｈｅ ｔａｘｏｎｏｍｙ ｏｆ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｍａｌａｇａｓｙ Ｌｉｏｔｒｉｇｏｎａ Ｍｏｕｒｅ，１９６１”Ａｆｒｉｃａｎ Ｉｎｖｅｒｔｅｂｒａｔｅｓ ５１（２）：４１３－４２１（２０１０）、及びＳｅｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，“Ｈｏｗ ｍａｎｙ ｌｏｃｉ ｄｏｅｓ ｉｔ ｔａｋｅ ｔｏ ＤＮＡ ｂａｒｃｏｄｅ ａ ｃｒｏｃｕｓ？”ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ４（２）：ｅ４５９８（２００９）。例えば、花や果実を得られない場合でも植物の葉を識別する、胃の内容物や糞に基づいて動物の食事を識別する、または商業製品（ハーブのサプリメントまたは木材など）を識別するために、バーコードが使用されている。Ｓｏｉｎｉｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，“Ａｎａｌｙｓｉｎｇ ｄｉｅｔ ｏｆ ｓｍａｌｌ ｈｅｒｂｉｖｏｒｅｓ：ｔｈｅ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｏｆ ＤＮＡ ｂａｒｃｏｄｉｎｇ ｃｏｕｐｌｅｄ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｆｏｒ ｄｅｃｉｐｈｅｒｉｎｇ ｔｈｅ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｍｐｌｅｘ ｐｌａｎｔ ｍｉｘｔｕｒｅｓ”Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｚｏｏｌｏｇｙ ６：１６（２００９）。
ＤＮＡバーコード化にとって望ましい遺伝子座を標準化して、その遺伝子座の配列の大規模なデータベースを開発できるようにする必要があることが示唆されている。関心のある分類群のほとんどは、種特異的ＰＣＲプライマーなしで配列決定可能な遺伝子座を持っている。ＣＢＯＬ Ｐｌａｎｔ Ｗｏｒｋｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ，“Ａ ＤＮＡ ｂａｒｃｏｄｅ ｆｏｒ ｌａｎｄ ｐｌａｎｔｓ”ＰＮＡＳ １０６（３１）：１２７９４－１２７９７（２００９）。さらに、これらの推定バーコード遺伝子座は、現在の技術で簡単に配列決定できるほど短いと考えられている。Ｋｒｅｓｓ ｅｔ ａｌ．，“ＤＮＡ ｂａｒｃｏｄｅｓ：Ｇｅｎｅｓ，ｇｅｎｏｍｉｃｓ，ａｎｄ ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ”ＰＮＡＳ １０５（８）：２７６１－２７６２（２００８）。したがって、これらの遺伝子座は、種内の比較的少量の変動と組み合わせて、種間の大きな変動を提供する。Ｌａｈａｙｅ ｅｔ ａｌ．，“ＤＮＡ ｂａｒｃｏｄｉｎｇ ｔｈｅ ｆｌｏｒａｓ ｏｆ ｂｉｏｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｈｏｔｓｐｏｔｓ”Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０５（８）：２９２３－２９２８（２００８）。
ＤＮＡバーコード化は、比較的単純な概念に基づいている。例えば、ほとんどの真核細胞にはミトコンドリアが含まれており、ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）の変異速度は比較的速いため、種間でｍｔＤＮＡ配列に大きな変化が生じ、原則として、種内では比較的小さな差異が生じる。ミトコンドリアのシトクロムｃオキシダーゼサブユニット１（ＣＯ１）遺伝子の６４８－ｂｐ領域が、潜在的な「バーコード」として提案された。２００９年の時点で、ＣＯ１配列のデータベースには、５８，０００種を超える動物種からの少なくとも６２０，０００の標本が含まれており、他のいずれかの遺伝子で利用可能なデータベースよりも大規模である。Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｊ．，“Ａ ｂｏｔａｎｉｃａｌ ｍａｃｒｏｓｃｏｐｅ”Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １０６（３１）：１２５６９（２００９）。
ＤＮＡバーコード化のソフトウェアには、フィールド情報管理システム（ＦＩＭＳ）、ラボ情報管理システム（ＬＩＭＳ）、配列分析ツール、フィールドデータとラボデータを接続するためのワークフロー追跡、データベース送信ツール、及びエコシステム規模のプロジェクトにスケールアップするためのパイプライン自動化の統合が必要である。Ｇｅｎｅｉｏｕｓ Ｐｒｏは配列分析コンポーネントに使用でき、Ｍｏｏｒｅａ Ｂｉｏｃｏｄｅ Ｐｒｏｊｅｃｔを通じて無料で入手できる２つのプラグイン、Ｂｉｏｃｏｄｅ ＬＩＭＳ及びＧｅｎｂａｎｋ Ｓｕｂｍｉｓｓｉｏｎプラグインが、ＦＩＭＳ、ＬＩＭＳ、ワークフロー追跡、及びデータベース送信との統合を処理する。
さらに、他のバーコード設計とツールについても記載されている（例えば、Ｂｉｒｒｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９８，１２６０８－１２６１３、Ｇｉａｅｖｅｒ，ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｎａｔｕｒｅ ４１８，３８７－３９１、Ｗｉｎｚｅｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９９９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８５，９０１－９０６、及びＸｕ ｅｔ ａｌ．，（２００９）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．Ｆｅｂ １７；１０６（７）：２２８９－９４を参照されたい）。
本明細書に記載の標的分子は、任意の標的核酸配列を含むことができ、実施形態において、１つ以上のガイドＲＮＡは、疾患状態に特徴的な１つ以上の標的分子に結合するように設計される。さらなる実施形態において、疾患状態は、感染症、臓器疾患、血液疾患、免疫系疾患、がん、脳及び神経系疾患、内分泌疾患、妊娠または出産関連疾患、遺伝性疾患、または環境によって獲得される疾患である。なおさらなる実施形態において、疾患状態は、微生物感染症を含む感染症である。
さらなる実施形態では、感染症はウイルス、細菌、もしくは真菌によって引き起こされるか、または感染症はウイルス感染症である。特定の実施形態では、ウイルス感染は、二本鎖ＲＮＡウイルス、プラス鎖ＲＮＡウイルス、マイナス鎖ＲＮＡウイルス、レトロウイルス、またはそれらの組み合わせによって引き起こされる。特定の実施形態において、用途は、多重化された株識別を達成することができる。いくつかの実施形態では、病原菌サブタイピングを検出でき、一実施形態では、インフルエンザサブタイピング、Ｓｔａｐｈまたはｓｔｒｅｐサブタイピング、及び細菌の重複感染サブタイプの検出を行うことができる。１つの好ましい実施形態では、インフルエンザＡウイルスのすべてのＨ及びＮサブタイプの多重検出及び同定を行うことができる。一態様において、プールされた（または配列された）ｃｒＲＮＡは、サブタイプ内の変動を捕捉するために使用される。特定の場合によっては、感染症はＨＩＶである。一実施形態において、ＨＩＶ逆転写酵素における薬剤耐性変異は、ＳＮＰ検出を介して行うことができる。いくつかの実施形態では、変異はＫ６５Ｒ、Ｋ１０３Ｎ、Ｖ１０６Ｍ、Ｙ１８１Ｃ、Ｍ１８４Ｖ、Ｇ１９０Ａであってよい。同様に、結核などの他の感染症におけるＳＮＰ検出を行うことができる。いくつかの実施形態では、変異はｋａｔＧ、３１５ＡＣＣ；イソニアジド耐性、ｒｐｏＢ、５３１ＴＴＧ：リファンピン耐性、ｇｙｒＡ、９４ＧＧＣ：フルオロキノロン耐性、ｒｒｓ、１４０１Ｇ：アミノグリコシド耐性であってよい。さらに、ＨＩＶ／ＴＢの同時感染も検出できる。汎ウイルス、ウイルスゾーン汎ウイルス、汎細菌、または汎病原菌の検出のための大規模な多重化を実現できる。
本明細書に記載されるように、本発明で使用するための標的分子を含むサンプルは、食品サンプル（新鮮な果物または野菜、肉）、飲料サンプル、紙の表面、布地の表面、金属表面、木材表面、プラスチック表面、土壌サンプル、淡水サンプル、廃水サンプル、塩水サンプル、大気への暴露または他のガスサンプル、またはそれらの組み合わせなどの生物学的または環境的サンプルであり得る。例えば、金属、木材、プラスチック、ゴムなどを含むがこれらに限定されない任意の材料で作られた家庭用／商業用／工業用の表面は、綿棒で拭き取り、汚染物質について試験することができる。土壌サンプルは、環境目的及び／またはヒト、動物、または植物の病気の検査のために、病原性細菌または寄生虫、または他の微生物の存在について検査することができる。淡水サンプル、廃水サンプル、または塩水サンプルなどの水サンプルは、清潔さと安全性、及び／または可搬性について評価して、例えば、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ、Ｇｉａｒｄｉａ ｌａｍｂｄａ、またはその他の微生物汚染の存在を検出できる。さらなる実施形態では、生体サンプルは、組織サンプル、唾液、血液、血漿、血清、大便、尿、痰、粘膜、リンパ液、滑液、脳脊髄液、腹水、胸水、漿液腫、膿、または皮膚もしくは粘膜表面のスワブを含むがこれらに限定されない供給源より取得できる。いくつかの特定の実施形態では、環境サンプルまたは生体サンプルは粗サンプルであり得、及び／または１つ以上の標的分子は、方法の適用前にサンプルから精製または増幅されなくてもよい。微生物の同定は、様々な用途に有用であり、及び／または必要であり、したがって、当業者によって適切とみなされる任意の供給源からの任意のタイプのサンプルが本発明に従って使用され得る。
いくつかの実施形態では、生体サンプルには、血液、血漿、血清、尿、大便、痰、粘液、リンパ液、滑液、胆汁、腹水、胸膜滲出液、血清腫、唾液、脳脊髄液、房水もしくは硝子体液、または任意の体の分泌物、濾出液、浸出液、または関節から得られた体液、または皮膚もしくは粘膜表面のスワブが含まれ得るが、必ずしもこれらに限定されるわけではない。
特定の実施形態では、サンプルは、ヒト患者から得られた血液、血漿、または血清であり得る。
いくつかの実施形態では、サンプルは植物サンプルであり得る。いくつかの実施形態では、サンプルは粗サンプルであり得る。いくつかの実施形態では、サンプルは精製されたサンプルであり得る。
マイクロウェルのアレイを含むマイクロ流体デバイス
マイクロ流体デバイスは、マイクロウェルの下に少なくとも１つのフローチャネルを備えたマイクロウェルのアレイを含む。特定の例示的な実施形態では、デバイスは、異なる液滴（すなわち、個々の個別のボリューム）を生成及び／またはマージするマイクロ流体デバイスである。例えば、スクリーニングされるサンプルを含む第１のセットの液滴が形成され、本明細書に記載のシステムの要素を含む第２のセットの液滴が形成されてもよい。次に、第１及び第２の液滴セットがマージされ、次に、マージ液滴セットに対して、本明細書に記載の診断方法が実行される。
本明細書に開示されるマイクロ流体デバイスは、シリコーンベースのチップであり、ホットエンボス加工、エラストマーの成形、射出成形、ＬＩＧＡ、ソフトリソグラフィ、シリコン加工、及び関連する薄膜処理技術を含むがこれらに限定されない様々な技術を使用して製造することができる。マイクロ流体デバイスを製造するための適切な材料には、環状オレフィン共重合体（ＣＯＣ）、ポリカーボネート、ポリ（ジメチルシロキサン）（ＰＤＭＳ）、及びポリ（メチルアクリレート）（ＰＭＭＡ）が含まれるが、これらに限定されない。一実施形態では、ＰＤＭＳにおけるソフトリソグラフィを使用して、マイクロ流体デバイスを調製することができる。例えば、基板内のフローチャネル、バルブ、及びフィルターの位置を定義するフォトリソグラフィを使用して型を作成することができる。基板材料を型に流し込み、硬化させてスタンプを作成する。次いで、スタンプは、ガラスなどであるがこれに限定されない固体支持体に密封される。一部のタンパク質を吸収し、特定の生物学的プロセスを阻害する可能性があるＰＤＭＳなどの一部のポリマーの疎水性のため、不動態化剤が必要になる場合がある（Ｓｃｈｏｆｆｎｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９６，２４：３７５－３７９）。適切な不動態化剤は当該技術分野で知られており、シラン、パリレン、ｎ－ドデシル－ｂ－Ｄ－マトシド（ＤＤＭ）、プルロニック、Ｔｗｅｅｎ－２０、他の同様の界面活性剤、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、アルブミン、コラーゲン、ならびに他の類似のタンパク質及びペプチドが含まれるが、これらに限定されない。
本発明の文脈で使用できるマイクロ流体デバイスの例は、参照により本明細書に組み込まれる、Ｋｕｌｅｓａ，ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ，１１５，６６８５－６６９０に記載される。
特定の例示的な実施形態では、デバイスは、マイクロプレートウェルなどの個々のウェルを含み得る。マイクロプレートのウェルのサイズは、標準の６、２４、９６、３８４、１５３６、３４５６、または９６００サイズのウェルのサイズであってよい。特定の実施形態において、マイクロウェルの数は、４０，００００超または１９０，０００超であってよい。特定の例示的な実施形態では、本明細書に記載のシステムの要素は、配布及び使用の前に、凍結乾燥され、ウェルの表面に適用されてもよい。
マイクロウェルチップは、代理人整理番号５２１９９－５０５Ｐ０３ＵＳ、または参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願第１５／５５９，３８１号に開示されているように設計することができる。一実施形態では、マイクロウェルチップは、４９２００個のマイクロウェルを含む約６．２×７．２ｃｍのフォーマット、または９７，１９４個のマイクロウェルを含む７．４×１０ｃｍの大きなフォーマットで設計することができる。マイクロウェルのアレイは、例えば、直径約５０～３００μｍ、特定の実施形態では、１０％の重なりに設定された直径１５０μｍの２つの円として成形することができる。マイクロウェルのアレイは、ウェル間の間隔が５０μｍの六角格子に配置することができる。場合によっては、様々な数の液滴を保持するために、マイクロウェルを他の形状、間隔、及びサイズで配置することができる。マイクロウェルチップは、いくつかの実施形態では、有利にも、顕微鏡などの画像化装置を含む標準的な実験装置で使用できるサイズである。
例示的な方法では、化合物を蛍光色素（例えば、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５５５、５９４、６４７）の一意の比率で混合することができる。標的分子と色素混合物の各混合物は、液滴に乳化することができる。同様に、光学バーコードを備えた各検出ＣＲＩＳＰＲ系は、液滴に乳化できる。いくつかの実施形態では、各液滴は約１ｎＬである。次に、ＣＲＩＳＰＲ検出システムの液滴と標的分子の液滴を組み合わせて、マイクロウェルチップに適用することができる。液滴は、単純な混合または他の組み合わせ方法によって組み合わせることができる。１つの例示的な実施形態において、マイクロウェルチップは、クランプまたは例えばネオジム磁石であり得る他の固定手段によって上下からクランプできる取り外し可能なスペーサーを備えた疎水性スライドガラスなどのプラットフォーム上に吊り下げられる。スペーサーによって作成されたチップとガラスの間のギャップに油をロードし、液滴のプールをチップに注入し、さらに油を注入して余分な液滴を排出することで液滴を流し続けることができる。ロードが完了すると、チップを油で洗浄し、スペーサーを取り外してマイクロウェルをスライドガラスに対して密閉し、クランプを閉じることができる。チップは、例えば落射蛍光顕微鏡で画像化することができ、液滴をマージして、例えばコロナ処理装置によって供給されるＡＣ電場を印加することにより各マイクロウェル内の化合物を混合し、続いて所望のプロトコールに従って処理することができる。一実施形態において、マイクロウェルは、落射蛍光顕微鏡を使用して蛍光を測定しながら、３７℃でインキュベートすることができる。液滴の操作に続いて、さらなる分析、処理、及び／または操作のために、本明細書に記載されるように、液滴をマイクロウェルから溶出することができる。
開示されるデバイスは、入口及び出口ポート、または開口部をさらに含むことができ、これは、バルブ、チューブ、チャネル、チャンバー、ならびにデバイスへの流体の導入及びデバイスからの流体の抽出のためのシリンジ及び／またはポンプに接続され得る。デバイスは、マイクロ流体デバイス内の流体の方向移動を可能にする流体フローアクチュエータに接続されてもよい。アクチュエータの例には、シリンジポンプ、機械的に作動する再循環ポンプ、電気浸透圧ポンプ、バルブ、ベローズ、ダイヤフラム、または流体の移動を強制するためのバブルが含まれるが、これらに限定されない。特定の例示的な実施形態では、デバイスは、デバイスを通して流体を移動させるために協働するプログラム可能なバルブを備えたコントローラに接続されている。特定の例示的な実施形態では、デバイスは、以下でさらに詳細に議論されるコントローラに接続される。デバイスは、デバイスの入口ポートに挿入するための金属ピンで終わるチューブによって、フローアクチュエータ、コントローラ、及びサンプルローディングデバイスに接続することができる。
本発明は、無線ラボオンチップ（ＬＯＣ）診断センサーシステムとともに使用することができる（例えば、米国特許第９，４７０，６９９号「Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ｒａｄｉｏ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｓｅｎｓｏｒｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｔｈｅｒｅｏｆ」を参照されたい）。特定の実施形態では、本発明は、無線デバイス（例えば、携帯電話、携帯情報端末（ＰＤＡ）、タブレット）によって制御されるＬＯＣで実行され、結果は前記デバイスに報告される。
無線自動識別（ＲＦＩＤ）タグシステムには、ＲＦＩＤリーダー（インテロゲータとも呼ばれる）による受信用のデータを送信するＲＦＩＤタグが含まれる。典型的なＲＦＩＤシステムでは、個々のオブジェクト（例えば、店舗の商品）には、トランスポンダーを含む比較的小さなタグが装備されている。トランスポンダーには、一意の電子製品コードが割り当てられたメモリチップがある。ＲＦＩＤリーダーは、通信プロトコールを使用してタグ内のトランスポンダーをアクティブにするシグナルを発信する。したがって、ＲＦＩＤリーダーは、タグに対してデータを読み書きすることができる。さらに、ＲＦＩＤタグリーダーは、ＲＦＩＤタグシステム用途に従ってデータを処理する。現在、パッシブ型とアクティブ型のＲＦＩＤタグが存在する。パッシブタイプのＲＦＩＤタグは、内部電源を含んでいないが、ＲＦＩＤリーダーから受信した無線周波数シグナルによって電力が供給される。代替的に、アクティブ型のＲＦＩＤタグは、アクティブ型のＲＦＩＤタグがより大きな送信範囲とメモリ容量を有することを可能にする内部電源を含む。パッシブ型タグとアクティブ型タグの使用は、特定の用途に依存する。
ラボオンチップ（Ｌａｂ－ｏｎ－ｔｈｅ ｃｈｉｐ）テクノロジーは科学文献によく記載されており、複数のマイクロ流体チャネル、入力または化学ウェルで構成される。ＲＦＩＤ電子チップからの導電性リードを各試験ウェルに直接接続できるため、無線自動識別（ＲＦＩＤ）タグ技術を使用してウェル内の反応を測定できる。アンテナは、電子チップの別の層に印刷またはマウントするか、デバイスの背面に直接取り付けることができる。さらに、リード、アンテナ、及び電子チップをＬＯＣチップに埋め込むことができるため、電極または電子機器の短絡を防ぐことができる。ＬＯＣにより複雑なサンプルの分離と分析が可能になるため、このテクノロジーにより、複雑または高価なリーダーと独立してＬＯＣ試験を行うことができる。むしろ、携帯電話またはＰＤＡなどの単純な無線デバイスを使用できる。一実施形態では、無線デバイスは、より複雑なＬＯＣ分析のためにマイクロ流体チャネルの分離及び制御も制御する。一実施形態では、ＬＥＤ及び他の電子測定または感知装置がＬＯＣ－ＲＦＩＤチップに含まれる。理論に縛られることなく、この技術は使い捨てであり、分離と混合を必要とする複雑な試験を実験室の外で行うことを可能にする。
好ましい実施形態では、ＬＯＣはマイクロ流体デバイスであり得る。ＬＯＣはパッシブ型チップであってもよく、チップは無線デバイスを介して電力供給及び制御される。特定の実施形態では、ＬＯＣは、試薬を保持するためのマイクロ流体チャネル及びサンプルを導入するためのチャネルを含む。特定の実施形態では、無線デバイスからのシグナルがＬＯＣに電力を供給し、サンプルとアッセイ試薬の混合を活性化する。具体的には、本発明の場合、システムは、マスキング剤、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質、及び標的分子に特異的なガイドＲＮＡを含み得る。ＬＯＣが活性化すると、マイクロ流体デバイスはサンプルとアッセイ試薬を混合することができる。混合すると、センサーがシグナルを検出し、結果を無線デバイスに送信する。特定の実施形態において、マスキング解除剤は、導電性ＲＮＡ分子である。導電性ＲＮＡ分子は、導電性材料に付着することができる。導電性分子は、導電性ナノ粒子、導電性タンパク質、タンパク質もしくはラテックスに付着した金属粒子、または導電性の他のビーズであり得る。特定の実施形態において、ＤＮＡまたはＲＮＡが使用される場合、導電性分子は、適合するＤＮＡまたはＲＮＡ鎖に直接付着することができる。導電性分子の放出は、センサー全体で検出することができる。アッセイは一段階プロセスであり得る。
表面積の電気伝導度を正確に測定できるため、使い捨て無線ＲＦＩＤエレクトロアッセイで定量的な結果が可能である。さらに、試験領域を非常に小さくできるため、特定のエリアでより多くの試験を実行できるため、結果としてコストを節約できる。特定の実施形態において、それぞれが異なるＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質に関連する別個のセンサー及びセンサーに固定化されたガイドＲＮＡが、複数の標的分子を検出するために使用される。理論に拘束されることなく、様々なセンサーの活性化は、無線デバイスによって区別される。
本明細書に記載の導電性方法に加えて、使い捨てＲＦＩＤアッセイのための基本的な低コスト通信及び電力プラットフォームとしてＲＦＩＤまたはＢｌｕｅｔｏｏｔｈに依存する他の方法を使用することができる。例えば、光学的手段を使用して、所与の標的分子の存在及びレベルを評価することができる。特定の実施形態において、光学センサーは、蛍光マスキング剤のマスキング解除を検出する。
特定の実施形態では、本発明のデバイスは、アッセイの診断的読み取りのためのハンドヘルドポータブルデバイスを含むことができる（例えば、Ｖａｓｈｉｓｔ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ Ｓｍａｒｔｐｈｏｎｅ－Ｂａｓｅｄ Ｄｅｖｉｃｅｓ ａｎｄ Ｓｍａｒｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ Ｐｅｒｓｏｎａｌｉｚｅｄ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ａｎｄ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ，Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ２０１４，４（３），１０４－１２８；ｍＲｅａｄｅｒ ｆｒｏｍ Ｍｏｂｉｌｅ Ａｓｓａｙ；及びＨｏｌｏｍｉｃ Ｒａｐｉｄ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｔｅｓｔ Ｒｅａｄｅｒを参照されたい）。
本明細書に記載されるように、特定の実施形態は、実施形態がＰＯＣ状況及びまたはシグナルを読み取るためのより複雑な検出機器へのアクセスが制限される可能性のある資源の乏しい環境で利用される場合に、特定の付随する利点を有する比色変化による検出を可能にする。しかしながら、本明細書に開示されるポータブル実施形態は、可視範囲外のシグナルの検出を可能にするハンドヘルド分光光度計と結合することもできる。本発明と組み合わせて使用できるハンドヘルド分光光度計デバイスの例は、Ｄａｓ ｅｔ ａｌ．“Ｕｌｔｒａ－ｐｏｒｔａｂｌｅ，ｗｉｒｅｌｅｓｓ ｓｍａｒｔｐｈｏｎｅ ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ ｆｏｒ ｒａｐｉｄ，ｎｏｎ－ｄｅｓｔｒｕｃｔｉｖｅ ｔｅｓｔｉｎｇ ｏｆ ｆｒｕｉｔ ｒｉｐｅｎｅｓｓ．”Ｎａｔｕｒｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ．２０１６，６：３２５０４，ＤＯＩ：１０．１０３８／ｓｒｅｐ３２５０４に記載される。最後に、量子ドットベースのマスキング構築物を利用する特定の実施形態では、量子ドットによって提供されるほぼ完全な量子収量のために、ハンドヘルドＵＶ光または他の適切なデバイスの使用が首尾よく使用されてシグナルを検出することができる。
個々の個別のボリューム
いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ系は、個々の個別のボリュームに含まれており、各個別のボリュームは、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質、対応する標的分子に結合するように設計された１つ以上のガイドＲＮＡ、及びＲＮＡベースのマスキング構築物を含む。場合によっては、これらの個々の個別のボリュームのそれぞれが液滴である。特に好ましい実施形態では、液滴は第１のセットの液滴として提供され、各液滴はＣＲＩＳＰＲ系を含む。いくつかの実施形態では、標的分子またはサンプルは個々の個別のボリュームに含まれ、各個々の個別のボリュームは標的分子を含む。場合によっては、これらの個々の個別のボリュームのそれぞれが液滴である。特に好ましい実施形態では、液滴は第２のセットの液滴として提供され、各液滴は標的分子を含む。
一態様では、本明細書に開示される実施形態は、ＣＲＩＳＰＲ系、対応する標的分子に結合するように設計された１つ以上のガイドＲＮＡ、マスキング構築物、及びサンプル中の標的核酸分子を増幅するための任意選択の増幅試薬を含む核酸検出システムに向けられた第１のセットの液滴を含むことができる。特定の例示的な実施形態では、システムは、１つ以上の検出アプタマーをさらに含み得る。１つ以上の検出アプタマーは、ＲＮＡポリメラーゼ部位またはプライマー結合部位を含み得る。１つ以上の検出アプタマーは、１つ以上の標的ポリペプチドに特異的に結合し、ＲＮＡポリメラーゼ部位またはプライマー結合部位が標的ペプチドへの検出アプタマーの結合時にのみ露出するように構成される。ＲＮＡポリメラーゼ部位の露出は、テンプレートとしてアプタマー配列を使用してトリガーＲＮＡオリゴヌクレオチドの生成を容易にする。したがって、そのような実施形態では、１つ以上のガイドＲＮＡは、トリガーＲＮＡに結合するように構成される。
「個々の個別のボリューム」は、個別のボリュームまたは個別の空間、例えばコンテナー、容器、または核酸、ＣＲＩＳＰＲ検出システム、及び本明細書に開示される方法を実行するために必要な試薬の移動を防止及び／または阻害する特性によって定義できる、他の定義されたボリュームもしくは空間などであり、例えば、不透過性または半透過性であってよい、壁、例えば、ウェルの壁、チューブの壁、または液滴の表面などの物理的特性によって定義される、または、化学的、制限された拡散率、電磁的、または光照射、またはそれらの任意の組み合わせなどの他の手段によって定義される、ボリュームまたは空間である。特に好ましい実施形態では、個々の個別のボリュームは液滴である。「制限された拡散率」（例えば、拡散によって定義されたボリューム）とは、特定の分子または反応のみがアクセスできる空間を意味する。これは、拡散の制約が、拡散が１つのストリームから他のストリームへの標的分子の移動を制限する２つの平行な層ストリームの場合のように、空間またはボリュームを効果的に定義するためである。「化学的」に定義されたボリュームまたは空間とは、サイズなどの化学的または分子的特性のために特定の標的分子のみが存在できる空間を意味し、例えば、ゲルビーズが、表面電荷、マトリックスサイズ、またはビーズの内部に入る可能性のある種の選択を可能にするビーズの他の物理的特性などによって、特定の種をビーズに侵入させないようにすることができる。「電磁的に」定義されたボリュームまたは空間とは、標的分子またはそれらの支持体の電磁特性、例えば電荷または磁気特性を使用して、磁場内または磁石上で直接磁性粒子を捕捉するなど、空間内の特定の領域を定義できる空間を意味する。「光学的に」定義されたボリュームとは、可視線、紫外線、赤外線、または他の波長の光でそれを照射することによって定義できる空間の任意の領域を意味し、定義された空間またはボリューム内の標的分子のみが標識され得る。壁のない、または半透膜を使用する利点の１つは、緩衝液、化学活性化剤、またはその他の試薬などの一部の試薬が個別のボリュームの中でまたは中を通って通過し、標的分子などの他の材料が個別のボリュームまたは空間に維持され得ることである。本明細書で説明するように、液滴系は、反応の開始が望まれるまで化合物の分離を可能にする。典型的には、個別のボリュームは、標識を可能にする条件下でインデックス可能な核酸識別子で標的分子を標識するのに適した流体媒体（例えば、水溶液、油、緩衝液、及び／または細胞増殖をサポートできる媒体）を含むことになる。開示された方法で有用な例示的な個別のボリュームまたは空間には、とりわけ、液滴（例えば、マイクロ流体液滴及び／またはエマルション液滴）、ヒドロゲルビーズまたは他のポリマー構造（例えば、ポリエチレングリコールジアクリレートビーズまたはアガロースビーズ）、組織スライド（例えば、化学的、光学的、または物理的手段によって特定の領域、ボリューム、または空間が定義された固定ホルマリンパラフィン包埋組織スライド）、秩序だったアレイまたはランダムパターンで試薬を堆積することによって領域が定義された顕微鏡スライド、チューブ（遠心管、マイクロ遠心管、試験管、キュベット、コニカルチューブなど）、ボトル（ガラスボトル、プラスチックボトル、セラミックボトル、三角フラスコ、シンチレーションバイアルなど）、ウェル（プレートのウェルなど）、プレート、ピペット、またはピペットチップが含まれる。特定の例示的な実施形態では、個々の個別のボリュームは液滴である。
液滴
本明細書で提供される液滴は、典型的には、油入力チャネル及び水性入力チャネルで形成される油中水型マイクロエマルションである。液滴は、当該技術分野で知られている様々な分散法によって形成することができる。１つの特定の実施形態において、油相中の多数の均一な液滴は、マイクロエマルションによって作ることができる。例示的な方法には、例えば、水相が油によって剪断され、それによって液滴が生成されるＲ接合形状；水流を２方向から剪断することによって液滴が生成される、流れに集中する形状；または水相が細い毛細管を通して排出され、油がポンプで送られる大きな毛細管の内側に同軸に配置された共流れ形状が含まれる。
単分散の水性液滴の使用は、油中水型エマルションとしてマイクロ流体デバイスによって生成できる。一実施形態では、液滴は流動油相中に運ばれ、界面活性剤によって安定化される。一態様では、単一細胞または単一細胞小器官または単一分子（タンパク質、ＲＮＡ、ＤＮＡ）が、水溶液／分散液から均一な液滴にカプセル化される。関連する態様において、複数の細胞または複数の分子が、単一の細胞または単一の分子の代わりになり得る。
１ｐＬ～１０ｎＬの範囲のボリュームの水性液滴は、個々の反応器として機能する。液滴中の１０４～１０５個の単一細胞は、１回の実行で処理及び分析できる。迅速な大規模化学スクリーニングまたは複雑な生物学的ライブラリーの同定に微小液滴を利用するには、それぞれが特定の化学化合物または生物学的プローブ細胞または目的の分子バーコードを含む異なる種の微小液滴を生成し、好ましい条件、例えば混合比、濃度、配合順序で組み合わせる必要がある。液滴の各種は、個別の入口マイクロ流体チャネルから主要なマイクロ流体チャネルの合流点に導入される。好ましくは、液滴のボリュームは、その各々が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国公開第ＵＳ２００７／０１９５１２７号及び国際公開第ＷＯ２００７／０８９５４１号に開示されるように、ある種が他の種よりも大きく、異なる速度で、通常は他の種よりも遅い速度でキャリア流体内を移動するようにする設計によって選択される。チャネルの幅と長さは、液滴の速い種が最も遅い種に追いつくように選択される。チャネルのサイズの制約により、移動の速い液滴が移動の遅い液滴を通過することが妨げられ、一連の液滴がマージゾーンに入ることになる。多段階の化学反応、生化学反応、またはアッセイ検出化学では、多くの場合、異なるタイプの種を反応に追加する前に、一定の反応時間が必要である。多段階反応は、それぞれが別のマージ点を含む、２回目、３回目、またはそれ以上の合流点でプロセスを複数回繰り返すことによって達成される。入口チャネルからの液滴の頻度が最適化された比率に一致し、種のボリュームが合わされた液滴で最適化された反応条件を提供するように適合する場合、非常に効率的で正確な反応と反応の分析が達成される。流体液滴は、液滴を含む液体の流れを変更することにより、本発明の流体システム内でスクリーニングまたは分類され得る。例えば、一組の実施形態において、流体液滴は、流体液滴を取り囲む液体を第１のチャネル、第２のチャネルなどに向けることによって誘導または分類され得る。別の組の実施形態では、流体システム内、例えば、異なるチャネル内またはチャネルの異なる部分内の圧力を制御して、流体液滴の流れを方向付けることができる。例えば、液滴は、さらなる流れの方向のための複数のオプションを含むチャネル接合部に向けられ得る（例えば、任意選択の下流フローチャネルを定義するチャネル内のブランチまたは分岐に向けられる）。１つ以上の任意選択の下流フローチャネル内の圧力を制御して、液滴をチャネルの１つに選択的に向けることができ、圧力の変化は、連続する液滴が接合部に到達するのに必要な時間のオーダーに影響を与えることができるため、連続する各液滴の下流流路を独立して制御することができる。
１つの構成において、液体リザーバーの膨張及び／または収縮は、例えば、流体液滴を含む液体の方向付けられた動きを引き起こすことによって、流体液滴をチャネルに誘導または分類するために使用され得る。別では、液体リザーバーの膨張及び／または収縮は、例えば本明細書に記載されるような他の流れ制御デバイス及び方法と組み合わせることができる。液体リザーバーの膨張及び／または収縮を引き起こすことができるデバイスの非限定的な例には、ピストンが含まれる。マイクロ流体チャネルを使用して液滴を処理するための重要な要素には次のものが含まれる：（１）正しい容量の液滴を生成し、（２）正しい頻度で液滴を生成し、（３）サンプル液滴の第１のストリームをサンプル液滴の第２のストリームと一緒にして、サンプル液滴の第１のストリームの頻度がサンプル液滴の第２のストリームの頻度と一致するようにする。好ましくは、ライブラリー液滴の頻度がサンプル液滴の頻度と一致するように、サンプル液滴のストリームを予め作製されたライブラリー液滴のストリームと一緒にする。一定の頻度で均一な容量の液滴を生成する方法は、当該技術分野で周知である。１つの方法は、米国公開第ＵＳ２００５／０１７２４７６号及び国際公開第ＷＯ２００４／００２６２７号に開示されているように、分散相流体及び非混和性キャリア流体の流体力学的集束を使用して液滴を生成することである。コンフルエンスに導入された種の１つは、予め作製された液滴のライブラリーであることが望ましく、ライブラリーは複数の反応条件を含む。例えば、ライブラリーは、細胞または酵素への影響をスクリーニングするための別個のライブラリー要素としてカプセル化された、様々な濃度の複数の異なる化合物を含み得る。あるいは、ライブラリーは、遺伝子座のコレクションの標的化増幅のための異なるライブラリー要素としてカプセル化された複数の異なるプライマー対から構成され得る。あるいは、ライブラリーは、複数の結合アッセイを実行するために異なるライブラリー要素としてカプセル化された複数の異なる抗体種を含み得る。反応条件のライブラリーの基板への導入は、ライブラリー液滴の事前に作製されたコレクションを駆動流体でバイアルから押し出すことによって達成される。駆動流体は連続流体である。駆動流体は、キャリア流体と同じ物質（例えば、フルオロカーボン油）を含むことができる。例えば、ライブラリーが、１０ピコリットルの液滴で構成されている場合、１秒あたり１０，０００ピコリットルの速度の駆動流体でマイクロ流体基板上の入口チャネルに駆動され、したがって、液滴が合流点に入ると予想される頻度は名目上、１秒あたり１０００である。ただし、実際には、液滴の間に油が詰まっており、ゆっくりと流れ出す。時間の経過とともに、ライブラリーの液滴からキャリア液が流出し、液滴の数密度（数／ｍＬ）が増加する。したがって、駆動流体の注入の単純な固定速度は、基板内のマイクロ流体チャネルへの液滴の均一な導入速度を提供しない。さらに、平均ライブラリー液滴量のライブラリー間の変動は、合流点での液滴導入の頻度のシフトをもたらす。このように、サンプルの変動と油の排出に起因する液滴の均一性の欠如は、解決すべき別の問題をもたらす。例えば、名目上の液滴量がライブラリー内で１０ピコリットルであると予想されるが、ライブラリー間で９～１１ピコリットルで変動する場合、１０，０００ピコリットル／秒の注入速度は名目上、１秒あたり９００～１,１００液滴の頻度の範囲を生成する。つまり、チップ上で作製された液滴の分散相の組成におけるサンプル間の変動、ライブラリー液滴の数密度が時間の経過とともに増加する傾向、及び平均液滴容量のライブラリー間の変動は、一定の注入速度を使用するだけで、コンフルエンスで液滴の頻度を確実に一致させることができる範囲を厳しく制限する。さらに、これらの制限は、ボリュームを再現可能に組み合わせる範囲にも影響を与える。ポンプ流量精度の一般的な変動及びチャネル寸法の変動と組み合わさると、システムは実行ごとに補正する手段がなければ、大幅に制限される。前述の事実は、解決すべき問題を説明するだけでなく、マイクロ流体チャネル内の微小液滴に対するマイクロ流体制御を瞬時に制御する方法の必要性も示している。
界面活性剤（複数可）と油の組み合わせを開発して、液滴の生成、保管、及び操作を容易にし、多様なライブラリーの各液滴内で独自の化学的／生化学的／生物学的環境を維持する必要がある。したがって、界面活性剤と油の組み合わせは、（１）液滴形成プロセス及びその後の収集及び保管中に制御されない凝集に対して液滴を安定化させ、（２）油相へ及び／または液滴間での任意の液滴内容物の輸送を最小限に抑え、（３）各液滴の内容物で化学的及び生物学的不活性を維持する（例えば、油水界面でのカプセル化内容物の吸着または反応がなく、液滴中の生物学的または化学的成分への悪影響がない）。液滴ライブラリーの機能と安定性に関する要件に加えて、油中界面活性剤溶液は、プラットフォームに関連する流体物理学及び材料と結合する必要がある。具体的には、油溶液は、マイクロ流体チップを構築するために使用される材料を膨潤、溶解、または劣化させてはならず、油の物理的特性（例えば、粘度、沸点など）は、プラットフォームの流れ及び動作条件に適している必要がある。界面活性剤のない油で形成された液滴は、凝集するには安定していないため、エマルションライブラリーの連続相として使用される油に界面活性剤を溶解する必要がある。界面活性剤分子は両親媒性であり、分子の一部は油溶性であり、分子の一部は水溶性である。例えば、本明細書に記載の入口モジュールにおいて、マイクロ流体チップのノズルに水－油界面が形成されると、油相に溶解した界面活性剤分子が界面に吸着する。分子の親水性部分は液滴の内部にあり、分子の親フッ素性（ｆｌｕｏｒｏｐｈｉｌｉｃ）部分は液滴の外部を修飾する。界面に界面活性剤が存在すると、液滴の表面張力が低下するため、エマルションの安定性が向上する。凝集に対して液滴を安定させることに加えて、界面活性剤は各液滴の内容物に対して不活性であるべきであり、界面活性剤はカプセル化された成分の油または他の液滴への輸送を促進してはならない。液滴ライブラリーは、単一のコレクションに一緒にプールされる多数のライブラリー要素で構成されてもよい（例えば、米国特許公開第２０１０００２２４１号を参照されたい）。
ライブラリーは、単一のライブラリー要素から１０１５以上のライブラリー要素まで、複雑さが異なり得る。各ライブラリー要素は、固定濃度の１つ以上の特定のコンポーネントであってもよい。要素は、細胞、オルガネラ、ウイルス、細菌、酵母、ビーズ、アミノ酸、タンパク質、ポリペプチド、核酸、ポリヌクレオチド、または小分子化学化合物であり得るが、これらに限定されない。要素には、標識などの識別子が含まれてもよい。「液滴ライブラリー」または「液滴ライブラリー（複数）」という用語は、本明細書では「エマルションライブラリー」または「エマルションライブラリー（複数）」とも呼ばれる。これらの用語は、本明細書全体で互換的に使用される。細胞ライブラリー要素には、ハイブリドーマ、Ｂ細胞、初代細胞、培養細胞株、がん細胞、幹細胞、組織から得られた細胞、または任意の他の細胞型が含まれるが、これらに限定されない。細胞ライブラリー要素は、個々の液滴に１から数十万までの多数の細胞をカプセル化することによって調製される。カプセル化された細胞の数は、通常、細胞の数密度と液滴の体積からポアソン統計によって与えられる。しかしながら、場合によっては、Ｅｄｄ ｅｔ ａｌ．，“Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ－ｃｅｌｌｓ ｉｎｔｏ ｍｏｎｏｄｉｓｐｅｒｓｅ ｐｉｃｏｌｉｔｒｅ ｄｒｏｐｓ．”Ｌａｂ Ｃｈｉｐ，８（８）：１２６２－１２６４，２００８に記載されるように、数がポアソン統計から逸脱している。細胞の個別の性質により、複数の細胞バリアントがすべて単一の開始培地に存在するライブラリーを大量に調製でき、その培地は最大で１つの細胞を含む個々の液滴カプセルに分割される。これらの個々の液滴カプセルは、次に結合またはプールされて、固有のライブラリー要素で構成されるライブラリーを形成する。カプセル化に続く、またはいくつかの実施形態では、カプセル化後の細胞分裂により、クローンライブラリー要素が生成される。
特定の実施形態では、ビーズベースのライブラリー要素は、所与のタイプの１つ以上のビーズを含むことができ、抗体、酵素、または他のタンパク質などの他の試薬も含むことができる。すべてのライブラリー要素が異なるタイプのビーズを含むが、同じ周囲の媒体を含む場合、ライブラリー要素はすべて、単一の開始流体から調製するか、様々な開始流体を有することができる。ゲノム改変された酵母または細菌細胞などのバリアントのコレクションから大量に調製された細胞ライブラリーの場合、ライブラリー要素は様々な開始流体から調製される。多くの場合、タンパク質のバリアントを生成するように操作された、複数の細胞または酵母または細菌で開始する場合、液滴ごとに正確に１つの細胞を持ち、ほんの少量の液滴にのみ１つを超える細胞を含むことが望ましい場合がある。場合によっては、ポアソン統計からの変動が達成され、液滴のロードが強化され、液滴ごとに正確に１つの細胞を持つ液滴が多くなり、空の液滴または１つを超える細胞を含む液滴の例外がほとんどなくなる。液滴ライブラリーの例は、ビーズ、細胞、小分子、ＤＮＡ、プライマー、抗体など、様々な内容物を持つ液滴のコレクションである。より小さな液滴は、フェムトリットル（ｆＬ）ほどの容量の液滴であり、液滴ディスペンサーで特に考えられる。容量は、約５～約６００ｆＬの範囲であり得る。より大きな液滴のサイズは、直径約０．５ミクロン～５００ミクロンの範囲であり、これは約１ピコリットル～１ナノリットルに相当する。しかしながら、液滴は５ミクロンと小さくても５００ミクロンと大きくてもよい。好ましくは、液滴は１００ミクロン未満であり、直径は約１ミクロン～約１００ミクロンである。最も好ましいサイズは、直径約２０～４０ミクロン（１０～１００ピコリットル）である。液滴ライブラリーの検討された好ましい特性には、浸透圧バランス、均一サイズ、及びサイズ範囲が含まれる。本発明のエマルションライブラリー内の液滴は、少なくとも１つのフルオロ界面活性剤を含み得る非混和性油内に含まれ得る。いくつかの実施形態では、非混和性フルオロカーボン油内のフルオロ界面活性剤は、１つ以上の過フッ素化ポリエーテル（ＰＦＰＥ）ブロックと１つ以上のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ブロックからなるブロック共重合体であり得る。他の実施形態では、フルオロ界面活性剤は、アミド結合基によって２つのＰＦＰＥブロックに共有結合したＰＥＧ中心ブロックからなるトリブロック共重合体である。フルオロ界面活性剤の存在（ライブラリー内の液滴の均一なサイズと同様）は、液滴の安定性と完全性を維持するために重要であり、本明細書に記載の様々な生物学的及び化学的アッセイのライブラリー内の液滴のその後の使用にも不可欠である。本発明の液滴ライブラリーで利用できる流体（例えば、水性流体、非混和性油など）及び他の界面活性剤は、本明細書でより詳細に説明される。
したがって、本発明は、少なくとも１つのフルオロ界面活性剤を含み得る非混和性油（例えば、フルオロカーボン油）内に複数の水性液滴を含み得るエマルションライブラリーを含み得、各液滴はサイズが均一であり、同じ水性流体を含み得、異なるライブラリー要素を含み得る。本発明はまた、異なるライブラリー要素を含み得る単一の水性流体を提供することと、各ライブラリー要素を少なくとも１つのフルオロ界面活性剤を含み得る非混和性フルオロカーボン油内の水性液滴にカプセル化することであって、ここで各液滴はサイズが均一であり、同じ水性流体を含み得、異なるライブラリー要素を含み得る、カプセル化することと、少なくとも１つのフルオロ界面活性剤を含み得る非混和性フルオロカーボン油内に水性液滴をプールし、それによりエマルションライブラリーを形成することと、を含むエマルションライブラリーを形成する方法を提供する。例えば、あるタイプのエマルションライブラリーでは、すべての異なるタイプの要素（例えば、細胞またはビーズ）を同じ媒体に含まれる単一のソースにプールすることができる。最初のプーリングの後、細胞またはビーズは液滴にカプセル化され、液滴のライブラリーが生成され、異なるタイプのビーズまたは細胞を含む各液滴は異なるライブラリー要素である。初期溶液の希釈により、カプセル化プロセスが可能になる。いくつかの実施形態では、形成される液滴は、単一の細胞またはビーズのいずれかを含むか、何も含まない、すなわち空になる。他の実施形態では、形成される液滴は、ライブラリー要素の複数のコピーを含む。カプセル化されている細胞またはビーズは、通常、同じタイプの細胞またはビーズのバリアントである。別の例では、エマルションライブラリーは、非混和性フルオロカーボン油内に複数の水性液滴を含むことができ、単一分子がカプセル化され、生成される２０～６０個の液滴（例えば、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０個の液滴、またはその間の任意の整数）ごとに液滴内に単一分子が含まれるようにすることができる。分子を含む溶液を希釈して、単一分子のカプセル化が可能になるような低濃度にすることにより、単一分子をカプセル化することができる。これらのライブラリーの形成は、限界希釈に依存してもよい。
本発明はまた、少なくとも１つの界面活性剤、一実施形態ではフルオロ界面活性剤を含み得る油、一実施形態ではフルオロカーボン油内に、少なくとも第１の水性液滴及び少なくとも第２の水性液滴を含み得るエマルションライブラリーを提供し、少なくとも第１及び少なくとも第２の液滴はサイズが均一であり、異なる水性流体及び異なるライブラリー要素を含む。本発明はまた、少なくとも第１の要素ライブラリーを含み得る少なくとも第１の水性流体を提供することと、少なくとも第２の要素ライブラリーを含み得る少なくとも第２の水性流体を提供することと、前記少なくとも第１のライブラリーの各要素を、少なくとも１つのフルオロ界面活性剤を含み得る非混和性フルオロカーボン油内の少なくとも第１の水性液滴中にカプセル化することと、前記少なくとも第２のライブラリーの各要素を、少なくとも１つのフルオロ界面活性剤を含み得る非混和性フルオロカーボン油内の少なくとも第２の水性液滴中にカプセル化することであって、少なくとも第１及び少なくとも第２の液滴はサイズが均一であり、異なる水性流体及び異なるライブラリー要素を含み得る、カプセル化することと、少なくとも１つのフルオロ界面活性剤を含み得る非混和性フルオロカーボン油内少なくとも第１の水性液滴及び少なくとも第２の水性液滴をプールし、それによりエマルションライブラリーを形成すること、を含み得るエマルションライブラリーを形成する方法を提供する。
当業者は、本発明の方法及びシステムが任意の特定のタイプのサンプルに限定される必要はなく、本発明の方法及びシステムが任意のタイプの有機、無機、または生体分子とともに使用され得ることを認識するであろう（例えば、米国特許公開第２０１２０１２２７１４号を参照されたい）。
特定の実施形態では、サンプルは核酸標的分子を含み得る。核酸分子は、合成されたものでも、天然に存在する供給源に由来するものでもよい。一実施形態において、核酸分子は、タンパク質、脂質、及び非鋳型核酸などの様々な他の成分を含む生体サンプルから単離され得る。核酸標的分子は、動物、植物、細菌、真菌、または任意の他の細胞生物から得られた、任意の細胞物質から得られ得る。特定の実施形態において、核酸標的分子は、単一細胞から得られてもよい。本発明で使用する生体サンプルには、ウイルス粒子または調製物が含まれ得る。核酸標的分子は、生物から直接、または生物から得られる生体サンプル、例えば、血液、尿、脳脊髄液、精液、唾液、痰、糞、及び組織から得ることができる。いかなる組織または体液標本も、本発明で使用するための核酸の供給源として使用することができる。核酸標的分子は、初代培養細胞または細胞株などの培養細胞から単離することもできる。標的核酸が得られる細胞または組織は、ウイルスまたは他の細胞内病原体に感染していてもよい。サンプルは、生物学的標本、ｃＤＮＡライブラリー、ウイルス、またはゲノムＤＮＡから抽出された全ＲＮＡであってもよい。一般に、核酸は、Ｍａｎｉａｔｉｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，ｐｐ．２８０－２８１（１９８２）に記載されるもののような様々な技術によって生体サンプルから抽出することができる。核酸分子は、一本鎖、二本鎖、または一本鎖領域（例えば、ステム構造及びループ構造）を有する二本鎖であり得る。生物学的サンプルから得られた核酸は、典型的には、分析に適した断片を生成するために断片化され得る。標的核酸は、様々な機械的、化学的及び／または酵素的方法を使用して、所望の長さに断片化または剪断され得る。ＤＮＡは、超音波処理、例えば、Ｃｏｖａｒｉｓ法、ＤＮａｓｅへの短時間の暴露、または１つ以上の制限酵素の混合物もしくはトランスポゼースもしくはニッキング酵素の使用によってランダムに剪断することができる。ＲＮＡは、ＲＮａｓｅ、熱＋マグネシウムへの短時間の暴露、または剪断によって断片化することができる。ＲＮＡはｃＤＮＡに変換してもよい。断片化を使用する場合、ＲＮＡは断片化の前または後にｃＤＮＡに変換してもよい。一実施形態では、生体サンプルからの核酸は、超音波処理によって断片化される。別の実施形態において、核酸は、水力剪断器具によって断片化される。一般に、個々の核酸標的分子は、約４０塩基から約４０ｋｂであり得る。核酸分子は、一本鎖、二本鎖、または一本鎖領域（例えば、ステム構造及びループ構造）を有する二本鎖であり得る。本明細書に記載の生体サンプルは、洗剤または界面活性剤の存在下で均質化または分画することができる。緩衝液中の洗剤の濃度は、約０．０５％～約１０．０％であり得る。洗剤の濃度は、最大で洗剤が溶液に溶けたままである量でよい。一実施形態において、洗剤の濃度は、０．１％～約２％である。洗剤、特に非変性の刺激の少ないものは、サンプルを可溶化するように働き得る。洗剤はイオン性でも非イオン性でもよい。非イオン性洗剤の例には、Ｔｒｉｔｏｎ（商標）Ｘシリーズ（Ｔｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ－１００ ｔ－Ｏｃｔ－Ｃ６Ｈ４－－（ＯＣＨ２－－ＣＨ２）ｘＯＨ、ｘ＝９－１０、Ｔｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ－１００Ｒ、Ｔｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ－１１４ ｘ＝７－８）などのｔｒｉｔｏｎ、オクチルグルコシド、ポリオキシエチレン（９）ドデシルエーテル、ジジトニン、ＩＧＥＰＡＬ（商標）ＣＡ６３０オクチルフェニルポリエチレングリコール、ｎ－オクチル－ベータ－Ｄ－グルコピラノシド（ｂｅｔａＯＧ）、ｎ－ドデシル－ベータ、Ｔｗｅｅｎ（商標）２０ポリエチレングリコールソルビタンモノラウレート、Ｔｗｅｅｎ（商標）８０ポリエチレングリコールソルビタンモノオレエート、ポリドカノール、ｎ－ドデシルベータ－Ｄ－マルトシド（ＤＤＭ）、ＮＰ－４０ノニルフェニルポリエチレングリコール、Ｃ１２Ｅ８（オクタエチレングリコールｎ－ドデシルモノエーテル）、ヘキサエチレングリコールモノ－ｎ－テトラデシルエーテル（Ｃ１４Ｅ０６）、オクチル－ベータ－チオグルコピラノシド（オクチルチオグルコシド、ＯＴＧ）、エマルゲン、及びポリオキシエチレン１０ラウリルエーテル（Ｃ１２Ｅ１０）が含まれる。イオン界面活性剤（アニオン性またはカチオン性）の例には、デオキシコール酸、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、Ｎ－ラウロイルサルコシン、及びセチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）が含まれる。Ｃｈａｐｓ、両性イオン３－１４、及び３－［（３－コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］－１－プロパンスルホン酸などの両性イオン試薬も、本発明の精製スキームで使用することができる。尿素は、別の洗剤または界面活性剤の有無にかかわらず添加できることも考えられる。溶解または均質化溶液は、還元剤などの他の薬剤をさらに含んでいてもよい。そのような還元剤の例には、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、β－メルカプトエタノール、ＤＴＥ、ＧＳＨ、システイン、システアミン、トリカルボキシエチルホスフィン（ＴＣＥＰ）、または亜硫酸の塩が含まれる。非常に短い断片または非常に長い断片を除去するために、核酸のサイズ選択を行うことができる。核酸断片は、当該技術分野で既知の任意の適切な方法を使用して、所望の数の断片を含み得る画分に分割することができる。各断片の断片サイズを制限する適切な方法は、当該技術分野で知られている。本発明の様々な実施形態において、断片のサイズは、約１０～約１００Ｋｂ以上に制限される。本発明における、または本発明に関するサンプルには、個々の標的タンパク質、タンパク質複合体、翻訳修飾を伴うタンパク質、及びタンパク質／核酸複合体が含まれ得る。タンパク質の標的にはペプチドが含まれ、酵素、ホルモン、ウイルスのカプシドタンパク質などの構造成分、及び抗体も含まれる。タンパク質標的は、合成されたものでも、天然に存在する供給源に由来するものでもよい。本発明のタンパク質標的は、脂質、非鋳型核酸、及び核酸を含む様々な他の成分を含む生体サンプルから単離され得る。タンパク質標的は、動物、細菌、真菌、細胞生物、及び単一細胞から得ることができる。タンパク質標的は、生物から直接、または血液、尿、脳脊髄液、精液、唾液、痰、糞、及び組織などの体液を含む、生物から得られる生体サンプルから得ることができる。タンパク質標的は、細胞及び組織の溶解物及び生化学的画分から取得することもできる。個々のタンパク質は、単離されたポリペプチド鎖である。タンパク質複合体には、２つ以上のポリペプチド鎖が含まれる。サンプルには、リン酸化、メチオニン酸化、脱アミド化、グリコシル化、ユビキチン化、カルバミル化、ｓ－カルボキシメチル化、アセチル化、及びメチル化を含むがこれらに限定されない翻訳後修飾を有するタンパク質が含まれ得る。タンパク質／核酸複合体には、架橋または安定なタンパク質－核酸複合体が含まれる。個々のタンパク質、タンパク質複合体、翻訳修飾を有するタンパク質、及びタンパク質／核酸複合体の抽出または単離は、当該技術分野で既知の方法を使用して行われる。
したがって、本発明は、サンプル液滴を形成することを含むことができる。液滴は、非混和性のキャリア流体に囲まれた水性液滴である。そのような液滴を形成する方法は、例えばＬｉｎｋ ｅｔ ａｌ．（米国特許出願第２００８／００１４５８９号、２００８／０００３１４２号、及び２０１０／０１３７１６３号）、Ｓｔｏｎｅ ｅｔ ａｌ．（米国特許第７，７０８，９４９号及び米国特許出願第２０１０／０１７２８０３号）、Ａｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（ＲＥ４１，７８０として再発行された米国特許第７，０４１，４８１号）、及びＲａｉｎｄａｎｃｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．の欧州公開第ＥＰ２０４７９１０号に示される。それぞれの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。本発明は、ハイスループットマイクロ流体システム内で液滴を操作するためのシステム及び方法に関してもよい。マイクロ流体液滴は、分化した細胞をカプセル化することができ、細胞は溶解され、そのｍＲＮＡは、すべて液滴の内側で、表面にバーコード化されたオリゴｄＴプライマーを含む捕捉ビーズ上にハイブリダイズされる。バーコードは、ＰＥＧなどの柔軟な多原子リンカーを介して捕捉ビーズに共有結合される。好ましい実施形態において、液滴は、フルオロ界面活性剤（パーフルオロオクタノールなど）の添加によって破壊され、洗浄され、収集される。次いで、逆転写（ＲＴ）反応が行われ、各細胞のｍＲＮＡが、一意のバーコードが付けられ、ｍＲＮＡ捕捉ビーズに共有結合された第１の鎖のｃＤＮＡに変換される。その後、テンプレートスイッチング反応を介したユニバーサルプライマーは、ＲＮＡ－Ｓｅｑライブラリーを調製する従来のライブラリー調製プロトコールを使用して修正される。任意の特定の細胞からのすべてのｍＲＮＡには一意のバーコードが付けられているため、単一のライブラリーの配列が決定され、コンピューターによって解決され、どのｍＲＮＡがどの細胞に由来するかを決定する。このようにして、１回の配列決定実行で、数万（またはそれ以上）の識別可能なトランスクリプトームを同時に取得できる。オリゴヌクレオチド配列は、ビーズ表面上に生成され得る。これらのサイクル中に、ビーズを合成カラムから取り出し、プールし、質量によって４つの等しい部分に等分した。次いで、これらのビーズのアリコートを別の合成カラムに入れ、ｄＧ、ｄＣ、ｄＴ、またはｄＡホスホラミダイトのいずれかと反応させた。他の例では、より長いジヌクレオチド、トリヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチドが使用され、他の例では、オリゴｄＴテールは、特定の標的（単数または複数）、すべてまたは特定のＲＮＡ捕捉のための任意の長さのランダム配列をプライムするために遺伝子特異的オリゴヌクレオチドに置き換えられる。このプロセスを１２回繰り返し、合計４１２＝１６，７７７，２１６の一意のバーコード配列を作成した。これらのサイクルの完了時に、８サイクルの縮重オリゴヌクレオチド合成をすべてのビーズで行い、続いて３０サイクルのｄＴ添加を行った。他の実施形態では、縮重合成は省略、短縮（８サイクル未満）、または延長（８サイクル超）され、他では、ｄＴ付加の３０サイクルが遺伝子特異的プライマー（単一の標的もしくは多数の標的）または縮重配列に置き換えられる。上述のマイクロ流体システムは、本発明の試薬送達システムマイクロ流体ライブラリープリンターまたは液滴ライブラリー印刷システムとみなされる。サンプル流体が、溶解試薬とバーコードを含む液滴発生器から、油を含むマイクロ流体出口チャネルを通って接合部に向かって流れるときに、液滴が形成される。定義された数の液滴に対応する、ロードされた試薬エマルションの定義された体積が、キャリア流体のフローストリームにオンデマンドで分配される。サンプル流体は、典型的には、超純水（例えば、カラムクロマトグラフィーにより得られた１８メガオームの抵抗）、１０ｍＭのトリスＨＣｌ及び１ｍＭのＥＤＴＡ（ＴＥ）緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、または酢酸緩衝液などの水生緩衝溶液を含んでもよい。核酸分子と生理学的に適合する任意の液体または緩衝液を使用することができる。キャリア流体は、サンプル流体と混和しないものを含んでもよい。キャリア流体は、非極性溶媒、デカン（例えば、テトラデカンまたはヘキサデカン）、フルオロカーボン油、シリコーン油、炭化水素などの不活性油、または別の油（例えば、鉱油）であり得る。キャリア流体は、表面張力を低下させる薬剤（界面活性剤）などの１つ以上の添加剤を含んでもよい。界面活性剤には、Ｔｗｅｅｎ、Ｓｐａｎ、フルオロ界面活性剤、及び水と比べて油に可溶性である他の薬剤が含まれる。一部の用途では、サンプル流体に第２の界面活性剤を追加することで性能が向上する。界面活性剤は、例えば、交差するチャネルに液滴を押し出したり注入したりするのに必要な剪断力を減らすことにより、液滴のサイズ、流れ、均一性の制御または最適化に役立つ。これは、液滴の量と周期性、または液滴が交差するチャネルに分かれる速度または頻度に影響を与え得る。さらに、界面活性剤は、フッ素化油中の水性エマルションを合体から安定化させる働きをすることができる。液滴は、水性油界面での表面張力を低下させることによって液滴を安定化させる界面活性剤に囲まれていてもよい。担体流体に添加することができる好ましい界面活性剤には、ソルビタンモノラウレート（Ｓｐａｎ２０）、ソルビタンモノパルミテート（スパン４０）、ソルビタンモノステアレート（スパン６０）及びソルビタンモノオレエート（スパン８０）を含むソルビタンベースのカルボン酸エステル（例えば、「Ｓｐａｎ」界面活性剤、ＦｌｕｋａＣｈｅｍｉｋａ）、過フッ素化ポリエーテル（例えば、ＤｕＰｏｎｔ Ｋｒｙｔｏｘ １５７ ＦＳＬ、ＦＳＭ、及び／またはＦＳＨ）などの界面活性剤が含まれるが、これらに限定されない。使用できる非イオン性界面活性剤の他の非限定的な例には、ポリオキシエチレン化アルキルフェノール（例えば、ノニル－、ｐ－ドデシル－、及びジノニルフェノール）、ポリオキシエチレン化直鎖アルコール、ポリオキシエチレン化ポリオキシプロピレングリコール、ポリオキシエチレン化メルカプタン、長鎖カルボン酸エステル（例えば、天然脂肪酸のグリセリル及びポリグリセリルエステル、プロピレングリコール、ソルビトール、ポリオキシエチレン化ソルビトールエステル、ポリオキシエチレングリコールエステルなど）及びアルカノールアミン（例えば、ジエタノールアミン－脂肪酸縮合物及びイソプロパノールアミン－脂肪酸縮合物）が含まれる。場合によっては、マイクロ流体システムを介して単一細胞配列決定ライブラリーを作成するための装置は、一定量が経時的に注入される容量駆動型の流れを提供する。流体チャネルの圧力は、注入率とチャネルの寸法の関数である。一実施形態では、デバイスは油／界面活性剤入口；分析物の入口；フィルター、ｍＲＮＡ捕捉マイクロビーズ及び溶解試薬の注入口；入口を接続するキャリア流体チャネル；抵抗器；液滴のピンチオフのための狭窄；ミキサー；及び液滴用の出口を提供する。一実施形態において、本発明は、マイクロ流体システムを介して単一細胞配列決定ライブラリーを作成するための装置であって、フィルター及びキャリア流体チャネルを含むことができ、前記キャリア流体チャネルがさらに抵抗器を含むことができる、油－界面活性剤入口；フィルター及びキャリア流体チャネルを含むことができ、前記キャリア流体チャネルが抵抗器をさらに含むことができる、分析物のための入口；フィルター及びキャリア流体チャネルを含むことができ、前記キャリア流体チャネルが抵抗器をさらに含むことができる、ｍＲＮＡ捕捉マイクロビーズ及び溶解試薬のための入口を含むことができ、前記キャリア流体チャネルは、調整可能または所定の流量で流れるキャリア流体を有し、各前記キャリア流体チャネルは、接合部でマージし、前記接合部は、液滴用の出口を含むミキサーに接続されている、装置を提供する。したがって、単一細胞ＲＮＡ－ｓｅｑのためのマイクロ流体システムのマイクロ流体フロースキームを介して単一細胞配列決定ライブラリーを作成するための装置が想定されている。１つは細胞懸濁液を保有し、もう１つは一意にバーコード化されたｍＲＮＡ捕捉ビーズ、溶解緩衝液、ライブラリー調製試薬を保有する２つのチャネルが接合部で出会い、液滴あたり１つの細胞及び１つのビーズの率で不活性なキャリア油にすぐに共カプセル化される。各液滴では、ビーズのバーコードタグ付きオリゴヌクレオチドをｃＤＮＡテンプレートとして使用し、各ｍＲＮＡに一意の細胞固有識別子がタグ付けされる。本発明はまた、マウス及びヒト細胞の混合物のＤｒｏｐ－Ｓｅｑライブラリーの使用を包含する。キャリア流体は、キャリア流体中の界面活性剤がチャネル壁をコーティングするように、出口チャネルを通して流されてもよい。フルオロ界面活性剤は、揮発性フッ素化溶媒中で過フッ素化ポリエーテルＤｕＰｏｎｔ Ｋｒｙｔｏｘ １５７ ＦＳＬ、ＦＳＭ、またはＦＳＨを水酸化アンモニウム水溶液と反応させることによって調製できる。ロータリーエバポレーターで溶媒と残留水とアンモニアを除去できる。次に、界面活性剤をフッ素化油（例えば、フロリナート（３Ｍ））に溶解し（例えば、２．５重量％）、これをキャリア流体として機能させる。試薬液滴を生成するためのサンプル流体リザーバーの活性化は、オンデマンド機能を介した動的試薬送達（例えば、コンビナトリアルバーコード化）の概念に基づく。オンデマンド機能は、本明細書に記載されるように、送達液滴を一次液滴に放出するための様々な技術的能力の１つによって提供され得る。
本開示及び本明細書に引用する文書及び当該技術分野の知識から、流量、チャネル長、及びチャネル形状を開発することは当業者の範囲内である。ランダムまたは指定された試薬の組み合わせを含む液滴を確立し、オンデマンドで生成し、目的のサンプル／細胞／基板を含む「反応チャンバー」液滴とマージできる。複数の一意のタグを追加の液滴に組み込み、タグを一次液滴に固有になるように設計された固体支持体に結合することにより、一次液滴がさらされる条件をコード化し、記録することができる。例えば、核酸タグを連続してライゲーションして、条件及び同じ順序を反映する配列を作成することができる。または、タグを個別に追加して、固体支持体に追加することもできる。生物情報学的に情報を記録するために使用できる動的標識システムの非限定的な例は、２０１２年９月２１日及び２０１２年１１月２９日に出願された「Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｕｎｉｑｕｅ Ｌａｂｅｌｉｎｇ ｏｆ Ａｇｅｎｔｓ」と題する米国仮特許出願に見出すことができる。このようにして、２つ以上の液滴を様々な異なる条件にさらすことができ、液滴が条件にさらされるたびに、条件をコードする核酸が、それぞれが一緒にライゲーションされた液滴に、または液滴と結合した一意の個体支持体に追加され、異なる履歴を持つ液滴が後で組み合わされても、異なる核酸を介してそれぞれの液滴の条件が利用可能なままであるようにされる。複数の条件への暴露に対する応答を評価する方法の非限定的な例は、２０１２年９月２１日出願の米国仮特許出願、及び２０１５年４月１７日出願の「Ｓｙｓｔｅｍｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｄｒｏｐｌｅｔ Ｔａｇｇｉｎｇ」と題する米国特許出願第１５／３０３８７４号に見出すことができる。したがって、本発明において、または本発明に関して、分子バーコード（例えば、ＤＮＡオリゴヌクレオチド、フルオロフォアなど）の動的生成が、目的の様々な化合物（ｓｉＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡ、試薬など）の制御可能な送達と独立してまたはそれと協調して存在し得ることが想定されている。例えば、一意の分子バーコードを１つのノズルアレイで作成し、個々の化合物または化合物の組み合わせを別のノズルアレイで作成できる。目的のバーコード／化合物は、次いで、ＣＲＩＳＰＲ検出システムを含む液滴とマージできる。送達されたバーコードと送達された下流試薬（複数可）を関連付けるために、コンピューターログファイルの形式で電子記録を保持できる。この方法論は、本明細書に開示された方法に従って、サンプルの大きな集団を効率的にスクリーニングすることを可能にする。開示された発明のデバイス及び技術は、単一細胞（または単一分子）レベルでのデータ分解を必要とする研究を費用効果の高い方法で実施する努力を容易にする。油中水型エマルションとしてマイクロ流体チップで１つずつ生成される単分散水性液滴を使用して、さらに評価するための標的分子のサンプルを含む可能性のある個々のエマルション液滴への試薬のハイスループットかつ高解像度の送達となる。
タンパク質の検出
本明細書に開示されるシステム、デバイス、及び方法は、特異的に構成されたポリペプチド検出アプタマーの組み込みを介して、核酸の検出に加えて、ポリペプチド（または他の分子）の検出にも適合され得る。ポリペプチド検出アプタマーは、上述のマスキング構築アプタマーとは異なる。まず、アプタマーは、１つ以上の標的分子に特異的に結合するように設計されている。一実施形態では、標的分子は標的ポリペプチドである。別の例示的な実施形態では、標的分子は、標的治療分子などの標的化学化合物である。ＳＥＬＥＸなどの所与の標的に対して特異性を有するアプタマーを設計及び選択する方法は、当該技術分野で知られている。与えられた標的に対する特異性に加えて、アプタマーはさらにＲＮＡポリメラーゼプロモーター結合部位を組み込むように設計されている。特定の例示的な実施形態において、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターはＴ７プロモーターである。アプタマー結合が標的に結合する前に、ＲＮＡポリメラーゼ部位は、ＲＮＡポリメラーゼにアクセスできないか、さもなければ認識できない。しかしながら、アプタマーは、標的の結合時にアプタマーの構造がコンフォメーション変化を受け、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターが露出するように構成される。ＲＮＡポリメラーゼプロモーターの下流のアプタマー配列は、ＲＮＡポリメラーゼによるトリガーＲＮＡオリゴヌクレオチドの生成のためのテンプレートとして機能する。したがって、アプタマーのテンプレート部分は、所定のアプタマー及びその標的を識別するバーコードまたは他の識別配列をさらに組み込んでもよい。次いで、上述のガイドＲＮＡを設計して、これらの特異的なトリガーオリゴヌクレオチド配列を認識することができる。ガイドＲＮＡのトリガーオリゴヌクレオチドへの結合は、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質を活性化し、続けてマスキング構築物を不活性化し、本明細書に記載されるように陽性の検出可能なシグナルを生成する。
したがって、特定の例示的な実施形態では、本明細書に開示される方法は、サンプルまたはサンプルのセットを個々の個別のボリュームのセットに分配する追加のステップであって、各個々の個別のボリュームは、ペプチド検出アプタマー、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質、１つ以上のガイドＲＮＡ、マスキング構築物を含む、追加のステップと、検出アプタマーの１つ以上の標的分子への結合を可能にするのに十分な条件下でサンプルまたはサンプルのセットをインキュベートする追加のステップと、を含み、対応する標的へのアプタマーの結合は、ＲＮＡポリメラーゼプロモーター結合部位の露出をもたらし、トリガーＲＮＡの合成は、ＲＮＡポリメラーゼがＲＮＡポリメラーゼプロモーター結合部位に結合することによって開始されるようにされる。
別の例示的な実施形態では、アプタマーの結合により、アプタマーが標的ポリペプチドに結合すると、プライマー結合部位が露出し得る。例えば、アプタマーは、ＲＰＡプライマー結合部位を露出させてもよい。したがって、プライマーの追加または包含は、上で概説したＲＰＡ反応などの増幅反応に供給される。
特定の例示的な実施形態において、アプタマーは、目的の標的に結合すると、二次構造を変化させ、一本鎖ＤＮＡの新しい領域を露出させ得るコンフォメーションスイッチングアプタマーであってよい。特定の例示的な実施形態において、一本鎖ＤＮＡのこれらの新しい領域は、ライゲーション、アプタマーを伸長させ、本明細書に開示される実施形態を用いて特異的に検出され得るより長いｓｓＤＮＡ分子を生成するための基質として使用され得る。アプタマーの設計は、グルコースなどの低エピトープ標的の検出のための三元複合体とさらに組み合わせることができる（Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．２０１５：ｈｔｔｐ：／／ｐｕｂｓ．ａｃｓ．ｏｒｇ／ｄｏｉ／ａｂｓ／１０．１０２１／ａｃｓ．ａｎａｌｃｈｅｍ．５ｂ０１６３４）。コンフォメーションシフトアプタマーと対応するガイドＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）の例を以下に示す。
Figure 2022507573000003
増幅
特定の例示的な実施形態において、標的ＲＮＡ及び／またはＤＮＡは、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質を活性化する前に増幅され得る。場合によっては、標的分子を含む液滴セットの形成に先立って増幅が行われる。他の実施形態は、標的分子を含む液滴セットの形成に引き続いて増幅を実行することを可能にし、したがって、標的分子を含む液滴中に核酸増幅試薬を含み得る。任意の適切なＲＮＡまたはＤＮＡ増幅技術を使用することができる。特定の例示的な実施形態において、ＲＮＡまたはＤＮＡ増幅は等温増幅である。特定の例示的な実施形態では、等温増幅は、核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）、ループ媒介等温増幅（ＬＡＭＰ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、ヘリカーゼ依存性増幅（ＨＤＡ）、またはニッキング酵素増幅反応（ＮＥＡＲ）であってよい。特定の例示的な実施形態では、非等温増幅方法を使用することができ、これには、限定はされないが、ＰＣＲ、多重置換増幅（ＭＤＡ）、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、または分岐増幅法（ＲＡＭ）が含まれ得る。いくつかの好ましい実施形態において、ＲＮＡまたはＤＮＡ増幅はＲＰＡまたはＰＣＲである。
特定の例示的な実施形態では、ＲＮＡまたはＤＮＡ増幅はＮＡＳＢＡであり、ＲＮＡ／ＤＮＡ二本鎖を生成するための配列特異的リバースプライマーによる標的ＲＮＡの逆転写で開始される。次いで、ＲＮａｓｅ Ｈを使用してＲＮＡテンプレートを分解し、Ｔ７プロモーターなどのプロモーターを含むフォワードプライマーが結合して相補鎖の伸長を開始し、二本鎖ＤＮＡ産物を生成する。次いで、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを介したＤＮＡテンプレートの転写により、標的ＲＮＡ配列のコピーが作成される。重要なことは、新しい標的ＲＮＡのそれぞれがガイドＲＮＡによって検出できるため、アッセイの感度がさらに向上するである。ガイドＲＮＡによる標的ＲＮＡの結合は、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質の活性化をもたらし、方法は上に概説したように進む。ＮＡＳＢＡ反応には、約４１℃などの適度な等温条件下で進行できるという追加の利点があり、臨床検査室から遠く離れた現場での早期の直接検出のために配備されたシステムやデバイスに適している。
特定の他の例示的な実施形態では、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）反応を使用して標的核酸を増幅することができる。ＲＰＡ反応は、配列特異的プライマーを二本鎖ＤＮＡの相同配列とペアリングできるリコンビナーゼを使用する。標的ＤＮＡが存在する場合、ＤＮＡ増幅が開始され、熱サイクルや化学的融解などの他のサンプル操作は必要ない。ＲＰＡ増幅システム全体は、乾燥した製剤として安定しており、冷蔵せずに安全に輸送できる。ＲＰＡ反応は、３７～４２℃の最適反応温度の等温温度で実施することもできる。配列特異的プライマーは、検出される標的核酸配列を含む配列を増幅するように設計される。特定の例示的な実施形態では、Ｔ７プロモーターなどのＲＮＡポリメラーゼプロモーターがプライマーの１つに加えられる。これにより、標的配列及びＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含む増幅された二本鎖ＤＮＡ産物が得られる。ＲＰＡ反応後または反応中に、二本鎖ＤＮＡテンプレートからＲＮＡを生成するＲＮＡポリメラーゼが追加される。増幅された標的ＲＮＡは、転じて、ＣＲＩＳＰＲエフェクターシステムによって検出できる。このようにして、本明細書に開示される実施形態を使用して標的ＤＮＡを検出することができる。ＲＰＡ反応は、標的ＲＮＡの増幅にも使用できる。標的ＲＮＡは、最初に逆転写酵素を使用してｃＤＮＡに変換され、続いて第２鎖ＤＮＡ合成が行われ、この時点で、上で概説されたようにＲＰＡ反応が進行する。
したがって、特定の例示的な実施形態では、本明細書に開示されるシステムは増幅試薬を含むことができる。核酸の増幅に有用な異なる成分または試薬が本明細書に記載されている。例えば、本明細書に記載の増幅試薬は、Ｔｒｉｓ緩衝液などの緩衝液を含むことができる。Ｔｒｉｓ緩衝液は、例えば、１ｍＭ、２ｍＭ、３ｍＭ、４ｍＭ、５ｍＭ、６ｍＭ、７ｍＭ、８ｍＭ、９ｍＭ、１０ｍＭ、１１ｍＭ、１２ｍＭ、１３ｍＭ、１４ｍＭ、１５ｍＭ、２５ｍＭ、５０ｍＭ、７５ｍＭ、１Ｍなどの濃度を含むが、これらに限定されない任意の濃度で、所望の用途または使用において使用され得る。当業者は、本発明で使用するためのＴｒｉｓなどの緩衝液の適切な濃度を決定することができるであろう。
塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）、塩化カリウム（ＫＣｌ）、または塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）などの塩は、核酸断片の増幅の改善のために、ＰＣＲなどの増幅反応に含めることができる。塩濃度は特定の反応と用途に依存するが、いくつかの実施形態では、特定のサイズの核酸断片が特定の塩濃度で最適な結果をもたらし得る。より大きな産物は、望ましい結果を得るために変更された塩濃度、通常はより低い塩を必要とし得るが、より小さな産物の増幅はより高い塩濃度でより良い結果を生み出し得る。当業者は、塩の存在及び／または濃度は、塩濃度の変化とともに、生物学的または化学的反応のストリンジェンシーを変化させ得ることを理解するであろう。したがって、本明細書に記載の本発明の反応に対する適切な条件を提供する任意の塩を使用できる。
生物学的または化学的反応の他の構成要素は、細胞内の物質の分析のために細胞を破壊または溶解するための細胞溶解成分を含み得る。細胞溶解成分としては、界面活性剤、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、硫酸アンモニウム［（ＮＨ４）２ＳＯ４］などの上記の塩が挙げられ得るが、これらに限定されない。本発明に適切な界面活性剤には、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ＣＨＡＰＳ（３－［（３－コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］－１－プロパンスルホネート）、エチルトリメチルアンモニウムブロミド、ノニルフェノキシポリエトキシルエタノール（ＮＰ－４０）が含まれ得る。界面活性剤の濃度は、特定の用途に依存してもよく、場合によっては反応に固有であってもよい。増幅反応には、１００ｎＭ、１５０ｎＭ、２００ｎＭ、２５０ｎＭ、３００ｎＭ、３５０ｎＭ、４００ｎＭ、４５０ｎＭ、５００ｎＭ、５５０ｎＭ、６００ｎＭ、６５０ｎＭ、７００ｎＭ、７５０ｎＭ、８００ｎＭ、８５０ｎＭ、９００ｎＭ、９５０ｎＭ、１ｍＭ、２ｍＭ、３ｍＭ、４ｍＭ、５ｍＭ、６ｍＭ、７ｍＭ、８ｍＭ、９ｍＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭ、３０ｍＭ、４０ｍＭ、５０ｍＭ、６０ｍＭ、７０ｍＭ、８０ｍＭ、９０ｍＭ、１００ｍＭ、１５０ｍＭ、２００ｍＭ、２５０ｍＭ、３００ｍＭ、３５０ｍＭ、４００ｍＭ、４５０ｍＭ、５００ｍＭなどの濃度を含むが、これらに限定されない本発明に適切な任意の濃度で使用されるｄＮＴＰ及び核酸プライマーが含まれ得る。同様に、本発明に従って有用なポリメラーゼは、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｑ５ポリメラーゼなどを含む、当該技術分野で知られており、有用な、または本発明の任意の特定のまたは一般的なポリメラーゼであり得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている増幅試薬は、ホットスタート増幅での使用に適していてもよい。いくつかの実施形態では、アダプター分子またはオリゴの二量体化を低減または排除するため、またはさもなければ不要な増幅産物またはアーティファクトを防止して、最適な所望の産物の増幅を得るために、ホットスタート増幅が有益であり得る。増幅に使用するための本明細書に記載の多くのコンポーネントは、ホットスタート増幅でも使用できる。いくつかの実施形態では、ホットスタート増幅での使用に適した試薬またはコンポーネントを、必要に応じて、１つ以上の構成コンポーネントの代わりに使用することができる。例えば、特定の温度または他の反応条件で所望の活性を示すポリメラーゼまたは他の試薬を使用することができる。いくつかの実施形態では、ホットスタート増幅での使用のために設計または最適化された試薬が使用されてもよく、例えば、ポリメラーゼは転位後または特定の温度に達した後に活性化され得る。そのようなポリメラーゼは、抗体ベースまたはアプタマーベースであり得る。本明細書に記載のポリメラーゼは当該技術分野において公知である。そのような試薬の例には、ホットスタートポリメラーゼ、ホットスタートｄＮＴＰ、及び光ケージｄＮＴＰが含まれ得るが、これらに限定されない。そのような試薬は当該技術分野で知られており、入手可能である。当業者は、個々の試薬に適した最適温度を決定することができるであろう。
核酸の増幅は、特定の熱サイクル機構または装置を使用して行うことができ、単一の反応または大量に行うことができるため、任意の所望の数の反応を同時に行うことができる。場合によっては、液滴内で、または液滴形成の前に、増幅を実行することができる。いくつかの実施形態では、増幅はマイクロ流体デバイスまたはロボットデバイスを使用して実行するか、手動で温度を変更して目的の増幅を達成することで実行できる。いくつかの実施形態では、特定の用途や材料に最適な反応条件を得るために、最適化が行われてもよい。当業者は、十分な増幅を得る反応条件を理解し、最適化することができるであろう。
場合によっては、核酸増幅試薬には、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）試薬、核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）試薬、ループ媒介等温増幅（ＬＡＭＰ）試薬、鎖置換増幅（ＳＤＡ）試薬、ヘリカーゼ依存性増幅（ＨＤＡ）試薬、ニッキング酵素増幅反応（ＮＥＡＲ）試薬、ＲＴ－ＰＣＲ試薬、多重置換増幅（ＭＤＡ）試薬、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）試薬、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）試薬、分岐増幅法（ＲＡＭ）試薬、トランスポゼースベースの増幅試薬、またはプログラム可能なＣＲＩＳＰＲニッキング増幅（ＰＣＮＡ）試薬が含まれる。
特定の実施形態において、本発明の方法またはシステムによるＤＮＡの検出は、検出の前に（増幅された）ＤＮＡのＲＮＡへの転写を必要とする。
本発明の検出方法が、核酸増幅及び検出手順を様々な組み合わせで含み得ることは明らかであろう。検出される核酸は、ＤＮＡ及びＲＮＡを含むがこれらに限定されない任意の天然に存在する核酸または合成核酸であり得、検出可能な中間産物を提供するために任意の適切な方法によって増幅され得る。中間産物の検出は、直接的または付随的活性により検出可能なシグナル部分を生成するＣＲＩＳＰＲタンパク質の結合及び活性化を含むがこれらに限定されない任意の適切な方法によって行うことができる。
検出可能な陽性シグナルの増幅及び／または増強
特定の例示的な実施形態では、検出可能な陽性シグナルをさらに増幅するさらなる改変が導入され得る。例えば、活性化ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質の付随的活性化は、二次標的または追加のガイド配列、またはその両方を生成するために使用され得る。一実施形態では、反応溶液は、高濃度でスパイクされた二次標的を含む。二次標的は、一次標的（すなわち、アッセイが検出するように設計されている標的）とは異なる場合があり、場合によっては、すべての反応ボリュームにわたって共通であり得る。二次標的のための二次ガイド配列は、例えば、ＲＮＡループを持つヘアピンなどの二次構造的特徴によって保護され、第２の標的またはＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質に結合できなくされていてもよい。活性化されたＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質による保護基の切断（すなわち、溶液中の一次標的（複数可）との複合体の形成による活性化後）及び溶液中の遊離ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質との複合体の形成及びスパイクされた二次標的からの活性化。特定の他の例示的な実施形態では、同様の概念が、二次標的配列に対する第２のガイド配列とともに使用される。二次標的配列は、二次標的上の構造的特徴または保護基により保護され得る。二次標的からの保護基の切断により、追加のＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質／第２のガイド配列／二次標的複合体が形成される。さらに別の例示的な実施形態では、一次標的（複数可）によるＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質の活性化を使用して、保護されたまたは環状化されたプライマーを切断することができ、次いで、これを放出して、本明細書に開示されるような等温増幅反応を、二次ガイド配列、二次標的配列、またはその両方をコードするテンプレート上で実行する。この増幅されたテンプレートのその後の転写により、より多くの二次ガイド配列及び／または二次標的配列が生成され、その後、追加のＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質の付随的活性化が続く。
方法
一態様では、本明細書に開示される実施形態は、本明細書に記載のシステムを使用して、サンプル中の標的核酸を検出する方法を対象とする。本明細書に開示される方法は、いくつかの実施形態において、第１のセットの液滴を生成するステップであって、第１のセットの液滴における各液滴は、少なくとも１つの標的分子及び光学バーコードを含む、ステップと、第２のセットの液滴を生成ステップであって、第２のセットの液滴の各液滴は、ＲＮＡ標的エフェクタータンパク質及び対応する標的分子に結合するように設計された１つ以上のガイドＲＮＡ、マスキング構築物、及び光学バーコードを含む検出ＣＲＩＳＰＲ系を含む、ステップを含むことができる。第１及び第２のセットの液滴は、典型的には、第１及び第２のセットの液滴を混合または攪拌することにより、液滴のプールに組み合わされる。次いで、液滴のプールは、マイクロウェルのアレイと、マイクロウェルの下の少なくとも１つのフローチャネルとを含むマイクロ流体デバイス上に流されることができ、マイクロウェルは、少なくとも２つの液滴を捕捉するサイズに設定され、各マイクロウェルで捕捉された液滴の光学バーコードを検出し、各マイクロウェルで捕捉された液滴をマージして、各マイクロウェルで形成されたマージ液滴にし、マージ液滴の少なくともサブセットは、検出ＣＲＩＳＰＲ系及び標的配列を含み、検出反応を開始して、１つ以上の時間間隔で各マージ液滴の検出可能なシグナルを測定する。
液滴の生成
第１のセットの液滴の生成に関して、第１のセットの液滴を生成する一態様において、各第１の液滴は検出ＣＲＩＳＰＲ系を含み、検出ＣＲＩＳＰＲ系は、ＲＮＡ標的エフェクタータンパク質と、対応する標的分子に結合するように設計された１つ以上のガイドＲＮＡと、ＲＮＡベースのマスキング構築物と、任意選択の本明細書に記載の光学バーコードとを含む。特定の実施形態では、第２のセットの液滴を生成するステップにおいて、第２のセットの各液滴が、少なくとも１つの標的分子と、本明細書で提供される光学バーコードを含む。
第１のセットの液滴及び第２のセットの液滴の生成に続いて、第１のセットの液滴及び第２のセットの液滴は、液滴のプールに組み合わされる。組み合わせることは、第１及び第２のセットを組み合わせる任意の手段によって行うことができる。１つの例示的な実施形態において、液滴のセットは混合されて液滴のプールに組み合わされる。
液滴のプールが生成されると、液滴のプールを流すステップが実施される。液滴のプールの流れは、複数のマイクロウェルを含むマイクロ流体デバイスに液滴をロードすることによって実施される。マイクロウェルは少なくとも２つの液滴を捕捉するサイズである。任意選択で、ローディングに続いて、界面活性剤が洗い流される。
液滴がマイクロウェルアレイにロードされると、各マイクロウェルで捕捉された液滴の光学バーコードを検出するステップが実施される。場合によっては、光学バーコードが蛍光バーコードである場合、光学バーコードの検出は、低倍率蛍光スキャンによって実施される。光学バーコードの種類に関係なく、各液滴のバーコードは一意であるため、各液滴の内容物を識別できる。検出方法は、使用する光学バーコードのタイプに応じて選択される。次いで、各マイクロウェルに含まれる液滴がマージされる。電界を印加することにより、マージを実施することができる。マージ液滴の少なくともサブセットは、検出ＣＲＩＳＰＲ系及び標的配列を含む。
液滴のマージ後、検出反応が開始される。いくつかの実施形態では、検出反応を開始することは、マージ液滴をインキュベートすることを含む。検出反応に続いて、マージ液滴は、光学的アッセイに供される。これは、場合によっては、アッセイスコアを生成するための低倍率蛍光スキャンである。
いくつかの実施形態では、この方法は、標的分子を増幅するステップを含むことができる。標的分子の増幅は、第１のセットの液滴の生成前または生成後に行うことができる。
さらに別の態様において、本明細書に開示される実施形態は、ポリペプチドを検出するための方法を対象とする。ポリペプチドの検出方法は、上述の標的核酸の検出方法と同様である。しかしながら、ペプチド検出アプタマーも含まれる。ペプチド検出アプタマーは、上述のように機能し、標的ポリペプチドに結合するとトリガーオリゴヌクレオチドの生成を促進する。ガイドＲＮＡはトリガーオリゴヌクレオチドを認識し、それによってＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質を活性化するように設計されている。活性化されたＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質によるマスキング構築物の非活性化は、検出可能な陽性シグナルのマスキング解除、放出、または生成をもたらす。
レポーター構築物（蛍光タンパク質など）を利用した多重検出診断では、標的配列を迅速に検出し、薬剤耐性ＳＮＰを診断し、微生物種の菌株とサブタイプを区別できる。例えば、微生物種の１つ以上の菌株の存在についてサンプルを評価する場合、サンプルからの一連の標的分子は、第２のセットの液滴に含まれる一連のＣＲＩＳＰＲ系を利用して評価され、各ＣＲＩＳＰＲ系には様々なガイドＲＮＡが含まれる。第１のセットの液滴と第２のセットの液滴を組み合わせた後、組み合わせを迅速に繰り返し試験する。試験する各標的分子は、マイクロプレートウェルに配置される。水系及び油の入力チャネルを使用して、スクリーニング対象の標的分子を含む単分散液滴が形成される。次いで、標的分子の液滴がマイクロ流体デバイスにロードされる。各標的分子はバーコードで標識されている。２つ以上の液滴がマージされる場合、組み合わされた光学バーコードは、マージ液滴に存在する標的分子及び／またはＣＲＩＳＰＲ系を識別する。バーコードは、光または蛍光顕微鏡で視覚化された光学的に検出可能なバーコード、またはオフチップで検出されるオリゴヌクレオチドバーコードである。
本明細書に記載されるように、ガイドＲＮＡが標的とされる標的分子を含むサンプルは、１つのセットの液滴にロードされ、ガイドＲＮＡ及びＣＲＩＳＰＲ系を含む液滴（複数可）とマージされる。ＣＲＩＳＰＲ系液滴に組み込まれたレポーター系は、マスキング構築物で光学的に検出可能なマーカー（蛍光タンパク質など）を発現する。液滴のセットは、エフェクタータンパク質と、対応する標的分子に結合するように設計された１つ以上のガイドＲＮＡと、ＲＮＡベースのマスキング構築物と、を含むＣＲＩＳＰＲ系を含む。液滴がマージされた後、各マイクロウェルを光学的にスキャンして光学バーコードを読み取ることにより、各ウェル内の分子種の同一性を決定できる。レポーターシステムの光学測定は、バーコードの光学スキャンと同時に行うことができる。したがって、このコンビナトリアルスクリーニングシステムを使用すると、実験データの収集と分子種の同定を同時に行うことができる。
場合によっては、マイクロ流体デバイスは、画像化の前に一定期間インキュベートされ、複数の時点で画像化され、経時的なレポーターの測定量の変化を追跡する。さらに、いくつかの実験では、マージ液滴は、オフチップ評価のためにマイクロ流体デバイスから溶出される（例えば、参照によりすべての目的のためにその全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第ＷＯ２０１６／１４９６６１号を参照されたい。溶出は特に［００５６］～［００５９］で論じられる）。
開示された処理戦略により、何百万もの液滴の並行処理は、コンビナトリアルスクリーニングに必要な規模に達する。さらに、液滴のナノリットルボリュームにより、スクリーニングに必要な化合物の消費量が削減される。本開示は、光学バーコード及び大きな固定位置空間アレイにおける液滴の並行操作を組み込んで、液滴の同一性をアッセイ結果と関連付ける。本システムの独自の利点は、２ｎＬのアッセイ容量でスクリーニングされた化合物の使用を最小限に抑えることである。本明細書でのプラットフォームは、液滴マイクロ流体システムのハイスループットの可能性を活用し、化合物のペアの組み合わせを構築するために必要な決定論的な液体処理操作をマイクロウェルデバイスで液滴のランダムなペアの並列マージと置き換える。この方法の独自の利点は、ハイスループットで手動で操作できることと、マイクロウェルでのアッセイの小型化により、少量のサンプルを使用できることである。ＳＨＥＲＯＣＫ技術と組み合わせると、この方法は、より小さなサンプルサイズを利用して大規模に多重化できる強力な検出技術を提供する。
本明細書の技法は、入力化合物のセットのすべての対の組み合わせを３つのステップで試験する処理プラットフォームを提供する。まず、標的分子がカラーバーコードと組み合わされる（２、３、４、またはそれ以上の蛍光色素の一意の比率）。標的分子は、蛍光色素（例えば、赤、緑、青など）の比率によってバーコード化され得る。サンプル処理に続いて、標的分子は、好ましくは約１ナノリットルのサイズの油滴中の水中に乳化される。いくつかの実施形態では、液滴を安定させるために界面活性剤を含ませることができる。標準的なマルチチャネルマイクロピペット技術を使用して、液滴を１つのプールに組み合わせることができる。ＣＲＩＳＰＲ系、蛍光色素の比率を使用する光学バーコード、及びＲＮＡマスキング化合物を含む第２のセットの液滴が調製される。第１のセットと第２のセットの液滴は１つの大きなプールに混合され、その後、各マイクロウェルが２つの液滴をランダムに捕捉するように、液滴がマイクロウェルアレイにロードされる。いくつかの実施形態では、マイクロウェルの交差汚染と蒸発を制限するために、ロード後のマイクロウェルアレイをガラス基板に密閉する。場合によっては、マイクロウェルアレイは機械的クランプによってアセンブリに固定される。各液滴の内容物は、識別された第１のセット及び第２のセットの液滴と事前に混合された２、３、４、またはそれ以上の蛍光色素の一意の比率から生じる蛍光バーコードによってコード化される。
低倍率（２～４倍）の落射蛍光顕微鏡は、各液滴及び／またはウェルの内容物を識別するために使用できる。次に、各ウェルの２つの液滴をマージし、高電圧ＡＣ電界を印加して液滴のマージを誘導する。マージに続いて、ＳＨＥＲＬＯＣＫ反応が開始され、いくつかの実施形態では、サンプルが３７℃でインキュベートされる。その後、アレイは、光学的表現型（例えば、陽性の蛍光）を決定し、この測定値を各ウェルで以前に識別された化合物のペアにマッピングするために画像化される。ローディング後の化合物交換を制限するマイクロウェルアレイ設計が特に好ましく、１つの例示的な方法は、液滴のローディング後にマイクロウェルアレイを機械的に密閉することである。
一態様では、本明細書に記載の実施形態は、１つ以上の核酸含有標本における核酸配列変動の多重スクリーニング方法を対象とする。核酸配列変動には、天然の配列の変動、遺伝子発現の変動、操作された遺伝的摂動、またはそれらの組み合わせが含まれ得る。核酸含有検体は、細胞性または無細胞性であり得る。核酸を含む検体は、光学バーコードを含む液滴として調製される。ＣＲＩＳＰＲ検出システムと光学バーコードを含む第２のセットの液滴が調製される。場合によっては、バーコードは、光または蛍光顕微鏡で視覚化できる光学的に検出可能なバーコードであり得る。特定の例示的な実施形態では、光学バーコードは、一連の定義された色から区別可能な色のフルオロフォアまたは量子ドットのサブセットを含む。場合によっては、光学的にコード化された粒子は、各ウェル内の光学的にコード化された粒子のランダムな組み合わせをもたらす個別のボリュームにランダムに送達されてもよいし、または光学的にコード化された粒子の一意の組み合わせが各個別のボリュームに具体的に割り当てられてもよい。光学的にコード化された粒子のランダムな分布は、すべての個別のボリュームへの分布を可能にするのに十分な時間、アッセイプラットフォームをポンピング、混合、ロッキング、または攪拌することによって達成することができる。当業者は、使用されるアッセイプラットフォームに基づいて、光学的にコード化された粒子を個別のボリューム全体にランダムに分配するための適切なメカニズムを選択することができる。
次いで、光学的にコード化された粒子の観察可能な組み合わせを使用して、各個別のボリュームを識別することができる。表現型などの光学的評価は、個別のボリュームごとに、例えば蛍光顕微鏡または他の画像化デバイスで作成及び記録することができる。図１３に示されるように、３つの蛍光色素、例えば、様々なレベルのＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５、５９４、６４７を使用して、１０５個のバーコードを生成できる。第４の色素を追加して使用することができ、数百の一意のバーコードの規模に拡張することができる。同様に、５色は、色の比率を変えることで達成できる一意のバーコードの数を増やすことができる。
例えば、核酸官能化粒子を固体支持体上で合成し、続いて様々なレベルで異なる比率の色素、例えばＦＡＭ、Ｃｙ３及びＣｙ５、または３つの蛍光色素、例えばＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５５５、５９４、６４７で標識して、１０５個のバーコードを生成できる。
一実施形態において、各液滴または個別のボリュームで受け取られるフルオロフォアの割り当てられたまたはランダムなサブセット（複数可）は、各個別のボリュームにおける個別の光学的にコード化された粒子の観察可能なパターンを決定し、それにより、各個別のボリュームが独立して識別されることを可能にする。各個々のボリュームは、光学的にコード化された粒子を検出する適切な画像化技術で画像化される。例えば、光学的にコード化された粒子が蛍光標識されている場合、各個別のボリュームは、蛍光顕微鏡を使用して画像化される。別の例では、光学的にコード化された粒子が比色的に標識されている場合、各個別のボリュームは、各カラーラベルに固有の波長または吸収スペクトルまたは発光スペクトルに一致する１以上のフィルターを備えた顕微鏡を使用して画像化される。使用される光学システムに適合する他の検出方法、例えば、量子ドット、色素などを検出するための当該技術分野で知られている方法が意図される。各個別のボリュームについて観察された個別の光学的にコード化された粒子のパターンは、後の使用のために記録することができる。
さらに、液滴のマージ、及びＣＲＩＳＰＲ検出システムと標的分子とのインキュベーションに続いて、光学的評価を行うことができる。標的分子がガイド分子によって検出されると、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質が活性化され、例えば、検出可能な陽性シグナルがマスキング解除、放出、または生成されるようにマスキング構築物を切断することにより、マスキング構築物を不活性化する。１つ以上の時間周期でマージした各液滴の検出可能なシグナルの検出及び測定を行うことができ、例えば、陽性の検出可能なシグナルが存在するとき、標的分子の存在を示す。
本発明のさらなる実施形態は、以下の番号の付いた項目で説明される。
１． 病原体に対するプローブ及びプライマーを開発する方法であって、
１つ以上の標的病原体に対して入力ゲノム配列のセットを提供することと、
セットカバー解法プロセスを前記標的配列のセットに適用して、１つ以上の標的増幅配列を同定することであって、前記１つ以上の標的増幅配列は、前記標的病原体の入力ゲノム配列のセットの間で共有される高度に保存された標的配列である、前記セットカバー解法プロセスを前記標的配列のセットに適用して、１つ以上の標的増幅配列を同定することと、
前記１つ以上の標的増幅配列に基づいて、１つ以上のプライマー、１つ以上のプローブ、またはプライマー対とプローブの組み合わせを生成することと、
を含む、前記方法。
２． 前記入力ゲノム配列のセットが、１０以上のウイルスのセットに由来するゲノム配列を表す、項目１に記載の方法。
３． 前記プライマーのセットが、５８～６０℃の標的融解温度によって同定される、項目１に記載の方法。
４． 推定アンプリコンが同定される、項目１に記載の方法。
５． 次に、前記１つ以上の標的増幅配列を診断設計ガイドに供して、前記１つ以上のプライマー、１つ以上のプローブ、またはプライマー対とプローブの組み合わせを生成する、項目３に記載の方法。
６． 前記入力ゲノム配列のセットが、２以上のウイルス病原体に由来するゲノム配列を表す、項目１に記載の方法。
７． 前記生成された１つ以上のプライマー、１つ以上のプローブ、またはプライマー対とプローブの組み合わせが、５つ以上のウイルスの検出のための配列を含む、項目１に記載の方法。
８． サンプル中のウイルスを検出する方法であって、
サンプルを、プライマー対及び検出可能な標識を含むプローブと接触させることを含み、前記１つ以上のプライマー及び／またはプローブが、それぞれがウイルス種またはサブ種を検出するよう構成されている、前記方法。
９． 前記１つ以上のプローブが、対応する標的分子に結合するよう設計された１つ以上のガイドＲＮＡを含む、項目８に記載の方法。
１０． 前記１つ以上のガイドＲＮＡが、標的ＲＮＡもしくはＤＮＡ中の一塩基多型、またはＲＮＡ転写物のスプライスバリアントを検出するように設計されている、項目９に記載の方法。
１１． 前記１つ以上のガイドＲＮＡが、疾患状態に特徴的な１つ以上の標的分子に結合するように設計されている、項目８に記載の方法。
１２． 前記１つ以上のガイドＲＮＡが、１つ以上のウイルス株を区別するように設計されている、項目８に記載の方法。
１３． 前記１つ以上のガイドＲＮＡが、少なくとも９０のガイドＲＮＡを含む、項目１２に記載の方法。
本発明は、特許請求の範囲に記載される本発明の範囲を限定しない、以下の実施例においてさらに説明される。
例示的な方法
例示的な方法では、化合物を蛍光色素の一意の比率で混合することができる。標的分子と色素混合物の各混合物は、液滴に乳化することができる。同様に、光学バーコードを備えた各検出ＣＲＩＳＰＲ系は、液滴に乳化された。いくつかの実施形態では、各液滴は約１ｎＬである。次いで、液滴を組み合わせてマイクロウェルチップに適用することができる。簡単な混合で液滴を組み合わせることができる。例示的な一実施形態では、マイクロウェルチップは、例えばネオジム磁石などのクランプによって上下からクランプできる取り外し可能なスペーサーを備えた疎水性スライドガラスなどのプラットフォーム上に吊り下げられる。スペーサーによって作成されたチップとガラスの間のギャップに油をロードし、液滴のプールをチップに注入し、さらに油を注入して余分な液滴を排出することで液滴を流し続けることができる。ロードが完了すると、チップを油で洗浄して、遊離している界面活性剤をパージできる。スペーサーを取り外して、マイクロウェルをスライドガラスに対して密閉し、クランプを閉じることができる。次いで、チップを落射蛍光顕微鏡で画像化し、次いで、液滴をマージして、例えばコロナ処理装置によって供給されるＡＣ電場を印加することにより各マイクロウェル内の化合物を混合する。３７℃でのマイクロウェルのインキュベーションと、落射蛍光顕微鏡を使用した蛍光の測定。
プライマーの設計に関しては、ソフトウェアツールに実装された「診断ガイド設計」法を利用して、ウイルス配列に対する以下の例示的な方法を利用することができる。ウイルス配列の場合、ウイルス配列のアライメントの入力が利用され、その目的は、ガイドと標的との間のいくつかのミスマッチ（通常は１）を許容する入力配列のいくつかの所望の画分（例えば、９５％）を検出する、いくつかの特定のアンプリコン長さ内にあるガイド配列のセットを見つけることである。サブタイピング（または任意の鑑別同定）にとって重要なことは、各コレクションが１つのサブタイプに固有であることを保証する様々なガイドのコレクションを設計することである。
目標は、これに基づいて、診断ガイド設計（「ｄ－ｇ－ｄ」）と他のツールを使用して、種同定用のアンプリコンプライマーとガイド配列を同時に設計することである。
必要なウイルスゲノムを組み立て、ｍａｆｆｔを使用して種レベルでアライメントを行い、データをクラスター化して密接に関連した種を識別する。セグメント化されたウイルスを特別に扱う。各セグメントを個別に扱う。最終的に、続行するのに最適なセグメント（または２つ）を選択する。
診断ガイド設計を使用して、推定プライマー結合部位（２５ｍｅｒ）を同定する。カバレッジが９５％で、ミスマッチが２つ以下の単一のプライマー配列を探す。
位置／ウィンドウでこのカバレッジを達成する方法がない場合は、次の位置に移動し、プライマー３を呼び出す前に、最初にゲノム全体でこれを実行する。
８０～１２０ヌクレオチド長のアンプリコンのプライマーペアを同定する。プライマー３を使用して２５ｍｅｒを絞り込み、５８～６０Ｃの標的融解温度を取得する。
ＳＥＱＵＥＮＣＥ＿ＰＲＩＭＥＲ＿ＰＡＩＲ＿ＯＫ＿ＲＥＧＩＯＮ＿ＬＩＳＴを使用して、推定アンプリコンのｆｗｄ／リバースプライマーの位置を指定する。これにより、［ｆｗｄ＿ｓｔａｒｔ、ｆｗｄ＿ｌｅｎｇｔｈ，ｒｅｖ＿ｓｔａｒｔ，ｒｅｖ＿ｌｅｎｇｔｈ］フォーマットを使用してプライマーが入る領域を入力できる。
好ましくは、ＰＣＲはより低い温度、例えば５０～５５Ｃで行うことができる。
プライマーの二次構造が悪い場合は、廃棄する（ＰＲＩＭＥＲ＿ＭＡＸ＿ＳＥＬＦ＿ＡＮＹ＿ＴＨ，ＰＲＩＭＥＲ＿ＰＡＩＲ＿ＭＡＸ＿ＣＯＭＰＬ＿ＡＮＹ＿ＴＨを４０Ｃに設定）。これは、デフォルト設定の４７Ｃよりも低い値であるが、ここで優れたプライマーを得るには、ストリンジェンシーが必要である。
クラスタリングデータを使用して、アンプリコンの交差反応性を確認する。これは、プライマーが避けるべき「ミスプライミングライブラリー」を可能にするプライマー３を使用して行うことができる。ここで、他の種（しかし同じクラスター内）からの配列表を入力できる。アンプリコンに固有のプライマーが含まれている可能性があるが、アッセイが非常に特異的であることを保証するために必要な、ｃｒＲＮＡレベルでの重複が依然として存在する可能性がある。
それらのアンプリコンをｄ－ｇ－ｄに渡し、ｃｒＲＮＡの発見を試みる。
以前と同じように、１つのミスマッチを許容する。
ウィンドウサイズはアンプリコン全体である（プライマー配列との重複なし）。
クラスタリングデータを使用して差動設計を行う（おそらく、増幅されていない材料が不足している必要があるため、アンプリコン対他のアンプリコンを確認するのみである）。少なくとも４つのミスマッチを要求する（Ｇ－Ｕペアは含まれない）。
ｃｒＲＮＡが少なく、カバレッジが高く、特異的なアンプリコンの表を作成する。
現時点では、単一の「最良の」設計を準備できるが、コードを変更して、例えば各ウイルスを試験するためのいくつかの選択肢を提供するホワイトリストの作成を可能にする必要がある。
２０ｕＬの反応を使用したプレート中のジカウイルスについてＳＨＥＲＬＯＣＫによって分析された同じジカサンプルの感度曲線は、２ｎＬの反応を使用した液滴中のジカウイルスのＳＨＥＲＬＯＣＫアッセイと同じであり、液滴ＳＨＥＲＬＯＣＫ（ｄＳＨＥＲＬＯＣＫ）の検出限界がプレートに匹敵することを示す。（図３）。同様に、ｄＳＨＥＲＬＯＣＫは、プレートでのアッセイと比較した場合、一塩基多型（ＳＮＰ）を同等に区別する。
本明細書に開示される方法及びシステムは、インフルエンザのサブタイプの多重検出に利用することができる（図５）。特に、チップ内の検出ミックスと標的のすべての組み合わせを生成するために必要な実験的努力は、ウェルプレートで対角線上の反応のみを構築するために必要な努力と同じであり、システムと方法を多数の組み合わせで分析に適用することを可能にする。チップは対角線に加えてすべての非対角線の組み合わせを自動的に構築するため、目的の製品に対する各検出ミックスの選択性の迅速な決定が達成可能である。ガイドＲＮＡは、寄託された配列に基づいて、ウイルスの特定の一意なセグメントを標的にするように設計できる。場合によっては、より新しい配列データ、またはより一般的な配列を含むように設計に重みを付けることができる。インフルエンザＨサブタイプについて図６に示すように、様々なウイルスのサブタイプに対してガイドＲＮＡのセットを設計でき、０または１のミスマッチを持つ各サブタイプの多数のコンセンサス配列に対するガイドＲＮＡのアライメントを提供する成功した結果が得られる。
現在のシステム及び方法の他の例示的な用途には、ＴＢ（図１１）及びＨＩＶ逆転写酵素における薬剤耐性突然変異の検出を含む、変異の多重検出が含まれる。ガイドＲＮＡは、祖先対立遺伝子と派生対立遺伝子を標的とするように設計することができ、派生対立遺伝子と標的対立遺伝子の試験を一緒に使用する可能性を示す試験を行うことができる。（図１０）。ｄＳＨＥＲＬＯＣＫは、３０分以内に検出される蛍光で実行できる。（図１１）。
マイクロウェルアレイチップと液滴検出を使用してＳＨＥＲＬＯＣＫを本明細書に開示する方法に組み合わせることで、バーコードの数とチップサイズを拡張して大規模な多重化を可能にする、これまでの多重検出を通じて最高のスループットを提供できる。（図１２～１４）。
＊＊＊
本発明の記載された方法、医薬組成物、及びキットの様々な改変及び変形は、本発明の範囲及び趣旨から逸脱することなく、当業者には明らかであろう。本発明を特定の実施形態に関連して説明してきたが、さらなる改変が可能であり、特許請求される本発明はそのような特定の実施形態に過度に限定されるべきではないことが理解されるであろう。実際、当業者にとって明らかな、本発明を実施するための記載されたモードの様々な改変は、本発明の範囲内にあることを意図している。本出願は、一般に、本発明の原理に従い、本発明が属する技術分野の既知の慣習の範囲内であり、本明細書上記の本質的な特徴に適用することができる本開示からのそのような逸脱を含む、本発明のあらゆる変形、使用、または適応を包含することを意図している。

Claims (13)

  1. 病原体に対するプローブ及びプライマーを開発する方法であって、
    セットカバー解法プロセスを入力ゲノム配列のセットに適用して、１つ以上の標的増幅配列を同定することであって、前記１つ以上の標的増幅配列は、入力ゲノム配列のセットと標的病原体との間で共有される高度に保存された標的配列である、前記セットカバー解法プロセスを入力ゲノム配列のセットに適用して、１つ以上の標的増幅配列を同定することと、
    前記１つ以上の標的増幅配列に基づいて、１つ以上のプライマー、１つ以上のプローブ、またはプライマー対とプローブの組み合わせを生成することと、
    を含む、前記方法。
  2. 前記入力ゲノム配列のセットが、１０以上のウイルスのセットに由来するゲノム配列を表す、請求項１に記載の方法。
  3. 前記プライマーのセットが、５８～６０℃の標的融解温度によって同定される、請求項１に記載の方法。
  4. 推定アンプリコンが同定される、請求項１に記載の方法。
  5. 次に、前記１つ以上の標的増幅配列を診断設計ガイドに供して、前記１つ以上のプライマー、１つ以上のプローブ、またはプライマー対とプローブの組み合わせを生成する、請求項３に記載の方法。
  6. 前記入力ゲノム配列のセットが、２以上のウイルス病原体に由来するゲノム配列を表す、請求項１に記載の方法。
  7. 前記生成された１つ以上のプライマー、１つ以上のプローブ、またはプライマー対とプローブの組み合わせが、５つ以上のウイルスの検出のための配列を含む、請求項１に記載の方法。
  8. サンプル中のウイルスを検出する方法であって、
    サンプルを、プライマー対及び検出可能な標識を含むプローブと接触させることを含み、前記１つ以上のプライマー及び／またはプローブが、それぞれがウイルス種またはサブ種を検出するよう構成されている、前記方法。
  9. 前記１つ以上のプローブが、対応する標的分子に結合するよう設計された１つ以上のガイドＲＮＡを含む、請求項８に記載の方法。
  10. 前記１つ以上のガイドＲＮＡが、標的ＲＮＡもしくはＤＮＡ中の一塩基多型、またはＲＮＡ転写物のスプライスバリアントを検出するように設計されている、請求項９に記載の方法。
  11. 前記１つ以上のガイドＲＮＡが、疾患状態に特徴的な１つ以上の標的分子に結合するように設計されている、請求項８に記載の方法。
  12. 前記１つ以上のガイドＲＮＡが、１つ以上のウイルス株を区別するように設計されている、請求項８に記載の方法。
  13. 前記１つ以上のガイドＲＮＡが、少なくとも９０のガイドＲＮＡを含む、請求項１２に記載の方法。
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