KR101880536B1 - 아연 핑거 뉴클레아제를 사용하는 로사 좌위의 게놈 편집 - Google Patents

아연 핑거 뉴클레아제를 사용하는 로사 좌위의 게놈 편집 Download PDF

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샤오샤 퀴
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필립 디. 그레고리
마이클 씨. 홀메스
에드워드 제이. 웨인스타인
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상가모 테라퓨틱스, 인코포레이티드
시그마-알드리치 컴퍼니 엘엘씨
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Abstract

아연 핑거 단백질 및 절단 도메인 또는 절단 절반 도메인을 포함하는 융합 단백질을 사용하는 로사 좌위의 게놈 편집을 위한 방법 및 조성물이 본 명세서에 개시된다. 상기 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 또한 제공되며, 상기 폴리뉴클레오타이드 및 융합 단백질을 포함하는 세포가 제공된다.

Description

아연 핑거 뉴클레아제를 사용하는 로사 좌위의 게놈 편집{GENOME EDITING OF A ROSA LOCUS USING ZINC-FINGER NUCLEASES}
관련 출원과의 상호참조
본 출원은 2010년 4월 26일 출원된 미국 가특허출원 제61/343,287호의 우선권을 주장하며, 이 기초출원은 그것의 전문이 본 명세서에 참조로 포함된다.
연방정부의 연구 지원하에서 만들어진 본 발명에 대한 권리의 언급
해당 없음.
기술분야
본 발명의 개시는 체세포성 및 유전성 유전자 삽입/붕괴, 게놈 변경, 무작위 돌연변이를 수행하는 대립유전자의 생성 및/또는 로사 좌위(Rosa locus)에 이식유전자의 삽입을 포함하는 게놈 유전자조작 분야에 관한 것이다.
로사 유전자 산물은 모든 발생 단계에서 편재하여 발현된다. 그것으로, 이 좌위는 내인성의 또는 도입된 프로모터로부터 내인성 서열을 발현시키고, 예를 들어 배아줄기세포로부터 유전자이식 마우스를 만들기 위해 널리 사용되어 왔다. 이에 대해서는, 예를 들어, 문헌[Strathdee et al . (2006) PLoS ONE , Issue 1, e4 ; Nyabi et al. (2009) Nucl . Acids . Res . 37:e55]을 참조할 수 있다.
그러나, 통상적인 방법의 표적화된 삽입은 표적 벡터의 복잡한 조립체를 필요로 한다. 따라서 표적화된 형식으로 로사 유전자에 및/또는 로사 유전자의 변형에 표적화된 삽입의 필요가 남아있다. 게놈 좌위의 정확히 표적화된 자리 특이적 절단은 통상적인 상동 재조합에 대해 효과적인 보충 및/또는 대안을 제공한다. 이중가닥 파손(double-strand break, DSB)의 생성은 1000배 이상의 표적화된 좌위에서 상동 재조합의 빈도를 증가시킨다. 더 단순하게, 비상동성 말단 접합(non-homologous end joining, NHEJ)에 의한 자리 특이적 DSB의 부정확한 복구는 또한 유전자 붕괴를 초래할 수 있다. 2개의 이러한 DSB의 생성은 임의적으로 거대 영역의 결실을 초래한다. 아연 핑거 단백질의 모듈 DNA 인식 선호도는 자리 특이적인 멀티 핑거 DNA 결합 단백질을 합리적으로 설계하도록 한다. 자리 특이적 아연 핑거 단백질에 대한 II형 제한 효소 FokI로부터 뉴클레아제 도메인의 융합은 자리 특이적 뉴클레아제를 생성하도록 한다. 이에 대해서는, 예를 들어, 미국 특허 공개 제20030232410호; 제20050208489호; 제20050026157호; 제20050064474호; 제20060188987호; 제20060063231호; 제20070134796호; 제2008015164호; 제20080131962호; 제2008015996호 및 국제특허 공개 제WO 07/014275호 및 제2008/133938호를 참조할 수 있으며, 이들 모두는 아연 핑거 뉴클레아제의 사용을 설명하고, 이들의 전문은 모든 목적을 위해 참조로 포함된다.
본 명세서에서 로사 유전자 좌위에 표적화된 삽입을 위한 조성물 및 방법이 개시된다. 본 명세서에 설명된 조성물 및 방법은, 이에 제한되는 것은 아니지만, 하나 이상의 유전자에서 표적화된 변경을 초래하며, 생식계열에 이 표적화된 변경의 통합을 포함하는 동물 세포 내 하나 이상의 유전자의 절단(삽입, 결실 및/또는 치환 돌연변이); 비내인성 핵산 서열의 표적화된 도입, 동물에서 하나 이상의 유전자의 부분적 또는 완전한 불활성화; 상동성 지향 복구의 유도 방법, 유전자이식 동물(예를 들어, 설치류)의 생성 및/또는 동물 유전자의 신규 대립유전자를 암호화하는 무작위 돌연변이의 생성을 포함하여, 게놈 편집을 위해 사용될 수 있다.
한 양태에서, 본 명세서에서 게놈(예를 들어 설치류 게놈) 내 로사 유전자 중의 표적 자리에 결합하는 아연 핑거 단백질(zinc-finger protein, ZFP)이 설명되되, ZFP는 하나 이상의 유전자조작된 아연 핑거 결합 도메인을 포함한다. 한 실시형태에서, ZFP는 관심의 표적 게놈 영역을 절단하는 아연 핑거 뉴클레아제(ZFN)이되, ZFN은 하나 이사의 유전자조작된 아연 핑거 결합 도메인 및 뉴클레아제 절단 도메인 또는 절단 절반 도메인(cleavage-half-domain)을 포함한다. 절단 도메인 및 절단 절반 도메인은, 예를 들어 다양한 제한 엔도뉴클레아제 및/또는 호밍(homing) 엔도뉴클레아제로부터 얻어질 수 있다. 한 실시형태에서, 절단 절반 도메인은 IIS형 제한 엔도뉴클레아제(예를 들어, FokI)로부터 유래된다. 특정 실시형태에서, 아연 핑거 도메인은 로사 유전자, 예를 들어 Rosa26 내 표적 자리를 인식한다.
ZFN은, 예를 들어 리더(leader) 서열, 트레일러(trailer) 서열 또는 인트론과 같은 유전자의 암호화 영역 내, 또는 유전자 내에 또는 유전자에 인접한 비암호화 영역, 또는 암호화 영역의 상류 또는 하류인 비전사 영역 내의 로사 유전자에 결합하고 및/또는 절단할 수 있다.
다른 양태에서, 본 명세서에 설명된 하나 이상의 아연 핑거 뉴클레아제를 포함하는 조성물이 본 명세서에 설명된다. 특정 실시형태에서, 조성물은 하나 이상의 아연 핑거 뉴클레아제를 약학적으로 허용가능한 부형제와 조합하여 포함한다.
다른 양태에서, 본 명세서에 설명된 하나 이상의 ZFN을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 본 명세서에 설명된다. 폴리뉴클레오타이드는, 예를 들어, mRNA일 수 있다.
다른 양태에서, 프로모터에 작동가능하게 연결된 본 명세서에 설명된 하나 이상의 ZFN을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 ZFN 발현 벡터가 본 명세서에 설명된다.
다른 양태에서, 본 명세서에 설명되는 바와 같은 하나 이상의 ZFN 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포가 본 명세서에 설명된다. 숙주 세포는 하나 이상의 ZFP 발현 벡터에 의해 안정하게 형질전환되거나, 또는 일시적으로 트랜스펙션되거나, 또는 이들의 조합일 수 있다. 한 실시형태에서, 숙주 세포는 배아 줄기 세포이다. 다른 실시형태에서, 하나 이상의 ZFP 발현 벡터는 숙주 세포 중에서 하나 이상의 ZFN을 발현시킨다. 다른 실시형태에서, 숙주 세포는 외인성 폴리뉴클레오타이드 공여자 서열을 추가로 포함할 수 있다. 임의의 실시형태에서, 본 명세서에 설명된 숙주 세포는 배아 세포, 예를 들어 하나 이상의 마우스, 래트, 토끼 또는 다른 포유류 세포 배아를 포함할 수 있다.
다른 양태에서, 세포 내에서 하나 이상의 로사 유전자를 절단하는 방법이 본명세서에 기술되며, 상기 방법은: (a) ZFN(들)이 발현되고 하나 이상의 유전자가 절단되도록 하는 조건 하에서, 상기 하나 이상의 유전자 내 표적 자리에 결합하는 하나 이상의 ZFN을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 세포 내로 도입하는 단계를 포함한다.
또 다른 양태에서, 세포의 게놈 내에 외인성 서열을 도입하는 방법이 본 명세서에 기술되며, 상기 방법은: (a) ZFN(들)이 발현되고 상기 하나 이상의 유전자가 절단되도록 하는 조건 하에서, 로사 유전자 내의 표적 자리에 결합하는 하나 이상의 ZFN을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 세포 내로 도입하는 단계; 및 (b) 상기 세포를 외인성 폴리뉴클레오타이드와 접촉시키는 단계를 포함하며, 상기 유전자(들)의 절단은 상동성 재조합에 의해 게놈 내로 외인성 폴리뉴클레오타이드의 도입을 자극한다. 특정 실시형태에서, 외인성 폴리뉴클레오타이드는 게놈 내에 물리적으로 통합된다. 다른 실시형태에서, 상기 외인성 폴리뉴클레오타이드는, 핵산 복제 과정(예를 들어, 이중 가닥 파손의 상동성 지향 복구)을 통해 숙주 세포 게놈 내로 외인성 서열을 복제함으로써 게놈 내에 통합된다. 또 다른 실시형태에서, 게놈 내로 통합은 비상동성 의존적 표적화 통합(예를 들어 "말단-포획")을 통해 일어난다. 특정 실시형태에서, 하나 이상의 뉴클레아제는 IIS형 제한 엔도뉴클레아제의 절단 도메인과 유전자 조작된 아연 핑거 결합 도메인의 융합체이다. 특정 실시형태에서, 외인성 서열은 작은 포유류(예를 들어, 토끼 또는 마우스, 래트 등과 같은 설치류) 로사 유전자에 통합된다.
다른 실시형태에서, 세포의 게놈 내 하나 이상의 로사 유전자 서열(들)을 변형시키는 방법이 본 명세서에 기술되며, 상기 방법은 (a) 하나 이상의 로사 서열을 포함하는 세포를 제공하는 단계; 및 (b) 상기 세포 중에서 제1 및 제2 아연 핑거 뉴클레아제(ZFN)를 발현시키는 단계를 포함하되, 제1 ZFN은 제1절단 자리에서 절단하고, 제2 ZFN은 제2 절단 자리에서 절단하며, 상기 유전자 서열은 상기 제1 절단 자리와 제2 절단 자리 사이에 위치되고, 제1 및 제2 절단 자리의 절단은 비상동성 말단 접합 및/또는 상동성 지향 복구에 의해 상기 유전자 서열의 변형을 초래한다. 선택적으로, 절단은 또한 세포에 도입된 외인성 서열(이식유전자)의 삽입을 초래한다. 다른 실시형태에서, 비상동성 말단 접합은 제1 및 제2 절단 자리 사이의 결실을 초래한다. 상기 유전자 서열에서의 결실 크기는 제1 및 제2 절단 자리 사이의 거리에 의해 결정된다. 따라서, 관심의 임의의 유전자 영역에서 임의 크기의 결실이 얻어질 수 있다. 25, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1,000개의 뉴클레오타이드 쌍의 결실, 또는 이 범위 내 임의의 정수 값이 얻어질 수 있다. 임의의 정수 값의 뉴클레오타이드 쌍을 갖는 서열의 결실에 더하여, 본 명세서에 개시된 방법과 조성물을 이용하여 1,000개 초과의 뉴클레오타이드 쌍이 얻어질 수 있다.
본 명세서에 설명된 내인성 로사 유전자를 변형시키는 방법은, 예를 들어 유전자를 (부분적으로 혹은 전체적으로) 불활성화시킴으로써, 또는 이들 유전자의 신규한 대립 유전자 형태를 운반하는 유전자이식 동물(예를 들어, 래트, 토끼 또는 마우스)을 확인 또는 선별하도록 하는 유전자의 정해진 위치에서 무작위 돌연변이를 생성함으로써, 또는 (비제한적인 예로서, 약물 대사를 연구하기 위한) 인간화된 유전자를 삽입함으로써, 또는 예를 들어 이러한 돌연변이체 대립유전자의 표현형 효과를 시험하기 위해 관심의 돌연변이체 대립유전자를 삽입함으로써, 동물(예를 들어, 인간) 질병 모델을 만드는데 사용될 수 있다.
또 다른 양태에서, 하나 이상의 표적 로사 유전자의 생식계열 붕괴 방법이 본 명세서에 기술되며, 상기 방법은 본 명세서에 설명된 방법 중 어느 하나에 의해 배아의 하나 이상의 세포의 게놈 내에서 하나 이상의 로사 서열을 변형시키는 단계, 및 해당 배아를 생장시키는 단계를 포함하되, 변형된 유전자 서열은 성적으로 성숙한 동물의 적어도 일부의 생식세포 내에 존재한다. 특정 실시형태에서, 해당 동물은 설치류 또는 토끼와 같은 작은 포유류이다.
다른 양태에서, 적어도 하나의 관심의 로사 좌위 내에 하나 이상의 유전성 돌연변이체 대립유전자를 생성하는 방법이 본 명세서에 기술되며, 상기 방법은 본 명세서에 설명된 방법 중 어느 하나에 의해 동물 배아의 하나 이상의 세포의 게놈 내 하나 이상의 로사 좌위를 변형시키는 단계; 상기 배아를 성적으로 성숙시키는 단계; 및 상기 성적으로 성숙한 동물이 자손을 번식시키도록 하되, 적어도 일부의 자손은 상기 돌연변이체 대립유전자를 포함하는 단계를 포함한다. 특정 실시형태에서, 해당 동물은 작은 포유류, 예를 들어 토끼 또는 래트, 마우스 또는 기니아피그와 같은 설치류이다.
본 명세서에 설명된 어떤 방법에서, 아연 핑거 뉴클레아제(들)를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 DNA, RNA 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 플라스미드를 포함한다. 다른 실시형태에서, 해당 뉴클레아제를 암호화하는 상기 폴리뉴클레오타이드는 mRNA를 포함한다.
또 다른 추가의 양태에서, 염색체의 로사 좌위 내에 핵산 서열을 자리 특이적으로 통합하는 방법이 본 명세서에 기술된다. 특정 실시형태에서, 상기 방법은 (a) (i) 적어도 하나의 DNA 벡터(해당 DNA 벡터는 통합될 핵산 서열에 옆에 있는 상류 서열 및 하류 서열을 포함한다), 및 (ii) 로사 좌위 내 통합 자리를 인식하는 아연 핑거 뉴클레아제를 암호화하는 적어도 하나의 RNA 분자를 배아에 주입하는 단계; 및 (b) 해당 배아를 배양하여 아연 핑거 뉴클레아제를 발현시키는 단계를 포함하되, 염색체 내로 핵산 서열을 통합시키기 위하여 아연 핑거 뉴클레아제에 의해 통합 자리 내에 도입된 이중 가닥 파손은 DNA 벡터에 의한 상동성 재조합을 통해 복구된다.
적합한 배아는 포유류, 조류, 파충류, 양서류 및 어류 종을 포함하는 몇몇 상이한 척추동물 종으로부터 유래될 수 있다. 일반적으로 말해서, 적합한 배아는 아연 핑거 뉴클레아제를 발현시키도록 수집되고, 주입되며 배양될 수 있는 배아이다. 일부 실시형태에서, 적합한 배아는 작은 포유류(예를 들어, 설치류, 토끼 등), 애완 동물, 가축 및 영장류를 포함할 수 있다. 설치류의 비제한적인 예는 마우스, 래트, 햄스터, 게르빌루스쥐 및 기니아피그를 포함할 수 있다. 애완 동물의 비제한적인 예는 고양이, 개, 토끼, 고슴도치 및 페럿을 포함할 수 있다. 가축의 비제한적인 예는 말, 염소, 양, 돼지, 라마, 알파카 및 소를 포함할 수 있다. 영장류의 비제한적인 예는 흰목꼬리감기 원숭이, 침팬지, 여우원숭이, 마카크, 마모셋, 타마린, 거미원숭이, 다람쥐원숭이 및 긴꼬리원숭이를 포함할 수 있다. 다른 실시형태에서, 적합한 배아는 어류, 파충류, 양서류, 또는 조류의 배아를 포함할 수 있다. 대안으로, 적합한 배아는 곤충 배아, 예컨대 초파리 배아 또는 모기 배아일 수 있다.
또한 적어도 하나의 DNA 벡터를 포함하는 배아가 제공되되, 해당 DNA 벡터는 통합될 핵산 서열 옆에 있는 상류 서열 및 하류 서열을 포함하며, 적어도 하나의 RNA 분자는 통합 염색체 자리를 인식하는 아연 핑거 뉴클레아제를 암호화한다. 본 명세서에서 설명되는 바와 같은 임의의 배아로부터 유래된 유기체가 또한 제공된다.
또한 본 발명의 ZFP를 포함하는 키트가 제공된다. 해당 키트는 ZFP를 암호화하는 핵산(예를 들어 RNA 분자 또는 적합한 발현 벡터 내에 함유된 ZFP 암호화 유전자), 공여자 분자, 적합한 숙주 세포주, 본 발명의 방법을 수행하기 위한 설명서 등을 포함할 수 있다.
도 1은 Surveyor(상표명)(Transgenomic) 미스매치 분석에 의해 분석한 것과 같은 래트 rosa26 좌위의 절단 후 NHEJ 복구의 결과를 증명하는 사우던 블롯을 도시한 도면. "G"는 세포가 GFP ZFN에 의해 트랜스펙션된 경우의 반응을 표시하며, 넘버링된 레인은 특이적 ZFN 쌍을 표시한다. 화살표는 NHEJ가 일어난 경우의 레인을 표시한다.
도 2는 마우스 게놈 DNA 내에 로사-표적화된 공여자 뉴클레오타이드의 삽입을 도시한 도면.
(예를 들어 마우스, 래트 또는 토끼와 같은 작은 포유류에서) 게놈 편집(예를 들어, 유전자의 절단; 유전자의 변경, 예를 들어 절단 후 외인성 서열의 삽입(물리적 삽입 또는 상동성 지향 복구를 통한 복제에 의한 삽입) 및/또는 절단 후 비상동성 말단 접합(NHEJ)에 의한 유전자의 변경; 하나 이상의 유전자의 부분적 또는 완전한 불활성화; 내인성 유전자의 변경된 발현을 만들기 위한 무작위 돌연변이를 갖는 대립유전자의 생성 등) 및 생식계열 내로 운반된 게놈의 변경을 위한 조성물 및 방법이 본 명세서에 개시된다. 또한, 예를 들어, 표적 동물(예를 들어, 작은 포유류) 세포에서 하나 이상의 유전자를 편집(변경)하기 위한 이러한 조성물(시약)의 제조 및 사용 방법도 개시된다. 이와 같이, 본 명세서에 설명된 방법과 조성물은 하나 이상의 유전자의 표적화 유전자 변경(예를 들어, 녹인(knock-in) 및/또는 녹아웃(knockout)(부분 또는 완전))을 위한 및/또는 임의의 표적 대립유전자 서열의 무작위 돌연변이 유발을 위한 고도로 효율적인 방법을 제공하며, 따라서 인간 질병의 동물 모델을 발생시킨다.
본 명세서에 설명된 조성물 및 방법은 노동 집약적인 선별 및/또는 스크리닝을 하지 않고, 최소의 비표적(off-target) 효과를 가지는 동물 내 내인성 좌위의 빠르며, 완전하고, 영구적인 표적화 붕괴를 제공한다. 전체 동물 유전자 녹아웃은 또한 ZFN mRNA 또는 ZFN 발현 카세트를 주입함으로써 단일 단계로 용이하게 만들어질 수 있다.
일반
방법의 실시뿐만 아니라 본 발명에 개시된 조성물의 제조와 사용은, 달리 언급되지 않는 한, 분자생물학, 생화학, 염색질 구조 및 분석, 컴퓨터 계산 화학, 세포 배양, 재조합 DNA 및 당업계에 내의 관련 분야의 통상적인 기술이 사용된다. 이러한 기술은 문헌에서 상세하게 설명된다. 이에 대해서는, 예를 들어, 문헌[Sambrook et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Second edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 and Third edition, 2001; Ausubel et al., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, New York, 1987] 및 정기 업데이트물; 연속 간행물[METHODS IN ENZYMOLOGY, Academic Press, San Diego]; [Wolffe, CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION, Third edition, Academic Press, San Diego, 1998; METHODS IN ENZYMOLOGY, Vol.304, "Chromatin" (P.M. Wassarman and A. P. Wolffe, eds.), Academic Press, San Diego, 1999; METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Vol. 119, "Chromatin Protocols" (P.B. Becker, ed.) Humana Press, Totowa, 1999]을 참조할 수 있다.
정의
용어 "핵산", "폴리뉴클레오타이드" 및 "올리고뉴클레오타이드"는 상호호환적으로로 사용되며, 선형 또는 고리형 입체구조, 단일- 또는 이중-가닥 형태인 데옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드 중합체를 말한다. 본 발명의 개시의 목적을 위하여, 이러한 용어는 중합체의 길이에 대한 한정으로서 해석되어서는 않는다. 상기 용어는 천연 뉴클레오타이드의 공지된 유사체뿐만 아니라, 염기, 당 및/또는 인산염 부분(예를 들어, 포스포로티오에이트 백본)이 변형된 뉴클레오타이드를 포괄할 수 있다. 일반적으로, 특정 뉴클레오타이드의 유사체는 동일한 염기쌍 특이성을 가지며; 즉, A의 유사체는 T와 염기쌍을 형성할 것이다.
용어 "폴리펩타이드", "펩타이드", 및 "단백질"은 상호호환적으로로 사용되며, 아미노산 잔기의 중합체를 말한다. 상기 용어는 또한 하나 이상의 아미노산이 대응하는 자연적으로 발생하는 아미노산의 화학적 유사체 또는 변형된 유도체인 아미노산 중합체에 적용된다.
"결합"은 거대분자 사이(예를 들어, 단백질과 핵산 사이)의 서열 특이적인 비공유적 상호작용을 말한다. 상호작용이 전체로서 서열 특이적이라면, 결합 상호작용의 모든 성분들이 서열 특이적(예를 들어, DNA 백본의 인산염 잔기와의 접촉)일 필요는 없다. 일반적으로, 이런 상호작용은 10-6M-1 또는 그 이하의 해리 상수(Kd)를 특징으로 한다. "친화도"는 것은 결합 강도를 의미하는데, 결합 친화도의 증가는 더 낮은 Kd와 상관 관계가 있다.
"결합 단백질"은 다른 분자와 비공유적으로 결합할 수 있는 단백질이다. 결합 단백질은, 예를 들어, DNA 분자(DNA-결합 단백질), RNA 분자(RNA-결합 단백질) 및/또는 단백질 분자(단백질-결합 단백질)와 결합할 수 있다. 단백질-결합 단백질의 경우에, 이것은 자기 자신과 결합할 수 있고(동종이합체, 동종삼합체 등을 형성) 및/또는 상이한 단백질 또는 단백질들의 하나 이상의 분자와 결합할 수 있다. 결합 단백질은 한 가지 이상의 유형의 결합 활성을 가질 수 있다. 예를 들어, 아연 핑거 단백질은 DNA-결합 활성, RNA-결합 활성 및 단백질-결합 활성을 가진다.
"아연 핑거 DNA 결합 단백질"(또는 결합 도메인)은, 아연 이온의 배위 결합을 통하여 구조가 안정화되는 결합 도메인 내의 아미노산 서열의 영역인 하나 이상의 아연 핑거를 통하여 서열 특이적인 방식으로 DNA와 결합하는 단백질 또는 더 큰 단백질 내의 도메인이다. 용어 아연 핑거 DNA 결합 단백질은 흔히 아연 핑거 단백질 또는 ZFP로 약칭된다.
아연 핑거 결합 도메인은 미리 결정해 놓은 뉴클레오타이드 서열과 결합하도록 "유전자 조작"될 수 있다. 아연 핑거 단백질을 조작하는 방법의 비제한적인 예는 설계 및 선별이다. 설계된 아연 핑거 단백질은 그 설계/조성이 주로 합리적인 기준으로부터 정해지는 것으로 자연에서 발생하지 않는 단백질이다. 설계를 위한 합리적인 기준에는 치환 규칙 및 기존의 ZFP 설계와 결합 데이터의 정보를 저장하고 있는 데이터베이스 정보 처리를 위한 컴퓨터를 이용한 알고리즘의 적용이 포함된다. 이에 대해서는, 예를 들어, 미국등록특허 제6,140,081호; 제6,453,242호; 제6,534,261호; 및 제WO 98/53058호; 제WO 98/53059호; 제WO 98/53060호; 제WO 02/016536호; 및 제WO 03/016496호를 참조할 수 있다.
"선별된" 아연 핑거 단백질은 파지 디스플레이, 상호작용 트랩 또는 혼성 선별과 같이 주로 실험적 과정의 결과로서 생산되는 것으로 자연에서 발견되지 않는 단백질이다. 이에 대해서는, 예를 들어, 미국등록특허 제5,789,538호; 제5,925,523호; 제6,007,988호; 제6,013,453호; 제6,200,759호; WO 95/19431; 제WO 96/06166호; 제WO 98/53057호; 제WO 98/54311호; 제WO 00/27878호; 제WO 01/60970호; 제WO 01/88197호; 및 제WO 02/099084호를 참조할 수 있다.
용어 "서열"은 임의의 길이의 뉴클레오타이드 서열을 말하는데, 이는 DNA 또는 RNA일 수 있고, 선형, 고리형 또는 분지형일 수 있으며, 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. 용어 "공여자 서열"은 게놈 내로 삽입되는 뉴클레오타이드 서열을 말한다. 공여자 서열은 임의의 길이, 예를 들어, 2개 내지 10,000개의 뉴클레오타이드 길이(또는 상기 범위 사이 또는 상기 범위를 초과하는 임의의 정수 값), 바람직하게는, 약 100개 내지 1,000개의 뉴클레오타이드(또는 상기 범위 사이의 임의의 정수), 더욱 바람직하게는, 약 200개 내지 500개의 뉴클레오타이드 길이일 수 있다.
"상동성 비동일 서열"은 제2 서열과 어느 정도의 서열 동일성을 공유하지만, 서열 자체는 제2 서열과 동일하지는 않은 제1 서열을 말한다. 예를 들어, 돌연변이 유전자의 야생형 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드는 상기 돌연변이 유전자의 서열과 상동성이긴 하지만 동일하지는 않다. 특정 실시형태에서, 2개 서열 간의 상동성 정도는, 정상적인 세포 메커니즘을 이용해 이들 사이에 상동성 재조합이 일어나도록 하는데 충분하다. 2개의 상동성 비동일 서열은 임의의 길이일 수 있으며, 이들의 비상동성 정도는 단일 뉴클레오타이드만큼 작거나(예를 들어, 표적화 상동성 재조합에 의한 게놈 점 돌연변이를 보정을 위해), 또는 10 kb 이상만큼 클 수 있다(예를 들어, 염색체 내의 미리 정해 놓은 이소성 자리(ectopic site)에 유전자를 삽입을 위해). 상동성 비동일 서열을 포함하는 2개의 폴리뉴클레오타이드는 길이가 동일할 필요는 없다. 예를 들어, 20개 내지 10,000개의 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 쌍의 외인성 폴리뉴클레오타이드(즉, 공여자 폴리뉴클레오타이드)가 사용될 수 있다.
핵산 및 아미노산 서열 동일성을 결정하기 위한 기술은 당업계에 공지되어 있다. 전형적으로 이러한 기술은 유전자에 대한 mRNA의 뉴클레오타이드 서열을 결정하는 단계 및/또는 이에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 결정하는 단계, 및 이러한 서열을 제2 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열과 비교하는 단계를 포함한다. 게놈 서열 역시 이러한 방식으로 결정되어 비교될 수 있다. 일반적으로, 동일성은 2개의 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드 서열 각각의 정확한 뉴클레오타이드-대-뉴클레오타이드 또는 아미노산-대-아미노산 대응을 말한다. 2개 이상의 서열(폴리뉴클레오타이드 또는 아미노산)은 그들의 동일성%를 측정함으로써 비교할 수 있다. 핵산 서열이든 아미노산 서열이든 간에 2개 서열의 동일성%는 2개의 배열된 서열 사이의 정확한 매치 수를 이들 중 짧은 서열의 길이로 나눈 후 100을 곱한 것이다.
대안으로, 폴리뉴클레오타이드 사이의 서열 유사성 정도는 상동성 영역 간 안정한 듀플렉스의 형성을 가능하게 하는 조건 하에서 폴리뉴클레오타이드를 혼성화한 후, 단일 가닥 특이적 뉴클레아제(들)로 소화 분해하여 상기 소화 분해된 단편의 크기를 측정함으로써 결정할 수 있다. 2개의 핵산, 또는 2개의 폴리펩타이드 서열은 이들 서열에 대해 상기 방법을 이용하여 측정했을 때 분자의 정해진 길이에 대하여 적어도 대략 70% 내지 75%, 바람직하게는 80% 내지 82%, 더 바람직하게는 85% 내지 90%, 더욱 더 바람직하게는 92%, 훨씬 더 바람직하게는 95%, 가장 바람직하게는 98%의 서열 동일성을 나타내는 경우에 서로 실질적으로 상동성이다. 본 명세서에서, 실질적으로 상동성이라는 것은 또한 명시된 DNA 또는 폴리펩타이드 서열과 완전한 동일성을 나타내는 서열을 말한다. 실질적으로 상동성인 DNA 서열은, 예를 들어, 특정 시스템에 대해 정의되는 바와 같은 엄중 조건 하에서의 서던 혼성화 실험으로 확인될 수 있다. 적합한 혼성화 조건을 규정하는 것은 해당 업계의 통상적인 기술에 속한다. 이에 대해서는, 예를 들어, 문헌[Sambrook et al., 상기와 동일]; [Nucleic Acid Hybridization : A Practical Approach, editors B.D. Hames and S.J. Higgins, (1985) Oxford; Washington, DC; IRL Press]을 참조할 수 있다.
2개의 핵산 단편의 선택적인 혼성화는 다음와 같이 결정할 수 있다. 2개의 핵산 분자 간의 서열 동일성 정도는 이들 분자 간의 혼성화 현상의 효율과 강도에 영향을 준다. 부분적으로 동일한 핵산 서열은 표적 분자와 완전하게 동일한 서열의 혼성화를 적어도 부분적으로는 억제할 것이다. 완전하게 동일한 서열의 혼성화의 억제는 해당 업계에 널리 공지된 혼성화 분석법(예를 들어, 서던(DNA) 블롯, 노던(RNA) 블롯, 용액 혼성화 등; 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Second Edition, (1989) Cold Spring Harbor, N.Y.] 참조)을 사용하여 평가될 수 있다. 이러한 분석은 다양한 정도의 선택성, 예를 들어, 낮은 엄격성 내지 높은 엄격성에 이르는 다양한 조건을 이용하여 수행될 수 있다. 낮은 엄격성의 조건이 사용되는 경우, 비특이적인 결합의 부재는 부분적인 정도의 서열 동일성조차도 결여된 2차 프로브(예를 들어, 표적 분자와 대략 30% 미만의 서열 동일성을 갖는 프로브)를 사용하여 평가될 수 있으며, 이로써 비특이적인 결합 현상의 부재 하에서 2차 프로브는 표적과 혼성화하지 않을 것이다.
혼성화-기반 검출 시스템을 이용할 때, 기준 핵산 서열에 상보적인 핵산 프로브를 선택한 후, 적절한 조건을 선택하여 상기 프로브와 상기 기준 서열을 서로 선택적으로 혼성화하거나 결합시켜 듀플렉스 분자를 형성한다. 중간 정도의 엄격성을 갖는 혼성화 조건 하에 기준 서열에 선택적으로 혼성화할 수 있는 핵산 분자는, 선택된 핵산 프로브의 서열과 적어도 약 70% 서열 동일성을 갖는 적어도 약 10 내지 14개의 뉴클레오타이드 길이의 표적 핵산 서열을 검출하도록 하는 조건 하에서 전형적으로 혼성화한다. 엄격한 혼성화 조건은 전형적으로 선택된 핵산 프로브의 서열과 약 90 내지 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 약 10 내지 14개 이상인 뉴클레오타이드 길이의 표적 핵산 서열을 검출하도록 한다. 프로브 및 기준 서열이 특정한 정도의 서열 동일성을 갖는 경우, 프로브/기준 서열 혼성화에 유용한 혼성화 조건은 해당 업계에 공지된 바와 같이 결정될 수 있다(예를 들어, 문헌[Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach, editors B.D. Hames and S.J. Higgins, (1985) Oxford; Washington, DC; IRL Press] 참조).
혼성화 조건은 당업자에게 잘 공지되어 있다. 혼성화 엄격성은, 혼성화 조건이 미스매치된 뉴클레오타이드를 함유하는 혼성의 형성을 꺼리는 정도를 말하며, 엄격성이 높을수록 미스매치 혼성에 대해 용인하는 정도(tolerance)가 낮은 상관 관계가 있다. 혼성화의 엄격성에 영향을 미치는 인자들은 당업자에게 널리 공지되어 있으며, 이에 제한되지는 않지만, 온도, pH, 이온 강도 및 예컨대, 포름아미드 및 다이메틸설폭사이드와 같은 유기 용매의 농도를 포함한다. 당업자에게 공지된 바와 같이, 혼성화 엄격성은 온도가 높을수록, 이온 강도가 낮을수록, 용매 농도가 낮을수록 증가된다.
혼성화를 위한 엄격성 조건에 대해, 특정한 엄격성을 확립하기 위해, 예를 들어 다음의 인자: 서열의 길이와 특성, 다양한 서열의 염기 조성, 염과 다른 혼성화 용액 성분의 농도, 혼성화 용액 중 차단제(예를 들어, 덱스트란 설페이트 및 폴리에틸렌 글라이콜)의 존재 또는 부재, 혼성화 반응 온도 및 시간 변수뿐만 아니라 세척 조건을 변화시킴으로써, 수많은 동등한 조건이 이용된 수 있다는 것은 당업계에 공지되어 있다. 특정 세트의 혼성화 조건의 선택은 해당 업계의 표준 방법을 따라 선택된다(예를 들어, 문헌[Sambrook, et al., Molecular Cloning : A Laboratory Manual . Second Edition, (1989) Cold Spring Harbor, N.Y.] 참조).
"재조합"은 두 폴리뉴클레오타이드 사이에 유전 정보가 교환되는 과정을 말한다. 본 개시 내용의 목적을 위해, "상동성 재조합(homologous recombination, HR)"은, 예를 들어 상동성 지향 복구 메커니즘을 통해 세포 내에서 이중 가닥 파손을 복구하는 동안 일어나는 이러한 교환의 특수화된 형태를 말한다. 이러한 과정은 뉴클레오타이드 서열 상동성이 필요하고, "표적" 분자(즉, 이중 가닥 절단을 거친 분자)의 주형 복구에 "공여자" 분자를 이용하며, "비교차성(noncrossover) 유전자 전환" 또는 "숏 트랙(short tract) 유전자 전환"으로서 다양하게 알려져 있는데, 이는 공여자로부터 표적으로의 유전 정보의 전달을 야기하기 때문이다. 임의의 특정 이론에 구속되지 않고, 이러한 전달은, 파손된 표적과 공여자 사이에 형성되는 헤테로듀플렉스(heteroduplex) DNA의 미스매치 보정, 및/또는 공여자를 이용하여 표적의 일부가 될 유전자 정보를 재합성하는 "합성 의존적 가닥 어닐링(synthesis-dependent strand annealing)", 및/또는 관련 공정들을 수반할 수 있다. 이러한 특수화된 HR은 종종 표적 분자 서열의 변경을 초래하며 해당 공여자 폴리뉴클레오타이드 서열의 일부 또는 모두는 표적 폴리뉴클레오타이드 내로 도입된다.
본 명세서의 방법에서, 본 명세서에 설명된 하나 이상의 표적화된 뉴클레아제는 표적 서열(예를 들어, 세포 염색질) 내의 미리 결정해 놓은 자리에서 이중 가닥 파손을 만들며, 이 파손 영역 내의 뉴클레오타이드 서열과 상동성을 보유하는 "공여자" 폴리뉴클레오타이드는 세포 내로 도입될 수 있다. 이중 가닥 절단의 존재는 공여자 서열의 통합을 용이하게 하는 것으로 나타났다. 공여자 서열은 물리적으로 통합될 수 있고, 또는 대안으로 공여자 폴리뉴클레오타이드는 상동성 재조합을 통해 절단 복구를 위한 주형으로 사용되어, 공여자와 같이 뉴클레오타이드 서열의 모두 또는 일부를 세포 염색질 내로 도입하는 것을 초래한다. 이렇게 하여, 세포 염색질 내 제1 서열이 변형될 수 있으며, 특정 실시형태에서, 공여자 폴리뉴클레오타이드 내에 존재하는 서열로 전환될 수 있다. 따라서, 용어 "치환하다" 또는 "치환"의 사용은, 하나의 뉴클레오타이드 서열을 다른 뉴클레오타이드 서열로 치환(즉, 정보적 센스에서 서열의 치환)하는 것을 나타내는 것으로 이해될 수 있으며, 하나의 폴리뉴클레오타이드의 다른 것으로 물리적 또는 화학적 치환을 반드시 필요로 하지는 않는다.
본 명세서에서 설명되는 어떤 방법에서, 추가적인 쌍의 아연 핑거 단백질이 세포 내 추가적인 표적 자리의 추가적인 이중 가닥 절단을 위해 사용될 수 있다.
세포 염색질 내 관심의 영역에서 서열의 표적화된 재조합 및/또는 치환 및/또는 변형을 위한 방법의 특정 실시형태에서, 염색체 서열은 외인성 "공여자" 뉴클레오타이드 서열에 의한 상동성 재조합에 의해 변경된다. 파손 영역에 서열 상동성이 존재한다면, 이러한 상동성 재조합은 세포의 염색질 내 이중 가닥 파손의 존재에 의해 자극된다.
본 명세서에 기술된 임의의 방법에서, 상기 제1 뉴클레오타이드 서열("공여자 서열")은 관심 대상 영역 내의 게놈 서열과 상동성이지만 동일하지 않은 서열을 포함하여, 이로써 상동성 재조합을 자극하여 관심 대상 영역 내에 비동일 서열을 삽입할 수 있다. 따라서, 특정 실시형태에서, 관심 영역 내 서열과 상동성인 공여자 서열은 치환된 게놈 서열과 약 80 내지 99%(또는 이 범위 내의 임의의 정수 값)의 서열 동일성을 나타낸다. 다른 실시형태에서, 공여자 서열과 게놈 서열 간의 상동성은 99%를 초과하며, 예를 들어, 100개 이상의 인접한 염기쌍의 공여자 서열과 게놈 서열 간에 있어서, 단 1개의 뉴클레오타이드만이 상이하다. 어떤 경우에, 공여자 서열의 비상동성 부분은 관심 대상 영역 내에 존재하지 않는 서열을 포함할 수 있어, 새로운 서열이 관심의 영역 내로 도입되게 된다. 이러한 경우, 상기 비상동성 서열은 일반적으로 관심 대상 영역 내의 서열과 상동성이거나 동일한, 50 내지 1,000개의 염기쌍(또는 이 범위 내의 임의의 정수 값) 또는 1,000개 초과의 임의 수의 염기쌍의 서열 옆에 있다. 다른 실시형태에서, 공여자 서열은 상기 제1 서열에 대해 비상동성이며, 비상동성 재조합 메커니즘에 의해 게놈 내로 삽입된다.
본 명세서에 설명된 임의의 방법은 관심의 유전자(들)의 발현을 방해하는 공여자 서열의 표적화된 통합에 의해 세포 내 하나 이상의 표적 서열의 부분적 또는 완전한 불활성화를 위해 사용될 수 있다. 부분적으로 또는 완전히 불활성화된 유전자를 갖는 세포주가 또한 제공된다.
더 나아가, 본 명세서에 설명된 바와 같은 표적화 통합 방법은 하나 이상의 외인성 서열을 통합하기 위해 사용될 수 있다. 외인성 핵산 서열은, 예를 들어 하나 이상의 유전자 또는 cDNA 분자, 또는 임의의 유형의 암호화 또는 비암호화 서열뿐만 아니라 하나 이상의 제어 요소(예를 들어, 프로모터)를 포함할 수 있다. 추가로, 외인성 핵산 서열은 하나 이상의 RNA 분자(예를 들어, 작은 헤어핀 RNA(shRNA), 억제성 RNA(RNAi), 마이크로RNA(miRNA) 등)를 생성할 수 있다.
"절단"은 DNA 분자의 공유 백본의 파손을 말한다. 절단은, 이에 제한되는 것은 아니지만, 포스포다이에스터 결합의 효소적 또는 화학적 가수분해를 포함하는 다양한 방법에 의해 개시될 수 있다. 단일 가닥 절단과 이중 가닥 절단이 둘다 가능하며, 이중 가닥 절단은 2가지의 별개의 단일 가닥 절단 현상의 결과로써 일어날 수 있다. DNA 절단은 블런트(blunt) 말단 또는 엇갈린(staggered) 말단 중 하나의 생성을 초래할 수 있다. 특정 실시형태에서, 융합 폴리펩타이드는 표적화된 이중 가닥 DNA 절단을 위해 사용된다.
"절단 절반 도메인"은 제2 폴리펩타이드(동일 또는 상이함)와 함께 절단 활성(바람직하게 이중 가닥 절단 활성)을 갖는 복합체를 형성하는 폴리펩타이드 서열이다. 용어 "제1 및 제2 절단 절반 도메인", "+ 및 - 절단 절반 도메인" 및 "우측 및 좌측 절단 절반 도메인"은 이합체화되는 절단 절반 도메인 쌍을 말하며, 상호 호환적으로 사용된다.
"유전자조작된 절단 절반 도메인"은 다른 절단 절반 도메인(예를 들어, 유전자조작된 다른 절단 절반 도메인)과 절대 이종 이합체를 형성하도록 변형된 절단 절반 도메인이다. 또한, 이에 대해서는, 미국특허공보 제2005/0064474호; 제2007/0218528호 및 제2008/0131962호를 참조할 수 있으며, 이들은 그 전문이 본 명세서에 참조로 포함된다.
"염색질"은 세포 게놈을 포함하는 핵단백질 구조물이다. 세포 염색질은 핵산, 주로 DNA, 및 히스톤과 비-히스톤 염색체 단백질을 포함하는 단백질을 포함한다. 대부분의 진핵 세포 염색질은 뉴클레오솜의 형태로 존재하되, 뉴클레오솜 코어는 히스톤 H2A, H2B, H3 및 H4를 각각 2개씩 포함하는 옥타머와 결합된 대략 150개 염기쌍의 DNA를 포함하며; 링커 DNA(유기체에 따라 길이가 가변적)는 뉴클레오솜 코어 사이에서 연장된다. 히스톤 H1의 분자는 일반적으로 링커 DNA에 결합된다. 본 명세서의 목적을 위해, 용어 "염색질"은 모든 유형의 세포성 핵단백질(원핵생물과 진핵생물 모두)을 포함하는 것을 의미한다. 세포 염색질은 염색체 염색질과 에피솜 염색질을 둘다 포함한다.
"염색체"는 세포 게놈의 전체 또는 일부를 포함하는 염색질 복합체이다. 세포의 게놈은 종종 세포의 게놈을 포함하는 모든 염색체의 집합인, 그것의 핵형(karyotype)을 특징으로 한다. 세포의 게놈은 하나 이상의 염색체를 포함할 수 있다.
"에피솜"은 세포의 염색체 핵형의 부분이 아닌 핵산을 포함하는 복제성 핵산, 핵단백질 복합체 또는 기타 구조물이다. 에피솜의 예는 플라스미드 및 특정 바이러스 게놈을 포함한다.
"표적 자리" 또는 "표적 서열"은 결합 분자가 결합할 핵산의 일부를 한정하는 핵산 서열이며, 단, 결합을 위한 충분 조건이 존재한다. 부분을 나타내는 핵산 서열이다. 예를 들어, 서열 5'-GAATTC-3'은 Eco RI 제한 엔도뉴클레아제에 대한 표적 자리이다.
"외인성" 분자는 보통은 세포에 존재하지 않지만 하나 이상의 유전학적, 생화학적 또는 기타 방법에 의해 세포 내로 도입될 수 있는 분자이다. "세포 내에서 보통 존재"는 세포의 특정 발달 단계 및 환경 조건에 대하여 결정된다. 따라서, 예를 들어, 단지 근육의 배아 발달 동안 존재하는 분자는 성인 근육 세포에 대해서는 외인성 분자이다. 유사하게, 열 충격에 의해 유발된 분자는 열 충격을 받지 않은 세포에 대해서는 외인성 분자이다. 외인성 분자는 예를 들어, 기능 부전 내인성 분자의 기능성 형태 또는 정상적으로 기능하는 내인성 분자의 기능 부전성 형태를 포함할 수 있다. 또한, 외인성 분자는 다른 종에서 보통 발견되는 분자, 예를 들어, 동물의 게놈 내에 도입된 인간 서열일 수 있다.
특히, 외인성 분자는 소분자, 예컨대, 조합 화학 공정에 의해 만들어진 소분자, 또는 거대 분자, 예컨대, 단백질, 핵산, 탄수화물, 지질, 당단백질, 지단백질, 다당류, 상기 분자들의 임의 변형 유도체, 또는 상기 분자들 중 하나 이상을 포함하는 임의의 복합체일 수 있다. 핵산은 DNA 및 RNA를 포함하며, 이는 단일- 또는 이중 가닥일 수 있고, 선형, 분지형 또는 고리형일 수 있으며, 임의의 길이를 가질 수 있다. 핵산은 듀플렉스를 형성할 수 있는 것뿐만 아니라 트리플렉스(triplex)- 형성 핵산을 포함한다. 이에 대해서는, 예를 들어, 미국특허 제5,176,996호 및 제5,422,251호를 참조할 수 있다. 단백질은, 이에 제한되는 것은 아니지만, DNA-결합 단백질, 전사 인자, 염색질 리모델링 인자, 메틸화 DNA 결합 단백질, 폴리머라제, 메틸라제, 데메틸라제, 아세틸라제, 데아세틸라제, 키나제, 포스파타아제, 인테그라제, 리콤비나제, 리가제, 토포이소머라제, 자이라제 및 헬리카제를 포함한다.
외인성 분자는 내인성 분자와 동일한 유형의 분자, 예를 들어, 외인성 단백질 또는 핵산일 수 있다. 예를 들어, 외인성 핵산은 감염성 바이러스 게놈, 세포 내로 도입된 플라스미드 또는 에피솜, 또는 세포 내에 보통은 존재하지 않는 염색체를 포함할 수 있다. 외인성 분자를 세포 내로 도입하는 방법은 당업자에게 공지되어 있는데, 이에 제한되는 것은 아니지만, 지질 매개 전달(즉, 중성 및 양이온성 지질을 포함하는 리포솜), 전기천공, 직접 주입, 세포 융합, 유전자총(particle bombardment), 인산칼슘 동시침전, DEAE-덱스트란 매개 전달 및 바이러스 벡터 매개형 전달을 포함한다.
대조적으로, "내인성" 분자는 특정 환경 조건 하의 특정 성장 단계에서 특정 세포 내에 정상적으로 존재하는 분자이다. 예를 들어, 내인성 핵산은 염색체, 미토콘드리아, 엽록체 또는 다른 세포 소기관의 게놈, 또는 자연적으로 발생하는 에피솜 핵산을 포함할 수 있다. 추가의 내인성 분자는 단백질, 예를 들어 전사 인자 및 효소를 포함할 수 있다.
"융합" 분자는 2개 이상의 소단위 분자가, 바람직하게는 공유적으로 연결된 분자이다. 소단위 분자는 동일한 화학적 유형의 분자이거나, 또는 상이한 화학적 유형의 분자일 수 있다. 첫 번째 유형의 융합 분자의 예는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 융합 단백질(예를 들어, ZFP DNA-결합 도메인과 절단 도메인 사이의 융합체) 및 융합 핵산(예를 들어, 상기에서 기술된 융합 단백질을 암호화하는 핵산)을 포함한다. 두 번째 유형의 융합 분자의 예는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 트리플렉스-형성 핵산과 폴리펩타이드 사이의 융합체, 및 좁은 그루브(minor groove) 결합제와 핵산 사이의 융합체를 포함한다.
세포 내에서 융합 단백질의 발현은, 해당 융합 단백질을 해당 세포에 전달함으로써, 또는 이러한 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 세포에 전달함으로써 생길 수 있되, 상기 폴리뉴클레오타이드는 전사되고, 해당 전사체가 번역되어 융합 단백질이 생성된다. 트랜스-스플라이싱(trans-splicing), 폴리펩타이드 절단 및 폴리펩타이드 결찰이 또한 세포 내 단백질의 발현에 수반될 수 있다. 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드를 세포에 전달하는 방법은 본 명세서의 다른 곳에서 제시된다.
본 명세서의 목적을 위해, "유전자"는 유전자 산물(하기 참조)을 암호화하는 DNA 영역뿐만 아니라, 유전자 산물의 생성을 조절하는 모든 DNA 영역을, 이러한 조절 서열이 암호화 서열 및/또는 전사된 서열에 인접하는지 여부에 상관없이 포함한다. 따라서, 유전자는, 이에 반드시 제한되는 것은 아니지만, 프로모터 서열, 종결자, 번역 조절 서열, 예컨대, 리보솜 결합 자리 및 내부 리보솜 도입 자리, 인핸서, 사일런서(silencer), 격리자(insulator), 경계 성분, 복제 원점, 매트릭스 부착 자리 및 유전자 좌위 제어 영역이 포함된다.
"유전자 발현"은 유전자에 포함된 정보가 유전자 산물로 전환되는 것을 말한다. 유전자 산물은 유전자의 직접 전사 산물(예를 들어, mRNA, tRNA, rRNA, 안티센스 RNA, 리보자임, 구조 RNA 또는 다른 임의 유형의 RNA), 또는 mRNA의 번역에 의해 생성된 단백질일 수 있다. 유전자 산물은 또한 캡핑, 폴리아데닐화, 메틸화 및 편집과 같은 과정에 의해 변형된 RNA, 및 예를 들어 메틸화, 아세틸화, 인산화, 유비퀴틴화, ADP-리보실화, 미리스틸화 및 글라이코실화에 의해 변형된 단백질을 포함한다.
유전자 발현의 "조절"은 유전자 활성의 변화를 지칭한다. 발현의 조절은, 이에 제한되는 것은 아니지만, 유전자 활성화 및 유전자 억제를 포함할 수 있다. 게놈 편집(예를 들어, 절단, 변경, 불활성화, 무작위 돌연변이 유발)이 발현을 조절하는데 사용될 수 있다. 유전자 불활성화는 본 명세서에서 설명되는 것과 같은 ZFP를 포함하지 않는 세포에 비하여 유전자 발현이 조금이라도 감소된 것을 말한다. 따라서, 유전자 불활성화는 부분적일 수도 있고 또는 완전할 수도 있다.
"관심 영역"은 외인성 분자에 결합하는 것이 바람직한 세포 염색질의 임의의 영역, 예를 들어, 유전자 또는 유전자 내부 혹은 유전자에 인접한 비암호화 서열이다. 결합은 표적화된 DNA 절단 및/또는 표적화된 재조합을 목적으로 할 수 있다. 관심 영역은, 예를 들어 염색체, 에피솜, 세포 소기관 게놈(예를 들어, 미토콘드리아, 엽록체), 또는 감염성 바이러스 게놈 내에 존재할 수 있다. 관심의 영역은 유전자의 암호화 영역 내에, 전사된 비암호화 영역, 예를 들면, 리더 서열, 트레일러 서열 또는 인트론 내에, 또는 암호화 영역의 상류 또는 하류의 비전사 영역 내에 존재할 수 있다. 관심 영역은 그 길이가 단일 뉴클레오타이드 쌍만큼 짧거나, 또는 2,000개까지의 뉴클레오타이드 쌍이거나, 또는 임의 정수 값의 뉴클레오타이드 쌍일 수 있다.
용어 "작동가능한 연결" 및 "작동가능하게 연결된" (또는 "작동할 수 있도록 연결된")은 2개 이상의 성분(예를 들어, 서열 구성요소)의 병렬 배치에 관하여 상호호환적으로 사용되며, 여기서 해당 성분은 성분들이 둘다 정상적으로 작용하고 적어도 하나의 성분이 적어도 하나의 다른 성분에 의해 발휘되는 기능을 매개할 수 있도록 배열된다. 예로써, 전사 조절 서열이 하나 이상의 전사 조절 인자의 존재 또는 부재에 응하여 암호화 서열의 전사 수준을 제어한다면, 프로모터와 같은 전사 조절 서열은 암호화 서열에 작동가능하게 연결된다. 전사 조절 서열은 일반적으로 암호화 서열과 시스(cis) 형태로 작동가능하게 연결되지만, 그것에 직접적으로 인접할 필요는 없다. 예를 들어, 인핸서는 암호화 서열과 근접하지 않는 경우에도, 암호화 서열에 작동가능하게 연결되는 전사 조절 서열이다.
융합 폴리펩타이드에 관하여, 용어 "작동가능하게 연결된"은, 각 성분이 서로 다른 성분에 연결되어 이렇게 연결되지 않았다면 수행할 기능과 동일한 기능을 수행한다는 사실을 의미할 수 있다. 예를 들어, ZFP DNA-결합 도메인이 절단 도메인에 융합된 융합 폴리펩타이드에 관하여, 융합 폴리펩타이드 내에서 ZFP DNA-결합 도메인 일부가 이의 표적 자리 및/또는 이의 결합 자리에 결합할 수 있는 한편 절단 도메인이 표적 자리의 근처에서 DNA를 절단할 수 있다고 한다면, ZFP DNA-결합 도메인과 절단 도메인은 작동가능하게 연결되어 있다.
단백질, 폴리펩타이드 또는 핵산의 "기능적 단편"은 서열이 전장 단백질, 폴리펩타이드 또는 핵산과 동일하지는 않지만 전장 단백질, 폴리펩타이드 또는 핵산과 동일한 기능을 보유하는 단백질, 폴리펩타이드 또는 핵산을 말한다. 기능적 단편은 그에 상응하는 천연 분자보다 많거나, 적거나 또는 그와 동일한 수의 잔기를 보유할 수 있고 및/또는 하나 이상의 아미노산 또는 뉴클레오타이드 치환을 함유할 수 있다. 핵산의 기능(예를 들어, 암호화 기능, 다른 핵산에 혼성화하는 능력)을 측정하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 유사하게, 단백질의 기능을 결정하는 방법도 잘 알려져 있다. 예를 들어, 폴리펩타이드의 DNA-결합 기능은 예컨대, 필터-결합, 전기영동 이동도-변화, 또는 면역침전 분석법에 의해 측정할 수 있다. DNA 절단은 젤 전기영동으로 분석할 수 있다. 이에 대해서는, 문헌[Ausubel et al., 상기와 동일]을 참조할 수 있다. 다른 단백질과 상호작용하는 한 단백질의 능력은 예를 들어, 공동-면역침전, 2-혼성 분석법 또는 상보성 분석법, 유전학적 및 생화학적 둘 다로 측정할 수 있다. 이에 대해서는, 예를 들어, 문헌[Fields et al., (1989) Nature 340:245-246]; 미국특허 제5,585,245호; 및 PCT 제WO 98/44350호를 참조할 수 있다.
아연 핑거 뉴클레아제
본 명세서에서 하나 이상의 로사 유전자의 게놈 편집(예를 들어, 절단, 변형, 불활성화 및/또는 무작위 돌연변이 유발)을 위해 사용될 수 있는 아연 핑거 뉴클레아제(ZFN)가 설명된다. ZFN은 아연 핑거 단백질(ZFP)과 뉴클레아제(절단) 도메인(예를 들어, 절단 절반 도메인)을 포함한다.
A. 아연 핑거 단백질
아연 핑거 결합 도메인은 선택한 서열에 결합을 위해 유전자조작될 수 있다. 이에 대해서는, 예를 들어, 문헌[Beerli et al ., (2002) Nature Biotechnol. 20:135-141]; [Pabo et al ., (2001) Ann . Rev . Biochem . 70:313-340; Isalan et al., (2001) Nature Biotechnol . 19:656-660; Segal et al ., (2001) Curr . Opin . Biotechnol. 12:632-637; Choo et al ., (2000) Curr . Opin . Struct . Biol. 10:411-416]을 참조할 수 있다. 유전자조작된 아연 핑거 결합 도메인은 자연적으로 발생하는 아연 핑거 단백질에 비해 신규한 결합 특이성을 가질 수 있다. 조작 방법은, 이에 제한되는 것은 아니지만, 합리적 설계와 다양한 유형의 선별이 포함된다. 합리적 설계는 예를 들어, 삼중(또는 사중) 뉴클레오타이드 서열과 각 개별 아연 핑거 아미노산 서열을 포함하는 데이터베이스를 이용하는 방법을 포함하는데, 이때 각각의 삼중 또는 사중 뉴클레오타이드 서열은 특정한 삼중 또는 사중 서열에 결합하는 아연 핑거의 하나 이상의 아미노산 서열과 관련이 있다. 이에 대해서는, 예를 들어, 공동소유의 미국특허 제6,453,242호 및 제6,534,261호를 참조할 수 있으며, 이는 본 명세서에 전문이 참조로 포함된다.
파지 디스플레이 및 2-혼성 시스템을 포함하는 대표적인 선별 방법은 미국특허 제5,789,538호; 제5,925,523호; 제6,007,988호; 제6,013,453호; 제6,410,248호; 제6,140,466호; 제6,200,759호; 및 제6,242,568호; 그리고 제WO 98/37186호; 제WO 98/53057호; 제WO 00/27878호; 제WO 01/88197호; 및 GB 제2,338,237호에 개시되어 있다. 추가로, 아연 핑거 결합 도메인에 대한 결합 특이성의 강화는, 예를 들어, 공동소유된 WO 02/077227에서 설명되었다.
표적 자리의 선별; ZFP 및 융합 단백질(및 이들을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드)의 설계와 구축을 위한 방법은 당업자에게 공지되어 있으며, 미국 출원 공개 제20050064474호 및 제20060188987호에서 상세하게 설명되고, 이들은 그들의 전문이 본 명세서에 참조로 포함된다.
추가로, 이들 및 다른 참고문헌에서 개시된 바와 같이, 아연 핑거 도메인 및/또는 멀티-핑거화된 아연 핑거 단백질은, 예를 들어 5개 이상의 아미노산 길이를 갖는 링커(예를 들어, TGEKP(서열번호 1), TGGQRP(서열번호 2), TGQKP(서열번호 3) 및/또는 TGSQKP(서열번호 4))를 포함하는 임의의 적합한 링커 서열을 사용하여 함께 연결될 수 있다. 또한 6개 이상의 아미노산 길이를 갖는 예시적인 링커 서열에 대해서는, 미국특허 제6,479,626호; 제6,903,185호 및 제7,153,949호를 참조할 수 있다. 본 명세서에 설명된 단백질은 단백질의 개개 아연 핑거 사이에 적합한 링커의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
이하에 설명하는 바와 같이, 특정 실시형태에서, 4개, 5개 또는 6개의 핑거 결합 도메인은 절단 절반 도메인, 예컨대, FokI와 같은 IIS형 제한 엔도뉴클레아제의 절단 도메인에 융합된다. 이러한 아연 핑거/뉴클레아제 절반 도메인 융합체의 하나 이상의 쌍은, 예컨대 미국 특허 공개 제20050064474호에 개시된 바와 같은 표적화된 절단을 위해 사용된다.
표적화 절단을 위해, 결합 자리의 인접 가장자리는 5개 이상의 뉴클레오타이드 쌍에 의해 분리될 수 있고, 각 융합 단백질은 DNA 표적의 맞은편 가닥에 결합할 수 있다. 모든 쌍별 조합이 로사 유전자의 표적화된 절단을 위해 사용될 수 있다. 본 명세서에 따라서, ZFN은 동물의 게놈 내 임의의 서열에 대해 표적화될 수 있다.
일부 실시형태에서, DNA 결합 도메인은 식물 병원체인 산토모나스 속 (Xanthomonas)에서 유래된 TAL 효과기의 유전자조작된 도메인이다(문헌[Boch et al, (2009) Science 326: 1509-1512 및 Moscou and Bogdanove, (2009) Science326: 1501] 참조).
B. 절단 도메인
ZFN은 또한 뉴클레아제(절단 도메인, 절단 절반 도메인)를 포함한다. 본 발명에 개시된 융합 단백질의 절단 도메인 일부는 임의의 엔도뉴클레아제 또는 엑소뉴클레아제로부터 얻어질 수 있다. 절단 도메인이 유래될 수 있는 예시적인 엔도뉴클레아제는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 제한 엔도뉴클레아제 및 호밍 엔도뉴클레아제를 포함한다. 예를 들어, 미국 메사추세츠주 베벌리 소재의 New England Biolabs, 2002-2003 카탈로그; 문헌[Belfort et al., (1997) Nucleic Acids Res . 25:3379-3388]을 참조한다. DNA를 절단하는 추가의 효소는 공지되어 있다(예를 들어, S1 뉴클레아제; 녹두 뉴클레아제; 췌장 DNase I; 마이크로코커스 뉴클레아제; 효모 HO 엔도뉴클레아제; 문헌[Linn et al ., (eds.) Nucleases , Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1993]을 또한 참조할 수 있다). 이러한 효소들(또는 이들의 기능적 단편들) 중에서 하나 이상의 효소들은 절단 도메인과 절단 절반 도메인의 공급원으로서 사용될 수 있다.
유사하게, 절단 절반 도메인은 절단 활성을 위해 이합체화를 필요로 하는 상기 열거한 임의의 뉴클레아제 또는 이것의 일부로부터 유래될 수 있다. 일반적으로, 융합 단백질이 절단 절반 도메인을 포함하는 경우에는, 절단을 위하여 2개의 융합 단백질이 필요하다. 대안으로, 2개의 절단 절반 도메인을 포함하는 단일 단백질이 사용될 수 있다. 2개의 절단 절반 도메인은 동일한 엔도뉴클레아제(또는 이의 기능적 단편)로부터 유래될 수 있고, 또는 각각의 절단 절반 도메인은 상이한 엔도뉴클레아제(또는 이의 기능적 단편)로부터 유래될 수 있다. 추가로, 두 융합 단백질에 대한 표적 자리는 바람직하게는 서로에 대해 배치되며, 두 융합 단백질의 각 표적 자리에 대한 결합은 절단 절반 도메인이, 예를 들어 이합체화에 의해 기능성 절단 도메인을 형성하도록 하는 서로에 대한 공간 배향으로 절단 절반 도메인을 위치시킨다. 따라서, 특정 실시형태에서, 표적 자리의 인접 가장자리는 5 내지 8개 뉴클레오타이드 또는 15 내지 18개 뉴클레오타이드에 의해서 분리된다. 그러나, 임의 정수 값의 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 쌍(예를 들어, 2개 내지 50개의 뉴클레오타이드 또는 그 이상)이 두 표적 자리 사이에 개입할 수 있다. 일반적으로, 절단 자리는 표적 자리 사이에 놓인다.
제한 엔도뉴클레아제(제한 효소)는 다수의 종에 존재하며, DNA에(인식 자리에서) 서열 특이적으로 결합할 수 있고, 결합 자리에서 또는 결합 자리 근처에서 DNA를 절단할 수 있다. 특정 제한 효소(예를 들어, IIS형)는 인식 자리로부터 떨어진 자리에서 DNA를 절단하며, 분리가능한 결합 도메인과 절단 도메인을 보유한다. 예를 들어, IIS형 효소 FokI는 한쪽 가닥에서 인식 자리로부터 9개 뉴클레오타이드, 및 나머지 한 가닥에서 인식 자리로부터 13개 뉴클레오타이드로 DNA의 이중 가닥 절단을 촉매시킨다. 이에 대해서는, 예를 들어, 미국등록특허 제5,356,802호; 제5,436,150호 및 제5,487,994호뿐만 아니라 문헌[Li et al ., (1992) Proc . Natl . Acad. Sci . USA 89:4275-4279; Li et al ., (1993) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 90:2764-2768; Kim et al., (1994a) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 91:883-887; Kim et al ., (1994b) J. Biol . Chem . 269:31,978-31,982]을 참조할 수 있다. 따라서, 한 실시형태에서, 융합 단백질은 적어도 하나의 IIS형 제한 효소의 절단 도메인 (또는 절단 절반 도메인) 및 유전자조작된 또는 유전자조작되지 않은 하나 이상의 아연 핑거 결합 도메인을 포함한다.
절단 도메인을 결합 도메인으로부터 분리가능한 예시적인 IIS형 제한 효소는 FokI이다. 이러한 특정 효소는 이합체로서 활성을 나타낸다. 이에 대해서는, 문헌[Bitinaite et al ., (1998) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 95:10,570-10,575]을 참조할 수 있다. 따라서, 본 발명의 개시 내용의 목적상, 개시된 융합 단백질에 사용된 FokI 효소의 일부분은 절단 절반 도메인으로 간주된다. 이에 따라, 아연 핑거-FokI 융합체를 이용한 표적화 이중 가닥 절단 및/또는 세포 서열의 표적화 치환에 있어서, 각각 FokI 절단 절반 도메인을 포함하는 두 융합 단백질을 사용하여 촉매적 활성 절단 도메인을 재구축할 수 있다. 대안으로, 아연 핑거 결합 도메인과 2개의 FokI 절단 절반 도메인을 함유하는 단일 폴리펩타이드 분자따 또한 사용될 수 있다. 아연 핑거-FokI 융합체를 이용한 표적화 절단과 표적화 서열 변경을 위한 변수는 본 명세서의 다른 곳에서 제공된다.
절단 도메인 또는 절단 절반 도메인은, 절단 활성을 보유하거나, 또는 기능성 절단 도메인을 형성하기 위해 다합체화(예를 들어, 이합체화)하는 능력을 보유하는 단백질의 임의의 일부일 수 있다.
예시적인 IIS형 제한 효소에 대해서는 국제특허 WO 07/014275에서 설명되며, 본 명세서에 전문이 포함된다. 추가적인 제한 효소는 또한 분리가능한 결합 도메인과 절단 도메인을 포함하며, 이들은 본 발명에 의해 고려된다. 이에 대해서는, 예를 들어, 문헌[Roberts et al., (2003) Nucleic Acids Res. 31:418-420]을 참조할 수 있다.
특정 실시형태에서, 절단 도메인은, 예를 들어 모든 개시가 본 명세서에 전문이 참조로 포함된 미국특허공보 제20050064474호; 제20060188987호 및 제20080131962호에서 설명된 바와 같이, 동종 이합체화를 최소화시키거나 방지하는 하나 이상의 조작된 절단 절반 도메인(또한 이합체화 도메인 돌연변이체로 언급됨)이 포함된다. FokI의 446, 447, 479, 483, 484, 486, 487, 490, 491, 496, 498, 499, 500, 531, 534, 537 및 538번 위치의 아미노산 잔기는 FokI 절단 절반 도메인의 이합체화에 영향을 미치기 위한 모든 표적이다.
절대 이종이합체를 형성하는 FokI의 예시적인 유전자조작된 절단 절반 도메인은, 첫 번째 절단 절반 도메인이 FokI의 490번과 538번 위치의 아미노산 잔기에서 돌연변이를 포함하고, 두 번째 절단 절반 도메인이 486번과 499번 위치의 아미노산 잔기에서 돌연변이를 포함하는 한 쌍을 포함한다.
따라서, 한 실시형태에서, 490번 위치의 돌연변이에서는 Glu(E)를 Lys(K)로 치환하고; 538번 위치의 돌연변이에서는 Iso(I)를 Lys(K)로 치환하며; 486번 위치의 돌연변이에서는 Gln(Q)를 Glu(E)로 치환하고; 499번 위치의 돌연변이에서는 Iso(I)를 Lys(K)로 치환한다. 구체적으로, 본 명세서에 설명된 유전자조작된 절단 절반 도메인은, 한쪽의 절단 절반 도메인에서는 490번 (E→K)과 538번 (I→K) 위치에 돌연변이를 유발시켜 "E490K:I538K"로 명명된 유전자조작된 절단 절반 도메인을 생성하고, 다른 한쪽의 절단 절반 도메인에서는 위치 486번(Q→E)과 499번(I→L) 위치에 돌연변이를 유발시켜 "Q486E:I499L"로 명명된 유전자조작된 절단 절반 도메인을 생성시켜 제조하였다. 본 발명에 기술된 유전자조작된 절단 절반 도메인은 비정상적인 절단이 최소화되거나 제거되는 절대 이종이합체 돌연변이체이다. 이에 대해서는, 예를 들어, 제WO 07/139898호의 실시예 1을 참조할 수 있다. 특정 실시형태에서, 유전자조작된 절단 절반 도메인은 위치 486, 499 및 496(야생형 FokI에 대해 넘버링됨)에서, 예를 들어 위치 486에서 야생형 Gln(Q) 잔기가 Glu(E) 잔기로, 위치 499에서 야생형 Iso(I) 잔기가 Leu(L) 잔기로, 위치 496에서 야생형 Asn(N) 잔기가 Asp(D) 또는 Glu(E) 잔기로 치환되는(또한 각각 “ELD” 및 “ELE”도메인으로 언급됨) 돌연변이를 포함한다. 다른 실시형태에서, 유전자조작된 절단 절반 도메인은 위치 490, 538 및 537(야생형 FokI에 대해 넘버링됨)에서, 예를 들어 위치 490에서 야생형 Glu(E) 잔기가 Lys(K) 잔기로, 위치 538에서 야생형 Iso(I) 잔기가 Lys(K) 잔기로, 위치 537에서 야생형 His(H) 잔기가 Lys(K) 또는 Arg(R) 잔기로 치환되는(또한 각각 “KKK” 및 “KKR” 도메인으로 언급됨) 돌연변이를 포함한다. 다른 실시형태에서, 유전자조작된 절단 절반 도메인은 위치 490 및 537(야생형 FokI에 대해 넘버링됨)에서, 예를 들어 위치 490에서 야생형 Glu(E) 잔기가 Lys(K) 잔기로, 위치 537에서 야생형 His(H) 잔기가 Lys(K) 잔기 또는 Arg(R) 잔기로 치환되는(또한 각각 “KIK” 및 “KIR”도메인으로 언급됨) 돌연변이를 포함한다(미국출원 제12/931,660호 참조).
본 명세서에 설명된 유전자조작된 절단 절반 도메인은 임의의 적절한 방법, 예를 들어, 미국특허공보 제20050064474호에 설명된 바와 같은 야생형 절단 절반 도메인 (FokI)의 특정 자리 돌연변이 유발법을 사용하여 제조될 수 있다.
C. 표적화된 절단을 위한 추가 방법
임의의 로사 유전자(들) 내에 표적 자리를 가지는 임의의 뉴클레아제는 본 명세서에 개시된 방법에 사용될 수 있다. 예를 들어, 호밍 엔도뉴클레아제 및 메가뉴클레아제는 매우 긴 인식 서열을 가지는데, 이들 중 일부는 통계를 기초로 할 때 인간형 크기의 게놈 내에 한번 존재할 가능성이 있다. 로사 유전자 내에 표적 자리를 가자는 임의의 이러한 뉴클레아제는 표적화된 절단을 위해서 아연 핑거 뉴클레아제 대신에, 또는 아연 핑거 뉴클레아제에 추가로 사용될 수 있다.
예시적인 호밍 엔도뉴클레아제로서는 I-SceI, I-CeuI, PI-PspI, PI-Sce, I-SceIV, I-CsmI, I-PanI, I-SceII, I-PpoI, I-SceIII, I-CreI, I-TevI, I-TevII 및 I-TevIII을 포함한다. 이들의 인식 서열은 공지되어 있다. 또한, 이에 대해서는, 미국특허 제5,420,032호; 제6,833,252호; 문헌[Belfort et al., (1997) Nucleic Acids Res . 25:3379-3388; Dujon et al., (1989) Gene 82:115-118; Perler et al., (1994) Nucleic Acids Res. 22, 1125-1127; Jasin (1996) Trends Genet . 12:224-228; Gimble et al., (1996) J. Mol . Biol . 263:163-180; Argast et al., (1998) J. Mol . Biol . 280:345-353] 및 뉴 잉글랜드 바이오랩스 카탈로그를 참조할 수 있다.
대부분의 호밍 엔도뉴클레아제의 절단 특이성이 그들의 인식 자리에 대해서 절대적이진 않지만, 해당 자리는 인식 자리의 단일 카피를 포함하는 세포 내에서 호밍 엔도뉴클레아제를 발현시켜 포유류 크기의 게놈마다 1회의 절단 사건이 얻어질 수 있을 만큼의 충분한 길이를 갖는다. 또한, 호밍 엔도뉴클레아제와 메가뉴클레아제의 특이성은 비천연 표적 자리에 결합하도록 유전자조작될 수 있는 것으로 보고된 바 있다. 이에 대해서는, 예를 들어, 문헌[Chevalier et al ., (2002) Molec. Cell 10:895-905; Epinat et al., (2003) Nucleic Acids Res . 31:2952-2962; Ashworth et al., (2006) Nature 441:656-659; Paques et al ., (2007) Current Gene Therapy 7:49-66]을 참조할 수 있다.
전달
본 명세서에 설명된 ZFN은 임의의 적합한 수단, 예를 들어 ZFN mRNA의 주입에 의해 표적 세포로 전달될 수 있다. 이에 대해서는, 문헌[Hammerschmidt et al., (1999) Methods Cell Biol . 59:87-115]을 참조할 수 있다.
아연 핑거를 포함하는 단백질을 전달하는 방법은, 예를 들어 미국특허 제6,453,242호; 제6,503,717호; 제6,534,261호; 제6,599,692호; 제6,607,882호; 제6,689,558호; 제6,824,978호; 제6,933,113호; 제6,979,539호; 제7,013,219호 및 제7,163,824호에 설명되어 있으며, 이것의 모든 개시는 본 명세서에 참조로 포함되어 있다.
본 명세서에 설명된 ZFN은 하나 이상의 ZFN을 암호화하는 서열을 함유하는 벡터를 이용하여 전달될 수도 있다. 임의의 벡터 시스템, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 플라스미드 벡터, 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 폭스바이러스 벡터; 헤르페스바이러스 벡터 및 아데노-연관 바이러스 벡터 등이 사용될 수 있다. 또한, 이에 대해서는, 미국등록특허 제6,534,261호; 제6,607,882호; 제 6,824,978호; 제6,933,113호; 제6,979,539호; 제7,013,219호 및 제7,163,824호를 참조할 수 있으며, 이들은 전문은 본 명세서에 참조로 포함된다. 더 나아가, 이들 벡터가 하나 이상의 ZFN 암호화 서열을 포함할 수 있다는 점도 명백할 것이다. 따라서, ZFN의 하나 이상의 쌍이 세포 내로 도입될 때, ZFN은 동일한 벡터 또는 상이한 벡터로 운반될 수 있다. 복수의 벡터가 이용되는 경우, 각 벡터는 하나 또는 복수의 ZFN을 암호화하는 서열을 포함할 수 있다.
통상적인의 바이러스 및 비-바이러스를 기반으로 한 유전자 전달 방법은 세포 내 유전자조작된 ZFP를 암호화하는 핵산을 하기 위하여 사용될 수 있다. 또한 이러한 방법은 ZFP를 암호화하는 핵산을 시험관 내 세포에 투여하기 위해 이용될 수 있다. 특정 실시 양태에서, ZFP를 암호화하는 핵산은 생체 내 또는 생체 외 용도를 위해 투여된다.
비바이러스 벡터 전달 시스템으로서는, 전기천공, 리포펙션(lipofection), 미량주입, 바이오리스틱스(biolistics), 바이로좀(virosome), 리포솜, 면역리포솜, 다가양이온 또는 지질:핵산 접합체, 네이키드 DNA, 인조 비리온 및 제제로 강화된 DNA의 흡수가 포함된다. 예를 들어, Sonitron 2000 시스템(Rich-Mar)을 사용하는 음향천공(sonoporation) 역시 핵산의 전달에 이용될 수 있다. 바이러스 벡터 전달 시스템은 세포로의 전달 후에 에피솜 게놈 또는 통합된 게놈을 가지는 DNA 및 RNA 바이러스를 포함한다. 추가의 예시적인 핵산 전달 시스템은 Amaxa Biosystems(독일 쾰른 소재), Maxcyte, Inc.(미국 메릴랜드주 락빌 소재), BTX Molecular Delivery Systems(미국 메사추세츠주 홀리스튼 소재) 및 Copernicus Therapeutics Inc.에 의해 제공된 것들을 포함한다(예를 들어, 미국등록특허 제6,008,336호 참조). 리포펙션은 예를 들어, 미국등록특허 제5,049,386호, 제4,946,787호 및 제4,897,355호에서 설명되며, 리포펙션 시약은 상업적으로 시판된다(예를 들어, Transfectam(상표명) 및 Lipofectin(상표명)). 폴리뉴클레오타이드의 효율적인 수용체 인식 리포펙션에 적합한 양이온성 및 중성 지질은 펠크너(Felgner)의 WO 91/17424, WO 91/16024에 기술된 것들을 포함한다. 전달은 세포(체외 투여)로 또는 표적 조직(생체 내 투여)으로 수행될 수 있다. 면역지질 복합체와 같은 표적화 리포좀을 비롯한 지질:핵산 복합체의 제조는 당업자에게 잘 알려져 있다(예를 들어, 문헌[Crystal, Science 270:404-410 (1995); Blaese et al., Cancer Gene Ther . 2:291-297 (1995); Behr et al ., Bioconjugate Chem . 5:382-389(1994); Remy et al., Bioconjugate Chem. 5:647-654 (1994); Gao et al ., Gene Therapy 2:710-722(1995); Ahmad et al ., Cancer Res . 52:4817-4820 (1992)]; 미국등록특허 제4,186,183호, 제4,217,344호, 제4,235,871호, 제4,261,975호, 제4,485,054호, 제4,501,728호, 제4,774,085호, 제4,837,028호 및 제4,946,787호 참조).
전달의 추가적인 방법은 핵산이 EnGeneIC 전달 비히클(EnGeneIC delivery vehicle, EDV)내로 전달되도록 포장의 사용을 포함한다. 항체 중 하나의 암이 표적 조직에 특이성을 가지며 나머지가 EDV에 대한 특이성을 가지는 경우, 이 EDV는 2중특이적 항체를 사용하여 표적 조직에 특이적으로 전달된다. 항체는 EDV를 표적 세포 표면으로 가져온 다음 EDV는 엔도사이토시스에 의해 세포 내로 운반된다. 일단 세포 내에서, 내용물이 방출된다(문헌[MacDiarmid et al (2009) Nature Biotechnology vol 27(7) p. 643] 참조).
상기 주목한 바와 같이, 개시된 방법 및 조성물은 임의의 유형의 세포 내에 사용될 수 있다. 동물 세포의 자손, 변이체 및 유도체가 또한 사용될 수 있다.
적용
상기 개시된 방법과 조성물은 임의의 로사 유전자 또는 유전자들의 게놈 편집에 사용될 수 있다. 특정 적용에서, 상기 방법과 조성물은 게놈의 로사 서열의 불활성화를 위해 사용될 수 있다. 다른 적용에서, 상기 방법과 조성물은, 편집되지 않은 유전자 또는 인간화된 로사 유전자의 통합과는 상이한 발현을 하는 유전자의 신규한 대립 형질 형태의 생성을 포함하는 무작위 돌연변이를 생성할 수 있는데, 이로써 결과적으로 동물 모델을 생성할 수 있게 된다. 다른 적용에서, 상기 방법과 조성물은 유전자의 신규한 대립 형질 형태를 수반하는 동물의 동정 및 선별을 가능하게 하는, 정해진 유전자의 위치에서 무작위 돌연변이를 생성하는데 사용될 수 있다. 다른 적용에서, 상기 방법과 조성물은 게놈의 임의의 선택된 영역, 예를 들어 마우스 또는 래트 로사 유전자 내로 외인성(공여자) 서열이 표적화된 통합을 하도록 한다. 조절 서열(예를 들어 프로모터)은 관심 자리에서 표적화 방식으로 통합될 수 있다. "통합"은 물리적 삽입(예를 들어, 숙주 세포의 게놈 내로 삽입)과, 또한, 핵산 복제 과정을 통해 숙주 세포 게놈 내로 공여자 서열을 카피(복제)하여 통합시키는 것 모두를 의미한다. 공여자 서열은 또한 shRNA, miRNA 등과 같은 핵산을 포함할 수 있다. 이러한 작은 핵산 공여자는 게놈 내의 관심 유전자에 대한 그 영향을 연구하는데 사용될 수 있다. 추가적인 관심의 공여자 서열은 질병 모델과 관련있는 단백질을 암호화하는 인간 유전자일 수 있다. 이러한 유전자의 비제한적 예는 인간 인자 VIII 및 인간 인자 IX를 포함한다. 로사 좌위에 이들 유전자의 이러한 삽입은 연구자들이 이들 단백질을 생체내에서 더욱 상세하게 조사하도록 할 수 있다. 동물 유전자의 게놈 편집(예를 들어, 불활성화, 통합 및/또는 표적화 또는 무작위 돌연변이)은, 예를 들어 단일 절단 이벤트에 의해, 절단 후 비상동성 말단 접합에 의해, 절단 후 상동성 지향 복구 메커니즘에 의해, 절단 후 공여자 서열의 물리적 통합에 의해, 2개 자리에서의 절단 후 상기 두 절단 자리 사이의 서열을 결실시키기 위한 접합에 의해, 암호화 영역 내로 미스센스 또는 넌센스 코돈의 표적화된 재조합에 의해, 유전자 또는 조절 영역을 방해하기 위한 유전자 또는 그 조절 영역 내에 관련이 없는 서열(즉, "스터퍼 (stuffer)" 서열)의 표적화된 재조합에 의해, 또는 전사체의 미스-스플라이싱을 유도하기 위한 인트론 내 스플라이스 수용체 서열의 표적화 재조합에 의해 달성될 수 있다. 이에 대해서는, 미국 공개 제20030232410호; 제20050208489호; 제20050026157호; 제20050064474호; 제20060188987호; 제20060063231호; 및 국제특허 WO 07/014275를 참조할 수 있으며, 이들의 개시는 그들의 전문이 모든 목적을 위하여 참조로 포함된다.
로사 유전자의 ZFN 매개 게놈 편집을 위한 다양한 적용이 있다. 본 명세서에 설명된 방법 및 조성물은 인간 질병 모델을 만들도록 한다. 예를 들어, p53 유전자의 편집은 암을 연구하고 암 치료를 시험하기 위한 동물 모델을 제공하는 "암 래트"를 만들도록 한다.
실시예
실시예 1: 래트 게놈의 rRosa26 핵산 영역에 표적화된 통합을 위한 제한효소 단편 길이 다형성( restriction fragment length polymorphism , RFLP ) 공여자의 구성체
래트 게놈의 rRosa26 영역 내로 NotI 및 PmeI RFLP 자리의 통합을 표적화하기 위해 플라스미드를 또한 구성하였다. 상동성의 rRosa26 영역을 증폭시키기 위해 사용한 PCR 프라이머 쌍을 표 1에서 설명한다.
프라이머 서열
명칭 서열
rRosa26 200 bp F Kpnl aaaaggtaccgggagtggatgaaggagttg (서열번호 5)
rRosa26 200 bp R Sacll aaaaccgcggcggatcacaagcaataat (서열번호 6)
rRose26 표적 F Notl cttcgcggccgcgatctgcaactggagtctttc (서열번호 7)
rRosa26 표적 F Pmel cttcgtttaaacgatctgcaactggagtctttc (서열번호 8)
rRosa26 표적 F Notl gatcgcggccgcgaagaagggggaagggaatc (서열번호 9)
rRosa26 표적 R Pmel gatcgtttaaacgaagaagggggaagggaatc (서열번호 10)
rRosa26 800 bp F Kpnl aaaaggtaccgcgtgtgaaaacacaaatgg (서열번호 11)
rRosa26 800 bp R Sacll aaaaccgcggaaggaaagaggcattcatgg (서열번호 12)
rRosa26 2Kb F Kpnl aaaaggtaccattatggaggggaggactgg (서열번호 13)
rRosa26 2Kb R Sacll aaaaccgcggacatgtggcaaacaggaga (서열번호 14)
rRosa26 50 bp F tgtcttctgaggaccgccc (서열번호 15)
rRosa26 50 bp R ctgcccagaagactcccgc (서열번호 16)
래트 Rosa26에서 표시한 표적 자리로 표적화된 아연 핑거 설계를 표 2 및 표 3에 나타낸다. ZFP 인식 나선에 의해 접촉된 표적 자리 내 뉴클레오타이드는 대문자로 표시하며; 비접촉 뉴클레오타이드는 소문자로 표시한다.
래트 rosa 26 핑거 설계
ZFN 명칭 F1 F2 F3 F4 F5 F6
rosa26인트론-r885a1
(쌍 1)		 DRSDLSR
(서열번호 38)		 RSDDLTR
(서열번호 39)		 TSGHLSR
(서열번호 40)		 RSDNLSV
(서열번호 41)		 RSANLTR
(서열번호 42)		 해당없음
rosa26인트론-891a1 (쌍 1) QSDHLTK
(서열번호 43)		 NSSNLSR
(서열번호 44)		 RSDHLTK
(서열번호 45)		 NSDHLSR
(서열번호 46)		 RSDHLSR
(서열번호 47)		 해당없음
rosa26인트론-r887a1
(쌍 2)		 RSDHLSE
(서열번호 48)		 RSAALAR
(서열번호 49)		 RSDHLST
(서열번호 50)		 QNAHRIT
(서열번호 51)		 RSAVLSE
(서열번호 52)		 해당없음
rosa26인트론-894a1 (쌍 2) QSGDLTR
(서열번호 17)		 TSGSLTR
(서열번호 18)		 RSANLTR
(서열번호 42)		 RSDHLTK
(서열번호 45)		 NSDHLSR
(서열번호 46)		 해당없음
rosa26인트론-r941a1
(쌍 3)		 RSANLTR
(서열번호 42)		 QSGDLTR
(서열번호 17)		 QSGDLTR
(서열번호 17)		 RSANLAR
(서열번호 53)		 RSDNLRE
(서열번호 54)		 해당없음
rosa26인트론-947a1 (쌍 3) RSDHLST
(서열번호 50)		 DNRDRIK
(서열번호 55)		 RSDTLSE
(서열번호 56)		 QSSHLAR
(서열번호 57)		 QNAHRKT
(서열번호 22)		 해당없음
rosa26인트론-r944a1
(쌍 4)		 QSGDLTR
(서열번호 17)		 QSGDLTR
(서열번호 17)		 RSDNLTR
(서열번호 58)		 RSDNLSE
(서열번호 21)		 QNAHRKT
(서열번호 22)		 해당없음
rosa26인트론-950a1 (쌍 4) DRSDLSR
(서열번호 38)		 RSDHLST
(서열번호 50)		 DNRDRIK
(서열번호 55)		 RSDTLSE
(서열번호 56)		 QSSHLAR
(서열번호 57)		 해당없음
rosa26인트론-r951a1
(쌍 5)		 QSGDLTR
(서열번호 17)		 RSDNLTR
(서열번호 58)		 RSDNLSE
(서열번호 21)		 QNAHRKT
(서열번호 22)		 RSDHLSE
(서열번호 48)		 TSSTRKT
(서열번호 59)
rosa26인트론-958a1 (쌍 5) TSGNLTR
(서열번호 60)		 QSGNLAR
(서열번호 61)		 RSDALSV
(서열번호 62)		 DSSHRTR
(서열번호 63)		 RSDVLSE
(서열번호 64)		 해당없음
rosa26인트론-r954a1
(쌍 6)		 RSDNLSE
(서열번호 21)		 QNAHRKT
(서열번호 22)		 RSDHLSE
(서열번호 48)		 TSSTRKT
(서열번호 59)		 TSGHLSR
(서열번호 40)		 해당없음
rosa26인트론-961a1 (쌍 6) TSGNLTR
(서열번호 60)		 QSGNLAR
(서열번호 61)		 RSDALSV
(서열번호 62)		 DSSHRTR (서열번호 63) 해당없음 해당없음
rosa26인트론-r983a1
(쌍 7)		 QRSNLVR
(서열번호 65)		 RSDHLTQ
(서열번호 66)		 QSGHLQR
(서열번호 67)		 DRSHLAR (서열번호 68) 해당없음 해당없음
rosa26인트론-989a1 (쌍 7) RSDVLSE
(서열번호 64)		 QRNHRTT
(서열번호 69)		 TKRSLIE
(서열번호 70)		 TSSNLSR
(서열번호 71)		 RSDDLSK
(서열번호 25)		 DNRDRIK
(서열번호 55)
rosa26인트론-r989a1
(쌍 8)		 RSDHLSA
(서열번호 72)		 QSGHLSR
(서열번호 24)		 RSDHLSR
(서열번호 47)		 QNDNRIK
(서열번호 73)		 QSGNLAR (서열번호 61) 해당없음
rosa26인트론-996a1 (쌍 8) NNRDLIN
(서열번호 74)		 TSSNLSR
(서열번호 71)		 RSDVLSE
(서열번호 64)		 QRNHRTT
(서열번호 69)		 TKRSLIE
(서열번호 70)
래트 rosa 26 표적 자리
ZFN 명칭 표적 서열
rosa26인트론-r885a1
(쌍 1)		 ctGAGAAGGGTGCGGCCttttctccgcc
(서열번호 75)
rosa26인트론-891a1
(쌍 1)		 acGGGGGAGGGGAGTGTtgcaatacctt
(서열번호 76)
rosa26인트론-r887a1
(쌍 2)		 tcCTGAGAAGGGTGCGGccttttctccg
(서열번호 77)
rosa26인트론-894a1
(쌍 2)		 ggGGAGGGGAGtGTTGCAatacctttct
(서열번호 78)
rosa26인트론-r941a1
(쌍 3)		 gaCAGGAGGCAGCAGAGaactcccagaa
(서열번호 79)
rosa26인트론-947a1
(쌍 3)		 tcTGAGGACCGCCCTGGgcctggaagat
(서열번호 80)
rosa26인트론-r944a1
(쌍 4)		 gaAGACAGGAGGCAGCAgagaactccca
(서열번호 81)
rosa26인트론-950a1
(쌍 4)		 gaGGACCGCCCTGGGCCtggaagattcc
(서열번호 82)
rosa26인트론-r951a1
(쌍 5)		 gtCCTCAGaAGACAGGAGGCAgcagaga
(서열번호 83)
rosa26인트론-958a1
(쌍 5)		 ccCTGGGCCTGGAAGATtcccttccccc
(서열번호 84)
rosa26인트론-r954a1
(쌍 6)		 gcGGTCCTCAGaAGACAGgaggcagcag
(서열번호 85)
rosa26인트론-961a1
(쌍 6)		 tgGGCCTGGAAGATtcccttcccccttc
(서열번호 86)
rosa26인트론-r983a1
(쌍 7)		 aaGGGGGAAGGGAAtcttccaggcccag
(서열번호 87)
rosa26인트론-989a1
(쌍 7)		 ttCCCTCGtGATCTGCAACTGgagtctt
(서열번호 88)
rosa26인트론-r989a1
(쌍 8)		 ggGAAGAAGGGGGAAGGgaatcttccag
(서열번호 89)
rosa26인트론-996a1
(쌍 8)		 gtGATCTGCAACTGGAGTCTttctggaa
(서열번호 90)
래트 C6 세포를 GFP 대조군 또는 각각의 8쌍의 ZFN으로 트랜스펙션하였다. 트랜스펙션 후 1일에 DNA를 세포로부터 제조하였다. 각각의 프라이머로 증폭한 산물을 사용하여, 예를 들어 미국 공개 제20080015164호; 제20080131962호 및 제20080159996호에서 설명한 바와 같은 Surveyor(상표명) 뉴클레아제에 의해 ZFN 절단을 분석하였다. 결과를 도 1에 제시한다. 화살표는 절단이 ZFN 쌍을 함유하는 샘플 내에서만 발견되었지만, 대조군 샘플 내에서 발견되지 않았다는 것을 나타내며, 여기서 세포는 GFP에 특이적인 ZFN으로 트랜스펙션되었다.
실시예 2: 마우스 Rosa26 좌위에 특이적인 아연 핑거 뉴클레아제
마우스 Rosa26 내 표시된 표적 자리에 표적화된 아연 핑거 설계를 표 4 및 표 5에 나타낸다. ZFP 인식 나선에 의해 접촉된 표적 자리 내 뉴클레오타이드는 대문자로 표시하며; 접촉되지 않은 뉴클레오타이드는 소문자로 표시한다.
마우스 Rosa 26 아연 핑거 설계
ZFN 명칭 F1 F2 F3 F4 F5 F6
18477 QSGDLTR
(서열번호 17)		 TSGSLTR
(서열번호 18)		 QSGHLAR
(서열번호 19)		 QSSDLTR
(서열번호 20)		 RSDNLSE
(서열번호 21)		 QNAHRKT
(서열번호 22)
18473 DRSARTR
(서열번호 23)		 QSGHLSR
(서열번호 24)		 RSDDLSK
(서열번호 25)		 RNDHRKN
(서열번호 26)		 해당없음 해당없음
25096 DTTSLDR
(서열번호 27)		 TSGSLTR
(서열번호 18)		 QSGHLAR
(서열번호 19)		 QSSDLTR
(서열번호 20)		 RSDNLSE
(서열번호 21)
마우스 Rosa26 표적 자리
ZFN 명칭 표적 서열
18477 ctAGAAAGACTGGAGTTGCAgatcacga (서열번호 28)
18473 gaTGGGCGGGAGTCttctgggcaggctt (서열번호 29)
25096 ctAGAAAGACTGGAGTTGCAgatcacga (서열번호 30)
Cel-I 분석을 ZFN 쌍 18473/18477 및 18473/25096에 대해 상기 설명한 바와 같이 수행하였고, 보이는 NHEJ%는 다음과 같다: ZFN 쌍 18477/18473을 사용하여 26.5% NHEJ 및 ZFN 쌍 18473/25096으로 35.70% NHEJ.
실시예 3: 마우스 게놈의 Rosa26 좌위 내에 공여자 폴리뉴클레오타이드의 표적화된 통합
로사 공여자를 다음의 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 만든 PCR 산물의 클로닝에 의해 구성하였다: 527 bp 좌측 암(arm)에 대해, PCR을 위해 사용한 올리고뉴클레오타이드는 5'-ggc tcg agt gag tca tca gac ttc taa gat cag g-3'(서열번호 31)이었고; 413 bp 좌측 암 공여자에 대해, 5'-ggc tcg agt ttt gat aag gct gca gaa g-3'(서열번호 32)이었으며, 역 프라이머는 5'-ctg aat tcg aat ggg cgg gag tct tct ggg ca-3'(서열번호 33)이었다.
640 bp 우측 암에 대해, PCR을 위해 사용한 올리고뉴클레오타이드는 5'-cca agc ttg gag gta ggt ggg gtg agg-3'(서열번호 34)이었고; 200 bp 암에 대해, 5'-cca agc tta gtc gct ctg agt tgt tat c-3'(서열번호 35)이며; 100 bp 암에 대해, 5'-cca agc ttt ctg gga gtt ctc tgc tgc c-3'(서열번호 36)이며 역 프라이머는 5'-cat tcg aat tca gaa aga ctg gag ttg cag atc-3'(서열번호 37)이었다. 개개의 암 앰플리콘을 융합 PCR을 통해 접합시키고 클로닝하여 다른 상동성 암을 가지는 공여자를 생성하였다. Neuro2a 세포(200,000)를 Amaxa-Shuttle Neuro2a 고효율 프로토콜을 사용하여 용액 SF 중에서 2 ㎍의 표시한 공여자와 함께 각각 400 ng SBS 18473 및 18477과 공동 트랜스펙션하였다.
게놈 DNA를 트랜스펙션 후 72시간에 채집하였고, 이것의 100 ng을 68℃의 어닐링 온도에서 72℃에서 2분 연장으로 28주기 동안 5'-cccagctacagcctcgattt-3', 5'-cacaaatggcgtgttttggt-3' 및 샘플 당 둘 다 5 μCi의 32P-dATP와 32P-dCTP과 함께 PCR을 위해 사용하였다. G-50 컬럼 정제 후, 10㎕의 각 50㎕ 반응을 EcoRI로 37℃에서 2시간 동안 분해시켰고, 10% 폴리아크릴아마이드 겔 상에 로딩하였다.
도 2에서 나타내는 바와 같이, 공여자 뉴클레오타이드를 표시된 빈도에서 로사 좌위에 삽입하였다.
본 명세서에 언급된 모든 특허, 특허 출원 및 간행물은 그것의 전문이 참조로 포함된다.
명세서가 이해의 명확함의 목적을 위해 예증 및 예시의 방법으로 일부 상세하게 제공되었지만, 당업자는 본 명세서의 정신 또는 범주로부터 벗어나지 않고 다양한 변화 및 변형이 실행될 수 있다는 것을 인식할 것이다. 따라서, 앞서 설명한 설명 및 실시예는 제한으로서 해석되어서는 안 된다.
SEQUENCE LISTING <110> SANGAMO BIOSCIENCES, INC. et al. <120> GENOME EDITING OF A ROSA LOCUS USING ZINC-FINGER NUCLEASES <130> 8325-0078.40 <140> PCT/US2011/000725 <141> 2011-04-25 <150> 61/343,287 <151> 2010-04-26 <160> 92 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1 Thr Gly Glu Lys Pro 1 5 <210> 2 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 2 Thr Gly Gly Gln Arg Pro 1 5 <210> 3 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 3 Thr Gly Gln Lys Pro 1 5 <210> 4 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 4 Thr Gly Ser Gln Lys Pro 1 5 <210> 5 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 5 aaaaggtacc 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acacaaatgg 30 <210> 12 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 12 aaaaccgcgg aaggaaagag gcattcatgg 30 <210> 13 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 13 aaaaggtacc attatggagg ggaggactgg 30 <210> 14 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 14 aaaaccgcgg acatgtggca aacaggaga 29 <210> 15 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 15 tgtcttctga ggaccgccc 19 <210> 16 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 16 ctgcccagaa gactcccgc 19 <210> 17 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 17 Gln Ser Gly Asp Leu Thr Arg 1 5 <210> 18 <211> 7 <212> PRT 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Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 24 Gln Ser Gly His Leu Ser Arg 1 5 <210> 25 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 25 Arg Ser Asp Asp Leu Ser Lys 1 5 <210> 26 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 26 Arg Asn Asp His Arg Lys Asn 1 5 <210> 27 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 27 Asp Thr Thr Ser Leu Asp Arg 1 5 <210> 28 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 28 ctagaaagac tggagttgca gatcacga 28 <210> 29 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 29 gatgggcggg agtcttctgg gcaggctt 28 <210> 30 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 30 ctagaaagac tggagttgca gatcacga 28 <210> 31 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 31 ggctcgagtg agtcatcaga cttctaagat cagg 34 <210> 32 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 32 ggctcgagtt ttgataaggc tgcagaag 28 <210> 33 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 33 ctgaattcga atgggcggga gtcttctggg ca 32 <210> 34 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 34 ccaagcttgg aggtaggtgg ggtgagg 27 <210> 35 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 35 ccaagcttag tcgctctgag ttgttatc 28 <210> 36 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 36 ccaagctttc tgggagttct ctgctgcc 28 <210> 37 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 37 cattcgaatt cagaaagact ggagttgcag atc 33 <210> 38 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 38 Asp Arg Ser Asp Leu Ser Arg 1 5 <210> 39 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 39 Arg Ser Asp Asp Leu Thr Arg 1 5 <210> 40 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 40 Thr Ser Gly His Leu Ser Arg 1 5 <210> 41 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 41 Arg Ser Asp Asn Leu Ser Val 1 5 <210> 42 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence 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Sequence: Synthetic peptide <400> 48 Arg Ser Asp His Leu Ser Glu 1 5 <210> 49 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 49 Arg Ser Ala Ala Leu Ala Arg 1 5 <210> 50 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 50 Arg Ser Asp His Leu Ser Thr 1 5 <210> 51 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 51 Gln Asn Ala His Arg Ile Thr 1 5 <210> 52 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 52 Arg Ser Ala Val Leu Ser Glu 1 5 <210> 53 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 53 Arg Ser Ala Asn Leu Ala Arg 1 5 <210> 54 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 54 Arg 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Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 67 Gln Ser Gly His Leu Gln Arg 1 5 <210> 68 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 68 Asp Arg Ser His Leu Ala Arg 1 5 <210> 69 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 69 Gln Arg Asn His Arg Thr Thr 1 5 <210> 70 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 70 Thr Lys Arg Ser Leu Ile Glu 1 5 <210> 71 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 71 Thr Ser Ser Asn Leu Ser Arg 1 5 <210> 72 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 72 Arg Ser Asp His Leu Ser Ala 1 5 <210> 73 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 73 Gln Asn Asp Asn Arg Ile Lys 1 5 <210> 74 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 74 Asn Asn Arg Asp Leu Ile Asn 1 5 <210> 75 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 75 ctgagaaggg tgcggccttt tctccgcc 28 <210> 76 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 76 acgggggagg ggagtgttgc aatacctt 28 <210> 77 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 77 tcctgagaag ggtgcggcct tttctccg 28 <210> 78 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 78 ggggagggga gtgttgcaat acctttct 28 <210> 79 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 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Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 85 gcggtcctca gaagacagga ggcagcag 28 <210> 86 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 86 tgggcctgga agattccctt cccccttc 28 <210> 87 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 87 aagggggaag ggaatcttcc aggcccag 28 <210> 88 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 88 ttccctcgtg atctgcaact ggagtctt 28 <210> 89 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 89 gggaagaagg gggaagggaa tcttccag 28 <210> 90 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 90 gtgatctgca actggagtct ttctggaa 28 <210> 91 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 91 cccagctaca gcctcgattt 20 <210> 92 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 92 cacaaatggc gtgttttggt 20

Claims (24)

  1. 뉴클레아제 도메인 및 유전자조작된 아연 핑거 도메인을 포함하는 융합 단백질로서, 상기 유전자조작된 아연 핑거 도메인은 서열번호 75 내지 90 중 어느 하나에서 특정된 표적 자리에 결합하는 것인 융합 단백질.
  2. 제1항에 있어서, 상기 뉴클레아제 도메인은 절단 도메인 또는 절단 절반 도메인(cleavage-half-domain)을 포함하는 것인 융합 단백질.
  3. 제1항에 있어서, 상기 뉴클레아제 도메인은 IIS형 제한 엔도뉴클레아제 절단 도메인 또는 절단 절반 도메인을 포함하는 것인 융합 단백질.
  4. 제3항에 있어서, 상기 절단 도메인 또는 절단 절반 도메인은 자연적으로 발생하거나 또는 유전자조작된 것인 융합 단백질.
  5. 제1항의 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드.
  6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 융합 단백질 또는 제5항의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 래트 세포.
  7. 제6항에 있어서, 상기 세포는 래트 배아 세포인 것인 래트 세포.
  8. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 융합 단백질 또는 제5항의 폴리뉴클레오타이드 및 약제학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 조성물.
  9. 시험관 내에서 래트 세포 내 하나 이상의 로사(Rosa) 유전자를 절단하는 방법으로서, 상기 방법은
    상기 하나 이상의 로사 유전자가 절단되도록, 상기 세포 내로 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 하나 이상의 융합 단백질 또는 제5항의 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 상기 세포 내로 도입하는 단계를 포함하는 것인, 래트 세포 내 하나 이상의 로사 유전자 절단방법.
  10. 시험관 내에서 래트 세포의 게놈 내로 외인성 폴리뉴클레오타이드 서열을 도입하는 방법으로서, 상기 방법은
    제9항의 하나 이상의 로사 유전자를 절단하는 단계; 및
    상기 세포를 외인성 폴리뉴클레오타이드 서열과 접촉시키는 단계를 포함하되,
    상기 하나 이상의 유전자의 절단은 상동성 재조합에 의해 또는 비상동성 의존성 표적화된 통합을 통하여 상기 게놈에 상기 외인성 폴리뉴클레오타이드 서열의 통합을 자극하는 것인, 래트 세포의 게놈 내로의 외인성 폴리뉴클레오타이드 서열의 도입방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 외인성 폴리뉴클레오타이드 서열은 상기 게놈 내로 물리적으로 통합된 것인, 래트 세포의 게놈 내로의 외인성 폴리뉴클레오타이드 서열의 도입방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 외인성 폴리뉴클레오타이드 서열은 핵산 복제 과정을 통해 상기 게놈 내로 통합된 것인, 래트 세포의 게놈 내로의 외인성 폴리뉴클레오타이드 서열의 도입방법.
  13. 제11항에 있어서, 상기 외인성 폴리뉴클레오타이드 서열은 비상동성 의존성 표적화된 통합을 통해 상기 게놈 내로 통합된 것인, 래트 세포의 게놈 내로의 외인성 폴리뉴클레오타이드 서열의 도입방법.
  14. 시험관 내에서 래트 세포의 게놈 내 로사 유전자 서열을 변형시키는 방법으로서, 상기 방법은
    제9항의 하나 이상의 로사 유전자를 절단하는 단계를 포함하되,
    (i) 제1 ZFN은 제1 절단 자리를 절단하며 제2 ZFN은 제2 절단 자리를 절단하고;
    (ii) 상기 로사 유전자 서열은 상기 제1 절단 자리와 상기 제2 절단 자리 사이에 위치되며;
    (iii) 상기 제1과 제2 절단 자리의 절단은 비상동성 말단 접합에 의해 또는 상동성 지향 복구에 의해 상기 유전자 서열의 변형을 초래하는 것인, 래트 세포의 게놈 내 로사 유전자 서열의 변형방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 변형은 결실을 포함하는 것인, 래트 세포의 게놈 내 로사 유전자 서열의 변형방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 변형은 외인성 서열의 삽입을 포함하는 것인, 래트 세포의 게놈 내 로사 유전자 서열의 변형방법.
  17. 로사 유전자 서열을 포함하는 형질전환 래트로서, 로사 유전자 서열은 제14항에 따라 변형된 것인 형질전환 래트.
  18. 제17항에 있어서, 상기 변형은 정해진 위치에서 하나 이상의 무작위 돌연변이를 포함하는 것인 형질전환 래트.
  19. 제17항에 있어서, 상기 변형은 인간화된 유전자의 삽입을 포함하는 것인 형질전환 래트.
  20. 제19항에 있어서, 상기 인간화된 유전자는 약물 대사와 관련된 것인 형질전환 래트.
  21. 제17항에 있어서, 상기 형질전환 래트는 성적으로 성숙한 동물이며, 상기 변형된 유전자 서열은 상기 성적으로 성숙한 동물의 생식세포의 적어도 일부에 존재하는 것인 형질전환 래트.
  22. 제17항의 형질전환 래트의 자손으로서, 상기 자손은 적어도 하나의 관심의 로사 좌위 내 하나 이상의 돌연변이 대립형질을 포함하는 것인 자손.
  23. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 융합 단백질 또는 제5항의 폴리뉴클레오타이드 및 래트 세포 내 융합 단백질 또는 폴리뉴클레오타이드를 사용하기 위한 설명서를 포함하는 키트.
  24. 제23항에 있어서, 하나 이상의 외인성 서열, 사용을 위한 설명서, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 추가적인 구성요소를 더 포함하는 것인 키트.
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