KR20220016474A - 변형된 ｃｄ247 유전자 자리로부터 키메라 수용체를 발현하는 세포, 관련 폴리뉴클레오타이드 및 방법 - Google Patents

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KR20220016474A
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스테펜 마이클 벌레이
크리스토퍼 히스 나이
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주노 쎄러퓨티크스 인코퍼레이티드
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Abstract

CD3제타(CD3ζ) 신호 전달 도메인을 포함하는 세포내 영역을 포함하는 키메라 수용체를 발현하는 조작된 면역 세포, 예를 들어 T 세포가 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 조작된 면역 세포는 키메라 수용체 또는 이의 일부를 암호화하는 변형된 CD247 유전자 자리를 함유한다. 일부 구현예에서, CD3제타 사슬의 적어도 일부는 CD247 게놈 유전자 자리에 의해 암호화된다. 또한 조작된 면역 세포를 함유하는 세포 조성물, 세포를 조작하기 위한 핵산, 및 예컨대 CD247 게놈 유전자 자리의 영역으로의 통합을 위해 키메라 수용체의 일부를 암호화하는 전이 유전자를 표적화함으로써 조작된 세포를 생산하기 위한 방법, 키트 및 제조품이 제공된다. 일부 구현예에서, 조작된 세포(예를 들어, T 세포)는 조작된 세포의 입양 전달을 포함하는 암 면역 요법과 관련하여를 포함하여 세포 요법과 관련하여 사용될 수 있다.

Description

변형된 ＣＤ247 유전자 자리로부터 키메라 수용체를 발현하는 세포, 관련 폴리뉴클레오타이드 및 방법
본 개시 내용은 CD3제타(CD3ζ) 신호 전달 도메인을 포함하는 세포내 영역을 포함하는 키메라 수용체를 발현하는 조작된 면역 세포, 예를 들어 T 세포에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 조작된 면역 세포는 키메라 수용체 또는 이의 일부를 암호화하는 변형된 CD247 유전자 자리를 함유한다. 일부 구현예에서, CD3제타 사슬의 적어도 일부는 CD247 게놈 유전자 자리에 의해 암호화된다. 또한 조작된 면역 세포를 함유하는 세포 조성물, 세포를 조작하기 위한 핵산, 및 예컨대 CD247 게놈 유전자 자리의 영역으로의 통합을 위해 키메라 수용체의 일부를 암호화하는 전이 유전자를 표적화함으로써 조작된 세포를 생산하기 위한 방법, 키트 및 제조품이 제공된다. 일부 구현예에서, 조작된 세포(예를 들어, T 세포)는 조작된 세포의 입양 전달을 포함하는 암 면역 요법과 관련하여를 포함하여 세포 요법과 관련하여 사용될 수 있다.
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2019년 5월 1일 출원된 미국 가출원 제62/841,578호(제목 “변형된 CD247 유전자 자리로부터 키메라 수용체를 발현하는 세포, 관련 폴리뉴클레오타이드 및 방법”)의 우선권을 주장하며 이의 내용들은 그 전체가 참조로 포함된다.
서열 목록의 참조 포함
본 출원은 전자 형식의 서열 목록과 함께 제출된다. 서열 목록은 2020년 4월 28일에 생성된 735042015840SeqList.txt라는 제목의 파일로 제공되며 이의 크기는 172 킬로바이트이다.　 전자 형식의 서열 목록 내 정보는 그 전체가 참조로 포함된다.
배경기술
키메라 항원 수용체(CAR)와 같은 키메라 수용체를 활용하여 질병과 관련된 항원을 인식하는 입양 세포 요법은 암 및 다른 질병의 치료를 위한 매력적인 치료 양식을 나타낸다. 예컨대 입양 면역 요법에, 예를 들어 암, 전염병 및 자가면역 질환 치료에 사용하기 위해 키메라 수용체를 발현하도록 T 세포를 조작하기 위한 개선된 전략이 필요하다. 상기 필요를 충족시키는 방법에 사용하기 위한 방법, 세포, 조성물 및 키트가 제공된다.
유전자 조작된 T 세포, 및 유전자 조작된 T 세포와 관련된 조성물, 방법, 용도, 키트 및 제조품이 본원에 제공된다. 제공된 임의의 구현예의 일부에서, 유전자 조작된 T 세포는 변형된 분화 클러스터 247(CD247) 유전자 자리를 포함한다. 임의의 구현예의 일부에서, 변형된 CD247 유전자 자리는 키메라 수용체 또는 이의 일부를 암호화하는 전이 유전자 서열을 포함한다. 제공된 구현예에서, 전이 유전자 서열은 내인성 CD247 유전자 자리의 개방형 해독틀 또는 이의 부분 서열과 틀 내에 있다. 따라서, 제공된 구현예에서, 변형된 CD247 유전자 자리는 전이 유전자 서열로부터 암호화된 서열 및 내인성 CD247 유전자 자리로부터 암호화된 서열을 포함하는 키메라 수용체를 암호화한다. 구체적인 구현예에서, 키메라 수용체는 CD3제타(CD3ζ) 신호 전달 도메인을 포함하는 세포내 영역을 함유하고, CD3ζ 신호 전달 도메인, 예를 들어 전체 CD3ζ 신호 전달 도메인 또는 CD3ζ 신호 전달 도메인의 적어도 일부는 T 세포와 같은 조작된 세포의 내인성 CD247 유전자 자리(CD3ζ을 암호화하는 게놈 유전자 자리)의 게놈 서열(예를 들어, 개방형 해독틀)에 의해 암호화된다.
변형된 CD247 유전자 자리를 함유하는 유전자 조작된 T 세포가 본원에 제공된다. 임의의 구현예의 일부에서, 변형된 CD247 유전자 자리는 CD3제타(CD3ζ) 신호 전달 도메인을 포함하는 세포내 영역을 포함하는 키메라 수용체를 암호화하는 핵산 서열을 포함한다. 임의의 구현예의 일부에서, 핵산 서열은 키메라 수용체의 일부를 암호화하는 전이 유전자 서열을 포함하며, 전이 유전자 서열은 내인성 CD247 유전자 자리에 통합되었다. 임의의 구현예의 일부에서, 통합은 상동 직접 수선(HDR)을 통해 일어난다. 임의의 구현예의 일부에서, 키메라 수용체의 세포내 영역의 CD3ζ 신호 전달 도메인의 전부 또는 단편은 내인성 CD247 유전자 자리의 개방형 해독틀 또는 이의 부분 서열에 의해 암호화된다. 임의의 구현예의 일부에서, 핵산 서열은 (i) 키메라 수용체의 일부를 암호화하는 전이 유전자 서열과 (ii) 내인성 CD247 유전자 자리의 개방형 해독틀 또는 이의 부분 서열의 틀 내 융합물을 포함한다. 구체적인 구현예에서, 변형된 CD247 유전자 자리는 CD3제타(CD3ζ) 신호 전달 도메인을 포함하는 세포내 영역을 함유하는 키메라 수용체를 암호화하고, CD3ζ 신호 전달 도메인, 예를 들어 전체 CD3ζ 신호 전달 도메인 또는 CD3ζ 신호 전달 도메인의 적어도 일부는 T 세포와 같은 조작된 세포의 내인성 CD247 유전자 자리(CD3ζ을 암호화하는 게놈 유전자 자리)의 게놈 서열에 의해 암호화된다.
변형된 CD247 유전자 자리를 함유하되, 상기 변형된 CD247 유전자 자리는 CD3ζ 신호 전달 도메인을 포함하는 세포내 영역을 포함하는 키메라 수용체를 암호화하는 핵산 서열을 포함하고, 핵산 서열은 (i) 키메라 수용체의 일부를 암호화하는 전이 유전자 서열과 (ii) CD3ζ 신호 전달 도메인을 암호화하는 내인성 CD247 유전자 자리의 개방형 해독틀 또는 이의 부분 서열의 틀 내 융합물을 포함하는, 유전자 조작된 T 세포가 본원에 제공된다. 구체적인 구현예에서, 변형된 CD247 유전자 자리는 CD3제타(CD3ζ) 신호 전달 도메인을 포함하는 세포내 영역을 함유하는 키메라 수용체를 암호화하고, CD3ζ 신호 전달 도메인 또는 CD3ζ 신호 전달 도메인의 적어도 일부는 T 세포와 같은 조작된 세포의 내인성 CD247 유전자 자리(CD3ζ을 암호화하는 게놈 유전자 자리)의 게놈 서열에 의해 암호화된다.
임의의 구현예의 일부에서, 전이 유전자 서열은 내인성 CD247 유전자 자리의 개방형 해독틀 또는 이의 부분 서열의 하나 이상의 엑손과 틀 내에 있다.
임의의 구현예의 일부에서, 전이 유전자 서열은 3’ UTR을 암호화하는 서열을 포함하지 않는다. 임의의 구현예의 일부에서, 전이 유전자 서열은 인트론을 포함하지 않는다.
임의의 구현예의 일부에서, 전이 유전자 서열은 CD3ζ 신호 전달 도메인의 단편을 암호화한다. 예를 들어, 구체적인 구현예에서, 키메라 수용체의 CD3ζ 신호 전달 도메인 또는 이의 단편은 전이 유전자 서열의 서열에 의해 그리고 T 세포와 같은 조작된 세포의 내인성 CD247 유전자 자리(CD3ζ을 암호화하는 게놈 유전자 자리)에서 게놈 서열(예를 들어, 개방형 해독틀)에 의해 함께 암호화된다.
임의의 구현예의 일부에서, 전이 유전자 서열은 CD3ζ 신호 전달 도메인 또는 이의 단편을 암호화하지 않는다. 예를 들어, 구체적인 구현예에서, 키메라 수용체의 CD3ζ 신호 전달 도메인의 전체 또는 전장 또는 이의 단편은 T 세포와 같은 조작된 세포의 내인성 CD247 유전자 자리(CD3ζ를 암호화하는 게놈 유전자 자리)의 게놈 서열에 의해 암호화된다.
임의의 구현예의 일부에서, 개방형 해독틀 또는 이의 부분 서열은 내인성 CD247 유전자 자리의 적어도 하나의 인트론 및 적어도 하나의 엑손을 포함한다. 임의의 구현예의 일부에서, 개방형 해독틀 또는 이의 부분 서열은 내인성 CD247 유전자 자리의 3’ UTR을 암호화한다.
임의의 구현예의 일부에서, 전이 유전자 서열은 내인성 CD247 유전자 자리의 개방형 해독틀의 엑손 1의 하단부 및 엑손 8의 상단부에 있다. 임의의 구현예의 일부에서, 전이 유전자 서열은 내인성 CD247 유전자 자리의 개방형 해독틀의 엑손 1의 하단부 및 엑손 3의 상단부에 있다.
임의의 구현예의 일부에서, 암호화된 키메라 수용체의 CD3ζ 신호 전달 도메인의 적어도 단편, 예컨대 전체 CD3ζ 신호 전달 도메인은 내인성 CD247 유전자 자리의 개방형 해독틀 또는 이의 부분 서열에 의해 암호화된다. 임의의 구현예의 일부에서, CD3ζ 신호 전달 도메인은 내인성 CD247 유전자 자리의 개방형 해독틀의 적어도 엑손 2의 일부 및 엑손 3-8을 포함하는 뉴클레오타이드의 서열에 의해 암호화된다. 임의의 구현예의 일부에서, CD3ζ 신호 전달 도메인은, 내인성 CD247 유전자 자리의 개방형 해독틀의 엑손 1을 포함하지 않고/거나, 엑손 1의 전장을 포함하지 않고/거나 엑손 2의 전장을 포함하지 않는 뉴클레오타이드의 서열에 의해 암호화된다.
임의의 구현예의 일부에서, 암호화된 키메라 수용체는 CD3ζ 신호 전달 도메인을 통해 신호 전달을 할 수 있다.
임의의 구현예의 일부에서, 암호화된 CD3ζ 신호 전달 도메인은 서열 번호: 13-15 중 어느 하나에서 선택된 서열, 또는 서열 번호: 13-15 중 어느 하나에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 동일성을 나타내는 서열, 또는 이의 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, 암호화된 CD3ζ 신호 전달 도메인은 서열 번호: 13에 제시된 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 암호화된 CD3ζ 신호 전달 도메인은 서열 번호: 14에 제시된 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 암호화된 CD3ζ 신호 전달 도메인은 서열 번호: 15에 제시된 서열을 포함한다.
임의의 구현예의 일부에서, 키메라 수용체는 기능성 비-T 세포 수용체(비-TCR) 항원 수용체이거나 이를 포함한다.
임의의 구현예의 일부에서, 키메라 수용체는 키메라 항원 수용체(CAR)이다. 임의의 구현예의 일부에서, 키메라 수용체는 세포외 영역, 및/또는 막관통 도메인을 더 포함한다.
임의의 구현예의 일부에서, 전이 유전자 서열은 키메라 수용체의 하나 이상의 영역을 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열을 포함한다. 임의의 구현예의 일부에서, 전이 유전자 서열은 세포외 영역, 막관통 도메인 및/또는 세포내 영역의 일부 중 하나 이상을 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열을 포함한다. 임의의 구현예의 일부에서, 세포외 영역은 결합 도메인을 포함한다. 임의의 구현예의 일부에서, 결합 도메인은 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다. 임의의 구현예의 일부에서, 결합 도메인은 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다.
임의의 구현예의 일부에서, 결합 도메인은 질병, 장애 또는 병태의 세포 또는 조직과 관련된, 이에 특이적인 및/또는 이에서 발현되는 표적 항원에 결합할 수 있다. 임의의 구현예의 일부에서, 표적 항원은 종양 항원이다. 임의의 구현예의 일부에서, 표적 항원은 αvβ6 인테그린(avb6 integrin), B 세포 성숙 항원(BCMA), B7-H3, B7-H6, 탄산 탈수 효소 9(CA9, CAIX 또는 G250으로도 공지), 암 고환 항원, 암/고환 항원 1B(CTAG, NY-ESO-1 및 LAGE-2로도 공지), 암배아 항원(CEA), 사이클린, 사이클린 A2, C-C 모티프 케모카인 리간드 1(CCL-1), CD19, CD20, CD22, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD123, CD133, CD138, CD171, 콘드로이틴 황산염 프로테오글리칸 4(chondroitin sulfate proteoglycan 4, CSPG4), 표피 성장 인자 단백질(EGFR), 타입 III 표피 성장 인자 수용체 돌연변이(EGFR vIII), 상피 당단백질 2(EPG-2), 상피 당단백질 40(EPG-40), 에프린B2, 에프린 수용체 A2(EPHa2), 에스트로겐 수용체, Fc 수용체 유사 5(FCRL5; Fc 수용체 동족체 5 또는 FCRH5로도 공지), 태아 아세틸콜린 수용체(태아 AchR), 엽산 결합 단백질(FBP), 엽산 수용체 알파, 강글리오사이드 GD2, O-아세틸화 GD2(OGD2), 강글리오사이드 GD3, 당단백질 100(gp100), 글리피칸-3(GPC3), G 단백질 결합 수용체 C 클래스 5 그룹 D 멤버(GPRC5D), Her2/neu(수용체 티로신 키나아제 erb-B2), Her3(erb-B3), Her4(erb-B4), erbB 이량체, 인간 고분자량 흑색종 관련 항원(HMW-MAA), B형 간염 표면 항원, 인간 백혈구 항원 A1(HLA-A1), 인간 백혈구 항원 A2(HLA-A2), IL-22 수용체 알파(IL-22Rα), IL-13 수용체 알파 2(IL-13Rα2), 키나아제 삽입 도메인 수용체(kinase insert domain receptor, kdr), 카파 경쇄, L1 세포 부착 분자(L1-CAM), L1-CAM의 CE7 에피토프, 패밀리 8 A 멤버를 함유하는 류신 풍부 반복(Leucine Rich Repeat Containing 8 Family Member A, LRRC8A), 루이스 Y, 흑색종 관련 항원(MAGE)-A1, MAGE-A3, MAGE-A6, MAGE-A10, 메소텔린(MSLN), c-Met, 뮤린 시토메갈로 바이러스(CMV), 뮤신 1(MUC1), MUC16, 자연 살생 2 그룹 D 멤버(NKG2D) 리간드, 멜란 A (MART-1), 신경 세포 부착 분자(NCAM), 종양태아성 항원, 흑색종 우선 발현 항원(PRAME), 프로게스테론 수용체, 전립선 특이적 항원, 전립선 줄기 세포 항원(PSCA), 전립선 특이적 막 항원(PSMA), 수용체 티로신 키나아제 유사 희귀 수용체 1(ROR1), 서바이빈(survivin), 영양막 당단백질(TPBG, 5T4로도 공지), 종양 관련 당단백질 72(TAG72), 티로시나아제 관련 단백질 1(TRP1, TYRP1 또는 gp75로도 공지), 티로시나아제 관련 단백질 2(TRP2, 도파크롬 타우토메라제, 도파크롬 델타 이성화 효소 또는 DCT로도 공지), 혈관 내피 성장 인자 수용체 2(VEGFR2), 빌름스 종양 1(WT-1), 병원체 특이적 또는 병원체 발현 항원 또는 보편적 표지(universal tag) 관련 항원 및/또는 비오티닐화 분자 및/또는 HIV, HCV, HBV 또는 다른 병원체에 의해 발현된 분자 중에서 선택된다.
임의의 구현예의 일부에서, 세포외 영역은 스페이서를 포함한다. 임의의 구현예의 일부에서, 스페이서는 결합 도메인 및 막관통 도메인 사이에 작동 가능하게 연결된다. 임의의 구현예의 일부에서, 스페이서는 면역글로불린 힌지 영역을 포함한다. 임의의 구현예의 일부에서, 스페이서는 CH2 영역 및 CH3 영역을 포함한다.
임의의 구현예의 일부에서, 전이 유전자 서열에 의해 암호화된 세포내 영역의 일부는 하나 이상의 공자극 신호 전달 도메인을 포함한다. 임의의 구현예의 일부에서, 하나 이상의 공자극 신호 전달 도메인은 CD28, 4-1BB 또는 ICOS 또는 이들의 신호 전달 부분의 세포내 신호 전달 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 공자극 신호 전달 도메인은 인간 CD28의 신호 전달 도메인이다. 일부 구현예에서, 공자극 신호 전달 도메인은 인간 4-1BB의 신호 전달 도메인이다. 일부 구현예에서, 공자극 신호 전달 도메인은 인간 ICOS의 신호 전달 도메인이다. 임의의 구현예의 일부에서, 하나 이상의 공자극 신호 전달 도메인은 4-1BB, 예컨대 인간 4-1BB의 세포내 신호 전달 도메인을 포함한다.
임의의 구현예의 일부에서, 변형된 CD247 유전자 자리는 N 말단에서 C 말단까지 세포외 결합 도메인, 스페이서, 막관통 도메인 및 세포내 신호 전달 영역을 순서대로 포함하는 키메라 수용체를 암호화한다. 구체적인 구현예에서, 세포내 영역은 CD3제타(CD3ζ) 신호 전달 도메인을 함유하고, CD3ζ 신호 전달 도메인 또는 CD3ζ 신호 전달 도메인의 적어도 일부는 T 세포와 같은 조작된 세포의 내인성 CD247 유전자 자리(CD3ζ을 암호화하는 게놈 유전자 자리)의 게놈 서열에 의해 암호화된다.
임의의 구현예의 일부에서, 전이 유전자 서열은 세포외 결합 도메인; 스페이서; 및 막관통 도메인; 공자극 신호 전달 도메인;을 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열을 순서대로 포함한다. 임의의 구현예의 일부에서, 변형된 CD247 유전자 자리는 세포외 결합 도메인; 스페이서; 및 막관통 도메인; 공자극 신호 전달 도메인 및 CD3제타(CD3ζ) 신호 전달 도메인을 함유한 세포내 영역;을 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열을 순서대로 포함한다. 구체적인 구현예에서, 세포내 신호 전달 영역은 공자극 신호 전달 도메인 및 CD3제타(CD3ζ) 신호 전달 도메인을 함유하고, CD3ζ 신호 전달 도메인 또는 CD3ζ 신호 전달 도메인의 적어도 일부는 T 세포와 같은 조작된 세포의 내인성 CD247 유전자 자리(CD3ζ을 암호화하는 게놈 유전자 자리)의 게놈 서열(예를 들어, 개방형 해독틀)에 의해 암호화된다. 임의의 구현예의 일부에서, 전이 유전자 서열은 세포외 결합 도메인, 즉 scFv; 인간 면역글로불린 힌지의, 즉 IgG1, IgG2 또는 IgG4 또는 이의 변형된 버전의 서열을 포함하고, 또한 CH2 영역 및/또는 CH3 영역을 포함하는, 스페이서; 인간 CD28의, 막관통 도메인; 및 인간 4-1BB의, 공자극 신호 전달 도메인;을 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열을 순서대로 포함한다. 임의의 구현예의 일부에서, 변형된 CD247 유전자 자리는 세포외 결합 도메인, 즉 scFv; 인간 면역글로불린 힌지의, 즉 IgG1, IgG2 또는 IgG4 또는 이의 변형된 버전의 서열을 포함하고, 또한 CH2 영역 및/또는 CH3 영역을 포함하는, 스페이서; 인간 CD28의, 막관통 도메인; 인간 4-1BB의, 공자극 신호 전달 도메인 및 CD3ζ 신호 전달 도메인을 함유하는 세포내 영역;을 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열을 순서대로 포함한다. 구체적인 구현예에서, 세포내 영역은 공자극 신호 전달 도메인 및 CD3제타(CD3ζ) 신호 전달 도메인을 함유하고, CD3ζ 신호 전달 도메인 또는 CD3ζ 신호 전달 도메인의 적어도 일부는 T 세포와 같은 조작된 세포의 내인성 CD247 유전자 자리(CD3ζ을 암호화하는 게놈 유전자 자리)의 게놈 서열(예를 들어, 개방형 해독틀)에 의해 암호화된다.
임의의 구현예의 일부에서, 키메라 수용체는 다중 사슬 CAR인 CAR이다.
임의의 구현예의 일부에서, 전이 유전자 서열은 적어도 하나의 추가 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열을 포함한다. 예를 들어, 적어도 하나의 추가 단백질은 CAR의 또 다른 사슬일 수 있다. 일부 예에서, 적어도 하나의 추가 단백질은 키메라 수용체와 세포 상에서 동시 발현을 위한 대리 표지자 또는 절단형 수용체이다. 임의의 구현예의 일부에서, 전이 유전자 서열은, 예컨대 키메라 수용체와 하나 이상의 추가 단백질을 분리하는, 하나 이상의 다중 시스트론 요소를 포함한다. 임의의 구현예의 일부에서, 다중 시스트론 요소(들)는 키메라 수용체의 일부를 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열과 적어도 하나의 추가 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열 사이에 위치한다. 임의의 구현예의 일부에서, 적어도 하나의 추가 단백질은 대리 표지자이다. 임의의 구현예의 일부에서, 대리 표지자는 절단형 수용체이다. 임의의 구현예의 일부에서, 절단형 수용체는 세포내 신호 전달 도메인이 결여되어 있고/있거나 그의 리간드에 의해 결합될 때 세포내 신호 전달을 매개할 수 없다. 임의의 구현예의 일부에서, 키메라 수용체는 다중 사슬 CAR이고, 다중 시스트론 요소는 다중 사슬 CAR의 한 사슬을 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열과 다중 사슬 CAR의 다른 한 사슬을 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열 사이에 위치한다. 임의의 구현예의 일부에서, 하나 이상의 다중 시스트론 요소는 키메라 수용체의 일부를 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열의 상단부에 있다. 임의의 구현예의 일부에서, 하나 이상의 다중 시스트론 요소는 리보솜 스킵 서열이거나 이를 포함한다. 임의의 구현예의 일부에서, 리보솜 스킵 서열은 T2A, P2A, E2A 또는 F2A 요소이다.
임의의 구현예의 일부에서, 변형된 CD247 유전자 자리는 키메라 수용체를 암호화하는 핵산 서열의 발현을 제어하도록 작동 가능하게 연결된 내인성 CD247 유전자 자리의 프로모터 및/또는 조절 또는 제어 요소를 포함한다. 임의의 구현예의 일부에서, 변형된 유전자 자리는 키메라 수용체를 암호화하는 핵산 서열의 발현을 제어하도록 작동 가능하게 연결된 하나 이상의 이종성 조절 또는 제어 요소를 포함한다. 임의의 구현예의 일부에서, 하나 이상의 이종성 조절 또는 제어 요소는 프로모터, 인핸서, 인트론, 폴리아데닐화 신호, 코작(Kozak) 공통 서열, 스플라이스 수용체 서열 및/또는 스플라이스 공여체 서열을 포함한다. 임의의 구현예의 일부에서, 이종성 프로모터는 인간 신장 인자 1 알파(EF1α) 프로모터 또는 MND 프로모터 또는 이의 변이체이거나 이를 포함한다.
임의의 구현예의 일부에서, T 세포는 대상체로부터 유래된 1차 T 세포이다. 임의의 구현예의 일부에서, 대상체는 인간이다. 임의의 구현예의 일부에서, T 세포는 CD8+ T 세포 또는 이의 아형이다. 임의의 구현예의 일부에서, T 세포는 CD4+ T 세포 또는 이의 아형이다. 임의의 구현예의 일부에서, T 세포는 다분화능 또는 다능성 세포로부터 유래된다. 임의의 구현예의 일부에서, 다능성 세포는 iPSC이다. 임의의 구현예의 일부에서, T 세포는 다분화능 또는 다능성 세포로부터 유래되고, 다분화능 또는 다능성 세포는 iPSC이다.
폴리뉴클레오타이드, 예컨대 키메라 수용체를 암호화하는 전이 유전자 서열을 CD247 유전자 자리 내로 통합하는 데 사용될 수 있는 폴리뉴클레오타이드가 또한 본원에 제공된다. 임의의 구현예의 일부에서, 폴리뉴클레오타이드는 (a) 키메라 수용체 또는 이의 일부를 암호화하는 핵산 서열; 및 (b) 핵산 서열에 연결된 하나 이상의 상동성 암 - 하나 이상의 상동성 암은 CD247 유전자 자리의 개방형 해독틀 또는 이의 부분 서열의 하나 이상의 영역에 대해 상동성인 서열을 포함함 - 을 포함한다. 일부 구현예의 일부에서, 폴리뉴클레오타이드의 CD247 유전자 자리 내로의 통합은 세포내 영역(예를 들어, CD3ζ 신호 전달 도메인을 포함하는 세포내 영역)을 포함하는 키메라 수용체를 암호화하고 (a)의 핵산 서열은 키메라 수용체의 일부를 암호화하는 핵산 서열이고, 상기 일부는 키메라 수용체의 전(full) 세포내 영역을 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 전(full) 세포내 영역은 CD3제타(CD3ζ) 신호 전달 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 전(full) 세포내 영역은 공자극 신호 전달 도메인 및 CD3제타(CD3ζ) 신호 전달 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, (a)의 핵산 서열은 CD3제타(CD3ζ) 신호 전달 도메인을 암호화하는 전체 또는 전장 서열을 포함하지 않는 키메라 수용체의 일부를 암호화한다. 일부 구현예에서, (a)의 핵산 서열은 CD3제타(CD3ζ) 신호 전달 도메인을 암호화하는 어떤 서열도 함유하지 않는다. 일부 구현예에서, (a)의 핵산 서열은 CD3제타(CD3ζ) 신호 전달 도메인의 단편을 포함하는 세포내 영역을 암호화한다. 상기 임의 예에서, (a)의 핵산 서열은 세포내 영역의 공자극 신호 전달 도메인을 암호화할 수 있다.
(a) 키메라 수용체의 일부를 암호화하는 핵산 서열 - 상기 키메라 수용체는 세포내 영역(예를 들어, CD3ζ 신호 전달 도메인을 포함하는 세포내 영역)을 포함하고, 키메라 수용체의 일부는 키메라 수용체의 전(full) 세포내 영역 미만을 포함함 -; 및 (b) 핵산 서열에 연결된 하나 이상의 상동성 암 - 하나 이상의 상동성 암은 CD247 유전자 자리의 개방형 해독틀 또는 이의 부분 서열의 하나 이상의 영역에 대해 상동성인 서열을 포함함 - 을 함유하는 폴리뉴클레오타이드가 또한 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드는 키메라 수용체를 암호화하는 전이 유전자 서열을 CD247 유전자 자리 내로 통합하는 데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 전(full) 세포내 영역은 CD3제타(CD3ζ) 신호 전달 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 전(full) 세포내 영역은 공자극 신호 전달 도메인 및 CD3제타(CD3ζ) 신호 전달 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, (a)의 핵산 서열은 CD3제타(CD3ζ) 신호 전달 도메인을 암호화하는 전체 또는 전장 서열을 포함하지 않는 키메라 수용체의 일부를 암호화한다. 일부 구현예에서, (a)의 핵산 서열은 CD3제타(CD3ζ) 신호 전달 도메인을 암호화하는 어떤 서열도 함유하지 않는다. 일부 구현예에서, (a)의 핵산 서열은 CD3제타(CD3ζ) 신호 전달 도메인의 단편을 포함하는 세포내 영역을 암호화한다. 상기 임의 예에서, (a)의 핵산 서열은 세포내 영역의 공자극 신호 전달 도메인을 암호화할 수 있다.
임의의 구현예의 일부에서, 키메라 수용체의 전(full) 세포내 영역은 CD3제타(CD3ζ) 신호 전달 도메인 또는 이의 단편을 포함하고, 세포내 영역의 적어도 일부는, 키메라 수용체가 폴리뉴클레오타이드가 도입된 세포로부터 발현될 때, 내인성 CD247 유전자 자리의 개방형 해독틀 또는 이의 부분 서열에 의해 암호화된다.
임의의 구현예의 일부에서, 키메라 수용체의 일부를 암호화하는 핵산 서열 및 하나 이상의 상동성 암은 키메라 수용체의 세포내 영역을 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열의 적어도 단편을 함께 포함하고, 세포내 영역의 적어도 일부는, 키메라 수용체가 폴리뉴클레오타이드가 도입된 세포로부터 발현될 때, CD247 유전자 자리의 개방형 해독틀 또는 이의 부분 서열에 의해 암호화되는 CD3ζ 신호 전달 도메인 또는 이의 단편을 포함한다.
임의의 구현예의 일부에서, (a)의 핵산 서열은 3’ UTR을 암호화하는 서열을 포함하지 않는다. 임의의 구현예의 일부에서, (a)의 핵산 서열은 인트론을 포함하지 않는다.
임의의 구현예의 일부에서, (a)의 핵산 서열은 CD3ζ 신호 전달 도메인의 단편을 암호화한다. 상기 구현예에서, 키메라 수용체가 폴리뉴클레오타이드가 도입된 세포로부터 발현될 때, CD3ζ 신호 전달 도메인의 적어도 일부는 T 세포와 같은 조작된 세포의 내인성 CD247 유전자 자리(CD3ζ을 암호화하는 게놈 유전자 자리)의 게놈 서열에 의해 암호화된다. 예를 들어, 구체적인 구현예에서, 키메라 수용체의 CD3ζ 신호 전달 도메인 또는 이의 단편은 전이 유전자 서열의 서열에 의해 그리고 T 세포와 같은 조작된 세포의 내인성 CD247 유전자 자리(CD3ζ을 암호화하는 게놈 유전자 자리)의 게놈 서열에 의해 함께 암호화된다.
임의의 구현예의 일부에서, (a)의 핵산 서열은 CD3ζ 신호 전달 도메인 또는 이의 단편을 암호화하지 않는다. 상기 구현예에서, 키메라 수용체가 폴리뉴클레오타이드가 도입된 세포로부터 발현될 때, 키메라 수용체의 CD3ζ 신호 전달 도메인 전체 또는 전장 또는 이의 단편은 T 세포와 같은 조작된 세포의 내인성 CD247 유전자 자리(CD3ζ을 암호화하는 게놈 유전자 자리)의 게놈 서열에 의해 암호화된다.
임의의 구현예의 일부에서, 내인성 CD247 유전자 자리의 개방형 해독틀 또는 이의 부분 서열은 내인성 CD247 유전자 자리의 적어도 하나의 인트론 및 적어도 하나의 엑손을 포함한다. 임의의 구현예의 일부에서, 개방형 해독틀 또는 이의 부분 서열은 내인성 CD247 유전자 자리의 3’ UTR을 암호화한다.
임의의 구현예의 일부에서, 암호화된 키메라 수용체의 CD3ζ 신호 전달 도메인의 적어도 단편, 예컨대 전체 CD3ζ 신호 전달 도메인은, 키메라 수용체가 폴리뉴클레오타이드가 도입된 세포로부터 발현될 때, 내인성 CD247 유전자 자리의 개방형 해독틀 또는 이의 부분 서열에 의해 암호화된다.
임의의 구현예의 일부에서, (a)의 핵산 서열은 T 세포, 예컨대 인간 T 세포의 내인성 게놈 CD247 유전자 자리의 개방형 해독틀에 외인성이거나 이종성인 서열이다.
임의의 구현예의 일부에서, (a)의 핵산 서열은 하나 이상의 상동성 암에 포함된 CD247 유전자 자리의 개방형 해독틀 또는 이의 부분 서열의 하나 이상의 엑손과 틀 내에 있는 뉴클레오타이드의 서열을 포함한다.
임의의 구현예의 일부에서, 내인성 CD247 유전자 자리의 개방형 해독틀 또는 이의 부분 서열의 하나 이상의 영역(들)은 CD247 유전자 자리의 개방형 해독틀의 엑손 8의 상단부에 있는 서열이거나 이를 포함한다. 임의의 구현예의 일부에서, 개방형 해독틀의 하나 이상의 영역(들)은 CD247 유전자 자리의 개방형 해독틀의 엑손 3의 상단부에 있는 서열이거나 이를 포함한다. 임의의 구현예의 일부에서, 개방형 해독틀의 하나 이상의 영역(들)은 CD247 유전자 자리의 개방형 해독틀의 엑손 3을 포함하는 서열이거나 이를 포함한다. 임의의 구현예의 일부에서, 개방형 해독틀의 하나 이상의 영역(들)은 CD247 유전자 자리의 개방형 해독틀의 엑손 2의 적어도 일부를 포함하는 서열이거나 이를 포함한다. 임의의 구현예의 일부에서, 하나 이상의 상동성 암은, 내인성 CD247 유전자 자리의 개방형 해독틀의 엑손 1을 포함하지 않고/거나, 엑손 1의 전장을 포함하지 않고/거나 엑손 2의 전장을 포함하지 않는다.
임의의 구현예의 일부에서, 폴리뉴클레오타이드가 도입된 세포에 의해 발현될 때, 암호화된 키메라 수용체는 CD3ζ 신호 전달 도메인을 통해 신호 전달을 할 수 있다. 임의의 구현예의 일부에서, 키메라 수용체에 의해 암호화된 전(full) 세포내 영역의 CD3ζ 신호 전달 도메인은 서열 번호: 13-15 중 어느 하나에서 선택된 서열, 또는 서열 번호: 13-15 중 어느 하나에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 동일성을 나타내는 서열, 또는 이의 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, CD3ζ 신호 전달 도메인은 서열 번호: 13에 제시된 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, CD3ζ 신호 전달 도메인은 서열 번호: 14에 제시된 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, CD3ζ 신호 전달 도메인은 서열 번호: 15에 제시된 서열을 갖는다.
임의의 구현예의 일부에서, 하나 이상의 상동성 암은 5’ 상동성 암 및 3’ 상동성 암을 포함한다. 임의의 구현예의 일부에서, 폴리뉴클레오타이드는 [5’ 상동성 암]-[(a)의 핵산 서열]-[3’ 상동성 암] 구조를 포함한다.
임의의 구현예의 일부에서, 5’ 상동성 암 및 3’ 상동성암은 독립적으로 (약) 50 내지 (약) 2000개 뉴클레오타이드, (약) 100 내지 (약) 1000개 뉴클레오타이드, (약) 100 내지 (약) 750개 뉴클레오타이드, (약) 100 내지 (약) 600개 뉴클레오타이드, (약) 100 내지 (약) 400개 뉴클레오타이드, (약) 100 내지 (약) 300개 뉴클레오타이드, (약) 100 내지 (약) 200개 뉴클레오타이드, (약) 200 내지 (약) 1000개 뉴클레오타이드, (약) 200 내지 (약) 750개 뉴클레오타이드, (약) 200 내지 (약) 600개 뉴클레오타이드, (약) 200 내지 (약) 400개 뉴클레오타이드, (약) 200 내지 (약) 300개 뉴클레오타이드, (약) 300 내지 (약) 1000개 뉴클레오타이드, (약) 300 내지 (약) 750개 뉴클레오타이드, (약) 300 내지 (약) 600개 뉴클레오타이드, (약) 300 내지 (약) 400개 뉴클레오타이드, (약) 400 내지 (약) 1000개 뉴클레오타이드, (약) 400 내지 (약) 750개 뉴클레오타이드, (약) 400 내지 (약) 600개 뉴클레오타이드, (약) 600 내지 (약) 1000개 뉴클레오타이드, (약) 600 내지 (약) 750개 뉴클레오타이드 또는 (약) 750 내지 (약) 1000개 뉴클레오타이드 길이이다. 임의의 구현예의 일부에서, 5’ 상동성 암 및 3’ 상동성 암은 독립적으로 (약) 200, 300, 400, 500, 600, 700 또는 800개 뉴클레오타이드 길이이거나, 또는 전술한 임의의 수치 사이의 임의의 수치 길이이다. 임의의 구현예의 일부에서, 5’ 상동성 암 및 3’ 상동성 암은 독립적으로 (약) 300개 뉴클레오타이드 길이를 초과한다. 임의의 구현예의 일부에서, 5’ 상동성 암 및 3’ 상동성 암은 독립적으로 (약) 400, 500 또는 600개 뉴클레오타이드 길이이거나, 또는 전술한 임의의 수치 사이의 임의의 수치 길이이다.
임의의 구현예의 일부에서, 5’ 상동성 암은 서열 번호: 80에 제시된 서열 또는 서열 번호: 80에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 동일성을 나타내는 서열 또는 이의 부분 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 5’ 상동성 암은 서열 번호: 80에 제시된 서열을 포함하다. 일부 구현예에서, 5’ 상동성 암은 서열 번호: 80에 제시된 서열로 구성되거나 이를 필수적으로 포함하여 구성된다. 임의의 구현예의 일부에서, 3’ 상동성 암은 서열 번호: 81에 제시된 서열 또는 서열 번호: 81에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 동일성을 나타내는 서열 또는 이의 부분 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 3’ 상동성 암은 서열 번호: 81에 제시된 서열을 포함하다. 일부 구현예에서, 3’ 상동성 암은 서열 번호: 81에 제시된 서열로 구성되거나 이를 필수적으로 포함하여 구성된다.
임의의 구현예의 일부에서, 키메라 수용체는 기능성 비-T 세포 수용체(비-TCR) 항원 수용체이거나 이를 포함한다.
임의의 구현예의 일부에서, 키메라 수용체는 키메라 항원 수용체(CAR)이다.
임의의 구현예의 일부에서, (a)의 핵산 서열은 세포외 영역을 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열 및 막관통 도메인 및/또는 세포내 영역의 일부를 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열을 포함한다. 임의의 구현예의 일부에서, (a)의 핵산 서열은 세포외 영역을 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열, 막관통 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열 및 세포내 영역의 일부를 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열을 포함한다. 임의의 구현예의 일부에서, 세포외 영역은 결합 도메인을 포함한다. 임의의 구현예의 일부에서, 결합 도메인은 항체 또는 이의 항원 결합 단편이거나 이를 포함한다.
임의의 구현예의 일부에서, 결합 도메인은 질병, 장애 또는 병태의 세포 또는 조직과 관련된, 이에 특이적인 및/또는 이에서 발현되는 표적 항원에 결합할 수 있다. 임의의 구현예의 일부에서, 표적 항원은 종양 항원이다. 임의의 구현예의 일부에서, 표적 항원은 αvβ6 인테그린(avb6 integrin), B 세포 성숙 항원(BCMA), B7-H3, B7-H6, 탄산 탈수 효소 9(CA9, CAIX 또는 G250으로도 공지), 암 고환 항원, 암/고환 항원 1B(CTAG, NY-ESO-1 및 LAGE-2로도 공지), 암배아 항원(CEA), 사이클린, 사이클린 A2, C-C 모티프 케모카인 리간드 1(CCL-1), CD19, CD20, CD22, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD123, CD133, CD138, CD171, 콘드로이틴 황산염 프로테오글리칸 4(chondroitin sulfate proteoglycan 4, CSPG4), 표피 성장 인자 단백질(EGFR), 타입 III 표피 성장 인자 수용체 돌연변이(EGFR vIII), 상피 당단백질 2(EPG-2), 상피 당단백질 40(EPG-40), 에프린B2, 에프린 수용체 A2(EPHa2), 에스트로겐 수용체, Fc 수용체 유사 5(FCRL5; Fc 수용체 동족체 5 또는 FCRH5로도 공지), 태아 아세틸콜린 수용체(태아 AchR), 엽산 결합 단백질(FBP), 엽산 수용체 알파, 강글리오사이드 GD2, O-아세틸화 GD2(OGD2), 강글리오사이드 GD3, 당단백질 100(gp100), 글리피칸-3(GPC3), G 단백질 결합 수용체 C 클래스 5 그룹 D 멤버(GPRC5D), Her2/neu(수용체 티로신 키나아제 erb-B2), Her3(erb-B3), Her4(erb-B4), erbB 이량체, 인간 고분자량 흑색종 관련 항원(HMW-MAA), B형 간염 표면 항원, 인간 백혈구 항원 A1(HLA-A1), 인간 백혈구 항원 A2(HLA-A2), IL-22 수용체 알파(IL-22Rα), IL-13 수용체 알파 2(IL-13Rα2), 키나아제 삽입 도메인 수용체(kinase insert domain receptor, kdr), 카파 경쇄, L1 세포 부착 분자(L1-CAM), L1-CAM의 CE7 에피토프, 패밀리 8 A 멤버를 함유하는 류신 풍부 반복(Leucine Rich Repeat Containing 8 Family Member A, LRRC8A), 루이스 Y, 흑색종 관련 항원(MAGE)-A1, MAGE-A3, MAGE-A6, MAGE-A10, 메소텔린(MSLN), c-Met, 뮤린 시토메갈로 바이러스(CMV), 뮤신 1(MUC1), MUC16, 자연 살생 2 그룹 D 멤버(NKG2D) 리간드, 멜란 A (MART-1), 신경 세포 부착 분자(NCAM), 종양태아성 항원, 흑색종 우선 발현 항원(PRAME), 프로게스테론 수용체, 전립선 특이적 항원, 전립선 줄기 세포 항원(PSCA), 전립선 특이적 막 항원(PSMA), 수용체 티로신 키나아제 유사 희귀 수용체 1(ROR1), 서바이빈(survivin), 영양막 당단백질(TPBG, 5T4로도 공지), 종양 관련 당단백질 72(TAG72), 티로시나아제 관련 단백질 1(TRP1, TYRP1 또는 gp75로도 공지), 티로시나아제 관련 단백질 2(TRP2, 도파크롬 타우토메라제, 도파크롬 델타 이성화 효소 또는 DCT로도 공지), 혈관 내피 성장 인자 수용체 2(VEGFR2), 빌름스 종양 1(WT-1), 병원체 특이적 또는 병원체 발현 항원 또는 보편적 표지(universal tag) 관련 항원 및/또는 비오티닐화 분자 및/또는 HIV, HCV, HBV 또는 다른 병원체에 의해 발현된 분자 중에서 선택된다.
임의의 구현예의 일부에서, 세포외 영역은 스페이서를 포함한다. 임의의 구현예의 일부에서, 스페이서는 결합 도메인 및 막관통 도메인 사이에 작동 가능하게 연결된다. 임의의 구현예의 일부에서, 스페이서는 면역글로불린 힌지 영역을 포함한다. 임의의 구현예의 일부에서, 스페이서는 CH2 영역 및 CH3 영역을 포함한다.
임의의 구현예의 일부에서, (a)의 핵산에 의해 암호화된 세포내 영역의 일부는 하나 이상의 공자극 신호 전달 도메인을 포함한다. 임의의 구현예의 일부에서, 하나 이상의 공자극 신호 전달 도메인은 CD28, 4-1BB 또는 ICOS 또는 이들의 신호 전달 부분의 세포내 신호 전달 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 공자극 신호 전달 도메인은 인간 CD28의 신호 전달 도메인이다. 일부 구현예에서, 공자극 신호 전달 도메인은 인간 4-1BB의 신호 전달 도메인이다. 일부 구현예에서, 공자극 신호 전달 도메인은 인간 ICOS의 신호 전달 도메인이다. 임의의 구현예의 일부에서, 하나 이상의 공자극 신호 전달 도메인은 4-1BB, 예컨대 인간 4-1BB의 세포내 신호 전달 도메인을 포함한다.
임의의 구현예의 일부에서, 암호화된 키메라 수용체는, 키메라 수용체가 폴리뉴클레오타이드가 도입된 세포로부터 발현될 때, N 말단에서 C 말단까지 세포외 결합 도메인, 스페이서, 막관통 도메인 및 세포내 신호 전달 영역을 순서대로 포함한다. 구체적인 구현예에서, T 세포와 같은 세포로부터 발현될 때, 암호화된 키메라 수용체의 세포내 영역은 CD3제타(CD3ζ) 신호 전달 도메인을 함유하고, 전체 CD3ζ 신호 전달 도메인 또는 CD3ζ 신호 전달 도메인의 적어도 일부는 내인성 CD247 유전자 자리(CD3ζ을 암호화하는 게놈 유전자 자리)의 게놈 서열에 의해 암호화된다.
임의의 구현예의 일부에서, (a)의 서열은 세포외 결합 도메인; 스페이서; 및 막관통 도메인; 및 공자극 신호 전달 도메인;을 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열을 순서대로 포함한다. 임의의 구현예의 일부에서, (a)의 서열은 세포외 결합 도메인; 스페이서; 막관통 도메인; 및 공자극 신호 전달 도메인 및 CD3ζ 신호 전달 도메인의 단편을 함유한 세포내 신호 전달 영역;을 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열을 순서대로 포함한다. 구체적인 구현예에서, T 세포와 같은 세포로부터 발현될 때, 폴리뉴클레오타이드는 공자극 신호 전달 도메인 및 CD3제타(CD3ζ) 신호 전달 도메인을 함유하는 세포내 신호 전달 영역이 있는 키메라 수용체를 암호화하고, CD3ζ 신호 전달 도메인 또는 CD3ζ 신호 전달 도메인의 적어도 일부는 T 세포와 같은 조작된 세포의 내인성 CD247 유전자 자리(CD3ζ을 암호화하는 게놈 유전자 자리)의 게놈 서열에 의해 암호화된다.
임의의 구현예의 일부에서, (a)의 핵산 서열은 세포외 결합 도메인, 즉 scFv; 인간 면역글로불린 힌지의, 즉 IgG1, IgG2 또는 IgG4 또는 이의 변형된 버전의 서열을 포함하고, 또한 CH2 영역 및/또는 CH3 영역을 포함하는, 스페이서; 인간 CD28의, 막관통 도메인; 및 인간 4-1BB의, 공자극 신호 전달 도메인;을 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열을 순서대로 포함한다. 임의의 구현예의 일부에서, (a)의 서열은 세포외 결합 도메인, 즉 scFv; 인간 면역글로불린 힌지의, 즉 IgG1, IgG2 또는 IgG4 또는 이의 변형된 버전의 서열을 포함하고, 또한 CH2 영역 및/또는 CH3 영역을 포함하는, 스페이서; 인간 CD28의, 막관통 도메인; 인간 4-1BB의, 공자극 신호 전달 도메인 및 CD3ζ 신호 전달 도메인의 단편을 함유하는 세포내 영역;을 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열을 순서대로 포함한다. 구체적인 구현예에서, T 세포와 같은 세포로부터 발현될 때, 폴리뉴클레오타이드는 인간 4-1BB 공자극 신호 전달 도메인 및 CD3제타(CD3ζ) 신호 전달 도메인을 함유하는 세포내 신호 전달 영역이 있는 키메라 수용체를 암호화하고, CD3ζ 신호 전달 도메인 또는 CD3ζ 신호 전달 도메인의 적어도 일부는 T 세포와 같은 조작된 세포의 내인성 CD247 유전자 자리(CD3ζ을 암호화하는 게놈 유전자 자리)의 게놈 서열에 의해 암호화된다. 임의의 구현예의 일부에서, 변형된 CD247 유전자 자리는, 폴리뉴클레오타이드의 T 세포 내로의 도입 이후, 세포외 결합 도메인, 즉 scFv; 인간 면역글로불린 힌지의, 즉 IgG1, IgG2 또는 IgG4 또는 이의 변형된 버전의 서열을 포함하고, 또한 CH2 영역 및/또는 CH3 영역을 포함하는, 스페이서; 인간 CD28의, 막관통 도메인; 및 인간 4-1BB의, 공자극 신호 전달 도메인;을 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열을 순서대로 포함한다.
임의의 구현예의 일부에서, CAR은 다중 사슬 CAR이다. 임의의 구현예의 일부에서, (a)의 핵산 서열은 적어도 하나의 추가 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열을 포함한다.
임의의 구현예의 일부에서, (a)의 핵산 서열은 하나 이상의 다중 시스트론 요소를 포함한다. 임의의 구현예의 일부에서, 다중 시스트론 요소(들)는 키메라 수용체의 일부를 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열과 적어도 하나의 추가 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열 사이에 위치한다. 임의의 구현예의 일부에서, 적어도 하나의 추가 단백질은 대리 표지자이다. 임의의 구현예의 일부에서, 대리 표지자는 절단형 수용체이다. 임의의 구현예의 일부에서, 절단형 수용체는 세포내 신호 전달 도메인이 결여되어 있고/있거나 그의 리간드에 의해 결합될 때 세포내 신호 전달을 매개할 수 없다. 임의의 구현예의 일부에서, 키메라 수용체는 다중 사슬 CAR이고, 다중 시스트론 요소는 다중 사슬 CAR의 한 사슬을 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열과 다중 사슬 CAR의 다른 한 사슬을 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열 사이에 위치한다. 임의의 구현예의 일부에서, 하나 이상의 다중 시스트론 요소는 키메라 수용체의 일부를 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열의 상단부에 있다. 임의의 구현예의 일부에서, 하나 이상의 다중 시스트론 요소는 리보솜 스킵 서열이거나 이를 포함한다. 임의의 구현예의 일부에서, 리보솜 스킵 서열은 T2A, P2A, E2A 또는 F2A 요소이다.
임의의 구현예의 일부에서, 변형된 CD247 유전자 자리는, 폴리뉴클레오타이드의 T 세포 내로의 도입 이후, 키메라 수용체를 암호화하는 핵산 서열의 발현을 제어하도록 작동 가능하게 연결된 내인성 CD247 유전자 자리의 프로모터 및/또는 조절 또는 제어 요소를 포함한다. 임의의 구현예의 일부에서, 변형된 유전자 자리는 키메라 수용체를 암호화하는 핵산 서열의 발현을 제어하도록 작동 가능하게 연결된 하나 이상의 이종성 조절 또는 제어 요소를 포함한다. 임의의 구현예의 일부에서, 하나 이상의 이종성 조절 또는 제어 요소는 프로모터, 인핸서, 인트론, 폴리아데닐화 신호, 코작(Kozak) 공통 서열, 스플라이스 수용체 서열 및/또는 스플라이스 공여체 서열을 포함한다. 임의의 구현예의 일부에서, 이종성 프로모터는 인간 신장 인자 1 알파(EF1α) 프로모터 또는 MND 프로모터 또는 이의 변이체이거나 이를 포함한다.
임의의 구현예의 일부에서, (a)의 핵산 서열은 키메라 수용체를 암호화하는 핵산 서열의 발현을 제어하도록 작동 가능하게 연결된 하나 이상의 이종성 조절 또는 제어 요소를 포함한다. 임의의 구현예의 일부에서, 하나 이상의 이종성 조절 또는 제어 요소는 프로모터, 인핸서, 인트론, 폴리아데닐화 신호, 코작(Kozak) 공통 서열, 스플라이스 수용체 서열 및/또는 스플라이스 공여체 서열을 포함한다. 임의의 구현예의 일부에서, 이종성 프로모터는 인간 신장 인자 1 알파(EF1α) 프로모터 또는 MND 프로모터 또는 이의 변이체이거나 이를 포함한다.
임의의 구현예의 일부에서, 폴리뉴클레오타이드는 바이러스 벡터에 포함된다. 임의의 구현예의 일부에서, 바이러스 벡터는 AAV 벡터이다. 임의의 구현예의 일부에서, AAV 벡터는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7 또는 AAV8 벡터 중에서 선택된다. 임의의 구현예의 일부에서, AAV 벡터는 AAV2 또는 AAV6 벡터이다. 임의의 구현예의 일부에서, 바이러스 벡터는 레트로바이러스 벡터이다. 임의의 구현예의 일부에서, 바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터이다.
임의의 구현예의 일부에서, 폴리뉴클레오타이드는 선형 폴리뉴클레오타이드이다. 임의의 구현예의 일부에서, 폴리뉴클레오타이드는 이중 가닥 폴리뉴클레오타이드 또는 단일 가닥 폴리뉴클레오타이드이다.
임의의 구현예의 일부에서, 폴리뉴클레오타이드는 적어도 (약) 2500, 2750, 3000, 3250, 3500, 3750, 4000, 4250, 4500, 4760, 5000, 5250, 5500, 5750, 6000, 7000, 7500, 8000, 9000 또는 10000개 뉴클레오타이드 길이이거나, 또는 전술한 임의의 수치 사이의 임의의 수치 길이이다. 임의의 구현예의 일부에서, 폴리뉴클레오타이드는 (약) 2500 내지 (약) 5000개 뉴클레오타이드, (약) 3500 내지 (약) 4500개 뉴클레오타이드 또는 (약) 3750개 뉴클레오타이드 내지 (약) 4250개 뉴클레오타이드 길이이다.　
유전자 조작된 T 세포를 생산하는 방법이 본원에 또한 제공되고, 본 방법은 본원에 제공된 구현예들 중 어느 하나의 폴리뉴클레오타이드를 CD247 유전자 자리에 유전자 파괴를 포함하는 T 세포 내로 도입하는 단계를 포함한다.
유전자 조작된 T 세포를 생산하는 방법이 본원에 또한 제공되고, 본 방법은: (a) T 세포 내로, T 세포의 내인성 CD247 유전자 자리 내의 표적 부위에서 유전자 파괴를 유도할 수 있는 하나 이상의 제제(들)을 도입하는 것과 (b) CD247 유전자 자리에 유전자 파괴를 포함하는 T 세포 내로, 본원에 기술된 임의의 폴리뉴클레오타이드들을 도입하는 것을 포함하고, 여기서 본 방법은 변형된 CD247 유전자 자리를 생산하고, 상기 변형된 CD247 유전자 자리는 CD3ζ 신호 전달 도메인을 포함하는 세포내 영역을 포함하는 키메라 수용체를 암호화하는 핵산 서열을 포함한다.
임의의 구현예의 일부에서, 폴리뉴클레오타이드는 키메라 수용체 또는 이의 일부를 암호화하는 핵산 서열을 포함하고, 키메라 수용체 또는 이의 일부를 암호화하는 핵산 서열은 상동 직접 수선(HDR)을 통해 내인성 CD247 유전자 자리 내에서 통합된다.
유전자 조작된 T 세포를 생산하는 방법이 본원에 또한 제공되고, 본 방법은 T 세포 내로 키메라 수용체 또는 이의 일부를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 도입하는 것을 포함하고, T 세포는 T 세포의 CD247 유전자 자리 내에 유전자 파괴를 가지며, 키메라 수용체 또는 이의 일부를 암호화하는 핵산 서열은 상동 직접 수선(HDR)을 통해 내인성 CD247 유전자 자리 내에서 통합된다.
임의의 구현예의 일부에서, 유전자 파괴는 T 세포 내로, T 세포의 내인성 CD247 유전자 자리 내의 표적 부위에 유전자 파괴를 유도할 수 있는 하나 이상의 제제를 도입하여 수행된다.
임의의 구현예의 일부에서, 본 방법은 변형된 CD247 유전자 자리를 생산하고, 상기 변형된 CD247 유전자 자리는 CD3ζ 신호 전달 도메인을 포함하는 세포내 영역을 포함하는 키메라 수용체를 암호화하는 핵산 서열을 포함한다.
임의의 구현예의 일부에서, 키메라 수용체 또는 이의 일부를 암호화하는 핵산 서열은 키메라 수용체의 일부를 암호화한다. 임의의 구현예의 일부에서, 폴리뉴클레오타이드는 핵산 서열에 연결된 하나 이상의 상동성 암을 더 포함하되, 하나 이상의 상동성 암은 CD247 유전자 자리의 개방형 해독틀의 하나 이상의 영역에 대해 상동성인 서열을 포함한다.
임의의 구현예의 일부에서, 키메라 수용체의 전(full) 세포내 영역은 CD3제타(CD3ζ) 신호 전달 도메인 또는 이의 단편을 포함하고, 세포내 영역의 적어도 일부는 본 방법에 의해 생성된 세포에서 내인성 CD247 유전자 자리의 개방형 해독틀 또는 이의 부분 서열에 의해 암호화된다.
임의의 구현예의 일부에서, 키메라 수용체의 일부를 암호화하는 핵산 서열 및 하나 이상의 상동성 암은 키메라 수용체의 세포내 영역을 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열의 적어도 단편을 함께 포함하고, 세포내 영역의 적어도 일부는 본 방법에 의해 생성된 세포에서 CD247 유전자 자리의 개방형 해독틀 또는 이의 부분 서열에 의해 암호화되는 CD3ζ 신호 전달 도메인 또는 이의 단편을 포함한다.
임의의 구현예의 일부에서, 키메라 수용체 또는 이의 일부를 암호화하는 핵산 서열은 3’ UTR을 암호화하는 서열을 포함하지 않는다. 임의의 구현예의 일부에서, 키메라 수용체 또는 이의 일부를 암호화하는 핵산 서열은 본 방법에 의해 생성된 세포에서 CD3ζ 신호 전달 도메인의 단편을 암호화한다. 임의의 구현예의 일부에서, 키메라 수용체 또는 이의 일부를 암호화하는 핵산 서열은 본 방법에 의해 생성된 세포에서 CD3ζ 신호 전달 도메인 또는 이의 단편을 암호화하지 않는다. 임의의 구현예의 일부에서, 암호화된 키메라 수용체의 CD3ζ 신호 전달 도메인의 적어도 단편, 예컨대 전체 CD3ζ 신호 전달 도메인은 본 방법에 의해 생성된 세포에서 내인성 CD247 유전자 자리의 개방형 해독틀 또는 이의 부분 서열에 의해 암호화된다.
임의의 구현예의 일부에서, 키메라 수용체 또는 이의 일부를 암호화하는 (a)의 핵산 서열은 T 세포, 예컨대 인간 T 세포의 내인성 게놈 CD247 유전자 자리의 개방형 해독틀에 외인성이거나 이종성인 서열이다.
임의의 구현예의 일부에서, 키메라 수용체 또는 이의 일부를 암호화하는 핵산 서열은 하나 이상의 상동성 암에 포함된 CD247 유전자 자리의 개방형 해독틀 또는 이의 부분 서열의 하나 이상의 엑손과 틀 내에 있는 뉴클레오타이드의 서열을 포함한다.
임의의 구현예의 일부에서, 폴리뉴클레오타이드가 도입된 세포에 의해 발현될 때, 키메라 수용체는 CD3ζ 신호 전달 도메인을 통해 신호 전달을 할 수 있다. 임의의 구현예의 일부에서, 전(full) 세포내 영역의 CD3ζ 신호 전달 도메인은 서열 번호: 13-15 중 어느 하나에서 선택된 서열, 또는 서열 번호: 13-15 중 어느 하나에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 동일성을 나타내는 서열, 또는 이의 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, CD3ζ 신호 전달 도메인은 서열 번호: 13에 제시된 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, CD3ζ 신호 전달 도메인은 서열 번호: 14에 제시된 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, CD3ζ 신호 전달 도메인은 서열 번호: 15에 제시된 서열을 포함한다.
임의의 구현예의 일부에서, 하나 이상의 상동성 암은 5’ 상동성 암 및 3’ 상동성 암을 포함한다. 임의의 구현예의 일부에서, 폴리뉴클레오타이드는 [5’ 상동성 암]-[키메라 수용체 또는 이의 일부를 암호화하는 핵산 서열]-[3’ 상동성 암] 구조를 포함한다.
임의의 구현예의 일부에서, 5’ 상동성 암 및 3’ 상동성암은 독립적으로 (약) 50 내지 (약) 2000개 뉴클레오타이드, (약) 100 내지 (약) 1000개 뉴클레오타이드, (약) 100 내지 (약) 750개 뉴클레오타이드, (약) 100 내지 (약) 600개 뉴클레오타이드, (약) 100 내지 (약) 400개 뉴클레오타이드, (약) 100 내지 (약) 300개 뉴클레오타이드, (약) 100 내지 (약) 200개 뉴클레오타이드, (약) 200 내지 (약) 1000개 뉴클레오타이드, (약) 200 내지 (약) 750개 뉴클레오타이드, (약) 200 내지 (약) 600개 뉴클레오타이드, (약) 200 내지 (약) 400개 뉴클레오타이드, (약) 200 내지 (약) 300개 뉴클레오타이드, (약) 300 내지 (약) 1000개 뉴클레오타이드, (약) 300 내지 (약) 750개 뉴클레오타이드, (약) 300 내지 (약) 600개 뉴클레오타이드, (약) 300 내지 (약) 400개 뉴클레오타이드, (약) 400 내지 (약) 1000개 뉴클레오타이드, (약) 400 내지 (약) 750개 뉴클레오타이드, (약) 400 내지 (약) 600개 뉴클레오타이드, (약) 600 내지 (약) 1000개 뉴클레오타이드, (약) 600 내지 (약) 750개 뉴클레오타이드 또는 (약) 750 내지 (약) 1000개 뉴클레오타이드 길이이다. 임의의 구현예의 일부에서, 5’ 상동성 암 및 3’ 상동성 암은 독립적으로 (약) 200, 300, 400, 500, 600, 700 또는 800개 뉴클레오타이드 길이이거나, 또는 전술한 임의의 수치 사이의 임의의 수치 길이이다. 임의의 구현예의 일부에서, 5’ 상동성 암 및 3’ 상동성 암은 독립적으로 (약) 300개 뉴클레오타이드 길이를 초과한다. 임의의 구현예의 일부에서, 5’ 상동성 암 및 3’ 상동성 암은 독립적으로 (약) 400, 500 또는 600개 뉴클레오타이드 길이이거나, 또는 전술한 임의의 수치 사이의 임의의 수치 길이이다.
임의의 구현예의 일부에서, 5’ 상동성 암은 서열 번호: 80에 제시된 서열 또는 서열 번호: 80에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 동일성을 나타내는 서열 또는 이의 부분 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 5’ 상동성 암은 서열 번호: 80에 제시된 서열을 포함하다. 일부 구현예에서, 5’ 상동성 암은 서열 번호: 80에 제시된 서열로 구성되거나 이를 필수적으로 포함하여 구성된다. 임의의 구현예의 일부에서, 3’ 상동성 암은 서열 번호: 81에 제시된 서열 또는 서열 번호: 81에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 동일성을 나타내는 서열 또는 이의 부분 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 3’ 상동성 암은 서열 번호: 81에 제시된 서열을 포함하다. 일부 구현예에서, 3’ 상동성 암은 서열 번호: 81에 제시된 서열로 구성되거나 이를 필수적으로 포함하여 구성된다.
임의의 구현예의 일부에서, 유전자 파괴를 유도할 수 있는 하나 이상의 제제는 표적 부위에 특이적으로 결합하거나 혼성화하는 DNA 결합 단백질 또는 DNA 결합 핵산, DNA-표적화 단백질 및 뉴클레아제를 포함하는 융합 단백질, 또는 RNA-가이드 뉴클레아제를 포함한다. 임의의 구현예의 일부에서, 하나 이상의 제제는 징크 핑거 뉴클레아제(ZFN), TAL-효과기 뉴클레아제(TALEN), 또는 표적 부위에 특이적으로 결합하거나, 이를 인식하거나 이에 혼성화하는 CRISPR-Cas9 조합물을 포함한다.
임의의 구현예의 일부에서, 하나 이상의 제제 각각은 적어도 하나의 표적 부위에 상보적인 표적화 도메인을 갖는 가이드 RNA(gRNA)를 포함한다. 임의의 구현예의 일부에서, 하나 이상의 제제는 gRNA 및 Cas9 단백질을 포함하는 리보핵산단백질(RNP) 복합체로서 도입된다.
임의의 구현예의 일부에서, RNP는 전기 천공법, 입자 총, 인산칼슘 형질주입, 세포 압축 또는 압착을 통해 도입된다. 임의의 구현예의 일부에서, RNP는 전기 천공법을 통해 도입된다.
임의의 구현예의 일부에서, RNP의 농도는 (약) 1, 2, 2.5, 5, 10, 20, 25, 30, 40 또는 50μM이거나, 전술한 수치 중 임의의 2개에 의해 정의되는 범위이다. 임의의 구현예의 일부에서, RNP의 농도는 (약) 25μM이다.
임의의 구현예의 일부에서, RNP 내 gRNA 및 Cas9 분자의 몰 비율은 (약) 5:1, 4:1, 3:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:3, 1:4 또는 1:5이거나, 전술한 수치 중 임의의 2개에 의해 정의되는 범위이다. 임의의 구현예의 일부에서, RNP 내 gRNA 및 Cas9 분자의 몰 비율은 (약) 2.6:1이다.
임의의 구현예의 일부에서, gRNA는 CACCUUCACUCUCAGGAACA(서열 번호: 87); GAAUGACACCAUAGAUGAAG(서열 번호:88); UGAAGAGGAUUCCAUCCAGC(서열 번호:89); 및 UCCAGCAGGUAGCAGAGUUU(서열 번호:90)에서 선택된 표적화 도메인 서열을 갖는다. 임의의 구현예의 일부에서, gRNA는 CACCUUCACUCUCAGGAACA(서열 번호: 87)의 표적화 도메인 서열을 갖는다. 임의의 구현예의 일부에서, gRNA는 UGAAGAGGAUUCCAUCCAGC(서열 번호: 89)의 표적화 도메인 서열을 갖는다.
임의의 구현예의 일부에서, T 세포는 대상체로부터 유래된 1차 T 세포이다. 임의의 구현예의 일부에서, 대상체는 인간이다. 임의의 구현예의 일부에서, T 세포는 CD8+ T 세포 또는 이의 아형이다. 임의의 구현예의 일부에서, T 세포는 CD4+ T 세포 또는 이의 아형이다. 임의의 구현예의 일부에서, T 세포는 다분화능 또는 다능성 세포로부터 유래된다. 임의의 구현예의 일부에서, 다분화능 또는 다능성 세포는 iPSC이다. 임의의 구현예의 일부에서, T 세포는 다분화능 또는 다능성 세포로부터 유래되고, 다분화능 또는 다능성 세포는 iPSC이다.
임의의 구현예의 일부에서, 폴리뉴클레오타이드는 바이러스 벡터에 포함된다. 임의의 구현예의 일부에서, 바이러스 벡터는 AAV 벡터이다. 임의의 구현예의 일부에서, AAV 벡터는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7 또는 AAV8 벡터 중에서 선택된다. 임의의 구현예의 일부에서, AAV 벡터는 AAV2 또는 AAV6 벡터이다. 임의의 구현예의 일부에서, 바이러스 벡터는 레트로바이러스 벡터이다. 임의의 구현예 중 일부에서, 바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터이다.
임의의 구현예의 일부에서, 폴리뉴클레오타이드는 선형 폴리뉴클레오타이드이다. 임의의 구현예의 일부에서, 선형 폴리뉴클레오타이드는 이중 가닥 폴리뉴클레오타이드 또는 단일 가닥 폴리뉴클레오타이드이다.
임의의 구현예의 일부에서, 하나 이상의 제제 및 폴리뉴클레오타이드는 동시에 또는 임의의 순서로 순차적으로 도입된다. 임의의 구현예의 일부에서, 폴리뉴클레오타이드는 하나 이상의 제제의 도입 후에 도입된다.
임의의 구현예의 일부에서, 폴리뉴클레오타이드는 제제의 도입 후 약 30초, 1분, 2분, 3분, 4분, 5분, 6분, 7분, 8분, 9분, 10분, 15분, 20분, 30분, 40분, 50분, 60분, 90분, 2시간, 3시간 또는 4시간 직후 또는 이내에 도입된다.
임의의 구현예의 일부에서, 하나 이상의 제제의 도입 전에, 본 방법은 세포를 자극제(들)와 시험관 내에서 하나 이상의 면역 세포를 자극 또는 활성화하기 위한 조건 하에서 인큐베이션하는 것을 포함한다. 임의의 구현예의 일부에서, 자극제(들)는 항-CD3 및/또는 항-CD28 항체, 예컨대 항-CD3/항-CD28 비드를 포함한다. 임의의 구현예의 일부에서, 비드 대 세포의 비율은 (약) 1:1이다.
임의의 구현예의 일부에서, 본 방법은 하나 이상의 제제를 도입하기 전에 하나 이상의 면역 세포로부터 자극제(들)를 제거하는 것을 포함한다.
임의의 구현예의 일부에서, 본 방법은 하나 이상의 제제의 도입 및/또는 폴리뉴클레오타이드와 하나 이상의 재조합 사이토카인의 도입 전, 도중 또는 이후에 세포를 인큐베이션하는 것을 또한 포함한다. 임의의 구현예의 일부에서, 하나 이상의 재조합 사이토카인은 IL-2, IL-7 및 IL-15로 구성된 군에서 선택된다. 임의의 구현예의 일부에서, 하나 이상의 재조합 사이토카인은 (약) 10U/mL 내지 (약) 200U/mL, 예컨대 (약) 50U/mL 내지 (약) 100U/mL 농도의 IL-2; 0.5ng/mL 내지 50ng/mL, 예컨대 (약) 5ng/mL 내지 (약) 10ng/mL 농도의 IL-7 및/또는 0.1ng/mL 내지 20ng/mL, 예컨대 (약) 0.5ng/mL 내지 (약) 5ng/mL 농도의 IL-15에서 선택된 농도로 첨가된다.
임의의 구현예의 일부에서, 인큐베이션은 하나 이상의 제제의 도입 및 폴리뉴클레오타이드의 도입 후에 최대 또는 약 24시간, 36시간, 48시간, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 또는 21일, 예컨대 최대 또는 약 7일 동안 수행된다.
임의의 구현예의 일부에서, 본 방법에 의해 생성된 복수의 조작된 세포에서 세포 예컨대 T 세포의 적어도 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 또는 90% 이상은 CD247 유전자 자리 내 적어도 하나의 표적 부위의 유전자 파괴를 포함한다. 임의의 구현예의 일부에서, 본 방법에 의해 생성된 복수의 조작된 세포, 예컨대 T 세포에서 세포의 적어도 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 또는 90% 이상은 키메라 수용체 또는 이의 항원 결합 단편을 발현한다. 임의의 구현예의 일부에서, 본 방법에 의해 생성된 복수의 조작된 세포에서 세포의 적어도 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 또는 90% 이상은 키메라 수용체 또는 이의 항원 결합 단편을 발현한다.
임의의 구현예의 일부에서, 본 방법에 의해 생성된 복수의 조작된 세포, 예컨대 T 세포에서 세포의 적어도 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 또는 90% 이상은 CD247 유전자 자리 내 적어도 하나의 표적 부위의 유전자 파괴를 포함한다. 임의의 구현예의 일부에서, 본 방법에 의해 생성된 복수의 조작된 세포, 예컨대 T 세포에서 세포의 적어도 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 또는 90% 이상은 키메라 수용체를 발현한다. 임의의 구현예의 일부에서, 본 방법에 의해 생성된 복수의 조작된 세포, 예컨대 T 세포에서 세포의 적어도 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 또는 90% 이상은 키메라 수용체를 발현하고, 키메라 수용체는 CD3제타(CD3ζ) 신호 전달 도메인을 함유하는 세포내 영역을 함유하고, CD3ζ 신호 전달 도메인 또는 CD3ζ 신호 전달 도메인의 적어도 일부는 T 세포와 같은 조작된 세포의 내인성 CD247 유전자 자리(CD3ζ을 암호화하는 게놈 유전자 자리)의 게놈 서열에 의해 암호화된다. 일부 구현예에서, CD3ζ 신호 전달 도메인의 적어도 일부는 내인성 CD247 유전자 자리의 게놈 서열에 의해 암호화된다. 일부 구현예에서, 키메라 수용체의 세포내 영역의 전체 또는 전(full) CD3ζ 신호 전달 도메인은 내인성 CD247 유전자 자리의 게놈 서열에 의해 암호화된다.
본원에 기술된 임의의 방법을 사용하여 생성된 조작된 T 세포 또는 복수의 조작된 T 세포가 본원에 또한 제공된다.
본원에 기술된 임의의 조작된 T 세포를 포함하는 조성물이 또한 제공된다.
본원에 기술된 임의의 조작된 T 세포를 포함하는 복수의 T 세포를 포함하는 조성물이 또한 제공된다. 임의의 구현예의 일부에서, 조성물 내 T 세포의 적어도 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 또는 90% 이상은 CD247 유전자 자리 내 적어도 하나의 표적 부위의 유전자 파괴를 포함한다. 임의의 구현예의 일부에서, 조성물 내 T 세포의 적어도 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 또는 90% 이상은 키메라 수용체를 발현한다. 임의의 구현예의 일부에서, 조성물 내 T 세포의 적어도 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 또는 90% 이상은 키메라 수용체를 발현하고, 키메라 수용체는 CD3제타(CD3ζ) 신호 전달 도메인을 함유하는 세포내 영역을 함유하고, CD3ζ 신호 전달 도메인 또는 CD3ζ 신호 전달 도메인의 적어도 일부는 T 세포와 같은 조작된 세포의 내인성 CD247 유전자 자리(CD3ζ을 암호화하는 게놈 유전자 자리)의 게놈 서열에 의해 암호화된다. 일부 구현예에서, CD3ζ 신호 전달 도메인의 적어도 일부는 내인성 CD247 유전자 자리의 게놈 서열에 의해 암호화된다. 일부 구현예에서, 키메라 수용체의 세포내 영역의 전체 또는 전(full) CD3ζ 신호 전달 도메인은 내인성 CD247 유전자 자리의 게놈 서열에 의해 암호화된다.
임의의 구현예의 일부에서, 조성물은 CD4+ T 세포 및/또는 CD8+ T 세포를 포함한다. 임의의 구현예의 일부에서, 조성물은 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포를 포함하고 CD4+ T 세포 대 CD8+ T 세포의 비율은 (약) 1:3 내지 3:1, 예컨대 1:1이다.
임의의 구현예의 일부에서, 키메라 수용체를 발현하는 세포는 조성물 내 총 세포 또는 조성물 내 총 CD4+ 세포 또는 CD8+ 세포의 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상을 구성한다.
질병 또는 장애가 있는 대상체에 본원에 제공된 임의의 구현예의 조작된 세포, 복수의 조작된 세포 또는 조성물을 투여하는 것을 포함하는 치료 방법이 본원에 또한 제공된다.
질병 또는 장애를 치료하기 위한 본원에 기술된 임의의 조작된 세포, 복수의 조작된 세포 또는 조성물의 용도가 본원에 또한 제공된다. 제공된 구현예에서, 조작된 세포에 의해 발현되는 키메라 수용체는 질병 또는 병태의 세포 또는 조직과 관련된 또는 이에서 발현된 항원을 향하거나 표적화한다.
질병 또는 장애를 치료하기 위한 약제의 제조에서 본원에 기술된 임의의 조작된 세포, 복수의 조작된 세포 또는 조성물의 용도가 본원에 또한 제공된다. 제공된 구현예에서, 조작된 세포에 의해 발현되는 키메라 수용체는 질병 또는 병태의 세포 또는 조직과 관련된 또는 이에서 발현된 항원을 향하거나 표적화한다.
질병 또는 장애의 치료에 사용하기 위한 본원에 제공된 임의의 구현예의 임의의 조작된 세포, 복수의 조작된 세포 또는 조성물이 또한 제공된다. 제공된 구현예에서, 조작된 세포에 의해 발현되는 키메라 수용체는 질병 또는 병태의 세포 또는 조직과 관련된 또는 이에서 발현된 항원을 향하거나 표적화한다.
임의의 구현예의 일부에서, 질병 또는 장애는 암 또는 종양이다. 임의의 구현예의 일부에서, 암 또는 종양은 혈액성 악성 종양이다. 임의의 구현예의 일부에서, 혈액성 악성 종양은 림프종, 백혈병 또는 형질 세포 악성 종양이다. 임의의 구현예의 일부에서, 암은 림프종이고 림프종은 버킷 림프종(Burkitt’s lymphoma), 비호지킨 림프종(non-Hodgkin’s lymphoma, NHL), 호지킨 림프종, 발덴스트롬 거대글로불린혈증(Waldenstrom macroglobulinemia), 여포성 림프종(follicular lymphoma), 소형 비절단 세포 림프종(small non-cleaved cell lymphoma), 점막-관련 림프 조직 림프종(mucosa-associated lymphatic tissue lymphoma, MALT), 변연부 림프종(marginal zone lymphoma), 비장 림프종, 결절성 단핵구 B 세포 림프종(nodal monocytoid B cell lymphoma), 면역 모세포 림프종(immunoblastic lymphoma), 거대 세포 림프종(large cell lymphoma), 확산 혼합 세포 림프종(diffuse mixed cell lymphoma), 폐 B 세포 혈관 중심 림프종(pulmonary B cell angiocentric lymphoma), 소형 림프구성 림프종(small lymphocytic lymphoma), 1차 종격동 B 세포 림프종(primary mediastinal B cell lymphoma), 림프구 형질세포성 림프종(lymphoplasmacytic lymphoma, LPL) 또는 외투 세포 림프종(mantle cell lymphoma, MCL)이다. 임의의 구현예의 일부에서, 암은 백혈병이고, 백혈병은 만성 림프구성 백혈병(CLL), 형질 세포 백혈병 또는 급성 림프구성 백혈병(ALL)이다. 임의의 구현예의 일부에서, 암은 형질 세포 악성 종양이고 형질 세포 악성 종양은 다발성 골수종(MM)이다.
임의의 구현예의 일부에서, 종양은 고형 종양이다. 임의의 구현예의 일부에서, 고형 종양은 비-소세포폐암(NSCLC) 또는 두경부 편평세포암종(HNSCC)이다.
키트가 또한 제공된다. 임의의 구현예의 일부에서, 키트는 CD247 유전자 자리 내의 표적 부위에 유전자 파괴를 유도할 수 있는 하나 이상의 제제; 및 본원에 제공된 임의의 구현예의 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.
CD247 유전자 자리 내의 표적 부위에 유전자 파괴를 유도할 수 있는 하나 이상의 제제; 및 키메라 수용체 또는 이의 일부를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 - 키메라 수용체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 사슬을 암호화하는 전이 유전자는 상동 직접 수선(HDR)을 통해 표적 부위에 또는 그 근처에 통합을 위해 표적화됨 -; 및 본원에 제공된 임의의 구현예의 방법을 실행하기 위한 사용법을 포함하는 키트가 또한 제공된다.
도 1은 CRISPR/Cas9-매개 유전자 편집에 의한 내인성 CD247 유전자 자리에서 유전자 파괴를 도입하기 위해 4개의 CD247-표적화 gRNA(gRNA 1, 2, 3, 4) 중 하나를 함유하는 리보핵산단백질(RNP) 복합체로 전기 천공된 T 세포에서, 또는 대조군으로서 gRNA를 함유하지 않은 모의 전기 천공을 거친 T 세포(모의)에서, 유세포 분석에 의해 평가된 CD3 및 TCR의 표면 발현을 도시한다.
도 2a는 CD247-표적화 gRNA 3, 및 항-BCMA CAR 또는 이의 부분을 암호화하는 전이 유전자 서열 및 조절 및/또는 다중 시스트론 요소를 함유하는 4개의 폴리뉴클레오타이드(표 E1에 기재된 폴리뉴클레오타이드 A, B, C, D) 중 하나를 함유한 인큐베이션된 아데노 연관 바이러스(AAV) 작제물을 함유하는 RNP 복합체로 전기 천공된 T 세포에서; 또는 대조군으로서 모의 전기 천공 및 형질도입을 거친 T 세포(모의)에서, 유세포 분석에 의해 평가된, CD3의 표면 발현(항-CD3ε 항체를 사용하여 검출) 및 항-BCMA 키메라 항원 수용체(CAR)의 표면 발현(C-말단에서 IgG의 Fc 영역에 융합된 가용성 인간 BCMA인, BCMA-Fc를 사용하여 검출)을 도시한다. 도 2b는 실시예 2.B에 기술된 바와 같이 조작된 예시적인 항-BCMA CAR의 발현의 변이 계수(CV)(세포 집단 내 신호의 표준 편차를 각 집단의 신호 평균으로 나눈 것) 및 기하 평균 형광(gMFI)을 도시한다.
도 3a는 2:1, 1:1 또는 1:2의 E:T 비율에서, 항-BCMA CAR 또는 이의 부분을 암호화하는 전이 유전자 서열 및 조절 및/또는 다중 시스트론 요소를 함유하는 4개의 폴리뉴클레오타이드(표 E1에 기재된 폴리뉴클레오타이드 A, B, C, D) 중 하나를 함유한 AAV 작제물을 사용하여 조작된 CAR-발현 T 세포, 및 RPMI 8226 다발성 골수종 세포(ATCC®CCL-155™; 낮은 수준의 BCMA 발현)의 공배양 후 세포 용해 활성 분석으로부터 얻은 총 용해 백분율을 도시한다. 적색 형광 신호(Essen Bioscience의 IncuCyte®Live Cell Analysis System 사용)에 의해 결정된, NucLight Red(NLR)-표지된 살아있는 표적 세포의 손실을 49시간에 걸쳐 측정하였다. 모의 전기 천공된 및 형질도입된 세포(모의) 및 CAR+ 세포 없이 배양된 표적 세포(표적 단독)를 대조군으로 평가하였다. 용해 백분율을 결정하여 CAR+ 집단으로 정규화하였다. 도 3b는 2:1, 1:1 또는 1:2의 E:T 비율에서, 조작된 CAR-발현 T 세포 및 K562 만성 골수성 백혈병(CML) 세포(ATCC®CCL-243™; K562-BCMA, 높은 수준의 BCMA 발현)의 공배양 후 세포 용해 활성 분석으로부터 얻은 총 용해 백분율을 도시한다. 도 3c-3e는 적색 형광 신호에 의해 결정된, 2:1(도 3c), 1:1(도 3d) 및 1:2(도 3e)의 E:T 비율에서 시간이 지남에 따른 RPMI 8226 세포의 용해를 도시한다. 도 3f-3h는 2:1(도 3f), 1:1(도 3g) 및 1:2(도 3h)의 E:T 비율에서 시간이 지남에 따른 K562 세포의 용해를 도시한다.
도 4a-4c는 실시예 3에 기술된 바와 같이 2:1, 1:1 및 1:2 E:T의 E:T 비율에서, 4개의 폴리뉴클레오타이드(표 E1에 기재된, 폴리뉴클레오타이드 A, B, C, D) 중 하나를 함유한 AAV 작제물을 사용하여 조작된 CAR-발현 T 세포와 RPMI 8226 또는 K562 표적 세포의 인큐베이션 후, 다중 사이토카인 면역 분석법을 사용하여 인터페론-감마(IFN-γ; 도 4a), 인터루킨-2(IL-2; 도 4b) 및 종양 괴사 인자 알파(TNF-α; 도 4c)의 수준을 도시한다. 모의 전기 천공된 및 형질도입된 세포(모의) 및 CAR+ 세포 없이 배양된 표적 세포(표적 단독)를 대조군으로 평가하였다.
도 5는 CD247-표적화 gRNA 1 또는 gRNA 3(각각은 Alt-R 변형을 가짐(IDT Technologies; Coralville, IA))을 함유한 리보핵산단백질(RNP) 복합체로, 약 2.6:1의 gRNA 대 Cas9 단백질의 비율과 25μM의 농도에서, 전기 천공된 T 세포에서, 유세포 분석에 의해 평가한, CD3의 표면 발현을 도시한다.
도 6a-6b는 CD247-표적화 gRNA 3, 및 4개의 폴리뉴클레오타이드(표 E1에 기재된 폴리뉴클레오타이드 A, B, C, D) 중 하나를 함유한 인큐베이션된 아데노 연관 바이러스(AAV) 작제물을 함유하는 RNP 복합체로 전기 천공된 대표적인 공여체(공여체 1)의 T 세포; 또는 렌티바이러스 전달(렌티바이러스; 도 6b 참조)에 의해 항-BCMA CAR을 발현하도록 조작된 T 세포에서; 대조군으로서 모의 전기 천공 및 형질도입을 거친 T 세포(모의) 또는 CD247-표적화 RNP 단독으로 모의 형질도입 및 전기 천공을 거친 T 세포(KO 단독)에서, 유세포 분석에 의해 평가된, CD3의 표면 발현(항-CD3ε 항체를 사용하여 검출) 및 항-BCMA 키메라 항원 수용체(CAR)의 표면 발현(C-말단에서 IgG의 Fc 영역에 융합된 가용성 인간 BCMA인, BCMA-Fc를 사용하여 검출)을 도시한다. 도 6c는 각 군의 항-BCMA CAR 발현의 히스토그램을 도시한다.
도 7a-7b는 항-BCMA CAR을 암호화하는 전이 유전자 서열 및 MM.1S(ATCC®CRL-2974™) 인간 B 림프모구 표적 세포를 함유하는 4개의 폴리뉴클레오타이드(표 E1에 기재된 폴리뉴클레오타이드 A, B, C, D, 도 7a 참조) 중 하나를 함유한 AAV 작제물을 사용하여 조작된 CAR-발현 T 세포를, 2:1 또는 1:2의 E:T 비율로, 렌티바이러스 전달(렌티바이러스, 도 7b 참조)에 의해 항-BCMA CAR을 발현하도록 조작된 T 세포 및 대조군으로서 CD247-표적화 RNP 단독으로 모의 형질도입 및 전기 천공법을 거친 T 세포(KO)의 공배양 후 세포 용해 활성 분석으로부터 얻은 총 용해 백분율을 도시한다. 3개 샘플로부터 용해율(%) 값을 평균하고 세 공여체에 대하여 정규화하였다.
도 8a-8c는 실시예 4에 기술된 바와 같이 2:1 및 1:2의 E:T 비율에서, 4개의 폴리뉴클레오타이드(표 E1에 기재된, 폴리뉴클레오타이드 A, B, C, D) 중 하나를 함유한 AAV 작제물을 사용하여 조작된 CAR-발현 T 세포와 MM.1S 표적 세포의 인큐베이션 후, 인터페론-감마(IFN-γ; 도 8a), 인터루킨-2(IL-2; 도 8b) 및 종양 괴사 인자 알파(TNF-α; 도 8c)의 수준을 도시한다. 렌티바이러스 전달(LV)에 의해 항-BCMA CAR을 발현하도록 조작된 T 세포, CD247-표적화 RNP 단독으로 모의 형질도입 및 전기 천공법을 거친 T 세포(KO) 및 모의 전기 천공된 및 형질도입된 세포(모의)를 또한 대조군으로 평가하였다.
키메라 항원 수용체(CAR) 또는 이의 부분과 같은 키메라 또는 재조합 수용체를 암호화하는 하나 이상의 전이 유전자 서열(이하, “공여체” 서열, 예를 들어 T 세포에 외인성 또는 이종성인 서열로도 상호 교환 가능하게 지칭됨)을 포함하는 변형된 CD247 유전자 자리를 가진, T 세포와 같은 유전자 조작된 세포가 본원에 제공된다. 일부 측면에서, 세포는 일반적으로 키메라 수용체의 C-말단에 존재하는 CD3제타(CD3ζ) 사슬 또는 이의 단편을 함유하는 키메라 수용체를 발현하도록 조작된다. 일부 구현예에서, CD3ζ 사슬 또는 단편의 적어도 일부는 T 세포와 같은 조작된 세포의 내인성 CD247 유전자 자리(CD3ζ를 암호화하는 게놈 유전자 자리)의 게놈 서열 또는 이의 부분 서열에 의해 암호화된다. 일부 측면에서, 예를 들어 상동 직접 수선(HDR)에 의해, 전이 유전자 서열의 내인성 CD247 유전자 자리로의 통합은, 키메라 수용체의 일부를 암호화하는 핵산 서열이 내인성 CD247 유전자 자리의 개방형 해독틀 또는 이의 부분 서열, 예컨대 개방형 해독틀의 엑손과 융합되도록, 예를 들어 틀 내에서 융합되도록, 수행된다.
또한 키메라 또는 재조합 수용체 또는 이의 일부를 발현하는 변형된 CD247 유전자 자리를 함유하는 유전자 조작된 세포를 생산하는 방법이 제공된다. 제공된 구현예는 내인성 CD247 유전자 자리에 대해 키메라 수용체(예를 들어, CAR) 또는 이의 일부를 암호화하는 전이 유전자 서열을 특이적으로 표적화하는 것을 포함한다. 일부 맥락에서, 제공된 구현예는 내인성 CD247 유전자 자리에서 키메라 수용체-암호화 전이 유전자 서열의 표적화된 통합을 위하여, 예를 들어 유전자 편집 방법을 사용하여 표적화된 유전자 파괴, 예를 들어 DNA 절단의 생성을 유도하는 것 및 HDR을 포함한다. 본원에 제공된 조작된 세포의 생성 및/또는 본원에 제공된 방법에 사용하기 위한 관련 세포 조성물, 핵산 및 키트가 또한 제공된다.
일부 구현예에서, 키메라 또는 재조합 수용체(예를 들어, CAR)의 일부를 암호화하는 전이 유전자 서열은 키메라 수용체의 하나 이상의 도메인 또는 영역, 예를 들어, 세포외 영역, 막관통 도메인, 및 세포내 영역을 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열을 함유한다. 일부 측면에서, 세포외 영역은 원하는 항원(예를 들어, 종양 항원) 또는 리간드에 대해 특이성을 제공하는 결합 도메인(예를 들어, 항원- 또는 리간드-결합 도메인) 및/또는 세포외 결합 도메인을 막관통 도메인 및 세포내 영역과 연결하기 위한 스페이서를 함유한다. 일부 측면에서, 전이 유전자 서열에 의해 암호화된 세포내 영역은 하나 이상의 공자극 도메인 및/또는 기타 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 전이 유전자 서열에 의해 암호화된 세포내 영역(즉, 세포에 외인성인 도입된 서열)은 CD3ζ 사슬의 전장 길이(full length) 미만을 포함하거나 CD3ζ 사슬을 암호화하는 서열을 포함하지 않는다. 전이 유전자 서열을 내인성 CD247 유전자 자리에 통합 시, 생성된 변형된 CD247 유전자 자리는 키메라 수용체를 암호화하는데, 이는 HDR에 의해 표적화된 전이 유전자 서열 및 내인성 CD247 유전자 자리의 개방형 해독틀 또는 이의 부분 서열의 융합에 의해 암호화된다. 암호화된 키메라 수용체는 CD3ζ 사슬 또는 이의 단편, 예를 들어, T 세포에서 1차 세포질 또는 세포내 신호를 매개, 활성화 또는 자극할 수 있는 기능성 CD3ζ 사슬 또는 이의 단편을 포함하는 세포내 영역을 함유한다. 생성된 유전자 조작된 세포 또는 세포 조성물은 입양 세포 요법 방법에 사용될 수 있다.
입양 T 세포 요법과 같은 T 세포 기반 요법(키메라 항원 수용체(CAR) 또는 다른 재조합, 조작된 또는 키메라 수용체와 같은 관심 질병 또는 장애에 특이적인 재조합, 조작된 또는 키메라 수용체를 발현하는 조작된 세포의 투여를 수반하는 것을 포함)은 암 및 기타 질병 및 장애의 치료에 효과적일 수 있다. 특정 맥락에서, 입양 세포 요법을 위한 조작된 세포를 생성하기 위한 다른 접근법이 항상 완전히 만족스럽지 않을 수 있다. 일부 맥락에서, 최적 효능은 면역 세포의 집단과 같은 세포 및/또는 치료용 세포 조성물 내 세포 중에서 수용체의 균일하고, 균질하며 및/또는 일관된 발현을 포함하여 키메라 수용체를 발현하는 투여된 세포의 능력 및 키메라 수용체가 대상체, 종양, 및 그 환경 내에서 항원, 예를 들어, 표적 항원을 인식하고 그에 결합하는 능력에 따라 달라질 수 있다.
일부 경우에, CAR과 같은 키메라 수용체를 세포 내로 도입하기 위한 이용 가능한 방법은 예컨대 바이러스 형질도입에 의한 것과 같은, 키메라 수용체를 암호화하는 서열의 무작위 통합을 포함한다. 어떤 면에서, 그러한 방법은 완전히 만족스럽지 않다. 일부 측면에서, 무작위 통합은 세포 기능 및 활성에 중요할 수 있는 것들을 포함하여 세포에서 하나 이상의 무작위 유전자 자리의 가능한 삽입 돌연변이 유발 및/또는 유전자 파괴를 초래할 수 있다. 일부 측면에서, 키메라 수용체 발현의 효율은 현재 이용 가능한 방법을 사용하여 조작된 특정 세포 또는 특정 세포 집단 중에 제한된다. 일부 경우에, 키메라 수용체는 세포의 집단 중에서 특정 세포에서만 발현되고, 키메라 수용체의 발현 수준은 해당 집단의 세포 간에 광범위하게 다를 수 있다. 특정 측면에서, 키메라 수용체의 발현 수준은 예측, 제어 및/또는 조절하기 어려울 수 있다. 일부 경우에, 세포의 게놈으로 수용체를 암호화하는 전이 유전자의 반무작위 또는 무작위 통합은, 일부 경우에, 게놈에서 원치 않는 위치로 예를 들어, 필수적인 유전자 또는 세포의 활성을 조절하는 데 중요한 유전자로 핵산 서열이 통합됨으로 인해 역효과 및/또는 원치 않는 효과를 초래할 수 있다.
일부 경우에, 무작위 통합은 재조합 또는 키메라 수용체를 암호화하는 서열의 가변적 통합을 초래할 수 있으며, 이는 치료용 세포 조성물과 같은 세포 조성물 내에서 일관성 없는 발현, 핵산의 가변적 복제수, 및/또는 수용체 발현의 가변성을 초래할 수 있다. 일부 경우에, 수용체를 암호화하는 핵산 서열의 무작위 통합은 통합 부위 및/또는 핵산 서열 복제수에 따라 다양성이 있는, 이종의, 비균일한 및/또는 최적이 아닌 발현 또는 항원 결합, 발암성 형질 전환 및 핵산 서열의 전사 침묵을 초래할 수 있다. 일부 측면에서, 세포 집단에서 이질적이고 비균일한 발현은 재조합 또는 키메라 수용체에 의한 발현 및 항원 결합의 비일관성 또는 불안정, 조작된 세포의 기능의 예측 불가능성 또는 기능 감소 및/또는 비균일한 약품으로 이어질 수 있고, 이로써 조작된 세포의 효능이 감소될 수 있다. 일부 측면에서, 특정 렌티바이러스 벡터와 같은 특정 무작위 통합 벡터를 사용하려면 조작된 세포가, 예컨대 복제 가능 렌티바이러스(replication competent lentivirus, RCL) 분석의 수행에 의해, 복제 가능 바이러스를 함유하고 있지 않다는 확인이 필요하다. 집단 내에서 핵산의 무작위 통합 및/또는 이종 발현을 최소화하면서 재조합 또는 키메라 수용체의 일관된 발현 수준 및 기능을 달성하기 위한 개선된 전략이 필요하다.
일부 측면에서, 키메라 수용체를 암호화하는 핵산 서열을 전달하는 데 사용되는 특정 폴리뉴클레오타이드 또는 벡터에서 (삽입될 전이 유전자 서열 또는 이종 서열과 같은) 페이로드의 크기는 제한적일 수 있다. 일부 경우에, 제한된 크기는 세포에서 발현 및/또는 도입 및 발현의 효능에 영향을 줄 수 있다.
제공된 구현예는 상동 직접 수선(HDR)에 의해 세포, 예를 들어, T 세포의 내인성 CD247 유전자 자리에 통합될 키메라 수용체를 암호화하는 핵산을 가지도록 세포를 조작하는 것에 관한 것이다. 일부 측면에서, HDR은 내인성 CD247 유전자 자리와 같은, 유전자 파괴를 위한 표적 부위에서 또는 그 근처에서 (재조합 수용체 또는 키메라 수용체 또는 부분, 사슬 또는 이들의 단편을 암호화하는 전이 유전자 서열과 같은) 전이 유전자 서열의 부위 특이적인 통합을 매개할 수 있다. 일부 구현예에서, (예를 들어, 내인성 CD247 유전자 자리의 표적 부위에서) 유전자 파괴의 존재 및 폴리뉴클레오타이드, 예를 들어 하나 이상의 상동성 암(arm)을 함유하는 (예를 들어, 유전자 파괴 주변의 서열에 상동성인 핵산 서열을 함유하는) 주형 폴리뉴클레오타이드(template polynucleotide)의 존재는 상동성 서열이 DNA 수선을 위한 주형으로 작용하여 HDR을 유도하거나 지시할 수 있다. 유전자 파괴 주변의 내인성 유전자 서열과 폴리뉴클레오타이드, 예를 들어 주형 폴리뉴클레오타이드에 포함된 상동성 암(arm) 사이의 상동성에 기초하여, 세포 DNA 수선 기구는 폴리뉴클레오타이드 예를 들어 주형 폴리뉴클레오타이드를 사용하여 유전자 파괴의 표적 부위에서 DNA 절단을 수선하고 유전자 정보를 재합성할 수 있으며, 이로써 유전자 파괴의 표적 부위에서 또는 그 근처에서 (키메라 수용체 또는 이의 일부를 암호화하는 전이 유전자 서열과 같은) 상동성 암(arm)들 사이에 서열을 효과적으로 삽입하거나 통합할 수 있다. 제공된 구현예는 키메라 수용체 또는 이의 부분을 암호화하는 변형된 CD247 유전자 자리를 함유하는 세포를 생성할 수 있으며, 여기서 키메라 수용체 또는 이의 부분을 암호화하는 전이 유전자 서열이 내인성 CD247 유전자 자리에 HDR에 의해 통합된다.
일부 측면에서, 제공된 구현예는 키메라 또는 재조합 수용체를 암호화하는 핵산의 세포 내로의 개선된 및/또는 더 효율적인 표적화로 조작된 세포를 생산하는 이점을 제공한다. 일부 경우에, 본 방법은 있을 수 있는 반무작위 또는 무작위 통합 및/또는 이종의 또는 다양성 있는 발현 및/또는 통합되지 않은 핵산 서열로부터 원하지 않는 발현을 최소화하고, 키메라 또는 재조합 수용체의 개선된, 균일한, 균질한, 일관된, 예측 가능한 또는 안정된 발현을 초래하거나 삽입 돌연변이 유발의 가능성이 감소되거나, 낮거나 또는 없게 된다. 일부 측면에서, 키메라 또는 재조합 수용체, 예를 들어, CAR을 발현하는 유전자 조작된 면역 세포를 생산하는 다른 방법과 비교하여, 제공된 구현예는 더 안정된, 더 생리적인, 더 제어 가능한 또는 더 균일한, 일관된 또는 균질한 키메라 또는 재조합 수용체의 발현을 가능하게 한다. 일부 경우에, 본 방법은 더 일관되고 더 예측 가능한 약품, 예를 들어 조작된 세포를 함유하는 세포 조성물이 생성되게 하며, 이를 통해 치료받은 환자에게 더 안전한 치료법을 제공할 수 있다. 일부 측면에서, 제공된 구현예는 또한 단일 유전자 자리에서 또는 관심 다중 유전자 자리에서 예측 가능한 및 일관된 통합을 가능하게 한다. 일부 구현예에서, 제공된 구현예는 또한 집단의 세포에서 통합된 핵산의 일관된 복제수(통상적으로, 1 또는 2)를 갖는 세포 집단을 생성하게 할 수 있으며, 이는 일부 측면에서, 키메라 또는 재조합 수용체 발현 및 세포 집단 내 내인성 수용체 유전자 발현의 일관성을 제공한다. 일부 경우에, 제공된 구현예는 통합을 위해 바이러스 벡터의 사용을 수반하지 않으며 따라서 조작된 세포가 복제 가능 바이러스를 함유하고 있지 않음을 확인할 필요를 감소시킬 수 있고, 이로써 세포 조성물의 안전성을 향상시킨다.
본원에 제공된 조작된 세포의 변형된 CD247 유전자 자리로부터 암호화된 키메라 수용체는 내인성 또는 외인성 조절 요소의 제어 하에 암호화될 수 있다. 일부 측면에서, 제공된 구현예는 키메라 수용체가 내인성 CD247 조절 요소의 제어 하에 발현 가능하게 하며, 일부 경우에, 이는 더 생리학적인 수준의 발현을 제공할 수 있다. 일부 측면에서, 제공된 구현예는 키메라 수용체를 암호화하는 핵산이 내인성 조절 요소 또는 제어 요소, 예를 들어, 프로모터와 같은 cis 조절 요소 또는 내인성 CD247 유전자 자리의 5’ 및/또는 3’ 비번역 영역(UTR)의 제어 하에 발현 가능하게 한다. 따라서, 일부 측면에서, 제공된 구현예는 키메라 수용체, 예를 들어, CAR, 또는 이의 부분이 발현 가능하게 하고/거나 이 발현이 내인성 CD3ζ 사슬과 유사한 수준으로 조절되게 한다.
일부 측면에서, 제공된 구현예는 키메라 수용체를 통해 항원-비의존적 신호 전달 또는 활성(“긴장성 신호 전달(tonic signaling)”로도 알려짐)을 감소시키거나 최소화할 수 있다. 일부 경우에, 항원-비의존적 신호 전달은 발현된 키메라 수용체의 과발현 또는 제어되지 않는 활성으로부터 초래될 수 있으며, 키메라 수용체를 발현하는 T 세포의 분화 증가 및/또는 탈진과 같은 원하지 않는 효과로 이어질 수 있다. 일부 구현예에서, 제공된 조작된 세포 및 세포 조성물은 발현된 키메라 수용체의 과발현 또는 제어되지 않는 활성으로부터 초래될 수 있는 것에 의한 항원-비의존적 신호 전달의 효과를 감소시킬 수 있다. 따라서, 제공된 구현예는 개선된 발현, 기능 및 발현의 균일성 및/또는 다른 원하는 특징 또는 특성, 및 궁극적으로 더 높은 효능을 나타내는 조작된 세포의 생산을 촉진할 수 있다. 일부 구현예에서, 제공된 폴리뉴클레오타이드, 전이 유전자 및/또는 벡터가 면역 세포로 전달될 때, T 세포 활성을 조절할 수 있고 일부 경우에, T 세포 분화 또는 항상성을 조절할 수 있는 키메라 수용체, 예를 들어 CAR의 발현을 초래한다.
일부 측면에서, 제공된 구현예는 키메라 수용체가 외인성 또는 이종성 조절 요소 또는 제어 요소의 제어 하에 발현 가능하게 하며, 일부 측면에서, 이는 더 제어 가능한 수준의 발현을 제공한다. 일부 측면에서, 제공된 구현예는 내인성 CD247 유전자 자리에서 내인성 프로모터가 활성이 아닐 수 있는 세포, 예컨대 일반적으로 CD3ζ 사슬을 발현하지 않는 세포, 예를 들어, 비-T 세포, 예컨대 NK 세포, B 세포 또는 특정 유도 다능성 줄기 세포(iPSC)-유래 세포를 포함하여 다양한 세포 유형에서 키메라 수용체의 표적화 및 제어된 발현을 가능하게 한다.
일부 측면에서, 제공된 구현예는 무작위로 통합되거나 통합되지 않은 폴리뉴클레오타이드로부터 제어되지 않은 발현 또는 발현을 방지할 수 있다. 일부 구현예에서, 도입된 폴리뉴클레오타이드, 예를 들어, 주형 폴리뉴클레오타이드는 전장(full length) 기능성 수용체를 암호화하는 핵산 서열을 함유하지 않는다. 일부 경우에, CD3ζ 사슬의 일부는 도입된 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화되지 않는다. 일부 측면에서, 무작위로 통합된 또는 통합되지 않은 폴리뉴클레오타이드로부터의 전사는 기능성 수용체를 생성하지 않을 것이다. 일부 측면에서, 표적 유전자 자리, 예를 들어 내인성 CD247 유전자 자리에서의 통합 시에만, 필요한 신호 전달 영역을 모두 함유하는 기능적 수용체가 생성될 수 있다. 일부 측면에서, 제공된 구현예는 예를 들어, 통합되지 않은 바이러스 벡터 서열과 같은 무작위로 통합된 또는 통합되지 않은 폴리뉴클레오타이드로부터의 제어되지 않은 발현을 방지함으로써 세포 조성물의 안전성 개선을 가져올 수 있다.
일부 측면에서, 제공된 구현예는 또한 예를 들어 동종이계 입양 세포 요법에 적용하기 위해 투여된 세포의 면역원성을 감소시키기 위해 세포외 부분 CD3ζ의 발현의 감소 및/또는 제거(녹아웃)를 가져올 수 있다.
제공된 구현예는 또한 예를 들어 동일한 벡터, 예를 들어 바이러스 벡터 내 추가적인 요소 및/또는 전이 유전자를 패키징할 충분한 공간을 부여하기 위해, 재조합 CAR을 세포에 전달하는 데 필요한 전이 유전자 서열의 길이를 감소시킬 수 있다. 일부 측면에서, 제공된 구현예는 또한 기존 방법과 비교하여, CAR의 CD3ζ 사슬의 전부 또는 일부를 암호화하기 위해 CD3ζ 사슬을 암호화하는 내인성 유전자의 개방형 해독틀 서열의 일부 또는 전부를 이용함으로써, 조작하기 위해 더 작은 핵산 서열 단편을 사용할 수 있게 해준다. 일부 측면에서, 제공된 구현예는 기존 방법과 비교하여, 본 방법은 키메라 수용체의 CD3ζ 또는 이의 일부를 암호화하기 위해 CD3ζ, CD247을 암호화하는 내인성 유전자의 개방형 해독틀 서열의 일부 또는 전부를 이용하기 때문에, CAR을 발현하기 위해 세포를 조작하는 데 있어 유연성을 제공한다. 일부 경우에, 이것은 키메라 수용체 또는 이의 일부를 암호화하는 핵산 서열에 대한 길이 요건을 감소시키므로, 키메라 수용체 또는 이의 일부를 암호화하는 서열을 위한 페이로드 공간을 감소시킬 수 있으며 다른 전이 유전자 서열, 상동성 암(arm), 조절 요소와 같은 다른 성분을 암호화하는 서열을 위한 공간을 남길 수 있다. 일부 측면에서, 제공된 구현예는 도입된 폴리뉴클레오타이드에서 키메라 수용체, 예를 들어, CAR의 전체 길이를 필요로 하는 기존 구현예와 비교하여 더 큰 상동성 암(arm)의 수용을 가능하게 할 수 있고/거나 키메라 수용체, 예를 들어 CAR의 일부를 암호화하는 핵산 서열에 대한 길이 요건이 감소됨에 따라 추가 분자를 암호화하는 핵산 서열의 수용을 가능하게 할 수 있다. 일부 측면에서, 핵산 서열, 예를 들어 전이 유전자 서열의 생성, 전달, 및/또는 상동 직접 수선(HDR)에 의한 표적화 효율은 제공된 구현예를 사용하여 촉진되거나 개선될 수 있다. 다른 측면에서, 제공된 구현예는 세포 상 또는 내에서 발현을 위해 추가 분자를 암호화하는 핵산 서열의 수용을 가능하게 한다.
조작된 세포를 조작, 준비 및 생산하는 방법 및 조작된 세포를 생성하거나 생산하기 위한 키트 및 장치가 또한 제공된다. 본 방법에 의해 생성된 세포 및 세포 조성물이 또한 제공된다. 키메라 수용체의 일부를 암호화하는 핵산 서열을 함유하는 폴리뉴클레오타이드(예를 들어, 바이러스 벡터) 및 예컨대 형질도입 또는 전기 천공과 같은 물리적 전달에 의해 상기 폴리뉴클레오타이드를 세포 내로 도입하기 위한 방법이 제공된다. 조작된 세포를 함유하는 조성물 및 예컨대 입양 세포 요법을 위해 대상체에 세포 및 조성물을 투여하기 위한 방법, 키트 및 장치가 또한 제공된다. 일부 측면에서, 세포는 대상체로부터 단리되고, 조작되어 동일한 대상체에 투여된다. 다른 측면에서, 세포는 한 대상체로부터 단리되고, 조작되어 다른 대상체에 투여된다. 생성된 유전자 조작된 세포 또는 세포 조성물은 입양 세포 요법 방법에 사용될 수 있다.
본 출원에서 언급된 특허 문헌, 과학 논문 및 데이터베이스를 포함한 모든 출판물은 각각의 개별 출판물이 개별적으로 참조로 통합된 것과 동일한 정도로 모든 목적을 위해 그 전체가 참조로 포함된다. 본원에 제시된 정의가 본원에 참조로 포함된 특허, 출원, 공개된 출원 및 기타 출판물에 제시된 정의와 상반되거나 달리 부합하지 않는 경우, 본원에 제시된 정의가 본원에 참조로 포함된 정의보다 우선한다.
본원에 사용된 섹션 제목은 단지 구성을 위한 목적이며 기재된 주제를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
I. 상동 직접 수선에 의해 키메라 수용체를 발현하는 세포를 생성하는 방법
여기서는 변형된 CD247 유전자 자리가 키메라 항원 수용체(CAR)와 같은 키메라 또는 재조합 수용체를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는, 변형된 CD247 유전자 자리를 포함하는 유전자 조작된 세포를 생성 또는 생산하는 방법이 제공된다. 일부 측면에서, 유전자 조작된 세포 내 변형된 CD247 유전자 자리는 일반적으로 CD3제타(CD3ζ) 사슬을 암호화하는 내인성 CD247 유전자 자리로 통합되는, 키메라 수용체 또는 키메라 수용체의 일부를 암호화하는 전이 유전자 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 방법은 키메라 또는 재조합 수용체 또는 키메라 수용체의 일부를 암호화하는 전이 유전자를 함유하는 폴리뉴클레오타이드(예를 들어, “주형 폴리뉴클레오타이드”로도 불림)를 사용하여, 표적화된 유전자 파괴 및 상동성 의존적 수선(homology-dependent repair, HDR)을 유도하고, 이로써 CD247 유전자 자리에서 전이 유전자의 통합을 표적화하는 것을 포함한다. 본 방법에 의해 생성된 세포 및 세포 조성물이 또한 제공된다. 일부 구현예에서, 세포 집단이 제공된 방법 중 어느 하나에 의해 생산된 유전자 조작된 면역 세포를 포함하여, 더 개선되고, 균일하고, 균질한 및/또는 안정적인 재조합 수용체에 의한 발현 및/또는 이에 의한 항원 결합을 나타내도록 키메라 수용체(예를 들어, CAR)를 발현하도록 조작된 세포의 집단을 함유하는 조성물, 및 본 방법에 사용하기 위한 폴리뉴클레오타이드(예를 들어, 주형 폴리뉴클레오타이드), 및 키트가 또한 제공된다.
일부 측면에서, 발현된 키메라 수용체는 CD3제타(CD3ζ) 사슬 또는 이의 단편을 함유하는 세포내 영역, 예컨대 CD3ζ의 신호 전달 영역 또는 신호 전달 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 암호화된 CD3ζ 사슬 또는 이의 단편은 기능성 CD3ζ 사슬 또는 이의 단편, 예컨대 세포질 신호 전달 도메인 또는 영역이다. 일부 구현예에서, CD3ζ 사슬 또는 이의 단편은 수용체의 C-말단에 있다. 일부 측면에서, 키메라 수용체의 일부를 암호화하는 전이 유전자 서열의 CD247 유전자 자리 내로의 통합 후에, CD3ζ 사슬의 적어도 일부는 게놈 내 CD247 유전자 자리의 개방형 해독틀 또는 이의 부분 서열에 의해 암호화된다. 일부 측면에서, 키메라 수용체는 내인성 CD247 유전자 자리의 개방형 해독틀 또는 이의 부분 서열과 융합된 외인성 핵산 서열에 의해 암호화된다.
일부 구현예에서, 본 방법은 전이 유전자 서열의 CD247 유전자 자리 내로의 표적화된 통합을 위해 HDR을 사용한다. 일부 경우에, 본 방법은 HDR에 의한 키메라 수용체 또는 키메라 수용체의 일부를 암호화하는 전이 유전자 서열의 표적화된 통합과 조합하여, 유전자 편집 기술에 의해 내인성 CD247 유전자 자리에서 하나 이상의 표적화된 유전자 파괴(예를 들어, DNA 절단)를 도입하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, HDR 단계는 표적 게놈 위치의 DNA에서 파괴 또는 절단, 예를 들어 이중 가닥 절단을 수반한다. 일부 구현예에서, DNA 절단은 유전자 편집 방법, 예를 들어, 표적화된 뉴클레아제를 사용하여 유도된다.
일부 측면에서, 제공된 방법은 CD247 유전자 자리 내 표적 부위에서 T 세포 내로 유전자 파괴를 유도할 수 있는 하나 이상의 제제를 도입하는 것과, T 세포 내로 전이 유전자 및 하나 이상의 상동성 암(arm)을 포함하는 폴리뉴클레오타이드(예를 들어, 주형 폴리뉴클레오타이드)를 도입하는 것을 포함한다. 일부 측면에서, 전이 유전자는 키메라 수용체 또는 이의 일부를 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열을 함유한다. 일부 구현예에서, 전이 유전자와 같은 핵산 서열은 상동 직접 수선(HDR)을 통해 CD247 유전자 자리 내 통합을 위해 표적화된다. 일부 측면에서, 제공된 방법은 키메라 수용체 또는 이의 일부를 암호화하는 전이 유전자 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 CD247 유전자 자리 내에 유전자 파괴를 가진 T 세포 내로 도입하는 것을 포함하고, 여기서 유전자 파괴는 CD247 유전자 자리 내의 하나 이상의 표적 부위의 유전자 파괴를 유도할 수 있는 하나 이상의 제제에 의해 유도되었으며, 전이 유전자와 같은 핵산 서열이 HDR을 통해 CD247 유전자 자리 내의 통합을 위해 표적화된다.
일부 측면에서, 구현예는 유전자 편집 및/또는 표적화된 뉴클레아제를 사용하여, 이어서 키메라 수용체의 일부를 암호화하는 전이 유전자 서열에 연결된 내인성 CD247 유전자 자리의 서열에 상동성인 상동성 서열, 및 일부 구현예에서, DNA 절단에서 또는 근처에서 전이 유전자 서열을 특이적으로 표적화 및 통합하기 위해 다른 분자를 암호화하는 핵산 서열을 함유하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드(예를 들어, 주형 폴리뉴클레오타이드)에 기초하여 HDR에 의해, 표적화된 DNA 절단과 같은 표적화된 게놈 파괴를 생성하는 것을 포함한다. 따라서, 일부 측면에서, 본 방법은 표적화된 유전자 파괴(예를 들어, 유전자 편집을 통해)를 유도하고 전이 유전자 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드(예를 들어, 주형 폴리뉴클레오타이드)를 세포 내로(예를 들어, HDR을 통해) 도입하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, HDR에 의한 전이 유전자 서열의 표적화된 유전자 파괴 및 표적화된 통합은 CD3제타(CD3ζ) 사슬을 암호화하는 내인성 CD247 유전자 자리의 하나 이상의 표적 부위에서 일어난다. 일부 측면에서, 표적화된 통합은 내인성 CD247 유전자 자리의 개방형 해독틀 서열 내에서 일어난다. 일부 측면에서, 전이 유전자 서열의 표적화된 통합은 전이 유전자의 코딩 부분과 내인성 CD247 유전자 자리의 개방형 해독틀(open reading frame)의 하나 이상의 엑손과의 틀 내 융합(in-frame fusion), 예를 들어, 통합 부위에서 인접 엑손과의 틀 내 융합을 초래한다.
일부 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드(예를 들어, 주형 폴리뉴클레오타이드)는 하나 이상의 표적화된 유전자 파괴를 유도할 수 있는 하나 이상의 제제의 도입 전, 도입과 동시에 또는 도입 후에 조작된 세포 내로 도입된다. 하나 이상의 표적화된 유전자 파괴(예를 들어, DNA 절단)의 존재 하에, 폴리뉴클레오타이드는 DNA 수선 주형으로 사용되어, 전이 유전자를 주형 폴리뉴클레오타이드에 포함되어 있는, 5’ 및/또는 3’ 상동성 암(arm)과 같은 하나 이상의 상동성 암 및 유전자 파괴 주변의 내인성 유전자 서열 사이 상동성에 기초하여 HDR에 의해 표적화된 유전자 파괴 부위에서 또는 이의 근처에서 효과적으로 복제 및/또는 통합할 수 있다.
일부 측면에서, 두 단계는 순차적으로 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 유전자 편집 및 HDR 단계는 동시에 및/또는 하나의 실험 반응에서 수행된다. 일부 구현예에서, 유전자 편집 및 HDR 단계는 하나 또는 연속적인 실험 반응에서 연속적으로 또는 순차적으로 수행된다. 일부 구현예에서, 유전자 편집 및 HDR 단계는 동시에 또는 상이한 시간에 별도의 실험 반응에서 수행된다.
면역 세포는 T 세포를 함유하는 세포 집단을 포함할 수 있다. 상기 세포는 말초 혈액 단핵세포(PBMC) 샘플, 비분획화 T 세포 샘플, 림프구 샘플, 백혈구 샘플, 성분채집술 생성물 또는 백혈구 성분채집술 생성물에서 수득된 것과 같은 대상체에서 수득된 세포일 수 있다. 일부 구현예에서, T 세포와 같은 면역 세포는 1차 T 세포와 같은 1차 세포이다. 일부 구현예에서, T 세포는 집단에서 T 세포가 농축되도록 양성 또는 음성 선택 및 농축 방법을 사용하여 분리 또는 선택될 수 있다. 일부 구현예에서, 집단에는 CD4+, CD8+ 또는 CD4+ 및 CD8+ T 세포가 함유되어 있다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드(예를 들어, 주형 폴리뉴클레오타이드)를 도입하는 단계 및 제제(예를 들어, Cas9/gRNA RNP)를 도입하는 단계는 동시에 또는 임의의 순서로 순차적으로 발생할 수 있다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드는 유전자 파괴를 유도할 수 있는 하나 이상의 제제(예를 들어, Cas9/gRNA RNP)의 도입과 동시에 도입된다. 구체적인 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드 주형은 제제(들)(예를 들어, Cas9/gRNA RNP)를 도입하는 단계에 의한 유전자 파괴를 유도한 후에 면역 세포 내로 도입된다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드 주형 및 하나 이상의 제제(예를 들어, Cas9/gRNA RNP)의 도입 전에, 도입 중에 및/또는 도입 이후에, 세포의 증폭 및/또는 증식을 자극하는 조건에서 세포를 배양 또는 인큐베이션한다.
제공된 방법의 구체적인 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오타이드의 도입은 유전자 파괴를 유도할 수 있는 하나 이상의 제제의 도입 후에 수행된다. 하나 이상의 제제를 도입하는 방법은 유전자 파괴를 유도하는 데 사용되는 특정 제제(들)에 따라, 기술된 바와 같이 사용될 수 있다. 일부 측면에서, 파괴는 유전자 편집에 의해 수행되며, 예컨대 파괴되는 CD247 유전자 자리에 특이적인 CRISPR-Cas9 시스템과 같은 클러스터링되고 규칙적으로 산재된 짧은 회문 핵산(CRISPR)-Cas 시스템과 같은 RNA-가이드 뉴클레아제를 사용하여 수행된다. 일부 측면에서, 파괴는 CD247 유전자 자리에 특이적인 CRISPR-Cas9 시스템을 사용하여 수행된다. 일부 구현예에서, Cas9을 함유한 제제 및 CD247 유전자 자리의 영역을 표적화하는 표적화 도메인을 함유한 가이드 RNA(gRNA)가 세포 내로 도입된다. 일부 구현예에서, 상기 제제는 Cas9 및 CD247-표적화된 표적화 도메인을 함유하는 gRNA의 리보핵산단백질(RNP) 복합체(Cas9/gRNA RNP)이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 도입은 제제 또는 이의 일부를 시험관 내에서 세포와 접촉시키는 것을 포함하며, 이에는 세포와 제제를 24, 36 또는 48시간 또는 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8일 동안 배양 또는 인큐베이션하는 것이 포함된다. 일부 구현예에서, 도입은 제제의 세포 내로 전달을 달성하는 것을 더 포함할 수 있다. 다양한 구현예에서, 본 개시 내용에 따른 방법, 조성물 및 세포는 Cas9 및 gRNA의 리보핵산단백질(RNP) 복합체를, 예를 들어 전기 천공법에 의해, 세포로 직접 전달하는 것을 이용한다. 일부 구현예에서, RNP 복합체는 3’ 폴리-A 꼬리 및 5’ 항-역방향 캡 유사체(ARCA) 캡을 포함하도록 변형된 gRNA를 포함한다. 일부 경우에, 변형될 세포의 전기 천공은 세포의 전기 천공이후 플레이팅 전에 예를 들어 32°C에서 세포를 저온 충격하는 것을 포함한다.
제공된 방법의 상기 측면에서, 폴리뉴클레오타이드(예를 들어, 주형 폴리뉴클레오타이드)는 예를 들어 전기 천공을 통해 도입된 Cas9/gRNA RNP와 같은 하나 이상의 제제의 도입 후에, 세포 내로 도입된다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드(예를 들어, 주형 폴리뉴클레오타이드)는 유전자 파괴를 유도할 수 있는 하나 이상의 제제의 도입 후 즉시 도입된다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드(예를 들어, 주형 폴리뉴클레오타이드)는 유전자 파괴를 유도할 수 있는 하나 이상의 제제의 도입 후 (약) 30초 내에, (약) 1분 내에, (약) 2분 내에, (약) 3분 내에, (약) 4분 내에, (약) 5분 내에, (약) 6분 내에, (약) 6분 내에, (약) 8분 내에, (약) 9분 내에, (약) 10분 내에, (약) 15분 내에, (약) 20분 내에, (약) 30분 내에, (약) 40분 내에, (약) 50분 내에, (약) 60분 내에, (약) 90분 내에, (약) 2시간 내에, (약) 3시간 내에 또는 (약) 4시간 내에 세포 내로 도입된다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드(예를 들어, 주형 폴리뉴클레오타이드)는 하나 이상의 제제를 도입한 후 (약) 15분과 (약) 4시간 사이, 예컨대 (약) 15분과 (약) 3시간 사이, (약) 15분과 (약) 2시간 사이, (약) 15분과 (약) 1시간 사이, (약) 15분과 (약) 30분 사이, (약) 30분과 (약) 4시간 사이, (약) 30분과 (약) 3시간 사이, (약) 30분과 (약) 2시간 사이, (약) 30분과 (약) 1시간 사이, (약) 1시간과 (약) 4시간 사이, (약) 1시간과 (약) 3시간 사이, (약) 1시간과 (약) 2시간 사이, (약) 2시간과 (약) 4시간 사이, (약) 2시간과 (약) 3시간 사이 또는 (약) 3시간과 (약) 4시간 사이의 시간에 세포 내로 도입된다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드(예를 들어, 주형 폴리뉴클레오타이드)는 예를 들어 전기 천공을 통해 도입된 Cas9/gRNA RNP와 같은 하나 이상의 제제의 도입 후, (약) 2시간 후에 세포내로 도입된다.
폴리뉴클레오타이드(예를 들어, 주형 폴리뉴클레오타이드)를 도입하는 방법은 폴리뉴클레오타이드(예를 들어, 주형 폴리뉴클레오타이드)를 세포에 전달하는 데 사용되는 특정 방법에 따라, 기술된 바와 같이 사용될 수 있다. 예시적인 방법은 바이러스(예를 들어, 레트로바이러스 또는 렌티바이러스), 형질도입, 트랜스포손 및 전기 천공법을 통한 것을 포함하여 수용체를 암호화하는 핵산의 전달을 위한 방법을 포함한다. 구체적인 구현예에서, 바이러스 형질도입 방법이 사용된다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드는 예를 들어, 시미안 바이러스 40(SV40), 아데노바이러스, 아데노 연관 바이러스(adeno-associated virus, AAV)로부터 유래된 벡터와 같은 재조합 감염성 바이러스 입자를 사용하여 세포 내로 전달 또는 도입될 수 있다. 일부 구현예에서, 재조합 핵산은 재조합 렌티바이러스 벡터 또는 레트로바이러스 벡터, 예컨대 감마-레트로바이러스 벡터를 사용하여 T 세포 내로 전달된다(예를 들어 문헌[Koste et al. (2014) Gene Therapy 2014 Apr 3. doi: 10.1038/gt.2014.25; Carlens et al. (2000) Exp Hematol 28(10): 1137-46; Alonso-Camino et al. (2013) Mol Ther Nucl Acids 2, e93; Park et al., Trends Biotechnol. 2011 November 29(11): 550-557] 참조). 구체적인 구현예에서, 바이러스 벡터는 AAV2 또는 AAV6과 같은 AAV이다.
일부 구현예에서, 제제를 세포와 접촉시키기 전, 도중 또는 후에 및/또는 전달을 달성하기(예를 들어, 전기 천공) 전, 도중 또는 후에, 제공된 방법은 사이토카인, 자극제 및/또는 면역 세포(예를 들어, T 세포)의 증식, 자극 또는 활성화를 유도할 수 있는 제제의 존재 하에서 세포를 인큐베이션하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 인큐베이션의 적어도 일부는 CD3에 특이적인 항체, CD28에 특이적인 항체 및/또는 항-CD3/항-CD28 비드와 같은 사이토카인이거나 이를 포함하는 자극제의 존재 하에서 이루어진다. 일부 구현예에서, 인큐베이션의 적어도 일부는 재조합 IL-2, 재조합 IL-7 및/또는 재조합 IL-15 중 하나 이상과 같은 사이토카인의 존재 하에서 이루어진다. 일부 구현예에서, 인큐베이션은 예를 들어 전기 천공을 통해, Cas9/gRNA RNP와 같은 하나 이상의 제제와 폴리뉴클레오타이드(예를 들어, 주형 폴리뉴클레오타이드)의 도입 전 또는 후에 최대 8일까지, 예컨대 최대 24시간, 36시간 또는 48시간 또는 3, 4, 5, 6, 7 또는 8일까지 동안 이루어진다.
일부 구현예에서, 본 방법은 제제(예를 들어, Cas9/gRNA RNP)와 폴리뉴클레오타이드 주형을 도입하기 전에 세포를 자극제(예를 들어, 항-CD3/항-CD28 항체)로 활성화 또는 자극하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 자극제(예를 들어, 항-CD3/항-CD28)의 존재 하에서 인큐베이션은 예를 들어, 전기 천공을 통해, Cas9/gRNA RNP와 같은 하나 이상의 제제의 도입 전에 6시간 내지 96시간 동안, 예컨대 24 내지 48시간 또는 24 내지 36시간 동안 이루어진다. 일부 구현예에서, 자극제를 이용한 인큐베이션은 재조합 IL-2, 재조합 IL-7 및/또는 재조합 IL-15 중 하나 이상과 같은 사이토카인의 존재를 더 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 인큐베이션은 IL-2(예를 들어, 1U/mL 내지 500U/mL, 예컨대 10U/mL 내지 200U/mL, 예를 들어 적어도 또는 약 50U/mL 또는 100U/mL), IL-7(예를 들어, 0.5ng/mL 내지 50ng/mL, 예컨대 1ng/mL 내지 20ng/mL, 예를 들어, 적어도 또는 약 5ng/mL 또는 10ng/mL) 또는 IL-15(예를 들어, 0.1ng/mL 내지 50ng/mL, 예컨대 0.5ng/mL 내지 25ng/mL, 예를 들어, 적어도 또는 약 1ng/mL 또는 5ng/mL)와 같은 재조합 사이토카인의 존재 하에서 수행된다. 일부 구현예에서, 자극제(들)(예를 들어, 항-CD3/항-CD28 항체)는 유전자 파괴를 유도할 수 있는 제제(들) Cas9/gRNA RNP 및/또는 폴리뉴클레오타이드 주형을 세포 내로 도입 또는 전달하기 전에 세포에서 세척되거나 제거된다. 일부 구현예에서, 제제(들)의 도입 전에, 세포는 예를 들어 자극제 또는 활성화제의 제거에 의해 정치된다(rested). 일부 구현예에서, 제제(들)를 도입하기 전에, 자극제 또는 활성화제 및/또는 사이토카인은 제거되지 않는다.
일부 구현예에서, 제제(들)(예를 들어, Cas9/gRNA) 및/또는 폴리뉴클레오타이드 주형의 도입 이후에, 세포는 재조합 IL-2, 재조합 IL-7 및/또는 재조합 IL-15 중 하나 이상과 같은 재조합 사이토카인의 존재 하에서 인큐베이션, 육성 또는 배양된다. 일부 구현예에서, 인큐베이션은 IL-2(예를 들어, 1U/mL 내지 500U/mL, 예컨대 10U/mL 내지 200U/mL, 예를 들어 적어도 또는 약 50U/mL 또는 100U/mL), IL-7(예를 들어, 0.5ng/mL 내지 50ng/mL, 예컨대 1ng/mL 내지 20ng/mL, 예를 들어, 적어도 또는 약 5ng/mL 또는 10ng/mL) 또는 IL-15(예를 들어, 0.1ng/mL 내지 50ng/mL, 예컨대 0.5ng/mL 내지 25ng/mL, 예를 들어, 적어도 또는 약 1ng/mL 또는 5ng/mL)와 같은 재조합 사이토카인의 존재 하에서 수행된다. 세포는 세포의 증식 또는 증폭을 유도하는 조건에서 인큐베이션 또는 육성될 수 있다. 일부 구현예에서, 세포는 수확을 위한 임계 개수의 세포가 달성될 때까지, 예를 들어, 치료적 유효 용량까지 인큐베이션 또는 육성될 수 있다.
일부 구현예에서, 공정의 일부 또는 공정의 전부 동안 인큐베이션은 30ºC ± 2ºC 내지 39ºC ± 2ºC, 예컨대 적어도 또는 약 적어도 30ºC ± 2ºC, 32ºC ± 2ºC, 34ºC ± 2ºC 또는 37ºC ± 2ºC의 온도에서 이루어질 수 있다. 일부 구현예에서, 인큐베이션의 적어도 일부는 30ºC ± 2ºC에서 이루어지고 인큐베이션의 적어도 일부는 37ºC ± 2ºC에서 이루어진다.
일부 구현예에서, 표적화된 통합 시, 변형된 CD247 유전자 자리에 존재하는 핵산 서열은 HDR에 의해 표적화되는 전이 유전자(예를 들어, 본원에 기술된 바와 같이 CAR과 같은 키메라 수용체의 일부)와 내인성 CD247 유전자 자리의 개방형 해독틀 또는 이의 부분 서열의 융합을 포함한다. 일부 측면에서, 변형된 CD247 유전자 자리에 존재하는 핵산 서열은 CD3ζ 사슬을 암호화하는 개방형 해독틀을 포함하는 내인성 CD247 유전자 자리에서 통합되는, 전이 유전자(예를 들어, 본원에 기술된 바와 같이 CAR과 같은 키메라 수용체의 일부)를 포함한다. 일부 측면에서, 표적화된 통합 또는 융합(예를 들어, 틀 내 융합) 시, 전이 유전자의 외인성 서열의 일부와 내인성 CD247 유전자 자리의 개방형 해독틀의 일부는 CD3ζ 신호 전달 도메인 또는 이의 단편을 함유하는 키메라 수용체(예를 들어, CAR)를 함께 암호화한다. 따라서, 제공된 구현예는 키메라 수용체의 CD3ζ 신호 전달 도메인 또는 이의 일부를 암호화하기 위해 내인성 CD247 유전자 자리의 개방형 해독틀 서열의 일부 또는 전부를 이용한다. 일부 구현예에서, 전이 유전자 서열의 표적화된 틀 내 통합 시, 변형된 CD247 유전자 자리는 CD3ζ 신호 전달 도메인을 함유하는 전체의, 완전한 또는 전장의 키메라 수용체(예를 들어, CAR)를 암호화하는 서열을 함유한다.
내인성 CD247 유전자 자리에서 유전자 파괴를 수행하고/거나 키메라 수용체의 일부, 예를 들어 CAR의 일부와 같은 전이 유전자 서열의 CD247 유전자 자리 내로의 표적화된 통합을 위해 HDR을 실행하는 예시적인 방법들이 다음 하위 섹션들에 기술된다.
A. 유전자 파괴
일부 구현예에서, 하나 이상의 표적화된 유전자 파괴가 내인성 CD247 유전자 자리에서 유도된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 표적화된 유전자 파괴가 내인성 CD247 유전자 자리 또는 그 근처의 하나 이상의 표적 부위에서 유도된다. 일부 구현예에서, 표적화된 유전자 파괴는 내인성 CD247 유전자 자리의 인트론에서 유도된다. 일부 구현예에서, 표적화된 유전자 파괴는 내인성 CD247 유전자 자리의 엑손에서 유도된다. 일부 측면에서, 하나 이상의 표적화된 유전자 파괴 및 키메라 수용체 또는 이의 일부를 암호화하는 전이 유전자 서열을 함유한 폴리뉴클레오타이드(예를 들어, 주형 폴리뉴클레오타이드)의 존재는 내인성 CD247 유전자 자리의 하나 이상의 유전자 파괴 부위(예를 들어, 표적 부위) 또는 그 근처에서 전이 유전자 서열의 표적화된 통합을 초래할 수 있다.
일부 구현예에서, 유전자 파괴는 게놈의 하나 이상의 표적 부위에서, 이중가닥 절단(DSB) 또는 절단과 같은 DNA 절단, 또는 단일가닥 절단(SSB)과 같은 닉(nick)을 초래한다. 일부 구현예에서, 유전자 파괴 부위(예를 들어, DNA 절단 또는 닉)에서, 세포 DNA 수선 메커니즘의 작용은 녹아웃, 삽입, 미스센스 돌연변이 또는 이중 대립 틀 이동 돌연변이와 같은 틀 이동 돌연변이, 유전자의 전부 또는 일부의 결실을 유발할 수 있거나; 또는 수선 주형, 예를 들어 주형 폴리뉴클레오타이드의 존재 하에서 주형에 함유된 재조합 수용체의 전부 또는 일부를 암호화하는 전이 유전자와 같은 핵산 서열의 통합 또는 삽입과 같은 수선 주형에 기초하여 DNA 서열을 변경할 수 있다. 일부 구현예에서, 유전자 파괴는 유전자 또는 이의 일부의 하나 이상의 엑손을 표적화할 수 있다. 일부 구현예에서, 유전자 파괴는 외인성 서열, 예를 들어 키메라 수용체를 암호화하는 전이 유전자 서열의 표적화된 통합의 원하는 부위 근처로 표적화할 수 있다.
일부 구현예에서, 적어도 하나의 표적 부위(들) 중 하나 근처의 영역에서 서열에 특이적으로 결합하거나 혼성화(hybridize)되는, DNA 결합 단백질 또는 DNA 결합 핵산이 표적화된 파괴에 사용된다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오타이드, 예를 들어, 키메라 수용체의 일부를 암호화하는 전이 유전자와 같은 핵산 서열 및 상동성 서열을 포함하는 주형 폴리뉴클레오타이드는 본원에 기술된 바와 같이 예를 들어 섹션 I.B에서, 유전자 파괴 부위 또는 그 근처에서 키메라 수용체-암호화 서열의 HDR에 의한 표적화된 통합을 위해 도입될 수 있다.
일부 구현예에서, 유전자 파괴는 유전자 파괴를 유도할 수 있는 하나 이상의 제제를 도입하여 수행된다. 일부 구현예에서, 상기 제제는 유전자에 특이적으로 결합하거나 혼성화하는 DNA 결합 단백질 또는 DNA 결합 핵산을 포함한다. 일부 구현예에서, 제제는 DNA 표적화 단백질 및 뉴클레아제를 포함하는 융합 단백질 또는 RNA-가이드 뉴클레아제와 같은 다양한 성분을 포함한다. 일부 구현예에서, 제제는 하나 이상의 표적 부위 또는 표적 위치를 표적화할 수 있다. 일부 측면에서, 표적 부위의 각 측면에 한 쌍의 단일 가닥 절단(예를 들어, 닉)이 생성될 수 있다.
제공된 구현예에서, 용어 “도입(introducing)”은 시험관 내 또는 생체 내에서 DNA와 같은 핵산 및/또는 단백질을 세포 내로 도입하는 다양한 방법을 포괄하며, 상기 방법은 형질 전환, 형질도입, 형질주입(예를 들어, 전기 천공) 및 감염을 포함한다. 벡터는 DNA 암호화 분자를 세포 내로 도입하는 데 유용하다. 가능한 벡터에는 플라스미드 벡터 및 바이러스 벡터가 포함된다. 바이러스 벡터에는 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터 또는 아데노바이러스 벡터 또는 아데노 연관 벡터와 같은 기타 벡터가 포함된다. 전기 천공과 같은 방법은 또한 예를 들어 표적화 gRNA와 복합체로 Cas9 단백질을 함유하는 단백질 또는 리보핵산단백질(RNP)을 관심 세포로 도입하거나 전달하는 데 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 유전자 파괴는 표적 부위(또한 “표적 위치(target position or target location)” 또는 “표적 DNA 서열”로도 알려짐)에서, 예를 들어 내인성 CD247 유전자 자리에서 발생한다. 일부 구현예에서, 표적 부위는 유전자 파괴를 유도할 수 있는 하나 이상의 제제, 예를 들어, 표적 부위를 지정하는 gRNA와 복합된 Cas9 분자에 의해 변형되는 표적 DNA 상의 부위를 포함한다. 예를 들어, 표적 부위는 절단 또는 DNA 절단이 발생하는, DNA 내 내인성 CD247 유전자 자리의 위치를 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 재조합 수용체 또는 이의 일부를 암호화하는 전이 유전자와 같은 핵산 서열의 HDR에 의한 통합은 표적 부위 또는 표적 서열에서 또는 그 근처에서 발생할 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 부위는 하나 이상의 뉴클레오타이드가 첨가되는 DNA 상의 두 뉴클레오타이드, 예를 들어 인접 뉴클레오타이드 사이의 부위일 수 있다. 표적 부위는 주형 폴리뉴클레오타이드에 의해 변경되는 하나 이상의 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 부위는 표적 서열(예를 들어, gRNA가 결합하는 서열) 내에 있다. 일부 구현예에서, 표적 부위는 표적 서열의 상류부위(upstream) 또는 하류부위(downstream)이다.
1. 내인성 CD247 유전자 자리에 있는 표적 부위
일부 구현예에서, 유전자 파괴, 및/또는 상동 직접 수선(HDR)을 통한, 키메라 수용체의 일부를 암호화하는 전이 유전자의 통합은 T 세포 표면 당단백질 CD3-제타 사슬(CD3제타; CD3ζ; T 세포 수용체 T3 제타 사슬; CD3Z; T3Z; TCRZ; 분화 클러스터 247; CD247; IMD25로도 알려짐)을 암호화하는 내인성 또는 게놈 유전자 자리에 표적화된다. 인간에서, CD3ζ는 분화 클러스터 247(CD247) 유전자에 의해 암호화된다. 일부 구현예에서, 유전자 파괴, 및 상동 직접 수선(HDR)을 통한, 키메라 수용체의 일부를 암호화하는 전이 유전자의 통합은 인간 CD247 유전자 자리에 표적화된다. 일부 측면에서, 유전자 파괴는, 전이 유전자 서열의 표적화된 통합, 융합 또는 삽입이 CD247 유전자 자리의 유전자 파괴 부위에서 또는 그 근처에서 발생하도록, CD3ζ를 암호화하는 개방형 해독틀을 함유한 CD247 유전자 자리 내 표적 부위에 표적화된다. 일부 측면에서, 유전자 파괴는 CD3ζ를 암호화하는 개방형 해독틀의 엑손에 또는 그 근처에 표적화된다. 일부 측면에서, 유전자 파괴는 CD3ζ를 암호화하는 개방형 해독틀의 인트론에 또는 그 근처에 표적화된다.
CD3ζ는 적응 면역 반응에 관여하는 T 세포의 표면 상에 존재하는 TCR-CD3 복합체의 일부이다. CD3ζ는 T 세포 수용체(TCR) 알파/베타(TCRαβ) 또는 TCR 감마/델타(TCRγδ) 이종이량체, CD3-감마(CD3γ), CD3-델타(CD3δ) 및 CD3-엡실론(CD3ε)과 함께 TCR-CD3 복합체를 형성한다. CD3ζ는 자신의 세포내 또는 세포질 도메인 내에 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프(ITAM)를 함유한다. CD3ζ 사슬은, 예를 들어 ITAM을 통해, 1차 세포질 또는 세포내 신호 전달을 자극하거나 활성화하여 항원 인식을 세포내 신호 전달 경로에 결합시킬 수 있다. TCR이 자신의 리간드(예를 들어, MHC 분자의 맥락에서 펩타이드; MHC-펩타이드 복합체)와 결합 시, ITAM 모티프는 Src 계열 단백질 티로신 키나아제인 LCK 및 FYN을 포함하는 키나아제들에 의해 인산화될 수 있으며, 이는 하류부위 신호 전달 경로의 자극을 유발한다. 일부 측면에서, CD3ζ ITAM의 인산화는 단백질 키나아제 ZAP70에 대한 도킹 부위를 생성하여 ZAP70의 인산화 및 활성화를 유도한다.
예시적인 인간 CD3ζ 전구체 폴리펩타이드 서열이 서열 번호: 73(동형 단백질 1; 성숙 폴리펩타이드는 서열 번호: 73의 잔기 22 내지 164를 포함함; Uniprot 수탁 번호 P20963; NCBI 참조 서열: NP_932170.1; 서열 번호: 74에 제시된 mRNA 서열, NCBI 참조 서열: NM_198053.2 참조) 또는 서열 번호 75(동형 단백질 2; 성숙 폴리펩타이드는 서열 번호: 75의 잔기 22 내지 163를 포함함; NCBI 참조 서열: NP_000725.1; 서열 번호: 76에 제시된 mRNA 서열, NCBI 참조 서열: NM_000734.3 참조)에 제시된다. 예시적인 성숙 CD3ζ 사슬은 세포외 영역(서열 번호: 73 또는 75에 제시된 인간 CD3ζ 사슬 전구체 서열의 아미노산 잔기 22 내지 30 포함), 막관통 영역(서열 번호: 73 또는 75에 제시된 인간 CD3ζ 사슬 전구체 서열의 아미노산 잔기 31 내지 51 포함), 및 세포내 영역(서열 번호: 73에 제시된 인간 CD3ζ 사슬 전구체 서열의 아미노산 잔기 52 내지 164 또는 서열 번호: 75에 제시된 인간 CD3ζ 사슬 전구체 서열의 아미노산 잔기 52 내지 163 포함)을 함유한다. CD3ζ 사슬은 서열 번호: 73에 제시된 인간 CD3ζ 사슬 전구체 서열의 아미노산 잔기 61 내지 89, 100 내지 128 또는 131 내지 159에 또는 서열 번호: 75에 제시된 인간 CD3ζ 사슬 전구체 서열의 아미노산 잔기 61 내지 89, 100 내지 127 또는 130 내지 158에 세 개의 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프(ITAM) 도메인을 함유한다.
인간에서, CD247의 예시적인 게놈 유전자 자리는 8개의 엑손과 7개의 인트론을 함유한 개방형 해독틀을 포함한다. CD247의 예시적인 mRNA 전사물은 인간 게놈 버전 GRCh38(UCSC Genome Browser on Human Dec. 2013 (GRCh38/hg38) Assembly)을 참조하여, 역 가닥(reverse strand) 상에서 염색체 1: 167,430,640-167,518,610에 해당하는 서열을 포괄할 수 있다. 표 1은 예시적인 인간 CD247 유전자 자리의 개방형 해독틀의 엑손 및 인트론 및 전사물의 비번역 영역의 좌표를 제시한다.
표 1. 예시적인 인간 CD247 유전자 자리(GRCh38, 염색체 1, 역 가닥)의 엑손 및 인트론의 좌표.
　 시작 (GrCh38) 끝 (GrCh38) 길이
5' UTR 및 엑손 1 167,518,610 167,518,408 203
인트론 1-2 167,518,407 167,440,768 77,640
엑손 2 167,440,767 167,440,664 104
인트론 2-3 167,440,663 167,439,401 1,263
엑손 3 167,439,400 167,439,344 57
인트론 3-4 167,439,343 167,438,651 693
엑손 4 167,438,650 167,438,570 81
인트론 4-5 167,438,569 167,435,432 3,138
엑손 5 167,435,431 167,435,399 33
인트론 5-6 167,435,398 167,434,077 1,322
엑손 6 167,434,076 167,434,020 57
인트론 6-7 167,434,019 167,433,060 960
엑손 7 167,433,059 167,433,024 36
인트론 7-8 167,433,023 167,431,747 1,277
엑손 8 및 3' UTR 167,431,746 167,430,640 1,107
일부 측면에서, 주형 폴리뉴클레오타이드 내의 전이 유전자(예를 들어, 외인성 핵산 서열)는 표적 부위 및/또는 상동성 암의 위치를 가이드하는 데 사용될 수 있다. 일부 측면에서, 유전자 파괴의 표적 부위는 HDR에 사용될 주형 폴리뉴클레오타이드 및/또는 상동성 암을 설계하기 위한 가이드로 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 유전자 파괴는(예를 들어, 키메라 수용체 또는 이의 일부를 암호화하는) 전이 유전자 서열의 표적화된 통합의 원하는 부위 근처에 표적화할 수 있다. 일부 측면에서, 유전자 파괴는 통합을 위해 전이 유전자 서열 내에 함유된 CD3ζ 사슬을 암호화하는 서열의 양에 기초하여 표적화된다. 일부 측면에서, 표적 부위는 내인성 CD247 유전자 자리의 개방형 해독틀의 엑손 내에 있다. 일부 측면에서, 표적 부위는 내인성 CD247 유전자 자리의 개방형 해독틀의 인트론 내에 있다.
일부 구현예에서, 유전자 파괴에 대한 표적 부위는, 전이 유전자 서열의 통합 후에, 변형된 CD247 유전자 자리에 의해 암호화된 키메라 수용체가 기능성 CD3제타 사슬 또는 이의 단편을 통해 신호 전달을 할 수 있도록 기능성 CD3제타 또는 이의 단편을 함유하도록, 선택된다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오타이드의 하나 이상의 상동성 암 서열은 유전자 파괴 부위를 둘러싸도록 설계된다. 일부 측면에서, 표적 부위는 내인성 CD247 유전자 자리의 엑손 내에 또는 그 근처에 배치되어, 그렇게 하여 키메라 수용체의 일부를 암호화하는 전이 유전자는 CD247 유전자 자리의 코딩 서열과 틀 내 통합될 수 있다.
일부 구현예에서, 표적 부위는 전이 유전자의 표적화된 통합이 전이 유전자와 CD247 유전자 자리의 내인성 서열의 유전자 융합을 발생시켜 이들이 함께 기능성 CD3ζ 사슬을 암호화하도록 선택된다. 일부 측면에서, 내인성 서열은 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프(ITAM)를 포함하는 CD3ζ 사슬의 일부와 같은, 1차 세포질 또는 세포내 신호, 예를 들어, CD3ζ 사슬의 세포질 도메인을 매개, 활성화 또는 자극할 수 있는 CD3ζ 사슬의 일부인 기능성 CD3ζ 사슬을 암호화한다. 일부 측면에서, 표적 부위는 CD3ζ 사슬의 세포내 영역을 암호화하는 내인성 개방형 해독틀 서열의 시작 부분 또는 근처에, 예를 들어, 서열 번호: 73에 제시된 인간 CD3ζ 사슬 전구체 서열의 아미노산 잔기 52 내지 164 또는 서열 번호: 75에 제시된 인간 CD3ζ 사슬 전구체 서열의 아미노산 잔기 52 내지 163에; 또는 엑손 2 또는 엑손 3(예를 들어, 본원의 표 1에 기술된 바와 같이 GrCh38에서 뉴클레오타이드 167,440,767 내지 167,440,664 또는 뉴클레오타이드 167,439,400 내지 167,439,344에 또는 그 근처에 있는 서열)에 또는 그 근처에 배치된다. 일부 측면에서, 표적 부위는 CD3ζ 사슬의 ITAM 도메인을 암호화하는 내인성 개방형 해독틀, 예를 들어, 서열 번호: 73에 제시된 인간 CD3ζ 사슬 전구체 서열의 아미노산 잔기 61 내지 89, 100 내지 128 또는 131 내지 159 또는 서열 번호: 75에 제시된 인간 CD3ζ 사슬 전구체 서열의 아미노산 잔기 61 내지 89, 100 내지 127 또는 130 내지 158의 앞에 또는 상류부위에 배치된다.
일부 측면에서, 표적 부위는 내인성 CD247 유전자 자리의 엑손 내에 있다. 일부 측면에서, 표적 부위는 내인성 CD247 유전자 자리의 인트론 내에 있다. 일부 측면에서, 표적 부위는 CD247 유전자 자리의 조절 또는 제어 요소, 예를 들어, 프로모터, 5’ 비번역 영역(UTR) 또는 3’ UTR 내에 있다. 일부 구현예에서, 표적 부위는 본원의 표 1에 기술된 CD247 게놈 영역 서열 내 또는 그 안에 함유된 CD247 게놈 영역 서열의 임의의 엑손 또는 인트론 내에 있다.
일부 측면에서, 표적 부위는 초기 코딩 영역에 해당하는 엑손과 같은 엑손 내에 있다. 일부 구현예에서, 표적 부위는 초기 코딩 영역에 해당하는 엑손, 예를 들어, 내인성 CD247 유전자 자리의 개방형 해독틀의 엑손 1, 2, 또는 3(예컨대 본원의 표 1에 기술됨) 내에 또는 가까이 근접하여, 또는 전사 시작 부위 바로 다음의 서열을 포함하여 엑손 1, 2, 또는 3 내에 또는 엑손 1, 2, 또는 3의 500, 450, 400, 350, 300, 250, 200, 150, 100 또는 50bp 미만 이내에 있다. 일부 측면에서, 표적 부위는 내인성 CD247 유전자 자리의 엑손 1에 또는 그 근처에, 예를 들어, 엑손 1의 500, 450, 400, 350, 300, 250, 200, 150, 100 또는 50bp 미만 이내에 있다. 일부 구현예에서, 표적 부위는 내인성 CD247 유전자 자리의 엑손 2에 또는 그 근처에, 또는 엑손 2의 500, 450, 400, 350, 300, 250, 200, 150, 100 또는 50bp 미만 이내에 있다. 일부 측면에서, 표적 부위는 내인성 CD247 유전자 자리의 엑손 3에 또는 그 근처에, 예를 들어, 엑손 3의 500, 450, 400, 350, 300, 250, 200, 150, 100 또는 50bp 미만 이내에 있다. 일부 측면에서, 표적 부위는 CD247 유전자 자리의 조절 또는 제어 요소, 예를 들어, 프로모터 내에 있다.
특정 구현예에서, 유전자 파괴는 CD247 유전자 자리에, 그 근처에 또는 그 내에 표적화된다. 구체적인 구현예에서, 유전자 파괴는 (본원의 표 1에 기술된 바와 같이) CD247 유전자 자리의 개방형 해독틀에, 그 근처에 또는 그 내에 표적화된다. 특정 구현예에서, 유전자 파괴는 CD3ζ 사슬을 암호화하는 개방형 해독틀에, 그 근처에 또는 그 내에 표적화된다. 일부 구현예에서, 유전자 파괴는 (본원의 표 1에 기술된 바와 같이) CD247 유전자 자리에, 그 근처에 또는 그 내에, 또는 (본원의 표 1에 기술된 바와 같이) CD247 유전자 자리의 전부 또는 일부, 예를 들어 적어도 500, 1,000, 1,500, 2,000, 2,500, 3,000, 3,500, 또는 4,000개 인접 뉴클레오타이드에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 99.9% 서열 동일성을 가진 서열에, 그 근처에 또는 그 내에 표적화된다.
일부 구현예에서, 유전자 파괴(예를 들어, DNA 절단)는 CD247 유전자 자리 또는 이의 개방형 해독틀의 엑손 내에 표적화된다. 특정 구현예에서, 유전자 파괴는 CD247 유전자 자리 또는 이의 개방형 해독틀의 제1 엑손, 제2 엑손, 제3 엑손 또는 제4 엑손 내에 있다. 구체적인 구현예에서, 유전자 파괴는 CD247 유전자 자리 또는 이의 개방형 해독틀의 제1 엑손 내에 있다. 일부 구현예에서, 유전자 파괴는 CD247 유전자 자리 또는 이의 개방형 해독틀에서 제1 엑손의 5’ 말단으로부터 하류부위로 500 염기쌍(bp) 내에 있다. 구체적인 구현예에서, 유전자 파괴는 엑손 1의 5’ 뉴클레오타이드와 엑손 1의 3’ 뉴클레오타이드의 상류부위 사이에 있다. 특정 구현예에서, 유전자 파괴는 CD247 유전자 자리 또는 이의 개방형 해독틀에서 제1 엑손의 5’ 말단으로부터 하류부위로 400bp, 350bp, 300bp, 250bp, 200bp, 150bp, 100bp 또는 50bp 내에 있다. 구체적인 구현예에서, 유전자 파괴는 CD247 유전자 자리 또는 이의 개방형 해독틀에서 제1 엑손의 5’ 말단으로부터 하류부위로 1bp 내지 400bp 사이, 50bp 내지 300bp 사이, 100bp 내지 200bp 사이, 또는 100bp 내지 150bp 사이에 있다. 특정 구현예에서, 유전자 파괴는 CD247 유전자 자리 또는 이의 개방형 해독틀에서 제1 엑손의 5’ 말단으로부터 하류부위로 100bp 내지 150bp 사이에 있다.
2. 유전자 파괴 방법
일부 측면에서, 유전자 조작된 세포를 생성하는 방법은 하나 이상의 표적 부위, 예를 들어 CD3제타(CD3ζ)를 암호화하는 CD247 유전자 자리의 하나 이상의 표적 부위에 유전자 파괴를 도입하는 것을 포함한다. 본원에 기술된 것을 포함하여 유전자 파괴를 생성하는 방법은 내인성 또는 게놈 DNA 내 표적 부위 또는 표적 위치에 유전자 파괴, 절단 및/또는 이중가닥 절단(DSB) 또는 닉(예를 들어, 단일가닥 절단(SSB))을 유도하도록 조작된 시스템과 같이 유전자 파괴를 유도할 수 있는 하나 이상의 제제의 사용을 포함할 수 있으며, 그렇게 하여 비-상동성 말단 봉합(NHEJ)과 같은 오류로 발생된 공정에 의한 절단의 수선 또는 수선 주형을 사용하는 HDR에 의한 수선이 표적 부위 또는 위치에 또는 그 근처에 관심 서열(예를 들어, 키메라 수용체의 일부를 암호화하는 외인성 핵산 서열 또는 전이 유전자)의 삽입을 초래할 수 있다. 본원에 제공된 방법에서 사용하기 위한, 유전자 파괴를 유도할 수 있는 하나 이상의 제제가 또한 제공된다. 일부 측면에서, 하나 이상의 제제는 전이 유전자 서열의 상동 직접 수선(HDR) 매개 표적화된 통합을 위해 본원에 제공된 주형 뉴클레오타이드와 조합하여 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 유전자 파괴를 유도할 수 있는 하나 이상의 제제는 게놈 내 특정한 부위 또는 위치, 예를 들어, 표적 부위 또는 표적 위치에 특이적으로 결합하거나 혼성화하는 DNA 결합 단백질 또는 DNA 결합 핵산을 포함한다. 일부 측면에서, 내인성 CD247 유전자 자리의 표적화된 유전자 파괴(예를 들어, DNA 절단 또는 절단)는 예컨대 키메라 또는 융합 단백질에서 유전자 편집 뉴클레아제와 결합하거나 복합된 단백질 또는 핵산을 사용하여 달성된다. 일부 구현예에서, 유전자 파괴를 유도할 수 있는 하나 이상의 제제는 RNA-가이드 뉴클레아제, 또는 DNA 표적화 단백질 및 뉴클레아제를 포함하는 융합 단백질을 포함한다.
일부 구현예에서, 제제는 RNA-가이드 뉴클레아제, 또는 DNA 표적화 단백질 및 뉴클레아제를 포함하는 융합 단백질 같은 다양한 성분을 포함한다. 일부 구현예에서, 표적화된 유전자 파괴는 하나 이상의 징크 핑거 단백질(ZFP)과 같은 DNA 결합 단백질 또는 엔도뉴클레아제와 같은 뉴클레아제에 융합된 전사 활성화인자 유사 효과기(transcription activator-like effector, TALE)를 포함하는 DNA 표적화 분자를 사용하여 수행된다. 일부 구현예에서, 표적화된 유전자 파괴는 (Cas 및/또는 Cfp1을 포함하여) 클러스터링되고 규칙적으로 산재된 짧은 회문 핵산(CRISPR)-결합 뉴클레아제(Cas) 시스템과 같은 RNA-가이드 뉴클레아제를 사용하여 수행된다. 일부 구현예에서, 표적화된 유전자 파괴는 징크 핑거 뉴클레아제(ZFN) 및 전사 활성화인자 유사 효과기 뉴클레아제(TALEN)과 같은 DNA 결합 표적화된 뉴클레아제 및 유전자 편집 뉴클레아제를 포함하여 서열-특이적 또는 표적화된 뉴클레아제, 및 적어도 하나의 표적 부위, 유전자의 서열 또는 이의 일부에 표적화되도록 특이적으로 설계된 CRISPR-결합 뉴클레아제(Cas) 시스템과 같은 RNA-가이드 뉴클레아제와 같은, 유전자 파괴를 유도할 수 있는 제제를 사용하여 수행된다. 예시적인 ZFN, TALE, 및 TALEN이 예를 들어 문헌[Lloyd et al., Frontiers in Immunology, 4(221): 1-7 (2013)]에 기술되어 있다.
징크 핑거 단백질(ZFP), 전사 활성화인자 유사 효과기(TALE), 및 CRISPR 시스템 결합 도메인은 예를 들어 자연 발생 ZFP 또는 TALE 단백질의 인식 나선 영역의 조작(하나 이상의 아미노산을 변경)을 통해, 미리 결정된 뉴클레오타이드 서열에 결합하도록 “조작될(engineered)” 수 있다. 조작된 DNA 결합 단백질(ZFP 또는 TALE)은 비자연 발생 단백질이다. 합리적 설계 기준에는 기존 ZFP 및/또는 TALE 설계 정보 및 결합 데이터를 저장하는 데이터베이스의 정보 처리를 위한 대체 규칙 및 컴퓨터 알고리즘의 적용이 포함된다. 예를 들어, 문헌[미국 특허 번호 6,140,081; 6,453,242; 및 6,534,261; 또한 WO 98/53058; WO 98/53059; WO 98/53060; WO 02/016536 및 WO 03/016496 및 미국 특허 출원 공개 번호 20110301073]을 참조한다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 제제는 CD247 유전자 자리에서 또는 그 근처에서 적어도 하나의 표적 부위를 특이적으로 표적화한다. 일부 구현예에서, 제제는 표적 부위(들)에 특이적으로 결합하는, 이를 인식하는 또는 이에 혼성화하는 ZFN, TALEN 또는 CRISPR/Cas9 조합물을 포함한다. 일부 구현예에서, CRISPR/Cas9 시스템은 특이적 절단을 가이드하도록 조작된 crRNA/tracr RNA(“단일 가이드 RNA”)를 포함한다. 일부 구현예에서, 제제는 아르고노트(Argonaute) 시스템에 기초하여 (예를 들어, ‘TtAgo’(Swarts et al., (2014) Nature 507(7491): 258-261)로 알려진 테르무스 테르모필루스(T. thermophilus)로부터의) 뉴클레아제를 포함한다. 본원에 기술된 임의의 뉴클레아제 시스템을 사용하는 표적화된 절단은 핵산 서열, 예를 들어, 키메라 수용체의 일부를 암호화하는 전이 유전자 서열을 내인성 CD247 유전자 자리의 특이적 표적 위치에 HDR 또는 NHEJ-매개 공정을 사용하여 삽입하는 데 이용될 수 있다.
일부 구현예에서, “징크 핑거 DNA 결합 단백질”(또는 결합 도메인)은 구조가 아연 이온의 배위(coordination)를 통해 안정화되는 결합 도메인 내 아미노산 서열의 영역인 하나 이상의 징크 핑거를 통해 서열 특이적 방식으로 DNA에 결합하는, 단백질 또는 더 큰 단백질 내 도메인이다. 징크 핑거 DNA 결합 단백질이라는 말은 종종 징크 핑거 단백질 또는 ZFP로 축약된다. ZFP들 중에는 개별 핑거들의 조립에 의해 생성된, 특이적인 DNA 서열(일반적으로 9 내지 18개 뉴클레오타이드 길이)을 표적화하는 인공 ZFP 도메인이 있다. ZFP에는 단일 핑거 도메인이 대략 30개 아미노산 길이이고 아연을 통해 단일 베타 회전의 2개의 시스테인과 배위결합된 두 개의 불변 히스티딘 잔기를 함유하고 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 핑거를 가진 알파 나선을 함유하는, 것이 포함된다. 일반적으로, ZFP의 서열-특이성은 징크 핑거 인식 나선 상의 4개 나선 위치(1, 2, 3, 및 6)에서 아미노산 치환을 함으로써 변경될 수 있다. 따라서, 예를 들어, ZFP 또는 ZFP-함유 분자는 비자연 발생이고,예를 들어, 선택된 표적 부위에 결합하도록 조작된다.
일부 경우에. DNA 표적화 분자는 DNA 절단 도메인에 융합되어 징크 핑거 뉴클레아제(ZFN)을 형성하는 징크 핑거 DNA 결합 도메인이거나 이를 포함한다. 예를 들어, 융합 단백질은 조작되거나 조작되지 않을 수 있는 적어도 하나의 IIS형 제한 효소 및 하나 이상의 징크 핑거 결합 도메인으로부터의 절단 도메인(또는 절단 절반-도메인)을 포함한다. 일부 경우에, 절단 도메인은 일반적으로 한 가닥의 인식 부위로부터 9개 뉴클레오타이드 및 다른 가닥의 인식 부위로부터 13개 뉴클레오타이드에서 DNA의 이중 가닥 절단을 촉매하는 IIS형 제한 엔도뉴클레아제 FokI에서 유래한다. 예를 들어,.문헌[미국 특허 번호 5,356,802; 5,436,150 및 5,487,994; Li et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4275-4279; Li et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2764-2768; Kim et al. (1994a) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:883-887; Kim et al. (1994b) J. Biol. Chem. 269: 978-982]을 참조한다. 일부 유전자-특이적 조작된 징크 핑거는 상업적으로 이용 가능하다. 예를 들어, 수천 개의 표적에 대해 특이적으로 표적화된 징크 핑거를 제공하는 징크 핑거 구성을 위한 CompoZr이라는 플랫폼을 이용할 수 있다. 예를 들어, 문헌[Gaj et al., Trends in Biotechnology, 2013, 31(7), 397-405]을 참조한다. 일부 경우에, 상업적으로 이용 가능한 징크 핑거가 사용되거나 맞춤 설계된다.
일부 구현예에서, 예를 들어 CD247 유전자 자리 내 하나 이상의 표적 부위는 조작된 ZFN들에 의해 유전자 파괴를 위해 표적화될 수 있다. 내인성 CD247 유전자 자리를 표적화하는 예시적인 ZFN은 예를 들어 문헌[Rudemiller et al., (2014) Hypertension. 63(3):559-64]에 기술된 것을 포함하며, 이 개시 내용 전체는 참조로 포함된다.
전사 활성화인자 유사 효과기(TALE)는 복수의 반복된 서열을 포함하는 박테리아 종 크산토모나스속(Xanthomonas)의 단백질이며, 각 반복은 핵산 표적화된 서열의 각 뉴클레오타이드 염기에 특이적인 위치 12 및 13에 이중잔기(di-risidue) (RVD)를 포함한다. 유사한 모듈형 염기-당-염기 핵산 결합 특성(MBBBD)을 갖는 결합 도메인이 또한 상이한 박테리아 종으로부터 유래될 수 있다. 새로운 모듈형 단백질은 TAL 반복보다 더 많은 서열 가변성을 표시하는 이점이 있다. 일부 구현예에서, 상이한 뉴클레오타이드의 인식과 관련된 RVD들은 C 인식을 위한 HD, T 인식을 위한 NG, A 인식을 위한 NI, G 또는 A 인식을 위한 NN, A, C, G 또는 T 인식을 위한 NS, T 인식을 위한 HG, T 인식을 위한 IG, G 인식을 위한 NK, C 인식을 위한 HA, C 인식을 위한 ND, C 인식을 위한 HI, G 인식을 위한 HN, G 인식을 위한 NA, G 또는 A 인식을 위한 SN 및 T 인식을 위한 YG, A 인식을 위한 TL, A 또는 G 인식을 위한 VT 및 A 인식을 위한 SW이다. 일부 구현예에서, 임계 아미노산 12 및 13은 뉴클레오타이드 A, T, C 및 G에 대한 특이성을 조절하고 특히 이 특이성을 향상시키기 위해 다른 아미노산 잔기들에 대해 돌연변이될 수 있다.
일부 구현예에서, “TALE DNA 결합 도메인” 또는 “TALE”는 하나 이상의 TALE 반복 도메인/단위를 포함하는 폴리펩타이드이다. 각각 반복 가변 이중잔기(RVD)를 포함하는 반복 도메인은 동족 표적 DNA 서열에 대한 TALE의 결합에 관여한다. 단일 “반복 단위”(“반복”이라고도 함)는 일반적으로 33-35개 아미노산 길이이고 자연 발생 TALE 단백질 내에서 다른 TALE 반복 서열과 적어도 일부 서열 상동성을 나타낸다. TALE 단백질은 반복 단위 내에서 표준(canonical) 또는 비표준(non-canonical) RVD를 사용하여 표적 부위에 결합하도록 설계될 수 있다. 예를 들어, 문헌[미국 특허 번호 8,586,526 및 9,458,205]를 참조한다.
일부 구현예에서, “TALE-뉴클레아제”(TALEN)는 일반적으로 전사 활성화인자 유사 효과기(TALE)로부터 유래된 핵산 결합 도메인 및 핵산 표적 서열을 절단하는 뉴클레아제 촉매 도메인을 포함하는 융합 단백질이다. 촉매 도메인은 뉴클레아제 도메인 또는 엔도뉴클레아제 활성을 갖는 도메인, 예를 들어 I-TevI, ColE7, NucA 및 Fok-I를 포함한다. 구체적인 구현예에서, TALE 도메인은 예를 들어 I-CreI 및 I-OnuI 또는 이의 기능적 변이체와 같이 메가뉴클레아제에 융합될 수 있다. 일부 구현예에서, TALEN은 단량체 TALEN이다. 단량체 TALEN은 WO2012138927에 기술된 조작된 TAL 반복과 I-TevI의 촉매 도메인의 융합과 같은, 특이적인 인식 및 절단에 대한 이량체화(dimerization)가 필요하지 않은 TALEN이다. TALEN은 유전자 표적화 및 유전자 변형에 관해 기술되고 사용되어 왔다(예를 들어, 문헌[Boch et al. (2009) Science 326(5959): 1509-12; Moscou and Bogdanove (2009) Science 326(5959): 1501; Christian et al. (2010) Genetics 186(2): 757-61; Li et al. (2011) Nucleic Acids Res 39(1): 359-72)]을 참조한다. 일부 구현예에서, CD247 유전자 자리 내 하나 이상의 표적 부위는 조작된 TALEN들에 의해 유전자 파괴를 위해 표적화될 수 있다.
일부 구현예에서, “TtAgo”는 유전자 침묵(gene silencing)에 관여하는 것을 생각되는 원핵 아르고노트 단백질이다. TtAgo는 박테리아 테르무스 테르모필루스에서 유래된다. 예를 들어, 문헌[Swarts et al., (2014) Nature 507(7491): 258-261, G. Sheng et al., (2013) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111, 652]을 참조한다. “TtAgo 시스템”은 TtAgo 효소에 의한 절단을 위해 예를 들어 가이드 DNA를 포함하여 필요한 모든 구성 요소이다.
일부 구현예에서, 조작된 징크 핑거 단백질, TALE 또는 CRISPR/Cas 시스템은 자연에서 발견되지 않으며 이의 생산은 주로 파지 디스플레이, 상호작용 트랩(interaction trap) 또는 잡종 선택(hybrid selection)과 같은 경험적 과정에서 비롯된다. 예를 들어, 문헌[미국 특허 번호 5,789,538; 미국 특허 번호 5,925,523; 미국 특허 번호 6,007,988; 미국 특허 번호 6,013,453; 미국 특허 번호 6,200,759; WO 95/19431; WO 96/06166; WO 98/53057; WO 98/54311; WO 00/27878; WO 01/60970; WO 01/88197 및 WO 02/099084]을 참조한다.
징크 핑거 및 TALE DNA-결합 도메인은, 예를 들어 자연 발생 징크 핑거 단백질의 인식 나선 영역의 조작(하나 이상의 아미노산을 변경)을 통해 또는 DNA 결합에 관여하는 아미노산(반복 가변 이중잔기 또는 RVD 영역)의 조작에 의해, 미리 결정된 뉴클레오타이드 서열에 결합하도록 조작될 수 있다. 따라서, 조작된 징크 핑거 단백질 또는 TALE 단백질은 비자연 발생 단백질이다. 징크 핑거 단백질 및 TALE를 조작하는 방법의 비제한적 예는 설계 및 선택이다. 설계된 단백질은 주로 합리적인 기준에서 설계/조성이 비롯되는 자연에서 발생하지 않는 단백질이다. 합리적 설계 기준에는 기존 ZFP 또는 TALE 설계(표준 및 비표준 RVD) 정보 및 결합 데이터를 저장하는 데이터베이스의 정보 처리를 위한 대체 규칙 및 컴퓨터 알고리즘의 적용이 포함된다. 예를 들어, 문헌[미국 특허 번호 9,458,205; 8,586,526; 6,140,081; 6,453,242; 및 6,534,261; 또한 WO 98/53058; WO 98/53059; WO 98/53060; WO 02/016536 및 WO 03/016496]을 참조한다.
게놈 DNA의 표적화된 절단을 위한 다양한 방법 및 조성물이 기술되어 왔다. 이러한 표적화된 절단 이벤트는 예를 들어 미리 결정된 염색체의 유전자 자리에서 표적화된 돌연변이 유발을 유도하고, 세포 DNA 서열의 표적화된 결실을 유도하고, 표적화된 재조합을 촉진하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 개시 내용 전체가 참조로 포함되는 문헌[미국 특허 번호 9,255,250; 9,200,266; 9,045,763; 9,005,973; 9,150,847; 8,956,828; 8,945,868; 8,703,489; 8,586,526; 6,534,261; 6,599,692; 6,503,717; 6,689,558; 7,067,317; 7,262,054; 7,888,121; 7,972,854; 7,914,796; 7,951,925; 8,110,379; 8,409,861; 미국 특허 공개 번호 20030232410; 20050208489; 20050026157; 20050064474; 20060063231; 20080159996; 201000218264; 20120017290; 20110265198; 20130137104; 20130122591; 20130177983; 20130196373; 20140120622; 20150056705; 20150335708; 20160030477 및 20160024474]을 참조한다.
a. CRISPR/Cas9
일부 구현예에서, 인간의 CD247과 같은, CD3제타(CD3ζ)를 암호화하는 내인성 유전자에서 표적화된 유전자 파괴(예를 들어, DNA 절단)는 클러스터링되고 규칙적으로 산재된 짧은 회문 반복체(CRISPR) 및 CRISPR-결합(Cas) 단백질을 사용하여 수행된다. 문헌[Sander and Joung (2014) Nature Biotechnology, 32(4): 347-355]을 참조한다.
일반적으로, “CRISPR 시스템”은 Cas 유전자를 암호화하는 서열, tracr(전이-활성화CRISPR) 서열(예를 들어, tracr RNA 또는 활성 부분 tracr RNA), tracr-메이트 서열(내인성 CRISPR 시스템의 맥락에서 “직접 반복” 및 tracr RNA-가공된 부분 직접 반복 포괄), 가이드 서열(내인성 CRISPR 시스템의 맥락에서 “스페이서”라고도 함), 및/또는 기타 서열을 포함하는, CRISPR-결합(“Cas”) 유전자 및 CRISPR 유전자 자리로부터의 전사물의 활성의 발현에 관여하는 또는 이를 지시하는 전사물 및 기타 요소를 집합적으로 지칭한다.
일부 측면에서, CRISPR/Cas 뉴클레아제 또는 CRISPR/Cas 시스템에는 DNA에 서열-특이적으로 결합하는 비코딩 가이드 RNA(gRNA) 및 뉴클레아제 기능을 갖는 Cas 단백질(예를 들어, Cas9)이 포함된다.
[0072] 유전자 파괴를 도입할 수 있는 하나 이상의 제제가 또한 제공된다. 유전자 파괴를 유도할 수 있는 하나 이상의 제제의 하나 이상의 성분을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드(예를 들어, 핵산 분자)가 또한 제공된다.
(i) 가이드 RNA(gRNA)
일부 구현예에서, 유전자 파괴를 유도할 수 있는 하나 이상의 제제는 CD247 유전자 자리에서 표적 부위와 상보적인 표적화 도메인을 갖는 가이드 RNA(gRNA) 또는 gRNA를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 중 적어도 하나를 포함한다.
일부 측면에서, “gRNA 분자”는 세포의 게놈 DNA 상의 유전자 자리와 같은 표적 핵산에 gRNA 분자/Cas9 분자 복합체의 특이적 표적화 또는 귀소를 촉진하는 핵산이다. gRNA 분자는 단분자(단일 RNA 분자를 가짐)이거나, 때때로 본원에서 “키메라” gRNA로 지칭되거나, 또는 모듈형(하나 초과, 일반적으로 2개의 개별 RNA 분자 포함)일 수 있다. 일반적으로, 가이드 서열(예를 들어, 가이드 RNA)은 표적 부위에서 표적 서열과 혼성화하고 표적 서열에 대한 CRISPR 복합체의 서열 특이적 결합을 지시하기에 CD247 유전자 자리에서와 같은 표적 폴리뉴클레오타이드 서열과 충분한 상보성을 갖는 서열 부분을 적어도 포함하는 임의의 폴리뉴클레오타이드 서열이다. 일부 구현예에서, CRISPR 복합체의 형성의 맥락에서, “표적 서열”은 가이드 서열이 상보성을 가지도록 설계되고, 여기서 표적 서열과 가이드 RNA의 도메인(예를 들어, 표적화 도메인) 사이의 혼성화가 CRISPR 복합체의 형성을 촉진하는, 서열에 대한 것이다. 혼성화를 유발하고 CRISPR 복합체의 형성을 촉진하기에 충분한 상보성이 있는 경우 완전한 상보성이 반드시 필요한 것은 아니다. 일반적으로, 가이드 서열은 가이드 서열 내 2차 구조의 정도를 감소시키도록 선택된다. 2차 구조는 임의의 적합한 폴리뉴클레오타이드 폴딩(folding) 알고리즘으로 결정될 수 있다.
일부 구현예에서, (예를 들어, 인간의 CD247 유전자 자리에서) 관심 표적 유전자 자리에 특이적인 가이드 RNA(gRNA)는 표적 부위 또는 표적 위치에 DNA 절단을 유도하기 위해 RNA-가이드 뉴클레아제(예를 들어, Cas)에 사용된다. gRNA 및 예시적인 표적화 도메인을 설계하는 방법에는 예를 들어 문헌[국제 PCT 공개 번호 WO2015/161276, WO2017/193107 및 WO2017/093969]에 기술된 것이 포함될 수 있다.
도메인이 표시된 몇 가지 예시적인 gRNA 구조는 WO2015/161276에 예를 들어 그 안의 도 1A-1G에 기술되어 있다. 이론에 얽매이고자 하는 것은 아니지만, gRNA의 활성 형태의 3차원 형태, 또는 가닥내 또는 가닥간 상호작용과 관련하여, 상보성이 높은 영역들은 WO2015/161276에 예를 들어 그 안의 도 1A-1G 및 본원에 제공된 다른 묘사에 때때로 이중체(duplex)로 도시된다.
일부 경우에, gRNA는 5’부터 3’까지: CD247 유전자 유래의 서열(서열 번호: 74에 제시된 코딩 서열)과 같은, 표적 핵산에 상보적인 표적화 도메인; 제1 상보성 도메인; 연결 도메인; 제2 상보성 도메인(제1 상보성 도메인에 상보적임); 근위 도메인; 및 선택적으로 꼬리 도메인을 포함하는 단분자 또는 키메라 gRNA이다.
다른 경우에, gRNA는 제1 및 제2 가닥을 포함하는 모둘형 gRNA이다. 이 경우에, 제1 가닥은 바람직하게는 5’부터 3’까지: (서열 번호: 74 또는 76에 제시된 코딩 서열인, CD247 유전자 유래 서열과 같은 표적 핵산에 상보적인) 표적화 도메인 및 제1 상보성 도메인을 포함한다. 제2 가닥은 일반적으로 5’부터 3’까지: 선택적으로 5’ 확장 도메인(extension domain); 제2 상보성 도메인; 근위 도메인; 및 선택적으로 꼬리 도메인을 포함한다.
(a) 표적화 도메인
표적화 도메인은 표적 핵산 상의 표적 서열에 대해 상보적인, 예를 들어, 적어도 80, 85, 90, 95, 98 또는 99% 상보적인, 예를 들어, 완전히 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 표적 서열을 포함하는 표적 핵산의 가닥은 본원에서 표적 핵산의 “상보적 가닥(complementary strand)”으로 지칭한다. 표적화 도메인의 선택에 대한 가이드는 예를 들어 문헌[Fu Y et al., Nat Biotechnol 2014 (doi: 10.1038/nbt.2808) 및 Sternberg SH et al., Nature 2014 (doi: 10.1038/nature13011)]에서 찾을 수 있다. 표적화 도메인의 배치의 예는 문헌[WO2015/161276, 예를 들어, 그 안의 도 1A-1G]에 기술된 것들을 포함한다.
표적화 도메인은 RNA 분자의 일부이므로 염기 우라실(U)을 포함하는 반면, gRNA 분자를 암호화하는 DNA는 염기 티민(T)을 포함한다. 이론에 얽매이고자 하는 것은 아니지만, 일부 구현예에서, 표적화 도메인의 표적 서열과의 상보성은 gRNA 분자/Cas9 분자 복합체의 표적 핵산과의 상호작용의 특이성에 기여하는 것으로 여겨진다. 표적화 도메인 및 표적 서열 쌍에서 표적화 도메인의 우라실 염기는 표적 서열의 아데닌 염기와 쌍을 이루는 것으로 이해된다. 일부 구현예에서, 표적화 도메인 자체는 5’에서 3’ 방향으로 선택적인 2차 도메인, 및 중심 도메인(core domain)을 포함한다. 일부 구현예에서, 중심 도메인은 표적 서열과 완전히 상보성이다. 일부 구현예에서, 표적화 도메인은 5 내지 50개의 뉴클레오타이드 길이이다. 표적화 도메인과 상보성인 표적 핵산의 가닥은 본원에서 상보적 가닥이라 지칭된다. 도메인의 뉴클레오타이드들 중 일부 또는 전부는, 예를 들어 분해에 덜 민감하게 만들고, 생체 적합성을 개선하는 등의 변형을 가질 수 있다. 비제한적인 예로서, 표적 도메인의 백본은 포스포로티오에이트, 또는 다른 변형(들)을 이용해 변형될 수 있다. 일부 경우에, 표적화 도메인의 뉴클레오타이드는 2’ 변형, 예를 들어 2-아세틸화, 예를 들어 2’ 메틸화 또는 다른 변형(들)을 포함할 수 있다.
다양한 구현예에서, 표적화 도메인은 16 내지 26개의 뉴클레오타이드 길이이다(즉, 16개의 뉴클레오타이드 길이, 17개의 뉴클레오타이드 길이, 또는 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 또는 26개의 뉴클레오타이드 길이이다).
(b) 예시적인 표적화 도메인
일부 구현예에서, gRNA 서열은은 설계되거나 확인된 CD247 유전자 자리와 같은 특정 유전자의 표적 부위를 표적화하는 표적화 도메인 서열이거나 이를 포함한다. CRISPR 게놈 편집을 위한 게놈 차원의 gRNA 데이터베이스는 공개적으로 이용 가능하며, 여기에는 인간 게놈 또는 마우스 게놈에 있는 유전자의 구성 엑손을 표적화하는 예시적인 단일 가이드 RNA(sgRNA) 서열이 포함되어 있다(예를 들어, genescript.com/gRNA-database.html; 또한 문헌[Sanjana et al. (2014) Nat. Methods, 11:783-4]을 참조한다). 일부 측면에서, gRNA 서열은 비-표적 부위 또는 위치에 대한 최소의 표적외 결합을 갖는 서열이거나 이를 포함한다.
일부 구현예에서, 표적 서열(표적 도메인)은 서열 번호: 74 또는 76에 제시된 CD247 코딩 서열의 임의의 부분과 같은 CD247 유전자 자리에 또는 그 근처에 있다. 일부 구현예에서, 표적화 도메인에 상보적인 표적 핵산은 CD247과 같은 관심 유전자의 초기 코딩 영역에 위치한다. 초기 코딩 영역의 표적화는 관심 유전자의 유전자 파괴(즉, 발현 제거)에 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 관심 유전자의 초기 코딩 영역은 시작 코돈(예를 들어, ATG) 바로 다음의 서열, 또는 시작 코돈의 500bp 이내(예를 들어, 500, 450, 400, 350, 300, 250, 200, 150, 100, 50bp, 40bp, 30bp, 20bp, 또는 10bp 미만) 서열을 포함한다. 구체적인 예에서, 표적 핵산은 시작 코돈의 200bp, 150bp, 100 bp, 50 bp, 40bp, 30bp, 20bp 또는 10bp 이내에 있다. 일부 예에서, gRNA의 표적화 도메인은 CD247 유전자 자리의 표적 핵산과 같은 표적 핵산 상의 표적 서열에 대해 상보적, 예를 들어, 적어도 80, 85, 90, 95, 98 또는 99% 상보적, 예를 들어, 완전히 상보적이다.
일부 구현예에서, gRNA는 예를 들어 키메라 수용체를 암호화하는, 전이 유전자 서열의 원하는 표적화된 통합 부위 근처의 CD247 유전자 자리에 있는 부위를 표적화할 수 있다. 일부 측면에서, gRNA는 통합을 위해 전이 유전자 서열 내에 함유된 CD3제타 사슬을 암호화하는 서열의 양에 기초하여 부위를 표적화할 수 있다. 일부 측면에서, gRNA는 내인성 CD247 유전자 자리의 개방형 해독틀의 엑손 내의 부위를 표적화할 수 있다. 일부 측면에서, gRNA는 내인성 CD247 유전자 자리의 개방형 해독틀의 인트론 내의 부위를 표적화할 수 있다. 일부 측면에서, gRNA는 내인성 CD247 유전자 자리의 조절 요소 또는 제어 요소, 예를 들어 프로모터 내의 부위를 표적화할 수 있다. 일부 측면에서, gRNA에 의해 표적화되는 CD247 유전자 자리의 표적 부위는 본원에 기술된, 예를 들어 섹션 I.A.1에 있는 임의의 표적 부위일 수 있다. 일부 구현예에서, gRNA는 초기 코딩 영역에 해당하는 엑손, 예를 들어, 내인성 CD247 유전자 자리의 개방형 해독틀의 엑손 1, 2, 또는 3 내에 또는 가까이 근접하여, 또는 전사 시작 부위 바로 다음의 서열을 포함하여 엑손 1, 2, 또는 3 내에 또는 엑손 1, 2, 또는 3의 500, 450, 400, 350, 300, 250, 200, 150, 100 또는 50bp 이내에 있는 부위를 표적화할 수 있다. 일부 구현예에서, gRNA는 내인성 CD247 유전자 자리의 엑손 2에 또는 그 근처에, 또는 엑손 2의 500, 450, 400, 350, 300, 250, 200, 150, 100 또는 50bp 이내에 있는 부위를 표적화할 수 있다.
인간의 CD247 유전자 자리에서 Cas9를 이용한 파괴를 위한 예시적인 표적 부위 서열에는 서열 번호: 59 내지 62 및 67 내지 72에 제시된 것이 포함될 수 있다. 일부 측면에서, NGG PAM을 포함하여 예시적인 표적 부위 서열에는 서열 번호: 63 내지 66에 제시된 것이 포함될 수 있다. 예시적인 gRNA는 서열 번호: 59 내지 62 및 67 내지 72 중 임의의 번호에 제시된 표적 부위 서열에 결합하거나 이를 표적화할 수 있는 리보핵산의 서열을 포함할 수 있다. 예시적인 gRNA 표적화 도메인 서열은 CACCUUCACUCUCAGGAACA(서열 번호:87); GAAUGACACCAUAGAUGAAG(서열 번호:88); UGAAGAGGAUUCCAUCCAGC(서열 번호:89); UCCAGCAGGUAGCAGAGUUU(서열 번호:90); AGACGCCCCCGCGUACCAGC(서열 번호:91); GCUGACUUACGUUAUAGAGC(서열 번호:92); UUUCACCGCGGCCAUCCUGC(서열 번호:93); UAAUCGGCAACUGUGCCUGC(서열 번호:94); CGGAGGCCUACAGUGAGAUU(서열 번호:95); 또는 UGGUACCCACCUUCACUCUC(서열 번호:96)를 포함할 수 있다. (CD3제타를 암호화하는) 내인성 CD247 유전자 자리의 유전자 파괴를 생성하는 예시적인 gRNA 서열은 예를 들어 문헌[국제 PCT 공개 번호 WO2017093969]에 기술되어 있다. (CD3제타를 암호화하는) 내인성 CD247 유전자 자리의 유전자 편집을 위한 예시적인 방법은 예를 들어 WO2017093969에 기술된 것을 포함한다. 임의의 알려진 방법이 내인성 CD247 유전자 자리의 유전자 파괴를 표적화하고 생성하는 데 사용될 수 있으며 본원에 제공된 구현예에서 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 표적화 도메인은 스트렙토코쿠스 피오게네스(S. pyogenes) Cas9를 사용하여 또는 나이세리아 메닝기티디스(N. meningitidis) Cas9를 사용하여 CD247 유전자에 유전자 파괴를 도입하기 위한 것을 포함한다.
일부 구현예에서, 표적화 도메인은 스트렙토코쿠스 피오게네스(S. pyogenes) Cas9를 사용하여 CD247 유전자에 유전자 파괴를 도입하기 위한 것을 포함한다. 임의의 표적화 도메인은 이중 가닥 절단(Cas9 뉴클레아제) 또는 단일 가닥 절단(Cas9 니카제)을 생성하는 스트렙토코쿠스 피오게네스 Cas9 분자와 함께 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 양 DNA 가닥에 상보적인 두 개의 표적화 도메인과 함께 스트렙토코쿠스 피오게네스 Cas9 니카제(nickase)를 사용하여 양 DNA 가닥 상에 두 개의 닉을 생성하는 데 이중 표적화가 사용되며, 예를 들어 임의의 마이너스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 gRNA는 플러스 가닥 표적화 도메인을 포함하는 임의의 gRNA와 쌍을 이룰 수 있다. 일부 구현예에서, 2개의 gRNA는 PAM들이 바깥쪽을 향하고 gRNA들의 5’ 말단 사이의 거리가 0-50bp가 되도록 DNA 상에 배향된다. 일부 구현예에서, 2개의 gRNA는, 예를 들어 표적화 도메인의 양 가닥 상의 2개의 단일 가닥 절단으로 표적 도메인을 절단하기 위해 2개의 상이한 gRNA 분자에 의해 가이드되는 한 쌍의 Cas9 분자/gRNA 분자 복합체를 사용하여, 2개의 Cas9 뉴클레아제 또는 2개의 Cas9 니카제를 표적화하는 데 사용된다. 일부 구현예에서, 2개의 Cas9 니카제는 HNH 활성을 갖는 분자, 예를 들어 RuvC 활성이 불활성화된 Cas9 분자, 예를 들어 D10에 돌연변이, 예를 들어 D10A 돌연변이를 갖는 Cas9 분자; RuvC 활성을 갖는 분자, 예를 들어 HNH 활성이 불활성화된 Cas9 분자, 예를 들어 H840에 돌연변이, 예를 들어 H840A를 갖는 Cas9 분자; 또는 RuvC 활성을 갖는 분자, 예를 들어 HNH 활성이 비활성화된 Cas9 분자, 예를 들어 N863에 돌연변이, 예를 들어 N863A를 갖는 Cas9 분자를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 2개의 gRNA 각각은 D10A Cas9 니카제와 복합된다.
(c) 제1 상보성 도메인
제1 상보성 도메인은 본원에 기술되는 제2 상보성 도메인과 상보적이며, 일반적으로 적어도 일부 생리학적 조건 하에서 이중체 영역을 형성하기에 제2 상보성 도메인에 대해 충분한 상보성을 갖는다. 제1 상보성 도메인은 통상적으로 5 내지 30개 뉴클레오타이드 길이이며, 5 내지 25개 뉴클레오타이드 길이, 7 내지 25개 뉴클레오타이드 길이, 7 내지 22개 뉴클레오타이드 길이, 7 내지 18개 뉴클레오타이드 길이, 또는 7 내지 15개 뉴클레오타이드 길이일 수 있다. 다양한 구현예에서, 제1 상보성 도메인은 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25개 뉴클레오타이드 길이이다. 제1 상보성 도메인의 예는 문헌[WO2015/161276, 예를 들어, 그 안의 도 1A-1G]에 기술된 것들을 포함한다.
통상적으로, 제1 상보성 도메인은 제2 상보성 도메인 표적과 정확한 상보성을 갖지 않는다. 일부 구현예에서, 제1 상보성 도메인은 제2 상보성 도메인의 대응하는 뉴클레오타이드와 상보적이지 않은 1, 2, 3, 4 또는 5개의 뉴클레오타이드를 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 제1 상보성 도메인의 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개(예를 들어, 3개) 뉴클레오타이드의 분절은 이중체에서 쌍을 이루지 않을 수 있고, 비-이중체 또는 루프-아웃 영역을 형성할 수 있다. 일부 경우에, 쌍을 이루지 않은 또는 루프-아웃 영역, 예를 들어 3개의 뉴클레오타이드의 루프-아웃이 제2 상보성 도메인 상에 존재한다. 이 쌍을 이루지 않은 영역은 선택적으로 제2 상보성 도메인의 5’ 말단으로부터 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개(예를 들어, 4개) 뉴클레오타이드에서 시작한다.
제1 상보성 도메인은 3개의 하위도메인을 포함할 수 있는데, 이들은 5’에서 3’ 방향으로 5’ 하위도메인, 중앙 하위도메인, 및 3’ 하위도메인이다. 일부 구현예에서, 5’ 하위도메인은 4 내지 9개, 예를 들어 4, 5, 6, 7, 8 또는 9개 뉴클레오타이드 길이이다. 일부 구현예에서, 중앙 하위도메인은 1, 2, 또는 3개, 예를 들어 1개 뉴클레오타이드 길이이다. 일부 구현예에서, 3’ 하위도메인은 3 내지 25개, 예를 들어, 4 내지 22개, 4 내지 18개, 또는 4 내지 10개, 또는 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25개 뉴클레오타이드 길이이다.
일부 구현예에서, 제1 및 제2 상보성 도메인은 이중체일 때 예를 들어 gRNA 서열(한 쌍의 가닥은 밑줄, 하나는 굵은 글씨): NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC(서열 번호: 97)에서 11개의 쌍을 이루는 뉴클레오타이드를 포함한다.
일부 구현예에서, 제1 및 제2 상보성 도메인은 이중체일 때 예를 들어 gRNA 서열(한 쌍의 가닥은 밑줄, 하나는 굵은 글씨): NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGAGCUAUGCUGAAAAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC(서열 번호: 98)에서 15개의 쌍을 이루는 뉴클레오타이드를 포함한다.
일부 구현예에서, 제1 및 제2 상보성 도메인은 이중체일 때 예를 들어 gRNA 서열(한 쌍의 가닥은 밑줄, 하나는 굵은 글씨): NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGAGCUAUGCUGGAAACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC(서열 번호: 99)에서 16개의 쌍을 이루는 뉴클레오타이드를 포함한다.
일부 구현예에서, 제1 및 제2 상보성 도메인은 이중체일 때 예를 들어 gRNA 서열(한 쌍의 가닥은 밑줄, 하나는 굵은 글씨): NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUGGAAACAAAACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC(서열 번호: 100)에서 21개의 쌍을 이루는 뉴클레오타이드를 포함한다.
일부 구현예에서, 뉴클레오타이드들은 예를 들어 gRNA 서열(교환된 뉴클레오타이드는 밑줄): NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGUAUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAUAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC (서열 번호: 101); NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUAAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUUAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC (서열 번호: 102); 및 NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGUAUUAGAGCUAUGCUGUAUUGGAAACAAUACAGCAUAGCAAGUUAAUAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC (서열 번호: 103)에서 폴리-U관을 제거하기 위해 교환된다.
제1 상보성 도메인은 자연 발생 제1 상보성 도메인과 상동성을 공유하거나 이로부터 유래될 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 제1 상보성 도메인, 예를 들어, 스트렙토코쿠스 피오게네스, 스타필로코쿠스 아우레우스(S. aureus), 나이세리아 메닝기티디스, 또는 스트렙토코쿠스 테르모필루스(S. thermophilus) 제1 상보성 도메인과 적어도 50% 상동성을 갖는다.
제1 상보성 도메인의 뉴클레오타이드의 하나 이상 또는 심지어 전부가 표적화 도메인에 대해 본원에서 논의된 라인들을 따라 변형을 가질 수 있음을 주목해야 한다.
(d) 연결 도메인
단분자 또는 키메라 gRNA에서, 연결 도메인은 단분자 gRNA의 제1 상보성 도메인과 제2 상보성 도메인을 연결하는 기능을 한다. 연결 도메인은 제1 및 제2 상보성 도메인을 공유적으로 또는 비공유적으로 연결할 수 있다. 일부 구현예에서, 연결은 공유적이다. 일부 구현예에서, 연결 도메인은 제1 및 제2 상보성 도메인을 공유적으로 결합시키며, 예를 들어, 문헌[WO2015/161276, 예를 들어 그 안의 도 1B-1E]을 참조한다. 일부 구현예에서, 연결 도메인은 제1 상보성 도메인과 제2 상보성 도메인 사이에 개재된 공유 결합이거나 이를 포함한다. 일반적으로 연결 도메인은 하나 이상의 예를 들어 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 뉴클레오타이드를 포함하지만, 다양한 구현예에서 링커는 20, 30, 40, 50개 또는 심지어 100개의 뉴클레오타이드 길이일 수 있다. 연결 도메인의 예는 문헌[WO2015/161276, 예를 들어, 그 안의 도 1A-1G]에 기술된 것들을 포함한다.
모듈형 gRNA 분자에서, 두 분자는 상보성 도메인의 혼성화에 의해 결합되고 연결 도메인은 존재하지 않을 수 있다. 예를 들어 문헌[WO2015/161276, 예를 들어, 그 안의 도 1A]를 참조한다.
다양한 연결 도메인이 단분자 gRNA 분자에 사용하기에 적합하다. 연결 도메인은 공유 결합으로 구성될 수 있거나, 1개 또는 몇 개의 뉴클레오타이드만큼 짧을 수 있으며, 예를 들어 1, 2, 3, 4 또는 5개의 뉴클레오타이드 길이일 수 있다. 일부 구현예에서, 연결 도메인은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 또는 25개 또는 그 이상의 뉴클레오타이드 길이이다. 일부 구현예에서, 연결 도메인은 2 내지 50개, 2 내지 40개, 2 내지 30개, 2 내지 20개, 2 내지 10개, 또는 2 내지 5개 뉴클레오타이드 길이이다. 일부 구현예에서, 연결 도메인은 자연 발생 서열, 예를 들어 제2 상보성 도메인에 대해 5’에 있는 tracrRNA의 서열과 상동성을 공유하거나 이로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 연결 도메인은 본원에 개시된 연결 도메인과 적어도 50%의 상동성을 가진다.
제1 상보성 도메인과 관련하여 본원에 논의된 바와 같이, 연결 도메인의 뉴클레오타이드의 일부 또는 전부는 변형을 포함할 수 있다.
(e) 5’ 확장 도메인
일부 경우에, 모듈형 gRNA는 본원에서 5’ 확장 도메인으로 지칭되는, 제2 상보성 도메인에 대한 5’인 추가 서열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 5’ 확장 도메인은 , 2-10, 2-9, 2-8, 2-7, 2-6, 2-5, 또는 2-4개 뉴클레오타이드 길이이다. 일부 구현예에서, 5’ 확장 도메인은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 또는 그 이상의 뉴클레오타이드 길이이다. 일부 구현예에서, 5’ 확장 도메인의 예는 문헌[WO2015/161276, 예를 들어, 그 안의 도 1A]에 기술된 것들을 포함한다.
(f) 제2 상보성 도메인
제2 상보성 도메인은 제1 상보성 도메인과 상보적이며, 일반적으로 적어도 일부 생리학적 조건 하에서 이중체 영역을 형성하기에 제2 상보성 도메인에 대해 충분한 상보성을 갖는다. 일부 경우에, 예를 들어, 문헌[WO2015/161276, 예를 들어, 그 안의 도 1A-1B]에 도시된 바와 같이, 제2 상보성 도메인은 제1 상보성 도메인, 예를 들어, 이중체 영역으로부터 루프 아웃되는 서열과 상보성을 결여하는 서열을 포함할 수 있다. 제2 상보성 도메인의 예는 문헌[WO2015/161276, 예를 들어, 그 안의 도 1A-1G]에 기술된 것들을 포함한다.
제2 상보성 도메인은 5 내지 27개 뉴클레오타이드 길이일 수 있고, 일부 경우에 제1 상보성 영역보다 더 길 수 있다. 일부 구현예에서, 제2 상보성 도메인은 7 내지 27개 뉴클레오타이드 길이, 7 내지 25개 뉴클레오타이드 길이, 7 내지 20개 뉴클레오타이드 길이, 또는 7 내지 17개 뉴클레오타이드 길이일 수 있다. 더 일반적으로, 상보성 도메인은 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 또는 26개 뉴클레오타이드 길이일 수 있다.
일부 구현예에서, 제2 상보성 도메인은 3개의 하위도메인을 포함할 수 있는데, 이들은 5’에서 3’ 방향으로 5’ 하위도메인, 중앙 하위도메인, 및 3’ 하위도메인이다. 일부 구현예에서, 5’ 하위도메인은 3 내지 25개, 예를 들어, 4 내지 22개, 4 내지 18개, 또는 4 내지 10개, 또는 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25개 뉴클레오타이드 길이이다. 일부 구현예에서, 중앙 하위도메인은 1, 2, 3, 4, 또는 5개, 예를 들어 3개 뉴클레오타이드 길이이다. 일부 구현예에서, 3’ 하위도메인은 4 내지 9개, 예를 들어 4, 5, 6, 7, 8 또는 9개 뉴클레오타이드 길이이다.
일부 구현예에서, 제1 상보성 도메인의 5’ 하위도메인 및 3’ 하위도메인은 제2 상보성 도메인읜 3’ 하위도메인 및 5’ 하위도메인과 각각 상보적이고, 예를 들어 완전히 상보적이다.
제2 상보성 도메인은 자연 발생 제2 상보성 도메인과 상동성을 공유하거나 이로부터 유래될 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 제2 상보성 도메인, 예를 들어, 스트렙토코쿠스 피오게네스, 스타필로코쿠스 아우레우스(S. aureus), 나이세리아 메닝기티디스, 또는 스트렙토코쿠스 테르모필루스(S. thermophilus) 제1 상보성 도메인과 적어도 50% 상동성을 갖는다.
제2 상보성 도메인의 뉴클레오타이드의 일부 또는 전부는 변형, 예를 들어 본원에 기술된 변형을 가질 수 있다.
(g) 근위 도메인
근위 도메인의 예는 문헌[WO2015/161276, 예를 들어, 그 안의 도 1A-1G]에 기술된 것들을 포함한다. 일부 구현예에서, 근위 도메인은 5 내지 20개의 뉴클레오타이드 길이이다. 일부 구현예에서, 근위 도메인은 자연 발생 근위 도메인과 상동성을 공유하거나 이로부터 유래될 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 근위 도메인, 예를 들어, 스트렙토코쿠스 피오게네스, 스타필로코쿠스 아우레우스(S. aureus), 나이세리아 메닝기티디스, 또는 스트렙토코쿠스 테르모필루스(S. thermophilus) 근위 도메인과 적어도 50% 상동성을 갖는다.
근위 도메인의 뉴클레오타이드의 일부 또는 전부는 본원에 기술된 라인들을 따라 변형을 가질 수 있다.
(h) 꼬리 도메인
문헌[WO2015/161276, 예를 들어, 그 안의 도 1A 및 도 1B-1F]의 꼬리 도메인의 검사에 의해 알 수 있는 바와 같이, 다양한 범위의 꼬리 도메인이 gRNA 분자에 사용하기에 적합하다. 다양한 구현예에서, 꼬리 도메인은 0(없음), 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 뉴클레오타이드 길이이다. 특정 구현예에서, 꼬리 도메인 뉴클레오타이드는 자연 발생 꼬리 도메인의 5’ 말단의 서열로부터 유래되거나 이와 상동성을 공유하며, 예를 들어, 문헌[WO2015/161276, 예를 들어, 그 안의 도 1D 또는 1E]을 참조한다. 꼬리 도메인은 또한 선택적으로 서로 상보적인 서열들을 포함하고, 이는 적어도 일부 생리학적 조건 하에서 이중체 영역을 형성한다. 꼬리 도메인의 예는 문헌[WO2015/161276, 예를 들어, 그 안의 도 1A-1G]에 기술된 것들을 포함한다.
꼬리 도메인은 자연 발생 근위 꼬리 도메인과 상동성을 공유하거나 이로부터 유래될 수 있다. 비제한적인 예로서, 본 개시 내용의 다양한 구현예들에 따른 주어진 꼬리 도메인은 본원에 개시된 자연 발생 꼬리 도메인, 예를 들어, 스트렙토코쿠스 피오게네스, 스타필로코쿠스 아우레우스(S. aureus), 나이세리아 메닝기티디스, 또는 스트렙토코쿠스 테르모필루스(S. thermophilus) 꼬리 도메인과 적어도 50% 상동성을 공유할 수 있다.
특정 경우에, 꼬리 도메인은 3’ 말단에 시험관 내 또는 생체 내 전사 방법과 관련된 뉴클레오타이드들을 포함한다. gRNA의 시험관 내 전사에 T7 프로모터가 사용되는 경우, 이 뉴클레오타이드들은 DNA 주형의 3’ 말단 전에 존재하는 임의의 뉴클레오타이드일 수 있다. 생체 내 전사에 U6 프로모터가 사용되는 경우, 이 뉴클레오타이드들은 서열 UUUUUU일 수 있다. 대체 pol-III 프로모터가 사용되는 경우, 이 뉴클레오타이드들은 다양한 수 또는 우라실 염기일 수 있거나 대체 염기를 포함할 수 있다.
비제한적인 예로서, 다양한 구현예에서, 근위 및 꼬리 도메인은 취합했을 때 다음 서열을 포함한다: AAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCU (서열 번호: 104), AAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGGUGC (서열 번호: 105), AAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCGGAUC (서열 번호: 106), AAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUG (서열 번호: 107), AAGGCUAGUCCGUUAUCA (SEQ ID NO:108), 또는 AAGGCUAGUCCG (서열 번호: 109).
일부 구현예에서, 꼬리 도메인은 예를 들어, U6 프로모터가 전사에 사용되면, 3’ 서열 UUUUUU를 포함한다. 일부 구현예에서, 꼬리 도메인은 예를 들어, H1 프로모터가 전사에 사용되면, 3’ 서열 UUUU를 포함한다. 일부 구현예에서, 꼬리 도메인은 예를 들어, 사용된 pol-III 프로모터의 종결 신호에 따라서, 가변적인 수의 3’ U들을 포함한다. 일부 구현예에서, 꼬리 도메인은 T7 프로모터가 사용되면 DNA 주형으로부터 유래된 가변적인 3’ 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 꼬리 도메인은 예를 들어, RNA 분자를 생성하는 데 시험관 내 전사가 사용되면, DNA 주형으로부터 유래된 가변적인 3’ 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 꼬리 도메인은 예를 들어, 전사를 유도하는 데 pol-II 프로모터가 사용되면, DNA 주형으로부터 유래된 가변적인 3’ 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, gRNA는 다음 구조: 5’ [표적화 도메인]-[제1 상보성 도메인]-[연결 도메인]-[제2 상보성 도메인]-[근위 도메인]-[꼬리 도메인]-3’을 가지며, 여기서, 표적화 도메인은 중심 도메인 및 선택적으로 2차 도메인을 포함하고, 10 내지 50개 뉴클레오타이드 길이이고; 제1 상동성 도메인은 5 내지 25개 뉴클레오타이드 길이이고, 일부 구현예에서 본원에 개시된 기준 제1 상보성 도메인과 적어도 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 98 또는 99% 상동성을 가지고; 연결 도메인은 1 내지 5개 뉴클레오타이드 길이이고; 근위 도메인은 5 내지 20개 뉴클레오타이드 길이이고, 일부 구현예에서 본원에 개시된 기준 근위 도메인과 적어도 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 98 또는 99% 상동성을 가지고; 그리고 꼬리 도메인은 없거나 뉴클레오타이드 서열이 1 내지 50개 뉴클레오타이드 길이이고, 일부 구현예에서 본원에 개시된 기준 꼬리 도메인과 적어도 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 98 또는 99% 상동성을 갖는다.
(i) 예시적인 키메라 gRNA
일부 구현예에서, 단분자 또는 키메라 gRNA는 바람직하게는 5’부터 3’까지: 예를 들어 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 또는 26개 뉴클레오타이드를 포함하는 표적화 도메인(이는 표적 핵산과 상보적임); 제1 상보성 도메인; 연결 도메인; 제2 상보성 도메인(이는 제1 상보성 도메인과 상보적임); 근위 도메인; 및 꼬리 도메인을 포함하고, 여기서, (a) 근위 및 꼬리 도메인은, 취합했을 때, 적어도 15, 18, 20, 25, 30, 31, 35, 40, 45, 49, 50, 또는 53개 뉴클레오타이드를 포함하거나; (b) 제2 상보성 도메인의 마지막 뉴클레오타이드에 대해 3’에 적어도 15, 18, 20, 25, 30, 31, 35, 40, 45, 49, 50, 또는 53개의 뉴클레오타이드가 있거나; 또는 (c) 제1 상보성 도메인의 상응하는 뉴클레오타이드에 상보적인 제2 상보성 도메인의 마지막 뉴클레오타이드에 대해 3’에 적어도 16, 19, 21, 26, 31, 32, 36, 41, 46, 50, 51, 또는 54개의 뉴클레오타이드가 있다.
일부 구현예에서, (a), (b) 또는 (c)의 서열은 자연 발생 gRNA의 상응하는 서열과 또는 본원에 기술된 gRNA와 적어도 60, 75, 80, 85, 90, 95, 또는 99% 상동성을 갖는다. 일부 구현예에서, 근위 및 꼬리 도메인은, 취합했을 때, 적어도 15, 18, 20, 25, 30, 31, 35, 40, 45, 49, 50, 또는 53개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 상보성 도메인의 마지막 뉴클레오타이드에 대해 3’에 적어도 15, 18, 20, 25, 30, 31, 35, 40, 45, 49, 50, 또는 53개의 뉴클레오타이드가 있다. 일부 구현예에서, 제1 상보성 도메인의 상응하는 뉴클레오타이드에 상보적인 제2 상보성 도메인의 마지막 뉴클레오타이드에 대해 3’에 적어도 16, 19, 21, 26, 31, 32, 36, 41, 46, 50, 51, 또는 54개의 뉴클레오타이드가 있다. 일부 구현예에서, 표적화 도메인은 표적화 도메인과 상보성을 갖는 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 또는 26개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 또는 26개의 연속적인 뉴클레오타이드)를 포함하거나, 갖거나 또는 이들로 구성되며, 예를 들어, 표적화 도메인은 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 또는 26개 뉴클레오타이드 길이이다.
일부 구현예에서, (표적화 도메인, 제1 상보성 도메인, 연결 도메인, 제2 상보성 도메인, 근위 도메인 및 선택적으로 꼬리 도메인을 포함하는) 단분자 또는 키메라 gRNA 분자는 다음 서열: NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU (서열 번호: 110)을 포함하는데, 여기서 표적화 도메인은 20개 N으로 표시되지만 임의의 서열일 수 있고 16 내지 26개 뉴클레오타이드 길이 범위일 수 있으며, gRNA 서열 뒤에 U6 프로모터의 종결 신호로 기능하는 6개 U가 뒤따르지만, 그 수가 없거나 더 적을 수 있다. 일부 구현예에서, 단분자 또는 키메라 gRNA 분자는 스트렙토코쿠스 피오게네스(S. pyogenes) gRNA 분자이다.
일부 구현예에서, (표적화 도메인, 제1 상보성 도메인, 연결 도메인, 제2 상보성 도메인, 근위 도메인 및 선택적으로 꼬리 도메인을 포함하는) 단분자 또는 키메라 gRNA 분자는 다음 서열: NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGUACUCUGGAAACAGAAUCUACUAAAACAAGGCAAAAUGCCGUGUUUAUCUCGUCAACUUGUUGGCGAGAUUUUUU(서열 번호: 111)을 포함하는데, 여기서 표적화 도메인은 20개 N으로 표시되지만 임의의 서열일 수 있고 16 내지 26개 뉴클레오타이드 길이 범위일 수 있으며, gRNA 서열 뒤에 U6 프로모터의 종결 신호로 기능하는 6개 U가 뒤따르지만, 그 수가 없거나 더 적을 수 있다. 일부 구현예에서, 단분자 또는 키메라 gRNA 분자는 스타필로코쿠스 아우레우스(S. aureus) gRNA 분자이다. 예시적인 키메라 gRNA의 서열 및 구조는 또한 문헌[WO2015/161276, 예를 들어, 그 안의 도 10A-10B]에 도시되어 있다.
본원에 기술된 바와 같은 임의의 gRNA 분자는 표적 핵산의 서열, 예를 들어, 표적 위치 또는 표적 유전자 시그니처를 변경하기 위해 이중가닥 절단 또는 단일가닥 절단을 생성하는 임의의 Cas9 분자와 함께 사용될 수 있다. 일부 예에서, 표적 핵산은 설명된 바와 같은 것과 같은 CD247 유전자 자리에 또는 그 근처에 있다. 일부 구현예에서, gRNA 분자와 같은 리보핵산 분자와, Cas9 단백질과 같은 단백질 또는 이의 변이체는 본원에 제공되는 임의의 조작된 세포에 도입된다. 본 방법들에 유용한 gRNA 분자가 아래 기술된다.
일부 구현예에서, gRNA, 예를 들어, 키메라 gRNA는 다음 특성들 중 하나 이상을 포함하도록 구성된다: a) 예를 들어 이중가닥 절단을 만드는 Cas9 분자를 표적화할 때, (i) 표적 위치의 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 또는 500개 뉴클레오타이드 내에, 또는 (ii) 표적 위치가 말단 절제 영역 내에 있도록 충분히 가깝게, 이중가닥 절단을 위치시킬 수 있고; b) 적어도 16개 뉴클레오타이드의 표적화 도메인, 예를 들어, (i) 16, (ii) 17, (iii) 18, (iv) 19, (v) 20, (vi) 21, (vii) 22, (viii) 23, (ix) 24, (x) 25, 또는 (xi) 26개 뉴클레오타이드의 표적화 도메인을 가지고; 그리고 c) (i) 근위 및 꼬리 도메인은, 취합했을 때, 적어도 15, 18, 20, 25, 30, 31, 35, 40, 45, 49, 50, 또는 53개의 뉴클레오타이드, 예를 들어, 자연 발생 스트렙토코쿠스 피오게네스(S. pyogenes), 스트렙토코쿠스 테르모필루스(S. thermophilus), 스타필로코쿠스 아우레우스(S. aureus), 또는 나이세리아 메닝기티디스(N. meningitidis) 꼬리 및 근위 도메인으로부터 유래된 적어도 15, 18, 20, 25, 30, 31, 35, 40, 45, 49, 50, 또는 53개의 뉴클레오타이드, 또는 이와 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 이내 뉴클레오타이드 만큼 상이한 서열을 포함하거나; (ii) 제2 상보성 도메인의 마지막 뉴클레오타이드에 대해 3’에 적어도 15, 18, 20, 25, 30, 31, 35, 40, 45, 49, 50, 또는 53개의 뉴클레오타이드, 예를 들어 자연 발생 스트렙토코쿠스 피오게네스(S. pyogenes), 스트렙토코쿠스 테르모필루스(S. thermophilus), 스타필로코쿠스 아우레우스(S. aureus), 또는 나이세리아 메닝기티디스(N. meningitidis) gRNA로부터 유래된 적어도 15, 18, 20, 25, 30, 31, 35, 40, 45, 49, 50, 또는 53개의 뉴클레오타이드, 또는 이와 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 이내 뉴클레오타이드 만큼 상이한 서열이 있거나; (iii) 제1 상보성 도메인의 상응하는 뉴클레오타이드에 상보적인 제2 상보성 도메인의 마지막 뉴클레오타이드에 대해 3’에 적어도 16, 19, 21, 26, 31, 32, 36, 41, 46, 50, 51, 또는 54개의 뉴클레오타이드, 예를 들어 자연 발생 스트렙토코쿠스 피오게네스(S. pyogenes), 스트렙토코쿠스 테르모필루스(S. thermophilus), 스타필로코쿠스 아우레우스(S. aureus), 또는 나이세리아 메닝기티디스(N. meningitidis) gRNA로부터 유래된 적어도 16, 19, 21, 26, 31, 32, 36, 41, 46, 50, 51, 또는 54개의 뉴클레오타이드, 또는 이와 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 이내 뉴클레오타이드 만큼 상이한 서열이 있거나; (iv) 꼬리 도메인은 적어도 10, 15, 20, 25, 30, 35 또는 40개의 뉴클레오타이드 길이이고, 예를 들어, 자연 발생 스트렙토코쿠스 피오게네스(S. pyogenes), 스트렙토코쿠스 테르모필루스(S. thermophilus), 스타필로코쿠스 아우레우스(S. aureus), 또는 나이세리아 메닝기티디스(N. meningitidis) 꼬리 도메인으로부터 유래된 적어도 10, 15, 20, 25, 30, 35 또는 40개의 뉴클레오타이드, 또는 이와 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 이내 뉴클레오타이드 만큼 상이한 서열을 포함하거나; 또는 (v) 꼬리 도메인은 15, 20, 25, 30, 35 또는 40개의 뉴클레오타이드 또는 자연 발생 꼬리 도메인, 예를 들어 스트렙토코쿠스 피오게네스(S. pyogenes), 스트렙토코쿠스 테르모필루스(S. thermophilus), 스타필로코쿠스 아우레우스(S. aureus), 또는 나이세리아 메닝기티디스(N. meningitidis) 꼬리 도메인의 상응하는 부분 전부를 포함한다.
일부 구현예에서, gRNA는 a 및 b(i) 특성을 포함하도록 구성된다. 일부 구현예에서, gRNA는 a 및 b(ii) 특성을 포함하도록 구성된다. 일부 구현예에서, gRNA는 a 및 b(iii) 특성을 포함하도록 구성된다. 일부 구현예에서, gRNA는 a 및 b(iv) 특성을 포함하도록 구성된다. 일부 구현예에서, gRNA는 a 및 b(v) 특성을 포함하도록 구성된다. 일부 구현예에서, gRNA는 a 및 b(vi) 특성을 포함하도록 구성된다. 일부 구현예에서, gRNA는 a 및 b(vii) 특성을 포함하도록 구성된다. 일부 구현예에서, gRNA는 a 및 b(viii) 특성을 포함하도록 구성된다. 일부 구현예에서, gRNA는 a 및 b(ix) 특성을 포함하도록 구성된다. 일부 구현예에서, gRNA는 a 및 b(x) 특성을 포함하도록 구성된다. 일부 구현예에서, gRNA는 a 및 b(xi) 특성을 포함하도록 구성된다. 일부 구현예에서, gRNA는 a 및 c 특성을 포함하도록 구성된다. 일부 구현예에서, gRNA는 a, b 및 c 특성을 포함하도록 구성된다. 일부 구현예에서, gRNA는 a(i), b(i) 및 c(i) 특성을 포함하도록 구성된다. 일부 구현예에서, gRNA는 a(i), b(i) 및 c(ii) 특성을 포함하도록 구성된다. 일부 구현예에서, gRNA는 a(i), b(ii) 및 c(i) 특성을 포함하도록 구성된다. 일부 구현예에서, gRNA는 a(i), b(ii) 및 c(ii) 특성을 포함하도록 구성된다. 일부 구현예에서, gRNA는 a(i), b(iii) 및 c(i) 특성을 포함하도록 구성된다. 일부 구현예에서, gRNA는 a(i), b(iii) 및 c(ii) 특성을 포함하도록 구성된다. 일부 구현예에서, gRNA는 a(i), b(iv) 및 c(i) 특성을 포함하도록 구성된다. 일부 구현예에서, gRNA는 a(i), b(iv) 및 c(ii) 특성을 포함하도록 구성된다. 일부 구현예에서, gRNA는 a(i), b(v) 및 c(i) 특성을 포함하도록 구성된다. 일부 구현예에서, gRNA는 a(i), b(v) 및 c(ii) 특성을 포함하도록 구성된다. 일부 구현예에서, gRNA는 a(i), b(vi) 및 c(i) 특성을 포함하도록 구성된다. 일부 구현예에서, gRNA는 a(i), b(vi) 및 c(ii) 특성을 포함하도록 구성된다. 일부 구현예에서, gRNA는 a(i), b(vii) 및 c(i) 특성을 포함하도록 구성된다. 일부 구현예에서, gRNA는 a(i), b(vii) 및 c(ii) 특성을 포함하도록 구성된다. 일부 구현예에서, gRNA는 a(i), b(viii) 및 c(i) 특성을 포함하도록 구성된다. 일부 구현예에서, gRNA는 a(i), b(viii) 및 c(ii) 특성을 포함하도록 구성된다. 일부 구현예에서, gRNA는 a(i), b(ix) 및 c(i) 특성을 포함하도록 구성된다. 일부 구현예에서, gRNA는 a(i), b(ix) 및 c(ii) 특성을 포함하도록 구성된다. 일부 구현예에서, gRNA는 a(i), b(x) 및 c(i) 특성을 포함하도록 구성된다. 일부 구현예에서, gRNA는 a(i), b(x) 및 c(ii) 특성을 포함하도록 구성된다. 일부 구현예에서, gRNA는 a(i), b(xi) 및 c(i) 특성을 포함하도록 구성된다. 일부 구현예에서, gRNA는 a(i), b(xi) 및 c(ii) 특성을 포함하도록 구성된다.
일부 구현예에서, gRNA, 예를 들어, 키메라 gRNA는 다음 특성들 중 하나 이상을 포함하도록 구성된다: a) gRNA들 중 하나 또는 둘 모두는 예를 들어 단일가닥 절단을 만드는 Cas9 분자를 표적화할 때, (i) 표적 위치의 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 또는 500개 뉴클레오타이드 내에, 또는 (ii) 표적 위치가 말단 절제 영역 내에 있도록 충분히 가깝게, 단일가닥 절단을 위치시킬 수 있고; b) 하나 또는 둘 모두는 적어도 16개 뉴클레오타이드의 표적화 도메인, 예를 들어, (i) 16, (ii) 17, (iii) 18, (iv) 19, (v) 20, (vi) 21, (vii) 22, (viii) 23, (ix) 24, (x) 25, 또는 (xi) 26개 뉴클레오타이드의 표적화 도메인을 가지고; 그리고 c) (i) 근위 및 꼬리 도메인은, 취합했을 때, 적어도 15, 18, 20, 25, 30, 31, 35, 40, 45, 49, 50, 또는 53개의 뉴클레오타이드, 예를 들어, 자연 발생 스트렙토코쿠스 피오게네스(S. pyogenes), 스트렙토코쿠스 테르모필루스(S. thermophilus), 스타필로코쿠스 아우레우스(S. aureus), 또는 나이세리아 메닝기티디스(N. meningitidis) 꼬리 및 근위 도메인으로부터 유래된 적어도 15, 18, 20, 25, 30, 31, 35, 40, 45, 49, 50, 또는 53개의 뉴클레오타이드, 또는 이와 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 이내 뉴클레오타이드 만큼 상이한 서열을 포함하거나; (ii) 제2 상보성 도메인의 마지막 뉴클레오타이드에 대해 3’에 적어도 15, 18, 20, 25, 30, 31, 35, 40, 45, 49, 50, 또는 53개의 뉴클레오타이드, 예를 들어 자연 발생 스트렙토코쿠스 피오게네스(S. pyogenes), 스트렙토코쿠스 테르모필루스(S. thermophilus), 스타필로코쿠스 아우레우스(S. aureus), 또는 나이세리아 메닝기티디스(N. meningitidis) gRNA로부터 유래된 적어도 15, 18, 20, 25, 30, 31, 35, 40, 45, 49, 50, 또는 53개의 뉴클레오타이드, 또는 이와 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 이내 뉴클레오타이드 만큼 상이한 서열이 있거나; (iii) 제1 상보성 도메인의 상응하는 뉴클레오타이드에 상보적인 제2 상보성 도메인의 마지막 뉴클레오타이드에 대해 3’에 적어도 16, 19, 21, 26, 31, 32, 36, 41, 46, 50, 51, 또는 54개의 뉴클레오타이드, 예를 들어 자연 발생 스트렙토코쿠스 피오게네스(S. pyogenes), 스트렙토코쿠스 테르모필루스(S. thermophilus), 스타필로코쿠스 아우레우스(S. aureus), 또는 나이세리아 메닝기티디스(N. meningitidis) gRNA로부터 유래된 적어도 16, 19, 21, 26, 31, 32, 36, 41, 46, 50, 51, 또는 54개의 뉴클레오타이드, 또는 이와 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 이내 뉴클레오타이드 만큼 상이한 서열이 있거나; (iv) 꼬리 도메인은 적어도 10, 15, 20, 25, 30, 35 또는 40개의 뉴클레오타이드 길이이고, 예를 들어, 자연 발생 스트렙토코쿠스 피오게네스(S. pyogenes), 스트렙토코쿠스 테르모필루스(S. thermophilus), 스타필로코쿠스 아우레우스(S. aureus), 또는 나이세리아 메닝기티디스(N. meningitidis) 꼬리 도메인으로부터 유래된 적어도 10, 15, 20, 25, 30, 35 또는 40개의 뉴클레오타이드, 또는 이와 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 이내 뉴클레오타이드 만큼 상이한 서열을 포함하거나; 또는 (v) 꼬리 도메인은 15, 20, 25, 30, 35 또는 40개의 뉴클레오타이드 또는 자연 발생 꼬리 도메인, 예를 들어 스트렙토코쿠스 피오게네스(S. pyogenes), 스트렙토코쿠스 테르모필루스(S. thermophilus), 스타필로코쿠스 아우레우스(S. aureus), 또는 나이세리아 메닝기티디스(N. meningitidis) 꼬리 도메인의 상응하는 부분 전부를 포함한다.
일부 구현예에서, gRNA는 a 및 b(i) 특성을 포함하도록 구성된다. 일부 구현예에서, gRNA는 a 및 b(ii) 특성을 포함하도록 구성된다. 일부 구현예에서, gRNA는 a 및 b(iii) 특성을 포함하도록 구성된다. 일부 구현예에서, gRNA는 a 및 b(iv) 특성을 포함하도록 구성된다. 일부 구현예에서, gRNA는 a 및 b(v) 특성을 포함하도록 구성된다. 일부 구현예에서, gRNA는 a 및 b(vi) 특성을 포함하도록 구성된다. 일부 구현예에서, gRNA는 a 및 b(vii) 특성을 포함하도록 구성된다. 일부 구현예에서, gRNA는 a 및 b(viii) 특성을 포함하도록 구성된다. 일부 구현예에서, gRNA는 a 및 b(ix) 특성을 포함하도록 구성된다. 일부 구현예에서, gRNA는 a 및 b(x) 특성을 포함하도록 구성된다. 일부 구현예에서, gRNA는 a 및 b(xi) 특성을 포함하도록 구성된다. 일부 구현예에서, gRNA는 a 및 c 특성을 포함하도록 구성된다. 일부 구현예에서, gRNA는 a, b 및 c 특성을 포함하도록 구성된다. 일부 구현예에서, gRNA는 a(i), b(i) 및 c(i) 특성을 포함하도록 구성된다. 일부 구현예에서, gRNA는 a(i), b(i) 및 c(ii) 특성을 포함하도록 구성된다. 일부 구현예에서, gRNA는 a(i), b(ii) 및 c(i) 특성을 포함하도록 구성된다. 일부 구현예에서, gRNA는 a(i), b(ii) 및 c(ii) 특성을 포함하도록 구성된다. 일부 구현예에서, gRNA는 a(i), b(iii) 및 c(i) 특성을 포함하도록 구성된다. 일부 구현예에서, gRNA는 a(i), b(iii) 및 c(ii) 특성을 포함하도록 구성된다. 일부 구현예에서, gRNA는 a(i), b(iv) 및 c(i) 특성을 포함하도록 구성된다. 일부 구현예에서, gRNA는 a(i), b(iv) 및 c(ii) 특성을 포함하도록 구성된다. 일부 구현예에서, gRNA는 a(i), b(v) 및 c(i) 특성을 포함하도록 구성된다. 일부 구현예에서, gRNA는 a(i), b(v) 및 c(ii) 특성을 포함하도록 구성된다. 일부 구현예에서, gRNA는 a(i), b(vi) 및 c(i) 특성을 포함하도록 구성된다. 일부 구현예에서, gRNA는 a(i), b(vi) 및 c(ii) 특성을 포함하도록 구성된다. 일부 구현예에서, gRNA는 a(i), b(vii) 및 c(i) 특성을 포함하도록 구성된다. 일부 구현예에서, gRNA는 a(i), b(vii) 및 c(ii) 특성을 포함하도록 구성된다. 일부 구현예에서, gRNA는 a(i), b(viii) 및 c(i) 특성을 포함하도록 구성된다. 일부 구현예에서, gRNA는 a(i), b(viii) 및 c(ii) 특성을 포함하도록 구성된다. 일부 구현예에서, gRNA는 a(i), b(ix) 및 c(i) 특성을 포함하도록 구성된다. 일부 구현예에서, gRNA는 a(i), b(ix) 및 c(ii) 특성을 포함하도록 구성된다. 일부 구현예에서, gRNA는 a(i), b(x) 및 c(i) 특성을 포함하도록 구성된다. 일부 구현예에서, gRNA는 a(i), b(x) 및 c(ii) 특성을 포함하도록 구성된다. 일부 구현예에서, gRNA는 a(i), b(xi) 및 c(i) 특성을 포함하도록 구성된다. 일부 구현예에서, gRNA는 a(i), b(xi) 및 c(ii) 특성을 포함하도록 구성된다.
일부 구현예에서, gRNA는 HNH 활성을 갖는 Cas9 니카제 분자, 예를 들어 RuvC 활성이 비활성화된 Cas9 분자, 예를 들어 D10에 돌연변이(예를 들어, D10A 돌연변이)를 갖는 Cas9 분자와 함께 사용된다.
일부 구현예에서, gRNA는 RuvC 활성을 갖는 Cas9 니카제 분자, 예를 들어 HNH 활성이 비활성화된 Cas9 분자, 예를 들어 H840에 돌연변이(예를 들어, H840A 돌연변이)를 갖는 Cas9 분자와 함께 사용된다.
일부 구현예에서, 제1 및 제2 gRNA를 포함하는 gRNA 쌍, 예를 들어, 키메라 gRNA 쌍은 다음 특성들 중 하나 이상을 포함하도록 구성된다: a) gRNA들 중 하나 또는 둘 모두는 예를 들어 단일가닥 절단을 만드는 Cas9 분자를 표적화할 때, (i) 표적 위치의 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 또는 500개 뉴클레오타이드 내에, 또는 (ii) 표적 위치가 말단 절제 영역 내에 있도록 충분히 가깝게, 단일가닥 절단을 위치시킬 수 있고; b) 하나 또는 둘 모두는 적어도 16개 뉴클레오타이드의 표적화 도메인, 예를 들어, (i) 16, (ii) 17, (iii) 18, (iv) 19, (v) 20, (vi) 21, (vii) 22, (viii) 23, (ix) 24, (x) 25, 또는 (xi) 26개 뉴클레오타이드의 표적화 도메인을 가지고; c) 하나 또는 둘 모두에 대해서: (i) 근위 및 꼬리 도메인은, 취합했을 때, 적어도 15, 18, 20, 25, 30, 31, 35, 40, 45, 49, 50, 또는 53개의 뉴클레오타이드, 예를 들어, 자연 발생 스트렙토코쿠스 피오게네스(S. pyogenes), 스트렙토코쿠스 테르모필루스(S. thermophilus), 스타필로코쿠스 아우레우스(S. aureus), 또는 나이세리아 메닝기티디스(N. meningitidis) 꼬리 및 근위 도메인으로부터 유래된 적어도 15, 18, 20, 25, 30, 31, 35, 40, 45, 49, 50, 또는 53개의 뉴클레오타이드, 또는 이와 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 이내 뉴클레오타이드 만큼 상이한 서열을 포함하거나; (ii) 제2 상보성 도메인의 마지막 뉴클레오타이드에 대해 3’에 적어도 15, 18, 20, 25, 30, 31, 35, 40, 45, 49, 50, 또는 53개의 뉴클레오타이드, 예를 들어 자연 발생 스트렙토코쿠스 피오게네스(S. pyogenes), 스트렙토코쿠스 테르모필루스(S. thermophilus), 스타필로코쿠스 아우레우스(S. aureus), 또는 나이세리아 메닝기티디스(N. meningitidis) gRNA로부터 유래된 적어도 15, 18, 20, 25, 30, 31, 35, 40, 45, 49, 50, 또는 53개의 뉴클레오타이드, 또는 이와 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 이내 뉴클레오타이드 만큼 상이한 서열이 있거나; (iii) 제1 상보성 도메인의 상응하는 뉴클레오타이드에 상보적인 제2 상보성 도메인의 마지막 뉴클레오타이드에 대해 3’에 적어도 16, 19, 21, 26, 31, 32, 36, 41, 46, 50, 51, 또는 54개의 뉴클레오타이드, 예를 들어 자연 발생 스트렙토코쿠스 피오게네스(S. pyogenes), 스트렙토코쿠스 테르모필루스(S. thermophilus), 스타필로코쿠스 아우레우스(S. aureus), 또는 나이세리아 메닝기티디스(N. meningitidis) gRNA로부터 유래된 적어도 16, 19, 21, 26, 31, 32, 36, 41, 46, 50, 51, 또는 54개의 뉴클레오타이드, 또는 이와 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 이내 뉴클레오타이드 만큼 상이한 서열이 있거나; (iv) 꼬리 도메인은 적어도 10, 15, 20, 25, 30, 35 또는 40개의 뉴클레오타이드 길이이고, 예를 들어, 자연 발생 스트렙토코쿠스 피오게네스(S. pyogenes), 스트렙토코쿠스 테르모필루스(S. thermophilus), 스타필로코쿠스 아우레우스(S. aureus), 또는 나이세리아 메닝기티디스(N. meningitidis) 꼬리 도메인으로부터 유래된 적어도 10, 15, 20, 25, 30, 35 또는 40개의 뉴클레오타이드, 또는 이와 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 이내 뉴클레오타이드 만큼 상이한 서열을 포함하거나; 또는 (v) 꼬리 도메인은 15, 20, 25, 30, 35 또는 40개의 뉴클레오타이드 또는 자연 발생 꼬리 도메인, 예를 들어 스트렙토코쿠스 피오게네스(S. pyogenes), 스트렙토코쿠스 테르모필루스(S. thermophilus), 스타필로코쿠스 아우레우스(S. aureus), 또는 나이세리아 메닝기티디스(N. meningitidis) 꼬리 도메인의 상응하는 부분 전부를 포함하고; d) gRNA들은 표적 핵산으로 혼성화될 때 0 내지 50, 0 내지 100, 0 내지 200, 적어도 10, 적어도 20, 적어도 30 또는 적어도 50개의 뉴클레오타이드에 의해 분리되도록 구성되고; e) 제1 gRNA 및 제2 gRNA에 의해 만들어지는 절단들은 상이한 가닥 상에 있고; 그리고 f) PAM들은 바깥쪽을 향하고 있다.
일부 구현예에서, gRNA들 중 하나 또는 둘 모두는 a 및 b(i) 특성을 포함하도록 구성된다. 일부 구현예에서, gRNA들 중 하나 또는 둘 모두는 a 및 b(ii) 특성을 포함하도록 구성된다. 일부 구현예에서, gRNA들 중 하나 또는 둘 모두는 a 및 b(iii) 특성을 포함하도록 구성된다. 일부 구현예에서, gRNA들 중 하나 또는 둘 모두는 a 및 b(iv) 특성을 포함하도록 구성된다. 일부 구현예에서, gRNA들 중 하나 또는 둘 모두는 a 및 b(v) 특성을 포함하도록 구성된다. 일부 구현예에서, gRNA들 중 하나 또는 둘 모두는 a 및 b(vi) 특성을 포함하도록 구성된다. 일부 구현예에서, gRNA들 중 하나 또는 둘 모두는 a 및 b(vii) 특성을 포함하도록 구성된다. 일부 구현예에서, gRNA들 중 하나 또는 둘 모두는 a 및 b(viii) 특성을 포함하도록 구성된다. 일부 구현예에서, gRNA들 중 하나 또는 둘 모두는 a 및 b(ix) 특성을 포함하도록 구성된다. 일부 구현예에서, gRNA들 중 하나 또는 둘 모두는 a 및 b(x) 특성을 포함하도록 구성된다. 일부 구현예에서, gRNA들 중 하나 또는 둘 모두는 a 및 b(xi) 특성을 포함하도록 구성된다. 일부 구현예에서, gRNA들 중 하나 또는 둘 모두는 a 및 c 특성을 포함하도록 구성된다. 일부 구현예에서, gRNA들 중 하나 또는 둘 모두는 a, b 및 c 특성을 포함하도록 구성된다. 일부 구현예에서, gRNA들 중 하나 또는 둘 모두는 a(i), b(i) 및 c(i) 특성을 포함하도록 구성된다. 일부 구현예에서, gRNA들 중 하나 또는 둘 모두는 a(i), b(i) 및 c(ii) 특성을 포함하도록 구성된다. 일부 구현예에서, gRNA들 중 하나 또는 둘 모두는 a(i), b(i), c 및 d 특성을 포함하도록 구성된다. 일부 구현예에서, gRNA들 중 하나 또는 둘 모두는 a(i), b(i), c 및 e 특성을 포함하도록 구성된다. 일부 구현예에서, gRNA들 중 하나 또는 둘 모두는 a(i), b(i), c, d 및 e 특성을 포함하도록 구성된다. 일부 구현예에서, gRNA들 중 하나 또는 둘 모두는 a(i), b(ii) 및 c(i) 특성을 포함하도록 구성된다. 일부 구현예에서, gRNA들 중 하나 또는 둘 모두는 a(i), b(ii) 및 c(ii) 특성을 포함하도록 구성된다. 일부 구현예에서, gRNA들 중 하나 또는 둘 모두는 a(i), b(ii), c 및 d 특성을 포함하도록 구성된다. 일부 구현예에서, gRNA들 중 하나 또는 둘 모두는 a(i), b(ii), c 및 e 특성을 포함하도록 구성된다. 일부 구현예에서, gRNA들 중 하나 또는 둘 모두는 a(i), b(ii), c, d 및 e 특성을 포함하도록 구성된다. 일부 구현예에서, gRNA들 중 하나 또는 둘 모두는 a(i), b(iii) 및 c(i) 특성을 포함하도록 구성된다. 일부 구현예에서, gRNA들 중 하나 또는 둘 모두는 a(i), b(iii) 및 c(ii) 특성을 포함하도록 구성된다. 일부 구현예에서, gRNA들 중 하나 또는 둘 모두는 a(i), b(iii), c 및 d 특성을 포함하도록 구성된다. 일부 구현예에서, gRNA들 중 하나 또는 둘 모두는 a(i), b(iii), c 및 e 특성을 포함하도록 구성된다. 일부 구현예에서, gRNA들 중 하나 또는 둘 모두는 a(i), b(iii), c, d 및 e 특성을 포함하도록 구성된다. 일부 구현예에서, gRNA들 중 하나 또는 둘 모두는 a(i), b(iv) 및 c(i) 특성을 포함하도록 구성된다. 일부 구현예에서, gRNA들 중 하나 또는 둘 모두는 a(i), b(iv) 및 c(ii) 특성을 포함하도록 구성된다. 일부 구현예에서, gRNA들 중 하나 또는 둘 모두는 a(i), b(iv), c 및 d 특성을 포함하도록 구성된다. 일부 구현예에서, gRNA들 중 하나 또는 둘 모두는 a(i), b(iv), c 및 e 특성을 포함하도록 구성된다. 일부 구현예에서, gRNA들 중 하나 또는 둘 모두는 a(i), b(iv), c, d 및 e 특성을 포함하도록 구성된다. 일부 구현예에서, gRNA들 중 하나 또는 둘 모두는 a(i), b(v) 및 c(i) 특성을 포함하도록 구성된다. 일부 구현예에서, gRNA들 중 하나 또는 둘 모두는 a(i), b(v) 및 c(ii) 특성을 포함하도록 구성된다. 일부 구현예에서, gRNA들 중 하나 또는 둘 모두는 a(i), b(v), c 및 d 특성을 포함하도록 구성된다. 일부 구현예에서, gRNA들 중 하나 또는 둘 모두는 a(i), b(v), c 및 e 특성을 포함하도록 구성된다. 일부 구현예에서, gRNA들 중 하나 또는 둘 모두는 a(i), b(v), c, d 및 e 특성을 포함하도록 구성된다. 일부 구현예에서, gRNA들 중 하나 또는 둘 모두는 a(i), b(vi) 및 c(i) 특성을 포함하도록 구성된다. 일부 구현예에서, gRNA들 중 하나 또는 둘 모두는 a(i), b(vi) 및 c(ii) 특성을 포함하도록 구성된다. 일부 구현예에서, gRNA들 중 하나 또는 둘 모두는 a(i), b(vi), c 및 d 특성을 포함하도록 구성된다. 일부 구현예에서, gRNA들 중 하나 또는 둘 모두는 a(i), b(vi), c 및 e 특성을 포함하도록 구성된다. 일부 구현예에서, gRNA들 중 하나 또는 둘 모두는 a(i), b(vi), c, d 및 e 특성을 포함하도록 구성된다. 일부 구현예에서, gRNA들 중 하나 또는 둘 모두는 a(i), b(vii) 및 c(i) 특성을 포함하도록 구성된다. 일부 구현예에서, gRNA들 중 하나 또는 둘 모두는 a(i), b(vii) 및 c(ii) 특성을 포함하도록 구성된다. 일부 구현예에서, gRNA들 중 하나 또는 둘 모두는 a(i), b(vii), c 및 d 특성을 포함하도록 구성된다. 일부 구현예에서, gRNA들 중 하나 또는 둘 모두는 a(i), b(vii), c 및 e 특성을 포함하도록 구성된다. 일부 구현예에서, gRNA들 중 하나 또는 둘 모두는 a(i), b(vii), c, d 및 e 특성을 포함하도록 구성된다. 일부 구현예에서, gRNA들 중 하나 또는 둘 모두는 a(i), b(viii) 및 c(i) 특성을 포함하도록 구성된다. 일부 구현예에서, gRNA들 중 하나 또는 둘 모두는 a(i), b(viii) 및 c(ii) 특성을 포함하도록 구성된다. 일부 구현예에서, gRNA들 중 하나 또는 둘 모두는 a(i), b(viii), c 및 d 특성을 포함하도록 구성된다. 일부 구현예에서, gRNA들 중 하나 또는 둘 모두는 a(i), b(viii), c 및 e 특성을 포함하도록 구성된다. 일부 구현예에서, gRNA들 중 하나 또는 둘 모두는 a(i), b(viii), c, d 및 e 특성을 포함하도록 구성된다. 일부 구현예에서, gRNA들 중 하나 또는 둘 모두는 a(i), b(ix) 및 c(i) 특성을 포함하도록 구성된다. 일부 구현예에서, gRNA들 중 하나 또는 둘 모두는 a(i), b(ix) 및 c(ii) 특성을 포함하도록 구성된다. 일부 구현예에서, gRNA들 중 하나 또는 둘 모두는 a(i), b(ix), c 및 d 특성을 포함하도록 구성된다. 일부 구현예에서, gRNA들 중 하나 또는 둘 모두는 a(i), b(ix), c 및 e 특성을 포함하도록 구성된다. 일부 구현예에서, gRNA들 중 하나 또는 둘 모두는 a(i), b(ix), c, d 및 e 특성을 포함하도록 구성된다. 일부 구현예에서, gRNA들 중 하나 또는 둘 모두는 a(i), b(x) 및 c(i) 특성을 포함하도록 구성된다. 일부 구현예에서, gRNA들 중 하나 또는 둘 모두는 a(i), b(x) 및 c(ii) 특성을 포함하도록 구성된다. 일부 구현예에서, gRNA들 중 하나 또는 둘 모두는 a(i), b(x), c 및 d 특성을 포함하도록 구성된다. 일부 구현예에서, gRNA들 중 하나 또는 둘 모두는 a(i), b(x), c 및 e 특성을 포함하도록 구성된다. 일부 구현예에서, gRNA들 중 하나 또는 둘 모두는 a(i), b(x), c, d 및 e 특성을 포함하도록 구성된다. 일부 구현예에서, gRNA들 중 하나 또는 둘 모두는 a(i), b(xi) 및 c(i) 특성을 포함하도록 구성된다. 일부 구현예에서, gRNA들 중 하나 또는 둘 모두는 a(i), b(xi) 및 c(ii) 특성을 포함하도록 구성된다. 일부 구현예에서, gRNA들 중 하나 또는 둘 모두는 a(i), b(xi), c 및 d 특성을 포함하도록 구성된다. 일부 구현예에서, gRNA들 중 하나 또는 둘 모두는 a(i), b(xi), c 및 e 특성을 포함하도록 구성된다. 일부 구현예에서, gRNA들 중 하나 또는 둘 모두는 a(i), b(xi), c, d 및 e 특성을 포함하도록 구성된다.
일부 구현예에서, gRNA들은 HNH 활성을 갖는 Cas9 니카제 분자, 예를 들어 RuvC 활성이 비활성화된 Cas9 분자, 예를 들어 D10에 돌연변이(예를 들어, D10A 돌연변이)를 갖는 Cas9 분자와 함께 사용된다.
일부 구현예에서, gRNA들은 RuvC 활성을 갖는 Cas9 니카제 분자, 예를 들어 HNH 활성이 비활성화된 Cas9 분자, 예를 들어 H840에 돌연변이(예를 들어, H840A 돌연변이)를 갖는 Cas9 분자와 함께 사용된다. 일부 구현예에서, gRNA들은 RuvC 활성을 갖는 Cas9 니카제 분자, 예를 들어 HNH 활성이 비활성화된 Cas9 분자, 예를 들어 N863에 돌연변이(예를 들어, N863A)를 갖는 Cas9 분자와 함께 사용된다.
(j) 예시적인 모듈형 gRNA
일부 구현예에서, 모듈형 gRNA는 제1 및 제2 가닥을 포함한다. 제1 가닥은 바람직하게는 5’부터 3’까지: 예를 들어 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 또는 26개 뉴클레오타이드를 포함하는 표적화 도메인; 제1 상보성 도메인을 포함한다. 제2 가닥은 바람직하게는 5’부터 3’까지: 선택적으로 5’ 확장 도메인; 제2 상보성 도메인; 근위 도메인; 및 꼬리 도메인을 포함하고, 여기서: (a) 근위 및 꼬리 도메인은, 취합했을 때, 적어도 15, 18, 20, 25, 30, 31, 35, 40, 45, 49, 50, 또는 53개 뉴클레오타이드를 포함하거나; (b) 제2 상보성 도메인의 마지막 뉴클레오타이드에 대해 3’에 적어도 15, 18, 20, 25, 30, 31, 35, 40, 45, 49, 50, 또는 53개의 뉴클레오타이드가 있거나; 또는 (c) 제1 상보성 도메인의 상응하는 뉴클레오타이드에 상보적인 제2 상보성 도메인의 마지막 뉴클레오타이드에 대해 3’에 적어도 16, 19, 21, 26, 31, 32, 36, 41, 46, 50, 51, 또는 54개의 뉴클레오타이드가 있다.
일부 구현예에서, (a), (b) 또는 (c)의 서열은 자연 발생 gRNA의 상응하는 서열과 또는 본원에 기술된 gRNA와 적어도 60, 75, 80, 85, 90, 95, 또는 99% 상동성을 갖는다. 일부 구현예에서, 근위 및 꼬리 도메인은, 취합했을 때, 적어도 15, 18, 20, 25, 30, 31, 35, 40, 45, 49, 50, 또는 53개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 상보성 도메인의 마지막 뉴클레오타이드에 대해 3’에 적어도 15, 18, 20, 25, 30, 31, 35, 40, 45, 49, 50, 또는 53개의 뉴클레오타이드가 있다.
일부 구현예에서, 제1 상보성 도메인의 상응하는 뉴클레오타이드에 상보적인 제2 상보성 도메인의 마지막 뉴클레오타이드에 대해 3’에 적어도 16, 19, 21, 26, 31, 32, 36, 41, 46, 50, 51, 또는 54개의 뉴클레오타이드가 있다.
일부 구현예에서, 표적화 도메인은 표적화 도메인과 상보성을 갖는 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 또는 26개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 또는 26개의 연속적인 뉴클레오타이드)를 갖거나 이들로 구성되며, 예를 들어, 표적화 도메인은 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 또는 26개 뉴클레오타이드 길이이다.
(k) gRNA를 설계하는 방법
표적화 도메인을 선택, 설계 및 검증하는 방법을 포함하여 gRNA를 설계하는 방법이 본원에 기술된다. 예시적인 표적화 도메인이 또한 본원에 제공된다. 본원에서 논의되는 표적화 도메인은 본원에 기술되는 gRNA에 통합될 수 있다.
표적 서열의 선택 및 검증을 위한 방법 및 표적외 분석이 예를 들어 문헌[Mali et al., 2013 Science 339(6121): 823-826; Hsu et al. Nat Biotechnol, 31(9): 827-32; Fu et al., 2014 Nat Biotechnol, doi: 10.1038/nbt.2808. PubMed PMID: 24463574; Heigwer et al., 2014 Nat Methods 11(2):122-3. doi: 10.1038/nmeth.2812. PubMed PMID: 24481216; Bae et al., 2014 Bioinformatics PubMed PMID: 24463181; Xiao A et al., 2014 Bioinformatics PubMed PMID: 24389662]에 기술되어 있다.
일부 구현예에서, 사용자의 표적 서열 내 gRNA의 선택을 최적화하는 데, 예를 들어 게놈 전체에서 총 표적외 활성을 최소화하는 데 소프트웨어 도구가 사용될 수 있다. 표적외 활성은 절단 이외의 것일 수 있다. 예를 들어, 스트렙토코쿠스 피오게네스(S. pyogenes) Cas9를 사용하는 각각의 가능한 gRNA 선택에 있어서, 소프트웨어 도구는 게놈 전체에서 최대 특정 수(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10)의 미스매치된 염기쌍을 함유하는 모든 잠재적인 표적외 서열(NAG 또는 NGG PAM보다 선행함)을 식별할 수 있다. 각각의 표적외 서열에서의 절단 효율은 예를 들어 실험적으로 유도된 가중치 체계를 사용하여 예측할 수 있다. 그런 후 각각의 가능한 gRNA는 총 예상된 표적외 절단에 따라 순위가 매겨질 수 있고; 최고 순위의 gRNA들은 가장 큰 표적내 및 가장 적은 표적외 절단을 가질 가능성이 있는 것들임을 나타낸다. 다른 기능들, 예를 들어, gRNA 벡터 작제를 위한 자동화된 시약 설계, 표적내 Surveyor 분석을 위한 프라이머 설계, 및 차세대 염기서열분석을 통해 표적외 절단의 고처리량 검출 및 정량화를 위한 프라이머 설계 등이 또한 상기 도구에 포함될 수 있다. 후보 gRNA 분자는 당업계에 공지된 방법에 의해 또는 본원에 기재된 바와 같이 평가될 수 있다.
일부 구현예에서, 스트렙토코쿠스 피오게네스(S. pyogenes), 스타필로코쿠스 아우레우스(S. aureus), 및 나이세리아 메닝기티디스(N. meningitidis) Cas9와 사용하기 위한 gRNA는 DNA 서열 탐색 알고리즘을 사용하여, 예를 들어, 공개 도구 cas-offinder(Bae et al. Bioinformatics. 2014; 30(10): 1473-1475)에 기초하여 맞춤형 gRNA 설계 소프트웨어를 사용하여 식별된다. 맞춤형 gRNA 설계 소프트웨어는 게놈 전체 표적외 성향을 계산한 후 가이드를 점수화한다. 일반적으로 완벽한 일치에서 7개 미스매치까지 범위의 매치가 길이로 17에서 24까지 범위의 가이드로 간주된다. 일부 측면에서, 일단 표적외 부위가 컴퓨터 계산에 의해 결정되면, 각 가이드에 대해 집계 점수가 계산되고 웹 인터페이스를 사용하여 표 형식의 출력으로 요약된다. PAM 서열에 인접한 잠재적인 gRNA 부위를 식별하는 것에 더하여, 이 소프트웨어는 선택된 gRNA 부위와 1, 2, 3개 또는 그 이상의 뉴클레오타이드가 다른 모든 PAM 인접 서열을 식별할 수도 있다. 일부 구현예에서, UCSC 게놈 브라우저로부터 각 유전자에 대한 게놈 DNA 서열을 획득하고 공개적으로 이용 가능한 RepeatMasker 프로그램을 사용하여 반복 요소에 대해 서열을 스크리닝할 수 있다. RepeatMasker는 반복되는 요소와 복잡성이 낮은 영역에 대한 입력 DNA 서열을 탐색한다. 출력은 주어진 쿼리 서열에 있는 반복들에 대한 자세한 주석이다.
식별 후, gRNA는 표적 부위까지의 거리, 직교성 및 5’ G의 존재 중 하나 이상에 기초하여(관련 PAM, 예를 들어, 스트렙토코쿠스 피오게네스(S. pyogenes)의 경우 NGG PAM, 스타필로코쿠스 아우레우스(S. aureus)의 경우 NNGRR(예를 들어, NNGRRT 또는 NNGRRV) PAM, 및 나이세리아 메닝기티디스(N. meningtidis)의 경우 NNNNGATT 또는 NNNNGCTT PAM을 함유하는 인간 게놈 내 근접 매치들의 식별에 기초하여) 계층으로 순위를 매길 수 있다. 직교성은 표적 서열에 대해 최소 수의 미스매치를 포함하는 인간 게놈 내 서열 수를 말한다. “높은 수준의 직교성” 또는 “우수한 직교성”은 예를 들어 의도된 표적 외에 인간 게놈에 동일한 서열이 없거나 또는 표적 서열에 하나 또는 두 개의 미스매치를 함유하는 서열이 없는 20량체 표적화 도메인을 의미할 수 있다. 우수한 직교성을 가진 표적화 도메인은 표적외 DNA 절단을 최소화하기 위해 선택된다. 이것은 비제한적인 예이며 스트렙토코쿠스 피오게네스(S. pyogenes), 스타필로코쿠스 아우레우스(S. aureus) 및 나이세리아 메닝기티디스(N. meningitidis) 또는 다른 Cas9 효소와 함께 사용하기 위한 gRNA를 식별하기 위해 다양한 전략이 이용될 수 있음을 이해해야 한다.
일부 구현예에서, 스트렙토코쿠스 피오게네스(S. pyogenes) Cas9와 함께 사용하기 위한 gRNA는 공개적으로 이용 가능한 웹 기반 ZiFiT 서버(Fu et al., Improving CRISPR-Cas nuclease specificity using truncated guide RNAs. Nat Biotechnol. 2014 Jan 26. doi: 10.1038/nbt.2808. PubMed PMID: 24463574, for the original references see Sander et al., 2007, NAR 35:W599-605; Sander et al., 2010, NAR 38: W462-8)를 사용하여 식별할 수 있다. PAM 서열에 인접한 잠재적인 gRNA 부위를 식별하는 것에 더하여, 이 소프트웨어는 또한 선택된 gRNA 부위와 1, 2, 3개 또는 그 이상의 뉴클레오타이드가 다른 모든 PAM 인접 서열을 식별한다. 일부 측면에서, UCSC 게놈 브라우저로부터 각 유전자에 대한 게놈 DNA 서열을 획득할 수 있고 공개적으로 이용 가능한 Repeat-Masker 프로그램을 사용하여 반복 요소에 대해 서열을 스크리닝할 수 있다. RepeatMasker는 반복되는 요소와 복잡성이 낮은 영역에 대한 입력 DNA 서열을 탐색한다. 출력은 주어진 쿼리 서열에 있는 반복들에 대한 자세한 주석이다.
식별 후, 스트렙토코쿠스 피오게네스(S. pyogenes) Cas9와 함께 사용하기 위한 gRNA는 계층으로, 예를 들어 5개 계층으로 순위를 매길 수 있다. 일부 구현예에서, 제1 계층 gRNA 분자에 대한 표적화 도메인은 표적 부위까지의 거리, 직교성 및 5’ G의 존재에 기초하여(NGG PAM을 함유한 인간 게놈 내 근접 매치들의 ZiFiT 식별에 기초하여) 선택된다. 일부 구현예에서, 17량체 및 20량체 gRNA 모두 표적을 위해 설계된다. 일부 측면에서, gRNA는 또한 단일-gRNA 뉴클레아제 절단 및 이중 gRNA 니카제 전략 둘 모두를 위해 선택된다. gRNA를 선택하기 위한 기준 및 gRNA를 어떤 전략에 사용할 수 있을지에 대한 결정은 여러 가지 고려 사항에 기초할 수 있다. 일부 구현예에서, 단일-gRNA 뉴클레아제 절단 및 이중-gRNA 쌍을 이루는 “니카제” 전략 둘 모두를 위한 gRNA가 식별된다. 이중-gRNA 쌍을 이루는 “니카제” 전략을 위해 어떤 gRNA를 사용할 수 있는지에 대한 결정을 포함하여 gRNA를 선택하기 위한 일부 구현예에서, gRNA 쌍은 PAM이 바깥을 향하고 D10A Cas9 니카제로 절단하면 5’ 돌출부가 발생하도록 DNA 상에 배향되어야 한다. 일부 측면에서, 이중 니카제 쌍을 사용한 절단은 합리적인 빈도로 전체 개재 서열의 결실을 초래할 것이라고 가정할 수 있다. 그러나, 이중 니카제 쌍을 사용한 절단은 종종 gRNA들 중 단지 하나의 부위에서 삽입-결실(indel) 돌연변이가 발생할 수도 있다. 후보 쌍 멤버들을, 하나의 gRNA 부위에서 삽입-결실(indel) 돌연변이를 일으키는 것과 비교하여 전체 서열을 얼마나 효율적으로 제거하는지 테스트할 수 있다.
일부 구현예에서, 제1 계층 gRNA 분자에 대한 표적화 도메인은 (1) 표적 위치까지의 합리적인 거리, 예를 들어, 시작 코돈의 코딩 서열 하류부위의 첫 500bp 이내, (2) 높은 수준의 직교성, 및 (3) 5’ G의 존재에 기초하여 선택될 수 있다. 일부 구현예에서, 제2 계층 gRNA의 선택의 경우, 5’G 요건은 제외될 수 있지만, 거리 제한은 필요하고 높은 수준의 직교성도 필요하였다. 일부 구현예에서, 제3 계층 선택은 동일한 거리 제한과 5’G 요건을 사용하지만, 우수한 직교성의 요건은 제외한다. 일부 구현예에서, 제4 계층 선택은 동일한 거리 제한을 사용하지만 우수한 직교성의 요건과 5’G부터 시작을 제외한다. 일부 구현예에서, 제5 계층 선택은 우수한 직교성의 요건과 5’G를 제외하고, 더 긴 서열(예를 들어, 코딩 서열의 나머지 부분, 예를 들어, 전사 표적 부위에 대한 추가 500bp 상류부위 또는 하류부위)이 스캔된다. 특정 예에서, gRNA는 특정 계층의 기준에 기초해 식별되지 않는다.
일부 구현예에서, 단일-gRNA 뉴클레아제 절단 및 이중-gRNA 쌍을 이루는 “니카제” 전략을 위해 gRNA가 식별된다.
일부 측면에서, 나이세리아 메닝기티디스(N. meningitidis) 및 스타필로코쿠스 아우레우스(S. aureus) Cas9와 사용하기 위한 gRNA는 PAM 서열의 존재에 대해 게놈 DNA 서열을 스캔하여 수동으로 식별될 수 있다. 이러한 gRNA들은 두 계층으로 분리될 수 있다. 일부 구현예에서, 제1 계층 gRNA의 경우, 표적화 도메인은 시작 코돈의 코딩 서열 하류부위의 첫 500bp 내에서 선택된다. 일부 구현예에서, 제2 계층 gRNA의 경우, 표적화 도메인은 나머지 코딩 서열(첫 500bp의 하류부위) 내에서 선택된다. 특정 예에서, gRNA는 특정 계층의 기준에 기초해 식별되지 않는다.
일부 구현예에서, 스트렙토코쿠스 피오게네스(S. pyogenes), 스타필로코쿠스 아우레우스(S. aureus) 및 나이세리아 메닝기티디스(N. meningtidis) Cas9와 사용하기 위한 가이드 RNA(gRNA)를 식별하기 위한 다른 전략은 DNA 서열 탐색 알고리즘을 사용할 수 있다. 일부 측면에서, 가이드 RNA 설계는 공개 도구 cas-offinder(Bae et al. Bioinformatics. 2014; 30(10): 1473-1475)에 기초하여 맞춤형 가이드 RNA 설계 소프트웨어를 사용하여 수행된다. 상기 맞춤형 가이드 RNA 설계 소프트웨어는 게놈 전체 표적외 성향을 계산한 후 가이드를 점수화한다. 일반적으로 완벽한 일치에서 7개 미스매치까지 범위의 매치가 길이로 17에서 24까지 범위의 가이드로 간주된다. 일단 표적외 부위가 컴퓨터 계산에 의해 결정되면, 각 가이드에 대해 집계 점수가 계산되고 웹 인터페이스를 사용하여 표 형식의 출력으로 요약된다. PAM 서열에 인접한 잠재적인 gRNA 부위를 식별하는 것에 더하여, 이 소프트웨어는 또한 선택된 gRNA 부위와 1, 2, 3개 또는 그 이상의 뉴클레오타이드가 다른 모든 PAM 인접 서열을 식별한다. 일부 구현예에서, UCSC 게놈 브라우저로부터 각 유전자에 대한 게놈 DNA 서열을 획득하고 공개적으로 이용 가능한 RepeatMasker 프로그램을 사용하여 반복 요소에 대해 서열을 스크리닝한다. RepeatMasker는 반복되는 요소와 복잡성이 낮은 영역에 대한 입력 DNA 서열을 탐색한다. 출력은 주어진 쿼리 서열에 있는 반복들에 대한 자세한 주석이다.
일부 구현예에서, 식별 후, gRNA는 표적 부위까지의 거리 또는 직교성에 기초하여(관련 PAM, 예를 들어, 스트렙토코쿠스 피오게네스(S. pyogenes)의 경우 NGG PAM, 스타필로코쿠스 아우레우스(S. aureus)의 경우 NNGRR(예를 들어, NNGRRT 또는 NNGRRV) PAM, 및 나이세리아 메닝기티디스(N. meningtidis)의 경우 NNNNGATT 또는 NNNNGCTT PAM을 함유하는 인간 게놈 내 근접 매치들의 식별에 기초하여) 계층으로 순위가 매겨진다. 일부 측면에서, 우수한 직교성을 가진 표적화 도메인은 표적외 DNA 절단을 최소화하기 위해 선택된다.
일 예로서, 스트렙토코쿠스 피오게네스(S. pyogenes) 및 나이세리아 메닝기티디스(N. meningtidis) 표적의 경우, 17량체 또는 20량체 gRNA가 설계될 수 있다. 다른 예로서, 스타필로코쿠스 아우레우스(S. aureus) 표적의 경우, 18량체, 19량체, 20량체, 21량체, 22량체, 23량체 및 24량체 gRNA가 설계될 수 있다.
일부 구현예에서, 단일-gRNA 뉴클레아제 절단 및 이중-gRNA 쌍을 이루는 “니카제” 전략 둘 모두를 위한 gRNA가 식별된다. 이중-gRNA 쌍을 이루는 “니카제” 전략을 위해 어떤 gRNA를 사용할 수 있는지에 대한 결정을 포함하여 gRNA를 선택하기 위한 일부 구현예에서, gRNA 쌍은 PAM이 바깥을 향하고 D10A Cas9 니카제로 절단하면 5’ 돌출부가 발생하도록 DNA 상에 배향되어야 한다. 일부 측면에서, 이중 니카제 쌍을 사용한 절단은 합리적인 빈도로 전체 개재 서열의 결실을 초래할 것이라고 가정할 수 있다. 그러나, 이중 니카제 쌍을 사용한 절단은 종종 gRNA들 중 단지 하나의 부위에서 삽입-결실(indel) 돌연변이가 발생할 수도 있다. 후보 쌍 멤버들을, 하나의 gRNA 부위에서 삽입-결실(indel) 돌연변이를 일으키는 것과 비교하여 전체 서열을 얼마나 효율적으로 제거하는지 테스트할 수 있다.
유전자 파괴를 위한 전략을 설계하기 위해, 일부 구현예에서, 스트렙토코쿠스 피오게네스(S. pyogenes)를 위한 제1 계층 gRNA 분자에 대한 표적화 도메인은 표적 부위까지의 거리 및 직교성(PAM은 NGG임)에 기초하여 선택된다. 일부 경우에, 제1 계층 gRNA 분자에 대한 표적화 도메인은 (1) 표적 위치까지의 합리적인 거리, 예를 들어, 시작 코돈의 코딩 서열 하류부위의 첫 500bp 이내 및 (2) 높은 수준의 직교성에 기초하여 선택된다. 일부 측면에서, 제2 계층 gRNA의 선택의 경우, 높은 수준의 직교성은 필요하지 않다. 일부 경우에, 제3 계층 gRNA는 우수한 직교성의 요건은 제외하고 더 긴 서열(예를 들어, 코딩 서열의 나머지 부분)이 스캔될 수 있다. 특정 예에서, gRNA는 특정 계층의 기준에 기초해 식별되지 않는다.
유전자 파괴를 위한 전략을 설계하기 위해, 일부 구현예에서, 나이세리아 메닝기티디스(N. meningtidis)를 위한 제1 계층 gRNA 분자에 대한 표적화 도메인은 코딩 서열의 첫 500bp 내에서 선택되었고 높은 수준의 직교성을 가졌다. 나이세리아 메닝기티디스(N. meningtidis)를 위한 제2 계층 gRNA 분자에 대한 표적화 도메인은 코딩 서열의 첫 500bp 내에서 선택되었고 높은 직교성을 필요로 하지 않았다. 나이세리아 메닝기티디스(N. meningtidis)를 위한 제3 계층 gRNA 분자에 대한 표적화 도메인은 500bp의 코딩 서열 하류부위의 나머지 내에서 선택되었다. 계층은 비포괄적(각 gRNA는 한 번만 나열됨)임에 유의한다. 특정 예에서, gRNA는 특정 계층의 기준에 기초해 식별되지 않았다.
유전자 파괴를 위한 전략을 설계하기 위해, 일부 구현예에서, 스타필로코쿠스 아우레우스(S. aureus)를 위한 제1 계층 gRNA 분자에 대한 표적화 도메인은 코딩 서열의 첫 500bp 내에서 선택되고, 높은 수준의 직교성을 가지며, NNGRRT PAM을 함유한다. 일부 구현예에서, 스타필로코쿠스 아우레우스(S. aureus)를 위한 제2 계층 gRNA 분자에 대한 표적화 도메인은 코딩 서열의 첫 500bp 내에서 선택되고, 직교성의 수준이 필요하지 않으며, NNGRRT PAM을 함유한다. 일부 구현예에서, 스타필로코쿠스 아우레우스(S. aureus)를 위한 제3 계층 gRNA 분자에 대한 표적화 도메인은 코딩 서열 하류부위의 나머지 내에서 선택되고 NNGRRT PAM을 함유한다. 일부 구현예에서, 스타필로코쿠스 아우레우스(S. aureus)를 위한 제4 계층 gRNA 분자에 대한 표적화 도메인은 코딩 서열의 첫 500bp 내에서 선택되고 NNGRRV PAM을 함유한다. 일부 구현예에서, 스타필로코쿠스 아우레우스(S. aureus)를 위한 제5 계층 gRNA 분자에 대한 표적화 도메인은 코딩 서열 하류부위의 나머지 내에서 선택되고 NNGRRV PAM을 함유한다. 특정 예에서, gRNA는 특정 계층의 기준에 기초해 식별되지 않는다.
(ii) Cas9
다양한 종(species)의 Cas9 분자가 본원에 기술된 방법 및 조성물에 사용될 수 있다. 스트렙토코쿠스 피오게네스, 스타필로코쿠스 아우레우스, 나이세리아 메닝기티디스, 및 스트렙토코쿠스 테르모필루스 Cas9 분자가 본원의 개시 내용의 많은 부분의 주제이지만, 본원에 나오는 다른 종의 Cas9 단백질의, 이로부터 유래된, 또는 이에 기초한 Cas9 분자도 사용될 수 있다. 달리 말하면, 본원의 설명의 많은 부분이 스트렙토코쿠스 피오게네스, 스타필로코쿠스 아우레우스, 나이세리아 메닝기티디스, 및 스트렙토코쿠스 테르모필루스 Cas9 분자를 사용하지만, 다른 종의 Cas9 분자가 이들을 대체할 수 있다. 상기 종에는: Acidovorax avenae, Actinobacillus pleuropneumoniae, Actinobacillus succinogenes, Actinobacillus suis, Actinomyces sp., Cycliphilusdenitrificans, Aminomonas paucivorans, Bacillus cereus, Bacillus smithii, Bacillus thuringiensis, Bacteroides sp., Blastopirellula marina, Bradyrhizobium sp., Brevibacillus laterosporus, Campylobacter coli, Campylobacter jejuni, Campylobacter lari, Candidatus puniceispirillum, Clostridium cellulolyticum, Clostridium perfringens, Corynebacterium accolens, Corynebacterium diphtheria, Corynebacterium matruchotii, Dinoroseobacter shibae, Eubacterium dolichum, Gammaproteobacterium, Gluconacetobacter diazotrophicus, Haemophilus parainfluenzae, Haemophilus sputorum, Helicobacter canadensis, Helicobacter cinaedi, Helicobacter mustelae, Ilyobacter polytropus, Kingella kingae, Lactobacillus crispatus, Listeria ivanovii, Listeria monocytogenes, Listeriaceae bacterium, Methylocystis sp., Methylosinus trichosporium, Mobiluncus mulieris, Neisseria bacilliformis, Neisseria cinerea, Neisseria flavescens, Neisseria lactamica, Neisseria meningitidis, Neisseria sp., Neisseria wadsworthii, Nitrosomonas sp., Parvibaculum lavamentivorans, Pasteurella multocida, Phascolarctobacterium succinatutens, Ralstonia syzygii, Rhodopseudomonas palustris, Rhodovulum sp., Simonsiella muelleri, Sphingomonas sp., Sporolactobacillus vineae, Staphylococcus aureus, Staphylococcus lugdunensis, Streptococcus sp., Subdoligranulum sp., Tistrella mobilis, Treponema sp., 또는 Verminephrobacter eiseniae이 포함된다. Cas9 분자의 예는 예를 들어, 문헌[WO2015/161276, WO2017/193107, WO2017/093969, US2016/272999 및 US2015/056705]에 기재된 것들을 포함할 수 있다.
Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드는, 이 용어가 본원에서 사용될 때, gRNA 분자와 상호작용할 수 있고 그 gRNA 분자와 협력하여 표적 도메인 및 PAM 서열을 포함하는 부위로 귀소하거나 국소화하는, 분자 또는 폴리펩타이드를 지칭한다. Cas9 분자 및 Cas9 폴리펩타이드는, 이 용어들이 본원에서 사용될 때, 자연 발생 Cas9 분자를 지칭하고 그리고 기준 서열, 예를 들어, 가장 유사한 자연 발생 Cas9 분자와 예를 들어, 적어도 하나의 아미노산 잔기가 상이한 조작된, 변경된, 또는 변형된 Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드를 지칭한다.
두 개의 상이한 자연 발생 박테리아 Cas9 분자(Jinek et al., Science, 343(6176):1247997, 2014)와 가이드 RNA가 있는 스트렙토코쿠스 피오게네스 Cas9(예를 들어, crRNA와 tracrRNA의 합성 융합)(Nishimasu et al., Cell, 156:935-949, 2014; and Anders et al., Nature, 2014, doi: 10.1038/nature13579)에 대한 결정 구조가 측정되었다.
자연 발생 Cas9 분자는 인식(REC) 엽(lobe) 및 뉴클레아제(NUC) 엽의 두 가지 엽을 포함하고; 이들 각각은 본원에 기술된 도메인을 더 포함한다. 1차 구조에서 중요한 Cas9 도메인의 조직화의 예시적인 개략도가 문헌[WO2015/161276, 예를 들어, 그 안의 도 8A-8B]에서 기술된다. 도메인 명명법 및 본 개시 내용 전반에 걸쳐 사용된 각 도메인에 의해 포함되는 아미노산 잔기의 넘버링은 문헌[Nishimasu et al]에 기술된 바와 같다. 아미노산 잔기의 넘버링은 스트렙토코쿠스 피오게네스의 Cas9를 참조한다.
REC 엽은 아르기닌이 풍부한 브리지 나선(BH), REC1 도메인 및 REC2 도메인을 포함한다. REC 엽은 다른 알려진 단백질과 구조적 유사성을 공유하지 않으며, 이는 이것이 Cas9-특이적 기능 도메인임을 나타낸다. BH 도메인은 긴 α-나선의 아르기닌이 풍부한 영역이며 스트렙토코쿠스 피오게네스 Cas9의 서열의 아미노산 60-93을 포함한다. REC1 도메인은 반복:항-반복(repeat:anti-repeat) 이중체의 인식, 예를 들어 gRNA 또는 tracrRNA의 인식에 중요하므로 표적 서열을 인식함으로써 Cas9 활성에 중요하다. REC1 도메인은 스트렙토코쿠스 피오게네스 Cas9의 서열의 아미노산 94 내지 179 및 308 내지 717에 두 개의 REC1 모티프를 포함한다. 이 두 개의 REC1 도메인은, 선형 1차 구조에서 REC2 도메인에 의해 분리되지만, 3차 구조에서 모여서 REC1 도메인을 형성한다. REC2 도메인 또는 이의 일부는 또한 반복:항-반복 이중체의 인식에서 역할을 할 수도 있다. REC2 도메인은 스트렙토코쿠스 피오게네스 Cas9의 서열의 아미노산 180-307을 포함한다.
NUC 엽은 RuvC 도메인(본원에서 RuvC 유사 도메인으로도 지칭됨), HNH 도메인(본원에서 HNH 유사 도메인으로도 지칭됨), 및 PAM-상호작용(PI) 도메인을 포함한다. RuvC 도메인은 레트로바이러스 인테그라제 상과 멤버와 구조적 유사성을 공유하고 단일 가닥, 예를 들어 표적 핵산 분자의 비-상보적 가닥을 절단한다. RuvC 도메인은 스트렙토코쿠스 피오게네스 Cas9의 서열의 아미노산 1-59, 718-769, 및 909-1098 각각에서 3개의 분할 RuvC 모티프(RuvC I, RuvCII, 및 RuvCIII, 이들은 종종 일반적으로 RuvCI 도메인 또는 N-말단 RuvC 도메인, RuvCII 도메인, 및 RuvCIII 도메인으로 불림)로부터 모인다. REC1 도메인과 유사하게, 3개의 RuvC 모티프는 1차 구조에서 다른 도메인들에 의해 선형으로 분리되지만, 3차 구조에서는 3개의 RuvC 모티프가 모여서 RuvC 도메인을 형성한다. HNH 도메인은 HNH 엔도뉴클레아제와 구조적 유사성을 공유하고 단일 가닥, 예를 들어 표적 핵산 분자의 상보적 가닥을 절단한다. HNH 도메인은 RuvC II-III 모티프 사이에 있으며 스트렙토코쿠스 피오게네스 Cas9의 서열의 아미노산 775-908을 포함한다. PI 도메인은 표적 핵산 분자의 PAM과 상호작용하며 스트렙토코쿠스 피오게네스 Cas9의 서열의 아미노산 1099-1368을 포함한다.
(a) RuvC 유사 도메인 및 HNH 유사 도메인
일부 구현예에서, Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드는 HNH 유사 도메인 및 RuvC 유사 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 절단 활성은 RuvC 유사 도메인 및 HNH 유사 도메인에 의존한다. Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드, 예를 들어 eaCas9 분자 또는 eaCas9 폴리펩타이드는 다음 도메인들: RuvC 유사 도메인 및 HNH 유사 도메인 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드는 eaCas9 분자 또는 eaCas9 폴리펩타이드이고 eaCas9 분자 또는 eaCas9 폴리펩타이드는 RuvC 유사 도메인, 예를 들어 본원에 기술된 RuvC 유사 도메인, 및/또는 HNH 유사 도메인, 예를 들어 본원에 기술된 HNH 유사 도메인을 포함한다.
(b) RuvC 유사 도메인
일부 구현예에서, RuvC 유사 도메인은 단일 가닥, 예를 들어 표적 핵산 분자의 비-상보적 가닥을 절단한다. Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드는 하나 이상의 RuvC 유사 도메인(예를 들어, 1, 2, 3개 또는 그 이상의 RuvC 유사 도메인)을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, RuvC 유사 도메인은 적어도 5, 6, 7, 8개 이상 아미노산 길이이지만 20, 19, 18, 17, 16 또는 15개 아미노산 길이를 넘지 않는다. 일부 구현예에서, Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드는 약 10 내지 20개 아미노산, 예를 들어 약 15개 아미노산 길이의 N-말단 RuvC 유사 도메인을 포함한다.
(c) N-말단 RuvC 유사 도메인
일부 자연 발생 Cas9 분자는 절단이 N-말단 RuvC 유사 도메인에 의존하는 하나 이상의 RuvC 유사 도메인을 포함한다. 따라서, Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드는 N-말단 RuvC 유사 도메인을 포함할 수 있다.
구현예에서, N-말단 RuvC 유사 도메인은 절단 가능하다.
구현예에서, N-말단 RuvC 유사 도메인은 절단 불가능하다.
일부 구현예에서, N-말단 RuvC 유사 도메인은 본원에 개시된, 예를 들어, 문헌[WO2015/161276, 예를 들어, 그 안의 도 3A-3B 또는 도 7A-7B]에 개시된 N-말단 RuvC 유사 도메인의 서열과 1개 이상 그러나 2, 3, 4, 또는 5개 이내 잔기가 상이하다. 일부 구현예에서, 문헌[WO2015/161276, 예를 들어, 그 안의 도 3A-3B 또는 도 7A-7B]에서 식별된 고도로 보존된 잔기들 중 1, 2, 또는 3개 모두가 존재한다.
일부 구현예에서, N-말단 RuvC 유사 도메인은 본원에 개시된, 예를 들어, 문헌[WO2015/161276, 예를 들어, 그 안의 도 4A-4B 또는 도 7A-7B]에 개시된 N-말단 RuvC 유사 도메인의 서열과 1개 이상 그러나 2, 3, 4, 또는 5개 이내 잔기가 상이하다. 일부 구현예에서, 문헌[WO2015/161276, 예를 들어, 그 안의 도 4A-4B 또는 도 7A-7B]에서 식별된 고도로 보존된 잔기들 중 1, 2, 3 또는 4개 모두가 존재한다.
(d) 추가 RuvC 유사 도메인
N-말단 RuvC 유사 도메인에 더하여, Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드, 예를 들어 eaCas9 분자 또는 eaCas9 폴리펩타이드는 하나 이상의 추가 RuvC 유사 도메인을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드는 2개의 추가 RuvC 유사 도메인을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 추가 RuvC 유사 도메인은 적어도 5개 아미노산 길이이고, 예를 들어 15개 미만 아미노산 길이, 예를 들어 5 내지 10개 아미노산 길이, 예를 들어 8개 아미노산 길이이다.
(e) HNH 유사 도메인
일부 구현예에서, HNH 유사 도메인은 단일 가닥 상보적 도메인, 예를 들어 이중 가닥 핵산 분자의 상보적 가닥을 절단한다. 일부 구현예에서, HNH 유사 도메인은 적어도 15, 20, 25개 아미노산 길이이지만, 40, 35 또는 30개 미만 아미노산 길이, 예를 들어 20 내지 35개 아미노산 길이, 예를 들어 25 내지 30개 아미노산 길이이다. 예시적인 HNH 유사 도메인을 본원에 기술한다.
일부 구현예에서, HNH 유사 도메인은 절단 가능하다.
일부 구현예에서, HNH 유사 도메인은 절단 불가능하다.
일부 구현예에서, HNH 유사 도메인은 본원에 개시된, 예를 들어, 문헌[WO2015/161276, 예를 들어, 그 안의 도 5A-5C 또는 도 7A-7B]에 개시된 HNH 유사 도메인의 서열과 1개 이상 그러나 2, 3, 4, 또는 5개 이내 잔기가 상이하다. 일부 구현예에서, 문헌[WO2015/161276, 예를 들어, 그 안의 도 5A-5C 또는 도 7A-7B]에서 식별된 고도로 보존된 잔기들 중 1개 또는 2개 모두가 존재한다.
일부 구현예에서, HNH 유사 도메인은 본원에 개시된, 예를 들어, 문헌[WO2015/161276, 예를 들어, 그 안의 도 6A-6B 또는 도 7A-7B]에 개시된 HNH 유사 도메인의 서열과 1개 이상 그러나 2, 3, 4, 또는 5개 이내 잔기가 상이하다. 일부 구현예에서, 문헌[WO2015/161276, 예를 들어, 그 안의 도 6A-6B 또는 도 7A-7B]에서 식별된 고도로 보존된 잔기들 중 1, 2, 또는 3개 모두가 존재한다.
(f) 뉴클레아제 및 나선효소 활성
일부 구현예에서, Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드는 표적 핵산 분자를 절단할 수 있다. 일반적으로 야생형 Cas9 분자는 표적 핵산 분자의 두 가닥을 모두 절단한다. Cas9 분자 및 Cas9 폴리펩타이드는 뉴클레아제 절단(또는 다른 특성)을 변경하도록, 예를 들어 니카제인 또는 표적 핵산 절단 능력이 결여된 Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드를 제공하도록 조작될 수 있다. 표적 핵산 분자를 절단할 수 있는 Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드는 본원에서 eaCas9 분자 또는 eaCas9 폴리펩타이드로 지칭된다.
일부 구현예에서, eaCas9 분자 또는 eaCas9 폴리펩타이드는 다음 활성들: 니카제 활성, 즉 핵산 분자의 단일 가닥 예를 들어 비-상보적 가닥 또는 상보적 가닥을 절단하는 능력; 이중 가닥 뉴클레아제 활성, 즉 이중 가닥 핵산의 양 가닥을 절단하고 이중 가닥 절단을 만드는 능력, 이는 일부 구현예에서 2개 니카제 활성의 존재임; 엔도뉴클레아제 활성; 엑소뉴클레아제 활성; 및 나선효소 활성, 즉 이중 가닥 핵산의 나선 구조를 푸는 능력; 중 하나 이상을 포함한다.
일부 구현예에서, 효소 활성 또는 eaCas9 분자 또는 eaCas9 폴리펩타이드는 두 가닥 모두를 절단하고 이중 가닥 절단을 초래한다. 일부 구현예에서, eaCas9 분자는 하나의 가닥, 예를 들어, gRNA가 혼성화하는 가닥, 또는 gRNA가 혼성화하는 가닥에 상보적인 가닥만을 절단한다. 일부 구현예에서, eaCas9 분자 또는 eaCas9 폴리펩타이드는 HNH 유사 도메인과 관련된 절단 활성을 포함한다. 일부 구현예에서, eaCas9 분자 또는 eaCas9 폴리펩타이드는 N-말단 RuvC 유사 도메인과 관련된 절단 활성을 포함한다. 일부 구현예에서, eaCas9 분자 또는 eaCas9 폴리펩타이드는 HNH 유사 도메인과 관련된 절단 활성 및 N-말단 RuvC 유사 도메인과 관련된 절단 활성을 포함한다. 일부 구현예에서, eaCas9 분자 또는 eaCas9 폴리펩타이드는 활성 또는 절단 가능한 HNH 유사 도메인 및 활성 또는 절단 가능한 N-말단 RuvC 유사 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, eaCas9 분자 또는 eaCas9 폴리펩타이드는 비활성 또는 절단 불가능한 HNH 유사 도메인 및 활성 또는 절단 가능한 N-말단 RuvC 유사 도메인을 포함한다.
일부 Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드는 gRNA 분자와 상호작용하는 능력이 있고, 그 gRNA 분자와 협력하여 중심 표적 도메인으로 국소화되지만, 표적 핵산을 절단할 수 없거나 또는 효율적인 속도로 절단할 수 없다. 절단 활성이 없거나 실질적으로 없는 Cas9 분자는 본원에서 eiCas9 분자 또는 eiCas9 폴리펩타이드로 지칭된다. 예를 들어, eiCas9 분자 또는 eiCas9 폴리펩타이드는 본원에 기술된 분석에 의해 측정된 바와 같이, 절단 활성이 결여되거나 실질적으로 더 적은, 예를 들어 기준 Cas9 분자 또는 eiCas9 폴리펩타이드의 절단 활성의 20, 10, 5, 1 또는 0.1% 미만을 가질 수 있다.
(g) 표적화 및 PAM
Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드는, 가이드 RNA(gRNA) 분자와 상호작용할 수 있고 그 gRNA 분자와 협력하여 표적 도메인 및 PAM 서열을 포함하는 부위로 국소화하는 폴리펩타이드이다.
일부 구현예에서, eaCas9 분자 또는 eaCas9 폴리펩타이드의 표적 핵산과 상호작용하고 이를 절단하는 능력은 PAM 서열 의존적이다. PAM 서열은 표적 핵산에 있는 서열이다. 일부 구현예에서, 표적 핵산의 절단은 PAM 서열로부터 상류부위에서 발생한다. 상이한 박테리아 종의 eaCas9 분자는 상이한 서열 모티프(예를 들어, PAM 서열)를 인식할 수 있다. 일부 구현예에서, 스트렙토코쿠스 피오게네스의 eaCas9 분자는 서열 모티프 NGG, NAG, NGA를 인식하고 그 서열로부터 상류부위의 표적 핵산 서열 1 내지 10개, 예를 들어 3 내지 5개의 염기쌍의 절단을 지시한다. 예를 들어, 문헌[Mali et al., Science 2013; 339(6121): 823-826]을 참조한다. 일부 구현예에서, 스트렙토코쿠스 테르모필루스의 eaCas9 분자는 서열 모티프 NGGNG 및/또는 NNAGAAW(W = A 또는 T)를 인식하고 이 서열들로부터 상류부위의 표적 핵산 서열 1 내지 10개, 예를 들어 3 내지 5개의 염기쌍의 절단을 지시한다. 예를 들어, 문헌[Horvath et al., Science 2010; 327(5962):167-170, and Deveau et al., J Bacteriol 2008; 190(4): 1390-1400]을 참조한다. 일부 구현예에서, 스트렙토코쿠스 뮤탄스(S. mutans)의 eaCas9 분자는 서열 모티프 NGG 및/또는 NAAR(R = A 또는 G)를 인식하고 이 서열로부터 상류부위의 표적 핵산 서열 1 내지 10개, 예를 들어 3 내지 5개의 염기쌍의 절단을 지시한다. 예를 들어, 문헌[Deveau et al., J Bacteriol 2008; 190(4): 1390-1400]을 참조한다. 일부 구현예에서, 스타필로코쿠스 아우레우스의 eaCas9 분자는 서열 모티프 NNGRR(R = A 또는 G)를 인식하고 그 서열로부터 상류부위의 표적 핵산 서열 1 내지 10개, 예를 들어 3 내지 5개의 염기쌍의 절단을 지시한다. 일부 구현예에서, 스타필로코쿠스 아우레우스의 eaCas9 분자는 서열 모티프 NNGRRT(R = A 또는 G)를 인식하고 그 서열로부터 상류부위의 표적 핵산 서열 1 내지 10개, 예를 들어 3 내지 5개의 염기쌍의 절단을 지시한다. 일부 구현예에서, 스타필로코쿠스 아우레우스의 eaCas9 분자는 서열 모티프 NNGRRV(R = A 또는 G)를 인식하고 그 서열로부터 상류부위의 표적 핵산 서열 1 내지 10개, 예를 들어 3 내지 5개의 염기쌍의 절단을 지시한다. 일부 구현예에서, 나이세리아 메닝기티디스의 eaCas9 분자는 서열 모티프 NNNNGATT 또는 NNNGCTT(R = A 또는 G, V = A, G 또는 C)를 인식하고 그 서열로부터 상류부위의 표적 핵산 서열 1 내지 10개, 예를 들어 3 내지 5개의 염기쌍의 절단을 지시한다. 예를 들어, 문헌[Hou et al., PNAS Early Edition 2013, 1-6]을 참조한다. Cas9 분자의 PAM 서열을 인식하는 능력은 예를 들어 문헌[Jinek et al., Science 2012 337:816]에 기술된 변환 분석(transformation assay)을 사용하여 결정될 수 있다. 전술한 구현예들에서, N은 임의의 뉴클레오타이드 잔기, 예를 들어 A, G, C 또는 T 중 임의의 것일 수 있다.
본원에서 논의된 바와 같이, Cas9 분자는 Cas9 분자의 PAM 특이성을 변경하도록 조작될 수 있다.
예시적인 자연 발생 Cas9 분자는 문헌[Chylinski et al., RNA Biology 2013 10:5, 727-737]에 기술되어 있다. 이러한 Cas9 분자에는 클러스터 1 - 78 세균과(bacterial family)의 Cas9 분자들이 포함된다.
예시적인 자연 발생 Cas9 분자에는 클러스터 1 세균과의 Cas9 분자가 포함된다. 예들에는 스트렙토코쿠스 피오게네스(S. pyogenes)(예를 들어, 균주 SF370, MGAS10270, MGAS10750, MGAS2096, MGAS315, MGAS5005, MGAS6180, MGAS9429, NZ131 및 SSI-1), 스트렙토코쿠스 테르모필루스(S. thermophilus)(예를 들어, 균주 LMD-9), 스트렙토코쿠스 슈도포르시누스(S. pseudoporcinus)(예를 들어, 균주 SPIN 20026), 스트렙토코쿠스 뮤탄스(S. mutans)(예를 들어, 균주 UA159, NN2025), 스트렙토코쿠스 마카카에(S. macacae)(예를 들어, 균주 NCTC11558), 스트렙토코쿠스 갈로라이티쿠스(S. gallolyticus)(예를 들어, 균주 UCN34, ATCC BAA-2069), 스트렙토코쿠스 에키네스(S. equines)(예를 들어, 균주 ATCC 9812, MGCS 124), 스트렙토코쿠스 디스칼락티애(S. dysdalactiae)(예를 들어, 균주 GGS 124), 스트렙토코쿠스 보비스(S. bovis)(예를 들어, 균주 ATCC 700338), 스트렙토코쿠스 안지노수스(S. anginosus)(예를 들어, 균주 F0211), 스트렙토코쿠스 아갈락티애(S. agalactiae)(예를 들어, 균주 NEM316, A909), 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes)(예를 들어, 균주 F6854), 리스테리아 이노쿠아(Listeria innocua)(L. innocua, 예를 들어, 균주 Clip11262), 엔테로코쿠스 이탈리쿠스(Enterococcus italicus)(예를 들어, 균주 DSM 15952), 또는 엔테로코쿠스 패시움(Enterococcus faecium)(예를 들어, 균주 1,231,408)의 Cas9 분자가 포함된다. 다른 예시적인 Cas9 분자는 나이세리아 메닝기티디스(Neisseria meningitidis)의 Cas9 분자이다(Hou et al., PNAS Early Edition 2013, 1-6).
일부 구현예에서, Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드, 예를 들어, eaCas9 분자 또는 eaCas9 폴리펩타이드는 본원에 기술된 임의의 Cas9 분자 서열 또는 자연 발생 Cas9 분자 서열, 예를 들어 본원에 등재된(예를 들어, 서열 번호: 112-115) 또는 문헌[Chylinski et al., RNA Biology 2013 10:5, 727-737; Hou et al., PNAS Early Edition 2013, 1-6]에 기술된 종의 Cas9 분자 서열과: 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함하거나; 비교하여 2, 5, 10, 15, 20, 30, 또는 40% 이내의 아미노산 잔기가 상이하거나; 적어도 1, 2, 5, 10 또는 20개 아미노산 이상 하지만 100, 80, 70, 60, 50, 40 또는 30개 아미노산 이내가 상이하거나; 또는 동일하다. 일부 구현예에서, Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드는 다음 활성들: 니카제 활성; 이중 가닥 절단 활성(예를 들어, 엔도뉴클레아제 및/또는 엑소뉴클레아제 활성); 나선효소 활성; 또는 gRNA 분자와 함께 표적 핵산으로 귀소하는 능력 중 하나 이상을 포함한다.
일부 구현예에서, Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드는 문헌[WO2015/161276, 예를 들어, 그 안의 도 2A-2G]의 공통 서열의 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 “*”는 스트렙토코쿠스 피오게네스(S. pyogenes), 스트렙토코쿠스 테르모필루스(S. thermophilus), 스트렙토코쿠스 뮤탄스(S. mutans) 및 리스테리아 이노쿠아(L. innocua)의 Cas9 분자의 아미노산 서열 내 상응하는 위치에서 발견된 임의의 아미노산을 표시하고, “-”는 임의의 아미노산을 표시한다. 일부 구현예에서, Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드는 서열 번호: 112-117의 공통 서열 또는 문헌[WO2015/161276, 예를 들어, 그 안의 도 2A-2G]에 개시된 공통 서열의 서열과 적어도 1개 이상 하지만 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 이내 아미노산 잔기가 상이하다. 일부 구현예에서, Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드는 서열 번호: 117의 아미노산 서열 또는 문헌[WO2015/161276, 예를 들어, 그 안의 도 7A-7B]에 기술된 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 “*”는 스트렙토코쿠스 피오게네스(S. pyogenes), 또는 나이세리아 메닝기티디스(N. meningitidis)의 Cas9 분자의 아미노산 서열 내 상응하는 위치에서 발견된 임의의 아미노산을 표시하고, “-”는 임의의 아미노산을 표시하고, “-”는 임의의 아미노산 또는 없음을 표시한다. 일부 구현예에서, Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드는 서열 번호: 116 또는 117의 서열 또는 문헌[WO2015/161276, 예를 들어, 그 안의 도 7A-7B]에 기술된 서열과 적어도 1개 이상 하지만 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 이내 아미노산 잔기가 상이하다.
다수의 Cas9 분자의 서열을 비교한 것은 특정 영역이 보존되어 있음을 나타낸다. 이들은 영역 1(잔기 1 내지 180, 또는 영역 1’의 경우 잔기 120 내지 180); 영역 2(잔기 360 내지 480); 영역 3(잔기 660 내지 720); 영역 4(잔기 817 내지 900); 및 영역 5(잔기 900 내지 960)으로 식별된다.
일부 구현예에서, Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드는 생물학적 활성 분자, 예를 들어, 본원에 기술된 적어도 하나 이상의 활성을 갖는 Cas9 분자를 제공하기에 충분한 추가 Cas9 분자 서열과 함께 영역 1 내지 5를 포함한다. 일부 구현예에서, 영역 1 내지 6의 각각은 독립적으로 본원에 기술된, 예를 들어, 서열 번호: 112-117에 제시된 Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드 또는 문헌[WO2015/161276, 예를 들어, 그 안의 도 2A-2G 또는 도 7A-7B]에 개시된 서열의 상응하는 잔기와 50%, 60%, 70%, 또는 80% 상동성을 갖는다.
일부 구현예에서, Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드, 예를 들어, eaCas9 분자 또는 eaCas9 폴리펩타이드는 스트렙토코쿠스 피오게네스(S. pyogenes)의 Cas9의 아미노산 서열의 아미노산 1-180(넘버링은 문헌[WO 2015/161276의 도 2A-2G]의 모티프 서열에 따르고; 문헌[WO 2015/161276의 도 2A-2G]의 4개의 Cas9 서열 내 잔기의 52%는 보존됨)과 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 상동성을 갖는, 영역 1로 지칭되는 아미노산 서열을 포함하거나; 스트렙토코쿠스 피오게네스(S. pyogenes), 스트렙토코쿠스 테르모필루스(S. thermophilus), 스트렙토코쿠스 뮤탄스(S. mutans) 또는 리스테리아 이노쿠아(L. innocua)의 Cas9의 아미노산 서열의 아미노산 1-180과 적어도 1, 2, 5, 10 또는 20개 이상 하지만 90, 80, 70, 60, 50, 40 또는 30개 이내의 아미노산이 상이하거나; 또는 스트렙토코쿠스 피오게네스(S. pyogenes), 스트렙토코쿠스 테르모필루스(S. thermophilus), 스트렙토코쿠스 뮤탄스(S. mutans) 또는 리스테리아 이노쿠아(L. innocua)의 Cas9의 아미노산 서열의 1-180과 동일하다.
일부 구현예에서, Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드, 예를 들어, eaCas9 분자 또는 eaCas9 폴리펩타이드는 스트렙토코쿠스 피오게네스(S. pyogenes), 스트렙토코쿠스 테르모필루스(S. thermophilus), 스트렙토코쿠스 뮤탄스(S. mutans) 또는 리스테리아 이노쿠아(L. innocua)의 Cas9의 아미노산 서열의 아미노산 120-180(문헌[WO 2015/161276의 도 2A-2G]의 4개의 Cas9 서열 내 잔기의 55%는 보존됨)과 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 상동성을 갖는, 영역 1’로 지칭되는 아미노산 서열을 포함하거나; 스트렙토코쿠스 피오게네스(S. pyogenes), 스트렙토코쿠스 테르모필루스(S. thermophilus), 스트렙토코쿠스 뮤탄스(S. mutans) 또는 리스테리아 이노쿠아(L. innocua)의 Cas9의 아미노산 서열의 아미노산 120-180과 적어도 1, 2, 또는 5개 이상 하지만 35, 30, 25, 20, 또는 10개 이내의 아미노산이 상이하거나; 또는 스트렙토코쿠스 피오게네스(S. pyogenes), 스트렙토코쿠스 테르모필루스(S. thermophilus), 스트렙토코쿠스 뮤탄스(S. mutans) 또는 리스테리아 이노쿠아(L. innocua)의 Cas9의 아미노산 서열의 120-180과 동일하다.
일부 구현예에서, Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드, 예를 들어, eaCas9 분자 또는 eaCas9 폴리펩타이드는 스트렙토코쿠스 피오게네스(S. pyogenes), 스트렙토코쿠스 테르모필루스(S. thermophilus), 스트렙토코쿠스 뮤탄스(S. mutans) 또는 리스테리아 이노쿠아(L. innocua)의 Cas9의 아미노산 서열의 아미노산 360-480(문헌[WO 2015/161276의 도 2A-2G]의 4개의 Cas9 서열 내 잔기의 52%는 보존됨)과 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 상동성을 갖는, 영역 2로 지칭되는 아미노산 서열을 포함하거나; 스트렙토코쿠스 피오게네스(S. pyogenes), 스트렙토코쿠스 테르모필루스(S. thermophilus), 스트렙토코쿠스 뮤탄스(S. mutans) 또는 리스테리아 이노쿠아(L. innocua)의 Cas9의 아미노산 서열의 아미노산 360-480과 적어도 1, 2, 또는 5개 이상 하지만 35, 30, 25, 20, 또는 10개 이내의 아미노산이 상이하거나; 또는 스트렙토코쿠스 피오게네스(S. pyogenes), 스트렙토코쿠스 테르모필루스(S. thermophilus), 스트렙토코쿠스 뮤탄스(S. mutans) 또는 리스테리아 이노쿠아(L. innocua)의 Cas9의 아미노산 서열의 360-480과 동일하다.
일부 구현예에서, Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드, 예를 들어, eaCas9 분자 또는 eaCas9 폴리펩타이드는 스트렙토코쿠스 피오게네스(S. pyogenes), 스트렙토코쿠스 테르모필루스(S. thermophilus), 스트렙토코쿠스 뮤탄스(S. mutans) 또는 리스테리아 이노쿠아(L. innocua)의 Cas9의 아미노산 서열의 아미노산 660-720(문헌[WO 2015/161276의 도 2A-2G]의 4개의 Cas9 서열 내 잔기의 56%는 보존됨)과 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 상동성을 갖는, 영역 3으로 지칭되는 아미노산 서열을 포함하거나; 스트렙토코쿠스 피오게네스(S. pyogenes), 스트렙토코쿠스 테르모필루스(S. thermophilus), 스트렙토코쿠스 뮤탄스(S. mutans) 또는 리스테리아 이노쿠아(L. innocua)의 Cas9의 아미노산 서열의 아미노산 660-720과 적어도 1, 2, 또는 5개 이상 하지만 35, 30, 25, 20, 또는 10개 이내의 아미노산이 상이하거나; 또는 스트렙토코쿠스 피오게네스(S. pyogenes), 스트렙토코쿠스 테르모필루스(S. thermophilus), 스트렙토코쿠스 뮤탄스(S. mutans) 또는 리스테리아 이노쿠아(L. innocua)의 Cas9의 아미노산 서열의 660-720과 동일하다.
일부 구현예에서, Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드, 예를 들어, eaCas9 분자 또는 eaCas9 폴리펩타이드는 스트렙토코쿠스 피오게네스(S. pyogenes), 스트렙토코쿠스 테르모필루스(S. thermophilus), 스트렙토코쿠스 뮤탄스(S. mutans) 또는 리스테리아 이노쿠아(L. innocua)의 Cas9의 아미노산 서열의 아미노산 817-900(문헌[WO 2015/161276의 도 2A-2G]의 4개의 Cas9 서열 내 잔기의 55%는 보존됨)과 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 상동성을 갖는, 영역 4로 지칭되는 아미노산 서열을 포함하거나; 스트렙토코쿠스 피오게네스(S. pyogenes), 스트렙토코쿠스 테르모필루스(S. thermophilus), 스트렙토코쿠스 뮤탄스(S. mutans) 또는 리스테리아 이노쿠아(L. innocua)의 Cas9의 아미노산 서열의 아미노산 817-900과 적어도 1, 2, 또는 5개 이상 하지만 35, 30, 25, 20, 또는 10개 이내의 아미노산이 상이하거나; 또는 스트렙토코쿠스 피오게네스(S. pyogenes), 스트렙토코쿠스 테르모필루스(S. thermophilus), 스트렙토코쿠스 뮤탄스(S. mutans) 또는 리스테리아 이노쿠아(L. innocua)의 Cas9의 아미노산 서열의 817-900과 동일하다.
일부 구현예에서, Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드, 예를 들어, eaCas9 분자 또는 eaCas9 폴리펩타이드는 스트렙토코쿠스 피오게네스(S. pyogenes), 스트렙토코쿠스 테르모필루스(S. thermophilus), 스트렙토코쿠스 뮤탄스(S. mutans) 또는 리스테리아 이노쿠아(L. innocua)의 Cas9의 아미노산 서열의 아미노산 900-960(문헌[WO 2015/161276의 도 2A-2G]의 4개의 Cas9 서열 내 잔기의 60%는 보존됨)과 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 상동성을 갖는, 영역 5로 지칭되는 아미노산 서열을 포함하거나; 스트렙토코쿠스 피오게네스(S. pyogenes), 스트렙토코쿠스 테르모필루스(S. thermophilus), 스트렙토코쿠스 뮤탄스(S. mutans) 또는 리스테리아 이노쿠아(L. innocua)의 Cas9의 아미노산 서열의 아미노산 900-960과 적어도 1, 2, 또는 5개 이상 하지만 35, 30, 25, 20, 또는 10개 이내의 아미노산이 상이하거나; 또는 스트렙토코쿠스 피오게네스(S. pyogenes), 스트렙토코쿠스 테르모필루스(S. thermophilus), 스트렙토코쿠스 뮤탄스(S. mutans) 또는 리스테리아 이노쿠아(L. innocua)의 Cas9의 아미노산 서열의 900-960과 동일하다.
(h) 조작된 또는 변경된 Cas9 분자 및 Cas9 폴리펩타이드
본원에 기술된 Cas9 분자 및 Cas9 폴리펩타이드, 예를 들어 천연 발생 Cas9 분자는: 니카제 활성, 뉴클레아제 활성(예를 들어, 엔도뉴클레아제 및/또는 엑소뉴클레아제 활성); 나선효소 활성; gRNA 분자와 기능적으로 결합하는 능력; 및 핵산의 부위를 표적화(또는 이곳에 국소화)하는 능력(예: PAM 인식 및 특이성)을 포함한 다수의 특성 중 임의의 것을 보유할 수 있다. 일부 구현예에서, Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드는 이 특성들의 전부 또는 서브세트를 포함할 수 있다. 통상적인 구현예에서, Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드는 gRNA 분자와 상호작용하고 그 gRNA 분자와 협력하여 핵산의 부위에 국소화하는 능력을 갖는다. 다른 활성들(예를 들어, PAM 특이성, 절단 활성, 또는 나선효소 활성)은 Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드에서 더 광범위하게 다양할 수 있다.
Cas9 분자에는 조작된 Cas9 분자 및 조작된 Cas9 폴리펩타이드가 포함된다(이 맥락에서 사용된 “조작된”은 단지 Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드가 기준 서열과 다르다는 것을 의미하며, 공정 또는 기원 제한을 암시하지 않는다). 조작된 Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드는 변경된 효소 특성, 예를 들어 변경된 뉴클레아제 활성(자연 발생 또는 다른 기준 Cas9 분자와 비교하여) 또는 변경된 나선효소 활성을 포함할 수 있다. 본원에서 논의될 때, 조작된 Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드는 (이중 가닥 뉴클레아제 활성과 대조되는) 니카제 활성을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 조작된 Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드는, 하나 이상 또는 임의의 Cas9 활성에 대한 유의미한 영향 없이, 크기를 변경하는 변경, 예를 들어, 크기를 감소시키는 아미노산 서열의 결실을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 조작된 Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드는 PAM 인식에 영향을 주는 변경을 포함할 수 있다. 예를 들어, 조작된 Cas9 분자는 내인성 야생형 PI 도메인에 의해 인식되는 것 이외의 PAM 서열을 인식하도록 변경될 수 있다. 일부 구현예에서, Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드는 자연 발생 Cas9 분자와 서열은 다르지만 하나 이상의 Cas9 활성에는 유의미한 변경을 가지지 않을 수 있다.
원하는 특성을 갖는 Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드는 다양한 방식으로, 예를 들어 모체, 예를 들어 자연 발생 Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드의 변경에 의해 원하는 특성을 갖는 변경된 Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드를 제공하도록 제조될 수 있다. 예를 들어, 모체 Cas9 분자, 예를 들어 자연 발생 또는 조작된 Cas9 분자에 관하여 하나 이상의 돌연변이 또는 차이가 도입될 수 있다. 이러한 돌연변이 및 차이는 치환(예를 들어, 보존적 치환 또는 비필수 아미노산의 치환); 삽입; 또는 결실을 포함한다. 일부 구현예에서, Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드는 하나 이상의 돌연변이 또는 차이, 예를 들어, 기준(예를 들어, 모체) Cas9 분자에 관하여 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 30, 40 또는 50개 이상 돌연변이 하지만 200, 100 또는 80개 미만 돌연변이를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 돌연변이 또는 돌연변이들은 Cas9 활성, 예를 들어 본원에 기술된 Cas9 활성에 실질적인 영향을 미치지 않는다. 일부 구현예에서, 돌연변이 또는 돌연변이들은 Cas9 활성, 예를 들어 본원에 기술된 Cas9 활성에 실질적인 영향을 미친다.
(i) 비-절단 및 변형된-절단 Cas9 분자 및 Cas9 폴리펩타이드
일부 구현예에서, Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드는 자연 발생 Cas9 분자와 상이한, 예를 들어, 가장 가까운 상동성을 가진 자연 발생 Cas9 분자와 상이한 절단 특성을 포함한다. 예를 들어, Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드는 자연 발생 Cas9 분자, 예를 들어, 스트렙토코쿠스 피오게네스(S. pyogenes)의 Cas9 분자와 다음과 같이 상이할 수 있는데: 예를 들어, 자연 발생 Cas9 분자(예를 들어, 스트렙토코쿠스 피오게네스의 Cas9 분자)와 비교하여, 이의 이중 가닥 핵산의 절단을 조절하는(예를 들어, 감소 또는 증가) 능력(엔도뉴클레아제 및/또는 엑소뉴클레아제 활성); 예를 들어, 자연 발생 Cas9 분자(예를 들어, 스트렙토코쿠스 피오게네스의 Cas9 분자)와 비교하여, 이의 핵산의 단일 가닥, 예를 들어, 핵산 분자의 비상보적 가닥 또는 핵산 분자의 상보적 가닥의 절단을 조절하는(예를 들어, 감소 또는 증가) 능력(니카제 활성); 또는 핵산 분자, 예를 들어, 이중 가닥 또는 단일 가닥 핵산 분자를 절단하는 능력은 제거될 수 있다.
(j) 변형된 절단 eaCas9 분자 및 eaCas9 폴리펩타이드
일부 구현예에서, eaCas9 분자 또는 eaCas9 폴리펩타이드는 다음 활성들: N-말단 RuvC 유사 도메인과 관련된 절단 활성; HNH 유사 도메인과 관련된 절단 활성; HNH 유사 도메인과 관련된 절단 활성과 N-말단 RuvC 유사 도메인과 관련된 절단 활성 중 하나 이상을 포함한다.
일부 구현예에서, eaCas9 분자 또는 eaCas9 폴리펩타이드는 활성 또는 절단 가능한 HNH 유사 도메인 및 활성 또는 절단 가능한 N-말단 RuvC 유사 도메인을 포함한다. 예시적인 비활성 또는 절단 불가능한 N-말단 RuvC 유사 도메인은 N-말단 RuvC 유사 도메인에 아스파르트산, 예를 들어, 서열 번호: 112-117의 공통 서열 또는 문헌[WO2015/161276, 예를 들어, 그 안의 도 2A-2G]에 개시된 공통 서열의 위치 9의 아스파르트산 또는 서열 번호 117의 위치 10의 아스파르트산의 돌연변이를 가질 수 있으며, 예를 들어 알라닌으로 치환될 수 있다. 일부 구현예에서, eaCas9 분자 또는 eaCas9 폴리펩타이드는 N-말단 RuvC 유사 도메인 내 야생형과 상이하고 표적 핵산을 절단하지 않거나, 또는 예를 들어, 본원에 기술된 분석법으로 측정했을 때 상당히 적은 효율로, 예를 들어 기준 Cas9 분자의 절단 활성의 20, 10, 5, 1 또는 0.1% 미만의 효율로 절단한다. 기준 Cas9 분자는 자연 발생 비변형 Cas9 분자, 예를 들어, 스트렙토코쿠스 피오게네스(S. pyogenes) 또는 스트렙토코쿠스 테르모필루스(S. thermophilus)의 Cas9 분자와 같은 자연 발생 Cas9 분자일 수 있다. 일부 구현예에서, 기준 Cas9 분자는 가장 가까운 서열 동일성 또는 상동성을 가진 자연 발생 Cas9 분자이다.
일부 구현예에서, eaCas9 분자 또는 eaCas9 폴리펩타이드는 비활성 또는 절단 불가능한 HNH 도메인 및 활성 또는 절단 가능한 N-말단 RuvC 유사 도메인을 포함한다. 예시적인 비활성 또는 절단 불가능한 HNH 유사 도메인은 HNH 유사 도메인 내 히스티딘, 예를 들어, 서열 번호: 112-117의 공통 서열 또는 문헌[WO2015/161276, 예를 들어, 그 안의 도 2A-2G]에 개시된 공통 서열의 위치 856에 보이는 히스티딘의 하나 이상에 돌연변이를 가질 수 있으며, 예를 들어 알라닌으로 치환될 수 있고; HNH 유사 도메인 내 하나 이상의 아스파라긴, 예를 들어, 서열 번호: 112-117의 공통 서열 또는 문헌[WO2015/161276, 예를 들어, 그 안의 도 2A-2G]에 개시된 공통 서열의 위치 870 및/또는 서열 번호: 112-117의 공통 서열 또는 문헌[WO2015/161276, 예를 들어, 그 안의 도 2A-2G]에 개시된 공통 서열의 위치 879에 보이는 아스파라긴은, 예를 들어, 알라닌으로 치환될 수 있다. 일부 구현예에서, eaCas9는 HNH 유사 도메인 내 야생형과 상이하고 표적 핵산을 절단하지 않거나, 또는 예를 들어, 본원에 기술된 분석법으로 측정했을 때 상당히 적은 효율로, 예를 들어 기준 Cas9 분자의 절단 활성의 20, 10, 5, 1 또는 0.1% 미만의 효율로 절단한다. 기준 Cas9 분자는 자연 발생 비변형 Cas9 분자, 예를 들어, 스트렙토코쿠스 피오게네스(S. pyogenes) 또는 스트렙토코쿠스 테르모필루스(S. thermophilus)의 Cas9 분자와 같은 자연 발생 Cas9 분자일 수 있다. 일부 구현예에서, 기준 Cas9 분자는 가장 가까운 서열 동일성 또는 상동성을 가진 자연 발생 Cas9 분자이다.
일부 구현예에서, eaCas9 분자 또는 eaCas9 폴리펩타이드는 비활성 또는 절단 불가능한 HNH 도메인 및 활성 또는 절단 가능한 N-말단 RuvC 유사 도메인을 포함한다. 예시적인 비활성 또는 절단 불가능한 HNH 유사 도메인은 HNH 유사 도메인 내 히스티딘, 예를 들어, 서열 번호: 112-117의 공통 서열 또는 문헌[WO2015/161276, 예를 들어, 그 안의 도 2A-2G]에 개시된 공통 서열의 위치 856에 보이는 히스티딘의 하나 이상에 돌연변이를 가질 수 있으며, 예를 들어 알라닌으로 치환될 수 있고; HNH 유사 도메인 내 하나 이상의 아스파라긴, 예를 들어, 서열 번호: 112-117의 공통 서열 또는 문헌[WO2015/161276, 예를 들어, 그 안의 도 2A-2G]에 개시된 공통 서열의 위치 870 및/또는 서열 번호: 112-117의 공통 서열 또는 문헌[WO2015/161276, 예를 들어, 그 안의 도 2A-2G]에 개시된 공통 서열의 위치 879에 보이는 아스파라긴은, 예를 들어, 알라닌으로 치환될 수 있다. 일부 구현예에서, eaCas9는 HNH 유사 도메인 내 야생형과 상이하고 표적 핵산을 절단하지 않거나, 또는 예를 들어, 본원에 기술된 분석법으로 측정했을 때 상당히 적은 효율로, 예를 들어 기준 Cas9 분자의 절단 활성의 20, 10, 5, 1 또는 0.1% 미만의 효율로 절단한다. 기준 Cas9 분자는 자연 발생 비변형 Cas9 분자, 예를 들어, 스트렙토코쿠스 피오게네스(S. pyogenes) 또는 스트렙토코쿠스 테르모필루스(S. thermophilus)의 Cas9 분자와 같은 자연 발생 Cas9 분자일 수 있다. 일부 구현예에서, 기준 Cas9 분자는 가장 가까운 서열 동일성 또는 상동성을 가진 자연 발생 Cas9 분자이다.
(k) 표적 핵산의 하나 또는 두 가닥 모두를 절단하는 능력의 변경
일부 구현예에서, 예시적인 Cas9 활성은 PAM 특이성, 절단 활성, 및 나선효소 활성 중 하나 이상을 포함한다. 돌연변이(들)가 예를 들어, 하나 이상의 RuvC 유사 도메인, 예를 들어 N-말단 RuvC 유사 도메인; HNH 유사 도메인; RuvC 유사 도메인 및 HNH 유사 도메인 밖의 영역;에 존재할 수 있다. 일부 구현예에서, 돌연변이(들)가 RuvC 유사 도메인, 예를 들어 N-말단 RuvC 유사 도메인에 존재한다. 일부 구현예에서, 돌연변이(들)가 HNH 유사 도메인에 존재한다. 일부 구현예에서, 돌연변이들이 RuvC 유사 도메인, 예를 들어, N-말단 RuvC 유사 도메인, 및 HNH 유사 도메인 둘 모두에 존재한다.
스트렙토코쿠스 피오게네스(S. pyogenes) 서열과 관련하여 RuvC 도메인 또는 HNH 도메인에서 만들어질 수 있는 예시적인 돌연변이에는 D10A, E762A, H840A, N854A, N863A 및/또는 D986A가 포함된다.
일부 구현예에서, Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드는 기준 Cas9 분자와 비교하여 RuvC 도메인 및/또는 HNH 도메인에 하나 이상의 차이를 포함하는 eiCas9 분자 또는 eiCas9 폴리펩타이드이고, 이 eiCas9 분자 또는 eiCas9 폴리펩타이드는 핵산을 절단하지 않거나, 또는 예를 들어 본원에 기술된 절단 분석법의 야생형과 비교할 때, 야생형보다 상당히 적은 효율로 절단하고, 본원에 기술된 분석법에 의해 측정했을 때 기준 Cas9 분자의 50, 25, 10 또는 1% 미만의 효율로 절단한다.
특정 서열, 예를 들어 치환이 표적화 활성, 절단 활성 등과 같은 하나 이상의 활성에 영향을 줄 수 있는지 여부는 예를 들어 돌연변이가 보존적인지 평가하여 평가 또는 예상할 수 있다. 일부 구현예에서, “비필수” 아미노산 잔기는, Cas9 분자의 맥락에서 사용될 때, Cas9 분자, 예를 들어, 자연 발생 Cas9 분자, 예를 들어, eaCas9 분자의 야생형 서열로부터, Cas9 활성(예를 들어, 절단 활성)을 파괴하지 않고 또는 더 바람직하게는 실질적으로 변경하지 않고, 변경될 수 있는 잔기이며, 반면 “필수” 아미노산 잔기를 변경하면 활성(예를 들어, 절단 활성)의 실질적인 손실을 초래한다.
일부 구현예에서, Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드는 자연 발생 Cas9 분자와 상이한, 예를 들어, 가장 가까운 상동성을 가진 자연 발생 Cas9 분자와 상이한 절단 특성을 포함한다. 예를 들어, Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드는 자연 발생 Cas9 분자, 예를 들어, 스타필로코쿠스 아우레우스(S. aureus), 스트렙토코쿠스 피오게네스(S. pyogenes), 또는 캄필로박터 제주니(C. jejuni)의 Cas9 분자와 다음과 같이 상이할 수 있는데: 예를 들어, 자연 발생 Cas9 분자(예를 들어, 스타필로코쿠스 아우레우스, 스트렙토코쿠스 피오게네스, 또는 캄필로박터 제주니(C. jejuni)의 Cas9 분자)와 비교하여, 이의 이중 가닥 절단의 절단을 조절하는(예를 들어, 감소 또는 증가) 능력(엔도뉴클레아제 및/또는 엑소뉴클레아제 활성); 예를 들어, 자연 발생 Cas9 분자(예를 들어, 스타필로코쿠스 아우레우스, 스트렙토코쿠스 피오게네스, 또는 캄필로박터 제주니의 Cas9 분자)와 비교하여, 이의 핵산의 단일 가닥, 예를 들어, 핵산 분자의 비상보적 가닥 또는 핵산 분자의 상보적 가닥의 절단을 조절하는(예를 들어, 감소 또는 증가) 능력(니카제 활성); 또는 핵산 분자, 예를 들어, 이중 가닥 또는 단일 가닥 핵산 분자를 절단하는 능력은 제거될 수 있다.
일부 구현예에서, 변경된 Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드는 다음 활성들: RuvC 도메인과 관련된 절단 활성; HNH 유사 도메인과 관련된 절단 활성; HNH 도메인과 관련된 절단 활성과 RuvC 도메인과 관련된 절단 활성 중 하나 이상을 포함하는 eaCas9 분자 또는 eaCas9 폴리펩타이드이다.
일부 구현예에서, 변경된 Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드는, 핵산 분자(이중 가닥 또는 단일 가닥 해산 분자)를 절단하지 않거나 또는 핵산 분자를, 예를 들어, 본원에 기술된 분석법으로 측정했을 때, 상당히 적은 효율로, 예를 들어 기준 Cas9 분자의 절단 활성의 20, 10, 5, 1 또는 0.1% 미만의 효율로 절단하는, eiCas9 분자 또는 eaCas9 폴리펩타이드이다. 기준 Cas9 분자는 자연 발생 비변형 Cas9 분자, 예를 들어, 스트렙토코쿠스 피오게네스(S. pyogenes), 스트렙토코쿠스 테르모필루스(S. thermophilus), 스타필로코쿠스 아우레우스(S. aureus), 캄필로박터 제주니(C. jejuni) 또는 나이세리아 메닝기티디스(N. meningitidis)의 Cas9 분자와 같은 자연 발생 Cas9 분자일 수 있다. 일부 구현예에서, 기준 Cas9 분자는 가장 가까운 서열 동일성 또는 상동성을 가진 자연 발생 Cas9 분자이다. 일부 구현예에서, eiCas9 분자 또는 eiCas9 폴리펩타이드는 RuvC 도메인과 관련된 절단 활성 및 HNH 도메인과 관련된 절단 활성이 실질적으로 결여되어 있다.
일부 구현예에서, 변경된 Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드는 문헌[WO2015/161276, 예를 들어, 그 안의 도 2A-2G]에 개시된 공통 서열에 도시된 스트렙토코쿠스 피오게네스(S. pyogenes)의 고정된 아미노산 잔기들을 포함하는 eaCas9 분자 또는 eaCas9 폴리펩타이드이고, 그리고 스트렙토코쿠스 피오게네스의 아미노산 서열과 서열 번호: 117의 하나 이상의 잔기(예를 들어, 2, 3, 5, 10, 15, 20, 30, 50, 70, 80, 90, 100, 또는 200개 아미노산 잔기) 또는 문헌[WO2015/161276, 예를 들어, 그 안의 도 2A-2G]에 개시된 공통 서열에 “-”로 표시된 잔기에서 상이한 하나 이상의 아미노산을 가진다.
일부 구현예에서, 변경된 Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드는: 문헌[WO2015/161276의 도 2A-2G]에 개시된 공통 서열의 고정된 서열에 해당하는 서열이 문헌[WO2015/161276의 도 2A-2G]에 개시된 공통 서열 내 고정된 잔기들의 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 또는 20% 이내에서 상이하고; 문헌[WO2015/161276의 도 2A-2G]에 개시된 공통 서열에서 “*”로 식별된 잔기들에 해당하는 서열이 자연 발생 Cas9 분자(예를 들어, 스트렙토코쿠스 피오게네스 Cas9 분자)의 해당 서열과 “*” 잔기들의 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 또는 40% 이내에서 상이하고; 그리고 문헌[WO2015/161276의 도 2A-2G]에 개시된 공통 서열에서 “-”로 식별된 잔기들에 해당하는 서열이 자연 발생 Cas9 분자(예를 들어, 스트렙토코쿠스 피오게네스 Cas9 분자)의 해당 서열과 “-” 잔기들의 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 55, 또는 60% 이내에서 상이한, 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 변경된 Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드는 문헌[WO2015/161276, 예를 들어, 그 안의 도 2A-2G]에 개시된 공통 서열에 도시된 스트렙토코쿠스 테르모필루스(S. thermophilus)의 고정된 아미노산 잔기들을 포함하는 eaCas9 분자 또는 eaCas9 폴리펩타이드이고, 그리고 스트렙토코쿠스 테르모필루스의 아미노산 서열과 문헌[WO2015/161276의 도 2A-2G]에 개시된 공통 서열에 “-”로 표시된 하나 이상의 잔기(예를 들어, 2, 3, 5, 10, 15, 20, 30, 50, 70, 80, 90, 100, 또는 200개 아미노산 잔기)에서 상이한 하나 이상의 아미노산을 가진다.
일부 구현예에서, 변경된 Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드는: 문헌[WO2015/161276의 도 2A-2G]에 개시된 공통 서열의 고정된 서열에 해당하는 서열이 문헌[WO2015/161276의 도 2A-2G]에 개시된 공통 서열 내 고정된 잔기들의 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 또는 20% 이내에서 상이하고; 문헌[WO2015/161276의 도 2A-2G]에 개시된 공통 서열에서 “*”로 식별된 잔기들에 해당하는 서열이 자연 발생 Cas9 분자(예를 들어, 스트렙토코쿠스 테르모필루스 Cas9 분자)의 해당 서열과 “*” 잔기들의 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 또는 40% 이내에서 상이하고; 그리고 문헌[WO2015/161276의 도 2A-2G]에 개시된 공통 서열에서 “-”로 식별된 잔기들에 해당하는 서열이 자연 발생 Cas9 분자(예를 들어, 스트렙토코쿠스 테르모필루스 Cas9 분자)의 해당 서열과 “-” 잔기들의 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 55, 또는 60% 이내에서 상이한, 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 변경된 Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드는 문헌[WO2015/161276, 예를 들어, 그 안의 도 2A-2G]에 개시된 공통 서열에 도시된 스트렙토코쿠스 뮤탄스(S. mutans)의 고정된 아미노산 잔기들을 포함하는 eaCas9 분자 또는 eaCas9 폴리펩타이드이고, 그리고 스트렙토코쿠스 뮤탄스의 아미노산 서열과 문헌[WO2015/161276의 도 2A-2G]에 개시된 공통 서열에 “-”로 표시된 하나 이상의 잔기(예를 들어, 2, 3, 5, 10, 15, 20, 30, 50, 70, 80, 90, 100, 또는 200개 아미노산 잔기)에서 상이한 하나 이상의 아미노산을 가진다.
일부 구현예에서, 변경된 Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드는: 문헌[WO2015/161276의 도 2A-2G]에 개시된 공통 서열의 고정된 서열에 해당하는 서열이 문헌[WO2015/161276의 도 2A-2G]에 개시된 공통 서열 내 고정된 잔기들의 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 또는 20% 이내에서 상이하고; 문헌[WO2015/161276의 도 2A-2G]에 개시된 공통 서열에서 “*”로 식별된 잔기들에 해당하는 서열이 자연 발생 Cas9 분자(예를 들어, 스트렙토코쿠스 뮤탄스(S. mutans) Cas9 분자)의 해당 서열과 “*” 잔기들의 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 또는 40% 이내에서 상이하고; 그리고 문헌[WO2015/161276의 도 2A-2G]에 개시된 공통 서열에서 “-”로 식별된 잔기들에 해당하는 서열이 자연 발생 Cas9 분자(예를 들어, 스트렙토코쿠스 뮤탄스 Cas9 분자)의 해당 서열과 “-” 잔기들의 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 55, 또는 60% 이내에서 상이한, 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 변경된 Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드는 문헌[WO2015/161276, 예를 들어, 그 안의 도 2A-2G]에 개시된 공통 서열에 도시된 리스테리아 이노쿨라(L. innocula)의 고정된 아미노산 잔기들을 포함하는 eaCas9 분자 또는 eaCas9 폴리펩타이드이고, 그리고 리스테리아 이노쿨라의 아미노산 서열과 문헌[WO2015/161276의 도 2A-2G]에 개시된 공통 서열에 “-”로 표시된 하나 이상의 잔기(예를 들어, 2, 3, 5, 10, 15, 20, 30, 50, 70, 80, 90, 100, 또는 200개 아미노산 잔기)에서 상이한 하나 이상의 아미노산을 가진다. 일부 구현예에서, 변경된 Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드는: 문헌[WO2015/161276의 도 2A-2G]에 개시된 공통 서열의 고정된 서열에 해당하는 서열이 문헌[WO2015/161276의 도 2A-2G]에 개시된 공통 서열 내 고정된 잔기들의 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 또는 20% 이내에서 상이하고; 문헌[WO2015/161276의 도 2A-2G]에 개시된 공통 서열에서 “*”로 식별된 잔기들에 해당하는 서열이 자연 발생 Cas9 분자(예를 들어, 리스테리아 이노쿨라(L. innocula) Cas9 분자)의 해당 서열과 “*” 잔기들의 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 또는 40% 이내에서 상이하고; 그리고 문헌[WO2015/161276의 도 2A-2G]에 개시된 공통 서열에서 “-”로 식별된 잔기들에 해당하는 서열이 자연 발생 Cas9 분자(예를 들어, 리스테리아 이노쿨라 Cas9 분자)의 해당 서열과 “-” 잔기들의 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 55, 또는 60% 이내에서 상이한, 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 변경된 Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드, 예를 들어, eaCas9 분자는 예를 들어 2개 이상의 상이한 Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드의, 예를 들어 상이한 종의 2개 이상의 자연 발생 Cas9 분자의 융합물일 수 있다. 예를 들어, 한 종의 자연 발생 Cas9 분자의 단편이 제2 종의 Cas9 분자의 단편에 융합될 수 있다. 예로서, N-말단 RuvC 유사 도메인을 포함하는 스트렙토코쿠스 피오게네스의 Cas9 분자의 단편은 HNH 유사 도메인을 포함하는 스트렙토코쿠스 피오게네스 이외 종(예를 들어, 스트렙토코쿠스 테르모필루스)의 Cas9 분자의 단편에 융합될 수 있다.
(l) 변경된 PAM 인식이 있거나 PAM 인식이 없는 Cas9 분자
자연 발생 Cas9 분자는 특정 PAM 서열, 예를 들어 스트렙토코쿠스 피오게네스, 스트렙토코쿠스 테르모필루스, 스트렙토코쿠스 뮤탄스, 스타필로코쿠스 아우레우스 및 나이세리아 메닝기티디스에 대해 본원에 기술된 PAM 인식 서열을 인식할 수 있다.
일부 구현예에서, Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드는 자연 발생 Cas9 분자로서 동일한 PAM 특이성을 갖는다. 다른 구현예에서, Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드는 자연 발생 Cas9 분자와 관련되지 않은 PAM 특이성, 또는 가장 가까운 서열 상동성을 갖는 자연 발생 Cas9 분자와 관련되지 않은 PAM 특이성을 갖는다. 예를 들어, 자연 발생 Cas9 분자는, 예를 들어 PAM 인식이 변경되도록, 예를 들어 Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드가 인식하는 PAM 서열을 변경하여 표적외 부위를 감소시키고/거나 특이성을 향상시키거나, 또는 PAM 인식 요건을 없애도록 변경될 수 있다. 일부 구현예에서, Cas9 분자는 예를 들어 PAM 인식 서열의 길이를 증가시키고/거나 높은 수준의 동일성에 대한 Cas9 특이성을 향상시키도록, 예를 들어, 표적외 부위를 감소시키고 특이성을 증가시키도록 변경될 수 있다. 일부 구현예에서, PAM 인식 서열의 길이는 적어도 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 15개 아미노산 길이이다.
상이한 PAM 서열을 인식하고/거나 감소된 표적외 활성을 갖는 Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드가 유도 진화(directed evolution)를 이용하여 생성될 수 있다. Cas9 분자의 유도 진화에 사용될 수 있는 예시적인 방법 및 시스템은 예를 들어 문헌[Esvelt et al. Nature 2011, 472(7344): 499-503]에 기술되어 있다. 후보 Cas9 분자를 예를 들어 본원에 기술된 방법으로 평가할 수 있다.
PAM 인식을 매개하는 PI 도메인의 변경이 여기에서 논의된다.
(m) PI 도메인이 변경된 합성 Cas9 분자 및 Cas9 폴리펩타이드
현재의 게놈 편집 방법은 활용되는 Cas9 분자에 의해 인식되는 PAM 서열에 의해 표적화될 수 있는 표적 서열의 다양성에서 제한된다. 합성 Cas9 분자(또는 Syn-Cas9 분자) 또는 합성 Cas9 폴리펩타이드(또는 Syn-Cas9 폴리펩타이드)라는 말은 여기에서 사용될 때 한 박테리아 종의 Cas9 중심 도메인, 및 기능적으로 변경된 PI 도메인 예를 들어 상이한 박테리아 종의 예를 들어 자연적으로 Cas9 중심 도메인과 관련되는 것 이외의 PI 도메인을 포함하는 Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드를 지칭한다.
일부 구현예에서, 변경된 PI 도메인은 Cas9 중심 도메인이 유래된 자연 발생 Cas9에 의해 인식되는 PAM 서열과 상이한 PAM 서열을 인식한다. 일부 구현예에서, 변경된 PI 도메인은 Cas9 중심 도메인이 유래된 자연 발생 Cas9에 의해 인식되지만 상이한 친화도 또는 특이성을 갖는 동일한 PAM 서열을 인식한다. Syn-Cas9 분자 또는 Syn-Cas9 폴리펩타이드는 각각 Syn-eaCas9 분자 또는 Syn-eaCas9 폴리펩타이드, 또는 Syn-eiCas9 분자 또는 Syn-eiCas9 폴리펩타이드일 수 있다.
예시적인 Syn-Cas9 분자 또는 Syn-Cas9 폴리펩타이드는 a) Cas9 중심 도메인, 예를 들어 Cas9 중심 도메인, 예를 들어 스타필로코쿠스 아우레우스, 스트렙토코쿠스 피오게네스, 또는 캄필로박터 제주니 Cas9 중심 도메인; 및 b) X 종 Cas9 서열 유래의 변경된 PI 도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 변경된 PI 도메인의 RKR 모티프(PAM 결합 모티프)는: Cas9 중심 도메인과 관련된 천연(native) 또는 내인성 PI 도메인의 RKR 모티프의 서열과 비교하여; 1, 2, 또는 3개 아미노산 잔기에 차이; 아미노산 서열에서 제1, 제2, 또는 제3 위치에 차이; 아미노산 서열에서 제1 및 제2 위치, 제1 및 제3 위치, 또는 제2 및 제3 위치에 차이를 포함한다.
일부 구현예에서, Syn-Cas9 분자 또는 Syn-Cas9 폴리펩타이드는 또한 크기가 최적화될 수 있으며, 예를 들어, Syn-Cas9 분자 또는 Syn-Cas9 폴리펩타이드는 하나 이상의 결실, 및 선택적으로 그 결실 옆의 아미노산 잔기들 사이에 하나 이상의 링커를 포함한다. 일부 구현예에서, Syn-Cas9 분자 또는 Syn-Cas9 폴리펩타이드는 REC 결실을 포함한다.
(n) 크기가 최적화된 Cas9 분자 및 Cas9 폴리펩타이드
여기에서 기술되는 조작된 Cas9 분자 및 조작된 Cas9 폴리펩타이드는 원하는 Cas9 특성, 예를 들어, 본질적으로 천연 형태, Cas9 뉴클레아제 활성, 및/또는 표적 핵산 분자 인식을 유지하면서 분자의 크기를 감소시키는 결실을 포함하는 Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드를 포함한다. 제공된 구현예의 맥락에서 사용되는 Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드는 하나 이상의 결실 및 선택적으로 하나 이상의 링커를 포함할 수 있으며, 여기서 링커는 그 결실 옆에 있는 아미노산 잔기들 사이에 배치된다.
결실은 가진 Cas9 분자, 예를 들어 스타필로코쿠스 아우레우스, 스트렙토코쿠스 피오게네스, 또는 캄필로박터 제주니 Cas9 분자는 상응하는 자연 발생 Cas9 분자보다 더 작으며, 예를 들어, 감소된 수의 아미노산을 가진다. Cas9 분자의 더 작은 크기는 전달 방법에 대한 유연성을 증가시켜 게놈 편집의 유용성을 증가시킨다. Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드는 본원에 기술되는 생성되는 Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드의 활성에 실질적으로 영향을 주거나 활성을 실질적으로 감소시키지 않는 하나 이상의 결실을 포함할 수 있다. 본원에 기술된 바와 같은 결실을 포함하는 Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드에 유지되는 활성들은 다음: 니카제 활성, 즉 핵산 분자의 단일 가닥 예를 들어 비-상보적 가닥 또는 상보적 가닥을 절단하는 능력; 이중 가닥 뉴클레아제 활성, 즉 이중 가닥 핵산의 양 가닥을 절단하고 이중 가닥 절단을 만드는 능력, 이는 일부 구현예에서 2개 니카제 활성의 존재임; 엔도뉴클레아제 활성; 엑소뉴클레아제 활성; 나선효소 활성, 즉 이중 가닥 핵산의 나선 구조를 푸는 능력; 및 핵산 분자, 예를 들어 표적 핵산 또는 gRNA의 인식 활성 중 하나 이상을 포함한다.
본원에 기술되는 Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드의 활성은 본원에 기술된 또는 공지된 활성 분석을 사용해 산정될 수 있다.
(o) 결실에 적합한 영역 식별하기
결실에 적합한 Cas9 분자의 영역은 다양한 방법에 의해 식별될 수 있다. 다양한 박테리아 종으로부터 유래된 자연 발생 이종상동성 Cas9 분자를 스트렙토코쿠스 피오게네스(S. pyogenes) Cas9(Nishimasu et al., Cell, 156:935-949, 2014)의 결정 구조에 모델링하여 단백질의 3차원 형태와 관련하여 선택된 Cas9 병렬상동체(ortholog)들 전체의 보존 수준을 조사할 수 있다. Cas9 활성과 관련된 영역, 예를 들어 표적 핵산 분자 및/또는 gRNA와의 계면에서 공간적으로 멀리 떨어진 덜 보존되거나 보존되지 않은 영역은 영역 또는 도메인을 나타내며 Cas9 활성에 실질적으로 영향을 미치거나 활성을 실질적으로 감소시키지 않는 결실을 위한 후보이다.
(p) REC-최적화된 Cas9 분자 및 Cas9 폴리펩타이드
REC-최적화된 Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드라는 말은 여기에서 사용될 때, REC2 도메인 및 RE1CT 도메인 중 하나 또는 둘 모두에 결실을 포함하는 Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드를 지칭하며, 여기서 결실은 동족 도메인 내 아미노산 잔기들의 적어도 10%를 포함한다. REC-최적화된 Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드는 eaCas9 분자 또는 eaCas9 폴리펩타이드, 또는 eiCas9 분자 또는 eiCas9 폴리펩타이드일 수 있다. 예시적인 REC-최적화된 Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드는: a) i) REC2 결실; ii) a REC1CT 결실; 또는 iii) REC1SUB 결실 중에서 선택된 결실을 포함한다.
선택적으로, 링커가 상기 결실 옆에 있는 아미노산 잔기들 사이에 배치된다. 일부 구현예에서, Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드는 하나의 결실만, 또는 두 개의 결실만 포함한다. Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드는 REC2 결실 및 REC1CT 결실을 포함할 수 있다. Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드는 REC2 결실 및 REC1SUB 결실을 포함할 수 있다.
일반적으로, 결실은 동족 도메인에 아미노산의 적어도 10%르 함유할 것이고, 예를 들어, REC2 결실은 REC2 도메인 내 아미노산의 적어도 10%를 포함할 것이다. 결실은 동족 도메인의 아미노산 잔기의 적어도 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 또는 90%; 동족 도메인의 아미노산 잔기의 전부; 동족 도메인 외부의 아미노산 잔기; 동족 도메인 외부의 복수의 아미노산 잔기; 동족 도메인에 아미노산 잔기 즉시 N 말단; 동족 도메인에 아미노산 잔기 즉시 C 말단; 동족 도메인에 아미노산 잔기 즉시 N 말단 및 동족 도메인에 아미노산 잔기 즉시 C 말단; 동족 도메인에 복수의, 예를 들어 최대 5, 10, 15, 또는 20개 아미노산 잔기 N 말단; 동족 도메인에 복수의, 예를 들어 최대 5, 10, 15, 또는 20개 아미노산 잔기 C 말단; 동족 도메인에 복수의, 예를 들어 최대 5, 10, 15, 또는 20개 아미노산 잔기 N 말단 및 동족 도메인에 복수의, 예를 들어 최대 5, 10, 15, 또는 20개 아미노산 잔기 C 말단을 포함한다.
일부 구현예에서, 결실은 동족 도메인; 동족 도메인의 N 말단 아미노산 잔기; 동족 도메인의 C 말단 아미노산 잔기를 넘어 확장되지 않는다.
REC-최적화된 Cas9 분자 또는 REC-최적화된 Cas9 폴리펩타이드는 그 결실 옆의 아미노산 잔기들 사이에 배치된 링커를 포함할 수 있다. REC-최적화된 Cas9 분자에서 REC 결실 옆의 아미노산 잔기들 사이에 사용할 적합한 링커는 본원에서 기술된다.
일부 구현예에서, REC-최적화된 Cas9 분자 또는 REC-최적화된 Cas9 폴리펩타이드는 임의의 REC 결실 및 관련된 링커 외에 자연 발생 Cas9, 예를 들어 스타필로코쿠스 아우레우스 Cas9 분자, 스트렙토코쿠스 피오게네스 Cas9 분자, 또는 캄필로박터 제주니 Cas9 분자의 아미노산 서열과 적어도 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 99 또는 100% 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, REC-최적화된 Cas9 분자 또는 REC-최적화된 Cas9 폴리펩타이드는 임의의 REC 결실 및 관련된 링커 외에 자연 발생 Cas9, 예를 들어 스타필로코쿠스 아우레우스 Cas9 분자, 스트렙토코쿠스 피오게네스 Cas9 분자, 또는 캄필로박터 제주니 Cas9 분자의 아미노산 서열과 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 또는 25개 이내 아미노산 잔기가 상이한 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, REC-최적화된 Cas9 분자 또는 REC-최적화된 Cas9 폴리펩타이드는 임의의 REC 결실 및 관련된 링커 외에 자연 발생 Cas9, 예를 들어 스타필로코쿠스 아우레우스 Cas9 분자, 스트렙토코쿠스 피오게네스 Cas9 분자, 또는 캄필로박터 제주니 Cas9 분자의 아미노산 서열과 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 또는 25% 이내 아미노산 잔기가 상이한 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
서열 비교를 위해, 일반적으로 하나의 서열이 시험 서열이 비교되는 기준 서열 역할을 한다. 서열 비교 알고리즘을 사용할 때, 시험 및 기준 서열을 컴퓨터에 입력하고, 필요에 따라 하위 서열 좌표를 지정하고, 서열 알고리즘 프로그램 매개변수를 지정한다. 기본 프로그램 매개변수를 사용하거나 대체 매개변수를 지정할 수 있다. 그런 후 서열 비교 알고리즘은 프로그램 매개변수에 기초하여 기준 서열 대비 시험 서열의 서열 동일성 백분율을 계산한다. 비교를 위한 서열의 정렬 방법은 잘 알려져 있다. 비교를 위한 서열의 최적 정렬은 예를 들어 [Smith and Waterman, (1970) Adv. Appl. Math. 2:482c]의 국소 상동성 알고리즘에 의해, [Needleman and Wunsch, (1970) J. Mol. Biol. 48:443]의 상동성 정렬 알고리즘에 의해, [Pearson and Lipman, (1988) Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA 85:2444]의 유사성 탐색 방법에 의해, 이러한 알고리즘들을 컴퓨터로 구현하여(GAP, BESTFIT, FASTA, and TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI), 또는 수동 정렬 및 육안 검사에 의해 수행될 수 있다(예를 들어, 문헌[Brent et al., (2003) Current Protocols in Molecular Biology] 참조).
서열 동일성 및 서열 유사성 백분율을 결정하기에 적합한 알고리즘의 두 가지 예는 BLAST 및 BLAST 2.0 알고리즘이며, 이들은 각각 문헌[Altschul et al., (1977) Nuc. Acids Res. 25:3389-3402] 및 문헌[Altschul et al., (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410]에 기술되어 있다. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 국립 생명 공학 정보 센터(National Center for Biotechnology Information)를 통해 공개적으로 사용 가능하다.
두 아미노산 서열 사이의 동일성 백분율은 또한 ALIGN 프로그램(버전 2.0)에 통합된 [E. Meyers and W. Miller, (1988) Comput. Appl. Biosci. 4:11-17]의 알고리즘을 사용하여, PAM120 가중치 잔여표(weight residue table), 갭 길이(gap length) 페널티 12 및 갭 페널티 4를 사용하여 결정될 수 있다. 또한, 두 아미노산 서열 사이의 동일성 백분율은 (www.gcg.com에서 이용 가능한) GCG 소프트웨어 패키지의 GAP 프로그램에 통합된 [Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:444-453] 알고리즘을 사용하여, Blossom 62 행렬 또는 PAM250 행렬, 및 갭 가중치(gap weight) 16, 14, 12, 10, 8, 6, 또는 4 및 길이 가중치(length weight) 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6을 사용하여 결정될 수 있다.
예시적인 REC 결실에 대한 서열 정보는 예를 들어 문헌[국제 PCT 공개 번호 WO2015/161276, WO2017/193107 및 WO2017/093969]에 기술된 83개 자연 발생 Cas9 병렬상동체에 대해 제공된다.
(q) Cas9 분자를 암호화하는 핵산
Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드, 예를 들어 eaCas9 분자 또는 eaCas9 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산은 본원에 제공된 임의의 구현예와 관련하여 사용될 수 있다.
Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드를 암호화하는 예시적인 핵산은 문헌[Cong et al., Science 2013, 399(6121):819-823; Wang et al., Cell 2013, 153(4):910-918; Mali et al., Science 2013, 399(6121):823-826; Jinek et al., Science 2012, 337(6096):816-821, 및 WO2015/161276, 예를 들어 그 안의 도 8]에 기술되어 있다.
일부 구현예에서, Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산은 합성 핵산 서열일 수 있다. 예를 들어, 합성 핵산 분자는 화학적으로 변형될 수 있다. 일부 구현예에서, Cas9 mRNA는 다음 특성들: 캡핑되고, 폴리아데닐화되고, 5-메틸시티딘 및/또는 유사우리딘으로 치환되는 것 중 하나 이상(예를 들어, 모두)을 갖는다.
또한, 또는 대안적으로, 합성 핵산 서열은 코돈 최적화될 수 있으며, 예를 들어, 적어도 하나의 비-공통 코돈 또는 덜-공통적인 코돈이 공통 코돈으로 대체되었다. 예를 들어, 합성 핵산은 예를 들어 본원에 기술된, 예를 들어 포유류 발현 시스템에서 발현에 최적화된, 최적화된 메신저 mRNA의 합성을 지시할 수 있다.
또한, 또는 대안적으로, Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산은 핵 위치 서열(nuclear localization sequence, NLS)을 포함할 수 있다. 핵 위치 서열은 공지되어 있다.
일부 구현예에서, Cas9 분자는 서열 번호: 121, 123 또는 125 중 어느 하나이거나 이를 포함하는 서열 또는 서열 번호: 121, 123 또는 125 중 어느 하나에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 동일성을 나타내는 서열에 의해 암호화된다. 일부 구현예에서, Cas9 분자는 서열 번호: 122, 124 또는 125 중 어느 하나 또는 서열 번호: 122, 123 또는 125 중 어느 하나에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 동일성을 나타내는 서열이거나 이를 포함한다. 서열 번호: 121은 스트렙토코쿠스 피오게네스(S. pyogenes)의 Cas9 분자를 암호화하는 예시적인 코돈 최적화된 핵산 서열이다. 서열 번호: 122는 스트렙토코쿠스 피오게네스 Cas9 분자의 상응하는 아미노산 서열이다. 서열 번호: 123은 나이세리아 메닝기티디스(N. meningitidis)의 Cas9 분자를 암호화하는 예시적인 코돈 최적화된 핵산 서열이다. 서열 번호: 124는 나이세리아 메닝기티디스 Cas9 분자의 상응하는 아미노산 서열이다. 서열 번호: 125는 스타필로코쿠스 아우레우스(S. aureus) Cas9의 Cas9 분자를 암호화하는 예시적인 코돈 최적화된 핵산 서열이다. 서열 번호: 126은 스타필로코쿠스 아우레우스 Cas9 분자의 아미노산 서열이다.
전술한 Cas9 서열 중 임의의 것이 C-말단에서 펩타이드 또는 폴리펩타이드와 융합되는 경우, 정지 코돈이 제거될 것으로 이해된다.
(r) 기타 Cas 분자 및 Cas 폴리펩타이드
다양한 유형의 Cas 분자 또는 Cas 폴리펩타이드를 사용하여 본원에 개시된 발명을 실시할 수 있다. 일부 구현예에서, II형 Cas 시스템의 Cas 분자가 사용된다. 다른 구현예에서, 다른 Cas 시스템의 Cas 분자가 사용된다. 예를 들어, I형 또는 III형 Cas 분자가 사용될 수 있다. 예시적인 Cas 분자(및 Cas 시스템)가 예를 들어 문헌[Haft et al., PLoS Computational Biology 2005, 1(6): e60 및 Makarova et al., Nature Review Microbiology 2011, 9:467-477]에 기술되고, 두 참조문헌의 내용은 본원에 그 전체가 참조로 포함된다. 예시적인 Cas 분자(및 Cas 시스템)이 또한 표 2에 표시된다.
표 2. Cas 시스템
유전자 이름 ‡ 시스템 유형 또는 아형 Haft et al .에 나오는 이름 § 암호화된 단백질(PDB 수탁)의 구조 암호화된 단백질의 과(family)(및 상과) #** 대표적인 것
cas1 * I형
* II형
* III형		 cas1 3GOD, 3LFX 및 2YZS COG1518 SERP2463, SPy1047 및 ygbT
cas2 * I형
* II형
* III형		 cas2 2IVY, 2I8E 및 3EXC COG1343 및 COG3512 SERP2462, SPy1048, SPy1723(N-말단 도메인) 및 ygbF
cas3′ * I형 ‡‡ cas3 NA COG1203 APE1232 및 ygcB
cas3′′ * 아형 I-A
* 아형 I-B		 NA NA COG2254 APE1231 및 BH0336
cas4 * 아형 I-A
* 아형 I-B
* 아형 I-C
* 아형 I-D
* 아형 II-B		 cas4 및 csa1 NA COG1468 APE1239 및 BH0340
cas5 * 아형 I-A
* 아형 I-B
* 아형 I-C
* 아형 I-E		 cas5a, cas5d, cas5e, cas5h, cas5p, cas5t 및 cmx5 3KG4 COG1688 (RAMP) APE1234, BH0337, devS 및 ygcI
cas6 * 아형 I-A
* 아형 I-B
* 아형 I-D
* 아형 III-A* 아형 III-B		 cas6 및 cmx6 3I4H COG1583 및 COG5551 (RAMP) PF1131 및 slr7014
cas6e * 아형 I-E cse3 1WJ9 (RAMP) ygcH
cas6f * 아형 I-F csy4 2XLJ (RAMP) y1727
cas7 * 아형 I-A
* 아형 I-B
* 아형 I-C
* 아형 I-E		 csa2, csd2, cse4, csh2, csp1 및 cst2 NA COG1857 및 COG3649 (RAMP) devR 및 ygcJ
cas8a1 * 아형 I-A ‡‡ cmx1, cst1, csx8, csx13 및 CXXC-CXXC NA BH0338-유사 LA3191§§ 및 PG2018§§
cas8a2 * 아형 I-A ‡‡ csa4 및 csx9 NA PH0918 AF0070, AF1873, MJ0385, PF0637, PH0918 및 SSO1401
cas8b * 아형 I-B ‡‡ csh1 및 TM1802 NA BH0338-유사 MTH1090 및 TM1802
cas8c * 아형 I-C ‡‡ csd1 및 csp2 NA BH0338-유사 BH0338
cas9 * II형 ‡‡ csn1 및 csx12 NA COG3513 FTN_0757 및 SPy1046
cas10 * III형 ‡‡ cmr2, csm1 및 csx11 NA COG1353 MTH326, Rv2823c§§ 및 TM1794§§
cas10d * 아형 I-D ‡‡ csc3 NA COG1353 slr7011
csy1 * 아형 I-F ‡‡ csy1 NA y1724-유사 y1724
csy2 * 아형 I-F csy2 NA (RAMP) y1725
csy3 * 아형 I-F csy3 NA (RAMP) y1726
cse1 * 아형 I-E ‡‡ cse1 NA YgcL-유사 ygcL
cse2 * 아형 I-E cse2 2ZCA YgcK-유사 ygcK
csc1 * 아형 I-D csc1 NA alr1563-유사 (RAMP) alr1563
csc2 * 아형 I-D csc1 및 csc2 NA COG1337 (RAMP) slr7012
csa5 * 아형 I-A csa5 NA AF1870 AF1870, MJ0380, PF0643 및 SSO1398
csn2 * 아형 II-A csn2 NA SPy1049-유사 SPy1049
csm2 * 아형 III-A ‡‡ csm2 NA COG1421 MTH1081 및 SERP2460
csm3 * 아형 III-A csc2 및 csm3 NA COG1337 (RAMP) MTH1080 및 SERP2459
csm4 * 아형 III-A csm4 NA COG1567 (RAMP) MTH1079 및 SERP2458
csm5 * 아형 III-A csm5 NA COG1332 (RAMP) MTH1078 및 SERP2457
csm6 * 아형 III-A APE2256 및 csm6 2WTE COG1517 APE2256 및 SSO1445
cmr1 * 아형 III-B cmr1 NA COG1367 (RAMP) PF1130
cmr3 * 아형 III-B cmr3 NA COG1769 (RAMP) PF1128
cmr4 * 아형 III-B cmr4 NA COG1336 (RAMP) PF1126
cmr5 * 아형 III-B ‡‡ cmr5 2ZOP 및 2OEB COG3337 MTH324 및 PF1125
cmr6 * 아형 III-B cmr6 NA COG1604 (RAMP) PF1124
csb1 * 아형 I-U GSU0053 NA (RAMP) Balac_1306 및 GSU0053
csb2 * 아형 I-U§§ NA NA (RAMP) Balac_1305 및 GSU0054
csb3 * 아형 I-U NA NA (RAMP) Balac_1303§§
csx17 * 아형 I-U NA NA NA Btus_2683
csx14 * 아형 I-U NA NA NA GSU0052
csx10 * 아형 I-U csx10 NA (RAMP) Caur_2274
csx16 * 아형 III-U VVA1548 NA NA VVA1548
csaX * 아형 III-U csaX NA NA SSO1438
csx3 * 아형 III-U csx3 NA NA AF1864
csx1 * 아형 III-U csa3, csx1, csx2, DXTHG, NE0113 및 TIGR02710 1XMX 및 2I71 COG1517 및 COG4006 MJ1666, NE0113, PF1127 및 TM1812
csx15 * 미공지 NA NA TTE2665 TTE2665
csf1 * U형 csf1 NA NA AFE_1038
csf2 * U형 csf2 NA (RAMP) AFE_1039
csf3 * U형 csf3 NA (RAMP) AFE_1040
csf4 * U형 csf4 NA NA AFE_1037
(iii) Cpf1
일부 구현예에서, 가이드 RNA 또는 gRNA는 세포에서 게놈 또는 에피솜 서열과 같은 표적 서열에 대한 Cas9 또는 Cpf1과 같은 RNA-가이드 뉴클레아제의 특이적 연관 표적화를 촉진한다. 일반적으로, gRNA들은 단분자(단일 RNA 분자를 포함하고 대안적으로 키메라로 지칭됨), 또는 모듈형(일부 구현예에서 이중화에 의해 일반적으로 서로 회합되는 crRNA 및 tracrRNA와 같은 하나 이상의, 일반적으로 2개의 개별 RNA 분자를 포함함)일 수 있다. gRNA들 및 이들의 구성 요소 부분은 일부 구현예에서 문헌[Briner et al. (Molecular Cell 56(2), 333-339, October 23, 2014 (Briner), 이는 참조로 포함됨) 및 Cotta-Ramusino] 전체에 걸쳐 기술되어 있다.
단분자이든 모듈형이든 가이드 RNA는 일반적으로 표적에 완전히 또는 부분적으로 상보적인 표적화 도메인을 포함하고, 일반적으로 10-30개 뉴클레오타이드 길이이고, 특정 구현예에서 16-24개 뉴클레오타이드 길이(일부 구현예에서, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 또는 24개 뉴클레오타이드 길이)이다. 일부 측면에서, 표적화 도메인은 Cas9 gRNA의 경우 gRNA의 5’ 말단에 또는 그 근처에 있으며, Cpf1 gRNA의 경우 3’ 말단에 또는 그 근처에 있다. 앞의 설명은 Cas9와 함께 사용하기 위한 gRNA에 초점을 맞추었지만, 이 점에 대해 설명한 것과 몇 가지 면에서 상이한 gRNA를 활용하는 다른 RNA-가이드 뉴클레아제가 발견되거나 발명되었다(또는 미래에 발견되거나 발명될 수 있다)는 점을 이해해야 한다. 일부 구현예에서, Cpf1(“프리보텔라 및 프랜시셀라 1의 CRISPR”)는 기능하기 위해 tracrRNA를 필요로하지 않는 최근에 발견된 RNA-가이드 뉴클레아제이다. (Zetsche et al., 2015, Cell 163, 759-771 October 22, 2015 (Zetsche I), 본원에 참조로 포함됨). Cpf1 게놈 편집 시스템에서 사용하기 위한 gRNA는 일반적으로 표적화 도메인 및 상보성 도메인(또는 “핸들”로 지칭됨)을 포함한다. 또한 Cpf1과 함께 사용하기 위한 gRNA에서 표적화 도메인은 일반적으로 Cas9 gRNA와 관련하여 위에서 설명한 5’ 말단보다는 3’ 말단에 또는 그 근처에 존재한다는 점에 유의해야 한다(핸들은 Cpf1 gRNA의 5’ 말단에 또는 그 근처에 있다).
다른 원핵생물 종의 gRNA들 사이 또는 Cpf1 및 Cas9 gRNA 사이에 구조적 차이가 존재할 수 있지만, gRNA가 작동하는 원리는 일반적으로 일관된다. 이러한 작동의 일관성 때문에 gRNA는 넓은 의미에서 표적 도메인 서열에 의해 정의될 수 있으며, 숙련된 기술자는 주어진 표적화 도메인 서열이 단분자 또는 키메라 gRNA를 포함하는 임의의 적합한 gRNA, 또는 하나 이상의 화학적 변형 및/또는 순차적 변형(치환, 추가 뉴클레오타이드, 절단 등)을 포함하는 gRNA에 포함될 수 있음을 이해할 것이다. 따라서, 본 개시 내용의 일부 측면에서, gRNA는 그의 표적화 도메인 서열의 관점에서만 단독으로 기술될 수 있다.
보다 일반적으로, 본 개시 내용의 일부 측면은 다중 RNA-가이드 뉴클레아제를 사용하여 구현될 수 있는 시스템, 방법 및 조성물에 관한 것이다. 달리 명시되지 않는 한, 용어 gRNA는 Cas9 또는 Cpf1의 특정 종과 호환되는 gRNA뿐만 아니라 임의의 RNA-가이드 뉴클레아제와 함께 사용될 수 있는 임의의 적합한 gRNA를 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 예시로서, 특정 구현예에서, 용어 gRNA는 II형 또는 V형 또는 CRISPR 시스템과 같은 클래스 2 CRISPR 시스템에서 발생하는 임의의 RNA-가이드 뉴클레아제, 또는 그로부터 유래되거나 적응된 RNA-가이드 뉴클레아제와 함께 사용하기 위한 gRNA를 포함할 수 있다.
이 섹션에서 논의된 특정 예시적인 변형은 5’ 말단에 또는 그 근처에(예를 들어, 5’ 말단의 1-10, 1-5, 또는 1-2개 뉴클레오타이드 이내에) 및/또는 3’ 말단에 또는 그 근처에(예를 들어, 3’ 말단의 1-10, 1-5, 또는 1-2개 뉴클레오타이드 이내에)를 포함하여 그러나 이에 제한되지 않고, gRNA 서열 내 임의의 위치에 포함될 수 있다. 일부 경우에, 변형은 Cas9 gRNA의 반복-항-반복 이중체, Cas9 또는 Cpf1 gRNA의 줄기 루프 구조, 및/또는 gRNA의 표적화 도메인과 같은 기능성 모티프 내에 위치한다.
RNA-가이드 뉴클레아제에는 Cas9와 같은 자연 발생 클래스 2 CRISPR 뉴클레아제, 및 Cpf1뿐만 아니라 그로부터 유래되거나 수득된 다른 뉴클레아제가 포함되지만 이에 국한되지 않는다. 기능적 측면에서, RNA-가이드 뉴클레아제는: (a) gRNA와 상호작용하는(예를 들어, 복합체를 형성하는); 그리고 (b) 그 gRNA와 함께, (i) gRNA의 표적화 도메인에 대한 서열 상보성, 및 선택적으로 (ii) 하기에 더 자세히 기술되는 “프로토스페이서 인접 모티프(PAM)”으로 지칭되는 추가 서열을 포함하는 DNA의 표적 영역과 회합하고, 선택적으로 이를 절단하거나 변형하는, 그러한 뉴클레아제로 정의된다. 다음 예에서 설명하는 바와 같이, RNA-가이드 뉴클레아제들은 동일한 PAM 특이성 또는 절단 활성을 공유하는 개별 RNA-가이드 뉴클레아제들 사이에 변이가 존재할 수 있음에도 불구하고 넓은 의미에서 그들의 PAM 특이성 및 절단 활성에 의해 정의될 수 있다. 숙련된 기술자는 본 개시 내용의 일부 측면이 특정 PAM 특이성 및/또는 절단 활성을 갖는 임의의 적합한 RNA-가이드 뉴클레아제를 사용하여 구현될 수 있는 시스템, 방법 및 조성물에 관한 것임을 이해할 것이다. 이러한 이유로, 달리 명시되지 않는 한 RNA-가이드 뉴클레아제라는 용어는 일반적인 용어로 이해되어야 하며, RNA-가이드 뉴클레아제의 임의의 특정 유형(예를 들어, Cas9 대 Cpf1), 종(예를 들어, 스트렙토코쿠스 피오게네스 대 스타필로코쿠스 아우레우스) 또는 변이(예를 들어, 전장 대 절단된 또는 분할된; 자연 발생 PAM 특이성 대 조작된 PAM 특이성 등)에 제한되지 않는다.
PAM 및 프로토스페이서의 특이적 순차적 배향을 인식하는 것 외에도, 일부 구현예에서 RNA-가이드 뉴클레아제는 또한 특이적 PAM 서열을 인식할 수 있다. 스타필로코쿠스 아우레우스 Cas9는, 일부 구현예에서, 일반적으로 NNGRRT 또는 NNGRRV의 PAM 서열을 인식하며, 여기서 N 잔기는 gRNA 표적화 도메인에 의해 인식되는 영역의 즉시 3’에 있다. 스트렙토코쿠스 피오게네스 Cas9는 일반적으로 NGG PAM 서열을 인식한다. 그리고 프란시셀라 노비시다(F.novicida) Cpf1은 일반적으로 TTN PAM 서열을 인식한다.
crRNA와 복합된 Acidaminococcus sp. Cpf1, 및 TTTN PAM 서열을 포함하는 이중 가닥(ds) DNA 표적의 결정 구조는 Yamano et al.(문헌[Cell. 2016 May 5; 165(4): 949-962 (Yamano)], 본원에 참조로 포함됨)에 의해 해결되었다. Cas9와 마찬가지로 Cpf1에는 2개의 엽(lobe): 즉, REC(인식) 엽과 NUC(뉴클레아제) 엽이 있다. REC 옆은 임의의 공지된 단백질 구조와 유사성이 결여된 REC1 및 REC2 도메인을 포함한다. 한편, NUC 엽은 3개의 RuvC 도메인(RuvC-I, -II 및 -III) 및 BH 도메인을 포함한다. 그러나, Cas9와 대조적으로, Cpf1 REC 엽은 HNH 도메인이 없고, 공지된 단백질 구조: 즉, 구조적으로 고유한 PI 도메인, 3개의 웨지(WED) 도메인(WED-I, -II 및 -III), 및 뉴클레아제(Nuc) 도메인과 유사성이 없는 다른 도메인들을 포함한다.
Cas9 및 Cpf1은 구조 및 기능면에서 유사성을 공유하지만, 특정 Cpf1 활성들은 임의의 Cas9 도메인과 유사하지 않은 구조적 도메인에 의해 매개된다는 점을 이해해야 한다. 일부 구현예에서, 표적 DNA의 상보적 가닥의 절단은 Cas9의 HNH 도메인과 순차적으로 및 공간적으로 상이한 Nuc 도메인에 의해 매개되는 것으로 보인다. 또한, Cpf1 gRNA의 비표적 부분(핸들)은 Cas9 gRNA의 반복:항반복 이중체에 의해 형성되는 줄기 루프 구조가 아닌 유사매듭 구조를 채택한다.
RNA-가이드 뉴클레아제, 예를 들어, Cas9, Cpf1 또는 이의 기능성 단편을 암호화하는 핵산이 본원에서 제공된다. RNA-가이드 뉴클레아제를 암호화하는 예시적인 핵산은 이전에 기술되었다(예를 들어, 문헌[Cong 2013; Wang 2013; Mali 2013; Jinek 2012] 참조).
b. 게놈 편집 접근법
일반적으로, 본원에 기술된 방법에 따른 임의의 유전자의 변경은 임의의 기전(mechanism)에 의해 매개될 수 있고 임의의 방법이 특정 기전에 제한되지 않음을 이해해야 한다. 유전자의 변경과 관련될 수 있는 예시적인 기전은 비-상동성 말단 봉합(예를 들어, 기존 또는 대체), 미세 상동성 매개 말단 봉합(MMEJ), 상동 직접 수선(예를 들어, 내인성 공여체 주형 매개), 합성 의존 가닥 어닐링(SDSA), 단일 가닥 어닐링, 단일 가닥 침습, 단일 가닥 절단 수선(SSBR), 미스매치 수선(MMR), 염기 절제 수선(BER), 가닥간 교차 결합(ICL) 손상통과 합성(TLS) 또는 오류 없는 복제후 수선(PRR)을 포함하나 이에 제한되지 않는다. CD247 유전자 자리 중 하나 또는 전부의 하나 또는 두 대립유전자 모두의 표적화된 녹아웃을 위한 예시적인 방법이 본원에 기술된다.
1) 유전자 표적화를 위한 NHEJ 접근법
본원에 기술된 바와 같이, 뉴클레아제-유도된 비-상동성 말단-봉합(NHEJ)은 유전자 특이적 녹아웃을 표적화하기 위해 사용될 수 있다. 뉴클레아제-유도된 NHEJ는 또한 관심 유전자에서 서열 삽입을 제거(예를 들어, 삭제)하는 데 사용할 수 있다.
이론에 얽매이고자 하는 것은 아니지만, 일부 구현예에서, 본원에 기재된 방법과 관련된 게놈 변경은 뉴클레아제-유도된 NHEJ 및 NHEJ 수선 경로의 오류 유발 특성에 의존하는 것으로 여겨진다. NHEJ는 두 말단을 함께 봉합하여 DNA의 이중 가닥 절단을 수선하지만, 일반적으로 원래 서열은 정확히 이중 가닥 절단으로 형성된 두 개의 호환 가능한 말단이 완벽하게 결찰되는 경우에만 복원된다. 이중 가닥 절단의 DNA 말단들은 종종 효소 처리의 대상이 되어 말단들을 다시 봉합하기 전에 한 가닥 또는 두 가닥 모두에서 뉴클레오타이드의 추가 또는 제거가 발생한다. 이는 NHEJ 수선 부위의 DNA 서열에 삽입 및/또는 결실(indel) 돌연변이의 존재를 초래한다. 이러한 돌연변이의 3분의 2는 일반적으로 해독틀을 변경하며, 따라서 비기능성 단백질을 생성한다. 또한, 해독틀을 유지하지만 상당한 양의 서열을 삽입하거나 결실하는 돌연변이는 단백질의 기능을 파괴할 수 있다. 이것은 중요한 기능성 도메인의 돌연변이가 단백질의 비중요 영역의 돌연변이보다 덜 허용될 가능성이 있으므로 유전자 자리에 의존적이다. NHEJ에 의해 생성된 삽입-결실(indel) 돌연변이는 본질적으로 예측할 수 없지만, 주어진 절단 부위에서 특정 삽입-결실 서열이 선호되고 집단 내에서 과도하게 대표되는데, 이는 미세 상동성의 작은 영역들 때문일 가능성이 있다. 결실의 길이는 매우 다양할 수 있는데, 가장 일반적으로 1-50bp 범위에 있지만, 100-200bp 이상에 쉽게 도달할 수 있다. 삽입은 더 짧은 경향이 있으며 종종 절단 부위 바로 주변의 서열의 짧은 복제를 포함한다. 그러나 큰 삽입을 얻을 수 있으며, 이러한 경우 삽입된 서열은 종종 게놈의 다른 영역이나 세포에 존재하는 플라스미드 DNA에서 유래한다.
NHEJ는 돌연변이 과정이기 때문에, 특정 최종 서열의 생성이 필요하지 않는 한 작은 서열 모티프를 결실하는 데에도 사용될 수 있다. 이중 가닥 절단이 짧은 표적 서열 근처에서 표적화되는 경우, NHEJ 수선으로 인한 결실 돌연변이가 종종 확장되어 원치 않는 뉴클레오타이드를 제거한다. 더 큰 DNA 분절의 결실을 위해, 2개의 이중 가닥 절단을 도입하면(서열의 양쪽에 하나씩) 전체 개재 서열이 제거되어 말단들 사이에 NHEJ가 발생할 수 있다. 일부 구현예에서, 한 쌍의 gRNA를 사용하여 2개의 이중 가닥 절단을 도입할 수 있으며, 결과적으로 2개의 절단 사이의 개재 서열이 결실된다.
이 두 가지 접근법은 모두 특정 DNA 서열을 결실하는 데 사용할 수 있지만, NHEJ의 오류 유발 특성은 여전히 수선 부위에서 삽입-결실(indel) 돌연변이를 생성할 수 있다.
이중 가닥 절단 eaCas9 분자 및 단일 가닥, 또는 니카제, eaCas9 분자 둘 모두는 NHEJ-매개 삽입-결실을 생성하기 위해 본원에 기재된 방법 및 조성물에서 사용될 수 있다. 관심 유전자, 예를 들어 코딩 영역, 예를 들어 유전자의 초기 코딩 영역을 표적화하는 NHEJ-매개 삽입-결실을 사용하여 관심 유전자를 녹아웃(즉, 발현 제거)할 수 있다. 예를 들어, 관심 유전자의 초기 코딩 영역은 전사 시작 부위 바로 뒤의 서열을, 코딩 서열의 첫 번째 엑손 내에, 또는 전사 시작 부위의 500bp 이내에(예를 들어, 500, 450, 400, 350, 300, 250, 200, 150, 100 또는 50bp미만) 포함한다.
일부 구현예에서, NHEJ 매개 삽입-결실이 CD247 유전자 자리와 같은 하나 이상의 T-세포 발현 유전자 내로 도입된다. 유전자를 표적으로 하는 개별 gRNA 또는 gRNA 쌍은 Cas9 이중 가닥 뉴클레아제 또는 단일 가닥 니카제와 함께 제공된다.
(1) 표적 위치를 기준으로 이중 가닥 또는 단일 가닥 절단의 배치
gRNA 및 Cas9 뉴클레아제가 NHEJ 매개 삽입-결실을 유도할 목적으로 이중 가닥 절단을 생성하는 일부 구현예에서, gRNA, 예를 들어 단분자(또는 키메라) 또는 모듈형 gRNA 분자는 표적 위치의 뉴클레오타이드에 매우 근접하여 하나의 이중 가닥 절단을 위치시키도록 구성된다. 일부 구현예에서, 절단 부위는 표적 위치로부터 0 내지 30bp(예를 들어, 표적 위치로부터 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1bp 미만) 떨어져 있다.
Cas9 뉴클레아제들과 복합되는 2개의 gRNA가 NHEJ 매개 삽입-결실을 유도할 목적으로 2개의 단일 가닥 절단을 유도하는 일부 구현예에서, 2개의 gRNA, 예를 들어 독립적으로, 단분자(또는 키메라) 또는 모듈형 gRNA는 표적 위치의 뉴클레오타이드에 NHEJ 수선을 제공하기 위해 2개의 단일 가작 절단을 위치시키도록 구성된다. 일부 구현예에서, gRNA들은 본질적으로 이중 가닥 절단을 모방하는 상이한 가닥들 상에서 동일한 위치에, 또는 서로의 몇 개의 뉴클레오타이드 내에 절단부를 위치시키도록 구성된다. 일부 구현예에서, 더 가까운 닉(nick)이 표적 위치로부터 0 내지 30bp(예를 들어, 표적 위치로부터 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1bp 미만) 떨어져 있고, 2개의 닉은 서로의 25 내지 55bp 내에(예를 들어, 25 내지 50, 25 내지 45, 25 내지 40, 25 내지 35, 25 내지 30, 50 내지 55, 45 내지 55, 40 내지 55, 35 내지 55, 30 내지 55, 30 내지 50, 35 내지 50, 40 내지 50, 45 내지 50, 35 내지 45, 또는 40 내지 45bp 사이에) 있고 서로로부터 100bp 이내에(예를 들어, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20 또는 10bp 이내에) 있다. 일부 구현예에서, gRNA는 표적 위치의 뉴클레오타이드의 양쪽에 단일 가닥 절단을 배치하도록 구성된다.
이중 가닥 절단 eaCas9 분자 및 단일 가닥, 또는 니카제, eaCas9 분자 둘 모두는 표적 위치의 양쪽에 절단을 생성하기 위해 본원에 기재된 방법 및 조성물에서 사용될 수 있다. 이중 가닥 또는 한 쌍의 단일 가닥 절단은 두 절단부(예를 들어, 결실된 두 절단 사이의 영역) 사이의 핵산 서열을 제거하기 위해 표적 위치의 양쪽에서 생성될 수 있다. 일부 구현예에서, 2개의 gRNA, 예를 들어 독립적으로, 단분자(또는 키메라) 또는 모듈형 gRNA는 표적 위치의 양쪽에 이중 가닥 절단을 위치시키도록 구성된다. 대안적 구현예에서, 3개의 gRNA, 예를 들어 독립적으로, 단분자(또는 키메라) 또는 모듈형 gRNA는 표적 위치의 양쪽에 하나의 이중 가닥 절단(즉, cas9 뉴클레아제와 복합된 하나의 gRNA) 및 2개의 단일 가닥 절단 또는 한 쌍의 단일 가닥 절단(즉, Cas9 니카제들과 복합된 2개의 gRNA)을 위치시키도록 구성된다. 또 다른 구현예에서, 4개의 gRNA, 예를 들어 독립적으로, 단분자(또는 키메라) 또는 모듈형 gRNA는 표적 위치의 양쪽에 2개 쌍의 단일 가닥 절단(즉, Cas9 니카제들과 복합된 2개 gRNA 2쌍)을 생성하도록 구성된다. 이중 가닥 절단(들) 또는 한 쌍에서 2개 단일 가닥 닉 중 더 가까운 쪽은 이상적으로 표적 위치의 0 내지 500bp 내에(예를 들어, 표적 위치로부터 450, 400, 350, 300, 250, 200, 150, 100, 50 또는 25bp 이내에) 있을 것이다. 니카제가 사용될 때, 한 쌍에서 2개의 닉은 서로의 25 내지 55bp 내에(예를 들어, 25 내지 50, 25 내지 45, 25 내지 40, 25 내지 35, 25 내지 30, 50 내지 55, 45 내지 55, 40 내지 55, 35 내지 55, 30 내지 55, 30 내지 50, 35 내지 50, 40 내지 50, 45 내지 50, 35 내지 45, 또는 40 내지 45bp 사이에) 있고 서로로부터 100bp 이내에(예를 들어, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20 또는 10bp 이내에) 있다.
2) 표적화된 녹다운
DNA 수준에서 유전자를 돌연변이시켜 발현을 영구적으로 제거하거나 감소시키는 CRISPR/Cas 매개 유전자 녹아웃과 달리, CRISPR/Cas 녹다운은 인공적인 전사 요소들의 사용을 통해 유전자 발현의 일시적인 감소를 가능하게 한다. Cas9 단백질의 두 DNA 절단 도메인에서 주요 잔기를 돌연변이시키면(예를 들어, D10A 및 H840A 돌연변이) 촉매적으로 불활성인 Cas9(eiCas9는 죽은 Cas9 또는 dCas9로도 알려짐)가 생성된다. 촉매적으로 비활성인 Cas9는 gRNA와 복합체를 형성하고 해당 gRNA의 표적화 도메인에 의해 지정된 DNA 서열에 국한되지만 표적 DNA를 절단하지는 않는다. 효과기 도메인, 예를 들어 전사 억제 도메인에 대한 dCas9의 융합은 gRNA에 의해 지정된 임의의 DNA 부위에 효과기의 보충(recruitment)을 가능하게 한다. eiCas9 자체가 코딩 서열의 초기 영역으로 모집될 때 전사를 차단할 수 있는 것으로 나타났지만, 전사 억제 도메인(예를 들어, KRAB, SID 또는 ERD)을 Cas9에 융합하고 이를 유전자의 프로모터 영역에 보충함으로써 보다 강력한 억제를 달성할 수 있다. 프로모터의 DNase I 과민성 영역을 표적화하면 이 영역들이 Cas9 단백질에 접근할 가능성이 더 높고 내인성 전사 인자를 위한 부위를 보유할 가능성이 더 높기 때문에 보다 효율적인 유전자 억제 또는 활성화를 산출할 수 있다. 특히 유전자 억제의 경우, 내인성 전사 인자의 결합 부위를 차단하는 것이 유전자 발현을 하향 조절하는 데 도움이 될 것으로 본원에서 고려된다. 또 다른 구현예에서, eiCas9는 염색질 변형 단백질에 융합될 수 있다. 염색질 상태를 변경하면 표적 유전자의 발현 감소를 초래할 수 있다.
일부 구현예에서, gRNA 분자는 공지된 전사 반응 요소(예를 들어, 프로모터, 인핸서 등), 공지된 상단부 활성화 서열(UAS), 및/또는 표적 DNA의 발현을 조절할 수 있다고 의심되는 미공지 또는 공지된 기능의 서열에 표적화될 수 있다.
일부 구현예에서, CRISPR/Cas 매개 유전자 녹다운은 하나 이상의 T 세포 발현 유전자의 발현을 감소시키기 위해 사용될 수 있다. 본원에 기술된 eiCas9 또는 eiCas9 융합 단백질이 CD247 유전자 자리를 녹다운하기 위해 사용되는 일부 구현예에서, 두 유전자 또는 모든 유전자를 표적화하는 개별 gRNA 또는 gRNA 쌍이 eiCas9 또는 eiCas9 융합 단백질과 함께 제공된다.
3) 단일 가닥 어닐링
단일 가닥 어닐링(SSA)은 표적 핵산에 존재하는 2개의 반복 서열 사이의 이중 가닥 절단을 수선하는 또 다른 DNA 수선 과정이다. SSA 경로에 의해 사용되는 반복 서열은 일반적으로 길이가 30개 뉴클레오타이드보다 크다. 절단 말단에서의 절제는 표적 핵산의 두 가닥 모두에서 반복 서열을 나타내기 위해 발생한다. 절제 후, 반복 서열을 함유하는 단일 가닥 돌출부는 RPA 단백질로 코팅되어 반복 서열이 예를 들어 자체에 대해 부적절한 어닐링되는 것을 방지한다. RAD52는 돌출부의 반복 서열 각각에 결합하고 상보적 반복 서열의 어닐링을 가능하게 하도록 서열을 정렬한다. 어닐링 후, 돌출부의 단일 가닥 플랩이 절단된다. 새로운 DNA 합성이 모든 갭을 채우고, 결찰이 DNA 이중체를 복원한다. 이 처리의 결과로 두 반복 사이의 DNA 서열이 결실된다. 결실의 길이는 사용된 두 반복의 위치, 절제의 경로 또는 진행도를 비롯한 많은 요인에 따라 달라질 수 있다.
HDR 경로와 달리, SSA는 표적 핵산 서열을 변경하거나 수정하기 위해 주형 핵산이 필요하지 않다. 대신에 상보적인 반복 서열이 사용된다.
4) 기타 DNA 수선 경로
A) SSBR(단일 가닥 절단 수선)
게놈의 단일 가닥 절단(SSB)은 위에서 논의한 DSB 수선 메커니즘과 구별되는 메커니즘인 SSBR 경로에 의해 수선된다. SSBR 경로에는 SSB 검출, DNA 말단 처리, DNA 갭 채우기 및 DNA 결찰의 4가지 주요 단계가 있다. 보다 자세한 설명은 문헌[Caldecott, Nature Reviews Genetics 9, 619-631 (August 2008)]에 제공되며 여기서는 요약을 제공한다.
제1 단계에서, SSB가 형성되면, PARP1 및/또는 PARP2가 절단을 인식하고 수선 기구를 동원한다. DNA 절단에서 PARP1의 결합 및 활성은 일시적이며 병변에서 SSBr 단백질 복합체의 초점 축적 또는 안정성을 촉진함으로써 SSBr을 가속화하는 것으로 보인다. 거의 틀림없이 이 SSBr 단백질들 중 가장 중요한 것은 XRCC1이며, 이는 DNA 3’ 및 5’ 말단의 청소를 담당하는 단백질을 포함하여 SSBr 과정의 여러 효소 성분과 상호작용하고, 이를 안정화하고, 자극하는 분자 스캐폴드로 기능한다. 일부 구현예에서, XRCC1은 말단 처리를 촉진하는 여러 단백질(DNA 중합효소 베타, PNK 및 세 가지 뉴클레아제, APE1, APTX 및 APLF)과 상호작용한다. APE1은 엔도뉴클레아제 활성을 가지고 있다. APLF는 엔도뉴클레아제 및 3’ 내지 5’ 엑소뉴클레아제 활성을 나타낸다. APTX는 엔도뉴클레아제 및 3’ 내지 5’ 엑소뉴클레아제 활성을 가지고 있다.
모두는 아니더라도 대부분 SSB의 3’- 및/또는 5’-말단이 ‘손상’되므로 이 말단 처리는 SSBR의 중요한 단계이다. 말단 처리는 일반적으로 손상된 3’-말단을 히드록실화 상태로 및/또는 손상된 5’-말단을 인산염 모이어티로 복원하여 말단이 결찰 가능하게 되도록 하는 것을 포함한다. 손상된 3’ 말단을 처리할 수 있는 효소에는 PNKP, APE1 및 TDP1이 있다. 손상된 5’ 말단을 처리할 수 있는 효소에는 PNKP, DNA 중합효소 베타 및 APTX가 있다. LIG3(DNA 리가아제 III)도 말단 처리에 참여할 수 있다. 말단이 청소되고 나면, 갭 채우기가 발생할 수 있다.
DNA 갭 채우기 단계에서, 일반적으로 존재하는 단백질은 PARP1, DNA 중합효소 베타, XRCC1, FEN1(플랩 엔도뉴클레아제 1), DNA 중합효소 델타/엡실론, PCNA 및 LIG1이다. 두 가지 갭 채우기 방법이 있는데, 짧은 패치 수선과 긴 패치 수선이다. 짧은 패치 수선은 없어진 단일 뉴클레오타이드의 삽입을 수반한다. 일부 SSB에서, “갭 채우기”는 2개 이상의 뉴클레오타이드를 계속 치환할 수 있다(최대 12개 염기의 치환이 보고됨). FEN1은 치환된 5’-잔기를 제거하는 엔도뉴클레아제이다. Pol β를 포함한 여러 DNA 중합효소는 SSB의 수선에 관여하며, DNA 중합효소의 선택은 SSB의 공급원과 유형에 영향을 받는다.
제4 단계에서, LIG1(Ligase I) 또는 LIG3(Ligase III)과 같은 DNA 리가아제가 말단의 봉합을 촉진시킨다. 짧은 패치 수선은 Ligase III을 사용하고 긴 패치 수선은 Ligase I을 사용한다.
경우에 따라 SSBR은 복제 결합된다. 이 경로에는 CtIP, MRN, ERCC1 및 FEN1 중 하나 이상이 포함될 수 있다. SSBR을 촉진할 수 있는 추가 인자에는 aPARP, PARP1, PARP2, PARG, XRCC1, DNA 중합효소 b, DNA 중합효소 d, DNA 중합효소 e, PCNA, LIG1, PNK, PNKP, APE1, APTX, APLF, TDP1, LIG3, FEN1, CtIP, MRN, 및 ERCC1이 포함된다.
B) MMR(미스매치 수선)
세포는 세 가지 절제 수선 경로: MMR, BER, 및 NER을 함유한다. 절제 수선 경로는 일반적으로 DNA의 한 가닥에 있는 병변을 인식한 다음, 엑소/엔도뉴클레아제가 병변을 제거하고 1-30개의 뉴클레오타이드 갭(순차적으로 DNA 중합효소에 의해 채워지고 최종적으로 리가아제로 밀봉됨)을 남기는 공통적인 특징을 가지고 있다. 보다 완전한 사진이 문헌[Li, Cell Research (2008) 18:85-98]에 제공되며 여기서는 요약을 제공한다. 미스매치 수선(MMR)은 잘못 짝지어진 DNA 염기에서 작동한다.
MSH2/6 또는 MSH2/3 복합체는 모두 미스매치 인식 및 수선 개시에 중요한 역할을 하는 ATPase 활성을 가지고 있다. MSH2/6은 염기-염기 미스매치를 우선적으로 인식하고 1개 또는 2개 뉴클레오타이드의 잘못된 짝을 식별하는 반면, MSH2/3은 더 큰 ID 잘못된 짝을 우선적으로 인식한다.
hMLH1은 hPMS2와 이종이합체화되어 hMutLα를 형성하고 hMutLα는 ATPase 활성을 보유하고 MMR의 여러 단계에 중요하다. 이것은 EXO1과 관련된 3’ 닉-지시(nick-directed) MMR에서 중요한 역할을 하는 PCNA/복제 인자 C(RFC)-의존 엔도뉴클레아제 활성을 가지고 있다. (EXO1은 HR과 MMR 모두에 참여한다.) 이것은 미스매치-유발 절제의 종결을 조절한다. 리가아제 I은 이 경로와 관련된 리가아제이다. MMR을 촉진할 수 있는 추가 인자에는 EXO1, MSH2, MSH3, MSH6, MLH1, PMS2, MLH3, DNA Pol d, RPA, HMGB1, RFC, 및 DNA 리가아제 I이 포함된다.
C) 염기 절제 수선(BER)
염기 절제 수선(BER) 경로는 세포 주기 전반에 걸쳐 활성이고, 주로 게놈에서 작은 비-나선-뒤틀린 염기 병변 제거를 담당한다. 대조적으로, 관련된 뉴클레오타이드 절제 수선 경로(다음 섹션에서 논의됨)는 부피가 큰 나선-뒤틀린 병변을 수선한다. 보다 자세한 설명은 문헌[Caldecott, Nature Reviews Genetics 9, 619-631 (August 2008)]에 제공되며 여기서는 요약을 제공한다.
DNA 염기가 손상되면 염기 절제 수선(BER)이 개시되며 이 과정은 다음의 5가지 주요 단계로 단순화될 수 있다: (a) 손상된 DNA 염기의 제거; (b) 후속 염기 부위의 절개; (c) DNA 말단의 청소; (d) 정확한 뉴클레오타이드를 수선 갭에 삽입; 및 (e) DNA 백본에 남아 있는 닉의 결찰. 이 마지막 단계들은 SSBR과 유사하다.
첫 번째 단계에서, 손상 특이적 DNA 글리코실라아제가 염기를 당인산염 백본에 연결하는 N-글리코시드 결합의 절단을 통해 손상된 염기를 절제한다. 그런 다음 AP 엔도뉴클레아제-1(APE1) 또는 관련 리아제 활성이 있는 2작용성(bifunctional) DNA 글리코실라아제가 인산디에스테르 백본을 절개하여 DNA 단일 가닥 절단(SSB)을 생성한다. BER의 세 번째 단계는 DNA 말단의 청소를 포함한다. BER의 네 번째 단계는 새로운 상보적 뉴클레오타이드를 수선 갭에 추가하는 Pol β에 의해 수행되고 마지막 단계에서는 XRCC1/Ligase III가 DNA 백본에 남아 있는 닉을 밀봉한다. 이렇게 하여 짧은 패치 BER 경로가 완료되고 여기에서 손상된 DNA 염기의 대부분(~80%)이 수선된다. 그러나 3단계의 5’-말단이 말단 처리 활성에 내성이 있는 경우, Pol β에 의한 1개의 뉴클레오타이드 삽입 후 중합효소가 복제 DNA 중합효소인 Pol δ/ε으로 전환되고, 이후 Pol δ/ε이 DNA 수선 갭에 ~2-8개의 뉴클레오타이드를 더 추가한다. 이것은 5’-플랩 구조를 생성하며, 이는 진행도 인자 증식 세포 핵 항원(PCNA)과 관련된 플랩 엔도뉴클레아제-1(FEN-1)에 의해 인식되고 절제된다. 그런 다음 DNA 리가아제 I이 DNA 백본에 남아 있는 닉을 밀봉하고 긴 패치 BER을 완성한다. BER 경로를 촉진할 수 있는 추가 인자에는 DNA 글리코실라아제, APE1, Polb, Pold, Pole, XRCC1, Ligase III, FEN-1, PCNA, RECQL4, WRN, MYH, PNKP, 및 APTX이 포함된다.
D) 뉴클레오타이드 절제 수선(NER)
뉴클레오타이드 절제 수선(NER)은 DNA에서 부피가 큰 나선-뒤틀린 병변을 제거하는 중요한 절제 메커니즘이다. NER에 대한 추가 세부 정보는 문헌[Marteijn et al., Nature Reviews Molecular Cell Biology 15, 465-481 (2014)]에 제공되며, 여기서는 요약을 제공한다. NER은 2개의 더 작은 경로인: 전역 게놈 NER(GG-NER) 및 전사 결합 수선 NER(TC-NER)을 포함하는 광범위한 경로이다. GG-NER 및 TC-NER은 DNA 손상을 인식하기 위해 서로 다른 인자를 사용한다. 그러나 이들은 병변 절개, 수선 및 결찰에 동일한 기구를 사용한다.
손상이 인식되면, 세포는 병변을 함유한 짧은 단일 가닥 DNA 분절을 제거한다. 엔도뉴클레아제 XPF/ERCC1 및 XPG(ERCC5에 의해 암호화됨)는 병변의 양쪽에서 손상된 가닥을 절단함으로써 병변을 제거하여 22-30개 뉴클레오타이드의 단일 가닥 갭을 생성한다. 다음으로, 세포는 DNA 갭 채우기 합성 및 결찰을 수행한다. 이 과정에는 PCNA, RFC, DNA Pol δ, DNA Pol ε 또는 DNA Pol κ, 및 DNA 리가아제 I 또는 XRCC1/Ligase III이 포함된다. 결찰 단계를 수행하기 위해, 복제 세포는 DNA pol ε 및 DNA 리가아제 I을 사용하는 경향이 있는 반면, 비복제 세포는 DNA Pol δ, DNA Pol κ 및 XRCC1/Ligase III 복합체를 사용하는 경향이 있다.
NER은 다음 인자들: XPA-G, POLH, XPF, ERCC1, XPA-G, 및 LIG1을 포함할 수 있다. 전사 결합 NER(TC-NER)은 다음 인자들: CSA, CSB, XPB, XPD, XPG, ERCC1 및 TTDA를 포함할 수 있다. NER 수선 경로를 촉진할 수 있는 추가 인자에는 XPA-G, POLH, XPF, ERCC1, XPA-G, LIG1, CSA, CSB, XPA, XPB, XPC, XPD, XPF, XPG, TTDA, UVSSA, USP7, CETN2, RAD23B, UV-DDB, CAK 부분 복합체, RPA, 및 PCNA가 포함된다.
E) 가닥간 교차 결합(ICL)
ICL 수선 경로라고 불리는 전용 경로가 가닥간 교차 결합을 수선한다. 가닥간 교차 결합 또는 상이한 DNA 가닥의 염기 간의 공유 교차 결합은 복제 또는 전사 중에 발생할 수 있다. ICL 수선은 특히 핵산분해 활성, 손상통과 합성(TLS) 및 HDR과 같은 여러 수선 과정의 조정을 포함한다. 뉴클레아제는 교차 결합된 염기의 양쪽에서 ICL을 절제하기 위해 동원되는 반면, TLS와 HDR은 절단된 가닥을 수선하기 위해 조정된다. ICL 수선은 다음 인자들: 엔도뉴클레아제(예를 들어, XPF 및 RAD51C), RAD51과 같은 엔도뉴클레아제, 손상통과 중합효소(예를 들어, DNA 중합효소 제타 및 Rev1) 및 판코니 빈혈(FA) 단백질(예를 들어, FancJ)을 포함할 수 있다.
F) 기타 경로
포유류에는 몇 가지 다른 DNA 수선 경로가 있다. 손상통과 합성(TLS)은 결함이 있는 복제 이벤트 후에 남겨진 단일 가닥 절단을 수선하기 위한 경로이며 손상통과 중합효소(예를 들어, DNA polζ 및 Rev1)를 포함한다. 오류 없는 복제후 수선(PRR)은 결함이 있는 복제 이벤트 후에 남겨진 단일 가닥 절단을 수선하기 위한 또 다른 경로이다.
(2) 유전자 편집을 위한 제제의 기능 분석
Cas9 분자, gRNA 분자, Cas9 분자/gRNA 분자 복합체 중 임의의 것은 당업계에 공지된 방법에 의해 또는 본원에 기술된 바와 같이 평가될 수 있다. 예를 들어, Cas9 분자의 엔도뉴클레아제 활성을 평가하기 위한 예시적인 방법은 예를 들어 문헌[Jinek et al., Science 2012, 337(6096):816-821]에 기술되어 있다.
(a) 결합 및 절단 분석: Cas9 분자의 엔도뉴클레아제 활성 시험
Cas9 분자/gRNA 분자 복합체가 표적 핵산에 결합하고 표적 핵산을 절단하는 능력은 플라스미드 절단 분석으로 평가될 수 있다. 이 분석에서, 합성 또는 시험관 내-전사된 gRNA 분자를 반응 전에 95°C로 가열하고 실온으로 천천히 냉각하여 사전 어닐링한다. 천연 또는 제한 소화-선형화된 플라스미드 DNA(300ng (~8nM))를 10 mM MgCl2가 있는 상태에서 또는 없는 상태에서 Cas9 플라스미드 절단 완충제(20mM HEPES pH 7.5, 150mM KCl, 0.5mM DTT, 0.1mM EDTA)에서 정제된 Cas9 단백질 분자(50-500nM) 및 gRNA(50-500nM, 1:1)와 함께 37°C에서 60분 동안 인큐베이션한다. 반응을 5X DNA 로딩 완충제(30% 글리세롤, 1.2% SDS, 250mM EDTA)로 중단시키고, 0.8 또는 1% 아가로스 겔 전기영동으로 분해하고 브롬화 에티듐 염색으로 시각화한다. 생성된 절단 산물은 Cas9 분자가 두 DNA 가닥을 모두 절단하는지 또는 두 가닥 중 하나만 절단하는지를 나타낸다. 예를 들어, 선형 DNA 산물은 두 DNA 가닥 모두의 절단을 나타낸다. 닉이 있는 열린 원형 산물은 두 가닥 중 하나만 절단되었음을 나타낸다.
대안적으로, Cas9 분자/gRNA 분자 복합체가 표적 핵산에 결합하고 표적 핵산을 절단하는 능력은 올리고뉴클레오타이드 DNA 절단 분석으로 평가될 수 있다. 이 분석에서, DNA 올리고뉴클레오타이드(10pmol)를, 50μL 반응물에서, 1X T4 폴리뉴클레오타이드 키나아제 반응 완충제에서 37°C에서 30분 동안 5개 단위 T4 폴리뉴클레오타이드 키나아제 및 ~3-6pmol (~20-40 mCi) [γ-32P]-ATP와 함께 인큐베이션하여 방사선 표지한다. 열 불활성화(20분 동안 65°C) 후, 통합되지 않은 표지를 제거하기 위해 컬럼을 통해 반응물을 정제한다. 표지된 올리고뉴클레오타이드를 등몰량의 표지되지 않은 상보적 올리고뉴클레오타이드로 95°C에서 3분 동안 어닐링한 다음 실온으로 천천히 냉각하여 이중체 기질(100nM)을 생성한다. 절단 분석을 위해 gRNA 분자를 30초 동안 95°C로 가열한 다음 실온으로 천천히 냉각하여 어닐링한다. Cas9(500nM 최종 농도)를 총 9μl 부피의 절단 분석 완충제(20mM HEPES pH 7.5, 100mM KCl, 5mM MgCl2, 1mM DTT, 5% 글리세롤)에서, 어닐링된 gRNA 분자(500nM)와 사전 인큐베이션한다. 1μl 표적 DNA(10nM)를 첨가하여 반응을 시작하고 37°C에서 1시간 동안 인큐베이션한다. 로딩 염료(5mM EDTA, 0.025% SDS, 포름아미드 중 5% 글리세롤) 20μl를 첨가하여 반응을 급랭시키고 5분 동안 95℃로 가열한다. 절단 산물을 7M 요소를 함유한 12% 변성 폴리아크릴아미드 겔에서 분해하고 인형상화기법으로 시각화한다. 생성된 절단 산물은 상보적 가닥, 비-상보적 가닥 또는 둘 모두가 절단되었는지 여부를 나타낸다.
이러한 분석 중 하나 또는 둘 모두를 사용하여 제공된 gRNA 분자 또는 Cas9 분자의 적합성을 평가할 수 있다.
G) 결합 분석: 표적 DNA에 대한 Cas9 분자의 결합 시험
표적 DNA에 대한 Cas9 분자의 결합을 평가하기 위한 예시적인 방법이 예를 들어 문헌[Jinek et al., Science 2012; 337(6096):816-821]에 기술되어 있다.
예를 들어, 전기영동 이동성 변화 분석에서, 탈이온수에서 각 가닥(10 nmol)을 혼합하고, 95°C로 3분 동안 가열하고 실온으로 천천히 냉각하여 표적 DNA 이중체를 형성한다. 모든 DNA를 1X TBE를 함유한 8% 천연 겔에서 정제한다. DNA 밴드를 UV 투영(shadowing)에 의해 시각화하고, 절제하고, DEPC 처리된 H2O에 겔 조각을 담가 용출한다. 용출된 DNA를 에탄올 침전시키고 DEPC 처리된 H2O에 용해한다. DNA 샘플을 37°C에서 30분 동안 T4 폴리뉴클레오타이드 키나아제를 사용하여 [γ-32P]-ATP로 5’ 말단 표지한다. 폴리뉴클레오타이드 키나아제는 65°C에서 20분 동안 열 변성하고, 통합되지 않은 방사성 표지는 컬럼을 사용하여 제거한다. 결합 분석은 총 10μl 부피의 20mM HEPES pH 7.5, 100mM KCl, 5mM MgCl2, 1mM DTT 및 10% 글리세롤을 함유한 완충제에서 결합 분석을 수행한다. Cas9 단백질 분자를 등몰량의 사전 어닐링된 gRNA 분자로 프로그래밍하고 100pM에서 1μM으로 적정한다. 방사성 표지된 DNA를 20pM의 최종 농도에 첨가한다. 샘플을 37°C에서 1시간 동안 인큐베이션하고 1X TBE 및 5mM MgCl2를 함유한 8% 천연 폴리아크릴아미드 겔에서 4°C에서 분해한다. 겔을 건조시키고 DNA를 인형상화기법으로 시각화한다.
H) Cas9/gRNA 복합체의 열안정성 측정 기법
Cas9-gRNA 리보핵산단백질(RNP) 복합체의 열안정성은 시차 주사 형광측정법(DSF) 및 기타 기법에 의해 검출할 수 있다. 단백질의 열안정성은 결합 RNA 분자(예를 들어, gRNA)의 첨가와 같은 유리한 조건에서 증가할 수 있다. 따라서 Cas9/gRNA 복합체의 열안정성에 관한 정보는 복합체가 안정적인지 여부를 결정하는 데 유용하다.
I) 시차 주사 형광측정법(DSF)
Cas9-gRNA 리보핵산단백질(RNP) 복합체의 열안정성은 DSF를 통해 측정할 수 있다. RNP 복합체는 후술하는 바와 같이 RNA 또는 gRNA와 같은 리보뉴클레오타이드의 서열 및 Cas9 단백질 또는 이의 변이체와 같은 단백질을 포함한다. 이 기법은 단백질의 열안정성을 측정하며, 열안정성은 결합 RNA 분자(예를 들어, gRNA)의 첨가와 같은 유리한 조건에서 증가할 수 있다.
이 분석법은 여러 가지 방법으로 적용될 수 있다. 예시적인 프로토콜은 RNP 형성을 위한 원하는 용액 조건을 결정하기 위한 프로토콜(분석 1, 아래 참조), 원하는 gRNA:Cas9 단백질의 화학량론적 비율을 시험하기 위한 프로토콜(분석 2, 아래 참조), Cas9 분자, 예를 들어 야생형 또는 돌연변이체 Cas9 분자에 대한 효과적인 gRNA 분자를 스크리닝하기 위한 프로토콜(분석 3, 아래 참조) 및 표적 DNA의 존재하에서 RNP 형성을 조사하기 위한 프로토콜(분석 4)를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 일부 구현예에서, 이 분석법은 gRNA:Cas9 단백질의 최상의 화학량론적 비율을 테스트하기 위한 프로토콜과 RNP 형성을 위한 최상의 용액 조건을 결정하기 위한 프로토콜인, 두 가지 상이한 프로토콜을 사용하여 수행된다.
RNP 복합체를 형성하기 위한 최상의 용액을 결정하기 위해 물 + 10x SYPRO Orange®Technologies cat#S-6650) 중 2μM의 Cas9 용액을 384 웰 플레이트에 분배한다. 그런 다음 pH와 염이 다양한 용액들에 희석된 등몰량의 gRNA를 첨가한다. 실온에서 10분 동안 인큐베이션하고 기포를 제거하기 위해 잠시 원심분리한 후, Bio-Rad CFX Manager 소프트웨어가 포함된 Bio-Rad CFX384™ Real-Time System C1000 Touch™ Thermal Cycler를 사용하여 20°C에서 90°C까지 10초마다 온도를 1°씩 증가시키며 구배(gradient)를 실행한다.
두 번째 분석법은 위의 분석 1의 최적 완충제에서 다양한 농도의 gRNA와 2μM Cas9를 혼합하고 384 웰 플레이트에 담아 RT(실온)에서 10분 동안 인큐베이션하는 것으로 구성된다. 동일한 부피의 최적 완충제 + 10x SYPRO Orange®Technologies cat#S-6650)를 첨가하고 플레이트를 Microseal®B 접착제(MSB-1001)로 밀봉한다. 기포를 제거하기 위해 잠시 원심분리한 후, Bio-Rad CFX Manager 소프트웨어가 포함된 Bio-Rad CFX384™ Real-Time System C1000 Touch™ Thermal Cycler를 사용하여 20°C에서 90°C까지 10초마다 온도를 1°씩 증가시키며 구배(gradient)를 실행한다.
세 번째 분석법에서, 관심 Cas9 분자(예를 들어, Cas9 단백질, 예를 들어, Cas9 변이체 단백질)을 정제한다. 변이체 gRNA 분자의 라이브러리를 합성하고 20μM의 농도로 재현탁한다. Cas9 분자를 5x SYPRO Orange®Technologies cat#S-6650)의 존재 하에 미리 결정된 완충제에서 각각 1μM의 최종 농도로 gRNA 분자와 함께 인큐베이션한다. 실온에서 10분 동안 인큐베이션하고 기포를 제거하기 위해 2000rpm으로 2분 동안 원심분리한 후, Bio-Rad CFX Manager 소프트웨어가 포함된 Bio-Rad CFX384™ Real-Time System C1000 Touch™ Thermal Cycler를 사용하여 20°C에서 90°C까지 10초마다 온도를 1°C씩 증가시키며 구배(gradient)를 실행한다.
네 번째 분석법에서, DSF 실험을 다음 샘플로 수행한다: Cas9 단백질 단독, gRNA가 있는 Cas9 단백질, gRNA와 표적 DNA가 있는 Cas9 단백질, 표적 DNA가 있는 Cas9 단백질. 성분 혼합 순서는 반응액, Cas9 단백질, gRNA, DNA, SYPRO Orange 순으로 한다. 반응액은 MgCl2의 부재 또는 존재하에 10mM HEPES pH 7.5, 100mM NaCl을 함유한다. 기포를 제거하기 위해 2000rpm으로 2분 동안 원심분리한 후, Bio-Rad CFX Manager 소프트웨어가 포함된 Bio-Rad CFX384™ Real-Time System C1000 Touch™ Thermal Cycler를 사용하여 20°C에서 90°C까지 10초마다 온도를 1°씩 증가시키며 구배(gradient)를 실행한다.
3. 유전자 파괴를 위한 제제의 전달
일부 구현예에서, 세포로의 도입 또는 전달을 위한 임의의 공지된 다수의 전달 방법 또는 매개체를 사용하여, 예를 들어 바이러스(예를 들어, 렌티바이러스) 전달 벡터, 또는 Cas9 분자 및 gRNA를 전달하기 위한 임의의 공지된 방법 또는 매개체를 사용하여 세포에 유전자 파괴를 유도할 수 있는 하나 이상의 제제(예를 들어, Cas9 및/또는 gRNA 성분들)를 전달 또는 도입하여, 인간의 (CD3제타를 암호화하는) 내인성 CD247 유전자 자리의 표적화된 유전자 파괴(예를 들어, DNA 절단)를 수행한다. 예시적인 방법이, 예를 들어, 문헌[Wang et al. (2012) J. Immunother. 35(9): 689-701; Cooper et al. (2003) Blood. 101:1637-1644; Verhoeyen et al. (2009) Methods Mol Biol. 506: 97-114; 및 Cavalieri et al. (2003) Blood. 102(2): 497-505]에 기재되어 있다. 일부 구현예에서, 유전자 파괴, 예를 들어 DNA 절단을 유도할 수 있는 하나 이상의 제제(들)의 하나 이상의 성분을 암호화하는 핵산 서열이, 예를 들어 본원에 기술된 또는 공지된 세포 내로 핵산을 도입하기 위한 임의의 방법에 의해, 세포 내로 도입된다. 일부 구현예에서, 유전자 파괴를 유도할 수 있는 CRISPR 가이드 RNA 및/또는 Cas9 효소와 같은 하나 이상의 제제의 성분들을 암호화하는 벡터는 세포 내로 전달될 수 있다.
일부 구현예에서, 유전자 파괴를 유도할 수 있는 하나 이상의 제제(예를 들어, Cas9/gRNA인 하나 이상의 제제)가 리보핵산단백질(RNP) 복합체로서 세포 내로 도입된다. RNP 복합체는 RNA 또는 gRNA 분자와 같은 리보뉴클레오타이드의 서열 및 Cas9 단백질 또는 이의 변이체와 같은 단백질을 포함한다. 예를 들어, Cas9 단백질은 표적 서열을 표적화하는 Cas9 단백질 및 gRNA 분자를 포함하는 RNP 복합체로서, 예를 들어 전기 천공법 또는 기타 물리적 전달 방법을 사용하여 전달된다. 일부 구현예에서, RNP는 전기 천공법 또는 기타 물리적 수단, 예를 들어 입자 총, 인산칼슘 형질주입, 세포 압축 또는 압착을 통해 세포 내로 전달된다. 일부 구현예에서, RNP는 추가 전달 제제(예를 들어, 저분자 제제, 지질 등)에 대한 필요 없이 세포의 원형질막을 통과할 수 있다. 일부 구현예에서, RNP로서 유전자 파괴를 유도할 수 있는 하나 이상의 제제(예를 들어, CRISPR/Cas9)의 전달은, 표적화된 파괴가 예를 들어 RNP가 도입된 세포에서 제제가 세포 자손으로 전파되지 않고 일시적으로 발생한다는 점에서 이점을 제공한다. 예를 들어, RNP에 의한 전달은 제제가 자손에게 유전되는 것을 최소화하여 자손에서 표적외 유전자 파괴의 가능성을 줄인다. 그러한 경우에, 유전자 파괴 및 전이 유전자의 통합은 자손 세포에 의해 유전될 수 있지만, 제제 자체가 없이 표적외 유전자 파괴를 추가로 도입할 수 있으며, 자손 세포로 전달된다.
유전자 파괴를 유도할 수 있는 제제(들) 및 성분들(예를 들어, Cas9 분자 및 gRNA 분자)은 표 3 및 4에 제시된 다양한 전달 방법 및 제형, 또는 예를 들어 문헌[WO 2015/161276; US 2015/0056705, US 2016/0272999, US 2017/0211075; 또는 US 2017/0016027]에 기술된 방법을 사용하여 다양한 형태로 표적 세포 내로 도입될 수 있다. 본원에 추가로 기재된 바와 같이, 이 전달 방법 및 제형을 사용하여 본원에 기재된 방법의 이전 또는 후속 단계에서 주형 폴리뉴클레오타이드 및/또는 기타 제제를 세포(예를 들어, 세포를 조작하는데 필요한 것)에 전달할 수 있다. Cas9 또는 gRNA 성분이 전달을 위한 DNA로서 암호화되는 경우, 이 DNA는 전형적으로, 예를 들어, 프로모터를 포함하는 조절 영역을 포함하여 발현을 달성할 수 있지만 반드시 그런 것은 아니다. Cas9 분자 서열에 대한 유용한 프로모터는 예를 들어 CMV, EF-1α, EFS, MSCV, PGK 또는 CAG 프로모터를 포함한다. gRNA에 대한 유용한 프로모터는 예를 들어 H1, EF-1α, tRNA 또는 U6 프로모터를 포함한다. 유사하거나 유사하지 않은 강도를 가진 프로모터를 선택하여 성분들의 발현을 조정할 수 있다. Cas9 분자를 암호화하는 서열은 핵 위치 신호(NLS), 예를 들어 SV40 NLS를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, Cas9 분자 또는 gRNA 분자에 대한 프로모터는 독립적으로 유도성, 조직 특이적 또는 세포 특이적일 수 있다. 일부 구현예에서, 유전자 파괴를 유도할 수 있는 제제는 RNP 복합체로서 도입된다. 일부 구현예에서, gRNA는 Alt-R 변형(IDT Technologies; Coralville, IA)과 같은 변형을 함유한다.
표 3. 예시적인 전달 방법
구성 요소 의견
Cas9 분자(들) gRNA 분자(들)
DNA DNA 본 구현예에서, Cas9 분자 및 gRNA는 DNA로부터 전사된다. 본 구현예에서, 이들은 별도의 분자들 상에서 암호화된다.
DNA 본 구현예에서, Cas9 분자 및 gRNA는 DNA로부터, 여기서는 단일 분자로부터 전사된다.
DNA RNA 본 구현예에서, Cas9 분자는 DNA로부터 전사되고, gRNA는 시험관 내 전사되거나 합성된 RNA로서 제공된다.
mRNA RNA 본 구현예에서, Cas9 분자는 시험관 내 전사된 mRNA 로부터 번역되고, gRNA는 시험관 내 전사되거나 합성된 RNA로서 제공된다.
mRNA DNA 본 구현예에서, Cas9 분자는 시험관 내 전사된 mRNA 로부터 번역되고, gRNA는 DNA로부터 전사된다.
단백질 DNA 본 구현예에서, Cas9 분자는 단백질로서 제공되고, gRNA는 DNA로부터 전사된다.
단백질 RNA 본 구현예에서, Cas9 분자는 단백질로서 제공되고, gRNA는 시험관 내 전사되거나 합성된 RNA로서 제공된다.
표 4. 예시적인 전달 방법의 비교
전달 벡터/방식 비분할 세포 내로 전달 발현 지속 기간

게놈 통합 전달된 분자의 유형

물리적(예를 들어, 전기 천공, 입자 총, 인산칼슘 형질주입, 세포 압축 또는 압착) 예 일시적 아니요 핵산 및 단백질
바이러스 레트로바이러스 아니요 안정적 예 RNA
렌티바이러스 예 안정적 예/변형 있는 경우 아니요 RNA
아데노바이러스 예 일시적 아니요 DNA
아데노 연관 바이러스(AAV) 예 안정적 아니요 DNA
우두 바이러스 예 매우 일시적 아니요 DNA
단순 헤르페스 바이러스 예 안정적 아니요 DNA
비바이러스 양이온성 리포솜 예 일시적 무엇이 전달되느냐에 따라 다름 핵산 및 단백질
중합 나노입자 예 일시적 무엇이 전달되느냐에 따라 다름 핵산 및 단백질
생물학적 비바이러스 전달 매개체 약독화 박테리아 예 일시적 아니요 핵산
조작된 박테리오파지
예 일시적 아니요 핵산
포유류 바이러스 유사 입자 예 일시적 아니요 핵산
생물학적 리포솜: 파열적혈구 및 엑소좀 예 일시적 아니요 핵산
일부 구현예에서, Cas9 분자 및/또는 gRNA 분자를 암호화하는 DNA, 또는 Cas9 분자 및/또는 gRNA 분자를 포함하는 RNP 복합체는 공지된 방법에 의해 또는 본원에 기술된 바와 같이 세포 내로 전달될 수 있다. 예를 들어, Cas9-암호화 및/또는 gRNA-암호화 DNA는 예를 들어 벡터(예를 들어, 바이러스 또는 비바이러스 벡터), 비벡터 기반 방법(예를 들어, 네이키드 DNA 또는 DNA 복합체를 사용함), 또는 이의 조합에 의해 전달될 수 있다. 일부 구현예에서, 제제(들) 및/또는 이의 성분들을 함유한 폴리뉴클레오타이드는 벡터(예를 들어, 바이러스 벡터/바이러스 또는 플라스미드)에 의해 전달된다. 이 벡터는 본원에 기술된 임의의 것일 수 있다.
일부 측면에서, CRISPR 효소(예를 들어, Cas9 뉴클레아제)가 가이드 서열과 조합하여(및 선택적으로 복합되어) 세포 내로 전달된다. 예를 들어, CRISPR 시스템의 하나 이상의 구성 요소는 I형, II형, 또는 III형 CRISPR 시스템으로부터 유래된다. 예를 들어, CRISPR 시스템의 하나 이상의 구성 요소는 스트렙토코쿠스 피오게네스(Streptococcus pyogenes), 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 또는 나이세리아 메닝기티디스(Neisseria meningitides)와 같은, 내인성 CRISPR 시스템을 포함하는 특정 유기체로부터 유래된다.
일부 구현예에서, Cas9 뉴클레아제(예를 들어, 스타필로코쿠스 아우레우스로부터 또는 스트렙토코쿠스 피오게네스로부터 유래된 mRNA(예를 들어, pCW-Cas9, Addgene #50661, Wang et al. (2014) Science, 3:343-80-4)에 의해 암호화된 것; 또는 Applied Biological Materials (ABM; Canada)에서 입수 가능한 Cat. No. K002, K003, K005 또는 K006의 뉴클레아제 또는 니카제 렌티바이러스 벡터) 및 표적 유전자(예를 들어, 인간의 CD247 유전자 자리)에 특이적인 가이드 RNA가 세포 내로 도입된다.
일부 구현예에서, 제제(들) 및/또는 이의 성분들을 함유한 폴리뉴클레오타이드 또는 RNP 복합체는 비벡터 기반 방법(예를 들어, 네이키드 DNA 또는 DNA 복합체를 사용함)에 의해 전달된다. 예를 들어, DNA 또는 RNA 또는 단백질 또는 이의 조합물, 예를 들어 리보핵산단백질(RNP) 복합체는 예를 들어 유기적으로 변형된 실리카 또는 규산염(Ormosil), 전기 천공법, 일시적 세포 압축 또는 압착(예컨대, 문헌[Lee, et al. (2012) Nano Lett 12: 6322-27, Kollmannsperger et al (2016) Nat Comm 7, 10372]에 기술됨), 유전자총, 소음파 천공법, 마그네토펙션, 지질 매개 형질주입, 덴드리머, 무기 나노입자, 인산칼슘, 또는 이의 조합에 의해 전달될 수 있다.
일부 구현예에서, 전기 천공법을 통한 전달은 카트리지, 챔버 또는 큐벳에서 세포를 Cas9- 및/또는 gRNA-암호화 DNA 또는 RNP 복합체와 혼합하고 정의된 기간 및 진폭으로 하나 이상의 전기 자극을 가하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 전기 천공법을 통한 전달은, 세포를 장치(예를 들어, 펌프)에 연결된 용기에서 Cas9- 및/또는 gRNA-암호화 DNA와 혼합하고 이 장치는 이 혼합물을 카트리지, 챔버 또는 큐벳에 공급하고 여기서 정의된 기간과 진폭으로 하나 이상의 전기 자극이 가해지고, 그 후 세포가 제2 용기로 전달되는, 시스템을 사용하여 수행된다.
일부 구현예에서, 전달 매개체는 비바이러스 벡터이다. 일부 구현예에서, 비바이러스 벡터는 무기 나노입자이다. 예시적인 무기 나노입자는 예를 들어 자성 나노입자(예를 들어, Fe3MnO2) 및 실리카를 포함한다. 나노입자의 외부 표면은 페이로드의 부착(예를 들어, 접합 또는 포착)을 허용하는 양으로 하전된 중합체(예를 들어, 폴리에틸렌이민, 폴리리신, 폴리세린)와 접합될 수 있다. 일부 구현예에서, 비바이러스 벡터는 유기 나노입자이다. 예시적인 유기 나노입자는 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜(PEG)로 코팅된 중성 헬퍼 지질과 함께 양이온성 지질을 함유하는 SNALP 리포솜, 및 지질로 코팅된 프로타민-핵산 복합체를 포함한다. 유전자 전달을 위한 예시적인 지질을 아래 표 5에 표시한다.
표 5. 유전자 전달에 사용되는 지질
지질 약어 특징
1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholine DOPC 헬퍼
1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphatidylethanolamine DOPE 헬퍼
콜레스테롤 헬퍼
N-[1-(2,3-Dioleyloxy)prophyl]N,N,N-trimethylammonium chloride DOTMA 양이온성
1,2-Dioleoyloxy-3-trimethylammonium-propane DOTAP 양이온성
Dioctadecylamidoglycylspermine DOGS 양이온성
N-(3-Aminopropyl)-N,N-dimethyl-2,3-bis(dodecyloxy)-1-propanaminium bromide GAP-DLRIE 양이온성
Cetyltrimethylammonium bromide CTAB 양이온성
6-Lauroxyhexyl ornithinate LHON 양이온성
1-(2,3-Dioleoyloxypropyl)-2,4,6-trimethylpyridinium 2Oc 양이온성
2,3-Dioleyloxy-N-[2(sperminecarboxamido-ethyl]-N,N-dimethyl-1-propanaminium trifluoroacetate DOSPA 양이온성
1,2-Dioleyl-3-trimethylammonium-propane DOPA 양이온성
N-(2-Hydroxyethyl)-N,N-dimethyl-2,3-bis(tetradecyloxy)-1-propanaminium bromide MDRIE 양이온성
Dimyristooxypropyl dimethyl hydroxyethyl ammonium bromide DMRI 양이온성
3β-[N-(N’,N’-Dimethylaminoethane)-carbamoyl]cholesterol DC-Chol 양이온성
Bis-guanidium-tren-cholesterol BGTC 양이온성
1,3-Diodeoxy-2-(6-carboxy-spermyl)-propylamide DOSPER 양이온성
Dimethyloctadecylammonium bromide DDAB 양이온성
Dioctadecylamidoglicylspermidin DSL 양이온성
rac-[(2,3-Dioctadecyloxypropyl)(2-hydroxyethyl)]-dimethylammonium chloride CLIP-1 양이온성
rac-[2(2,3-Dihexadecyloxypropyl-oxymethyloxy)ethyl]trimethylammonium bromide CLIP-6 양이온성
Ethyldimyristoylphosphatidylcholine EDMPC 양이온성
1,2-Distearyloxy-N,N-dimethyl-3-aminopropane DSDMA 양이온성
1,2-Dimyristoyl-trimethylammonium propane DMTAP 양이온성
O,O’-Dimyristyl-N-lysyl aspartate DMKE 양이온성
1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine DSEPC 양이온성
N-Palmitoyl D-erythro-sphingosyl carbamoyl-spermine CCS 양이온성
N-t-Butyl-N0-tetradecyl-3-tetradecylaminopropionamidine diC14-amidine 양이온성
Octadecenolyoxy[ethyl-2-heptadecenyl-3 hydroxyethyl] imidazolinium chloride DOTIM 양이온성
N1-Cholesteryloxycarbonyl-3,7-diazanonane-1,9-diamine CDAN 양이온성
2-(3-[Bis(3-amino-propyl)-amino]propylamino)-N-ditetradecylcarbamoylme-ethyl-acetamide RPR209120 양이온성
1,2-dilinoleyloxy-3-dimethylaminopropane DLinDMA 양이온성
2,2-dilinoleyl-4-dimethylaminoethyl-[1,3]-dioxolane DLin-KC2-DMA 양이온성
dilinoleyl-methyl-4-dimethylaminobutyrate DLin-MC3-DMA 양이온성
유전자 전달을 위한 예시적인 중합체를 아래 표 6에 표시한다.
표 6. 유전자 전달에 사용되는 중합체
중합체 약어
폴리(에틸렌)글리콜 PEG
폴리에틸렌이민 PEI
Dithiobis(succinimidylpropionate) DSP
Dimethyl-3,3’-dithiobispropionimidate DTBP
Poly(ethylene imine) biscarbamate PEIC
Poly(L-lysine) PLL
히스티딘 변형 PPL
Poly(N-vinylpyrrolidone) PVP
Poly(propylenimine) PPI
Poly(amidoamine) PAMAM
Poly(amido ethylenimine) SS-PAEI
Triethylenetetramine TETA
Poly(β-aminoester)
Poly(4-hydroxy-L-proline ester) PHP
Poly(allylamine)
Poly(α-[4-aminobutyl]-L-glycolic acid) PAGA
Poly(D,L-lactic-co-glycolic acid) PLGA
Poly(N-ethyl-4-vinylpyridinium bromide)
Poly(phosphazene)s PPZ
Poly(phosphoester)s PPE
Poly(phosphoramidate)s PPA
Poly(N-2-hydroxypropylmethacrylamide) pHPMA
Poly (2-(dimethylamino)ethyl methacrylate) pDMAEMA
Poly(2-aminoethyl propylene phosphate) PPE-EA
키토산
갈락토실화 키토산
N-Dodacylated chitosan
히스톤
콜라겐
덱스트란-스페르민 D-SPM
일부 구현예에서, 매개체는 나노입자 및 리포솜, 예를 들어 세포 특이적 항원, 단클론 항체, 단일 사슬 항체, 앱타머, 중합체, 당 및 세포 투과 펩타이드의 표적 세포 업데이트를 증가시키기 위한 표적화 변형을 갖는다. 일부 구현예에서, 매개체는 융합 및 엔도솜-불안정화 펩타이드/중합체를 사용한다. 일부 구현예에서, 매개체는 (예를 들어, 카고(cargo)의 엔도솜 탈출을 가속화하기 위해) 산-유발 형태 변화를 겪는다. 일부 구현예에서, 예를 들어 세포 구획에서의 방출을 위해 자극-절단성 중합체가 사용된다. 예를 들어, 환원성 세포 환경에서 절단되는 이황화물 기반 양이온성 중합체를 사용할 수 있다.
일부 구현예에서, 전달 매개체는 생물학적 비바이러스 전달 매개체이다. 일부 구현예에서, 매개체는 (예를 들어, 침습적이지만 발병을 방지하도록 약독화되고 전이 유전자(예를 들어, 리스테리아 모노사이토제니스, 특정 살모넬라균 계통, 비피도박테리움 롱굼, 및 변형된 대장균), 특정 세포를 표적화하는 영양 및 조직 특이적 친화성을 갖는 박테리아, 표적 세포 특이성을 변경하기 위해 표면 단백질을 변형시킨 박테리아를 발현하도록 자연적으로 또는 인공적으로 조작된) 약독화된 박테리아이다. 일부 구현예에서, 매개체는 유전적으로 변형된 박테리오파지(예를 들어, 큰 패키징 능력을 갖고, 면역원성이 낮고, 포유류 플라스미드 유지 서열을 함유하고 통합된 표적화 리간드를 갖는 조작된 파지)이다. 일부 구현예에서, 매개체는 포유류 바이러스 유사 입자이다. 예를 들어, 변형된 바이러스 입자는 (예를 들어, “빈” 입자들을 정제한 후 바이러스와 원하는 카고의 생체 외 시험 조립에 의하여) 생성될 수 있다. 매개체는 또한 표적화 리간드를 통합하여 표적 조직-특이성을 변경하도록 조작될 수 있다. 일부 구현예에서, 매개체는 생물학적 리포솜이다. 예를 들어, 생물학적 리포솜은 인간 세포(예를 들어, 대상체로부터 유래된 구형 구조물들로 분해된 적혈구 세포인 파열적혈구(예를 들어, 조직 표적화는 다양한 조직 또는 세포-특이적 리간드의 부탁으로 달성될 수 있음), 또는 세포내 기원의 대상체-유래 막-결합 나노소포(30-100nm)인 분비 엑소좀(예를 들어, 다양한 세포 유형으로부터 생성될 수 있고 따라서 표적화 리간드가 필요 없이 세포에 의해 흡수될 수 있음))로부터 유래된 인지질 기반 입자이다.
일부 구현예에서, Cas9 분자 및/또는 gRNA 분자를 암호화하는 RNA는 세포, 예를 들어 본원에 기술된 표적 세포 내로 공지된 방법에 의해 또는 본원에 기술된 바와 같이 전달될 수 있다. 예를 들어, Cas9-암호화 및/또는 gRNA-암호화 RNA는 예를 들어 미세주입, 전기 천공법, 일시적 세포 압축 또는 압착(예컨대, 문헌[Lee, et al. (2012) Nano Lett 12: 6322-27]에 기술됨), 지질 매개 형질주입, 펩타이드 매개 전달(예를 들어, 세포 관통 펩타이드), 또는 이들의 조합에 의해 전달될 수 있다.
일부 구현예에서, 전기 천공법을 통한 전달은 카트리지, 챔버 또는 큐벳에서 세포를 Cas9 분자 및/또는 gRNA 분자를 암호화하는 RNA와 혼합하고 정의된 기간 및 진폭으로 하나 이상의 전기 자극을 가하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 전기 천공법을 통한 전달은, 세포를 장치(예를 들어, 펌프)에 연결된 용기에서 Cas9 분자 및/또는 gRNA 분자를 암호화하는 RNA와 혼합하고 이 장치는 이 혼합물을 카트리지, 챔버 또는 큐벳에 공급하고 여기서 정의된 기간과 진폭으로 하나 이상의 전기 자극이 가해지고, 그 후 세포가 제2 용기로 전달되는, 시스템을 사용하여 수행된다.
일부 구현예에서, Cas9 분자는 공지된 방법에 의해 또는 본원에 기술된 바와 같이 세포 내로 전달될 수 있다. 예를 들어, Cas9 단백질 분자는 예를 들어 미세주입, 전기 천공법, 일시적 세포 압축 또는 압착(예컨대, 문헌[Lee, et al. (2012) Nano Lett 12: 6322-27]에 기술됨), 지질 매개 형질주입, 펩타이드 매개 전달, 또는 이들의 조합에 의해 전달될 수 있다. 전달은 gRNA를 암호화하는 DNA에 의해 또는 gRNA에 의해 달성될 수 있다.
일부 구현예에서, 절단을 도입할 수 있는 하나 이상의 제제(예를 들어, Cas9/gRNA 시스템)가 리보핵산단백질(RNP) 복합체로서 세포 내로 도입된다. RNP 복합체는 RNA 또는 gRNA 분자와 같은 리보뉴클레오타이드의 서열 및 Cas9 단백질 또는 이의 변이체와 같은 단백질을 포함한다. 예를 들어, Cas9 단백질은 표적 서열을 표적화하는 Cas9 단백질 및 gRNA 분자를 포함하는 RNP 복합체로서, 예를 들어 전기 천공법 또는 기타 물리적 전달 방법을 사용하여 전달된다. 일부 구현예에서, RNP는 전기 천공법 또는 기타 물리적 수단, 예를 들어 입자 총, 인산칼슘 형질주입, 세포 압축 또는 압착을 통해 세포 내로 전달된다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 제제는 리보핵산단백질(RNP) 복합체이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 조작을 위한 세포와 인큐베이션되거나 이에 첨가되거나 이와 접촉하는 RNP의 농도는 (약) 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 2, 2.2, 2.5, 3, 4, 5, 6, 7, 7.5, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40 또는 50μM의 농도이거나, 전술한 수치 중 임의의 2개에 의해 정의된 범위이다. 일부 구현예에서, 조작을 위한 세포와 인큐베이션되거나 이에 첨가되거나 이와 접촉하는 RNP의 농도는 (약) 1, 2, 2.5, 5, 10, 20, 25, 30, 40 또는 50μM의 농도이거나, 전술한 수치 중 임의의 2개에 의해 정의된 범위이다. 일부 구현예에서, RNP의 농도는 2μM이다. 일부 구현예에서, RNP의 농도는 25μM이다. 일부 구현예에서, RNP 복합체에서, gRNA 및 Cas9 분자 또는 다른 뉴클레아제의 비율(예를 들어, 몰 비율)은 (약) 5:1, 4:1, 3:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:3, 1:4 또는 1:5이거나, 전술한 수치 중 임의의 2개에 의해 정의된 범위이다. 일부 구현예에서, RNP 복합체에서, gRNA 및 Cas9 분자 또는 다른 뉴클레아제의 비율(예를 들어, 몰 비율)은 (약) 3:1, 2.9:1, 2.8:1, 2.7:1, 2.6:1, 2.5:1, 2.4:1, 2.3:1, 2.2:1, 2.1:1, 2:1 또는 1:1이거나, 전술한 수치 중 임의의 2개에 의해 정의된 범위이다. 일부 구현예에서, RNP 복합체에서, gRNA 및 Cas9 분자 또는 다른 뉴클레아제의 몰 비율은 (약) 2.6:1이다.
일부 구현예에서, 전기 천공법을 통한 전달은 카트리지, 챔버 또는 큐벳에서 세포를 Cas9 분자와 gRNA 분자가 있는 상태로 또는 없는 상태로 혼합하고 정의된 기간 및 진폭으로 하나 이상의 전기 자극을 가하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 전기 천공법을 통한 전달은, 세포를 장치(예를 들어, 펌프)에 연결된 용기에서 Cas9 분자와 gRNA 분자가 있는 상태로 또는 없는 상태로 혼합하고 이 장치는 이 혼합물을 카트리지, 챔버 또는 큐벳에 공급하고 여기서 정의된 기간과 진폭으로 하나 이상의 전기 자극이 가해지고, 그 후 세포가 제2 용기로 전달되는, 시스템을 사용하여 수행된다.
일부 구현예에서, 전기 천공법을 통한 전달은 카트리지, 챔버 또는 큐벳에서 세포를 Cas9 분자(예를 들어, eaCas9 분자, eiCas9 분자 또는 eiCas9 융합 단백질)와 gRNA 분자가 있는 상태로 또는 없는 상태로 혼합하고 정의된 기간 및 진폭으로 하나 이상의 전기 자극을 가하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 전기 천공법을 통한 전달은, 세포가 Cas9 분자(예를 들어, eaCas9 분자, eiCas9 분자 또는 eiCas9 융합 단백질)와 혼합되는, 시스템을 사용하여 수행된다.
일부 구현예에서, 제제(들) 및/또는 이의 성분들을 함유한 폴리뉴클레오타이드는 벡터 및 비벡터 기반 방법의 조합에 의해 전달된다. 예를 들어, 비로좀(virosome)은 불활성화 바이러스(예를 들어, HIV 또는 인플루엔자 바이러스)와 결합된 리포솜을 포함하며, 이는 바이러스 또는 리포솜 방법 단독보다 더 효율적인 유전자 전달을 초래한다.
일부 구현예에서, 하나 초과의 제제(들) 또는 이의 성분들이 세포 내로 전달된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 게놈에서 둘 이상의 위치, 예컨대 (CD3제타를 암호화하는) CD247 유전자 자리 내 둘 이상의 부위의 유전자 파괴를 유도할 수 있는 제제(들)가 세포 내로 전달된다. 일부 구현예에서, 제제(들) 및 이의 성분들은 한 방법을 사용하여 전달된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, CD247 유전자 자리의 유전자 파괴를 유도하기 위한 제제(들)는 유전자 파괴를 위한 성분을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드로서 전달된다. 일부 구현예에서, 하나의 폴리뉴클레오타이드는 CD247 유전자 자리를 표적화하는 제제들을 암호화할 수 있다. 일부 구현예에서, 둘 이상의 상이한 폴리뉴클레오타이드는 CD247 유전자 자리를 표적화하는 제제들을 암호화할 수 있다. 일부 구현예에서, 유전자 파괴를 유도할 수 있는 제제들은 리보핵산단백질(RNP) 복합체로서 전달될 수 있고, 둘 이상의 상이한 RNP 복합체는 혼합물로서 함께 또는 별도로 전달될 수 있다.
일부 구현예에서, 유전자 파괴를 유도할 수 있는 하나 이상의 제제(들) 및/또는 이의 성분들(예를 들어, Cas9 분자 성분 및/또는 gRNA 분자 성분) 외의 하나 이상의 핵산 분자, 예컨대 HDR-유도 통합을 위한 주형 폴리뉴클레오타이드(예컨대 본원, 예를 들어 섹션 I.B.2에 기술된 임의의 주형 폴리뉴클레오타이드)가 전달된다. 일부 구현예에서, 핵산 분자(예를 들어, 주형 폴리뉴클레오타이드)는 Cas 시스템의 성분들 중 하나 이상과 동시에 전달된다. 일부 구현예에서, 핵산 분자는 Cas 시스템의 성분들 중 하나 이상이 전달되기 (예를 들어, 약 1분, 5분, 10분, 15분, 30분, 1시간, 2시간, 3시간, 6시간, 9시간, 12시간, 1일, 2일, 3일, 1주일, 2주일, 또는 4주일 미만) 전 또는 후에 전달된다. 일부 구현예에서, 핵산 분자(예를 들어, 주형 폴리뉴클레오타이드)는 Cas 시스템의 성분들(예를 들어, Cas9 분자 성분 및/또는 gRNA 분자 성분) 중 하나 이상과 상이한 수단에 의해 전달된다. 핵산 분자(예를 들어, 주형 폴리뉴클레오타이드)는 본원에 기술된 임의의 방법에 의해 전달될 수 있다. 예를 들어, 핵산 분자(예를 들어, 주형 폴리뉴클레오타이드)는 바이러스 벡터(예를 들어, 레트로바이러스 또는 렌티바이러스)에 의해 전달될 수 있고, Cas9 분자 성분 및/또는 gRNA 분자 성분은 전기 천공법에 의해 전달될 수 있다. 일부 구현예에서, 핵산 분자(예를 들어, 주형 폴리뉴클레오타이드)는 하나 이상의 외인성 서열(예를 들어, 키메라 수용체 또는 이의 일부를 암호화하는 서열) 및/또는 다른 외인성 유전자 핵산 서열을 포함한다.
B. 상동 직접 수선(HDR)을 통한 표적화된 통합
일부 측면에서, 제공된 구현예는 CD3제타(CD3ζ)를 암호화하는 내인성 CD247 유전자 자리의 게놈 내 특정 위치(예컨대 표적 부위 또는 표적 위치)에서, 키메라 수용체 또는 이의 일부를 암호화하는 전이 유전자 서열을 함유하는 주형 폴리뉴클레오타이드의 부분과 같은 폴리뉴클레오타이드의 특이적인 부분의 표적화된 통합을 포함한다. 일부 측면에서, 상동 직접 수선(HDR)은 표적 부위에서 전이 유전자 서열의 부위 특이적인 통합을 중개할 수 있다. 일부 구현예에서, 유전자 파괴(예를 들어, 섹션 I.A에 기술된 것과 같은 DNA 절단) 및 하나 이상의 상동성 암(arm)을 함유하는 (예를 들어, 유전자 파괴 주변의 서열에 상동성인 핵산 서열을 함유하는) 주형 폴리뉴클레오타이드의 존재는 상동성 서열이 DNA 수선을 위한 주형으로 작용하여 HDR을 유도하거나 지시할 수 있다. 유전자 파괴 주변의 내인성 유전자 서열과 폴리뉴클레오타이드에 포함된 5’ 및/또는 3’ 상동성 암(arm) 사이의 상동성에 기초하여, 세포 DNA 수선 기구는 주형 폴리뉴클레오타이드를 사용하여 유전자 파괴의 표적 부위에서 DNA 절단을 수선하고 유전자 정보를 재합성(예를 들어, 복제)할 수 있으며, 이로써 유전자 파괴의 부위에서 또는 그 근처에서 주형 폴리뉴클레오타이드에 전이 유전자 서열을 효과적으로 삽입하거나 통합할 수 있다. 일부 구현예에서, CD3ζ를 암호화하는 내인성 CD247 유전자 자리에서 유전자 파괴는 본원에 기술된 예를 들어 섹션 I.A에 기술된 표적화된 유전자 파괴를 생성하는 임의의 방법에 의해 생성될 수 있다.
폴리뉴클레오타이드, 예를 들어 본원에 기술된 주형 폴리뉴클레오타이드, 및 그러한 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 키트가 또한 제공된다. 일부 구현예에서, 제공된 폴리뉴클레오타이드 및/또는 키트는 CD3제타를 암호화하는 내인성 CD247 유전자 자리에서 키메라 수용체의 일부를 암호화하는 전이 유전자 서열을 표적화하기 위해, 예를 들어 HDR을 포함하여 본원에 기술된 방법에 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오타이드는 키메라 수용체 또는 이의 일부(예를 들어, 키메라 수용체의 하나 이상의 영역 또는 도메인)를 암호화하는, 외인성 또는 이종성 핵산 서열과 같은 전이 유전자, 및 CD3ζ를 암호화하는 내인성 CD247 유전자 자리에서 내인성 게놈 부위의 또는 그 근처의 서열에 상동성인 상동성 서열(예를 들어, 상동성 암)을 함유하는 폴리뉴클레오타이드이거나 이를 포함한다. 일부 측면에서, 주형 폴리뉴클레오타이드 내 전이 유전자 서열은 키메라 수용체의 일부를 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 키메라 수용체의 일부를 암호화하는 전이 유전자 서열의 표적화된 통합 시, 조작된 세포 내 CD247 유전자 자리가 변형되며, 이로써 변형된 CD247 유전자 자리가 전이 유전자 서열과 내인성 CD247 유전자 자리의 서열의 융합물을 함유하게 되고, 상기 융합물은 키메라 수용체(예를 들어, 키메라 항원 수용체(CAR))를 암호화한다.
일부 측면에서, 주형 폴리뉴클레오타이드는 선형 DNA 단편으로서 도입되거나 벡터에 포함된다. 일부 측면에서, 유전자 파괴를 유도하는 단계 및 (예를 들어, 주형 폴리뉴클레오타이드의 도입에 의한) 표적화된 통합 단계는 동시에 또는 순차적으로 수행된다.
1. 상동 직접 수선(HDR)
일부 구현예에서, 상동 직접 수선(HDR)은 CD247 유전자 자리의 게놈 내 하나 이상의 표적 부위에서, 키메라 수용체 또는 이의 일부를 암호화하는 하나 이상의 핵산 서열(예를 들어, 전이 유전자 서열)의 표적화된 통합 또는 삽입에 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 뉴클레아제-유도 HDR은 표적 서열을 변경하고, 특정 표적 위치에서 전이 유전자 서열을 통합하고, 및/또는 특정 표적 유전자 내 돌연변이를 편집 또는 수선하는 데 사용될 수 있다.
표적 부위에서 핵산 서열의 변경은 외인성으로 제공된 폴리뉴클레오타이드, 예를 들어 주형 폴리뉴클레오타이드(“공여 폴리뉴클레오타이드” 또는 “주형 서열”로도 지칭됨)를 사용한 HDR에 의해 발생할 수 있다. 예를 들어, 주형 폴리뉴클레오타이드는 주형 폴리뉴클레오타이드 내에 함유된 전이 유전자 서열의 삽입과 같은 표적 서열의 변경을 제공한다. 일부 구현예에서, 상동 재조합을 위한 주형으로 플라스미드 또는 벡터가 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 선형 DNA 단편이 상동 재조합을 위한 주형으로 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 서열 및 주형 폴리뉴클레오타이드 사이의 상동 직접 수선(예를 들어, 단일 가닥 어닐링)의 대체 방법에 의한 표적 서열의 변경을 위한 주형으로 단일 가닥 주형 폴리뉴클레오타이드가 사용될 수 있다. 주형 폴리뉴클레오타이드-영향을 받은 표적 서열의 변경은 뉴클레아제, 예를 들어 CRISPR/Cas9와 같은 표적화된 뉴클레아제에 의한 절단에 의존한다. 뉴클레아제에 의한 절단은 이중 가닥 절단 또는 두 개의 단일 가닥 절단을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, “재조합”은 두 폴리뉴클레오타이드 사이에 유전자 정보의 교환 과정을 포함한다. 일부 구현예에서, “상동 재조합(HR)”은, 예를 들어 세포에서 상동 직접 수선 메커니즘을 통해 이중 가닥 절단의 수선 중에, 발생하는 상기와 같은 교환의 특수화된 형태를 포함한다. 이 과정은 뉴클레오타이드 서열 상동성을 필요로 하고, 표적 DNA(즉, 내인성 유전자 내 표적 부위와 같이 이중 가닥 절단을 경험한 것)의 수선을 주형하는 데 주형 뉴클레오타이드를 사용하고, 그리고 “비교차형 유전자 전환” 또는 “단관 유전자 전환(short tract gene conversion)”으로 다양하게 알려져 있으며, 이는 주형 폴리뉴클레오타이드로부터 표적으로의 유전자 정보의 전달로 이어지기 때문이다. 일부 구현예에서, 이러한 전달은 절단된 표적 및 주형 폴리뉴클레오타이드 사이에 형성되는 이형2중가닥 DNA의 미스매치 정정, 및/또는 “합성-의존 가닥 어닐링(synthesis-dependent strand annealing)”을 포함할 수 있으며, 여기서 주형 폴리뉴클레오타이드는 표적의 일부, 및/또는 관련 과정이 될 유전자 정보를 재합성하는 데 사용된다. 상기 특수화된 HR은 종종 주형 폴리뉴클레오타이드의 서열의 일부 또는 전부가 표적 폴리뉴클레오타이드 내로 편입되도록 표적 분자의 서열의 변경을 초래한다.
일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오타이드와 같은 폴리뉴클레오타이드(예를 들어, 전이 유전자를 함유한 폴리뉴클레오타이드)의 일부가 상동-독립적 메커니즘을 통해 세포의 게놈 내로 통합된다. 본 방법은 세포의 게놈에서 이중 가닥 절단(DSB)를 생성하는 것과 뉴클레아제를 사용하여 주형 폴리뉴클레오타이드 분자를 절단하는 것을 포함하며, 이로써 주형 폴리뉴클레오타이드가 DSB의 부위에서 통합되게 한다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오타이드는 비상동 의존적 방법(예를 들어, NHEJ)을 통해 통합된다. 생체 내 절단 시 주형 폴리뉴클레오타이드는 DSB의 위치에서 세포의 게놈 내로 표적화된 방식으로 통합될 수 있다. 주형 폴리뉴클레오타이드는 DSB를 생성하는 데 사용되는 뉴클레아제들 중 하나 이상에 대한 동일한 표적 부위들 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 따라서, 주형 폴리뉴클레오타이드는 통합이 필요한 내인성 유전자를 절단하는 데 사용되는 동일한 뉴클레아제들 중 하나 이상에 의해 절단될 수 있다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오타이드는 DSB를 유도하기 위해 사용되는 뉴클레아제와 상이한 뉴클레아제 표적 부위를 포함한다. 본원에 기술된 바와 같이, 표적 부위 또는 표적 위치의 유전자 파괴는 ZFN, TALEN, CRISPR/Cas9 시스템 또는 TtAgo 뉴클레아제와 같은 임의의 공지된 방법 또는 본원에 기재된 임의의 방법에 의해 생성될 수 있다.
일부 구현예에서, DNA 수선 메커니즘은 (1) 단일 이중 가닥 절단, (2) 2개의 단일 가닥 절단, (3) 표적 부위의 양쪽에서 절단이 발생하는 2개의 이중 가닥 절단, (4) 표적 부의의 양쪽에서 이중 가닥 절단 및 2개의 단일 가닥 절단이 발생하는 1개의 이중 가닥 절단 및 2개의 단일 가닥 절단, (5) 표적 부위의 양쪽에서 단일 가닥 절단 쌍이 발생하는 4개의 단일 가닥 절단, 또는 (6) 1개의 단일 가닥 절단 후에 뉴클레아제에 의해 유도될 수 있다. 일부 구현예에서, 단일 가닥 주형 폴리뉴클레오타이드가 사용되며 표적 부위는 대안적 HDR에 의해 변경될 수 있다.
주형 폴리뉴클레오타이드-영향을 받은 표적 부위의 변경은 뉴클레아제 분자에 의한 절단에 의존한다. 뉴클레아제에 의한 절단은 닉(nick), 이중 가닥 절단, 또는 2개의 단일 가닥 절단을, 예를 들어 표적 부위에서 DNA의 각 가닥에 하나씩 포함할 수 있다. 표적 부위에 절단들의 도입 후에, 절단 말단에서 절제가 일어나 단일 가닥의 돌출된 DNA 영역들이 생성된다.
표준 HDR에서, 표적 부위 내로 직접 편입되거나 또는 전이 유전자를 삽입하거나 표적 부위의 서열을 정정하는 데 주형으로 사용될 표적 부위에 대한 상동 서열을 포함하는 이중 가닥 주형 폴리뉴클레오타이드가 도입된다. 절단에서 절개 후, 수선은 상이한 경로들에 의해, 예를 들어 이중 홀리데이 접합 모델(또는 이중 가닥 절단 수선(DSBR) 경로) 또는 합성-의존 가닥 어닐링(SDSA) 경로에 의해 진행될 수 있다.
이중 홀리데이 접합 모델에서, 주형 폴리뉴클레오타이드에서 상동 서열에 대한 표적 부위의 2개의 단일 가닥 돌출부에 의한 가닥 침습이 발생하여, 2개의 홀리데이 접합이 있는 중간체의 형성을 초래한다. 침습 가닥의 말단에서 새로운 DNA가 합성되어 절제로 인한 갭을 채움에 따라 접합부가 이동한다. 새로 합성된 DNA의 말단이 절개된 말단에 결찰되고, 접합부는 분해되어 표적 부위에 삽입, 예를 들어 주형 폴리뉴클레오타이드에 전이 유전자의 삽입이 일어난다. 접합부 분해 시 주형 폴리뉴클레오타이드와의 교차가 발생할 수 있다.
SDSA 경로에서, 단 하나의 단일 가닥 돌출부가 주형 폴리뉴클레오타이드를 침습하고 침습 가닥의 말단으로부터 새로운 DNA가 합성되어 절개로 인한 갭을 채운다. 그런 후 새로 합성된 DNA는 나머지 단일 가닥 돌출부에 어닐링되고, 새로운 DNA가 합성되어 갭을 채우고, 가닥들이 결찰되어 변형된 DNA 이중체가 생성된다.
대안적 HDR에서, 단일 가닥 주형 폴리뉴클레오타이드, 예를 들어 주형 폴리뉴클레오타이드가 도입된다. 원하는 표적 부위를 변경하기 위해 표적 부위에서 닉, 단일 가닥 절단 또는 이중 가닥 절단이 뉴클레아제 분자에 의해 매개되고, 절단에서 절개가 발생하여 단일 가닥 돌출부를 드러낸다. DNA의 표적 부위를 정정 또는 변경하기 위한 주형 폴리뉴클레오타이드의 서열의 편입은 일반적으로 본원에 기술된 바와 같은 SDSA에 의해 발생한다.
“대안적 HDR” 또는 일부 구현예에서 대안적 상동 직접 수선은 상동 핵산(예를 들어, 내인성 상동 서열, 예를 들어 자매 염색분체, 또는 외인성 핵산, 예를 들어 주형 폴리뉴클레오타이드)을 사용하여 DNA 손상을 수선하는 과정을 지칭한다. 대안적 HDR은 그 과정이 표준 HDR과 상이한 경로를 사용한다는 점에서 표준 HDR과 다르며, 표준 HDR 매개체인 RAD51 및 BRCA2에 의해 억제될 수 있다. 또한, 대안적 HDR은 절단의 수선을 위해 단일 가닥 또는 닉이 발생한 상동 핵산을 사용한다. “표준 HDR” 또는 일부 구현예에서 표준 상동 직접 수선은 상동 핵산(예를 들어, 내인성 상동 서열, 예를 들어 자매 염색분체, 또는 외인성 핵산, 예를 들어 주형 핵산)을 사용하여 DNA 손상을 수선하는 과정을 지칭한다. 표준 HDR은 일반적으로 이중 가닥 절단에서 상당한 절제가 있을 때 작동하여 DNA의 적어도 하나의 단일 가닥 부분을 형성한다. 정상 세포에서, HDR은 일반적으로 절단의 인식, 절단의 안정화, 절개, 단일 가닥 DNA의 안정화, DNA 교차 중간체의 형성, 교차 중간체의 분해, 및 결찰과 같은 일련의 단계들을 포함한다. 이 과정은 RAD51 및 BRCA2를 필요로 하며 상동 핵산은 일반적으로 이중 가닥이 된다. 달리 나타내지 않는 한, 일부 실시예에서 용어 “HDR”은 표준 HDR 및 대안적 HDR을 포함한다.
일부 구현예에서, 이중 가닥 절단은 뉴클레아제, 예를 들어 HNH 유사 도메인과 관련된 절단 활성 및 RuvC 유사 도메인(예를 들어, N-말단 RuvC 유사 도메인)과 관련된 절단 활성을 가진 Cas9 분자, 예를 들어 야생형 Cas9에 의해 달성된다. 이러한 구현예는 단일 gRNA만을 필요로 한다.
일부 구현예에서, 하나의 단일 가닥 절단 또는 닉은 니카제 활성을 가진 뉴클레아제 분자, 예를 들어 Cas9 니카제에 의해 달성된다. 표적 부위의 닉이 발생한 DNA는 대안적 HDR의 기질이 될 수 있다.
일부 구현예에서, 2개의 단일 가닥 절단 또는 닉은 니카제 활성, 예를 들어 HNH 유사 도메인과 관련된 절단 활성 또는 N-말단 RuvC 유사 도메인과 관련된 절단 활성을 가진 뉴클레아제, 예를 들어 Cas9 분자에 의해 달성된다. 이러한 구현예는 일반적으로 각 단일 가닥 절단의 배치를 위해 하나씩 2개의 gRNA를 필요로 한다. 일부 구현예에서, 니카제 활성을 가진 Cas9 분자는 gRNA가 혼성화되는 가닥을 절단하지만, gRNA가 혼성화하는 가닥에 상보적인 가닥은 절단하지 않는다. 일부 구현예에서, 니카제 활성을 가진 Cas9 분자는 gRNA가 혼성화되는 가닥을 절단하지 않지만, gRNA가 혼성화하는 가닥에 상보적인 가닥은 절단한다. 일부 구현예에서, 니카제는 HNH 활성을 갖는데, 예를 들어 RuvC 활성이 비활성화된 Cas9 분자, 예를 들어 D10에 돌연변이(예를 들어, D10A 돌연변이)를 갖는 Cas9 분자를 갖는다. D10A는 RuvC를 비활성화하며, 따라서, Cas9 니카제는 HNH 활성(만)을 가지며 gRNA가 혼성화하는 가닥(예를 들어, NGG PAM이 없는 상보적 가닥)을 절단할 것이다. 일부 구현예에서, H840, 예를 들어, H840A 돌연변이를 갖는 Cas9 분자는 니카제로 사용될 수 있다. H840A는 HNH를 비활성화하며, 따라서, Cas9 니카제는 RuvC 활성(만)을 가지며 비상보적 가닥(예를 들어, NGG PAM이 있고 서열이 gRNA와 동일한 가닥)을 절단한다. 일부 구현예에서, Cas9 분자는 N-말단 RuvC 유사 도메인 니카제이고, 예를 들어 Cas9 분자는 N863, 예를 들어 N863A에서의 돌연변이를 포함한다.
니카제 및 2개의 gRNA를 사용하여 2개의 단일 가닥 닉을 위치시키는 일부 구현예에서, 1개의 닉은 표적 DNA의 + 가닥에 있고 하나의 닉은 - 가닥에 있다. PAM은 바깥쪽을 향하고 있다. gRNA는 gRNA가 약 0-50, 0-100, 또는 0-200개 뉴클레오타이드로 분리되도록 선택될 수 있다. 일부 구현예에서, 두 gRNA의 표적화 도메인에 상보적인 표적 서열 사이에는 겹치는 부분이 없다. 일부 구현예에서, gRNA는 겹치지 않으며 50, 100 또는 200개의 뉴클레오타이드 만큼으로 분리된다. 일부 구현예에서, 2개의 gRNA를 사용하면 예를 들어 표적외 결합을 감소시킴으로써 특이성을 증가시킬 수 있다(Ran et al., Cell 2013).
일부 구현예에서, 단일 닉을 사용하여 HDR(예를 들어, 대안적 HDR)을 유도할 수 있다. 여기서는 단일 닉이 표적 부위와 같은 주어진 절단 부위에서 NHEJ에 대한 HR의 비율을 증가시키기 위해 사용될 수 있다는 것이 고려된다. 일부 구현예에서, 단일 가닥 절단은 상기 gRNA의 표적화 도메인이 상보적인 표적 부위의 DNA 가닥에 형성된다. 일부 구현예에서, 단일 가닥 절단은 상기 gRNA의 표적화 도메인이 상보적인 가닥 이외의 표적 부위의 DNA 가닥에 형성된다.
일부 구현예에서, 단일 가닥 어닐링(SSA), 단일 가닥 절단 수선(SSBR), 미스매치 수선(MMR), 염기 절제 수선(BER), 뉴클레오타이드 절제 수선(NER), 가닥간 교차 결합(ICL), 손상통과 합성(TLS), 오류 없는 복제후 수선(PRR)과 같은 다른 DNA 수선 경로가 뉴클레아제에 의해 생성된 이중 가닥 또는 단일 가닥 절단을 복구하기 위해 세포에 의해 사용될 수 있다.
표적화된 통합은 전이 유전자, 예를 들어 상동성 암들 사이의 서열이 게놈의 CD247 유전자 자리에 통합되도록 한다. 전이 유전자는 게놈 내의 적어도 하나의 표적 부위(들) 또는 부위 중 하나 또는 그 근처의 어느 곳에서나 통합될 수 있다. 일부 구현예에서, 전이 유전자는 적어도 하나의 표적 부위(들) 중 하나에서 또는 그 근처에서, 예를 들어, 절단 부위의 300, 250, 200, 150, 100, 50, 10, 5, 4, 3, 2, 1개 이하 염기쌍 상단부 또는 하단부 내에서, 예컨대 표적 부위의 양쪽 100, 50, 10, 5, 4, 3, 2, 1개 염기쌍 내에서, 예컨대 표적 부위의 양쪽 50, 10, 5, 4, 3, 2, 1개 염기쌍 내에서 통합된다. 일부 구현예에서, 전이 유전자를 포함하는 통합된 서열은 임의의 벡터 서열(예를 들어, 바이러스 벡터 서열)을 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 통합된 서열은 임의의 벡터 서열(예를 들어, 바이러스 벡터 서열)의 일부를 포함한다.
가닥들 중 하나의 이중 가닥 절단 또는 단일 가닥 절단(예컨대 표적 부위)은 원하는 영역에서 전이 유전자의 삽입 또는 돌연변이의 정정이 발생하는 것과 같은 변경이 생성되도록 표적 통합 부위, 예를 들어 표적화 통합을 위한 부위에 충분히 가까워야 한다. 일부 구현예에서, 거리는 10, 25, 50, 100, 200, 300, 350, 400 또는 500개의 뉴클레오타이드 이하이다. 일부 구현예에서, 절단은 절단이 말단 절제 동안 엑소뉴클레아제 매개 제거의 대상이 되는 영역 내에 있도록 표적 통합 부위에 충분히 가까워야 한다고 여겨진다. 일부 구현예에서, 표적화 도메인은 절단 이벤트, 예를 들어 이중 가닥 또는 단일 가닥 절단이 변경되기를 원하는 영역, 예를 들어 표적화 삽입을 위한 부위의 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 300, 350, 400 또는 500개 뉴클레오타이드 내에 위치하도록 구성된다. 절단, 예를 들어 이중 가닥 또는 단일 가닥 절단은 변경되기를 원하는 영역, 예를 들어 표적화된 삽입을 위한 부위의 상단부 또는 하단부에 위치할 수 있다. 일부 구현예에서, 절단은 변경되기를 원하는 영역 내에, 예를 들어 적어도 2개의 돌연변이체 뉴클레오타이드에 의해 정의된 영역 내에 위치한다. 일부 구현예에서, 절단은 변경되기를 원하는 영역에 바로 인접하여, 예를 들어 표적 통합 부위의 바로 상단부 또는 하단부에 위치한다.
일부 구현예에서, 단일 가닥 절단은 제2 gRNA 분자에 의해 위치가 결정되는 추가의 단일 가닥 절단을 수반한다. 예를 들어, 표적화 도메인은 절단 이벤트, 예를 들어 2개의 단일 가닥 절단이 표적 통합 부위의 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 300, 350, 400 또는 500개 뉴클레오타이드 내에 위치하도록 구성된다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 gRNA 분자는 Cas9 니카제를 가이드할 때 단일 가닥 절단이 원하는 영역의 변경을 초래하기에 충분히 서로 가까이에 제2 gRNA에 의해 위치가 결정되는 추가 단일 가닥 절단을 수반하도록 구성된다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 gRNA 분자는, 예를 들어 Cas9가 니카제일 때, 상기 제2 gRNA에 의해 위치가 결정되는 단일 가닥 절단이 상기 제1 gRNA 분자에 의해 위치가 결정되는 절단의 10, 20, 30, 40 또는 50개 뉴클레오타이드 내에 있도록 구성된다. 일부 구현예에서, 2개 gRNA 분자는 예를 들어 본질적으로 이중 가닥 절단을 모방하는 상이한 가닥들 상에서 동일한 위치에, 또는 서로의 몇 개의 뉴클레오타이드 내에 절단부를 위치시키도록 구성된다.
gRNA(단분자(또는 키메라) 또는 모듈형 gRNA) 및 Cas9 뉴클레아제가 전이 유전자의 매개된 삽입 또는 정정에 대해 HDR을 유도할 목적으로 이중 가닥 절단을 유도하는 일부 구현예에서, 표적 부위와 같은 절단 부위는 표적 통합 부위로부터 0 내지 200bp(예를 들어, 0 내지 175, 0 내지 150, 0 내지 125, 0 내지 100, 0 내지 75, 0 내지 50, 0 내지 25, 25 내지 200, 25 내지 175, 25 내지 150, 25 내지 125, 25 내지 100, 25 내지 75, 25 내지 50, 50 내지 200, 50 내지 175, 50 내지 150, 50 내지 125, 50 내지 100, 50 내지 75, 75 내지 200, 75 내지 175, 75 내지 150, 75 내지 125 또는 75 내지 100bp) 떨어져 있다. 일부 구현예에서, 표적 부위와 같은 절단 부위는 표적화된 통합을 위한 부위로부터 0 내지 100bp(예를 들어, 0 내지 75, 0 내지 50, 0 내지 25, 25 내지 100, 25 내지 75, 25 내지 50, 50 내지 100, 50 내지 75 또는 75 내지 100bp) 떨어져 있다.
일부 구현예에서, 돌출부가 있는 절단을 생성하기 위해 니카제를 사용함으로써 HDR을 촉진할 수 있다. 일부 구현예에서, 돌출부의 단일 가닥 성질은 예를 들어 NHEJ와 대조적으로 HDR에 의해 절단을 수선할 세포의 가능성을 향상시킬 수 있다.
구체적으로, 일부 구현예에서, HDR은 제1 표적 부위에 대한 제1 니카제를 표적으로 하는 제1 gRNA와 제1 표적 부위의 반대쪽 DNA 가닥에 있고 제1 닉으로부터 오프셋된 제2 표적 부위에 대한 제2 니카제를 표적으로 하는 제2 gRNA를 선택함으로써 촉진된다. 일부 구현예에서, gRNA 분자의 표적화 도메인은 뉴클레오타이드가 변경되지 않도록, 미리 선택된 뉴클레오타이드, 예를 들어 코딩 영역의 뉴클레오타이드로부터 절단 이벤트를 충분히 멀리 위치시키도록 구성된다. 일부 구현예에서, gRNA 분자의 표적화 도메인은, 엑손 서열의 변경 또는 원치 않는 스플라이싱 이벤트를 방지하도록, 인트론/엑손 경계 또는 자연적으로 발생하는 스플라이스 신호로부터 인트론 절단 이벤트를 충분히 멀리 위치시키도록 구성된다. 일부 구현예에서, gRNA 분자의 표적화 도메인은, 적어도 하나의 표적 부위(들) 중 하나에서 또는 그 근처에서 전이 유전자 서열의 틀 내 통합(in-frame integration)을 허용하도록, 초기 엑손에 위치하도록 구성된다.
일부 구현예에서, 이중 가닥 절단은 제2 gRNA 분자에 의해 위치가 결정되는 추가의 이중 가닥 절단을 수반할 수 있다. 일부 구현예에서, 이중 가닥 절단은 제2 gRNA 분자 및 제3 gRNA 분자에 의해 위치가 결정되는 추가의 2개 단일 가닥 절단을 수반할 수 있다.
일부 구현예에서, 2개의 gRNA, 예를 들어 독립적으로, 단분자(또는 키메라) 또는 모듈형 gRNA는 표적 통합 부위, 예를 들어 표적화된 통합을 위한 부위의 양쪽에 이중 가닥 절단을 위치시키도록 구성된다.
2. 주형 폴리뉴클레오타이드
일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오타이드, 예를 들어 키메라 수용체, 재조합 수용체, 또는 이의 일부의 하나 이상의 사슬을 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열을 포함하는 외인성 또는 이종성 핵산 서열과 같은 전이 유전자를 함유하는 폴리뉴클레오타이드, 및 표적화된 통합을 위한 내인성 게놈 부위 또는 그 근처의 서열과 상동성인 상동성 서열(예를 들어, 상동성 암)은 상동 재조합과 같은 세포 DNA 수선 과정에 관여하는 분자 및 기구를 수선 주형으로 사용할 수 있다. 일부 측면에서, 내인성 DNA에서 하나 이상의 표적 부위(들)의 또는 그 근처의 서열과 상동성을 갖는 주형 폴리뉴클레오타이드는 전이 유전자 또는 외인성 서열, 예를 들어 키메라 수용체 또는 이의 일부를 암호화하는 외인성 핵산 서열의 표적화된 삽입을 위해 내인성 CD247 유전자 자리의 표적 부위와 같은 표적 DNA의 구조를 변경하는 데 사용될 수 있다. 또한, 예를 들어 전이 유전자 서열의 상동 직접 수선(HDR) 매개된 표적화된 통합을 위한 주형으로서, 본원에 제공된 방법에서 사용하기 위한 폴리뉴클레오타이드, 예를 들어 주형 폴리뉴클레오타이드가 제공된다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드는 키메라 수용체 또는 이의 일부의 하나 이상의 서열을 암호화하는 전이 유전자와 같은 핵산 서열; 및 이 핵산 서열에 연결된 하나 이상의 상동성 암(들)을 포함하고, 여기서 하나 이상의 상동성 암(들)은 CD247 유전자 자리의 개방형 해독틀의 하나 이상의 영역(들)에 상동성인 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드는 키메라 수용체의 일부를 암호화하는 핵산 서열 - 상기 키메라 수용체는 세포내 영역을 포함하고, 키메라 수용체의 일부는 키메라 수용체의 전체 세포내 영역 미만(예를 들어, 전체 CD3ζ 신호 전달 도메인 미만)을 포함함 -; 및 이 핵산 서열에 연결된 하나 이상의 상동성 암(들) - 하나 이상의 상동성 암(들)은 CD247 유전자 자리의 개방형 해독틀의 하나 이상의 영역(들)에 상동성인 서열을 포함함 - 을 포함한다.
일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오타이드는 키메라 수용체 또는 이의 일부의 하나 이상의 사슬을 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열을 포함하는 전이 유전자(외인성 또는 이종성 핵산 서열)에 연결된 및/또는 이 옆에 있는 하나 이상의 상동성 서열(예를 들어, 상동성 암)을 함유한다. 일부 구현예에서, 상동성 서열은 내인성 CD247 유전자 자리의 외인성 서열을 표적화하는 데 사용된다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오타이드는 상동성 암들 사이에 세포의 게놈 내로 삽입 또는 통합을 위한 전이 유전자 서열과 같은 핵산 서열을 포함한다. 주형 폴리뉴클레오타이드 내 전이 유전자는 프로모터 또는 다른 조절 요소가 있거나 없는 기능성 폴리펩타이드(예를 들어, cDNA)를 암호화하는 하나 이상의 서열을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오타이드는 표적 부위의 구조를 변경하기 위해 유전자 파괴를 도입할 수 있는 하나 이상의 제제(들)와 함께 사용될 수 있는 핵산 서열이다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오타이드는 상동 직접 수선 이벤트에 의해 표적 부위의 구조, 예를 들어 전이 유전자의 삽입을 변경한다.
일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오타이드는 표적 부위의 서열을 변경하는데, 예를 들어 상동성 암들 사이의 전이 유전자 서열이 세포의 게놈 내로 삽입 또는 통합되도록 초래한다. 일부 측면에서, 표적화된 통합은 전이 유전자 서열의 코딩 부분과 내인성 CD247 유전자 자리의 개방형 해독틀의 하나 이상의 엑손과의 틀 내 통합(in-frame integration), 예를 들어, 통합 부위에서 인접 엑손과의 틀 내 통합을 초래한다. 예를 들어, 일부 경우에, 틀 내 통합은 내인성 개방형 해독틀의 일부 및 전이 유전자에 의해 암호화된 키메라 수용체의 일부가 발현되도록 초래한다.
일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오타이드는 예를 들어 유전자 파괴를 도입할 수 있는 하나 이상의 제제(들)에 의해 절단되는 표적 서열 상의 부위에 상응하거나 상동성인 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오타이드는 유전자 파괴를 도입할 수 있는 제1 제제에서 절단되는 표적 서열 상의 제1 부위 및 유전자 파괴를 도입할 수 있는 제2 제제에서 절단되는 표적 서열 상의 제2 부위 둘 모두에 상응하거나 상동성인 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오타이드는 다음 성분들: [5’ 상동성 암]-[전이 유전자 서열(예를 들어, 키메라 수용체 또는 이의 일부의 하나 이상의 사슬을 암호화하는 외인성 또는 이종성 핵산 서열)]-[3’ 상동성 암]을 포함한다. 일부 구현예에서, 키메라 수용체를 암호화하는 핵산 서열은 키메라 수용체의 일부를 암호화하는 전이 유전자 서열을 포함한다. 상동성 암은 염색체 내로의 재조합을 제공하며, 따라서 예를 들어 키메라 수용체 또는 이의 일부를 암호화하는 전이 유전자를 표적 부위(들)와 같은 절단 부위에서 또는 그 근처에서 게놈 DNA 내로 효과적으로 삽입하거나 통합한다. 일부 구현예에서, 상동성 암은 유전자 파괴의 표적 부위의 서열 옆에 위치한다.
일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오타이드는 이중 가닥이다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오타이드는 단일 가닥이다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오타이드는 단일 가닥 부분 및 이중 가닥 부분을 포함한다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오타이드는 벡터에 포함된다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오타이드는 DNA이다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오타이드는 RNA이다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오타이드는 이중 가닥 DNA이다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오타이드는 단일 가닥 DNA이다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오타이드는 이중 가닥 RNA이다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오타이드는 단일 가닥 RNA이다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오타이드는 단일 가닥 부분 및 이중 가닥 부분을 포함한다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오타이드는 벡터에 포함된다.
특정 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드, 예를 들어 주형 폴리뉴클레오타이드는 키메라 수용체, 예를 들어 CAR 또는 이의 일부의 하나 이상의 사슬의 일부 및/또는 단편을 암호화하는 전이 유전자를 함유 및/또는 포함한다. 구체적인 구현예에서, 전이 유전자는 CD3제타(CD3ζ) 사슬 또는 이의 단편을 암호화하는 내인성 유전자, 유전자 자리, 또는 개방형 해독틀 내에 있는 표적 부위(들)를 표적화한다. 일부 구현예에서, 전이 유전자는 CD3제타(CD3ζ) 사슬을 함유하는 완전한, 전체 및/또는 전장 CAR을 암호화하는 코딩 서열을 생성하는 것과 같이 내인성 CD247 개방형 해독틀 내의 틀 내 통합을 위해 표적화된다.
삽입을 위한 폴리뉴클레오타이드는 또한 “전이 유전자(transgene)” 또는 “외인성 서열(exogenous sequences)” 또는 “공여체(donor)” 폴리뉴클레오타이드 또는 분자로 지칭될 수 있다. 주형 폴리뉴클레오타이드는 DNA, 단일 가닥 및/또는 이중 가닥일 수 있고 선형 또는 원형 형태로 세포 내로 도입될 수 있다.
주형 폴리뉴클레오타이드는 DNA, 단일 가닥 및/또는 이중 가닥일 수 있고 선형 또는 원형 형태로 세포 내로 도입될 수 있다. 주형 폴리뉴클레오타이드는 RNA, 단일 가닥 및/또는 이중 가닥일 수 있고 RNA 분자(예를 들어, RNA 바이러스의 일부)로서 도입될 수 있다. 또한 문헌[미국 특허 공개 번호 20100047805 및 20110207221]을 참조한다. 주형 폴리뉴클레오타이드는 또한 DNA 형태로 도입될 수 있고, 이는 원형 또는 선형 형태로 세포 내로 도입될 수 있다. 선형 형태로 도입되는 경우, 주형 폴리뉴클레오타이드의 말단은 (예를 들어, 외부 핵분해성 분해로부터) 공지된 방법에 의해 보호될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 디디옥시뉴클레오타이드 잔기는 선형 분자의 3’ 말단에 추가되고/거나 자가-상보적 올리고뉴클레오타이드는 한쪽 또는 양쪽 말단에 결찰된다. 예를 들어, 문헌[Chang et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:4959-4963; Nehls et al. (1996) Science 272:886-889]을 참조한다. 외인성 폴리뉴클레오타이드를 분해로부터 보호하기 위한 추가적인 방법은 말단 아미노기(들)의 추가 및 포스포로티오에이트, 포스포라미데이트, 및 O-메틸 리보스 또는 디옥시리보스 잔기와 같은 변형된 뉴클레오타이드간 연결의 사용을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 이중 가닥 형태로 도입되는 경우, 주형 폴리뉴클레오타이드는 하나 이상의 뉴클레아제 표적 부위(들), 예를 들어 세포의 게놈 내로 통합될 전이 유전자의 옆에 있는 뉴클레아제 표적 부위를 포함할 수 있다. 예를 들어, 문헌[미국 특허 공개 번호 20130326645]을 참조한다.
일부 구현예에서, 이중 가닥 주형 폴리뉴클레오타이드는 길이가 1kb를 초과하는, 예를 들어 2 내지 200kb, 2 내지 10kb(또는 그 사이의 임의의 값)인 서열(또한 전이 유전자로 지칭됨)을 포함한다. 이중 가닥 주형 폴리뉴클레오타이드는 또한 예를 들어 적어도 하나의 뉴클레아제 표적 부위를 포함한다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오타이드는 예를 들어 한 쌍의 ZFN 또는 TALEN에 대해 적어도 2개의 표적 부위를 포함한다. 전형적으로, 뉴클레아제 표적 부위는 전이 유전자 서열의 외부, 예를 들어 전이 유전자의 절단을 위한 전이 유전자 서열의 5’ 및/또는 3’에 있다. 표적 부위(들)와 같은 뉴클레아제 절단 부위(들)는 임의의 뉴클레아제(들)에 대한 것일 수 있다. 일부 구현예에서, 이중 가닥 주형 폴리뉴클레오타이드에 함유된 뉴클레아제 표적 부위(들)는 상동-독립적 방법을 통해 절단된 주형 폴리뉴클레오타이드가 통합되는 내인성 표적을 절단하는 데 사용되는 동일한 뉴클레아제에 대한 것이다.
일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오타이드는 단일 가닥 핵산이다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오타이드는 이중 가닥 핵산이다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오타이드는 예를 들어 표적 DNA에 추가되거나 그 변화를 주형할 하나 이상의 뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오타이드는 표적 부위를 변형하는 데 사용될 수 있는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오타이드는 표적 DNA, 예를 들어 표적 부위의 야생형 서열에 상응하는, 예를 들어 하나 이상의 뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오타이드는 선형 이중 가닥 DNA이다. 길이는 예를 들어 약 200 내지 5000개 염기쌍, 예를 들어 약 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1200, 1400, 1600, 1800, 2000, 2500, 3000, 4000 또는 5000개 염기쌍일 수 있다. 길이는 예를 들어 적어도 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1200, 1400, 1600, 1800, 2000, 2500, 3000, 4000 또는 5000개 염기쌍일 수 있다. 일부 구현예에서, 길이는 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1200, 1400, 1600, 1800, 2000, 2500, 3000, 4000 또는 5000개 염기쌍 이하이다. 일부 구현예에서, 이중 가닥 주형 폴리뉴클레오타이드는 약 160개 염기쌍, 예를 들어 약 200 내지 4000, 300 내지 3500, 400 내지 3000, 500 내지 2500, 600 내지 2000, 700 내지 1900, 800 내지 1800, 900 내지 1700, 1000 내지 1600, 1100 내지 1500 또는 1200 내지 1400개 염기쌍의 길이를 가진다.
본원에 기술된 주형 폴리뉴클레오타이드 상에 함유된 전이 유전자는 PCR과 같은 공지된 표준 기법을 사용하여 플라스미드, 세포 또는 기타 공급원에서 단리될 수 있다. 사용을 위한 주형 폴리뉴클레오타이드는 원형 초나선형, 원형 이완형, 선형 등을 비롯한 다양한 유형의 토폴로지를 포함할 수 있다. 대안적으로, 이들은 표준 올리고뉴클레오타이드 합성 기술을 사용하여 화학적으로 합성될 수 있다. 또한, 주형 폴리뉴클레오타이드는 메틸화되거나 메틸화되지 않을 수 있다. 주형 폴리뉴클레오타이드는 박테리아 인공 염색체 또는 효모 인공 염색체(BAC 또는 YAC)의 형태일 수 있다.
주형 폴리뉴클레오타이드는 선형 단일 가닥 DNA일 수 있다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오타이드는 (i) 표적 DNA의 닉이 발생한 가닥에 어닐링할 수 있는 선형 단일 가닥 DNA, (ii) 표적 DNA의 온전한 가닥에 어닐링할 수 있는 선형 단일 가닥 DNA, (iii) 표적 DNA의 전사된 가닥에 어닐링할 수 있는 선형 단일 가닥 DNA, (iv) 표적 DNA의 전사되지 않은 가닥에 어닐링할 수 있는 선형 단일 가닥 DNA, 또는 앞의 것 중 하나 이상이다.
길이는 예를 들어 약 200 내지 5000개 뉴클레오타이드, 예를 들어 약 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1200, 1400, 1600, 1800, 2000, 2500, 3000, 4000 또는 5000개 뉴클레오타이드일 수 있다. 길이는 예를 들어 적어도 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1200, 1400, 1600, 1800, 2000, 2500, 3000, 4000 또는 5000개 뉴클레오타이드일 수 있다. 일부 구현예에서, 길이는 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1200, 1400, 1600, 1800, 2000, 2500, 3000, 4000 또는 5000개 뉴클레오타이드 이하이다. 일부 구현예에서, 단일 가닥 주형 폴리뉴클레오타이드는 약 160개 뉴클레오타이드, 예를 들어 약 200 내지 4000, 300 내지 3500, 400 내지 3000, 500 내지 2500, 600 내지 2000, 700 내지 1900, 800 내지 1800, 900 내지 1700, 1000 내지 1600, 1100 내지 1500 또는 1200 내지 1400개 뉴클레오타이드의 길이를 가진다.
일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오타이드는 원형 이중 가닥 DNA, 예를 들어 플라스미드이다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오타이드는 전이 유전자 및/또는 표적 부위의 양쪽에 약 500 내지 1000개의 상동성 염기쌍을 포함한다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오타이드는 표적 부위 또는 전이 유전자의 5’, 표적 부위 또는 전이 유전자의 3’, 또는 표적 부위 또는 전이 유전자의 5’ 및 3’ 둘 모두에 약 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500 또는 2000개의 상동성 염기쌍을 포함한다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오타이드는 표적 부위 또는 전이 유전자의 5’, 표적 부위 또는 전이 유전자의 3’, 또는 표적 부위 또는 전이 유전자의 5’ 및 3’ 둘 모두에 적어도 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500 또는 2000개의 상동성 염기쌍을 포함한다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오타이드는 표적 부위 또는 전이 유전자의 5’, 표적 부위 또는 전이 유전자의 3’, 또는 표적 부위 또는 전이 유전자의 5’ 및 3’ 둘 모두에 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500 또는 2000개 이내의 상동성 염기쌍을 포함한다.
일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오타이드 내 전이 유전자 서열은 하나 이상의 상동성 암(들)에 포함된 CD247 유전자 자리의 개방형 해독틀의 하나 이상의 엑손과 틀 내에 있는 뉴클레오타이드의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 개방형 해독틀의 하나 이상의 영역(들)은 CD247 유전자 자리의 개방형 해독틀의 엑손 8의 상단부에 있는 서열이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 개방형 해독틀의 하나 이상의 영역(들)은 CD247 유전자 자리의 개방형 해독틀의 엑손 3의 상단부에 있는 서열이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 개방형 해독틀의 하나 이상의 영역(들)은 CD247 유전자 자리의 개방형 해독틀의 엑손 3을 포함하는 서열이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 개방형 해독틀의 하나 이상의 영역(들)은 CD247 유전자 자리의 개방형 해독틀의 엑손 2의 적어도 일부를 포함하는 서열이거나 이를 포함한다.
일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오타이드 내 하나 이상의 상동성 암(들)은 CD247 유전자 자리의 개방형 해독틀의 엑손 1의 전장(full length)을 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오타이드 내 하나 이상의 상동성 암(들)은 엑손 1을 포함하지 않고/거나 CD247 유전자 자리의 개방형 해독틀의 엑손 2의 전장(full length)을 포함하지 않는다.
a. 전이 유전자 서열
일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오타이드는 키메라 수용체 또는 이의 일부의 하나 이상의 사슬, 예컨대 키메라 수용체의 하나 이상의 영역 또는 도메인, 예컨대 본원의 예를 들어 섹션 III.B에 기술된 임의의 키메라 수용체, 또는 그러한 키메라 수용체의 하나 이상의 영역 또는 도메인을 암호화하는 전이 유전자 서열 또는 외인성 서열을 함유한다. 일부 측면에서, 내인성 CD247 유전자 자리에서 표적 부위 근처의 서열과 상동성인 하나 이상의 상동성 암(들)에 연결된 전이 유전자 서열을 함유하는 주형 폴리뉴클레오타이드의 존재 하에서 HDR은 키메라 수용체를 암호화하는 변형된 CD247 유전자 자리가 되게 한다. 일부 구현예에서, 전이 유전자 서열은 세포외 결합 영역, 막관통 도메인 및/또는 세포내 영역의 일부를 포함하는 키메라 수용체 또는 키메라 수용체의 하나 이상의 도메인, 영역 또는 사슬과 같은 이의 일부를 암호화한다. 일부 구현예에서, 전이 유전자 서열은 인트론을 포함하지 않는다. 일부 측면에서, 전이 유전자 서열은 T 세포, 선택적으로 인간 T 세포의 내인성 게놈 CD247 유전자 자리의 개방형 해독틀에 외인성이거나 이종성인 서열이다.
일부 측면에서, 전이 유전자 서열에 의해 암호화되는 키메라 수용체는 기능성 비-T 세포 수용체(비-TCR) 항원 수용체이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 키메라 수용체는 키메라 항원 수용체(CAR)이다. 일부 구현예에서, 전이 유전자 서열은 본원의, 예를 들어 섹션 III.B에 기술된 임의의 키메라 수용체, 또는 그의 일부를 암호화한다. 일부 측면에서, 전이 유전자 서열을 내인성 CD247 유전자 자리 내로 통합 시, 생성된 변형된 CD247 유전자 자리는 본원의, 예를 들어 섹션 III.B에 기술된 임의의 키메라 수용체와 같은 키메라 수용체를 암호화한다. 일부 구현예에서, 전이 유전자 서열은 CD3ζ 사슬 또는 이의 단편을 포함하는 세포내 영역(예를 들어, CD3ζ 사슬의 세포내 영역)을 함유하는 키메라 수용체의 일부와 같은 본원의, 예를 들어 섹션 III.B에 기술된 키메라 수용체의 일부를 암호화한다. 일부 구현예에서, 전이 유전자 서열은 다중 사슬 CAR, 예컨대 본원의 섹션 III.B.2에 기술된 다중 사슬 CAR인 키메라 수용체의 사슬, 예컨대 CD3ζ 사슬 또는 이의 단편을 함유하는 다중 사슬 CAR의 사슬의 일부를 암호화한다.
일부 구현예에서, 변형된 CD247 유전자 자리에 의해 암호화되는 키메라 수용체는 예를 들어 CD3ζ 신호 전달 도메인을 포함하는 세포내 영역을 포함하고, 전이 유전자 서열은 키메라 수용체의 일부를 암호화하되, 상기 일부는 키메라 수용체의 키메라 수용체의 전체 세포내 영역을 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 변형된 CD247 유전자 자리에 의해 암호화되는 키메라 수용체는 CD3ζ 신호 전달 도메인을 포함하고, 전이 유전자 서열은 CD3ζ 신호 전달 도메인 전체를 암호화하지 않는다. 일부 구현예에서, 내인성 CD247 유전자 자리 내로 전이 유전자 서열을 통합 시, 적어도 CD3ζ 사슬의 일부, 예컨대 CD3ζ 신호 전달 도메인 전체의 단편은 내인성 CD247 유전자 자리의 개방형 해독틀 서열 또는 이의 부분 서열에 의해 암호화된다. 일부 측면에서, 키메라 수용체의 일부를 암호화하는 핵산 서열 및 하나 이상의 상동성 암을 함유하는 주형 폴리뉴클레오타이드는 키메라 수용체의 세포내 영역(예를 들어, CD3ζ 신호 전달 도메인을 포함)을 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열의 적어도 단편을 함께 포함하고, 여기서 세포내 영역의 적어도 일부는 키메라 수용체가 폴리뉴클레오타이드가 도입된 세포로부터 발현될 때 CD247 유전자 자리의 개방형 해독틀 또는 이의 부분 서열에 의해 암호화되는 CD3제타 신호 전달 도메인 또는 이의 단편을 포함한다.
일부 측면에서, 게놈의 표적 위치에 삽입되거나 통합되는 코딩 및/또는 비코딩 서열 및/또는 이의 부분 코딩 서열을 포함한 키메라 수용체 또는 이의 일부의 하나 이상의 사슬을 암호화하는 관심 핵산 서열인 전이 유전자 서열은 또한 “전이 유전자”, “전이 유전자 서열”, 외인성 핵산 서열” “이종성 서열” 또는 “공여체 서열”로 지칭될 수 있다. 일부 측면에서, 전이 유전자는 T 세포, 예를 들어 인간 T 세포의 게놈 내 특정 표적 유전자 자리 또는 표적 위치의 내인성 게놈 서열과 같은 내인성 게놈 서열에 외인성 또는 이종성인 핵산 서열이다. 일부 측면에서, 전이 유전자는 T 세포, 예를 들어 인간 T 세포의 표적 유전자 자리 또는 표적 위치의 내인성 게놈 서열과 비교해 변형되거나 상이한 서열이다. 일부 측면에서, 전이 유전자는 상이한 유전자, 종 및/또는 기원으로부터 유래된 핵산 서열로부터 기원하거나 이에 비해 변형된 핵산 서열이다. 일부 측면에서, 전이 유전자는 동일한 종의 상이한 유전자 자리, 예를 들어 상이한 게놈 영역 또는 상이한 유전자의 서열로부터 유래된 서열이다. 일부 측면에서, 예시적인 키메라 수용체는 본원의 예를 들어 섹션 III.B에 기술된 임의의 것을 포함한다.
일부 구현예에서, 뉴클레아제-유도된 HDR은 표적화된 삽입에 대한 전이 유전자의 발현을 위한 전이 유전자(또한 “외인성 서열” 또는 “전이 유전자 서열”로도 불림)의 삽입을 초래한다. 주형 폴리뉴클레오타이드 서열은 일반적으로 그것이 위치하는 게놈 서열과 동일하지 않다. 주형 폴리뉴클레오타이드는 관심 위치에서 효율적인 HDR을 허용하기 위해 옆에 2개의 상동성 영역이 있는 비-상동성 서열을 함유할 수 있다. 추가로, 주형 폴리뉴클레오타이드 서열은 세포 염색질에서 관심 영역과 상동성이 아닌 서열을 함유하는 벡터 분자를 포함할 수 있다. 주형 폴리뉴클레오타이드 서열은 세포 염색질과 상동성인 불연속적인 여러 개의 영역을 함유할 수 있다. 예를 들어, 관심 영역에 일반적으로 존재하지 않는 서열의 표적화된 삽입을 위해, 상기 서열은 전이 유전자에 존재할 수 있고 관심 영역 내 서열에 상동성인 영역들이 옆에 있을 수 있다.
일부 측면에서, 전이 유전자는 상이한 유전자, 종 및/또는 기원으로부터 유래된 상이한 핵산 서열들을 접합하여 생성된 서열을 포함하는 키메라 서열이다. 일부 측면에서, 전이 유전자는 접합되거나 연결된 상이한 유전자, 코딩 서열 또는 엑손 또는 그 일부로부터 유래된 상이한 영역 또는 도메인 또는 그 일부를 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열을 함유한다. 일부 측면에서, 표적화된 통합을 위한 전이 유전자 서열은 폴리펩타이드, 예를 들어 융합 폴리펩타이드 또는 이의 단편을 암호화한다.
일부 측면에서, 전이 유전자에 의해 암호화된 폴리펩타이드는 키메라 폴리펩타이드이다. 일부 측면에서, 전이 유전자는 또한 비코딩, 조절 또는 제어 서열, 예를 들어 암호화된 폴리펩타이드 또는 이의 단편의 발현을 허용, 조절 및/또는 조정하는 데 필요한 서열 또는 폴리펩타이드를 변형하는 데 필요한 서열을 함유한다. 일부 구현예에서, 전이 유전자가 게놈 서열로부터 유래된 경우, 전이 유전자는 게놈 내의 상응하는 핵산과 비교하여 인트론을 포함하지 않거나 하나 이상의 인트론이 결여되어 있다. 일부 구현예에서, 전이 유전자 서열은 인트론을 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 전이 유전자는 키메라 수용체 또는 이의 일부를 암호화하는 서열을 함유하고, 여기서 전이 유전자 서열의 전부 또는 일부는 예를 들어 인간 세포에서 발현을 위해 코돈-최적화된다.
일부 구현예에서, 코딩 및 비코딩 영역을 포함하여 전이 유전자 서열의 길이는 (약) 100 내지 약 10,000개 염기쌍, 예컨대 약 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000 또는 10000개 염기쌍이다. 일부 구현예에서, 전이 유전자 서열의 길이는 제조, 합성 또는 조립 및/또는 세포 내로 도입될 수 있는 폴리뉴클레오타이드의 최대 길이 또는 바이러스 벡터의 용량에 의해 제한된다. 일부 측면에서, 전이 유전자 서열의 길이는 주형 폴리뉴클레오타이드의 최대 길이 및/또는 필요한 하나 이상의 상동성 암(들)의 길이에 따라 달라질 수 있다.
일부 구현예에서, 유전자 파괴로 유도된 HDR은 게놈 내 표적 부위에서 전이 유전자 서열의 삽입 또는 통합을 초래한다. 주형 폴리뉴클레오타이드 서열은 일반적으로 그것이 표적으로 하는 게놈 서열과 동일하지 않다. 주형 폴리뉴클레오타이드는 관심 위치에서 효율적인 HDR을 허용하기 위해 옆에 2개의 상동성 영역이 있는 전이 유전자 서열을 함유할 수 있다. 주형 폴리뉴클레오타이드 서열은 게놈 DNA와 상동성인 불연속적인 여러 개의 영역을 함유할 수 있다. 예를 들어, 관심 영역에 일반적으로 존재하지 않는 서열의 표적화된 삽입을 위해, 상기 서열은 전이 유전자에 존재할 수 있고 관심 영역 내 서열에 상동성인 영역들이 옆에 있을 수 있다. 일부 구현예에서, 전이 유전자는 키메라 수용체 또는 이의 일부, 예를 들어 세포외 결합 영역, 막관통 도메인 및/또는 세포내 영역의 일부 중 하나 이상을 암호화한다.
일부 측면에서, HDR에 의한 전이 유전자의 표적화된 통합 시, 세포의 게놈은 키메라 수용체 또는 이의 일부를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 변형된 CD247 유전자 자리를 함유한다. 일부 구현예에서, 표적화된 통합 시, 변형된 CD247 유전자 자리는 전이 유전자의 융합물, 예를 들어 유전자 융합물 및 내인성 CD247 유전자 자리의 개방형 해독틀 또는 이의 부분 서열을 함유한다. 일부 측면에서, 융합은 기원이 상이한 둘 이상의 핵산 분자의 융합, 예를 들어 HDR매개 표적화된 통합의 결과로 발생하는 전이 유전자 서열과 게놈 DNA의 융합과 관련이 있다. 일부 구현예에서, 표적화된 통합 시, 변형된 CD247 유전자 자리는 내인성 CD247 유전자 자리의 개방형 해독틀 내 부위로 통합된 전이 유전자를 함유한다. 일부 구현예에서, 표적화된 통합 시, 전이 유전자 서열과 내인성 CD247 유전자 자리의 서열의 융합물, 예를 들어 유전자 융합물을 함유한 변형된 CD247 유전자 자리는 키메라 수용체, 예를 들어 키메라 항원 수용체(CAR)를 암호화한다. 일부 측면에서, 키메라 수용체의 특정 부분은 전이 유전자에 의해 암호화되고, 키메라 수용체의 다른 부분은 내인성 CD247 유전자 자리의 개방형 해독틀 또는 이의 부분 서열에 의해 암호화된다. 일부 구현예에서, 전이 유전자 서열은 하나 이상의 상동성 암(들)에 포함된 CD247 유전자 자리의 개방형 해독틀의 하나 이상의 엑손과 틀 내에 있는 뉴클레오타이드의 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 키메라 수용체 전체는 전이 유전자 서열에 의해 암호화된다. 일부 측면에서, 전이 유전자 서열은 또한 다중 사슬 키메라 수용체의 다른 분자 또는 다른 사슬, 및/또는 조절 또는 제어 요소, 예를 들어 외인성 프로모터 및/또는 다중 시스트론 요소를 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열을 함유한다. 일부 측면에서, 예시적인 키메라 수용체는 본원의 예를 들어 섹션 III.B에 기술된 임의의 것을 포함한다.
일부 측면에서, 표적화 통합을 위한 전이 유전자 서열은 키메라 항원 수용체(CAR) 또는 키메라 자가항체 수용체(CAAR)와 같은 키메라 수용체인 키메라 수용체를 암호화하는 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 전이 유전자는 접합되거나 연결된 상이한 유전자, 코딩 서열 또는 엑손 또는 그 일부로부터 유래될 수 있는 키메라 수용체의 상이한 영역 또는 도메인 또는 일부를 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열을 함유한다.
일부 구현예에서, 전이 유전자 서열은 섹션 III.B에 기술된 키메라 수용체와 또는 다양한 영역, 도메인 또는 사슬과 같은 키메라 수용체의 다양한 영역, 도메인 또는 사슬의 전부 또는 일부 또는 부분을 암호화한다. 일부 구현예에서, 전이 유전자 서열은 키메라 수용체의 다양한 영역, 도메인 또는 사슬의 일부를 암호화한다. 일부 구현예에서, 전이 유전자 서열은 다중 사슬 키메라 수용체의 폴리펩타이드 사슬 또는 이의 일부를 암호화한다. 일부 구현예에서, 암호화된 키메라 수용체는 CAR의 다양한 영역 또는 도메인을 함유한다. 일부 구현예에서, 암호화된 키메라 수용체는 하나 이상의 영역 또는 도메인, 예컨대 세포외 영역(예를 들어, 하나 이상의 세포외 결합 도메인(들) 및/또는 스페이서들을 함유), 막관통 도메인 및/또는 세포내 영역(예를 들어, 1차 신호 전달 영역 또는 도메인 및/또는 하나 이상의 공자극 신호 전달 도메인을 함유) 중 하나 이상을 함유한다. 일부 측면에서, 암호화된 CAR은 다량체화 도메인 또는 링커와 같은 다른 도메인을 더 함유한다.
일부 구현예에서, 전이 유전자는 세포내 영역을 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 전이 유전자는 또한 막관통 영역 또는 막 회합 영역(membrane association region)을 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 전이 유전자는 또한 세포외 영역을 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 키메라 수용체는 세포외 영역, 및/또는 막관통 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 전이 유전자 서열은 키메라 수용체의 하나 이상의 영역을 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열을 포함하고, 선택적으로 여기서 전이 유전자 서열은 세포외 영역, 막관통 도메인, 및/또는 세포내 영역의 일부 중 하나 이상을 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열을 포함한다.
일부 측면에서, 전이 유전자에서, 세포외 영역을 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열은 신호 서열과 스페이서를 암호화하는 뉴클레오타이드 사이에 위치한다. 일부 측면에서, 전이 유전자에서, 세포외 다량체화 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열은 결합 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열과 스페이서를 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열 사이에 위치한다. 일부 측면에서, 스페이서를 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열은 결합 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열과 막관통 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열 사이에 위치한다.
일부 구현예에서, 전이 유전자는 5’에서 3’ 순서로 세포외 영역을 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열, 막관통 도메인(또는 막 회합 도메인)을 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열 및 세포내 영역을 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 전이 유전자는 5’에서 3’ 순서로 막관통 도메인(또는 막 회합 도메인)을 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열 및 세포내 영역을 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 전이 유전자는 5’에서 3’ 순서로 세포외 영역을 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열, 막관통 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열 및 세포내 영역을 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열을 포함한다.
일부 측면에서, 키메라 수용체의 영역들 또는 도메인들의 일부는 전이 유전자의 서열(예를 들어, 이종성 또는 외인성 서열)에 의해 암호화된다. 예를 들어, 전이 유전자 서열은 세포외 영역, 막관통 도메인, 및 공자극 신호 전달 도메인을 포함할 수 있는 세포내 영역, 및 다른 도메인 또는 이의 부분 중 하나 이상을 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열을 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 키메라 수용체의 영역들 또는 도메인들의 일부는 CD247 유전자 자리의 내인성 서열의 서열에 의해 암호화된다. 예를 들어, CD3ζ 사슬 또는 이의 단편의 전부 또는 일부는 내인성 CD247 유전자 자리의 개방형 해독틀 서열 또는 이의 부분 서열에 의해 암호화될 수 있고/거나 CD3ζ 사슬의 일부는 전이 유전자에 의해 암호화될 수 있다. 따라서, 전이 유전자의 표적화된 통합 시, 암호화된 키메라 수용체는 통합된 전이 유전자 및 CD247 유전자 자리의 내인성 서열을 포함하는 유전자 융합물에 의해 암호화된다.
일부 측면에서, 세포외 영역은 결합 도메인 및/또는 스페이서를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 세포외 영역은 세포외 다량체화 도메인을 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 전이 유전자 서열에 의해 암호화된 세포내 영역은 하나 이상의 공자극 도메인 및/또는 다량체화 도메인 및 기타 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 전이 유전자 서열에 의해 암호화된 세포내 영역은 CD3ζ 사슬의 전장 길이 미만 또는 CD3ζ 사슬의 일부를 포함한다. 일부 측면에서, 전이 유전자는 CD3ζ 사슬 또는 이의 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열을 함유하지 않는다. 일부 구현예에서, 전이 유전자 서열은 또한 신호 펩타이드, 조절 또는 제어 요소, 예컨대 프로모터, 및/또는 하나 이상의 다중 시스트론 요소, 예를 들어 리보솜 스킵 요소 또는 내부 리보솜 유입점(IRES)을 암호화하는 신호 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 신호 서열은 세포외 영역을 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열의 5’에 위치할 수 있다. 일부 구현예에서, 전이 유전자는 또한 하나 이상의 다중 시스트론 요소, 예를 들어 리보솜 스킵 서열 및/또는 내부 리보솜 유입점(IRES)을 포함한다. 일부 측면에서, 전이 유전자는 또한 전형적으로 전이 유전자 서열의 가장 5’ 부분, 예를 들어 신호 서열의 5’에서 프로모터와 같은 조절 또는 제어 요소를 포함한다. 일부 측면에서, 하나 이상의 추가 분자를 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열은 폴리뉴클레오타이드의 전이 유전자 부분에 포함될 수 있다. 일부 측면에서, 하나 이상의 추가 분자를 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열은 키메라 수용체의 하나 이상의 영역 또는 도메인 또는 사슬을 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열의 5’에 위치한다. 일부 측면에서, 하나 이상의 추가 분자 또는 추가 도메인, 영역 또는 사슬을 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열은 키메라 수용체의 하나 이상의 영역을 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열의 상단부에 있다.
전이 유전자 서열에 의해 암호화된 예시적인 영역 또는 도메인은 아래 제시되며, 또한 본원의 섹션 III.B에 기술된 임의의 영역 또는 도메인을 포함한다. 구체적인 구현예에서, 전이 유전자 서열은 신호 펩타이드, 결합 도메인(예를 들어, scFv와 같은 항원 결합 도메인), 스페이서, 막관통 도메인 및 공자극 신호 전달 도메인과 CD3ζ 사슬 또는 CD3ζ 사슬의 일부를 함유하는 세포내 신호 전달 영역을 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열을 포함한다.
(i) 신호 서열
일부 구현예에서, 전이 유전자는 신호 펩타이드를 암호화하는 신호 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 신호 서열은 이종성 또는 비천연 신호 펩타이드, 예를 들어 상이한 유전자 또는 종 또는 내인성 CD247 유전자 자리의 신호 펩타이드와 상이한 신호 펩타이드로부터 유래한 신호 펩타이드를 암호화할 수 있다. 일부 측면에서, 예시적인 신호 펩타이드에는 서열 번호: 24에 제시된 GMCSFR 알파 사슬의 신호 서열 및 서열 번호: 25에 제시된 신호 펩타이드 또는 서열 번호: 26에 제시된 CD8 알파 신호 펩타이드를 암호화하는 서열이 포함된다. 발현된 키메라 수용체의 성숙한 형태에서, 신호 서열은 폴리펩타이드의 나머지 부분으로부터 절단된다. 일부 측면에서, 신호 서열은 조절 또는 제어 요소, 예를 들어 이종성 프로모터와 같은 프로모터, 예를 들어 CD247 유전자 자리로부터 유래되지 않은 프로모터의 3’에 위치한다. 일부 측면에서, 신호 서열은 하나 이상의 다중 시스트론 요소, 예를 들어 리보솜 스킵 서열 및/또는 내부 리보솜 유입점(IRES)을 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열의 3’에 위치한다. 일부 측면에서, 신호 서열은 전이 유전자 내 세포외 영역의 하나 이상 성분을 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열의 5’에 위치할 수 있다. 일부 구현예에서, 신호 서열은 전이 유전자에 존재하는 가장 5’ 영역이고, 상동성 암들 중 하나에 연결된다. 일부 측면에서, 전이 유전자 서열에 의해 암호화된 신호 서열은 본원의 예를 들어 섹션 III.B에 기술된 임의의 신호 서열을 포함한다.
(ii) 결합 도메인
일부 구현예에서, 전이 유전자는 특정 세포 유형의 표면 상에 발현된 항원과 같은 특정 항원(또는 리간드)에 대한 특이성을 갖는 CAR과 같은 키메라 수용체의 일부를 암호화한다. 일부 구현예에서, 항원은 예를 들어 건강한 세포 또는 조직 내 정상 또는 비-표적화 세포 또는 조직과 비교하여 질병 또는 병태의 세포 상에서, 예를 들어 종양 또는 병원성 세포 상에서 선택적으로 발현되거나 과발현된다.
일부 측면에서, 전이 유전자는 키메라 수용체의 세포외 영역을 암호화한다. 일부 구현예에서, 전이 유전자 서열은 항원 또는 리간드에 특이적으로 결합하는 결합 도메인과 같은 세포외 결합 도메인을 암호화한다.
일부 구현예에서, 결합 도메인은 폴리펩타이드, 리간드, 수용체, 리간드-결합 도메인, 수용체-결합 도메인, 항원, 에피토프, 항체, 항원-결합 도메인, 에피토프-결합 도메인, 항체-결합 도메인, 태그-결합 도메인 또는 전술한 임의의 것의 단편이거나 이를 포함한다. 다른 구현예에서, 항원은 정상 세포 상에서 발현되고/거나 조작된 세포 상에서 발현된다. 일부 측면에서, 항원은 리간드 결합 도메인 또는 항원 결합 도메인과 같은 결합 도메인에 의해 인식된다. 일부 측면에서, 전이 유전자는 하나 이상의 결합 도메인(들)을 함유하는 세포외 영역을 암호화한다. 일부 구현예에서, 전이 유전자에 의해 암호화되는 예시적인 결합 도메인은 항체 및 scFv 또는 sdAb를 포함한 항원-결합 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, 항원 결합 단편은 가요성 링커에 의해 연결되는 항체 가변 영역을 포함한다.
일부 구현예에서, 결합 도메인은 단일 사슬 가변 단편(scFv)이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 결합 도메인은 단일 도메인 항체(sdAb)이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 결합 도메인은 질병, 장애 또는 병태의 세포 또는 조직과 관련된, 이에 특이적인 및/또는 이에서 발현되는 표적 항원에 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 질병, 장애 또는 병태는 감염 질병 또는 장애,자가 면역 질환, 염증성 질환 또는 종양 또는 암이다. 일부 구현예에서, 표적 항원은 종양 항원이다.
전이 유전자 서열에 의해 암호화되는 예시적인 항원 및 항원- 도는 리간드-결합 도메인은 본원의 섹션 III.B.1에 기술된 것들을 포함한다. 일부 측면에서, 암호화된 키메라 수용체는 주요 조직적합성 복합체(MHC)-펩타이드 복합체로서 세포 표면 상에 제시된, 종양-관련 항원과 같은 세포내 항원을 특이적으로 인식하는 scFv와 같은 TCR-유사 항체 또는 이의 단편이거나 이를 포함하는 결합 도메인을 함유한다. 일부 측면에서, 전이 유전자 서열은 TCR-유사 항체 또는 이의 단편인 결합 도메인을 암호화할 수 있다. 따라서, 암호화된 키메라 수용체는 본원의 섹션 III.B.1에 기술된 임의의 것과 같은 TCR-유사 CAR이다. 일부 구현예에서, 결합 도메인은 이중-특이적과 같은 다중-특이적 결합 도메인이다. 일부 구현예에서, 암호화된 키메라 수용체는 자가항체에 결합하는 항원인 결합 도메인을 함유한다. 일부 구현예에서, 키메라 수용체는 본원의 섹션 III.B.3에 기술된 임의의 것과 같은 키메라 자가항체 수용체(CAAR)이다.
일부 측면에서, 하나 이상의 결합 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열은 전이 유전자 내에 존재하는 경우 신호 서열의 3’에 위치할 수 있다. 일부 측면에서, 하나 이상의 결합 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열은 전이 유전자 내에서 하나 이상의 조절 또는 제어 요소를 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열의 3’에 위치할 수 있다. 일부 측면에서, 하나 이상의 결합 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열은 전이 유전자 내에 존재하는 경우 스페이서를 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열의 5’에 위치할 수 있다. 일부 측면에서, 하나 이상의 결합 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열은 전이 유전자 내에서 막관통 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열의 5’에 위치할 수 있다.
(iii) 스페이서 및 막관통 도메인
일부 구현예에서, 전이 유전자는 스페이서를 암호화하는 서열 및/또는 막관통 도메인 또는 이의 일부를 암호화하는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 암호화된 키메라 수용체의 세포외 영역은 스페이서를 포함하고, 선택적으로 여기서 스페이서는 결합 도메인 및 막관통 도메인 사이에 작동 가능하게 연결된다. 일부 측면에서, 스페이서 및/또는 막관통 도메인은 리간드-(예를 들어, 항원-)결합 도메인을 함유하는 세포외 부분과 (예를 들어, 하나 이상의 공자극 신호 전달 도메인, 세포내 다량체화 도메인 및/또는 CD3ζ 사슬 또는 이의 단편을 함유하는) 세포내 영역과 같은 키메라 수용체의 기타 영역 또는 도메인을 연결할 수 있다.
일부 구현예에서, 전이 유전자는 스페이서 및/또는 항원-결합 도메인과 막관통 도메인을 분리하는 힌지 영역을 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열을 더 포함한다. 일부 측면에서, 스페이서는 면역글로불린 불변 영역 또는 이의 변이체 또는 변형된 버전의 적어도 일부, 예컨대 힌지 영역, 예를 들어 IgG4 힌지 영역 및/또는 CH1/CL 및/또는 Fc 영역이거나 이를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 불변 영역 또는 부분은 IgG4 또는 IgG1과 같은 인간 IgG의 것이다. 일부 측면에서, 불변 영역의 일부는 결합 도메인, 예를 들어 scFv와 막관통 도메인 사이에서 스페이서 영역으로 기능한다. 전이 유전자에 의해 암호화될 수 있는 예시적인 스페이서는 IgG4 힌지 단독, CH2 및 CH3 도메인에 연결된 IgG4 힌지, 또는 CH3 도메인에 연결된 IgG4 힌지 및 문헌[Hudecek et al. (2013) Clin. Cancer Res., 19:3153, Hudecek et al. (2015) Cancer Immunol Res. 3(2): 125-135 또는 국제 특허 출원 공개 번호 WO2014031687]에 기술된 것들 또는 본원의 섹션 III.B.1에 기술된 임의의 것을 포함한다.
일부 측면에서, 스페이서를 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열은 전이 유전자 내에서 하나 이상의 결합 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열의 3’에 위치할 수 있다. 일부 측면에서, 스페이서를 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열은 전이 유전자 내에서 막관통 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열의 5’에 위치할 수 있다. 일부 구현예에서, 스페이서를 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열은 하나 이상의 결합 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열과 막관통 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열 사이에 위치한다.
일부 구현예에서, 전이 유전자는 막관통 도메인을 암호화하고, 이 도메인은 예를 들어 하나 이상의 결합 도메인 및/또는 스페이서를 함유하는 세포외 영역과, 예를 들어, 하나 이상의 공자극 신호 전달 도메인, 세포내 다량체화 도메인 및/또는 CD3ζ 사슬 또는 이의 단편을 함유하는 세포내 영역을 연결할 수 있다. 일부 구현예에서, 전이 유전자는 막관통 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열을 포함하고, 선택적으로 막관통 도메인은 인간의 것이거나 인간 단백질로부터 유래된 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 막관통 도메인은 CD4, CD28 또는 CD8로부터 유래된, 선택적으로 인간 CD4, 인간 CD28 또는 인간 CD8로부터 유래된 막관통 도메인이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 막관통 도메인은 CD28로부터 유래된, 선택적으로 인간 CD28로부터 유래된 막관통 도메인이거나 이를 포함한다.
일부 구현예에서, 막관통 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열이 세포외 영역을 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열에 융합된다. 일부 구현예에서, 막관통 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열이 세포내 영역을 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열에 융합된다. 일부 측면에서, 막관통 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열은 전이 유전자 내에서 하나 이상의 결합 도메인 및/또는 스페이서를 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열의 3’에 위치할 수 있다. 일부 측면에서, 막관통 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열은 전이 유전자 내에서 예를 들어 하나 이상의 공자극 신호 전달 도메인, 세포내 다량체화 도메인 및/또는 CD3ζ 사슬 또는 이의 단편을 함유하는 세포내 영역을 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열의 5’에 위치할 수 있다. 일부 측면에서, 전이 유전자 서열에 의해 암호화된 막관통 도메인은 본원의 예를 들어 섹션 III.B.1에 기술된 임의의 막관통 도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, 암호화된 키메라 수용체가 CD3ζ 사슬을 포함하는 세포내 영역을 포함하지만 막관통 도메인 및/또는 세포외 영역을 포함하지 않는 경우에, 전이 유전자는 본원의, 예를 들어 섹션 III.B에 기술된 임의의 것과 같은 막 회합 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열을 포함할 수 있다.
(iv) 세포내 영역
일부 구현예에서, 전이 유전자는 세포내 영역을 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 세포내 영역은 하나 이상의 2차 또는 공자극 신호 전달 영역을 포함한다. 일부 측면에서, 막관통 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열은 전이 유전자 내에서 하나 이상의 결합 도메인 및/또는 스페이서를 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열의 3’에 위치할 수 있다. 일부 측면에서, 하나 이상의 공자극 신호 전달 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열은 CD3ζ 사슬의 일부를 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열의 5’에 위치할 수 있다. 일부 측면에서, 하나 이상의 공자극 신호 전달 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열은 전이 유전자 내 가장 3’ 영역이고, 그런 후 이는 상동성 암 서열들 중 하나, 예를 들어 3’ 상동성 암 서열에 연결된다. 예를 들어, 일부 경우에, 전이 유전자는 CD3ζ 사슬 또는 이의 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열을 포함하지 않으며, 따라서 상동성 암에 연결된 전이 유전자 내 가장 3’ 영역은 하나 이상의 공자극 신호 전달 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열이다. 일부 측면에서, 하나 이상의 공자극 신호 전달 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열은 전이 유전자 내에서 막관통 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열의 3’에 위치할 수 있다. 일부 측면에서, 전이 유전자 서열에 의해 암호화된 공자극 신호 전달 영역 또는 CD3ζ 또는 이의 일부는 본원의 예를 들어 섹션 III.B.1에 기술된 임의의 공자극 신호 전달 영역 또는 CD3ζ 또는 이의 일부를 포함한다.
(a) 공자극 신호 전달 도메인
일부 구현예에서, 전이 유전자는 하나 이상의 공자극 신호 전달 도메인을 포함할 수 있는 세포내 영역의 일부를 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 공자극 신호 전달 도메인은 T 세포 공자극 분자 또는 이의 신호 전달 부분의 세포내 신호 전달 도메인을 포함하고, 선택적으로 T 세포 공자극 분자 또는 이의 신호 전달 부분은 인간의 것이다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 공자극 신호 전달 도메인은 T 세포 공자극 분자 또는 이의 신호 전달 부분의 세포내 신호 전달 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, T 세포 공자극 분자 또는 이의 신호 전달 부분은 인간의 것이다. 일부 구현예에서, 전이 유전자에 의해 암호화된 예시적인 공자극 신호 전달 도메인은 CD28, CD137 (4-1BB), OX40 (CD134), CD27, DAP10, DAP12, NKG2D, ICOS 및/또는 본원의 섹션 III.B에 기술된 임의의 것과 같은 기타 공자극 수용체와 같은 하나 이상의 공자극 수용체로부터 유래된 신호 전달 영역 또는 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 공자극 신호 전달 도메인은 CD28, 4-1BB 또는 ICOS 또는 이들의 신호 전달 부분의 세포내 신호 전달 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 공자극 신호 전달 도메인은 인간 CD28, 인간 4-1BB, 인간 ICOS 또는 이들의 신호 전달 부분의 신호 전달 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 공자극 신호 전달 도메인은 인간 4-1BB의 세포내 신호 전달 도메인을 포함한다.
(b) CD3ζ 사슬 또는 CD3ζ 사슬의 부분
일부 구현예에서, 전이 유전자는 CD3ζ 사슬 또는 이의 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열, 예컨대 CD3ζ 또는 이의 일부의 세포질 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 전이 유전자는 CD3ζ 사슬의 일부만을 암호화한다. 일부 측면에서, 내인성 CD247 유전자 자리 내로 전이 유전자를 통합 시, 생성된 변형된 CD247 유전자 자리는 CD3ζ 사슬 또는 이의 단편, 예컨대 CD3ζ의 세포내 영역을 함유하는 키메라 수용체, 예를 들어 CAR을 암호화한다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드가 도입된 세포에 의해 발현될 때, 키메라 수용체는 CD3ζ 신호 전달 도메인을 통해 신호 전달을 할 수 있다. 일부 구현예에서, 암호화된 키메라 수용체는 본원의 예를 들어 섹션 III.B에 기술된 임의의 것이다.
일부 측면에서, 폴리뉴클레오타이드의 전이 유전자 서열 부분은 CD3ζ 사슬의 전장을 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열을 함유하지 않는다. 따라서, 일부 측면에서, 암호화된 키메라 수용체 내 CD3ζ 사슬의 적어도 일부는 내인성 CD247 유전자 자리에 존재하는 서열에 의해 암호화된다. 일부 구현예에서, 전이 유전자 서열은 CD3ζ 사슬의 임의의 부분을 암호화하는 핵산 서열을 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 전이 유전자는 CD3ζ 사슬의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개 이하의 아미노산의 일부만을 암호화한다. 일부 측면에서, 전이 유전자 서열의 통합 시, 키메라 수용체의 CD3ζ 사슬 또는 이의 단편을 암호화하는 핵산 서열의 일부 또는 전부는 내인성 CD247 유전자 자리의 개방형 해독틀 서열 또는 이의 부분 서열로부터 유래되거나 이로부터 기원한다. 일부 구현예에서, 전이 유전자는 CD3ζ 사슬 또는 이의 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열을 포함하지 않거나 또는 CD3ζ 사슬 또는 이의 단편을 제외한 세포내 영역의 부분 또는 일부를 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열만을 포함한다.
일부 구현예에서, 전이 유전자는 CD3ζ 사슬의 전장 길이 미만 또는 CD3ζ 사슬의 일부를 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 전이 유전자는 CD3ζ 사슬의 세포내 영역을 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열, 또는 이의 부분 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 전이 유전자는 CD3ζ 사슬의 부분, 예를 들어 CD3ζ 사슬의 세포내 영역을 암호화하는 서열에 인트론을 포함하지 않는다.
일부 구현예에서, 전이 유전자의 표적화된 통합은 전이 유전자와 CD247 유전자 자리의 내인성 서열의 유전자 융합물을 생성하고, 이들은 함께 기능성 CD3ζ 사슬, 예를 들어 1차 세포질 또는 세포내 신호를 매개하거나, 활성화하거나 자극할 수 있는 CD3ζ 사슬의 일부, 예를 들어 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프(ITAM)를 포함하는 CD3ζ 사슬 또는 CD3ζ 사슬의 일부의 세포질 도메인을 암호화한다.
일부 측면에서, 전이 유전자와 CD247 유전자 자리의 내인성 서열의 유전자 융합물에 의해 암호화된 예시적인 CD3ζ 사슬 또는 이의 단편은 CD3ζ 사슬의 세포내 영역의 전부 또는 일부, 예를 들어 서열 번호: 73에 제시된 인간 CD3ζ 사슬 전구체 서열의 아미노산 잔기 52-164 또는 서열 번호: 75에 제시된 인간 CD3ζ 사슬 전구체 서열의 아미노산 잔기 52-163, 또는 서열 번호: 73에 제시된 인간 CD3ζ 사슬 전구체 서열의 아미노산 잔기 52-164 또는 서열 번호: 75에 제시된 인간 CD3ζ 사슬 전구체 서열의 아미노산 잔기 52-163에 대해 적어도 (약) 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 또는 이의 부분 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 전이 유전자와 CD247 유전자 자리의 내인성 서열의 유전자 융합물에 의해 암호화된 예시적인 CD3ζ 사슬 또는 이의 단편은 서열 번호: 13, 14 또는 15에 제시된 아미노산 서열 또는 서열 번호: 13, 14 또는 15에 대해 적어도 (약) 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 또는 이의 부분 서열을 포함한다. 전이 유전자와 CD247 유전자 자리의 내인성 서열의 유전자 융합물에 의해 암호화된 예시적인 CD3ζ 사슬 또는 이의 단편은 CD3ζ 사슬의 ITAM 도메인들 중 하나 이상, 예를 들어 서열 번호: 73에 제시된 인간 CD3ζ 사슬 전구체 서열의 아미노산 잔기 61-89, 100-128 또는 131-159 또는 서열 번호: 75에 제시된 인간 CD3ζ 사슬 전구체 서열의 아미노산 잔기 61-89, 100-127 또는 130-158 또는 CD3ζ 사슬의 하나 이상의 ITAM 도메인을 함유하고 서열 번호: 73에 대해 적어도 (약) 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열 또는 서열 번호: 75에 제시된 인간 CD3ζ 사슬 전구체 서열의 아미노산 잔기 61-89, 100-127 또는 130-158을 포함한다.
일부 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드가 도입된 세포에 의해 발현될 때, 키메라 수용체는 CD3제타 신호 전달 도메인을 통해 신호 전달을 할 수 있다. 임의의 구현예의 일부에서, 암호화된 키메라 수용체, 예를 들어 변형된 CD247 유전자 자리에 의해 암호화된 키메라 수용체는 신호 전달이 가능한 CD3ζ 신호 전달 도메인, 예컨대 전체 CD3ζ 신호 전달 도메인을 포함한다. 임의의 구현예의 일부에서, 전체 CD3ζ 신호 전달 도메인은 서열 번호: 13-15 중 어느 하나에서 선택된 서열, 또는 서열 번호: 13-15 중 어느 하나에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 동일성을 나타내는 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 전부 또는 완전한 CD3ζ 신호 전달 도메인(예를 들어, 전체 CD3ζ 신호 전달 도메인) 도는 CD3ζ 신호 전달 도메인의 일부(예를 들어, CD3ζ 신호 전달 도메인의 단편)는 제공된 조작된 세포에서 세포(예를 들어, T 세포)의 내인성 CD247 유전자 자리의 개방형 해독틀에 의해 암호화된다. 일부 구현예에서, 키메라 수용체를 암호화하는 변형된 CD247 유전자 자리에 의해 암호화된 완전한 세포내 신호 전달 도메인의 CD3ζ 신호 전달 도메인(예를 들어, 전체 CD3ζ 신호 전달 도메인)은 서열 번호: 13-15 중 어느 하나에서 선택된 서열, 또는 서열 번호: 13-15 중 어느 하나에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 동일성을 나타내는 서열, 또는 이의 단편을 포함한다. 상기 임의 예에서, CD3ζ 신호 전달 도메인은 서열 번호: 13에 제시된 서열을 포함한다. 상기 임의 예에서, CD3ζ 신호 전달 도메인은 서열 번호: 13에 제시된 서열로 구성되거나 이를 필수적으로 포함하여 구성된다. 상기 임의 예에서, CD3ζ 신호 전달 도메인은 서열 번호: 14에 제시된 서열을 포함한다. 상기 임의 예에서, CD3ζ 신호 전달 도메인은 서열 번호: 14에 제시된 서열로 구성되거나 이를 필수적으로 포함하여 구성된다. 상기 임의 예에서, CD3ζ 신호 전달 도메인은 서열 번호: 15에 제시된 서열을 포함한다. 상기 임의 예에서, CD3ζ 신호 전달 도메인은 서열 번호: 15에 제시된 서열로 구성되거나 이를 필수적으로 포함하여 구성된다.
구체적인 구현예에서, 전이 유전자는 CD3ζ 사슬의 전장 길이 미만, 예를 들어 전체 CD3ζ 신호 전달 도메인 미만을 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열이거나 이를 함유한다. 특정 구현예에서, 전이 유전자는 CD247 개방형 해독틀의 4개 미만 엑손, 3개 전(full) 엑손, 3개 미만 엑손, 2개 전 엑손, 2개 미만 엑손, 1개 엑손, 또는 1개 미만 엑손이거나 이를 포함하는 CD3ζ 사슬의 일부를 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열을 함유한다. 구체적인 구현예에서, 전이 유전자는 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 또는 2개 뉴클레오타이드 길이이거나 그 이하인 CD3ζ 사슬의 일부를 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열을 함유한다. 일부 구현예에서, 전이 유전자는 서열 번호: 74 또는 76에 제시된 핵산 서열의 전부 또는 일부에 대해 (적어도) 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 또는 99.9%의 서열 동일성을 갖는 서열의 (약) 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 또는 2개 또는 그 미만의 인접 뉴클레오타이드인 CD3ζ 사슬의 일부를 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열을 함유한다.
일부 측면에서, 전이 유전자에 의해 암호화된 CD3ζ 사슬의 일부는 엑손 1, 2, 3, 4 또는 5 중에서 선택되는 하나 이상의 엑손에 의해 암호화된 일부, 또는 엑손 1-5 또는 2-5(예를 들어, 인트론 서열 없음)를 포함하는 인접 서열의 부분 서열에 의해 암호화된 일부를 포함한다. 일부 측면에서, 전이 유전자에 의해 암호화된 CD3ζ 사슬의 일부는 엑손 1, 2 또는 3 중에서 선택되는 하나 이상의 엑손에 의해 암호화된 일부, 또는 엑손 1-3 또는 2-3(예를 들어, 인트론 서열 없음)를 포함하는 인접 서열의 부분 서열에 의해 암호화된 일부를 포함한다. 일부 측면에서, 전이 유전자에 의해 암호화된 CD3ζ 사슬의 일부는 엑손 2 또는 이의 부분 서열에 의해 암호화된 일부를 포함한다. 일부 측면에서, 전이 유전자는 내인성 CD247 유전자 자리의 개방형 해독틀 서열의 엑손 2의 마지막 3, 6, 9, 12, 15 또는 18개 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 전이 유전자는 내인성 CD247 유전자 자리의 개방형 해독틀의 엑손 2에 의해 암호화된 마지막 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개 아미노산 잔기를 암호화하는 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 전이 유전자는 엑손 2의 마지막 9개 뉴클레오타이드 및/또는 내인성 CD247 유전자 자리의 개방형 해독틀의 엑손 2에 의해 암호화된 마지막 3개 아미노산 잔기를 암호화하는 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 전이 유전자는 엑손 3의 첫 3, 6, 9, 12, 15 또는 18개 뉴클레오타이드 및/또는 내인성 CD247 유전자 자리의 개방형 해독틀의 엑손 3에 의해 암호화된 첫 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개 아미노산 잔기를 암호화하는 서열을 포함한다.
구체적인 구현예에서, 전이 유전자는 어떠한 인트론도 함유하지 않는다. 구체적인 구현예에서, 전이 유전자 내 CD3ζ 사슬의 일부를 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열은 어떠한 인트론이나 이의 일부도 함유하지 않는다.
일부 측면에서, 전이 유전자는 CD3ζ 사슬의 임의의 부분을 암호화하는 핵산 서열을 포함하지 않는다. 일부 측면에서, 전이 유전자 내에 존재하는 경우 CD3ζ 사슬의 일부를 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열은 일반적으로 상동성 암 서열들 중 하나, 예를 들어 3’ 상동성 암 서열에 연결된다. 일부 측면에서, 전이 유전자 내에 존재하는 경우 전이 유전자 내 가장 3’ 영역이고, 그런 후 이는 상동성 암 서열들 중 하나, 예를 들어 3’ 상동성 암 서열에 연결된다.
(v) 추가 도메인, 예를 들어 다량체화 도메인
일부 구현예에서, 전이 유전자는 또한 하나 이상의 다량체화 도메인, 예를 들어 이량체화 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 암호화된 다량체화 도메인은 세포외 또는 세포내일 수 있다. 일부 구현예에서, 암호화된 다량체화 도메인은 세포외일 수 있다. 일부 구현예에서, 암호화된 다량체화 도메인은 세포내일 수 있다. 일부 구현예에서, 전이 유전자 서열에 의해 암호화된 세포내 영역의 일부는 다량체화 도메인, 선택적으로 이량체화 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 전이 유전자는 세포외 영역을 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포외 영역은 다량체화 도메인, 선택적으로 이량체화 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 다량체화 도메인은 유도인자에 결합 시 이량체화할 수 있다.
일부 측면에서, 키메라 수용체는 다중 사슬 CAR과 같은 다중 사슬 수용체이다. 일부 구현예에서, 다중 사슬 키메라 수용체의 하나 이상의 사슬 또는 이의 일부는 전이 유전자 서열에 의해 암호화된다. 일부 구현예에서, 다중 사슬 키메라 수용체의 하나 이상의 사슬은 키메라 수용체의 각 사슬에 포함된 다량체화 도메인의 다량체화에 의해, 함께 기능성 또는 활성 키메라 수용체를 형성할 수 있다.
일부 측면에서, 다량체화 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열은 다른 도메인들의 5’ 또는 3’에 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 암호화된 다량체화 도메인은 세포외이고, 다량체화 도메인을 암호화하는 서열은 스페이서를 암호화하는 서열의 5’에 있다. 일부 구현예에서, 암호화된 다량체화 도메인은 세포내이고, 다량체화 도메인을 암호화하는 서열은 CD3ζ 사슬 또는 이의 단편을 암호화하는 서열의 5’에 있다. 일부 구현예에서, 다량체화 도메인은 세포내이고, 다량체화 도메인을 암호화하는 서열은 하나 이상의 공자극 신호 전달 도메인을 암호화하는 서열의 5’ 또는 3’에 있다. 일부 구현예에서, 암호화된 다량체화 도메인은 유도인자의 결합 시 다량체화(예를 들어, 이량체화)할 수 있다. 예시적인 암호화된 다량체화 도메인은 본원의 예를 들어 섹션 III.B에 기술된 임의의 다량체화 도메인을 포함한다.
(vi) 추가 분자, 예를 들어 표지자
일부 구현예에서, 전이 유전자는 또한 하나 이상의 추가 분자, 예컨대 항체, 항원, 다중 사슬 키메라 수용체(예를 들어, 다중 사슬 CAR, 키메라 공자극 수용체, 억제성 수용체, 조절 가능 키메라 항원 수용체 또는 본원의 예를 들어 섹션 III.B.2에 기술된 다중 사슬 키메라 수용체 시스템의 다른 성분; 또는 재조합 T 세포 수용체(TCR))의 추가 키메라 또는 추가 폴리펩타이드 사슬, 형질도입 표지자 또는 대리 표지자(예를 들어, 절단형 세포 표면 표지자), 효소, 인자, 전사 인자, 억제성 펩타이드, 성장 인자, 핵 수용체, 호르몬, 림포카인, 사이토카인, 케모카인, 가용성 수용체, 가용성 사이토카인 수용체, 가용성 케모카인 수용체, 리포터, 전술한 것 중 임의의 것 및 전술한 것의 조합의 기능성 단편 또는 기능적 변이체를 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 하나 이상의 추가 분자를 암호화하는 이러한 뉴클레오타이드의 서열은 키메라 수용체의 영역 또는 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열의 5’에 위치할 수 있다. 일부 측면에서, 하나 이상의 다른 분자를 암호화하는 서열 및 키메라 수용체의 영역 또는 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열은 2A 리보솜 스키핑 요소 및/또는 프로모터 서열과 같은 조절 서열에 의해 분리된다.
일부 구현예에서, 전이 유전자는 또한 하나 이상의 추가 분자를 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 하나 이상의 추가 분자는 하나 이상의 표지자(들)를 포함한다.　 일부 구현예에서, 하나 이상의 표지자(들)는 형질도입 표지자, 대리 표지자 및/또는 선택 표지자를 포함한다.　일부 구현예에서, 전이 유전자는 또한 예컨대 전달된 세포의 생존력 및/또는 기능을 촉진함으로써 요법의 효능을 개선할 수 있는 핵산 서열; 예컨대 생체 내 생존 또는 국소화를 평가하기 위한 세포의 선택 및/또는 평가를 위한 유전자 표지자를 제공하기 위한 핵산 서열; 문헌[Lupton S. D. et al., Mol. and Cell Biol., 11:6 (1991); and Riddell et al., Human Gene Therapy 3:319-338 (1992)]에 기술된 바와 같이 예를 들어 생체 내에서 음성 선택에 세포를 예민하게 만들어 안정성을 개선하기 위한 핵산 서열을 포함하고; 또한 우성의 양성 선택 가능한 표지자를 음성 선택 가능한 표지자와 융합시켜 유래된 2작용성 선택 가능한 융합 유전자의 용도를 기술하는 문헌[WO 1992008796 및 WO 1994028143와 미국 특허 번호 6,040,177]을 참조한다. 일부 측면에서, 표지자는 본원의 예를 들어 본 섹션 또는 섹션 II 또는 III.B에 기술된 임의의 표지자, 또는 본원의 예를 들어 섹션 III.B.2에 기술된 임의의 추가 분자 및/또는 수용체 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 추가 분자는 대리 표지자, 선택적으로 절단형 수용체, 선택적으로 여기서 절단형 수용체는 세포내 신호 전달 도메인이 결여되어 있고/있거나 그의 리간드에 의해 결합될 때 세포내 신호 전달을 매개할 수 없다.
일부 구현예에서, 표지자는 형질도입 표지자 또는 대리 표지자이다.　 형질도입 표지자 또는 대리 표지자는 폴리뉴클레오타이드, 예를 들어, 키메라 수용체 또는 이의 일부를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 도입된 세포를 검출하는 데 사용될 수 있다.　 일부 구현예에서, 형질도입 표지자는 세포의 변형을 나타내거나 확인할 수 있다. 일부 구현예에서, 대리 표지자는 키메라 수용체 또는 이의 일부(예를 들어, CAR)와 함께 세포 표면 상에 공발현되도록 만들어진 단백질이다.　 구체적인 구현예에서,, 상기 대리 표지자는 거의 또는 전혀 활성을 갖지 않도록 변형된 표면 단백질이다.　 특정 구현예에서, 대리 표지자는 키메라 수용체 또는 이의 일부를 암호화하는 동일한 폴리뉴클레오타이드 상에 암호화된다.　 일부 구현예에서, 키메라 수용체 또는 이의 일부를 암호화하는 핵산 서열은, 선택적으로 내부 리보솜 유입점(IRES)에 의해 분리되는, 표지자를 암호화하는 핵산 서열에 또는 자가 절단 펩타이드 또는 T2A, P2A, E2A 또는 F2A와 같은 2A 서열과 같은 리보솜 스키핑을 일으키는 펩타이드를 암호화하는 핵산에 작동 가능하게 연결된다.　 외인성 표지 유전자는 일부 경우에 세포의 검출 또는 선택을 허용하도록 조작된 세포와 관련하여 사용될 수 있고, 일부 경우에 세포 제거 및/또는 세포 자살을 촉진하도록 조작된 세포와 관련하여 또한 사용될 수 있다.　
예시적인 대리 표지자는, 비기능적이며 신호 또는 일반적으로 전장 형태의 세포 표면 폴리펩타이드에 의해 전달되는 신호를 전달할 수 없거나 전달하지 않고/거나 내재화될 수 없거나 내재화되지 않는 절단 형태와 같은, 세포 표면 폴리펩타이드의 절단 형태를 포함할 수 있다. 예시적인 절단된 세포 표면 폴리펩타이드는 절단된 인간 표피 성장 인자 수용체 2(tHER2), 절단된 표피 성장 인자 수용체(tEGFR, 서열 번호: 7 또는 16에 제시된 예시적인 tEGFR 서열) 또는 전립선-특이적 막 항원(PSMA) 또는 이의 변형된 형태와 같은 성장 인자 또는 다른 수용체의 절단 형태를 포함한다. tEGFR은 항체 세툭시맙(Erbitux®또는 다른 치료용 항-EGFR 항체 또는 결합 분자에 의해 인식되는 에피토프를 함유할 수 있으며, 이는 tEGFR 작제물 및 암호화된 외인성 단백질로 조작된 세포를 식별 또는 선택하기 위해 및/또는 암호화된 외인성 단백질을 발현하는 세포를 제거 또는 분리하기 위해 사용될 수 있다.　 문헌[미국 특허 번호 8,802,374 및 Liu et al., Nature Biotech. 2016 April; 34(4): 430-434]을 참조한다.　 일부 측면에서, 표지자(예를 들어, 대리 표지자)에는 CD34의 전부 또는 일부(예를 들어, 절단 형태), NGFR, CD19 또는 절단된 CD19(예를 들어, 절단된 비-인간 CD19), 또는 표피 성장 인자 수용체(예를 들어, tEGFR)가 포함된다.
일부 구현예에서, 표지자는 형광 단백질의 종 변이체, 단량체 변이체, 코돈-최적화된, 안정화된 및/또는 강화된 변이체를 포함하여, 녹색 형광 단백질(green fluorescent protein, GFP), 강화된 녹색 형광 단백질(EGFP), 예컨대 슈퍼-폴드 GFP(super-fold GFP, sfGFP), 적색 형광 단백질(red fluorescent protein, RFP), 예컨대 tdTomato, mCherry, mStrawberry, AsRed2, DsRed 또는 DsRed2, 시안 형광 단백질(cyan fluorescent protein, CFP), 청록 형광 단백질(blue green fluorescent protein, BFP), 강화된 청색 형광 단백질(EBFP) 및 노랑 형광 단백질(YFP) 및 이들의 변이체와 같은 형광 단백질과 같은 검출 가능한 단백질이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 표지자는 루시퍼라아제, 대장균(E. Coli)의 lacZ 유전자, 알칼리 포스파타아제, 분비 배아 알칼리 포스파타아제(SEAP), 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라아제(CAT)와 같은 효소이거나 이를 포함한다.　예시적인 발광 리포터 유전자에는 루시퍼라아제(luc), β-갈락토시다아제, 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라아제(CAT), β-글루쿠로니다아제(GUS) 또는 이들의 변이체가 포함된다. 일부 측면에서, 효소의 발현은 효소의 발현 및 기능적 활성 시 검출될 수 있는 기질의 첨가에 의해 검출될 수 있다.
일부 구현예에서, 표지자는 선택 표지자이다.　일부 구현예에서, 선택 표지자는 외인성 제제 또는 약물에 대한 내성을 부여하는 폴리펩타이드이거나 이를 포함한다.　 일부 구현예에서, 선택 표지자는 항생제 내성 유전자이다. 일부 구현예에서, 선택 표지자는 포유류 세포에 대해 항생제 내성을 부여하는 항생제 내성 유전자이다.　 일부 구현예에서, 선택 표지자는 퓨로마이신 내성 유전자, 히그로마이신 내성 유전자, 블라스티사이딘 내성 유전자, 네오마이신 내성 유전자, 게네티신 내성 유전자 또는 제오신 내성 유전자 또는 이들의 변이체이거나 이를 포함한다.
일부 구현예에서, 분자는 비자기(non-self) 분자, 예를 들어 비자기 단백질, 즉 세포가 입양으로 전달될 숙주의 면역 시스템에 의해 “자기(self)”로 인식되지 않는 분자이다.
일부 구현예에서, 표지자는 치료 기능을 제공하지 않고/거나 유전자 조작, 예를 들어 성공적으로 조작된 세포를 선택하기 위한 표지자로서 사용되는 것 외에 다른 효과를 생성하지 않는다. 다른 구현예에서, 표지자는 치료적 분자 또는 달리 일부 원하는 효과를 나타내는 분자, 예컨대 생체 내에서 세포가 조우하게 될 리간드, 예컨대 입양 전달 및 리간드와의 조우 시 세포의 반응을 강화하고/거나 약화시키는 공자극 또는 면역 관문 분자일 수 있다.
일부 구현예에서, 전이 유전자는 면역 조절제인 하나 이상의 추가 분자를 암호화하는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 면역 조절 분자는 면역 관문 조절제, 면역 관문 억제제, 사이토카인 또는 케모카인 중에서 선택된다. 일부 구현예에서, 면역 조절제는 면역 관문 분자의 기능 또는 면역 관문 분자를 포함하는 신호 전달 경로를 억제할 수 있는 면역 관문 억제제이다. 일부 구현예에서, 면역 관문 분자는 PD-1, PD-L1, PD-L2, CTLA-4, LAG-3, TIM3, VISTA, 아데노신 수용체 또는 세포외 아데노신, 선택적으로 아데노신 2A 수용체(A2AR) 또는 아데노신 2B 수용체(A2BR), 또는 아데노신 또는 전술한 임의의 것 중 하나를 포함하는 경로 중에서 선택된다. 기타 예시적인 추가 분자에는 에피토프 태그, 형광 또는 발광 단백질과 같은 검출 가능한 분자, 또는 강화된 성장 및/또는 유전자 증폭을 매개하는 분자(예를 들어, 디하이드로폴레이트 환원효소)가 포함된다. 에피토프 태그는 예를 들어 FLAG, His, myc, Tap, HA 또는 임의의 검출 가능한 아미노산 서열의 하나 이상의 복제본을 포함한다. 일부 구현예에서, 추가 분자는 비코딩 서열, 역배열 RNA, RNAi, shRNA 및 마이크로 RNA(miRNA)와 같은 억제성 핵산 서열, 또는 뉴클레아제 인식 서열을 포함할 수 있다.
일부 측면에서, 추가 분자는 본원에 기술된 임의의 추가 수용체 폴리펩타이드, 예컨대 섹션 III.B.2에 기술된 것과 같은 다중 사슬 키메라 수용체의 임의의 추가 수용체 폴리펩타이드사슬을 포함할 수 있다.
(vii) 다중 시스트론 요소 및 조절 또는 제어 요소
일부 구현예에서, 전이 유전자(예를 들어, 외인성 핵산 서열)는 또한 하나 이상의 이종성 또는 외인성 조절 또는 제어 요소, 예를 들어 내인성 CD247 유전자 자리의 조절 또는 제어 요소가 아니거나 이와 상이한 cis-조절 요소를 함유한다. 일부 측면에서, 이종성 조절 또는 제어 요소는 예컨대 프로모터, 인핸서, 인트론, 인슐레이터, 폴리아데닐화 신호, 전사 종결 서열, 코작(Kozak) 공통서열, 다중 시스트론 요소(예를 들어, 내부 리보솜 유입점(IRES), 2A 서열), 메신저 RNA(mRNA)의 비번역 영역(UTR)에 상응하는 서열, 및 CD247 유전자 자리에서 조절 또는 제어 요소가 아니거나 이와 상이한 것들과 같은 스플라이스 수용체 또는 공여체 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 이종성 조절 또는 제어 요소는 프로모터, 인핸서, 인트론, 폴리아데닐화 신호, 코작 공통 서열, 스플라이스 수용체 서열 및/또는 스플라이스 공여체 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 전이 유전자는 이종성이고/거나 표적 부위에 또는 그 근처에 일반적으로 존재하지 않는 프로모터를 포함한다. 일부 측면에서, 조절 또는 제어 요소는 CD247 유전자 자리에서 통합될 때 키메라 수용체의 발현을 조절 또는 제어하는 데 필요한 요소를 포함한다. 일부 구현예에서, 전이 유전자 서열은 이종성 유전자 또는 유전자 자리의 5’ 및/또는 3’ 비번역 영역(UTR)에 상응하는 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 전이 유전자 서열은 본 섹션 및 섹션 II에 기술된 것을 포함하여 본원에 기술된 임의의 조절 또는 제어 요소를 포함할 수 있다.
키메라 수용체 또는 이의 일부를 암호화하는 전이 유전자를 포함하여 전이 유전자는 그 발현이 통합 부위에서 내인성 프로모터, 즉 내인성 CD247 유전자의 발현을 구동하는 프로모터에 의해 구동되도록 삽입될 수 있다. 서열을 암호화하는 폴리펩타이드는 프로모터가 없는 일부 구현예에서, 그러면 통합된 전이 유전자의 발현은 관심 영역의 내인성 프로모터 또는 다른 제어 요소에 의해 구동된 전사에 의해 보장된다. 예를 들어, 키메라 수용체의 일부를 암호화하는 전이 유전자는 프로모터 없이, 그렇지만 내인성 CD247 유전자 자리의 코딩 서열과 틀 내에서, 통합된 전이 유전자의 발현이 통합 부위에서 내인성 프로모터 및/또는 다른 조절 요소의 전사에 의해 제어되도록, 삽입될 수 있다. 일부 구현예에서, 리보솜 스키핑 요소/자가 절단 요소(예를 들어, 2A 요소 또는 내부 리보솜 유입점(IRES))와 같은 다중 시스트론 요소는, 키메라 수용체의 일부를 암호화하는 전이 유전자의 상단부에 위치하여, 다중 시스트론 요소가 CD247 유전자 자리의 내인성 개방형 해독틀의 하나 이상의 엑손과 틀 내에 위치하도록, 키메라 수용체를 암호화하는 전이 유전자의 발현이 내인성 CD247 프로모터에 작동 가능하게 연결되도록 한다. 일부 구현예에서, 전이 유전자 서열은 3’ UTR을 암호화하는 서열을 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 내인성 CD247 유전자 자리 내로 전이 유전자를 통합 시, 전이 유전자는, 키메라 수용체를 암호화하는 메시지가 내인성 CD247 유전자 자리의, 예를 들어 내인성 CD247 유전자 자리의 개방형 해독틀 또는 이의 부분 서열의 3’ UTR을 함유하도록, 내인성 CD247 유전자 자리의 3’ UTR의 상단부에 통합된다. 일부 구현예에서, 키메라 수용체의 나머지 부분을 암호화하는 개방형 해독틀 또는 이의 부분 서열은 내인성 CD247 유전자 자리의 3’ UTR을 포함한다.
일부 구현예에서, “탠덤(tandem)” 카세트가 선택된 부위에 통합된다. 일부 구현예에서, “탠덤” 카세트들 중 하나 이상이 하나 이상의 폴리펩타이드 또는 인자를 암호화하고, 각각은 조절 요소에 의해 독립적으로 제어되거나 모두가 다중 시스트론 발현 시스템으로서 제어된다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드가 제1 및 제2 핵산 서열을 함유하는 것과 같이 각각의 상이한 폴리펩타이드 사슬을 암호화하는 코딩 서열은 동일하거나 상이할 수 있는 프로모터에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 일부 구현예에서, 핵산 분자는 둘 이상의 상이한 폴리펩타이드 사슬의 발현을 구동하는 프로모터를 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 핵산 분자는 다중 시스트론(이중 시스트론 또는 삼중 시스트론, 예를 들어, 미국 특허 번호 6,060,273 참조)일 수 있다. 일부 구현예에서, 전사 단위는 단일 프로모터로부터의 메시지에 의해 유전자 산물의 공발현을 허용하는 IRES(내부 리보솜 유입점)를 함유하는 이중 시스트론 단위로 조작될 수 있다. 대안적으로, 일부 경우에, 단일 프로모터는 단일 개방형 해독틀(open reading frame, ORF)에, 본원에 기술된 바와 같이, 자가-절단 펩타이드(예를 들어, 2A 서열) 또는 프로테아제 인식 부위(예를 들어, 퓨린)를 암호화하는 서열에 의해 서로 분리된, 2개 또는 3개의 폴리펩타이드를 함유하는 RNA의 발현을 지시할 수 있다. 따라서, ORF는 번역 동안(2A의 경우) 또는 번역 후에 개별 단백질로 가공되는 단일 폴리펩타이드를 암호화한다. 일부 구현예에서, “탠덤 카세트(tandem cassette)”는 프로모터 없는 서열, 이어서 전사 종결 서열, 및 자율 발현 카세트 또는 다중 시스트론 발현 서열을 암호화하는 제2 서열을 포함하는 카세트의 제1 성분을 포함한다. 일부 구현예에서, 탠덤 카세트는 둘 이상의 상이한 폴리펩타이드 또는 인자, 예를 들어 키메라 수용체의 둘 이상의 사슬 또는 도메인을 암호화한다. 일부 구현예에서, 키메라 수용체의 둘 이상의 사슬 또는 도메인을 암호화하는 핵산 서열이 탠덤 발현 카세트 또는 이중- 또는 다중-시스트론 카세트로서 하나의 표적 DNA 통합 부위 내로 도입된다.
일부 경우에, T2A와 같은 다중 시스트론 요소는 리보솜이 2A 요소의 C-말단에서 펩타이드 결합의 합성을 건너뛰도록(리보솜 스키핑) 유발할 수 있으며, 이는 2A 서열의 말단과 다음(next) 펩타이드 하단부 사이의 분리로 이어진다(예를 들어, 문헌[de Felipe, Genetic Vaccines and Ther. 2:13 (2004) 및 de Felipe et al. Traffic 5:616-626 (2004)] 참조; 또한 자가 절단 요소로도 불림). 이는 삽입된 전이 유전자가 통합 부위에서 CD247 프로모터와 같은 내인성 프로모터의 전사에 의해 제어되도록 해준다. 예시적인 다중 시스트론 요소는 문헌[미국 특허 공개 번호 20070116690]에 기술된 바와 같은 구제역 바이러스(F2A, 예를 들어, 서열 번호: 21), 말 비염 A 바이러스(E2A, 예를 들어, 서열 번호: 20), 토세아 아시그나 바이러스(T2A, 예를 들어, 서열 번호: 6 또는 17) 및 돼지 테스코 바이러스-1(P2A, 예를 들어, 서열 번호: 18 또는 19)의 2A 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오타이드는 전이 유전자, 예를 들어 키메라 수용체 또는 이의 일부를 암호화하는 핵산의 상단부에 있는 P2A 리보솜 스키핑 요소(서열 번호: 18 또는 19에 제시된 서열)를 포함한다.
일부 구현예에서, 키메라 수용체 또는 이의 일부의 하나 이상의 사슬을 암호화하는 전이 유전자 및/또는 추가 분자를 암호화하는 하나 이상의 서열은 독립적으로 하나 이상의 다중 시스트론 요소(들)를 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 다중 시스트론 요소(들)는 키메라 수용체 또는 이의 일부를 암호화하는 핵산 서열 및/또는 추가 분자를 암호화하는 서열의 상단부에 있다. 일부 구현예에서, 다중 시스트론 요소(들)는 키메라 수용체 또는 이의 일부를 암호화하는 핵산 서열 및/또는 추가 분자를 암호화하는 서열 사이에 위치한다. 일부 구현예에서, 다중 시스트론 요소(들)는 키메라 수용체의 일부 또는 사슬을 암호화하는 핵산 서열 사이에 위치한다.
일부 구현예에서, 이종성(heterologous) 조절 또는 제어 요소는 이종성 프로모터를 포함한다. 일부 구현예에서, 이종성 프로모터는 구성적 프로모터(constitutive promoter), 유도성 프로모터, 억제성 프로모터 및/또는 조직 특이적(tissue-specific) 프로모터 중에서 선택된다. 일부 구현예에서, 조절 또는 제어 요소는 프로모터 및/또는 인핸서이고, 예를 들어 구성적 프로모터 또는 유도성 또는 조직 특이적 프로모터이다. 일부 구현예에서, 프로모터는 RNA pol I, pol II 또는 pol III 프로모터 중에서 선택된다. 일부 구현예에서, 프로모터는 RNA 중합효소 II(예를 들어, CMV, SV40 초기 영역 또는 아데노바이러스 주요 후기 프로모터)에 의해 인식된다. 일부 구현예에서, 프로모터는 RNA 중합효소 III(예를 들어, U6 또는 H1 프로모터)에 의해 인식된다. 일부 구현예에서, 프로모터는 구성적 프로모터이거나 이를 포함한다. 예시적인 구성적 프로모터에는 예를 들어 시미안 바이러스 40 초기 프로모터(SV40), 시토메갈로 바이러스 즉석 초기 프로모터(CMV), 인간 유비퀴틴 C 프로모터(UBC), 인간 신장 인자 1α 프로모터(EF1α), 마우스 포스포글리세린산 키나아제 1 프로모터(PGK) 및 CMV 초기 인핸서와 결합한 닭 β-액틴 프로모터(CAGG)가 포함된다. 일부 구현예에서, 이종성 프로모터는 인간 신장 인자 1 알파(EF1α) 프로모터 또는 MND 프로모터 또는 이의 변이체이거나 이를 포함한다.
일부 구현예에서, 프로모터는 조절되는 프로모터(예를 들어, 유도성 프로모터)이다. 일부 구현예에서, 프로모터는 유도성 프로모터 또는 억제성 프로모터이다. 일부 구현예에서, 프로모터는 Lac 작동유전자 서열, 테트라사이클린 작동유전자 서열, 갈락토스 작동유전자 서열 또는 독시사이클린 작동유전자 서열을 포함하거나 또는 이의 유사체이거나 Lac 억제인자 또는 테트라사이클린 억제인자 또는 이의 유사체에 의해 결합되거나 인식될 수 있다. 일부 구현예에서, 프로모터는 조직 특이적 프로모터이다. 일부 경우에, 프로모터는 특정 세포 유형에서만 발현된다(예를 들어, T 세포 또는 B 세포 또는 NK 세포 특이적 프로모터).
일부 구현예에서, 프로모터는 구성적 프로모터이거나 이를 포함한다. 예시적인 구성적 프로모터에는 예를 들어 시미안 바이러스 40 초기 프로모터(SV40), 시토메갈로 바이러스 즉석 초기 프로모터(CMV), 인간 유비퀴틴 C 프로모터(UBC), 인간 신장 인자 1α 프로모터(EF1α), 마우스 포스포글리세린산 키나아제 1 프로모터(PGK) 및 CMV 초기 인핸서와 결합한 닭 β-액틴 프로모터(CAGG)가 포함된다. 일부 구현예에서, 구성적 프로모터는 합성 또는 변형된 프로모터이다. 일부 구현예에서, 프로모터는 골수증식 육종바이러스 인핸서가 있는 변형된 MoMuLV LTR의 U3 영역을 함유하는 합성 프로모터인 MND 프로모터이거나 이를 포함한다(문헌 [Challita et al. (1995) J. Virol. 69(2):748-755] 참조). 일부 구현예에서, 프로모터는 조직 특이적 프로모터이다. 일부 경우에, 프로모터는 특정 세포 유형에서만 발현을 구동한다(예를 들어, T 세포 또는 B 세포 또는 NK 세포 특이적 프로모터).
일부 구현예에서, 프로모터는 바이러스 프로모터이다. 일부 구현예에서, 프로모터는 비-바이러스 프로모터이다. 일부 경우에, 프로모터는 인간 신장 인자 1 알파(EF1α) 프로모터(예컨대 서열 번호: 77 또는 118에 제시됨) 또는 이의 변형된 형태(HTLV1 인핸서를 갖는 EF1α 프로모터; 예컨대 서열 번호: 119에 제시됨) 또는 MND 프로모터(예컨대 서열 번호: 131에 제시됨) 중에서 선택된다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드는 이종성 또는 외인성 조절 요소, 예를 들어, 프로모터를 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 프로모터는 양방향 프로모터이다(예를 들어, 문헌[WO2016/022994] 참조).
일부 구현예에서, 전이 유전자 서열은 또한 스플라이스 수용체 서열을 포함할 수 있다. 예시적인 공지된 스플라이스 수용체 부위 서열은 예를 들어 (인간 HBB 유전자의) CTGACCTCTTCTCTTCCTCCCACAG(서열 번호: 78) 및 (인간 IgG 유전자의) TTTCTCTCCACAG(서열 번호: 79)를 포함한다.
일부 구현예에서, 전이 유전자 서열은 또한 전사 종결 및/또는 폴리아데닐화 신호에 필요한 서열을 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 예시적인 폴리아데닐화 신호는 SV40, hGH, BGH, 및 rbGlob 전사 종결 서열 및/또는 폴리아데닐화 신호에서 선택된다. 일부 구현예에서, 전이 유전자는 SV40 폴리아데닐화 신호를 포함한다. 일부 구현예에서, 전이 유전자 내에 존재하는 경우, 전사 종결 서열 및/또는 폴리아데닐화 신호는 일반적으로 전이 유전자 내 가장 3’ 서열이고, 상동성 암 중 하나에 연결된다. 일부 측면에서, 전이 유전자 서열은 3’ UTR 또는 전사 종결자를 암호화하는 서열을 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 내인성 CD247 유전자 자리 내로 전이 유전자를 통합 시, 전이 유전자는, 키메라 수용체를 암호화하는 메시지가 내인성 CD247 유전자 자리의, 예를 들어 내인성 CD247 유전자 자리의 개방형 해독틀 또는 이의 부분 서열의 3’ UTR을 함유하도록, 내인성 CD247 유전자 자리의 3’ UTR 및/또는 전사 종결자의 상단부에 통합된다. 따라서, 일부 구현예에서, 키메라 수용체의 일부를 암호화하는 전이 유전자 서열의 통합 시, 키메라 수용체를 암호화하는 핵산 서열은 3’ UTR의 제어 하에 있도록 내인성 CD247 유전자 자리의 전사 종결자 및/또는 다른 조절 요소에 작동 가능하게 연결된다.
(viii) 예시적인 전이 유전자 서열
일부 구현예에서, 예시적인 전이 유전자는 5’에서 3’ 순서로 각각 막관통 도메인(또는 막 회합 도메인) 및 세포내 영역을 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 예시적인 전이 유전자는 5’에서 3’ 순서로 각각 세포외 영역, 막관통 도메인 및 세포내 영역을 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 세포외 영역을 암호화하는 예시적인 전이 유전자는 5’에서 3’ 순서로 세포외 결합 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열 및 스페이서를 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 예시적인 전이 유전자는 또한 하나 이상의 세포외 다량체화 도메인(들)을 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열을 포함하고, 이는 결합 도메인들을 암호화하는 뉴클레오타이드의 임의의 서열의 5’ 또는 3’에 위치하고/거나 막관통 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열의 5’에 위치할 수 있다. 일부 측면에서, 예시적인 전이 유전자 서열은 또한 일반적으로 세포외 영역을 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열의 5’에 위치한 신호 서열을 포함한다.
일부 측면에서, 예시적인 전이 유전자에서, 결합 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열은 신호 서열과 스페이서를 암호화하는 뉴클레오타이드 사이에 위치한다. 일부 측면에서, 예시적인 전이 유전자에서, 세포외 다량체화 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열은 결합 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열과 스페이서를 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열 사이에 위치한다. 일부 측면에서, 스페이서를 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열은 결합 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열과 막관통 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열 사이에 위치한다.
일부 구현예에서, 예시적인 전이 유전자는 세포내 영역을 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열을 함유하고, 이는 5’에서 3’ 순서로 하나 이상의 공자극 신호 전달 도메인(들)을 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열 및 선택적으로 CD3ζ 사슬의 일부를 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 예시적인 전이 유전자는 또한 하나 이상의 세포내 다량체화 도메인(들)을 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열을 포함하고, 이는 하나 이상의 공자극 도메인의 임의의 것의 5’ 또는 3’에 위치하고/거나 존재할 경우 CD3ζ 사슬의 일부를 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열의 5’ 또는 폴리뉴클레오타이드 내 예시적인 전이 유전자에 인접한 3’ 상동성 암 서열에 위치할 수 있다. 일부 구현예에서, 예시적인 전이 유전자는 세포내 영역을 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열을 함유하고, 이는 5’에서 3’ 순서로 세포내 다량체화 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열, 하나 이상의 공자극 신호 전달 도메인(들)을 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열 및 선택적으로 CD3ζ 사슬의 일부를 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열을 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 예시적인 전이 유전자에서, 하나 이상의 공자극 신호 전달 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열은 막관통 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열과 존재할 경우 CD3ζ 사슬의 일부를 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열 또는 폴리뉴클레오타이드 내 예시적인 전이 유전자에 인접한 3’ 상동성 암 서열 사이에 위치한다. 일부 측면에서, 예시적인 전이 유전자에서, 세포내 다량체화 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열은 막관통 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열과 하나 이상의 공자극 신호 전달 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열 사이에; 또는 하나 이상의 공자극 신호 전달 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열과 존재할 경우 CD3ζ 사슬의 일부를 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열 또는 폴리뉴클레오타이드 내 예시적인 전이 유전자에 인접한 3’ 상동성 암 서열 사이에 위치한다.
일부 구현예에서, 예시적인 전이 유전자 서열은 5’에서 3’ 방향으로 각각 신호 펩타이드, 세포외 결합 도메인, 스페이서, 막관통 도메인 및 CD3ζ 사슬의 일부를 포함하는 세포내 영역을 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 예시적인 전이 유전자 서열은 5’에서 3’ 방향으로 각각 신호 펩타이드, 세포외 결합 도메인, 스페이서, 막관통 도메인 및 공자극 신호 전달 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 예시적인 전이 유전자 서열은 5’에서 3’ 방향으로 각각 신호 펩타이드, 세포외 결합 도메인, 스페이서, 막관통 도메인 및 2개의 공자극 신호 전달 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 예시적인 전이 유전자 서열은 5’에서 3’ 방향으로 각각 신호 펩타이드, 세포외 결합 도메인, 스페이서, 막관통 도메인 및 3개의 공자극 신호 전달 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 예시적인 전이 유전자 서열은 5’에서 3’ 방향으로 각각 신호 펩타이드, 세포외 결합 도메인, 스페이서, 막관통 도메인 및 공자극 신호 전달 도메인과 CD3ζ 사슬의 일부를 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 예시적인 전이 유전자 서열은 5’에서 3’ 방향으로 각각 신호 펩타이드, 세포외 결합 도메인, 스페이서, 막관통 도메인 및 2개의 공자극 신호 전달 도메인과 CD3ζ 사슬의 일부를 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 예시적인 전이 유전자 서열은 5’에서 3’ 방향으로 각각 신호 펩타이드, 세포외 결합 도메인, 스페이서, 막관통 도메인 및 3개의 공자극 신호 전달 도메인과 CD3ζ 사슬의 일부를 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 예시적인 전이 유전자 서열은 5’에서 3’ 방향으로 각각 막관통 도메인(또는 막 회합 도메인), 세포내 다량체화 도메인, 선택적으로 하나 이상의 공자극 신호 전달 도메인(들), 및 선택적으로 CD3ζ 사슬의 일부를 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 예시적인 전이 유전자 서열은 5’에서 3’ 방향으로 각각 세포외 다량체화 도메인, 막관통 도메인, 선택적으로 하나 이상의 공자극 신호 전달 도메인(들), 및 선택적으로 CD3ζ 사슬의 일부를 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 예시적인 전이 유전자 서열은 또한 다중 시스트론 요소(예를 들어, 2A 요소 또는 내부 리보솜 유입점(IRES)), 및/또는 조절 또는 제어 요소(예를 들어, 신호 펩타이드 및/또는 세포외 영역을 암호화하는 서열의 5’에 위치한 프로모터)를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 예시적인 전이 유전자 서열은 또한 추가 서열, 예를 들어 표지자, 추가 키메라 수용체, 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 면역 조절 분자, 리간드, 사이토카인 또는 케모카인과 같은 하나 이상의 추가 분자를 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열을 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 하나 이상의 다른 분자를 암호화하는 서열 및 키메라 수용체의 영역 또는 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열은 2A 리보솜 스키핑 요소 및/또는 프로모터 서열과 같은 조절 서열에 의해 분리된다. 일부 측면에서, 예시적인 전이 유전자에서, 하나 이상의 추가 분자를 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열은 신호 펩타이드 및/또는 세포외 영역을 암호화하는 서열의 5’에 위치한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 추가 분자를 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열은 다중 시스트론 요소 및/또는 조절 또는 제어 요소와 키메라 수용체의 영역 또는 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열 사이에 위치한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 추가 분자를 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열은 2개의 요소 및/또는 조절 또는 제어 요소들 사이에 위치한다. 일부 구현예에서, 예시적인 전이 유전자 서열은 5’에서 3’ 방향으로: 다중 시스트론 요소 및/또는 조절 요소, 추가 분자를 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열, 다중 시스트론 요소 및/또는 조절 요소, 신호 펩타이드, 키메라 수용체의 영역 또는 도메인(예를 들어, 세포외 영역, 막관통 도메인, 세포내 영역)을 암호화하는 핵산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 전이 유전자 서열은 순서대로: 세포외 결합 도메인, 선택적으로 scFv; 선택적으로 인간 면역글로불린 힌지의, 선택적으로 IgG1, IgG2 또는 IgG4 또는 이의 변형된 버전의 서열을 포함하고, 선택적으로 CH2 영역 및/또는 CH3 영역을 더 포함하는, 스페이서; 선택적으로 인간 CD28의, 막관통 도메인; 선택적으로 인간 4-1BB의, 공자극 신호 전달 도메인을 포함하는 세포내 영역; 및 선택적으로 CD3제타 신호 전달 도메인의 일부;를 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 키메라 수용체의 암호화된 세포내 영역은 N 말단에서 C 말단까지 순서대로: 하나 이상의 공자극 신호 전달 도메인(들) 및 CD3제타 사슬 또는 이의 단편을 포함한다.
b. 상동성 암
일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오타이드는 5’ 및/또는 3’ 말단에, 키메라 수용체 또는 이의 일부의 하나 이상의 사슬을 암호화하는 전이 유전자 서열에 연결된, 그 옆의 또는 그 주변의 하나 이상의 상동성 서열(“상동성 암”으로도 불림)을 함유한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 상동성 암은 5’ 및/또는 3’ 상동성 암을 포함한다. 상동성 암은 DNA 수선 메커니즘, 예를 들어 상동 재조합 기구가 상동성을 인식하고 주형 폴리뉴클레오타이드를 수선을 위한 주형으로 사용하도록 해주고, 상동성 암들 사이의 핵산 서열이 수선하는 DNA 내로 복제되고, 상동성 위치 사이의 게놈에서 통합 표적 부위 내로 전이 유전자 서열을 효과적으로 삽입 또는 통합하게 해준다.
일부 측면에서, 전이 유전자 서열의 통합 시, 전이 유전자 서열은 하나 이상의 상동성 암(들)에 포함된 CD247 유전자 자리의 개방형 해독틀의 하나 이상의 엑손과 틀 내에 있는 뉴클레오타이드의 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 키메라 수용체의 일부는 전이 유전자 서열에 의해 암호화되고, 키메라 수용체의 나머지 부분, 예를 들어 CD3ζ 신호 전달 도메인의 일부 또는 CD3ζ 신호 전달의 전체는 내인성 CD247 유전자 자리의 하나 이상의 엑손에 의해 암호화된다.
일부 구현예에서, 상동성 암 서열은 유전자 파괴, 예를 들어 CD247 유전자 자리 내 표적 부위 주변의 게놈 서열에 상동성인 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오타이드는 다음 성분들: [5’ 상동성 암]-[전이 유전자 서열(예를 들어, 키메라 수용체의 하나 이상의 사슬을 암호화하는 외인성 또는 이종성 핵산 서열)]-[3’ 상동성 암]을 포함한다. 일부 구현예에서, 5’ 상동성 암 서열은 5’측의 유전자 파괴 근처에 위치한 서열에 상동성인 인접 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 3’ 상동성 암 서열은 3’측의 유전자 파괴 근처에 위치한 서열에 상동성인 인접 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 표적 부위는 유전자 파괴를 도입할 수 있는 하나 이상의 제제(들), 예를 들어 CD247 유전자 자리 내 특정 부위를 표적화하는 Cas9 및 gRNA의 표적화에 의해 결정된다.
일부 측면에서, 주형 폴리뉴클레오타이드 내의 전이 유전자 서열은 표적 부위 및/또는 상동성 암의 위치를 가이드하는 데 사용될 수 있다. 일부 측면에서, 유전자 파괴의 표적 부위는 HDR에 사용될 주형 폴리뉴클레오타이드 및/또는 상동성 암을 설계하기 위한 가이드로 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 유전자 파괴는 전이 유전자 서열의 표적화된 통합의 원하는 부위 근처로 표적화할 수 있다. 일부 측면에서, 상동성 암은 내인성 CD247 유전자 자리의 개방형 해독틀의 엑손 내 통합을 표적화하도록 설계되고, 상동성 암 서열은 유전자 파괴 주변의 엑손 및 인트론 서열을 포함하여 유전자 파괴 주변의 원하는 통합 위치에 기초하여 결정된다. 일부 구현예에서, 표적 부위의 위치, 하나 이상의 상동성 암(들)의 상대적 위치, 및 삽입을 위한 전이 유전자(외인성 핵산 서열)는 효율적인 표적화를 위한 요구 사항 및 사용될 수 있는 주형 폴리뉴클레오타이드 또는 벡터의 길이에 따라 설계될 수 있다. 일부 측면에서, 상동성 암은 내인성 CD247 유전자 자리의 개방형 해독틀의 인트론 내 통합을 표적화하도록 설계된다. 일부 측면에서, 상동성 암은 내인성 CD247 유전자 자리의 개방형 해독틀의 엑손 내 통합을 표적화하도록 설계된다.
일부 측면에서, CD247 유전자 자리 내 표적 통합 부위(표적화 통합을 위한 부위)는 CD3ζ 사슬을 암호화하는 내인성 CD247 유전자 자리의 개방형 해독틀 내에 위치한다. 일부 구현예에서, 표적 통합 부위는 본원의 예를 들어 섹션 I.A에 기술된 임의의 표적 부위에 또는 그 근처에 있다. 일부 측면에서, 통합을 위한 표적 위치는 유전자 파괴를 위한 표적 부위에 또는 그 주변에, 예를 들어 유전자 파괴를 위한 표적 부위의 500, 450, 400, 350, 300, 250, 200, 150, 100 또는 50bp 미만 이내에 있다.
일부 측면에서, 표적 통합 부위는 내인성 CD247 유전자 자리의 개방형 해독틀의 엑손 내에 있다. 일부 측면에서, 표적 통합 부위는 내인성 CD247 유전자 자리의 개방형 해독틀의 인트론 내에 있다. 일부 측면에서, 표적 통합 부위는 CD247 유전자 자리의 조절 또는 제어 요소, 예를 들어, 프로모터 내에 있다. 일부 구현예에서, 표적 통합 부위는 초기 코딩 영역에 해당하는 엑손, 예를 들어, 내인성 CD247 유전자 자리의 개방형 해독틀의 엑손 1, 2, 또는 3 내에 또는 가까이 근접하여, 또는 전사 시작 부위 바로 다음의 서열을 포함하여 엑손 1, 2, 또는 3(예컨대, 본원의 표 1에 기술됨) 내에 또는 엑손 1, 2, 또는 3의 500, 450, 400, 350, 300, 250, 200, 150, 100 또는 50bp 미만 이내에 있다. 일부 구현예에서, 통합은 내인성 CD247 유전자 자리의 엑손 2에 또는 그 근처에, 또는 엑손 2의 500, 450, 400, 350, 300, 250, 200, 150, 100 또는 50bp 미만 이내에 표적화된다. 일부 측면에서, 표적 통합 부위는 내인성 CD247 유전자 자리의 엑손 1에 또는 그 근처에, 예를 들어, 엑손 1의 500, 450, 400, 350, 300, 250, 200, 150, 100 또는 50bp 미만 이내에 있다. 일부 구현예에서, 표적 통합 부위는 내인성 CD247 유전자 자리의 엑손 2에 또는 그 근처에, 또는 엑손 2의 500, 450, 400, 350, 300, 250, 200, 150, 100 또는 50bp 미만 이내에 있다. 일부 측면에서, 표적 통합 부위는 내인성 CD247 유전자 자리의 엑손 3에 또는 그 근처에, 예를 들어, 엑손 3의 500, 450, 400, 350, 300, 250, 200, 150, 100 또는 50bp 미만 이내에 있다.
일부 구현예에서, 5’ 상동성 암 서열은 내인성 CD247 유전자 자리의 표적 부위 근처를 시작으로, 유전자 파괴를 위한 표적 부위의 5’에 대략 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 3000, 4000, 또는 5000개 염기쌍의 인접 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 3’ 상동성 암 서열은 내인성 CD247 유전자 자리의 표적 부위 근처를 시작으로, 유전자 파괴를 위한 표적 부위의 3’에 대략 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 3000, 4000, 또는 5000개 염기쌍의 인접 서열을 포함한다. 따라서, HDR을 통한 통합 시, 전이 유전자 서열은 유전자 파괴를 위한 표적 부위, 예를 들어 내인성 CD247 유전자 자리의 엑손 또는 인트론 내 표적 부위에 또는 그 근처에 통합을 위해 표적화된다.
일부 측면에서, 상동성 암은 내인성CD247 유전자 자리의 개방형 해독틀 서열의 일부에 상동성인 서열을 함유한다. 일부 측면에서, 상동성 암 서열은 내인성CD247 유전자 자리의 엑손 및 인트론을 포함하여 개방형 해독틀 서열의 인접 부분에 상동성인 서열을 함유한다. 일부 측면에서, 상동성 암은 내인성CD247 유전자 자리의 엑손 및 인트론을 포함하여 개방형 해독틀 서열의 인접 부분과 동일한 서열을 함유한다.
일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오타이드는 내인성 CD247 유전자 자리의 전이 유전자 서열의 통합을 표적화하기 위한 상동성 암(본원의 표 1에 기술된 예시적인 게놈 유전자 자리; 서열 번호: 74, NCBI 기준 서열: NM_198053.2 및 서열 번호: 76, NCBI 기준 서열: NM_000734.3에 제시된 예시적인 mRNA 서열)을 함유한다. 일부 구현예에서, 유전자 파괴는 유전자 파괴를 위한 임의의 제제, 예를 들어 본원에 기술된 표적화된 뉴클레아제 및/또는 gRNA를 사용하여 도입된다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오타이드는 표적화된 뉴클레아제 및/또는 gRNA에 의해 도입된 유전자 파괴의 양쪽에 약 500 내지 1000개, 예를 들어 500 내지 900개 또는 600 내지 700개의 상동성 염기쌍을 포함한다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오타이드는 CD247 유전자 자리의 유전자 파괴의 5’에 있는 서열의 500, 600, 700, 800, 900 또는 1000개 염기쌍에 상동성인 5’ 상동성 암 서열의 약 500, 600, 700, 800, 900 또는 1000개 염기쌍, 전이 유전자, 및 CD247 유전자 자리의 유전자 파괴의 3’에 있는 서열의 500, 600, 700, 800, 900 또는 1000개 염기쌍에 상동성인 3’ 상동성 암 서열의 약 500, 600, 700, 800, 900 또는 1000개 염기쌍을 포함한다.
일부 측면에서, 전이 유전자와 하나 이상의 상동성 암 서열 사이의 경계는, HDR 및 전이 유전자 서열의 표적화된 통합 시 하나 이상의 폴리펩타이드, 예를 들어 키메라 수용체의 사슬(들), 도메인(들) 또는 영역(들)을 암호화하는 전이 유전자 내 서열이 내인성 CD247 유전자 자리의 개방형 해독틀 서열의 하나 이상의 엑손과 틀 내 통합되고/거나 폴리펩타이드 및 내인성 CD247 유전자 자리의 개방형 해독틀 서열의 하나 이상의 엑손을 암호화하는 전이 유전자의 틀 내 융합물을 생성하도록, 설계된다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 상동성 암 서열은 내인성 CD247 유전자 자리의 개방형 해독틀 서열 내에 있는 표적 부위를 둘러싼 또는 그 옆에 있는 서열에 상동성인, 실질적으로 동일한 또는 동일한 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 상동성 암(들)은 CD247 유전자 자리의 개방형 해독틀의 적어도 하나의 인트론 및 적어도 하나의 엑손을 포함한다. 일부 측면에서, 하나 이상의 상동성 암 서열은 내인성CD247 유전자 자리의 개방형 해독틀의 부분 서열의 인트론 및 엑손을 함유한다. 일부 측면에서, 5’ 상동성 암 서열 및 전이 유전자의 경계는, 이종성 프로모터를 함유하지 않는 전이 유전자의 경우 전이 유전자 서열의 코딩 부분이 표적화된 통합의 위치에 따라서 내인성 CD247 유전자 자리의 개방형 해독틀의 상단부 엑손 또는 이의 일부, 예를 들어 엑손 1, 2 또는 3과 틀 내 융합되도록, 된다. 일부 측면에서, 3’ 상동성 암 서열 및 전이 유전자의 경계는, 내인성 CD247 유전자 자리의 개방형 해독틀의 하단부 엑손들 또는 이의 일부, 예를 들어 엑손 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8이 전이 유전자 서열의 코딩 부분들과 틀 내 융합되도록, 된다. 따라서, 표적화된 통합, 전사 및 번역 시, 인접 폴리펩타이드인 암호화된 키메라 수용체가 전이 유전자의 융합 DNA 서열과 내인성 CD247 유전자 자리의 개방형 해독틀 서열로부터 생성된다. 일부 측면에서, 융합 DNA 서열에 의해 생성된 암호화된 키메라 수용체의 일부는 CD3ζ 사슬 또는 이의 단편이다. 일부 측면에서, 암호화된 키메라 수용체는 CD3ζ 사슬 또는 이의 일부를 통해 신호 전달을 할 수 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 상동성 암(들)은 CD247 유전자 자리의 개방형 해독틀의 엑손 1의 전장(full length)을 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오타이드 내 하나 이상의 상동성 암(들)은 엑손 1을 포함하지 않고/거나 CD247 유전자 자리의 개방형 해독틀의 엑손 2의 전장(full length)을 포함하지 않는다.
일부 구현예에서, 내인성 CD247 유전자 자리에서 표적화 통합을 위한 예시적인 5’ 상동성 암은 서열 번호: 80에 제시된 서열 또는 서열 번호: 80에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 동일성을 나타내는 서열 또는 이의 부분 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 5’ 상동성 암은 서열 번호: 80에 제시된 서열을 포함하다. 일부 구현예에서, 5’ 상동성 암은 서열 번호: 80에 제시된 서열로 구성되거나 이를 필수적으로 포함하여 구성된다.
일부 구현예에서, 내인성 CD247 유전자 자리에서 표적화 통합을 위한 예시적인 3’ 상동성 암은 서열 번호: 81에 제시된 서열 또는 서열 번호: 81에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 동일성을 나타내는 서열 또는 이의 부분 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 3’ 상동성 암은 서열 번호: 81에 제시된 서열을 포함하다. 일부 구현예에서, 3’ 상동성 암은 서열 번호: 81에 제시된 서열로 구성되거나 이를 필수적으로 포함하여 구성된다.
일부 측면에서, 표적 부위는 상동성 암의 상대적 위치 및 서열을 결정할 수 있다. 상동성 암은 일반적으로, 예를 들어 절제된 단일 가닥 돌출부가 주형 폴리뉴클레오타이드 내에서 상보적 영역을 찾을 수 있도록, 유전자 파괴, 예를 들어 DSB가 도입된 후 DNA 수선 메커니즘에 의한 말단 절제가 발생할 수 있는 영역만큼 확장될 수 있다. 전체 길이는 플라스미드 크기, 바이러스 패키징 한계 또는 작제물 크기 한계와 같은 매개변수에 의해 제한될 수 있다.
일부 구현예에서, 상동성 암은 내인성 유전자의 표적 부위의 양쪽에 (약) 500 내지 1000개, 예를 들어 600 내지 900개 또는 700 내지 800개의 상동성 염기쌍을 포함한다. 일부 구현예에서, 상동성 암은 CD247 유전자 자리의 표적 부위의 상동성 5’에, 표적 부위의 3’에, 또는 표적 부위의 5’ 및 3’ 둘 모두에 적어도 (약) 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 또는 1000개 염기쌍 또는 그 미만을 포함한다.
일부 구현예에서, 상동성 암은 CD247 유전자 자리의 표적 부위의 상동성 3’에 (약) 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 3000, 4000, 또는 5000개 염기쌍을 포함한다. 일부 구현예에서, 상동성 암은 CD247 유전자 자리의 전이 유전자 및/또는 표적 부위의 상동성 3’에 (약) 100 내지 500, 200 내지 400 또는 250 내지 350개 염기쌍을 포함한다. 일부 구현예에서, 상동성 암은 CD247 유전자 자리의 표적 부위의 상동성 5’에 약 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 15, 또는 10개 염기쌍 미만을 포함한다.
일부 구현예에서, 상동성 암은 CD247 유전자 자리의 표적 부위의 상동성 5’에 (약) 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 3000, 4000, 또는 5000개 염기쌍을 포함한다. 일부 구현예에서, 상동성 암은 CD247 유전자 자리의 전이 유전자 및/또는 표적 부위의 상동성 5’에 (약) 100 내지 500, 200 내지 400 또는 250 내지 350개 염기쌍을 포함한다. 일부 구현예에서, 상동성 암은 CD247 유전자 자리의 표적 부위의 상동성 3’에 약 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 15, 또는 10개 염기쌍 미만을 포함한다.
일부 구현예에서, 5’ 상동성 암의 3’ 말단은 전이 유전자의 5’ 말단 옆의 위치이다. 일부 구현예에서, 5’ 상동성 암은 전이 유전자의 5’ 말단으로부터 5’에 적어도 (약) 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 3000, 4000, 또는 5000개 뉴클레오타이드 이상 연장될 수 있다.
일부 구현예에서, 3’ 상동성 암의 5’ 말단은 전이 유전자의 3’ 말단 옆의 위치이다. 일부 구현예에서, 3’ 상동성 암은 전이 유전자의 3’ 말단으로부터 3’에 적어도 (약) 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 3000, 4000, 또는 5000개 뉴클레오타이드 이상 연장될 수 있다.
일부 구현예에서, 표적화된 삽입을 위해, 상동성 암, 예를 들어 5’ 및 3’ 상동성 암은 각각 가장 원위 표적 부위 옆에 있는 서열의 약 1000개 염기쌍(bp)(예를 들어, 돌연변이의 양쪽의 서열의 1000개 bp)을 포함할 수 있다.
예시적인 상동성 암 길이는 적어도 (약) 50, 100, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 750, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 또는 5000개 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 상동성 암 길이는 (약) 50-100, 100-250, 250-500, 500-750, 750-1000, 1000-2000, 2000-3000, 3000-4000, 또는 4000-5000개 뉴클레오타이드이다. 예시적인 상동성 암 길이는 (약) 50, 100, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 750, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 또는 5000개 뉴클레오타이드이거나 그 미만을 포함한다. 일부 구현예에서, 상동성 암 길이는 (약) 50-100, 100-250, 250-500, 500-750, 750-1000, 1000-2000, 2000-3000, 3000-4000, 또는 4000-5000개 뉴클레오타이드이다. 예시적인 상동성 암 길이는 (약) 100 내지 (약) 1000개 뉴클레오타이드, (약) 100 내지 (약) 750개 뉴클레오타이드, (약) 100 내지 (약) 600개 뉴클레오타이드, (약) 100 내지 (약) 400개 뉴클레오타이드, (약) 100 내지 (약) 300개 뉴클레오타이드, (약) 100 내지 (약) 200개 뉴클레오타이드, (약) 200 내지 (약) 1000개 뉴클레오타이드, (약) 200 내지 (약) 750개 뉴클레오타이드, (약) 200 내지 (약) 600개 뉴클레오타이드, (약) 200 내지 (약) 400개 뉴클레오타이드, (약) 200 내지 (약) 300개 뉴클레오타이드, (약) 300 내지 (약) 1000개 뉴클레오타이드, (약) 300 내지 (약) 750개 뉴클레오타이드, (약) 300 내지 (약) 600개 뉴클레오타이드, (약) 300 내지 (약) 400개 뉴클레오타이드, (약) 400 내지 (약) 1000개 뉴클레오타이드, (약) 400 내지 (약) 750개 뉴클레오타이드, (약) 400 내지 (약) 600개 뉴클레오타이드, (약) 600 내지 (약) 1000개 뉴클레오타이드, (약) 600 내지 (약) 750개 뉴클레오타이드 또는 750 내지 (약) 1000개 뉴클레오타이드를 포함한다.
상기 임의의 구현예 중 일부에서, 전이 유전자는 다수의 T 세포 각각으로 도입된 주형 폴리뉴클레오타이드에 의해 통합된다. 구체적인 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오타이드는 [5’ 상동성 암]-[전이 유전자]-[3’ 상동성 암] 구조를 포함한다. 특정 구현예에서, 5’ 상동성 암 및 3’ 상동성 암은 적어도 (약) 하나 이상의 표적 부위 주변의 핵산 서열에 상동성인 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 5’ 상동성 암은 표적 부위의 5’ 핵산 서열에 상동성인 핵산 서열을 포함한다. 구체적인 구현예에서, 3’ 상동성 암은 표적 부위의 3’ 핵산 서열에 상동성인 핵산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 5’ 상동성 암 및 3’ 상동성 암은 독립적으로 적어도 (약) 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500 또는 2000개 뉴클레오타이드 이상 또는 (약) 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500 또는 2000개 뉴클레오타이드 미만이다. 일부 구현예에서, 5’ 상동성 암 및 3’ 상동성 암은 독립적으로 (약) 50 내지 (약) 100, 100 내지 (약) 250, 250 내지 (약) 500, 500 내지 (약) 750, 750 내지 (약) 1000, 1000 내지 (약) 2000개 뉴클레오타이드이다. 상기 임의의 구현예 중 일부에서, 5’ 상동성 암 및 3’ 상동성 암은 독립적으로 (약) 50 내지 (약) 100개 뉴클레오타이드 길이, (약) 100 내지 (약) 250개 뉴클레오타이드 길이, (약) 250 내지 (약) 500개 뉴클레오타이드 길이, (약) 500 내지 (약) 750개 뉴클레오타이드 길이, (약) 750 내지 (약) 1000개 뉴클레오타이드 길이 또는 (약) 1000 내지 (약) 2000개 뉴클레오타이드 길이이다.
구체적인 구현예에서, 5’ 상동성 암 및 3’ 상동성암은 독립적으로 (약) 100 내지 (약) 1000개 뉴클레오타이드, (약) 100 내지 (약) 750개 뉴클레오타이드, (약) 100 내지 (약) 600개 뉴클레오타이드, (약) 100 내지 (약) 400개 뉴클레오타이드, (약) 100 내지 (약) 300개 뉴클레오타이드, (약) 100 내지 (약) 200개 뉴클레오타이드, (약) 200 내지 (약) 1000개 뉴클레오타이드, (약) 200 내지 (약) 750개 뉴클레오타이드, (약) 200 내지 (약) 600개 뉴클레오타이드, (약) 200 내지 (약) 400개 뉴클레오타이드, (약) 200 내지 (약) 300개 뉴클레오타이드, (약) 300 내지 (약) 1000개 뉴클레오타이드, (약) 300 내지 (약) 750개 뉴클레오타이드, (약) 300 내지 (약) 600개 뉴클레오타이드, (약) 300 내지 (약) 400개 뉴클레오타이드, (약) 400 내지 (약) 1000개 뉴클레오타이드, (약) 400 내지 (약) 750개 뉴클레오타이드, (약) 400 내지 (약) 600개 뉴클레오타이드, (약) 600 내지 (약) 1000개 뉴클레오타이드, (약) 600 내지 (약) 750개 뉴클레오타이드 또는 (약) 750 내지 (약) 1000개 뉴클레오타이드이다. 구체적인 구현예에서, 5’ 상동성 암 및 3’ 상동성암은 독립적으로 (약) 100 내지 (약) 1000개 뉴클레오타이드, (약) 100 내지 (약) 750개 뉴클레오타이드, (약) 100 내지 (약) 600개 뉴클레오타이드, (약) 100 내지 (약) 400개 뉴클레오타이드, (약) 100 내지 (약) 300개 뉴클레오타이드, (약) 100 내지 (약) 200개 뉴클레오타이드, (약) 200 내지 (약) 1000개 뉴클레오타이드, (약) 200 내지 (약) 750개 뉴클레오타이드, (약) 200 내지 (약) 600개 뉴클레오타이드, (약) 200 내지 (약) 400개 뉴클레오타이드, (약) 200 내지 (약) 300개 뉴클레오타이드, (약) 300 내지 (약) 1000개 뉴클레오타이드, (약) 300 내지 (약) 750개 뉴클레오타이드, (약) 300 내지 (약) 600개 뉴클레오타이드, (약) 300 내지 (약) 400개 뉴클레오타이드, (약) 400 내지 (약) 1000개 뉴클레오타이드, (약) 400 내지 (약) 750개 뉴클레오타이드, (약) 400 내지 (약) 600개 뉴클레오타이드, (약) 600 내지 (약) 1000개 뉴클레오타이드, (약) 600 내지 (약) 750개 뉴클레오타이드 또는 (약) 750 내지 (약) 1000개 뉴클레오타이드 길이이다. 일부 구현예에서, 5’ 상동성 암 및 3’ 상동성 암은 독립적으로 (약) 200, 300, 400, 500, 600, 700 또는 800개 뉴클레오타이드 길이이거나, 또는 전술한 임의의 수치 사이의 임의의 수치 길이이다. 일부 구현예에서, 5’ 상동성 암 및 3’ 상동성 암은 독립적으로 (약) 300개 뉴클레오타이드 길이를 초과하고, 선택적으로 여기서 5’ 상동성 암 및 3’ 상동성 암은 독립적으로 (약) 400, 500 또는 600개 뉴클레오타이드 길이이거나 또는 전술한 임의의 수치 사이의 임의의 수치 길이이다. 일부 구현예에서, 5’ 상동성 암 및 3’ 상동성 암은 독립적으로 (약) 300개 뉴클레오타이드 길이를 초과한다.
일부 구현예에서, 상동성 암들 중 하나 이상은 CD3ζ 사슬 또는 이의 단편을 암호화하는 서열에 상동성인 뉴클레오타이드의 서열을 함유한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 상동성 암은 키메라 수용체 또는 이의 일부를 암호화하는 전이 유전자 서열과 틀 내에서 연결 또는 연계된다. 따라서, 일부 구현예에서, 상동성 암들 중 하나 이상과 전이 유전자는 함께 CD3ζ 사슬 또는 전이 유전자 단독에 의해 암호화된 CD3ζ 사슬의 일부보다 큰 이의 단편을 암호화한다. 일부 구현예에서, 상동성 암들 중 하나 이상과 전이 유전자의 조합이 CD247인 CD3ζ 사슬을 암호화하는 내인성 유전자, 유전자 자리 또는 개방형 해독틀의 전(full) 엑손에 상동성인 서열을 함께 함유한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 상동성 암은 CD247인 CD3ζ 사슬을 암호화하는 내인성 유전자, 유전자 자리 또는 개방형 해독틀의 인트론의 전부 또는 일부에 상동성인 뉴클레오타이드의 서열을 함유한다.
일부 구현예에서, 대안적 HDR이 사용된다. 일부 구현예에서, 대안적 HDR은 주형 폴리뉴클레오타이드가 상동성을 5’에서 표적 부위로(즉, 표적 부위 가닥의 5’ 방향으로) 확장할 때 더 효율적으로 진행된다. 따라서, 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오타이드는 더 긴 상동성 암과 더 짧은 상동성 암을 가지며, 더 긴 상동성 암은 표적 부위의 5’에서 어닐링할 수 있다. 일부 구현예에서, 5’를 표적 부위로 어닐링할 수 있는 암은 전이 유전자의 표적 부위 또는 5’ 또는 3’ 말단으로부터 적어도 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 3000, 4000, 또는 5000개 이상 뉴클레오타이드이다. 일부 구현예에서, 5’를 표적 부위로 어닐링할 수 있는 암은 3’에서 표적 부위로 어닐링할 수 있는 암보다 적어도 10%, 20%, 30%, 40% 또는 50% 이상 더 길다. 일부 구현예에서, 5’를 표적 부위로 어닐링할 수 있는 암은 3’를 표적 부위로 어닐링할 수 있는 암보다 적어도 2x, 3x, 4x 또는 5x 이상 더 길다. ssDNA 주형이 온전한 가닥 또는 표적화된 가닥에 어닐링할 수 있는지 여부에 따라, 5’를 표적 부위로 어닐링하는 상동성 암은 각각 ssDNA 주형의 5’ 말단 또는 ssDNA 주형의 3’ 말단에 있을 수 있다.
유사하게, 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오타이드는 5’ 상동성 암, 전이 유전자, 및 3’ 상동성 암을 가지며, 이로써 주형 폴리뉴클레오타이드는 표적 부위의 5’에 대해 연장된 상동성을 함유한다. 예를 들어, 5’ 상동성 암 및 3’ 상동성 암은 실질적으로 동일한 길이일 수 있지만, 전이 유전자는 표적 부위의 3’보다 표적 부위의 5’를 더 길게 연장할 수 있다. 일부 구현예에서, 상동성 암은 표적 부의의 3’ 말단보다 표적 부위의 5’ 말단으로 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 2x, 3x, 4x, 또는 5x 이상 더 연장된다.
일부 구현예에서, 대안적 HDR은 주형 폴리뉴클레오타이드가 표적 부위의 중심에 있을 때 더 효율적으로 진행된다. 따라서, 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오타이드는 본질적으로 동일한 크기인 2개의 상동성 암을 갖는다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오타이드의 제1 상동성 암(예를 들어, 5’ 상동성 암)은 주형 폴리뉴클레오타이드의 제2 상동성 암(예를 들어, 3’ 상동성 암)의 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 또는 1% 이내 길이를 가질 수 있다.
유사하게, 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오타이드는 5’ 상동성 암, 전이 유전자, 및 3’ 상동성 암을 가지며, 이로써 주형 폴리뉴클레오타이드는 표적 부위의 양쪽에서 실질적으로 동일한 거리로 연장된다. 예를 들어, 상동성 암은 상이한 길이를 가질 수 있지만, 전이 유전자는 이를 보상하도록 선택될 수 있다. 예를 들어, 전이 유전자는 표적 부위의 3’보다 표적부위로부터 5’를 더 연장할 수 있지만, 표적 부위의 상동성 암 5’는 이를 보상하기 위해 표적 부위의 상동성 암 3’보다 더 짧다. 그 반대의 경우도 가능한데, 예를 들어, 전이 유전자는 표적 부위의 5’에서보다 표적부위로부터 3’를 더 연장할 수 있지만, 표적 부위의 상동성 암 3’는 이를 보상하기 위해 표적 부위의 상동성 암 5’보다 더 짧다.
일부 구현예에서, 전이 유전자 서열 및 하나 이상의 상동성 암을 포함하여 주형 폴리뉴클레오타이드의 길이는 (약) 1000 내지 약 20,000개 염기쌍, 예컨대 약 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10000, 11000, 12000, 13000, 14000, 15000, 16000, 17000, 18000, 19000 또는 20000개 염기쌍이다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오타이드의 길이는 제조, 합성 또는 조립 및/또는 세포 내로 도입될 수 있는 폴리뉴클레오타이드의 최대 길이 또는 바이러스 벡터의 용량, 및 폴리뉴클레오타이드 또는 벡터의 유형에 의해 제한된다. 일부 측면에서, 주형 폴리뉴클레오타이드의 제한된 용량은 전이 유전자 서열 및/또는 하나 이상의 상동성 암의 길이를 결정할 수 있다. 일부 측면에서, 전이 유전자 서열 및 하나 이상의 상동성 암의 조합된 총 길이는 폴리뉴클레오타이드 또는 벡터의 최대 길이 또는 용량 내에 있어야 한다. 예를 들어, 일부 측면에서, 주형 폴리뉴클레오타이드의 전이 유전자 부분은 약 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500 또는 4000개 염기쌍이고, 주형 폴리뉴클레오타이드의 최대 길이가 약 5000개 염기쌍인 경우, 서열의 나머지 부분은 예를 들어 3’ 또는 5’ 상동성 암이 대략 500, 750, 1000, 1250, 1500, 1750 또는 2000개의 염기쌍일 수 있도록 하나 이상의 상동성 암으로 분할될 수 있다.
일부 측면에서, 제공된 구현예는 기존 방법과 비교하여 조작을 위해 더 작거나 더 짧은 핵산 서열 단편의 사용을 허용한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 전이 유전자 서열은 키메라 수용체의 CD3ζ 또는 이의 일부의 일부를 암호화하거나 하나도 암호화하지 않는다. 키메라 수용체의 CD3ζ 또는 이의 일부를 암호화하기 위해 내인성 CD247 유전자의 개방형 해독틀 서열의 일부 또는 전부를 이용함으로써, 제공된 구현예는 더 작은 전이 유전자 서열의 사용을 허용한다. 일부 구현예에서, 키메라 수용체의 일부를 암호화하는 전이 유전자 서열은 내인성 CD247 개방형 해독틀의 엑손들 중 하나 이상과 틀 내에서 융합되고, 따라서 내인성 CD247 조절 요서의 제어 하에 위치할 수 있다. 따라서, 일부 경우에, 이종성 조절 또는 제어 요소는 필요하지 않으며, 발현을 위해 조절 또는 제어 요소가 필요한 기존 방법과 비교하여 전이 유전자 서열이 더 작을 수 있다. 일부 측면에서, 구현예는 더 작거나 더 짧은 전이 유전자 서열, 예를 들어 1차 신호 전달 영역, 예를 들어 CD3ζ 사슬 또는 이의 단편의 전체 길이를 포함하고/하거나 이종성 조절 요소를 포함하는 기존 방법에서 사용되는 전이 유전자 서열보다, 예를 들어 대략 100 내지 1000개 염기쌍이 더 작은, 예를 들어 약 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 또는 1000개 염기쌍이 더 작은 전이 유전자 서열의 사용을 허용한다. 따라서, 폴리뉴클레오타이드의 최대 길이가 제한된 경우에, 제공된 구현예는, 키메라 수용체의 일부를 암호화하는 전이 유전자 서열의 길이 요구 사항이 감소함에 따라, 더 큰 상동성 암의 수용을 가능하게 하고/거나 추가 분자를 암호화하는 핵산 서열의 수용을 가능하게 한다. 일부 측면에서, 핵산 서열, 예를 들어 전이 유전자 서열의 생성, 전달, 및/또는 상동 직접 수선(HDR)에 의한 표적화 효율은 다른 방법과 비교하여 촉진되거나 개선될 수 있다.
3. 주형 폴리뉴클레오타이드의 전달
일부 구현예에서, (예를 들어, 본원의 섹션 I.B.2에 기술된) 키메라 수용체 또는 이의 일부의 하나 이상의 서열을 암호화하는 전이 유전자 서열을 함유한 주형 폴리뉴클레오타이드와 같은 폴리뉴클레오타이드 뉴클레오타이드 형태로 예를 들어 폴리뉴클레오타이드 또는 벡터로서 세포 내로 도입된다. 구체적인 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드는 키메라 수용체의 일부 및 하나 이상의 상동성 암을 암호화하는 전이 유전자 서열을 함유하고, 전이 유전자 서열의 상동 직접 수선(HDR) 매개 통합을 위해 세포 내로 도입될 수 있다.
일부 측면에서, 제공된 구현예는 HDR 및 전이 유전자 서열의 표적화된 통합을 유도하기 위해 유전자 파괴를 유도할 수 있는 하나 이상의 제제(들) 또는 이의 성분 및 주형 폴리뉴클레오타이드의 도입에 의한 세포의 유전자 조작을 제공한다. 일부 측면에서, 하나 이상의 제제(들) 및 주형 폴리뉴클레오타이드는 동시에 전달된다. 일부 측면에서, 하나 이상의 제제(들) 및 주형 폴리뉴클레오타이드는 순차적으로 전달된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 제제(들)는 폴리뉴클레오타이드의 전달 전에 전달된다.
일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오타이드는 표적화된 유전자 파괴를 유도할 수 있는 제제(들), 예를 들어 뉴클레아제 및/또는 gRNA에 더하여 조작을 위해 세포 내로 도입된다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오타이드(들)는 표적화된 유전자 파괴를 유도할 수 있는 제제(들)의 하나 이상의 성분이 세포 내로 도입되기 전에, 도입과 동시에 또는 도입된 후에 전달될 수 있다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오타이드(들)는 제제들과 동시에 전달된다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오타이드는 제제보다 1 내지 60분(또는 이 사이 임의의 시간) 전, 제제보다 1 내지 24시간(또는 이 사이 임의의 시간) 전 또는 제제보다 24시간 초과 전을 포함하여(그러나 이에 제한되지 않음) 제제보다 전에, 예를 들어 주형 폴리뉴클레오타이드보다 수초 내지 수시간 내지 수일 전에 전달된다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오타이드는 제제의 전달 직후, 예를 들어 제제의 전달보다 30초 내지 4시간 후에, 예컨대 약 30초, 1분, 2분, 3분, 4분, 5분, 6분, 7분, 8분, 9분, 10분, 15분, 20분, 30분, 40분, 50분, 60분, 90분, 2시간, 3시간 또는 4시간 후에 및/또는 바람직하게는 제제의 전달 후 4시간 내를 포함하여, 제제보다 후에, 주형 폴리뉴클레오타이드보다 수초 내지 수시간 내지 수일 후에 전달된다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오타이드는 제제의 전달보다 4시간 초과 후에 전달된다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오타이드는 하나 이상의 제제의 도입 후 (약) 2 시간에 도입된다.
일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오타이드들은 표적화된 유전자 파괴를 유도할 수 있는 제제(들), 예를 들어 뉴클레아제 및/또는 gRNA로서 동일한 전달 시스템을 사용하여 전달될 수 있다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오타이드들은 표적화된 유전자 파괴를 유도할 수 있는 제제(들), 예를 들어 뉴클레아제 및/또는 gRNA로서 상이한 전달 시스템을 사용하여 전달될 수 있다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오타이드는 제제(들)와 동시에 전달된다. 다른 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오타이드는 제제(들)의 전달 전 또는 후에, 상이한 시간에 전달된다. 표적화된 유전자 파괴를 유도할 수 있는 제제(들), 예를 들어 뉴클레아제 및/또는 gRNA 내 핵산의 전달을 위해 본원의 섹션 I.A.3에(예를 들어, 표 3 및 4에) 기술된 임의의 전달 방법은 주형 폴리뉴클레오타이드를 전달하는 데 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 제제(들) 및 주형 폴리뉴클레오타이드는 동일한 형식 또는 방법으로 전달된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 하나 이상의 제제(들) 및 주형 폴리뉴클레오타이드는 모두 벡터, 예를 들어 바이러스 벡터에 포함된다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오타이드는 동일한 벡터 백본, 예를 들어 AAV 게놈, 플라스미드 DNA 상에서 Cas9 및 gRNA로서 암호화된다. 일부 측면에서, 하나 이상의 제제(들) 및 주형 폴리뉴클레오타이드는 상이한 형식, 예를 들어 Cas9-gRNA 제제에 대해서 리보핵산-단백질 복합체(RNP) 및 주형 폴리뉴클레오타이드에 대해서 선형 DNA이지만, 이들은 동일한 방법을 이용하여 전달된다.
일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오타이드는 선형 또는 환형 핵산 분자, 예컨대 선형 또는 환형 DNA 또는 선형 RNA이며, 핵산 분자를 세포 내로 전달하기 위한 본원의 섹션 I.A.3에 기술된(예를 들어, 본원의 표 3 및 4) 방법들 중 임의의 방법을 사용하여 전달될 수 있다.
구체적인 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드, 예를 들어 주형 폴리뉴클레오타이드는 뉴클레오타이드 형태로, 예를 들어, 비-바이러스 벡터로 또는 그 내에서 세포 내로 도입된다. 일부 구현예에서, 비-바이러스 벡터는 유전자 전달을 위한 임의의 적합한 및/또는 공지된 방법, 예컨대(그러나 이에 한정되지 않는) 미세주입, 전기 천공법, 일시적 세포 압축 또는 압착(예컨대 문헌[Lee, et al. (2012) Nano Lett 12: 6322-27]에 기술된 것), 지질 매개 형질주입, 펩타이드 매개 전달(예를 들어, 세포 관통 펩타이드) 또는 이들의 조합에 의해 형질도입 및/또는 형질주입을 위해 적합한 폴리뉴클레오타이드(예를 들어, DNA 또는 RNA 폴리뉴클레오타이드)이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 비-바이러스 폴리뉴클레오타이드는 본원에 기술된 비-바이러스 방법, 예컨대 본원의 표 4에 나열된 비-바이러스 방법에 의해 세포 내로 전달된다.
일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오타이드 서열은 게놈 DNA에서 관심 영역과 상동성이 아닌 서열을 함유하는 벡터 분자에 포함될 수 있다. 일부 구현예에서, 바이러스는 DNA 바이러스(예를 들어, dsDNA 또는 ssDNA 바이러스)이다. 일부 구현예에서, 바이러스는 RNA 바이러스(예를 들어, ssRNA 바이러스)이다. 예시적인 바이러스 벡터/바이러스에는 예를 들어, 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노 연관 바이러스(AAV), 우두바이러스, 수두바이러스, 및 단순헤르페스바이러스 또는 본원의 다른 곳에 기술된 임의의 바이러스가 포함된다. 폴리뉴클레오타이드는 예를 들어 복제 원점, 프로모터 및 항생제 내성을 암호화하는 유전자와 같은 추가 서열을 갖는 벡터 분자의 일부로서 세포 내로 도입될 수 있다. 더욱이, 주형 폴리뉴클레오타이드는 네이키드 핵산으로, 리포솜, 나노 입자 또는 폴록사머와 같은 물질과 복합된 핵산으로 도입될 수 있고, 또는 바이러스(예를 들어, 아데노바이러스, AAV, 헤르페스바이러스, 레트로바이러스, 렌티바이러스 및 인테그라제 결함 렌티바이러스(IDLV))에 의해 전달될 수 있다.
일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오타이드는 예를 들어, 시미안 바이러스 40(SV40), 아데노바이러스, 아데노 연관 바이러스(adeno-associated virus, AAV)로부터 유래된 벡터와 같은 재조합 감염성 바이러스 입자를 사용하여 세포 내로 전달될 수 있다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오타이드는 재조합 렌티바이러스 벡터 또는 레트로바이러스 벡터, 예컨대 감마-레트로바이러스 벡터(예를 들어 문헌[Koste et al. (2014) Gene Therapy 2014 Apr 3. doi: 10.1038/gt.2014.25; Carlens et al. (2000) Exp Hematol 28(10): 1137-46; Alonso-Camino et al. (2013) Mol Ther Nucl Acids 2, e93; Park et al., Trends Biotechnol. 2011 November 29(11): 550-557] 참조) 또는 HIV-1 유래 렌티바이러스 벡터를 사용하여 T 세포 내로 전달된다.
다른 측면에서, 주형 폴리뉴클레오타이드는 바이러스 및/또는 비-바이러스 유전자 전달 방법에 의해 전달된다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오타이드는 아데노 연관 바이러스(AAV)를 통해 세포 내로 전달된다. AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8 및 이들의 조합을 포함하여(그러나 이에 한정되지 않음) 임의의 AAV 벡터를 사용할 수 있다. 일부 예에서, AAV는 캡시드 혈청형과 비교하여 이종 혈청형인 LTR(예를 들어, AAV5, AAV6, 또는 AAV8 캡시드를 갖는 AAV2 ITR)을 포함한다. 주형 폴리뉴클레오타이드는 (동일한 벡터 상에서를 포함하여) 뉴클레아제를 전달하는 데 사용되는 것과 동일한 유전자 전달 시스템을 사용하여 전달될 수 있거나 또는 뉴클레아제에 사용되는 것과 상이한 전달 시스템을 사용하여 전달될 수 있다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오타이드는 바이러스 벡터(예를 들어, AAV)를 사용하여 전달되고 뉴클레아제(들)는 mRNA 형태로 전달된다. 세포는 또한 (예를 들어, 뉴클레아제(들) 및/또는 주형 폴리뉴클레오타이드를 운반하는) 바이러스 벡터의 전달 전, 전달과 동시에 및/또는 전달 후에 본원에 기술된 바와 같은 세포 표면 수용체에 대한 바이러스 벡터의 결합을 억제하는 하나 이상의 분자로 처리될 수 있다.
일부 구현예에서, 레트로바이러스 벡터는 긴 말단 반복 서열(long terminal repeat sequence, LTR), 예를 들어 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스(MoMLV), 골수증식 육종바이러스(myeloproliferative sarcoma virus, MPSV), 뮤린 배아 줄기 세포 바이러스(murine embryonic stem cell virus, MESV), 뮤린 줄기 세포 바이러스(murine stem cell virus, MSCV) 또는 비장 병소 형성 바이러스(spleen focus forming virus, SFFV)로부터 유래된 재조합 레트로바이러스 벡터를 갖는다. 대부분의 레트로바이러스 벡터는 뮤린 레트로바이러스로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 레트로바이러스는 임의의 조류 또는 포유류 세포 공급원으로부터 유래된 것을 포함한다. 레트로바이러스는 통상적으로 인간을 포함하여 몇몇 종의 숙주 세포를 감염시킬 수 있음을 의미하는, 암포트로픽(amphotropic)이다. 일 구현예에서, 발현될 유전자는 레트로바이러스의 gag(객), pol(폴) 및/또는 env(엔브) 서열을 대체한다. 다수의 예시적인 레트로바이러스 시스템이 문헌[예를 들어, 미국 특허 번호 5,219,740; 6,207,453; 5,219,740; Miller and Rosman (1989) BioTechniques 7:980-990; Miller, A. D. (1990) Human Gene Therapy 1:5-14; Scarpa et al. (1991) Virology 180:849-852; Burns et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:8033-8037; 및 Boris-Lawrie and Temin (1993) Cur. Opin. Genet. Develop. 3:102-109]에 기술되어 있다.
일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오타이드는 AAV 벡터 및 표적화된 유전자 파괴를 유도할 수 있는 제제(들), 예컨대 상이한 형태로 전달되는 뉴클레아제 및/또는 gRNA, 예컨대 뉴클레아제 및/또는 gRNA를 암호화하는 mRNA를 사용하여 전달된다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오타이드 및 뉴클레아제는 바이러스 벡터와 같은 동일한 유형의 방법을 사용하지만 별도의 벡터를 사용하여 전달된다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오타이드들은 뉴클레아제 및/또는 gRNA와 같은 유전자 파괴를 유도할 수 있는 제제로서 상이한 전달 시스템을 사용하여 전달될 수 있다. 절단을 위한 유형 또는 핵산 및 벡터는 본원의 섹션 III에 기술된 것들을 포함한다.
일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오타이드 및 뉴클레아제는 동일한 벡터, 예를 들어 AAV 벡터(예컨대, AAV6) 상에 있을 수 있다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오타이드는 AAV 벡터 및 표적화된 유전자 파괴를 유도할 수 있는 제제(들), 예컨대 상이한 형태로 전달되는 뉴클레아제 및/또는 gRNA, 예컨대 뉴클레아제 및/또는 gRNA를 암호화하는 mRNA를 사용하여 전달된다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오타이드 및 뉴클레아제는 바이러스 벡터와 같은 동일한 유형의 방법을 사용하지만 별도의 벡터를 사용하여 전달된다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오타이드들은 뉴클레아제 및/또는 gRNA와 같은 유전자 파괴를 유도할 수 있는 제제로서 상이한 전달 시스템을 사용하여 전달될 수 있다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오타이드는 gRNA 인식 서열이 옆에 있는 것과 같이 생체 내 벡터 백본으로부터 절제된다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오타이드는 Cas9 및 gRNA로서 별도의 폴리뉴클레오타이드 분자 상에 있다. 일부 구현예에서, Cas9 및 gRNA는 리보핵산단백질(RNP) 복합체의 형태로 도입되고, 주형 폴리뉴클레오타이드는 폴리뉴클레오타이드 분자로서 예컨대 벡터 또는 선형 DNA와 같은 선형 핵산 분자의 형태로 도입된다. 절단을 위한 유형 또는 핵산 및 벡터는 본원의 섹션 II에 기술된 것들을 포함한다.
일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오타이드는 아데노바이러스 벡터, 예를 들어 AAV 벡터, 예를 들어 AAV 캡시드에 패키징될 수 있게 하는 길이 및 서열의 ssDNA 분자이다. 벡터는 예를 들어 5kb 미만일 수 있고 캡시드 내로 패키징을 촉진하는 ITR 서열을 함유할 수 있다. 벡터는 통합-결핍일 수 있다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오타이드는 전이 유전자 및/또는 표적 부위의 양쪽에 상동성의 약 150 내지 1000개 염기쌍을 포함한다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오타이드는 표적 부위 또는 전이 유전자의 5’, 표적 부위 또는 전이 유전자의 3’, 또는 표적 부위 또는 전이 유전자의 5’ 및 3’ 둘 모두에 약 100, 150, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500 또는 2000개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오타이드는 표적 부위 또는 전이 유전자의 5’, 표적 부위 또는 전이 유전자의 3’, 또는 표적 부위 또는 전이 유전자의 5’ 및 3’ 둘 모두에 적어도 100, 150, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500 또는 2000개 이상의 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오타이드는 표적 부위 또는 전이 유전자의 5’, 표적 부위 또는 전이 유전자의 3’, 또는 표적 부위 또는 전이 유전자의 5’ 및 3’ 둘 모두에 최대 100, 150, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500 또는 2000개의 뉴클레오타이드를 포함한다.
일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오타이드는 렌티바이러스 벡터, 예를 들어 IDLV(통합 결핍 렌티바이러스)이다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오타이드는 전이 유전자 및/또는 표적 부위의 양쪽에 약 500 내지 1000개의 상동성 염기쌍을 포함한다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오타이드는 표적 부위 또는 전이 유전자의 5’, 표적 부위 또는 전이 유전자의 3’, 또는 표적 부위 또는 전이 유전자의 5’ 및 3’ 둘 모두에 약 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500 또는 2000개의 상동성 염기쌍을 포함한다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오타이드는 표적 부위 또는 전이 유전자의 5’, 표적 부위 또는 전이 유전자의 3’, 또는 표적 부위 또는 전이 유전자의 5’ 및 3’ 둘 모두에 적어도 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500 또는 2000개의 상동성 염기쌍을 포함한다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오타이드는 표적 부위 또는 전이 유전자의 5’, 표적 부위 또는 전이 유전자의 3’, 또는 표적 부위 또는 전이 유전자의 5’ 및 3’ 둘 모두에 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500 또는 2000개 이내의 상동성 염기쌍을 포함한다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오타이드는 Cas9가 주형 폴리뉴클레오타이드를 인식하고 절단하는 것을 방지하는 하나 이상의 돌연변이, 예를 들어 침묵 돌연변이를 포함한다. 주형 폴리뉴클레오타이드는 변경될 세포의 게놈 내 상응하는 서열 대비 예를 들어 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 또는 30개의 침묵 돌연변이를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오타이드는 변경될 세포의 게놈 내 상응하는 서열 대비 최대 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30 또는 50개의 침묵 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, cDNA는 Cas9가 주형 폴리뉴클레오타이드를 인식하고 절단하는 것을 방지하는 하나 이상의 돌연변이, 예를 들어 침묵 돌연변이를 포함한다. 주형 폴리뉴클레오타이드는 변경될 세포의 게놈 내 상응하는 서열 대비 예를 들어 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 또는 30개의 침묵 돌연변이를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오타이드는 변경될 세포의 게놈 내 상응하는 서열 대비 최대 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30 또는 50개의 침묵 돌연변이를 포함한다.
본원에 기술된 이중 가닥 주형 폴리뉴클레오타이드는 하나 이상의 비천연 염기 및/또는 백본을 포함할 수 있다. 구체적으로, 관심 영역에서 전사 휴면 상태를 달성하기 위해 본원에 기재된 방법을 사용하여 메틸화된 시토신을 갖는 주형 폴리뉴클레오타이드의 삽입이 수행될 수 있다.
II. 핵산, 벡터 및 전달
일부 구현예에서, 키메라 수용체 또는 이의 일부의 하나 이상의 사슬을 암호화하는 주형 폴리뉴클레오타이드와 같은 폴리뉴클레오타이드는 폴리뉴클레오타이드 또는 벡터와 같은 뉴클레오타이드 형태로 세포 내로 도입된다. 구체적인 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드는 키메라 수용체 또는 이의 일부를 암호화하는 전이 유전자를 함유한다. 특정 구현예에서, 유전자 파괴를 위한 하나 이상의 제제(들) 또는 이의 성분은 폴리뉴클레오타이드 및/또는 벡터와 같은 핵산 형태로 세포 내로 도입된다. 일부 구현예에서, 조작을 위한 성분은 본원의 섹션 I.A.3 및 표 3과 4에 기술된 바와 같은 제제(들)의 전달에 사용되는 임의의 적합한 방법을 포함하여 다양한 전달 방법을 사용하여 다양한 형태로 전달될 수 있다. (예를 들어, 본원의 섹션 I.A에 기술된) 유전자 파괴를 유도할 수 있는 하나 이상의 제제(들)의 하나 이상의 성분을 암호화하는 (핵산 분자와 같은) 폴리뉴클레오타이드가 또한 제공된다. (예를 들어, 본원의 섹션 I.B.2에 기술된) 전이 유전자 서열을 함유하는 하나 이상의 주형 폴리뉴클레오타이드가 또한 제공된다. 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드, 예컨대 주형 폴리뉴클레오타이드 또는 유전자 파괴를 유도할 수 있는 하나 이상의 제제(들)의 하나 이상의 성분을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 전이 유전자의 표적화된 통합을 위해 세포를 유전자 조작하기 위한 벡터와 같은 벡터가 또한 제공된다.
일부 구현예에서, 특정 게놈 표적 위치에서, 예컨대 CD247 유전자 자리에서 전이 유전자를 표적화하기 위한 주형 폴리뉴클레오타이드와 같은 폴리뉴클레오타이드가 제공된다. 일부 구현예에서, 본원의 섹션 I.B에 기술된 임의의 주형 폴리뉴클레오타이드가 제공된다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오타이드는 키메라 수용체 또는 이의 일부 또는 다른 폴리뉴클레오타이드 및/또는 인자를 암호화하는 핵산 서열, 및 표적화된 통합을 위한 상동성 암을 포함하는 전이 유전자를 함유한다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오타이드는 벡터에 함유될 수 있다.
일부 구현예에서, 유전자 파괴를 유도할 수 있는 제제는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드에 암호화될 수 있다. 일부 구현예에서, Cas9 분자 및/또는 gRNA 분자와 같은 제제의 성분은 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드에 암호화되어 세포 내로 도입될 수 있다. 일부 구현예에서, 제제의 하나 이상의 성분을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 벡터에 포함될 수 있다.
일부 구현예에서, 벡터는 Cas9 분자 및/또는 gRNA 분자를 암호화하는 서열 및/또는 주형 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 벡터는 또한 (예컨대 핵 국소화, 핵소체 국소화, 미토콘드리아 국소화를 위한) 예컨대 Cas9 분자 서열에 융합된 신호 펩타이드를 암호화하는 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 벡터는 Cas9 분자를 암호화하는 서열에 융합된 (예컨대 SV40 유래의) 핵 위치 서열(nuclear localization sequence)을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 섹션 I.B.2에 기술된 주형 폴리뉴클레오타이드와 같은 폴리뉴클레오타이드에 함유된 전이 유전자 서열의 표적화된 통합을 위해 세포를 유전자 조작하기 위한 벡터가 제공된다.
구체적인 구현예에서, 프로모터, 인핸서, 인트론, 폴리아데닐화 신호, 코작 공통 서열, 내부 리보솜 유입점(IRES), 2A 서열 및 스플라이스 수용체 또는 공여체와 같은 하나 이상의 조절/제어 요소가 벡터에 포함될 수 있다. 일부 구현예에서, 프로모터는 RNA pol I, pol II 또는 pol III 프로모터 중에서 선택된다. 일부 구현예에서, 프로모터는 (CMV, SV40 초기 영역 또는 아데노바이러스 주요 후기 프로모터와 같은) RNA 중합효소 II에 의해 인식된다. 다른 구현예에서, 프로모터는 (U6 또는 H1 프로모터와 같은) RNA 중합효소 III에 의해 인식된다.
특정 구현예에서, 프로모터는 조절되는 프로모터(예컨대, 유도성 프로모터)이다. 일부 구현예에서, 프로모터는 유도성 프로모터 또는 억제성 프로모터이다. 일부 구현예에서, 프로모터는 Lac 작동유전자 서열, 테트라사이클린 작동유전자 서열, 갈락토스 작동유전자 서열 또는 독시사이클린 작동유전자 서열을 포함하거나 또는 이의 유사체이거나 Lac 억제인자 또는 테트라사이클린 억제인자 또는 이의 유사체에 의해 결합되거나 인식될 수 있다.
일부 구현예에서, 프로모터는 구성적 프로모터이거나 이를 포함한다. 예시적인 구성적 프로모터에는 예를 들어 시미안 바이러스 40 초기 프로모터(SV40), 시토메갈로 바이러스 즉석 초기 프로모터(CMV), 인간 유비퀴틴 C 프로모터(UBC), 인간 신장 인자 1α 프로모터(EF1α), 마우스 포스포글리세린산 키나아제 1 프로모터(PGK) 및 CMV 초기 인핸서와 결합한 닭 β-액틴 프로모터(CAGG)가 포함된다. 일부 구현예에서, 구성적 프로모터는 합성 또는 변형된 프로모터이다. 일부 구현예에서, 프로모터는 골수증식 육종바이러스 인핸서가 있는 변형된 MoMuLV LTR의 U3 영역을 함유하는 합성 프로모터인 MND 프로모터이거나 이를 포함한다(서열 번호: 18 또는 126에 제시된 서열; 문헌 [Challita et al. (1995) J. Virol. 69(2):748-755] 참조). 일부 구현예에서, 프로모터는 조직 특이적 프로모터이다. 다른 구현예에서, 프로모터는 바이러스 프로모터이다. 다른 구현예에서, 프로모터는 비-바이러스 프로모터이다. 일부 구현예에서, 예시적인 프로모터는 인간 신장 인자 1 알파(EF1α) 프로모터(예컨대 서열 번호: 77 또는 118에 제시됨) 또는 이의 변형된 형태(HTLV1 인핸서를 갖는 EF1α 프로모터; 예컨대 서열 번호: 119에 제시됨) 또는 MND 프로모터(예컨대 서열 번호: 131에 제시됨)을 포함할 수 있으나 이에 한정되지 않는다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드 및/또는 벡터는 조절 요소, 예를 들어, 프로모터를 포함하지 않는다.
구체적인 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드, 예를 들어 키메라 수용체 또는 이의 일부를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 뉴클레오타이드 형태로, 예를 들어, 비-바이러스 벡터로 또는 그 내에서 세포 내로 도입된다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드는 DNA 또는 RNA 폴리뉴클레오타이드이다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드는 이중 가닥 또는 단일 가닥 폴리뉴클레오타이드이다. 일부 구현예에서, 비-바이러스 벡터는 유전자 전달을 위한 임의의 적합한 및/또는 공지된 방법, 예컨대(그러나 이에 한정되지 않는) 미세주입, 전기 천공법, 일시적 세포 압축 또는 압착(예컨대 문헌[Lee, et al. (2012) Nano Lett 12: 6322-27]에 기술된 것), 지질 매개 형질주입, 펩타이드 매개 전달 또는 이들의 조합에 의해 형질도입 및/또는 형질주입을 위해 적합한 폴리뉴클레오타이드(예를 들어, DNA 또는 RNA 폴리뉴클레오타이드)이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 비-바이러스 폴리뉴클레오타이드는 본원에 기술된 비-바이러스 방법, 예컨대 표 4에 나열된 비-바이러스 방법에 의해 세포 내로 전달된다.
일부 구현예에서, 벡터 또는 전달 매개체는 (예를 들어, 재조합 바이러스의 생성을 위한) 바이러스 벡터이다. 일부 구현예에서, 바이러스는 DNA 바이러스(예를 들어, dsDNA 또는 ssDNA 바이러스)이다. 일부 구현예에서, 바이러스는 RNA 바이러스(예를 들어, ssRNA 바이러스)이다. 예시적인 바이러스 벡터/바이러스에는 예를 들어, 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노 연관 바이러스(AAV), 우두바이러스, 수두바이러스, 및 단순헤르페스바이러스 또는 본원의 다른 곳에 기술된 임의의 바이러스가 포함된다.
일부 구현예에서, 바이러스는 분열하는 세포를 감염시킨다. 다른 구현예에서, 바이러스는 비-분열하는 세포를 감염시킨다. 다른 구현예에서, 바이러스는 분열 및 비-분열하는 세포 모두를 감염시킨다. 다른 구현예에서, 바이러스는 숙주 게놈 내로 통합된다. 다른 구현예에서, 바이러스는 예를 들어 인간에서 감소된 면역성을 갖도록 조작된다. 다른 구현예에서, 바이러스는 복제 가능하다. 다른 구현예에서, 바이러스는 복제 결함이 있으며, 예를 들어 추가 라운드의 비리온 복제 및/또는 패키징에 필요한 유전자에 대한 하나 이상의 코딩 영역이 다른 유전자로 대체되거나 결실된다. 다른 구현예에서, 바이러스는 유전자 파괴의 일시적인 유도를 목적으로 Cas9 분자 및/또는 gRNA 분자의 일시적인 발현을 유발한다. 다른 구현예에서, 바이러스는 Cas9 분자 및/또는 gRNA 분자의 장기간의, 예를 들어, 적어도 1주일, 2주일, 1개월, 2개월, 3개월, 6개월, 9개월, 1년, 2년 또는 영구적인 발현을 유발한다. 바이러스의 패키징 용량은, 예를 들어, 적어도 약 4kb 내지 적어도 약 30kb까지, 예를 들어, 적어도 약 5kb, 10kb, 15kb, 20kb, 25kb, 30kb, 35kb, 40kb, 45kb 또는 50kb까지 다양할 수 있다.
일부 구현예에서, 제제(들)를 함유한 폴리뉴클레오타이드 및/또는 주형 폴리뉴클레오타이드는 재조합 레트로바이러스에 의해 전달된다. 다른 구현예에서, 레트로바이러스(예를 들어, 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스)는 예를 들어 숙주 게놈 내로 통합을 가능하게 하는 역전사 효소를 포함한다. 일부 구현예에서, 레트로바이러스는 복제 가능하다. 다른 구현예에서, 레트로바이러스는 복제 결함이 있으며, 예를 들어 추가 라운드의 비리온 복제 및/또는 패키징에 필요한 유전자에 대한 하나 이상의 코딩 영역이 다른 유전자로 대체되거나 결실된다.
일부 구현예에서, 제제(들)를 함유한 폴리뉴클레오타이드 및/또는 주형 폴리뉴클레오타이드는 재조합 렌티바이러스에 의해 전달된다. 예를 들어, 렌티바이러스는 복제 결함이 있으며, 예를 들어 바이러스 복제에 필요한 하나 이상의 유전자를 포함하지 않는다.
일부 구현예에서, 제제(들)를 함유한 폴리뉴클레오타이드 및/또는 주형 폴리뉴클레오타이드는 재조합 아데노바이러스에 의해 전달된다. 다른 구현예에서, 아데노바이러스는 인간에서 감소된 면역성을 갖도록 조작된다.
일부 구현예에서, 제제(들)를 함유한 폴리뉴클레오타이드 및/또는 주형 폴리뉴클레오타이드는 재조합 AAV에 의해 전달된다. 일부 구현예에서, AAV는 자신의 게놈을 본원에 기술된 바와 같이 숙주 세포(예를 들어, 표적 세포)의 게놈으로 통합시킬 수 있다. 다른 구현예에서, AAV는 자기 상보성 아데노 연관 바이러스(scAAV), 예를 들어, 함께 어닐링하여 이중 가닥 DNA를 형성하는 두 가닥을 패키징하는 scAAV이다. 개시되는 방법에 사용될 수 있는 AAV 혈청형은 AAV1, AAV2, 변형 AAV2(예를 들어, Y444F, Y500F, Y730F 및 S662V에서 변형), AAV3, 변형 AAV3(예를 들어, Y705F, Y731F 및/또는 T492V에서 변형), AAV4, AAV5, AAV6, 변형 AAV6(예를 들어, S663V 및/또는 T492V에서 변형), AAV7, AAV8, AAV 8.2, AAV9, AAV.rh10, 변형 AAV.rh10, AAV.rh32/33, 변형 AAV.rh32/33, AAV.rh43, 변형 AAV.rh43, AAV.rh64R1, 변형 AAV.rh64R1, 및 위형(pseudotyped) AAV, 예컨대 AAV2/8, AAV2/5 및 AAV2/6을 포함한다.
일부 구현예에서, 제제(들)를 함유한 폴리뉴클레오타이드 및/또는 주형 폴리뉴클레오타이드는 하이브리드 바이러스, 예를 들어 본원에 기술된 바이러스들 중 하나 이상의 하이브리드에 의해 전달된다.
패키징 세포는 표적 세포를 감염시킬 수 있는 바이러스 입자를 형성하는 데 사용된다. 이러한 세포는 아데노바이러스를 패키징할 수 있는 293 세포 및 레트로바이러스를 패키징할 수 있는 ψ2 세포 또는 PA317 세포를 포함한다. 유전자 치료에 사용되는 바이러스 벡터는 일반적으로 핵산 벡터를 입자 내로 패키징하는 생산자 세포주에 의해 생성된다. 벡터는 일반적으로 패키징 및 숙주 또는 표적 세포(해당되는 경우) 내로 후속 통합에 필요한 최소 바이러스 서열을 함유하며, 다른 바이러스 서열은 발현될 단백질, 예를 들어 Cas9를 암호화하는 발현 카세트로 대체된다. 예를 들어, 유전자 치료에 사용되는 AAV 벡터는 일반적으로 숙주 또는 표적 세포에 패키징 및 유전자 발현에 필요한 AAV 게놈의 역 말단 반복(ITR) 서열만을 보유한다. 누락된 바이러스 기능은 패키징 세포주에 의해 수송 중에 공급된다. 이후로, 바이러스 DNA는 다른 AAV 유전자, 즉 rep 및 cap을 암호화하지만 ITR 서열이 없는 헬퍼 플라스미드를 함유한 세포주에 패키징된다. 이 세포주는 또한 헬퍼로서 아데노바이러스에 감염된다. 헬퍼 바이러스는 AAV 벡터의 복제 및 헬퍼 플라스미드로부터 AAV 유전자의 발현을 촉진한다. 헬퍼 플라스미드는 ITR 서열의 결핍으로 인해 상당한 양으로 패키징되지 않는다. 아데노바이러스에 의한 오염은 예를 들어 아데노바이러스가 AAV보다 더 민감한 열처리에 의해 감소될 수 있다.
일부 구현예에서, 바이러스 벡터는 세포 유형 인식 능력이 있다. 예를 들어, 바이러스 벡터는 다른/대체 바이러스 외피 당단백질로 위형화될 수 있고; 세포 유형 특이적 수용체로 조작될 수 있고(예를 들어, 펩타이드 리간드, 단일 사슬 항체, 성장 인자와 같은 표적화 리간드를 통합하기 위한 바이러스 외피 당단백질의 유전적 변형); 및/또는 한쪽 끝이 바이러스 당단백질을 인식하고 다른 쪽 끝이 표적 세포 표면의 모이어티를 인식하는 이중 특이성을 갖는 분자 다리(molecular bridge)(예를 들어, 리간드-수용체, 단클론 항체, 아비딘-비오틴 및 화학적 접합)를 갖도록 조작될 수 있다.
일부 구현예에서, 바이러스 벡터는 세포 유형 특이적 발현을 달성한다. 예를 들어, 조직-특이적 프로모터는 특정 표적 세포에서만 유전자 파괴를 도입할 수 있는 제제(예를 들어, Cas9 및 gRNA)의 발현을 제한하도록 작제될 수 있다. 벡터의 특이성은 또한 발현의 microRNA 의존적 조절에 의해 매개될 수 있다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터는 바이러스 벡터와 표적 세포막의 융합 효율을 증가시켰다. 예를 들어, 융합 가능 혈구응집소(HA)와 같은 융합 단백질은 세포 내로의 바이러스 흡수를 증가시키기 위해 통합될 수 있다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터는 핵 국소화 기능을 갖는다. 예를 들어, (세포 분열 중에) 핵막의 파괴가 필요하므로 비-분열하는 세포를 감염시키지 않는 바이러스는 바이러스의 기질 단백질에 핵 위치 펩타이드를 통합하여 비증식 세포의 형질도입을 가능하게 하도록 위해 변경될 수 있다.
III. 키메라 수용체를 발현하는 조작된 세포 및 세포 조성물
여기서는 키메라 항원 수용체(CAR) 또는 이의 일부와 같은 키메라 수용체의 하나 이상의 사슬을 암호화하는 전이 유전자와 같은 핵산 서열을 포함하는 변형된 CD247 유전자 자리를 포함하는 유전자 조작된 세포가 제공된다. 일부 측면에서, 유전자 조작된 세포 내 변형된 CD247 유전자 자리는 내인성 CD247 유전자 자리에 통합된, 키메라 수용체 또는 이의 일부의 하나 이상의 사슬을 암호화하는 외인성 핵산 서열(예를 들어, 전이 유전자 서열)을 포함한다. 일부 측면에서, 제공된 조작된 세포는 예를 들어, 유전자 파괴를 유도하기 위한 제제(들)(예를 들어, 섹션 I.A에 기술됨) 및 수선을 위한 전이 유전자 서열을 함유하는 주형 폴리뉴클레오타이드(예를 들어, 섹션 I.B에 기술됨)를 사용하여 상동성 의존적 수선(HDR)을 포함한, 본원에 기술된 방법들을 사용하여 생산된다. 일부 측면에서, 섹션 I.B에 기술된 임의의 주형 폴리뉴클레오타이드와 같은 제공된 폴리뉴클레오타이드의 부분, 예를 들어 인접 분절이 내인성 CD247 유전자 자리에서 통합을 위해 표적화되어, 키메라 수용체를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 변형된 CD247 유전자 자리를 함유하는 세포를 생성할 수 있다. 일부 측면에서, 암호화된 키메라 수용체는 CD3제타(CD3ζ) 신호 전달 도메인을 포함하는 세포내 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, HDR에 의해 내인성 CD247 유전자 자리로 통합되는 주형 폴리뉴클레오타이드의 부분은 주형 폴리뉴클레오타이드의 (본원의 예를 들어 섹션 I.B에 기술된 것과 같은) 전이 유전자 서열 부분을 포함한다.
일부 측면에서, 세포는 키메라 항원 수용체(CAR)와 같은 키메라 수용체를 발현하도록 조작된다. 일부 측면에서, 키메라 수용체는 조작된 세포에서 변형된 CD247 유전자 자리에 존재하는 핵산 서열에 의해 암호화된다. 일부 측면에서, 세포는 HDR을 통해 키메라 수용체의 전부 또는 일부를 암호화하는 전이 유전자 서열을 통합하여 생성된다. 일부 구현예에서, 키메라 수용체는 리간드 또는 항원, 예를 들어 질병 또는 장애와 연관된 항원에 결합하거나 이를 인식하는 결합 도메인을 함유한다. 일부 측면에서, 키메라 수용체는 신호 전달 영역, 예를 들어 CD3제타(CD3ζ) 사슬 또는 이의 단편을 포함하는 신호 전달 영역, 예컨대 CD3ζ의 신호 전달 영역 또는 신호 전달 도메인을 함유하는 세포내 영역을 함유한다. 일부 구현예에서, 세포에 의해 발현되는 키메라 수용체는 일반적으로 수용체의 C-말단에 CD3ζ 또는 이의 일부를 함유한다. 일부 측면에서, 변형된 CD247 유전자 자리에 존재하는 키메라 수용체 또는 이의 일부를 암호화하는 핵산 서열은 내인성 CD247 유전자 자리의 개방형 해독틀 또는 이의 부분 서열과 융합된 외인성 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 키메라 수용체 내 CD3ζ 사슬의 적어도 일부는 게놈에서 내인성 CD247 유전자 자리의 서열에 의해 암호화된다. 일부 측면에서, CD3ζ 사슬 또는 이의 일부는 기능성 CD3ζ 사슬 또는 부분이다. 일부 측면에서, 키메라 수용체는 CD3ζ 사슬 또는 이의 단편을 통해 신호 전달을 할 수 있다.
일부 측면에서, 조작된 세포는 T 세포와 같은 면역 세포이다. 일부 측면에서, 면역 세포는 키메라 수용체, 예를 들어 키메라 항원 수용체 또는 본원에 기술된 것과 같은 변형된 키메라 수용체를 발현하도록 조작된다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 방법, 조성물, 제조품, 및/또는 키트는 CD3제타(CD3ζ) 신호 전달 도메인을 함유하는 키메라 수용체를 발현하기 위해 변형된 CD247 유전자 자리를 가지거나 함유하는 유전자 조작된 세포, 예를 들어 유전자 조작된 면역 세포 및/또는 T 세포를 생성, 제조 또는 생산하는 데 유용하다. 구체적인 구현예에서, 본원에 제공된 방법은 변형된 CD247 유전자 자리를 가지거나 함유하는 유전자 조작된 세포를 생성한다. 구체적인 구현예에서, 변형된 유전자 자리는 전이 유전자, 예를 들어 섹션 I.B에 기술된 전이 유전자와 내인성 CD247 유전자의 개방형 해독틀의 융합물이거나 이를 함유한다. 특정 구현예에서, 전이 유전자는 CD3제타(CD3ζ) 사슬 또는 이의 단편을 포함하는 키메라 수용체의 일부를 암호화하고, 내인성 CD247 유전자의 개방형 해독틀 내로 틀 내 삽입되어, 전(full) 키메라 수용체를 암호화하는 변형된 유전자 자리를 생성한다. 일부 구현예에서, 키메라 수용체는 키메라 항원 수용체(CAR)이다.
일부 경우에, 세포는 하나 이상의 추가 분자, 예를 들어 추가 인자 및/또는 부속 분자, 예컨대 본원에 기술된, 치료 분자를 포함한 임의의 추가 분자를 발현하도록 조작된다. 일부 구현예에서, 추가 분자는 표지자, 추가 키메라 수용체 폴리펩타이드 사슬, 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 면역 조절 분자, 리간드, 사이토카인 또는 케모카인을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 추가 인자는 가용성 분자이다. 일부 구현예에서, 추가 인자는 막-결합 분자이다. 일부 측면에서, 추가 인자는 종양 미세 환경(TME)과 같은 면역 억제 환경의 영향을 극복하거나 해소하는 데 사용될 수 있다. 일부 측면에서, 예시적인 추가 분자는 사이토카인, 사이토카인 수용체, 키메라 공자극 수용체, 공자극 리간드 및 T 세포 기능 또는 활성이 있는 기타 조절제를 포함한다. 일부 구현예에서, 조작된 세포에 의해 발현되는 추가 분자는 IL-7, IL-12, IL-15, CD40 리간드(CD40L), 및 4-1BB 리간드(4-1BBL)를 포함한다. 일부 측면에서, 추가 분자는 상이한 분자에 결합하는 추가 수용체, 예를 들어 막-결합 수용체이다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 추가 분자는 사이토카인 수용체 또는 케모카인 수용체, 예를 들어 IL-4 수용체 또는 CCL2 수용체이다. 일부 경우에, 조작된 세포는 “장갑을 갖춘(armored) CAR” 또는 보편적인 사이토카인 킬링을 위해 재배치된 T 세포(TRUCK)라 불린다.
다수의 조작된 세포를 함유하는 조성물이 또한 제공된다. 일부 측면에서, 조작된 세포를 함유하는 조성물은 키메라 수용체가 무작위로 세포의 게놈에 도입되는 방법과 같은 다른 조작 방법을 사용하여 생성된 세포 또는 세포 조성물과 비교하여 키메라 수용체에 의한 개선된, 균일하고, 균질한 및/또는 안정된 발현 및/또는 항원 결합을 나타낸다. 일부 구현예에서, 조작된 세포 또는 조작된 세포를 포함하는 조성물은 치료 요법, 예를 들어 입양 세포 요법에 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 제공된 세포 또는 세포 조성물은 본원에 기술된 임의의 치료 방법에 또는 본원에 기술된 치료 용도에 사용될 수 있다.
A. 변형된 CD247 유전자 자리
일부 측면에서, 변형된 CD247 유전자 자리를 포함하는 유전자 조작된 세포가 제공된다. 일부 구현예에서, 변형된 CD247 유전자 자리는 CD3제타(CD3ζ) 신호 전달 도메인을 포함하는 세포내 영역을 포함하는 키메라 수용체의 하나 이상의 사슬을 암호화하는 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 핵산 서열은 키메라 수용체의 하나 이상의 사슬의 일부를 암호화하는 전이 유전자 서열을 포함하며, 전이 유전자 서열은, 선택적으로 상동 직접 수선(HDR)을 통해, 내인성 CD247 유전자 자리에 통합되었다. 일부 구현예에서, CD3제타 신호 전달 도메인의 전부(예를 들어, 전체 또는 전 CD3ζ 신호 전달 도메인) 또는 단편은 내인성 CD247 유전자 자리의 개방형 해독틀 또는 이의 부분 서열에 의해 암호화된다. 일부 구현예에서, 핵산 서열은 키메라 수용체의 일부를 암호화하는 전이 유전자 서열과 내인성 CD247 유전자 자리의 개방형 해독틀 또는 이의 부분 서열의 융합물을 포함한다.
일부 측면에서, 변형된 CD247 유전자 자리는, 예컨대 HDR 방법을 통해, 키메라 수용체 또는 이의 일부를 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열을 포함하는 전이 유전자 서열(예를 들어, 외인성 또는 이종성 핵산 서열)의 유전자 파괴 및 통합의 결과로서 생성된다. 일부 측면에서, 변형된 CD247 유전자 자리에 존재하는 핵산 서열은 일반적으로 전장(full length) CD3ζ를 암호화하는 개방형 해독틀을 포함하는 내인성 CD247 유전자 자리 내 영역에 통합된, 외인성 서열과 같은, 전이 유전자 서열(들)을 포함한다. 일부 측면에서, HDR에 의한 전이 유전자의 표적화된 통합 시, 세포의 게놈은 키메라 수용체 또는 이의 일부를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 변형된 CD247 유전자 자리를 함유한다. 일부 구현예에서, 표적화된 통합 시, 변형된 CD247 유전자 자리는, 키메라 수용체의 일부가 조작된 세포로부터 발현되도록, 내인성 CD247 유전자 자리의 개방형 해독틀 내 부위로 통합된 전이 유전자를 함유하고, 또한 CD3ζ 사슬을 암호화하는 개방형 해독틀을 포함하는 내인성 CD247 유전자 자리로부터 유래된 CD3ζ의 일부를 함유한다.
일부 측면에서, HDR에 의한 전이 유전자의 표적화된 통합 시, 세포의 게놈은 키메라 수용체 또는 이의 일부를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 변형된 CD247 유전자 자리를 함유한다. 일부 구현예에서, 표적화된 통합 시, 변형된 CD247 유전자 자리는 전이 유전자의 융합물 및 내인성 CD247 유전자 자리의 개방형 해독틀 또는 이의 부분 서열을 함유한다. 일부 구현예에서, 표적화된 통합 시, 변형된 CD247 유전자 자리는 내인성 CD247 유전자 자리의 개방형 해독틀 내 부위로 통합된 전이 유전자를 함유한다. 일부 구현예에서, 표적화된 통합 시, 변형된 CD247 유전자 자리는 완전한(complete), 온전한(whole) 및/또는 전장(full length)의 키메라 수용체를 암호화하는 핵산 서열, 예를 들어 DNA 서열을 함유하고, 이 수용체의 일부는 전이 유전자에 의해, 예를 들어 통합된 전이 유전자 또는 이종성 서열에 의해 암호화되고, 나머지 부분은 내인성 CD247 유전자 자리의 개방형 해독틀의 일부, 예를 들어 내인성 CD247 유전자 자리의 개방형 해독틀의 하나 이상의 엑손에 의해 암호화된다. 일부 구현예에서, 표적화된 통합 시, 변형된 CD247 유전자 자리는 완전한(complete), 온전한(whole), 전장(full length) 및/또는 전체(entire) CD3ζ 신호 전달 도메인을 포함하는 키메라 수용체를 암호화하는 핵산 서열, 예를 들어 DNA 서열을 함유한다. 예를 들어, CD3ζ 신호 전달 도메인은 기능적이며 신호 전달이 가능하다. 상기 예에서, CD3ζ 신호 전달 도메인의 일부는 전이 유전자에 의해, 예를 들어 통합된 전이 유전자 또는 이종성 서열에 의해 암호화되고, 나머지 부분은 내인성 CD247 유전자 자리의 개방형 해독틀의 일부, 예를 들어 내인성 CD247 유전자 자리의 개방형 해독틀의 하나 이상의 엑손에 의해 암호화된다. 따라서, 전이 유전자 서열과 CD247 유전자 자리는 함께 키메라 수용체의 CD3ζ 신호 전달 도메인을 암호화한다. 다른 예에서, 암호화된 키메라 수용체의 전체 CD3ζ 신호 전달 도메인은 내인성 CD247 유전자 자리의 개방형 해독틀에 존재하는 서열에 의해, 예컨대 내인성 CD247 유전자 자리의 개방형 해독틀의 하나 이상의 엑손에 의해 암호화된다.
일부 구현예에서, 암호화된 키메라 수용체는 CD3ζ 사슬의 전부 또는 일부를 포함하는 세포내 영역(예를 들어, CD3ζ 사슬의 세포내 영역, 예를 들어 CD3ζ 신호 전달 도메인)을 함유하는 수용체이다. 임의의 구현예의 일부에서, 암호화된 키메라 수용체의 세포내 영역(예를 들어, 변형된 CD247 유전자 자리에 의해 암호화됨)은 CD3제타(CD3ζ) 신호 전달 도메인, 예컨대 전체 또는 전 CD3ζ 신호 전달 도메인(예를 들어, 일부 경우에 서열 번호: 13-15 중 어느 하나에서 선택된 서열을 포함하는 전장 CD3ζ 신호 전달 도메인)을 포함한다. 임의의 구현예의 일부에서, 전체 CD3ζ 신호 전달 도메인은 신호 전달을 할 수 있다. 일부 측면에서, 암호화된 키메라 수용체는 전체 CD3ζ 신호 전달 도메인(예를 들어, 서열 번호: 13-15 중 어느 하나에서 선택된 서열을 포함)을 포함하고, 이는 내인성 CD247 유전자 자리의 개방형 해독틀 또는 이의 부분 서열에 의해 부분적으로 또는 전체적으로 암호화된다. 일부 구현예에서, 내인성 CD247 유전자 자리의 개방형 해독틀 또는 이의 부분 서열은 키메라 수용체의 CD3제타 신호 전달 도메인을 암호화한다. 일부 구현예에서, 핵산 서열은 키메라 수용체의 일부를 암호화하는 전이 유전자 서열을 포함하고, 상기 일부는 선택적으로 CD3제타 신호 전달 도메인의 단편을 암호화하고, 여기서 개방형 해독틀 또는 이의 부분 서열은 CD3제타 신호 전달 도메인을 암호화하거나, 선택적으로 CD3제타 신호 전달 도메인의 추가 단편을 암호화한다. 일부 구현예에서, 전이 유전자는 CD3ζ 사슬의 일부 또는 CD3ζ 사슬의 세포내 영역의 일부만을 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열을 함유한다. 일부 구현예에서, 전이 유전자는 전장 CD3ζ 사슬을 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 전이 유전자는 CD3ζ 사슬을 암호화하는 핵산 서열을 포함하지 않는다. 일부 측면에서, 전이 유전자의 통합 시, 키메라 수용체의 CD3ζ 사슬 또는 이의 단편을 암호화하는 핵산 서열의 일부 또는 전부는 내인성 CD247 유전자 자리의 개방형 해독틀 서열 또는 이의 부분 서열로부터 유래되거나 이로부터 기원한다. 따라서, 일부 구현예에서, 전이 유전자의 통합은 전이 유전자와 CD247 유전자 자리의 내인성 서열의 유전자 융합물을 생성하고, 이들은 함께 CD3ζ 사슬 또는 이의 단편을 함유하는 키메라 수용체를 암호화할 수 있다.
일부 구현예에서, 전이 유전자는 키메라 수용체(예를 들어, CAR)의 세포외 영역, 막관통 도메인 및 세포내 영역 중 하나 이상을 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 세포내 영역의 일부는 CD3ζ 사슬 또는 이의 단편을 포함하고, CD3ζ 사슬의 일부만 전이 유전자에 의해 암호화된다. 일부 구현예에서, 전이 유전자에 의해 암호화되는 세포내 영역은 CD3ζ 사슬을 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열을 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 내인성 CD247 유전자 자리의 개방형 해독틀 또는 이의 부분 서열은 키메라 수용체에 존재하는 CD3ζ 사슬의 전부 또는 일부를 암호화한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 변형된 CD247 유전자 자리에 존재하는 키메라 수용체를 암호화하는 핵산에서, CD3ζ 사슬 또는 이의 단편을 암호화하는 서열의 일부 또는 전부는 내인성 CD247 유전자 자리 및/또는 내인성 CD247 유전자 자리에 상동성인 서열을 함유하는 상동성 암 서열로부터 유래되거나 이들로부터 기원한다.
일부 구현예에서, 전이 유전자의 통합은 전이 유전자와 CD247 유전자 자리의 내인성 서열의 유전자 융합물을 생성하고, 이들은 함께 CD3ζ 사슬 또는 이의 단편을 함유하는 키메라 수용체를 암호화한다.
일부 구현예에서, 표적화된 통합 시, 변형된 CD247 유전자 자리는 내인성 CD247 유전자 자리의 적어도 하나의 인트론 및 적어도 하나의 엑손을 포함하는 키메라 수용체 또는 이의 일부를 암호화하는 핵산 서열을 함유한다. 일부 구현예에서, 통합 시, 키메라 수용체의 일부는 내인성 CD247 유전자 자리의 적어도 하나의 인트론 및 적어도 하나의 엑손을 포함하는 내인성 CD247 유전자 자리의 개방형 해독틀의 부분 서열에 의해 암호화된다. 일부 구현예에서, 통합 시, 키메라 수용체의 일부는 내인성 CD247 유전자 자리의 적어도 하나, 적어도 둘, 적어도 셋, 적어도 넷, 적어도 다섯, 적어도 여섯 또는 적어도 일곱 개의 인트론을 포함하는 내인성 CD247 유전자 자리의 개방형 해독틀의 부분 서열에 의해 암호화된다. 일부 구현예에서, 통합된 전이 유전자 서열은 3’ UTR을 암호화하는 서열을 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 표적화된 통합 시, 변형된 CD247 유전자 자리는 키메라 수용체를 암호화하는 핵산 서열을 함유하고, 이 핵산 서열은 내인성 CD247 유전자 자리의 3’ UTR을 암호화한다. 일부 구현예에서, 개방형 해독틀 또는 이의 부분 서열은 내인성 CD247 유전자 자리의 3’ UTR을 포함한다. 일부 구현예에서, 표적화된 통합 시, 변형된 CD247 유전자 자리는 인트론을 포함하지 않는 전이 유전자를 함유한다.
특정 구현예에서, 전이 유전자는 CAR과 같은 키메라 수용체의 일부를 암호화하고, CD3ζ 사슬을 암호화하는 CD247 유전자 자리의 내인성 개방형 해독틀 내에 틀 내 삽입된다. 일부 구현예에서, 변형된 유전자 자리는 키메라 수용체의 전장을 암호화한다. 구체적인 구현예에서, 암호화된 키메라 수용체의 일부는 전이 유전자에 존재하는 핵산 서열에 의해 암호화되고, 키메라 수용체의 나머지 부분은 내인성 CD247 유전자 자리의 개방형 해독틀에 존재하는 핵산 서열에 의해 암호화된다. 구체적인 구현예에서, 변형된 유전자 자리의 전사는 키메라 수용체를 암호화하는 mRNA를 생성한다. 구체적인 구현예에서, mRNA의 일부는 전이 유전자에 존재하는 핵산 서열로부터 전사되고, mRNA의 나머지 부분은 내인성 CD247 유전자 자리의 개방형 해독틀에 존재하는 핵산 서열로부터 전사된다. 일부 구현예에서, 전이 유전자는 CD3ζ 사슬을 암호화하는 내인성 CD247 유전자 자리의 개방형 해독틀의 하나 이상의 엑손의 바로 상단부의 표적 부위에서 이와 틀 내 통합된다.
일부 구현예에서, 변형된 유전자 자리로부터 전사된 mRNA는, 내인성 CD247 유전자 자리에 의해 암호화되고/거나 내인성 CD247 유전자 자리로부터 전사된 mRNA의 3’ UTR과 동일한 3’ UTR을 함유한다. 일부 구현예에서, 전이 유전자는 CAR의 일부를 암호화하는 핵산의 서열의 상단부, 예를 들어 바로 상단부의 리보솜 스키핑 요소를 함유한다. 특정 구현예에서, 변형된 유전자 자리의 전사는 CAR의 전장을 암호화하는 mRNA를 생성한다. 일부 구현예에서, CAR을 암호화하는 mRNA는, 내인성 유전자에 의해 암호화되고/거나 내인성 CD247 유전자 자리로부터 전사된 mRNA의 5’ UTR과 동일한 5’ UTR을 함유한다.
특정 구현예에서, 변형된 유전자 자리는 키메라 수용체를 암호화하는 핵산 서열을 함유하고, 이 핵산 서열은 적어도 하나, 적어도 둘, 적어도 셋, 적어도 넷, 적어도 다섯, 적어도 여섯 또는 적어도 일곱 개의 인트론을 함유한다. 일부 구현예에서, 개방형 해독틀 또는 이의 부분 서열은 내인성 CD247 유전자 자리의 적어도 하나의 인트론 및 적어도 하나의 엑손을 포함한다. 일부 구현예에서, 인트론은 통합된 전이 유전자 서열 내에 위치하지 않는다. 일부 구현예에서, 개방형 해독틀 또는 이의 부분 서열은 내인성 CD247 유전자 자리의 3’ UTR을 암호화한다. 일부 구현예에서, 전이 유전자 서열은 인트론을 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 전이 유전자 서열은 내인성 CD247 유전자 자리의 개방형 해독틀 또는 이의 부분 서열의 하나 이상의 엑손과 틀 내에 있다.
일부 구현예에서, 변형된 CD247 유전자 자리에 의해 암호화된 키메라 수용체(예를 들어, CAR)는 기능성 CAR이다. 일부 구현예에서, 변형된 유전자 자리에 의해 암호화된 CAR은 표적 항원에 결합하고/거나 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 항원은 질병, 장애 또는 병태와 관련된 세포 또는 조직과 관련되고, 이에 특이적이고 및/또는 이에서 발현된다. 일부 구현예에서, 변형된 CD247 유전자 자리에 의해 암호화된 키메라 수용체(예를 들어, CAR)는, 예컨대 CD3-제타(CD3ζ) 사슬 또는 이의 기능적 변이체 또는 신호 전달 부분의 세포내 신호 전달 도메인 또는 영역을 통해, T 세포, T 세포 수용체(TCR) 성분의 신호 전달 도메인 및/또는 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프(ITAM)를 포함하는 신호 전달 도메인에서 1차 활성화 신호를 자극 및/또는 유도할 수 있는, 기능적 CAR이다.
일부 구현예에서, 표적화된 통합 시, 변형된 CD247 유전자 자리는 전이 유전자 서열을 함유하고(예를 들어, 폴리펩타이드, 예를 들어 키메라 수용체의 도메인(들) 또는 영역(들)을 암호화하고), 전이 유전자(외인성) 서열의 코딩 부분은 내인성 CD247 유전자 자리에서 개방형 해독틀의 하나 이상의 엑손과 틀 내 통합된다. 일부 구현예에서, 전이 유전자 서열은 내인성 CD247 유전자 자리의 개방형 해독틀의 엑손 1의 하단부 및 엑손 8의 상단부에 통합 또는 삽입된다. 일부 구현예에서, 전이 유전자 서열은 내인성 CD247 유전자 자리의 개방형 해독틀의 엑손 1의 하단부 및 엑손 3의 상단부에 통합 또는 삽입된다.
일부 구현예에서, 표적화된 통합 시, 변형된 CD247 유전자 자리는 세포내 영역을 포함하는 키메라 수용체를 암호화하는 핵산 서열을 함유하고, 여기서 세포내 영역의 적어도 일부는 내인성 CD247 유전자 자리의 개방형 해독틀 또는 이의 부분 서열에 의해 암호화된 CD3제타(CD3ζ) 사슬 또는 이의 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포내 영역을 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열은 내인성 CD247 유전자 자리의 개방형 해독틀의 적어도 엑손 3-8을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포내 영역을 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열은 내인성 CD247 유전자 자리의 개방형 해독틀의 엑손 2 및 엑손 3-8의 적어도 일부를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포내 신호 전달 영역을 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열은 내인성 CD247 유전자 자리의 개방형 해독틀의 엑손 1의 전장 미만을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포내 영역을 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열은 내인성 CD247 유전자 자리의 개방형 해독틀의 엑손 1을 포함하지 않고/거나 엑손 2의 전장 미만을 포함한다.
일부 측면에서, 암호화된 키메라 수용체는 전이 유전자 서열과 내인성 CD247 유전자 자리의 내인성 서열의 융합에 의해 암호화된 CD3제타 사슬 또는 이의 단편을 통해 신호 전달을 할 수 있다. 일부 구현예에서, 암호화된 CD3ζ 사슬 또는 이의 단편은 인간 CD3ζ의 동형 단백질 3의 112 AA 세포내 또는 세포질 도메인(수탁 번호: P20963.2) 또는 문헌[미국 특허 번호 7,446,190 또는 미국 특허 번호 8,911,993]에 기술된 바와 같은 CD3 제타 신호 전달 도메인을 포함한다.　일부 구현예에서, 암호화된 CD3ζ 사슬 또는 이의 단편은 서열 번호: 13, 14 또는 15에 제시된 아미노산 서열 또는 서열 번호: 13, 14 또는 15에 대해 적어도 (약) 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열, 또는 이의 부분 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 전이 유전자 서열은 내인성 CD247 유전자 자리의 개방형 해독틀의 엑손 1의 하단부 및 엑손 8의 상단부에 있다. 일부 구현예에서, 전이 유전자 서열은 내인성 CD247 유전자 자리의 개방형 해독틀의 엑손 1의 하단부 및 엑손 3의 상단부에 있다. 일부 구현예에서, 암호화된 키메라 수용체의 CD3ζ 신호 전달 도메인의 적어도 단편, 선택적으로 전체 CD3ζ 신호 전달 도메인은 내인성 CD247 유전자 자리의 개방형 해독틀 또는 이의 부분 서열에 의해 암호화된다. 일부 구현예에서, CD3ζ 신호 전달 도메인은 내인성 CD247 유전자 자리의 개방형 해독틀의 적어도 엑손 3-8을 포함하는 뉴클레오타이드의 서열에 의해 암호화된다. 일부 구현예에서, CD3ζ 신호 전달 도메인은 내인성 CD247 유전자 자리의 개방형 해독틀의 적어도 엑손 2의 일부 및 엑손 3-8을 포함하는 뉴클레오타이드의 서열에 의해 암호화된다. 일부 구현예에서, CD3ζ 신호 전달 도메인은 내인성 CD247 유전자 자리의 개방형 해독틀의 엑손 1의 전장을 포함하지 않는 뉴클레오타이드의 서열에 의해 암호화된다. 일부 구현예에서, CD3ζ 신호 전달 도메인은 내인성 CD247 유전자 자리의 개방형 해독틀의 엑손 1의 전장을 포함하지 않고/거나 엑손 2의 전장을 포함하지 않는 뉴클레오타이드의 서열에 의해 암호화된다.
일부 구현예에서, 키메라 수용체의 일부를 암호화하는 전이 유전자 서열은 순서대로: 세포외 결합 도메인, 선택적으로 scFv; 선택적으로 인간 면역글로불린 힌지, 선택적으로 IgG1, IgG2 또는 IgG4 또는 이들의 변형된 버전의 서열을 포함하고, 선택적으로 CH2 영역 및/또는 CH3 영역을 더 포함하는 스페이서; 및 선택적으로 인간 CD28의 막관통 도메인;을 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열; 선택적으로 인간 4-1BB의 공자극 신호 전달 도메인을 포함하는 세포내 영역을 포함하고/거나; 전이 유전자 서열의 통합 시, 변형된 CD247 유전자 자리는 순서대로: 세포외 결합 도메인, 선택적으로 scFv; 선택적으로 인간 면역글로불린 힌지, 선택적으로 IgG1, IgG2 또는 IgG4 또는 이들의 변형된 버전의 서열을 포함하고, 선택적으로 CH2 영역 및/또는 CH3 영역을 더 포함하는 스페이서; 선택적으로 인간 CD28의 막관통 도메인; 선택적으로 인간 4-1BB의 공자극 신호 전달 도메인을 포함하는 세포내 영역; 및 CD3제타 신호 전달 도메인;을 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 키메라 수용체의 암호화된 세포내 영역은 N 말단에서 C 말단까지 순서대로: 하나 이상의 공자극 신호 전달 도메인(들) 및 CD3제타 사슬 또는 이의 단편을 포함한다.
B. 암호화된 키메라 수용체
일부 구현예에서, 본원에 제공된 조작된 세포에 의해 암호화된 키메라 수용체, 또는 본원에 제공된 방법에 따라 생성된 조작된 세포는 CD3ζ 사슬 또는 이의 단편 또는 일부를 포함하는 세포내 영역(예를 들어, CD3ζ 신호 전달 도메인과 같은 CD3ζ 사슬의 세포내 영역)을 함유하는 키메라 수용체를 포함한다. 일부 측면에서, 키메라 수용체의 적어도 일부는 상기 섹션 I.B.2에 기술된 임의의 주형 폴리뉴클레오타이드와 같은, 본원에 제공된 폴리뉴클레오타이드에 존재하는 전이 유전자 서열에 의해 암호화된다. 일부 측면에서, 폴리뉴클레오타이드에 함유된 키메라 수용체의 일부를 암호화하는 전이 유전자 서열은 조작된 세포의 내인성 CD247 유전자 자리에서 통합되어, 본원에 기술된 임의의 키메라 수용체와 같은 키메라 수용체를 암호화하는 변형된 CD247 유전자 자리를 생성한다. 일부 측면에서, 암호화된 키메라 수용체는 CD3ζ 사슬 또는 이의 단편 또는 일부, 예컨대 CD3ζ 신호 전달 도메인, 예를 들어 전체 또는 전 CD3ζ 신호 전달 도메인을 함유한다. 일부 구현예에서, CD3ζ 사슬의 적어도 일부, 예컨대 CD3ζ 신호 전달 도메인의 일부 또는 전체 CD3ζ 신호 전달 도메인은 내인성 CD247 유전자 자리의 개방형 해독틀 또는 이의 부분 서열에 의해 암호화된다. 일부 구현예에서, 조작된 세포는 또한 하나 이상의 추가 분자, 예를 들어 표지자, 추가 키메라 수용체 폴리펩타이드, 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 면역 조절 분자, 리간드, 사이토카인 또는 케모카인을 발현할 수 있다. 일부 측면에서, 폴리뉴클레오타이드에 함유된 키메라 수용체 또는 이의 일부를 암호화하는 전이 유전자 서열은 조작된 세포의 내인성 CD247 유전자 자리에서 통합되어, 다중 사슬 키메라 수용체의 하나 이상의 폴리펩타이드 사슬을 포함하여, 본원에 기술된 임의의 키메라 수용체와 같은 키메라 수용체 또는 이의 일부를 암호화하는 변형된 CD247 유전자 자리를 생성한다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 키메라 수용체를 발현하는 T 세포와 같은 면역 세포와 같은 조작된 세포가 제공된다. 키메라 수용체 중에는 항원 수용체와 이의 하나 이상의 성분을 함유하는 수용체가 있다. 이 키메라 수용체는 리간드 결합 도메인 또는 이의 결합 단편 및 세포내 신호 전달 도메인 또는 영역을 함유하는 것과 같은 키메라 수용체, 기능성 비-TCR 항원 수용체, 키메라 항원 수용체(CAR), 키메라 자가항체 수용체(CAAR) 및 상기 중 어느 하나의 영역(들), 사슬(들), 도메인(들) 또는 성분(들)을 포함할 수 있다.
본원에 제공된 유전자 조작된 세포에서 암호화된 CAR과 같은 키메라 수용체는 일반적으로 세포외 영역(예를 들어, 하나 이상의 세포외 결합 도메인(들) 및/또는 스페이서들을 함유), 막관통 도메인 및/또는 세포내 영역(예를 들어, CD3제타(CD3ζ) 사슬 또는 이의 단편 및/또는 하나 이상의 공자극 신호 전달 도메인을 함유) 중 하나 이상과 같은 다양한 영역 또는 도메인을 함유한다. 일부 측면에서, 암호화된 키메라 수용체는 다량체화 도메인과 같은 다른 도메인, 링커 및/또는 조절 요소를 더 함유한다. 일부 구현예에서, 암호화된 키메라 수용체는 N 말단에서 C 말단까지 순서대로: 세포외 결합 도메인, 스페이서, 막관통 도메인 및 세포내 영역을 포함한다.
일부 구현예에서, 조작된 세포로부터 발현된 예시적인 키메라 수용체는 일부 경우에 상이한 성분, 도메인 또는 영역을 함유하는 둘 이상의 수용체 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 측면에서, 키메라 수용체는 함께 기능성 키메라 수용체를 포함하는 둘 이상의 폴리펩타이드를 포함하는 다중 사슬 수용체 또는 다중 사슬 키메라 수용체 시스템이고, 또는 폴리펩타이드들 중 하나 이상은 다른 수용체 폴리펩타이드의 발현, 활성 또는 기능을 조절, 변형 또는 제어할 수 있다. 일부 측면에서, 키메라 수용체는 함께 기능성 키메라 수용체를 포함하는 두 개의 폴리펩타이드를 포함하는 이중 사슬 수용체이다. . 일부 측면에서, 다중 사슬 수용체는 수용체의 특이성, 활성, 항원(또는 리간드) 결합, 기능 및/또는 발현의 공간적 또는 시간적 조절 또는 제어를 허용할 수 있다. 상기 구현예의 일부에서, 변형된 CD247 유전자 자리에서 핵산 서열에 의해 암호화된 키메라 수용체 폴리펩타이드 사슬은 CD3제타(CD3ζ) 사슬 또는 이의 단편을 포함하는 세포내 영역을 포함하는 키메라 수용체 폴리펩타이드 사슬이다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 유전자 조작된 세포에서 암호화된 키메라 수용체는 막관통 도메인 도는 막 회합 도메인(membrane association domain)을 함유한다. 일부 측면에서, 키메라 수용체는 또한 세포외 영역을 함유한다. 일부 측면에서, 키메라 수용체는 또한 세포내 영역을 함유한다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 유전자 조작된 세포에서 암호화된 키메라 수용체는 일반적으로 세포외 영역(예를 들어, 하나 이상의 세포외 결합 도메인(들) 및/또는 스페이서들을 함유), 막관통 도메인 및 세포내 영역(예를 들어, 세포내 신호 전달 영역 및/또는 하나 이상의 공자극 신호 전달 도메인을 함유) 중 하나 이상과 같은 다양한 영역 또는 도메인을 함유한다. 일부 경우에, 스페이서는 세포외 영역(예를 들어, 세포외 결합 도메인) 및 막관통 도메인 사이를 분리하거나 이 사이에 위치한다. 일부 측면에서, 암호화된 키메라 수용체는 다량체화 도메인과 같은 다른 도메인, 링커 및/또는 조절 요소를 더 함유한다.
일부 구현예에서, 조작된 세포로부터 발현된 예시적인 키메라 수용체는, 일부 경우에 상이한 성분, 도메인 또는 영역을 함유하는 둘 이상의 수용체 폴리펩타이드를 함유하는 다중 사슬 수용체를 포함한다. 일부 측면에서, 키메라 수용체는 함께 기능성 키메라 수용체를 포함하는 둘 이상의 폴리펩타이드를 함유한다. 일부 측면에서, 다중 사슬 수용체는 함께 기능성 키메라 수용체를 포함하는 두 개의 폴리펩타이드를 포함하는 이중 사슬 수용체이다. 일부 구현예에서, 키메라 수용체는 하나 이상의 폴리펩타이드가 다른 수용체 폴리펩타이드의 발현, 활성 또는 기능을 조절, 변형 또는 제어하는 다중 사슬 수용체이다. 일부 측면에서, 다중 사슬 수용체는 수용체의 특이성, 활성, 항원(또는 리간드) 결합, 기능 및/또는 발현의 공간적 또는 시간적 조절 또는 제어를 허용한다.
일부 구현예에서, 암호화된 키메라 수용체는 CAR과 같은 키메라 수용체이다. 예시적인 암호화된 CAR 서열은 세포외 결합 도메인, 스페이서, 막관통 도메인 및 1차 신호 전달 도메인 또는 영역 및 하나 이상의 공자극 신호 전달 도메인을 포함하는 세포내 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 예시적인 암호화된 CAR 서열은 세포외 결합 도메인, 스페이서, 막관통 도메인 및 하나 이상의 공자극 신호 전달 도메인과 1차 신호 전달 도메인 또는 영역을 포함한다.
일부 구현예에서, 예시적인 암호화된 키메라 수용체는 N 말단부터 C 말단까지 순서대로: 막관통 도메인(또는 막 회합 도메인) 및 CD3ζ 사슬 또는 이의 단편을 포함하는 세포내 영역을 포함하고, 여기서 키메라 수용체를 암호화하는 핵산 서열이 변형된 CD247 유전자 자리에 존재한다. 일부 구현예에서, 세포내 영역의 적어도 일부는 내인성 CD247 유전자 자리의 개방형 해독틀 또는 이의 부분 서열에 의해 암호화된 CD3ζ제타(CD3ζ) 사슬 또는 이의 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, 예시적인 암호화된 키메라 수용체는 N 말단부터 C 말단까지 순서대로: 세포외 영역, 막관통 도메인 및 CD3ζ 사슬 또는 이의 단편을 포함하는 세포내 영역을 포함한다.
일부 구현예에서, 예시적인 암호화된 키메라 수용체는 N 말단부터 C 말단까지 순서대로: 신호 펩타이드, 세포외 결합 도메인, 스페이서, 막관통 도메인 및 CD3ζ 사슬 또는 이의 단편을 포함하는 세포내 영역을 포함하고, 여기서 키메라 수용체를 암호화하는 핵산 서열이 변형된 CD247 유전자 자리에 존재한다. 일부 구현예에서, 세포내 영역의 적어도 일부는 내인성 CD247 유전자 자리의 개방형 해독틀 또는 이의 부분 서열에 의해 암호화된 CD3ζ제타(CD3ζ) 사슬 또는 이의 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, 예시적인 암호화된 키메라 수용체는 N 말단부터 C 말단까지 순서대로: 신호 펩타이드, 세포외 결합 도메인, 스페이서, 막관통 도메인 및 공자극 신호 전달 도메인 및 CD3ζ 사슬 또는 이의 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, 예시적인 암호화된 키메라 수용체는 N 말단부터 C 말단까지 순서대로: 신호 펩타이드, 세포외 결합 도메인, 스페이서, 막관통 도메인 및 2개의 공자극 신호 전달 도메인 및 CD3ζ 사슬 또는 이의 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, 예시적인 암호화된 키메라 수용체는 N 말단부터 C 말단까지 순서대로: 신호 펩타이드, 세포외 결합 도메인, 스페이서, 막관통 도메인 및 3개의 공자극 신호 전달 도메인 및 CD3ζ 사슬 또는 이의 단편을 포함한다.
일부 구현예에서, 예시적인 암호화된 키메라 수용체는 N 말단부터 C 말단까지 순서대로: 막관통 도메인(또는 막 회합 도메인), 세포내 다량체화 도메인, 선택적으로 하나 이상의 공자극 신호 전달 도메인, 및 CD3ζ 사슬 또는 이의 단편을 포함하고, 여기서 키메라 수용체를 암호화하는 핵산 서열이 변형된 CD247 유전자 자리에 존재한다. 일부 구현예에서, 세포내 영역의 적어도 일부는 내인성 CD247 유전자 자리의 개방형 해독틀 또는 이의 부분 서열에 의해 암호화된 CD3ζ제타(CD3ζ) 사슬 또는 이의 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, 예시적인 암호화된 키메라 수용체는 N 말단부터 C 말단까지 순서대로:, 세포외 다량체화 도메인, 막관통 도메인, 선택적으로 하나 이상의 공자극 신호 전달 도메인, 및 CD3ζ 사슬 또는 이의 단편을 포함한다.
일부 구현예에서, 예시적인 암호화된 CAR 서열은 순서대로: 세포외 결합 도메인, 선택적으로 scFv; 선택적으로 인간 면역글로불린 힌지의, 선택적으로 IgG1, IgG2 또는 IgG4 또는 이의 변형된 버전의 서열을 포함하고, 선택적으로 CH2 영역 및/또는 CH3 영역을 더 포함하는, 스페이서; 선택적으로 인간 CD28의, 막관통 도메인; 선택적으로 인간 4-1BB의, 공자극 신호 전달 도메인을 포함하는 세포내 영역; 및 1차 신호 전달 도메인 또는 영역, 예컨대 CD3제타 사슬의 세포내 신호 전달 영역;을 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 키메라 수용체의 암호화된 세포내 영역은 N 말단에서 C 말단까지 순서대로: 하나 이상의 공자극 신호 전달 도메인(들) 및 예컨대 CD3제타 사슬 또는 이의 단편을 함유하는 1차 신호 전달 도메인 또는 영역을 포함한다.
1. 키메라 항원 수용체(CAR)
일부 구현예에서, 변형된 CD247 유전자 자리에 의해 암호화된 키메라 수용체는 키메라 항원 수용체(CAR)이다. 일부 구현예에서, T 세포와 같은 조작된 세포는 특정 세포 유형의 표면 상에 발현된 항원과 같은 특정 항원(또는 표지자 또는 리간드)에 대한 특이성을 갖는 CAR과 같은 키메라 수용체를 발현한다. 일부 측면에서, 다중 사슬 또는 조절 가능 CAR을 포함하여 본원에 기술된 임의의 CAR의 적어도 일부는 전이 유전자 서열에서 암호화된다. 일부 측면에서, 본원에 기술된 CAR 또는 이의 일부를 암호화하는 전이 유전자 서열은 섹션 I.B.2에 기술된 임의의 것일 수 있다. 일부 측면에서, HDR을 통한 전이 유전자 서열의 통합 시, 생성되는 변형된 CD247 유전자 자리는 다중 사슬 또는 조절 가능 CAR을 포함하여 본원에 기술된 임의의 CAR과 같은 CAR을 암호화하는 핵산 서열을 함유한다.
일부 구현예에서, 변형된 CD247 유전자 자리에 의해 암호화된 키메라 수용체(예를 들어, CAR)는 세포외 영역(예를 들어, 하나 이상의 세포외 결합 도메인(들) 및/또는 스페이서들을 함유), 막관통 도메인 및/또는 세포내 영역(예를 들어, 1차 신호 전달 영역 또는 도메인 및/또는 하나 이상의 공자극 신호 전달 도메인을 함유) 중 하나 이상을 함유한다. 일부 측면에서, 암호화된 키메라 수용체는 다량체화 도메인과 같은 다른 도메인을 더 함유한다. 일부 측면에서, 변형된 CD247 유전자 자리는 링커 및/또는 조절 요소를 암호화하는 서열을 함유한다. 일부 구현예에서, 암호화된 키메라 수용체는 N 말단에서 C 말단까지 순서대로: 세포외 결합 도메인, 막관통 도메인 및 예를 들어 1차 신호 전달 영역 또는 도메인 또는 이의 일부 및/또는 공자극 신호 전달 도메인을 포함하는 세포내 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 암호화된 키메라 수용체는 N 말단에서 C 말단까지 순서대로: 세포외 결합 도메인, 스페이서, 막관통 도메인 및 예를 들어 1차 신호 전달 영역 또는 도메인 또는 이의 일부 및/또는 공자극 신호 전달 도메인을 포함하는 세포내 영역을 포함한다.
일부 구현예에서, 변형된 CD247 유전자 자리에 의해 암호화된 키메라 수용체(예를 들어, CAR)는 세포외 영역(예를 들어, 하나 이상의 세포외 결합 도메인(들) 및/또는 스페이서들을 함유), 막관통 도메인 및/또는 세포내 영역(예를 들어, CD3제타(CD3ζ) 사슬 또는 이의 단편(예컨대, CD3ζ 사슬의 세포외 영역) 및/또는 하나 이상의 공자극 신호 전달 도메인을 함유) 중 하나 이상을 함유한다. 일부 구현예에서, 키메라 수용체는 키메라 수용체의 C-말단에, CD3제타(CD3ζ) 사슬 또는 이의 단편을 포함하는 세포내 영역을 포함한다. 일부 측면에서, 암호화된 키메라 수용체는 다량체화 도메인과 같은 다른 도메인을 더 함유한다. 일부 측면에서, 변형된 CD247 유전자 자리는 링커 및/또는 조절 요소를 암호화하는 서열을 함유한다. 일부 구현예에서, 암호화된 키메라 수용체는 N 말단부터 C 말단까지 순서대로: 세포외 결합 도메인, 스페이서, 막관통 도메인 및 예를 들어 CD3제타(CD3ζ) 사슬 또는 이의 단편을 포함하는 세포내 영역을 포함한다.
a. 결합 도메인
일부 구현예에서, 암호화된 키메라 수용체의 세포외 영역은 결합 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 결합 도메인은 세포외 결합 도메인이다. 일부 구현예에서, 결합 도메인은 폴리펩타이드, 리간드, 수용체, 리간드-결합 도메인, 수용체-결합 도메인, 항원, 에피토프, 항체, 항원-결합 도메인, 에피토프-결합 도메인, 항체-결합 도메인, 태그-결합 도메인 또는 전술한 임의의 것의 단편이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 결합 도메인은 리간드- 또는 항원-결합 도메인이다.
일부 측면에서, 리간드-(예를 들어, 항원-)결합 영역 또는 도메인(들)과 같은 세포외 결합 도메인 및 세포내 영역 또는 도메인(들)은 하나 이상의 링커 및/또는 막관통 도메인(들)을 통해 연계 또는 연결된다. 일부 구현예에서, 키메라 항원 수용체는 세포외 영역과 세포내 영역 사이에 배치된 막관통 도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, 항원, 예를 들어 키메라 수용체의 결합 도메인에 결합하는 항원은 폴리펩타이드이다. 일부 구현예에서, 항원은 탄수화물 또는 다른 분자이다. 일부 구현예에서, 항원은 예를 들어 건강한 세포 또는 조직 내 정상 또는 비-표적화 세포 또는 조직과 비교하여 질병, 장애 또는 병태의 세포 상에서, 예를 들어 종양 또는 병원성 세포 상에서 선택적으로 발현되거나 과발현된다. 일부 구현예에서, 질병, 장애 또는 병태는 감염 질병 또는 장애,자가 면역 질환, 염증성 질환 또는 종양 또는 암이다. 일부 구현예에서, 항원은 정상 세포 상에서 발현되고/거나 조작된 세포 상에서 발현된다. 일부 측면에서, 키메라 수용체(예를 들어, CAR)는 세포외 리간드-(예를 들어, 항원)결합 영역 또는 도메인, 예를 들어 본원에 기술된 임의의 항체 또는 단편, 및 세포내 영역에서 선택된 하나 이상의 영역 또는 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 리간드-(예를 들어, 항원-)결합 영역 또는 도메인은 scFv 또는 단일-도메인 VH 항체이거나 이를 포함하고 세포내 영역은 CD3-제타(CD3ζ) 사슬 또는 이의 단편을 포함하는 세포내 신호 전달 영역 또는 도메인을 포함한다.
CAR을 포함하는 예시적 암호화된 키메라 수용체는 예를 들어 문헌[국제 특허 출원 공개 번호 WO2000/14257, WO2013/126726, WO2012/129514, WO2014/031687, WO2013/166321, WO2013/071154, WO2013/123061, 미국 특허 출원 공개 번호 US2002131960, US2013287748, US20130149337, 미국 특허 번호 6,451,995, 7,446,190, 8,252,592, 8,339,645, 8,398,282, 7,446,179, 6,410,319, 7,070,995, 7,265,209, 7,354,762, 7,446,191, 8,324,353, 및 8,479,118 및 유럽 특허 출원 번호 EP2537416]에 기재된 것들 및/또는 문헌[Sadelain et al., Cancer Discov. 2013 April; 3(4): 388-398; Davila et al. (2013) PLoS ONE 8(4): e61338; Turtle et al., Curr. Opin. Immunol., 2012 October; 24(5): 633-39; and Wu et al., Cancer, 2012 March 18(2): 160-75]에 기재된 것들을 포함한다. 일부 측면에서, 항원 수용체는 문헌[미국 특허 번호 7,446,190]에 기재된 바와 같은 CAR 및 문헌[국제 특허 출원 공개 번호 WO 2014/055668]에 기재된 것들을 포함한다. CAR의 예로는 전술한 참조문헌 중 어느 하나, 예컨대 문헌[WO2014/031687, US 8,339,645, US 7,446,179, US 2013/0149337, US 7,446,190, US 8,389,282, Kochenderfer et al., 2013, Nature Reviews Clinical Oncology, 10, 267-276 (2013); Wang et al. (2012) J. Immunother. 35(9): 689-701; 및 Brentjens et al., Sci Transl Med. 2013 5(177)]에 개시된 바와 같은 CAR이 포함된다.
일부 구현예에서, 암호화된 키메라 수용체(예를 들어, 항원 수용체)는 예를 들어 항원, 리간드 및/또는 표지자에 특이적으로 결합하는 항원- 또는 리간드-결합 도메인과 같은 세포외 결합 도메인을 함유한다. 항원 수용체 중에는 키메라 항원 수용체(CAR)와 같은 기능성 비-TCR 항원 수용체가 있다. 일부 구현예에서, 항원 수용체는 항원에 특이적으로 결합하는 세포외 항원 인식 도메인을 함유하는 CAR이다. 일부 구현예에서, 입양 요법에 의해 표적화될 특정 세포 유형에서 발현되는 항원과 같은 특정 항원, 표지자 또는 리간드(예를 들어, 암 표지자) 및/또는 정상 또는 비질병 세포 유형 상에서 발현된 항원과 같은 감쇠 반응을 유도하도록 의도된 항원에 대한 특이성을 갖는 CAR이 작제된다. 따라서, CAR은 통상적으로 하나 이상의 리간드-(예를 들어, 항원-)결합 분자, 예컨대 하나 이상의 항원 결합 단편, 도메인 또는 부분 또는 하나 이상의 항체 가변 도메인 및/또는 항체 분자를 세포외 부분에 포함한다. 일부 구현예에서, CAR은 단클론 항체(mAb), 또는 sdFv, 나노바디, VHH 및 VNAR과 같은 단일 도메인 항체(sdAb)의 가변 중쇄(VH) 및 가변 경쇄(VL)로부터 유래된 단일 사슬 항체 단편(scFv)과 같은 항체 분자의 항원 결합 부분 또는 부분들을 포함한다. 일부 구현예에서, 항원 결합 단편은 가요성 링커에 의해 연결되는 항체 가변 영역을 포함한다.
일부 구현예에서, 암호화된 CAR은 세포의 표면 상에 발현된 온전한(intact) 항원과 같은 항원 또는 리간드를 특이적으로 인식하는 항체 또는 항원 결합 단편(예를 들어 scFv)을 함유한다. 일부 구현예에서, 항원 또는 리간드는 세포의 표면 상에 발현된 단백질이다. 일부 구현예에서, 항원 또는 리간드는 폴리펩타이드이다. 일부 구현예에서, 이는 탄수화물 또는 다른 분자이다. 일부 구현예에서, 항원 또는 리간드는 정상 또는 비-표적화 세포 또는 조직과 비교하여 질병 또는 병태의 세포 상에서, 예를 들어 종양 또는 병원성 세포 상에서 선택적으로 발현되거나 과발현된다. 다른 구현예에서, 항원은 정상 세포 상에서 발현되고/거나 조작된 세포 상에서 발현된다.
일부 구현예에서, 키메라 수용체에 의해 표적화되는 항원 중에는 입양 세포 요법을 통해 표적화될 질병, 병태 또는 세포 유형의 맥락에서 발현되는 것들이 있다. 질병 및 병태 중에는 혈액성 악성 종양, 면역계 암, 예컨대 림프종, 백혈병 및/또는 골수종, 예컨대 B, T 및 골수성 백혈병, 림프종 및 다발성 골수종을 포함한 암 및 종양을 포함한 증식성, 신생물성 및 악성 질병 및 장애가 있다.
일부 구현예에서, 항원 또는 리간드는 종양 항원 또는 암 표지자이다. 일부 구현예에서, 질병 또는 장애와 관련된 항원은 αvβ6 인테그린(avb6 integrin), B 세포 성숙 항원(BCMA), B7-H3, B7-H6, 탄산 탈수 효소 9(CA9, CAIX 또는 G250으로도 공지), 암 고환 항원, 암/고환 항원 1B(CTAG, NY-ESO-1 및 LAGE-2로도 공지), 암배아 항원(CEA), 사이클린, 사이클린 A2, C-C 모티프 케모카인 리간드 1(CCL-1), CD19, CD20, CD22, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD123, CD133, CD138, CD171, 콘드로이틴 황산염 프로테오글리칸 4(chondroitin sulfate proteoglycan 4, CSPG4), 표피 성장 인자 단백질(EGFR), 타입 III 표피 성장 인자 수용체 돌연변이(EGFR vIII), 상피 당단백질 2(EPG-2), 상피 당단백질 40(EPG-40), 에프린B2, 에프린 수용체 A2(EPHa2), 에스트로겐 수용체, Fc 수용체 유사 5(FCRL5; Fc 수용체 동족체 5 또는 FCRH5로도 공지), 태아 아세틸콜린 수용체(태아 AchR), 엽산 결합 단백질(FBP), 엽산 수용체 알파, 강글리오사이드 GD2, O-아세틸화 GD2(OGD2), 강글리오사이드 GD3, 당단백질 100(gp100), 글리피칸-3(GPC3), G 단백질 결합 수용체 C 클래스 5 그룹 D 멤버(GPRC5D), Her2/neu(수용체 티로신 키나아제 erb-B2), Her3(erb-B3), Her4(erb-B4), erbB 이량체, 인간 고분자량 흑색종 관련 항원(HMW-MAA), B형 간염 표면 항원, 인간 백혈구 항원 A1(HLA-A1), 인간 백혈구 항원 A2(HLA-A2), IL-22 수용체 알파(IL-22Rα), IL-13 수용체 알파 2(IL-13Rα2), 키나아제 삽입 도메인 수용체(kinase insert domain receptor, kdr), 카파 경쇄, L1 세포 부착 분자(L1-CAM), L1-CAM의 CE7 에피토프, 패밀리 8 A 멤버를 함유하는 류신 풍부 반복(Leucine Rich Repeat Containing 8 Family Member A, LRRC8A), 루이스 Y, 흑색종 관련 항원(MAGE)-A1, MAGE-A3, MAGE-A6, MAGE-A10, 메소텔린(MSLN), c-Met, 뮤린 시토메갈로 바이러스(CMV), 뮤신 1(MUC1), MUC16, 자연 살생 2 그룹 D 멤버(NKG2D) 리간드, 멜란 A (MART-1), 신경 세포 부착 분자(NCAM), 종양태아성 항원, 흑색종 우선 발현 항원(PRAME), 프로게스테론 수용체, 전립선 특이적 항원, 전립선 줄기 세포 항원(PSCA), 전립선 특이적 막 항원(PSMA), 수용체 티로신 키나아제 유사 희귀 수용체 1(ROR1), 서바이빈(survivin), 영양막 당단백질(TPBG, 5T4로도 공지), 종양 관련 당단백질 72(TAG72), 티로시나아제 관련 단백질 1(TRP1, TYRP1 또는 gp75로도 공지), 티로시나아제 관련 단백질 2(TRP2, 도파크롬 타우토메라제, 도파크롬 델타 이성화 효소 또는 DCT로도 공지), 혈관 내피 성장 인자 수용체 2(VEGFR2), 빌름스 종양 1(WT-1), 병원체 특이적 또는 병원체 발현 항원 또는 보편적 표지(universal tag) 관련 항원 및/또는 비오티닐화 분자 및/또는 HIV, HCV, HBV 또는 다른 병원체에 의해 발현된 분자이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 수용체에 의해 표적화되는 항원은 다수의 공지된 B 세포 표지자 중 어느 하나와 같은 B 세포 악성 종양과 연관된 항원을 포함한다. 일부 구현예에서, 항원은 CD20, CD19, CD22, ROR1, CD45, CD21, CD5, CD33, Ig카파, Ig람다, CD79a, CD79b 또는 CD30이거나 이를 포함한다.
일부 구현예에서, 항원은 병원체 특이적 또는 병원체 발현 항원이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 항원은 바이러스 항원(예컨대 HIV, HCV, HBV 등으로부터 유래된 바이러스 항원), 세균 항원 및/또는 기생 항원이다.
일부 구현예에서, 항체 또는 항원 결합 단편(예를 들어, scFv 또는 VH 도메인)은 CD19와 같은 항원을 특이적으로 인식한다. 일부 구현예에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 CD19에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편으로부터 유래하거나 이의 변이체이다.
일부 구현예에서, 항원은 CD19이다. 일부 구현예에서, scFv는 CD19에 특이적인 항체 또는 항체 단편으로부터 유래된 VH 및 VL을 함유한다. 일부 구현예에서, CD19에 결합하는 항체 또는 항체 단편은 FMC63 및 SJ25C1과 같은 마우스 유래 항체이다. 일부 구현예에서, 항체 또는 항체 단편은 예를 들어, 문헌[미국 특허 공개 번호 US 2016/0152723]에 기재된 바와 같은 인간 항체이다.
일부 구현예에서, scFv는 FMC63으로부터 유래된다.　 FMC63은 일반적으로 인간 기원의 CD19를 발현하는 Nalm-1 및 -16 세포에 대하여 발생된 마우스 단클론성 IgG1 항체를 지칭한다(Ling, N. R., et al. (1987). Leucocyte typing III. 302).　 일부 구현예에서, FMC63 항체는 서열 번호: 38 및 39에 각각 제시된 CDR-H1 및 CDR-H2 및 서열 번호: 40 또는 54에 제시된 CDR-H3 및 서열 번호: 35에 제시된 CDR-L1 및 서열 번호: 36 또는 55에 제시된 CDR-L2 및 서열 번호: 37 또는 56에 제시된 CDR-L3을 포함한다.　 일부 구현예에서, FMC63 항체는 서열 번호: 41의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 서열 번호: 42의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함한다.
일부 구현예에서, scFv는 서열 번호: 35의 CDR-L1 서열, 서열 번호: 36의 CDR-L2 서열, 서열 번호: 37의 CDR-L3 서열을 함유하는 가변 경쇄 및/또는 서열 번호: 38의 CDR-H1 서열, 서열 번호: 39의 CDR-H2 서열, 및 서열 번호: 40의 CDR-H3 서열을 함유하는 가변 중쇄를 포함한다.　 일부 구현예에서, scFv는 서열 번호: 41에 제시된 가변 중쇄 영역 및 서열 번호: 42에 제시된 가변 경쇄 영역을 포함한다.　 일부 구현예에서, 가변 중쇄 및 가변 경쇄는 링커에 의해 연결된다.　 일부 구현예에서, 링커는 서열 번호: 58에 제시된다.　 일부 구현예에서, scFv는 VH, 링커 및 VL을 순서대로 포함한다.　 일부 구현예에서, scFv는 VL, 링커 및 VH를 순서대로 포함한다.　 일부 구현예에서, scFv는 서열 번호: 57에 제시된 뉴클레오타이드 서열 또는 서열 번호: 57에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 나타내는 서열에 의해 암호화된다.　 일부 구현예에서, scFv는 서열 번호: 43에 제시된 아미노산 서열 또는 서열 번호: 43에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 나타내는 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, scFv는 SJ25C1로부터 유래된다.　 SJ25C1은 인간 기원의 CD19를 발현하는 Nalm-1 및 -16 세포에 대하여 발생된 마우스 단클론성 IgG1 항체이다(Ling, N. R., et al. (1987). Leucocyte typing III. 302).　 일부 구현예에서, SJ25C1 항체는 서열 번호: 47-49에 각각 제시된 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3 서열 및 서열 번호: 44-46에 각각 제시된 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3 서열을 포함한다.　 일부 구현예에서, SJ25C1 항체는 서열 번호: 50의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 서열 번호: 51의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함한다.
일부 구현예에서, scFv는 서열 번호: 44의 CDR-L1 서열, 서열 번호: 45의 CDR-L2 서열, 서열 번호: 46의 CDR-L3 서열을 함유하는 가변 경쇄 및/또는 서열 번호: 47의 CDR-H1 서열, 서열 번호: 48의 CDR-H2 서열, 및 서열 번호: 49의 CDR-H3 서열을 함유하는 가변 중쇄를 포함한다.　 일부 구현예에서, scFv는 서열 번호: 50에 제시된 가변 중쇄 영역 및 서열 번호: 51에 제시된 가변 경쇄 영역을 포함한다.　 일부 구현예에서, 가변 중쇄 및 가변 경쇄는 링커에 의해 연결된다.　 일부 구현예에서, 링커는 서열 번호: 52에 제시된다.　 일부 구현예에서, scFv는 VH, 링커 및 VL을 순서대로 포함한다.　 일부 구현예에서, scFv는 VL, 링커 및 VH를 순서대로 포함한다.　 일부 구현예에서, scFv는 서열 번호: 53에 제시된 아미노산 서열 또는 서열 번호: 53에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 나타내는 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 항원은 CD20이다. 일부 구현예에서, scFv는 CD20에 특이적인 항체 또는 항체 단편으로부터 유래된 VH 및 VL을 함유한다. 일부 구현예에서, CD20에 결합하는 항체 또는 항체 단편은 리툭시맙이거나 이로부터 유래된 리툭시맙 scFv와 같은 항체이다.
일부 구현예에서, 항원은 CD22이다. 일부 구현예에서, scFv는 CD22에 특이적인 항체 또는 항체 단편으로부터 유래된 VH 및 VL을 함유한다. 일부 구현예에서, CD22에 결합하는 항체 또는 항체 단편은 m971이거나 이로부터 유래된 m971 scFv와 같은 항체이다.
일부 구현예에서, 항원은 BCMA이다. 일부 구현예에서, scFv는 BCMA에 특이적인 항체 또는 항체 단편으로부터 유래된 VH 및 VL을 함유한다. 일부 구현예에서, BCMA에 결합하는 항체 또는 항체 단편은 문헌[국제 특허 출원 공개 번호 WO 2016/090327 및 WO 2016/090320]에 제시된 항체 또는 항체 단편으로부터의 VH 및 VL이거나 이를 함유한다.
일부 구현예에서, 항원은 GPRC5D이다. 일부 구현예에서, scFv는 GPRC5D에 특이적인 항체 또는 항체 단편으로부터 유래된 VH 및 VL을 함유한다. 일부 구현예에서, GPRC5D에 결합하는 항체 또는 항체 단편은 문헌[국제 특허 출원 공개 번호 WO 2016/090329 및 WO 2016/090312]에 제시된 항체 또는 항체 단편으로부터의 VH 및 VL이거나 이를 함유한다.
일부 측면에서, 암호화된 CAR은 예를 들어 보편적 표지 또는 보편적 에피토프에 결합하거나 이를 인식하는, 예를 들어 이에 특이적으로 결합하는 리간드-(예를 들어, 항원-)결합 도메인을 함유한다. 일부 측면에서, 결합 도메인은 질병 또는 장애와 관련된 항원을 인식하는 상이한 결합 분자(예를 들어, 항체 또는 항원 결합 단편)에 연결될 수 있는 분자, 표지, 폴리펩타이드 및/또는 에피토프에 결합할 수 있다. 예시적인 표지 또는 에피토프는 염료(예를 들어, 플루오레세인 이소티오시아네이트) 또는 비오틴을 포함한다. 일부 측면에서, 표지에 연결된 결합 분자(예를 들어, 항체 또는 항원 결합 단편)는 이 표지에 특이적인 CAR을 발현하는 조작된 세포로 질병 또는 장애(예를 들어, 종양 항원)을 인식하여 조작된 세포의 세포 독성 또는 다른 효과기 기능을 달성한다. 일부 측면에서, 질병 또는 장애와 관련된 항원에 대한 CAR의 특이성은 표지된 결합 분자(예를 들어, 항체)에 의해 제공되고, 상이한 항원을 표적화하는 데는 상이하게 표지된 결합 분자가 사용될 수 있다. 보편적 표지 또는 보편적 에피토프에 특이적인 예시적인 CAR은 예를 들어 문헌[U.S. 9,233,125, WO 2016/030414, Urbanska et al., (2012) Cancer Res 72: 1844-1852, 및 Tamada et al., (2012) Clin Cancer Res 18:6436-6445]에 기술된 것들을 포함한다.
일부 구현예에서, 암호화된 CAR은 주요 조직적합성 복합체(MHC)-펩타이드 복합체로서 세포 표면 상에 제시된 종양 관련 항원과 같은 세포내 항원을 특이적으로 인식하는 항체 또는 항원 결합 단편(예를 들어 scFv)과 같은 TCR 유사 항체를 함유한다. 일부 구현예에서, MHC-펩타이드 복합체를 인식하는 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 항원 수용체와 같은 키메라 수용체의 일부로 세포 상에서 발현될 수 있다. 항원 수용체 중에는 키메라 항원 수용체(CAR)와 같은 기능성 비-T 세포 수용체(TCR) 항원 수용체가 있다. 일부 구현예에서, 펩타이드 MHC 복합체를 겨냥하여 TCR 유사 특이성을 나타내는 항체 또는 항원 결합 단편을 함유하는 CAR은 또한 TCR 유사 CAR로 지칭될 수 있다. 일부 구현예에서, CAR은 TCR 유사 CAR이고 항원은 TCR과 마찬가지로 MHC 분자의 맥락에서 세포 표면 상에서 인식되는 세포내 단백질의 펩타이드 항원과 같은 가공된 펩타이드 항원이다. 일부 구현예에서, TCR 유사 CAR의 MHC-펩타이드 복합체에 특이적인 세포외 항원 결합 도메인은 일부 측면에서 링커 및/또는 막관통 도메인(들)을 통해 하나 이상의 세포내 신호 전달 성분에 연결된다. 일부 구현예에서, 상기 분자는 통상적으로 TCR과 같은 천연 항원 수용체를 통한 신호 및 선택적으로 공자극 수용체와 조합하여 상기 수용체를 통한 신호를 모방하거나 이와 유사할 수 있다.
일부 구현예에서, 주요 조직적합성 복합체(major histocompatibility complex, MHC)는 일부 경우에, 세포 기작에 의해 가공된 펩타이드 항원을 포함하여 폴리펩타이드의 펩타이드 항원과 복합체를 형성할 수 있는 다형성 펩타이드 결합 부위 또는 결합 고랑(groove)을 함유하는 단백질, 일반적으로 당단백질을 포함한다. 일부 경우에, MHC 분자는 TCR 또는 TCR 유사 항체와 같은 T 세포 상의 항원 수용체에 의해 인식 가능한 형태로 항원 제시를 위해 펩타이드와의 복합체로, 즉 MHC-펩타이드 복합체를 포함하여 세포 표면 상에 표시되거나 발현될 수 있다. 일반적으로, MHC 클래스 I 분자는 일부 경우에, 3개의 α 도메인 및 비공유 결합된 β2 마이크로글로불린을 갖는, 막에 걸쳐있는 α 사슬을 갖는 이종이량체이다. 일반적으로 MHC 클래스 II 분자는 두 개의 막관통 당단백질, α 및 β로 구성되며, 둘 다 전형적으로 막에 걸쳐 있다. MHC 분자는 항원 결합 부위 또는 펩타이드에 결합하기 위한 부위 및 적절한 항원 수용체에 의한 인식에 필요한 서열을 함유하는 MHC의 유효 부분을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, MHC 클래스 I 분자는 시토솔에서 기원한 펩타이드를 세포 표면으로 전달하고, 여기서 MHC-펩타이드 복합체는 일반적으로 CD8+ T 세포와 같은, 일부 경우에는 CD4+ T 세포와 같은 T 세포에 의해 인식된다. 일부 구현예에서, MHC 클래스 II 분자는 소포성 계(vesicular system)에서 기원한 펩타이드를 세포 표면으로 전달하며, 이는 전형적으로 CD4+ T 세포에 의해 인식된다. 일반적으로, MHC 분자는 인간에서 인간 백혈구 항원(human leukocyte antigen, HLA) 및 마우스에서 H-2라고 통칭되는 연관된 유전자 자리(loci) 그룹에 의해 암호화된다. 따라서, 전형적으로 인간 MHC는 인간 백혈구 항원(HLA)으로도 지칭될 수 있다.
용어 “MHC-펩타이드 복합체(MHC-peptide complex)” 또는 “펩타이드-MHC 복합체(peptide-MHC complex)” 또는 이의 변형은 예컨대 일반적으로 MHC 분자의 결합 고랑(groove) 또는 틈에서 펩타이드의 비공유 상호작용에 의한 펩타이드 항원 및 MHC 분자의 복합체 또는 회합을 지칭한다. 일부 구현예에서, MHC-펩타이드 복합체는 세포의 표면 상에 존재하거나 표시된다. 일부 구현예에서, MHC-펩타이드 복합체는 TCR, TCR 유사 CAR 또는 이의 항원 결합 부분과 같은 항원 수용체에 의해 특이적으로 인식될 수 있다.
일부 구현예에서, 폴리펩타이드의 펩타이드 항원 또는 에피토프와 같은 펩타이드는 예컨대 항원 수용체에 의한 인식을 위해 MHC 분자와 회합할 수 있다. 일반적으로, 펩타이드는 폴리펩타이드 또는 단백질과 같은 보다 긴 생물학적 분자의 단편으로부터 유래되거나 이를 기초로 한다. 일부 구현예에서, 펩타이드는 전형적으로 약 8 내지 약 24개의 아미노산 길이이다. 일부 구현예에서, 펩타이드는 MHC 클래스 II 복합체에서 인식을 위해 (약) 9 내지 22개의 아미노산 길이를 갖는다. 일부 구현예에서, 펩타이드는 MHC 클래스 I 복합체에서 인식을 위해 (약) 8 내지 13개의 아미노산 길이를 갖는다. 일부 구현예에서, MHC-펩타이드 복합체와 같은 MHC 분자의 맥락에서 펩타이드 인식 시, TCR 또는 TCR 유사 CAR과 같은 항원 수용체는 T 세포 반응, 예컨대 T 세포 증식, 사이토카인 생성, 세포 독성 T 세포 반응 또는 다른 반응을 유도하는 T 세포에 대한 활성화 신호를 생성하거나 유발시킨다.
일부 구현예에서, TCR 유사 항체 또는 항원 결합 부분은 공지되어 있거나, 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다(예를 들어 문헌[미국 특허 출원 공개 번호 US 2002/0150914; US 2003/0223994; US 2004/0191260; US 2006/0034850; US 2007/00992530; US20090226474; US20090304679; 및 국제 출원 공개 번호 WO 03/068201] 참조).
일부 구현예에서, MHC-펩타이드 복합체에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 특이적인 MHC-펩타이드 복합체를 함유하는 유효량의 면역원으로 숙주를 면역화함으로써 생산될 수 있다. 일부 경우에, MHC-펩타이드 복합체의 펩타이드는 종양 항원, 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 범용 종양 항원, 골수종 항원 또는 기타 항원과 같이 MHC에 결합할 수 있는 항원의 에피토프이다. 일부 구현예에서, 이어서 유효량의 면역원이 면역 반응을 유발하기 위해 숙주에 투여되고, 여기서 면역원은 MHC 분자의 결합 고랑에서 펩타이드의 3차원 제시에 대하여 면역 반응을 유발하기에 충분한 기간 동안 이의 3차원 형태를 유지한다. 이어서 숙주로부터 수집된 혈청을 분석하여 MHC 분자의 결합 고랑에서 펩타이드의 3차원 제시를 인식하는 원하는 항체가 생성되고 있는지 여부를 결정한다. 일부 구현예에서, 생성된 항체를 분석하여 상기 항체가 MHC-펩타이드 복합체와 MHC 분자 단독, 관심 펩타이드 단독 및 MHC 및 무관한 펩타이드의 복합체를 구별할 수 있는지 확인할 수 있다. 이어서 원하는 항체를 단리할 수 있다.
일부 구현예에서, MHC-펩타이드 복합체에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 부분이 파지 항체 라이브러리와 같은 항체 라이브러리 디스플레이 방법을 사용하여 생성될 수 있다. 일부 구현예에서, 예를 들어 라이브러리의 멤버들이 CDR 또는 CDR들의 하나 이상의 잔기에서 돌연변이되는 돌연변이체 Fab, scFv 또는 기타 항체 형태의 파지 디스플레이 라이브러리가 생성될 수 있다. 예를 들어, 문헌[미국 출원 공개 번호 US20020150914, US20140294841; 및 Cohen CJ. et al. (2003) J Mol. Recogn. 16:324-332]을 참조한다.
본 명세서에서 용어 “항체(antibody)”는 가장 넓은 의미로 사용되며, 온전한 항체 및 기능성(항원-결합) 항체 단편을 포함하는 다클론성 및 단클론성 항체를 포함하며, 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 단편 항원 결합(Fab) 단편, F(ab’)2 단편, Fab’ 단편, Fv 단편, 재조합 IgG(rIgG) 단편, 가변 중쇄(VH) 영역, 단일 사슬 가변 단편(scFv)을 포함한 단일 사슬 항체 단편 및 단일 도메인 항체(예를 들어, sdAb, sdFv, 나노바디(nanobody), VHH 또는 VNAR) 또는 단편을 포함한다. 상기 용어는 유전자 조작된 및/또는 달리 변형된 형태의 면역글로불린, 예컨대 인트라바디(intrabodies), 펩티바디(peptibodies), 키메라 항체, 완전한 인간 항체, 인간화된 항체 및 이종 접합 항체, 다중특이성(예를 들어, 이중 특이성) 항체, 디아바디(diabodies), 트리아바디(triabodies) 및 테트라바디(tetrabodies), 탠덤 디-scFv, 탠덤 트리-scFv를 포괄한다. 달리 언급되지 않는 한, 용어 “항체”는 이의 기능성 항체 단편을 포괄하는 것으로 이해되어야 한다. 상기 용어는 또한 IgG 및 이의 하위 클래스, IgM, IgE, IgA 및 IgD를 포함하는 임의의 클래스 또는 하위 클래스의 항체를 포함하는 온전한 또는 전장 항체를 포괄한다. 일부 측면에서, CAR은 예를 들어 상이한 특이성을 갖는 2개의 항원 결합 도메인을 함유하는 이중특이성 CAR이다.
일부 구현예에서, 항원 결합 단백질, 항체 및 이의 항원 결합 단편은 전장 항체의 항원을 특이적으로 인식한다. 일부 구현예에서, 항체의 중쇄 및 경쇄는 전장일 수 있거나 또는 항원 결합 부분(Fab, F(ab’)2, Fv 또는 단일 사슬 Fv 단편(scFv))일 수 있다. 다른 구현예에서, 항체 중쇄 불변 영역은 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgD 및 IgE로부터 선택되고, 구체적으로 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4로부터 선택되고, 더 구체적으로, IgG1(예를 들어, 인간 IgG1)로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 항체 경쇄 불변 영역은 예를 들어, 카파 또는 람다, 특히 카파로부터 선택된다.
암호화된 키메라 수용체의 결합 도메인 중에는 항체 단편이 있다. “항체 단편(antibody fragment)”은 온전한 항체가 결합하는 항원에 결합하는 온전한 항체의 일부를 포함하는 온전한 항체 이외의 분자를 지칭한다. 항체 단편의 예는 Fv, Fab, Fab’, Fab’-SH, F(ab’)2; 디아바디; 선형 항체; 가변 중쇄(VH) 영역, scFv와 같은 단일 사슬 항체 분자 및 단일 도메인 VH 단일 항체; 및 항체 단편들로부터 형성된 다중특이성 항체를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 구체적인 구현예에서, 항체는 scFv와 같은, 가변 중쇄 영역 및/또는 가변 경쇄 영역을 포함하는 단일 사슬 항체 단편이다.
용어 “가변 영역(variable region)” 또는 “가변 도메인(variable domain)”은 항체가 항원에 결합하는 데 관여하는 항체의 중쇄 또는 경쇄의 도메인을 지칭한다. 천연 항체의 중쇄 및 경쇄(각각 VH 및 VL) 가변 도메인은 일반적으로 유사한 구조를 가지며, 각각의 도메인은 4개의 보존된 프레임워크 영역(framework region, FR) 및 3개의 CDR을 포함한다. (예를 들어, 문헌[Kindt et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007)]을 참조한다). 단일 VH 또는 VL 도메인은 항원 결합 특이성을 부여하기에 충분할 수 있다. 또한, 특정 항원에 결합하는 항체는 상보적 VL 또는 VH 도메인 라이브러리를 각각 선별하기 위해 항원에 결합하는 항체로부터의 VH 또는 VL 도메인을 사용하여 단리될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Portolano et al., J. Immunol. 150:880-887 (1993); Clarkson et al., Nature 352:624-628 (1991)]을 참조한다.
단일 도메인 항체(sdAb)는 항체의 중쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부 또는 경쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부를 포함하는 항체 단편이다. 특정 구현예에서, 단일 도메인 항체는 인간 단일 도메인 항체이다. 일부 구현예에서, CAR은 본원에 기술되거나 공지된 표적 항원 중 어느 하나와 같이, 종양 세포 또는 암세포와 같은 표적화될 세포 또는 질병의 암 표지자 또는 세포 표면 항원과 같은 항원에 특이적으로 결합하는 항체 중쇄 도메인을 포함한다. 예시적인 단일 도메인 항체는 sdFv, 나노바디, VHH 또는 VNAR을 포함한다.
항체 단편은 온전한 항체의 단백질 가수 분해 소화 및 재조합 숙주 세포에 의한 생산을 포함하나 이에 한정되지 않는 다양한 기술에 의해 제조될 수 있다. 일부 구현예에서, 항체는 합성 링커, 예를 들어 펩타이드 링커에 의해 연결된 둘 이상의 항체 영역 또는 사슬을 갖는 것과 같이 자연적으로 발생하지 않고/거나 자연적으로 발생하는 온전한 항체의 효소 소화에 의해 생성되지 않을 수 있는 배열을 포함하는 단편과 같은 재조합으로 생성된 단편이다. 일부 구현예에서, 항체 단편은 scFv이다.
“인간화된(humanized)” 항체는, 모든 또는 실질적으로 모든 CDR 아미노산 잔기가 비인간 CDR로부터 유래되고 모든 또는 실질적으로 모든 FR 아미노산 잔기가 인간 FR로부터 유래된, 항체이다. 인간화된 항체는 선택적으로 인간 항체로부터 유래된 항체 불변 영역의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 비인간 항체의 “인간화된 형태(humanized form)”는 모체 비인간 항체의 특이성 및 친화도를 유지하면서, 통상적으로 인간에 대한 면역원성을 감소시키기 위해 인간화를 거친 비인간 항체의 변이체를 지칭한다. 일부 구현예에서, 인간화된 항체의 일부 FR 잔기는 비인간 항체(예를 들어, CDR 잔기가 유래된 항체)의 해당 잔기로 치환되어 예를 들어, 항체 특이성 또는 친화도가 회복되거나 개선된다.
따라서, 일부 구현예에서, TCR 유사 CAR을 포함하는 암호화된 키메라 항원 수용체는 항체 또는 항체 단편을 함유하는 세포외 부분을 포함한다. 일부 구현예에서, 항체 또는 단편은 scFv를 포함한다. 일부 측면에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 복수의 항원 결합 단편 또는 분자 예컨대 라이브러리를 스크리닝하여, 예컨대 특이적 항원 또는 리간드에 결합하기 위한 scFv 라이브러리를 스크리닝하여 수득될 수 있다.
일부 구현예에서, 암호화된 CAR은 다중특이성 CAR이고, 예를 들어 복수의 상이한 항원에 결합 및/또는 이를 인식, 예를 들어 이에 특이적으로 결합할 수 있는 복수의 리간드-(예를 들어, 항원-)결합 도메인을 함유한다. 일부 측면에서, 암호화된 CAR은 예컨대 상이한 특이성을 갖는 2개의 항원 결합 도메인을 함유함으로써 예를 들어 2개의 항원을 표적화하는 이중특이성 CAR이다. 일부 구현예에서, CAR은 예를 들어 본원에 기술된 바와 같은 임의의 목록에 있는 항원, 예를 들어 CD19 및 CD22 또는 CD19 및 CD20에서 선택된, 표적 세포상의 상이한 표면 항원들에 결합하는 적어도 하나의 항원 결합 도메인을 함유하는 이중특이성 결합 도메인, 예를 들어 이중특이성 항체 또는 이의 단편을 함유한다. 일부 구현예에서, 자신의 에피토프 또는 항원의 각각에 대한 이중특이성 결합 도메인의 결합은 T 세포의 기능, 활성 및/또는 반응의 자극, 예를 들어 세포 독성 활성 및 후속적인 표적 세포의 용해의 자극을 초래할 수 있다. 상기 예시적인 이중특이성 결합 도메인 중에는 일부 경우에 예를 들어 가요성 링커를 통해 서로 융합되는, 탠덤 scFv 분자들; 탠덤 디아바디를 포함하는 디아바디 및 이의 유도체(Holliger et al, Prot Eng 9, 299-305 (1996); Kipriyanov et al, J Mol Biol 293, 41-66 (1999)); C-말단 이황화물 다리가 있는 디아바디 형식을 포함할 수 있는 이중 친화도 재표적화(DART) 분자; 가요성 링커에 의해 융합된 탠덤 scFv 분자를 함유하는, 이중특이성 T 세포 관여항체(BiTE) 분자(예를 들어, 문헌[Nagorsen and Bauerle, Exp Cell Res 317, 1255-1260 (2011)] 참조); 또는 전체 하이브리드 마우스/랫트 IgG 분자를 포함하는 트리오맙(Seimetz et al, Cancer Treat Rev 36, 458-467 (2010))이 포함될 수 있다. 이러한 임의의 결합 도메인은 본원에 기술된 임의의 CAR에 함유될 수 있다.
b. 스페이서 및 막관통 도메인
일부 측면에서, 암호화된 키메라 수용체, 예를 들어, 키메라 항원 수용체(CAR)는 항체 또는 이의 단편과 같은 하나 이상의 리간드-(예를 들어, 항원-)결합 도메인을 함유하는 세포외 부분, 및 하나 이상의 세포내 신호 전달 영역 또는 도메인(상호 교환적으로 세포질 신호 전달 도메인 또는 영역으로도 불림)을 포함한다. 일부 측면에서, 키메라 수용체(예를 들어, CAR)는 스페이서 및/또는 막관통 도메인 또는 부분을 더 포함한다. 일부 측면에서, 스페이서 및/또는 막관통 도메인은 리간드-(예를 들어, 항원-)결합 도메인을 함유하는 세포외 부분과 세포내 신호 전달 영역(들) 또는 도메인(들)을 연결할 수 있다.
일부 구현예에서, CAR과 같은 암호화된 키메라 수용체는, 면역글로불린 불변 영역 또는 이의 변이체 또는 변형된 버전, 예컨대 힌지 영역, 예를 들어 IgG4 힌지 영역 및/또는 CH1/CL 및/또는 Fc 영역의 적어도 일부이거나 이를 포함할 수 있는 스페이서를 더 포함한다. 일부 구현예에서, 키메라 수용체는 스페이서 및/또는 힌지 영역을 더 포함한다. 일부 구현예에서, 불변 영역 또는 부분은 IgG4, IgG2 또는 IgG1과 같은 인간 IgG의 것이다. 일부 측면에서, 불변 영역의 일부는 항원-인식 성분, 예를 들어, scFv와 막관통 도메인 사이에서 스페이서 영역으로 기능한다. 스페이서는 스페이서의 부재와 비교하여 항원 결합 후에 세포의 반응성 증가를 제공하는 길이의 것일 수 있다. 일부 예에서, 스페이서는 (약) 12개 아미노산 길이이거나 또는 12개 이내의 아미노산 길이이다. 예시적인 스페이서는 적어도 약 10 내지 229개 아미노산, 약 10 내지 200개 아미노산, 약 10 내지 175개 아미노산, 약 10 내지 150개 아미노산, 약 10 내지 125개 아미노산, 약 10 내지 100개 아미노산, 약 10 내지 75개 아미노산, 약 10 내지 50개 아미노산, 약 10 내지 40개 아미노산, 약 10 내지 30개 아미노산, 약 10 내지 20개 아미노산, 또는 약 10 내지 15개의 아미노산을 갖는 것을 포함하고, 열거된 범위 중 임의의 종점들 사이 임의의 정수를 포함한다. 일부 구현예에서, 스페이서 영역은 약 12개 이하의 아미노산, 약 119개 이하의 아미노산, 또는 약 229개 이하의 아미노산을 갖는다. 일부 구현예에서, 스페이서는 250개 미만 아미노산 길이, 200개 미만 아미노산 길이, 150개 미만 아미노산 길이, 100개 미만 아미노산 길이, 75개 미만 아미노산 길이, 50개 미만 아미노산 길이, 25개 미만 아미노산 길이, 20개 미만 아미노산 길이, 15개 미만 아미노산 길이, 12개 미만 아미노산 길이, 또는 10개 미만 아미노산 길이이다. 일부 구현예에서, 스페이서는 (약) 10 내지 250개 아미노산 길이, 10 내지 150개 아미노산 길이, 10 내지 100개 아미노산 길이, 10 내지 50개 아미노산 길이, 10 내지 25개 아미노산 길이, 10 내지 15개 아미노산 길이, 15 내지 250개 아미노산 길이, 15 내지 150개 아미노산 길이, 15 내지 100개 아미노산 길이, 15 내지 50개 아미노산 길이, 15 내지 25개 아미노산 길이, 25 내지 250개 아미노산 길이, 25 내지 100개 아미노산 길이, 25 내지 50개 아미노산 길이, 50 내지 250개 아미노산 길이, 50 내지 150개 아미노산 길이, 50 내지 100개 아미노산 길이, 100 내지 250개 아미노산 길이, 100 내지 150개 아미노산 길이, 또는 150 내지 250개 아미노산 길이이다. 예시적인 스페이서는 IgG4 힌지 단독, CH2 및 CH3 도메인에 연결된 IgG4 힌지, 또는 CH3 도메인에 연결된 IgG4 힌지를 포함한다. 예시적인 스페이서는 문헌[Hudecek et al. (2013) Clin. Cancer Res., 19:3153, Hudecek et al. (2015) Cancer Immunol Res. 3(2): 125-135 또는 국제 특허 출원 공개 번호 WO2014031687]에 기재된 것을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
일부 구현예에서, 스페이서는 IgG4 및/또는 IgG2로부터 전부 또는 일부 유래될 수 있다.　 일부 구현예에서, 스페이서는 IgG4, IgG2 및/또는 IgG2 및 IgG4로부터 유래된 힌지, CH2 및/또는 CH3 서열(들) 중 하나 이상을 함유하는 키메라 폴리펩타이드일 수 있다. 일부 구현예에서, 스페이서는 하나 이상의 도메인 내의 하나 이상의 단일 아미노산 돌연변이와 같은 돌연변이를 함유할 수 있다. 일부 예에서, 아미노산 변형은 IgG4의 힌지 영역에서 세린(S)을 프롤린(P)으로 치환한 것이다. 일부 구현예에서, 아미노산 변형은 글리코실화 이질성을 감소시키기 위해 아스파라긴(N)을 글루타민(Q)으로 치환한 것이며, 예컨대 서열 번호: 128에 제시된 IgG4 중쇄 불변 영역 서열의 CH2 영역에서 177번 위치에 해당하는 위치(Uniprot 수탁 번호 P01861; EU 넘버링에 의한 297번 위치 및 서열 번호: 4에 제시된 힌지-CH2-CH3 스페이서 서열의 79번 위치에 해당하는 위치)에서 N의 Q로의 치환 또는 서열 번호: 127에 제시된 IgG2 중쇄 불변 영역 서열의 CH2 영역에서 176번 위치에 해당하는 위치(Uniprot 수탁 번호 P01859; EU 넘버링에 의한 297번 위치에 해당하는 위치)에서 N의 Q로의 치환이다.
일부 측면에서, 스페이서는 서열 번호:1에 제시된 힌지 단독 스페이서와 같은 IgG4, IgG2 또는 IgG1의 힌지 단독과 같은 IgG의 힌지 영역 단독을 함유하며, 서열 번호: 2에 제시된 서열에 의해 암호화된다. 다른 구현예에서, 스페이서는 CH2 및/또는 CH3 도메인에 연결된 Ig 힌지(예를 들어, IgG4 힌지)이다. 일부 구현예에서, 스페이서는 서열 번호: 3에 제시된 바와 같이 CH2 및 CH3 도메인에 연결된 Ig 힌지(예를 들어, IgG4 힌지)이다. 일부 구현예에서, 스페이서는 서열 번호: 4에 제시된 바와 같이 CH3 도메인에만 연결된 Ig 힌지(예를 들어, IgG4 힌지)이다. 일부 구현예에서, 스페이서는 글리신-세린 풍부 서열 또는 공지된 가요성 링커(flexible linker)와 같은 다른 가요성 링커이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 불변 영역 또는 부분은 IgD의 것이다. 일부 구현예에서, 스페이서는 서열 번호: 5에 제시된 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, 스페이서는 서열 번호: 1, 3, 4 및 5 중 어느 하나에 대해 적어도 (약) 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 갖는다.
일부 측면에서, 스페이서는 (a) 면역 글로불린 힌지 또는 이의 변형된 버전의 전부 또는 일부를 포함하거나 이로 구성되거나, 약 15개 이하의 아미노산을 포함하고, CD28 세포외 영역 또는 CD8 세포외 영역을 포함하지 않거나; (b) 면역글로불린 힌지, 선택적으로 IgG4 힌지, 또는 이의 변형된 버전의 전부 또는 일부를 포함하거나 이로 구성되고/거나 약 15개 이하의 아미노산을 포함하고, CD28 세포외 영역 또는 CD8 세포외 영역을 포함하지 않거나; (c) (약) 12개의 아미노산 길이이고/거나 면역글로불린 힌지, 선택적으로 IgG4, 또는 이의 변형된 버전의 전부 또는 일부를 포함하거나 이로 구성되거나; (d) 서열 번호: 1, 3-5, 27-34에 제시된 아미노산 서열 또는 이에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 동일성을 갖는 상기 중 어느 하나의 변이체로 구성되거나 이를 포함하거나; 또는 (e) 화학식 X1PPX2P(여기에서 X1은 글리신, 시스테인 또는 아르기닌이고 X2는 시스테인 또는 트레오닌)을 포함하거나 이로 구성되는; 것 중에서 선택된 하나 이상과 같은 폴리펩타이드 스페이서이다.
예시적인 스페이서는 면역글로불린 불변 영역의 부분(들)을 함유하는 것, 예컨대 IgG 힌지 도메인과 같은 Ig 힌지를 함유하는 것을 포함한다. 일부 측면에서, 스페이서는 IgG 힌지를 단독으로, CH2 및 CH3 도메인 중 하나 이상에 연결된 IgG 힌지를, 또는 CH3 도메인에 연결된 IgG 힌지를 포함한다. 일부 구현예에서, IgG 힌지, CH2 및/또는 CH3은 IgG4 또는 IgG2로부터 전부 또는 일부 유래될 수 있다. 일부 구현예에서, 스페이서는 IgG4, IgG2 및/또는 IgG2 및 IgG4로부터 유래된 힌지, CH2 및/또는 CH3 서열(들) 중 하나 이상을 함유하는 키메라 폴리펩타이드일 수 있다. 일부 구현예에서, 힌지 영역은 IgG4 힌지 영역의 전부 또는 일부 및/또는 IgG2 힌지 영역의 전부 또는 일부를 포함하고, 여기서 IgG4 힌지 영역은 선택적으로 인간 IgG4 힌지 영역이고 IgG2 힌지 영역은 선택적으로 인간 IgG2 힌지 영역이며; CH2 영역은 IgG4 CH2 영역의 전부 또는 일부 및/또는 IgG2 CH2 영역의 전부 또는 일부를 포함하고, 여기서 IgG4 CH2 영역은 선택적으로 인간 IgG4 CH2 영역이고 IgG2 CH2 영역은 선택적으로 인간 IgG2 CH2 영역이며; 및/또는 CH3 영역은 IgG4 CH3 영역의 전부 또는 일부 및/또는 IgG2 CH3 영역의 전부 또는 일부를 포함하고, 여기서 IgG4 CH3 영역은 선택적으로 인간 IgG4 CH3 영역이고 IgG2 CH3 영역은 선택적으로 인간 IgG2 CH3 영역이다. 일부 구현예에서, 힌지, CH2 및 CH3은 IgG4로부터의 힌지 영역, CH2 및 CH3의 각각의 전부 또는 일부를 포함한다. 일부 구현예에서, 힌지 영역은 키메라이고 인간 IgG4 및 인간 IgG2로부터의 힌지 영역을 포함하고; CH2 영역은 키메라이고 인간 IgG4 및 인간 IgG2로부터의 CH2 영역을 포함하고/거나; CH3 영역은 키메라이고 인간 IgG4 및 인간 IgG2로부터의 CH3 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 스페이서는 IgG4/2 키메라 힌지 또는 인간 IgG4 힌지 영역과 비교하여 적어도 하나의 아미노산 교체를 포함하는 변형된 IgG4 힌지; 인간 IgG2/4 키메라 CH2 영역; 및 인간 IgG4 CH3 영역을 포함한다.
일부 구현예에서, 스페이서는 IgG4 및/또는 IgG2로부터 전부 또는 일부 유래될 수 있고 하나 이상의 도메인에 하나 이상의 단일 아미노산 돌연변이와 같은 돌연변이를 함유할 수 있다. 일부 예에서, 아미노산 변형은 IgG4의 힌지 영역에서 세린(S)을 프롤린(P)으로 치환한 것이다. 일부 구현예에서, 아미노산 변형은 서열 번호: 128에 제시된 전장 IgG4 Fc 서열의 CH2 영역에서 177번 위치의 N177Q 돌연변이 또는 서열 번호: 127에 제시된 전장 IgG2 Fc 서열의 CH2 영역에서 176번 위치의 N176Q와 같이 글리코실화 이질성을 감소시키기 위해 아스파라긴(N)을 글루타민(Q)으로 치환한 것이다. 일부 구현예에서, 스페이서는 IgG4/2 키메라 힌지 또는 변형된 IgG4 힌지; IgG2/4 키메라 CH2 영역; 및 IgG4 CH3 영역이거나 이를 포함하고 선택적으로 약 228개 아미노산 길이이거나; 또는 서열 번호: 129에 제시된 스페이서이다. 일부 구현예에서, CAR의 리간드-(예를 들어, 항원-)결합 또는 인식 도메인은 예를 들어 세포내 신호 전달 영역 또는 도메인과 같은 하나 이상의 세포내 신호 전달 성분, 및/또는 TCR 복합체와 같은 항원 수용체 복합체를 통한 활성화 및/또는 다른 세포 표면 수용체를 통한 신호를 모방하는 신호 전달 성분을 함유하는 세포내 영역에 연결된다. 따라서, 일부 구현예에서, 예를 들어 항원 결합 성분(예를 들어, 항체)과 같은 결합 도메인을 함유하는 세포외 영역은 하나 이상의 막관통 및 세포내 영역(들) 또는 도메인(들)에 연결된다. 일부 구현예에서, 막관통 도메인은 세포외 영역에 융합된다. 일부 구현예에서, 수용체, 예를 들어 CAR에 있는 도메인 중 하나와 자연적으로 회합하는 막관통 도메인이 사용된다. 일부 경우에, 막관통 도메인은 동일하거나 상이한 표면 막 단백질의 막관통 도메인에 대한 상기 도메인의 결합을 피하도록 아미노산 치환에 의해 변형되거나 선택되어 수용체 복합체의 다른 멤버와의 상호 작용이 최소화된다.
일부 구현예에서, 막관통 도메인은 천연 또는 합성 공급원으로부터 유래된다. 공급원이 천연인 경우, 일부 측면에서, 도메인은 임의의 막-결합 또는 막관통 단백질로부터 유래된다. 막 관통 영역은 T 세포 수용체의 알파, 베타 또는 제타 사슬, CD28, CD3 엡실론, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137(4-1BB) 또는 CD154로부터 유래된 것을 포함한다(즉, 적어도 이들의 막관통 영역(들)을 포함한다). 대안적으로 일부 구현예에서 막관통 도메인은 합성이다. 일부 측면에서, 합성 막관통 도메인은 주로 류신 및 발린과 같은 소수성 잔기를 포함한다. 일부 측면에서, 페닐알라닌, 트립토판 및 발린의 트리플릿(triplet)이 합성 막관통 도메인의 각 말단에서 발견될 것이다. 일부 구현예에서, 연결은 링커, 스페이서 및/또는 막관통 도메인에 의한 것이다. 일부 측면에서, 막관통 도메인은 CD28 또는 이의 변이체의 막관통 부분을 함유한다. 세포외 영역과 막관통은 직접 또는 간접적으로 연결될 수 있다.　 일부 구현예에서, 세포외 영역과 막관통은 본원에 기술된 임의의 것과 같은 스페이서에 의해 연결된다.　
일부 구현예에서, 수용체(예를 들어 CAR)의 막관통 도메인은 인간 CD28 또는 이의 변이체의 막관통 도메인, 예를 들어 인간 CD28의 27-아미노산 막관통 도메인(수탁 번호: P10747.1)이거나 또는 서열 번호: 8에 제시된 아미노산 서열 또는 서열 번호: 8에 대해 적어도 (약) 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 막관통 도메인이며; 일부 구현예에서, 키메라 수용체의 일부를 함유하는 막관통 도메인은 서열 번호: 9에 제시된 아미노산 서열 또는 이에 대해 적어도 (약) 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.　
c. 세포내 영역
일부 측면에서, 변형된 CD247 유전자 자리에서 암호화된 키메라 수용체(예를 들어, CAR)는 신호 전달 영역 또는 도메인을 포함하는 세포내 영역(또한 세포질 영역으로도 불림)을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포내 영역은 세포내 신호 전달 영역 또는 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포내 신호 전달 영역 또는 도메인은 1차 신호 전달 영역, T 세포에서 1차 활성화 신호를 자극 및/또는 유도할 수 있는 신호 전달 도메인, T 세포 수용체(TCR) 성분의 신호 전달 도메인(예를 들어, CD3-제타(CD3ζ) 사슬 또는 이의 기능적 변이체 또는 신호 전달 부분의 세포내 신호 전달 도메인 또는 영역), 및/또는 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프(ITAM)를 포함하는 신호 전달 도메인이거나 이를 포함한다.
일부 구현예에서, 키메라 수용체(예를 들어, CAR)는 적어도 하나의 세포내 신호 전달 성분 또는 성분들, 예컨대 세포내 신호 전달 영역 또는 도메인을 포함한다. 세포내 신호 전달 영역 중에는 천연 항원 수용체를 통한 신호, 공자극 수용체와 조합으로 상기 수용체를 통한 신호 및/또는 공자극 수용체 단독을 통한 신호를 모방하거나 이와 유사한 것이 있다. 일부 구현예에서, 짧은 올리고- 또는 폴리펩타이드 링커, 예를 들어 글리신 및 세린, 예를 들어 글리신-세린 더블릿(doublet)을 함유하는 것과 같은 2 내지 10개 아미노산 길이의 링커가 CAR의 막관통 도메인과 세포질 신호 전달 도메인 사이에 존재하고 연결을 형성한다.
일부 구현예에서, CAR의 결찰 시, CAR의 세포질(또는 세포내) 도메인 또는 영역, 예를 들어 세포내 신호 전달 영역은 면역 세포, 예를 들어 CAR을 발현하도록 조작된 T 세포의 정상 효과기 기능 또는 반응 중 적어도 하나를 자극 및/또는 활성화시킨다. 예를 들어, 일부 맥락에서, CAR은 T 세포의 기능, 예컨대 세포 용해 활성 또는 T-헬퍼 활성, 예컨대 사이토카인 또는 기타 인자의 분비를 유도한다. 일부 구현예에서, 항원 수용체 성분 또는 공자극 분자의 세포내 신호 전달 영역 또는 도메인의 절단 부분은 예를 들어 그것이 효과기 기능 신호를 전달하는 경우 온전한 면역 자극 사슬 대신에 사용된다. 일부 구현예에서, 예를 들어 세포내 도메인 또는 도메인들을 포함하는 세포내 신호 전달 영역은 T 세포 수용체(TCR)의 세포질 서열 및 일부 측면에서 천연 맥락에서 항원 수용체 결합 후에 신호 전달을 개시하기 위해 상기 수용체와 협력하여 작용하는 공-수용체 및/또는 상기 분자의 임의의 유도체 또는 변이체 및/또는 동일한 기능적 능력을 갖는 임의의 합성 서열의 세포질 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 예를 들어 세포내 도메인 또는 도메인들을 포함하는 세포내 신호 전달 영역은 공자극 신호를 제공하는 데 관여하는 영역 또는 도메인의 세포질 서열을 포함한다.
(i) 공자극 신호 전달 도메인
일부 구현예에서, 완전한 자극 및/또는 활성화를 촉진하기 위해, 2차 또는 공자극 신호를 생성하기 위한 하나 이상의 성분이 암호화된 CAR에 포함된다. 다른 구현예에서, 암호화된 CAR은 공자극 신호를 생성하기 위한 성분을 포함하지 않는다. 일부 측면에서, 추가의 수용체 폴리펩타이드 또는 이의 일부가 동일한 세포에서 발현되고 2차 또는 공자극 신호를 생성하기 위한 성분을 제공한다.
일부 구현예에서, 암호화된 CAR은 공자극 수용체, 예컨대 CD28, 4-1BB, OX40(CD134), CD27, DAP10, DAP12, ICOS 및/또는 다른 공자극 수용체의 신호 전달 영역 및/또는 막관통 부분을 포함한다. 일부 측면에서, 동일한 CAR은 1차 세포질 신호 전달 영역 및 공자극 신호 전달 성분 둘 모두를 포함한다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 상이한 키메라 수용체는 하나 이상의 상이한 세포내 신호 전달 영역(들) 또는 도메인(들)을 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 1차 세포질 신호 전달 영역은 하나의 암호화된 CAR 내에 포함되는 반면, 공자극 성분은 다른 수용체, 예를 들어 다른 항원을 인식하는 다른 CAR에 의해 제공된다. 일부 구현예에서, 암호화된 CAR은 활성화 또는 자극 CAR 및 공자극 CAR을 포함하며, 둘 다 동일한 세포 상에서 발현된다(WO2014/055668 참조).
특정 구현예에서, 세포내 신호 전달 영역은 CD3(예를 들어, CD3ζ) 세포내 영역 또는 도메인에 연결된 CD28 막관통 및 신호 전달 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포내 영역은 CD3ζ 세포내 영역 또는 도메인에 연결된, 키메라 CD28 및 CD137(4-1BB, TNFRSF9) 공자극 도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, 암호화된 CAR은 세포질 부분에서 하나 이상의, 예를 들어 2개 이상의 공자극 도메인 및 1차 세포질 신호 전달 영역을 포함한다. 예시적인 CAR은 세포내 성분, 예컨대 CD3-제타, CD28, CD137(4-1BB), OX40(CD134), CD27, DAP10, DAP12, NKG2D 및/또는 ICOS의 세포내 신호 전달 영역(들) 또는 도메인(들)을 포함한다. 일부 구현예에서, 키메라 항원 수용체는 예를 들어 CD28, CD137(4-1BB), OX40(CD134), CD27, DAP10, DAP12, NKG2D 및/또는 ICOS로부터의 T 세포 공자극 분자의 세포내 신호 전달 영역 또는 도메인을, 일부 경우에 막관통 도메인과 세포내 신호 전달 영역 또는 도메인 사이에 함유한다. 일부 측면에서, T 세포 공자극 분자는 CD28, CD137(4-1BB), OX40(CD134), CD27, DAP10, DAP12, NKG2D 및/또는 ICOS 중 하나 이상이다. 일부 구현예에서, 공자극 분자는 인간 공자극 분자이다.
일부 구현예에서, 세포내 신호 전달 영역 또는 도메인은 인간 CD28 또는 이의 기능적 변이체 또는 이의 일부의 세포내 공자극 신호 전달 도메인, 예컨대 이의 41개의 아미노산 도메인 및/또는 천연 CD28 단백질의 186-187 위치에서 LL의 GG로의 치환을 갖는 상기 도메인을 포함한다.　 일부 구현예에서, 세포내 신호 전달 도메인은 서열 번호: 10 또는 11에 제시된 아미노산 서열 또는 서열 번호: 10 또는 11에 대해 적어도 (약) 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 세포내 영역은 CD137(4-1BB) 또는 이의 기능적 변이체 또는 이의 일부의 세포내 공자극 신호 전달 도메인 또는 영역, 예컨대 인간 4-1BB(수탁 번호: Q07011.1) 또는 이의 기능적 변이체 또는 이의 일부의 42-아미노산 세포질 도메인, 예컨대 서열 번호: 12에 제시된 아미노산 서열 또는 서열 번호: 12에 대해 적어도 (약) 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 경우에, 암호화된 CAR은 제1, 제2, 제3 또는 제4 세대 CAR로 지칭된다. 일부 측면에서, 제1 세대 CAR은, 예를 들어, 항원 결합 시 CD3-사슬 유도 신호만을 제공하는 것이고; 일부 측면에서, 제2 세대 CAR은 CD28, CD137 (4-1BB), OX40 (CD134), CD27, DAP10, DAP12, NKG2D, ICOS 및/또는 다른 공자극 수용체와 같은 하나 이상의 공자극 수용체로부터의 세포내 신호 전달 영역(들) 또는 도메인(들)을 포함하는 것과 같은 상기 신호 및 공자극 신호를 제공하는 것이고; 제3 세대 CAR은, 예를 들어, CD28, CD137 (4-1BB), OX40 (CD134), CD27, DAP10, DAP12, NKG2D, ICOS 및/또는 다른 공자극 수용체로부터 선택된 상이한 공자극 수용체들의 다수의 공자극 도메인을 포함하는 것이며; 일부 측면에서, 제4 세대 CAR은, 예를 들어, CD28, CD137 (4-1BB), OX40 (CD134), CD27, DAP10, DAP12, NKG2D, ICOS 및/또는 다른 공자극 수용체로부터 선택된 상이한 공자극 수용체들의 셋 이상의 공자극 도메인을 포함하는 것이다.
(ii) CD3ζ 사슬
일부 구현예에서, 암호화된 키메라 수용체는 T-세포 활성화 및 세포 독성을 매개하는 TCR CD3 사슬, 예를 들어 CD3 제타 사슬과 같은 TCR 복합체의 세포내 성분을 포함한다. 따라서, 일부 측면에서, 항원 결합 또는 항원 인식 도메인은 하나 이상의 세포 신호 전달 모듈에 연결된다. 일부 구현예에서, 세포 신호 전달 모듈은 CD3 막관통 도메인, CD3 세포내 신호 전달 도메인 및/또는 기타 CD 막관통 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 암호화된 키메라 수용체, 예를 들어 CAR은 또한 Fc 수용체 감마(FcRγ), CD8 알파, CD8 베타, CD4, CD25 또는 CD16과 같은 하나 이상의 추가 분자의 일부를 포함한다. 예를 들어, 일부 측면에서, CAR은 CD3제타(CD3ζ)와 CD8 알파, CD8 베타, CD4, CD25 또는 CD16 중 하나 이상 사이에 키메라 분자를 포함한다.
천연 TCR의 맥락에서, 완전한 자극은 일반적으로 TCR을 통한 신호 전달뿐만 아니라 공자극 신호가 필요하다. 일부 측면에서, T 세포 자극은 두 종류의 세포질 신호 전달 서열, 즉 TCR을 통한 항원-의존적 1차 활성화를 개시하는 서열(1차 세포질 신호 전달 영역(들) 또는 도메인(들)), 및 항원-비의존적 방식으로 작용하여 2차 또는 공자극 신호를 제공하는 서열(2차 세포질 신호 전달 영역(들) 또는 도메인(들))에 의해 매개될 수 있다. 일부 측면에서, CAR은 상기 신호 전달 성분 중 하나 또는 둘 모두를 포함한다.
일부 측면에서, 암호화된 CAR은 TCR 복합체의 1차 자극 및/또는 활성화를 조절하는 1차 세포질 신호 전달 영역을 포함하는 세포내 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 암호화된 키메라 수용체는, 예를 들어, 키메라 수용체의 결합 시 T 세포 활성화 및/또는 세포 독성을 매개하는 신호 전달을 할 수 있는, 전체 또는 전 CD3ζ 신호 전달 도메인과 같은 CD3ζ 신호 전달 도메인을 포함하는 세포내 영역을 포함한다. 일부 측면에서, 암호화된 키메라 수용체의, 예를 들어, CD3ζ의 세포내 신호 전달 도메인, 또는 선택적으로 전체 CD3ζ 신호 전달 도메인과 같은 CD3ζ 사슬 또는 이의 단편을 함유하는 1차 세포질 신호 전달 영역의 적어도 일 단편은 내인성 CD247 유전자 자리의 개방형 해독틀 또는 이의 부분 서열에 의해 암호화된다. 자극 방식으로 작용하는 1차 세포질 신호 전달 영역(들)은, 예를 들어, CD3 제타(CD3ζ)로부터 유래된, 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 또는 ITAM으로 공지된 신호 전달 모티프를 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, CAR은 CD3ζ 제타로부터 유래된 세포질 신호 전달 도메인, 이의 단편 또는 부분, 또는 서열을 함유한다. 일부 구현예에서, 세포내(또는 세포질) 신호 전달 영역은 CD3ζ 또는 이의 기능적 변이체의 세포내 또는 세포질 자극 신호 전달 도메인을 포함하여, 인간 CD3 제타 사슬 또는 이의 단편 또는 부분, 예컨대 인간 CD3ζ의 동형 단백질 3의 112 AA 세포질 도메인(수탁 번호: P20963.2) 또는 문헌[미국 특허 번호 7,446,190 또는 미국 특허 번호 8,911,993]에 기술된 바와 같은 CD3ζ 신호 전달 도메인을 포함한다.　일부 구현예에서, 암호화된 키메라 수용체의 세포내 영역은 서열 번호: 13, 14 또는 15에 제시된 아미노산 서열 또는 서열 번호: 13, 14 또는 15에 대해 적어도 (약) 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열 또는 이의 부분 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 전이 유전자와 CD247 유전자 자리의 내인성 서열의 유전자 융합물에 의해 암호화된 예시적인 CD3ζ 사슬 또는 이의 단편은 CD3ζ 사슬의 ITAM 도메인들, 예를 들어 서열 번호: 73에 제시된 인간 CD3ζ 사슬 전구체 서열의 아미노산 잔기 61-89, 100-128 또는 131-159 또는 CD3ζ 사슬로부터의 하나 이상의 ITAM 도메인을 함유하고 서열 번호: 73에 대해 적어도 (약) 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 세포는 암호화된 CAR의 기능 및/또는 활성을 조절, 제어, 또는 조정하는 데 사용되는 하나 이상의 추가 분자(예를 들어, 추가 키메라 수용체 폴리펩타이드 또는 이의 부분과 같은 폴리펩타이드)를 발현하도록 조작된다. 다중 사슬 CAR과 같은 예시적인 다중 사슬 키메라 수용체는 본원의 예를 들어 섹션 III.B.2에 기술된다.
일부 구현예에서, 암호화된 CAR은 항체(예를 들어, 항체 단편), CD28 또는 이의 기능적 변이체의 막관통 부분이거나 이를 함유하는 막관통 도메인, 및 CD28 또는 이의 기능적 변이체의 신호 전달 부분과 CD3 제타 또는 이의 기능적 변이체의 신호 전달 부분을 함유하는 세포내 신호 전달 영역을 함유한다. 일부 구현예에서, CAR은 항체(예를 들어, 항체 단편), CD28 또는 이의 기능적 변이체의 막관통 부분이거나 이를 함유하는 막관통 도메인, 및 4-1BB 또는 이의 기능적 변이체의 신호 전달 부분과 CD3 제타 또는 이의 기능적 변이체의 신호 전달 부분을 함유하는 세포내 신호 전달 도메인을 함유한다. 일부 상기 구현예에서, 수용체는 Ig 분자의 일부, 예컨대 인간 Ig 분자, 예컨대 Ig 힌지, 예를 들어 IgG4 힌지, 예컨대 힌지 단독 스페이서를 함유하는 스페이서를 더 포함한다. 일부 구현예에서, 키메라 수용체는 수용체의 C-말단에 CD3 제타(CD3ζ)를 포함한다.
2. 다중 사슬 CAR
일부 구현예에서, 변형된 CD247 유전자 자리의 핵산 서열에 의해 암호화된 키메라 수용체는 다중 사슬 CAR일 수 있다. 일부 구현예에서, 만일 둘 이상의 폴리펩타이드 사슬을 포함하는 다중 사슬 CAR이 세포에서 발현되면, 폴리펩타이드 사슬 중 적어도 하나는 CD3제타(CD3ζ) 사슬 또는 이의 단편 또는 부분을 포함하고 변형된 CD247 유전자 자리에 의해 암호화된다. 일부 측면에서, 다중 사슬 CAR의 하나 이상의 사슬을 암호화하는 핵산 서열을 도입하는 데 사용되는 폴리뉴클레오타이드는 본원의 섹션 I.B에 기술된 것을 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 폴리뉴클레오타이드, 예를 들어 주형 폴리뉴클레오타이드는 다중 사슬 CAR 또는 이의 부분의 적어도 하나의 사슬, 예컨대 CD3제타(CD3ζ) 사슬 또는 이의 단편 또는 부분을 함유하는 다중 사슬 CAR의 적어도 하나의 폴리펩타이드의 적어도 일부를 암호화하는 전이 유전자 서열을 함유한다. 일부 측면에서, 전이 유전자 서열은 또한 상이한 또는 추가 폴리펩타이드, 예를 들어 다중 사슬 CAR의 다른 또는 추가 사슬, 또는 본원의 섹션 I.B.2.(vi)에 기술된 것과 같은 추가 분자를 암호화하는 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 다중 사슬 CAR의 추가 성분을 암호화하는 추가 폴리뉴클레오타이드, 예를 들어 추가 주형 폴리뉴클레오타이드가 도입될 수 있다. 일부 측면에서, 추가 폴리뉴클레오타이드는 본원의 예를 들어 섹션 I.B.2에 기술된 임의의 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 변형된 형태, 예컨대 별개의 게놈 유전자 자리에서 통합을 위해 핵산을 표적화하기 위한 상이한 상동성 암들을 포함하는 것일 수 있다.
일부 구현예에서, 제공된 조작된 세포는 다중 사슬 CAR과 같은 다중 사슬 수용체를 발현하는 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 예시적인 다중 사슬 CAR은 세포 상에 둘 이상의 유전자 조작된 수용체를 함유할 수 있고, 이들은 함께 기능성 키메라 수용체를 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 다양한 폴리펩타이드 사슬이 조합되어 CAR의 기능 또는 활성을 수행하고/하거나 CAR의 기능 및/또는 활성을 조절, 제어 또는 조정할 수 있다. 일부 측면에서, 다중 사슬 CAR은 둘 이상의 폴리펩타이드 사슬을 함유할 수 있고, 각각은 상이한 항원의 동일한 것을 인식하고 전형적으로 각각은 상이한 세포내 신호 전달 성분과 같은 상이한 영역 또는 도메인을 포함한다. 일부 측면에서, 유전자 조작된 수용체 중 적어도 하나의 세포내 신호 전달 성분은 CD3제타(CD3ζ) 사슬 또는 이의 단편 또는 부분을 포함한다. 일부 측면에서, 변형된 CD247 유전자 자리는 CD3제타(CD3ζ) 사슬 또는 이의 단편 또는 부분을 함유하는 수용체 폴리펩타이드와 같은 다중 사슬 수용체의 적어도 하나의 사슬을 암호화하는 핵산 서열을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 키메라 수용체는 둘 이상의 폴리펩타이드 사슬을 포함하는 다중 사슬 CAR 또는 이중 사슬 CAR이다. 일부 구현예에서, 다중 사슬 수용체는 조절 가능 CAR, 조건부 활성 CAR 또는 유도성 CAR이다. 일부 측면에서, 이중 사슬 CAR과 같은 다중 사슬 수용체의 둘 이상의 폴리펩타이드는 키메라 수용체의 특이성, 활성, 항원(또는 리간드) 결합, 기능 및/또는 발현의 공간적 또는 시간적 조절 또는 제어를 허용한다. 상기 구현예의 일부에서, 변형된 CD247 유전자 자리에서 핵산 서열에 의해 암호화된 키메라 수용체는 이중 사슬 또는 다중 사슬 수용체의 하나 이상의 사슬을 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 이중 사슬 CAR 중 하나만 변형된 CD247 유전자 자리에 의해 암호화되는 경우, 다른 사슬은 상이한 게놈 위치에서 통합되거나 에피솜인 별도의 핵산 분자에 의해 암호화된다.
일부 구현예에서, 다중 사슬 CAR은 활성화 및 공자극 CAR의 조합을 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 다중 사슬 CAR은 비표적 세포, 예를 들어 정상 세포에 개별적으로 존재하지만 치료될 질병 또는 병태의 세포 상에만 함께 존재하는 2개의 상이한 항원을 표적화하는 CAR들을 암호화하는 2개의 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 다중 사슬 CAR은, 예컨대 활성화 CAR은 정상 또는 비질병 세포 및 치료될 질병 또는 병태의 세포 둘 모두에서 발현되는 하나의 항원에 결합하고 억제성 CAR은 정상 세포 또는 치료가 바람직하지 않은 세포상에서만 발현되는 다른 항원에 결합하는, 활성화 CAR 및 억제성 CAR을 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 다중 사슬 CAR은 조절, 조정 또는 제어될 수 있는 CAR을 암호화하는 하나 이상의 폴리펩타이드를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 다중 사슬 CAR은 CAR의 하나 이상의 도메인 또는 영역을 암호화하는 하나 이상의 폴리펩타이드 사슬을 포함한다. 일부 측면에서, 다양한 폴리펩타이드 사슬이 조합하여 CAR을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 추가 도메인 또는 영역이 CAR에 존재한다. 일부 구현예에서, 다중 사슬 CAR의 하나 이상의 폴리펩타이드 사슬에 존재하는 다양한 도메인 또는 영역은 CAR의 기능 및/또는 활성을 조절, 제어 또는 조정하는 데 사용된다. 일부 구현예에서, 조작된 세포는 상이한 성분, 도메인 또는 영역을 함유하는 둘 이상의 폴리펩타이드 사슬을 발현한다. 일부 측면에서, 둘 이상의 폴리펩타이드 사슬은 키메라 수용체의 특이성, 활성, 항원(또는 리간드) 결합, 기능 및/또는 발현의 공간적 또는 시간적 조절 또는 제어를 허용한다. 하나보다 많은 폴리펩타이드, 예를 들어 2 이상의 폴리펩타이드를 포함하는 다중 사슬 CAR의 일부 구현예에서, 적어도 하나의 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열, 예컨대 수용체의 세포내 영역에, 예들 들어 C 말단에 CD3제타(CD3ζ)를 함유하는 폴리펩타이드 사슬을 암호화하는 핵산 서열이 내인성 CD247 유전자 자리에서 통합을 위해 표적화된다. 일부 구현예에서, 추가 분자 또는 폴리펩타이드, 예를 들어 다중 사슬 CAR 또는 추가 분자의 추가 폴리펩타이드 사슬을 암호화하는 핵산 서열은 예를 들어 표적화에 사용되는 동일한 폴리뉴클레오타이드 상에 배치됨으로써 동일한 유전자 자리에 표적화될 수 있다. 일부 구현예에서, 추가 분자 또는 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열은 다른 유전자 자리에 표적화되거나 다른 방법에 의해 전달된다.
일부 측면에서, CAR의 도메인 또는 영역을 암호화하는 하나 이상의 폴리펩타이드 사슬은 하나 이상의 항원 또는 분자를 표적화할 수 있다. 예시적인 다중 사슬 CAR 또는 다른 다중 표적화 전략은 예를 들어 문헌[국제 특허 출원 공개 번호 WO 2014055668 또는 Fedorov et al., Sci. Transl. Medicine, Sci Transl Med. (2013) 5(215):215ra172; Sadelain, Curr Opin Immunol. (2016) 41: 68-76; Wang et al. (2017) Front. Immunol. 8:1934; Mirzaei et al. (2017) Front. Immunol. 8:1850; Marin-Acevedo et al. (2018) Journal of Hematology & Oncology 11:8; Fesnak et al. (2016) Nat Rev Cancer. 16(9): 566-581; 및 Abate-Daga and Davila, (2016) Molecular Therapy - Oncolytics 3, 16014]에 기술된 것을 포함한다.
일부 구현예에서, 조작된 세포는, 일반적으로 제1 폴리펩타이드 사슬에 의해 인식되는 항원, 예를 들어 제1 항원에 특이적인 결합 시, 세포에 대한 활성화 또는 자극 신호를 유도할 수 있는 키메라 수용체, 예를 들어, CAR의 제1 폴리펩타이드 사슬을 발현할 수 있다. 일부 구현예에서, 세포는 또한, 일반적으로 제2 폴리펩타이드 사슬에 의해 인식되는 제2 항원에 특이적인 결합 시, 면역 세포에 대해 공자극 신호를 유도할 수 있는 키메라 수용체, 예를 들어 CAR(일부 경우에 키메라 공자극 수용체라 불림)의 제2 폴리펩타이드 사슬을 발현할 수 있다. 일부 구현예에서, 제1 항원 및 제2 항원은 동일하다. 일부 구현예에서, 제1 항원 및 제2 항원은 상이하다.
일부 구현예에서, 제1 및/또는 제2 폴리펩타이드 사슬은 세포에 대한 활성화 또는 자극 신호를 유도할 수 있다. 일부 구현예에서, 수용체는 ITAM 또는 ITAM 유사 모티프를 함유하는 세포내 신호 전달 성분을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 폴리펩타이드 사슬에 의해 유도된 활성화는 면역 반응의 개시, 예컨대 ITAM 인산화 및/또는 ITAM 매개 신호 전달 계단식 다단계 반응의 개시, 면역 시냅스의 형성 및/또는 결합된 수용체(예를 들어, CD4 또는 CD8 등) 근처 분자의 클러스터링, 하나 이상의 전사 인자, 예컨대 NF-κB 및/또는 AP-1의 활성화, 및/또는 사이토카인과 같은 인자의 유전자 발현, 증식 및/또는 생존의 유도를 초래하는 세포에서의 신호 전달 또는 단백질 발현의 변화를 수반한다. 일부 구현예에서, 활성화 도메인은 다중 사슬 CAR의 적어도 하나, 예컨대 변형된 CD247 유전자 자리에 의해 암호화된 폴리펩타이드 사슬 내에 포함되는 반면, 공자극 성분은 다른 항원을 인식하는 다른 폴리펩타이드에 의해 제공된다. 일부 구현예에서, 조작된 세포는 활성화 또는 자극 CAR, 공자극 CAR을 포함하는 다중 사슬 CAR을 포함할 수 있으며, 둘 다 동일한 세포 상에서 발현된다(WO2014/055668 참조). 일부 측면에서, 하나 이상의 자극 또는 활성화 CAR(예컨대 본원의 예를 들어 섹션 III.A에 기술된 바와 같은 변형된 CD247 유전자 자리에 의해 암호화된 것) 및/또는 공자극 CAR을 발현한다.
일부 구현예에서, 제1 및/또는 제2 폴리펩타이드 사슬은 CD28, CD137 (4-1BB), OX40 (CD134), CD27, DAP10, DAP12, NKG2D, ICOS 및/또는 다른 공자극 수용체와 같은 공자극 수용체의 세포내 신호 전달 영역 또는 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 폴리펩타이드 사슬은 상이한 공자극 수용체의 세포내 신호 전달 도메인(들)을 함유할 수 있다. 일 구현예에서, 제1 폴리펩타이드 사슬은 CD28 공자극 신호 전달 도메인을 함유하고 제2 폴리펩타이드 사슬은 4-1BB 공자극 신호 전달 영역을 함유하거나 그 역이다.
일부 구현예에서, 제1 및/또는 제2 폴리펩타이드 사슬은 CD3제타(CD3ζ) 사슬 또는 이의 단편 또는 부분의 것과 같은 ITAM 또는 ITAM 유사 모티프를 함유하는 세포내 신호 전달 도메인, 예컨대 CD3ζ 세포내 신호 전달 도메인 및 공자극 수용체의 세포내 신호 전달 도메인 둘 모두를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 폴리펩타이드 사슬은 ITAM 또는 ITAM 유사 모티프를 함유하는 세포내 신호 전달 도메인을 함유하고 제2 폴리펩타이드 사슬은 공자극 수용체의 세포내 신호 전달 도메인을 함유한다. 동일한 세포에서 유도된 활성화 또는 자극 신호와 결합한 공자극 신호는 면역 반응, 예컨대 강력하고 지속적인 면역 반응, 예컨대 유전자 발현의 증가, 사이토카인 및 기타 인자의 분비, 및 세포 사멸과 같은 T 세포 매개 효과기 기능을 초래하는 것이다.
일부 구현예에서, 제1 폴리펩타이드 사슬 단독의 결찰 또는 제2 폴리펩타이드 사슬 단독의 결찰은 모두 강력한 면역 반응을 유도하지 못한다. 일부 측면에서, 하나의 수용체만 결찰되는 경우에, 세포는 항원에 내성화되거나 반응하지 않게 되거나 억제되고/거나 증식 또는 인자 분비를 하도록 또는 효과기 기능을 수행하도록 유도되지 않는다. 그러나, 일부 상기 구현예에서, 다수의 폴리펩타이드 사슬이 결찰되면, 예컨대 제1 및 제2 항원을 발현하는 세포와의 조우 시, 예를 들어, 하나 이상의 사이토카인 분비, 증식, 지속성 및/또는 표적 세포의 세포 독성 사멸과 같은 면역 작동 기능의 수행에 의해 나타난 바와 같이 전체 면역 활성화 또는 자극과 같은 원하는 반응이 달성된다.
일부 구현예에서, 다중 사슬 CAR의 하나 이상의 사슬은 억제성 CAR(iCAR, 문헌[Fedorov et al., Sci. Transl. Medicine, 5(215) (2013)] 참조), 예컨대 질병 또는 병태에 특이적이고/거나 이와 관련된 것 외의 항원을 인식하는 - 이로써 질병 표적화 CAR을 통해 전달된 활성화 신호가 예를 들어 표적외 효과를 감소시키도록 이의 리간드에 대한 억제성 CAR의 결합에 의해 감소 또는 억제되는 - CAR을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 억제성 CAR은 (예를 들어, CD247 유전자 자리에 통합된 폴리뉴클레오타이드와 같은 CD3제타(CD3ζ) 사슬 또는 이의 단편 또는 부분을 함유하는) 자극 또는 활성화 CAR로서 동일한 폴리뉴클레오타이드에 의해, 또는 상이한 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화될 수 있다.
일부 구현예에서, 다중 사슬 CAR의 2개의 폴리펩타이드 사슬은 각각 세포에 활성화 및 억제 신호를 세포에 유도하여, 항원에 하나의 폴리펩타이드 사슬의 결찰은 세포를 활성화하거나 반응을 유도하지만, 항원에 제2 폴리펩타이드 사슬, 예를 들어 억제성 수용체의 결찰은 그 반응을 억제하거나 약화시키는 신호를 유도한다. 활성화 CAR 및 억제성 CAR(iCAR)을 조합하는 예가 있다. 예를 들어, 상기 전략은 활성화 CAR이 질병 또는 병태에서 발현되나 정상 세포에서도 발현되는 항원에 결합하고 억제성 수용체는 정상 세포에서 발현되나 질병 또는 병태의 세포에서는 발현되지 않는 별개의 항원에 결합하는 맥락에서 표적외 효과의 가능성을 감소시키는 데 사용될 수 있다.
일부 측면에서, 세포에서 발현되는 추가 수용체 폴리펩타이드는 추가로 억제성 CAR(예를 들어, iCAR)을 포함하고 면역 반응, 예컨대 세포에서 ITAM- 및/또는 공자극-촉진 반응을 약화 또는 억제하는 세포내 성분을 포함한다. 상기 세포내 신호 전달 성분의 예는 PD-1, CTLA4, LAG3, BTLA, OX2R, TIM-3, TIGIT, LAIR-1, PGE2 수용체, A2AR을 포함한 EP2/4 아데노신 수용체를 포함한 면역 관문 분자에서 발견되는 것이다. 일부 측면에서, 조작된 세포는 상기 억제 분자의 또는 이로부터 유래된 신호 전달 도메인을 포함하는 억제성 CAR를 포함하여, 이것이 예를 들어, 활성화 및/또는 공자극 CAR에 의해 유도되는 세포의 반응을 약화시키는 역할을 한다.
일부 구현예에서, 다중 사슬 CAR은 특정 질병 또는 병태와 관련된 항원이 비질병 세포에서 발현되고/거나 조작된 세포 자체에서 일시적으로(예를 들어, 유전자 조작과 관련된 자극 시) 또는 상시적으로 발현되는 경우에 사용될 수 있다. 상기 경우에, 2개의 별도의 및 개별적으로 특이적인 폴리펩타이드의 결찰을 요구함으로써, 특이성, 선택성 및/또는 효능이 향상될 수 있다.
일부 구현예에서, 복수의 항원, 예를 들어, 제1 및 제2 항원이 암세포 상과 같이 표적화되는 세포, 조직 또는 질병 또는 병태 상에서 발현된다. 일부 측면에서, 세포, 조직, 질병 또는 병태는 다발성 골수종 또는 다발성 골수종 세포이다. 일부 구현예에서, 복수의 항원 중 하나 이상은 일반적으로 정상 또는 비질병 세포 또는 조직 및/또는 조작된 세포 자체와 같이 세포 요법으로 표적화하는 것이 바람직하지 않은 세포 상에서도 발현된다. 상기 구현예에서, 세포의 반응을 달성하기 위해 다중 수용체의 결찰을 요구함으로써, 특이성 및/또는 효능이 달성된다.
일부 구현예에서, 제1 및/또는 제2 폴리펩타이드 사슬 중 하나는 다른 폴리펩타이드 사슬의 발현, 항원 결합 및/또는 활성을 조절할 수 있다.
일부 측면에서, 두 개의 폴리펩타이드 사슬 시스템은 폴리펩타이드 사슬들 중 적어도 하나의 발현을 조절하는 데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 제1 폴리펩타이드 사슬은 조절 가능 절단 요소를 통해 연결된, 전사 인자와 같은 조절 분자에 연결된 제1 리간드-(예를 들어, 항원-)결합 도메인을 함유한다. 일부 측면에서, 조절 가능 절단 요소는 제1 리간드-(예를 들어, 항원-)결합 도메인의 결합 시 세포내 도메인을 절단 및 방출할 수 있는, 변형된 노치(Notch) 수용체(예를 들어, synNotch)로부터 유래된다. 일부 측면에서, 제2 폴리펩타이드 사슬은 ITAM-함유 세포내 신호 전달 도메인과 같은, 세포에 대해 활성화 또는 자극 신호를 유도할 수 있는 세포내 신호 전달 성분에 연결된 제2 리간드-(예를 들어, 항원-)결합 도메인을 함유한다. 일부 측면에서, 제2 폴리펩타이드 사슬을 암호화하는 핵산 서열은 특정 전사 인자, 예를 들어 제1 폴리펩타이드 사슬에 의해 암호화된 전사 인자에 의해 조절될 수 있는 전사 조절 요소(예를 들어, 프로모터)에 작동 가능하게 연결된다. 일부 측면에서, 제1 리간드-(예를 들어, 항원-)결합 도메인에 대한 리간드 또는 항원의 결합은 전사 인자의 단백질 분해 방출로 이어지고, 이는 이어서 제2 폴리펩타이드 사슬의 발현을 유도할 수 있다(문헌[Roybal et al. (2016) Cell164:770-779; Morsut et al. (2016) Cell 164:780-791] 참조). 일부 구현예에서, 제1 항원 및 제2 항원은 상이하다.
일부 경우에, 키메라 수용체(예를 들어, CAR)는 조절, 제어, 유도 또는 억제될 수 있으며, 이는 키메라 수용체를 이용한 치료 요법의 안전성 및 효능을 최적화하는 데 바람직할 수 있다. 일부 구현예에서, 다중 사슬 CAR은 조절 가능 CAR이다. 일부 측면에서, 조절될 수 있는 CAR을 포함하는 조작된 세포가 여기에서 제공된다. 본원에서 “조절 가능 키메라 수용체” 또는 “조절 가능 CAR”로도 불리는 조절될 수 있는 키메라 수용체는 적어도 2개의 폴리펩타이드 사슬의 세트와 같은 다수 폴리펩타이드를 지칭하며, 이는 조작된 세포(예를 들어, 조작된 T 세포)에서 발현될 때 유도인자의 제어 하에 세포내 신호를 생성하는 능력을 가진 조작된 세포를 제공한다.
일부 구현예에서, 조절 가능 CAR의 폴리펩타이드는 다른 다량체화 도메인과 다량체화할 수 있는 다량체화 도메인을 함유한다. 일부 구현예에서, 다량체화 도메인은 유도인자에 결합 시 다량체화할 수 있다. 예를 들어, 다량체화 도메인은 화학적 유도인자와 같은 유도인자와 결합할 수 있고, 이는 다량체화 도메인의 다량체화에 의해 조절 가능 CAR의 폴리펩타이드의 다량체화를 초래하고, 이에 의해 조절 가능 CAR을 생성한다.
일부 구현예에서, 조절 가능 CAR의 한 폴리펩타이드는 리간드-(예를 들어, 항원-)결합 도메인을 포함하고 조절 가능 CAR의 다른 폴리펩타이드는 세포내 신호 전달 영역을 포함하며, 여기서 다량체화 도메인의 다량체화에 의해 2개의 폴리펩타이드의 다량체화가 리간드-결합 도메인 및 세포내 신호 전달 영역을 포함하는 조절 가능 CAR을 생산한다. 일부 구현예에서, 다량체화는 조절 가능 CAR을 함유하는 조작된 세포에서 신호를 유도, 조절, 활성화, 매개 및/또는 촉진할 수 있다. 일부 구현예에서, 유도인자는 조절 가능 CAR의 적어도 하나의 폴리펩타이드에서 다량체화 도메인에 결합하고 조절 가능 CAR의 형태 변화를 유도하며, 여기서 형태 변화는 신호 전달을 활성화한다. 일부 구현예에서, 이러한 키메라 수용체에 대한 리간드의 결합은 일부 경우에 폴리펩타이드 사슬 올리고머화를 포함하여 폴리펩타이드 사슬의 형태 변화를 유도하고, 이는 수용체를 세포내 신호 전달에 적합하게 만들 수 있다.
일부 구현예에서, 유도인자는 조절 가능 CAR이 예컨대 표적 항원과 조절 가능 CAR의 상호작용 중에 원하는 세포내 신호를 생성하게 하기 위해, 조작된 세포에서 발현되는 조절 가능 CAR의 적어도 2개 폴리펩타이드 사슬의 세트를 결합 또는 다량체화(예를 들어, 이량체화)하는 기능을 한다. 유도인자에 의한 조절 가능 CAR의 적어도 2개 폴리펩타이드의 결합 또는 다량체화는 다량체화 도메인에 대한 유도인자의 결합 시 달성된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 조작된 세포에서 제1 폴리펩타이드 및 제2 폴리펩타이드는 각각 유도인자에 결합할 수 있는 다량체화 도메인을 포함할 수 있다. 유도인자에 의한 다량체화 도메인의 결합 시, 제1 폴리펩타이드 및 제2 폴리펩타이드는 함께 결합하여 원하는 세포내 신호를 생성한다. 일부 구현예에서, 다량체화 도메인은 폴리펩타이드의 세포내 부분 상에 위치한다. 일부 구현예에서, 다량체화 도메인은 폴리펩타이드의 세포외 부분 상에 위치한다.
일부 구현예에서, 조절 가능 CAR의 적어도 2개 폴리펩타이드의 세트는 2, 3, 4, 또는 5개 이상의 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 2개 폴리펩타이드의 세트는 동일한 폴리펩타이드, 예를 들어 세포내 신호 전달 영역 및 다량체화 도메인을 포함하는 2개, 3개 또는 그 이상의 동일한 폴리펩타이드이다. 일부 구현예에서, 적어도 2개 폴리펩타이드의 세트는 상이한 폴리펩타이드들, 예를 들어 리간드-(예를 들어, 항원-)결합 도메인 및 다량체화 도메인을 포함하는 제1 폴리펩타이드 및 세포내 신호 전달 영역 및 다량체화 도메인을 포함하는 제2 폴리펩타이드이다. 일부 구현예에서, 세포내 신호는 유도인자의 존재 하에서 생성된다. 일부 구현예에서, 세포내 신호는 유도인자의 부재 하에서 생성되며, 예를 들어 유도인자는 조절 가능 CAR의 적어도 2개 폴리펩타이드의 다량체화를 방해하고 이에 의해 조절 가능 CAR에 의한 세포내 신호 전달을 막는다.
다중 사슬 CAR의 일부 구현예에서, 폴리펩타이드 사슬들 중 적어도 하나를 암호화하는 핵산 서열이 내인성 CD247 유전자 자리 내로 예를 들어 HDR에 의해 통합된다. 키메라 수용체(예를 들어, 다중 사슬 CAR)의 일부 구현예에서, CD3제타(CD3ζ) 사슬 또는 이의 단편을, 일부 경우에 C 말단에 함유하는 키메라 수용체 폴리펩타이드 사슬을 암호화하는 핵산 서열이 내인성 CD247 유전자 자리 내로 예를 들어 HDR에 의해 통합된다. 일부 구현예에서, 둘 이상의 키메라 수용체 폴리펩타이드 사슬 중 다른 것, 예를 들어 CD3제타(CD3ζ) 사슬 또는 이의 단편을 함유하지 않는 것을 암호화하는 핵산 서열은 동일한 유전자 자리 내에서(예를 들어, CD3제타(CD3ζ) 사슬 또는 이의 단편을 함유하는 키메라 수용체 폴리펩타이드 사슬을 암호화하는 핵산 서열의 통상적으로 5’에 위치한 동일한 전이 유전자 서열 내에서) 표적화될 수 있다. 일부 측면에서, 둘 이상의 별도의 키메라 수용체 중 다른 것, 예를 들어 CD3제타(CD3ζ) 사슬 또는 이의 단편을 함유하지 않는 것을 암호화하는 핵산 서열의 도입은 상이한 전달 방법들을 통해, 예를 들어 일시적 전달 방법에 의해 또는 에피솜 핵산 분자로서 이루어질 수 있다.
일부 구현예에서, 다중 사슬 CAR의 폴리펩타이드 사슬들 중 하나 이상은 다량체화 도메인을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 제공된 키메라 수용체 폴리펩타이드들의 일부와 같은 수용체 폴리펩타이드들 중 하나 이상은 다량체화 도메인을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 다량체화 도메인은 유도인자의 결합 시 다량체화(예를 들어, 이량체화)할 수 있다. 본원에서 고려되는 유도인자는 화학적 유도인자 또는 단백질(예를 들어, 카스파제)을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 일부 구현예에서, 유도인자는 에스트로겐, 글루코코티코이드, 비타민 D, 스테로이드, 테트라사이클린, 시클로스포린, 라파마이신(Rapamycin), 쿠메르마이신(Coumermycin), 지베렐린(Gibberellin), FK1012, FK506, FKCsA, 리미듀시드(rimiducid) 또는 HaXS, 또는 이들의 유사체 또는 유도체로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 유도인자는 AP20187 또는 AP20187 유사체(예컨대, AP1510)이다.
일부 구현예에서, 다량체화 도메인은 본원에 제공된 유도인자와 같은 유도인자의 결합 시 다량체화(예를 들어, 이량체화)할 수 있다. 일부 구현예에서, 다량체화 도메인은 FKBP, 시클로필린 수용체, 스테로이드 수용체, 테트라사이클린 수용체, 에스트로겐 수용체, 글루코코티코이드 수용체, 비타민 D 수용체, 칼시뉴린 A, CyP-Fas, mTOR의 FRB 도메인, GyrB, GAI, GID1, Snap-tag 및/또는 HaloTag, 또는 이들의 일부 또는 유도체에서 유래된 것일 수 있다. 일부 구현예에서, 다량체화 도메인은 FK506 결합 단백질(FKBP) 또는 이의 유도체, 또는 이의 단편 및/또는 다량체, 예컨대 FKBP12v36이다. 일부 구현예에서, FKBP는 아미노산 서열 GVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKMDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLE(서열 번호: 82)를 포함한다. 일부 구현예에서, FKBP12v36은 아미노산 서열 GVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKVDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLE(서열 번호: 83)를 포함한다.
예시적인 유도인자 및 상응하는 다량체화 도메인은, 예를 들어 문헌[미국 특허 출원 공개 번호 2016/0046700, Clackson et al. (1998) Proc Natl Acad Sci U S A. 95(18):10437-42; Spencer et al. (1993) Science 262(5136):1019-24; Farrar et al. (1996) Nature 383 (6596):178-81; Miyamoto et al. (2012) Nature Chemical Biology 8(5): 465-70; Erhart et al. (2013) Chemistry 및 Biology 20(4): 549-57)]에 기술된 바와 같이, 공지되어 있다. 일부 구현예에서, 유도인자는 리미듀시드(AP1903으로도 공지됨; CAS 색인명: 2-Piperidinecarboxylic acid, 1-[(2S)-1-oxo-2-(3,4,5-trimethoxyphenyl)butyl]-, 1,2-ethanediylbis [imino (2-oxo-2, 1-ethanediyl)oxy-3,1-phenylene[(1R)-3-(3,4- Dimethoxyphenyl)propylidene]]ester, [2S-[1(R*),2R *[S*[S*[1(R*),2R]]]]]-(9Cl); CAS 등록 번호: 195514-63- 7; 분자 화학식: C78H98N4O20; 분자량: 1411.65)이고, 다량체화 도메인은 FK506 결합 단백질(FKBP)이다.
일부 구현예에서, 조작된 세포의 세포막은 유도인자에 대해 불투과성이다. 일부 구현예에서, 조작된 세포의 세포막은 유도인자에 대해 투과성이다.
일부 구현예에서, 조절 가능 CAR은 유도인자의 부재 하에서 다량체 또는 2량체의 부분이 아니다. 유도인자의 결합 시, 다량체화 도메인은 다량체화(예를 들어, 이량체화)할 수 있다. 일부 측면에서, 다량체화 도메인의 다량체화는 조절 가능 CAR의 폴리펩타이드의 조절 가능 CAR의 다른 폴리펩타이드와의 다량체화, 예를 들어 조절 가능 CAR의 적어도 2개 폴리펩타이드의 다량체 복합체를 초래한다. 일부 구현예에서, 다량체화 도메인의 다량체화는 신호 전달 성분의 물리적 접근성 또는 다량체 또는 이량체의 형성을 유도함으로써 신호 전달을 유도, 조절, 활성화, 매개 및/또는 촉진할 수 있다. 일부 구현예에서, 유도인자의 결합 시, 다량체화 도메인의 다량체화는 또한 다량체화 도메인에 직접 또는 간접적으로 연결된 신호 전달 도메인의 다량체화를 유도한다. 일부 구현예에서, 다량체화는 신호 전달 도메인 또는 영역을 통한 신호 전달을 유도, 조절, 활성화, 매개 및/또는 촉진한다. 일부 구현예에서, 다량체화 도메인에 연결된 신호 전달 도메인 또는 영역은 세포내 신호 전달 영역이다.
일부 구현예에서, 다량체화 도메인은 세포내이거나 조작된 세포(예를 들어, 조작된 T 세포)의 세포내 또는 세포질 측의 세포막과 회합된다. 일부 측면에서, 세포내 다량체화 도메인은 막 회합 도메인(예를 들어, 지질 연결 도메인), 예컨대 미리스토일화 도메인, 팔미토일화 도메인, 프레닐화 도메인, 또는 막관통 도메인에 연결된다. 일부 구현예에서, 다량체화 도메인은 세포내이고, 막관통 도메인을 통해 세포외 리간드-(예를 들어, 항원-)결합 도메인에 연결된다. 일부 구현예에서, 세포내 다량체화 도메인은 세포내 신호 전달 영역에 직접 또는 간접적으로 연결된다. 일부 측면에서, 다량체화 도메인의 유도된 다량체화는 또한 세포내 신호 전달 영역들을 서로 근접하게 하여 다량체화, 예를 들어 이량체화를 허용하고 세포내 신호 전달을 자극한다. 일부 구현예에서, 조절 가능 CAR의 폴리펩타이드는 막관통 도메인, 하나 이상의 세포내 신호 전달 영역(들), 및 하나 이상의 다량체화 도메인(들)을 포함하고, 이들 각각은 직접 또는 간접적으로 연결된다.
일부 구현예에서, 다량체화 도메인은 세포외이거나 조작된 세포(예를 들어, 조작된 T 세포)의 세포외 측의 세포막과 회합된다. 일부 측면에서, 세포외 다량체화 도메인은 막 회합 도메인(예를 들어, 지질 연결 도메인), 예컨대 미리스토일화 도메인, 팔미토일화 도메인, 프레닐화 도메인, 또는 막관통 도메인에 연결된다. 일부 구현예에서, 세포외 다량체화 도메인은 리간드-결합 도메인, 예를 들어, 항원 결합 도메인에 예컨대 질병과 연관된 항원에 결합하기 위해 직접 또는 간접적으로 연결된다. 일부 구현예에서, 다량체화 도메인은 세포외이고, 막관통 도메인을 통해 세포내 신호 전달 영역에 연결된다.
일부 측면에서, 막 회합 도메인은 기존 막관통 단백질의 막관통 도메인이다. 일부 예에서, 막 회합 도메인은 본원에 기술된 임의의 막관통 도메인이다. 일부 측면에서, 막 회합 도메인은 단백질-단백질 상호작용 모티프들 또는 막관통 서열들을 함유한다.
일부 측면에서, 막 회합 도메인은 미리스토일화 도메인, 팔미토일화 도메인, 프레닐화 도메인(즉, 파르네실화, 게라닐-게라닐화, CAAX Box)과 같은 아실화 도메인이다. 예를 들어, 막 회합 도메인은 단백질의 N 말단 또는 C 말단에 존재하는 아실화 서열모티프일 수 있다. 이러한 도메인은 아실 모이어티를 그 도메인을 함유하는 폴리펩타이드에 전달하는 아실전이효소에 의해 인식될 수 있는 특정 서열 모티프를 함유한다. 예를 들어, 아실화 모티프는 단일 아실 모이어티로 변형될 수 있다(일부 경우에, 이어서 양으로 하전된 여러 잔기(예를 들어, 인간 c-Src: MGSNKSKPKDASQRRR(서열 번호: 84))에 의해 음이온성 지질 헤드 그룹과의 회합을 향상시킨다). 다른 측면에서, 아세틸화 모티프는 다수의 아실 모이어티로 변형될 수 있다. 예를 들어, 이중 아실화 영역은 Src 계열 멤버의 서브세트(예를 들어, Yes, Fyn, Lck) 및 G-단백질 알파 서브유닛과 같은 특정 단백질 키나아제의 N 말단 영역 내에 위치한다. 예시적인 이중 아실화 영역은 서열 모티프 Met-Gly-Cys-Xaa-Cys(서열 번호: 85)를 함유하고, 여기서 Met는 절단되고, Gly는 N-아실화되고 Cys 잔기들 중 하나는 S-아실화된다. Gly는 종종 미리스토일화되고 Cys는 팔미토일화될 수 있다.
다른 예시적인 아실화 영역은, C15 또는 O10 이소프레닐 모이어티로 변형될 수 있고 공지된(예를 들어, 문헌[Gauthier-Campbell et al. (2004) Molecular Biology of the Cell 15:2205-2217; Glabati et al. (1994) Biochem. J. 303: 697-700 and Zlakine et al. (1997) J. Cell Science 110:673-679; ten Klooster et al. (2007) Biology of the Cell 99:1-12; Vincent et al. (2003) Nature Biotechnology 21:936-40] 참조) 서열 모티프 Cys-Ala-Ala-Xaa(소위 “CAAX 박스”, 서열 번호: 86)를 포함한다. 일부 구현예에서, 아실 모이어티는 C1-C20 알킬, C2-C20 알케닐, C2-C20 알키닐, C3-C6 사이클로알킬, C1-C4 할로알킬, C4-C12 사이클로알킬알킬, 아릴, 치환된 아릴 또는 아릴(C1-C4) 알킬이다. 일부 구현예에서, 아실-함유 모이어티는 지방산이고, 지방산의 예는 프로필(C3), 부틸(C4), 펜틸(C5), 헥실(C6), 헵틸(C7), 옥틸(C8), 노닐(C9), 데실(C10), 운데실(C11), 라우릴(C12), 미리스틸(C14), 팔미틸(C16), 스테아릴(C18), 아라키딜(C20), 베헤닐(C22) 및 리그노세릴(C24) 모이어티들이 있고, 각 모이어티는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개의 불포화 결합(즉, 이중 결합)을 함유할 수 있다. 일부 예에서, 아실 모이어티는 지질 분자, 예컨대 포스파티딜 지질(예를 들어, 포스파티딜 세린, 포스파티딜 이노시톨, 포스파티딜 에탄올아민, 포스파티딜 콜린), 스핑고지질(예를 들어, 스핑고미엘린, 스핑고신, 세라마이드, 강글리오사이드, 세레브로사이드), 또는 이들의 변형된 버전이다. 특정 구현예에서, 1, 2, 3, 4 또는 5개 또는 그 이상의 아실 모이어티가 막 회합 도메인에 연결된다.
일부 측면에서, 막 회합 도메인은 당지질(글리코실 포스파티딜이노시톨 또는 GPI로도 공지됨)의 첨가를 촉진하는 도메인이다. 일부 측면에서, GPI 분자는 트랜스아미드화 반응에 의해 단백질 표적에 전사 후 부착되고, 이는 카르복시 말단 GPI 신호 서열(예를 들어, 문헌[White et al. (2000) J. Cell Sci. 113:721] 참조)의 절단 및 이미 합성된 GPI 앵커 분자를 새로 형성된 카르복시 말단 아미노산으로의 동시 전달(예를 들어, 문헌[Varki A, et al., editors. Essentials of Glycobiology. Cold Spring Harbor (NY): Cold Spring Harbor Laboratory Press; 1999. Chapter 10, Glycophospholipid Anchors. Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK20711/] 참조)을 초래한다. 특정 구현예에서, 막 회합 도메인은 GPI 신호 서열이다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 바와 같은 다량체화 도메인은 세포내 신호 전달 영역, 예를 들어 1차 신호 전달 영역 및/또는 공자극 신호 전달 도메인에 연결된다. 일부 구현예에서, 다량체화 도메인은 세포외이고, 막관통 도메인을 통해 세포내 신호 전달 영역에 연결된다. 일부 구현예에서, 다량체화 도메인은 세포내이고, 막관통 도메인을 통해 리간드-(예를 들어, 항원-)결합 도메인에 연결된다. 리간드-결합 도메인과 막관통 도메인은 직접 또는 간접적으로 연결될 수 있다. 일부 구현예에서, 리간드-결합 도메인과 막관통은 본원에 기술된 임의의 것과 같은 스페이서에 의해 연결된다. 일부 구현예에서, 다량체화 도메인은 FK506 결합 단백질(FKBP) 또는 이의 유도체 또는 단편, 예컨대 FKBP12v36이다. 일부 예에서, 리미듀시드와 같은 유도인자의 도입 시, 조절 가능 CAR이 다량체화(예를 들어, 이량체화)되고, 이에 의해 다량체화 도메인과 회합된 신호 전달 도메인을 자곡하고 다량체 복합체를 형성한다. 다량체 복합체의 형성은 세포내 신호 전달 영역을 통해 신호를 유도, 조절, 자극, 활성화, 매개 및/또는 촉진하는 것을 초래한다.
일부 구현예에서, 조절 가능 CAR을 통한 신호 전달은 조건부 다량체화를 통해 조건부 방식으로 조절될 수 있다. 예를 들어, 조절 가능 CAR의 폴리펩타이드의 다량체화 도메인은 유도인자에 결합하여 다량체화할 수 있고, 유도인자는 외인성으로 제공될 수 있다. 일부 측면에서, 유도인자의 결합 시, 다량체화 도메인은 다량체화하고 신호 전달 도메인을 통해 신호 전달을 유도, 조절, 활성화, 매개 및/또는 촉진한다. 예를 들어, 유도인자는 외인성으로 투여될 수 있고, 이에 의해 조절 가능 CAR을 함유하는 조작된 세포에 제공되는 신호의 위치와 기간을 조절한다. 일부 구현예에서, 조절 가능 CAR의 폴리펩타이드의 다량체화 도메인은 유도인자에 결합하여 다량체화할 수 있고, 유도인자는 내인성으로 제공될 수 있다. 예를 들어, 유도인자는 유도성 또는 조건부 프로모터의 제어 하에 재조합 발현 벡터로부터의 조작된 세포(예를 들어, 조작된 T 세포)에 의해 또는 조작된 세포의 게놈으로부터 내인성으로 생성될 수 있고, 이에 의해 조절 가능 CAR을 함유하는 조작된 세포에 제공되는 신호의 위치와 기간을 조절한다.
일부 구현예에서, 조절 가능 CAR은 자살 스위치(suicide switch)를 사용하여 제어된다. 예시적인 키메라 수용체는, 인간 카스파제-9 및 변형된 FKBP 이량체화 도메인의 융합물을 포함하고 유도인자(예를 들어, AP1903)와 결합 시 조건부 이량체화를 허용하는, 유도성 카스파제-9(iCasp9) 시스템을 이용한다. 유도인자의 결합에 의한 다량체화 시, 카스파제-9는 활성화되고 키메라 수용체를 발현하는 세포의 세포자연사 및 세포사(cell death)를 초래한다(예를 들어, 문헌[Di Stasi et al. (2011) N. Engl. J. Med. 365:1673-1683] 참조).
일부 구현예에서, 예시적인 조절 가능 CAR은: (1) (i) 세포내 신호 전달 영역, 및 (ii) 유도인자에 결합할 수 있는 적어도 하나의 다량체화 도메인을 포함하는 조절 가능 CAR의 제1 폴리펩타이드; 및 (2) (i) 리간드-(예를 들어, 항원-)결합 도메인, (ii) 막관통 도메인, 및 (iii) 유도인자에 결합할 수 있는 적어도 하나의 다량체화 도메인을 포함하는 조절 가능 CAR의 제2 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 예시적인 조절 가능 CAR은: (1) (i) 막관통 도메인 또는 아실화 도메인, (ii) 세포내 신호 전달 영역, 및 (iii) 유도인자에 결합할 수 있는 적어도 하나의 다량체화 도메인을 포함하는 조절 가능 CAR의 제1 폴리펩타이드; 및 (2) (i) 리간드-(예를 들어, 항원-)결합 도메인, (ii) 막관통 도메인, 및 (iii) 유도인자에 결합할 수 있는 적어도 하나의 다량체화 도메인을 포함하는 조절 가능 CAR의 제2 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포내 신호 전달 영역은 또한 공자극 신호 전달 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 폴리펩타이드는 공자극 신호 전달 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 두 폴리펩타이드 상의 적어도 하나의 다량체화 도메인(들)은 세포내이다. 일부 구현예에서, 두 폴리펩타이드 상의 적어도 하나의 다량체화 도메인(들)은 세포외이다.
일부 구현예에서, 예시적인 조절 가능 CAR은: (1) (i) 유도인자에 결합할 수 있는 적어도 하나의 세포외 다량체화 도메인, (ii) 막관통 도메인, 및 (iii) 세포내 신호 전달 영역을 포함하는 조절 가능 CAR의 제1 폴리펩타이드; 및 (2) (i) 리간드-(예를 들어, 항원-)결합 도메인, (ii) 유도인자에 결합할 수 있는 적어도 하나의 세포외 다량체화 도메인, 및 (iii) 막관통 도메인, 아실화 도메인 또는 GPI 신호 서열을 포함하는 조절 가능 CAR의 제2 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포내 신호 전달 영역은 또한 공자극 신호 전달 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 폴리펩타이드는 공자극 신호 전달 도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, 예시적인 조절 가능 CAR은: (1) (i) 막관통 도메인 또는 아실화 도메인, (ii) 적어도 하나의 공자극 도메인, 및 (iii) 유도인자에 결합할 수 있는 다량체화 도메인, (iv) 세포내 신호 전달 영역을 포함하는 조절 가능 CAR의 제1 폴리펩타이드; 및 (2) (i) 리간드-(예를 들어, 항원-)결합 도메인, (ii) 막관통 도메인, (iii) 적어도 하나의 공자극 도메인, 및 (iv) 유도인자에 결합할 수 있는 적어도 하나의 세포외 다량체화 도메인을 포함하는 조절 가능 CAR의 제2 폴리펩타이드를 포함한다.
일부 측면에서, 예시적인 조절 가능 CAR에 기술된 임의의 영역 및/또는 도메인은 다양하게 상이한 순서로 순서가 이루어질 수 있다. 일부 측면에서, 조절 가능 CAR(들)의 다양한 폴리펩타이드들은 세포막의 동일한 면에 다량체화 도메인을 함유하며, 예를 들어 둘 이상의 폴리펩타이드 내 다량체화 도메인은 모두 세포내이거나 모두 세포외이다.
조절 가능한 CAR의 변형은 공지되어 있으며, 예를 들어 문헌[미국 특허 출원 공개 번호 2014/0286987, 미국 특허 출원 공개 번호 2015/0266973, 국제 특허 출원 공개 번호 WO2014/127261 및 국제 특허 출원 공개 번호 WO2015/142675]에 기술된다.
3. 키메라 자가항체 수용체(CAAR)
일부 구현예에서, 변형된 CD247 유전자 자리에 의해 암호화된 키메라 수용체는 키메라 자가항체 수용체(CAAR)이다. 일부 측면에서, CAAR은 CD3제타(CD3ζ) 사슬 또는 이의 단편 또는 부분, 예컨대 CD3ζ 신호 전달 도메인을 포함한다. 일부 측면에서, CD3ζ 신호 전달 도메인의 전부(예를 들어, 전체 CD3ζ 신호 전달 도메인) 또는 단편은 내인성 CD247 유전자 자리의 개방형 해독틀 또는 이의 부분 서열에 의해 암호화된다. 일부 구현예에서, CAAR은 자가항체에 결합(예를 들어, 특이적으로 결합)하거나 이를 인식한다. 일부 구현예에서, CAAR을 발현하도록 조작된 T 세포와 같은 CAAR을 발현하는 세포는 정상적인 항체 발현 세포가 아닌 자가항체 발현 세포에 결합하여 이를 사멸하는 데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, CAAR 발현 세포는 자가면역 질환과 같은 자가항원 발현과 관련된 자가면역 질환을 치료하는 데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, CAAR 발현 세포는 궁극적으로 자가항체를 생산하고 세포 표면에 자가항체를 나타내는 B 세포를 표적화할 수 있고, 치료적 개입을 위한 질병 특이적 표적으로 상기 B 세포를 표지할 수 있다. 일부 구현예에서, CAAR 발현 세포는 항원 특이적 키메라 자가항체 수용체를 이용하여 질병을 유발하는 B 세포를 표적화함으로써 자가면역 질환에서 병원성 B 세포를 효율적으로 표적화하고 사멸시키는 데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 키메라 수용체는 문헌[미국 특허 출원 공개 번호 US 2017/0051035]에 기술된 어느 하나와 같은 CAAR이다.
일부 구현예에서, CAAR은 자가항체 결합 도메인, 막관통 도메인, 및 하나 이상의 세포내 신호 전달 영역 또는 도메인(상호 교환적으로 세포질 신호 전달 도메인 또는 영역으로도 불림)을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포내 신호 전달 영역은 세포내 신호 전달 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포내 신호 전달 도메인은 1차 신호 전달 영역, T 세포에서 1차 활성화 신호를 자극 및/또는 유도할 수 있는 신호 전달 도메인, T 세포 수용체(TCR) 성분의 신호 전달 도메인(예를 들어, CD3-제타(CD3ζ) 사슬 또는 이의 기능적 변이체 또는 신호 전달 부분의 세포내 신호 전달 도메인 또는 영역), 및/또는 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프(ITAM)를 포함하는 신호 전달 도메인이거나 이를 포함한다.
일부 구현예에서, 자가항체 결합 도메인은 자가항원 또는 이의 단편을 포함한다. 자가항원의 선택은 표적화되는 자가항체의 유형에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, 자가항원은 특정 질병 상태, 예를 들어 자가면역 질환, 예컨대 자가항체 매개 자가면역 질환과 관련된 B 세포와 같은 표적 세포 상의 자가항체를 인식하기 때문에 선택될 수 있다. 일부 구현예에서, 자가면역 질환은 심상성 천포창(pemphigus vulgaris, PV)을 포함한다. 예시적인 자가항원은 데스모글레인 1(desmoglein 1, Dsg1) 및 Dsg3을 포함한다.
C. 유전자 조작을 위한 세포 및 세포 제조
일부 구현예에서, 조작된 세포, 예를 들어 유전자 조작된 또는 변형된 세포, 및 재조합 수용체 또는 이의 일부를 암호화하는 전이 유전자 서열을 포함하는 변형된 CD247 유전자 자리를 포함하는 유전자 조작된 세포를 포함하여 세포를 조작하는 방법이 제공된다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드들, 예를 들어, 키메라 수용체 및/또는 추가 분자(들)의 일부를 암호화하는 전이 유전자 서열을 포함하는 핵산 서열을 함유하는, 본원의 예컨대 섹션 I.B.2에 기술된 주형 폴리뉴클레오타이드들이 예를 들어 본원에 기술된 조작 방법에 따라 조작을 위한 하나의 세포 내로 도입된다. 일부 측면에서, 세포는 본원에 제공된 임의의 방법을 사용하여 조작된다. 일부 구현예에서, 조작된 세포는 변형된 CD247 유전자 자리를 함유하고 상기 변형된 CD247 유전자 자리는 CD3제타(CD3ζ) 신호 전달 도메인을 포함하는 세포내 영역을 포함하는 키메라 수용체를 암호화하는 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 조작된 세포의 변형된 CD247 유전자 자리는 본원의 섹션 III.A에 기술된 것을 포함한다.
일부 측면에서, 폴리뉴클레오타이드(예컨대 예를 들어 본원의 섹션 I.B.2에 기술된 주형 폴리뉴클레오타이드) 및/또는 이의 부분들 내 전이 유전자 서열(본원의 섹션 I.B.2에 기술된 것과 같은, 외인성 또는 이종성 핵산 서열)은 이종 기원인데, 즉, 다른 유기체 또는 세포로부터 수득된 것과 같이 세포 또는 세포로부터 수득된 샘플에는 일반적으로 존재하지 않으며, 예를 들어, 이는 조작되는 세포 및/또는 상기 세포가 유래된 유기체에서 보통 발견되지 않는다. 일부 구현예에서, 핵산 서열은 자연에서 발견되지 않는 핵산 서열과 같이 천연 발생이 아니거나 다수의 상이한 세포 유형으로부터 다양한 도메인을 암호화하는 핵산의 키메라 조합을 포함하는 것을 포함해, 자연에서 발견되는 핵산 서열로부터 변형된 것이다.
일부 측면에서, 유전자 조작된 T 세포를 생산하는 방법이 제공되고, 상기 방법은, 예를 들어, 본원의 섹션 I.B.2에 기술된, 제공된 임의의 폴리뉴클레오타이드를 CD247 유전자 자리에 유전자 파괴를 포함하는 T 세포 내로 도입하는 것을 포함한다. 일부 측면에서, 유전자 파괴는 본원의 예컨대 섹션 I.A에 기술된 것을 포함하여 표적화된 유전자 파괴를 도입하기 위한 임의의 제제 또는 방법에 의해 도입된다. 일부 측면에서, 본 방법은 변형된 CD247 유전자 자리를 생산하고, 상기 변형된 CD247 유전자 자리는 CD3제타(CD3ζ) 신호 전달 도메인을 포함하는 세포내 영역을 포함하는 키메라 수용체를 암호화하는 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면에서, T 세포 내로, T 세포의 내인성 CD247 유전자 자리 내의 표적 부위에서 유전자 파괴를 유도할 수 있는 하나 이상의 제제(들)을 도입하는 것과 CD247 유전자 자리에 유전자 파괴를 포함하는 T 세포 내로, 예를 들어 본원의 섹션 I.B.2에 기술된, 임의의 제공된 폴리뉴클레오타이드들을 도입하는 것을 포함하는 유전자 조작된 T 세포를 생산하는 방법이 제공되고, 여기서 상기 방법은 변형된 CD247 유전자 자리를 생산하고, 상기 변형된 CD247 유전자 자리는 CD3제타(CD3ζ) 신호 전달 도메인을 포함하는 세포내 영역을 포함하는 키메라 수용체를 암호화하는 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 핵산 서열은 키메라 수용체의 일부를 암호화하는 전이 유전자 서열을 포함하며, 전이 유전자 서열은 상동 직접 수선(HDR)을 통해 내인성 CD247 유전자 자리 내에서 통합을 위해 표적화된다.
일부 구현예에서, T 세포 내로, 키메라 수용체 또는 이의 일부를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 도입하는 것을 포함하는 유전자 조작된 T 세포를 생산하는 방법이 제공되고, 상기 T 세포는 T 세포의 CD247 유전자 자리 내에 유전자 파괴를 가지며, 여기서 키메라 수용체 또는 이의 일부를 암호화하는 핵산 서열은 상동 직접 수선(HDR)을 통해 내인성 CD247 유전자 자리 내에서 통합을 위해 표적화된다. 일부 구현예에서, 본 방법은 변형된 CD247 유전자 자리를 생산하고, 상기 변형된 CD247 유전자 자리는 CD3제타(CD3ζ) 신호 전달 도메인을 포함하는 세포내 영역을 포함하는 키메라 수용체를 암호화하는 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 핵산 서열은 예컨대 본원의 예를 들어 섹션 I.B.2에 기술된 것과 같은 키메라 수용체의 일부를 암호화하는 전이 유전자 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 방법의 수행 시, 유전자 조작된 T 세포 내 CD3ζ 신호 전달 도메인의 전부(예를 들어, 전체 또는 전 CD3ζ 신호 전달 도메인) 또는 단편은 내인성 CD247 유전자 자리의 개방형 해독틀 또는 이의 부분 서열에 의해 암호화된다. 일부 구현예에서, 핵산 서열은 키메라 수용체의 일부를 암호화하는 전이 유전자 서열을 포함하고, 상기 일부는 선택적으로 CD3제타 신호 전달 도메인의 단편(예컨대 전체 CD3ζ의 일부; 예컨대 전체 CD3ζ 신호 전달 도메인 또는 전장 CD3ζ 신호 전달 도메인 미만)을 암호화하고, 여기서 개방형 해독틀 또는 이의 부분 서열은 CD3제타 신호 전달 도메인(예컨대 전체 또는 전 CD3ζ 신호 전달 도메인)을 암호화하거나, 선택적으로 CD3제타 신호 전달 도메인의 추가 단편을 암호화한다. 일부 구현예에서, 암호화된 키메라 수용체의 CD3제타 신호 전달 도메인의 적어도 단편, 선택적으로 전체 CD3제타 신호 전달 도메인은 내인성 CD247 유전자 자리의 개방형 해독틀 또는 이의 부분 서열에 의해 암호화된다.
세포는 일반적으로 포유류 세포와 같은 진핵 세포이며, 통상적으로 인간 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 혈액, 골수, 림프, 또는 림프성 기관으로부터 유래되며, 선천성 또는 적응성 면역 세포와 같은, 면역 계통의 세포, 예를 들어 림프구, 통상적으로 T 세포 및/또는 NK 세포를 포함한 골수성 또는 림프성 세포이다. 다른 예시적인 세포에는 유도된 다능성 줄기 세포(induced pluripotent stem cell: iPSC)를 포함한, 다분화능 및 다능성 줄기 세포와 같은 줄기 세포가 포함된다. 세포는 통상적으로 대상체로부터 직접 단리되고/거나 대상체로부터 단리되고 동결된 세포와 같은 1차 세포이다. 일부 구현예에서, 세포에는 T 세포 또는 다른 세포 유형의 하나 이상의 서브세트, 예컨대 전체 T 세포의 집단, CD4+ 세포, CD8+ 세포 및 이의 하위 집단, 예컨대 기능, 활성화 상태, 성숙도, 분화 가능성, 증폭, 재순환, 국소화 및/또는 지속성 용량, 항원 특이성, 항원 수용체 유형, 특정 기관 또는 구획에의 존재, 표지자 또는 사이토카인 분비 프로필 및/또는 분화 정도에 의해 정의되는 것이 포함된다. 치료될 대상체와 관련하여, 세포는 동종이계 및/또는 자가 조직일 수 있다. 상기 방법 중에는 기성 방법이 포함된다. 일부 측면에서, 예컨대 기성 기술에 대해, 세포는 iPSC와 같은 줄기 세포 등과 같은 다능성 및/또는 다분화능이다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 대상체로부터 세포를 단리하고, 세포를 제조, 가공, 배양 및/또는 조작하고, 냉동 보존 전 또는 후에 동일한 대상체에 이 세포를 재도입하는 것을 포함한다.
T 세포 및/또는 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포의 아형 및 하위 집단 중에는 나이브 T(naive T, TN) 세포, 효과기 T 세포(effector T cell, TEFF), 기억 T 세포 및 이의 하위-유형, 예컨대 줄기 세포 기억 T(stem cell memory T, TSCM), 중앙 기억 T(central memory T, TCM), 효과기 기억 T(effector memory T, TEM) 또는 말단 분화된 효과기 기억 T 세포, 종양 침윤성 림프구(tumor-infiltrating lymphocytes, TIL), 미성숙 T 세포, 성숙 T 세포, 헬퍼 T 세포, 세포 독성 T 세포, 점막 연관 불변 T(mucosa-associated invariant T, MAIT) 세포, 천연 발생 및 적응성 조절 T(regulatory T, Treg) 세포, 헬퍼 T 세포, 예컨대 TH1 세포, TH2 세포, TH3 세포, TH17 세포, TH9 세포, TH22 세포, 여포성 헬퍼 T 세포, 알파/베타 T 세포 및 델타/감마 T 세포가 있다.
일부 구현예에서, 세포는 자연 살생(natural killer, NK) 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 단핵구 또는 과립구, 예를 들어 골수성 세포, 대식 세포, 호중구, 수지상 세포, 비만 세포, 호산구 및/또는 호염기구이다. 일부 구현예에서, 세포는 유전자 조작을 통해 도입된 하나 이상의 핵산을 포함하고 이로써 상기 핵산의 재조합 또는 유전자 조작된 산물을 발현한다. 일부 구현예에서, 핵산은 이종 기원인데, 즉, 다른 유기체 또는 세포로부터 수득된 것과 같이 세포 또는 세포로부터 수득된 샘플에는 정상적으로 존재하지 않으며, 예를 들어, 이는 조작되는 세포 및/또는 상기 세포가 유래된 유기체에서 보통 발견되지 않는다. 일부 구현예에서, 핵산은 천연 발생이 아니고, 예컨대 다수의 상이한 세포 유형으로부터 다양한 도메인을 암호화하는 핵산의 키메라 조합을 포함하는 것을 포함해, 자연에서 발견되지 않는 핵산이다.
일부 구현예에서, 조작된 세포의 제조는 하나 이상의 배양 및/또는 제조 단계를 포함한다. CAR과 같은 형질전환 수용체(transgenic receptor)를 암호화하는 핵산의 도입을 위한 세포는, 생물학적 샘플, 예를 들어 대상체로부터 수득되거나 유래된 것과 같은 샘플로부터 단리될 수 있다. 일부 구현예에서, 세포가 단리되는 대상체는 질병 또는 병태가 있거나 세포 요법이 필요하거나 또는 세포 요법이 투여될 대상체이다. 일부 구현예에서, 대상체는 세포가 단리, 가공 및/또는 조작되는 입양 세포 요법과 같은 특정한 치료적 개입이 필요한 인간이다.
따라서, 일부 구현예에서 세포는 1차 세포, 예를 들어 1차 인간 세포이다. 샘플에는 대상체에서 직접 채취한 조직, 체액 및 기타 샘플뿐만 아니라 분리, 원심분리, 유전자 조작(예를 들어, 바이러스 벡터를 이용한 형질도입), 세척 및/또는 인큐베이션과 같은 하나 이상의 가공 단계에서 생성된 샘플이 포함된다. 생물학적 샘플은 생물학적 공급원으로부터 직접 수득된 샘플 또는 가공된 샘플일 수 있다. 생물학적 샘플에는 혈액, 혈장, 혈청, 뇌척수액, 활액, 소변 및 땀과 같은 체액, 조직 및 장기 샘플(이들로부터 유래된 가공 샘플 포함)이 포함되나, 이에 한정되지 않는다.
일부 측면에서, 세포가 유래되거나 단리된 샘플은 혈액 또는 혈액 유래 샘플이거나, 성분채집술 또는 백혈구 성분채집술 산물이거나 이로부터 유래된다. 예시적인 샘플에는 전혈, 말초 혈액 단핵 세포(peripheral blood mononuclear cell, PBMC), 백혈구, 골수, 흉선, 조직 생검, 종양, 백혈병, 림프종, 림프절, 장 관련 림프 조직, 점막 관련 림프 조직, 비장, 기타 림프 조직, 간, 폐, 위, 창자, 결장, 신장, 췌장, 유방, 뼈, 전립선, 자궁경부, 고환, 난소, 편도 또는 기타 장기 및/또는 이들로부터 유래된 세포가 포함된다. 샘플에는 세포 요법, 예를 들어, 입양 세포 요법의 맥락에서 자가 및 동종이계 공급원으로부터의 샘플이 포함된다.
일부 구현예에서, 세포는 세포주, 예를 들어 T 세포주로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 세포는 이종성 공급원, 예를 들어 마우스, 랫트, 비인간 영장류 및 돼지로부터 수득된다.
일부 구현예에서, 세포의 단리는 하나 이상의 제조 단계 및/또는 비친화도 기반 세포 분리 단계를 포함한다. 일부 실시예에서, 세포는 예를 들어 원치 않는 성분의 제거, 원하는 성분의 농축, 특정 시약에 민감한 세포를 용해하거나 제거하기 위해, 하나 이상의 시약의 존재 하에 세척, 원심분리 및/또는 인큐베이션된다. 일부 실시예에서, 세포는 하나 이상의 특성, 예컨대 밀도, 부착 특성, 크기, 특정 성분에 대한 민감성 및/또는 내성에 기초하여 분리된다.
일부 예에서, 대상체의 순환 혈액으로부터의 세포는 예를 들어 성분채집술 또는 백혈구 성분채집술에 의해 수득된다. 일부 측면에서, 샘플은 T 세포, 단핵구, 과립구, B 세포, 기타 유핵 백혈구, 적혈구 및/또는 혈소판을 포함한 림프구를 함유하고, 일부 측면에서 적혈구 및 혈소판 이외의 세포를 함유한다.
일부 구현예에서, 대상체로부터 수집된 혈액 세포는, 예를 들어 혈장 분획을 제거하고 후속 가공 단계를 위한 적절한 완충제 또는 배지에 세포를 배치하기 위해 세척한다. 일부 구현예에서, 세포는 인산 완충 식염수(phosphate buffered saline, PBS)로 세척된다. 일부 구현예에서, 세척 용액에는 칼슘 및/또는 마그네슘 및/또는 많은 또는 모든 2가 양이온이 결여되어 있다. 일부 측면에서, 세척 단계는 제조업체의 지침에 따라 반자동 “플로우-쓰루(flow-through)” 원심 분리기(예를 들어, Cobe 2991 세포 프로세서, Baxter)로 달성된다. 일부 측면에서, 세척 단계는 제조업체의 지침에 따라 접선 유동 여과(tangential flow filtration, TFF)에 의해 달성된다. 일부 구현예에서, 세포는 세척 후 다양한 생체 적합성 완충제, 예를 들어 Ca++/Mg++이 없는 PBS에 재현탁된다. 특정 구현예에서, 혈액 세포 샘플의 성분이 제거되고 이 세포는 배양 배지에서 직접 재현탁된다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 밀도 기반 세포 분리 방법, 예컨대 적혈구를 용해시켜 말초 혈액으로부터 백혈구의 제조 및 Percoll 또는 Ficoll 구배를 통한 원심분리를 포함한다.
일부 구현예에서, 단리 방법은 표면 표지자, 예를 들어, 표면 단백질, 세포내 표지자 또는 핵산과 같은 하나 이상의 특정 분자의 세포에서의 발현 또는 존재에 기초한 상이한 세포 유형의 분리를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 표지자에 기초한 분리를 위한 임의의 공지된 방법이 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 분리는 친화도- 또는 면역 친화도-기반 분리이다. 예를 들어, 일부 측면에서 단리에는 하나 이상의 표지자, 통상적으로 세포 표면 표지자의 세포 발현 또는 발현 수준에 기초하여, 예를 들어 상기 표지자에 특이적으로 결합하는 항체 또는 결합 파트너와의 인큐베이션 후 일반적으로 세척 단계 및 항체 또는 결합 파트너와 결합하지 않은 세포로부터 항체 또는 결합 파트너와 결합한 세포의 분리에 의한 세포 및 세포의 집단의 분리가 포함된다.
상기 분리 단계는 시약에 결합된 세포가 추가 사용을 위해 유지되는 양성 선택 및/또는 항체 또는 결합 파트너에 결합하지 않은 세포가 유지되는 음성 선택에 기초할 수 있다. 일부 실시예에서, 두 분획 모두 추가 사용을 위해 유지된다. 일부 측면에서, 음성 선택은 이종 집단에서 세포 유형을 특이적으로 식별하는 항체가 이용 가능하지 않은 경우에 특히 유용할 수 있어서, 분리는 원하는 집단 이외의 세포에 의해 발현된 표지자에 기초하여 가장 잘 수행된다.
분리는 특정 표지자를 발현하는 특정 세포 집단 또는 세포의 100% 농축 또는 제거로 귀결될 필요는 없다. 예를 들어, 표지자를 발현하는 것과 같은 특정 유형의 세포에 대한 양성 선택 또는 농축은 상기 세포의 수 또는 백분율을 증가시키는 것을 지칭하나, 상기 표지자를 발현하지 않는 세포의 완전한 부재로 귀결될 필요는 없다. 마찬가지로, 표지자를 발현하는 것과 같은 특정 유형의 세포의 음성 선택, 제거 또는 고갈은 상기 세포의 수 또는 백분율을 감소시키는 것을 지칭하나, 상기 모든 세포의 완전한 제거로 귀결될 필요는 없다.
일부 예에서, 다수 라운드의 분리 단계가 수행되고, 여기서 한 단계에서 양성 또는 음성 선택된 분획은 후속 양성 또는 음성 선택과 같은 또 다른 분리 단계를 거친다. 일부 예에서, 단일 분리 단계는 예컨대 각각 음성 선택을 위해 표적화된 표지자에 대해 특이적인 다수의 항체 또는 결합 파트너와 세포를 인큐베이션함으로써 동시에 다수의 표지자를 발현하는 세포를 고갈시킬 수 있다. 마찬가지로, 다수의 세포 유형이 다양한 세포 유형에서 발현되는 복수의 항체 또는 결합 파트너와 세포를 인큐베이션함으로써 동시에 양성 선택될 수 있다.
예를 들어, 일부 측면에서, 예컨대 하나 이상의 표면 표지자를 높은 수준으로 발현하거나 양성인 세포와 같은 T 세포, 예를 들어 CD28+, CD62L+, CCR7+, CD27+, CD127+, CD4+, CD8+, CD45RA+ 및/또는 CD45RO+ T 세포의 특정 하위 집단은 양성 또는 음성 선택 기술에 의해 단리된다.
예를 들어, CD3+, CD28+ T 세포는 항-CD3/항-CD28 접합 자성 비드(예를 들어, DYNABEADS®M-450 CD3/CD28 T Cell Expander)를 사용하여 양성 선택될 수 있다.
일부 구현예에서, 단리는 양성 선택에 의한 특정 세포의 집단에 대한 농축 또는 음성 선택에 의한 특정 세포의 집단의 고갈에 의해 수행된다. 일부 구현예에서, 양성 또는 음성 선택은 각각 양성 또는 음성 선택된 세포 상에서 발현(표지자+)되거나 상대적으로 보다 높은 수준으로 발현(표지자high)된 하나 이상의 표면 표지자에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 항체 또는 다른 결합제와 세포를 인큐베이션함으로써 달성된다.
일부 구현예에서, T 세포는 B 세포, 단핵구 또는 다른 백혈구, 예컨대 CD14와 같은 비-T 세포 상에서 발현되는 표지자의 음성 선택에 의해 PBMC 샘플로부터 분리된다. 일부 측면에서, CD4+ 또는 CD8+ 선택 단계는 CD4+ 헬퍼 및 CD8+ 세포 독성 T 세포를 분리하는 데 사용된다. 상기 CD4+ 및 CD8+ 집단은, 하나 이상의 나이브(naive), 기억 및/또는 효과기(effector) T 세포 하위 집단 상에서 발현되거나 상대적으로 보다 높은 정도로 발현되는 표지자에 대한 양성 또는 음성 선택에 의해 하위 집단으로 추가 분류될 수 있다.
일부 구현예에서, CD8+ 세포는 예컨대 각각의 하위 집단과 관련된 표면 항원에 기초한 양성 또는 음성 선택에 의해 나이브, 중앙 기억, 효과기 기억 및/또는 중앙 기억 줄기 세포에 대해 추가로 농축되거나 고갈된다. 일부 구현예에서, 중앙 기억 T(TCM) 세포의 농축은 효능을 증가시키기 위해, 예컨대 투여 후의 장기간 생존, 증폭 및/또는 생착을 향상하기 위해 수행되며, 이는 일부 측면에서 상기 하위 집단에서 특히 견고하다. 문헌[Terakura et al. (2012) Blood.1:72-82; Wang et al. (2012) J Immunother. 35(9):689-701]을 참조한다. 일부 구현예에서, TCM-농축 CD8+ T 세포 및 CD4+ T 세포의 조합은 효능을 더욱 향상시킨다.
일부 구현예에서, T 세포는 B 세포, 단핵구 또는 다른 백혈구, 예컨대 CD14와 같은 비-T 세포 상에서 발현되는 표지자의 음성 선택에 의해 PBMC 샘플로부터 분리된다. 일부 측면에서, CD4+ 또는 CD8+ 선택 단계는 CD4+ 헬퍼 및 CD8+ 세포 독성 T 세포를 분리하는 데 사용된다. 상기 CD4+ 및 CD8+ 집단은, 하나 이상의 나이브(naive), 기억 및/또는 효과기(effector) T 세포 하위 집단 상에서 발현되거나 상대적으로 보다 높은 정도로 발현되는 표지자에 대한 양성 또는 음성 선택에 의해 하위 집단으로 추가 분류될 수 있다.
일부 구현예에서, CD8+ 세포는 예컨대 각각의 하위 집단과 관련된 표면 항원에 기초한 양성 또는 음성 선택에 의해 나이브, 중앙 기억, 효과기 기억 및/또는 중앙 기억 줄기 세포에 대해 추가로 농축되거나 고갈된다. 일부 구현예에서, 중앙 기억 T(TCM) 세포의 농축은 효능을 증가시키기 위해, 예컨대 투여 후의 장기간 생존, 증폭 및/또는 생착을 향상하기 위해 수행되며, 이는 일부 측면에서 상기 하위 집단에서 특히 견고하다. 문헌[Terakura et al. (2012) Blood.1:72-82; Wang et al. (2012) J Immunother. 35(9):689-701]을 참조한다. 일부 구현예에서, TCM-농축 CD8+ T 세포 및 CD4+ T 세포의 조합은 효능을 더욱 향상시킨다.
일부 구현예에서, 기억 T 세포는 CD8+ 말초 혈액 림프구의 CD62L+ 및 CD62L- 서브세트 모두에 존재한다. PBMC는 예컨대 항-CD8 및 항-CD62L 항체를 사용하여 CD62L-CD8+ 및/또는 CD62L+CD8+ 분획에 대해 농축되거나 고갈될 수 있다.
일부 구현예에서, 중앙 기억 T(TCM) 세포의 농축은 CD45RO, CD62L, CCR7, CD28, CD3 및/또는 CD127의 양성 또는 고도의 표면 발현에 기초하고; 일부 측면에서, 이는 CD45RA 및/또는 그랜자임 B를 발현하거나 고도로 발현하는 세포에 대한 음성 선택에 기초한다. 일부 측면에서, TCM 세포에 대해 농축된 CD8+ 집단의 단리는 CD4, CD14, CD45RA를 발현하는 세포의 고갈 및 CD62L을 발현하는 세포에 대한 양성 선택 또는 농축에 의해 수행된다. 일 측면에서, 중앙 기억 T(TCM) 세포에 대한 농축은 CD4 발현에 기초하여 선택된 세포의 음성 분획으로 시작하여 수행되며, 이는 CD14 및 CD45RA의 발현에 기초한 음성 선택 및 CD62L에 기초한 양성 선택을 거친다. 일부 측면에서, 상기 선택은 동시에 수행되며, 다른 측면에서, 순차적으로, 어떠한 순서로든 수행된다. 일부 측면에서, CD8+ 세포의 집단 또는 하위 집단을 제조하는 데 사용된 동일한 CD4 발현 기반 선택 단계가 CD4+ 세포의 집단 또는 하위 집단을 생성하는 데 또한 사용되어, CD4 기반 분리로부터의 양성 및 음성 분획 모두가 유지되고, 선택적으로 하나 이상의 추가적인 양성 또는 음성 선택 단계 후에 본 방법의 후속 단계에서 사용된다.
구체적인 예에서, PBMC 샘플 또는 다른 백혈구 샘플은, 음성 및 양성 분획 모두가 유지되는 CD4+ 세포의 선택을 거친다. 이어서 음성 분획은 CD14 및 CD45RA 또는 CD19의 발현에 기초한 음성 선택 및 CD62L 또는 CCR7과 같은 중앙 기억 T 세포의 특유한 표지자에 기초한 양성 선택을 거치고, 양성 및 음성 선택은 어느 순서로든 수행된다.
CD4+ T 헬퍼 세포는 세포 표면 항원을 갖는 세포 집단을 식별하여 나이브, 중앙 기억 및 효과기 세포(effector cell)로 분류된다. CD4+ 림프구는 표준 방법으로 수득될 수 있다. 일부 구현예에서, 나이브 CD4+ T 림프구는 CD45RO-, CD45RA+, CD62L+, CD4+ T 세포이다. 일부 구현예에서, 중앙 기억 CD4+ 세포는 CD62L+ 및 CD45RO+이다. 일부 구현예에서, 효과기 CD4+ 세포는 CD62L- 및 CD45RO-이다.
일 예에서, 음성 선택에 의해 CD4+ 세포를 농축하기 위해, 단클론 항체 칵테일은 통상적으로 CD14, CD20, CD11b, CD16, HLA-DR 및 CD8에 대한 항체를 포함한다. 일부 구현예에서, 항체 또는 결합 파트너는 양성 및/또는 음성 선택을 위한 세포의 분리가 가능하도록 자성 비드 또는 상자성 비드와 같은 고체 지지체 또는 매트릭스에 결합된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 세포 및 세포의 집단은 면역자성(또는 자성친화도) 분리 기법을 사용하여 분리되거나 단리된다(문헌[Methods in Molecular Medicine, vol. 58: Metastasis Research Protocols, Vol. 2: Cell Behavior In Vitro and In Vivo, p 17-25 Edited by: S. A. Brooks and U. Schumacher ⓒHumana Press Inc., Totowa, NJ]에서 검토됨).
일부 측면에서, 분리될 세포 샘플 또는 세포 조성물은 작고, 자화 가능한 또는 자성 반응성 물질, 예컨대 자성 반응성 입자 또는 미세입자, 예컨대 상자성 비드(예를 들어, Dynalbeads 또는 MACS 비드)와 함께 인큐베이션된다. 자성 반응성 물질(예를 들어, 입자)은 일반적으로 분리가 바람직한, 예를 들어 음성 또는 양성 선택이 바람직한 세포 또는 세포의 집단에 존재하는 분자(예를 들어, 표면 표지자)에 특이적으로 결합하는 결합 파트너(예를 들어, 항체)에 직접 또는 간접적으로 부착된다.
일부 구현예에서, 자성 입자 또는 비드는 항체 또는 다른 결합 파트너와 같은 특이적인 결합 부재에 결합되는 자성 반응성 물질을 포함한다. 자성 분리 방법에 사용되는 널리 공지된 많은 자성 반응 물질이 있다. 적합한 자성 입자에는 본 명세서에 참조로 통합된 문헌[Molday, 미국 특허 번호 4,452,773 및 유럽 특허 명세서 EP 452342 B]에 기재된 것이 포함된다. 콜로이드 크기의 입자, 예컨대 문헌[Owen 미국 특허 번호 4,795,698 및 Liberti et al., 미국 특허 번호 5,200,084]에 기재된 것이 다른 예이다.
인큐베이션은 일반적으로 항체 또는 결합 파트너 또는 분자, 예컨대 자성 입자 또는 비드에 부착된 상기 항체 또는 결합 파트너에 특이적으로 결합하는 2차 항체 또는 다른 시약이 샘플 내의 세포 상에 존재하는 경우 세포 표면 분자에 특이적으로 결합하는 조건하에서 수행된다.
일부 측면에서, 샘플은 자기장에 배치되고, 이에 부착된 자성 반응성 또는 자화 가능 입자를 갖는 상기 세포는 자석에 끌려당겨지고 표지되지 않은 세포로부터 분리될 것이다. 양성 선택의 경우, 자석에 끌려당겨진 세포가 유지되고; 음성 선택의 경우, 끌려당겨지지 않은 세포(비표지 세포)가 유지된다. 일부 측면에서, 양성 및 음성 선택의 조합이 동일한 선택 단계 동안 수행되며, 상기 양성 및 음성 분획은 유지되고 추가적으로 가공되거나 추가적인 분리 단계를 거친다.
특정 구현예에서, 자성 반응성 입자는 1차 항체 또는 다른 결합 파트너, 2차 항체, 렉틴, 효소 또는 스트렙타비딘으로 코팅된다. 특정 구현예에서, 자성 입자는 하나 이상의 표지자에 특이적인 1차 항체의 코팅을 통해 세포에 부착된다. 특정 구현예에서, 비드보다는 세포가 1차 항체 또는 결합 파트너로 표지되고, 이어서 세포 유형 특이적 2차 항체- 또는 다른 결합 파트너(예를 들어, 스트렙타비딘)-코팅된 자성 입자가 첨가된다. 특정 구현예에서, 스트렙타비딘 코팅된 자성 입자는 비오틴이 부착된 1차 또는 2차 항체와 함께 사용된다.
일부 구현예에서, 자성 반응성 입자는 후속적인 인큐베이션, 배양 및/또는 조작될 세포에 부착되어 남아있고; 일부 측면에서, 상기 입자는 환자에게 투여하기 위한 세포에 부착되어 남아있는다. 일부 구현예에서, 자화 가능 또는 자성 반응성 입자는 세포로부터 제거된다. 세포에서 자화 가능 입자를 제거하는 방법은 공지되어 있고, 예를 들어 경쟁 비-표지 항체 및 절단 가능한 링커에 접합된 자화 가능 입자 또는 항체 등의 사용을 포함한다. 일부 구현예에서, 자화 가능 입자는 생분해성이다.
일부 구현예에서, 친화도 기반 선택은 자성 활성화 세포 분류(magnetic-activated cell sorting, MACS)(Miltenyi Biotec, Auburn, CA)를 통한 것이다. 자성 활성화 세포 분류(MACS) 시스템은 자화된 입자가 부착되어 있는 세포를 고순도로 선택할 수 있다. 특정 구현예에서, MACS는 외부 자기장의 적용 후에 비 표적 종 및 표적 종이 순차적으로 용리되는 방식으로 작동한다. 즉, 자화된 입자에 부착된 세포는 제자리에 유지되는 반면 부착되지 않은 종(species)은 용리된다. 이어서, 상기 제1 용리 단계가 완료된 후, 자기장에 포획되고 용리가 방지된 종은 용리 및 회수될 수 있는 상당한 방식으로 해제된다. 특정 구현예에서, 비 표적 세포는 표지되고 이종 세포의 집단으로부터 고갈된다.
특정 구현예에서, 단리 또는 분리는 본 방법의 단리, 세포 조제, 분리, 가공, 인큐베이션, 배양 및/또는 제형화 단계 중 하나 이상을 수행하는 시스템, 디바이스 또는 장치를 사용하여 수행된다. 일부 측면에서, 시스템은 예를 들어 오류, 사용자 취급 및/또는 오염을 최소화하기 위해 폐쇄 또는 멸균 환경에서 상기 단계 각각을 수행하는 데 사용된다. 일 예에서, 시스템은 문헌[국제 특허 출원 공개 번호 WO2009/072003, 또는 US 20110003380]에 기재된 바와 같은 시스템이다.
일부 구현예에서, 시스템 또는 장치는 통합 또는 독립 언어 시스템 및/또는 자동화되거나 프로그램 가능한 방식으로 단리, 가공, 조작 및 제형화 단계 중 하나 이상, 예를 들어 모두를 수행한다. 일부 측면에서, 시스템 또는 장치는 사용자가 가공, 단리, 조작 및 제형화 단계의 결과를 프로그램, 제어, 산정하고/거나 가공, 단리, 조작 및 제형화 단계의 다양한 측면을 조정할 수 있게 하는, 상기 시스템 또는 장치와 통신하는 컴퓨터 및/또는 컴퓨터 프로그램을 포함한다.
일부 측면에서, 분리 및/또는 다른 단계는 예를 들어 폐쇄 및 멸균 시스템에서 임상 규모 수준으로 세포의 자동 분리를 위해 CliniMACS 시스템(Miltenyi Biotec)을 사용하여 수행된다. 구성 요소에는 통합 마이크로 컴퓨터, 자성 분리 유닛, 연동 펌프 및 다양한 핀치 밸브가 포함될 수 있다. 일부 측면에서, 통합 컴퓨터는 기기의 모든 구성 요소를 제어하고 시스템에 표준화된 순서로 반복된 절차를 수행하도록 지시한다. 일부 측면에서, 자성 분리 유닛은 이동 가능한 영구 자석 및 선택 컬럼을 위한 홀더를 포함한다. 연동 펌프는 배관 세트 전체의 유량을 제어하고, 핀치 밸브와 함께 시스템을 통한 완충제의 흐름 제어와 세포의 지속적인 현탁을 보장한다.
일부 측면에서, CliniMACS 시스템은 멸균, 비발열성 용액에 담겨 공급되는 항체 결합 자화 가능 입자를 사용한다. 일부 구현예에서, 자성 입자로 세포를 표지한 후 세포를 세척하여 과량의 입자를 제거한다. 이어서, 세포 조제 백은 배관 세트에 연결되고, 이는 차례로 완충제를 함유한 백 및 세포 수집 백에 연결된다. 배관 세트는 전치 컬럼 및 분리 컬럼을 포함한 사전 조립된 멸균 배관으로 구성되며 일회용이다. 분리 프로그램이 시작된 후, 시스템은 세포 샘플을 분리 컬럼에 자동으로 적용한다. 표지된 세포는 컬럼 내에 유지되는 반면, 표지되지 않은 세포는 일련의 세척 단계에 의해 제거된다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 방법과 함께 사용하기 위한 세포의 집단은 표지되지 않고 컬럼에 유지되지 않는다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 방법과 함께 사용하기 위한 세포의 집단은 표지되고 컬럼에 유지된다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 방법과 함께 사용하기 위한 세포의 집단은 자기장을 제거한 후 컬럼으로부터 용리되고, 세포 수집 백 내에 수집된다.
특정 구현예에서, 분리 및/또는 다른 단계는 CliniMACS Prodigy 시스템(Miltenyi Biotec)을 사용하여 수행된다. 일부 측면에서, CliniMACS Prodigy 시스템에는 원심 분리에 의한 세포의 자동 세척 및 세포의 분획화가 가능한 세포 가공 유닛이 구비되어 있다. CliniMACS Prodigy 시스템에는 공급원 세포 산물의 거시적인 층을 식별하여 최적의 세포 분획화 종점을 결정하는 내장 카메라 및 이미지 인식 소프트웨어도 포함될 수 있다. 예를 들어, 말초 혈액은 적혈구, 백혈구 및 혈장 층으로 자동 분리된다. CliniMACS Prodigy 시스템에는 또한 예를 들어, 세포 분화 및 증폭, 항원 로딩 및 장기 세포 배양과 같은 세포 배양 프로토콜을 달성하는 통합 세포 배양 챔버가 포함될 수 있다. 입력 포트는 배지의 멸균 제거 및 보충을 가능하게 할 수 있고 통합 현미경을 사용하여 세포를 모니터링할 수 있다. 예를 들어, 문헌[Klebanoff et al. (2012) J Immunother. 35(9): 651-660, Terakura et al. (2012) Blood.1:72-82, 및 Wang et al. (2012) J Immunother. 35(9):689-701]을 참조한다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 세포 집단은 유세포 분석을 통해 수집 및 농축(또는 고갈)되고, 여기서 다수의 세포 표면 표지자에 대해 염색된 세포는 유체 스트림으로 운반된다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 세포 집단은 제조 규모(FACS) 분류를 통해 수집 및 농축(또는 고갈)된다. 특정 구현예에서, 본 명세서에 기재된 세포 집단은 FACS 기반 검출 시스템과 조합된 미세전자기계 시스템(microelectromechanical system, MEMS) 칩을 사용하여 수집 및 농축(또는 고갈)된다(예를 들어, 문헌[국제 출원 WO 2010/033140, Cho et al. (2010) Lab Chip 10, 1567-1573; 및 Godin et al. (2008) J Biophoton. 1(5):355-376] 참조). 두 경우 모두에서, 세포는 다수의 표지자로 표지될 수 있으며, 이는 고순도로 명확한 T 세포 서브세트의 단리를 가능하게 한다.
일부 구현예에서, 항체 또는 결합 파트너는 하나 이상의 검출 가능한 표지자로 표지되어, 양성 및/또는 음성 선택을 위한 분리를 용이하게 한다. 예를 들어, 분리는 형광 표지 항체에 대한 결합에 기초할 수 있다. 일부 예에서, 하나 이상의 세포 표면 표지자에 특이적인 항체 또는 다른 결합 파트너의 결합에 기초한 세포의 분리는 예를 들어 유세포 분석 검출 시스템과 조합하여 예컨대 제조 규모(FACS) 및/또는 미세전자기계 시스템(MEMS) 칩을 포함하는 형광 활성화 세포 분류(fluorescence-activated cell sorting, FACS)에 의해 유체 스트림에서 수행된다. 상기 방법은 다수의 표지자에 기초하여 양성 및 음성 선택을 동시에 가능하게 한다.
일부 구현예에서, 제조 방법은 단리, 인큐베이션 및/또는 조작 전이든 후이든 세포를 동결하는 단계, 예를 들어, 냉동 보존하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 동결 및 후속 해동 단계는 세포 집단에서 과립구 및 어느 정도 단핵구를 제거한다. 일부 구현예에서, 세포는 예를 들어, 혈장 및 혈소판을 제거하기 위한 세척 단계 이후에 동결 용액에서 현탁된다. 일부 측면에서, 공지된 임의의 다양한 동결 용액 및 매개변수가 사용될 수 있다. 일 예는 20% DMSO 및 8% 인간 혈청 알부민(HSA)을 함유하는 PBS, 또는 다른 적합한 세포 동결 배지를 사용하는 것을 포함한다. 이어서, 상기를 DMSO 및 HSA의 최종 농도가 각각 10% 및 4%가 되도록 배지로 1:1로 희석시킨다. 이어서 세포를 일반적으로 분당 1°의 속도로 -80℃까지 동결시키고 액체 질소 저장 탱크에 기체상(vapor phase)으로 저장한다.
일부 구현예에서, 세포는 유전자 조작과 연결하여 또는 그 전에 인큐베이션 및/또는 배양된다. 인큐베이션 단계는 배양, 양성, 자극, 활성화 및/또는 번식(propagation)을 포함할 수 있다. 인큐베이션 및/또는 조작은 배양 용기, 예컨대 유닛, 챔버, 웰(well), 컬럼, 관, 배관 세트, 밸브, 바이알(vial), 배양 접시, 백(bag) 또는 세포 배양 또는 양성을 위한 다른 용기에서 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 조성물 또는 세포는 자극 조건 또는 자극제의 존재 하에 인큐베이션된다. 상기 조건은 집단에서 세포의 증식, 증폭, 활성화 및/또는 생존을 유도하고, 항원 노출을 모방하고, 및/또는 재조합 항원 수용체의 도입과 같은 유전자 조작을 위해 세포를 프라이밍하도록 설계된 것을 포함한다.
상기 조건은 특정 배지, 온도, 산소 함량, 이산화탄소 함량, 시간, 제제(agents), 예를 들어 영양소, 아미노산, 항생제, 이온 및/또는 자극 인자, 예컨대 사이토카인, 케모카인(chemokines), 항원, 결합 파트너, 융합 단백질, 재조합 가용성 수용체 및 세포를 활성화시키기 위해 설계된 임의의 기타 제제 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 자극 조건 또는 제제는 TCR 복합체의 세포내 신호 전달 도메인을 자극 또는 활성화시킬 수 있는 하나 이상의 제제(예를 들어, 리간드)를 포함한다. 일부 측면에서, 상기 제제는 T 세포에서 TCR/CD3 세포내 신호 전달 계단식 다단계 반응을 켜거나 개시한다. 상기 제제는 항체, 예컨대 TCR에 특이적인 것, 예를 들어 항-CD3을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 자극 조건은 공자극 수용체, 예를 들어 항-CD28을 자극할 수 있는 하나 이상의 제제(예를 들어, 리간드)를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 제제 및/또는 리간드는 비드와 같은 고체 지지체 및/또는 하나 이상의 사이토카인에 결합될 수 있다. 선택적으로, 증폭 방법은 (예를 들어, 적어도 약 0.5ng/mL 이상의 농도에서) 배양 배지에 항-CD3 및/또는 항-CD28 항체를 첨가하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 자극제는 IL-2, IL-15 및/또는 IL-7을 포함한다. 일부 측면에서, IL-2 농도는 적어도 약 10단위/mL이다.
일부 측면에서, 인큐베이션은 예컨대 문헌[미국 특허 번호 6,040,177, Klebanoff et al. (2012) J Immunother. 35(9): 651-660, Terakura et al. (2012) Blood.1:72-82, 및/또는 Wang et al. (2012) J Immunother. 35(9):689-701]에 기술된 기술에 따라 수행된다.
일부 구현예에서, T 세포는 배양-개시 조성물 배양보조 세포, 예컨대 비분할 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)에 첨가하고(예를 들어, 생성된 세포의 집단은 증폭될 초기 집단 중 각각의 T 림프구에 대해 적어도 약 5, 10, 20 또는 40 이상의 PBMC 배양보조 세포를 함유하도록); 상기 배양물을 (예를 들어, T 세포 수를 증폭시키기에 충분한 시간 동안) 인큐베이션하여, 증폭된다. 일부 측면에서, 비분할 배양보조 세포는 감마-조사된(gamma-irradiated) PBMC 배양보조 세포를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, PBMC에 약 3000 내지 3600 라드(rad) 범위의 감마선을 조사하여 세포 분열을 방지한다. 일부 측면에서, 배양보조 세포는 T 세포의 집단의 첨가 전에 배양 배지에 첨가된다.
일부 구현예에서, 자극 조건은 인간 T 림프구의 성장에 적합한 온도, 예를 들어, 적어도 약 25℃ 이상, 일반적으로 적어도 약 30℃ 이상 및 일반적으로 (약) 37℃를 포함한다. 선택적으로, 인큐베이션은 배양보조 세포로서 비분할 EBV 형질전환 림프아구 세포(LCL)를 첨가하는 것을 더 포함할 수 있다. LCL은 약 6000 내지 10,000 라드 범위의 감마선으로 조사될 수 있다. 일부 측면에서, LCL 배양보조 세포는 임의의 적합한 양으로 제공되며, 예컨대 LCL 배양보조 세포 대 초기 T 림프구의 비율이 적어도 약 10:1 이상으로 제공된다.
구현예에서, 항원 특이적 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포와 같은 항원 특이적 T 세포는 항원으로 나이브 또는 항원 특이적 T 림프구를 자극하여 수득된다. 예를 들어, 항원 특이적 T 세포주 또는 클론은 감염된 대상체로부터 T 세포를 단리하고 시토메갈로 바이러스 항원으로 시험관 내에서 세포를 자극함으로써 같은 항원에 대해 생성될 수 있다.
유전자 조작된 성분, 예를 들어 유전자 파괴를 유도하기 위한 제제 및/또는 키메라 수용체, 예를 들어 CAR을 암호화하는 핵산의 도입을 위한 다양한 방법이 공지되어 있으며 제공된 방법 및 조성물과 함께 사용될 수 있다. 예시적인 방법은 바이러스 베터(예를 들어, 레트로바이러스 또는 렌티바이러스), 비-바이러스 벡터 또는 트랜스포손, 예를 들어 Sleeping Beauty 트랜스포손 시스템을 통한 것을 포함하여 폴리펩타이드 또는 수용체를 암호화하는 핵산의 전달을 위한 방법을 포함한다. 유전자 전달 방법은 형질도입, 전기 천공법 또는 세포 내로 유전자 전달이 이루어지는 다른 방법 또는 본원의 섹션 I.A에 기술된 임의의 전달 방법을 포함한다. 재조합 산물을 암호화하는 핵산 전달을 위한 다른 접근법 및 벡터는 예를 들어, 문헌[WO2014055668 및 미국 특허 번호 7,446,190]에 기재된 것이다.
일부 구현예에서, 재조합 핵산은 전기 천공법을 통해 T 세포로 전달된다(예를 들어, 문헌[Chicaybam et al, (2013) PLoS ONE 8(3): e60298 및 Van Tedeloo et al. (2000) Gene Therapy 7(16): 1431-1437] 참조). 일부 구현예에서, 재조합 핵산은 전위를 통해 T 세포로 전달된다(예를 들어, 문헌[Manuri et al. (2010) Hum Gene Ther 21(4): 427-437; Sharma et al. (2013) Molec Ther Nucl Acids 2, e74; 및 Huang et al. (2009) Methods Mol Biol 506: 115-126] 참조). 면역 세포에서 유전 물질을 도입하고 발현시키는 다른 방법에는 인산칼슘 형질주입(예컨대, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York. N.Y.에 기재된 바와 같음), 원형질체 융합, 양이온성 리포솜-매개 형질주입; 텅스텐 입자 촉진 미세 입자 충격(Johnston, Nature, 346: 776-777 (1990)); 및 인산스트론튬 DNA 공동 침전(Brash et al., Mol. Cell Biol., 7: 2031-2034 (1987))이 포함된다.
일부 구현예에서, 유전자 전달은 먼저 세포를 자극하고, 예컨대 세포를 증식, 생존 및/또는 활성화와 같은 반응을 유도하는 자극과 조합하고, 예를 들어 사이토카인 또는 활성화 표지자의 발현에 의해 측정된 바와 같이, 뒤이어 활성화된 세포의 형질도입 및 임상 적용에 충분한 수로 배양에서 증폭시켜 달성된다.　
일부 맥락에서, 자극 인자(예를 들어, 림포카인 또는 사이토카인)의 과발현이 잠재적으로 대상체에서 독성과 관련된 인자와 같은 대상체에서 원치 않는 결과 또는 더 낮은 효능을 초래할 수 있는 가능성에 대해 보호하는 것이 바람직할 수 있다. 따라서, 일부 맥락에서, 조작된 세포는 예컨대 입양 면역 요법에서 투여 시에 생체 내에서 세포를 음성 선택에 취약하게 하는 유전자 분절을 포함한다. 예를 들어, 일부 측면에서, 세포는 세포가 투여되는 환자의 생체 내 조건 변화의 결과로서 제거될 수 있도록 조작된다. 음성 선택 가능한 표현형은 투여된 제제, 예를 들어 화합물에 대한 민감성을 부여하는 유전자의 삽입으로부터 초래될 수 있다. 음성 선택 가능한 유전자는 간시클로비르(ganciclovir) 민감성을 부여하는 단순 헤르페스 바이러스 I형 티미딘 키나아제(HSV-I TK) 유전자(Wigler et al., Cell 11:223, 1977); 세포성 히포크산틴 포스포리보실 전달효소(hypoxanthine phosphoribosyltransferase, HPRT) 유전자, 세포성 아데닌 포스포리보실 전달효소(adenine phosphoribosyltransferase, APRT) 유전자, 박테리아 시토신 디아미나제(Mullen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89:33 (1992))를 포함한다.
일부 구현예에서, 세포, 예를 들어 T 세포는 증폭 도중에 또는 후에 조작될 수 있다. 원하는 폴리펩타이드 또는 수용체의 유전자 도입을 위한 이 조작은 예를 들어 임의의 적합한 레트로바이러스 벡터로 수행될 수 있다. 이어서 유전자 변형 세포의 집단은 초기 자극(예를 들어, CD3/CD28 자극)으로부터 유리될 수 있으며, 후속적으로 제2 유형의 자극으로 (예를 들어, 새로이 도입된 수용체를 통해) 자극될 수 있다. 상기 제2 유형의 자극은 새로운 수용체의 프레임워크 내에서 직접 결합하는(예를 들어, 수용체 내의 불변 영역을 인지함으로써) 유전자 도입된 수용체의 펩타이드/MHC 분자, 즉 동종(교차 결합) 리간드(예를 들어, CAR의 천연 리간드) 또는 임의의 리간드(예컨대 항체) 형태의 항원 자극을 포함할 수 있다. 예를 들어, 문헌[Cheadle et al, “Chimeric antigen receptors for T-cell based therapy” Methods Mol Biol. 2012; 907:645-66 또는 Barrett et al., Chimeric Antigen Receptor Therapy for Cancer Annual Review of Medicine Vol. 65: 333-347 (2014)]을 참조한다.
추가 핵산 중에서, 예를 들어 도입을 위한 유전자는, 예컨대 전달된 세포의 생존력 및/또는 기능을 촉진함으로써 요법의 효능을 개선하기 위한 유전자; 예컨대 생체 내 생존 또는 국소화를 평가하기 위한 세포의 선택 및/또는 평가를 위한 유전자 표지자를 제공하기 위한 유전자; 문헌[Lupton S. D. et al., Mol. and Cell Biol., 11:6 (1991); and Riddell et al., Human Gene Therapy 3:319-338 (1992)]에 기재된 바와 같이 예를 들어 생체 내에서 음성 선택에 세포를 예민하게 만들어 안정성을 개선하기 위한 유전자가 있고; 또한 우성 양성 선택 가능한 표지자를 음성 선택 가능한 표지자와 융합시켜 유래된 2작용성 선택 가능한 융합 유전자의 용도를 기술하는 문헌[국제 출원 공보 PCT/US91/08442 및 PCT/US94/05601 by Lupton et al.]을 참조한다. 예를 들어, 문헌[Riddell et al., 미국 특허 번호 6,040,177의 14-17열]을 참조한다.
본원에 기술된 바와 같이, 일부 구현예에서, 세포는 유전자 조작과 연결하여 또는 그 전에 인큐베이션 및/또는 배양된다. 인큐베이션 단계는 배양, 양성, 자극, 활성화, 번식 및/또는 보존을 위한 동결, 예를 들어 냉동 보존을 포함할 수 있다.
D. 키메라 수용체를 발현하는 세포의 조성물
복수의 조작된 세포 또는 조작된 세포의 집단, 상기 세포를 함유하고/거나 상기 세포에 대해 농축된 조성물이 또한 제공된다. 일부 측면에서, 제공된 조작된 세포 및/또는 조작된 세포의 조성물은 예를 들어 재조합 수용체 또는 이의 일부를 암호화하는 전이 유전자 서열을 포함하는 변형된 CD247 유전자 자리를 포함하는 본원에 기술된 것을 포함하고/거나 본원에 기술된 방법에 의해 생산된다. 일부 측면에서, 복수의 조작된 세포 또는 조작된 세포의 집단은 본원의에 기술된, 예를 들어 본원의 섹션 III.C에 기술된 임의의 조작된 세포를 함유한다. 일부 측면에서, 제공된 세포 및 세포 조성물은 본원에 기술된 임의의 방법을 사용하여, 예를 들어 본원의 섹션 I.A에 기술된 바와 같은 유전자 파괴를 도입하기 위한 제제(들) 또는 방법을 사용하여, 및/또는 상동 직접 수선(HDR)을 통해 본원에 기술된 예를 들어 섹션 I.B.2에 기술된 주형 폴리뉴클레오타이드와 같은 폴리뉴클레오타이드를 사용하여, 조작될 수 있다. 일부 측면에서, 본원에 제공되는 이러한 세포 집단 및/또는 조성물은 약학 조성물 또는 예를 들어 본원의 섹션 V에 기술된 바와 같은 치료 용도 또는 방법을 위한 조성물이거나 이에 포함된다.
일부 구현예에서, 조작된 세포를 함유하는 제공된 세포 집단 및/또는 조성물은 다른 방법을 사용하여 생성된 세포 집단 및/또는 조성물의 발현 및/또는 항원 결합과 비교하여, 키메라 수용체에 의한 더 개선되고, 균일하고, 균질하고 및/또는 안정된 발현 및/또는 항원 결합을 나타내는, 예를 들어 감소된 변이 계수를 나타내는 세포 집단을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포 집단 및/또는 조성물은, 다른 방법, 예를 들어 키메라 수용체를 암호화하는 서열의 무작위 통합을 사용하여 생성된 각각의 집단과 비교하여, 적어도 100%, 95%, 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20% 또는 10% 더 낮은 키메라 수용체의 발현의 변이 계수 및/또는 키메라 수용체에 의한 항원 결합을 나타낸다. 변이 계수는 세포의 집단, 예를 들어 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포들 내의 관심 핵산(예를 들어, 키메라 수용체 또는 이의 일부를 암호화하는 전이 유전자 서열)의 발현의 표준 편차를 각각의 세포의 집단에서 각각의 관심 핵산의 발현의 평균으로 나누어 정의된다. 일부 구현예에서, 세포 집단 및/또는 조성물은, 본원에 제공된 방법을 사용하여 조작된 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포 집단들 중에서 측정했을 때, 0.70, 0.65, 0.60, 0.55, 0.50, 0.45, 0.40, 0.35 또는 0.30 이하인 변이 계수를 나타낸다.
일부 구현예에서, 조작된 세포를 함유하는 제공된 세포 집단 및/또는 조성물은 키메라 수용체 또는 이의 일부를 암호화하는 전이 유전자의 최소 또는 감소된 무작위 통합을 나타내는 세포 집단을 포함한다. 일부 측면에서, 세포의 게놈 내로 전이 유전자의 무작위 통합은 게놈 내 원치 않는 위치로 예를 들어, 필수적인 유전자 또는 세포의 활성을 조절하는 데 중요한 유전자 내로 전이 유전자 서열이 통합됨으로 인해 및/또는 수용체의 조절되지 않은 또는 제어되지 않은 발현으로 인해, 역효과 또는 세포사를 초래할 수 있다. 일부 측면에서, 전이 유전자의 무작위 통합은 다른 방법을 사용하여 생성된 세포 집단들과 비교하여 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상 감소한다.
일부 구현예에서, 키메라 수용체를 발현하는 복수의 조작된 면역 세포를 포함하는 세포 집단 및/또는 조성물이 제공되며, 여기서 키메라 수용체를 암호화하는 핵산 서열이, 예를 들어 상동 직접 수선(HDR)을 통해 CD247 유전자 자리에서 키메라 수용체의 일부를 암호화하는 전이 유전자의 통합에 의해, CD247 유전자 자리에 존재한다. 일부 구현예에서, 조성물 내 세포 및/또는 CD247 유전자 자리에 유전자 파괴를 함유하는 조성물 내 세포의 적어도 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 또는 90% 또는 그 이상은 CD247 유전자 자리에서 키메라 수용체의 일부를 암호화하는 전이 유전자의 통합을 포함한다.
일부 구현예에서, 예컨대 키메라 수용체를 발현하는 세포가 특정 유형의 세포 예컨대 T 세포 또는 CD8+ 또는 CD4+ 세포와 같은 특정 유형의 세포 또는 조성물에서 총 세포의 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상을 구성하는, 세포를 함유하는 조성물이 제공된다. 일부 구현예에서, 예컨대 키메라 수용체를 발현하는 세포가 CD247 유전자 자리에 유전자 파괴를 함유하는 조성물에서 총 세포의 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상을 구성하는, 세포를 함유하는 조성물이 제공된다.
IV. 치료 방법
본원에 기술된 임의의 조작된 세포 또는 조작된 세포를 함유하는 임의의 조성물, 예를 들어, 재조합 수용체 또는 이의 일부를 암호화하는 전이 유전자를 포함하는 변형된 CD247 유전자 자리를 포함하는 조작된 세포를 투여하는 것을 포함하는, 치료 방법이 본원에 제공된다. 일부 측면에서, 본원에 기술된 임의의 조작된 세포 또는 조작된 세포를 함유하는 임의의 조성물을 대상체에, 예컨대 질병 또는 장애가 있는 대상체에 투여하는 방법이 또한 제공된다. 본원에 기술되는, 키메라 항원 수용체(CAR)과 같은 키메라 수용체를 발현하는 조작된 세포 또는 이를 포함하는 조성물은 다양한 치료, 진단 및 예방적 적응증에 유용하다. 예를 들어, 조작된 세포 또는 조작된 세포를 포함하는 조성물은 대상체에서 다양한 질병 및 장애를 치료하는 데 유용하다. 상기 방법 및 용도는 예를 들어, 조작된 세포 또는 이를 함유하는 조성물을 종양 또는 암과 같은 질병, 병태 또는 장애가 있는 대상체에 투여하는 것을 포함한 치료 방법 및 용도를 포함한다.　 일부 구현예에서, 조작된 세포 또는 이를 포함하는 조성물은 질병 또는 장애의 치료에 효과적인 유효량으로 투여된다.　 용도는 상기 방법 및 치료에서, 및 상기 치료 방법을 수행하기 위한 약제의 제조에서 조작된 세포 또는 조성물의 용도를 포함한다.　 일부 구현예에서, 본 방법은 조작된 세포 또는 이를 포함하는 조성물을, 질병 또는 병태를 가진 또는 가진 것으로 의심되는 대상체에 투여함으로써 수행된다.　 일부 구현예에서, 본 방법은 이를 통해 대상체에서 질병 또는 병태 또는 장애를 치료한다. 대상체, 예를 들어 환자에게 세포 및 조성물을 투여하기 위한 치료 방법이 또한 제공된다.
입양 세포 요법을 위한 세포의 투여 방법은 공지되어 있으며 제공된 방법 및 조성물과 연결하여 사용될 수 있다. 예를 들어, 입양 T 세포 요법 방법은 예를 들어, 문헌[미국 특허 출원 공개 번호 2003/0170238(Gruenberg et al); 미국 특허 번호 4,690,915(Rosenberg); Rosenberg (2011) Nat Rev Clin Oncol. 8(10):577-85]에 기술되어 있다. 예를 들어, 문헌[Themeli et al. (2013) Nat Biotechnol. 31(10): 928-933; Tsukahara et al. (2013) Biochem Biophys Res Commun 438(1): 84-9; Davila et al. (2013) PLoS ONE 8(4): e61338]을 참조한다.
치료되는 질병 또는 병태는 항원의 발현이 질병, 병태 또는 장애의 병인과 관련되고/거나 병인에 수반되는, 예를 들어, 상기 질병, 병태 또는 장애를 일으키거나, 악화하거나 또는 그렇지 않으면 그에 수반되는, 임의의 것일 수 있다. 예시적인 질병 및 병태는 악성 종양 또는 세포의 형질전환(예를 들어, 암), 자가면역 또는 염증성 질환 또는 예를 들어 세균, 바이러스 또는 기타 병원체로 인한 전염병과 관련된 질병 또는 병태를 포함할 수 있다. 치료할 수 있는 다양한 질병 및 병태와 관련된 항원을 포함하는 예시적인 항원들이 본원에 기술된다. 구체적인 구현예에서, 키메라 항원 수용체는 질병 또는 병태와 관련된 항원에 특이적으로 결합한다.
질병, 병태 및 장애 중에는 고형 종양, 혈액성 악성 종양 및 흑색종을 포함한 종양이 있고, 국소화 및 전이성 종양, 감염병, 예컨대 바이러스 또는 기타 병원체, 예를 들어 HIV, HCV, HBV, CMV, HPV로 인한 감염 및 기생충병 및 자가면역 질환 및 염증성 질환이 포함된다. 일부 구현예에서, 질병, 장애 또는 병태는 종양, 암, 악성 종양, 신생물 또는 기타 증식성 질병 또는 장애이다. 상기 질병은 백혈병, 림프종, 예를 들어, 급성 골수성(또는 골수형성) 백혈병(acute myeloid (or myelogenous) leukemia, AML), 만성 골수성(또는 골수형성) 백혈병(chronic myeloid (or myelogenous) leukemia, CML), 급성 림프구성(또는 림프모구) 백혈병(acute lymphocytic (or lymphoblastic) leukemia, ALL), 만성 림프구성 백혈병(chronic lymphocytic leukemia, CLL), 모발 세포 백혈병(hairy cell leukemia, HCL), 소형 림프구성 림프종(small lymphocytic lymphoma, SLL), 외투 세포 림프종(Mantle cell lymphoma, MCL), 변연부 림프종, 버킷 림프종, 호지킨 림프종(Hodgkin lymphoma, HL), 비호지킨 림프종(non-Hodgkin lymphoma, NHL), 역형성 거대 세포 림프종(Anaplastic large cell lymphoma, ALCL), 여포성 림프종(follicular lymphoma), 불응성 여포성 림프종, 미만성 거대 B 세포 림프종(diffuse large B-cell lymphoma, DLBCL) 및 다발성 골수종(multiple myeloma, MM)을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 일부 구현예에서, 질병 또는 병태는 급성 림프모구 백혈병(acute lymphoblastic leukemia, ALL), 성인 ALL, 만성 림프모구 백혈병(chronic lymphoblastic leukemia, CLL), 비호지킨 림프종(non-Hodgkin lymphoma, NHL) 및 미만성 거대 B 세포 림프종(Diffuse Large B-Cell Lymphoma, DLBCL)에서 선택된 B 세포 악성 종양이다. 일부 구현예에서, 질병 또는 병태는 NHL이고 상기 NHL은 공격적인 NHL, 미만성 거대 B 세포 림프종(DLBCL), NOS(비활동성으로부터 다시 형질전환됨), 1차 종격동 거대 B 세포 림프종(primary mediastinal large B cell lymphoma, PMBCL), T 세포/조직세포 풍부 거대 B 세포 림프종(T cell/histocyte-rich large B cell lymphoma, TCHRBCL), 버킷 림프종, 외투 세포 림프종(MCL) 및/또는 여포성 림프종(FL), 임의적으로, 여포성 림프종 3B 등급(follicular lymphoma Grade 3B, FL3B)으로 구성된 군에서 선택된다.
일부 구현예에서, 질병 또는 장애는 다발성 골수종(MM)이다. 일부 구현예에서, 제공된 세포, 예를 들어 CAR과 같은 키메라 수용체를 암호화하는 변형된 CD247 유전자 자리를 함유하는 조작된 세포의 투여는 대상체에서 MM과 같은 질병 또는 병태의 치료 및/또는 개선을 가져올 수 있다. 일부 구현예에서, 대상체는 B 세포 성숙 항원(BCMA)과 같은 종양 관련 항원의 발현과 관련된 MM을 가지거나 가진 것으로 의심된다.
일부 구현예에서, 질병 또는 장애는 만성 림프구성 백혈병(CLL)이다. 일부 구현예에서, 제공된 세포, 예를 들어 CAR과 같은 키메라 수용체를 암호화하는 변형된 CD247 유전자 자리를 함유하는 조작된 세포의 투여는 대상체에서 CLL과 같은 질병 또는 병태의 치료 및/또는 개선을 가져올 수 있다. 일부 구현예에서, 대상체는 수용체 티로신 키나아제 유사 희귀 수용체 1(ROR1)과 같은 종양 관련 항원의 발현과 관련된 CLL을 가지거나 가진 것으로 의심된다.
일부 구현예에서, 질병 또는 장애는 고형 종양, 또는 비혈액 종양과 관련된 암이다. 일부 구현예에서, 질병 또는 장애는 고형 종양, 또는 고형 종양과 관련된 암이다. 일부 구현예에서, 질병 또는 장애는 췌장암, 방광암, 대장암, 유방암, 전립선암, 신장암, 간세포암, 폐암, 난소암, 자궁경부암, 췌장암, 직장암, 갑상선암, 자궁암, 위암(gastric cancer), 식도암, 두경부암, 흑색종, 신경내분비암, CNS(중추신경계)암, 뇌종양, 골암, 또는 연부조직 육종이다. 일부 구현예에서, 질병 또는 장애는 방광암, 폐암, 뇌암, 흑색종(예를 들어, 소세포성 폐, 흑색종), 유방암, 자궁경부암, 난소암, 대장암(colorectal cancer), 췌장암, 자궁내막암, 식도암, 신장암, 간암, 전립선암, 피부암, 갑상선암, 또는 자궁암이다. 일부 구현예에서, 질병 또는 장애는 췌장암, 방광암, 대장암, 유방암, 전립선암, 신장암, 간세포암, 폐암, 난소암, 자궁경부암, 췌장암, 직장암, 갑상선암, 자궁암, 위암(gastric cancer), 식도암, 두경부암, 흑색종, 신경내분비암, CNS(중추신경계)암, 뇌종양, 골암, 또는 연부조직 육종이다.
일부 구현예에서, 질병 또는 장애는 비-소세포폐암(NSCLC)이다. 일부 구현예에서, 제공된 세포, 예를 들어 CAR과 같은 키메라 수용체를 암호화하는 변형된 CD247 유전자 자리를 함유하는 조작된 세포의 투여는 대상체에서 NSCLC과 같은 질병 또는 병태의 치료 및/또는 개선을 가져올 수 있다. 일부 구현예에서, 대상체는 수용체 티로신 키나아제 유사 희귀 수용체 1(ROR1)과 같은 종양 관련 항원의 발현과 관련된 NSCLC을 가지거나 가진 것으로 의심된다.
일부 구현예에서, 질병 또는 병태는 바이러스, 레트로바이러스, 박테리아 및 원생 동물 감염, 면역결핍, 시토메갈로 바이러스(Cytomegalovirus, CMV), 엡스타인-바 바이러스(Epstein-Barr virus, EBV), 아데노바이러스, BK 폴리오마바이러스 같은 감염성 질병 또는 병태이나, 이에 한정되지 않는다. 일부 구현예에서, 질병 또는 병태는 자가면역 또는 염증성 질병 또는 병태, 예컨대 관절염, 예를 들어 류머티스성 관절염(rheumatoid arthritis, RA), I 형 당뇨병, 전신 홍반성 루푸스(systemic lupus erythematosus, SLE), 염증성 장질환, 건선, 피부 경화증, 자가면역 갑상선 질환, 그레이브병, 크론병, 다발성 경화증, 천식 및/또는 이식과 관련된 질병 또는 병태이다.
일부 구현예에서, 질병 또는 장애와 관련된 항원은 αvβ6 인테그린(avb6 integrin), B 세포 성숙 항원(BCMA), B7-H3, B7-H6, 탄산 탈수 효소 9(CA9, CAIX 또는 G250으로도 공지), 암 고환 항원, 암/고환 항원 1B(CTAG, NY-ESO-1 및 LAGE-2로도 공지), 암배아 항원(CEA), 사이클린, 사이클린 A2, C-C 모티프 케모카인 리간드 1(CCL-1), CD19, CD20, CD22, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD123, CD133, CD138, CD171, 콘드로이틴 황산염 프로테오글리칸 4(chondroitin sulfate proteoglycan 4, CSPG4), 표피 성장 인자 단백질(EGFR), 타입 III 표피 성장 인자 수용체 돌연변이(EGFR vIII), 상피 당단백질 2(EPG-2), 상피 당단백질 40(EPG-40), 에프린B2, 에프린 수용체 A2(EPHa2), 에스트로겐 수용체, Fc 수용체 유사 5(FCRL5; Fc 수용체 동족체 5 또는 FCRH5로도 공지), 태아 아세틸콜린 수용체(태아 AchR), 엽산 결합 단백질(FBP), 엽산 수용체 알파, 강글리오사이드 GD2, O-아세틸화 GD2(OGD2), 강글리오사이드 GD3, 당단백질 100(gp100), 글리피칸-3(GPC3), G 단백질 결합 수용체 C 클래스 5 그룹 D 멤버(GPRC5D), Her2/neu(수용체 티로신 키나아제 erb-B2), Her3(erb-B3), Her4(erb-B4), erbB 이량체, 인간 고분자량 흑색종 관련 항원(HMW-MAA), B형 간염 표면 항원, 인간 백혈구 항원 A1(HLA-A1), 인간 백혈구 항원 A2(HLA-A2), IL-22 수용체 알파(IL-22Rα), IL-13 수용체 알파 2(IL-13Rα2), 키나아제 삽입 도메인 수용체(kinase insert domain receptor, kdr), 카파 경쇄, L1 세포 부착 분자(L1-CAM), L1-CAM의 CE7 에피토프, 패밀리 8 A 멤버를 함유하는 류신 풍부 반복(Leucine Rich Repeat Containing 8 Family Member A, LRRC8A), 루이스 Y, 흑색종 관련 항원(MAGE)-A1, MAGE-A3, MAGE-A6, MAGE-A10, 메소텔린(MSLN), c-Met, 뮤린 시토메갈로 바이러스(CMV), 뮤신 1(MUC1), MUC16, 자연 살생 2 그룹 D 멤버(NKG2D) 리간드, 멜란 A (MART-1), 신경 세포 부착 분자(NCAM), 종양태아성 항원, 흑색종 우선 발현 항원(PRAME), 프로게스테론 수용체, 전립선 특이적 항원, 전립선 줄기 세포 항원(PSCA), 전립선 특이적 막 항원(PSMA), 수용체 티로신 키나아제 유사 희귀 수용체 1(ROR1), 서바이빈(survivin), 영양막 당단백질(TPBG, 5T4로도 공지), 종양 관련 당단백질 72(TAG72), 티로시나아제 관련 단백질 1(TRP1, TYRP1 또는 gp75로도 공지), 티로시나아제 관련 단백질 2(TRP2, 도파크롬 타우토메라제, 도파크롬 델타 이성화 효소 또는 DCT로도 공지), 혈관 내피 성장 인자 수용체 2(VEGFR2), 빌름스 종양 1(WT-1), 병원체 특이적 또는 병원체 발현 항원 또는 보편적 표지(universal tag) 관련 항원 및/또는 비오티닐화 분자 및/또는 HIV, HCV, HBV 또는 다른 병원체에 의해 발현된 분자이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 수용체에 의해 표적화되는 항원은 다수의 공지된 B 세포 표지자 중 어느 하나와 같은 B 세포 악성 종양과 연관된 항원을 포함한다. 일부 구현예에서, 항원은 CD20, CD19, CD22, ROR1, CD45, CD21, CD5, CD33, Ig카파, Ig람다, CD79a, CD79b 또는 CD30이거나 이를 포함한다.
일부 구현예에서, 항원은 병원체 특이적 또는 병원체 발현 항원이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 항원은 바이러스 항원(예컨대 HIV, HCV, HBV 등으로부터 유래된 바이러스 항원), 세균 항원 및/또는 기생 항원이다.
일부 측면에서, CAR과 같은 키메라 수용체는, B 세포 악성 종양과 연관된 병변 환경의 세포에서 발현되거나 질병 또는 병태와 연관된 항원에 특이적으로 결합한다. 일부 구현예에서, 수용체에 의해 표적화되는 항원은 다수의 공지된 B 세포 표지자 중 어느 하나와 같은 B 세포 악성 종양과 연관된 항원을 포함한다. 일부 구현예에서, 수용체에 의해 표적화되는 항원은 CD20, CD19, CD22, ROR1, CD45, CD21, CD5, CD33, Ig카파, Ig람다, CD79a, CD79b 또는 CD30 또는 이의 조합물이다.
일부 구현예에서, 질병 또는 병태는 다발성 골수종과 같은 골수종이다. 일부 측면에서, CAR과 같은 키메라 수용체는 다발성 골수종과 연관된 병변 환경의 세포에서 발현되거나 질병 또는 병태와 연관된 항원에 특이적으로 결합한다. 일부 구현예에서 수용체에 의해 표적화된 항원은 다발성 골수종과 연관된 항원을 포함한다. 일부 측면에서, 항원, 예를 들어 질병 특이적 항원 및/또는 관련 항원과 같은 제2 또는 추가 항원은 다발성 골수종, 예컨대 B 세포 성숙 항원(BCMA), G 단백질 결합 수용체 C 클래스 5 그룹 D 멤버(GPRC5D), CD38(환형 ADP 리보오스 가수 분해 효소), CD138(신데칸-1, 신데칸, SYN-1), CS-1(CS1, CD2 서브세트 1, CRACC, SLAMF7, CD319 및 19A24), BAFF-R, TACI 및/또는 FcRH5 상에서 발현된다. 다른 예시적인 다발성 골수종 항원은 CD56, TIM-3, CD33, CD123, CD44, CD20, CD40, CD74, CD200, EGFR, β2-마이크로글로불린, HM1.24, IGF-1R, IL-6R, TRAIL-R1 및 액티빈(activin) 수용체 IIA형(ActRIIA)을 포함한다. 문헌[Benson and Byrd, J. Clin. Oncol. (2012) 30(16): 2013-15; Tao and Anderson, Bone Marrow Research (2011):924058; Chu et al., Leukemia (2013) 28(4):917-27; Garfall et al., Discov Med. (2014) 17(91):37-46]을 참조한다. 일부 구현예에서, 항원은 림프성 종양, 골수종, AIDS(에이즈) 관련 림프종 및/또는 CD38과 같은 이식 후 림프구 증식에 존재하는 것을 포함한다. 상기 항원에 대해 유도된 항체 또는 항원 결합 단편은 공지되어 있고, 예를 들어 문헌[미국 특허 번호 8,153,765; 8,603477, 8,008,450; 미국 공개 번호 US20120189622 또는 US20100260748; 및/또는 국제 PCT 공개 번호 WO2006099875, WO2009080829 또는 WO2012092612 또는 WO2014210064]에 기술된 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편(예를 들어, scFv)은 다중특이성 항체, 다중특이성 키메라 수용체, 예컨대 다중특이성 CAR 및/또는 다중특이성 세포에 함유되어 있다.
일부 구현예에서, 질병 또는 장애는 G 단백질 결합 수용체 C 클래스 5 그룹 D 멤버(GPRC5D)의 발현 및/또는 B 세포 성숙 항원(BCMA)의 발현과 연관된다.
일부 구현예에서, 질병 또는 장애는 B 세포 관련 장애이다. 제공된 방법의 제공된 임의의 구현예의 일부에서, BCMA와 연관된 질병 또는 장애는 자가면역 질환 또는 장애이다. 제공된 방법의 제공된 임의의 구현예의 일부에서, 자가면역 질환 또는 장애는 전신 홍반성 루푸스(systemic lupus erythematosus, SLE), 루푸스 신염, 염증성 장질환, 류머티스성 관절염, ANCA 연관 혈관염, 특발성 혈소판 감소성 자반증(idiopathic thrombocytopenia purpura, ITP), 혈전성 혈소판 감소성 자반증(thrombotic thrombocytopenia purpura, TTP), 자가 면역성 혈소판 감소증, 샤가스병(Chagas’ disease), 그레이브병(Grave’s disease), 베게너 육아종증(Wegener’s granulomatosis), 다발성 결절성 동맥염(poly-arteritis nodosa), 쇼그렌 증후군(Sjogren’s syndrome), 심상성 천포창(pemphigus vulgaris), 피부 경화증(scleroderma), 다발성 경화증(multiple sclerosis), 건선(psoriasis), IgA 신장병(nephropathy), IgM 다발성 신경병(polyneuropathies), 혈관염(vasculitis), 진성 당뇨병(diabetes mellitus), 레이노드 증후군(Reynaud’s syndrome), 항인지질 증후군(anti-phospholipid syndrome), 굿파스처 병(Goodpasture’s disease), Kawasaki disease(가와사키 병), 자가면역 용혈성 빈혈(autoimmune hemolytic anemia), 중증 근무력증(myasthenia gravis) 또는 진행성 사구체 신염(progressive glomerulonephritis)이다.
일부 구현예에서, 질병 또는 장애는 암이다. 일부 구현예에서, 암은 GPRC5D-발현 암이다. 일부 구현예에서, 암은 혈장 세포 악성 종양이고 혈장 세포 악성 종양은 다발성 골수종(multiple myeloma, MM) 또는 형질세포종(plasmacytoma)이다. 일부 구현예에서, 암은 다발성 골수종(MM)이다. 일부 구현예에서, 암은 재발성/불응성 다발성 골수종이다.
일부 구현예에서, 항원은 ROR1이고, 질병 또는 장애는 CLL이다. 일부 구현예에서, 항원은 ROR1이고, 질병 또는 장애는 NSCLC이다.
일부 구현예에서, 항체 또는 항원 결합 단편(예를 들어, scFv 또는 VH 도메인)은 CD19, BCMA, GPRC5D 또는 ROR1와 같은 항원을 특이적으로 인식한다. 일부 구현예에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 CD19, BCMA, GPRC5D 또는 ROR1에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편으로부터 유래하거나 이의 변이체이다.
일부 구현예에서, 세포 요법(예를 들어, 입양 T 세포 요법)은 자가 전달에 의해 수행되며, 세포는 세포 요법을 받을 대상체 또는 상기 대상체로부터 유래된 샘플로부터 단리 및/또는 달리 제조된다. 따라서, 일부 측면에서, 세포는 치료가 필요한 대상체, 예를 들어, 환자로부터 유래되고, 세포는 단리 및 가공 후에 동일한 대상체에 투여된다.
일부 구현예에서, 세포 요법(예를 들어, 입양 T 세포 요법)은 동종이계 전달에 의해 수행되며, 세포는 세포 요법을 받을 예정이거나 최종적으로 받은 대상체, 예를 들어 제1 대상체 외의 대상체로부터 단리 및/또는 달리 제조된다. 상기 구현예에서, 이어서 세포는 상이한 대상체, 예를 들어, 같은 종의 제2 대상체에 투여된다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 대상체는 유전적으로 동일하다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 대상체는 유전적으로 유사하다. 일부 구현예에서, 제2 대상체는 제1 대상체와 동일한 HLA 클래스(HLA class) 또는 수퍼타입(supertype)을 발현한다.
세포는, 임의의 적합한 수단, 예를 들어 볼루스 주입, 주사, 예를 들어 정맥내 또는 피하 주사, 안구내(intraocular) 주사, 안구주위(periocular) 주사, 망막하(subretinal) 주사, 유리체내(intravitreal) 주사, 중격-경유성(trans-septal) 주사, 공막하(subscleral) 주사, 맥락막내(intrachoroidal) 주사, 전방내(intracameral) 주사, 결막하 주사(subconjectval injection, subconjuntival injection), 서브 테논(sub-Tenon) 주사, 안구뒤(retrobulbar) 주사, 안구주위(peribulbar) 주사 또는 후부 점막 주사(posterior juxtascleral) 전달에 의해 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 이는 비경구, 폐내 및 비강내 및 국소 치료가 바람직한 경우 병변내 투여에 의해 투여된다. 비경구 주입은 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내 또는 피하 투여를 포함한다. 일부 구현예에서, 주어진 단위 용량이 세포의 단일 볼루스 투여에 의해 투여된다. 일부 구현예에서, 이는 예를 들어, 3일 이내의 기간에 걸쳐 세포의 다중 볼루스 투여에 의해, 또는 세포의 지속적인 주입 투여에 의해 투여된다. 일부 구현예에서, 세포 단위 용량 또는 임의의 추가 요법, 예를 들어 림프구 고갈 요법, 개입 요법 및/또는 병용 요법의 투여는 통원 전달을 통해 수행된다.
질병의 예방 또는 치료를 위해, 적절한 투여량은 치료될 질병의 유형, 세포 또는 키메라 수용체의 유형, 질병의 중증도 및 진행 경과, 세포가 예방 또는 치료 목적으로 투여되는지 여부, 선행 요법, 대상체의 임상 이력과 세포에 대한 반응 및 주치의의 재량에 따라 달라질 수 있다. 일부 구현예에서 조성물 및 세포는 한 번에 또는 일련의 치료에 걸쳐 대상체에 적합하게 투여된다.
일부 구현예에서, 세포는 다른 치료적 개입, 예컨대 항체 또는 조작된 세포 또는 수용체 또는 제제, 예컨대 세포 독성제 또는 치료제와 예컨대 동시에 또는 순차적으로, 임의 순서로 병용 치료의 일부로서 투여된다. 일부 구현예에서, 세포는 하나 이상의 추가 치료제와 함께 또는 다른 치료적 개입과 관련하여 동시이든 순차적이든 임의의 순서로 공동-투여된다. 일부 맥락에서, 세포는 세포의 집단이 하나 이상의 추가 치료제의 효과를 강화하도록(또는 그 역으로 강화하도록) 하는 데 충분히 가까운 시점에 다른 요법과 공동-투여된다. 일부 구현예에서, 세포는 하나 이상의 추가 치료제보다 앞서 투여된다. 일부 구현예에서, 세포는 하나 이상의 추가 치료제 이후에 투여된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 추가 제제는 예를 들어, 지속성을 향상시키기 위해 IL-2와 같은 사이토카인을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 방법은 화학적 치료제의 투여를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 방법은 예를 들어 투여 전에 종양 부담을 감소시키기 위한 화학요법제, 예를 들어, 조절 화학요법제의 투여를 포함한다.
일부 측면에서 면역 고갈(예를 들어, 림프구 고갈) 요법으로 대상체를 사전 조절하면 입양 세포 요법(ACT)의 효과를 향상시킬 수 있다.
따라서, 일부 구현예에서, 본 방법은 세포 요법의 개시 전에 대상체에 시클로포스파미드, 플루다라빈 또는 이의 조합물과 같은 림프구 고갈제 또는 화학 요법제와 같은 사전 조절제를 투여하는 것을 포함한다. 예를 들어, 대상체는 세포 요법을 개시하기 적어도 2일 전, 예컨대 적어도 3, 4, 5, 6 또는 7일 전에 사전 조절제를 투여받을 수 있다. 일부 구현예에서, 대상체는 세포 요법의 개시 7일 이내 전, 예컨대 6, 5, 4, 3 또는 2일 이내 전에 사전 조절제를 투여받는다.
일부 구현예에서, 대상체는 (약) 20mg/kg 내지 100mg/kg, 예컨대 (약) 40mg/kg 내지 80mg/kg의 단위 용량의 시클로포스파미드로 사전 조절된다. 일부 측면에서, 대상체는 (약) 60mg/kg의 시클로포스파미드로 사전 조절된다. 일부 구현예에서, 시클로포스파미드는 단일 단위 용량으로 투여될 수 있거나, 예컨대 매일, 격일 또는 3일마다 주어진 복수의 단위 용량으로 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 시클로포스파미드는 1일 또는 2일 동안 매일 1회 투여된다. 일부 구현예에서, 림프구 고갈제가 시클로포스파미드를 포함하는 경우, 대상체에 (약) 100mg/m2 내지 500mg/m2, 예컨대 (약) 200 mg/m2 내지 400mg/m2 또는 250mg/m2 내지 350mg/m2(수치 포함)의 단위 용량으로 시클로포스파미드가 투여된다. 일부 경우에, 대상체에 약 300mg/m2의 시클로포스파미드를 투여한다. 일부 구현예에서, 시클로포스파미드는 단일 단위 용량으로 투여될 수 있거나, 예컨대 매일, 격일 또는 3일마다 주어진 복수의 단위 용량으로 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 시클로포스파미드는 예컨대 1 내지 5일 동안, 예를 들어 3 내지 5일 동안 매일 투여된다. 일부 경우에, 대상체에 세포 요법의 개시 전 3일 동안 매일 약 300mg/m2의 시클로포스파미드가 투여된다.
일부 구현예에서, 림프구 고갈제가 플루다라빈을 포함하는 경우, 대상체에 (약) 1mg/m2 내지 100mg/m2, 예컨대 (약) 10mg/m2 내지 75mg/m2, 15mg/m2 내지 50mg/m2, 20 mg/m2 내지 40 mg/m2 또는 24mg/m2 내지 35mg/m2(수치 포함)의 단위 용량으로 플루다라빈이 투여된다. 일부 경우에, 대상체에 약 30mg/m2의 플루다라빈이 투여된다. 일부 구현예에서, 플루다라빈은 단일 단위 용량으로 투여될 수 있거나, 예컨대 매일, 격일 또는 3일마다 주어진 복수의 단위 용량으로 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 플루다라빈은 예컨대 1 내지 5일 동안, 예를 들어 3 내지 5일 동안 매일 투여된다. 일부 경우에, 대상체에 세포 요법의 개시 전 3일 동안 매일 약 30mg/m2의 플루다라빈이 투여된다.
일부 구현예에서, 림프구 고갈제는 시클로포스파미드 및 플루다라빈의 조합물과 같은 제제의 조합물을 포함한다. 따라서, 제제의 조합물은 본원에 기재된 바와 같은 임의의 단위 용량 또는 투여 일정의 시클로포스파미드 및 본원에 기재된 바와 같은 임의의 단위 용량 또는 투여 일정의 플루다라빈을 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 측면에서, 대상체에 제1 또는 후속 단위 용량 전에 60mg/kg(~2g/m2)의 시클로포스파미드 및 25mg/m2 플루다라빈의 3 내지 5 단위 용량이 투여된다.
일부 구현예에서 세포의 투여 후에, 조작된 세포의 집단의 생물학적 활성이 예를 들어, 공지된 다수의 방법 중 하나에 의해 측정된다. 산정 매개변수는 생체 내에서, 예를 들어 영상화에 의해 또는 생체 외 시험에서, 예를 들어 ELISA 또는 유세포 분석에 의해 항원에 조작된 또는 천연 T 세포 또는 다른 면역 세포를 특이적으로 결합하는 것을 포함한다. 특정 구현예에서, 조작된 세포가 표적 세포를 파괴하는 능력은 예를 들어 문헌[Kochenderfer et al., J. Immunotherapy, 32(7): 689-702 (2009), 및 Herman et al. J. Immunological Methods, 285(1): 25-40 (2004)]에 기술된 세포 독성 분석과 같은 공지된 임의의 적합한 방법을 이용하여 측정될 수 있다. 특정 구현예에서, 세포의 생물학적 활성은 하나 이상의 사이토카인, 예컨대 CD107a, IFNγ, IL-2 및 TNF의 발현 및/또는 분비를 분석하여 측정된다. 일부 측면에서, 생물학적 활성은 종양 부담 또는 부하 감소와 같은 임상 결과를 산정하여 측정된다.
특정 구현예에서, 조작된 세포는 이들의 치료적 또는 예방적 효능이 증가하도록 임의의 수의 방법으로 추가 변형된다. 예를 들어, 집단에 의해 발현된 조작된 CAR은 표적화 모이어티에 직접적으로 또는 링커를 통해 간접적으로 접합될 수 있다. 화합물, 예를 들어 CAR을 표적화 모이어티에 접합시키는 실시는 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[Wadwa et al., J. Drug Targeting 3: 1 1 1 (1995) 및 미국 특허 5,087,616]을 참조한다.
일부 구현예에서, 세포는 다른 치료적 개입, 예컨대 항체 또는 조작된 세포 또는 수용체 또는 제제, 예컨대 세포 독성제 또는 치료제와 예컨대 동시에 또는 순차적으로, 임의 순서로 병용 치료의 일부로서 투여된다. 일부 구현예에서, 세포는 하나 이상의 추가 치료제와 함께 또는 다른 치료적 개입과 관련하여 동시이든 순차적이든 임의의 순서로 공동-투여된다. 일부 맥락에서, 세포는 세포의 집단이 하나 이상의 추가 치료제의 효과를 강화하도록(또는 그 역으로 강화하도록) 하는 데 충분히 가까운 시점에 다른 요법과 공동-투여된다. 일부 구현예에서, 세포는 하나 이상의 추가 치료제보다 앞서 투여된다. 일부 구현예에서, 세포는 하나 이상의 추가 치료제 이후에 투여된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 추가 제제는 예를 들어, 지속성을 향상시키기 위해 IL-2와 같은 사이토카인을 포함한다.
일부 구현예에서, 세포의 단위 용량이 제공된 방법, 및/또는 제공된 제조품 또는 조성물에 부합되게 대상체에 투여된다. 일부 구현예에서, 단위 용량의 크기 또는 투여 시기는 대상체에서 특정 질병 또는 병태에 대한 작용으로서 결정된다. 일부 경우에, 제공된 기재의 관점에서 특정 질병에 대한 단위 용량의 크기 또는 투약 시기는 경험적으로 결정될 수 있다.
일부 구현예에서, 세포의 단위 용량은 (약) 2 x 105개 세포/kg 내지 (약) 2 x 106개 세포/kg, 예컨대 (약) 4 x 105개 세포/kg 내지 (약) 1 x 106개 세포/kg 또는 (약) 6 x 105개 세포/kg 내지 (약) 8 x 105개 세포/kg를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포의 단위 용량은 대상체 체중 1 킬로그램 당 2 x 105 이내의 세포(예를 들어 항원 발현, 예컨대 CAR 발현 세포)(세포/kg), 예컨대 (약) 3 x 105 이내의 세포/kg, (약) 4 x 10 5 이내의 세포/kg, (약) 5 x 105 이내의 세포/kg, (약) 6 x 105 이내의 세포/kg, (약) 7 x 105 이내의 세포/kg, (약) 8 x 105 이내의 세포/kg, (약) 9 x 105 이내의 세포/kg, (약) 1 x 106 이내의 세포/kg 또는 (약) 2 x 106 이내의 세포/kg를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포의 단위 용량은 대상체의 체중 1 킬로그램 당 약 또는 적어도 (약) 2 x 105의 세포(예를 들어 항원 발현, 예컨대 CAR 발현 세포)(세포/kg), 예컨대 약 또는 적어도 (약) 3 x 105 세포/kg, 약 또는 적어도 (약) 4 x 105 세포/kg, 약 또는 적어도 (약) 5 x 105 세포/kg, 약 또는 적어도 (약) 6 x 105 세포/kg, 약 또는 적어도 (약) 7 x 105 세포/kg, 약 또는 적어도 (약) 8 x 105 세포/kg, 약 또는 적어도 (약) 9 x 105 세포/kg, 약 또는 적어도 (약) 1 x 106 세포/kg, 또는 약 또는 적어도 (약) 2 x 106의 세포/kg를 포함한다.
특정 구현예에서, 세포 또는 세포의 아형의 개별 집단은 (약) 10만 내지 (약) 1000억 세포의 범위로 및/또는 대상체의 체중 1kg 당 세포의 양으로, 예컨대, 예를 들어, (약) 10만 내지 (약) 500억 세포(예를 들어, (약) 5백만 세포, (약) 2천5백만 세포, (약) 5억 세포, (약) 10억 세포, (약) 50억 세포, (약) 200억 세포, (약) 300억 세포, (약) 400억 세포 또는 전술한 수치 중 임의의 2개에 의해 정의되는 범위), (약) 1백만 내지 (약) 500억 세포(예를 들어, (약) 5백만 세포, (약) 2천5백만 세포, (약) 5억 세포, (약) 10억 세포, (약) 50억 세포, (약) 200억 세포, (약) 300억 세포, (약) 400억 세포 또는 전술한 수치 중 임의의 2개에 의해 정의되는 범위), 예컨대 (약) 1천만 내지 (약) 1000억 세포(예를 들어, (약) 2천만 세포, (약) 3천만 세포, (약) 4천만 세포, (약) 6천만 세포, (약) 7천만 세포, (약) 8천만 세포, (약) 9천만 세포, (약) 100억 세포, (약) 250억 세포, (약) 500억 세포, (약) 750억 세포, (약) 900억 세포 또는 전술한 수치 중 임의의 2개에 의해 정의되는 범위) 및 일부 경우에 (약) 1억 세포 내지 (약) 500억 세포(예를 들어, (약) 1억2천만 세포, (약) 2억5천만 세포, (약) 3억5천만 세포, (약) 6억5천만 세포, (약) 8억 세포, (약) 9억 세포, (약) 30억 세포, (약) 300억 세포, (약) 450억 세포) 또는 상기 범위 사이의 임의의 수치 및/또는 대상체의 체중 1kg당 세포의 양으로 대상체에 투여된다. 투여량은 질병 또는 장애 및/또는 환자 및/또는 다른 치료의 구체적인 속성에 따라 달라질 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 수치는 키메라 수용체 발현 세포의 수를 지칭하고; 다른 구현예에서, 이는 투여된 T 세포 또는 PBMC 또는 총 세포의 수를 지칭한다.
일부 구현예에서, 예를 들어, 대상체가 인간인 경우에, 단위 용량은 약 5 x 108개 미만의 총 키메라 수용체(예를 들어, CAR)-발현 세포, T 세포 또는 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를, 예를 들어, (약) 1 x 106 내지 (약) 5 x 108개의 상기 세포 수 범위내에서, 예컨대, (약) 2 x 106, 5 x 106, 1 x 107, 5 x 107, 1 x 108, 1.5 x 108 또는 5 x 108개의 총 상기 세포 수의 범위내에서, 또는 전술한 수치 중 임의의 두 개 수치 사이의 범위내에서 포함한다. 일부 구현예에서, 예를 들어, 대상체가 인간인 경우에, 단위 용량은 (약) 1 x 106개 초과의 총 키메라 수용체(예를 들어, CAR)-발현 세포, T 세포 또는 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 및 (약) 2 x 109개 미만의 총 키메라 수용체(예를 들어, CAR)-발현 세포, T 세포 또는 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를, 예를 들어, (약) 2.5 x 107 내지 (약) 1.2 x 109개의 상기 세포 수 범위내, 예컨대, (약) 2.5 x 107, 5 x 107, 1 x 108, 1.5 x 108, 8 x 108 또는 1.2 x 109개의 총 상기 세포 수, 또는 전술한 수치 중 임의의 2개 사이의 범위내 수를 포함한다.
일부 구현예에서, 유전자 조작된 세포의 단위 용량은 (약) 1 x 105 내지 (약) 5 x 108개 총 CAR-발현(CAR+) T 세포, (약) 1 x 105 내지 (약) 2.5 x 108개 총 CAR+ T 세포, (약) 1 x 105 내지 (약) 1 x 108개 총 CAR+ T 세포, (약) 1 x 105 내지 (약) 5 x 107개 총 CAR+ T 세포, (약) 1 x 105 내지 (약) 2.5 x 107개 총 CAR+ T 세포, (약) 1 x 105 내지 (약) 1 x 107개 총 CAR+ T 세포, (약) 1 x 105 내지 (약) 5 x 106개 총 CAR+ T 세포, (약) 1 x 105 내지 (약) 2.5 x 106개 총 CAR+ T 세포, (약) 1 x 105 내지 (약) 1 x 106개 총 CAR+ T 세포, (약) 1 x 106 내지 (약) 5 x 108개 총 CAR+ T 세포, (약) 1 x 106 내지 (약) 2.5 x 108개 총 CAR+ T 세포, (약) 1 x 106 내지 (약) 1 x 108개 총 CAR+ T 세포, (약) 1 x 106 내지 (약) 5 x 107개 총 CAR+ T 세포, (약) 1 x 106 내지 (약) 2.5 x 107개 총 CAR+ T 세포, (약) 1 x 106 내지 (약) 1 x 107개 총 CAR+ T 세포, (약) 1 x 106 내지 (약) 5 x 106개 총 CAR+ T 세포, (약) 1 x 106 내지 (약) 2.5 x 106개 총 CAR+ T 세포, (약) 2.5 x 106 내지 (약) 5 x 108개 총 CAR+ T 세포, (약) 2.5 x 106 내지 (약) 2.5 x 108개 총 CAR+ T 세포, (약) 2.5 x 106 내지 (약) 1 x 108개 총 CAR+ T 세포, (약) 2.5 x 106 내지 (약) 5 x 107개 총 CAR+ T 세포, (약) 2.5 x 106 내지 (약) 2.5 x 107개 총 CAR+ T 세포, (약) 2.5 x 106 내지 (약) 1 x 107개 총 CAR+ T 세포, (약) 2.5 x 106 내지 (약) 5 x 106개 총 CAR+ T 세포, (약) 5 x 106 내지 (약) 5 x 108개 총 CAR+ T 세포, (약) 5 x 106 내지 (약) 2.5 x 108개 총 CAR+ T 세포, (약) 5 x 106 내지 (약) 1 x 108개 총 CAR+ T 세포, (약) 5 x 106 내지 (약) 5 x 107개 총 CAR+ T 세포, (약) 5 x 106 내지 (약) 2.5 x 107개 총 CAR+ T 세포, (약) 5 x 106 내지 (약) 1 x 107개 총 CAR+ T 세포, (약) 1 x 107 내지 (약) 5 x 108개 총 CAR+ T 세포, (약) 1 x 107 내지 (약) 2.5 x 108개 총 CAR+ T 세포, (약) 1 x 107 내지 (약) 1 x 108개 총 CAR+ T 세포, (약) 1 x 107 내지 (약) 5 x 107개 총 CAR+ T 세포, (약) 1 x 107 내지 (약) 2.5 x 107개 총 CAR+ T 세포, (약) 2.5 x 107 내지 (약) 5 x 108개 총 CAR+ T 세포, (약) 2.5 x 107 내지 (약) 2.5 x 108개 총 CAR+ T 세포, (약) 2.5 x 107 내지 (약) 1 x 108개 총 CAR+ T 세포, (약) 2.5 x 107 내지 (약) 5 x 107개 총 CAR+ T 세포, (약) 5 x 107 내지 (약) 5 x 108개 총 CAR+ T 세포, (약) 5 x 107 내지 (약) 2.5 x 108개 총 CAR+ T 세포, (약) 5 x 107 내지 (약) 1 x 108개 총 CAR+ T 세포, (약) 1 x 108 내지 (약) 5 x 108개 총 CAR+ T 세포, (약) 1 x 108 내지 (약) 2.5 x 108개 총 CAR+ T 세포, 또는 (약) 2.5 x 108 내지 (약) 5 x 108개 총 CAR+ T 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 유전자 조작된 세포의 단위 용량은 (약) 2.5 x 107 내지 (약) 1.5 x 108개의 총 CAR+ T 세포, 예컨대 (약) 5 x 107 내지 (약) 1 x 108개의 총 CAR+ T 세포를 포함한다.
일부 구현예에서, 유전자 조작된 세포의 단위 용량은 적어도 (약) 1 x 105 CAR+개 세포, 적어도 (약) 2.5 x 105 CAR+개 세포, 적어도 (약) 5 x 105 CAR+개 세포, 적어도 (약) 1 x 106 CAR+개 세포, 적어도 (약) 2.5 x 106 CAR+개 세포, 적어도 (약) 5 x 106 CAR+개 세포, 적어도 (약) 1 x 107 CAR+개 세포, 적어도 (약) 2.5 x 107 CAR+개 세포, 적어도 (약) 5 x 107 CAR+개 세포, 적어도 (약) 1 x 108 CAR+개 세포, 적어도 (약) 1.5 x 108 CAR+개 세포, 적어도 (약) 2.5 x 108 CAR+개 세포, 또는 적어도 (약) 5 x 108 CAR+개 세포를 포함한다.
일부 구현예에서, 세포 요법은 (약) 1 x 105 내지 (약) 5 x 108개의 총 키메라 수용체-발현 세포, 총 T 세포 또는 총 말초 혈액 단핵 세포(PBMC), (약) 5 x 105 내지 (약) 1 x 107개의 총 키메라 수용체-발현 세포, 총 T 세포 또는 총 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 또는 (약) 1 x 106 내지 (약) 1 x 107개의 총 키메라 수용체-발현 세포, 총 T 세포 또는 총 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)(각 수치 포함)의 세포 수를 포함하는 단위 용량의 투여를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포 요법은 적어도 (약) 1 x 105개의 총 키메라 수용체-발현 세포, 총 T 세포 또는 총 말초 혈액 단핵 세포(PBMC), 예컨대 적어도 (약) 1 x 106개, 적어도 (약) 1 x 107개, 적어도 (약) 1 x 108개의 상기 세포의 수를 포함하는 세포의 단위 용량의 투여를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 수는 CD3+ 또는 CD8+, 일부 경우에 또한 키메라 수용체-발현(예를 들어, CAR+) 세포의 총 수를 기준으로 한다. 일부 구현예에서, 세포 요법은 (약) 1 x 105 내지 5 x 108개의 CD3+ 또는 CD8+ 총 T 세포 또는 CD3+ 또는 CD8+ 키메라 수용체-발현 세포, (약) 5 x 105 내지 1 x 107개의 CD3+ 또는 CD8+ 총 T 세포 또는 CD3+ 또는 CD8+ 키메라 수용체-발현 세포, 또는 (약) 1 x 106 내지 1 x 107개의 CD3+ 또는 CD8+ 총 T 세포 또는 CD3+ 또는 CD8+ 키메라 수용체-발현 세포의 세포 수(각 수치 포함)를 포함하는 단위 용량의 투여를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포 요법은 (약) 1 x 105 내지 5 x 108개의 총 CD3+/CAR+ 또는 CD8+/CAR+ 세포, (약) 5 x 105 내지 1 x 107개의 총 CD3+/CAR+ 또는 CD8+/CAR+ 세포 또는 (약) 1 x 106 내지 1 x 107개의 총 CD3+/CAR+ 또는 CD8+/CAR+ 세포의 세포 수(각 수치 포함)를 포함하는 단위 용량의 투여를 포함한다.
일부 구현예에서, 단위 용량의 T 세포는 CD4+ T 세포, CD8+ T 세포 또는 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 포함한다.
일부 구현예에서, 예를 들어, 대상체가 인간인 경우, CD4+ 및 CD8+ T 세포를 포함하는 단위 용량에 포함된 단위 용량의 CD8+ T 세포는 (약) 1 x 106 내지 5 x 108개의 총 키메라 수용체(예를 들어, CAR)-발현 CD8+ 세포, 예를 들어, (약) 5 x 106 내지 1 x 108개의 상기 세포의 범위내, 예컨대 1 x 107, 2.5 x 107, 5 x 107, 7.5 x 107, 1 x 108, 1.5 x 108, 또는 5 x 108개의 총 상기 세포 수, 또는 전술한 수치 중 임의의 2개 사이의 범위내 수를 포함한다.　 일부 구현예에서, 환자는 다중 단위 용량으로 투여받고, 각각의 단위 용량 또는 총 용량은 전술한 수치 중 어느 하나 내에 있을 수 있다. 일부 구현예에서, 세포의 단위 용량은 (약) 1 x 107 내지 (약) 0.75 x 108개의 총 키메라 수용체-발현 CD8+ T 세포, (약) 1 x 107 내지 (약) 5 x 107개의 총 키메라 수용체-발현 CD8+ T 세포, (약) 1 x 107 내지 (약) 0.25 x 108개의 총 키메라 수용체-발현 CD8+ T 세포(각 수치 포함)의 투여를 포함한다.　 일부 구현예에서, 세포의 단위 용량은 (약) 1 x 107, 2.5 x 107, 5 x 107, 7.5 x 107, 1 x 108, 1.5 x 108, 2.5 x 108, 또는 5 x 108개의 총 키메라 수용체-발현 CD8+ T 세포의 투여를 포함한다.
일부 구현예에서, 세포, 예를 들어 키메라 수용체-발현 T 세포의 단위 용량이 단일 단위 용량으로 대상체에 투여되거나 2주, 1개월, 3개월, 6개월, 1년 이상의 기간 내에 1회만 투여된다. 입양 세포 요법의 맥락에서, 주어진 “단위 용량(dose)”의 투여는 단일 조성물 및/또는 단일 비중단 투여, 예를 들어 단일 주사 또는 연속 주입으로서 주어진 세포의 양 또는 수의 투여를 포괄하며, 또한 다중 개별 조성물 또는 주입제로 제공된 경우 명시된 기간에 걸쳐, 예컨대 3일 이내에 걸쳐 분할된 단위 용량 또는 복수의 조성물로서 주어진 세포의 양 또는 수의 투여를 포괄한다. 따라서, 일부 맥락에서, 단위 용량은 단일 시점에서 주어진 또는 개시된, 명시된 세포 수의 단일 또는 연속 투여이다. 그러나, 일부 맥락에서, 단위 용량은 3일 동안 또는 2일 동안 하루에 한 번 또는 하루의 기간에 걸쳐 다중 주입에 의한 것과 같이 3일 이내의 기간에 걸쳐 다중 주사 또는 주입으로 투여된다.
따라서, 일부 측면에서, 단위 용량의 세포는 단일 약학 조성물로 투여된다. 일부 구현예에서, 단위 용량의 세포는 총체적으로 단위 용량의 세포를 함유하는 복수의 조성물로 투여된다.
일부 구현예에서, 용어 “분할 단위 용량(split dose)”은 1일 이상에 걸쳐 투여되도록 분할된 단위 용량을 지칭한다. 상기 유형의 투약은 본 방법에 포괄되고 단일 단위 용량으로 간주된다.
따라서, 단위 용량의 세포는 분할 단위 용량, 예를 들어, 시간에 걸쳐 투여되는 분할 단위 용량으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 단위 용량은 2일 또는 3일에 걸쳐 대상체에 투여될 수 있다. 분할 투약에 대한 예시적인 방법은 첫 날에 단위 용량의 25%를 투여하고 두 번째 날에 단위 용량의 나머지 75%를 투여하는 것을 포함한다. 다른 구현예에서, 단위 용량의 33%가 첫 날에 투여되고 두 번째 날에 나머지 67%가 투여될 수 있다. 일부 측면에서, 단위 용량의 10%가 첫 날에 투여되고, 단위 용량의 30%가 두 번째 날에 투여되며, 단위 용량의 60%가 셋째 날에 투여된다. 일부 구현예에서, 분할 단위 용량은 3일을 초과하는 기간에 걸쳐 나뉘지는 않는다.
일부 구현예에서, 단위 용량의 세포는 복수의 조성물 또는 용액, 예컨대 제1 및 제2, 선택적으로 그 이상의 투여로 투여될 수 있고, 각각은 단위 용량의 세포를 일부 함유한다. 일부 측면에서, 각각이 상이한 세포의 집단 및/또는 아형을 함유하는 복수의 조성물이 별도로 또는 독립적으로 선택적으로 특정 기간 내에 투여된다. 예를 들어, 세포의 집단 및/또는 아형은 각각 CD8+ 및 CD4+ T 세포, 및/또는 각각 CD8+ 및 CD4+ 농축된 집단, 예를 들어, CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포를 포함할 수 있고 각각은 개별적으로 키메라 수용체를 발현하도록 유전자 조작된 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 단위 용량의 투여는 CD8+ T 세포의 단위 용량 또는 CD4+ T 세포의 단위 용량을 포함하는 제1 조성물의 투여 및 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포의 다른 단위 용량을 포함하는 제2 조성물의 투여를 포함한다.
일부 구현예에서, 조성물 또는 단위 용량의 투여, 예를 들어, 복수의 세포 조성물의 투여는 세포 조성물의 별도 투여를 수반한다. 일부 측면에서, 별도 투여는 동시에, 또는 임의의 순서로 순차적으로 수행된다.　 일부 구현예에서, 단위 용량은 제1 조성물 및 제2 조성물을 포함하고, 제1 조성물 및 제2 조성물은 (약) 0 내지 (약) 12시간 간격으로, (약) 0 내지 (약) 6시간 간격으로 또는 (약) 0 내지 (약) 2시간 간격으로 투여된다. 일부 구현예에서, 제1 조성물의 투여 개시 및 제2 조성물의 투여 개시는 (약) 2시간 이내, (약) 1시간 이내 또는 (약) 30분 이내의 간격, (약) 15분 이내, (약) 10분 이내 또는 (약) 5분 이내의 간격으로 수행된다. 일부 구현예에서, 제1 조성물의 투여 개시 및/또는 완료 및 제2 조성물의 투여 개시 및/또는 완료는 (약) 2시간 이내, (약) 1시간 이내 또는 (약) 30분 이내의 간격, (약) 15분 이내, (약) 10분 이내 또는 (약) 5분 이내의 간격으로 수행된다.
일부 조성물에서, 제1 조성물, 예를 들어, 단위 용량의 제1 조성물은 CD4+ T 세포를 포함한다.　 일부 조성물에서, 제1 조성물, 예를 들어, 단위 용량의 제1 조성물은 CD8+ T 세포를 포함한다.　 일부 구현예에서, 제1 조성물은 제2 조성물 전에 투여된다.
일부 구현예에서, 단위 용량의 세포 또는 세포 조성물은 키메라 수용체를 발현하는 CD4+ 세포 대 키메라 수용체를 발현하는 CD8+ 세포 및/또는 CD4+ 세포 대 CD8+ 세포의 정의된 비율 또는 표적 비율을 포함하고, 상기 비율은 선택적으로 대략 1:1이거나 대략 1:3 내지 대략 3:1, 예컨대 대략 1:1이다. 일부 측면에서, 표적 또는 원하는 비율의 상이한 세포 집단(예컨대 CD4+:CD8+ 비율 또는 CAR+CD4+:CAR+CD8+ 비율, 예를 들어, 1:1)을 갖는 조성물 또는 단위 용량의 투여는 집단들 중 하나를 함유하는 세포 조성물의 투여 후 집단들 중 다른 하나를 포함하는 별도의 세포 조성물의 투여를 수반하고, 상기 투여는 표적 또는 원하는 비율이거나 대략적인 표적 또는 원하는 비율로 수행된다.　 일부 측면에서, 정의된 비율로 단위 용량의 세포 또는 세포 조성물의 투여는 T 세포 요법의 증폭, 지속성 및/또는 항종양 활성의 향상으로 이어진다.
일부 구현예에서, 대상체는 세포의 다중 단위 용량, 예를 들어 둘 이상의 단위 용량 또는 다중 연속 단위 용량을 받는다.　 일부 구현예에서, 두 단위 용량이 대상체에 투여된다.　 일부 구현예에서, 대상체는 연속적인 단위 용량, 예를 들어 제2 단위 용량을 받는데, 이는 첫 번째 단위 용량 후 대략 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 또는 21일에 투여된다.　 일부 구현예에서, 다중 연속 단위 용량은 제1 단위 용량 후에 투여되어, 추가적인 단위 용량 또는 단위 용량들이 연속 단위 용량의 투여 후에 투여되도록 한다.　 일부 측면에서, 추가 단위 용량으로 대상체에 투여되는 세포의 수는 제1 단위 용량 및/또는 연속 단위 용량과 동일하거나 이와 유사하다.　 일부 구현예에서, 추가 단위 용량 또는 단위 용량들은 선행 단위 용량들보다 더 크다.
일부 측면에서, 제1 및/또는 연속 단위 용량의 크기는 하나 이상의 기준 예컨대 선행 치료, 예를 들어 화학 요법에 대한 대상체의 반응, 대상체에서 질병 부담, 예컨대 종양 부하, 부피, 크기 또는 전이의 정도, 범위 또는 유형, 단계 및/또는 대상체가 독성 결과, 예를 들어 CRS, 대식세포 활성화 증후군, 종양 용해 증후군, 신경 독성을 발달시킬 가능성 또는 발생률 및/또는 투여되는 세포 및/또는 키메라 수용체에 대한 숙주 면역 반응에 기초하여 결정된다.
일부 측면에서, 제1 단위 용량의 투여와 연속 단위 용량의 투여 사이의 시간은 약 9 내지 약 35일, 약 14일 내지 약 28일 또는 15일 내지 27일이다.　 일부 구현예에서, 연속 단위 용량의 투여는 제1 단위 용량의 투여 후 약 14일 초과 및 약 28일 미만의 시점에 수행한다.　 일부 측면에서, 제1 단위 용량 및 연속 단위 용량 사이 시간은 약 21일이다. 일부 구현예에서, 추가 단위 용량 또는 단위 용량들, 예를 들어, 연속 단위 용량들은 연속 단위 용량 투여 후 투여된다.　 일부 측면에서, 추가 연속 단위 용량 또는 단위 용량들은 선행 단위 용량 투여 후 약 14일 이상 및 약 28일 미만에 투여된다.　 일부 구현예에서, 추가 단위 용량은 선행 단위 용량 후 약 14일 미만에, 예를 들어, 선행 단위 용량 후 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 13일에 투여된다.　 일부 구현예에서, 선행 단위 용량 후 약 14일 미만 및/또는 선행 단위 용량 후 약 28일 이상에는 어떤 단위 용량도 투여되지 않는다.
일부 구현예에서, 세포, 예를 들어 키메라 수용체 발현 세포의 단위 용량은 제1 단위 용량의 T 세포 및 연속 단위 용량의 T 세포를 포함한 2 단위 용량(예를 들어, 2배 단위 용량)을 포함하며, 여기서 제1 단위 용량 및 제2 단위 용량 중 하나 또는 둘 모두는 T 세포의 분할 단위 용량 투여를 포함한다.
일부 구현예에서, 세포의 단위 용량은 일반적으로 질병 부담을 감소시키는 데 효과적일 만큼 충분히 크다.
일부 구현예에서, 세포는 원하는 투여량으로 투여되며, 이는 일부 측면에서 원하는 단위 용량 또는 세포 수 또는 세포 유형(들) 및/또는 세포 유형의 원하는 비율을 포함한다. 따라서, 일부 구현예에서 세포의 투여량은 세포의 총 수(또는 체중 1kg당 수) 및 개별 집단 또는 아형의 원하는 비율, 예컨대 CD4+ 대 CD8+ 비율에 기초한다. 일부 구현예에서, 세포의 투여량은 개별 집단 내 세포 또는 개별 세포 유형의 원하는 총 수(또는 체중 1kg당 수)에 기초한다. 일부 구현예에서, 투여량은 개별 집단에서 원하는 총 세포의 수, 원하는 비율 및 원하는 세포의 총 수와 같은 상기 특성의 조합에 기초한다.
일부 구현예에서, CD8+ 및 CD4+ T 세포와 같은 세포의 집단 또는 아형의 세포는 원하는 T 세포의 단위 용량과 같이 원하는 총 세포의 단위 용량의 허용된 차이로 또는 허용된 차이 내로 투여된다. 일부 측면에서, 원하는 단위 용량은 원하는 세포 수 또는 세포가 투여되는 대상체의 체중 단위 당 원하는 세포 수, 예를 들어 세포/kg이다. 일부 측면에서, 원하는 단위 용량은 최소 세포 수 또는 체중 단위당 최소 세포 수 이상이다. 일부 측면에서, 원하는 단위 용량으로 투여되는 총 세포 중, 개별 집단 또는 아형은 원하는 산출 비율(예컨대 CD4+ 대 CD8+ 비율)로 또는 부근의 비율로, 예를 들어 상기 비율의 특정 허용된 차이 또는 오차 내로 존재한다.
일부 구현예에서, 세포는 CD4+ 세포의 원하는 단위 용량 및/또는 CD8+ 세포의 원하는 단위 용량과 같은 하나 이상의 개별 세포 집단 또는 아형의 세포의 원하는 단위 용량의 허용된 차이 또는 차이 내에서 투여된다. 일부 측면에서, 원하는 단위 용량은 원하는 아형 또는 집단의 세포 수 또는 세포가 투여되는 대상체의 체중 단위 당 원하는 상기 세포 수, 예를 들어 세포/kg이다. 일부 측면에서, 원하는 단위 용량은 집단 또는 아형의 최소 세포 수 또는 체중 단위당 집단 또는 아형의 최소 세포 수 이상이다.
따라서, 일부 구현예에서, 투여량은 총 세포의 원하는 고정 단위 용량 및 원하는 비율에 기초하고/거나 하나 이상, 예를 들어 각각의 개별 아형 또는 하위 집단의 원하는 고정 단위 용량에 기초한다. 따라서, 일부 구현예에서, 투여량은 T 세포의 원하는 고정 또는 최소 단위 용량 및 CD4+ 대 CD8+ 세포의 원하는 비율에 기초하고/거나 CD4+ 및/또는 CD8+ 세포의 원하는 고정 또는 최소 단위 용량에 기초한다.
일부 구현예에서, 세포는 CD4+ 및 CD8+ 세포 또는 아형과 같은 다중 세포 집단 또는 아형의 원하는 산출 비율의 허용된 범위에서 또는 범위 내에서 투여된다. 일부 측면에서, 원하는 비율은 특정 비율일 수 있거나 비율의 범위일 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 원하는 비율(예를 들어, CD4+ 대 CD8+ 세포의 비율)은 (약) 5:1 내지 (약) 5:1(또는 약 1:5 초과 내지 약 5:1 미만), 또는 (약) 1:3 내지 (약) 3:1(또는 약 1:3 초과 내지 약 3:1 미만), 예컨대 (약) 2:1 내지 (약) 1:5(또는 약 1:5 초과 내지 약 2:1 미만), 예컨대 (약) 5:1, 4.5:1, 4:1, 3.5:1, 3:1, 2.5:1, 2:1, 1.9:1, 1.8:1, 1.7:1, 1.6:1, 1.5:1, 1.4:1, 1.3:1, 1.2:1, 1.1:1, 1:1, 1:1.1, 1:1.2, 1:1.3, 1:1.4, 1:1.5, 1:1.6, 1:1.7, 1:1.8, 1:1.9, 1:2, 1:2.5, 1:3, 1:3.5, 1:4, 1:4.5 또는 1:5이다. 일부 측면에서, 허용된 차이는 원하는 비율의 약 1%, 약 2%, 약 3%, 약 4% 약 5%, 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50% (상기 범위 사이의 임의의 수치 포함) 이내이다.
구체적인 구현예에서, 세포의 수 및/또는 농도는 키메라 수용체(예를 들어, CAR)-발현 세포의 수를 지칭한다. 다른 구현예에서, 세포의 수 및/또는 농도는 투여된 모든 세포, T 세포 또는 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)의 수 또는 농도를 지칭한다.
일부 측면에서, 단위 용량의 크기는 하나 이상의 기준 예컨대 선행 치료, 예를 들어 화학 요법에 대한 대상체의 반응, 대상체에서 질병 부담, 예컨대 종양 부하, 규모, 크기 또는 전이의 정도, 범위 또는 유형, 단계(stage) 및/또는 대상체가 독성 결과, 예를 들어 CRS, 대식세포 활성화 증후군, 종양 용해 증후군, 신경 독성을 발달시킬 가능성 또는 발생률 및/또는 투여되는 세포 및/또는 키메라 수용체에 대한 숙주 면역 반응에 기초하여 결정된다.
일부 구현예에서, 본 방법은 또한 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하는 세포 및/또는 림프구 고갈 요법의 하나 이상의 추가 단위 용량의 투여를 포함하고/거나 본 방법 중 하나 이상의 단계가 반복된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 추가 단위 용량은 초기 단위 용량과 동일하다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 추가 단위 용량은 초기 단위 용량과 상이하며, 예를 들어, 초기 단위 용량보다 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배 또는 10배 또는 그 이상만큼 더 높거나, 초기 단위 용량보다 예를 들어 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배 또는 10배 또는 그 이상만큼 더 낮다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 추가 단위 용량의 투여는 초기 치료 또는 임의의 선행 치료에 대한 대상체의 반응, 대상체에서 질병 부담, 예컨대 종양 부하, 부피, 크기 또는 전이의 정도, 범위 또는 유형, 단계 및/또는 대상체가 독성 결과, 예를 들어 CRS, 대식세포 활성화 증후군, 종양 용해 증후군, 신경 독성을 발달시킬 가능성 또는 발생률 및/또는 투여되는 세포에 대한 숙주 면역 반응에 기초하여 결정된다.
V. 약학 조성물 및 제형
예컨대 입양 세포 요법을 위한 투여용 약학 조성물 및 제형과 같은 조성물이 또한 제공된다. 일부 측면에서, 약학 조성물은, 예를 들어, 키메라 수용체의 일부를 암호화하는 전이 유전자 서열을 포함하는 변형된 CD247 유전자 자리를 포함하는, 본원에 기술된 조작된 세포를 함유하는 임의의 조작된 세포 또는 조성물을 함유한다. 일부 구현예에서, 키메라 수용체, 예를 들어, CAR로 조작된 세포를 포함하는 세포의 단위 용량이 약학 조성물 또는 제형과 같은 조성물 또는 제형으로 제공된다. 상기 조성물은 제공된 방법, 및/또는 제공된 제조품 또는 조성물에 부합되게, 예컨대 질병, 병태 및 장애의 예방 또는 치료에, 또는 검출, 진단, 및 예후 방법에 사용될 수 있다.
용어 “약학적 제형(pharmaceutical formulation)”은 그 안에 함유된 활성 성분의 생물학적 활성이 효과적일 수 있도록 하는 형태이고, 상기 제형이 투여되는 대상체에 허용 가능하지 않을 정도로 독성인 추가 성분을 함유하지 않는 조제품(preparation)을 지칭한다.
“약학적으로 허용 가능한 운반체(pharmaceutically acceptable carrier)”는 활성 성분 외의 약학적 제형 안에 있는 성분을 지칭하고, 이는 대상체에 무독성이다. 약학적으로 허용 가능한 운반체는 완충제, 부형제, 안정제 또는 보존제를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
일부 측면에서, 운반체의 선택은 특정 세포 또는 제제 및/또는 투여 방법에 의해 부분적으로 결정된다. 따라서, 적합한 제형이 다양하게 존재한다. 예를 들어, 약학 조성물은 보존제를 함유할 수 있다. 적합한 보존제는 예를 들어, 메틸파라벤, 프로필파라벤, 벤조산 나트륨 및 염화 벤잘코늄을 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 2개 이상의 보존제의 혼합물이 사용된다. 보존제 또는 이의 혼합물은 통상적으로 전체 조성물의 약 0.0001% 내지 약 2 중량%의 양으로 존재한다. 운반체는, 예를 들어, 문헌[Remington’s Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)]에 기술되어 있다. 약학적으로 허용 가능한 운반체는 사용된 용량 및 농도에서 일반적으로 수용체(recipient)에게 무독성이며, 인산염, 구연산염 및 기타 유기산과 같은 완충제; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함한 항산화제; 보존제(예컨대 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤잘코늄 클로라이드; 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 메틸 또는 프로필 파라벤과 같은 알킬 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 시클로 헥사놀; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량(약 10 잔기 미만) 폴리펩타이드; 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린과 같은 단백질; 폴리비닐피롤리돈과 같은 친수성 중합체; 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신과 같은 아미노산; 글루코스, 마노스 또는 덱스트린을 포함하는 단당류, 이당류 및 다른 탄수화물; EDTA와 같은 킬레이트제; 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 솔비톨과 같은 설탕; 나트륨과 같은 염 형성 반대 이온; 금속 복합체(예를 들어, Zn-단백질 복합체); 및/또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 같은 비이온 계면활성제를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
일부 측면에서 완충제가 조성물에 포함된다. 적합한 완충제에는 예를 들어, 구연산, 구연산 나트륨, 인산, 인산 칼륨 및 다양한 다른 산 및 염이 포함된다. 일부 측면에서, 2개 이상의 완충제의 혼합물이 사용된다. 완충제 또는 이의 혼합물은 통상적으로 전체 조성물의 약 0.001중량% 내지 약 4 중량%의 양으로 존재한다. 투여 가능한 약학 조성물의 제조 방법은 공지되어 있다. 예시적인 방법이 예를 들어, 문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott Williams & Wilkins; 21st ed. (May 1, 2005)]에 보다 상세하게 기술되어 있다.
제형 또는 조성물은 또한 세포 또는 제제로 예방 또는 치료될 특정 징후, 질병 또는 병태에 유용한 하나보다 많은 활성 성분을 함유할 수 있으며, 여기서 각각의 활성이 서로 악영향을 미치지 않는다. 상기 활성 성분은 의도된 목적에 효과적인 양으로 조합하여 적합하게 존재한다. 따라서, 일부 구현예에서, 약학 조성물은 화학 요법제, 예를 들어 아스파라기나아제, 부설판, 카보플라틴, 시스플라틴, 다우노루비신, 독소루비신, 플루오로우라실, 젬시타빈, 히드록시우레아, 메토트렉세이트, 파클리탁셀, 리툭시맙, 빈블라스틴, 빈크리스틴 등과 같은 다른 약학적 활성제 또는 약물을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 제제 또는 세포는 염의 형태, 예를 들어, 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 투여된다. 적합한 약학적으로 허용 가능한 산 부가 염은 염산, 브롬화 수소산, 인산, 메타인산, 질산 및 황산과 같은 무기산, 및 타르타르산, 아세트산, 시트르산, 말산, 락트산, 푸마르산, 벤조산, 글리콜산, 글루콘산, 숙신산 및 아릴술폰산, 예를 들어 p-톨루엔술폰산과 같은 유기산으로부터 유래된 것을 포함한다.
일부 구현예에서 약학 조성물은 치료적 유효량 또는 예방적 유효량과 같이 질병 또는 병태를 치료 또는 예방하기에 효과적인 양으로 제제 또는 세포를 함유한다. 일부 구현예에서 치료적 또는 예방적 효능은 치료받은 대상체의 주기적인 평가에 의해 모니터링된다. 병태에 따라 며칠 또는 그 이상에 걸쳐 반복 투여되는 경우, 질병 증상의 원하는 억제가 발생할 때까지 치료가 반복된다. 그러나, 다른 투여량 요법이 유용할 수 있고 결정될 수 있다. 원하는 투여량이 조성물의 단일 볼루스 투여, 조성물의 다중 볼루스 투여 또는 조성물의 지속적인 주입 투여에 의해 전달될 수 있다.
제제 또는 세포는, 임의의 적합한 수단, 예를 들어 볼루스 주입, 주사, 예를 들어 정맥내 또는 피하 주사, 안구내(intraocular) 주사, 안구주위(periocular) 주사, 망막하(subretinal) 주사, 유리체내(intravitreal) 주사, 중격-경유성(trans-septal) 주사, 공막하(subscleral) 주사, 맥락막내(intrachoroidal) 주사, 전방내(intracameral) 주사, 결막하 주사(subconjectval injection, subconjuntival injection), 서브 테논(sub-Tenon) 주사, 안구뒤(retrobulbar) 주사, 안구주위(peribulbar) 주사 또는 후부 점막 주사(posterior juxtascleral) 전달에 의해 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 이는 비경구, 폐내 및 비강내 및 국소 치료가 바람직한 경우 병변내 투여에 의해 투여된다. 비경구 주입은 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내 또는 피하 투여를 포함한다. 일부 구현예에서, 주어진 단위 용량이 세포 또는 제제의 단일 볼루스 투여에 의해 투여된다. 일부 구현예에서, 이는 예를 들어, 3일 이내의 기간에 걸쳐 세포 또는 제제의 다중 볼루스 투여에 의해, 또는 세포 또는 제제의 지속적인 주입 투여에 의해 투여된다.
질병의 예방 또는 치료를 위한, 적절한 투여량은 치료될 질병의 유형, 제제의 유형, 세포 또는 키메라 수용체의 유형, 질병의 중증도 및 진행 경과, 제제 또는 세포가 예방 또는 치료 목적으로 투여되는지, 선행 요법, 대상체의 임상 이력과 제제 또는 세포에 대한 반응, 및 주치의의 재량에 따라 달라질 수 있다. 일부 구현예에서 조성물은 한 번에 또는 일련의 치료에 걸쳐 대상체에 적합하게 투여된다.
세포 또는 제제는 표준 투여 기술, 제형 및/또는 디바이스를 사용하여 투여될 수 있다. 조성물의 저장 및 투여를 위해 주사기 및 바이알과 같은 제형 및 디바이스가 제공된다. 세포에 관하여, 투여는 자가 조직 또는 이종 기원일 수 있다. 일부 측면에서, 세포는 대상체로부터 단리되고, 조작되어 동일한 대상체에 투여된다. 다른 측면에서, 세포는 한 대상체로부터 단리되고, 조작되어 다른 대상체에 투여된다. 예를 들어, 면역 반응성 세포 또는 전구체(progenitor)는 하나의 대상체로부터 수득될 수 있고, 동일한 대상체 또는 상이하고, 양립 가능한 대상체에 투여될 수 있다. 말초 혈액 유래 면역 반응성 세포 또는 이의 자손(예를 들어, 생체 내, 생체 외 시험 또는 시험관 내 유래)은 카테터 투여, 전신 주사, 국소 주사, 정맥내 주사 또는 비경구 투여를 포함하는 국소 주사를 통해 투여될 수 있다. 치료 조성물(예를 들어, 신경 독성의 증상을 치료 또는 개선하는 유전자 변형 면역 반응성 세포 또는 제제를 함유하는 약학 조성물)을 투여할 때, 일반적으로 이는 주사 가능한 단위 투여량 형태(용액, 현탁액, 에멀션)로 제형화될 것이다.
제형에는 경구, 정맥내, 복강내, 피하, 폐, 경피, 근육내, 비강내, 볼, 설하 또는 좌약 투여를 위한 것이 포함된다. 일부 구현예에서, 제제 또는 세포 집단은 비경구적으로 투여된다. 본원에서 사용된 바와 같은 용어 “비경구(parenteral)”는 정맥내, 근육내, 피하, 직장, 질 및 복강내 투여를 포함한다. 일부 구현예에서, 제제 또는 세포 집단은 정맥내, 복강내 또는 피하 주사에 의한 말초 전신 전달을 사용하여 대상체에 투여된다.
일부 구현예에서 조성물은 멸균 액체 제제로서, 예를 들어, 등장성 수용액, 현탁액, 에멀션, 분산액 또는 점성 조성물로 제공되며, 이는 일부 측면에서 선택된 pH로 완충될 수 있다. 액체 제제는 일반적으로 겔, 다른 점성 조성물 및 고체 조성물보다 제조가 보다 용이하다. 또한, 액체 조성물은 특히 주사에 의해 투여하기가 다소 더 편리하다. 반면에, 점성 조성물은 적절한 점도 범위 내에서 제형화되어 특정 조직과의 보다 긴 접촉 기간을 제공할 수 있다. 액체 또는 점성 조성물은 예를 들어, 물, 식염수, 인산 완충 식염수, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액상 폴리에틸렌 글리콜) 및 이의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 배지일 수 있는 운반체를 포함할 수 있다.
멸균 주사용 용액은 적합한 멸균수, 생리 식염수, 포도당, 덱스트로스 등과 같은 부형제, 운반체 또는 희석제와 혼합하는 것과 같이 용매에 제제 또는 세포를 통합함으로써 제조될 수 있다.
생체 내 투여에 사용될 제형은 일반적으로 멸균된다. 멸균은 예를 들어, 멸균 여과 막을 통한 여과에 의해 용이하게 달성될 수 있다.
VI. 키트 및 제조품
제공된 구현예를 수행하는 데 유용한 제조품, 시스템, 장치 및 키트가 또한 제공된다. 일부 구현예에서, 제공된 제조품 또는 키트는 유전자 파괴를 유도할 수 있는 하나 이상의 제제(들) 중 하나 이상의 성분 및/또는 주형 폴리뉴클레오타이드, 예를 들어 키메라 수용체 또는 이의 일부를 암호화하는 전이 유전자 서열을 함유하는 주형 폴리뉴클레오타이드를 함유한다. 일부 구현예에서, 제조품 또는 키트는 예를 들어 CD3제타(CD3ζ) 신호 전달 도메인을 포함하는 세포내 영역을 포함하는 키메라 수용체를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 변형된 CD247 유전자 자리를 포함하는 조작된 세포를 생성하기 위해, 예컨대 상동성 의존적 수선(HDR)에 의한 키메라 수용체 또는 이의 일부를 암호화하는 전이 유전자 서열의 통합을 통해, 키메라 수용체 및/또는 다른 분자를 발현하도록 T 세포를 조작하는 방법에 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 제조품 또는 키트는 제공된 방법을 수행하는 데 유용한 폴리펩타이드, 핵산, 벡터 및/또는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 제조품 또는 키트는 예를 들어 CD247 유전자 자리에서 유전자 파괴를 유도할 수 있는 하나 이상의 제제(예컨대 본원의 섹션 I.A에 기술된 것)를 포함한다. 일부 구현예에서, 제조품 또는 키트는 유전자 파괴를 유도할 수 있는 하나 이상의 제제(들) 중 하나 이상의 성분을 암호화하고/거나 예를 들어 HDR을 통해 세포 내로 전이 유전자 서열을 표적화하는 데 사용하기 위한 주형 폴리뉴클레오타이드(예컨대 본원의 섹션 I.B.2에 기술된 것)를 포함하는 하나 이상의 핵산 분자, 예를 들어 플라스미드 또는 DNA 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 제공되는 제조품 또는 키트는 제어 벡터를 함유한다.
일부 구현예에서, 본원에 제공되는 제조품 또는 키트는 하나 이상의 제제 - 여기서 하나 이상의 제제 각각은 CD247 유전자 자리 내의 표적 부위의 유전자 파괴를 독립적으로 유도할 수 있음 -; 및 키메라 수용체의 일부를 암호화하는 전이 유전자를 포함하는 주형 폴리뉴클레오타이드 - 여기서 전이 유전자는 상동 직접 수선(HDR)을 통해 표적 부위에 또는 그 근처에 통합을 위해 표적화됨 - 를 함유한다. 일부 측면에서, 유전자 파괴를 유도할 수 있는 하나 이상의 제제는 본원에 기술된 임의의 것이다. 일부 측면에서, 하나 이상의 제제는 Cas9/gRNA 복합체를 포함하는 리보핵산단백질(RNP) 복합체이다. 일부 측면에서, RNP에 포함된 gRNA는 CD247 유전자 자리 내 표적 부위, 예컨대 본원에 기술된 임의의 표적 부위를 표적화한다. 일부 측면에서, 주형 폴리뉴클레오타이드는 본원에 기술된 임의의 주형 폴리뉴클레오타이드이다.
일부 구현예에서, 제조품 또는 키트는 하나 이상의 용기, 일반적으로 복수의 용기, 포장 재료, 및 용기 또는 용기들 및/또는 일반적으로 사용 설명, 예를 들어 조작을 위해 성분들을 세포 내로 도입하는 것에 대한 설명을 포함한, 포장 위에 또는 그 위 관련된 라벨 또는 포장 삽입물을 포함한다.
본원에 제공되는 제조품은 포장 재료를 함유한다. 제공된 물질을 포장하는 데 사용되는 포장 재료는 잘 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[미국 특허 번호 5,323,907, 5,052,558 및 5,033,252, 이들 각각은 전체가 본 명세서에 참조로 포함됨]을 참조한다. 포장 재료의 예로는 블리스터 팩, 병, 튜브, 흡입기, 펌프, 백, 바이알, 용기, 주사기, 일회용 실험실 용품(예를 들어, 피펫 팁 및/또는 플라스틱 판) 또는 병이 포함되나 이에 제한되지 않는다. 제조품 또는 키트는 재료의 분배를 용이하게 하거나, 예를 들어 로봇 장비에서의 사용을 용이하게 하기 위해 고처리량 또는 대규모 방식으로 사용을 용이하게 하기 위한 디바이스를 포함할 수 있다. 통상적으로, 포장은 그 안에 함유된 조성물과 비반응성이다.
일부 구현예에서, 유전자 파괴를 유도할 수 있는 하나 이상의 제제(들) 및/또는 주형 폴리뉴클레오타이드(들)가 별도로 포장된다. 일부 구현예에서, 각 용기는 단일 칸을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 제조품 또는 키트의 다른 성분들이 단일 칸에 별도로, 또는 함께 포장된다.
예를 들어 요법 또는 치료에 사용하기 위해 제공된 세포 및/또는 세포 조성물을 투여하는 데 유용한 제조품, 시스템, 장치 및 키트가 또한 제공된다. 일부 구현예에서, 본원에 제공되는 제조품 또는 키트는 T 세포 및/또는 T 세포 조성물, 예컨대 본원에 기술된 임의의 T 세포 및/또는 T 세포 조성물을 함유한다. 일부 측면에서, 본원에 제공되는 제조품 또는 키트는 T 세포 또는 T 세포 조성물의 투여를 위해 사용될 수 있고, 사용 설명을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 제공되는 제조품 또는 키트는 T 세포, 및/또는 T 세포 조성물, 예컨대 본원에 기술된 임의의 T 세포, 및/또는 T 세포 조성물을 함유한다. 일부 구현예에서, T 세포, 및/또는 T 세포 조성물은 본원에 기술된 스크리닝 방법을 위해 사용되는 임의의 변형된 T 세포를 함유한다. 일부 구현예에서, 본원에 제공되는 제조품 또는 키트는 대조군 또는 비변형된 T 세포 및/또는 T 세포 조성물을 함유한다. 일부 구현예에서, 제조품 또는 키트는 치료 요법을 위해 조작된 세포 및/또는 세포 조성물의 투여를 위한 하나 이상의 사용 설명을 포함한다.
치료 요법을 위한 세포 또는 세포 조성물을 함유하는 제조품 및/또는 키트는 용기 및 용기 위에 또는 그와 연관된 라벨(label) 또는 포장 삽입물을 포함할 수 있다. 적합한 용기에는, 예를 들어, 병, 바이알, 주사기, IV 용액백 등이 포함된다. 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 재료로 형성될 수 있다. 일부 구현예에서 용기는 조성물을 그 자체로 또는 병태를 치료, 예방 및/또는 진단하는 데 효과적인 다른 조성물과 조합하여 담는다. 일부 구현예에서, 용기는 멸균 접근 포트를 갖는다. 예시적인 용기에는 주사용 바늘에 의해 천공될 수 있는 마개가 있는 것 또는 경구 투여 제제를 위한 병 또는 바이알을 포함하여 정맥내 주사용 용액백, 바이알 등이 포함된다. 라벨 또는 포장 삽입물은 조성물이 질병 또는 병태를 치료하는 데 사용되는 것임을 나타낼 수 있다. 제조품은 (a) 내부에 조성물이 함유되어 있고, 조성물이 키메라 수용체를 발현하는 조작된 세포를 포함하는 제1 용기, 및 (b) 내부에 조성물이 함유되어 있고, 조성물이 제2 제제를 포함하는 제2 용기를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 제조품은 (a) 내부에 제1 조성물이 함유되어 있고, 조성물이 키메라 수용체를 발현하는 조작된 세포의 아형(subtype)을 포함하는 제1 용기, 및 (b) 내부에 조성물이 함유되어 있고, 조성물이 키메라 수용체를 발현하는 조작된 세포의 다른 아형을 포함하는 제2 용기를 포함할 수 있다. 제조품은 조성물이 특정 병태를 치료하는 데 사용할 수 있음을 나타내는 포장 삽입물을 더 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 제조품은 약학적으로 허용 가능한 완충제를 포함하는 다른 용기 또는 동일한 용기를 추가로 포함할 수 있다. 다른 완충제, 희석제, 필터, 바늘 및/또는 주사기와 같이 다른 물질이 추가로 포함될 수 있다.
VII. 정의
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 용어, 표기법 및 다른 기술 및 과학 용어 또는 전문 용어는 청구된 주제가 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는 것으로 의도된다. 일부 경우에, 일반적으로 이해되는 의미를 갖는 용어는 명확성 및/또는 용이한 참조를 위해 본원에서 정의되며, 본원에 상기 정의를 포함하는 것이 당업계에서 일반적으로 이해되는 것과 실질적인 차이를 나타내는 것으로 반드시 해석되는 것은 아니다.
본원에 사용된 바와 같이, 단수 형태(“a”, “an” 및 “the”)는 문맥상 명백하게 다르게 지시하지 않는 한 복수의 지시 대상을 포함한다. 예를 들어, 단수 형태(“a” 또는 “an”)는 “적어도 하나(at least one)” 또는 “하나 이상(one or more)”을 의미한다. 본원에 기재된 측면 및 변형은 측면 및 변형으로 “구성되는(consisting)” 및/또는 “필수적으로 포함하여 구성되는(consisting essentially of)”을 포함하는 것으로 이해된다.
본 개시 내용 전체에서, 청구된 주제의 다양한 측면이 범위 형식으로 제시된다. 범위 형식의 기재는 단지 편의 및 간결성을 위한 것이며 청구된 주제의 범위에 대한 융통성 없는 제한으로 해석되어서는 안된다는 것을 이해해야 한다. 따라서, 범위의 기재는 모든 가능한 하위 범위 및 상기 범위 내의 개별 수치를 구체적으로 개시한 것으로 간주되어야 한다. 예를 들어, 값의 범위가 제공되는 경우, 상기 범위의 상한 내지 하한 사이 각각의 사이에 오는 값과 상기 언급된 범위에서 임의의 다르게 언급되거나 사이에 오는 값은 청구된 주제 내에 포함되는 것으로 이해된다. 상기 더 작은 범위의 상한 내지 하한은 독립적으로 더 작은 범위에 포함될 수 있고, 또한 언급된 범위에서 임의의 구체적으로 배제된 한계를 조건으로, 청구된 주제 내에 포함된다. 언급된 범위가 한계 중 하나 또는 둘 모두를 포함하는 경우, 상기 포함된 한계 중 하나 또는 둘 모두를 제외한 범위도 청구된 주제에 포함된다. 이는 범위의 폭에 관계없이 적용된다.
본원에 사용된 용어 “약(about)”은 용이하게 공지된 각각의 값에 대한 일반적인 오차 범위를 지칭한다. 본원에서 “약(about)”의 값 또는 매개변수에 대한 언급은 상기 값 또는 매개변수 자체에 관한 구현예를 포함(및 기술)한다. 예를 들어, “약 X”를 지칭하는 기재는 “X”의 기재를 포함한다. 일부 구현예에서, “약”은 ±25%, ±20%, ±15%, ±10%, ±5%, 또는 ±1%를 지칭할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 뉴클레오타이드 또는 아미노산 위치가 서열 목록에 제시된 것과 같은 개시된 서열의 뉴클레오타이드 또는 아미노산 위치에 “해당(correspond to)”한다는 기재는 GAP 알고리즘과 같은 표준 정렬 알고리즘을 사용하여 동일성을 극대화하기 위해 개시된 서열과 정렬 시 확인된 뉴클레오타이드 또는 아미노산 위치를 지칭한다. 서열을 정렬함으로써, 예를 들어 보존된 동일한 아미노산 잔기를 가이드로 사용하여 해당 잔기를 식별할 수 있다. 일반적으로, 해당 위치를 확인하기 위해, 아미노산 서열은 가장 높은 순서의 일치가 수득되도록 정렬된다(예를 들어 문헌[Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New.Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; and Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991; Carrillo et al. (1988) SIAM J Applied Math 48: 1073] 참조).
본원에 사용된 바와 같은 용어 “벡터(vector)”는 이에 연결된 다른 핵산을 번식시킬 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 상기 용어는 자가-복제 핵산 구조로서의 벡터 및 이것이 도입된 숙주 세포의 게놈 내로 편입된 벡터를 포함한다. 특정 벡터는 자신이 작동 가능하게 연결된 핵산의 발현을 지시할 수 있다. 이러한 벡터를 본원에서 “발현 벡터(expression vector)”로 지칭한다. 벡터 중에는 레트로바이러스, 예를 들어 감마레트로바이러스 및 렌티바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터가 있다.
용어 “숙주 세포(host cell)”, “숙주 세포주(host cell line)” 및 “숙주 세포 배양물(host cell culture)”은 상호 교환적으로 사용되며, 상기 세포의 자손을 포함하여 외인성 핵산이 도입된 세포를 지칭한다. 숙주 세포는 “형질 전환체(transformants)” 및 “형질 전환된 세포(transformed cells)”를 포함하고, 이는 1차 형질 전환된 세포 및 계대 수(number of passages)에 관계없이 이로부터 유래된 자손을 포함한다. 자손은 핵산 함량에서 모세포와 완전히 동일하지 않을 수 있으나 돌연변이를 함유할 수 있다. 원래 형질 전환된 세포에서 선별되거나 선택된 것과 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 돌연변이체 자손이 본원에 포함된다.
본원에 사용된 바와 같이, 세포 또는 세포의 집단이 특정 표지자에 대해 “양성(positive)”이라는 진술은 특정 표지자, 통상적으로 표면 표지자가 세포 상에 또는 세포 내에 검출 가능하게 존재함을 지칭한다. 표면 표지자를 언급할 때, 상기 용어는 유세포 분석에 의해, 예를 들어, 이 표지자에 특이적으로 결합하는 항체로 염색하고 상기 항체를 검출함으로써 검출된 바와 같은 표면 발현의 존재를 지칭하며, 이 염색은 달리 동일한 조건 하에서 동종형-매칭된 대조군으로 같은 절차를 수행하여 검출된 염색보다 실질적으로 상위 수준에서 및/또는 표지자에 대해 양성인 것으로 공지된 세포에 대한 것과 실질적으로 유사한 수준에서 및/또는 표지자에 대해 음성인 것으로 공지된 세포에 대한 것보다 실질적으로 더 높은 수준에서 유세포 분석에 의해 검출 가능하다.
본원에 사용된 바와 같이, 세포 또는 세포의 집단이 특정 표지자에 대해 “음성(negative)”이라는 진술은 특정 표지자, 통상적으로 표면 표지자가 세포 상에 또는 세포 내에 실질적으로 검출 가능하게 존재하지 않음을 지칭한다. 표면 표지자를 언급할 때, 상기 용어는 유세포 분석에 의해, 예를 들어, 이 표지자에 특이적으로 결합하는 항체로 염색하고 상기 항체를 검출함으로써 검출된 바와 같은 표면 발현의 부재를 지칭하며, 이 염색은 달리 동일한 조건 하에서 동종형-매칭된 대조군으로 같은 절차를 수행하여 검출된 염색보다 실질적으로 상위 수준에서 및/또는 표지자에 대해 양성인 것으로 공지된 세포에 대한 것보다 실질적으로 더 낮은 수준에서 및/또는 표지자에 대해 음성인 것으로 공지된 세포에 대한 것과 비교하여 실질적으로 유사한 수준에서 유세포 분석에 의해 검출되지 않는다.
본원에 사용된 바와 같이, “아미노산 서열 동일성 백분율(percent (%) amino acid sequence identity)” 및 “동일성 백분율(percent identity)”이 아미노산 서열(기준 폴리펩타이드 서열)에 대하여 사용될 때, 서열 동일성의 일부로서 임의의 보존적 치환을 고려하지 않고 최대 백분율의 서열 동일성을 달성하기 위해 서열을 정렬하고 필요하다면 갭을 도입한 후 기준 폴리펩타이드 서열의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열(예를 들어, 대상체 항체 또는 단편) 내 아미노산 잔기의 백분율로 정의된다. 아미노산 서열 동일성 백분율을 결정하기 위한 목적의 정렬은, 일부 구현예에서, BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 Megalign(DNASTAR) 소프트웨어와 같은 공개적으로 이용 가능한 컴퓨터 소프트웨어를 이용하여 다양한 공지된 방법으로 달성될 수 있다. 서열을 정렬하기 위한 적절한 매개변수는 비교되는 서열의 전장에 대한 최대 정렬 달성을 위해 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여 결정될 수 있다.
일부 구현예에서, “작동 가능하게 연결된”은 DNA 서열(예를 들어, 이종 핵산) 및 조절 서열(들)과 같은 성분들의 회합을 포함할 수 있으며, 이는 적절한 분자(예를 들어, 전사 활성제 단백질)가 상기 조절 서열에 결합할 때 유전자 발현이 가능하게 되는 방식으로 이루어진다. 따라서, 기술된 성분이 의도된 방식으로 작용하도록 허용하는 관계에 있음을 의미한다.
아미노산 치환은 폴리펩타이드에서 하나의 아미노산을 다른 아미노산으로 대체하는 것을 포함할 수 있다. 치환은 보존적 아미노산 치환 또는 비보존적 아미노산 치환일 수 있다. 아미노산 치환은 관심 결합 분자(예를 들어, 항체)에 도입될 수 있고, 그 산물은 원하는 활성, 예를 들어 유지/향상된 항원 결합, 감소된 면역원성 또는 개선된 ADCC 또는 CDC에 대해 선별된다.
아미노산은 일반적으로 하기와 같은 공통적인 측쇄(side-chain) 특성에 따라 그룹화될 수 있다:
(1) 소수성: 노르루신(Norleucine), Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) 산성: Asp, Glu;
(4) 염기성: His, Lys, Arg;
(5) 사슬 배향에 영향을 미치는 잔기: Gly, Pro;
(6) 방향족: Trp, Tyr, Phe.
일부 구현예에서, 보존적 치환은 상기 클래스 중 하나의 멤버를 동일한 클래스의 다른 멤버로 교환하는 것을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 비보존적 아미노산 치환은 상기 클래스 중 하나의 멤버를 다른 클래스로 교환하는 것을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 조성물(compostion)은 세포를 포함하여 둘 이상의 산물, 물질 또는 화합물의 임의의 혼합물을 지칭한다. 이는 용액, 현탁액, 액체, 분말, 페이스트, 수성, 비수성 또는 이들의 임의의 조합물일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, “대상체(subject)”는 인간 또는 다른 동물과 같은 포유동물이며, 통상적으로 인간이다.
VIII. 예시적인 구현예
제공된 구현예 중에는 하기가 있다:
1. 변형된 CD247 유전자 자리를 포함하되, 상기 변형된 CD247 유전자 자리는 CD3제타(CD3ζ) 신호 전달 도메인을 포함하는 세포내 영역을 포함하는 키메라 수용체를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포.
2. 구현예 1에 있어서, 상기 핵산 서열은 키메라 수용체의 일부를 암호화하는 전이 유전자 서열을 포함하되, 상기 전이 유전자 서열은, 선택적으로 상동 직접 수선(HDR)을 통해, 내인성 CD247 유전자 자리 내에서 통합을 위해 표적화되는 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포.
3. 구현예 1 또는 구현예 2에 있어서, 상기 CD3ζ 신호 전달 도메인의 전부 또는 단편은 상기 내인성 CD247 유전자 자리의 개방형 해독틀 또는 이의 부분 서열에 의해 암호화되는 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포.
4. 구현예 1 내지 3 중 어느 하나에 있어서, 상기 핵산 서열은 (i) 상기 키메라 수용체의 일부를 암호화하는 전이 유전자 서열과 (ii) 상기 내인성 CD247 유전자 자리의 개방형 해독틀 또는 이의 부분 서열의 틀 내 융합물을 포함하는 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포.
5. 변형된 CD247 유전자 자리를 포함하되, 상기 변형된 CD247 유전자 자리는 CD3ζ 신호 전달 도메인을 포함하는 세포내 영역을 포함하는 키메라 수용체를 암호화하는 핵산 서열을 포함하고, 상기 핵산 서열은 (i) 상기 키메라 수용체의 일부를 암호화하는 전이 유전자 서열과 (ii) 상기 CD3ζ 신호 전달 도메인을 암호화하는 내인성 CD247 유전자 자리의 개방형 해독틀 또는 이의 부분 서열의 틀 내 융합물을 포함하는 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포.
6. 구현예 2, 3 및 5 중 어느 하나에 있어서, 상기 전이 유전자 서열은 상기 내인성 CD247 유전자 자리의 개방형 해독틀 또는 이의 부분 서열의 하나 이상의 엑손과 틀 내에 있는 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포.
7. 구현예 2 내지 6 중 어느 하나에 있어서, 상기 전이 유전자 서열은 3’ UTR을 암호화하는 서열을 포함하지 않는 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포.
8. 구현예 2 내지 7 중 어느 하나에 있어서, 상기 전이 유전자 서열은 인트론을 포함하지 않는 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포.
9. 구현예 2 내지 8 중 어느 하나에 있어서, 상기 전이 유전자 서열은 상기 CD3ζ 신호 전달 도메인의 단편을 암호화하는 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포.
10. 구현예 2 내지 8 중 어느 하나에 있어서, 상기 전이 유전자 서열은 상기 CD3ζ 신호 전달 도메인 또는 이의 단편을 암호화하지 않는 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포.
11. 구현예 3 내지 10 중 어느 하나에 있어서, 상기 개방형 해독틀 또는 이의 부분 서열은 상기 내인성 CD247 유전자 자리의 적어도 하나의 인트론 및 적어도 하나의 엑손을 포함하는 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포.
12. 구현예 3 내지 11 중 어느 하나에 있어서, 상기 개방형 해독틀 또는 이의 부분 서열은 상기 내인성 CD247 유전자 자리의 3’ UTR을 암호화하는 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포.
13. 구현예 2 내지 12 중 어느 하나에 있어서, 상기 전이 유전자 서열은 상기 내인성 CD247 유전자 자리의 상기 개방형 해독틀의 엑손 1의 하단부 및 엑손 8의 상단부에 있는 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포.
14. 구현예 2 내지 13 중 어느 하나에 있어서, 상기 전이 유전자 서열은 상기 내인성 CD247 유전자 자리의 상기 개방형 해독틀의 엑손 1의 하단부 및 엑손 3의 상단부에 있는 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포.
15. 구현예 3 내지 14 중 어느 하나에 있어서, 상기 암호화된 키메라 수용체의 상기 CD3ζ 신호 전달 도메인의 적어도 단편, 선택적으로 전체 CD3ζ 신호 전달 도메인은 상기 내인성 CD247 유전자 자리의 개방형 해독틀 또는 이의 부분 서열에 의해 암호화되는 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포.
16. 구현예 1 내지 15 중 어느 하나에 있어서, 상기 CD3ζ 신호 전달 도메인은 상기 내인성 CD247 유전자 자리의 상기 개방형 해독틀의 적어도 엑손 2의 일부 및 엑손 3-8을 포함하는 뉴클레오타이드의 서열에 의해 암호화되는 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포.
17. 구현예 1 내지 16 중 어느 하나에 있어서, 상기 CD3ζ 신호 전달 도메인은, 상기 내인성 CD247 유전자 자리의 상기 개방형 해독틀의 엑손 1을 포함하지 않고/거나, 엑손 1의 전장을 포함하지 않고/거나 엑손 2의 전장을 포함하지 않는 뉴클레오타이드의 서열에 의해 암호화되는 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포.
18. 구현예 1 내지 17 중 어느 하나에 있어서, 상기 암호화된 키메라 수용체는 상기 CD3ζ 신호 전달 도메인을 통해 신호 전달을 할 수 있는 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포.
19. 구현예 1 내지 18 중 어느 하나에 있어서, 상기 암호화된 CD3ζ 신호 전달 도메인은 서열 번호: 13-15 중 어느 하나에서 선택된 서열, 또는 서열 번호: 13-15 중 어느 하나에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 동일성을 나타내는 서열, 또는 이의 단편을 포함하는 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포.
20. 구현예 1 내지 19 중 어느 하나에 있어서, 상기 키메라 수용체는 기능성 비-T 세포 수용체(비-TCR) 항원 수용체이거나 이를 포함하는 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포.
21. 구현예 1 내지 20 중 어느 하나에 있어서, 상기 키메라 수용체는 키메라 항원 수용체(CAR)인 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포.
22. 구현예 1 내지 21 중 어느 하나에 있어서, 상기 키메라 수용체는 세포외 영역 및/또는 막관통 도메인을 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포.
23. 구현예 2 내지 22 중 어느 하나에 있어서, 상기 전이 유전자 서열은 상기 키메라 수용체의 하나 이상의 영역을 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열을 포함하고, 선택적으로 상기 전이 유전자 서열은 세포외 영역, 막관통 도메인 및/또는 상기 세포내 영역의 일부 중 하나 이상을 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포.
24. 구현예 23에 있어서, 상기 세포외 영역은 결합 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포.
25. 구현예 24에 있어서, 상기 결합 도메인은 항체 또는 이의 항원 결합 단편이거나 이를 포함하는 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포.
26. 구현예 24 또는 구현예 25에 있어서, 상기 결합 도메인은 질병, 장애 또는 병태의 세포 또는 조직과 관련된, 이에 특이적인 및/또는 이에서 발현되는 표적 항원에 결합할 수 있는 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포.
27. 구현예 26에 있어서, 상기 표적 항원은 종양 항원인 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포.
28. 구현예 26 또는 구현예 27에 있어서, 상기 표적 항원은 αvβ6 인테그린(avb6 integrin), B 세포 성숙 항원(BCMA), B7-H3, B7-H6, 탄산 탈수 효소 9(CA9; CAIX 또는 G250으로도 공지), 암 고환 항원, 암/고환 항원 1B(CTAG; NY-ESO-1 및 LAGE-2로도 공지), 암배아 항원(CEA), 사이클린, 사이클린 A2, C-C 모티프 케모카인 리간드 1(CCL-1), CD19, CD20, CD22, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD123, CD133, CD138, CD171, 콘드로이틴 황산 프로테오글리칸 4(chondroitin sulfate proteoglycan 4, CSPG4), 표피 성장 인자 단백질(EGFR), 타입 III 표피 성장 인자 수용체 돌연변이(EGFR vIII), 상피 당단백질 2(EPG-2), 상피 당단백질 40(EPG-40), 에프린B2, 에프린 수용체 A2(EPHa2), 에스트로겐 수용체, Fc 수용체 유사 5(FCRL5; Fc 수용체 동족체 5 또는 FCRH5로도 공지), 태아 아세틸콜린 수용체(태아 AchR), 엽산 결합 단백질(FBP), 엽산 수용체 알파, 강글리오사이드 GD2, O-아세틸화 GD2(OGD2), 강글리오사이드 GD3, 당단백질 100(gp100), 글리피칸-3(GPC3), G 단백질 결합 수용체 C 클래스 5 그룹 D 멤버(GPRC5D), Her2/neu(수용체 티로신 키나아제 erb-B2), Her3(erb-B3), Her4(erb-B4), erbB 이량체, 인간 고분자량 흑색종 관련 항원(HMW-MAA), B형 간염 표면 항원, 인간 백혈구 항원 A1(HLA-A1), 인간 백혈구 항원 A2(HLA-A2), IL-22 수용체 알파(IL-22Rα), IL-13 수용체 알파 2(IL-13Rα2), 키나아제 삽입 도메인 수용체(kinase insert domain receptor, kdr), 카파 경쇄, L1 세포 부착 분자(L1-CAM), L1-CAM의 CE7 에피토프, 8족 A 멤버를 함유하는 류신 풍부 반복(Leucine Rich Repeat Containing 8 Family Member A, LRRC8A), 루이스 Y, 흑색종 관련 항원(MAGE)-A1, MAGE-A3, MAGE-A6, MAGE-A10, 메소텔린(MSLN), c-Met, 뮤린 시토메갈로 바이러스(CMV), 뮤신 1(MUC1), MUC16, 자연 살생 2 그룹 D 멤버(NKG2D) 리간드, 멜란 A(MART-1), 신경 세포 부착 분자(NCAM), 종양태아성 항원, 흑색종 우선 발현 항원(PRAME), 프로게스테론 수용체, 전립선 특이적 항원, 전립선 줄기 세포 항원(PSCA), 전립선 특이적 막 항원(PSMA), 수용체 티로신 키나아제 유사 희귀 수용체 1(ROR1), 서바이빈(survivin), 영양막 당단백질(TPBG, 5T4로도 공지), 종양 관련 당단백질 72(TAG72), 티로시나아제 관련 단백질 1(TRP1; TYRP1 또는 gp75로도 공지), 티로시나아제 관련 단백질 2(TRP2; 도파크롬 타우토메라제, 도파크롬 델타 이성화 효소 또는 DCT로도 공지), 혈관 내피 성장 인자 수용체(VEGFR), 혈관 내피 성장 인자 수용체 2(VEGFR2), 빌름스 종양 1(WT-1), 병원체 특이적 또는 병원체 발현 항원, 또는 보편적 표지(universal tag) 관련 항원, 및/또는 비오틴화 분자 및/또는 HIV, HCV, HBV 또는 다른 병원체에 의해 발현된 분자 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포.
29. 구현예 22 내지 27 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포외 영역은 스페이서를 포함하고, 선택적으로 상기 스페이서는 상기 결합 도메인 및 상기 막관통 도메인 사이에 작동 가능하게 연결되는 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포.
30. 구현예 29에 있어서, 상기 스페이서는 면역글로불린 힌지 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포.
31. 구현예 29 또는 구현예 30에 있어서, 상기 스페이서는 CH2 영역 및 CH3 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포.
32. 구현예 23 내지 31 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포내 영역의 일부는 하나 이상의 공자극 신호 전달 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포.
33. 구현예 32에 있어서, 상기 하나 이상의 공자극 신호 전달 도메인은 CD28, 4-1BB 또는 ICOS 또는 이들의 신호 전달 부분의 세포내 신호 전달 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포.
34. 구현예 32 또는 구현예 33에 있어서, 상기 하나 이상의 공자극 신호 전달 도메인은 4-1BB의 세포내 신호 전달 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포.
35. 구현예 24 내지 34 중 어느 하나에 있어서, 상기 변형된 CD247 유전자 자리는 N 말단에서 C 말단까지 상기 세포외 결합 도메인, 상기 스페이서, 상기 막관통 도메인 및 세포내 신호 전달 영역을 순서대로 포함하는 키메라 수용체를 암호화하는 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포.
36. 구현예 1 내지 35 중 어느 하나에 있어서,
상기 전이 유전자 서열은 순서대로: 세포외 결합 도메인, 선택적으로 scFv; 선택적으로 인간 면역글로불린 힌지의, 선택적으로 IgG1, IgG2 또는 IgG4 또는 이의 변형된 버전의 서열을 포함하고, 선택적으로 CH2 영역 및/또는 CH3 영역을 더 포함하는, 스페이서; 선택적으로 인간 CD28의, 막관통 도메인; 선택적으로 인간 4-1BB의, 공자극 신호 전달 도메인;을 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열을 포함하고/거나;
상기 변형된 CD247 유전자 자리는 순서대로: 세포외 결합 도메인, 선택적으로 scFv; 선택적으로 인간 면역글로불린 힌지의, 선택적으로 IgG1, IgG2 또는 IgG4 또는 이의 변형된 버전의 서열을 포함하고, 선택적으로 CH2 영역 및/또는 CH3 영역을 더 포함하는, 스페이서; 선택적으로 인간 CD28의, 막관통 도메인; 선택적으로 인간 4-1BB의, 공자극 신호 전달 도메인; 및 상기 CD3ζ 신호 전달 도메인;을 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포.
37. 구현예 21 내지 36 중 어느 하나에 있어서, 상기 CAR은 다중 사슬 CAR인 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포.
38. 구현예 2 내지 37 중 어느 하나에 있어서, 상기 전이 유전자 서열은 적어도 하나의 추가 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포.
39. 구현예 2 내지 38 중 어느 하나에 있어서, 상기 전이 유전자 서열은 하나 이상의 다중 시스트론 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포.
40. 구현예 39에 있어서, 상기 다중 시스트론 요소(들)는 상기 키메라 수용체의 일부를 암호화하는 상기 뉴클레오타이드의 서열과 상기 적어도 하나의 추가 단백질을 암호화하는 상기 뉴클레오타이드의 서열 사이에 위치하는 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포.
41. 구현예 38 내지 40 중 어느 하나에 있어서, 상기 적어도 하나의 추가 단백질은 대리 표지자이고, 선택적으로 상기 대리 표지자는 절단형 수용체이고, 선택적으로 상기 절단형 수용체는 세포내 신호 전달 도메인이 결여되어 있고/있거나 그의 리간드에 의해 결합될 때 세포내 신호 전달을 매개할 수 없는 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포.
42. 구현예 39에 있어서, 상기 키메라 수용체는 다중 사슬 CAR이고, 다중 시스트론 요소가 상기 다중 사슬 CAR의 한 사슬을 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열과 상기 다중 사슬 CAR의 다른 한 사슬을 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열 사이에 위치하는 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포.
43. 구현예 39 내지 42 중 어느 하나에 있어서, 상기 하나 이상의 다중 시스트론 요소는 상기 키메라 수용체의 일부를 암호화하는 상기 뉴클레오타이드의 서열의 상단부에 있는 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포.
44. 구현예 39 내지 43 중 어느 하나에 있어서, 상기 하나 이상의 다중 시스트론 요소는 리보솜 스킵 서열이거나 이를 포함하고, 선택적으로 상기 리보솜 스킵 서열은 T2A, P2A, E2A 또는 F2A 요소인 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포.
45. 구현예 1 내지 44 중 어느 하나에 있어서, 상기 변형된 CD247 유전자 자리는 상기 키메라 수용체를 암호화하는 핵산 서열의 발현을 제어하도록 작동 가능하게 연결된 상기 내인성 CD247 유전자 자리의 프로모터 및/또는 조절 또는 제어 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포.
46. 구현예 1 내지 45 중 어느 하나에 있어서, 상기 변형된 유전자 자리는 상기 키메라 수용체를 암호화하는 상기 핵산 서열의 발현을 제어하도록 작동 가능하게 연결된 하나 이상의 이종성 조절 또는 제어 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포.
47. 구현예 46에 있어서, 상기 하나 이상의 이종성 조절 또는 제어 요소는 프로모터, 인핸서, 인트론, 폴리아데닐화 신호, 코작(Kozak) 공통 서열, 스플라이스 수용체 서열 및/또는 스플라이스 공여체 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포.
48. 구현예 47에 있어서, 상기 이종성 프로모터는 인간 신장 인자 1 알파(EF1α) 프로모터 또는 MND 프로모터 또는 이들의 변이체이거나 이를 포함하는 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포.
49. 구현예 1 내지 48 중 어느 하나에 있어서, 상기 T 세포는 대상체로부터 수득된 1차 T 세포이고, 선택적으로 상기 대상체는 인간인 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포.
50. 구현예 1 내지 49 중 어느 하나에 있어서, 상기 T 세포는 CD8+ T 세포 또는 이의 아형인 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포.
51. 구현예 1 내지 49 중 어느 하나에 있어서, 상기 T 세포는 CD4+ T 세포 또는 이의 아형인 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포.
52. 구현예 1 내지 51 중 어느 하나에 있어서, 상기 T 세포는 다분화능 또는 다능성 세포로부터 유래되고, 상기 다분화능 또는 다능성 세포는 선택적으로 iPSC인 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포.
53. 폴리뉴클레오타이드로서, (a) 키메라 수용체 또는 이의 일부를 암호화하는 핵산 서열; 및 (b) 상기 핵산 서열에 연결된 하나 이상의 상동성 암 - 상기 하나 이상의 상동성 암은 CD247 유전자 자리의 개방형 해독틀 또는 이의 부분 서열의 하나 이상의 영역에 대해 상동성인 서열을 포함함 - 을 포함하는 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오타이드.
54. 구현예 53에 있어서, 상기 키메라 수용체는 세포내 영역을 포함하고 상기 (a)의 핵산 서열은 상기 키메라 수용체의 일부를 암호화하는 핵산 서열이고, 상기 일부는 상기 키메라 수용체의 전(full) 세포내 영역을 포함하지 않는 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오타이드.
55. 폴리뉴클레오타이드로서, (a) 키메라 수용체의 일부를 암호화하는 핵산 서열 - 상기 키메라 수용체는 세포내 영역을 포함하고, 상기 키메라 수용체의 일부는 상기 키메라 수용체의 전(full) 세포내 영역 미만을 포함함 -; 및 (b) 상기 핵산 서열에 연결된 하나 이상의 상동성 암 - 상기 하나 이상의 상동성 암은 CD247 유전자 자리의 개방형 해독틀 또는 이의 부분 서열의 하나 이상의 영역에 대해 상동성인 서열을 포함함 - 을 포함하는 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오타이드.
56. 구현예 54 또는 구현예 55에 있어서, 상기 키메라 수용체의 전(full) 세포내 영역은 CD3제타(CD3ζ) 신호 전달 도메인 또는 이의 단편을 포함하고, 상기 세포내 영역의 적어도 일부는, 상기 키메라 수용체가 상기 폴리뉴클레오타이드가 도입된 세포로부터 발현될 때, 상기 내인성 CD247 유전자 자리의 상기 개방형 해독틀 또는 이의 부분 서열에 의해 암호화되는 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오타이드.
57. 구현예 53 내지 56 중 어느 하나에 있어서, 상기 키메라 수용체의 일부를 암호화하는 핵산 서열 및 상기 하나 이상의 상동성 암은 상기 키메라 수용체의 세포내 영역을 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열의 적어도 단편을 함께 포함하고, 상기 세포내 영역의 적어도 일부는, 상기 키메라 수용체가 상기 폴리뉴클레오타이드가 도입된 세포로부터 발현될 때, 상기 CD247 유전자 자리의 상기 개방형 해독틀 또는 이의 부분 서열에 의해 암호화되는 상기 CD3ζ 신호 전달 도메인 또는 이의 단편을 포함하는 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오타이드.
58. 구현예 53 내지 57 중 어느 하나에 있어서, 상기 (a)의 핵산 서열은 3’ UTR을 암호화하는 서열을 포함하지 않는 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오타이드.
59. 구현예 53 내지 58 중 어느 하나에 있어서, 상기 (a)의 핵산 서열은 인트론을 포함하지 않는 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오타이드.
60. 구현예 53 내지 59 중 어느 하나에 있어서, 상기 (a)의 핵산 서열은, 상기 키메라 수용체가 상기 폴리뉴클레오타이드가 도입된 세포로부터 발현될 때, 상기 CD3ζ 신호 전달 도메인의 단편을 암호화하는 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오타이드.
61. 구현예 53 내지 59 중 어느 하나에 있어서, 상기 (a)의 핵산 서열은, 상기 키메라 수용체가 상기 폴리뉴클레오타이드가 도입된 세포로부터 발현될 때, 상기 CD3ζ 신호 전달 도메인 또는 이의 단편을 암호화하지 않는 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오타이드.
62. 구현예 53 내지 61 중 어느 하나에 있어서, 상기 개방형 해독틀 또는 이의 부분 서열은 상기 내인성 CD247 유전자 자리의 적어도 하나의 인트론 및 적어도 하나의 엑손을 포함하는 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오타이드.
63. 구현예 53 내지 62 중 어느 하나에 있어서, 상기 개방형 해독틀 또는 이의 부분 서열은 상기 내인성 CD247 유전자 자리의 3’ UTR을 암호화하는 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오타이드.
64. 구현예 53 내지 63 중 어느 하나에 있어서, 상기 암호화된 키메라 수용체의 상기 CD3ζ 신호 전달 도메인의 적어도 단편, 선택적으로 전체 CD3ζ 신호 전달 도메인은, 상기 키메라 수용체가 상기 폴리뉴클레오타이드가 도입된 세포로부터 발현될 때, 상기 내인성 CD247 유전자 자리의 상기 개방형 해독틀 또는 이의 부분 서열에 의해 암호화되는 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오타이드.
65. 구현예 53 내지 64 중 어느 하나에 있어서, 상기 (a)의 핵산 서열은 T 세포, 선택적으로 인간 T 세포의 내인성 게놈 CD247 유전자 자리의 개방형 해독틀에 외인성이거나 이종성인 서열인 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오타이드.
66. 구현예 53 내지 65 중 어느 하나에 있어서, 상기 (a)의 핵산 서열은 상기 하나 이상의 상동성 암에 포함된 상기 CD247 유전자 자리의 개방형 해독틀 또는 이의 부분 서열의 하나 이상의 엑손과 틀 내에 있는 뉴클레오타이드의 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오타이드.
67. 구현예 53 내지 66 중 어느 하나에 있어서, 상기 개방형 해독틀의 하나 이상의 영역은 상기 CD247 유전자 자리의 상기 개방형 해독틀의 엑손 8의 상단부에 있는 서열이거나 이를 포함하는 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오타이드.
68. 구현예 53 내지 67 중 어느 하나에 있어서, 상기 개방형 해독틀의 상기 하나 이상의 영역은 상기 CD247 유전자 자리의 상기 개방형 해독틀의 엑손 3의 상단부에 있는 서열, 선택적으로 상기 CD247 유전자 자리의 상기 개방형 해독틀의 엑손 3을 포함하는 서열이거나 이를 포함하는 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오타이드.
69. 구현예 53 내지 68 중 어느 하나에 있어서, 상기 개방형 해독틀의 상기 하나 이상의 영역은 상기 CD247 유전자 자리의 상기 개방형 해독틀의 엑손 2의 적어도 일부를 포함하는 서열이거나 이를 포함하는 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오타이드.
70. 구현예 53 내지 69 중 어느 하나에 있어서, 상기 하나 이상의 상동성 암은, 상기 내인성 CD247 유전자 자리의 상기 개방형 해독틀의 엑손 1을 포함하지 않고/거나, 엑손 1의 전장을 포함하지 않고/거나 엑손 2의 전장을 포함하지 않는 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오타이드.
71. 구현예 53 내지 70 중 어느 하나에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드가 도입된 세포에 의해 발현될 때, 상기 키메라 수용체는 상기 CD3ζ 신호 전달 도메인을 통해 신호 전달을 할 수 있는 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오타이드.
72. 구현예 53 내지 71 중 어느 하나에 있어서, 상기 CD3ζ 신호 전달 도메인은 서열 번호: 13-15 중 어느 하나에서 선택된 서열, 또는 서열 번호: 13-15 중 어느 하나에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 동일성을 나타내는 서열, 또는 이의 단편을 포함하는 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오타이드.
73. 구현예 53 내지 72 중 어느 하나에 있어서, 상기 하나 이상의 상동성 암은 5’ 상동성 암 및 3’ 상동성 암을 포함하는 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오타이드.
74. 구현예 53 내지 73 중 어느 하나에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 [5’ 상동성 암]-[(a)의 핵산 서열]-[3’ 상동성 암] 구조를 포함하는 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오타이드.
75. 구현예 73 또는 구현예 74에 있어서, 상기 5’ 상동성 암 및 상기 3’ 상동성암은 독립적으로 (약) 50 내지 (약) 2000개 뉴클레오타이드, (약) 100 내지 (약) 1000개 뉴클레오타이드, (약) 100 내지 (약) 750개 뉴클레오타이드, (약) 100 내지 (약) 600개 뉴클레오타이드, (약) 100 내지 (약) 400개 뉴클레오타이드, (약) 100 내지 (약) 300개 뉴클레오타이드, (약) 100 내지 (약) 200개 뉴클레오타이드, (약) 200 내지 (약) 1000개 뉴클레오타이드, (약) 200 내지 (약) 750개 뉴클레오타이드, (약) 200 내지 (약) 600개 뉴클레오타이드, (약) 200 내지 (약) 400개 뉴클레오타이드, (약) 200 내지 (약) 300개 뉴클레오타이드, (약) 300 내지 (약) 1000개 뉴클레오타이드, (약) 300 내지 (약) 750개 뉴클레오타이드, (약) 300 내지 (약) 600개 뉴클레오타이드, (약) 300 내지 (약) 400개 뉴클레오타이드, (약) 400 내지 (약) 1000개 뉴클레오타이드, (약) 400 내지 (약) 750개 뉴클레오타이드, (약) 400 내지 (약) 600개 뉴클레오타이드, (약) 600 내지 (약) 1000개 뉴클레오타이드, (약) 600 내지 (약) 750개 뉴클레오타이드 또는 (약) 750 내지 (약) 1000개 뉴클레오타이드 길이인 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오타이드.
76. 구현예 73 내지 75 중 어느 하나에 있어서, 상기 5’ 상동성 암 및 상기 3’ 상동성 암은 독립적으로 (약) 200, 300, 400, 500, 600, 700 또는 800개 뉴클레오타이드 길이이거나, 또는 전술한 임의의 수치 사이의 임의의 수치 길이인 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오타이드.
77. 구현예 73 내지 76 중 어느 하나에 있어서, 상기 5’ 상동성 암 및 상기 3’ 상동성 암은 독립적으로 (약) 300개 뉴클레오타이드 길이를 초과하고, 선택적으로 상기 5’ 상동성 암 및 상기 3’ 상동성 암은 독립적으로 (약) 400, 500 또는 600개 뉴클레오타이드 길이이거나 또는 전술한 임의의 수치 사이의 임의의 수치 길이인 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오타이드.
78. 구현예 53 내지 77 중 어느 하나에 있어서, 상기 5’ 상동성 암은 서열 번호: 80에 제시된 서열 또는 서열 번호: 80에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 동일성을 나타내는 서열 또는 이의 부분 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오타이드.
79. 구현예 53 내지 78 중 어느 하나에 있어서, 상기 3’ 상동성 암은 서열 번호: 81에 제시된 서열 또는 서열 번호: 81에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 동일성을 나타내는 서열 또는 이의 부분 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오타이드.
80. 구현예 53 내지 79 중 어느 하나에 있어서, 상기 키메라 수용체는 기능성 비-T 세포 수용체(비-TCR) 항원 수용체이거나 이를 포함하는 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오타이드.
81. 구현예 53 내지 80 중 어느 하나에 있어서, 상기 키메라 수용체는 키메라 항원 수용체(CAR)인 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오타이드.
82. 구현예 53 내지 81 중 어느 하나에 있어서, 상기 (a)의 핵산 서열은 세포외 영역을 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열 및 막관통 도메인 및/또는 상기 세포내 영역의 일부를 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오타이드.
83. 구현예 82에 있어서, 상기 세포외 영역은 결합 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오타이드.
84. 구현예 83에 있어서, 상기 결합 도메인은 항체 또는 이의 항원 결합 단편이거나 이를 포함하는 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오타이드.
85. 구현예 83 또는 구현예 84에 있어서, 상기 결합 도메인은 질병, 장애 또는 병태의 세포 또는 조직과 관련된, 이에 특이적인 및/또는 이에서 발현되는 표적 항원에 결합할 수 있는 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오타이드.
86. 구현예 85에 있어서, 상기 표적 항원은 종양 항원인 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오타이드.
87. 구현예 85 또는 구현예 86에 있어서, 상기 표적 항원은 αvβ6 인테그린(avb6 integrin), B 세포 성숙 항원(BCMA), B7-H3, B7-H6, 탄산 탈수 효소 9(CA9; CAIX 또는 G250으로도 공지), 암 고환 항원, 암/고환 항원 1B(CTAG; NY-ESO-1 및 LAGE-2로도 공지), 암배아 항원(CEA), 사이클린, 사이클린 A2, C-C 모티프 케모카인 리간드 1(CCL-1), CD19, CD20, CD22, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD123, CD133, CD138, CD171, 콘드로이틴 황산 프로테오글리칸 4(chondroitin sulfate proteoglycan 4, CSPG4), 표피 성장 인자 단백질(EGFR), 타입 III 표피 성장 인자 수용체 돌연변이(EGFR vIII), 상피 당단백질 2(EPG-2), 상피 당단백질 40(EPG-40), 에프린B2, 에프린 수용체 A2(EPHa2), 에스트로겐 수용체, Fc 수용체 유사 5(FCRL5; Fc 수용체 동족체 5 또는 FCRH5로도 공지), 태아 아세틸콜린 수용체(태아 AchR), 엽산 결합 단백질(FBP), 엽산 수용체 알파, 강글리오사이드 GD2, O-아세틸화 GD2(OGD2), 강글리오사이드 GD3, 당단백질 100(gp100), 글리피칸-3(GPC3), G 단백질 결합 수용체 C 클래스 5 그룹 D 멤버(GPRC5D), Her2/neu(수용체 티로신 키나아제 erb-B2), Her3(erb-B3), Her4(erb-B4), erbB 이량체, 인간 고분자량 흑색종 관련 항원(HMW-MAA), B형 간염 표면 항원, 인간 백혈구 항원 A1(HLA-A1), 인간 백혈구 항원 A2(HLA-A2), IL-22 수용체 알파(IL-22Rα), IL-13 수용체 알파 2(IL-13Rα2), 키나아제 삽입 도메인 수용체(kinase insert domain receptor, kdr), 카파 경쇄, L1 세포 부착 분자(L1-CAM), L1-CAM의 CE7 에피토프, 8족 A 멤버를 함유하는 류신 풍부 반복(Leucine Rich Repeat Containing 8 Family Member A, LRRC8A), 루이스 Y, 흑색종 관련 항원(MAGE)-A1, MAGE-A3, MAGE-A6, MAGE-A10, 메소텔린(MSLN), c-Met, 뮤린 시토메갈로 바이러스(CMV), 뮤신 1(MUC1), MUC16, 자연 살생 2 그룹 D 멤버(NKG2D) 리간드, 멜란 A(MART-1), 신경 세포 부착 분자(NCAM), 종양태아성 항원, 흑색종 우선 발현 항원(PRAME), 프로게스테론 수용체, 전립선 특이적 항원, 전립선 줄기 세포 항원(PSCA), 전립선 특이적 막 항원(PSMA), 수용체 티로신 키나아제 유사 희귀 수용체 1(ROR1), 서바이빈(survivin), 영양막 당단백질(TPBG, 5T4로도 공지), 종양 관련 당단백질 72(TAG72), 티로시나아제 관련 단백질 1(TRP1; TYRP1 또는 gp75로도 공지), 티로시나아제 관련 단백질 2(TRP2; 도파크롬 타우토메라제, 도파크롬 델타 이성화 효소 또는 DCT로도 공지), 혈관 내피 성장 인자 수용체(VEGFR), 혈관 내피 성장 인자 수용체 2(VEGFR2), 빌름스 종양 1(WT-1), 병원체 특이적 또는 병원체 발현 항원, 또는 보편적 표지(universal tag) 관련 항원, 및/또는 비오틴화 분자 및/또는 HIV, HCV, HBV 또는 다른 병원체에 의해 발현된 분자 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오타이드.
88. 구현예 82 내지 87 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포외 영역은 스페이서를 포함하고, 선택적으로 상기 스페이서는 상기 결합 도메인 및 상기 막관통 도메인 사이에 작동 가능하게 연결되는 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오타이드.
89. 구현예 88에 있어서, 상기 스페이서는 면역글로불린 힌지 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오타이드.
90. 구현예 88 또는 구현예 89에 있어서, 상기 스페이서는 CH2 영역 및 CH3 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오타이드.
91. 구현예 82 내지 90 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포내 영역의 일부는 하나 이상의 공자극 신호 전달 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오타이드.
92. 구현예 91에 있어서, 상기 하나 이상의 공자극 신호 전달 도메인은 CD28, 4-1BB 또는 ICOS 또는 이들의 신호 전달 부분의 세포내 신호 전달 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오타이드.
93. 구현예 91 또는 구현예 92에 있어서, 상기 하나 이상의 공자극 신호 전달 도메인은 4-1BB의 세포내 신호 전달 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오타이드.
94. 구현예 82 내지 93 중 어느 하나에 있어서, 상기 암호화된 키메라 수용체는, 상기 키메라 수용체가 상기 폴리뉴클레오타이드가 도입된 세포로부터 발현될 때, N 말단에서 C 말단까지 상기 세포외 결합 도메인, 상기 스페이서, 상기 막관통 도메인 및 세포내 신호 전달 영역을 순서대로 포함하는 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오타이드.
95. 구현예 53 내지 94 중 어느 하나에 있어서,
상기 (a)의 핵산 서열은 순서대로: 세포외 결합 도메인, 선택적으로 scFv; 선택적으로 인간 면역글로불린 힌지의, 선택적으로 IgG1, IgG2 또는 IgG4 또는 이의 변형된 버전의 서열을 포함하고, 선택적으로 CH2 영역 및/또는 CH3 영역을 더 포함하는, 스페이서; 선택적으로 인간 CD28의, 막관통 도메인; 선택적으로 인간 4-1BB의, 공자극 신호 전달 도메인;을 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열을 포함하고/거나;
상기 변형된 CD247 유전자 자리는 순서대로: 세포외 결합 도메인, 선택적으로 scFv; 선택적으로 인간 면역글로불린 힌지의, 선택적으로 IgG1, IgG2 또는 IgG4 또는 이의 변형된 버전의 서열을 포함하고, 선택적으로 CH2 영역 및/또는 CH3 영역을 더 포함하는, 스페이서; 선택적으로 인간 CD28의, 막관통 도메인; 선택적으로 인간 4-1BB의, 공자극 신호 전달 도메인; 및 상기 CD3ζ 신호 전달 도메인;을 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오타이드.
96. 구현예 81 내지 95 중 어느 하나에 있어서, 상기 CAR은 다중 사슬 CAR인 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오타이드.
97. 구현예 53 내지 96 중 어느 하나에 있어서, 상기 (a)의 핵산 서열은 적어도 하나의 추가 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오타이드.
98. 구현예 53 내지 97 중 어느 하나에 있어서, 상기 (a)의 핵산 서열은 하나 이상의 다중 시스트론 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오타이드.
99. 구현예 98에 있어서, 상기 다중 시스트론 요소(들)는 상기 키메라 수용체의 일부를 암호화하는 상기 뉴클레오타이드의 서열과 상기 적어도 하나의 추가 단백질을 암호화하는 상기 뉴클레오타이드의 서열 사이에 위치하는 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오타이드.
100. 구현예 97 내지 99 중 어느 하나에 있어서, 상기 적어도 하나의 추가 단백질은 대리 표지자이고, 선택적으로 상기 대리 표지자는 절단형 수용체이고, 선택적으로 상기 절단형 수용체는 세포내 신호 전달 도메인이 결여되어 있고/있거나 그의 리간드에 의해 결합될 때 세포내 신호 전달을 매개할 수 없는 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오타이드.
101. 구현예 100에 있어서, 상기 키메라 수용체는 다중 사슬 CAR이고, 다중 시스트론 요소는 상기 다중 사슬 CAR의 한 사슬을 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열과 상기 다중 사슬 CAR의 다른 한 사슬을 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열 사이에 위치하는 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오타이드.
102. 구현예 98 내지 101 중 어느 하나에 있어서, 상기 하나 이상의 다중 시스트론 요소는 상기 키메라 수용체의 일부를 암호화하는 상기 뉴클레오타이드의 서열의 상단부에 있는 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오타이드.
103. 구현예 98 내지 102 중 어느 하나에 있어서, 상기 하나 이상의 다중 시스트론 요소는 리보솜 스킵 서열이거나 이를 포함하고, 선택적으로 상기 리보솜 스킵 서열은 T2A, P2A, E2A 또는 F2A 요소인 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오타이드.
104. 구현예 53 내지 103 중 어느 하나에 있어서, 상기 변형된 CD247 유전자 자리는 상기 키메라 수용체를 암호화하는 상기 핵산 서열의 발현을 제어하도록 작동 가능하게 연결된 상기 내인성 CD247 유전자 자리의 프로모터 및/또는 조절 또는 제어 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오타이드.
105. 구현예 53 내지 104 중 어느 하나에 있어서, 상기 변형된 유전자 자리는 상기 키메라 수용체를 암호화하는 상기 핵산 서열의 발현을 제어하도록 작동 가능하게 연결된 하나 이상의 이종성 조절 또는 제어 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오타이드.
106. 구현예 105에 있어서, 상기 하나 이상의 이종성 조절 또는 제어 요소는 프로모터, 인핸서, 인트론, 폴리아데닐화 신호, 코작(Kozak) 공통 서열, 스플라이스 수용체 서열 및/또는 스플라이스 공여체 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오타이드.
107. 구현예 106에 있어서, 상기 이종성 프로모터는 인간 신장 인자 1 알파(EF1α) 프로모터 또는 MND 프로모터 또는 이들의 변이체이거나 이를 포함하는 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오타이드.
108. 구현예 53 내지 107 중 어느 하나에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 바이러스 벡터에 포함된 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오타이드.
109. 구현예 108에 있어서, 상기 바이러스 벡터는 AAV 벡터인 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오타이드.
110. 구현예 109에 있어서, 상기 AAV 벡터는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7 또는 AAV8 벡터 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오타이드.
111. 구현예 109 또는 구현예 110에 있어서, 상기 AAV 벡터는 AAV2 또는 AAV6 벡터인 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오타이드.
112. 구현예 108에 있어서, 상기 바이러스 벡터는 레트로바이러스 벡터, 선택적으로 렌티바이러스 벡터인 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오타이드.
113. 구현예 53 내지 112 중 어느 하나에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 선형 폴리뉴클레오타이드, 선택적으로 이중 가닥 폴리뉴클레오타이드 또는 단일 가닥 폴리뉴클레오타이드인, 폴리뉴클레오타이드.
114. 구현예 52 내지 113 중 어느 하나에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 적어도 (약) 2500, 2750, 3000, 3250, 3500, 3750, 4000, 4250, 4500, 4760, 5000, 5250, 5500, 5750, 6000, 7000, 7500, 8000, 9000 또는 10000개 뉴클레오타이드 길이이거나, 또는 전술한 임의의 수치 사이의 임의의 수치 길이인 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오타이드.
115. 구현예 52 내지 114 중 어느 하나에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 (약) 2500 내지 (약) 5000개 뉴클레오타이드, (약) 3500 내지 (약) 4500개 뉴클레오타이드 또는 (약) 3750개 뉴클레오타이드 내지 (약) 4250개 뉴클레오타이드 길이인 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오타이드.　
116. 유전자 조작된 T 세포를 생산하는 방법에 있어서, 상기 방법은 구현예 53 내지 115 중 어느 하나의 폴리뉴클레오타이드를 CD247 유전자 자리에 유전자 파괴를 포함하는 T 세포 내로 도입하는 단계를 포함하는, 유전자 조작된 T 세포를 생산하는 방법.
117. 유전자 조작된 T 세포를 생산하는 방법에 있어서, 상기 방법은: (a) T 세포 내로, 상기 T 세포의 내인성 CD247 유전자 자리 내의 표적 부위에 유전자 파괴를 유도할 수 있는 하나 이상의 제제를 도입하는 단계; 및 (b) 구현예 53 내지 115 중 어느 하나의 폴리뉴클레오타이드를 CD247 유전자 자리에 유전자 파괴를 포함하는 T 세포 내로 도입하는 단계를 포함하되, 상기 방법은 변형된 CD247 유전자 자리를 생산하고, 상기 변형된 CD247 유전자 자리는 CD3ζ 신호 전달 도메인을 포함하는 세포내 영역을 포함하는 상기 키메라 수용체를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포를 생산하는 방법.
118. 구현예 117에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 키메라 수용체 또는 이의 일부를 암호화하는 핵산 서열을 포함하고, 키메라 수용체 또는 이의 일부를 암호화하는 상기 핵산 서열은 상동 직접 수선(HDR)을 통해 상기 내인성 CD247 유전자 자리 내에서 통합되는 것을 특징으로 하는, 방법.
119. 유전자 조작된 T 세포를 생산하는 방법에 있어서, 상기 방법은 T 세포 내로 키메라 수용체 또는 이의 일부를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 도입하는 단계를 포함하고, 상기 T 세포는 상기 T 세포의 CD247 유전자 자리 내에 유전자 파괴를 가지며, 상기 키메라 수용체 또는 이의 일부를 암호화하는 상기 핵산 서열은 상동 직접 수선(HDR)을 통해 상기 내인성 CD247 유전자 자리 내에서 통합되는 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포를 생산하는 방법.
120. 구현예 116 또는 구현예 119에 있어서, 상기 유전자 파괴는 T 세포 내로, 상기 T 세포의 내인성 CD247 유전자 자리 내의 표적 부위에 유전자 파괴를 유도할 수 있는 하나 이상의 제제를 도입하여 수행되는 것을 특징으로 하는, 방법.
121. 구현예 116 내지 120 중 어느 하나에 있어서, 상기 방법은 변형된 CD247 유전자 자리를 생산하고, 상기 변형된 CD247 유전자 자리는 CD3ζ 신호 전달 도메인을 포함하는 세포내 영역을 포함하는 키메라 수용체를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
122. 구현예 119 내지 121 중 어느 하나에 있어서, 상기 핵산은 키메라 수용체 또는 이의 일부를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
123. 구현예 119 내지 122 중 어느 하나에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 상기 핵산 서열에 연결된 하나 이상의 상동성 암을 더 포함하되, 상기 하나 이상의 상동성 암은 CD247 유전자 자리의 개방형 해독틀의 하나 이상의 영역에 대해 상동성인 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
124. 구현예 116 내지 123 중 어느 하나에 있어서, 상기 키메라 수용체의 전(full) 세포내 영역은 CD3제타(CD3ζ) 신호 전달 도메인 또는 이의 단편을 포함하고, 상기 세포내 영역의 적어도 일부는 상기 방법에 의해 생성된 세포에서 상기 내인성 CD247 유전자 자리의 상기 개방형 해독틀 또는 이의 부분 서열에 의해 암호화되는 것을 특징으로 하는, 방법.
125. 구현예 116 내지 124 중 어느 하나에 있어서, 상기 키메라 수용체의 일부를 암호화하는 핵산 서열 및 상기 하나 이상의 상동성 암은 상기 키메라 수용체의 세포내 영역을 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열의 적어도 단편을 함께 포함하고, 상기 세포내 영역의 적어도 일부는 상기 방법에 의해 생성된 세포에서 상기 CD247 유전자 자리의 상기 개방형 해독틀 또는 이의 부분 서열에 의해 암호화되는 상기 CD3ζ 신호 전달 도메인 또는 이의 단편을 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
126. 구현예 119 내지 125 중 어느 하나에 있어서, 키메라 수용체 또는 이의 일부를 암호화하는 상기 핵산 서열은 3’ UTR을 암호화하는 서열을 포함하지 않는 것을 특징으로 하는, 방법.
127. 구현예 119 내지 126 중 어느 하나에 있어서, 키메라 수용체 또는 이의 일부를 암호화하는 상기 핵산 서열은 상기 방법에 의해 생성된 세포에서 상기 CD3ζ 신호 전달 도메인의 단편을 암호화하는 것을 특징으로 하는, 방법.
128. 구현예 119 내지 126 중 어느 하나에 있어서, 키메라 수용체 또는 이의 일부를 암호화하는 상기 핵산 서열은 상기 방법에 의해 생성된 세포에서 상기 CD3ζ 신호 전달 도메인 또는 이의 단편을 암호화하지 않는 것을 특징으로 하는, 방법.
129. 구현예 119 내지 128 중 어느 하나에 있어서, 상기 암호화된 키메라 수용체의 상기 CD3ζ 신호 전달 도메인의 적어도 단편, 선택적으로 전체 CD3ζ 신호 전달 도메인은 상기 방법에 의해 생성된 세포에서 상기 내인성 CD247 유전자 자리의 개방형 해독틀 또는 이의 부분 서열에 의해 암호화되는 것을 특징으로 하는, 방법.
130. 구현예 119 내지 129 중 어느 하나에 있어서, 키메라 수용체 또는 이의 일부를 암호화하는 상기 핵산 서열은 T 세포, 선택적으로 인간 T 세포의 내인성 게놈 CD247 유전자 자리의 개방형 해독틀에 외인성이거나 이종성인 서열인 것을 특징으로 하는, 방법.
131. 구현예 119 내지 130 중 어느 하나에 있어서, 키메라 수용체 또는 이의 일부를 암호화하는 핵산 서열은 상기 하나 이상의 상동성 암에 포함된 상기 CD247 유전자 자리의 상기 개방형 해독틀 또는 이의 부분 서열의 하나 이상의 엑손과 틀 내에 있는 뉴클레오타이드의 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
132. 구현예 119 내지 131 중 어느 하나에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드가 도입된 세포에 의해 발현될 때, 상기 키메라 수용체는 상기 CD3ζ 신호 전달 도메인을 통해 신호 전달을 할 수 있는 것을 특징으로 하는, 방법.
133. 구현예 119 내지 132 중 어느 하나에 있어서, 상기 CD3ζ 신호 전달 도메인은 서열 번호: 13-15 중 어느 하나에서 선택된 서열, 또는 서열 번호: 13-15 중 어느 하나에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 동일성을 나타내는 서열, 또는 이의 단편을 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
134. 구현예 119 내지 133 중 어느 하나에 있어서, 상기 하나 이상의 상동성 암은 5’ 상동성 암 및 3’ 상동성 암을 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
135. 구현예 119 내지 134 중 어느 하나에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 [5’ 상동성 암]-[키메라 수용체 또는 이의 일부를 암호화하는 핵산 서열]-[3’ 상동성 암] 구조를 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
136. 구현예 134 또는 구현예 135에 있어서, 상기 5’ 상동성 암 및 상기 3’ 상동성암은 독립적으로 (약) 50 내지 (약) 2000개 뉴클레오타이드, (약) 100 내지 (약) 1000개 뉴클레오타이드, (약) 100 내지 (약) 750개 뉴클레오타이드, (약) 100 내지 (약) 600개 뉴클레오타이드, (약) 100 내지 (약) 400개 뉴클레오타이드, (약) 100 내지 (약) 300개 뉴클레오타이드, (약) 100 내지 (약) 200개 뉴클레오타이드, (약) 200 내지 (약) 1000개 뉴클레오타이드, (약) 200 내지 (약) 750개 뉴클레오타이드, (약) 200 내지 (약) 600개 뉴클레오타이드, (약) 200 내지 (약) 400개 뉴클레오타이드, (약) 200 내지 (약) 300개 뉴클레오타이드, (약) 300 내지 (약) 1000개 뉴클레오타이드, (약) 300 내지 (약) 750개 뉴클레오타이드, (약) 300 내지 (약) 600개 뉴클레오타이드, (약) 300 내지 (약) 400개 뉴클레오타이드, (약) 400 내지 (약) 1000개 뉴클레오타이드, (약) 400 내지 (약) 750개 뉴클레오타이드, (약) 400 내지 (약) 600개 뉴클레오타이드, (약) 600 내지 (약) 1000개 뉴클레오타이드, (약) 600 내지 (약) 750개 뉴클레오타이드 또는 (약) 750 내지 (약) 1000개 뉴클레오타이드 길이인 것을 특징으로 하는, 방법.
137. 구현예 134 내지 136 중 어느 하나에 있어서, 상기 5’ 상동성 암 및 상기 3’ 상동성 암은 독립적으로 (약) 200, 300, 400, 500, 600, 700 또는 800개 뉴클레오타이드 길이이거나, 또는 전술한 임의의 수치 사이의 임의의 수치 길이인 것을 특징으로 하는, 방법.
138. 구현예 134 내지 137 중 어느 하나에 있어서, 상기 5’ 상동성 암 및 상기 3’ 상동성 암은 독립적으로 (약) 300개 뉴클레오타이드 길이를 초과하고, 선택적으로 상기 5’ 상동성 암 및 상기 3’ 상동성 암은 독립적으로 (약) 400, 500 또는 600개 뉴클레오타이드 길이이거나 또는 전술한 임의의 수치 사이의 임의의 수치 길이인 것을 특징으로 하는, 방법.
139. 구현예 134 내지 138 중 어느 하나에 있어서, 상기 5’ 상동성 암은 서열 번호: 80에 제시된 서열 또는 서열 번호: 80에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 동일성을 나타내는 서열 또는 이의 부분 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
140. 구현예 134 내지 139 중 어느 하나에 있어서, 상기 3’ 상동성 암은 서열 번호: 81에 제시된 서열 또는 서열 번호: 81에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 동일성을 나타내는 서열 또는 이의 부분 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
141. 구현예 117 및 120 내지 140 중 어느 하나에 있어서, 유전자 파괴를 유도할 수 있는 상기 하나 이상의 제제는 상기 표적 부위에 특이적으로 결합하거나 혼성화하는 DNA 결합 단백질 또는 DNA 결합 핵산, DNA-표적화 단백질 및 뉴클레아제를 포함하는 융합 단백질, 또는 RNA-가이드 뉴클레아제를 포함하고, 선택적으로 상기 하나 이상의 제제는 징크 핑거 뉴클레아제(ZFN), TAL-효과기 뉴클레아제(TALEN), 또는 상기 표적 부위에 특이적으로 결합하거나, 이를 인식하거나 이에 혼성화하는 CRISPR-Cas9 조합물을 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
142. 구현예 117 및 120 내지 141 중 어느 하나에 있어서, 상기 하나 이상의 제제 각각은 상기 적어도 하나의 표적 부위에 상보적인 표적화 도메인을 갖는 가이드 RNA(gRNA)를 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
143. 구현예 117 및 120 내지 142 중 어느 하나에 있어서, 상기 하나 이상의 제제는 상기 gRNA 및 Cas9 단백질을 포함하는 리보핵산단백질(RNP) 복합체로서 도입되는 것을 특징으로 하는, 방법.
144. 구현예 143에 있어서, 상기 RNP는 전기 천공법, 입자 총, 인산칼슘 형질주입, 세포 압축 또는 압착을 통해, 선택적으로 전기 천공법을 통해 도입되는 것을 특징으로 하는, 방법.
145. 구현예 143 또는 구현예 144에 있어서, 상기 RNP의 농도는 (약) 1, 2, 2.5, 5, 10, 20, 25, 30, 40 또는 50μM이거나, 전술한 수치 중 임의의 2개에 의해 정의되는 범위이고, 선택적으로 상기 RNP의 농도는 (약) 25μM인 것을 특징으로 하는, 방법.
146. 구현예 143 내지 145 중 어느 하나에 있어서, 상기 RNP 내 상기 gRNA 및 상기 Cas9 분자의 몰 비율은 (약) 5:1, 4:1, 3:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:3, 1:4 또는 1:5이거나, 전술한 수치 중 임의의 2개에 의해 정의되는 범위이고, 선택적으로 상기 RNP 내 상기 gRNA 및 상기 Cas9 분자의 몰 비율은 (약) 2.6:1인 것을 특징으로 하는, 방법.
147. 구현예 142 내지 146 중 어느 하나에 있어서, 상기 gRNA는 CACCUUCACUCUCAGGAACA(서열 번호: 87); GAAUGACACCAUAGAUGAAG(서열 번호:88); UGAAGAGGAUUCCAUCCAGC(서열 번호:89); 및 UCCAGCAGGUAGCAGAGUUU(서열 번호:90)에서 선택된 표적화 도메인 서열을 갖는 것을 특징으로 하는, 방법.
148. 구현예 142 내지 147 중 어느 하나에 있어서, 상기 gRNA는 CACCUUCACUCUCAGGAACA(서열 번호: 87)의 표적화 도메인 서열을 갖는 것을 특징으로 하는, 방법.
149. 구현예 142 내지 147 중 어느 하나에 있어서, 상기 gRNA는 UGAAGAGGAUUCCAUCCAGC(서열 번호: 89)의 표적화 도메인 서열을 갖는 것을 특징으로 하는, 방법.
150. 구현예 116 내지 149 중 어느 하나에 있어서, 상기 T 세포는 대상체로부터 수득된 1차 T 세포이고, 선택적으로 상기 대상체는 인간인 것을 특징으로 하는, 방법.
151. 구현예 116 내지 150 중 어느 하나에 있어서, 상기 T 세포는 CD8+ T 세포 또는 이의 아형인 것을 특징으로 하는, 방법.
152. 구현예 116 내지 150 중 어느 하나에 있어서, 상기 T 세포는 CD4+ T 세포 또는 이의 아형인 것을 특징으로 하는, 방법.
153. 구현예 116 내지 152 중 어느 하나에 있어서, 상기 T 세포는 다분화능 또는 다능성 세포로부터 유래되고, 상기 다분화는 또는 다능성 세포는 선택적으로 iPSC인 것을 특징으로 하는, 방법.
154. 구현예 119 내지 153 중 어느 하나에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 바이러스 벡터에 포함된 것을 특징으로 하는, 방법.
155. 구현예 154에 있어서, 상기 바이러스 벡터는 AAV 벡터인 것을 특징으로 하는, 방법.
156. 구현예 155에 있어서, 상기 AAV 벡터는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7 또는 AAV8 벡터 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 방법.
157. 구현예 155 또는 구현예 156에 있어서, 상기 AAV 벡터는 AAV2 또는 AAV6 벡터인 것을 특징으로 하는, 방법.
158. 구현예 154에 있어서, 상기 바이러스 벡터는 레트로바이러스 벡터, 선택적으로 렌티바이러스 벡터인 것을 특징으로 하는, 방법.
159. 구현예 119 내지 153 중 어느 하나에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 선형 폴리뉴클레오타이드, 선택적으로 이중 가닥 폴리뉴클레오타이드 또는 단일 가닥 폴리뉴클레오타이드인 것을 특징으로 하는, 방법.
160. 구현예 117 및 120 내지 159 중 어느 하나에 있어서, 상기 하나 이상의 제제 및 상기 폴리뉴클레오타이드는 동시에 또는 임의의 순서로 순차적으로 도입되는 것을 특징으로 하는, 방법.
161. 구현예 117 및 120 내지 160 중 어느 하나에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 상기 하나 이상의 제제의 도입 후에 도입되는 것을 특징으로 하는, 방법.
162. 구현예 161에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 상기 제제의 도입 후 약 30초, 1분, 2분, 3분, 4분, 5분, 6분, 7분, 8분, 9분, 10분, 15분, 20분, 30분, 40분, 50분, 60분, 90분, 2시간, 3시간 또는 4시간 직후 또는 이내에 도입되는 것을 특징으로 하는, 방법.
163. 구현예 117 및 120 내지 162 중 어느 하나에 있어서, 상기 하나 이상의 제제의 도입 전에, 상기 방법은 상기 세포를 자극제(들)와 시험관 내에서 하나 이상의 면역 세포를 자극 또는 활성화하기 위한 조건 하에서 인큐베이션하는 단계를 포함하는, 방법.
164. 구현예 163에 있어서, 상기 자극제(들)는 항-CD3 및/또는 항-CD28 항체를, 선택적으로 항-CD3/항-CD28 비드를 포함하고, 선택적으로 상기 비드 대 세포 비율은 (약) 1:1인 것을 특징으로 하는, 방법.
165. 구현예 163 또는 구현예 164에 있어서, 상기 방법은 상기 하나 이상의 제제를 도입하기 전에 상기 하나 이상의 면역 세포로부터 상기 자극제(들)를 제거하는 단계를 포함하는, 방법.
166. 구현예 117 및 120 내지 165 중 어느 하나에 있어서, 상기 방법은 상기 하나 이상의 제제의 도입 및/또는 상기 폴리뉴클레오타이드와 하나 이상의 재조합 사이토카인의 도입 전, 도중 또는 이후에 상기 세포를 인큐베이션하는 단계를 더 포함하고, 선택적으로 상기 하나 이상의 재조합 사이토카인은 IL-2, IL-7, 및 IL-15로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 방법.
167. 구현예 166에 있어서, 상기 하나 이상의 재조합 사이토카인은 (약) 10U/mL 내지 (약) 200U/mL, 선택적으로 (약) 50U/mL 내지 (약) 100U/mL 농도의 IL-2; 0.5ng/mL 내지 50ng/mL, 선택적으로 (약) 5ng/mL 내지 (약) 10ng/mL 농도의 IL-7 및/또는 0.1ng/mL 내지 20ng/mL, 선택적으로 (약) 0.5ng/mL 내지 (약) 5ng/mL 농도의 IL-15에서 선택된 농도로 첨가되는 것을 특징으로 하는, 방법.
168. 구현예 166 또는 구현예 167에 있어서, 상기 인큐베이션은 상기 하나 이상의 제제의 도입 및 상기 폴리뉴클레오타이드의 도입 후에 최대 또는 약 24시간, 36시간, 48시간, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 또는 21일, 선택적으로 최대 또는 약 7일 동안 수행되는 것을 특징으로 하는, 방법.
169. 구현예 116 내지 168 중 어느 하나에 있어서, 상기 방법에 의해 생성된 복수의 조작된 세포에서 세포의 적어도 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 또는 90% 이상은 CD247 유전자 자리 내 적어도 하나의 표적 부위의 유전자 파괴를 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
170. 구현예 116 내지 169 중 어느 하나에 있어서, 상기 방법에 의해 생성된 복수의 조작된 세포에서 세포의 적어도 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 또는 90% 이상은 상기 키메라 수용체 또는 이의 항원 결합 단편을 발현하는 것을 특징으로 하는, 방법.
171. 구현예 116 내지 170 중 어느 하나의 방법을 사용하여 생성된 조작된 T 세포 또는 복수의 조작된 T 세포.
172. 구현예 1 내지 52 및 171 중 어느 하나의 조작된 T 세포를 포함하는, 조성물.
173. 구현예 1 내지 52 및 171 중 어느 하나의 복수의 조작된 T 세포를 포함하는, 조성물.
174. 구현예 172 또는 구현예 173에서, 상기 조성물은 CD4+ T 세포 및/또는 CD8+ T 세포를 포함하는, 조성물.
175. 구현예 172 내지 174 중 어느 하나에 있어서, 상기 조성물은 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포를 포함하고 CD4+ T 세포 대 CD8+ T 세포의 비율은 (약) 1:3 내지 3:1, 선택적으로 1:1인 것을 특징으로 하는, 조성물.
176. 구현예 172 내지 175 중 어느 하나에 있어서, 상기 키메라 수용체를 발현하는 세포는 상기 조성물 내 총 세포 또는 상기 조성물 내 총 CD4+ 세포 또는 CD8+ 세포의 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상을 구성하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
177. 질병 또는 장애가 있는 대상체에 구현예 1 내지 52 및 171 내지 176 중 어느 하나의 조작된 세포, 복수의 조작된 세포 또는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 치료 방법.
178. 질병 또는 장애의 치료를 위한 구현예 1 내지 52 및 171 내지 176 중 어느 하나의 조작된 세포, 복수의 조작된 세포 또는 조성물의 용도.
179. 질병 또는 장애를 치료하기 위한 약제의 제조에서 구현예 1 내지 52 및 171 내지 176 중 어느 하나의 조작된 세포, 복수의 조작된 세포 또는 조성물의 용도.
180. 질병 또는 장애의 치료에 사용하기 위한 구현예 1 내지 52 및 171 내지 176 중 어느 하나의 조작된 세포, 복수의 조작된 세포 또는 조성물.
181. 구현예 177 내지 180 중 어느 하나의 사용을 위한 방법, 용도, 또는 조작된 세포, 복수의 조작된 세포 또는 조성물에 있어서, 상기 질병 또는 장애는 암 또는 종양인 것을 특징으로 하는, 방법, 용도, 또는 조작된 세포, 복수의 조작된 세포 또는 조성물.
182. 구현예 181에 있어서, 상기 암 또는 상기 종양은 혈액성 악성 종양, 선택적으로 림프종, 백혈병 또는 형질 세포 악성 종양인 것을 특징으로 하는, 사용을 위한 방법, 용도, 또는 조작된 세포, 복수의 조작된 세포 또는 조성물.
183. 구현예 181 또는 구현예 182에 있어서, 상기 암은 림프종이고 상기 림프종은 버킷 림프종(Burkitt’s lymphoma), 비호지킨 림프종(non-Hodgkin’s lymphoma, NHL), 호지킨 림프종, 발덴스트롬 거대글로불린혈증(Waldenstrom macroglobulinemia), 여포성 림프종(follicular lymphoma), 소형 비절단 세포 림프종(small non-cleaved cell lymphoma), 점막-관련 림프 조직 림프종(mucosa-associated lymphatic tissue lymphoma, MALT), 변연부 림프종(marginal zone lymphoma), 비장 림프종, 결절성 단핵구 B 세포 림프종(nodal monocytoid B cell lymphoma), 면역 모세포 림프종(immunoblastic lymphoma), 거대 세포 림프종(large cell lymphoma), 확산 혼합 세포 림프종(diffuse mixed cell lymphoma), 폐 B 세포 혈관 중심 림프종(pulmonary B cell angiocentric lymphoma), 소형 림프구성 림프종(small lymphocytic lymphoma), 1차 종격동 B 세포 림프종(primary mediastinal B cell lymphoma), 림프구 형질세포성 림프종(lymphoplasmacytic lymphoma, LPL) 또는 외투 세포 림프종(mantle cell lymphoma, MCL)인 것을 특징으로 하는, 사용을 위한 방법, 용도 또는, 조작된 세포, 복수의 조작된 세포 또는 조성물.
184. 구현예 181 또는 구현예 182에 있어서, 상기 암은 백혈병이고, 상기 백혈병은 만성 림프구성 백혈병(chronic lymphocytic leukemia, CLL), 혈장 세포 백혈병 또는 급성 림프구성 백혈병(acute lymphocytic leukemia, ALL)인 것을 특징으로 하는, 사용을 위한 방법, 용도, 또는 조작된 세포, 복수의 조작된 세포 또는 조성물.
185. 구현예 181 또는 구현예 182에 있어서, 상기 암은 형질 세포 악성 종양이고 상기 형질 세포 악성 종양은 다발성 골수종(MM)인 것을 특징으로 하는, 사용을 위한 방법, 용도, 또는 조작된 세포, 복수의 조작된 세포 또는 조성물.
186. 구현예 181에 있어서, 상기 종양은 고형 종양인 것을 특징으로 하는, 사용을 위한 방법, 용도, 또는 조작된 세포, 복수의 조작된 세포 또는 조성물.
187. 구현예 186에 있어서, 상기 고형 종양은 비-소세포폐암(NSCLC) 또는 두경부 편평세포암종(HNSCC)인 것을 특징으로 하는, 사용을 위한 방법, 용도, 또는 조작된 세포, 복수의 조작된 세포 또는 조성물.
188. 키트로서, CD247 유전자 자리 내의 표적 부위에 유전자 파괴를 유도할 수 있는 하나 이상의 제제; 및 구현예 53 내지 115 중 어느 하나의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 키트.
189. 키트로서, CD247 유전자 자리 내의 표적 부위에 유전자 파괴를 유도할 수 있는 하나 이상의 제제; 및 키메라 수용체 또는 이의 일부를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 - 상기 키메라 수용체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 사슬을 암호화하는 전이 유전자는 상동 직접 수선(HDR)을 통해 상기 표적 부위에 또는 그 근처에 통합을 위해 표적화됨 -; 및 구현예 116 내지 170 중 어느 하나의 방법을 실행하기 위한 사용법을 포함하는, 키트.
IX. 실시예들
하기 실시예들은 예시적인 목적으로만 포함되며 본 발명의 범위를 한정하려는 의도는 아니다.
실시예 1 내인성 CD247 유전자 자리에서의 유전자 파괴
CRISPR/Cas9 매개 유전자 편집에 의해 내인성 CD247 유전자 자리(CD3ζ을 암호화함) 내의 유전자 파괴에 대해 가이드 RNA를 평가하였다.
건강한 공여체로부터 얻은 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)로부터 면역친화도 기반 선택에 의해 1차 인간 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 단리하였다. 생성된 CD4+ 및 CD8+ 세포(1:1 비율)를 항-CD3/항-CD28 시약으로 배양하여 72시간 동안 자극하였다. 항-CD3/항-CD28 시약을 제거하고, CRISPR/Cas9 매개 유전자 편집에 의해 내인성 CD247 유전자 자리에 유전자 파괴를 도입하기 위해 자극된 세포를 2μM 리보핵산단백질(RNP) 복합체로 전기 천공하였다. RNP 복합체는 스트렙토코쿠스 피오게네스 Cas9와 다음과 같은 표적화 도메인 서열을 가진 4개의 예시적인 gRNA 중 하나를 함유하였다: CACCUUCACUCUCAGGAACA (CD247 gRNA 1; 서열 번호: 87); GAAUGACACCAUAGAUGAAG (CD247 gRNA 2; 서열 번호: 88); UGAAGAGGAUUCCAUCCAGC (CD247 gRNA 3; 서열 번호: 89); 또는 UCCAGCAGGUAGCAGAGUUU (CD247 gRNA 4; 서열 번호: 90), 또는 모의 처리(모의). gRNA 대 Cas9 단백질의 비율은 약 2.0:1이었다. 세포를 3일 동안 배양하고 유세포 분석에 의해, 항-CD3 항체 및 항-T 세포 수용체(TCR) 항체로 염색하여 평가하였다.
도 1에 도시된 바와 같이, CD247-표적화된 gRNA를 함유하는 RNP 복합체로 전기 천공된 세포에서 CD3 발현이 녹아웃되었으며, 약 12.6% 내지 76.1% 범위의 세포가 CD3 발현에 대해 녹아웃되었다. CD247 gRNA 3(서열 번호: 89에 제시된 표적화 도메인 서열을 가짐)은 가장 높은 녹아웃 효율을 나타냈다.
실시예 2 T 세포의 내인성 CD247 유전자 자리에서 키메라 항원 수용체(CAR)의 일부를 암호화하는 전이 유전자 서열의 표적화된 통합
키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하도록 인간 T 세포를 조작하였고, 여기서 CAR 또는 이의 일부를 암호화하는 핵산 서열은 상동성 의존적 수선(HDR)을 통해 내인성 CD247 유전자 자리(CD3ζ를 암호화함)에서의 통합을 위해 표적화되었다.
A. HDR 매개 표적화를 위한 주형 폴리뉴클레오타이드
예시적인 항원 BCMA에 특이적인 scFv, 면역글로불린 유래 스페이서, CD28 유래의 막관통 도메인 및 4-1BB 유래의 공자극 영역을 포함하는 CAR의 일부를 암호화하는 핵산 서열을 포함한 전이 유전자 서열의 표적화된 통합을 위해 예시적인 주형 폴리뉴클레오타이드를 생성하였다.
전이 유전자 서열은 또한 a) 이종성 프로모터의 제어 하에 CAR-암호화 서열의 발현을 유도하는 인간 신장 인자 1 알파(EF1α) 프로모터; 또는 b) CD247 개방형 해독틀 내로 HDR 매개 틀 내 표적화된 통합 시 내인성 CD247 유전자 자리로부터 CAR의 발현을 유도하기 위해, 항-BCMA CAR의 일부를 암호화하는 핵산 서열의 상단부에 있는 P2A 리보솜 스키핑 요소를 포함하였다. 전이 유전자 서열은 또한 i) CD3ζ 사슬의 세포내 부분과 이종성 폴리아데닐화 신호(SV40 폴리아데닐화 서열; SV40pA)를 암호화하는 이종 핵산 서열; 또는 ii) 표적화된 통합 시 CAR을 암호화하는 전사물이 CD3ζ 사슬의 내인성 3’ UTR을 함유하도록, CD3ζ 사슬의 일부를 암호화하는 무 이종 서열을 포함하였다.
주형 폴리뉴클레오타이드는 또한 T 세포의 내인성 인간 CD247 유전자 자리 내로 전이 유전자 서열의 표적화된 통합을 지시하기 위한 상동성 암을 함유하였다. 예시적인 주형 폴리뉴클레오타이드의 일반적인 구조는 다음과 같다: [5’ 상동성 암]-[전이 유전자 서열]-[3’ 상동성 암]. 5’ 상동성 암은 내인성 인간 CD247 유전자 자리의 첫 번째 인트론 및 두 번째 엑손의 일부와 상동성인 약 600bp의 서열을 함유했다(서열 번호: 80에 제시된 5’ 상동성 암 서열). 3’ 상동성 암은 두 번째 엑손에 의해 암호화된 마지막 3개의 아미노산을 암호화하는 서열을 포함하여 두 번째 엑손의 일부, 및 두 번째 인트론의 일부와 상동성인 대략 600bp의 서열을 함유하였다(서열 번호: 81에 제시된 3’ 상동성 암 서열).
표 E1은 생성된 주형 폴리뉴클레오타이드의 구조를 제시한다.
표 E1. 예시적인 주형 폴리뉴클레오타이드.
Figure pct00001
B. HDR 및 CAR의 발현에 의한 조작된 T 세포의 생성
HDR에 의한 표적화된 통합을 위해, 표 E1에 제시된 4개의 폴리뉴클레오타이드 중 하나를 함유하는 아데노 연관 바이러스(AAV) 벡터 작제물을 생성하였다(폴리뉴클레오타이드 A, B, C, D). 주형 폴리뉴클레오타이드, 혈청형 헬퍼 플라스미드 및 아데노바이러스 헬퍼 플라스미드를 293T 세포주 내로 도입하기 위해 AAV 벡터의 삼중 형질주입에 의해 AAV 주(stock)를 생산하였다. 형질주입된 세포를 수집하고, 용해시키고, 세포의 형질도입을 위해 AAV 주(stock)를 수집하였다.
1차 인간 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 인간 공여 대상체로부터 분리하고 자극하였고, 자극된 세포를 실시예 1에 기술된 바와 같이 약 2.0:1의 gRNA 대 Cas9 단백질에 CD247-표적화 gRNA 3 및 스트렙토코쿠스 피오게네스 Cas9를 함유하는 2μM의 RNP 복합체로 전기 천공하였다. 전기 천공 직후에, 5% v/v에서 폴리뉴클레오타이드 A, B, C, D 중 하나를 함유하는 AAV 제제로 세포를 형질도입하였다. 대조군으로, 항-BCMA CAR을 암호화하는 핵산 서열을 렌티바이러스 형질도입하였고 또는 모의 처리하였다.
세포를 3일 동안 배양하고 유세포 분석에 의해, 항-BCMA CAR의 발현을 검출하기 위해 항-CD3 입실론(항-CD3ε) 항체 및 BCMA-Fc(C-말단에서 IgG의 Fc 영역에 융합된 가용성 인간 BCMA) 융합 폴리펩타이드로 염색하여, 평가하였다.
도 2a에 도시된 바와 같이, 4개의 주형 폴리뉴클레오타이드(폴리뉴클레오타이드 A, B, C, D) 각각의 도입은 CD247 유전자 자리 내로 항-BCMA CAR의 표적화된 통합을 초래했고, 이는 세포의 포면에서 항-BCMA CAR의 발현 및 20% 미만의 세포가 CD3을 발현에 의해 증명되었다. 도 2b는 각 조건에서 예시적인 항-BCMA CAR의 발현의 변이 계수(CV)(세포 집단 내 신호의 표준 편차를 각 집단의 신호 평균으로 나눈 것) 및 기하 평균 형광(gMFI)을 도시한다. 도시된 바와 같이, HDR을 통한 내인성 CD247 유전자 자리에서 핵산의 표적화된 통합은 시험한 특정 폴리뉴클레오타이드에 대해 더 낮은 변이 계수를 나타냈다.
실시예 3 T 세포의 내인성 CD247 유전자 자리에서 키메라 항원 수용체(CAR)의 일부를 암호화하는 전이 유전자 서열의 표적화된 통합에 의해 조작된 CAR-발현 세포의 기능적 활성 평가
실시예 2에 기재된 바와 같이 생성된 조작된 세포를 항원-의존성 자극 후 세포 용해 활성 및 사이토카인 생산에 대해 평가하였다.
세포 용해 활성을 평가하기 위해, 조작된 CAR-발현 T 세포를 RPMI 8226 다발성 골수종 세포(ATCC®CCL-155™; 낮은 수준의 BCMA를 발현) 또는 BCMA-형질도입된 K562 만성 골수성 백혈병(CML) 세포(ATCC®CCL-243™; K562-BCMA, 높은 수준의 BCMA를 발현)가 있는 96-웰 플레이트에서 배양하고, 2:1, 1:1 또는 1:2의 E:T 비율로 인큐베이션하였다. 모의 전기 천공된 및 형질도입된 세포(모의) 및 CAR+ 세포 없이 배양된 표적 세포(표적 단독)를 대조군으로 평가하였다. 적색 형광 신호(Essen Bioscience의 IncuCyte®Live Cell Analysis System 사용)에 의해 결정된, NucLight Red(NLR)-표지된 살아있는 표적 세포의 손실을 49시간에 걸쳐 측정하였다. 용해 백분율을 결정하여 CAR+ 집단으로 정규화하였다.
표적 세포와 조작된 항-BCMA CAR-발현 세포의 공배양 후 사이토카인 생산을 또한 평가하였다. 다중 사이토카인 면역분석을 사용하여, 인터페론-감마(IFN-γ), 종양 괴사 인자 알파(TNF-α) 및 인터루킨-2(IL-2)의 측정을 위해 공배양된 세포의 상청액을 수집하였다.
RPMI 8226 세포에 대한 조작된 세포의 각 군에 대해 평가된 E:T 비율 각각에서 실험 동안의 총 용해 백분율이 도 3a에 도시되어 있다. 시간 경과에 따라 관찰된 2:1, 1:1 및 1:2 E:T 비율에서 RPMI 8226 세포의 용해가 도 3c, 3d 및 3e에 각각 도시되어 있다. 도시된 바와 같이, HDR을 통해 CD247 유전자 자리에서 표적화된 통합에 의해 예시적인 항-BCMA CAR을 발현하도록 조작된 세포는 예시적인 RPMI 8226 세포에 대해 렌티바이러스 전달에 의해 CAR로 조작된 세포와 비슷한 활성을 나타냈다.
상대적으로 더 높은 BCMA를 발현하는 대안적인 K562-BCMA 표적 세포에 대한 결과가 도 3b 및 3f-3h에 도시되어 있다. 조작된 세포의 각 군에 대해 평가된 E:T 비율 각각에서 실험 동안의 총 용해 백분율이 도 3b에 도시되어 있고, 2:1, 1:1 및 1:2 E:T 비율에서 시간 경과에 따라 관찰된 K562 표적 세포의 용해가 도 3f, 3g 및 3h에 각각 도시되어 있다. 이 실험에서, HDR을 통해 CD247 유전자 자리에서 표적화된 통합에 의해 예시적인 항-BCMA CAR을 발현하도록 조작된 세포는 렌티바이러스 형질도입을 사용하여 조작된 세포와 비교하여 다양한 E:T 비율에서 K562-BMCA 표적 세포에 대해 비슷하거나 더 큰 세포 용해 활성을 나타냈다. 구체적으로, 가장 큰 세포 용해 활성은 폴리뉴클레오타이드 D(EF1α 프로모터를 사용하여 발현되고 내인성 CD3ζ 3’ UTR을 함유함)를 사용하여 CAR의 표적화된 통합에 의해 조작된 세포에서 관찰되었으며, 특히 더 낮은 E:T 비율에서, HDR 매개 표적화된 통합을 위한 작제물로 사용될 때 우수한 활성을 나타냈다.
도 4a에 도시된 바와 같이, HDR을 사용하여 조작된 세포는 BCMA-발현 세포주 모두에 대해, 렌티바이러스 형질도입을 사용하여 조작된 세포와 비교하여 비슷하거나 더 높은 IFN-γ를 생산했다. 이 연구에서, 폴리뉴클레오타이드 D를 사용하여 CAR의 표적화된 통합에 의해 조작된 세포는 IFN-γ의 가장 높은 일반적인 생산을 나타냈다. 도 4b-4c에 도시된 바와 같이, IL-2 및 TNF-α 생산은 HDR을 사용하여 CAR을 CD247 유전자 자리 내로 표적화된 통합에 의해 조작된 세포에서 더 낮았다.
결과는 렌티바이러스 형질도입을 사용하여 조작된 세포와 비교하여, 내인성 CD247 유전자 자리에서 CAR 또는 이의 일부를 암호화하는 핵산 서열의 HDR-매개 통합에 의해 예시적인 CAR을 발현하도록 조작된 1차 T 세포의 비슷하거나 개선된 활성과 일치하였다.
실시예 4 다양한 주형 폴리뉴클레오타이드 작제물을 사용한 HDR 매개 통합에 의한 또는 렌티바이러스 전달에 의한 T 세포에서 CAR의 발현의 비교
T 세포를, 상기 기재된 바와 같은 다양한 작제물을 사용하여 HDR을 통해, 또는 렌티바이러스 전달에 의해 내인성 CD247 유전자 자리(CD3ζ를 암호화함)에서의 통합을 위해 CAR의 전부 또는 일부를 암호화하는 핵산 서열을 표적화함으로써 예시적인 CAR을 발현하도록 조작하였고, CAR의 발현 및 활성을 평가하였다.
1차 인간 T 세포를 상기 실시예 1에 기재된 바와 같이 자극하고, 자극된 세포를 각각 Alt-R 변형이 있는 합성된 gRNA 1 또는 gRNA 3을 함유하는 RNP 복합체로 전기 천공하였다(IDT Technologies; Coralville, IA). RNP 복합체는 gRNA 대 Cas9 단백질을 약 2.6:1의 비율로 함유하였고, 세포를 25μM 농도에서 RNP로 전기 천공하였다. 도 5에 도시된 바와 같이, 세포의 약 87.9% 및 95.5%가 각각 gRNA 1 및 gRNA 3을 사용하여 CD3 발현에 대해 녹아웃되었다. 이러한 결과는 gRNA의 변형, gRNA 대 Cas9 단백질의 비율 및/또는 더 높은 농도의 RNP가 CD247 유전자 자리의 더 높은 녹아웃 효율이라는 결과를 나타낸 것을 뒷받침한다.
HDR에 의한 CAR 발현 세포의 생성을 위해, 위에서 기술한 바와 같이, 1차 인간 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 3명의 인간 공여 대상체(공여체 1-3)으로부터 단리하고, 자극하고, CD247-표적화 변형된 gRNA 1(공여체 1) 또는 gRNA 3(공여체 2 및 3)을 함유하는 25μM의 RNP 복합체로 전기 천공하였다. 전기 천공 직후에, 세포를 (위의 표 E1에 제시된) 폴리뉴클레오타이드 A, B, C, D를 함유하는 AAV 제제와 함께 인큐베이션하였다. 대조군으로, 세포를 렌티바이러스 형질도입을 통해 항-BCMA CAR을 암호화하는 핵산 서열을 도입함으로써 조작하거나, CD247-표적화 RNP로 전기 천공하였지만 AAV 제제와 접촉되지 않았고, 또는 모의 처리하였다(모의). 전기 천공 및/또는 형질도입 후 4일 후, 세포를, 항-BCMA CAR의 발현을 검출하기 위해, 항-CD3 엡실론(항-CD3ε) 항체 및 BCMA-Fc(C-말단에서 IgG의 Fc 영역에 융합된 가용성 인간 BCMA) 융합 폴리펩타이드로 염색하였다.
세포를 2:1 또는 1:2의 효과기:표적(E:T) 비율로 표지된 MM.1S(ATCC®CRL-2974™) 인간 B 림프모구 표적 세포와 함께 인큐베이션하였고, NucLight Red(NLR)-표지된 살아있는 표적 세포의 손실을 적색 형광 신호(IncuCyte®Live Cell Analysis System, Essen Bioscience 사용)에 의해 결정된 바와 같이 3일에 걸쳐 측정하였다. 용해된 세포의 백분율(용해%)을 결정하고, 3명의 공여체에 대해 정규화하고 3중 샘플로부터 평균을 냈다. 24시간에 공동 배양된 세포로부터 상청액을 수집하고 다중 사이토카인 면역분석을 사용하여 IFN-γ, TNF-α 및 IL-2를 측정함으로써 사이토카인 생산.
예시적인 공여체로부터의 대표적인 결과가 도 6a-6c에 도시되어 있다. 이 실험에서 gRNA 3의 CD3ε- 집단에 의해 나타난 CD3 녹아웃 효율은 약 90%였다. CD247 유전자 자리에서 HDR에 의한 표적화된 통합을 위한 4개의 주형 폴리뉴클레오타이드 각각의 도입(폴리뉴클레오타이드 A, B, C, D)은 세포의 대략 49% 내지 65%가 세포의 표면에서 항-BCMA CAR을 발현하는 결과를 나타냈다. HDR에 의한 CD247 유전자 자리 내로 통합을 위해 표적화된 세포에서(도 6a의 폴리뉴클레오타이드 A, B, C 및 D 패널 참조), 일부 세포에서 CD247의 녹아웃과 일치하는 항-BCMA CAR을 발현하는 세포에서 CD3 표면 발현의 손실이 있었다. 도 6b에 도시된 바와 같이, 렌티바이러스 전달은 세포의 약 58%가 세포의 표면에서 항-BCMA CAR을 발현하는 결과로 나타났다. 2명의 추가 공여체(공여체 2 및 3, gRNA 3을 사용한 CD3ζ 녹아웃)의 결과에서, 도 6a-6b에서와 유사하게 게이팅된, 유세포 분석 플롯의 사분면에 있는 세포의 백분율이 아래 표 E2 및 E3에 표시되어 있다.
Figure pct00002
Figure pct00003
도 6c에 도시된 바와 같이, CAR 발현 수준의 분포는, HDR 주형이 이종성 EF1α 프로모터 및 전(full) 외인성 CAR을 CD247 유전자 자리 내로 통합한 전략과 비교하여(즉, 폴리뉴클레오타이드 D(내인성 CD3ζ 3’ UTR) 대 폴리뉴클레오타이드 C(이종성 3’ UTR)을 비교), CAR이 이종성 EF1α 프로모터의 제어 하에 발현되도록 조작되고 내인성 CD3ζ 3’ UTR을 함유하는 전략을 사용하여 HDR 매개 표적 통합에 의해 조작된 세포 중에서, 더 좁고 균일하였다. CAR 발현 수준은 또한 렌티바이러스 전달에 의해 CAR을 발현하도록 조작된 세포에서보다 더 빽빽하였다. 이 결과는 HDR에 의해 조작된 세포 내 CAR의 발현 수준에서 더 낮은 변이 계수 및 더 빽빽한 범위와 일치하였다.
도 7a에 도시된 바와 같이, 상이한 폴리뉴클레오타이드들을 사용하여 HDR에 의해 조작된 세포 중에서, 용해율(%)로 표시된 세포 용해 활성은, 내인성 CD247 프로모터(폴리뉴클레오타이드 A 및 B)의 제어 하에서 발현된 CAR이 있는 HDR에 의해 발현된 세포와 비교하여, 이종성 EF1α 프로모터(폴리뉴클레오타이드 C 및 D)의 제어 하에서 발현된 CAR이 있는 HDR에 의해 조작된 세포에서 일반적으로 더 높았다. 도 7b에 도시된 바와 같이, 용해율(%)로 표시된 세포 용해 활성은 렌티바이러스 전달에 의해 조작된 세포에서 관찰된 것과 비슷하였다.
도 8a-8c에 도시된 바와 같이, HDR에 의해 조작된 세포에 의한 IFN-γ(도 8a), TNF-α(도 8b) 및 IL-2(도 8c) 생산 수준은 일반적으로 렌티바이러스 전달을 사용하여 조작된 세포와 비교하여 유사하거나 더 낮았다. HDR에 의해 조작된 세포 중에서, EF1α 프로모터를 사용하여 발현되고 내인성 CD3ζ 3’ UTR를 함유하는 CAR이 있는 세포가 가장 높은 IL-2를 생산했고(폴리뉴클레오타이드 D), EF1α 프로모터 및 SV40pA를 사용하여 발현된 CAR이 있는 세포가 한 공여체에서 가장 높은 IFN-γ 생산을 나타냈다.
결과는, 예를 들어 내인성 CD247 유전자 자리에서, 이종성 EF1α 프로모터를 함유하는 작제물을 사용하고 내인성 CD3ζ 3’ UTR을 함유하는, CAR 또는 이의 일부를 암호화하는 핵산 서열의 HDR 매개 통합에 의해 예시적인 CAR을 발현하도록 조작된 1차 T 세포가, 렌티바이러스 전달에 의해 조작된 세포와 비교하여 유사하거나 개선된 세포 용해 활성 및 사이토카인 생산을 보이는 기능적 CAR을 발현하는 세포를 생성하는 것과 일치하였다. 결과는 일관된 기능적 활성을 갖는 높고 균일한 CAR 발현을 나타내는 T 세포 조작을 위해 내인성 CD247 유전자 자리의 3’ UTR이 있는 CAR의 발현을 위해 내인성 CD247 유전자 자리(CD3ζ를 암호화함)에서 CAR 또는 이의 일부를 암호화하는 핵산 서열의 HDR 매개 통합의 사용을 뒷받침한다.
본 발명은 본 발명의 다양한 측면을 설명하기 위해, 예를 들어 제공되는 특정 개시된 구현예로 범위를 제한하려는 것이 아니다. 기술된 조성물 및 방법에 대한 다양한 변형은 본 명세서의 기재 및 가르침에서 명백해질 것이다. 상기 변형은 본 개시의 진정한 범위와 정신에서 벗어나지 않고 실시될 수 있으며, 본 개시의 범위에 속하도록 의도된다.
서열
표 7에 서열을 아래와 같이 첨부한다.
# 서열 주석
1 ESKYGPPCPPCP 스페이서 (IgG4힌지) (aa)
2 GAATCTAAGTACGGACCGCCCTGCCCCCCTTGCCCT 스페이서 (IgG4힌지) (nt)
3 ESKYGPPCPPCPGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK 힌지-CH3 스페이서
4 ESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK 힌지-CH2-CH3 스페이서
5 RWPESPKAQASSVPTAQPQAEGSLAKATTAPATTRNTGRGGEEKKKEKEKEEQEERETKTPECPSHTQPLGVYLLTPAVQDLWLRDKATFTCFVVGSDLKDAHLTWEVAGKVPTGGVEEGLLERHSNGSQSQHSRLTLPRSLWNAGTSVTCTLNHPSLPPQRLMALREPAAQAPVKLSLNLLASSDPPEAASWLLCEVSGFSPPNILLMWLEDQREVNTSGFAPARPPPQPGSTTFWAWSVLRVPAPPSPQPATYTCVVSHEDSRTLLNASRSLEVSYVTDH IgD-힌지-Fc
6 LEGGGEGRGSLLTCGDVEENPGPR T2A
7 MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPRKVCNGIGIGEFKDSLSINATNIKHFKNCTSISGDLHILPVAFRGDSFTHTPPLDPQELDILKTVKEITGFLLIQAWPENRTDLHAFENLEIIRGRTKQHGQFSLAVVSLNITSLGLRSLKEISDGDVIISGNKNLCYANTINWKKLFGTSGQKTKIISNRGENSCKATGQVCHALCSPEGCWGPEPRDCVSCRNVSRGRECVDKCNLLEGEPREFVENSECIQCHPECLPQAMNITCTGRGPDNCIQCAHYIDGPHCVKTCPAGVMGENNTLVWKYADAGHVCHLCHPNCTYGCTGPGLEGCPTNGPKIPSIATGMVGALLLLLVVALGIGLFM tEGFR
8 FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV CD28 (Uniprot P10747의 aa 153-179)
9 IEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKP FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV CD28 (Uniprot P10747의 aa 114-179)
10 RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS CD28 (Uniprot P10747의 aa 180-220)
11 RSKRSRGGHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS CD28(LL이 GG로)
12 KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL 4-1BB (Q07011.1의 aa 214-255)
13 RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR CD3 제타
14 RVKFSRSAEPPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR CD3 제타
15 RVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR CD3 제타
16 RKVCNGIGIGEFKDSLSINATNIKHFKNCTSISGDLHILPVAFRGDSFTHTPPLDPQELDILKTVKEITGFLLIQAWPENRTDLHAFENLEIIRGRTKQHGQFSLAVVSLNITSLGLRSLKEISDGDVIISGNKNLCYANTINWKKLFGTSGQKTKIISNRGENSCKATGQVCHALCSPEGCWGPEPRDCVSCRNVSRGRECVDKCNLLEGEPREFVENSECIQCHPECLPQAMNITCTGRGPDNCIQCAHYIDGPHCVKTCPAGVMGENNTLVWKYADAGHVCHLCHPNCTYGCTGPGLEGCPTNGPKIPSIATGMVGALLLLLVVALGIGLFM tEGFR
17 EGRGSLLTCGDVEENPGP T2A
18 GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP P2A
19 ATNFSLLKQAGDVEENPGP P2A
20 QCTNYALLKLAGDVESNPGP E2A
21 VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP F2A
22 -PGGG-(SGGGG)5-P- 여기에서 P는 프롤린, G는 글리신 및 S는 세린 링커
23 GSADDAKKDAAKKDGKS 링커
24 atgcttctcctggtgacaagccttctgctctgtgagttaccacacccagcattcctcctgatccca GMCSFR 알파 사슬 신호 서열
25 MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIP GMCSFR 알파 사슬 신호 서열
26 MALPVTALLLPLALLLHA CD8 알파 신호 펩타이드
27 EPKSCDKTHTCPPCP 힌지
28 ERKCCVECPPCP 힌지
29 ELKTPLGDTHTCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCP 힌지
30 ESKYGPPCPSCP 힌지
31 X1PPX2PX1은 글리신, 시스테인 또는 아르기닌이다
X2는 시스테인 또는 트레오닌이다		 힌지
32 Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro 힌지
33 Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro 힌지
34 Glu Val Val Val Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro 힌지
35 RASQDISKYLN CDR L1
36 SRLHSGV CDR L2
37 GNTLPYTFG CDR L3
38 DYGVS CDR H1
39 VIWGSETTYYNSALKS CDR H2
40 YAMDYWG CDR H3
41 EVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSS VH
42 DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEIT VL
43 DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSS scFv
44 KASQNVGTNVA CDR L1
45 SATYRNS CDR L2
46 QQYNRYPYT CDR L3
47 SYWMN CDR H1
48 QIYPGDGDTNYNGKFKG CDR H2
49 KTISSVVDFYFDY CDR H3
50 EVKLQQSGAELVRPGSSVKISCKASGYAFSSYWMNWVKQRPGQGLEWIGQIYPGDGDTNYNGKFKGQATLTADKSSSTAYMQLSGLTSEDSAVYFCARKTISSVVDFYFDYWGQGTTVTVSS VH
51 DIELTQSPKFMSTSVGDRVSVTCKASQNVGTNVAWYQQKPGQSPKPLIYSATYRNSGVPDRFTGSGSGTDFTLTITNVQSKDLADYFCQQYNRYPYTSGGGTKLEIKR VL
52 GGGGSGGGGSGGGGS 링커
53 EVKLQQSGAELVRPGSSVKISCKASGYAFSSYWMNWVKQRPGQGLEWIGQIYPGDGDTNYNGKFKGQATLTADKSSSTAYMQLSGLTSEDSAVYFCARKTISSVVDFYFDYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIELTQSPKFMSTSVGDRVSVTCKASQNVGTNVAWYQQKPGQSPKPLIYSATYRNSGVPDRFTGSGSGTDFTLTITNVQSKDLADYFCQQYNRYPYTSGGGTKLEIKR scFv
54 HYYYGGSYAMDY HC-CDR3
55 HTSRLHS LC-CDR2
56 QQGNTLPYT LC-CDR3
57 gacatccagatgacccagaccacctccagcctgagcgccagcctgggcgaccgggtgaccatcagctgccgggccagccaggacatcagcaagtacctgaactggtatcagcagaagcccgacggcaccgtcaagctgctgatctaccacaccagccggctgcacagcggcgtgcccagccggtttagcggcagcggctccggcaccgactacagcctgaccatctccaacctggaacaggaagatatcgccacctacttttgccagcagggcaacacactgccctacacctttggcggcggaacaaagctggaaatcaccggcagcacctccggcagcggcaagcctggcagcggcgagggcagcaccaagggcgaggtgaagctgcaggaaagcggccctggcctggtggcccccagccagagcctgagcgtgacctgcaccgtgagcggcgtgagcctgcccgactacggcgtgagctggatccggcagccccccaggaagggcctggaatggctgggcgtgatctggggcagcgagaccacctactacaacagcgccctgaagagccggctgaccatcatcaaggacaacagcaagagccaggtgttcctgaagatgaacagcctgcagaccgacgacaccgccatctactactgcgccaagcactactactacggcggcagctacgccatggactactggggccagggcaccagcgtgaccgtgagcagc scFv를 암호화하는 서열
58 GSTSGSGKPGSGEGSTKG 링커
59 CACCTTCACTCTCAGGAACA CD247 (CD3z) 표적 서열 1
60 GAATGACACCATAGATGAAG CD247 (CD3z) 표적 서열 2
61 TGAAGAGGATTCCATCCAGC CD247 (CD3z) 표적 서열 3
62 TCCAGCAGGTAGCAGAGTTT CD247 (CD3z) 표적 서열 4
63 CACCTTCACTCTCAGGAACAGG CD247 (CD3z) 표적 서열 + PAM 1
64 GAATGACACCATAGATGAAGAGG CD247 (CD3z) 표적 서열 + PAM 2
65 TGAAGAGGATTCCATCCAGCAGG CD247 (CD3z) 표적 서열 + PAM 3
66 TCCAGCAGGTAGCAGAGTTTGGG CD247 (CD3z) 표적 서열 + PAM 4
67 AGACGCCCCCGCGTACCAGC CD247 (CD3z) 표적 서열 5
68 GCTGACTTACGTTATAGAGC CD247 (CD3z) 표적 서열 6
69 TTTCACCGCGGCCATCCTGC CD247 (CD3z) 표적 서열 7
70 TAATCGGCAACTGTGCCTGC CD247 (CD3z) 표적 서열 8
71 CGGAGGCCTACAGTGAGATT CD247 (CD3z) 표적 서열 9
72 TGGTACCCACCTTCACTCTC CD247 (CD3z) 표적 서열 10
73 MKWKALFTAAILQAQLPITEAQSFGLLDPKLCYLLDGILFIYGVILTALFLRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR CD247 동형 단백질 1 전구체 단백질 서열 (NCBI 기준 서열: NP_932170.1)
74 tgctttctcaaaggccccacagtcctccacttcctggggaggtagctgcagaataaaaccagcagagactccttttctcctaaccgtcccggccaccgctgcctcagcctctgcctcccagcctctttctgagggaaaggacaagatgaagtggaaggcgcttttcaccgcggccatcctgcaggcacagttgccgattacagaggcacagagctttggcctgctggatcccaaactctgctacctgctggatggaatcctcttcatctatggtgtcattctcactgccttgttcctgagagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtaccagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgcagagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgctaacagccaggggatttcaccactcaaaggccagacctgcagacgcccagattatgagacacaggatgaagcatttacaacccggttcactcttctcagccactgaagtattcccctttatgtacaggatgctttggttatatttagctccaaaccttcacacacagactgttgtccctgcactctttaagggagtgtactcccagggcttacggccctggccttgggccctctggtttgccggtggtgcaggtagacctgtctcctggcggttcctcgttctccctgggaggcgggcgcactgcctctcacagctgagttgttgagtctgttttgtaaagtccccagagaaagcgcagatgctagcacatgccctaatgtctgtatcactctgtgtctgagtggcttcactcctgctgtaaatttggcttctgttgtcaccttcacctcctttcaaggtaactgtactgggccatgttgtgcctccctggtgagagggccgggcagaggggcagatggaaaggagcctaggccaggtgcaaccagggagctgcaggggcatgggaaggtgggcgggcaggggagggtcagccagggcctgcgagggcagcgggagcctccctgcctcaggcctctgtgccgcaccattgaactgtaccatgtgctacaggggccagaagatgaacagactgaccttgatgagctgtgcacaaagtggcataaaaaacatgtggttacacagtgtgaataaagtgctgcggagcaagaggaggccgttgattcacttcacgctttcagcgaatgacaaaatcatctttgtgaaggcctcgcaggaagacccaacacatgggacctataactgcccagcggacagtggcaggacaggaaaaacccgtcaatgtactaggatactgctgcgtcattacagggcacaggccatggatggaaaacgctctctgctctgctttttttctactgttttaatttatactggcatgctaaagccttcctattttgcataataaatgcttcagtgaaaatgcaaaaaaaaaa CD247 동형 단백질 1 전구체 mRNA 서열 (NCBI 기준 서열: NM_198053.2)
75 MKWKALFTAAILQAQLPITEAQSFGLLDPKLCYLLDGILFIYGVILTALFLRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR CD247 동형 단백질 2 전구체 단백질 서열 (NCBI 기준 서열: NP_000725.1)
76 tgctttctcaaaggccccacagtcctccacttcctggggaggtagctgcagaataaaaccagcagagactccttttctcctaaccgtcccggccaccgctgcctcagcctctgcctcccagcctctttctgagggaaaggacaagatgaagtggaaggcgcttttcaccgcggccatcctgcaggcacagttgccgattacagaggcacagagctttggcctgctggatcccaaactctgctacctgctggatggaatcctcttcatctatggtgtcattctcactgccttgttcctgagagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtaccagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgctaacagccaggggatttcaccactcaaaggccagacctgcagacgcccagattatgagacacaggatgaagcatttacaacccggttcactcttctcagccactgaagtattcccctttatgtacaggatgctttggttatatttagctccaaaccttcacacacagactgttgtccctgcactctttaagggagtgtactcccagggcttacggccctggccttgggccctctggtttgccggtggtgcaggtagacctgtctcctggcggttcctcgttctccctgggaggcgggcgcactgcctctcacagctgagttgttgagtctgttttgtaaagtccccagagaaagcgcagatgctagcacatgccctaatgtctgtatcactctgtgtctgagtggcttcactcctgctgtaaatttggcttctgttgtcaccttcacctcctttcaaggtaactgtactgggccatgttgtgcctccctggtgagagggccgggcagaggggcagatggaaaggagcctaggccaggtgcaaccagggagctgcaggggcatgggaaggtgggcgggcaggggagggtcagccagggcctgcgagggcagcgggagcctccctgcctcaggcctctgtgccgcaccattgaactgtaccatgtgctacaggggccagaagatgaacagactgaccttgatgagctgtgcacaaagtggcataaaaaacatgtggttacacagtgtgaataaagtgctgcggagcaagaggaggccgttgattcacttcacgctttcagcgaatgacaaaatcatctttgtgaaggcctcgcaggaagacccaacacatgggacctataactgcccagcggacagtggcaggacaggaaaaacccgtcaatgtactaggatactgctgcgtcattacagggcacaggccatggatggaaaacgctctctgctctgctttttttctactgttttaatttatactggcatgctaaagccttcctattttgcataataaatgcttcagtgaaaatgcaaaaaaaaaa CD247 동형 단백질 2 전구체 mRNA 서열 (NCBI 기준 서열: NM_000734.3)
77 cgtgaggctccggtgcccgtcagtgggcagagcgcacatcgcccacagtccccgagaagttggggggaggggtcggcaattgaaccggtgcctagagaaggtggcgcggggtaaactgggaaagtgatgtcgtgtactggctccgcctttttcccgagggtgggggagaaccgtatataagtgcagtagtcgccgtgaacgttctttttcgcaacgggtttgccgccagaacacaggtaagtgccgtgtgtggttcccgcgggcctggcctctttacgggttatggcccttgcgtgccttgaattacttccacgcccctggctgcagtacgtgattcttgatcccgagcttcgggttggaagtgggtgggagagttcgaggccttgcgcttaaggagccccttcgcctcgtgcttgagttgaggcctggcctgggcgctggggccgccgcgtgcgaatctggtggcaccttcgcgcctgtctcgctgctttcgataagtctctagccatttaaaatttttgatgacctgctgcgacgctttttttctggcaagatagtcttgtaaatgcgggccaagatctgcacactggtatttcggtttttggggccgcgggcggcgacggggcccgtgcgtcccagcgcacatgttcggcgaggcggggcctgcgagcgcggccaccgagaatcggacgggggtagtctcaagctggccggcctgctctggtgcctggcctcgcgccgccgtgtatcgccccgccctgggcggcaaggctggcccggtcggcaccagttgcgtgagcggaaagatggccgcttcccggccctgctgcagggagctcaaaatggaggacgcggcgctcgggagagcgggcgggtgagtcacccacacaaaggaaaagggcctttccgtcctcagccgtcgcttcatgtgactccacggagtaccgggcgccgtccaggcacctcgattagttctcgagcttttggagtacgtcgtctttaggttggggggaggggttttatgcgatggagtttccccacactgagtgggtggagactgaagttaggccagcttggcacttgatgtaattctccttggaatttgccctttttgagtttggatcttggttcattctcaagcctcagacagtggttcaaagtttttttcttccatttcaggtgtcgtgaa EF1알파 프로모터 (GenBank: J04617.1)
78 CTGACCTCTTCTCTTCCTCCCACAG 인간 HBB 스플라이스 수용체 부위
79 TTTCTCTCCACAG 인간 IgG 스플라이스 수용체 부위
80 AGATCCCACTGTCCTAGGCGGGAGAGTGCTTGGCACTGAGGAGGCAGGGAGTTGGGGGAGAGTTAACCCAGATTCTCCCTGTCCTAGTTAACTGTCAGATATTGAAATGATCTCATTTGACCATCATTTGACCTATTGTCTCCCTGTGGGTAGGCCTCAGAGCCACACACCTCAGGCCAGGAGTACCATTCATCCAGACGTGAACATCTTCCCGAGGCTTCCAGAGTTCTTGGTTCACACCGGGGCTAACATGGCTGGGCTTCTGCTGCAGTGGCAGGAGCTCTGTGCACAGAGAACAGCCTCATCTGCTCGCCTTGTTTCCACCTCCCCTCCCATTGCCCCAGGTTCTTTGGCCCCACAGCGGCCACATCTGCCGTTGGTGCCAATAGGTTTTCCAGGAGCTGGTTGAGGTGGGAGGGAGGGAGAGGGTTGTGATCAGGCTGAGGCATGGGGATTGGATATAGTCTCCGTGTCATGATTTATTTGGTCAGTCAGTCCTAGTGCCACCCTGGGGTAATGGGGATGTGTTCTCGTCACCTTGGGCCTGGCTGACCAGCTTTATCTCTTGGCACAGAGGCACAGAGCTTTGGCCTGCTGGAT 5’ 상동성 암
81 AGAGTGAAGGTGGGTACCACTGGGCTTTGGGAGGAGGGCACGGGGTCCCCCACTTGATGGATGTTCAGAGGGGCCTTGGTCTTGGAAGGTCTCAAGCTCGGGTGGTGCCTGGGGCTTGGTATCCAGGAGCAAAGCAAGGACCAGCCAAGTGTGTGCCTTGAGTGGGCTGAGGAGGAGGTGGCAGTGTCTGGCTGAGATGGACAGGGTAGGAGGGAGAGCCTGGTGCTAGGCACCTCCATGACAAGCCGTACAAATGTGTGCACATCAGAGTGTCCCAGGGAAGGCGATGCTACTGGTGACAAAGGGGCTTACACTCAGGCAGAGGTCCTTCTTTCCAAGTGTGAATGAAGGCCATGTTAGCCTTTCTCTTGAAAAGGCCCTTTCCTCATCTGTAACTGGGGAGCTGACCAGAGCGTGGGTTTTTCACTTGGTGCCTTGCAGACCCTGGATTTCTTCGTGGGGCTGGTCATGGTGTGGGCAGAGATTGGAAGAATTTAGGAGTAAAGGGGAGAATCCAGTCCCAGTCATCACTTCAGTGCTTCTCAACCCATTTCTTGTTTGAATTTTGGACTTTGGCATAATATTTTATTTGAAAAACCA 3’ 상동성 암
82 GVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKMDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLE FKBP
83 GVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKVDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLE FKBP12v36
84 MGSNKSKPKDASQRRR 인간 C-Src 아실화 모티프
85 MGCXC 이중 아실화 모티프
86 CAAX CAAX 모티프
87 CACCUUCACUCUCAGGAACA CD247 (CD3z) 표적화 도메인 1
88 GAAUGACACCAUAGAUGAAG CD247 (CD3z) 표적화 도메인 2
89 UGAAGAGGAUUCCAUCCAGC CD247 (CD3z) 표적화 도메인 3
90 UCCAGCAGGUAGCAGAGUUU CD247 (CD3z) 표적화 도메인 4
91 AGACGCCCCCGCGUACCAGC CD247 (CD3z) 표적화 도메인 5
92 GCUGACUUACGUUAUAGAGC CD247 (CD3z) 표적화 도메인 6
93 UUUCACCGCGGCCAUCCUGC CD247 (CD3z) 표적화 도메인 7
94 UAAUCGGCAACUGUGCCUGC CD247 (CD3z) 표적화 도메인 8
95 CGGAGGCCUACAGUGAGAUU CD247 (CD3z) 표적화 도메인 9
96 UGGUACCCACCUUCACUCUC CD247 (CD3z) 표적화 도메인 10
97 NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC 예시적인 gRNA 상보성 도메인
98 NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGAGCUAUGCUGAAAAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC 예시적인 gRNA 상보성 도메인
99 NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGAGCUAUGCUGGAAACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC 예시적인 gRNA 상보성 도메인
100 NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUGGAAACAAAACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC 예시적인 gRNA 상보성 도메인
101 NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGUAUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAUAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC 예시적인 gRNA
102 NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUAAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUUAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC 예시적인 gRNA
103 NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGUAUUAGAGCUAUGCUGUAUUGGAAACAAUACAGCAUAGCAAGUUAAUAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC 예시적인 gRNA
104 AAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCU 예시적인 근위 및 꼬리 도메인
105 AAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGGUGC 예시적인 근위 및 꼬리 도메인
106 AAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCGGAUC 예시적인 근위 및 꼬리 도메인
107 AAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUG 예시적인 근위 및 꼬리 도메인
108 AAGGCUAGUCCGUUAUCA 예시적인 근위 및 꼬리 도메인
109 AAGGCUAGUCCG 예시적인 근위 및 꼬리 도메인
110 NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU 예시적인 키메라 gRNA
111 NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGUACUCUGGAAACAGAAUCUACUAAAACAAGGCAAAAUGCCGUGUUUAUCUCGUCAACUUGUUGGCGAGAUUUUUU 예시적인 키메라 gRNA
112 KKPYSIGLDIGTNSVGWAVVTDDYKVPAKKMKVLGNTDKSHIEKNLLGALLFDSGNTAEDRRLKRTARRRYTRRRNRILYLQEIFSEEMGKVDDSFFHRLEDSFLVTEDKRGERHPIFGNLEEEVKYHENFPTIYHLRQYLADNPEKVDLRLVYLALAHIIKFRGHFLIEGKFDTRNNDVQRLFQEFLAVYDNTFENSSLQEQNVQVEEILTDKISKSAKKDRVLKLFPNEKSNGRFAEFLKLIVGNQADFKKHFELEEKAPLQFSKDTYEEELEVLLAQIGDNYAELFLSAKKLYDSILLSGILTVTDVGTKAPLSASMIQRYNEHQMDLAQLKQFIRQKLSDKYNEVFSDVSKDGYAGYIDGKTNQEAFYKYLKGLLNKIEGSGYFLDKIEREDFLRKQRTFDNGSIPHQIHLQEMRAIIRRQAEFYPFLADNQDRIEKLLTFRIPYYVGPLARGKSDFAWLSRKSADKITPWNFDEIVDKESSAEAFINRMTNYDLYLPNQKVLPKHSLLYEKFTVYNELTKVKYKTEQGKTAFFDANMKQEIFDGVFKVYRKVTKDKLMDFLEKEFDEFRIVDLTGLDKENKVFNASYGTYHDLCKILDKDFLDNSKNEKILEDIVLTLTLFEDREMIRKRLENYSDLLTKEQVKKLERRHYTGWGRLSAELIHGIRNKESRKTILDYLIDDGNSNRNFMQLINDDALSFKEEIAKAQVIGETDNLNQVVSDIAGSPAIKKGILQSLKIVDELVKIMGHQPENIVVEMARENQFTNQGRRNSQQRLKGLTDSIKEFGSQILKEHPVENSQLQNDRLFLYYLQNGRDMYTGEELDIDYLSQYDIDHIIPQAFIKDNSIDNRVLTSSKENRGKSDDVPSKDVVRKMKSYWSKLLSAKLITQRKFDNLTKAERGGLTDDDKAGFIKRQLVETRQITKHVARILDERFNTETDENNKKIRQVKIVTLKSNLVSNFRKEFELYKVREINDYHHAHDAYLNAVIGKALLGVYPQLEPEFVYGDYPHFHGHKENKATAKKFFYSNIMNFFKKDDVRTDKNGEIIWKKDEHISNIKKVLSYPQVNIVKKVEEQTGGFSKESILPKGNSDKLIPRKTKKFYWDTKKYGGFDSPIVAYSILVIADIEKGKSKKLKTVKALVGVTIMEKMTFERDPVAFLERKGYRNVQEENIIKLPKYSLFKLENGRKRLLASARELQKGNEIVLPNHLGTLLYHAKNIHKVDEPKHLDYVDKHKDEFKELLDVVSNFSKKYTLAEGNLEKIKELYAQNNGEDLKELASSFINLLTFTAIGAPATFKFFDKNIDRKRYTSTTEILNATLIHQSITGLYETRIDLNKLGGD 스트렙토코쿠스 뮤탄스 Cas9
113 DKKYSIGLDIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD 스트렙토코쿠스 피오게네스 Cas9
114 TKPYSIGLDIGTNSVGWAVTTDNYKVPSKKMKVLGNTSKKYIKKNLLGVLLFDSGITAEGRRLKRTARRRYTRRRNRILYLQEIFSTEMATLDDAFFQRLDDSFLVPDDKRDSKYPIFGNLVEEKAYHDEFPTIYHLRKYLADSTKKADLRLVYLALAHMIKYRGHFLIEGEFNSKNNDIQKNFQDFLDTYNAIFESDLSLENSKQLEEIVKDKISKLEKKDRILKLFPGEKNSGIFSEFLKLIVGNQADFRKCFNLDEKASLHFSKESYDEDLETLLGYIGDDYSDVFLKAKKLYDAILLSGFLTVTDNETEAPLSSAMIKRYNEHKEDLALLKEYIRNISLKTYNEVFKDDTKNGYAGYIDGKTNQEDFYVYLKKLLAEFEGADYFLEKIDREDFLRKQRTFDNGSIPYQIHLQEMRAILDKQAKFYPFLAKNKERIEKILTFRIPYYVGPLARGNSDFAWSIRKRNEKITPWNFEDVIDKESSAEAFINRMTSFDLYLPEEKVLPKHSLLYETFNVYNELTKVRFIAESMRDYQFLDSKQKKDIVRLYFKDKRKVTDKDIIEYLHAIYGYDGIELKGIEKQFNSSLSTYHDLLNIINDKEFLDDSSNEAIIEEIIHTLTIFEDREMIKQRLSKFENIFDKSVLKKLSRRHYTGWGKLSAKLINGIRDEKSGNTILDYLIDDGISNRNFMQLIHDDALSFKKKIQKAQIIGDEDKGNIKEVVKSLPGSPAIKKGILQSIKIVDELVKVMGGRKPESIVVEMARENQYTNQGKSNSQQRLKRLEKSLKELGSKILKENIPAKLSKIDNNALQNDRLYLYYLQNGKDMYTGDDLDIDRLSNYDIDHIIPQAFLKDNSIDNKVLVSSASNRGKSDDVPSLEVVKKRKTFWYQLLKSKLISQRKFDNLTKAERGGLSPEDKAGFIQRQLVETRQITKHVARLLDEKFNNKKDENNRAVRTVKIITLKSTLVSQFRKDFELYKVREINDFHHAHDAYLNAVVASALLKKYPKLEPEFVYGDYPKYNSFRERKSATEKVYFYSNIMNIFKKSISLADGRVIERPLIEVNEETGESVWNKESDLATVRRVLSYPQVNVVKKVEEQNHGLDRGKPKGLFNANLSSKPKPNSNENLVGAKEYLDPKKYGGYAGISNSFTVLVKGTIEKGAKKKITNVLEFQGISILDRINYRKDKLNFLLEKGYKDIELIIELPKYSLFELSDGSRRMLASILSTNNKRGEIHKGNQIFLSQKFVKLLYHAKRISNTINENHRKYVENHKKEFEELFYYILEFNENYVGAKKNGKLLNSAFQSWQNHSIDELCSSFIGPTGSERKGLFELTSRGSAADFEFLGVKIPRYRDYTPSSLLKDATLIHQSVTGLYETRIDLAKLGEG 스트렙토코쿠스 테르모필루스 Cas9
115 KKPYTIGLDIGTNSVGWAVLTDQYDLVKRKMKIAGDSEKKQIKKNFWGVRLFDEGQTAADRRMARTARRRIERRRNRISYLQGIFAEEMSKTDANFFCRLSDSFYVDNEKRNSRHPFFATIEEEVEYHKNYPTIYHLREELVNSSEKADLRLVYLALAHIIKYRGNFLIEGALDTQNTSVDGIYKQFIQTYNQVFASGIEDGSLKKLEDNKDVAKILVEKVTRKEKLERILKLYPGEKSAGMFAQFISLIVGSKGNFQKPFDLIEKSDIECAKDSYEEDLESLLALIGDEYAELFVAAKNAYSAVVLSSIITVAETETNAKLSASMIERFDTHEEDLGELKAFIKLHLPKHYEEIFSNTEKHGYAGYIDGKTKQADFYKYMKMTLENIEGADYFIAKIEKENFLRKQRTFDNGAIPHQLHLEELEAILHQQAKYYPFLKENYDKIKSLVTFRIPYFVGPLANGQSEFAWLTRKADGEIRPWNIEEKVDFGKSAVDFIEKMTNKDTYLPKENVLPKHSLCYQKYLVYNELTKVRYINDQGKTSYFSGQEKEQIFNDLFKQKRKVKKKDLELFLRNMSHVESPTIEGLEDSFNSSYSTYHDLLKVGIKQEILDNPVNTEMLENIVKILTVFEDKRMIKEQLQQFSDVLDGVVLKKLERRHYTGWGRLSAKLLMGIRDKQSHLTILDYLMNDDGLNRNLMQLINDSNLSFKSIIEKEQVTTADKDIQSIVADLAGSPAIKKGILQSLKIVDELVSVMGYPPQTIVVEMARENQTTGKGKNNSRPRYKSLEKAIKEFGSQILKEHPTDNQELRNNRLYLYYLQNGKDMYTGQDLDIHNLSNYDIDHIVPQSFITDNSIDNLVLTSSAGNREKGDDVPPLEIVRKRKVFWEKLYQGNLMSKRKFDYLTKAERGGLTEADKARFIHRQLVETRQITKNVANILHQRFNYEKDDHGNTMKQVRIVTLKSALVSQFRKQFQLYKVRDVNDYHHAHDAYLNGVVANTLLKVYPQLEPEFVYGDYHQFDWFKANKATAKKQFYTNIMLFFAQKDRIIDENGEILWDKKYLDTVKKVMSYRQMNIVKKTEIQKGEFSKATIKPKGNSSKLIPRKTNWDPMKYGGLDSPNMAYAVVIEYAKGKNKLVFEKKIIRVTIMERKAFEKDEKAFLEEQGYRQPKVLAKLPKYTLYECEEGRRRMLASANEAQKGNQQVLPNHLVTLLHHAANCEVSDGKSLDYIESNREMFAELLAHVSEFAKRYTLAEANLNKINQLFEQNKEGDIKAIAQSFVDLMAFNAMGAPASFKFFETTIERKRYNNLKELLNSTIIYQSITGLYESRKRLDD 리스테리아 이노쿠아 Cas9
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117 MDKKYSIGLDIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD 스트렙토코쿠스 피오게네스 Cas9
118 CGTGAGGCTCCGGTGCCCGTCAGTGGGCAGAGCGCACATCGCCCACAGTCCCCGAGAAGTTGGGGGGAGGGGTCGGCAATTGAACCGGTGCCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTGATGTCGTGTACTGGCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATATAAGTGCACTAGTCGCCGTGAACGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAGAACACAGGTAAGTGCCGTGTGTGGTTCCCGCGGGCCTGGCCTCTTTACGGGTTATGGCCCTTGCGTGCCTTGAATTACTTCCACCTGGCTGCAGTACGTGATTCTTGATCCCGAGCTTCGGGTTGGAAGTGGGTGGGAGAGTTCGTGGCCTTGCGCTTAAGGAGCCCCTTCGCCTCGTGCTTGAGTTGTGGCCTGGCCTGGGCGCTGGGGCCGCCGCGTGCGAATCTGGTGGCACCTTCGCGCCTGTCTCGCTGCTTTCGATAAGTCTCTAGCCATTTAAAATTTTTGATGACCTGCTGCGACGCTTTTTTTCTGGCAAGATAGTCTTGTAAATGCGGGCCAAGATCAGCACACTGGTATTTCGGTTTTTGGGGCCGCGGGCGGCGACGGGGCCCGTGCGTCCCAGCGCACATGTTCGGCGAGGCGGGGCCTGCGAGCGCGGCCACCGAGAATCGGACGGGGGTAGTCTCAAGCTGCCCGGCCTGCTCTGGTGCCTGGCCTCGCGCCGCCGTGTATCGCCCCGCCCTGGGCGGCAAGGCTGGCCCGGTCGGCACCAGTTGCGTGAGCGGAAAGATGGCCGCTTCCCGGCCCTGCTGCAGGGAGCACAAAATGGAGGACGCGGCGCTCGGGAGAGCGGGCGGGTGAGTCACCCACACAAAGGAAAAGGGCCTTTCCGTCCTCAGCCGTCGCTTCATGTGACTCCACGGAGTACCGGGCGCCGTCCAGGCACCTCGATTAGTTCTCCAGCTTTTGGAGTACGTCGTCTTTAGGTTGGGGGGAGGGGTTTTATGCGATGGAGTTTCCCCACACTGAGTGGGTGGAGACTGAAGTTAGGCCAGCTTGGCACTTGATGTAATTCTCCTTGGAATTTGCCCTTTTTGAGTTTGGATCTTGGTTCATTCTCAAGCCTCAGACAGTGGTTCAAAGTTTTTTTCTTCCATTTCAGGTGTCGTGAAAACTACCCCTAAAAGCCAAA EF1알파 프로모터
119 GGATCTGCGATCGCTCCGGTGCCCGTCAGTGGGCAGAGCGCACATCGCCCACAGTCCCCGAGAAGTTGGGGGGAGGGGTCGGCAATTGAACCGGTGCCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTGATGTCGTGTACTGGCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATATAAGTGCAGTAGTCGCCGTGAACGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAGAACACAGCTGAAGCTTCGAGGGGCTCGCATCTCTCCTTCACGCGCCCGCCGCCCTACCTGAGGCCGCCATCCACGCCGGTTGAGTCGCGTTCTGCCGCCTCCCGCCTGTGGTGCCTCCTGAACTGCGTCCGCCGTCTAGGTAAGTTTAAAGCTCAGGTCGAGACCGGGCCTTTGTCCGGCGCTCCCTTGGAGCCTACCTAGACTCAGCCGGCTCTCCACGCTTTGCCTGACCCTGCTTGCTCAACTCTACGTCTTTGTTTCGTTTTCTGTTCTGCGCCGTTACAGATCCAAGCTGTGACCGGCGCCTAC HTLV1 인핸서를 갖는 Ef1알파 프로모터
120 GGATCTGGAGCGACGAATTTTAGTCTACTGAAACAAGCGGGAGACGTGGAGGAAAACCCTGGACCT P2A 뉴클레오타이드 서열
121 atggataaaaagtacagcatcgggctggacatcggtacaaactcagtggggtgggccgtgattacggacgagtacaaggtaccctccaaaaaatttaaagtgctgggtaacacggacagacactctataaagaaaaatcttattggagccttgctgttcgactcaggcgagacagccgaagccacaaggttgaagcggaccgccaggaggcggtataccaggagaaagaaccgcatatgctacctgcaagaaatcttcagtaacgagatggcaaaggttgacgatagctttttccatcgcctggaagaatcctttcttgttgaggaagacaagaagcacgaacggcaccccatctttggcaatattgtcgacgaagtggcatatcacgaaaagtacccgactatctaccacctcaggaagaagctggtggactctaccgataaggcggacctcagacttatttatttggcactcgcccacatgattaaatttagaggacatttcttgatcgagggcgacctgaacccggacaacagtgacgtcgataagctgttcatccaacttgtgcagacctacaatcaactgttcgaagaaaaccctataaatgcttcaggagtcgacgctaaagcaatcctgtccgcgcgcctctcaaaatctagaagacttgagaatctgattgctcagttgcccggggaaaagaaaaatggattgtttggcaacctgatcgccctcagtctcggactgaccccaaatttcaaaagtaacttcgacctggccgaagacgctaagctccagctgtccaaggacacatacgatgacgacctcgacaatctgctggcccagattggggatcagtacgccgatctctttttggcagcaaagaacctgtccgacgccatcctgttgagcgatatcttgagagtgaacaccgaaattactaaagcaccccttagcgcatctatgatcaagcggtacgacgagcatcatcaggatctgaccctgctgaaggctcttgtgaggcaacagctccccgaaaaatacaaggaaatcttctttgaccagagcaaaaacggctacgctggctatatagatggtggggccagtcaggaggaattctataaattcatcaagcccattctcgagaaaatggacggcacagaggagttgctggtcaaacttaacagggaggacctgctgcggaagcagcggacctttgacaacgggtctatcccccaccagattcatctgggcgaactgcacgcaatcctgaggaggcaggaggatttttatccttttcttaaagataaccgcgagaaaatagaaaagattcttacattcaggatcccgtactacgtgggacctctcgcccggggcaattcacggtttgcctggatgacaaggaagtcagaggagactattacaccttggaacttcgaagaagtggtggacaagggtgcatctgcccagtctttcatcgagcggatgacaaattttgacaagaacctccctaatgagaaggtgctgcccaaacattctctgctctacgagtactttaccgtctacaatgaactgactaaagtcaagtacgtcaccgagggaatgaggaagccggcattccttagtggagaacagaagaaggcgattgtagacctgttgttcaagaccaacaggaaggtgactgtgaagcaacttaaagaagactactttaagaagatcgaatgttttgacagtgtggaaatttcaggggttgaagaccgcttcaatgcgtcattggggacttaccatgatcttctcaagatcataaaggacaaagacttcctggacaacgaagaaaatgaggatattctcgaagacatcgtcctcaccctgaccctgttcgaagacagggaaatgatagaagagcgcttgaaaacctatgcccacctcttcgacgataaagttatgaagcagctgaagcgcaggagatacacaggatggggaagattgtcaaggaagctgatcaatggaattagggataaacagagtggcaagaccatactggatttcctcaaatctgatggcttcgccaataggaacttcatgcaactgattcacgatgactctcttaccttcaaggaggacattcaaaaggctcaggtgagcgggcagggagactcccttcatgaacacatcgcgaatttggcaggttcccccgctattaaaaagggcatccttcaaactgtcaaggtggtggatgaattggtcaaggtaatgggcagacataagccagaaaatattgtgatcgagatggcccgcgaaaaccagaccacacagaagggccagaaaaatagtagagagcggatgaagaggatcgaggagggcatcaaagagctgggatctcagattctcaaagaacaccccgtagaaaacacacagctgcagaacgaaaaattgtacttgtactatctgcagaacggcagagacatgtacgtcgaccaagaacttgatattaatagactgtccgactatgacgtagaccatatcgtgccccagtccttcctgaaggacgactccattgataacaaagtcttgacaagaagcgacaagaacaggggtaaaagtgataatgtgcctagcgaggaggtggtgaaaaaaatgaagaactactggcgacagctgcttaatgcaaagctcattacacaacggaagttcgataatctgacgaaagcagagagaggtggcttgtctgagttggacaaggcagggtttattaagcggcagctggtggaaactaggcagatcacaaagcacgtggcgcagattttggacagccggatgaacacaaaatacgacgaaaatgataaactgatacgagaggtcaaagttatcacgctgaaaagcaagctggtgtccgattttcggaaagacttccagttctacaaagttcgcgagattaataactaccatcatgctcacgatgcgtacctgaacgctgttgtcgggaccgccttgataaagaagtacccaaagctggaatccgagttcgtatacggggattacaaagtgtacgatgtgaggaaaatgatagccaagtccgagcaggagattggaaaggccacagctaagtacttcttttattctaacatcatgaatttttttaagacggaaattaccctggccaacggagagatcagaaagcggccccttatagagacaaatggtgaaacaggtgaaatcgtctgggataagggcagggatttcgctactgtgaggaaggtgctgagtatgccacaggtaaatatcgtgaaaaaaaccgaagtacagaccggaggattttccaaggaaagcattttgcctaaaagaaactcagacaagctcatcgcccgcaagaaagattgggaccctaagaaatacgggggatttgactcacccaccgtagcctattctgtgctggtggtagctaaggtggaaaaaggaaagtctaagaagctgaagtccgtgaaggaactcttgggaatcactatcatggaaagatcatcctttgaaaagaaccctatcgatttcctggaggctaagggttacaaggaggtcaagaaagacctcatcattaaactgccaaaatactctctcttcgagctggaaaatggcaggaagagaatgttggccagcgccggagagctgcaaaagggaaacgagcttgctctgccctccaaatatgttaattttctctatctcgcttcccactatgaaaagctgaaagggtctcccgaagataacgagcagaagcagctgttcgtcgaacagcacaagcactatctggatgaaataatcgaacaaataagcgagttcagcaaaagggttatcctggcggatgctaatttggacaaagtactgtctgcttataacaagcaccgggataagcctattagggaacaagccgagaatataattcacctctttacactcacgaatctcggagcccccgccgccttcaaatactttgatacgactatcgaccggaaacggtataccagtaccaaagaggtcctcgatgccaccctcatccaccagtcaattactggcctgtacgaaacacggatcgacctctctcaactgggcggcgactag 스트렙토코쿠스 피오게네스 Cas9 코돈 최적화된 핵산 서열
122 MDKKYSIGLDIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD 스트렙토코쿠스 피오게네스 Cas9
123 atggccgccttcaagcccaaccccatcaactacatcctgggcctggacatcggcatcgccagcgtgggctgggccatggtggagatcgacgaggacgagaaccccatctgcctgatcgacctgggtgtgcgcgtgttcgagcgcgctgaggtgcccaagactggtgacagtctggctatggctcgccggcttgctcgctctgttcggcgccttactcgccggcgcgctcaccgccttctgcgcgctcgccgcctgctgaagcgcgagggtgtgctgcaggctgccgacttcgacgagaacggcctgatcaagagcctgcccaacactccttggcagctgcgcgctgccgctctggaccgcaagctgactcctctggagtggagcgccgtgctgctgcacctgatcaagcaccgcggctacctgagccagcgcaagaacgagggcgagaccgccgacaaggagctgggtgctctgctgaagggcgtggccgacaacgcccacgccctgcagactggtgacttccgcactcctgctgagctggccctgaacaagttcgagaaggagagcggccacatccgcaaccagcgcggcgactacagccacaccttcagccgcaaggacctgcaggccgagctgatcctgctgttcgagaagcagaaggagttcggcaacccccacgtgagcggcggcctgaaggagggcatcgagaccctgctgatgacccagcgccccgccctgagcggcgacgccgtgcagaagatgctgggccactgcaccttcgagccagccgagcccaaggccgccaagaacacctacaccgccgagcgcttcatctggctgaccaagctgaacaacctgcgcatcctggagcagggcagcgagcgccccctgaccgacaccgagcgcgccaccctgatggacgagccctaccgcaagagcaagctgacctacgcccaggcccgcaagctgctgggtctggaggacaccgccttcttcaagggcctgcgctacggcaaggacaacgccgaggccagcaccctgatggagatgaaggcctaccacgccatcagccgcgccctggagaaggagggcctgaaggacaagaagagtcctctgaacctgagccccgagctgcaggacgagatcggcaccgccttcagcctgttcaagaccgacgaggacatcaccggccgcctgaaggaccgcatccagcccgagatcctggaggccctgctgaagcacatcagcttcgacaagttcgtgcagatcagcctgaaggccctgcgccgcatcgtgcccctgatggagcagggcaagcgctacgacgaggcctgcgccgagatctacggcgaccactacggcaagaagaacaccgaggagaagatctacctgcctcctatccccgccgacgagatccgcaaccccgtggtgctgcgcgccctgagccaggcccgcaaggtgatcaacggcgtggtgcgccgctacggcagccccgcccgcatccacatcgagaccgcccgcgaggtgggcaagagcttcaaggaccgcaaggagatcgagaagcgccaggaggagaaccgcaaggaccgcgagaaggccgccgccaagttccgcgagtacttccccaacttcgtgggcgagcccaagagcaaggacatcctgaagctgcgcctgtacgagcagcagcacggcaagtgcctgtacagcggcaaggagatcaacctgggccgcctgaacgagaagggctacgtggagatcgaccacgccctgcccttcagccgcacctgggacgacagcttcaacaacaaggtgctggtgctgggcagcgagaaccagaacaagggcaaccagaccccctacgagtacttcaacggcaaggacaacagccgcgagtggcaggagttcaaggcccgcgtggagaccagccgcttcccccgcagcaagaagcagcgcatcctgctgcagaagttcgacgaggacggcttcaaggagcgcaacctgaacgacacccgctacgtgaaccgcttcctgtgccagttcgtggccgaccgcatgcgcctgaccggcaagggcaagaagcgcgtgttcgccagcaacggccagatcaccaacctgctgcgcggcttctggggcctgcgcaaggtgcgcgccgagaacgaccgccaccacgccctggacgccgtggtggtggcctgcagcaccgtggccatgcagcagaagatcacccgcttcgtgcgctacaaggagatgaacgccttcgacggtaaaaccatcgacaaggagaccggcgaggtgctgcaccagaagacccacttcccccagccctgggagttcttcgcccaggaggtgatgatccgcgtgttcggcaagcccgacggcaagcccgagttcgaggaggccgacacccccgagaagctgcgcaccctgctggccgagaagctgagcagccgccctgaggccgtgcacgagtacgtgactcctctgttcgtgagccgcgcccccaaccgcaagatgagcggtcagggtcacatggagaccgtgaagagcgccaagcgcctggacgagggcgtgagcgtgctgcgcgtgcccctgacccagctgaagctgaaggacctggagaagatggtgaaccgcgagcgcgagcccaagctgtacgaggccctgaaggcccgcctggaggcccacaaggacgaccccgccaaggccttcgccgagcccttctacaagtacgacaaggccggcaaccgcacccagcaggtgaaggccgtgcgcgtggagcaggtgcagaagaccggcgtgtgggtgcgcaaccacaacggcatcgccgacaacgccaccatggtgcgcgtggacgtgttcgagaagggcgacaagtactacctggtgcccatctacagctggcaggtggccaagggcatcctgcccgaccgcgccgtggtgcagggcaaggacgaggaggactggcagctgatcgacgacagcttcaacttcaagttcagcctgcaccccaacgacctggtggaggtgatcaccaagaaggcccgcatgttcggctacttcgccagctgccaccgcggcaccggcaacatcaacatccgcatccacgacctggaccacaagatcggcaagaacggcatcctggagggcatcggcgtgaagaccgccctgagcttccagaagtaccagatcgacgagctgggcaaggagatccgcccctgccgcctgaagaagcgccctcctgtgcgctaa 나이세리아 메닝기티디스 Cas9 코돈 최적화된 핵산 서열
124 MAAFKPNPINYILGLDIGIASVGWAMVEIDEDENPICLIDLGVRVFERAEVPKTGDSLAMARRLARSVRRLTRRRAHRLLRARRLLKREGVLQAADFDENGLIKSLPNTPWQLRAAALDRKLTPLEWSAVLLHLIKHRGYLSQRKNEGETADKELGALLKGVADNAHALQTGDFRTPAELALNKFEKESGHIRNQRGDYSHTFSRKDLQAELILLFEKQKEFGNPHVSGGLKEGIETLLMTQRPALSGDAVQKMLGHCTFEPAEPKAAKNTYTAERFIWLTKLNNLRILEQGSERPLTDTERATLMDEPYRKSKLTYAQARKLLGLEDTAFFKGLRYGKDNAEASTLMEMKAYHAISRALEKEGLKDKKSPLNLSPELQDEIGTAFSLFKTDEDITGRLKDRIQPEILEALLKHISFDKFVQISLKALRRIVPLMEQGKRYDEACAEIYGDHYGKKNTEEKIYLPPIPADEIRNPVVLRALSQARKVINGVVRRYGSPARIHIETAREVGKSFKDRKEIEKRQEENRKDREKAAAKFREYFPNFVGEPKSKDILKLRLYEQQHGKCLYSGKEINLGRLNEKGYVEIDHALPFSRTWDDSFNNKVLVLGSENQNKGNQTPYEYFNGKDNSREWQEFKARVETSRFPRSKKQRILLQKFDEDGFKERNLNDTRYVNRFLCQFVADRMRLTGKGKKRVFASNGQITNLLRGFWGLRKVRAENDRHHALDAVVVACSTVAMQQKITRFVRYKEMNAFDGKTIDKETGEVLHQKTHFPQPWEFFAQEVMIRVFGKPDGKPEFEEADTPEKLRTLLAEKLSSRPEAVHEYVTPLFVSRAPNRKMSGQGHMETVKSAKRLDEGVSVLRVPLTQLKLKDLEKMVNREREPKLYEALKARLEAHKDDPAKAFAEPFYKYDKAGNRTQQVKAVRVEQVQKTGVWVRNHNGIADNATMVRVDVFEKGDKYYLVPIYSWQVAKGILPDRAVVQGKDEEDWQLIDDSFNFKFSLHPNDLVEVITKKARMFGYFASCHRGTGNINIRIHDLDHKIGKNGILEGIGVKTALSFQKYQIDELGKEIRPCRLKKRPPVR 나이세리아 메닝기티디스 Cas9
125 atgaaaaggaactacattctggggctggacatcgggattacaagcgtggggtatgggattattgactatgaaacaagggacgtgatcgacgcaggcgtcagactgttcaaggaggccaacgtggaaaacaatgagggacggagaagcaagaggggagccaggcgcctgaaacgacggagaaggcacagaatccagagggtgaagaaactgctgttcgattacaacctgctgaccgaccattctgagctgagtggaattaatccttatgaagccagggtgaaaggcctgagtcagaagctgtcagaggaagagttttccgcagctctgctgcacctggctaagcgccgaggagtgcataacgtcaatgaggtggaagaggacaccggcaacgagctgtctacaaaggaacagatctcacgcaatagcaaagctctggaagagaagtatgtcgcagagctgcagctggaacggctgaagaaagatggcgaggtgagagggtcaattaataggttcaagacaagcgactacgtcaaagaagccaagcagctgctgaaagtgcagaaggcttaccaccagctggatcagagcttcatcgatacttatatcgacctgctggagactcggagaacctactatgagggaccaggagaagggagccccttcggatggaaagacatcaaggaatggtacgagatgctgatgggacattgcacctattttccagaagagctgagaagcgtcaagtacgcttataacgcagatctgtacaacgccctgaatgacctgaacaacctggtcatcaccagggatgaaaacgagaaactggaatactatgagaagttccagatcatcgaaaacgtgtttaagcagaagaaaaagcctacactgaaacagattgctaaggagatcctggtcaacgaagaggacatcaagggctaccgggtgacaagcactggaaaaccagagttcaccaatctgaaagtgtatcacgatattaaggacatcacagcacggaaagaaatcattgagaacgccgaactgctggatcagattgctaagatcctgactatctaccagagctccgaggacatccaggaagagctgactaacctgaacagcgagctgacccaggaagagatcgaacagattagtaatctgaaggggtacaccggaacacacaacctgtccctgaaagctatcaatctgattctggatgagctgtggcatacaaacgacaatcagattgcaatctttaaccggctgaagctggtcccaaaaaaggtggacctgagtcagcagaaagagatcccaaccacactggtggacgatttcattctgtcacccgtggtcaagcggagcttcatccagagcatcaaagtgatcaacgccatcatcaagaagtacggcctgcccaatgatatcattatcgagctggctagggagaagaacagcaaggacgcacagaagatgatcaatgagatgcagaaacgaaaccggcagaccaatgaacgcattgaagagattatccgaactaccgggaaagagaacgcaaagtacctgattgaaaaaatcaagctgcacgatatgcaggagggaaagtgtctgtattctctggaggccatccccctggaggacctgctgaacaatccattcaactacgaggtcgatcatattatccccagaagcgtgtccttcgacaattcctttaacaacaaggtgctggtcaagcaggaagagaactctaaaaagggcaataggactcctttccagtacctgtctagttcagattccaagatctcttacgaaacctttaaaaagcacattctgaatctggccaaaggaaagggccgcatcagcaagaccaaaaaggagtacctgctggaagagcgggacatcaacagattctccgtccagaaggattttattaaccggaatctggtggacacaagatacgctactcgcggcctgatgaatctgctgcgatcctatttccgggtgaacaatctggatgtgaaagtcaagtccatcaacggcgggttcacatcttttctgaggcgcaaatggaagtttaaaaaggagcgcaacaaagggtacaagcaccatgccgaagatgctctgattatcgcaaatgccgacttcatctttaaggagtggaaaaagctggacaaagccaagaaagtgatggagaaccagatgttcgaagagaagcaggccgaatctatgcccgaaatcgagacagaacaggagtacaaggagattttcatcactcctcaccagatcaagcatatcaaggatttcaaggactacaagtactctcaccgggtggataaaaagcccaacagagagctgatcaatgacaccctgtatagtacaagaaaagacgataaggggaataccctgattgtgaacaatctgaacggactgtacgacaaagataatgacaagctgaaaaagctgatcaacaaaagtcccgagaagctgctgatgtaccaccatgatcctcagacatatcagaaactgaagctgattatggagcagtacggcgacgagaagaacccactgtataagtactatgaagagactgggaactacctgaccaagtatagcaaaaaggataatggccccgtgatcaagaagatcaagtactatgggaacaagctgaatgcccatctggacatcacagacgattaccctaacagtcgcaacaaggtggtcaagctgtcactgaagccatacagattcgatgtctatctggacaacggcgtgtataaatttgtgactgtcaagaatctggatgtcatcaaaaaggagaactactatgaagtgaatagcaagtgctacgaagaggctaaaaagctgaaaaagattagcaaccaggcagagttcatcgcctccttttacaacaacgacctgattaagatcaatggcgaactgtatagggtcatcggggtgaacaatgatctgctgaaccgcattgaagtgaatatgattgacatcacttaccgagagtatctggaaaacatgaatgataagcgcccccctcgaattatcaaaacaattgcctctaagactcagagtatcaaaaagtactcaaccgacattctgggaaacctgtatgaggtgaagagcaaaaagcaccctcagattatcaaaaagggc 스타필로코쿠스 아우레우스 Cas9 코돈 최적화된 핵산 서열
126 MKRNYILGLDIGITSVGYGIIDYETRDVIDAGVRLFKEANVENNEGRRSKRGARRLKRRRRHRIQRVKKLLFDYNLLTDHSELSGINPYEARVKGLSQKLSEEEFSAALLHLAKRRGVHNVNEVEEDTGNELSTKEQISRNSKALEEKYVAELQLERLKKDGEVRGSINRFKTSDYVKEAKQLLKVQKAYHQLDQSFIDTYIDLLETRRTYYEGPGEGSPFGWKDIKEWYEMLMGHCTYFPEELRSVKYAYNADLYNALNDLNNLVITRDENEKLEYYEKFQIIENVFKQKKKPTLKQIAKEILVNEEDIKGYRVTSTGKPEFTNLKVYHDIKDITARKEIIENAELLDQIAKILTIYQSSEDIQEELTNLNSELTQEEIEQISNLKGYTGTHNLSLKAINLILDELWHTNDNQIAIFNRLKLVPKKVDLSQQKEIPTTLVDDFILSPVVKRSFIQSIKVINAIIKKYGLPNDIIIELAREKNSKDAQKMINEMQKRNRQTNERIEEIIRTTGKENAKYLIEKIKLHDMQEGKCLYSLEAIPLEDLLNNPFNYEVDHIIPRSVSFDNSFNNKVLVKQEENSKKGNRTPFQYLSSSDSKISYETFKKHILNLAKGKGRISKTKKEYLLEERDINRFSVQKDFINRNLVDTRYATRGLMNLLRSYFRVNNLDVKVKSINGGFTSFLRRKWKFKKERNKGYKHHAEDALIIANADFIFKEWKKLDKAKKVMENQMFEEKQAESMPEIETEQEYKEIFITPHQIKHIKDFKDYKYSHRVDKKPNRELINDTLYSTRKDDKGNTLIVNNLNGLYDKDNDKLKKLINKSPEKLLMYHHDPQTYQKLKLIMEQYGDEKNPLYKYYEETGNYLTKYSKKDNGPVIKKIKYYGNKLNAHLDITDDYPNSRNKVVKLSLKPYRFDVYLDNGVYKFVTVKNLDVIKKENYYEVNSKCYEEAKKLKKISNQAEFIASFYNNDLIKINGELYRVIGVNNDLLNRIEVNMIDITYREYLENMNDKRPPRIIKTIASKTQSIKKYSTDILGNLYEVKSKKHPQIIKKG 스타필로코쿠스 아우레우스 Cas9
127 ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDISVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 인간 IgG2 Fc (Uniprot P01859)
128 ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK 인간 IgG4 Fc (Uniprot P01861)
129 ESKYGPPCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFQSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK 스페이서
130 tgctttatttgtgaaatttgtgatgctattgctttatttgtaaccattataagctgcaataaacaagttaacaacaacaattgcattcattttatgtttcaggttcagggggaggtgtgggaggttttttaaa SV40 poly A 신호
131 gaacagagaaacaggagaatatgggccaaacaggatatctgtggtaagcagttcctgccccggctcagggccaagaacagttggaacagcagaatatgggccaaacaggatatctgtggtaagcagttcctgccccggctcagggccaagaacagatggtccccagatgcggtcccgccctcagcagtttctagagaaccatcagatgtttccagggtgccccaaggacctgaaatgaccctgtgccttatttgaactaaccaatcagttcgcttctcgcttctgttcgcgcgcttctgctccccgagctctatataagcagagctcgtttagtgaaccgtcagatc MND 프로모터
SEQUENCE LISTING <110> Juno Therapeutics, INC. <120> CELLS EXPRESSING A CHIMERIC RECEPTOR FROM A MODIFIED CD247 LOCUS, RELATED POLYNUCLEOTIDES AND METHODS <130> 735042015840 <140> Not yet assigned <141> Concurrently herewith <150> 62/841,578 <151> 2019-05-01 <160> 131 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> spacer (IgG4hinge) <400> 1 Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro 1 5 10 <210> 2 <211> 36 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> spacer (IgG4hinge) <400> 2 gaatctaagt acggaccgcc ctgcccccct tgccct 36 <210> 3 <211> 119 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Hinge-CH3 spacer <400> 3 Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Gly Gln Pro Arg 1 5 10 15 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys 20 25 30 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 35 40 45 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 50 55 60 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 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Ser Ala Glu Pro Pro Ala Tyr Gln Gln Gly 1 5 10 15 Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr 20 25 30 Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys 35 40 45 Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys 50 55 60 Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg 65 70 75 80 Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala 85 90 95 Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 100 105 110 <210> 15 <211> 112 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> CD3 zeta <400> 15 Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly 1 5 10 15 Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr 20 25 30 Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys 35 40 45 Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys 50 55 60 Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg 65 70 75 80 Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala 85 90 95 Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 100 105 110 <210> 16 <211> 335 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> tEGFR <400> 16 Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu 1 5 10 15 Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser Ile 20 25 30 Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe 35 40 45 Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu Asp Ile Leu Lys Thr 50 55 60 Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile Gln Ala Trp Pro Glu Asn 65 70 75 80 Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu Glu Ile Ile Arg Gly Arg 85 90 95 Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val Val Ser Leu Asn Ile 100 105 110 Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser Asp Gly Asp Val 115 120 125 Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala Asn Thr Ile Asn Trp 130 135 140 Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr Lys Ile Ile Ser Asn 145 150 155 160 Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln Val Cys His Ala Leu 165 170 175 Cys 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tctttaaggg agtgtactcc 840 cagggcttac ggccctggcc ttgggccctc tggtttgccg gtggtgcagg tagacctgtc 900 tcctggcggt tcctcgttct ccctgggagg cgggcgcact gcctctcaca gctgagttgt 960 tgagtctgtt ttgtaaagtc cccagagaaa gcgcagatgc tagcacatgc cctaatgtct 1020 gtatcactct gtgtctgagt ggcttcactc ctgctgtaaa tttggcttct gttgtcacct 1080 tcacctcctt tcaaggtaac tgtactgggc catgttgtgc ctccctggtg agagggccgg 1140 gcagaggggc agatggaaag gagcctaggc caggtgcaac cagggagctg caggggcatg 1200 ggaaggtggg cgggcagggg agggtcagcc agggcctgcg agggcagcgg gagcctccct 1260 gcctcaggcc tctgtgccgc accattgaac tgtaccatgt gctacagggg ccagaagatg 1320 aacagactga ccttgatgag ctgtgcacaa agtggcataa aaaacatgtg gttacacagt 1380 gtgaataaag tgctgcggag caagaggagg ccgttgattc acttcacgct ttcagcgaat 1440 gacaaaatca tctttgtgaa ggcctcgcag gaagacccaa cacatgggac ctataactgc 1500 ccagcggaca gtggcaggac aggaaaaacc cgtcaatgta ctaggatact gctgcgtcat 1560 tacagggcac aggccatgga tggaaaacgc tctctgctct gctttttttc tactgtttta 1620 atttatactg gcatgctaaa gccttcctat tttgcataat aaatgcttca gtgaaaatgc 1680 aaaaaaaaaa 1690 <210> 75 <211> 163 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> CD247 isoform 2 precursor protein sequence <300> <308> NO_000725.1 <309> 2020-02-20 <400> 75 Met Lys Trp Lys Ala Leu Phe Thr Ala Ala Ile Leu Gln Ala Gln Leu 1 5 10 15 Pro Ile Thr Glu Ala Gln Ser Phe Gly Leu Leu Asp Pro Lys Leu Cys 20 25 30 Tyr Leu Leu Asp Gly Ile Leu Phe Ile Tyr Gly Val Ile Leu Thr Ala 35 40 45 Leu Phe Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr 50 55 60 Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg 65 70 75 80 Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met 85 90 95 Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu 100 105 110 Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys 115 120 125 Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu 130 135 140 Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu 145 150 155 160 Pro Pro Arg <210> 76 <211> 1687 <212> DNA <213> Homo 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acaagccgta caaatgtgtg cacatcagag tgtcccaggg aaggcgatgc tactggtgac 300 aaaggggctt acactcaggc agaggtcctt ctttccaagt gtgaatgaag gccatgttag 360 cctttctctt gaaaaggccc tttcctcatc tgtaactggg gagctgacca gagcgtgggt 420 ttttcacttg gtgccttgca gaccctggat ttcttcgtgg ggctggtcat ggtgtgggca 480 gagattggaa gaatttagga gtaaagggga gaatccagtc ccagtcatca cttcagtgct 540 tctcaaccca tttcttgttt gaattttgga ctttggcata atattttatt tgaaaaacca 600 <210> 82 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FKBP <400> 82 Gly Val Gln Val Glu Thr Ile Ser Pro Gly Asp Gly Arg Thr Phe Pro 1 5 10 15 Lys Arg Gly Gln Thr Cys Val Val His Tyr Thr Gly Met Leu Glu Asp 20 25 30 Gly Lys Lys Met Asp Ser Ser Arg Asp Arg Asn Lys Pro Phe Lys Phe 35 40 45 Met Leu Gly Lys Gln Glu Val Ile Arg Gly Trp Glu Glu Gly Val Ala 50 55 60 Gln Met Ser Val Gly Gln Arg Ala Lys Leu Thr Ile Ser Pro Asp Tyr 65 70 75 80 Ala Tyr Gly Ala Thr Gly His Pro Gly Ile Ile Pro Pro His Ala Thr 85 90 95 Leu Val Phe Asp Val Glu Leu Leu Lys Leu Glu 100 105 <210> 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CAAX motif <220> <221> VARIANT <222> (4)...(4) <223> Xaa is any amino acid <400> 86 Cys Ala Ala Xaa 1 <210> 87 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD247 (CD3z) targeting domain 1 <400> 87 caccuucacu cucaggaaca 20 <210> 88 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD247 (CD3z) targeting domain 2 <400> 88 gaaugacacc auagaugaag 20 <210> 89 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD247 (CD3z) targeting domain 3 <400> 89 ugaagaggau uccauccagc 20 <210> 90 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD247 (CD3z) targeting domain 4 <400> 90 uccagcaggu agcagaguuu 20 <210> 91 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD247 (CD3z) targeting domain 5 <400> 91 agacgccccc gcguaccagc 20 <210> 92 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD247 (CD3z) targeting domain 6 <400> 92 gcugacuuac guuauagagc 20 <210> 93 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD247 (CD3z) targeting domain 7 <400> 93 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uugaaaaagu ggcaccgagu cggugc 116 <210> 104 <211> 47 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> exemplary proximal and tail domain <400> 104 aaggcuaguc cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcu 47 <210> 105 <211> 49 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> exemplary proximal and tail domain <400> 105 aaggcuaguc cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cgguggugc 49 <210> 106 <211> 51 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> exemplary proximal and tail domain <400> 106 aaggcuaguc cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcggau c 51 <210> 107 <211> 31 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> exemplary proximal and tail domain <400> 107 aaggcuaguc cguuaucaac uugaaaaagu g 31 <210> 108 <211> 18 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> exemplary proximal and tail domain <400> 108 aaggcuaguc cguuauca 18 <210> 109 <211> 12 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> exemplary proximal and tail domain <400> 109 aaggcuaguc cg 12 <210> 110 <211> 102 <212> RNA <213> 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Lys Gly Tyr Lys His His Ala Glu Asp 690 695 700 Ala Leu Ile Ile Ala Asn Ala Asp Phe Ile Phe Lys Glu Trp Lys Lys 705 710 715 720 Leu Asp Lys Ala Lys Lys Val Met Glu Asn Gln Met Phe Glu Glu Lys 725 730 735 Gln Ala Glu Ser Met Pro Glu Ile Glu Thr Glu Gln Glu Tyr Lys Glu 740 745 750 Ile Phe Ile Thr Pro His Gln Ile Lys His Ile Lys Asp Phe Lys Asp 755 760 765 Tyr Lys Tyr Ser His Arg Val Asp Lys Lys Pro Asn Arg Glu Leu Ile 770 775 780 Asn Asp Thr Leu Tyr Ser Thr Arg Lys Asp Asp Lys Gly Asn Thr Leu 785 790 795 800 Ile Val Asn Asn Leu Asn Gly Leu Tyr Asp Lys Asp Asn Asp Lys Leu 805 810 815 Lys Lys Leu Ile Asn Lys Ser Pro Glu Lys Leu Leu Met Tyr His His 820 825 830 Asp Pro Gln Thr Tyr Gln Lys Leu Lys Leu Ile Met Glu Gln Tyr Gly 835 840 845 Asp Glu Lys Asn Pro Leu Tyr Lys Tyr Tyr Glu Glu Thr Gly Asn Tyr 850 855 860 Leu Thr Lys Tyr Ser Lys Lys Asp Asn Gly Pro Val Ile Lys Lys Ile 865 870 875 880 Lys Tyr Tyr Gly Asn Lys Leu Asn Ala His Leu Asp Ile Thr Asp Asp 885 890 895 Tyr Pro Asn Ser Arg Asn Lys Val Val Lys Leu Ser Leu Lys Pro Tyr 900 905 910 Arg Phe Asp Val Tyr Leu Asp Asn Gly Val Tyr Lys Phe Val Thr Val 915 920 925 Lys Asn Leu Asp Val Ile Lys Lys Glu Asn Tyr Tyr Glu Val Asn Ser 930 935 940 Lys Cys Tyr Glu Glu Ala Lys Lys Leu Lys Lys Ile Ser Asn Gln Ala 945 950 955 960 Glu Phe Ile Ala Ser Phe Tyr Asn Asn Asp Leu Ile Lys Ile Asn Gly 965 970 975 Glu Leu Tyr Arg Val Ile Gly Val Asn Asn Asp Leu Leu Asn Arg Ile 980 985 990 Glu Val Asn Met Ile Asp Ile Thr Tyr Arg Glu Tyr Leu Glu Asn Met 995 1000 1005 Asn Asp Lys Arg Pro Pro Arg Ile Ile Lys Thr Ile Ala Ser Lys Thr 1010 1015 1020 Gln Ser Ile Lys Lys Tyr Ser Thr Asp Ile Leu Gly Asn Leu Tyr Glu 1025 1030 1035 1040 Val Lys Ser Lys Lys His Pro Gln Ile Ile Lys Lys Gly 1045 1050 <210> 127 <211> 326 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Human IgG2 Fc <300> <308> Uniprot P01859 <309> 2008-12-16 <400> 127 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 1 5 10 15 Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 100 105 110 Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 115 120 125 Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 130 135 140 Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 145 150 155 160 Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn 165 170 175 Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp 180 185 190 Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro 195 200 205 Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu 210 215 220 Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn 225 230 235 240 Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile 245 250 255 Ser Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 260 265 270 Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 275 280 285 Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys 290 295 300 Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu 305 310 315 320 Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 <210> 128 <211> 327 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Human IgG4 Fc <300> <308> Uniprot P01861 <309> 1986-07-21 <400> 128 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 1 5 10 15 Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr 65 70 75 80 Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro 100 105 110 Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 115 120 125 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 130 135 140 Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp 145 150 155 160 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe 165 170 175 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 180 185 190 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu 195 200 205 Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 210 215 220 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys 225 230 235 240 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 245 250 255 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 260 265 270 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 275 280 285 Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser 290 295 300 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 305 310 315 320 Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 325 <210> 129 <211> 228 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Spacer <400> 129 Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val 1 5 10 15 Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 20 25 30 Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 35 40 45 Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 50 55 60 Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Gln Ser Thr 65 70 75 80 Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn 85 90 95 Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser 100 105 110 Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln 115 120 125 Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val 130 135 140 Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val 145 150 155 160 Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 165 170 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347

Claims (112)

  1. 변형된 CD247 유전자 자리를 포함하되, 상기 변형된 CD247 유전자 자리는 CD3제타(CD3ζ) 신호 전달 도메인을 포함하는 세포내 영역을 포함하는 키메라 수용체를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 핵산 서열은 키메라 수용체의 일부를 암호화하는 전이 유전자 서열을 포함하되, 상기 전이 유전자 서열은, 선택적으로 상동 직접 수선(HDR)을 통해, T 세포의 내인성 CD247 유전자 자리 내에서 통합을 위해 표적화된 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 전체 CD3ζ 신호 전달 도메인 또는 상기 CD3ζ 신호 전달 도메인의 단편은 상기 내인성 CD247 유전자 자리의 개방형 해독틀 또는 이의 부분 서열에 의해 암호화되는 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 키메라 수용체를 암호화하는 상기 핵산 서열은 (i) 상기 키메라 수용체의 일부를 암호화하는 상기 전이 유전자 서열과 (ii) 상기 내인성 CD247 유전자 자리의 개방형 해독틀 또는 이의 부분 서열의 틀 내 융합물을 포함하는 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포.
  5. 변형된 CD247 유전자 자리를 포함하되, 상기 변형된 CD247 유전자 자리는 CD3제타(CD3ζ) 신호 전달 도메인을 포함하는 세포내 영역을 포함하는 키메라 수용체를 암호화하는 핵산 서열을 포함하고, 상기 핵산 서열은 (i) 상기 키메라 수용체의 일부를 암호화하는 전이 유전자 서열과 (ii) 상기 CD3ζ 신호 전달 도메인을 암호화하는 내인성 CD247 유전자 자리의 개방형 해독틀 또는 이의 부분 서열의 틀 내 융합물을 포함하는 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포.
  6. 제2항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 전이 유전자 서열은 상기 내인성 CD247 유전자 자리의 상기 개방형 해독틀 또는 이의 부분 서열의 하나 이상의 엑손과 틀 내에 있는 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포.
  7. 제2항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 전이 유전자 서열은 3’ UTR을 암호화하는 서열을 포함하지 않고/거나 인트론을 포함하지 않는 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포.
  8. 제2항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 전이 유전자 서열은 상기 CD3ζ 신호 전달 도메인의 단편을 암호화하거나 상기 CD3ζ 신호 전달 도메인 또는 이의 단편을 암호화하지 않는 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포.
  9. 제3항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 개방형 해독틀 또는 이의 부분 서열은 상기 내인성 CD247 유전자 자리의 적어도 하나의 인트론 및 적어도 하나의 엑손을 포함하고/거나, 상기 내인성 CD247 유전자 자리의 3’ UTR을 암호화하는 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포.
  10. 제2항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 전이 유전자 서열은 상기 내인성 CD247 유전자 자리의 상기 개방형 해독틀의 엑손 1의 하단부 및 엑손 8의 상단부에 있고; 선택적으로 상기 내인성 CD247 유전자 자리의 상기 개방형 해독틀의 엑손 1의 하단부 및 엑손 3의 상단부에 있는 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 암호화된 키메라 수용체의 상기 CD3ζ 신호 전달 도메인의 적어도 단편, 선택적으로 전체 CD3ζ 신호 전달 도메인은 상기 내인성 CD247 유전자 자리의 상기 개방형 해독틀 또는 이의 부분 서열에 의해 암호화되고, 선택적으로 상기 CD3ζ 신호 전달 도메인은 상기 내인성 CD247 유전자 자리의 상기 개방형 해독틀의 적어도 엑손 2의 일부 및 엑손 3-8을 포함하는 뉴클레오타이드의 서열; 또는 상기 내인성 CD247 유전자 자리의 상기 개방형 해독틀의 엑손 1을 포함하지 않고/거나, 엑손 1의 전장을 포함하지 않고/거나 엑손 2의 전장을 포함하지 않는 뉴클레오타이드의 서열에 의해 암호화되는 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 암호화된 키메라 수용체는 상기 CD3ζ 신호 전달 도메인을 통해 신호 전달을 할 수 있는 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 암호화된 CD3ζ 신호 전달 도메인은 서열 번호: 13-15 중 어느 하나에서 선택된 서열, 또는 서열 번호: 13-15 중 어느 하나에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 동일성을 나타내는 서열, 또는 이의 단편을 포함하는 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 키메라 수용체는 키메라 항원 수용체(CAR)인 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 키메라 수용체는 결합 도메인을 포함하는 세포외 영역, 막관통 도메인 및 세포내 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 결합 도메인은 항체 또는 이의 항원 결합 단편이거나 이를 포함하는 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포.
  17. 제15항 또는 제16항에 있어서,
    상기 결합 도메인은 질병, 장애 또는 병태의 세포 또는 조직과 관련된, 이에 특이적인 및/또는 이에서 발현되는 표적 항원에 결합할 수 있고, 선택적으로 상기 표적 항원은 종양 항원인 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포.
  18. 제17항에 있어서,
    상기 표적 항원은 αvβ6 인테그린(avb6 integrin), B 세포 성숙 항원(BCMA), B7-H3, B7-H6, 탄산 탈수 효소 9(CA9, CAIX 또는 G250으로도 공지), 암 고환 항원, 암/고환 항원 1B(CTAG, NY-ESO-1 및 LAGE-2로도 공지), 암배아 항원(CEA), 사이클린, 사이클린 A2, C-C 모티프 케모카인 리간드 1(CCL-1), CD19, CD20, CD22, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD123, CD133, CD138, CD171, 콘드로이틴 황산염 프로테오글리칸 4(chondroitin sulfate proteoglycan 4, CSPG4), 표피 성장 인자 단백질(EGFR), 타입 III 표피 성장 인자 수용체 돌연변이(EGFR vIII), 상피 당단백질 2(EPG-2), 상피 당단백질 40(EPG-40), 에프린B2, 에프린 수용체 A2(EPHa2), 에스트로겐 수용체, Fc 수용체 유사 5(FCRL5; Fc 수용체 동족체 5 또는 FCRH5로도 공지), 태아 아세틸콜린 수용체(태아 AchR), 엽산 결합 단백질(FBP), 엽산 수용체 알파, 강글리오사이드 GD2, O-아세틸화 GD2(OGD2), 강글리오사이드 GD3, 당단백질 100(gp100), 글리피칸-3(GPC3), G 단백질 결합 수용체 C 클래스 5 그룹 D 멤버(GPRC5D), Her2/neu(수용체 티로신 키나아제 erb-B2), Her3(erb-B3), Her4(erb-B4), erbB 이량체, 인간 고분자량 흑색종 관련 항원(HMW-MAA), B형 간염 표면 항원, 인간 백혈구 항원 A1(HLA-A1), 인간 백혈구 항원 A2(HLA-A2), IL-22 수용체 알파(IL-22Rα), IL-13 수용체 알파 2(IL-13Rα2), 키나아제 삽입 도메인 수용체(kinase insert domain receptor, kdr), 카파 경쇄, L1 세포 부착 분자(L1-CAM), L1-CAM의 CE7 에피토프, 패밀리 8 A 멤버를 함유하는 류신 풍부 반복(Leucine Rich Repeat Containing 8 Family Member A, LRRC8A), 루이스 Y, 흑색종 관련 항원(MAGE)-A1, MAGE-A3, MAGE-A6, MAGE-A10, 메소텔린(MSLN), c-Met, 뮤린 시토메갈로 바이러스(CMV), 뮤신 1(MUC1), MUC16, 자연 살생 2 그룹 D 멤버(NKG2D) 리간드, 멜란 A (MART-1), 신경 세포 부착 분자(NCAM), 종양태아성 항원, 흑색종 우선 발현 항원(PRAME), 프로게스테론 수용체, 전립선 특이적 항원, 전립선 줄기 세포 항원(PSCA), 전립선 특이적 막 항원(PSMA), 수용체 티로신 키나아제 유사 희귀 수용체 1(ROR1), 서바이빈(survivin), 영양막 당단백질(TPBG, 5T4로도 공지), 종양 관련 당단백질 72(TAG72), 티로시나아제 관련 단백질 1(TRP1, TYRP1 또는 gp75로도 공지), 티로시나아제 관련 단백질 2(TRP2, 도파크롬 타우토메라제, 도파크롬 델타 이성화 효소 또는 DCT로도 공지), 혈관 내피 성장 인자 수용체 2(VEGFR2), 빌름스 종양 1(WT-1), 병원체 특이적 또는 병원체 발현 항원 또는 보편적 표지(universal tag) 관련 항원 및/또는 비오티닐화 분자 및/또는 HIV, HCV, HBV 또는 다른 병원체에 의해 발현된 분자 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포.
  19. 제15항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 세포외 영역은 스페이서를 포함하고, 선택적으로 상기 스페이서는 상기 결합 도메인 및 상기 막관통 도메인 사이에 작동 가능하게 연결되는 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포.
  20. 제19항에 있어서,
    상기 스페이서는 면역글로불린 힌지 영역 및/또는 CH2 영역 및 CH3 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 세포내 영역은 하나 이상의 공자극 신호 전달 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포.
  22. 제21항에 있어서,
    상기 하나 이상의 공자극 신호 전달 도메인은 CD28, 4-1BB 또는 ICOS 또는 이들의 신호 전달 부분의 세포내 신호 전달 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포.
  23. 제2항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 전이 유전자 서열은 순서대로: 결합 도메인, 선택적으로 단일 사슬 Fv 단편(scFv); 선택적으로 인간 면역글로불린 힌지의, 선택적으로 IgG1, IgG2 또는 IgG4 또는 이의 변형된 버전의 서열을 포함하고, 선택적으로 CH2 영역 및/또는 CH3 영역을 더 포함하는, 스페이서; 선택적으로 인간 CD28의, 막관통 도메인; 선택적으로 인간 4-1BB의, 공자극 신호 전달 도메인을 포함하는 세포내 영역;을 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열을 포함하고/거나;
    상기 변형된 CD247 유전자 자리는 순서대로: 결합 도메인, 선택적으로 scFv; 선택적으로 인간 면역글로불린 힌지의, 선택적으로 IgG1, IgG2 또는 IgG4 또는 이의 변형된 버전의 서열을 포함하고, 선택적으로 CH2 영역 및/또는 CH3 영역을 더 포함하는, 스페이서; 선택적으로 인간 CD28의, 막관통 도메인; 선택적으로 인간 4-1BB의, 공자극 신호 전달 도메인을 포함하는 세포내 영역; 상기 CD3ζ 신호 전달 도메인;을 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포.
  24. 제2항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 전이 유전자 서열은 적어도 하나의 추가 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포.
  25. 제24항에 있어서,
    상기 적어도 하나의 추가 단백질은 대리 표지자이고, 선택적으로 상기 대리 표지자는 절단형 수용체이고, 선택적으로 상기 절단형 수용체는 세포내 신호 전달 도메인이 결여되어 있고/있거나 그의 리간드에 의해 결합될 때 세포내 신호 전달을 매개할 수 없는 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포.
  26. 제2항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 전이 유전자 서열은 하나 이상의 다중 시스트론 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포.
  27. 제26항에 있어서,
    상기 전이 유전자 서열은 상기 키메라 수용체의 일부를 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열을 포함하고, 상기 하나 이상의 다중 시스트론 요소는 상기 키메라 수용체의 일부를 암호화하는 상기 뉴클레오타이드 서열의 상단부에 위치하고/거나; 상기 키메라 수용체의 일부를 암호화하는 상기 뉴클레오타이드 서열과 상기 적어도 하나의 추가 단백질을 암호화하는 상기 뉴클레오타이드의 서열 사이에 위치하고/거나;
    상기 키메라 수용체는 다중 사슬 CAR인 CAR이고 상기 하나 이상의 다중 시스트론 요소는 상기 다중 사슬 CAR의 한 사슬을 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열과 상기 다중 사슬 CAR의 다른 한 사슬을 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열 사이에 위치하는 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포.
  28. 제26항 또는 제27항에 있어서,
    상기 하나 이상의 다중 시스트론 요소는 리보솜 스킵 서열이거나 이를 포함하고, 선택적으로 상기 리보솜 스킵 서열은 T2A, P2A, E2A 또는 F2A 요소인 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 변형된 CD247 유전자 자리는 상기 키메라 수용체를 암호화하는 상기 핵산 서열의 발현을 제어하도록 작동 가능하게 연결된 상기 내인성 CD247 유전자 자리의 프로모터 및/또는 조절 또는 제어 요소를 포함하거나; 상기 변형된 CD247 유전자 자리는 상기 키메라 수용체 또는 이의 일부의 발현을 제어하도록 작동 가능하게 연결된 하나 이상의 이종성 조절 또는 제어 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 T 세포는 대상체로부터 수득된 1차 T 세포이고, 선택적으로 상기 대상체는 인간인 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포.
  31. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 T 세포는 CD8+ T 세포 또는 이의 아형, 또는 CD4+ T 세포 또는 이의 아형인 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포.
  32. 폴리뉴클레오타이드로서,
    (a) 키메라 수용체 또는 이의 일부를 암호화하는 핵산 서열; 및
    (b) 상기 핵산 서열에 연결된 하나 이상의 상동성 암 - 상기 하나 이상의 상동성 암은 CD247 유전자 자리의 개방형 해독틀 또는 이의 부분 서열의 하나 이상의 영역에 대해 상동성인 서열을 포함함 - 을 포함하는 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오타이드.
  33. 제32항에 있어서,
    상기 (a)의 핵산 서열은 키메라 수용체의 일부를 암호화하고, 상기 핵산 서열에 의해 암호화된 상기 키메라 수용체의 일부는 결합 도메인을 포함하는 세포외 영역 및 막관통 도메인을 포함하고, 세포내 영역의 전체 CD3제타(CD3ζ) 신호 전달 도메인을 포함하지 않는 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오타이드.
  34. 폴리뉴클레오타이드로서,
    (a) 키메라 수용체의 일부를 암호화하는 핵산 서열 - 상기 키메라 수용체는 CD3제타(CD3ζ) 신호 전달 도메인을 포함하는 세포내 영역을 포함하고, 상기 핵산 서열에 의해 암호화된 상기 키메라 수용체의 일부는 결합 도메인을 포함하는 세포외 영역 및 막관통 도메인을 포함하고, 세포내 영역의 전체 CD3제타(CD3ζ) 신호 전달 도메인을 포함하지 않음 -; 및
    (b) 상기 핵산 서열에 연결된 하나 이상의 상동성 암 - 상기 하나 이상의 상동성 암은 CD247 유전자 자리의 개방형 해독틀 또는 이의 부분 서열의 하나 이상의 영역에 대해 상동성인 서열을 포함함 - 을 포함하는 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오타이드.
  35. 제32항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 (a)의 핵산 서열은 T 세포, 선택적으로 인간 T 세포의 내인성 게놈 CD247 유전자 자리의 개방형 해독틀에 외인성이거나 이종성인 서열인 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오타이드.
  36. 제32항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 개방형 해독틀 또는 이의 부분 서열은 T 세포, 선택적으로 인간 T 세포의 상기 내인성 CD247 유전자 자리의 적어도 하나의 인트론 및 적어도 하나의 엑손 및/또는 3’ UTR을 포함하는 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오타이드.
  37. 제32항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 CD3ζ 신호 전달 도메인의 적어도 단편, 선택적으로 전체 CD3ζ 신호 전달 도메인은, 키메라 수용체가 상기 폴리뉴클레오타이드가 도입된 세포로부터 발현될 때, 상기 내인성 CD247 유전자 자리의 상기 개방형 해독틀 또는 이의 부분 서열에 의해 암호화되는 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오타이드.
  38. 제32항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 (a)의 핵산 서열은 상기 CD3ζ 신호 전달 도메인의 단편을 암호화하는 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 폴리뉴클레오타이드.
  39. 제32항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 (a)의 핵산 서열은 상기 CD3ζ 신호 전달 도메인을 암호화하지 않는 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오타이드.
  40. 제32항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 (a)의 핵산 서열은 3’ UTR을 암호화하는 서열을 포함하지 않고/거나; 인트론을 포함하지 않는 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오타이드.
  41. 제32항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 (a)의 핵산 서열은 상기 하나 이상의 상동성 암에 포함된 상기 CD247 유전자 자리의 상기 개방형 해독틀 또는 이의 부분 서열의 하나 이상의 엑손과 틀 내에 있는 뉴클레오타이드의 서열을 포함하고; 상기 개방형 해독틀의 상기 하나 이상의 영역은 상기 CD247 유전자 자리의 상기 개방형 해독틀의 엑손 8의 상단부에 있는 서열; 상기 CD247 유전자 자리의 상기 개방형 해독틀의 엑손 3의 상단부에 있는 서열, 선택적으로 상기 CD247 유전자 자리의 상기 개방형 해독틀의 엑손 3을 포함하는 서열; 및/또는 상기 CD247 유전자 자리의 상기 개방형 해독틀의 엑손 2의 적어도 일부를 포함하는 서열이거나 이를 포함하는 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오타이드.
  42. 제32항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 하나 이상의 상동성 암은, 상기 내인성 CD247 유전자 자리의 상기 개방형 해독틀의 엑손 1을 포함하지 않고/거나, 엑손 1의 전장을 포함하지 않고/거나 엑손 2의 전장을 포함하지 않는 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오타이드.
  43. 제32항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 폴리뉴클레오타이드가 도입된 세포에 의해 발현될 때, 상기 키메라 수용체는 상기 CD3ζ 신호 전달 도메인을 통해 신호 전달을 할 수 있는 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오타이드.
  44. 제33항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 전체 CD3ζ 신호 전달 도메인은 서열 번호: 13-15 중 어느 하나에서 선택된 서열, 또는 서열 번호: 13-15 중 어느 하나에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 동일성을 나타내는 서열, 또는 이의 단편을 포함하는 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오타이드.
  45. 제32항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 하나 이상의 상동성 암은 5’ 상동성 암 및 3’ 상동성 암을 포함하고 상기 폴리뉴클레오타이드는 [5’ 상동성 암]-[(a)의 핵산 서열]-[3’ 상동성 암] 구조를 포함하는 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오타이드.
  46. 제32항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 5’ 상동성 암 및 상기 3’ 상동성 암은 독립적으로 (약) 200, 300, 400, 500, 600, 700 또는 800개 뉴클레오타이드 길이, 또는 전술한 임의의 수치 사이의 임의의 수치 길이; 또는 (약) 300개 뉴클레오타이드 길이, 선택적으로 (약) 400, 500 또는 600개 뉴클레오타이드 길이 또는 전술한 임의의 수치 사이의 임의의 수치 길이인 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오타이드.
  47. 제32항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 5’ 상동성 암은 서열 번호: 80에 제시된 서열 또는 서열 번호: 80에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 동일성을 나타내는 서열 또는 이의 부분 서열을 포함하고/거나; 상기 3’ 상동성 암은 서열 번호: 81에 제시된 서열 또는 서열 번호: 81에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 동일성을 나타내는 서열 또는 이의 부분 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오타이드.
  48. 제32항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 키메라 수용체는 키메라 항원 수용체(CAR)인 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오타이드.
  49. 제33항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 결합 도메인은 항체 또는 이의 항원 결합 단편이거나 이를 포함하는 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오타이드.
  50. 제33항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 결합 도메인은 질병, 장애 또는 병태의 세포 또는 조직과 관련된, 이에 특이적인 및/또는 이에서 발현되는 표적 항원에 결합할 수 있고, 선택적으로 상기 표적 항원은 종양 항원인 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오타이드.
  51. 제50항에 있어서,
    상기 표적 항원은 αvβ6 인테그린(avb6 integrin), B 세포 성숙 항원(BCMA), B7-H3, B7-H6, 탄산 탈수 효소 9(CA9, CAIX 또는 G250으로도 공지), 암 고환 항원, 암/고환 항원 1B(CTAG, NY-ESO-1 및 LAGE-2로도 공지), 암배아 항원(CEA), 사이클린, 사이클린 A2, C-C 모티프 케모카인 리간드 1(CCL-1), CD19, CD20, CD22, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD123, CD133, CD138, CD171, 콘드로이틴 황산염 프로테오글리칸 4(chondroitin sulfate proteoglycan 4, CSPG4), 표피 성장 인자 단백질(EGFR), 타입 III 표피 성장 인자 수용체 돌연변이(EGFR vIII), 상피 당단백질 2(EPG-2), 상피 당단백질 40(EPG-40), 에프린B2, 에프린 수용체 A2(EPHa2), 에스트로겐 수용체, Fc 수용체 유사 5(FCRL5; Fc 수용체 동족체 5 또는 FCRH5로도 공지), 태아 아세틸콜린 수용체(태아 AchR), 엽산 결합 단백질(FBP), 엽산 수용체 알파, 강글리오사이드 GD2, O-아세틸화 GD2(OGD2), 강글리오사이드 GD3, 당단백질 100(gp100), 글리피칸-3(GPC3), G 단백질 결합 수용체 C 클래스 5 그룹 D 멤버(GPRC5D), Her2/neu(수용체 티로신 키나아제 erb-B2), Her3(erb-B3), Her4(erb-B4), erbB 이량체, 인간 고분자량 흑색종 관련 항원(HMW-MAA), B형 간염 표면 항원, 인간 백혈구 항원 A1(HLA-A1), 인간 백혈구 항원 A2(HLA-A2), IL-22 수용체 알파(IL-22Rα), IL-13 수용체 알파 2(IL-13Rα2), 키나아제 삽입 도메인 수용체(kinase insert domain receptor, kdr), 카파 경쇄, L1 세포 부착 분자(L1-CAM), L1-CAM의 CE7 에피토프, 패밀리 8 A 멤버를 함유하는 류신 풍부 반복(Leucine Rich Repeat Containing 8 Family Member A, LRRC8A), 루이스 Y, 흑색종 관련 항원(MAGE)-A1, MAGE-A3, MAGE-A6, MAGE-A10, 메소텔린(MSLN), c-Met, 뮤린 시토메갈로 바이러스(CMV), 뮤신 1(MUC1), MUC16, 자연 살생 2 그룹 D 멤버(NKG2D) 리간드, 멜란 A (MART-1), 신경 세포 부착 분자(NCAM), 종양태아성 항원, 흑색종 우선 발현 항원(PRAME), 프로게스테론 수용체, 전립선 특이적 항원, 전립선 줄기 세포 항원(PSCA), 전립선 특이적 막 항원(PSMA), 수용체 티로신 키나아제 유사 희귀 수용체 1(ROR1), 서바이빈(survivin), 영양막 당단백질(TPBG, 5T4로도 공지), 종양 관련 당단백질 72(TAG72), 티로시나아제 관련 단백질 1(TRP1, TYRP1 또는 gp75로도 공지), 티로시나아제 관련 단백질 2(TRP2, 도파크롬 타우토메라제, 도파크롬 델타 이성화 효소 또는 DCT로도 공지), 혈관 내피 성장 인자 수용체 2(VEGFR2), 빌름스 종양 1(WT-1), 병원체 특이적 또는 병원체 발현 항원 또는 보편적 표지(universal tag) 관련 항원 및/또는 비오티닐화 분자 및/또는 HIV, HCV, HBV 또는 다른 병원체에 의해 발현된 분자 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오타이드.
  52. 제33항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 세포외 영역은 스페이서를 포함하고, 선택적으로 상기 스페이서는 상기 결합 도메인 및 상기 막관통 도메인 사이에 작동 가능하게 연결되는 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오타이드.
  53. 제52항에 있어서,
    상기 스페이서는 면역글로불린 힌지 영역 및/또는 CH2 영역 및 CH3 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오타이드.
  54. 제33항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 세포내 영역은 하나 이상의 공자극 신호 전달 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오타이드.
  55. 제54항에 있어서,
    상기 하나 이상의 공자극 신호 전달 도메인은 CD28, 4-1BB 또는 ICOS 또는 이들의 신호 전달 부분의 세포내 신호 전달 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오타이드.
  56. 제32항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 (a)의 핵산 서열은 순서대로: 결합 도메인, 선택적으로 단일 사슬 Fv 단편(scFv); 선택적으로 인간 면역글로불린 힌지의, 선택적으로 IgG1, IgG2 또는 IgG4 또는 이의 변형된 버전의 서열을 포함하고, 선택적으로 CH2 영역 및/또는 CH3 영역을 더 포함하는, 스페이서; 선택적으로 인간 CD28의, 막관통 도메인; 선택적으로 인간 4-1BB의, 공자극 신호 전달 도메인을 포함하는 세포내 영역;을 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오타이드.
  57. 제32항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 (a)의 핵산 서열은 적어도 하나의 추가 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오타이드.
  58. 제57항에 있어서,
    상기 적어도 하나의 추가 단백질은 대리 표지자이고, 선택적으로 상기 대리 표지자는 절단형 수용체이고, 선택적으로 상기 절단형 수용체는 세포내 신호 전달 도메인이 결여되어 있고/있거나 그의 리간드에 의해 결합될 때 세포내 신호 전달을 매개할 수 없는 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오타이드.
  59. 제32항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 (a)의 핵산 서열은 하나 이상의 다중 시스트론 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오타이드.
  60. 제59항에 있어서,
    상기 (a)의 핵산 서열은 상기 키메라 수용체의 일부를 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열을 포함하고, 상기 하나 이상의 다중 시스트론 요소는 상기 키메라 수용체의 일부를 암호화하는 상기 뉴클레오타이드 서열의 상단부에 위치하고/거나; 상기 키메라 수용체의 일부를 암호화하는 상기 뉴클레오타이드 서열과 상기 적어도 하나의 추가 단백질을 암호화하는 상기 뉴클레오타이드의 서열 사이에 위치하고/거나;
    상기 키메라 수용체는 다중 사슬 CAR인 CAR이고 상기 하나 이상의 다중 시스트론 요소는 상기 다중 사슬 CAR의 한 사슬을 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열과 상기 다중 사슬 CAR의 다른 한 사슬을 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열 사이에 위치하는 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오타이드.
  61. 제59항 또는 제60항에 있어서,
    상기 하나 이상의 다중 시스트론 요소는 리보솜 스킵 서열이거나 이를 포함하고, 선택적으로 상기 리보솜 스킵 서열은 T2A, P2A, E2A 또는 F2A 요소인 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오타이드.
  62. 제32항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 (a)의 핵산 서열은 상기 키메라 수용체 또는 이의 일부의 발현을 제어하도록 작동 가능하게 연결된 하나 이상의 이종성 조절 또는 제어 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오타이드.
  63. 제32항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 폴리뉴클레오타이드는 바이러스 벡터에 포함된 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오타이드.
  64. 제63항에 있어서,
    상기 바이러스 벡터는 AAV 벡터이고, 선택적으로 상기 AAV 벡터는 AAV2 또는 AAV6 벡터인 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오타이드.
  65. 제63항에 있어서,
    상기 바이러스 벡터는 레트로바이러스 벡터, 선택적으로 렌티바이러스 벡터인 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오타이드.
  66. 제32항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 폴리뉴클레오타이드는 선형 폴리뉴클레오타이드, 선택적으로 이중 가닥 폴리뉴클레오타이드 또는 단일 가닥 폴리뉴클레오타이드인, 폴리뉴클레오타이드.
  67. 제32항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 폴리뉴클레오타이드는 (약) 2500 내지 (약) 5000개 뉴클레오타이드, (약) 3500 내지 (약) 4500개 뉴클레오타이드 또는 (약) 3750개 뉴클레오타이드 내지 (약) 4250개 뉴클레오타이드 길이인 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오타이드.　
  68. 유전자 조작된 T 세포를 생산하는 방법에 있어서,
    상기 방법은 제32항 내지 67항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오타이드를 CD247 유전자 자리에 유전자 파괴를 포함하는 T 세포 내로 도입하는 단계를 포함하는, 유전자 조작된 T 세포를 생산하는 방법.
  69. 유전자 조작된 T 세포를 생산하는 방법에 있어서,
    상기 방법은:
    (a) T 세포 내로, 상기 T 세포의 내인성 CD247 유전자 자리 내의 표적 부위에 유전자 파괴를 유도할 수 있는 하나 이상의 제제를 도입하는 단계; 및
    (b) 제32항 내지 제67항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오타이드를 CD247 유전자 자리에 유전자 파괴를 포함하는 T 세포 내로 도입하는 단계를 포함하는, 유전자 조작된 T 세포를 생산하는 방법.
  70. 제68항 또는 제69항에 있어서,
    상기 키메라 수용체 또는 이의 일부를 암호화하는 상기 핵산 서열은 상동 직접 수선(HDR)을 통해 상기 내인성 CD247 유전자 자리 내에서 통합되는 것을 특징으로 하는, 방법.
  71. 유전자 조작된 T 세포를 생산하는 방법에 있어서,
    상기 방법은 T 세포 내로 키메라 수용체 또는 이의 일부를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 도입하는 단계를 포함하고, 상기 T 세포는 상기 T 세포의 CD247 유전자 자리 내에 유전자 파괴를 가지며, 상기 키메라 수용체 또는 이의 일부를 암호화하는 상기 핵산 서열은 상동 직접 수선(HDR)을 통해 상기 내인성 CD247 유전자 자리 내에서 통합되는 것을 특징으로 하는, 유전자 조작된 T 세포를 생산하는 방법.
  72. 제68항, 제70항 및 제71항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 유전자 파괴는 T 세포 내로, 상기 T 세포의 내인성 CD247 유전자 자리 내의 표적 부위에 유전자 파괴를 유도할 수 있는 하나 이상의 제제를 도입하여 수행되는 것을 특징으로 하는, 방법.
  73. 제68항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 방법은 변형된 CD247 유전자 자리를 생산하고, 상기 변형된 CD247 유전자 자리는 CD3ζ 신호 전달 도메인을 포함하는 세포내 영역을 포함하는 키메라 수용체를 암호화하는 핵산 서열을 포함하고, 상기 CD3ζ 신호 전달 도메인의 적어도 단편은 상기 내인성 CD247 유전자 자리의 상기 개방형 해독틀에 의해 암호화되는 것을 특징으로 하는, 방법.
  74. 제71항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 폴리뉴클레오타이드는 상기 핵산 서열에 연결된 하나 이상의 상동성 암을 포함하되, 상기 하나 이상의 상동성 암은 CD247 유전자 자리의 개방형 해독틀의 하나 이상의 영역에 대해 상동성인 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  75. 제71항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 키메라 수용체 또는 이의 일부를 암호화하는 상기 핵산 서열은 3’ UTR을 암호화하는 서열을 포함하지 않고/거나 인트론을 포함하지 않는 것을 특징으로 하는, 방법.
  76. 제73항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 폴리뉴클레오타이드가 도입된 세포에 의해 발현될 때, 상기 키메라 수용체는 상기 CD3ζ 신호 전달 도메인을 통해 신호 전달을 할 수 있는 것을 특징으로 하는, 방법.
  77. 제73항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 암호화된 CD3ζ 신호 전달 도메인은 서열 번호: 13-15 중 어느 하나에서 선택된 서열, 또는 서열 번호: 13-15 중 어느 하나에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 동일성을 나타내는 서열, 또는 이의 단편을 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  78. 제74항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 하나 이상의 상동성 암은 5’ 상동성 암 및 3’ 상동성 암을 포함하고, 상기 폴리뉴클레오타이드는 [5’ 상동성 암]-[키메라 수용체 또는 이의 일부를 암호화하는 핵산 서열]-[3’ 상동성 암] 구조를 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  79. 제69항 및 제72항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서,
    유전자 파괴를 유도할 수 있는 상기 하나 이상의 제제는 상기 표적 부위에 특이적으로 결합하거나 혼성화하는 DNA 결합 단백질 또는 DNA 결합 핵산, DNA-표적화 단백질 및 뉴클레아제를 포함하는 융합 단백질, 또는 RNA-가이드 뉴클레아제를 포함하고, 선택적으로 상기 하나 이상의 제제는 징크 핑거 뉴클레아제(ZFN), TAL-효과기 뉴클레아제(TALEN), 또는 상기 표적 부위에 특이적으로 결합하거나, 이를 인식하거나 이에 혼성화하는 CRISPR-Cas9 조합물을 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  80. 제69항 및 제72항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 하나 이상의 제제 각각은 상기 적어도 하나의 표적 부위에 상보적인 표적화 도메인을 갖는 가이드 RNA(gRNA)를 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  81. 제80항에 있어서,
    상기 하나 이상의 제제는 상기 gRNA 및 Cas9 단백질을 포함하는 리보핵산단백질(RNP) 복합체로서 도입되고, 선택적으로 상기 RNP는 전기 천공법, 입자 총, 인산칼슘 형질주입, 세포 압축 또는 압착을 통해, 선택적으로 전기 천공법을 통해 도입되는 것을 특징으로 하는, 방법.
  82. 제81항에 있어서,
    상기 RNP의 농도는 (약) 1, 2, 2.5, 5, 10, 20, 25, 30, 40 또는 50μM이거나, 전술한 수치 중 임의의 2개에 의해 정의되는 범위이고, 선택적으로 상기 RNP의 농도는 (약) 25μM인 것을 특징으로 하는, 방법.
  83. 제80항 내지 제82항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 RNP 내 상기 gRNA 및 상기 Cas9 분자의 몰 비율은 (약) 5:1, 4:1, 3:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:3, 1:4 또는 1:5이거나, 전술한 수치 중 임의의 2개에 의해 정의되는 범위이고, 선택적으로 상기 RNP 내 상기 gRNA 및 상기 Cas9 분자의 몰 비율은 (약) 2.6:1인 것을 특징으로 하는, 방법.
  84. 제80항 내지 제83항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 gRNA는 CACCUUCACUCUCAGGAACA(서열 번호: 87); GAAUGACACCAUAGAUGAAG(서열 번호:88); UGAAGAGGAUUCCAUCCAGC(서열 번호:89); 및 UCCAGCAGGUAGCAGAGUUU(서열 번호:90)에서 선택된 표적화 도메인 서열을 갖는 것을 특징으로 하는, 방법.
  85. 제80항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 gRNA는 CACCUUCACUCUCAGGAACA(서열 번호: 87)의 표적화 도메인 서열을 갖는 것을 특징으로 하는, 방법.
  86. 제80항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 gRNA는 UGAAGAGGAUUCCAUCCAGC(서열 번호: 89)의 표적화 도메인 서열을 갖는 것을 특징으로 하는, 방법
  87. 제68항 내지 제86항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 T 세포는 대상체로부터 수득된 1차 T 세포이고, 선택적으로 상기 대상체는 인간인 것을 특징으로 하는, 방법.
  88. 제68항 내지 제87항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 T 세포는 CD8+ T 세포 또는 이의 아형, 또는 CD4+ T 세포 또는 이의 아형인 것을 특징으로 하는, 방법.
  89. 제68항 내지 제88항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 폴리뉴클레오타이드는 바이러스 벡터에 포함된 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오타이드.
  90. 제89항에 있어서,
    상기 바이러스 벡터는 AAV 벡터이고, 선택적으로 상기 AAV 벡터는 AAV2 또는 AAV6 벡터인 것을 특징으로 하는, 방법.
  91. 제89항에 있어서,
    상기 바이러스 벡터는 레트로바이러스 벡터, 선택적으로 렌티바이러스 벡터인 것을 특징으로 하는, 방법.
  92. 제68항 내지 제88항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 폴리뉴클레오타이드는 선형 폴리뉴클레오타이드, 선택적으로 이중 가닥 폴리뉴클레오타이드 또는 단일 가닥 폴리뉴클레오타이드인 것을 특징으로 하는, 방법.
  93. 제69항 및 제72항 내지 제92항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 폴리뉴클레오타이드는 상기 하나 이상의 제제의 도입 후에 도입되는 것을 특징으로 하는, 방법.
  94. 제93항에 있어서,
    상기 폴리뉴클레오타이드는 상기 제제의 도입 후 약 30초, 1분, 2분, 3분, 4분, 5분, 6분, 7분, 8분, 9분, 10분, 15분, 20분, 30분, 40분, 50분, 60분, 90분, 2시간, 3시간 또는 4시간 직후 또는 이내에 도입되는 것을 특징으로 하는, 방법.
  95. 제69항 및 제72항 내지 제94항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 하나 이상의 제제의 도입 전에, 상기 방법은 상기 세포를 하나 이상의 자극제와 시험관 내에서 하나 이상의 면역 세포를 자극 또는 활성화하기 위한 조건 하에서 인큐베이션하는 단계를 포함하고, 선택적으로 상기 하나 이상의 자극제는 항-CD3 및/또는 항-CD28 항체를, 선택적으로 항-CD3/항-CD28 비드를 포함하고, 선택적으로 상기 비드 대 세포 비율은 (약) 1:1인 것을 특징으로 하는, 방법.
  96. 제69항 및 제72항 내지 제95항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 방법은 상기 하나 이상의 제제의 도입 및/또는 상기 폴리뉴클레오타이드와 하나 이상의 재조합 사이토카인의 도입 전, 도중 또는 이후에 상기 세포를 인큐베이션하는 단계를 더 포함하고, 선택적으로 상기 하나 이상의 재조합 사이토카인은 IL-2, IL-7, 및 IL-15로 구성된 군에서 선택되고, 선택적으로 상기 하나 이상의 재조합 사이토카인은 (약) 10U/mL 내지 (약) 200U/mL, 선택적으로 (약) 50U/mL 내지 (약) 100U/mL 농도의 IL-2; 0.5ng/mL 내지 50ng/mL, 선택적으로 (약) 5ng/mL 내지 (약) 10ng/mL 농도의 IL-7 및/또는 0.1ng/mL 내지 20ng/mL, 선택적으로 (약) 0.5ng/mL 내지 (약) 5ng/mL 농도의 IL-15에서 선택된 농도로 첨가되는 것을 특징으로 하는, 방법.
  97. 제95항 또는 제96항에 있어서,
    상기 인큐베이션은 상기 하나 이상의 제제의 도입 및 상기 폴리뉴클레오타이드의 도입 후에 최대 또는 약 24시간, 36시간, 48시간, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 또는 21일, 선택적으로 최대 또는 약 7일 동안 수행되는 것을 특징으로 하는, 방법.
  98. 제68항 내지 제97항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 방법에 의해 생성된 복수의 조작된 세포에서 세포의 적어도 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 또는 90% 이상은 CD247 유전자 자리 내 적어도 하나의 표적 부위의 유전자 파괴를 포함하고/거나; 상기 방법에 의해 생성된 복수의 조작된 세포에서 세포의 적어도 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 또는 90% 이상은 상기 키메라 수용체를 발현하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  99. 제68항 내지 제98항 중 어느 한 항의 방법을 사용하여 생성된 유전자 조작된 T 세포 또는 복수의 유전자 조작된 T 세포.
  100. 제1항 내지 제31항 및 제99항 중 어느 한 항의 유전자 조작된 T 세포; 또는 제1항 내지 제31항 및 제99항 중 어느 한 항의 복수의 유전자 조작된 T 세포를 포함하는, 조성물.
  101. 제100항에 있어서,
    상기 조성물은 CD4+ T 세포 및/또는 CD8+ T 세포를 포함하는, 조성물.
  102. 제101항에 있어서,
    상기 조성물은 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포를 포함하고 CD4+ T 세포 대 CD8+ T 세포의 비율은 (약) 1:3 내지 3:1, 선택적으로 1:1인 것을 특징으로 하는, 조성물.
  103. 제100항 내지 제102항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 키메라 수용체를 발현하는 세포는 상기 조성물 내 총 세포 또는 상기 조성물 내 총 CD4+ 세포 또는 CD8+ 세포의 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상을 구성하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  104. 질병 또는 장애가 있는 대상체에 제1항 내지 제31항 및 제100항 내지 제103항 중 어느 한 항의 유전자 조작된 T 세포, 복수의 유전자 조작된 T 세포 또는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 치료 방법.
  105. 질병 또는 장애의 치료를 위한 제1항 내지 제31항 및 제100항 내지 제103항 중 어느 한 항의 유전자 조작된 T 세포, 복수의 유전자 조작된 T 세포 또는 조성물의 용도.
  106. 질병 또는 장애를 치료하기 위한 약제의 제조에서 제1항 내지 제31항 및 제100항 내지 제103항 중 어느 한 항의 유전자 조작된 T 세포, 복수의 유전자 조작된 T 세포 또는 조성물의 용도.
  107. 질병 또는 장애의 치료에 사용하기 위한 제1항 내지 제31항 및 제100항 내지 제103항 중 어느 한 항의 유전자 조작된 T 세포, 복수의 유전자 조작된 T 세포 또는 조성물.
  108. 제104항 내지 제107항 중 어느 한 항의 사용을 위한 방법, 용도 또는 조작된 세포, 복수의 조작된 세포 또는 조성물에 있어서,
    상기 질병 또는 장애는 암 또는 종양인 것을 특징으로 하는, 사용을 위한 방법, 용도, 또는 조작된 세포, 복수의 조작된 세포 또는 조성물.
  109. 제108항에 있어서,
    상기 암 또는 상기 종양은 혈액성 악성 종양, 선택적으로 림프종, 백혈병 또는 형질 세포 악성 종양인 것을 특징으로 하는, 사용을 위한 방법, 용도, 또는 조작된 세포, 복수의 조작된 세포 또는 조성물.
  110. 제108항에 있어서,
    상기 암 또는 상기 종양은 고형 종양이고, 선택적으로 상기 고형 종양은 비-소세포폐암(NSCLC) 또는 두경부 편평세포암종(HNSCC)인 것을 특징으로 하는, 사용을 위한 방법, 용도, 또는 조작된 세포, 복수의 조작된 세포 또는 조성물.
  111. 키트로서,
    CD247 유전자 자리 내의 표적 부위에 유전자 파괴를 유도할 수 있는 하나 이상의 제제; 및
    제32항 내지 제67항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 키트.
  112. 키트로서,
    CD247 유전자 자리 내의 표적 부위에 유전자 파괴를 유도할 수 있는 하나 이상의 제제; 및
    키메라 수용체 또는 이의 일부를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 - 상기 키메라 수용체 또는 이의 일부를 암호화하는 상기 핵산 서열은 상동 직접 수선(HDR)을 통해 상기 표적 부위에 또는 그 근처에 통합을 위해 표적화됨 -; 및
    제68항 내지 제98항 중 어느 한 항의 방법을 실행하기 위한 사용법을 포함하는, 키트.
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