EA015584B1 - Антитело к cd38 человека и его применение - Google Patents

Антитело к cd38 человека и его применение Download PDF

Info

Publication number
EA015584B1
EA015584B1 EA200702053A EA200702053A EA015584B1 EA 015584 B1 EA015584 B1 EA 015584B1 EA 200702053 A EA200702053 A EA 200702053A EA 200702053 A EA200702053 A EA 200702053A EA 015584 B1 EA015584 B1 EA 015584B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
antibody
human
sequence
region
peptide
Prior art date
Application number
EA200702053A
Other languages
English (en)
Other versions
EA200702053A1 (ru
Inventor
Мишель де Верс
Иво Граус
Юдит Опринс
Пауль Паррен Паррен
Ян ван де Винкел
Мартин ван Вюгт
Original Assignee
Генмаб А/С
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=36617365&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=EA015584(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Генмаб А/С filed Critical Генмаб А/С
Publication of EA200702053A1 publication Critical patent/EA200702053A1/ru
Publication of EA015584B1 publication Critical patent/EA015584B1/ru

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/18—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for pancreatic disorders, e.g. pancreatic enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/0004—Screening or testing of compounds for diagnosis of disorders, assessment of conditions, e.g. renal clearance, gastric emptying, testing for diabetes, allergy, rheuma, pancreas functions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/08—Drugs for disorders of the urinary system of the prostate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A61P15/08—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives for gonadal disorders or for enhancing fertility, e.g. inducers of ovulation or of spermatogenesis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/16—Otologicals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70596—Molecules with a "CD"-designation not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2896—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against molecules with a "CD"-designation, not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/566—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using specific carrier or receptor proteins as ligand binding reagents where possible specific carrier or receptor proteins are classified with their target compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/734—Complement-dependent cytotoxicity [CDC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/77—Internalization into the cell
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/70596—Molecules with a "CD"-designation not provided for elsewhere in G01N2333/705

Abstract

Изобретение относится к антителам, которые связываются с CD38 человека, и основанным на антителах композициям и молекулам. Изобретение также касается фармацевтических композиций, включающих указанные антитела, и терапевтических и диагностических способов применения антител.

Description

Настоящее изобретение относится к антителам, связывающим СО38, которые обладают специфическими характеристиками и которые применяются для лечения ш1ег айа множественной миеломы.
Уровень техники
Множественная миелома является злокачественным перерождением В-клеток, характеризуемым латентным накоплением в костном мозге секреторных плазматических клеток с низким пролиферативным индексом и увеличенной продолжительностью жизни. Это заболевание, в конечном счете, атакует кости и костный мозг, что приводит к множественным опухолям и повсеместному повреждению всей скелетной системы.
Приблизительно 1% всех раковых заболеваний и немногим более 10% всех злокачественных гематологических заболеваний можно отнести к множественной миеломе (ММ). Частота случаев ММ возрастает в стареющей популяции, где медиана возраста постановки этого диагноза приходится приблизительно на 61 год.
Доступные в настоящее время терапии множественной миеломы включают химиотерапию, трансплантацию стволовых клеток, Τΐιαίοιηίά® (талидомид), Уе1еайе® (ботремозид), ЛтеФа® (памидронат) и ΖοιικΙα® (золедроновая кислота). В настоящее время протоколы лечения, которые включают сочетание химиотерапевтических агентов, таких как винкристин, ΒΟΝυ, мельфалан, циклофосфамид, адриамицин, и преднизон или дексаметазон, приводят к частоте полной ремиссии только около 5% и медиана выживаемости составляет приблизительно 36-48 месяцев от момента постановки диагноза. Недавние достижения при применении химиотерапии с высокими дозами с последующей трансплантацией аутологической ткани костного мозга или мононуклеарных клеток периферической крови привели к увеличению процента полной ремиссии и продолжительности ремиссии. Однако общая выживаемость только слегка увеличилась, и никаких доказательств излечения получено не было. В конечном итоге, все пациенты с ММ получают рецидив болезни даже при поддерживающей терапии интерфероном-альфа (ΙΡΝ-α) самим по себе или в сочетании со стероидами.
Эффективность доступных режимов химиотерапевтического лечения при ММ ограничена низкой скоростью пролиферации клеток и развитием множественной устойчивости к лекарствам. У более чем 90% больных ММ заболевание становится устойчивым к химиотерапии. В результате идет поиск альтернативных режимов лечения с целью разработки адоптивной иммунотерапии, направленной на поверхностные антигены на плазматических клетках.
СЭ38 является примером антигена, экспрессируемого такими злокачественными плазматическими клетками, он экспрессируется при различных злокачественных заболеваниях крови, включая, но не ограничиваясь этим, хронический лимфоцитарный лейкоз В-клеток, острый лимфоцитарный лейкоз Вклеток, макроглобулинемию Валденстрема, первичный системный амилоидоз, лимфому клеток мантии, пролимфоцитарный/миелоцитарный лейкоз, острый миелоидный лейкоз, хронический миелоидный лейкоз, фолликулярную лимфому, лейкоз ΝΚ-клеток и лейкоз плазматических клеток. Экспрессия СЭ38 описана для эпителиальных/эндотелиальных клеток различного происхождения, включая гранулярный эпителий простаты, островковые клетки поджелудочной железы, эпителий протоков в железах, включая околоушную железу, клетки бронхиального эпителия, клетки яичка и яичников и клетки опухоли аденокарциномы ободочной и прямой кишки. Заболевания, при которых может быть вовлечена экспрессия СО38, включают, но не ограничиваются этим бронхоэпителиальные карциномы легких, рак груди (развившийся из злокачественной пролиферации эпителиальной выстилки протоков и долей груди), опухоли поджелудочной железы, опухоли, развившиеся из Ь-клеток, из эпителия кишечника (например, аденокарцинома и карцинома чешуйчатых клеток). В ЦНС нейробластома экспрессирует СЭ38. Другие заболевания включают карциному простаты, семиномы яичка и рак яичника.
В норме СЭ38 экспрессируется гемопоэтическими клетками в плотных тканях. Что касается гемопоэтических клеток, основная часть медуллярных тимоцитов является СЭ38'. покоящиеся и циркулирующие Т- и В-клетки являются СО38-, активированные клетки являются СЭ38'. СЭ38 также экспрессируется у приблизительно 80% покоящихся ΝΚ клеток и моноцитов и лимфобластами центра размножения лимфатического узла, плазматическими В-клетками и некоторыми внутрифолликулярными клетками. СЭ38 может также экспрессироваться древовидными клетками. Значительная часть нормальных клеток костного мозга, в особенности клетки предшественников, экспрессируют СЭ38. К тому же 50-80% кровяных клеток пуповины является СЭ38' и остается такими в крови человека в течение первых двухтрех лет жизни. В дополнение к лимфатическим клеткам предшественника СЭ38 также экспрессируется в эритроцитах и кровяных пластинках.
Что касается твердых тканей, СЭ38 экспрессируется в кишечнике интраэпителиальными клетками и лимфоцитами 1ашша ргорпа, клетками Пуркинье и нейрофибриллярными клубками мозга, эпителиальными клетками простаты, β-клетками поджелудочной железы, остеокластами костей, ретинальными клетками глаза, сарколеммой гладкой и поперечно-полосатой мускулатуры.
Функции, приписываемые СО38, включают как рецепторную роль в адгезии и передаче сигнала, так и (экто)ферментативную активность. Выступая в роли эктофермента, СЭ38 применяет НАД' в каче
- 1 015584 стве субстрата для образования циклической АДФ-рибозы (цАДФР) и АДФР, а также никотинамида и никотинамидадениндинуклеотидфосфата (НАДФ). Показано, что цАДФР является вторичным мессенджером для высвобождения Са2+ из эндоплазматического ретикулюма. В добавок к передаче сигнала с помощью Са2+, опосредованная СЭ38 передача сигнала происходит посредством взаимодействия (сгозз!а1к) с комплексами антиген-рецептор на Т- и В-клетках или другими типами рецепторных комплексов, например молекулами МНС, и таким образом включена в несколько клеточных ответов, а также в переключение и секрецию 1дС1.
Анти-СО38 антитела описаны в литературе, например в Байбе В. е! а1., Се11. 1ттипо1. 220 (1), 30-8 (2002), Аиае11о С.М. е! а1., Пззие апбдепз 56(6), 539-547 (2000) апб Со1пет Т. е! а1., ΙπΙ. 1ттипорйаттасо1. 3(3), 255-268 (1981). У ΟΌ38 несколько функций, которые могут активироваться или не активироваться молекулой, связавшейся с ΟΌ38. Например, мышиные анти-СЭ38 антитела ΙΒ4 обладают агонистическими свойствами по отношению к ΟΌ38. Показано, что ΙΒ4 индуцируют активацию Т-клеток, на что указывает высвобождение (мобилизация) Са2+ в клетках 1шка1 (ΖιΦίαιπ V. е! а1., 1. 1ттипо1. 159(1), 193205 (1997)), индуцируют значительную пролиферацию мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС), индуцируют высвобождение значительных уровней ГБ-6 и индуцируют высвобождение детектируемых уровней ΙΡΝ-γ (Байбе, ΖιΦίαιπ Могга, Апз1е11о. зирга).
Раскрытие изобретения
Настоящее изобретение представляет антитело, связывающееся с ΟΌ38 человека, кодируемое:
(1) нуклеиновыми кислотами легкой цепи человека и тяжелой цепи человека, включающими нуклеотидные последовательности в их вариабельных районах, согласно 8ЕО ΙΌ N0:1 и 8ЕО ΙΌ N0:6 соответственно;
(2) нуклеиновыми кислотами легкой цепи человека и тяжелой цепи человека, включающими нуклеотидные последовательности в их вариабельных районах, согласно 8Е0 ΙΌ N0:11 и 8Е0 ΙΌ N0:16 соответственно;
(3) нуклеиновыми кислотами легкой цепи человека и тяжелой цепи человека, включающими нуклеотидные последовательности в их вариабельных районах, согласно 8Е0 ΙΌ N0:21 и 8Е0 ΙΌ N0:26 соответственно или (4) нуклеиновыми кислотами легкой цепи человека и тяжелой цепи человека, включающими нуклеотидные последовательности в их вариабельных районах, которые являются консервативными модификациями последовательностей по пп.(1), (2) или (3).
Настоящее изобретение представляет антитело, связывающееся с ΟΌ38 человека, включающее νΗ 0ΌΕ3 с последовательностью согласно 8Е0 ΙΌ N0:10.
Настоящее изобретение представляет антитело, связывающееся с ΟΌ38 человека, включающее V 0ΌΕ3 с последовательностью согласно 8Е0 ΙΌ N0:5 и νΗ СБР3 с последовательностью согласно 8Е0 ΙΌ N0:10.
Настоящее изобретение представляет антитело, связывающееся с ΟΌ38 человека, включающее вариабельные районы легкой цепи человека и тяжелой цепи человека, где вариабельный район легкой цепи включает V,. СБР1 с последовательностью согласно 8Е0 ΙΌ N0:3, V,. СБР2 с последовательностью согласно 8Е0 ΙΌ N0:4 и V,. СБР3 с последовательностью согласно 8Е0 ΙΌ N0:5 и вариабельный район тяжелой цепи включает V СБР1 с последовательностью согласно 8Е0 ΙΌ N0:8, СБР2 с последовательностью согласно 8Е0 ΙΌ N0:9 и СБР3 с последовательностью согласно 8Е0 ΙΌ N0:10.
Настоящее изобретение представляет антитело, связывающееся с ΟΌ38 человека, включающее V район с аминокислотной последовательностью согласно 8Е0 ΙΌ N0:2.
Настоящее изобретение представляет антитело, связывающееся с ΟΌ38 человека, включающее V район с аминокислотной последовательностью, обладающей по меньшей мере 90%, например, по меньшей мере 95% идентичностью последовательности согласно 8Е0 ΙΌ N0:2.
Настоящее изобретение представляет антитело, связывающееся с ΟΌ38 человека, включающее VII район с аминокислотной последовательностью согласно 8Е0 ΙΌ N0:7.
Настоящее изобретение представляет антитело, связывающееся с ΟΌ38 человека, включающее V район с аминокислотной последовательностью, охватывающей СЭКЕ-Уб СБР3 район 8Е0 ΙΌ N0:7.
Настоящее изобретение представляет антитело, связывающееся с СБ38 человека, включающее V район с аминокислотной последовательностью, обладающей по меньшей мере 90%, например, по меньшей мере 95% идентичностью последовательности согласно 8Е0 ΙΌ N0:7 или охватывающей СБР1СБР3 район последовательности согласно 8Е0 ΙΌ N0:7.
Настоящее изобретение представляет антитело, связывающееся с СБ38 человека, включающее V район, обладающий 1-5, например 1-3, замещениями, делециями или добавлениями аминокислот по сравнению с последовательностью согласно 8Е0 ΙΌ N0:7 или охватывающей V СЭКб-Уб СБР3 район 8ЕО ΙΌ N0:7.
Настоящее изобретение представляет антитело, связывающееся с СБ 38 человека, включающее V район, как определено выше, и район, как определено выше.
Настоящее изобретение представляет антитело, связывающееся с СБ38 человека, включающее V СБВ3 с последовательностью согласно 8Е0 ΙΌ N0:20.
- 2 015584
Настоящее изобретение представляет антитело, связывающееся с СГО38 человека, включающее Уь СГОЕ3 с последовательностью согласно 8ЕО ГО N0:15 и Ун СГОЕ3 с последовательностью согласно 8Е0 ГО N0:20.
Настоящее изобретение представляет антитело, связывающееся с СГО38 человека, включающее вариабельные районы легкой цепи человека и тяжелой цепи человека, где вариабельный район легкой цепи включает Уь СГОЕ1 с последовательностью согласно 8Е(^ ГО N0:13, Уь СГОЕ2 с последовательностью согласно 8Е0 ГО N0:14 и Уь СГОЕ3 с последовательностью согласно 8Е0 ГО N0:15 и вариабельный район тяжелой цепи включает Ун СГОЕ1 с последовательностью согласно 8Е0 ГО N0:18, Ун СГОЕ2 с последовательностью согласно 8Е0 ГО N0:19 и Ун 0ΌΚ.3 с последовательностью согласно 8Е0 ГО N0:20.
Настоящее изобретение представляет антитело, связывающееся с СГО38 человека, включающее Уь район с аминокислотной последовательностью согласно 8Е0 ГО N0:12.
Настоящее изобретение представляет антитело, связывающееся с СГО38 человека, включающее Уь район с аминокислотной последовательностью, обладающей по меньшей мере 90%, например, по меньшей мере 95% идентичностью последовательности согласно 8Е0 ГО N0:12.
Настоящее изобретение представляет антитело, связывающееся с СГО38 человека, включающее Ун район с аминокислотной последовательностью согласно 8Е0 ГО N0:17.
Настоящее изобретение представляет антитело, связывающееся с СГО38 человека, включающее Ун район, включающий аминокислотную последовательность, охватывающую Ун СЭВ.1-Ун 0ΌΚ.3 район 8ЕО ГО N0:17.
Настоящее изобретение представляет антитело, связывающееся с СГО38 человека, включающее Ун район с аминокислотной последовательностью, обладающей по меньшей мере 90%, например, по меньшей мере 95% идентичностью последовательности согласно 8Е0 ГО N0:17 или охватывающей Ун СПН1-У.. 0ΌΚ.3 район 8ЕО ГО N0:17.
Настоящее изобретение представляет антитело, связывающееся с СГО38 человека, включающее Ун район, обладающий 1-5, например 1-3, замещениями, делециями или добавлениями аминокислот по сравнению с последовательностью согласно 8Е0 ГО N0:17 или охватывающей Ун СЭЕ1-Ун СГОЕ3 район 8ЕО ГО N0:17.
Настоящее изобретение представляет антитело, связывающееся с СГО38 человека, включающее Уь район, как определено выше, и Ун район, как определено выше.
Настоящее изобретение представляет антитело, связывающееся с СГО38 человека, включающее Ун СГОЕ3 с последовательностью согласно 8Е0 ГО N0:30.
Настоящее изобретение представляет антитело, связывающееся с СГО38 человека, включающее Уь СГОЕ3 с последовательностью согласно 8Е0 ГО N0:25 и Ун СГОЕ3 с последовательностью согласно 8Е0 ГО N0:30.
Настоящее изобретение представляет антитело, связывающееся с СГО38 человека, включающее вариабельные районы легкой цепи человека и тяжелой цепи человека, где вариабельный район легкой цепи включает Уъ СГОЕ1 с последовательностью согласно 8Е(^ ГО N0:23, Уъ СГОЕ2 с последовательностью согласно 8Е0 ГО N0:24 и Уъ СГОЕ3 с последовательностью согласно 8Е0 ГО N0:25 и вариабельный район тяжелой цепи включает Ун СГОЕ1 с последовательностью согласно 8Е0 ГО N0:28, Ун СГОЕ2 с последовательностью согласно 8Е0 ГО N0:29 и Ун СГОЕ3 с последовательностью согласно 8Е0 ГО N0:30.
Настоящее изобретение представляет антитело, связывающееся с СГО38 человека, включающее Уь район с аминокислотной последовательностью согласно 8Е0 ГО N0:22.
Настоящее изобретение представляет антитело, связывающееся с СГО38 человека, включающее Уь район с аминокислотной последовательностью, обладающей по меньшей мере 90%, например, по меньшей мере 95% идентичностью последовательности согласно 8Е0 ГО N0:22.
Настоящее изобретение представляет антитело, связывающееся с СГО38 человека, включающее Ун район с аминокислотной последовательностью согласно 8Е0 ГО N0:27.
Настоящее изобретение представляет антитело, связывающееся с СГО38 человека, включающее Ун район с аминокислотной последовательностью, охватывающей Ун СЭЕ1-Ун СГОЕ3 район 8Е0 ГО N0:27.
Настоящее изобретение представляет антитело, связывающееся с СГО38 человека, включающее Ун район с аминокислотной последовательностью, обладающей по меньшей мере 90%, например, по меньшей мере 95% идентичностью последовательности согласно 8Е0 ГО N0:27 или охватывающей Ун СПН1-У.. СОК.3 район 8ЕО ГО N0:27.
Настоящее изобретение представляет антитело, связывающееся с СГО38 человека, включающее Ун район, обладающий 1-5, например 1-3, замещениями, делениями или добавлениями аминокислот по сравнению с последовательностью согласно 8Е0 ГО N0:27 или охватывающей Ун СГОЕ1-Уц СГОЕ3 район 8ЕО ГО N0:27.
Настоящее изобретение представляет антитело, связывающееся с СГО38 человека, включающее Уь район, как определено выше, и Ун район, как определено выше.
Настоящее изобретение представляет пептид, который связывается с СГО38 человека (8Е0 ГО N0:31) и который не связывается с мутантным СГО38 человека, где остаток серина в положении 274 замещен остатком фенилаланина (8Е0 ГО N0:34) в той же степени, как оно связывается с СГО38 человека
- 3 015584 (8ЕЦ ΙΌ N0:31).
Настоящее изобретение представляет пептид, как определено выше, где ЕС50 для связывания пептида с мутантным ΟΌ38 человека, где остаток серина в положении 274 замещен остатком фенилаланина (8ЕЦ ΙΌ N0:34), составляет менее 50%, например менее 10, менее 5 или менее 1% величины ЕС50 для связывания пептида с ΟΌ38 человека (8ЕЦ ΙΌ N0:31).
Настоящее изобретение представляет пептид, который связывается с ΟΌ38 человека (8ЕЦ ΙΌ N0:31) и не связывается с мутантным ΟΌ38 человека, где остаток глутамина в положении 272 замещен остатком аргинина (8ЕЦ ΙΌ N0:33) в той же степени, как оно связывается с ΟΌ38 человека (8ЕЦ ΙΌ N0:31).
Настоящее изобретение представляет пептид, как определено выше, где ЕС50 для связывания пептида с мутантным ΟΌ38 человека, где остаток глутамина в положении 272 замещен остатком аргинина (8ЕЦ ΙΌ N0:33), менее 50%, например менее 10, менее 5 или менее 1% величины ЕС50 для связывания пептида с ΟΌ38 человека (8ЕЦ ΙΌ N0:31).
Настоящее изобретение представляет пептид, как определено выше, где упомянутый пептид связывается с мутантным ΟΌ38 человека, где остаток треонина в положении 237 замещен остатком аланина (8ЕЦ ΙΌ N0:32) в той же степени, как оно связывается с ΟΌ38 человека (8ЕЦ ΙΌ N0:31).
Настоящее изобретение представляет пептид, как определено выше, где ЕС50 для связывания пептида с мутантным ΟΌ38 человека, где остаток треонина в положении 237 замещен остатком аланина (8ЕЦ ΙΌ N0:32), соответствует 75-125% величины ЕС50 для связывания пептида с ΟΌ38 человека (8ЕЦ ΙΌ N0:31).
Настоящее изобретение представляет пептид, который связывается с ΟΌ38 человека (8ЕЦ ΙΌ N0:31), где пептид обладает следующими характеристиками связывания: (1) связывается с мутантным ΟΌ38 человека, где остаток серина в положении 274 замещен остатком фенилаланина (8ЕЦ ΙΌ N0:34) в той же степени, как оно связывается с ΟΌ38 человека (8ЕЦ ΙΌ N0:31); (2) связывается с мутантным ΟΌ38 человека, где остаток глутамина в положении 272 замещен остатком аргинина (8ЕЦ ΙΌ N0:33) в той же степени, как оно связывается с ΟΌ38 человека (8ЕЦ ΙΌ N0:31); (3) связывается с мутантным ΟΌ38 человека, где остаток треонина в положении 237 замещен остатком аланина (8ЕЦ ΙΌ N0:32) в той же степени, как оно связывается с ΟΌ38 человека (8ЕЦ ΙΌ N0:31).
Настоящее изобретение представляет пептид, который связывается с ΟΌ38 человека (8ЕЦ ΙΌ N0:31), где пептид обладает следующими характеристиками связывания: (1) не связывается с мутантным ΟΌ38 человека, где остаток серина в положении 274 замещен остатком фенилаланина (8ЕЦ ΙΌ N0:34) в той же степени, как оно связывается с ΟΌ38 человека (8ЕЦ ΙΌ N0:31); (2) не связывается с мутантным ΟΌ38 человека, где остаток глутамина в положении 272 замещен остатком аргинина (8ЕЦ ΙΌ N0:33) в той же степени, как оно связывается с ΟΌ38 человека (8ЕЦ ΙΌ N0:31); (3) связывается с мутантным ΟΌ38 человека, где остаток треонина в положении 237 замещен остатком аланина (8ЕЦ ΙΌ N0:32) в той же степени, как оно связывается с ΟΌ38 человека (8ЕЦ ΙΌ N0:31).
Настоящее изобретение представляет пептид, где ЕС50 определяют с помощью ЕЫ8Л, как описано в примере 17 данного описания.
Настоящее изобретение представляет пептид, который конкурирует с антителом согласно воплощению (1) выше за связывание ΟΌ38. В одном воплощении конкуренцию определяют с помощью ЕЫ8Л, как описано в примере 8 или 9 изобретения, где конкуренция определена как сигнал, составляющий по меньшей мере 90% при измерении по поглощению или с применением измерений перекрестной блокировки, как описано в примере 7 изобретения, где конкуренция определена как сигнал, составляющий по меньшей мере 90% при измерении по флуоресценции.
Настоящее изобретение представляет пептид, который специфически связывается с эпитопом ΟΌ38, причем эпитоп также специфически связывается антителом, как определено выше.
Настоящее изобретение представляет пептид, который специфически связывается с районом 5ΚΗ\ΙΟΕ5ΕΚ\ΙΥΗ и районом ЕКИУП.ЕЛАУШбС. ΟΌ38 человека (8ЕЦ ΙΌ N0:31).
Настоящее изобретение представляет пептид, обладающий в основном такими же характеристиками специфического связывания с ΟΌ38 человека, как антитело, как определено выше.
Настоящее изобретение представляет пептид, связывающийся с ΟΌ38 человека, где антитело обладает одной или более из следующих характеристик:
(1) действует как антагонист ΟΌ38;
(2) не индуцирует значительную пролиферацию мононуклеарных клеток периферической крови, как определяют по способу, описанному в примере 18 настоящего изобретения;
(3) не индуцирует высвобождение значительного количества ГО-б моноцитами человека или мононуклеарными клетками периферической крови, как определяют по способу, описанному в примере 19 настоящего изобретения;
(4) не индуцирует высвобождение детектируемого количества ШЫ-у Т-клетками человека или мононуклеарными клетками периферической крови, как определяют по способу, описанному в примере 20 настоящего изобретения;
(5) интернализуется клетками, экспрессирующими ΟΌ38, например интернализуется клетками
- 4 015584
СН0-СЭ38 в течение 5-15 мин при 37°С по способу, описанному в примере 12 настоящего изобретения;
(6) индуцирует ЛЭСС. например, со значением ЕС50 ниже 15 нг/мл, например, ниже 10 нг/мл в клетках Паиб1-1ис и со значением ЕС50 ниже 75 нг/мл, например, ниже 50, 30 или 10 нг/мл в клетках ММ, как определяют по способу, описанному в примере 5 настоящего изобретения;
(7) индуцирует СЭС в присутствии комплемента, например, со значением ЕС50 ниже 5 мкг/мл, например, ниже 1 мкг/мл в клетках ЭаибМис или СНО-СЭ38 согласно способу, описанному в примере 6 настоящего изобретения;
(8) ингибирует синтез цГДФР;
(9) ингибирует синтез цАДФР;
(10) связывается с СЭ38 человека со сродством (Кс) ниже 10-8М, например в интервале от 10-8 до 10-11 М, например в интервале от 7х10-9 до 10-10 М, как определяют с помощью поверхностного плазмонового резонанса, как описано в примере 20 настоящего изобретения.
Настоящее изобретение представляет пептид, как описано выше, который ингибирует синтез цГДФР не менее чем на 25%, например не менее чем на 30%, через 90 мин в концентрации 3 мкг/мл, как определяют с помощью спектроскопического способа, описанного в примере 24 настоящего изобретения.
Настоящее изобретение представляет пептид, как определено выше, который ингибирует синтез цАДФР не менее чем на 25%, например не менее чем на 30%, через 90 мин в концентрации 3 мкг/мл, как определяют с помощью ВЭЖХ, как описано в МиибЫ е! а1., 1. Βίο1. СЬет. 275, 21566-21571 (2000).
В одном воплощении пептид, как определено выше, является моноклональным антителом человека.
Настоящее изобретение представляет антитело, как определено выше, отличающееся тем, что оно является полноразмерным Ι§61, 1§С2, Ι§63, Ι§64, Ι§Ό, 1дА, 1дЕ или 1дМ антителом, например 1дС1 антителом, предпочтительно 1дС1,к антителом или 1дМ антителом, предпочтительно 1§М,к антителом.
Настоящее изобретение представляет изолированное моноклональное антитело человека, включающее:
(1) аминокислотную последовательность вариабельного района тяжелой цепи, произведенную из Ην1263/3Μ28(νΗΙ) последовательности зародышевой линии человека, и аминокислотную последовательность вариабельного района легкой цепи, произведенную из Ь15 (Ук1) последовательности зародышевой линии человека, где антитело человека связывается с СЭ38 человека, или (2) аминокислотную последовательность вариабельного района тяжелой цепи, произведенную из νΗ3-ΌΡ-47/ν3-23 (νΗΙΙΙ) последовательности зародышевой линии человека, и аминокислотную последовательность вариабельного района легкой цепи, полученную из Ь6 (νκΙ) последовательности зародышевой линии человека, где антитело человека связывается с СЭ38 человека.
Настоящее изобретение представляет пептид, как определено выше, где пептид гликозилирован в эукариотической клетке.
В одном воплощении антитело согласно изобретению является фрагментом антитела или одиночной цепью антитела.
Настоящее изобретение представляет пептид, как определено выше, далее включающий линкер хелатор для присоединения радиоизотопа.
Настоящее изобретение представляет пептид, как определено выше, который находится в основном в изолированном виде.
Настоящее изобретение представляет изолированную нуклеиновую кислоту, кодирующую пептид, как определено выше.
Настоящее изобретение представляет экспрессирующий вектор, включающий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую пептид, как определено выше.
Настоящее изобретение представляет экспрессирующий вектор, включающий:
(1) V нуклеотидную последовательность согласно 8ЕО ΙΌ N0:1, (2) νΗ нуклеотидную последовательность согласно 8ЕО ΙΌ N0:6, (3) ν нуклеотидную последовательность согласно 8Е0 ΙΌ N0:1 и νΗ нуклеотидную последовательность согласно 8Е0 ΙΌ N0:6, (4) ν нуклеотидную последовательность согласно 8Е0 ΙΌ N0:11, (5) νΗ нуклеотидную последовательность согласно 8Е0 ΙΌ N0:16, (6) ν нуклеотидную последовательность согласно 8Е0 ΙΌ N0:11 и νΗ нуклеотидную последовательность согласно 8Е0 ΙΌ N0:16, (7) ν нуклеотидную последовательность согласно 8Е0 ΙΌ N0:21, (8) νΗ нуклеотидную последовательность согласно 8Е0 ΙΌ N0:26, (9) ν нуклеотидную последовательность согласно 8Е0 ΙΌ N0:21 и νΗ нуклеотидную последовательность согласно 8Е0 ΙΌ N0:26.
Настоящее изобретение представляет экспрессирующий вектор, как определено выше, далее включающий нуклеотидную последовательность, кодирующую константный район легкой цепи, тяжелой цепи или обеих легкой и тяжелой цепей антитела человека.
- 5 015584
Настоящее изобретение представляет экспрессирующий вектор, как определено выше, где нуклеотидная последовательность, кодирующая константный район легкой цепи, тяжелой цепи или обеих легкой и тяжелой цепей антитела человека, кодирует 1дС1 антитело.
Настоящее изобретение представляет гибридому, которая продуцирует моноклональное анти-СЭ38 антитело человека, кодируемое нуклеиновыми кислотами легкой цепи человека и тяжелой цепи человека, включающими:
(1) нуклеиновые кислоты легкой цепи человека и тяжелой цепи человека, включающие нуклеотидные последовательности в их вариабельных районах согласно 8Е0 Ш N0:1 и 8Е0 ЕЭ N0:6 соответственно;
(2) нуклеиновые кислоты легкой цепи человека и тяжелой цепи человека, включающие нуклеотидные последовательности в их вариабельных районах согласно 8Е0 Ш N0:11 и 8Е0 ΕΌ N0:16 соответственно;
(3) нуклеиновые кислоты легкой цепи человека и тяжелой цепи человека, включающие нуклеотидные последовательности в их вариабельных районах согласно 8Е0 ΕΌ N0:21 и 8Е0 ΕΌ N0:26 соответственно; или (4) нуклеиновые кислоты легкой цепи человека и тяжелой цепи человека, включающие нуклеотидные последовательности в их вариабельных районах, которые являются консервативными модификациями последовательностей согласно пп.(1), (2) или (3).
Настоящее изобретение представляет гибридому, которая продуцирует моноклональное анти-СЭ38 антитело человека, несущее вариабельные районы тяжелой цепи и легкой цепи человека, которые включают:
(1)
N0:2 и
N0:7, (2) вариабельную аминокислотную последовательность легкой вариабельную аминокислотную последовательность тяжелой цепи цепи последовательность последовательность последовательность последовательность цепи легкой тяжелой цепи человека легкой цепи человека тяжелой цепи человека человека человека человека
согласно 8Ер ΕΌ
согласно 8ЕО ΕΌ
согласно 8ЕО ΕΌ
согласно 8ЕО ΕΌ
согласно 8ЕО ΕΌ
согласно 8ЕО ΕΌ
вариабельную аминокислотную
N0:12 и вариабельную аминокислотную N0:17, (3) вариабельную аминокислотную
N0:22 и вариабельную аминокислотную
N0:27 или (4) консервативные модификации последовательностей в вариабельных районах аминокислотных последовательностей легкой цепи человека и тяжелой цепи человека согласно пп.(1), (2) или (3).
Настоящее изобретение представляет трансфектому, которая продуцирует моноклональное антиΟΌ38 антитело человека, кодируемое нуклеиновыми кислотами легкой цепи человека и тяжелой цепи человека, включающими:
(1) нуклеиновые кислоты легкой цепи человека и тяжелой цепи человека, включающие нуклеотидные последовательности в их вариабельных районах согласно 8Е0 Ш N0:1 и 8Е0 ΕΌ N0:6 соответственно;
(2) нуклеиновые кислоты легкой цепи человека и тяжелой цепи человека, включающие нуклеотидные последовательности в их вариабельных районах согласно 8Е0 Ш N0:11 и 8Е0 ΕΌ N0:16 соответственно;
(3) нуклеиновые кислоты легкой цепи человека и тяжелой цепи человека, включающие нуклеотидные последовательности в их вариабельных районах согласно 8Е0 ΕΌ N0:21 и 8Е0 ΕΌ N0:26 соответственно; или (4) нуклеиновые кислоты легкой цепи человека и тяжелой цепи человека, включающие нуклеотидные последовательности в их вариабельных районах, которые являются консервативными модификациями последовательностей согласно пп.(1), (2) или (3).
Настоящее изобретение представляет трансфектому, которая продуцирует моноклональное антиΟΌ38 антитело человека, несущее вариабельные районы тяжелой цепи человека и легкой цепи человека, которые включают:
вариабельную аминокислотную последовательность легкой вариабельную аминокислотную последовательность тяжелой (1) N0:2 и N0:7, (2) цепи цепи последовательность последовательность последовательность последовательность цепи легкой тяжелой цепи человека легкой цепи человека тяжелой цепи человека человека человека человека
согласно 8Ер ΕΌ
согласно 8ЕО ΕΌ
согласно 8Ер ΕΌ
согласно 8ЕО ΕΌ
согласно 8ЕО ΕΌ
согласно 8ЕО ΕΌ
вариабельную аминокислотную
N0:12 и вариабельную аминокислотную N0:17, (3) вариабельную аминокислотную
N0:22 и вариабельную аминокислотную
N0:27 или (4) консервативные модификации последовательностей в вариабельных аминокислотных последовательностях легкой цепи человека и тяжелой цепи человека согласно пп.(1), (2) или (3).
Настоящее изобретение представляет эукариотическую или прокариотическую клетку хозяина, ко- 6 015584 торая продуцирует пептид, как определено выше.
Настоящее изобретение представляет эукариотическую или прокариотическую клетку хозяина, содержащую экспрессирующий вектор, как определено выше.
Настоящее изобретение представляет трансгенное животное, не являющегося человеком, или растение, включающее нуклеиновые кислоты, кодирующие тяжелую цепь человека и легкую цепь человека, где животное или растение продуцирует детектируемое количество пептида, как определено выше.
Настоящее изобретение представляет иммуноконъюгат, включающий пептид, как определено выше, соединенный с цитотоксическим агентом, радиоизотопом или лекарством.
Настоящее изобретение представляет иммуноконъюгат, включающий пептид, как определено выше, где пептид является мономерным 1дМ антителом, соединенным с цитотоксическим агентом, радиоизотопом или лекарством.
Настоящее изобретение представляет биспецифичную или мультиспецифичную молекулу, включающую пептид, как определено выше, и специфичность связывания эффекторной клетки человека.
Настоящее изобретение представляет биспецифичную или мультиспецифичную молекулу, включающую пептид, как определено выше, и специфичность связывания СЭЗ. СЭ4. СЭ138. 1Б-15К, мембраносвязанного или связанного с рецептором ΤΕΝ-α, Ес рецептором человека или мембраносвязанного или связанного с рецептором 1Ь-15.
Настоящее изобретение представляет фармацевтическую композицию, включающую пептид, как определено выше, или иммуноконъюгат, как определено выше, и фармацевтически приемлемый носитель.
Настоящее изобретение представляет фармацевтическую композицию, как определено выше, включающую один или более дополнительный терапевтический агент.
Настоящее изобретение представляет способ ингибирования роста и/или пролиферации клеток, экспрессирующих СО38, включающий введение пептида, как определено выше, иммуноконъюгата, как определено выше, фармацевтической композиции, как определено выше, или экспрессирующего вектора, как определено выше, так что рост и/или пролиферация клеток ингибируется.
Настоящее изобретение представляет способ лечения заболевания или нарушения, вовлекающего клетки, экспрессирующие ί.Ό38 у субъекта, где способ включает введение пептида, как определено выше, иммуноконъюгата, как определено выше, фармацевтической композиции, как определено выше, или экспрессирующего вектора, как определено выше, субъекту, который в этом нуждается.
Настоящее изобретение представляет способ предотвращения заболевания или нарушения, вовлекающего клетки, экспрессирующие СЭ38, где способ включает введение пептида, как определено выше, иммуноконъюгата, как определено выше, фармацевтической композиции, как определено выше, или экспрессирующего вектора, как определено выше, субъекту, который в этом нуждается.
В одном воплощении заболевание или нарушение является ревматоидным артритом.
В одном воплощении заболевание или нарушение является множественной миеломой.
В одном воплощении способ включает введение одного или более дополнительного терапевтического агента субъекту.
В одном воплощении дополнительные один или более терапевтический агент выбирают из химиотерапевтического агента, противовоспалительного агента, иммуносупрессивного и/или иммуномодуляторного агента.
В одном воплощении дополнительные один или более терапевтический агент выбирают из группы, состоящей из цисплатина, гефитиниба, цетуксимаба, ритуксимаба, бевацизумаба, эрлотиниба, бортезомиба, талидомида, памидроната, золедроновой кислоты, клодроната, ризендроната, ибандроната, этидроната, алендроната, тилудроната, триокиси мышьяка, леналидомида, филграстима, пегфилграстима, зарграмостима, суберройанилида гидроксамовой кислоты и 8СЮ-469.
Настоящее изобретение представляет ίη νίίτο способ детектирования наличия ί.Ό38 антигена или клеток, экспрессирующих СО38, в образце, включающий:
А) контактирование образца с пептидом, как определено выше, в условиях, позволяющих образование комплекса между пептидом и ί.Ό38 и
Б) детектирование образования этого комплекса.
Настоящее изобретение представляет набор для детектирования наличия ί.Ό38 антигена или клеток, экспрессирующих СО38, в образце, включающий пептид, как определено выше.
Настоящее изобретение представляет ίη νίνο способ для детектирования ί.Ό38 антигена или клеток, экспрессирующих ί.Ό38 у субъекта, включающий:
А) введение пептида, как определено выше, в условиях, позволяющих образование комплекса между пептидом и СО38, и
Б) детектирование образованного комплекса.
Настоящее изобретение представляет антиидиотипическое антитело, связывающееся с антителом, как определено выше.
- 7 015584
В одном воплощении антиидиотипическое антитело применяют для детектирования уровня антитела, как определено выше, в образце.
В одном воплощении антиидиотипическое антитело применяют для детектирования уровня моноклонального антитела человека против СЬ38 в образце.
Краткое описание чертежей
Фиг. 1А показывает связывание -003, -005 и антитела контрольного изотипа НиМаЬ-КЬН с СЭ38трансфицированными СНО (СНО-СО38) клетками при измерении с помощью проточной цитометрии. Постановка эксперимента описана в примере 4.
Фиг. 1Б показывает связывание -024 и НиМаЬ-КЬН с СО38-трансфицированными СНО (СНО0038) клетками при измерении с помощью проточной цитометрии. Постановка эксперимента описана в примере 4.
Фиг. 2А показывает связывание -003, -005 и НиМаЬ-КЬН с ОаиФ клетками при измерении с помощью проточной цитометрии. Постановка эксперимента описана в примере 4.
Фиг. 2Б показывает связывание -024 и НиМаЬ-КЬН с ОаиФ клетками при измерении с помощью проточной цитометрии. Постановка эксперимента описана в примере 4.
Фиг. 3 показывает связывание -003, -005, -024 и НиМаЬ-КЬН с клетками множественной миеломы. Постановка эксперимента описана в примере 4.
Фиг. 4А показывает способность -003 и -005 индуцировать лизис клеток ОашЬ посредством ЛЬСС по сравнению с ритуксимабом и НиМаЬ-КЬН. Постановка эксперимента описана в примере 5.
Фиг. 4Б показывает способность -024 индуцировать лизис клеток Οηιιάί посредством АОСС по сравнению с НиМаЬ-КЬН. Постановка эксперимента описана в примере 5.
Фиг. 5 А показывает способность -003, -005 и -024 индуцировать лизис свежих опухолевых клеток множественной миеломы посредством АОСС по сравнению с НиМаЬ-КЬН. Постановка эксперимента описана в примере 5.
Фиг. 5Б показывает способность -003, -005 и -024 индуцировать лизис свежих опухолевых клеток лейкоза плазматических клеток посредством АОСС по сравнению с НиМаЬ-КЬН. Постановка эксперимента описана в примере 5.
Фиг. 6 показывает способность -003 и -005 индуцировать лизис ДКбЬ (клеток линии множественной миеломы) посредством АОСС по сравнению с НиМаЬ-КЬН. Постановка эксперимента описана в примере 5.
Фиг. 7 показывает способность -003 и -005 индуцировать лизис АМО-1 (клеток линии множественной миеломы) посредством АОСС по сравнению с НиМаЬ-КЬН. Постановка эксперимента описана в примере 5.
Фиг. 8 показывает СОС-опосредованный лизис Оаиб1-1ис клеток, индуцированный -003 и -005, по сравнению с НиМаЬ-КЬН. Постановка эксперимента описана в примере 6.
Фиг. 9А показывает СОС-опосредованный лизис СНО-СЭ38 клеток, индуцированный -003 и -005, по сравнению с НиМаЬ-КЬН. Постановка эксперимента описана в примере 6.
Фиг. 9Б показывает СОС-опосредованный лизис СНО-СО38 клеток, индуцированный -024, по сравнению с НиМаЬ-КЬН. Постановка эксперимента описана в примере 6.
Фиг. 10А показывает СОС-опосредованный лизис 3% устойчивых к лечению опухолевых клеток в присутствии -003, -005 и НиМаЬ-КЬН. Постановка эксперимента описана в примере 6.
Фиг. 10Б показывает СОС-опосредованный лизис 9% устойчивых к лечению опухолевых клеток в присутствии -003, -005 и НиМаЬ-КЬН. Постановка эксперимента описана в примере 6.
Фиг. 10В показывает СОС-опосредованный лизис 30-40% устойчивых к лечению опухолевых клеток в присутствии -003, -005 и НиМаЬ-КЬН. Постановка эксперимента описана в примере 6.
Фиг. 10Г показывает СОС-опосредованный лизис 70% устойчивых к лечению опухолевых клеток в присутствии -003, -005 и НиМаЬ-КЬН. Постановка эксперимента описана в примере 6.
Фиг. 10Д показывает СОС-опосредованный лизис клеток множественной миеломы в присутствии -024 и НиМаЬ-КЬН. Постановка эксперимента описана в примере 6.
Фиг. 11 показывает, что -003 и -005 не проявляют перекрестного блокирования связывания с СО38. Постановка эксперимента описана в примере 7.
Фиг. 12А показывает иммунопатологическое окрашивание макрофагов, лимфоцитов и плазматических В-клеток с помощью -003. Постановка эксперимента описана в примере 10.
Фиг. 12Б показывает иммуногистологическое окрашивание бронхиального эпителия с помощью -003. Постановка эксперимента описана в примере 10.
Фиг. 12В показывает иммуногистологическое окрашивание миоцитов с помощью -003. Постановка эксперимента описана в примере 10.
Фиг. 12Г показывает иммуногистологическое окрашивание лимфоидной ткани обезьяны циномолгус с помощью -003. Постановка эксперимента описана в примере 10.
Фиг. 13 А показывает иммуногистологическое окрашивание макрофагов, лимфоцитов и плазматических В-клеток с помощью -005. Постановка эксперимента описана в примере 10.
- 8 015584
Фиг. 13Б показывает иммуногистологическое окрашивание бронхиального эпителия с помощью -005. Постановка эксперимента описана в примере 10.
Фиг. 13В показывает иммуногистологическое окрашивание миоцитов с помощью -005. Постановка эксперимента описана в примере 10.
Фиг. 13Г показывает иммуногистологическое окрашивание лимфоидной ткани обезьяны циномолгус с помощью -005. Постановка эксперимента описана в примере 10.
Фиг. 14 А показывает иммуногистологическое окрашивание эндотелия печени с помощью ί.Ό31. Постановка эксперимента описана в примере 10.
Фиг. 14Б показывает иммуногистологическое окрашивание эндотелия печени с помощью ννΡ. Постановка эксперимента описана в примере 10.
Фиг. 14В показывает иммуногистологическое окрашивание эндотелия печени с помощью антиКЬН. Постановка эксперимента описана в примере 10.
Фиг. 14Г показывает иммуногистологическое окрашивание эндотелия печени с помощью -003. Постановка эксперимента описана в примере 10.
Фиг. 14Д показывает иммуногистологическое окрашивание эндотелия печени с помощью -005. Постановка эксперимента описана в примере 10.
Фиг. 15А показывает перекрестную реактивность -003 и -005 по сравнению с НиМаЬ-КЬН на лимфоцитах обезьяны циномолгус, измеряемую с помощью проточной цитометрии. Постановка эксперимента описана в примере 11.
Фиг. 15Б показывает перекрестную реактивность -003 и -005 по сравнению с НиМаЬ-КЬН на моноцитах обезьяны циномолгус, измеряемую с помощью проточной цитометрии. Постановка эксперимента описана в примере 11.
Фиг. 15В показывает перекрестную реактивность -003 и -005 по сравнению с НиМаЬ-КЬН на РВМС обезьян резус, измеряемую с помощью проточной цитометрии. Постановка эксперимента описана в примере 11.
Фиг. 16А показывает интернализацию -003 при измерении по тушению флуоресценции этидий бромида. Постановка эксперимента описана в примере 12.
Фиг. 16Б показывает интернализацию -005 при измерении по тушению флуоресценции этидий бромида. Постановка эксперимента описана в примере 12.
Фиг. 17А показывает обусловленное -003 и -005 по сравнению с анти-СО20 моноклональным антителом (ритуксимаб) и НиМаЬ-КЬН ингибирование роста опухолевых клеток в превентивной постановке при измерении с помощью ίη νίνο 8СГО люциферазного получения изображения. Постановка эксперимента описана в примере 13.
Фиг. 17Б показывает обусловленное -003 и -005 по сравнению с анти-СО20 моноклональным антителом (ритуксимаб) и НиМаЬ-КЬН ингибирование роста опухолевых клеток в терапевтической постановке I при измерении с помощью ίη νίνο 8СГО люциферазного получения изображения. Постановка эксперимента описана в примере 13.
Фиг. 17В показывает обусловленное -003 и -005 по сравнению с анти-СО20 моноклональным антителом (ритуксимаб) и НиМаЬ-КЬН ингибирование роста опухолевых клеток в терапевтической постановке II при измерении с помощью ίη νίνο 8СШ люциферазного получения изображения. Постановка эксперимента описана в примере 13.
Фиг. 17Г показывает обусловленное -003 и -024 по сравнению с НиМаЬ-КЬН ингибирование роста опухолевых клеток в терапевтической постановке III при измерении с помощью ίη νίνο 8СГО люциферазного получения изображения. Постановка эксперимента описана в примере 13.
Фиг. 18 показывает индукцию апоптоза с помощью -003 и -005 по сравнению с анти-СО20 моноклональным антителом (ритуксимаб) и НиМаЬ-КЬН со сшивками и без. Постановка эксперимента описана в примере 14.
Фиг. 19 показывает гистологическую оценку СО3 8-положительных клеток в имплантированных К.А-8СГО гетеротрансплантатах мыши на 14 день после обработки анти-КЬН (НиМаЬ-КЬН) или -005. Способы описаны в примере 15.
Фиг. 20 показывает гистологическую оценку СО 138-положительных клеток в имплантированных К.А-8СГО гетеротрансплантатах мыши на 14 день после обработки анти-КЬН (НиМаЬ-КЬН) или -005. Способы описаны в примере 15.
Фиг. 21 показывает СО38 окрашивание В-клеток в гетеротрансплантатах перед имплантацией (А) или после обработки анти-КЬН (Б) или -005 (В). Способы описаны в примере 15.
Фиг. 22 показывает СО138 окрашивание В-клеток в гетеротрансплантатах перед имплантацией (А) или после обработки анти-КЬН (Б) или -005 (В). Способы описаны в примере 15.
Фиг. 23 показывает связывание -003 и -005 с диким типом и мутантным СО38 человека при измерении с помощью ЕЫ8А. 23А: связывание -003 и -005 с Т237А мутантом СО38 человека. 23Б: связывание -003 и -005 с О272Р мутантом СО38 человека. 23В: связывание -003 и -005 с 8274Е мутантом СО38 человека. Способы описаны в примере 17.
- 9 015584
Фиг. 24 показывает действие -003 и -005 по сравнению с НиМаЬ-КЬН на пролиферацию (А), продукцию 1Ь-б (Б) и продукцию ΙΡΝ-γ (В) клетками РВМС человека. Способы описаны в примерах 18, 19 и 20 соответственно.
Фиг. 25 показывает ферментативную продукцию цГДФ-рибозы в присутствии различных концентраций -003 (Б), -005 (В), -024 (Г) или анти-КЬН (А). Способы описаны в примере 23.
Фиг. 2б показывает сравнение между -003 -005 и Мотрйовув антителом ТН-3079 при СЭС клеток СН0-СП38 (2бА), СЭС клеток ОаиФ (2бБ) и АЭСС клеток ОаиФ (2бВ).
Последовательности согласно изобретению приведены в приложенном списке последовательностей.
8ЕЦ ΙΌ N0:1 является нуклеотидной последовательностью Уъ района антитела -003.
8ЕЦ ΙΌ N0:2 является аминокислотной последовательностью Уъ района антитела -003.
8ЕЦ ΙΌ N0:3 является аминокислотной последовательностью Уъ СЭР1 антитела -003, включающей аминокислотные остатки 24-34 8ЕЦ ΙΌ N0:2.
8ЕЦ ΙΌ N0:4 является аминокислотной последовательностью Уъ СЭР2 антитела -003, включающей аминокислотные остатки 50-5б 8ЕЦ ΙΌ N0:2.
8ЕЦ ΙΌ N0:5 является аминокислотной последовательностью Уъ СЭР3 антитела -003, включающей аминокислотные остатки 89-97 8ЕЦ ΙΌ N0:2.
8ЕЦ ΙΌ N0/) является нуклеотидной последовательностью УН района антитела -003.
8ЕЦ ΙΌ N0:7 является аминокислотной последовательностью УН района антитела -003.
8ЕЦ ΙΌ N0:8 является аминокислотной последовательностью УН СЭР1 антитела -003, включающей аминокислотные остатки 31-35 8ЕЦ ΙΌ N0:7.
8ЕЦ ΙΌ N0:9 является аминокислотной последовательностью УН СЭР2 антитела -003, включающей аминокислотные остатки 50-бб 8ЕЦ ΙΌ N0:7.
8ЕЦ ΙΌ N0:10 является аминокислотной последовательностью УН СЭР3 антитела -003, включающей аминокислотные остатки 99-109 8ЕЦ ΙΌ N0:7.
8ЕЦ ΙΌ N0:11 является нуклеотидной последовательностью Уъ района антитела -005.
8ЕЦ ΙΌ N0:12 является аминокислотной последовательностью Уъ района антитела -005.
8ЕЦ ΙΌ N0:13 является аминокислотной последовательностью У|, СЭР1 антитела -005, включающей аминокислотные остатки 24-34 8ЕЦ ΙΌ N0:12.
8ЕЦ ΙΌ N0:14 является аминокислотной последовательностью У|. СЭР2 антитела -005, включающей аминокислотные остатки 50-5б 8ЕЦ ΙΌ N0:12.
8ЕЦ ΙΌ N0:15 является аминокислотной последовательностью У|. СЭР3 антитела -005, включающей аминокислотные остатки 89-97 8ЕЦ ΙΌ N0:12.
8ЕЦ ΙΌ N0:1/) является нуклеотидной последовательностью УН района антитела -005.
8ЕЦ ΙΌ N0:17 является аминокислотной последовательностью УН района антитела -005.
8ЕЦ ΙΌ N0:18 является аминокислотной последовательностью УН СЭР1 антитела -005, включающей аминокислотные остатки 31-35 8ЕЦ ΙΌ N0:17.
8ЕЦ ΙΌ N0:19 является аминокислотной последовательностью УН СЭР2 антитела -005, включающей аминокислотные остатки 50-бб 8ЕЦ ΙΌ N0:17.
8ЕЦ ΙΌ N0:20 является аминокислотной последовательностью УН СЭР3 антитела -005, включающей аминокислотные остатки 99-111 8ЕЦ ΙΌ N0:17.
8ЕЦ ΙΌ N0:21 является нуклеотидной последовательностью Уъ района антитела -024.
8ЕЦ ΙΌ N0:22 является аминокислотной последовательностью Уъ района антитела -024.
8ЕЦ ΙΌ N0:23 является аминокислотной последовательностью У|. СЭР1 антитела -024, включающей аминокислотные остатки 24-34 8ЕЦ ΙΌ N0:22.
8ЕЦ ΙΌ N0:24 является аминокислотной последовательностью У|. СЭР2 антитела -024, включающей аминокислотные остатки 50-5б 8ЕЦ ΙΌ N0:22.
8ЕЦ ΙΌ N0:25 является аминокислотной последовательностью У|. СЭР3 антитела -024, включающей аминокислотные остатки 89-97 8ЕЦ ΙΌ N0:22.
8ЕЦ ΙΌ N0:2/) является нуклеотидной последовательностью УН района антитела -024.
8ЕЦ ΙΌ N0:27 является аминокислотной последовательностью УН района антитела -024.
8ЕЦ ΙΌ N0:28 является аминокислотной последовательностью УН СЭР1 антитела -024, включающей аминокислотные остатки 31-35 8ЕЦ ΙΌ N0:27.
8ЕЦ ΙΌ N0:29 является аминокислотной последовательностью УН СЭР2 антитела -024, включающей аминокислотные остатки 50-бб 8ЕЦ ΙΌ N0:27.
8ЕЦ ΙΌ N0:30 является аминокислотной последовательностью УН СЭР3 антитела -024, включающей аминокислотные остатки 99-111 8ЕЦ ΙΌ N0:27.
8ЕЦ ΙΌ N0:31 является последовательностью СЭ38 человека.
8ЕЦ ΙΌ N0:32 является последовательностью мутантного СЭ38 человека, где остаток треонина в положении 237 замещен остатком аланина.
8ЕЦ ΙΌ N0:33 является последовательностью мутантного СЭ38 человека, где остаток глутамина в положении 272 замещен остатком аргинина.
- 10 015584
8ЕО ГО N0:34 является последовательностью мутантного ΟΌ38 человека, где остаток серина в положении 274 замещен остатком фенилаланина.
Осуществление изобретения
Настоящее изобретение представляет СО38-связывающие пептиды (СО38ВР), которые можно применять для лечения, диагностики и предотвращения разнообразных нарушений, вовлекающих клетки, экспрессирующие ΟΌ38. например, множественной миеломы.
В одном воплощении СГО38ВР согласно изобретению является антителом -003. -003 является моноклональным 1дС1 антителом человека, имеющим У|, район, состоящий из последовательности согласно 8ЕО ГО N0:2, и Ун район, состоящий из последовательности согласно 8Е0 ГО N0:7.
В одном воплощении СГО38ВР согласно изобретению является антителом -005. -005 является моноклональным 1дС1 антителом человека, имеющим Уъ район, состоящий из последовательности согласно 8Е0 ГО N0:12, и Ун район, состоящий из последовательности согласно 8Е0 ГО N0:17.
В одном воплощении СГО38ВР согласно изобретению является антителом -024. -024 является моноклональным 1дС1 антителом человека, имеющим Уъ район, состоящий из последовательности согласно 8Е0 ГО N0:22, и Ун район, состоящий из последовательности согласно 8Е0 ГО N0:27.
Антитела взаимодействуют с антигенами мишени первично через аминокислотные остатки, которые расположены в шести определяющих комплементарность районах тяжелой и легкой цепи (СОВ). Изза этого аминокислотные последовательности внутри СОВ больше различаются между индивидуальными антителами, чем последовательности за пределами СОВ. Поскольку СОВ последовательности отвечают за большую часть взаимодействий антиген-антитело, возможно экспрессировать рекомбинантные антитела, которые симулируют свойства специфических встречающихся в природе антител, с помощью создания экспрессирующих векторов, которые включают СОВ последовательности из специфических встречающихся в природе антител, вставленные среди каркасных последовательностей другого антитела с другими свойствами (см., например, В1ссйшапи с! а1., №1Шгс 332, 323-327 (1998), 1оис5 с! а1., №1Шгс 321, 522-525 (1986), Оиссп с! а1., Р^8 И8А 86, 10029-10033 (1989)).
Поскольку в данной области техники хорошо известно, что СГОВ3 домены тяжелой цепи антитела играют особенно важную роль в специфичности/сродстве связывания антитела с антигеном ГОй/с1 НЭ. с! а1., 1. 1шшипо1. 157(2), 739-49 (1996), ВагЬак 8.М. с! а1., 1. Ат. Сйсш. 8ос. 116, 2161-2162 (1994), ВагЬак 8.М. с! а1., Ргос. Иаб. Асаб. 8с1. И8А 92(7), 2529-33 (1995)), СО38ВР изобретения могут включать СЭВ3 тяжелой цепи антител -003, -005 или -024. СГО38ВР изобретения могут также включать 0ΌΡ3 тяжелой и легкой цепи антител -003, -005 или -024. СГО38ВР изобретения могут далее включать СЭВ2 антител -003, -005 и -024 соответственно. СГО38ВР изобретения могут далее включать СГОВ1 антител -003, -005 и -024 соответственно.
Настоящее изобретение представляет СЭ38ВР, которые конкурируют с -003 за связывание с СГО38. Настоящее изобретение представляет СЭ38ВР, которые конкурируют с -005 за связывание с СГО38. Настоящее изобретение представляет СЭ38ВР, которые конкурируют с -024 за связывание с СГО38. В одном воплощении конкуренцию определяют с помощью ЕЬ18А, как описано в разделе примеров.
В одном воплощении конкуренцию определяют с помощью РАС8, как описано в разделе примеров.
Настоящее изобретение представляет СЭ38ВР, которое специфически связывается с эпитопом ί.Ό38, причем эпитоп также специфически связывается антителами -003, или -005, или -024.
Настоящее изобретение представляет СЭ38ВР, обладающее в основном такими же характеристиками специфического связывания по отношению к СГО38 человека, как -003, или -005, или -024.
Настоящее изобретение представляет СЭ38ВР, включающее У|. СОВ1, состоящий в основном из 8ЕО ГО N0:3.
Настоящее изобретение представляет СЭ38ВР, включающее Уь СОВ2, состоящий в основном из 8ЕО ГО N0:4.
Настоящее изобретение представляет СЭ38ВР, включающее У|, СОВ3, состоящий в основном из 8ЕО ГО N0:5.
Настоящее изобретение представляет СЭ38ВР, включающее У|, СОВ3, состоящий в основном из 8Е0 ГО N0:5, и Уь СОВ1, состоящий в основном из 8Е0 ГО N0:3.
Настоящее изобретение представляет СЭ38ВР, включающее Уь СОВ3, состоящий в основном из 8Е0 ГО N0:5, и Уъ СОВ2, состоящий в основном из 8Е0 ГО N0:4.
Настоящее изобретение представляет СЭ38ВР, включающее Уь СОВ3, состоящий в основном из 8Е0 ГО N0:5, и Уъ СОВ2, состоящий в основном из 8Е0 ГО N0:4 и Уъ СОВ1, состоящий в основном из 8ЕО ГО N0:3.
Настоящее изобретение представляет СЭ38ВР, включающее УН СОВ1, состоящий в основном из 8ЕО ГО N0:8.
Настоящее изобретение представляет СЭ38ВР, включающее УН СОВ2, состоящий в основном из 8ЕО ГО N0:9.
Настоящее изобретение представляет СЭ38ВР, включающее УН СОВ3, состоящий в основном из 8ЕО ГО N0:10.
- 11 015584
Настоящее изобретение представляет СЭ38ВР. включающее νΗ СГОК3. состоящий в основном из 8ЕО ГО N0:10. и νΗ СЭК1. состоящий в основном из 8Е0 ГО N0:8.
Настоящее изобретение представляет СГО38ВР. включающее νΗ СО К.3. состоящий в основном из 5>Е0 ГО N0:10. и νΗ СГОК2. состоящий в основном из 8Е0 ГО N0:9.
Настоящее изобретение представляет СГО38ВР. включающее νΗ СГОК3. состоящий в основном из 5>Е0 ГО N0:10. и νΗ СГОК2. состоящий в основном из 8Е0 ГО N0:9. и νΗ СГОКЕ состоящий в основном из 5ЕО ГО N0:8.
Настоящее изобретение представляет СГО38ВР. включающее Уь СГОКЕ состоящий в основном из 5ЕО ГО N0:13.
Настоящее изобретение представляет СГО38ВР. включающее Уь СГОК2. состоящий в основном из 5ЕО ГО N0:14.
Настоящее изобретение представляет СГО38ВР. включающее Уь СГОК3. состоящий в основном из 5ЕО ГО N0:15.
Настоящее изобретение представляет СГО38ВР. включающее Уь СГОК3. состоящий в основном из 8Е0 ГО N0:15. и Уь СГОКЕ состоящий в основном из 8Е0 ГО N0:13.
Настоящее изобретение представляет СГО38ВР. включающее Уь СГОК3. состоящий в основном из 8Е0 ГО N0:15. и νΗ СГОК2. состоящий в основном из 8Е0 ГО N0:14.
Настоящее изобретение представляет СГО38ВР. включающее Уь СГОК3. состоящий в основном из 8Е0 ГО N0:15. и νΗ СГОК2. состоящий в основном из 8Е0 ГО N0:14. и Уь СГОКЕ состоящий в основном из 5ЕО ГО N0:13.
Настоящее изобретение представляет СГО38ВР. включающее νΗ СГОКЕ состоящий в основном из 5ЕО ГО N0:18.
Настоящее изобретение представляет СГО38ВР. включающее νΗ СГОК2. состоящий в основном из 5ЕО ГО N0:19.
Настоящее изобретение представляет СГО38ВР. включающее νΗ СГОК3. состоящий в основном из 5ЕО ГО N0:20.
Настоящее изобретение представляет СГО38ВР. включающее νΗ СГОК3. состоящий в основном из 8Е0 ГО N0:20. и νΗ СОК1. состоящий в основном из 8Е0 ГО N0:18.
Настоящее изобретение представляет СГО38ВР. включающее νΗ СГОК3. состоящий в основном из 8Е0 ГО N0:20. и νΗ СГОК2. состоящий в основном из 8Е0 ГО N0:19.
Настоящее изобретение представляет СГО38ВР. включающее νΗ СГОК3. состоящий в основном из 8Е0 ГО N0:20. и νΗ СГОК2. состоящий в основном из 8Е0 ГО N0:19. и νΗ СГОКЕ состоящий в основном из 5ЕО ГО N0:18.
Настоящее изобретение представляет СГО38ВР. включающее Уь СГОКЕ состоящий в основном из 5ЕО ГО N0:23.
Настоящее изобретение представляет СГО38ВР. включающее Уь СГОК2. состоящий в основном из 5ЕО ГО N0:24.
Настоящее изобретение представляет СГО38ВР. включающее Уь СГОК3. состоящий в основном из 5ЕО ГО N0:25.
Настоящее изобретение представляет СГО38ВР. включающее Уь СГОК3. состоящий в основном из 8Е0 ГО N0:25. и Уь СОК1. состоящий в основном из 8Е0 ГО N0:23.
Настоящее изобретение представляет СГО38ВР. включающее Уь СГОК3. состоящий в основном из 8Е0 ГО N0:25. и Уь СГОК2. состоящий в основном из 8Е0 ГО N0:24.
Настоящее изобретение представляет СГО38ВР. включающее Уь СГОК3. состоящий в основном из 8Е0 ГО N0:25. и Уь СГОК2. состоящий в основном из 8Е0 ГО N0:24. и Уь СГОКЕ состоящий в основном из 5ЕО ГО N0:23.
Настоящее изобретение представляет СГО38ВР. включающее νΗ СГОКЕ состоящий в основном из 5ЕО ГО N0:28.
Настоящее изобретение представляет СГО38ВР. включающее νΗ СГОК2. состоящий в основном из 5ЕО ГО N0:29.
Настоящее изобретение представляет СГО38ВР. включающее νΗ СГОК3. состоящий в основном из 5ЕО ГО N0:30.
Настоящее изобретение представляет СГО38ВР. включающее νΗ СГОК3. состоящий в основном из 8Е0 ГО N0:30. и νΗ СОК1. состоящий в основном из 8Е0 ГО N0:28.
Настоящее изобретение представляет СГО38ВР. включающее νΗ СГОК3. состоящий в основном из 8Е0 ГО N0:30. и νΗ СГОК2. состоящий в основном из 8Е0 ГО N0:29.
Настоящее изобретение представляет СГО38ВР. включающее νΗ СГОК3. состоящий в основном из 8Е0 ГО N0:30. и νΗ СГОК2. состоящий в основном из 8Е0 ГО N0:29. и νΗ СГОКЕ состоящий в основном из 5ЕО ГО N0:28.
- 12 015584
Настоящее изобретение представляет СБ38ВР, включающее:
(а) первый νι. район, включающий три Уъ СЭР. которые независимо друг от друга состоят в основном из 8ЕЦ ГО N0:3, 4 и 5. и (б) первый νΗ район. включающий три νΗ СГОК, которые независимо друг от друга состоят в основном из 8ЕЦ ГО N0:8, 9 и 10.
Настоящее изобретение представляет СБ38ВР, включающее:
(а) первый V район, включающий три Ун СГОК, которые независимо друг от друга состоят в основном из 8ЕЦ ГО N0:13, 14 и 15, и (б) первый νΗ район, включающий три νΗ СБК, которые независимо друг от друга состоят в основном из 8ЕЦ ГО N0:18, 19 и 20.
Настоящее изобретение представляет СБ38ВР, включающее:
(а) первый Уь район, включающий три Ун СБК, которые независимо друг от друга состоят в основном из 8ЕЦ ГО N0:23, 24 и 25, и (б) первый νΗ район, включающий три νΗ СБК, которые независимо друг от друга состоят в основном из 8ЕЦ ГО N0:28, 29 и 30.
В одном воплощении Уь район и νΗ район, оба, находятся на одной и той же цепи пептида.
В дальнейшем воплощении Уь район и νΗ район разделены гибким линкером.
В одном воплощении Уь район и νΗ район находятся на разных цепях пептида.
В дальнейшем воплощении Уь район и νΗ район находятся на разных цепях пептида скрученного белка иммуноглобулина.
В одном воплощении первый Уь район и первый νΗ район ориентированы таким образом, что три СБК в У|. районе и три СБК в νΗ районе кооперативно связаны так, чтобы вносить вклад в избирательное и/или специфическое связывание антигенной детерминанты СБ38 человека.
В дальнейшем воплощении пептид включает второй ν!. район, идентичный первому νι. району, и второй νΗ район идентичный первому νΗ району, где второй Уъ район и второй νΗ район кооперативно связаны так, чтобы вносить вклад в избирательное и/или специфическое связывание антигенной детерминанты СГО38 человека.
Настоящее изобретение представляет СБ38ВР, включающее ν,. район, который является функциональным вариантом νι, района антитела -003, или -005, или -024.
В одном воплощении νι, район СГО38ВР состоит в основном из последовательности, обладающей по меньшей мере приблизительно 50%, по меньшей мере приблизительно 60%, по меньшей мере приблизительно 70%, по меньшей мере приблизительно 75%, по меньшей мере приблизительно 80%, по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95% идентичностью последовательности аминокислот последовательности согласно 8ЕЦ ГО N0:2, или 8Е0 ГО N0:12, или 8ЕЦ ГО N0:22 соответственно. В одном воплощении СГО38ВР обладает по меньшей мере приблизительно 50%, по меньшей мере приблизительно 60%, по меньшей мере приблизительно 70%, по меньшей мере приблизительно 80%, по меньшей мере приблизительно 90% или по меньшей мере приблизительно 95% эпитопсвязывающих характеристик антител -003, или -005, или -024 соответственно.
Настоящее изобретение представляет СБ38ВР, включающий νΗ район, который является функциональным вариантом νΗ района антитела -003, или -005, или -024.
В одном воплощении νΗ район пептида состоит в основном из последовательности, обладающей по меньшей мере приблизительно 50%, по меньшей мере приблизительно 60%, по меньшей мере приблизительно 70%, по меньшей мере приблизительно 75%, по меньшей мере приблизительно 80%, по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95% идентичностью последовательности аминокислот последовательности согласно 8ЕЦ ГО N0:7, или 8Е0 ГО N0:17, или 8ЕЦ ГО N0:27 соответственно. В одном воплощении СГО38ВР обладает по меньшей мере приблизительно 50%, по меньшей мере приблизительно 60%, по меньшей мере приблизительно 70%, по меньшей мере приблизительно 80%, по меньшей мере приблизительно 90% или по меньшей мере приблизительно 95% эпитопсвязывающих характеристик антител -003, или -005, или -024 соответственно.
Настоящее изобретение представляет СБ38ВР, включающий по меньшей мере один СБК, который является функциональным вариантом СБК антитела -003, или -005, или -024.
В одном воплощении по меньшей мере один из СБК пептида состоит в основном из последовательности, обладающей по меньшей мере приблизительно 50%, по меньшей мере приблизительно 60%, по меньшей мере приблизительно 70%, по меньшей мере приблизительно 75%, по меньшей мере приблизительно 80%, по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95% идентичностью последовательности аминокислот последовательности согласно 8ЕЦ ГО N0:3-5, 8, 9 или 10, или согласно 8ЕЦ ГО N0:13-15, 18, 19 или 20, или согласно 8Е0 ГО N0:23-25, 28, 29 или 30 соответственно. В одном воплощении СГО38ВР обладает по меньшей мере приблизительно 50%, по меньшей мере приблизительно 60%, по меньшей мере приблизительно 70%, по меньшей мере приблизительно 80%, по меньшей мере приблизительно 90% или по меньшей ме
- 13 015584 ре приблизительно 95% эпитопсвязывающих характеристик антитела -003, или -005, или -024 соответственно.
В одном воплощении СЭ38ВР обладает по меньшей мере приблизительно 50%, по меньшей мере приблизительно 60%, по меньшей мере приблизительно 70%, по меньшей мере приблизительно 80%, по меньшей мере приблизительно 90% или по меньшей мере приблизительно 95% сродства, авидности или специфичности антитела -003, или -005, или -024.
В одном воплощении СО38ВР конкурирует -003, либо -005, либо -024 за связывание СЭ38. В дальнейшем воплощении конкуренцию измеряют с помощью ЕЬ18А, как описано в разделе примеров. В другом дальнейшем воплощении конкуренцию измеряют с помощью РАС8, как описано в разделе примеров.
В одном воплощении СО38ВР специфически связывается с эпитопом СЭ38. причем эпитоп также специфически связывается антителом -003, или -005, или -024.
В одном воплощении СО38ВР связывается с СЭ38 человека с большим сродством, чем -003, или -005, или -024.
В одном воплощении СО38ВР обладает в основном такими же характеристиками специфического связывания СЭ38, как -003, или -005, или -024.
В одном воплощении СО38ВР в основном свободен от других связывающих СЭ38 пептидов.
В одном воплощении СО38ВР настоящего изобретения является антителом. В дальнейшем воплощении СО38ВР является антителом человека. В другом дальнейшем воплощении СЭ38ВР является гуманизированным антителом. В другом дальнейшем воплощении СО38ВР является химерным антителом.
В другом воплощении антитело настоящего изобретения является моноклональным антителом.
В одном воплощении антитело согласно настоящему изобретению является 1§С1, 1§С2, 1§С3, 1§С4, 1§ϋ, 1дА, 1дЕ или 1дМ антителом. В дальнейшем воплощении антитело является 1§С1 антителом. В дальнейшем воплощении антитело является 1дО1,к антителом. В другом дальнейшем воплощении антитело является 1дМ антителом. В другом дальнейшем воплощении антитело является 1дМ,к антителом.
В одном воплощении антитело согласно настоящему изобретению является фрагментом антитела или одиночной цепью антителом.
В одном воплощении СО38ВР гликозилирован в эукариотической клетке.
В одном воплощении СО38ВР далее включает линкер хелатор для присоединения радиоизотопа.
В одном воплощении СО38ВР находится в основном в изолированной форме.
Настоящее изобретение представляет изолированную нуклеиновую кислоту, кодирующую СО38ВР настоящего изобретения.
Настоящее изобретение представляет экспрессирующий вектор, включающий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую СО38ВР согласно настоящему изобретению.
В одном воплощении экспрессирующий вектор включает Уъ нуклеотидную последовательность согласно 8ЕО ГО N0:1, Ун нуклеотидную последовательность согласно 8ЕО ГО N0:6 или Уъ нуклеотидную последовательность согласно 8ЕО ГО N0:1 и Ун нуклеотидную последовательность согласно 8ЕО ГО N0:6.
В одном воплощении экспрессирующий вектор включает Уъ нуклеотидную последовательность согласно 8ЕО ГО N0:11, Ун нуклеотидную последовательность согласно 8ЕО ГО N0:16 или Уъ нуклеотидную последовательность согласно 8Е0 ГО N0:11 и Ун нуклеотидную последовательность согласно 8Е0 ГО N0:16.
В одном воплощении экспрессирующий вектор включает У|, нуклеотидную последовательность согласно 8Е0 ГО N0:21, Ун нуклеотидную последовательность согласно 8Е0 ГО N0:26 или У|, нуклеотидную последовательность согласно 8Е0 ГО N0:21 и Ун нуклеотидную последовательность согласно 8Е0 ГО N0:26.
В дальнейшем воплощении экспрессирующий вектор далее включает нуклеотидную последовательность, кодирующую константный район легкой цепи, тяжелой цепи или обеих легкой и тяжелой цепей антитела человека.
В дальнейшем воплощении нуклеотидная последовательность, кодирующая константный район легкой цепи, тяжелой цепи или обеих легкой и тяжелой цепей антитела человека, кодирует 1§С1 антитело.
Настоящее изобретение представляет гибридому, которая продуцирует моноклональное анти-СО38 антитело человека, кодируемое нуклеиновыми кислотами легкой цепи человека и тяжелой цепи человека, включающими нуклеотидные последовательности в вариабельном районе легкой цепи согласно 8Е0 ГО N0:1, или консервативные модификации их последовательностей, и нуклеотидные последовательности в вариабельном районе тяжелой цепи согласно 8Е0 ГО N0:6, или консервативные модификации их последовательностей. В одном воплощении нуклеиновая кислота легкой цепи человека включает нуклеотидную последовательность согласно 8Е0 ГО N0:1 и нуклеиновая кислота тяжелой цепи человека включает нуклеотидную последовательность согласно 8Е0 ГО N0:6.
Настоящее изобретение представляет гибридому, которая продуцирует моноклональное анти-СО38
- 14 015584 антитело человека, включающее вариабельные районы тяжелой цепи человека и легкой цепи человека, которые включают вариабельную аминокислотную последовательность легкой цепи человека согласно 8Е0 ΙΌ N0:2, или консервативные модификации этой последовательности и вариабельную аминокислотную последовательность тяжелой цепи человека согласно 8Е0 ГО N0:7, или консервативные модификации этой последовательности. В одном воплощении вариабельный район легкой цепи человека включает аминокислотную последовательность согласно 8Е0 ГО N0:2 и вариабельный район тяжелой цепи человека включает аминокислотную последовательность согласно 8Е0 ГО N0:7.
Настоящее изобретение представляет трансфектому, которая продуцирует моноклональное антиСЭ38 антитело человека, кодируемое нуклеиновыми кислотами вариабельного района легкой цепи человека согласно 8Е0 ГО N0:1, или консервативными модификациями этой последовательности и нуклеиновыми кислотами тяжелой цепи человека согласно 8Е0 ГО N0:6 или консервативными модификациями этой последовательности. В одном воплощении моноклональное анти-СО38 антитело человека кодируется нуклеиновыми кислотами вариабельного района легкой цепи человека согласно 8Е0 ГО N0:1 и нуклеиновыми кислотами тяжелой цепи человека согласно 8Е0 ГО N0:6.
Настоящее изобретение представляет трансфектому, которая продуцирует моноклональное антиСЭ38 антитело человека, включающее вариабельные районы тяжелой цепи человека и легкой цепи человека, которые включают вариабельную аминокислотную последовательность легкой цепи человека согласно 8Е0 ГО N0:2, или консервативные модификации этой последовательности и вариабельную аминокислотную последовательность тяжелой цепи человека согласно 8Е0 ГО N0:7, или консервативные модификации этой последовательности. В одном воплощении легкая цепь человека включает вариабельную аминокислотную последовательность согласно 8Е0 ГО N0:2 и тяжелая цепь человека включает вариабельную аминокислотную последовательность согласно 8Е0 ГО N0:7.
Настоящее изобретение представляет гибридому, которая продуцирует моноклональное анти-СО38 антитело человека, кодируемое нуклеиновыми кислотами легкой цепи человека и тяжелой цепи человека, включающими нуклеотидные последовательности в вариабельном районе легкой цепи согласно 8Е0 ГО N0:11, или консервативные модификации этих последовательностей и нуклеотидные последовательности в вариабельном районе тяжелой цепи согласно 8Е0 ГО N0:16, или консервативные модификации этих последовательностей. В одном воплощении нуклеиновая кислота легкой цепи человека включает нуклеотидную последовательность согласно 8Е0 ГО N0:11 и нуклеиновая кислота тяжелой цепи человека включает нуклеотидную последовательность согласно 8Е0 ГО N0:16.
Настоящее изобретение представляет гибридому, которая продуцирует моноклональное анти-СО38 антитело человека, включающее вариабельные районы тяжелой цепи человека и легкой цепи человека, которые включают аминокислотную последовательность в вариабельном районе легкой цепи согласно 8Е0 ГО N0:12, или консервативные модификации этой последовательности и аминокислотную последовательность в вариабельном районе тяжелой цепи согласно 8Е0 ГО N0:17, или консервативные модификации этой последовательности. В одном воплощении вариабельный район легкой цепи человека включает аминокислотную последовательность согласно 8Е0 ГО N0:12 и вариабельный район тяжелой цепи человека включает аминокислотную последовательность согласно 8Е0 ГО N0:17.
Настоящее изобретение представляет трансфектому, которая продуцирует моноклональное антиСЭ38 антитело человека, кодируемое нуклеиновыми кислотами вариабельного района легкой цепи человека согласно 8Е0 ГО N0:11, или консервативными модификациями этой последовательности и нуклеиновыми кислотами тяжелой цепи человека согласно 8Е0 ГО N0:16 или консервативными модификациями этой последовательности. В одном воплощении моноклональное анти-СО38 антитело человека кодируется нуклеиновыми кислотами вариабельного района легкой цепи человека согласно 8Е0 ГО N0:11 и нуклеиновыми кислотами тяжелой цепи человека согласно 8Е0 ГО N0:16.
Настоящее изобретение представляет трансфектому, которая продуцирует моноклональное антиС.ГО38 антитело человека, включающее вариабельные районы легкой цепи человека и тяжелой цепи человека, которые включают вариабельную аминокислотную последовательность легкой цепи человека согласно 8Е0 ГО N0:12, или консервативные модификации этой последовательности и вариабельную аминокислотную последовательность тяжелой цепи человека согласно 8Е0 ГО N0:17, или консервативные модификации этой последовательности. В одном воплощении легкая цепь человека включает вариабельную аминокислотную последовательность согласно 8Е0 ГО N0:12 и тяжелая цепь человека включает вариабельную аминокислотную последовательность согласно 8Е0 ГО N0:17.
Настоящее изобретение представляет гибридому, которая продуцирует моноклональное анти-СО38 антитело человека, кодируемое нуклеиновыми кислотами легкой цепи человека и тяжелой цепи человека, включающими нуклеотидную последовательность в вариабельном районе легкой цепи согласно 8Е0 ГО N0:21, или консервативные модификации этой последовательности и нуклеотидную последовательность в вариабельном районе тяжелой цепи согласно 8Е0 ГО N0:26, или консервативные модификации этой последовательности. В одном воплощении нуклеиновая кислота легкой цепи человека включает нуклеотидную последовательность согласно 8Е0 ГО N0:21 и нуклеиновая кислота тяжелой цепи человека включает нуклеотидную последовательность согласно 8Е0 ГО N0:26.
Настоящее изобретение представляет гибридому, которая продуцирует моноклональное анти-СГО38
- 15 015584 антитело человека, включающее вариабельные районы тяжелой цепи человека и легкой цепи человека, которые включают вариабельную аминокислотную последовательность легкой цепи человека согласно 8Е0 ΙΌ N0:22, или консервативные модификации этой последовательности и вариабельную аминокислотную последовательность тяжелой цепи согласно 8Е0 ΙΌ N0:27, или консервативные модификации этой последовательности. В одном воплощении вариабельный район легкой цепи человека включает аминокислотную последовательность согласно 8Е0 ΙΌ N0:22 и вариабельный район тяжелой цепи человека включает аминокислотную последовательность согласно 8Е0 ΙΌ N0:27.
Настоящее изобретение представляет трансфектому, которая продуцирует моноклональное антиСЭ38 антитело человека, кодируемое нуклеиновыми кислотами вариабельного района легкой цепи человека согласно 8Е0 ΙΌ N0:21, или консервативными модификациями этой последовательности и нуклеиновыми кислотами тяжелой цепи человека согласно 8Е0 ΙΌ N0:26 или консервативными модификациями этой последовательности. В одном воплощении моноклональное анти-СО38 антитело человека кодируется нуклеиновыми кислотами вариабельного района легкой цепи человека согласно 8Е0 ΙΌ N0:21 и нуклеиновыми кислотами тяжелой цепи человека согласно 8Е0 ΙΌ N0:26.
Настоящее изобретение представляет трансфектому, которая продуцирует моноклональное антиСЭ38 антитело человека, включающее вариабельные районы легкой цепи человека и тяжелой цепи человека, которые включают вариабельную аминокислотную последовательность легкой цепи человека согласно 8Е0 ΙΌ N0:22, или консервативные модификации этой последовательности и вариабельную аминокислотную последовательность тяжелой цепи человека согласно 8Е0 ΙΌ N0:27, или консервативные модификации этой последовательности. В одном воплощении легкая цепь человека включает вариабельную аминокислотную последовательность согласно 8Е0 ΙΌ N0:22 и тяжелая цепь человека включает вариабельную аминокислотную последовательность согласно 8Е0 ΙΌ N0:27.
Настоящее изобретение представляет эукариотическую или прокариотическую клетку хозяина, которая продуцирует СО38ВР согласно настоящему изобретению.
Настоящее изобретение представляет эукариотическую или прокариотическую клетку хозяина, содержащую экспрессирующий вектор, согласно настоящему изобретению.
Настоящее изобретение представляет трансгенное животное, отличное от человека, или растение, включающие нуклеиновые кислоты, кодирующие тяжелую цепь человека и легкую цепь человека, где животное или растение продуцирует детектируемое количество СЭ38ВР, согласно настоящему изобретению.
Настоящее изобретение представляет иммуноконъюгат, включающий СО38ВР согласно настоящему изобретению, соединенный с цитотоксическим агентом, радиоизотопом или лекарством. В одном воплощении пептид является мономерным Ι§Μ антителом, соединенным с цитотоксическим агентом, радиоизотопом или лекарством.
Настоящее изобретение представляет биспецифичную или мультиспецифичную молекулу, включающую СЭ38ВР согласно настоящему изобретению, и специфичность связывания эффекторной клетки человека. В одном воплощении специфичность связывания эффекторной клетки человека является специфичностью связывания СЭ3, СЭ4, СО138, ΙΕ-15Κ, мембраносвязанного или связанного с рецептором ТР№а, Рс рецептором человека или мембраносвязанного или связанного с рецептором ГЬ-15.
Настоящее изобретение представляет антиидиотипическое антитело, связывающееся с СЭ38ВР согласно настоящему изобретению.
Настоящее изобретение представляет применение антиидиотипического антитела согласно настоящему изобретению для детектирования уровня моноклонального антитела человека против СЭ38 в образце.
Далее следует список избранных воплощений настоящего изобретения.
Воплощение 1: антитело, связывающееся с СЭ38 человека, кодируемое нуклеиновыми кислотами легкой цепи человека и тяжелой цепи человека, включающими нуклеотидные последовательности в их вариабельных районах согласно 8Е0 ΙΌ N0:1 и 8Е0 ΙΌ N0:6 соответственно или консервативные модификации их последовательности.
Воплощение 2: антитело, связывающееся с СЭ38 человека, кодируемое нуклеиновыми кислотами легкой цепи человека и тяжелой цепи человека, включающими нуклеотидные последовательности в их вариабельных районах согласно 8Е0 ΙΌ N0:1 и 8Е0 ΙΌ N0:6 соответственно.
Воплощение 3: антитело, связывающееся с СЭ38 человека, кодируемое нуклеиновыми кислотами легкой цепи человека и тяжелой цепи человека, включающими нуклеотидные последовательности в их вариабельных районах согласно 8Е0 ΙΌ N0:11 и 8Е0 ΙΌ N0:16 соответственно или консервативные модификации их последовательности.
Воплощение 4: антитело, связывающееся с СЭ38 человека, кодируемое нуклеиновыми кислотами легкой цепи человека и тяжелой цепи человека, включающими нуклеотидные последовательности в их вариабельных районах согласно 8Е0 ΙΌ N0:11 и 8Е0 ΙΌ N0:16 соответственно.
Воплощение 5: антитело, связывающееся с СЭ38 человека, кодируемое нуклеиновыми кислотами легкой цепи человека и тяжелой цепи человека, включающими нуклеотидные последовательности в их вариабельных районах согласно 8Е0 ΙΌ N0:21 и 8Е0 ΙΌ N0:26 соответственно или консервативные мо
- 16 015584 дификации их последовательности.
Воплощение 6: антитело, связывающееся с СЭ38 человека, кодируемое нуклеиновыми кислотами легкой цепи человека и тяжелой цепи человека, включающими нуклеотидные последовательности в их вариабельных районах согласно 8Е0 ΙΌ ΝΌ:21 и 8Е0 ΙΌ ΝΌ:26 соответственно.
Воплощение 7: пептид, который конкурирует с антителом согласно воплощению 2 за связывание с СО38.
Воплощение 8: пептид по воплощению 7, где конкуренцию определяют с помощью ЕЬ1§А, как описано в примере 8 или 9 изобретения.
Воплощение 9: пептид по воплощению 7, где конкуренцию определяют с помощью измерения перекрестного блокирования, как описано в примере 7 изобретения.
Воплощение 10: пептид, который специфически связывается с эпитопом СЭ38. где эпитоп также специфически связывается антителом согласно воплощению 2.
Воплощение 11: пептид, обладающий в основном такими же характеристиками специфического связывания для связывания СЭ38 человека, как антитело согласно воплощению 2.
Воплощение 12: пептид, включающий Уъ СЭКЕ состоящий в основном из 8ЕО ΙΌ ΝΌ:3.
Воплощение 13: пептид, включающий Уь СОК.2, состоящий в основном из 8ЕО ΙΌ ΝΌ:4.
Воплощение 14: пептид, включающий Уъ СОКЗ, состоящий в основном из 8ЕО ΙΌ ΝΌ:5.
Воплощение 15: пептид согласно воплощению 14, где пептид включает также Уь СЭКЕ состоящий в основном из 8ЕО ΙΌ ΝΌ:3.
Воплощение 16: пептид согласно воплощению 14, где пептид включает также Уь СОК2, состоящий в основном из 8ЕО ΙΌ ΝΌ:4.
Воплощение 17: пептид согласно воплощению 16, где пептид включает также Уь СЭКЕ состоящий в основном из 8ЕО ΙΌ ΝΌ:3.
Воплощение 18: пептид, включающий УН СОК1, состоящий в основном из 8ЕО ΙΌ ΝΌ:8.
Воплощение 19: пептид, включающий УН СОК2, состоящий в основном из 8ЕО ΙΌ ΝΌ:9.
Воплощение 20: пептид, включающий УН СОКЗ, состоящий в основном из 8ЕО ΙΌ ΝΌ:10.
Воплощение 21: пептид согласно воплощению 20, где пептид включает также УН СОК1, состоящий в основном из 8ЕО ΙΌ ΝΌ:8.
Воплощение 22: пептид согласно воплощению 20, где пептид включает также УН СОК2, состоящий в основном из 8ЕО ΙΌ ΝΌ:9.
Воплощение 23: пептид согласно воплощению 22, где пептид включает также УН СОК1, состоящий в основном из 8ЕО ΙΌ ΝΌ:8.
Воплощение 24: пептид, включающий:
(а) первый Уъ район, включающий три Уъ СОК, которые независимо друг от друга состоят в основном из 8ЕО ΙΌ ΝΌ:3, 4 и 5, и (б) первый УН район, включающий три УН СОК, которые независимо друг от друга состоят в основном из 8ЕО ΙΌ ΝΌ:8, 9 и 10.
Воплощение 25: пептид согласно воплощению 24, где Уъ район и УН район, оба, находятся на одной и той же цепи пептида.
Воплощение 26: пептид согласно воплощению 24, где Уь район и УН район разделены гибким линкером.
Воплощение 27: пептид согласно воплощению 24, где Уь район и УН район находятся на разных цепях пептида.
Воплощение 28: пептид согласно воплощению 24, где Уь район и УН район находятся на разных цепях пептида в скрученном белке иммуноглобулина.
Воплощение 29: пептид согласно воплощениям 24-28, где первый Уъ район и первый УН район ориентированы таким образом, что три СОК в Уъ районе и три СОК в УН районе кооперативно связаны так, чтобы вносить вклад в избирательное и/или специфическое связывание антигенной детерминанты СЭ38 человека.
Воплощение 30: пептид согласно воплощению 29, где пептид включает второй Уъ район, идентичный первому Уь району, и второй УН район, идентичный первому УН району, где второй Уъ район и второй УН район кооперативно связаны так, чтобы вносить вклад в избирательное и/или специфическое связывание антигенной детерминанты СЭ38 человека.
Воплощение 31: пептид, включающий Уъ район, который является функциональным вариантом Уъ района антитела согласно воплощению 2.
Воплощение 32: пептид согласно воплощению 31, где Уь район пептида состоит в основном из последовательности, обладающей по меньшей мере приблизительно 50%, по меньшей мере приблизительно 60%, по меньшей мере приблизительно 70%, по меньшей мере приблизительно 75%, по меньшей мере приблизительно 80%, по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95% идентичностью последовательности аминокислот последовательности согласно 8ЕО ΙΌ ΝΌ:2.
- 17 015584
Воплощение 33: пептид, включающий УН район, который является функциональным вариантом УН района антитела согласно воплощению 2.
Воплощение 34: пептид согласно воплощению 33, где УН район пептида состоит в основном из последовательности, обладающей по меньшей мере приблизительно 50%, по меньшей мере приблизительно 60%, по меньшей мере приблизительно 70%, по меньшей мере приблизительно 75%, по меньшей мере приблизительно 80%, по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95% идентичностью последовательности аминокислот последовательности согласно 8ЕО ГО N0:7.
Воплощение 35: пептид, включающий по меньшей мере один СЭК, являющийся функциональным вариантом СЭК антитела согласно воплощению 2.
Воплощение 36: пептид согласно воплощению 35, где по меньшей мере один СЭК пептида состоит в основном из последовательности, обладающей по меньшей мере приблизительно 50%, по меньшей мере приблизительно 60%, по меньшей мере приблизительно 70%, по меньшей мере приблизительно 75%, по меньшей мере приблизительно 80%, по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95% идентичностью последовательности аминокислот последовательности согласно 8ЕО ГО N0:3-5, 8-10.
Воплощение 37: пептид согласно любому воплощению от 31 до 36, где пептид обладает по меньшей мере приблизительно 50%, по меньшей мере приблизительно 60%, по меньшей мере приблизительно 70%, по меньшей мере приблизительно 75%, по меньшей мере приблизительно 80%, по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95% эпитопсвязывающих характеристик антитела согласно воплощению 2.
Воплощение 38: пептид согласно любому воплощению от 31 до 36, где пептид обладает по меньшей мере приблизительно 50%, по меньшей мере приблизительно 60%, по меньшей мере приблизительно 70%, по меньшей мере приблизительно 75%, по меньшей мере приблизительно 80%, по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95% сродства, авидности или специфичности антитела согласно воплощению 2.
Воплощение 39: пептид согласно любому воплощению от 12 до 38, где пептид специфически связывает ΟΌ38 человека.
Воплощение 40: пептид согласно любому воплощению от 12 до 39, где пептид конкурирует с антителом согласно воплощению 2 за связывание ΟΌ38.
Воплощение 41: пептид согласно воплощению 40, где конкуренцию определяют с помощью ЕЫ8А, как описано в примере 8 или 9 изобретения.
Воплощение 42: пептид согласно воплощению 7, где конкуренцию определяют с помощью определения перекрестной блокировки, как описано в примере 7 изобретения.
Воплощение 43: пептид согласно воплощению 39, где пептид специфически связывается с эпитопом ΟΌ38, причем эпитоп также специфически связывается антителом согласно воплощению 2.
Воплощение 44: пептид согласно любому воплощению от 39 до 43, где пептид связывается с ΟΌ38 человека с большим сродством, чем антитело согласно воплощению 2.
Воплощение 45: пептид согласно любому воплощению от 39 до 43, где пептид обладает в основном такими же характеристиками специфического связывания ΟΌ38, как антитело согласно воплощению 2.
Воплощение 46: пептид согласно любому воплощению от 39 до 45, где пептид, связывающий ΟΌ38, в основном свободен от других пептидов, связывающих ΟΌ38.
Воплощение 47: пептид, который связывается с ΟΌ38 человека (8Е0 ГО N0:31) и не связывается с мутантным ΟΌ38 человека, где остаток серина в положении 274 замещен остатком фенилаланина (8Е0 ГО N0:34) в той же степени, как он связывается с ΟΌ38 человека (8Е0 ГО N0:31).
Воплощение 48: пептид согласно воплощению 47, где ЕС50 для связывания пептида с мутантным ΟΌ38 человека, где остаток серина в положении 274 замещен остатком фенилаланина (8Е0 ГО N0:34), составляет менее 50% величины ЕС50 для связывания пептида с ΟΌ38 человека (8Е0 ГО N0:31).
Воплощение 49: пептид согласно воплощению 48, где ЕС50 для связывания пептида с мутантным ΟΌ38 человека, где остаток серина в положении 274 замещен остатком фенилаланина (8Е0 ГО N0:34), составляет менее 10% ЕС50 для связывания пептида с ΟΌ38 человека (8Е0 ГО N0:31).
Воплощение 50: пептид согласно воплощению 49, где ЕС50 для связывания пептида с мутантным ΟΌ38 человека, где остаток серина в положении 274 замещен остатком фенилаланина (8Е0 ГО N0:34), составляет менее 5% ЕС50 для связывания пептида с ΟΌ38 человека (8Е0 ГО N0:31).
Воплощение 51: пептид согласно воплощению 50, где ЕС50 для связывания пептида с мутантным ΟΌ38 человека, где остаток серина в положении 274 замещен остатком фенилаланина (8Е0 ГО N0:34), составляет менее 1% ЕС50 для связывания пептида с ΟΌ38 человека (8Е0 ГО N0:31).
Воплощение 52: пептид, который связывается с ΟΌ38 человека (8Е0 ГО N0:31) и не связывается с мутантным ΟΌ38 человека, где остаток глутамина в положении 272 замещен остатком аргинина (8Е0 ГО N0:33) в той же степени, как оно связывается с ΟΌ38 человека (8Е0 ГО N0:31).
Воплощение 53: пептид согласно воплощению 52, где ЕС50 для связывания пептида с мутантным ΟΌ38 человека, где остаток серина в положении 274 замещен остатком фенилаланина (8Е0 ГО N0:34),
- 18 015584 составляет менее 50% величины ЕС50 для связывания пептида с СЭ38 человека (8Е0 ΙΌ N0:31).
Воплощение 54: пептид согласно воплощению 53, где ЕС50 для связывания пептида с мутантным СЭ38 человека, где остаток серина в положении 274 замещен остатком фенилаланина (8Е0 ΙΌ N0:34), составляет менее 10% величины ЕС50 для связывания пептида с СЭ38 человека (8Е0 ΙΌ N0:31).
Воплощение 55: пептид согласно любому воплощению от 47 до 51, который не связывается с мутантным СЭ38 человека, где остаток глутамина в положении 272 замещен остатком аргинина (8Е0 ΙΌ N0:33) в той же степени, как оно связывается с СЭ38 человека (8Е0 ΙΌ N0:31).
Воплощение 56: пептид согласно воплощению 55, где ЕС50 для связывания пептида с мутантным СЭ38 человека, где остаток серина в положении 274 замещен остатком фенилаланина (8Е0 ΙΌ N0:34), составляет менее 50% величины ЕС50 для связывания пептида с СЭ38 человека (8Е0 ΙΌ N0:31).
Воплощение 57: пептид согласно воплощению 55, где ЕС50 для связывания пептида с мутантным СЭ38 человека, где остаток серина в положении 274 замещен остатком фенилаланина (8Е0 ΙΌ N0:34), составляет менее 10% величины ЕС50 для связывания пептида с СЭ38 человека (8Е0 ΙΌ N0:31).
Воплощение 58: пептид согласно любому воплощению от 47 до 57, где упомянутый пептид связывается с мутантным СЭ38 человека, где остаток треонина в положении 237 замещен остатком аланина (8Е0 ΙΌ N0:32) в той же степени, как оно связывается с СЭ38 человека (8Е0 ΙΌ N0:31).
Воплощение 59: пептид согласно воплощению 58, где ЕС50 для связывания пептида с мутантным СЭ38 человека, где остаток треонина в положении 237 замещен остатком аланина (8Е0 ПЭ N0:32), составляет более 75% величины ЕС50 для связывания пептида с СЭ38 человека (8Е0 ΙΌ N0:31).
Воплощение 60: пептид согласно воплощению 59, где ЕС50 для связывания пептида с мутантным СЭ38 человека, где остаток треонина в положении 237 замещен остатком аланина (8Е0 ПЭ N0:32), составляет более 85% величины ЕС50 для связывания пептида с СЭ38 человека (8Е0 ΙΌ N0:31).
Воплощение 61: пептид согласно воплощению 60, где ЕС50 для связывания пептида с мутантным СЭ38 человека, где остаток треонина в положении 237 замещен остатком аланина (8Е0 ПЭ N0:32), составляет более 90% величины ЕС50 для связывания пептида с СЭ38 человека (8Е0 ΙΌ N0:31).
Воплощение 62: пептид согласно воплощению 61, где ЕС50 для связывания пептида с мутантным СЭ38 человека, где остаток треонина в положении 237 замещен остатком аланина (8Е0 ПЭ N0:32), составляет более 95% величины ЕС50 для связывания пептида с СЭ38 человека (8Е0 ΙΌ N0:31).
Воплощение 63: пептид, который конкурирует с антителом согласно воплощению 4 за связывание ΟΌ38.
Воплощение 64: пептид согласно воплощению 63, где конкуренцию определяют с помощью ЕЫ8А, как описано в примере 8 или 9 изобретения.
Воплощение 65: пептид согласно воплощению 63, где конкуренцию определяют с помощью измерения перекрестного блокирования, как описано в примере 7 изобретения.
Воплощение 66: пептид, который специфически связывается с эпитопом СЭ38, причем эпитоп также специфически связывается антителом согласно воплощению 4.
Воплощение 67: пептид, обладающий в основном такими же характеристиками специфического связывания СЭ38, как антитело согласно воплощению 4.
Воплощение 68: пептид, включающий Уь 0ΌΒ1, состоящий в основном из 8Е0 ΙΌ N0:13.
Воплощение 69: пептид, включающий Уь 0ΌΒ2, состоящий в основном из 8Е0 ΙΌ N0:14.
Воплощение 70: пептид, включающий Уь 0ΌΒ3, состоящий в основном из 8Е0 ΙΌ N0:15.
Воплощение 71: пептид согласно воплощению 70, где пептид включает также Уь 0ΌΒ1, состоящий в основном из 8Е0 ΙΌ N0:13.
Воплощение 72: пептид согласно воплощению 70, где пептид включает также Уь 0ΌΒ2, состоящий в основном из 8Е0 ΙΌ N0:14.
Воплощение 73: пептид согласно воплощению 72, где пептид включает также Уь СЭКЕ состоящий в основном из 8Е0 ΙΌ N0:13.
Воплощение 74: пептид, включающий Ун СЭКЕ состоящий в основном из 8Е0 ΙΌ N0:18.
Воплощение 75: пептид, включающий νΗ 0ΌΒ2, состоящий в основном из 8Е0 ΙΌ N0:19.
Воплощение 76: пептид, включающий νΗ 0ΌΒ3, состоящий в основном из 8Е0 ΙΌ N0:20.
Воплощение 77: пептид согласно воплощению 76, где пептид включает также Ун СЭКЕ состоящий в основном из 8Е0 ΙΌ N0:18.
Воплощение 78: пептид согласно воплощению 76, где пептид включает также Ун СЭК2, состоящий в основном из 8Е0 ΙΌ N0:19.
Воплощение 79: пептид согласно воплощению 78, где пептид включает также Ун СЭКЕ состоящий в основном из 8Е0 ΙΌ N0:18.
Воплощение 80: пептид, включающий:
(а) первый Уь район, включающий три Уь СЭК, которые независимо друг от друга состоят в основном из 8Е0 ΙΌ N0:13, 14 и 15, и (б) первый Ун район, включающий три Ун СЭК, которые независимо друг от друга состоят в основном из 8Е0 ΙΌ N0:18-20.
Воплощение 81: пептид согласно воплощению 80, где Уь район и Ун район, оба, находятся на одной
- 19 015584 и той же цепи пептида.
Воплощение 82: пептид согласно воплощению 81, где ν,. район и νΗ район разделены гибким линкером.
Воплощение 83: пептид согласно воплощению 80, где V район и νΗ район находятся на разных цепях пептида.
Воплощение 84: пептид согласно воплощению 83, где Уъ район и νΗ район находятся на разных цепях пептида в скрученном белке иммуноглобулина.
Воплощение 85: пептид согласно воплощениям 80-84, где первый V район и первый νΗ район ориентированы таким образом, что три СЭВ в VI, районе и три СЭВ в νΗ районе кооперативно связаны так, чтобы вносить вклад в избирательное и/или специфическое связывание антигенной детерминанты СЭ38 человека.
Воплощение 8б: пептид согласно воплощению 85, где пептид включает второй νι. район, идентичный первому ν району, и второй νΗ район, идентичный первому νΗ району, где второй У9 район и второй νΗ район кооперативно связаны так, чтобы вносить вклад в избирательное и/или специфическое связывание антигенной детерминанты СЭ38 человека.
Воплощение 87: пептид, включающий νί, район, который является функциональным вариантом νι. района антитела согласно воплощению 4.
Воплощение 88: пептид согласно воплощению 87, где ν,. район пептида состоит в основном из последовательности, обладающей по меньшей мере приблизительно 50%, по меньшей мере приблизительно б0%, по меньшей мере приблизительно 70%, по меньшей мере приблизительно 75%, по меньшей мере приблизительно 80%, по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95% идентичностью последовательности аминокислот последовательности согласно 8ЕЦ ΙΌ N0:12.
Воплощение 89: пептид, включающий νΗ район, который является функциональным вариантом νΗ района антитела согласно воплощению 4.
Воплощение 90: пептид согласно воплощению 89, где νΗ район пептида состоит в основном из последовательности, обладающей по меньшей мере приблизительно 50%, по меньшей мере приблизительно б0%, по меньшей мере приблизительно 70%, по меньшей мере приблизительно 75%, по меньшей мере приблизительно 80%, по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95% идентичностью последовательности аминокислот последовательности согласно 8ЕЦ ΙΌ N0:17.
Воплощение 91: пептид, включающий по меньшей мере один из СОЯ, являющийся функциональным вариантом СОЯ антитела согласно воплощению 4.
Воплощение 92: пептид согласно воплощению 91, где по меньшей мере один из СОЯ пептида состоит в основном из последовательности, обладающей по меньшей мере приблизительно 50%, по меньшей мере приблизительно б0%, по меньшей мере приблизительно 70%, по меньшей мере приблизительно 75%, по меньшей мере приблизительно 80%, по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95% идентичностью последовательности аминокислот последовательности согласно 8ЕЦ ΙΌ N0:13-15, 18-20.
Воплощение 93: пептид согласно любому воплощению от 87 до 92, где пептид обладает по меньшей мере приблизительно 50%, по меньшей мере приблизительно б0%, по меньшей мере приблизительно 70%, по меньшей мере приблизительно 75%, по меньшей мере приблизительно 80%, по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95% эпитопсвязывающих характеристик антитела согласно воплощению 4.
Воплощение 94: пептид согласно любому воплощению от 87 до 92, где пептид обладает по меньшей мере приблизительно 50%, по меньшей мере приблизительно б0%, по меньшей мере приблизительно 70%, по меньшей мере приблизительно 75%, по меньшей мере приблизительно 80%, по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95% сродства, авидности или специфичности антитела согласно воплощению 4.
Воплощение 95: пептид согласно любому воплощению от б8 до 94, где пептид специфически связывает СЭ38 человека.
Воплощение 9б: пептид согласно любому воплощению от б8 до 95, где пептид конкурирует с антителом согласно воплощению 4 за связывание ί.Ό38.
Воплощение 97: пептид согласно воплощению 9б, где конкуренцию определяют с помощью ЕЫ8Л, как описано в примере 8 или 9 изобретения.
Воплощение 98: пептид согласно воплощению 9б, где конкуренцию определяют с помощью определения перекрестного блокирования, как описано в примере 7 изобретения.
Воплощение 99: пептид согласно воплощению 95, где пептид специфически связывается с эпитопом ί.Ό38. причем эпитоп также специфически связывается антителом согласно воплощению 4.
Воплощение 100: пептид согласно любому воплощению от 95 до 99, где пептид связывается с ί.Ό38 человека с большим сродством, чем антитело согласно воплощению 4.
- 20 015584
Воплощение 101: пептид согласно любому воплощению от 95 до 99, где пептид обладает в основном такими же характеристиками специфического связывания ΟΌ38. как антитело согласно воплощению 4.
Воплощение 102: пептид согласно любому воплощению от 95 до 101, где пептид, связывающий СЭ38, в основном свободен от других пептидов, связывающих ΟΌ38.
Воплощение 103: пептид согласно любому воплощению от 63 до 102, который связывается с ΟΌ38 человека (8ЕО ΙΌ N0:31) и не связывается с мутантным ΟΌ38 человека, где остаток серина в положении 274 замещен остатком фенилаланина (8Е0 ΙΌ N0:34) в той же степени, как он связывается с ΟΌ38 человека (8ЕО ΙΌ N0:31).
Воплощение 104: пептид согласно воплощению 103, где ЕС50 для связывания пептида с мутантным ΟΌ38 человека, где остаток серина в положении 274 замещен остатком фенилаланина (8Е0 ΙΌ N0:34), составляет менее 50% ЕС50 для связывания пептида с ΟΌ38 человека (8Е0 ΙΌ N0:31).
Воплощение 105: пептид согласно воплощению 104, где ЕС50 для связывания пептида с мутантным ΟΌ38 человека, где остаток серина в положении 274 замещен остатком фенилаланина (8Е0 ΙΌ N0:34), составляет менее 10% ЕС50 для связывания пептида с ΟΌ38 человека (8Е0 ΙΌ N0:31).
Воплощение 106: пептид согласно воплощению 105, где ЕС50 для связывания пептида с мутантным ΟΌ38 человека, где остаток серина в положении 274 замещен остатком фенилаланина (8Е0 ΙΌ N0:34), составляет менее 5% ЕС50 для связывания пептида с ΟΌ38 человека (8Е0 ΙΌ N0:31).
Воплощение 107: пептид согласно воплощению 106, где ЕС50 для связывания пептида с мутантным ΟΌ38 человека, где остаток серина в положении 274 замещен остатком фенилаланина (8Е0 ΙΌ N0:34), составляет менее 1% ЕС50 для связывания пептида с ΟΌ38 человека (8Е0 ΙΌ N0:31).
Воплощение 108: пептид, который связывается с ΟΌ38 человека (8Е0 ΙΌ N0:31) и не связывается с мутантным ΟΌ38 человека, где остаток глутамина в положении 272 замещен остатком аргинина (8Е0 ΙΌ N0:33) в той же степени, как он связывается с ΟΌ38 человека (8Е0 ΙΌ N0:31).
Воплощение 109: пептид согласно воплощению 108, где ЕС50 для связывания пептида с мутантным ΟΌ38 человека, где остаток серина в положении 274 замещен остатком фенилаланина (8Е0 ΙΌ N0:34), составляет менее 50% величины ЕС50 для связывания пептида с ΟΌ38 человека (8Е0 ΙΌ N0:31).
Воплощение 110: пептид согласно воплощению 109, где ЕС50 для связывания пептида с мутантным ΟΌ38 человека, где остаток серина в положении 274 замещен остатком фенилаланина (8Е0 ΙΌ N0:34), составляет менее 10% величины ЕС50 для связывания пептида с ΟΌ38 человека (8Е0 ΙΌ N0:31).
Воплощение 111: пептид согласно любому воплощению от 103 до 107, который не связывается с мутантным ΟΌ38 человека, где остаток глутамина в положении 272 замещен остатком аргинина (8Е0 ΙΌ N0:33) в той же степени, как он связывается с ΟΌ38 человека (8Е0 ΙΌ N0:31).
Воплощение 112: пептид согласно воплощению 111, где ЕС50 для связывания пептида с мутантным ΟΌ38 человека, где остаток серина в положении 274 замещен остатком фенилаланина (8Е0 ΙΌ N0:34), составляет менее 50% величины ЕС50 для связывания пептида с ΟΌ38 человека (8Е0 ΙΌ N0:31).
Воплощение 113: пептид согласно воплощению 112, где ЕС50 для связывания пептида с мутантным ΟΌ38 человека, где остаток серина в положении 274 замещен остатком фенилаланина (8Е0 ΙΌ N0:34), составляет менее 10% величины ЕС50 для связывания пептида с ΟΌ38 человека (8Е0 ΙΌ N0:31).
Воплощение 114: пептид согласно любому воплощению от 103 до 113, где упомянутый пептид связывается с мутантным ΟΌ38 человека, где остаток треонина в положении 237 замещен остатком аланина (8Е0 ΙΌ N0:32) в той же степени, как он связывается с ΟΌ38 человека (8Е0 ΙΌ N0:31).
Воплощение 115: пептид согласно воплощению 114, где ЕС50 для связывания пептида с мутантным ΟΌ38 человека, где остаток треонина в положении 237 замещен остатком аланина (8Е0 ПЭ N0:32), составляет более 75% величины ЕС50 для связывания пептида с ΟΌ38 человека (8Е0 ΙΌ N0:31).
Воплощение 116: пептид согласно воплощению 115, где ЕС50 для связывания пептида с мутантным ΟΌ38 человека, где остаток треонина в положении 237 замещен остатком аланина (8Е0 ПЭ N0:32), составляет более 85% величины ЕС50 для связывания пептида с ΟΌ38 человека (8Е0 ΙΌ N0:31).
Воплощение 117: пептид согласно воплощению 116, где ЕС50 для связывания пептида с мутантным ΟΌ38 человека, где остаток треонина в положении 237 замещен остатком аланина (8Е0 ПЭ N0:32), составляет более 90% величины ЕС50 для связывания пептида с ΟΌ38 человека (8Е0 ΙΌ N0:31).
Воплощение 118: пептид согласно воплощению 117, где ЕС50 для связывания пептида с мутантным ΟΌ38 человека, где остаток треонина в положении 237 замещен остатком аланина (8Е0 ПЭ N0:32), составляет более 95% величины ЕС50 для связывания пептида с ΟΌ38 человека (8Е0 ΙΌ N0:31).
Воплощение 119: пептид, который конкурирует с антителом согласно воплощению 6 за связывание СО38.
Воплощение 120: пептид согласно воплощению 119, где конкуренцию определяют с помощью ΕΕΙ8Α, как описано в примере 8 или 9 изобретения.
Воплощение 121: пептид согласно воплощению 119, где конкуренцию определяют с помощью определения перекрестного блокирования, как описано в примере 7 изобретения.
Воплощение 122: пептид, который специфически связывается с эпитопом СЭ38, причем эпитоп также специфически связывается антителом согласно воплощению 6.
- 21 015584 пептид, включающий Уъ СБК1, состоящий в основном из 8ЕЦ ГО N0:23. пептид, включающий Уъ СБК2, состоящий в основном из 8ЕЦ ГО N0:24. пептид, включающий νι, СБК3, состоящий в основном из 8ЕЦ ГО N0:25. пептид согласно воплощению
126, где пептид включает также
Уь СБК1, состоявоплощению воплощению
126,
128, где пептид где пептид включает включает также также
Уь СБК2,
Уь СБК1,
Воплощение 123: пептид, обладающий в основном такими же характеристиками специфического связывания СБ38, как антитело согласно воплощению 6.
Воплощение 124:
Воплощение 125:
Воплощение 126:
Воплощение 127:
щий в основном из 8Е0 ГО N0:23.
Воплощение 128: пептид согласно щий в основном из 8Е0 ГО N0:24.
Воплощение 129: пептид согласно щий в основном из 8Е0 ГО N0:23.
Воплощение 130: пептид, включающий νΗ СБК1, состоящий в основном из 8ЕЦ ГО N0:28.
Воплощение 131: пептид, включающий νΗ СБК2, состоящий в основном из 8ЕЦ ГО N0:29.
Воплощение 132: пептид, включающий νΗ СБК3, состоящий в основном из 8ЕЦ ГО N0:30.
Воплощение 133: пептид согласно щий в основном из 8Е0 ГО N0:28.
Воплощение 134: пептид согласно щий в основном из 8Е0 ГО N0:29.
Воплощение 135: пептид согласно щий в основном из 8Е0 ГО N0:28.
Воплощение 136: пептид, включающий:
(а) первый νι, район, включающий три Уъ СБК, которые независимо друг от друга состоят в основном из 8ЕЦ ГО N0:23, 24 и 25, и (б) первый νΗ район, включающий три νΗ СБК, которые независимо друг от друга состоят в основном из 8ЕЦ ГО N0:28, 29 и 30.
Воплощение 137: пептид согласно воплощению 136, где Уъ район и νΗ район, оба, находятся на одной и той же цепи пептида.
воплощению воплощению воплощению
132,
132,
134, состоясостоягде пептид где пептид где пептид включает включает включает также также также νΗ СБК1, νΗ СБК2, νΗ СБК1, состоясостоясостояВоплощение 138: пептид согласно воплощению 137, где Уь район и νΗ район разделены гибким линкером.
Воплощение 139: пептид согласно воплощению 136, где Уь район и νΗ район находятся на разных цепях пептида.
Воплощение 140: пептид согласно воплощению 139, где Уь район и νΗ район находятся на разных цепях пептида в скрученном белке иммуноглобулина.
Воплощение 141: пептид согласно воплощениям 136-140, где первый Уъ район и первый νΗ район ориентированы таким образом, что три СБК в Уъ районе и три СБК в νΗ районе кооперативно связаны так, чтобы вносить вклад в избирательное и/или специфическое связывание антигенной детерминанты СГО38 человека.
Воплощение 142: пептид согласно воплощению 141, где пептид включает второй Уъ район, идентичный первому Уъ району, и второй νΗ район, идентичный первому νΗ району, где второй Уъ район и второй νΗ район кооперативно связаны так, чтобы вносить вклад в избирательное и/или специфическое связывание антигенной детерминанты СБ38 человека.
Воплощение 143: пептид, включающий Уъ район, который является функциональным вариантом Уъ района антитела согласно воплощению 6.
Воплощение 144: пептид согласно воплощению 143, где Уь район пептида состоит в основном из последовательности, обладающей по меньшей мере приблизительно 50%, по меньшей мере приблизительно 60%, по меньшей мере приблизительно 70%, по меньшей мере приблизительно 75%, по меньшей мере приблизительно 80%, по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95% идентичностью последовательности аминокислот последовательности согласно 8ЕЦ ГО N0:22.
Воплощение 145: пептид, включающий νΗ район, который является функциональным вариантом νΗ района антитела согласно воплощению 6.
Воплощение 146: пептид согласно воплощению 145, где νΗ район пептида состоит в основном из последовательности, обладающей по меньшей мере приблизительно 50%, по меньшей мере приблизительно 60%, по меньшей мере приблизительно 70%, по меньшей мере приблизительно 75%, по меньшей мере приблизительно 80%, по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95% идентичностью последовательности аминокислот последовательности согласно 8ЕЦ ГО N0:27.
Воплощение 147: пептид, включающий по меньшей мере один СБК, являющийся функциональным вариантом СБК антитела согласно воплощению 6.
Воплощение 148: пептид согласно воплощению 147, где по меньшей мере один СБК пептида состоит в основном из последовательности, обладающей по меньшей мере приблизительно 50%, по меньшей мере приблизительно 60%, по меньшей мере приблизительно 70%, по меньшей мере приблизитель
- 22 015584 но 75%, по меньшей мере приблизительно 80%, по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95% идентичностью последовательности аминокислот последовательности согласно 8ЕЦ ГО N0:23-25, 28-30.
Воплощение 149: пептид согласно любому воплощению от 143 до 148, где пептид обладает по меньшей мере приблизительно 50%, по меньшей мере приблизительно 60%, по меньшей мере приблизительно 70%, по меньшей мере приблизительно 75%, по меньшей мере приблизительно 80%, по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95% эпитопсвязывающих характеристик антитела согласно воплощению 6.
Воплощение 150: пептид согласно любому воплощению от 143 до 148, где пептид обладает по меньшей мере приблизительно 50%, по меньшей мере приблизительно 60%, по меньшей мере приблизительно 70%, по меньшей мере приблизительно 75%, по меньшей мере приблизительно 80%, по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95% сродства, авидности или специфичности антитела согласно воплощению 6.
Воплощение 151: пептид согласно любому воплощению от 124 до 150, где пептид специфически связывает СЭ38 человека.
Воплощение 152: пептид согласно любому воплощению от 124 до 151, где пептид конкурирует с антителом согласно воплощению 6 за связывание СЭ38.
Воплощение 153: пептид согласно воплощению 152, где конкуренцию определяют с помощью ЕЬ18А, как описано в примере 8 или 9 изобретения.
Воплощение 154: пептид согласно воплощению 152, где конкуренцию определяют с помощью определения перекрестного блокирования, как описано в примере 7 изобретения.
Воплощение 155: пептид согласно воплощению 151, где пептид специфически связывается с эпитопом СЭ38, причем эпитоп также специфически связывается антителом согласно воплощению 6.
Воплощение 156: пептид согласно любому воплощению от 151 до 155, где пептид связывается с СЭ38 человека с большим сродством, чем антитело согласно воплощению 6.
Воплощение 157: пептид согласно любому воплощению от 151 до 155, где пептид обладает в основном такими же характеристиками специфического связывания СЭ38, как антитело согласно воплощению 6.
Воплощение 158: пептид согласно любому воплощению от 151 до 157, где пептид, связывающий СЭ38, в основном свободен от других пептидов, связывающих СЭ38.
Воплощение 159: пептид согласно любому воплощению от 1 до 158, где пептид не является агонистом СО38.
Воплощение 160: пептид согласно любому воплощению от 1 до 159, где пептид не индуцирует значительную пролиферацию мононуклеарных клеток периферической крови.
Воплощение 161: пептид согласно любому воплощению от 1 до 160, где пептид не индуцирует высвобождение значительных уровней 1Ь-6 моноцитами человека или мононуклеарными клетками периферической крови.
Воплощение 162: пептид согласно любому воплощению от 1 до 161, где пептид не индуцирует высвобождение детектируемых уровней ГОЫ-у Т-клетками человека или мононуклеарными клетками периферической крови.
Воплощение 163: пептид согласно любому воплощению от 7 до 162, где пептид является антитесогласно согласно согласно согласно любому воплощению любому воплощению любому воплощению от от от до до до или или или
163,
163,
163, где где где антитело антитело антитело является является является любому воплощению от 1 до 6 или 163-166, где антитело являлом.
Воплощение 164: антитело антителом человека.
Воплощение 165: антитело гуманизированным антителом.
Воплощение 166: антитело химерным антителом.
Воплощение 167: антитело ется моноклональным антителом.
Воплощение 168: антитело согласно любому воплощению от 1 до 6 или 163-167, характеризующееся тем, что оно является 1дС1, 1§С2, Ι§63, Ι§64, Ι§Ό, 1дА, 1дЕ или 1дМ антителом.
Воплощение
1дС1 антителом.
Воплощение
1дС1,к антителом.
Воплощение
1дМ антителом.
Воплощение
1дМ,к антителом.
169:
170:
171:
172:
антитело антитело антитело антитело согласно согласно согласно согласно воплощению воплощению воплощению воплощению
168,
169,
168,
171, характеризующееся тем, характеризующееся тем, характеризующееся тем, характеризующееся тем, что что что что оно оно оно оно является является является является
- 23 015584
Воплощение 173: пептид согласно любому воплощению от 2 до 172, где пептид гликозилирован в эукариотической клетке.
Воплощение 174: антитело согласно любому воплощению от 1 до 6 или от 163 до 173, которое является фрагментом антитела или одиночной цепью антитела.
Воплощение 175: пептид или антитело согласно любому воплощению от 1 до 174, далее включающие линкер хелатор для присоединения радиоизотопа.
Воплощение 176: пептид согласно любому воплощению от 1 до 175, который находится в основном в изолированном виде.
Воплощение 177: изолированная нуклеиновая кислота, кодирующая пептид согласно любому воплощению от 1 до 175.
Воплощение 178: экспрессирующий вектор, включающий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей пептид согласно любому воплощению от 1 до 175.
Воплощение 179: экспрессирующий вектор, включающий V нуклеотидную последовательность согласно 8Е0 ΙΌ N0:1, нуклеотидную последовательность согласно 8Е0 ΙΌ N0:6 или VI, нуклеотидную последовательность согласно 8Е0 ΙΌ N0:1 и V нуклеотидную последовательность согласно 8Е0 ΙΌ N0:6.
Воплощение 180: экспрессирующий вектор, включающий V нуклеотидную последовательность согласно 8Е0 ΙΌ N0:11, Ун нуклеотидную последовательность согласно 8Е0 ΙΌ N0:16 или Уь нуклеотидную последовательность согласно 8Е0 ΙΌ N0:11 и УΗ нуклеотидную последовательность согласно 81Ό ΙΌ N0:16.
Воплощение 181: экспрессирующий вектор согласно воплощению 179 или 180, далее включающий нуклеотидную последовательность, кодирующую константный район легкой цепи, тяжелой цепи или обеих легкой и тяжелой цепей антитела человека.
Воплощение 182: экспрессирующий вектор согласно воплощению 181, где нуклеотидная последовательность, кодирующая константный район легкой цепи, тяжелой цепи или обеих легкой и тяжелой цепи антитела человека, кодирует Ι§01 антитело.
Воплощение 183: гибридома, которая продуцирует моноклональное анти-СБ38 антитело человека, кодируемое нуклеиновыми кислотами легкой цепи человека и тяжелой цепи человека, включающими нуклеотидные последовательности в вариабельном районе легкой цепи согласно 8Е0 ΙΌ N0:1, или консервативные модификации этих последовательностей и нуклеотидные последовательности в вариабельном районе тяжелой цепи согласно 8Е0 ΙΌ N0:6, или консервативные модификации этих последовательностей.
Воплощение 184: гибридома согласно воплощению 183, где нуклеиновые кислоты легкой цепи человека включают нуклеотидную последовательность согласно 8Е0 ΙΌ N0:1 и нуклеиновые кислоты тяжелой цепи человека включают нуклеотидную последовательность согласно 8Е0 ΙΌ N0:6.
Воплощение 185: гибридома, которая продуцирует моноклональное анти-СБ38 антитело человека, включающее вариабельные районы тяжелой цепи человека и легкой цепи человека, которые включают вариабельную аминокислотную последовательность легкой цепи согласно 8Е0 ΙΌ N0:2, или консервативные модификации этой последовательности и вариабельную аминокислотную последовательность тяжелой цепи согласно 8Е0 ΙΌ N0:7, или консервативные модификации этой последовательности.
Воплощение 186: гибридома согласно воплощению 185, где вариабельный район легкой цепи человека включает аминокислотную последовательность согласно 8Е0 ΙΌ N0:2 и вариабельный район тяжелой цепи человека включает аминокислотную последовательность согласно 8Е0 ΙΌ N0:7.
Воплощение 187: трансфектома, которая продуцирует моноклональное анти-СБ38 антитело человека, кодируемое нуклеиновыми кислотами легкой цепи человека 8Е0 ΙΌ N0:1, или консервативными модификациями этих последовательностей и нуклеиновыми кислотами тяжелой цепи согласно 8Е0 ΙΌ N0:6, или консервативными модификациями этих последовательностей.
Воплощение 188: трансфектома согласно воплощению 187, где моноклональное анти-СБ38 антитело человека кодируется нуклеиновой кислотой вариабельного района легкой цепи человека согласно 8Е0 ΙΌ N0:1 и нуклеиновыми кислотами тяжелой цепи человека согласно 8Е0 ΙΌ N0:6.
Воплощение 189: трансфектома, которая продуцирует моноклональное анти-СБ38 антитело человека, включающее вариабельные районы легкой цепи человека и тяжелой цепи человека, которые включают вариабельную аминокислотную последовательность легкой цепи согласно 8Е0 ΙΌ N0:2, или консервативные модификации этой последовательности и вариабельную аминокислотную последовательность тяжелой цепи согласно 8Е0 ΙΌ N0:7, или консервативные модификации этой последовательности.
Воплощение 190: трансфектома согласно воплощению 189, где легкая цепь человека включает вариабельную аминокислотную последовательность легкой цепи согласно 8Е0 ΙΌ N0:2, и тяжелая цепь человека включает вариабельную аминокислотную последовательность тяжелой цепи согласно 8Е0 ΙΌ N0:7.
Воплощение 191: гибридома, которая продуцирует моноклональное анти-СБ38 антитело человека, кодируемое нуклеиновыми кислотами легкой цепи человека и тяжелой цепи человека, включающими нуклеотидные последовательности в вариабельном районе легкой цепи согласно 8Е0 ΙΌ N0:11, или кон
- 24 015584 сервативные модификации этих последовательностей и нуклеотидные последовательности в вариабельном районе тяжелой цепи согласно 8Е0 ЕО N0:16, или консервативные модификации этих последовательностей.
Воплощение 192: гибридома согласно воплощению 191, где нуклеиновые кислоты легкой цепи человека включают нуклеотидную последовательность согласно 8Е0 ЕО N0:11, нуклеиновые кислоты тяжелой цепи человека включают нуклеотидную последовательность согласно 8Е0 ЕО N0:16.
Воплощение 193: гибридома, которая продуцирует моноклональное анти-СИ38 антитело человека, включающее вариабельные районы тяжелой цепи человека и легкой цепи человека, которые включают вариабельную аминокислотную последовательность легкой цепи человека согласно 8Е0 ЕО N0:12, или консервативные модификации этой последовательности и вариабельную аминокислотную последовательность тяжелой цепи согласно 8Е0 ЕО N0:17, или консервативные модификации этой последовательности.
Воплощение 194: гибридома согласно воплощению 193, где вариабельный район легкой цепи человека включает аминокислотную последовательность согласно 8Е0 ЕО N0:12 и вариабельный район тяжелой цепи человека включает аминокислотную последовательность согласно 8Е0 ЕО N0:17.
Воплощение 195: трансфектома, которая продуцирует моноклональное анти-СО38 антитело человека, кодируемое нуклеиновыми кислотами вариабельного района легкой цепи человека согласно 8Е0 ЕО N0:11, или консервативными модификациями этих последовательностей и нуклеотидными последовательностями тяжелой цепи человека согласно 8Е0 ГО N0:16, или консервативными модификациями этих последовательностей.
Воплощение 196: трансфектома согласно воплощению 195, где моноклональное анти-СО38 антитело человека кодируется нуклеиновыми кислотами вариабельного района легкой цепи человека согласно 8Е0 ГО N0:11 и нуклеиновыми кислотами тяжелой цепи человека согласно 8Е0 ГО N0:16.
Воплощение 197: трансфектома, которая продуцирует моноклональное анти-СО38 антитело человека, включающее вариабельные районы легкой цепи человека и тяжелой цепи человека, которые включают вариабельную аминокислотную последовательность легкой цепи человека согласно 8Е0 ГО N0:12, или консервативные модификации этой последовательности и вариабельную аминокислотную последовательность тяжелой цепи человека согласно 8Е0 ГО N0:17, или консервативные модификации этой последовательности.
Воплощение 198: трансфектома согласно воплощению 197, где легкая цепь человека включает вариабельную аминокислотную последовательность легкой цепи человека согласно 8Е0 ГО N0:12 и тяжелая цепь человека включает вариабельную аминокислотную последовательность тяжелой цепи человека согласно 5>Е0 ГО N0:17.
Воплощение 199: эукариотическая или прокариотическая клетка хозяина, которая продуцирует пептид согласно любому воплощению от 1 до 175.
Воплощение 200: эукариотическая или прокариотическая клетка хозяина, содержащая экспрессирующий вектор согласно воплощению 178.
Воплощение 201: трансгенное животное, отличное от человека, или растение, включающие нуклеиновые кислоты, кодирующие тяжелую цепь человека и легкую цепь человека, где животное или растение продуцирует детектируемое количество пептида согласно любому воплощению от 1 до 175.
Воплощение 202: иммуноконъюгат, включающий пептид согласно любому воплощению от 1 до 174, соединенный с цитотоксическим агентом, радиоизотопом или лекарством.
Воплощение 203: иммуноконъюгат, включающий пептид согласно любому воплощению от 1 до 168 или от 171 до 174, где пептид является мономерным Σ§Μ антителом, соединенным с цитотоксическим агентом, радиоизотопом или лекарством.
Воплощение 204: биспецифичная или мультиспецифичная молекула, включающая пептид согласно любому воплощению от 1 до 175 и специфичность связывания эффекторной клетки человека.
Воплощение 205: биспецифичная или мультиспецифичная молекула, включающая пептид согласно любому воплощению от 1 до 175 и специфичность связывания СО3, СО4, [И-15К. мембраносвязанного или связанного с рецептором ТЕЛ-а, Ес рецептором человека или мембраносвязанного или связанного с рецептором ΣΕ-15.
Воплощение 206: фармацевтическая композиция, включающая пептид согласно любому воплощению от 1 до 176 или иммуноконъюгат согласно любому воплощению от 202 до 205 и фармацевтически приемлемый носитель.
Воплощение 207: фармацевтическая композиция согласно воплощению 206, включающая один или более дополнительный терапевтический агент.
Воплощение 208: способ ингибирования роста и/или пролиферации клеток, экспрессирующих СО38, включающий применение пептида согласно любому воплощению от 1 до 176, иммуноконъюгата согласно любому воплощению от 202 до 205, фармацевтической композиции согласно воплощению 206 или 207 или экспрессирующего вектора согласно любому воплощению от 178 до 182, так что рост и/или пролиферация клеток ингибируется.
- 25 015584
Воплощение 209: способ лечения заболевания или нарушения, вовлекающего клетки, экспрессирующие ΟΌ38, где этот способ включает применение/введение пептида согласно любому воплощению от 1 до 176, иммуноконъюгата согласно любому воплощению от 202 до 205, фармацевтической композиции согласно воплощению 206 или 207, или экспрессирующего вектора согласно любому воплощению от 178 до 182 субъекту, который в них нуждается.
Воплощение 210: способ предотвращения заболевания или нарушения, вовлекающего клетки, экспрессирующие ΟΌ38 у субъекта, где способ включает введение терапевтически эффективного количества пептида согласно любому воплощению от 1 до 176, иммуноконъюгата согласно любому воплощению от 202 до 205, фармацевтической композиции согласно воплощению 206 или 207 или экспрессирующего вектора согласно любому воплощению от 178 до 182 субъекту, который в них нуждается.
Воплощение 211: способ согласно воплощению 209 или 210, где заболевание или нарушение является ревматоидным артритом.
Воплощение 212: способ согласно воплощению 209 или 210, где заболевание или нарушение является множественной миеломой.
Воплощение 213: способ согласно любому воплощению от 209 до 212, где способ включает введение одного или более дополнительного терапевтического агента субъекту.
Воплощение 214: способ согласно воплощению 213, где дополнительный один или более терапевтический агент выбирают из химиотерапевтического агента, противовоспалительного агента, иммуносупрессивного и/или иммуномодуляторного агента.
Воплощение 215: способ согласно воплощению 213, где дополнительный один или более терапевтический агент выбирают из группы, состоящей из цисплатина, гефитиниба, цетуксимаба, ритуксимаба, бевацизумаба, эрлотиниба, бортезомиба, талидомида, памидроната, золедроновой кислоты, клодроната, ризендроната, ибандроната, этидроната, алендроната, тилудроната, триокисид мышьяка, леналидомида, филграстима, пегфилграстима, зарграмостима, субероиланилид гидроксамовой кислоты и 8С10-469.
Воплощение 216: ίη У1!го способ для детектирования наличия ΟΌ38 антигена или клеток, экспрессирующих ΟΌ38, в образце, включающий:
а) контактирование образца с пептидом согласно любому воплощению от 1 до 176 в условиях, позволяющих образование комплекса между пептидом и СЭ38, и
б) детектирование образования этого комплекса.
Воплощение 217: ίη νίίΐΌ способ согласно воплощению 216, где упомянутый пептид является антителом.
Воплощение 218: набор для детектирования наличия ΟΌ38 антигена или клеток, экспрессирующих ΟΌ38, в образце, включающий пептид согласно любому воплощению от 1 до 176.
Воплощение 219: ίη νί\Ό способ для детектирования ΟΌ38 антигена или клеток, экспрессирующих ΟΌ38 у субъекта, включающий:
а) введение пептида согласно любому воплощению от 1 до 176 в условиях, позволяющих образование комплекса между пептидом и ΟΌ38, и
б) детектирование образованного комплекса.
Воплощение 220: ίη νίίΐΌ способ согласно воплощению 219, где упомянутый пептид является антителом.
Воплощение 221: антиидиотипическое антитело, связывающееся с пептидом согласно любому воплощению 2, 4 или от 163 до 174.
Воплощение 222: применение антиидиотипического антитела согласно воплощению 221 для детектирования уровня пептида согласно любому воплощению 2, 4 или от 163 до 174 в образце.
Воплощение 223: применение антиидиотипического антитела согласно воплощению 221 для детектирования уровня моноклонального антитела человека против ΟΌ38 в образце.
Термины ί.Ό38 и антиген СЭ38 применяются здесь взаимозаменяемо и включают любые варианты, изоформы и виды гомологов СЭ38 человека, которые естественным образом экспрессируются клетками, трансфицированными геном СЭ38. Синонимы СО38, как принято в данной области техники, включают АДФ-рибозилциклазу 1, цАДФР-гидролазу 1, СО38-Г51, гидролазу 1 циклической АДФрибозы, 1-19, №М-В5 антиген.
Термин пептид по отношению как к СО38-связывающим пептидам, так и не-СО38 пептидам, описанным здесь, включает любой подходящий пептид и может применяться как синоним терминам полипептид и белок, если не отмечено обратное или это не противоречит контексту; при условии, что читатель понимает, что каждый тип соответствующей молекулы, содержащей аминокислотный полимер, может быть связан с существенными различиями и таким образом образует отдельное воплощение настоящего изобретения (например, такой пептид, как антитело, которое состоит из нескольких полипептидных цепей, значительно отличается, например, от одноцепочечного антитела, пептидного иммуноадгезина или одноцепочечного иммуногенного пептида). Поэтому термин пептид здесь следует в основном понимать как относящийся к любому подходящему пептиду любого подходящего размера или состава (с точки зрения количества аминокислот и числа объединенных цепей в молекуле белка). Далее, пептиды в контексте способов и композиций изобретения, описанных здесь, могут включать не встре
- 26 015584 чающиеся в природе и/или не-Ь-аминокислотные остатки, если не отмечено обратное или это не противоречит контексту.
Как будет обсуждаться далее, если не отмечено обратное или это не противоречит контексту, термин пептид (и если обсуждать отдельные воплощения термина, полипептид и/или белок) также охватывает дериватизированные молекулы пептида. Вкратце, в контексте данного изобретения, производное (дериват) является пептидом, у которого один или более аминокислотный остаток химически модифицирован (например, посредством алкилирования, ацилирования, образования сложного эфира, образования амида) или связан с одним или более неаминокислотным органическим и/или неорганическим атомным или молекулярным заместителем (например, группой полиэтиленгликоля (ПЭГ), липофильным заместителем (который при необходимости может быть связан с аминокислотной последовательностью пептида через разделительный остаток или группу, такую как β-аланин, γ-аминобутировую кислоту (ГАБК), Ь/Όглутаминовую кислоту, янтарную кислоту и т.п.) флуорофором, биотином, радиоизотопом и т.д. и может также или альтернативно включать неосновные, неприродного происхождения и/или не-Ьаминокислотные остатки, если не отмечено обратное или это не противоречит контексту (однако, опять следует понимать, что такие производные могут рассматриваться как независимые свойства настоящего изобретения и включение таких молекул в понятие пептида сделано ради удобства описания настоящего изобретения, скорее чем для введения какого-то ни было равенства между голыми пептидами и такими производными). Неограничивающие примеры таких аминокислотных остатков включают, например, 2аминоадипиновую кислоту, 3-аминоадипиновую кислоту, β-аланин, β-аминопропионовую кислоту, 2аминомасляную кислоту, 4-аминомасляную кислоту, 6-аминокапроновую кислоту, 2-аминогептановую кислоту, 2-аминоизомасляную кислоту, 3-аминоизомасляную кислоту, 2-аминопимелиновую кислоту, 2,4-диаминомасляную кислоту, десмозин, 2,2'-диаминопимелиновую кислоту, 2,3-диаминопропионовую кислоту, №этилглицин, №этиласпарагин, гидроксилизин, аллогидроксилизин, 3-гидроксипролин, 4гидроксипролин, изодесмозин, аллоизолейцин, №метилглицин, №метилизолейцин, 6-№метиллизин, N метилвалин, норвалин, норлейцин, орнитин и статин, галогенированные аминокислоты.
Антигенсвязывающий пептид относится к любому пептиду, который специфически связывается с частью данного антигена в клеточных и/или физиологических условиях в течение времени, достаточного, чтобы индуцировать, ускорить, усилить и/или другим способ модулировать физиологическое действие, связанное с антигеном; чтобы позволить детекцию с помощью ЕЫ8Л, блоттинга (АеЧегп Ь1о1) или других сходных применимых техник исследования связывания белков, описанных здесь и/или известных в данной области техники, и/или быть связанным с ним другим детектируемым способом в течение соответствующего времени (например, по меньшей мере приблизительно 15 мин, по меньшей мере приблизительно 30 мин, по меньшей мере приблизительно 45 мин, по меньшей мере приблизительно 1 ч, по меньшей мере приблизительно 2 ч, по меньшей мере приблизительно 4 ч, по меньшей мере приблизительно 6 ч, по меньшей мере приблизительно 12 ч, приблизительно 1-12 ч, приблизительно 1-36 ч, приблизительно 1-48 ч, приблизительно 1-72 ч, приблизительно одной недели или дольше).
СЛ38-связывавающий пептид, или СЭ38ВР, является пептидом, связывающим антиген, который специфически связывается с антигеном ί.Ό38. В одном воплощении связывание СЭ38ВР с СЭ38 измеряют с помощью способа, описанного в примере 4.
Термин иммуноглобулин относится к классу структурно родственных гликопротеидов, состоящих из двух пар полипептидных цепей, одной пары легких (Ь) цепей с низким молекулярным весом и одной пары тяжелых (Н) цепей, где все четыре связаны между собой дисульфидными связями. Структура иммуноглобулинов хорошо охарактеризована; см., например, РипйатепШ Ιιηιηιιηοίοβν с11. 7 (Раи1 А. Ей. 2'1 ей., Яауеп Ргекк, ΚΥ (1989)). Вкратце, каждая тяжелая цепь обычно состоит из вариабельного района тяжелой цепи (сокращенно обозначенного здесь как Ун) и константного района тяжелой цепи. Константный район тяжелой цепи обычно состоит из трех доменов, Сн1, Сн2 и Сн3. Каждая легкая цепь обычно состоит из вариабельного района легкой цепи (сокращенно обозначенного здесь как Уь) и константного района легкой цепи. Константный район легкой цепи обычно состоит из одного домена, СЬ. Районы Ун и Уь можно далее подразделить на районы гипервариабельности (или гипервариабельные районы, которые могут быть гипервариабельными по последовательности и/или форме задаваемых структурой петель), называемые также районами, определяющими комплементарность (СПЯ), перемежающиеся более консервативными районами, называемыми каркасными районами (РЯ).
Каждый Ун и Уъ обычно состоит из трех СПЯ и четырех РЯ, организованных от аминоконца к карбоксиконцу в следующем порядке: РЯ1, СПЯ1, РЯ2, СПЯ2, РЯ3, СПЯ3, РЯ4 (см. также С1ю11иа апй Ьекк, Ь. Μοί. Βίο1. 196, 901-917 (1987)). Обычно нумерацию аминокислотных остатков в этом районе проводят по способу, описанному в КаЬа! е1 а1., Зециепсек о£ Рго1ешк о£ йппшпо^щсгй йИегекк 5'1' ей., РиЬйс неайй 8егу1се, №шопа1 МкШШе о£ неайй, ВеШекйа, МЛ (1991) (такие фразы, как нумерация остатков вариабельного района, как у Кабата или по Кабату, относится здесь к такой системе нумерации вариабельных доменов тяжелой цепи или вариабельных доменов легкой цепи). При применении этой системы нумерации действительная линейная аминокислотная последовательность пептида может содержать меньше аминокислот или дополнительные аминокислоты в соответствии с укорочением или вставками в РЯ или СПЯ
- 27 015584 вариабельного домена. Например, вариабельный домен тяжелой цепи может включать вставку из единичной аминокислоты (остаток 52а согласно Кабату) после остатка 52 в νΗ СЭК2 и вставленные остатки (например, 82а, 82б и 82в и т.д., согласно Кабату) после остатка 82 в ЕК тяжелой цепи. Нумерацию остатков по Кабату можно определить для данного антитела посредством сопоставления (выравнивания) районов гомологии последовательности со стандартной пронумерованной последовательностью Кабата.
Термин антитело (ЛЬ) в контексте настоящего изобретения относится к молекуле иммуноглобулина, фрагменту молекулы иммуноглобулина или производному любого из них, которая обладает способностью специфически связываться с антигеном в типичных физиологических условиях в течение значительных периодов времени, таких как по меньшей мере приблизительно 30 мин, по меньшей мере приблизительно 45 мин, по меньшей мере приблизительно 1 ч, по меньшей мере приблизительно 2 ч, по меньшей мере приблизительно 4 ч, по меньшей мере приблизительно 8 ч, по меньшей мере приблизительно 12 ч, приблизительно 24 ч или более, приблизительно 48 ч или более, приблизительно 3, 4, 5, 6, 7 или более дней и т.д. или любого другого соответствующего определенного функционально периода (такого как время, достаточное для того, чтобы индуцировать, ускорить, усилить и/или модулировать физиологический ответ, вызванный связыванием антитела с антигеном).
Вариабельные районы тяжелой и легкой цепей молекулы иммуноглобулина содержат связывающие домены, которые взаимодействуют с антигеном. Константные районы антител (ЛЬ§) могут опосредовать связывание иммуноглобулина с тканями хозяина или факторами, включающими различные клетки иммунной системы (такими как эффекторные клетки) и первый компонент (С1с.|) классической системы комплемента.
Анти-СЭ38 антитело может быть биспецифичным антителом, диателом или сходными молекулами (см., например, ΡNΑ8 И8А 90(14), 6444-8 (1993) для описания диател). Действительно, биспецифичные антитела, диатела и т.п., предоставленные настоящим изобретением, могут связывать любую подходящую мишень в придачу к части СЭ38.
Как отмечено выше, термин антитело здесь, если не отмечено обратное или это не противоречит контексту, включает фрагменты антитела, которые сохраняют способность специфически связываться с антигеном. Показано, что антигенсвязывающая функция антитела может осуществляться фрагментами полноразмерного антитела. Примеры связывающих фрагментов, охваченные термином антитело, включают (1) ЕаЬ фрагмент, одновалентный фрагмент, состоящий из доменов ν^ νΗ, С|. и Сн1; (2) Е(аЬ)2 и Е(аЬ')2 фрагменты, двухвалентные фрагменты, включающие два ЕаЬ фрагмента, соединенные дисульфидным мостиком в районе связки; (3) Ей фрагмент, состоящий в основном из νΗ и СН1 доменов; (4) Εν фрагмент, состоящий в основном из и νΗ доменов одной руки антитела; (5) йАЬ фрагмент (^агй с1 а1., №-11игс 341, 544-546 (1989)), который состоит в основном из νΗ домена; (6) изолированный район, определяющий комплементарность (СОК), и (7) сочетание двух или более изолированных СОК, которые при необходимости могут быть соединены синтетическим линкером. Далее, хотя два домена Εν фрагмента, ν и νΗ кодируются отдельными генами, они могут быть соединены с помощью рекомбинантных методов посредством синтетического линкера, который позволяет получать их в виде единой цепи белка, в котором У|. и νΗ районы образуют пару для образования одновалентных молекул (известных, как одноцепочечные антитела или одноцепочечное Εν (^Εν), см., например, В1гй с1 а1., 8с1епсе 242, 423-426 (1988) апй ΗιΐδΙοη еί а1., ΡNΑ8 И8А 85, 5879-5883 (1988)). Такие одноцепочечные антитела охватываются термином антитело, если не отмечено обратное или это не противоречит контексту. Другие формы одноцепочечных антител, такие как диатела, включены в термин антитело. Хотя такие фрагменты в основном включены в термин антитело, они все вместе и каждое отдельно являются уникальными свойствами настоящего изобретения, проявляя различные биологические свойства и применения. Эти и другие полезные фрагменты антител в контексте настоящего изобретения обсуждаются далее.
Также следует понимать, что термин антитело также в основном включает поликлональные антитела, моноклональные антитела (тАЬ§), антителоподобные полипептиды, такие как химерные антитела и гуманизированные антитела, антиидиотипические (апО-И) антитела к антителам и фрагменты антител, сохраняющие способность специфически связываться с антигеном (антигенсвязывающие фрагменты), предоставленные любым известным способом, таким как ферментативное расщепление, синтез пептидов и рекомбинантные техники. Полученные антитела могут обладать любым изотипом.
Анти-СО38 антитело является антителом, как описано выше, которое специфически связывается с антигеном СЭ38.
Термин эпитоп означает белковую детерминанту, способную специфически связываться с антителом. Эпитопы обычно состоят их химически активной поверхностной группировки молекул, таких как аминокислоты или боковые цепи сахаров, и обычно обладают специфическими трехмерными структурными характеристиками, а также специфическими характеристиками заряда. Конформационные и неконформационные эпитопы различаются тем, что связывание с первым, но не со вторым утрачивается в присутствии денатурирующих растворителей. Эпитоп может включать аминокислотные остатки, прямо вовлеченные в связывание (называемые также иммунодоминантным компонентом эпитопа) и другие аминокислотные остатки, которые не вовлечены непосредственно в связывание, такие как аминокислот
- 28 015584 ные остатки, которые эффективно блокируются специфически антигенсвязывающим пептидом (другими словами, аминокислотный остаток расположен внутри отпечатка (Гоо1ртш1) специфичного антигенсвязывающего пептида).
Термин биспецифичная молекула включает любой агент, такой как белок, пептид или комплекс белка или пептида, который обладает двумя разными специфичностями связывания. Например, молекула может связываться с или реагировать с (а) антигеном клеточной поверхности, (б) Ес рецептором на поверхности эффекторной клетки. Термин мультиспецифичная молекула включает любой агент, такой как белок, пептид или комплекс белка или пептида, который обладает более чем двумя разными специфичностями связывания. Например, молекула может связываться с или реагировать с (а) антигеном клеточной поверхности, (б) Ес рецептором на поверхности эффекторной клетки и (в) по меньшей мере еще одним компонентом. Соответственно настоящее изобретение включает, но не ограничивается этим, биспецифичные, триспецифичные, тетраспецифичные и другие мультиспецифичные молекулы, направленные на СЭ38 и на другие антигены или мишени клеточной поверхности, такие как Ес рецепторы на эффекторных клетках.
Термин биспецифичные антитела включает любое анти-СЭ38 антитело, которое является биспецифичной молекулой. Термин биспецифичные антитела также включает диатела. Диатела являются двухвалентными биспецифичными антителами, у которых УН и Уъ домены экспрессированы на одной полипептидной цепи, но с применением линкера, который слишком короток, чтобы позволить образование пары между двумя доменами одной и той же цепи, заставляя таким образом домены образовывать пары с комплементарными доменами другой цепи с образованием двух антигенсвязывающих участков (см., например, НоШдег е! а1., РNА8 И8А 90, б444-б448 (1993), РоЩак К.1. е! а1., 81гис1иге 2, 1121-1123 (1994)).
Как применяется здесь, термин эффекторная клетка относится к иммунной клетке, которая участвует в эффекторной фазе иммунного ответа, в противоположность когнитивной и фазе активации иммунного ответа. Примеры иммунных клеток включают клетку миелоидного или лимфоидного происхождения, например лимфоцит (такой как В-клетки и Т-клетки, включая цитолитические Т-клетки (СТЬ)), клетки-убийцы, природные клетки-убийцы, макрофаги, моноциты, эозинофилы, нейтрофилы, полиморфоядерные клетки, гранулоциты, тучные клетки и базофилы. Некоторые эффекторные клетки экспрессируют специфические Ес рецепторы и выполняют специфические иммунные функции. В ряде воплощений эффекторная клетка способна индуцировать зависимую от антитела клеточную цитотоксичность (АЭСС). как, например, нейтрофил способен индуцировать АЭСС. Например, моноциты, макрофаги, экспрессирующие ЕсК, вовлечены в специфическое убийство клеток мишени и презентацию антигенов для других компонентов иммунной системы или связывание с клетками, которые несут антигены. В некоторых воплощениях эффекторная клетка может фогоцитировать антиген мишени, клетку мишени или микроорганизм. Экспрессия отдельного ЕсК эффекторной клеткой может регулироваться гуморальными факторами, такими как цитокины. Например, обнаружено, что экспрессия ЕсуК! регулируется на повышение интерфероном γ (ΙΕ^υ) и/или О-С8Е. Такая повышенная экспрессия увеличивает цитотоксическую активность клеток, несущих ЕсуК1, против мишеней. Эффекторная клетка может фагоцитировать или лизировать антитело-мишень или клетку-мишень.
Термин антитело человека, как применяется здесь, включает антитела, обладающие вариабельными и константными районами, произведенными из последовательностей иммуноглобулина зародышевой линии человека. Антитела человека по настоящему изобретению могут включать аминокислотные остатки, не кодируемые последовательностями иммуноглобулина зародышевой линии человека (например, мутации, введенные посредством случайного или направленного мутагенеза ίη У11то или соматические мутации ίη У1уо). Однако термин антитело человека, как применяется здесь, не включает антитела, у которых СЭК последовательности, произведенные из зародышевых линий других видов млекопитающих, таких как мышь, были помещены среди каркасных последовательностей человека.
Как применяется здесь, антитело человека произведено из последовательности определенной зародышевой линии человека, если антитело получено из системы с применением последовательностей иммуноглобулина человека, например, с помощью иммунизации трансгенной мыши, несущей гены иммуноглобулина человека, или посредством скрининга библиотеки генов иммуноглобулина человека и где выбранное антитело человека является по меньшей мере на 90%, например, по меньшей мере на 95%, например, по меньшей мере на 9б%, например, по меньшей мере на 97%, например, по меньшей мере на 98%, например, по меньшей мере на 99% идентичным по последовательности аминокислот аминокислотной последовательности, кодируемой зародышевыми УН или Уъ сегментами гена вариабельного района. Обычно антитело человека, произведенное из отдельного сегмента гена УН или Уъ вариабельного района зародышевой линии человека, проявляет не более 10 аминокислот разницы, например, не более 5, например не более 4, 3, 2 или 1 аминокислоты разницы по сравнению с аминокислотной последовательностью, кодируемой геном иммуноглобулина зародышевой линии.
Химерное антитело является антителом, которое содержит один или более район одного антитела и один или более район одного или более другого антитела, произведенного из других видов. Одновалентное химерное антитело является димером (НЬ), образованным химерной Н цепью, связанной посредст
- 29 015584 вом дисульфидных связей с химерной Ь цепью. Двухвалентное химерное антитело является тетрамером (Η2Ε2), образованным двумя ИЬ димерами, связанными посредством по меньшей мере одной дисульфидой связи. Поливалентное химерное антитело можно также получить, например, с применением СН района, который олигомеризуется (например, из Н цепи ΙβΜ или μ цепи). Обычно химерное антитело относится к антителу, у которого часть тяжелой и/или легкой цепи идентична или гомологична соответствующей последовательности антител, произведенных из определенных видов, или принадлежащих определенному классу или подклассу антител, тогда как остаток цепи(ей) идентичен или гомологичен соответствующим последовательностям антител, произведенных из других видов, или принадлежащих определенному классу или подклассу антител, а также фрагментов таких антител, пока они проявляют желаемую биологическую активность (см., например, И8 4816567 и Моглзоп е! а1., ΡNΑ8 И8А 81, 68516855 (1984)). Химерные антитела получают с помощью рекомбинантных подходов, хорошо известных в данной области техники (см., например, СаЫ11у е! а1., ΡNА8 И8А 81, 3273-3277 (1984), Моглзои е! а1., Р^8 И8А 8!Ь 6851-6855 (1984), Воийаппе е1 а1., ХаИие 312, 643-646 (1984), ЕР 125023, ХеиЬегдег е1 а1., Хаип-е 314, 268-270 (1985), ЕР 171496, ЕР 173494, \\'0 86/01533, ЕР 184187, 8айадап е1 а1., 1. ]ттипо1. 137, 1066-1074 (1986), \\'0 87/02671, Ьш е1 а1., РЫА5 И8А 84, 3439-3443 (1987), 8ип е1 а1., Р^8 И8А 84, 214-218 (1987), ВеИег е! а1., 8с1епсе 240, 1041-1043 (1988) апб Чаг1о^ е! а1., АпйЬоб1ез: А ЬаЬогайгу Мапиа1, Со1б 8рппд ЧагЬог ЬаЬогайгу Ргезз, Со1б 8рппд ЧарЬог, ΚΥ. (1988)).
Гуманизированное антитело является антителом, которое произведено из отличных от человека видов, у которого определенные аминокислоты в каркасных и константных районах тяжелой и легкой цепей мутированы так, чтобы избежать или отменить иммунный ответ у человека. Гуманизированные формы нечеловеческих (например, мышиных) антител являются химерными антителами, которые содержат минимальную последовательность, произведенную из нечеловеческого иммуноглобулина. По большей части гуманизированные антитела являются иммуноглобулинами человека (антитело реципиента), у которых остатки в гипервариабельном районе реципиента замещены остатками из гипервариабельного района видов, отличных от человека (антитело донора), таких как мышь, крыса, кролик или примат, отличный от человека, обладающими желаемыми антигенсвязывающими характеристиками, такими как специфичность и сродство. В некоторых случаях остатки Ρν каркасного района (РЯ) иммуноглобулина человека замещают соответствующими нечеловеческими остатками. Далее, гуманизированные антитела могут включать остатки, которые не обнаруживаются ни в антителах донора, ни в антителах реципиента. Такие модификации делают, чтобы далее оптимизировать свойства антител. В основном гуманизированное антитело включает по большей части все по крайней мере из одного и обычно двух вариабельных доменов, в которых все или по большей части все гипервариабельные петли соответствуют таковым нечеловеческого иммуноглобулина и все или по большей части все РЯ районы являются таковыми последовательности иммуноглобулина человека. Гуманизированное антитело при необходимости также включает по меньшей мере часть константного района иммуноглобулина (Рс), обычно из иммуноглобулина человека. Детали см. в 1опез е! а1., ^йте 321, 522-525 (1986), Я1есйтапп е! а1., 332, 323-329 (1988) апб РгезЮ, Сиг. 0р. 81псГ Вю1. 2, 593-596 (1992).
Термин моноклональное антитело или композиция моноклонального антитела, как применяется здесь, относится к получению молекул антитела единого молекулярного состава. Композиция моноклонального антитела проявляет единую специфичность связывания и сродство для определенного эпитопа. Соответственно термин моноклональное антитело человека относится к антителам, проявляющим единую специфичность связывания, у которых вариабельный и константный районы произведены из последовательностей иммуноглобулина зародышевой линии человека. Моноклональные антитела человека могут производиться гибридомой, которая включает В-клетку, полученную из трансгенного или трансхромосомного животного, отличного от человека, такого как трансгенная мышь, обладающего геномом, включающим трансген тяжелой цепи человека и трансген легкой цепи человека, объединенные в бессмертной клетке. Моноклональное антитело может сокращенно обозначаться как тАЬ.
Термин рекомбинантное антитело человека, как применяется здесь, включает все антитела человека, которые получены, экспрессированы, созданы или выделены с помощью рекомбинантных подходов, такие как (а) антитела, выделенные из животного (такого как мышь), которое является трансгенным или трансхромосомным относительно генов иммуноглобулина человека, или гибридома, полученная из них (описанная здесь далее), (б) антитела, выделенные из клетки хозяина, трансформированной для экспрессии антител, такой как трансфектома, (в) антитела, выделенные из рекомбинантной комбинаторной библиотеки антител человека, и (г) антитела, полученные, экспрессированные, созданные или изолированные другими способами, которые включают сплайсинг последовательностей гена иммуноглобулина человека в другие последовательности ДНК. Такие рекомбинантные антитела человека включают вариабельные и константные районы, произведенные из последовательностей иммуноглобулина зародышевой линии человека. В определенных воплощениях, однако, такие рекомбинантные антитела человека могут подвергаться ш νίΙΐΌ мутагенезу (или, когда применяют животное трансгенное относительно последовательностей иммуноглобулина человека, соматическому мутагенезу ш νί\Ό) и таким образом аминокислотные последовательности νΗ и Уъ районов рекомбинантных антител являются последовательностями, которые будучи произведенными из и родственными νΗ и Уъ последовательностям зародышевой линии
- 30 015584 человека, могут не существовать в природе среди набора антител зародышевой линии человека ίη νίνο.
Как применяется здесь, гетерологичное антитело определено по отношению к трансгенному организму, отличному от человека, продуцирующему такое антитело. Этот термин относится к антителу, обладающему аминокислотной последовательностью, соответствующей последовательности, обнаруженной у организма, не представляющего собой животное, отличное от человека, и в основном из видов, отличных от этого трансгенного животного, отличного от человека.
Изолированное антитело, как применяется здесь, относится к антителу, которое в основном освобождено от других антител, обладающих другими антигенными специфичностями (например, изолированное антитело, которое специфически связывается с СЭ38, в основном освобождено от антител, которые специфически связываются с антигенами, отличающимися от СЭ38). Изолированное антитело, которое специфически связывается с эпитопом, изоформой или вариантом СЭ38 человека, может, однако, обладать перекрестной реактивностью с другими родственными антигенами, например, из других видов (такими как видовые гомологи СЭ38). Далее, изолированное антитело может быть в основном освобождено от других клеточных материалов и/или химических веществ. В одном воплощении настоящего изобретения комбинации изолированных моноклональных антител, обладающих различными специфичностями, сочетаются в хорошо определенной композиции.
Как применяется здесь, специфическое связывание относится к антигенсвязывающему пептиду, такому как антитело, связывающемуся с предопределенным антигеном. Обычно антигенсвязывающий пептид, такой как антитело, связывается со сродством, соответствующим Кс около 10-7 М или менее, например, около 10-8 М или менее, например, около 10-9 М или менее, около 10-10 М или менее или около 10-11 М или еще меньше при определении с помощью техники поверхностного плазмонового резонанса (8РК) с прибором ЫАсоге 3000 с применением рекомбинантного СЭ38 в качестве лиганда и анализируемого антитела. Антигенсвязывающий пептид может связываться с предопределенным антигеном со сродством, соответствующим Кс, которая по меньшей мере в 10 раз ниже, например, по меньшей мере в 100 раз ниже, например, по меньшей мере в 1000 раз ниже, например, по меньшей мере в 10000 раз ниже, например, по меньшей мере в 100000 раз ниже, чем его сродство к неспецифическому антигену (например, БСА, казеину), другому, чем предопределенный антиген или близкородственный антиген. То, насколько сродство ниже, зависит от Кс антигенсвязывающего пептида так, что когда КО антигенсвязывающего пептида очень низка (что означает очень высокую специфичность антигенсвязывающего пептида), тогда разница, на которую сродство к антигену выше по сравнению со сродством к неспецифическому антигену, может составлять не менее 10000 раз. Фразы антигенсвязывающий пептид, узнающий антиген и антигенсвязывающий пептид, специфичный для антигена применяются взаимозаменяемо с термином антигенсвязывающий пептид, который специфически связывается с антигеном. Подобным образом, фразы антитело, узнающее антиген и антитело, специфичное для антигена применяются взаимозаменяемо с термином антитело, которое специфически связывается с антигеном.
Термин ка (с-1), как применяется здесь, относится к константе скорости реакции диссоциации данного комплекса антиген-антитело. Упомянутая величина называется также значением ко££.
Термин ка (М-1с-1), как применяется здесь, относится к константе скорости реакции ассоциации для данного взаимодействия антиген-антитело.
Термин Ки (М), как применяется здесь, относится к константе равновесия реакции диссоциации для данного взаимодействия антиген-антитело.
Термин КА (М-1), как применяется здесь, относится к константе равновесия реакции ассоциации для данного взаимодействия антиген-антитело и получается посредством деления ка на ка.
Как применяется здесь, изотип относится к классу антител (например, Ι§Ο1, Ι§Ο2, Ι§Ο3, Ι§Ο4, Ι§Ο, ΙβΛ, ΙβΞ или ^М), который кодируется генами константного района тяжелой цепи.
Как применяется здесь, переключение изотипа относится к феномену, посредством которого класс или изотип антитела изменяется от одного класса иммуноглобулина на тот или другой класс иммуноглобулина.
Как применяется здесь, непереключенный изотип относится к изотипическому классу тяжелой цепи, продуцируемому, когда переключение изотипа не имело места; СН ген, кодирующий непереключенный изотип, является обычно первым СН геном сразу после функционально реорганизованного УО1 гена. Переключение изотипов подразделяют на классическое или неклассическое переключение изотипа. Классическое переключение изотипа происходит с помощью рекомбинации, которая включает по меньшей мере один район перестановки последовательности у трансгена. Неклассическое переключение изотипа может происходить, например, посредством гомологичной рекомбинации между σ μ человека и Σμ (δ-связанная делеция) человека. Альтернативные механизмы неклассического переключения, такие как трансгенная и/или трансхромосомная рекомбинация среди других, могут происходить и осуществлять изотипическое переключение.
Как применяется здесь, термин последовательность переключения относится к таким последовательностям ДНК, которые ответственны за рекомбинацию с переключением. Последовательность донора переключения, обычно район μ переключения, является 5' (т.е. выше по ходу) районом конструкции,
- 31 015584 который делетируется при рекомбинации с переключением. Район акцептора переключения находится между районом конструкции, который делетируется, и заменяемым константным районом (например, γ, ε и т.д.). Поскольку нет специфического участка, где рекомбинация происходит всегда, окончательную последовательность гена обычно нельзя предсказать по конструкции.
Как применяется здесь, профиль гликозилирования определяется как профиль расположения углеводородных единиц, которые ковалентно присоединены к белку, точнее к белку иммуноглобулина (антитела). Профиль гликозилирования гетерологичного антитела можно охарактеризовать как в основном близкую профилю гликозилирования, которая встречается в природе у антител, продуцируемых видами трансгенных животных, не являющихся человеком, причем рядовой специалист в данной области поймет, что профиль гликозилирования гетерологичного антитела ближе к упомянутому профилю гликозилирования у видов трансгенных животных, не являющихся человеком, чем у видов, из которых СН гены трансгенных животных были произведены.
Термин встречающийся в природе, как применяется здесь по отношению к объектам, относится к факту, что объект может быть обнаружен в природе. Например, последовательность полипептида или полинуклеотида, присутствующая у организма (включая вирусы), которую можно изолировать из природного источника и которая не была преднамеренно изменена человеком в лаборатории, является встречающейся в природе.
Термин реорганизованный, как применяется здесь, относится к конфигурации локуса тяжелой цепи или легкой цепи иммуноглобулина, где У-сегмент расположен непосредственно рядом с Ό-1- или 1-сегментом в конформации, кодирующей в основном полный УН- или Уъ-домен соответственно. Реорганизованный локус гена иммуноглобулина (антитела) можно идентифицировать посредством сравнения с ДНК зародышевой линии; в реорганизованном локусе будет по меньшей мере один рекомбинированный гептамерный/нонамерный элемент гомологии.
Термин нереорганизованный или конфигурация зародышевой линии, как применяется здесь по отношению к У-сегменту, относится к конфигурации, где У-сегмент не рекомбинирован так, чтобы быть непосредственно рядом с Ό- или 1-сегментом.
Термин молекула нуклеиновой кислоты, как применяется здесь, включает молекулы ДНК и молекулы РНК. Молекула нуклеиновой кислоты может быть одноцепочечной или двухцепочечной, но предпочтительно является двухцепочечной ДНК. Нуклеиновые кислоты могут присутствовать в целой клетке, в клеточном лизате или в частично очищенной или в основном чистой форме. Нуклеиновая кислота является изолированной или значительно очищенной, когда она отделена от других клеточных компонентов или других загрязнений, таких как другие клеточные нуклеиновые кислоты или белки, с помощью стандартных способов, включая обработку щелочью/ДСН, разделение в С§С1, колоночную хроматографию, электрофорез в агарозном геле и другие способы, хорошо известные в данной области (см. Р. Аи8иЬе1 с1 а1., ей. СиггеШ ΡγοΙοοοΡ ίη Мο1еси1а^ Βίο1ο§γ, Сгсспс РнЫМинд аий XVПсу !п1сг8с1Спсс №\ν ΥοΠ< (1987)).
Нуклеиновая кислота является оперативно связанной, когда находится в функциональной взаимосвязи с другой последовательностью нуклеиновой кислоты. Например, промотор или усилитель оперативно связаны с кодирующей последовательностью, если они оказывают действие на транскрипцию последовательности. По отношению к транскрипции регуляторных последовательностей, оперативно связанная означает, что последовательности ДНК, будучи связаны являются смежными и, при необходимости, присоединены к двум районам, кодирующим белок, непосредственно и в рамке считывания. Для последовательностей переключения оперативно связанные указывают, что последовательности способны действовать на рекомбинацию с переключением.
Как применяется здесь, термин ингибирует рост (например, по отношению к клеткам) включает любое измеримое уменьшение роста клеток при контакте с СЭ38ВР, например анти-СЭ38 антителом, по сравнению с ростом тех же клеток в отсутствие контакта с СЭ38ВР, таким как анти-СЭ38 антитело, например ингибирование роста клеточной культуры по меньшей мере приблизительно на 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 99 или 100%.
Как применяется здесь, термины ингибирует связывание и блокирует связывание (например, по отношению к ингибированию/блокированию связывания СО38-связывающего партнера с СЭ38) применяются взаимозаменяемо и охватывают как частичное, так и полное ингибирование/блокирование. Ингибирование/блокирование связывания СО38-связывающего партнера с СЭ38 может уменьшать или изменять нормальный уровень или тип клеточного сигнала, имеющего место, когда СО38-связывающий партнер связывается с СЭ38 в отсутствие ингибирования или блокирования. Ингибирование и блокирование также включают любое измеримое уменьшение сродства связывания СО38-связывающего партнера с СЭ38 при контакте с СЭ38ВР, таким как анти-СЭ38 антитело, по сравнению с лигандом в отсутствие контакта с СЭ38ВР, таким как анти-СЭ38 антитело, например, блокирование связывания СЭ38связывающего партнера с СЭ38 по меньшей мере приблизительно на 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 99 или 100%.
- 32 015584
Клетка мишени означает любую нежелательную клетку у субъекта (например, человека или животного), на которую может быть направлено действие композиции (включающей, например, СБ38ВР, например моноклональное анти-С.'Б38 антитело человека и/или биспецифичную или мультиспецифичную молекулу, направленную против СБ38) настоящего изобретения. В некоторых воплощениях клетка мишени является клеткой, экспрессирующей или сверхэкспрессирующей СБ38В. Клетки, экспрессирующие СБ38, обычно включают гематопоэтические клетки, такие как медуллярные тимоциты, активированные Т- и В-клетки, 80% покоящихся ΝΚ клеток и моноцитов, лимфобласты центра размножения в лимфатическом узле, плазматические В-клетки и некоторые внутрифолликуллярные клетки, древовидные клетки, нормальные клетки костного мозга, отдельные клетки предшественники, 50-80% кровяных клеток пуповины, эритроциты и кровяные пластинки. СБ38 также может экспрессироваться негематопоэтическими клетками, например, в кишечнике интраэпителиальными клетками и лимфоцитами 1ашша ргорпа, клетками Пуркинье и нейрофибриллярными клубками в мозге, эпителиальными клетками простаты, β-клетками поджелудочной железы, остеокластами костей, ретинальными клетками глаза, сарколеммой гладкой и поперечно-полосатой мускулатуры. Среди злокачественных клеток СБ38 экспрессируется при различных злокачественных заболеваниях крови, включая, но не ограничиваясь этим, множественную миелому, первичный или вторичный лейкоз плазматических клеток, хронический лимфоцитарный лейкоз В-клеток, острый лимфоцитарный лейкоз В-клеток, макроглобулинемию Валденстрема, первичный системный амилоидоз, лимфому клеток мантии, пролимфоцитарный/миелоцитарный лейкоз, острый миелоидный лейкоз, хронический миелоидный лейкоз, фолликулярную лимфому и лейкоз ΝΚклеток.
Термин вектор, как применяется здесь, относится к молекуле нуклеиновой кислоты, способной переносить другую нуклеиновую кислоту, с которой она связана. Одним типом вектора является плазмида, что относится к кольцевой двухцепочечной ДНК, в которую можно лигировать дополнительный сегмент ДНК. Другим типом вектора является вирусный вектор, где дополнительные сегменты ДНК можно лигировать в вирусный геном. Определенные векторы способны к независимой репликации в клетке хозяина, в которую они введены (например, бактериальные векторы, имеющие бактериальное начало репликации и эписомальные векторы млекопитающих). Другие векторы, например неэписомальные векторы млекопитающих, интегрируются в геном клетки хозяина после введения в клетку хозяина и вследствие этого реплицируются вместе с геномом хозяина. Далее, определенные векторы способны управлять экспрессией генов, с которыми они связаны на оперативном уровне. Такие векторы называются здесь рекомбинантными экспрессирующими векторами или просто экспрессирующими векторами. Обычно экспрессирующие векторы, применяемые в технике рекомбинантных ДНК, часто представлены в форме плазмид. Термины плазмида и вектор могут здесь применяться взаимозаменяемо, поскольку плазмида является наиболее распространенной формой вектора. Однако изобретение охватывает и такие иные формы экспрессируюших векторов, как вирусные векторы (например, ретровирусы с нарушенной репликацией, аденовирусы и аденосвязанные вирусы), которые выполняют такие же функции.
Термин рекомбинантная клетка хозяина (или просто клетка хозяина), как применяется здесь, относится к клетке, в которую введен рекомбинантный экспрессирующий вектор. Следует понимать, что такие термины относятся не только к клеткам данного субъекта, но и к потомству таких клеток. Поскольку определенные модификации могут происходить в последующих генерациях из-за мутаций или влияния окружающей среды, такое потомство может не быть по существу идентичным родительской клетке, но по-прежнему охватывается областью притязаний термина клетка хозяина, как применяется здесь. Рекомбинантные клетки хозяина включают, например, трансфектомы, такие как СНО клетки, Νδ/О клетки и лимфоцитарные клетки.
Термин регуляторная последовательность включает промоторы, усилители и другие элементы контроля экспрессии (например, сигналы полиаденилирования), которые контролируют транскрипцию или трансляцию генов цепей антитела. Такие регуляторные последовательности описаны, например, у СоеббеЕ Оепе Ехргеккюп Тес1по1оду: МеЛобк ίη Епхуто1оду 185, Асабетэс Ргекк, 8ап Б1едо, СА (1990). Специалисту в данной области будет ясно, что конструкция экспрессирующего вектора, включая выбор регуляторных последовательностей, может зависеть от таких факторов, как выбор клетки хозяина, которую будут трансформировать, желаемого уровня экспрессии белка и т.д. Примеры регуляторных последовательностей для экспрессии в клетках хозяина млекопитающего включают вирусные элементы, которые управляют высокими уровнями экспрессии белка в клетках млекопитающих, такие как промоторы и/или усилители, произведенные из цитомегаловирусов (СМУ), 81ш1ап νίιυκ 40 (8У40), аденовирусов (например, основной поздний промотор аденовируса (АбМЬР)) и полиомы. Альтернативно, можно применять регуляторные последовательности невирусного происхождения, такие как убиквитиновый промотор или β-глобулиновый промотор.
Как применяется здесь, термин субъект включает любого человека или любое животное, отличное от человека. Термин животное, отличное от человека включает всех позвоночных, например млекопитающих и немлекопитающих, таких как приматы, отличные от человека, овцы, собаки, коровы, цыплята, земноводные, пресмыкающиеся и т. д.
- 33 015584
Различные формы термина трансфекция охватывают широкое разнообразие техник, обычно применяемых для введения чужеродных ДНК в прокариотическую или эукариотическую клетку хозяина, например электропорацию, со-осаждение с фосфатом кальция, трансфекцию, опосредованную ДЭАЭдекстраном, липофектиновую трансфекцию и т.п.
Термин трансфектома, как применяется здесь, включает рекомбинантные эукариотические клетки хозяина, экспрессирующие антитело, такие как СНО клетки, N8/0 клетки, нЕК293 клетки, клетки растений или грибов, включая дрожжевые клетки.
Термин животное, отличное от человека включает всех позвоночных, например млекопитающих и немлекопитающих, таких как приматы, отличные от человека, овцы, собаки, коровы, цыплята, земноводные, пресмыкающиеся и т. д.
Термин трансгенное животное, отличное от человека относится к животному, отличному от человека, обладающему геномом, включающим один или более трансген тяжелой цепи человека и/или легкой цепи человека или трансхромосомы (интегрированные или неинтегрированные в природную геномную ДНК животного), которое способно экспрессировать полностью человеческие антитела. Например, трансгенная мышь может иметь трансген легкой цепи человека и трансген тяжелой цепи человека или трансхромосому тяжелой цепи человека, так что мышь продуцирует анти-СЭ38 антитела человека при иммунизации ΟΌ38 антигеном и/или клетки, экспрессирующие СЭ38. Трансген тяжелой цепи человека можно интегрировать в хромосомную ДНК мыши, как в случае трансгенных мышей, например ниМАЬ мышей, таких как НСо7 или НСо12 мышей, или трансген тяжелой цепи человека можно поддерживать вне хромосомы, как в случае трансхромосомных КМ мышей, как описано в \У0 02/43478. Такие трансгенные и трансхромосомные мыши (все вместе называемые трансгенными мышами) способны продуцировать множественные изотипы моноклональных антител человека к данному антигену (таких как Ι80, Ι§Α, Ι8Μ, ΙβΌ и/или Ι§Ε), претерпевая У-Ό-Ι рекомбинацию и переключение изотипа. Трансгенное животное, отличное от человека, можно также применять для продукции антител против специфического антигена посредством введения генов, кодирующих такое специфическое антитело, например, с помощью оперативного связывания генов с геном, который экспрессируется в молоке животного.
Термин специфичность здесь относится к способности СО38-связывающего пептида, такого как анти-СЭ38 антитело, узнавать эпитоп внутри СЭ38, при этом обладая только малой или никакой реактивностью по отношению к другим частям ΟΌ38 (включая другие эпитопы, которые связаны другими ΟΌ38ΒΡ, например анти-СЭ38 антителом). Специфичность можно определять относительным образом в анализах конкуренции, как описано здесь. Специфичность можно более точно определять с помощью любых техник идентификации/характеризации эпитопа, описанной здесь или их эквивалентов, известных в данной области.
Антитело, специфичное для данной антигенной детерминанты, может, однако, вступать в перекрестную реакцию с другими биологическими молекулами, которые могут присутствовать в ряде биологических окружений вместе с ΟΌ38. Более типично, СЭ38ВР, такое как анти-СЭ38 антитело, может вступать в перекрестную реакцию с гомологами ΟΌ38 из других видов. В любом или обоих случаях обычно такие перекрестно реагирующие антитела избирательны для ΟΌ38 человека по сравнению со сходными структурами и/или факторами среды.
Термин избирательно здесь относится к предпочтительному связыванию ΟΌ38ΒΡ, например анти-СО38 антитела, с отдельным районом, мишенью или пептидом; обычно районом или эпитопом СЭ38 в противоположность одной или более другим биологическим молекулам, структурам, клеткам, тканям и т.д. В одном воплощении ΟΌ38ΒΡ, такое как анти-СЭ38 антитело настоящего изобретения, является избирательным к порции ΟΌ38 у клеток рака толстой кишки (например, анти-СЭ38 антитела избирательно связывается с порцией ΟΌ38 по сравнению с другими компонентами клетки рака толстой кишки).
ΟΌ38ΒΡ согласно настоящему изобретению обычно применяются и предоставляются в значительной степени в изолированном виде. В значительной степени изолированной молекулой является молекула, которая является превалирующим видом в композиции, в которой она находится, среди класса молекул, к которому она относится (т.е. она составляет по меньшей мере около 50% типа молекул в композиции и обычно составляет по меньшей мере около 70%, по меньшей мере около 80%, по меньшей мере около 85%, по меньшей мере около 90%, по меньшей мере около 95% или более этого вида молекул, например пептидов, в композиции (например, композиция проявляет по меньшей мере около 98 или 99% гомогенности по ΟΌ38ΒΡ среди всех присутствующих видов пептидов)).
Изолированная молекула относится к молекуле, которая не связана со значительными уровнями (например, более чем приблизительно 1%, более чем приблизительно 2%, более чем приблизительно 3%, более чем приблизительно 5%) любых посторонних и нежелательных физиологических факторов, таких как не-СЭ38 связывающие биомолекулы (или СО38-связывающие молекулы), которые могут мешать связыванию и/или активности ΟΌ38ΒΡ по настоящему изобретению, содержащихся в клетке или у животного, где ΟΌ38ΒΡ продуцируется. Изолированная молекула также относится к любой молекуле, которая прошла этап очистки благодаря вмешательству человека (будь то автоматическое, ручное или оба). Во многих различных композициях, предоставленных настоящим изобретением, например в композиции, включающей один или более фармацевтически приемлемый носитель, ΟΌ38ΒΡ может присутство
- 34 015584 вать в относительно небольшом количестве в терминах числа от общего количества молекулярных видов в композиции (например, в случае композиции, включающей большое количество фармацевтически приемлемого носителя, стабилизатора и/или консерванта). В некоторых случаях дополнительные пептиды, такие как БСА, могут быть включены в такую композицию вместе с предварительно очищенным СЭ38ВР. Однако при том, что такие дополнительные компоненты являются приемлемыми для намеченного приложения СЭ38ВР, такую композицию можно тем не менее считать включающей изолированный СО38ВР.
СЭ38ВР по настоящему изобретению обычно в основном освобождены от других СЭ38ВР, например СЭ38ВР, обладающих другими антигенными специфичностями. Однако настоящее изобретение также представляет композицию, включающую несколько СЭ38ВР с различными специфичностями и характеристиками (например, настоящее изобретение представляет коктейль из СЭ38ВР, обладающих различными характеристиками специфичности и/или избирательности).
Обработка/лечение означает введение эффективного количества терапевтически активного соединения настоящего изобретения с целью облегчения, улучшения или искоренения (излечения) симптомов или болезненных состояний.
В одном воплощении настоящее изобретение представляет СЭ38ВР, включающий Уъ район, состоящий в основном из последовательности согласно 8Е0 ΙΌ N0:2.
В одном воплощении настоящее изобретение представляет СЭ38ВР, включающий УН район, состоящий в основном из последовательности согласно 8Е0 ΙΌ N0:6.
В одном воплощении настоящее изобретение представляет СЭ38ВР, включающее Уь район, состоящий в основном из последовательности согласно 8Е0 ΙΌ N0:2, и УН район, состоящий в основном из последовательности согласно 8Е0 ΙΌ N0:6.
В одном воплощении настоящее изобретение представляет СЭ38ВР, включающее Уь 0ΌΡ1 район, состоящий в основном из последовательности согласно 8Е0 ΙΌ N0:3.
В одном воплощении настоящее изобретение представляет СЭ38ВР, включающее Уъ 0ΌΡ2 район, состоящий в основном из последовательности согласно 8Е0 ΙΌ N0:4.
В одном воплощении настоящее изобретение представляет СЭ38ВР, включающее Уъ 0ΌΡ3 район, состоящий в основном из последовательности согласно 8Е0 ΙΌ N0:5.
В одном воплощении настоящее изобретение представляет СЭ38ВР, включающее УН 0ΌΡ1 район, состоящий в основном из последовательности согласно 8Е0 ΙΌ N0:8.
В одном воплощении настоящее изобретение представляет СЭ38ВР, включающее УН 0ΌΡ2 район, состоящий в основном из последовательности согласно 8Е0 ΙΌ N0:9.
В одном воплощении настоящее изобретение представляет СЭ38ВР, включающее УН 0ΌΡ3 район, состоящий в основном из последовательности согласно 8Е0 ΙΌ N0:10.
В одном воплощении настоящее изобретение представляет СЭ38ВР, включающее Уь СОВ районы (Уь СЭРЕ СЭВ2 и СОВ3), состоящие в основном из последовательностей согласно 8Е0 ΙΌ N0:3, 4 и 5 соответственно.
В одном воплощении настоящее изобретение представляет СЭ38ВР, включающее УН СОВ районы (УН СОВ1, СЭВ2 и СОВ3), состоящие в основном из последовательностей согласно 8Е0 ΙΌ N0:8, 9 и 10 соответственно.
В одном воплощении настоящее изобретение представляет СЭ38ВР, включающее:
(а) три Уь СОВ района, которые независимо состоят в основном из последовательностей согласно 8Е0 ΙΌ N0:3, 4 и 5 в тесной близости друг к другу (например, приблизительно с разрядкой Уъ СОВ районов у анти-СЭ38 антитела дикого типа) в СЭ38ВР, и (б) три УН СОВ района, которые независимо состоят в основном из последовательностей согласно 8Е0 ΙΌ N0:8, 9 и 10 в тесной близости друг к другу (например, приблизительно с разрядкой УН СОВ районов у анти-СЭ38 антитела дикого типа) в СЭ38ВР.
В дальнейшем воплощении настоящее изобретение представляет СЭ38ВР, включающее гибкий линкер, расположенный между Уъ районом и УН районом СЭ38ВР. В другом воплощении настоящее изобретение представляет СЭ38ВР, где Уъ и УН районы присутствуют на отдельных цепях в скрученном белке иммуноглобулина и ориентированы таким образом, что Уь СОВ1, СЭВ2 и СЭВ3 и УН СОВ1, СЭВ2 и СЭВ3 кооперативно связаны так, чтобы вносить вклад в избирательное и/или специфическое связывание антигенной детерминанты на СЭ38. В другом дальнейшем воплощении настоящее изобретение представляет СЭ38ВР, который включает два набора вариабельных доменов (наборы связанных УН и Уь доменов на связанных отдельных цепях), так что СЭ38ВР включает два идентичных участка связывания антигенных детерминант.
Ожидается, что любой их таких СЭ38ВР, описанных в этом абзаце, по меньшей мере, отчасти обладает сходной специфичностью к эпитопу, избирательностью и другими характеристиками, как антитело, имеющее Уъ район, включающий последовательность согласно 8Е0 ΙΌ N0:2, и УН район, включающий последовательность согласно 8Е0 ΙΌ N0:7, и соответственно может применяться для лечения множественной миеломы.
- 35 015584
В одном воплощении настоящее изобретение представляет ΟΌ38ΒΡ. включающее У|. район, состоящий в основном из последовательности согласно 8ЕО ЕО N0:12.
В одном воплощении настоящее изобретение представляет СО38ВР, включающее Ун район, состоящий в основном из последовательности согласно 8Е0 ГО N0:17.
В одном воплощении настоящее изобретение представляет СО38ВР, включающее У|. район, состоящий в основном из последовательности согласно 8Е0 ГО N0:12, и Ун район, состоящий в основном из последовательности согласно 8Е0 ГО N0:17.
В одном воплощении настоящее изобретение представляет СО38ВР, включающее У|. СОВ1 район, состоящий в основном из последовательности согласно 8Е0 ГО N0:13.
В одном воплощении настоящее изобретение представляет СО38ВР, включающее У|. СОВ2 район, состоящий в основном из последовательности согласно 8Е0 ГО N0:14.
В одном воплощении настоящее изобретение представляет СО38ВР, включающее У|. СОВ3 район, состоящий в основном из последовательности согласно 8Е0 ГО N0:15.
В одном воплощении настоящее изобретение представляет СО38ВР, включающее Ун СОВ1 район, состоящий в основном из последовательности согласно 8Е0 ГО N0:18.
В одном воплощении настоящее изобретение представляет СО38ВР, включающее Ун СОВ2 район, состоящий в основном из последовательности согласно 8Е0 ГО N0:19.
В одном воплощении настоящее изобретение представляет СО38ВР, включающее Ун СОВ3 район, состоящий в основном из последовательности согласно 8Е0 ГО N0:20.
В одном воплощении настоящее изобретение представляет СО38ВР, включающее У|. СОВ районы (Уь СЭРЕ СЭВ2 и СОВ3), состоящие в основном из последовательностей согласно 8Е0 ГО N0:13, 14 и 15 соответственно.
В одном воплощении настоящее изобретение представляет СО38ВР, включающее Ун СОВ районы (Ун СОВ1, СОВ2 и СОВ3), состоящие в основном из последовательностей согласно 8Е0 ГО N0:18, 19 и 20 соответственно.
В одном воплощении настоящее изобретение представляет СО38ВР, включающее:
(а) три Уъ СОВ района, которые независимо состоят в основном из последовательностей согласно 8Е0 ГО N0:13, 14 и 15 в тесной близости друг к другу (например, приблизительно с разрядкой Уь СОВ районов у анти-СО38 антитела дикого типа) в СО38ВР, и (б) три Ун СОВ района, которые независимо состоят в основном из последовательностей согласно 8Е0 ГО N0:18, 19 и 20 в тесной близости друг к другу (например, приблизительно с разрядкой Ун СОВ районов у анти-СО38 антитела дикого типа) в СО38ВР.
В дальнейшем воплощении настоящее изобретение представляет СО38ВР, включающее гибкий линкер, расположенный между У|, районом и Ун районом СО38ВР. В другом воплощении настоящее изобретение представляет СО38ВР, где Уь и Ун районы присутствуют на отдельных цепях в скрученном белке иммуноглобулина и ориентированы таким образом, что Уь СОВ1, СОВ2 и СОВ3 и Ун СОВ1, СОВ2 и СОВ3 кооперативно связаны так, чтобы вносить вклад в избирательное и/или специфическое связывание антигенной детерминанты на СО38. В другом дальнейшем воплощении настоящее изобретение представляет СО38ВР, который включает два набора вариабельных доменов (наборы связанных Ун и Уь доменов на связанных отдельных цепях), так что СО38ВР включает два идентичных участка связывания антигенных детерминант.
Ожидается, что любой их таких СО38ВР, описанных в этом абзаце, по меньшей мере, отчасти обладает сходной специфичностью к эпитопу, избирательностью и другими характеристиками, как антитело, имеющее Уь район, включающий последовательность согласно 8Е0 ГО N0:12, и Ун район, включающий последовательность согласно 8Е0 ГО N0:17, и соответственно может применяться для лечения множественной миеломы.
В одном воплощении настоящее изобретение представляет СО38ВР, включающее Уь район, состоящий в основном из последовательности согласно 8Е0 ГО N0:22.
В одном воплощении настоящее изобретение представляет СО38ВР, включающее Ун район, состоящий в основном из последовательности согласно 8Е0 ГО N0:27.
В одном воплощении настоящее изобретение представляет СО38ВР, включающее Уь район, состоящий в основном из последовательности согласно 8Е0 ГО N0:22, и Ун район, состоящий в основном из последовательности согласно 8Е0 ГО N0:27.
В одном воплощении настоящее изобретение представляет СО38ВР, включающее Уь СОВ1 район, состоящий в основном из последовательности согласно 8Е0 ГО N0:23.
В одном воплощении настоящее изобретение представляет СО38ВР, включающее Уь СОВ2 район, состоящий в основном из последовательности согласно 8Е0 ГО N0:24.
В одном воплощении настоящее изобретение представляет СО38ВР, включающее Уь СОВ3 район, состоящий в основном из последовательности согласно 8Е0 ГО N0:25.
В одном воплощении настоящее изобретение представляет СО38ВР, включающее Ун СОВ1 район, состоящий в основном из последовательности согласно 8Е0 ГО N0:28.
В одном воплощении настоящее изобретение представляет СО38ВР, включающее Ун СОВ2 район,
- 36 015584 состоящий в основном из последовательности согласно 8ЕЦ ΙΌ N0:29.
В одном воплощении настоящее изобретение представляет СБ38ВР, включающее νΗ СБР3 район, состоящий в основном из последовательности согласно 8ЕЦ ΙΌ N0:30.
В одном воплощении настоящее изобретение представляет СБ38ВР, включающее Уъ СБР районы (Уь СБК1, СБК2 и СБК3), состоящие в основном из последовательностей согласно 8ЕЦ ΙΌ N0:23, 24 и 25 соответственно.
В одном воплощении настоящее изобретение представляет СБ38ВР, включающее νΗ СБР районы (Ун СБК1, СБР2 и СБК3), состоящие в основном из последовательностей согласно 8ЕЦ ΙΌ N0:28, 29 и 30 соответственно.
В одном воплощении настоящее изобретение представляет СБ38ВР, включающее:
(а) три Уь СБР района, которые независимо состоят в основном из последовательностей согласно 8Е0 ΙΌ N0:23, 24 и 25 в тесной близости друг к другу (например, приблизительно с разрядкой Уъ СБР районов у анти-СБ38 антитела дикого типа) в СБ38ВР, и (б) три νΗ СЭР района, которые независимо состоят в основном из последовательностей согласно 8Е0 ΙΌ N0:28, 19 и 30 в тесной близости друг к другу (например, приблизительно с разрядкой νΗ СЭР районов у анти-СБ38 антитела дикого типа) в СБ38ВР.
В дальнейшем воплощении настоящее изобретение представляет СБ38ВР, включающее гибкий линкер, расположенный между Уъ районом и νΗ районом СБ38ВР. В другом воплощении настоящее изобретение представляет СБ38ВР, где Уь и νΗ районы присутствуют на отдельных цепях в скрученном белке иммуноглобулина и ориентированы таким образом, что Уь СБИТ, СБР2 и СБР3 и νΗ СБРЕ СБР2 и СБР3 кооперативно связаны так, чтобы вносить вклад в избирательное и/или специфическое связывание антигенной детерминанты на СБ38. В другом дальнейшем воплощении настоящее изобретение представляет СБ38ВР, который включает два набора вариабельных доменов (наборы связанных νΗ и Уь доменов на связанных отдельных цепях), так что СБ38ВР включает два идентичных участка связывания антигенных детерминант.
Ожидается, что любой их таких СБ38ВР, описанных в этом абзаце, по меньшей мере, отчасти обладает сходной специфичностью к эпитопу, избирательностью и другими характеристиками, как антитело, имеющее Уь район, включающий последовательность согласно 8ЕЦ ГБ N0:22, и νΗ район, включающий последовательность согласно 8ЕЦ ГО N0:27, и соответственно может применяться для лечения множественной миеломы.
В одном воплощении настоящее изобретение представляет СБ38ВР, включающий Уъ СБРЕ состоящий в основном из последовательности согласно 8ЕЦ ГО N0:3, или 13, или 23, где один или более И-концевой остаток и/или один, два или три С-концевых аминокислотных остатка отсутствуют.
В одном воплощении настоящее изобретение представляет СБ38ВР, включающий Уъ СБР2, состоящий в основном из последовательности согласно 8ЕЦ ГО N0:4, или 14, или 24, где ^концевой остаток и/или один, два или три С-концевых аминокислотных остатка отсутствуют.
В одном воплощении настоящее изобретение представляет СБ38ВР, включающий Уъ СБР3, состоящий в основном из последовательности согласно 8ЕЦ ГО N0:5, или 15, или 25, где ^концевой остаток и/или один, два, три или четыре С-концевых аминокислотных остатка отсутствуют.
В одном воплощении настоящее изобретение представляет СБ38ВР, включающий νΗ СБРЕ состоящий в основном из последовательности согласно 8ЕЦ ГО N0:8, или 18, или 28, где один, два, три или четыре ^концевых остатка и/или один, два, три или четыре С-концевых аминокислотных остатка отсутствуют.
В одном воплощении настоящее изобретение представляет СБ38ВР, включающий νΗ СБР2, состоящий в основном из последовательности согласно 8ЕЦ ГО N0:9, или 19, или 29, где один, два, три, четыре или пять ^концевых остатка и/или один, два, три, четыре, пять или шесть С-концевых аминокислотных остатка отсутствуют.
В одном воплощении настоящее изобретение представляет СБ38ВР, включающий νΗ СБР3, состоящий в основном из последовательности согласно 8ЕЦ ГО N0:10, или 20, или 30, где один, два или три ^концевых остатка и/или один, два, три или четыре С-концевых аминокислотных остатка отсутствуют.
Настоящее изобретение также представляет СБ38ВР, где такие усеченные последовательности СБР комбинированы друг с другом и/или другими последовательностями СБР, описанными здесь.
В одном воплощении настоящее изобретение представляет СБ38ВР, включающее:
(а) три Уь СБР района, которые независимо состоят в основном из последовательностей согласно 8Е0 ГО N0:3, 4 и 5 в тесной близости друг к другу (например, приблизительно с разрядкой Уъ СБР районов у анти-СБ38 антитела дикого типа) в СБ38ВР, и (б) три νΗ СБР района, которые независимо состоят в основном из последовательностей согласно 8Е0 ГО N0:8, 9 и 10 в тесной близости друг к другу (например, приблизительно с разрядкой νΗ СБР районов у анти-СБ38 антитела дикого типа) в СБ38ВР.
В дальнейшем воплощении настоящее изобретение представляет СБ38ВР, включающее гибкий линкер, расположенный между Уъ районом и νΗ районом СБ38ВР.
- 37 015584
В другом воплощении настоящее изобретение представляет СГО38ВР. где У|. и νΗ районы присутствуют на отдельных цепях в скрученном белке иммуноглобулина и ориентированы таким образом. что Уь СГОКЕ СГОК2 и СГОК3 и νΗ СГОКЕ СГОК2 и СГОК3 кооперативно связаны так. чтобы вносить вклад в избирательное и/или специфическое связывание антигенной детерминанты на СГО38. В дальнейшем воплощении настоящее изобретение представляет СГО38ВР. который включает два набора вариабельных доменов (наборы связанных νΗ и У|, доменов на связанных отдельных цепях). так что СГО38ВР включает два идентичных участка связывания антигенных детерминант. Ожидается. что любой их таких СГО38ВР. описанных в этом абзаце. по меньшей мере. отчасти обладает сходной специфичностью к эпитопу. избирательностью и другими характеристиками. как антитело. имеющее У|. последовательность согласно 8Е0 ΙΌ N0:2 и νΗ последовательность согласно 8Е0 ΙΌ N0:7.
В одном воплощении настоящее изобретение представляет СГО38ВР. включающее:
(а) три У|, СОК района. которые независимо состоят в основном из последовательностей согласно 5>Е0 ΙΌ N0:13. 14 и 15 в тесной близости друг к другу (например. приблизительно с разрядкой Уъ СОК районов у анти-СГО38 антитела дикого типа) в СГО38ВР. и (б) три νΗ СОК района. которые независимо состоят в основном из последовательностей согласно 5>Е0 ΙΌ N0:18. 19 и 20 в тесной близости друг к другу (например. приблизительно с разрядкой νΗ СОК районов у анти-СГО38 антитела дикого типа) в СГО38ВР.
В дальнейшем воплощении настоящее изобретение представляет СГО38ВР. включающее гибкий линкер. расположенный между У|, районом и νΗ районом СГО38ВР.
В другом воплощении настоящее изобретение представляет СГО38ВР. где Уь и νΗ районы присутствуют на отдельных цепях в скрученном белке иммуноглобулина и ориентированы таким образом. что Уь СГОКЕ СГОК2 и СГОК3 и νΗ СГОКЕ СГОК2 и СГОК3 кооперативно связаны так. чтобы вносить вклад в избирательное и/или специфическое связывание антигенной детерминанты на СГО38. В дальнейшем воплощении настоящее изобретение представляет СГО38ВР. который включает два набора вариабельных доменов (наборы связанных νΗ и Уъ доменов на связанных отдельных цепях). так что СГО38ВР включает два идентичных участка связывания антигенных детерминант. Ожидается. что любой их таких СГО38ВР. описанных в этом абзаце. по меньшей мере. отчасти обладает сходной специфичностью к эпитопу. избирательностью и другими характеристиками. как антитело. имеющее Уь район. включающий последовательность согласно 8Е0 ΙΌ N0:12. и νΗ район. включающий последовательность согласно 8Е0 ΙΌ N0:17.
В одном воплощении настоящее изобретение представляет СГО38ВР. включающее:
(а) три У|, СОК района. которые независимо состоят в основном из последовательностей согласно 5>Е0 ΙΌ N0:23. 24 и 25 в тесной близости друг к другу (например. приблизительно с разрядкой У|. СОК районов у анти-СГО38 антитела дикого типа) в СГО38ВР. и (б) три νΗ СОК района. которые независимо состоят в основном из последовательностей согласно 5>Е0 ΙΌ N0:28. 29 и 30 в тесной близости друг к другу (например. приблизительно с разрядкой νΗ СОК районов у анти-СГО38 антитела дикого типа) в СГО38ВР.
В дальнейшем воплощении настоящее изобретение представляет СГО38ВР. включающее гибкий линкер. расположенный между У|, районом и νΗ районом СГО38ВР.
В другом воплощении настоящее изобретение представляет СГО38ВР. где Уь и νΗ районы присутствуют на отдельных цепях в скрученном белке иммуноглобулина и ориентированы таким образом. что Уь СГОКЕ СГОК2 и СГОК3 и νΗ СГОКЕ СГОК2 и СГОК3 кооперативно связаны так. чтобы вносить вклад в избирательное и/или специфическое связывание антигенной детерминанты на СГО38. В дальнейшем воплощении настоящее изобретение представляет СГО38ВР. который включает два набора вариабельных доменов (наборы связанных νΗ и У|, доменов на связанных отдельных цепях). так что СГО38ВР включает два идентичных участка связывания антигенных детерминант. Ожидается. что любой их таких СГО38ВР. описанных в этом абзаце. по меньшей мере. отчасти обладает сходной специфичностью к эпитопу. избирательностью и другими характеристиками. как антитело. имеющее У|, район. включающий последовательность согласно 8Е0 ΙΌ N0:22. и νΗ район. включающий последовательность согласно 8Е0 ΙΌ N0:27.
Настоящее изобретение также представляет СГО38ВР. включающие функциональные варианты Уь района. νΗ района или одного или более СОК антител примеров. Функциональный вариант Уь. νΗ или СОК. примененные в составе СГО38ВР. все еще позволяет СГО38ВР сохранять. по меньшей мере. значительную часть (по меньшей мере около 50. 60. 70. 80. 90. 95% или более) сродства/авидности и/или специфичности/избирательности родительского антитела и в некоторых случаях. например. такой СГО38ВР может обладать большим сродством. избирательностью и/или специфичностью. чем родительское антитело.
В одном воплощении настоящее изобретение представляет СГО38ВР. включающее вариант Уъ. состоящий в основном из последовательности. обладающей по меньшей мере около 50%. например. по меньшей мере около 60%. например. по меньшей мере около 70%. например. по меньшей мере около 75%. например. по меньшей мере около 80%. например. по меньшей мере около 85%. например. по меньшей мере около 90%. например. по меньшей мере около 95% идентичности последовательности
- 38 015584 аминокислот последовательности согласно 8ЕО ΙΌ N0:2, или 12, или 22, где ΟΌ38ΒΡ обладает, по меньшей мере, значительной частью (по меньшей мере около 50, 60, 70, 80, 90, 95% или более) эпитопсвязывающих характеристик антитела, обладающего вариантом Уъ последовательности согласно 8Е0 ΙΌ N0:2, или 12, или 22 соответственно, например антитела, включающего Уъ последовательность согласно 8Е0 ΙΌ N0:2 и Ун последовательность согласно 8Е0 ΙΌ N0:7, и антитела, включающего Уъ последовательность согласно 8Е0 ΙΌ N0:12 и Ун последовательность согласно 8Е0 ΙΌ N0:17, и антитела, включающего Уь последовательность согласно 5>Е0 ΙΌ N0:22 и Ун последовательность согласно 5>Е0 ΙΌ N0:27 соответственно.
В одном воплощении настоящее изобретение представляет ΟΌ38ΒΡ, включающее вариант Уъ 0ΌΒ1, состоящий в основном из последовательности, обладающей по меньшей мере около 50%, например, по меньшей мере около 60%, например, по меньшей мере около 70%, например, по меньшей мере около 75%, например, по меньшей мере около 80%, например, по меньшей мере около 85%, например, по меньшей мере около 90%, например, по меньшей мере около 95% идентичности последовательности аминокислот любой из последовательностей согласно 8Е0 ΙΌ N0:3, или 13, или 23, где ΟΌ38ΒΡ обладает, по меньшей мере, значительной частью (по меньшей мере около 50, 60, 70, 80, 90, 95% или более) эпитопсвязывающих характеристик антитела, обладающего вариантом Уъ СЭК1 последовательности согласно 8Е0 ΙΌ N0:3, или 13, или 23, соответственно, например антитела, включающего последовательность согласно 8Е0 ΙΌ N0:2, или 12, или 22 соответственно, например антитела, имеющего Уъ последовательность согласно 8Е0 ΙΌ N0:2 и Ун последовательность согласно 8Е0 ΙΌ N0:7, или антитела, включающего Уъ последовательность согласно 8Е0 ΙΌ N0:12 и Ун последовательность согласно 8Е0 ΙΌ N0:17, или антитела, включающего Уь последовательность согласно 8Е0 ΙΌ N0:22 и Ун последовательность согласно 5>Е0 ΙΌ N0:27 соответственно.
В одном воплощении настоящее изобретение представляет ΟΌ38ΒΡ, включающее вариант Уъ СЭК2, состоящий в основном из последовательности, обладающей по меньшей мере около 50%, например, по меньшей мере около 60%, например, по меньшей мере около 70%, например, по меньшей мере около 75%, например, по меньшей мере около 80%, например, по меньшей мере около 85%, например, по меньшей мере около 90%, например, по меньшей мере около 95% идентичности последовательности аминокислот любой из последовательностей согласно 8Е0 ΙΌ N0:4 или 14, где ΟΌ38ΒΡ обладает, по меньшей мере, значительной частью (по меньшей мере около 50, 60, 70, 80, 90, 95% или более) эпитопсвязывающих характеристик антитела, обладающего вариантом Уъ СЭК2 последовательности согласно 8Е0 ΙΌ N0:4, или 14, или 24 соответственно, например антитела, включающего Уь последовательность согласно 8Е0 ΙΌ N0:2, или 12, или 22 соответственно, например антитела, включающего Уь последовательность согласно 8Е0 ΙΌ N0:2 и Ун последовательность согласно 8Е0 Ш N0:7, или антитела, включающего Уь последовательность согласно 5>Е0 ΙΌ N0:12 и Ун последовательность согласно 5>Е0 ΙΌ N0:17, или антитела, включающего Уь последовательность согласно 8Е0 ΙΌ N0:22 и Ун последовательность согласно 5>Е0 ΙΌ N0:27 соответственно.
В одном воплощении настоящее изобретение представляет ΟΌ38ΒΡ, включающее вариант Уъ СЭК3, состоящий в основном из последовательности, обладающей по меньшей мере около 50%, например, по меньшей мере около 60%, например, по меньшей мере около 70%, например, по меньшей мере около 75%, например, по меньшей мере около 80%, например, по меньшей мере около 85%, например, по меньшей мере около 90%, например, по меньшей мере около 95% идентичности последовательности аминокислот любой из последовательностей согласно 8Е0 ΙΌ N0:5, или 15, или 25, где ΟΌ38ΒΡ обладает, по меньшей мере, значительной частью (по меньшей мере около 50, 60, 70, 80, 90, 95% или более) эпитопсвязывающих характеристик антитела, обладающего вариантом Уъ СЭК3 последовательности согласно 8Е0 ΙΌ N0:5, или 15, или 25 соответственно, например антитела, включающего Уь последовательность согласно 8Е0 ΙΌ N0:2, или 12, или 22 соответственно, например антитела, включающего Уь последовательность согласно 8Е0 ΙΌ N0:2 и Ун последовательность согласно 8Е0 ΙΌ N0:7, или антитела, включающего Уь последовательность согласно 8Е0 ΙΌ N0:12 и Ун последовательность согласно 8Е0 ΙΌ N0:17, или антитела, включающего Уъ последовательность согласно 8Е0 ΙΌ N0:22 и Ун последовательность согласно 8Е0 ΙΌ N0:27 соответственно.
В одном воплощении настоящее изобретение представляет ΟΌ38ΒΡ, включающее вариант Ун, состоящий в основном из последовательности, обладающей по меньшей мере около 50%, например, по меньшей мере около 60%, например, по меньшей мере около 70%, например, по меньшей мере около 75%, например, по меньшей мере около 80%, например, по меньшей мере около 85%, например, по меньшей мере около 90%, например, по меньшей мере около 95% идентичности последовательности аминокислот последовательности согласно 8Е0 ΙΌ N0:7, или 17, или 27, где ΟΌ38ΒΡ обладает, по меньшей мере, значительной частью (по меньшей мере около 50, 60, 70, 80, 90, 95% или более) эпитопсвязывающих характеристик антитела, обладающего вариантом Ун последовательности согласно 8Е0 ΙΌ N0:7, или 12, или 27 соответственно, например антитела, включающего и Ун последовательность согласно 8Е0 ΙΌ N0:7, и Уъ последовательность согласно 8Е0 ΙΌ N0:2, или антитела, включающего Ун последовательность согласно 8Е0 ΙΌ N0:17 и Уъ последовательность согласно 8Е0 ΙΌ N0:12, или антитела, включающего Ун последовательность согласно 8Е0 Ш N0:27 и Уъ последовательность согласно
- 39 015584
8Е0 ΙΌ N0:22 соответственно.
В одном воплощении настоящее изобретение представляет СЭ38ВР, включающее вариант νΗ СЭК1, состоящий в основном из последовательности, обладающей по меньшей мере около 50%, например, по меньшей мере около 60%, например, по меньшей мере около 70%, например, по меньшей мере около 75%, например, по меньшей мере около 80%, например, по меньшей мере около 85%, например, по меньшей мере около 90%, например, по меньшей мере около 95% идентичности последовательности аминокислот любой из последовательностей согласно 8ЕС ΙΌ N0:8 или 8ЕС ΙΌ N0:18, или 8ЕС ΙΌ N0:28, где СЭ38ВР обладает, по меньшей мере, значительной частью (по меньшей мере около 50, 60, 70, 80, 90, 95% или более) эпитопсвязывающих характеристик антитела, обладающего вариантом νΗ СЭК1 последовательности согласно 8ЕС ΙΌ N0:8, или 18, или 28 соответственно, например антитела, включающего νΗ последовательность согласно 8ЕС ΙΌ N0:7, или 17, или 27 соответственно, например антитела, включающего νΗ последовательность согласно 8ЕС ΙΌ N0:7, или 17, или 27 соответственно, например антитела, включающего νΗ последовательность согласно 8ЕС ΙΌ N0:7 и νι, последовательность согласно 8Е0 ΙΌ N0:2, или антитела, включающего νΗ последовательность согласно 8ЕС ΙΌ N0:17 и Уъ последовательность согласно 8ЕС ΙΌ N0:12, или антитела, включающего Ун последовательность согласно 5>Е0 ΙΌ N0:27 и Уь последовательность согласно 8ЕС ΙΌ N0:22 соответственно.
В одном воплощении настоящее изобретение представляет СЭ38ВР, включающее вариант Ун СЭК2, состоящий в основном из последовательности, обладающей по меньшей мере около 50%, например, по меньшей мере около 60%, например, по меньшей мере около 70%, например, по меньшей мере около 75%, например, по меньшей мере около 80%, например, по меньшей мере около 85%, например, по меньшей мере около 90%, например, по меньшей мере около 95% идентичности последовательности аминокислот любой из последовательностей согласно 8ЕС ΙΌ N0:9, или 19, или 29, где СЭ38ВР обладает, по меньшей мере, значительной частью (по меньшей мере около 50, 60, 70, 80, 90, 95 или более) эпитопсвязывающих характеристик антитела, обладающего вариантом Ун СЭК1 последовательности согласно 8Е0 ΙΌ N0:9, или 19, или 29 соответственно, например антитела, включающего Ун последовательность согласно 8Е0 ΙΌ N0:7, или 17, или 27 соответственно, например антитела, включающего Ун последовательность согласно 8ЕС ΙΌ N0:7 и Уъ последовательность согласно 8ЕС ΙΌ N0:2, или антитела, включающего Ун последовательность согласно 8ЕС ΙΌ N0:17 и Уь последовательность согласно 8ЕС ΙΌ N0:12, или антитела, включающего Ун последовательность согласно 8ЕС ΙΌ N0:27 и νι. последовательность согласно 8Е0 ΙΌ N0:22 соответственно.
В одном воплощении настоящее изобретение представляет СЭ38ВР, включающее вариант Ун СЭК3, состоящий в основном из последовательности, обладающей по меньшей мере около 50%, например, по меньшей мере около 60%, например, по меньшей мере около 70%, например, по меньшей мере около 75%, например, по меньшей мере около 80%, например, по меньшей мере около 85%, например, по меньшей мере около 90%, например, по меньшей мере около 95% идентичности последовательности аминокислот любой из последовательностей согласно 8ЕС ΙΌ N0:10, или 20, или 30, где СЭ38ВР обладает, по меньшей мере, значительной частью (по меньшей мере около 50, 60, 70, 80, 90, 95% или более) эпитопсвязывающих характеристик антитела, обладающего вариантом Ун СЭК3 последовательности согласно 8Е0 ΙΌ N0:10, или 20, или 30 соответственно, например антитело, включающее Ун последовательность согласно 8Е0 ΙΌ N0:7, или 17, или 27 соответственно, например антитела, включающего Ун последовательность согласно 8ЕС ΙΌ N0:7 и νι, последовательность согласно 8ЕС ΙΌ N0:2, или антитела, включающего Ун последовательность согласно 8ЕС ΙΌ N0:17 и Уь последовательность согласно 8ЕС ΙΌ N0:12, или антитела, включающего Ун последовательность согласно 8ЕС ΙΌ N0:27 и νι, последовательность согласно 8Е0 ΙΌ N0:22 соответственно.
Процент идентичности между двумя последовательностями является функцией числа идентичных положений, поделенного на длину последовательности (т.е. % гомологии=число идентичных положений/общее число положенийх100), принимая во внимание число разрывов и длину каждой бреши, которые необходимо ввести для оптимального выравнивания двух последовательностей. Сравнение последовательностей и определение процента идентичности двух последовательностей достигается с применением математических алгоритмов, как описано в нижеследующих примерах, которые не являются ограничивающими.
Процент идентичности между двумя нуклеотидными последовательностями можно определять с помощью программы САР программного пакета ССС (доступного на 1Шр://\\л\л\'.дсд.сот) с применением N^§дарйηа, матрицы СМР, веса бреши 40, 50, 60, 70 или 80 и веса протяженности 1, 2, 3, 4, 5 или 6. Процент идентичности между двумя нуклеотидными последовательностями определяют с помощью алгоритма Е. Меуегк апй ^. МШег (Сотри! Арр1. Вюкск, 4: 11-17 (1989)), включенного в программу А^IСN (версия 2.0), применяя таблицу веса остатков (\уе1д1й геыйие !аЬ1е) РАМ120, штраф за протяженность бреши (а дар 1епд(11 репаПу) 12 и штраф за брешь (а дар репайу) 4. Дополнительно, процент идентичности между двумя аминокислотными последовательностями можно определить с применением алгоритма по №ей1етап апй ^ипксй, I. Мо1. Вю1. 48, 444-453 (1970), включенного в программу САР пакета ССС (доступного на ййр://^^^.дсд.сот), с применением либо матрицы В1о88ит 62, либо матрицы РАМ250, веса бреши 16, 14, 12, 10, 8, 6 или 4 и веса протяженности 1, 2, 3, 4, 5 или 6.
- 40 015584
Последовательности нуклеиновой кислоты и белка согласно настоящему изобретению далее можно применять в качестве последовательности запроса для проведения поиска по общедоступным базам данных для того, чтобы, например, идентифицировать родственные последовательности. Такие поиски можно проводить с применением программ В^А8ТN и ХВЬА8Т (версия 2.0) по А1!всЬи1, е! а1. (1990) 1. Мо1. В1о1. 215:403-10. Поиск нуклеотидов с применением ВЬА8Т можно проводить с помощью программы В^А8ТN с параметрами счет=100, длина слова=12 для получения нуклеотидных последовательностей, гомологичных молекулам нуклеиновых кислот согласно настоящему изобретению. Поиск белков с применением ВЬА8Т можно проводить с помощью программы ХВЬА8Т с параметрами счет=50, длина слова=3 для получения аминокислотных последовательностей, гомологичных молекулам белков согласно настоящему изобретению. Для получения выравниваний с брешами с целями сравнения можно применять Саррей ВЬА8Т, как описано у А1!вс1и1 е! а1. (1997), ШсШс Ас1йв. Кев. 25 (17): 3389-3402. При применении программ ВЬА8Т и Саррей ВЬА8Т можно применять параметры по умолчанию соответствующих программ (т.е. ХВЬА8Т и ВЬА8ТЦ); см. 1Шр://\\л\лу.псЫ.ш1п.ш11.доу.
Последовательность СЭК вариантов может отличаться от последовательностей СЭК родительского антитела наиболее консервативными замещениями, например, по меньшей мере около 35%, около 50% или более, около б0% или более, около 70% или более, около 75% или более, около 80% или более, около 85% или более, около 90% или более, около 95% или более (например, приблизительно б5-99%) замещений у вариантов являются консервативными замещениями аминокислотных остатков. В контексте настоящего изобретения консервативные замещения можно определить как замещения внутри классов аминокислот, приведенных в одной или более следующих таблиц.
Классы аминокислотных остатков для консервативных замещений
Кислые остатки Асп и Глу
Основные остатки Лиз, Арг и Гис
Гидрофильные незаряженные остатки Сер, Тре, Асн и Глн
Алифатические незаряженные остатки Гли, Ала, Вал, Лей и Иле
Неполярные незаряженные остатки Цис, Мет и Про
Ароматические остатки Фен, Тир и Три
Классы альтернативных консервативных замещений аминокислотных остатков
1 Ала (А) Сер (8) Тре (Ν)
2 Асп (Ό) Глу(Е)
3 Асн (Ν) Глн (0)
4 Арг(В) Лиз (К)
5 Иле (Г) Лей (Ь) Мет (М)
6 Фен (Р) Тир (Υ) Трп
Альтернативная физическая и функциональная классификация аминокислотных остатков
Остатки, содержащие спиртовую группу 8иТ
Алифатические остатки Ι,ί,νπΜ
Циклоалкенил-связанные остатки Е, Η, Ψο Υ
Гидрофобные остатки А, С, Е, О, Η, I, Ь, М, В., Т, V, Ψ и Υ
Отрицательно заряженные остатки ϋπΕ
Полярные остатки С, О, Е, Н, К, Ν, О, В, 8 и Т
Положительно заряженные остатки Н, КиВ
Маленькие остатки А, С, О, О. Ν, Р, 8, ТиУ
Очень маленькие остатки А, Ои8
Остатки, участвующие в образовании поворотов А, С,ϋ,Е, О,Н, К,Ν, 0,К, 8,РиТ
Гибкие остатки О, Т, К, 8, О, Р, ϋ, Е и К.
Группировки более консервативного замещения включают валин-лейцин-изолейцин, фенилаланинтирозин, лизин-аргинин, аланин-валин и аспарагин-глутамин. Дополнительные группы аминокислот также можно образовать с применением принципов, описанных, например, в СгещЫоп (1984), Рго!ешв: 81гис!иге апй Мо1еси1аг Ргорегйев (2й Ей. 1993), \У.Н. Егеетап апй Сотрапу.
В одном воплощении настоящего изобретения консервативность в терминах свойств гидрофобности/гидрофильности и веса/размера остатков также в основном сохраняется у вариантов СЭК по сравнению с СОК антитела примеров (например, класс веса, оценка гидрофобности или оба у последовательностей сохраняются по меньшей мере на приблизительно 50%, по меньшей мере на приблизительно б0%, по меньшей мере на приблизительно 70%, по меньшей мере на приблизительно 75%, по меньшей мере на приблизительно 80%, по меньшей мере на приблизительно 85%, по меньшей мере на приблизительно 90%, по меньшей мере на приблизительно 95% или более (например, приблизительно б5-99%)). Например, консервативные замещения остатков могут также или альтернативно основываться на замещении по принципу сохранения сильной или слабой группы и по принципу веса групп, что известно в данной области.
Сохранение сходных остатков может также или альтернативно измеряться с помощью оценки сходства, как определяется в программе ВЬА8Т (например, ВЬА8Т 2.2.8 доступна через NСВI). Пригодные варианты обычно проявляют по меньшей мере приблизительно 45%, по меньшей мере приблизительно 55%, по меньшей мере приблизительно б5%, по меньшей мере приблизительно 75%, по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95% или более (например, приблизительно 70-99%) сходства с родительским пептидом.
- 41 015584
Значительные изменения функции можно произвести, выбирая замещения, которые являются менее консервативными, чем показанные в определенных группах выше. Например, можно произвести неконсервативные замещения, которые более значительным образом повлияют на структуру пептида в области изменения, например структуру альфа-спирали или бета-листов; заряд или гидрофобность молекулы на участке мишени или объем боковых цепей. Замещениями, которые обычно считаются приводящими к наибольшим изменениям свойств пептида, являются такие, где 1) гидрофильный остаток, например серил или треонил, замещается (или замещает) гидрофобным остатком, например лейцилом, изолейцилом, фенилаланилом, валилом или аланилом; 2) цистеин или пролин замещается (или замещает) любым другим остатком; 3) остаток, обладающий электроположительной боковой цепью, например лизил, аргинил или гистидил, замещается (или замещает) электроотрицательным остатком, например глутамилом или аспартилом; или 4) остаток, обладающий объемистой боковой цепью, например фенилаланил, замещается (или замещает) остатком, у которого нет боковой цепи, например глицином. Соответственно эти и другие неконсервативные замещения можно вводить в варианты пептида, когда требуются значительные изменения функции/структуры, и такие замещения избегают, когда требуется сохранять функцию/структуру.
Удобным способом образования вариантов замещений является созревание сродства с применением фага с помощью способов, известных в данной области. Для того чтобы идентифицировать возможные кандидаты для модификации среди участков гипервариабельных районов, можно проводить также мутагенез со сканированием аланина, чтобы идентифицировать остатки гипервариабельных районов, вносящие значительный вклад в связывание антигена. Альтернативно или дополнительно, может быть полезным проанализировать кристаллическую структуру комплекса антиген-антитело, чтобы идентифицировать точки контакта между антителом и антигеном. Такие контактные остатки и соседние остатки являются весьма подходящими кандидатами для замещения.
Когда для получения варианта антитела делают вставки в гипервариабельные районы, следует принимать во внимание типичный диапазон длины рассматриваемого вариабельного района у известных антител. Например, для первого гипервариабельного района вариабельного домена легкой цепи вставки можно вводить в Уъ СЭЯ 1 последовательность родительского антитела, сохраняя при этом в основном близкий и поэтому ожидаемый нужный размер, который согласно КаЬа! е1 а1., кирга, например, обычно включает всего около 9-20 (например, около 10-17) остатков. Сходным образом, Уъ СЭЯ2 обычно имеет общую длину около 5-10 остатков, Уъ СЭЯ3 обычно имеет длину около 7-20 остатков; Ун СЭЯ1 обычно имеет длину около 10-15 остатков, Ун СЭЯ2 обычно имеет длину около 15-20 остатков, Ун СЭЯ3 обычно имеет длину около 6-30 остатков (например, 3-25 остатков). Вставки в Ун район обычно делают в Ун СЭЯ3 и обычно поблизости от С-конца домена, например, приблизительно около остатков 97-102 родительского Ун СЭЯ3 (например, смежные с или С-концевые в последовательности с остатком номер 100 родительской Ун СЭЯ3 последовательности), применяя сопоставление и нумерацию, как описано у Кабат. Варианты антитела со вставленными аминокислотными остатками в гипервариабельном районе могут быть сделаны случайным образом, особенно когда начальное сродство связывания родительского антитела с антигеном мишени является таковым, что полученные случайным образом варианты антитела легко подвергать скринингу. Например, фаговый дисплей представляет удобный способ скрининга таких случайных вариантов.
При разработке конструкции и/или оценке вариантов СОЯ можно уделить внимание тому факту, что СОЯ районы можно изменять, чтобы осуществить лучшее связывание с эпитопом. СОЯ антитела обычно действуют, предоставляя комплементарную поверхность, возможно включающую пальцы, которые могут входить внутрь белковой поверхности антигена, или другую паратопическую структуру, к которой подходит эпитоп. Если эпитоп подходит не плотно, то антитело не может проявлять высокого сродства. Однако как и в случае эпитопа, часто имеются несколько ключевых остатков в структуре паратопа, которые вносят основной вклад в это связывание. Таким образом, последовательности СОЯ могут значительно варьировать по длине и составу от антитела к антителу для того же пептида. Опытный специалист в данной области поймет, что определенные остатки, такие как остатки тирозина (например, в составе Ун СЭЯ3 последовательностей), которые часто являются важными участниками в связывании эпитопа, обычно сохраняются в вариантах СОЯ.
Варианты СОЯ района могут также увеличить контакты аминокислот между антигеном и вариантом антитела по сравнению с контактами аминокислот между антигеном и родительским антителом, посредством введения одного или более аминокислотного остатка (посредством замещения или вставки), которые увеличивают контакты или энергетически предпочтительные взаимодействия между одной или более аминокислотными остатками, присутствующими у антигена, и одним или более аминокислотными остатками, присутствующими у антитела. Рассматриваемые взаимодействия аминокислот можно выбирать из водородных связей, Ван-дер-Вальсовых взаимодействий и ионных связей.
Специалисты в данной области осведомлены о дополнительных принципах, применяемых при конструкции и выборе СЭ38ВР, включающих СОЯ варианты антител согласно настоящему изобретению.
Среди СОЯ вариантов, которые являются вариантами СОЯ антител из примеров, особенно среди варианта СОЯ у анти-СО38 антител или их фрагментов, остатки, необходимые для поддержания и/или
- 42 015584 ориентации структурной петли в структуре СБВ, обычно могут сохраняться; остатки, попадающие в радиус 10 ангстрем от СБВ структурной петли (но при необходимости только те остатки в этой области, у которых доступная водным растворителям поверхность составляет 5 ангстрем2 или более), обычно могут быть неизмененными или измененными только посредством консервативных замещений аминокислотных остатков; и/или аминокислотная последовательность может обычно подвергаться только ограниченному числу вставок и/или делеций (если такие есть), так что петлеобразные структуры СЭР сохраняются у варианта (описание нужных подходов и относящихся к этому принципов предоставлено, например, в 8с1и\\еск с! а1., 1. Мо1. Вю1. 268(5), 934-51 (1997), Могеа, ВюрЬуз Сбет. 68(1-3), 9-16 (1997), 8биш е! а1., ЕЕВ8 Ьеб. 399(1-2), 1-8 (1996), 8Ыга1 е! а1., ЕЕВ8 Бей. 455(1-2), 188-97 (1999), Веск/о е! а1., Рго!еш Епд. 8(4), 389-95 (1995) и Е^епЬго! е! а1., 1. Мо1. Вю1. 229(4), 969-95 (1993). См. также XV0 03/048185, ΧΧΌ 03/070747 и ΧΧΌ 03/027246.
Дополнительные способы, которые можно применять для получения вариантов антител, включают направленную эволюцию и другие варианты подходов, описанные, например, в И8 20040009498, Магкз е! а1., Ме!бобз Мо1. Вю1. 248, 327-43 (2004), АтеьВозеп&И е! а1., 1. Мо1. Вю1. 335(1), 177-92 (2004), Рагк е! а1., Вюсбет ВюрЬуз Вез Соттип. 275(2). 553-7 (2000), Капд е! а1., Ргос. №б. Асаб. 8ск И8А. 88(24), 11120-3 (1991), Ζ36π6 е! а1., 1. Вю1. Сбет. 279(18), 18870-7 (2004), Хи е! а1., Сбет Вю1. 9(8), 933-42 (2002), Вогбег е! а1., Ргос. N311. Асаб. 8ск И8А. 97(20), 10701-5 (2000), Сгатеп е! а1., N3!. Меб. 2(1), 100-2 (1996) и как описано в основном, например, в ΧΧ0 03/048185.
Полученные варианты антител можно подвергать любой подходящей технике скрининга, и антитела с необходимыми и желательными улучшенными свойствами согласно одному или более соответствующему анализу можно отбирать для дальнейшего развития.
СБВ38, включающие СБВ последовательности, как описано выше, могут включать любое подходящее число и сочетание таких V!, и V!! СБВ, при этом сохраняя по меньшей мере основную часть (по меньшей мере приблизительно 50, 60, 70, 80, 90, 95% или более) сродства/авидности и/или специфичности/избирательности антитела, обладающего V!, последовательностью согласно 8ЕО ΙΌ N0:2 и VII последовательностью согласно 8ЕО ΙΌ N0:7, и/или антитела, обладающего V!, последовательностью согласно 8ЕО ΙΌ N0:12 и УΗ последовательностью согласно 8ЕО ΙΌ N0:17, и/или антитела, обладающего VI. последовательностью согласно 8ЕО ΙΌ N0:22 и УΗ последовательностью согласно 8ЕО ΙΌ N0:27, но при необходимости отличаясь по другим характеристикам, таким как иммуногенность у больного человека, сродство к эпитопу, увеличенное время полужизни и т.д. В некоторых случаях, например, СБ38ВР может обладать большим сродством, избирательностью и/или специфичностью, чем родительское антитело. В одном воплощении в СБ38 настоящего изобретения присутствует меньше полного набора районов VI. СБВ и/или УΗ СБВ. В одном воплощении присутствуют все районы У^ СБВ и УΗ СБВ.
Примерами других функциональных свойств антител, которые можно изменить или сохранить у вариантов СБ38ВР настоящего изобретения по сравнению с -003, -005 и -024, являются:
(1) высокое сродство связывания с СБ38;
(2) низкая скорость диссоциации комплекса с СБ38;
(3) ингибирование или блокирование связывания с СБ38-мишенью;
(4) уничтожение Т-клеток или В-клеток, экспрессирующих СБ38;
(5) индукция высокого уровня СБС либо СБ55/59 отрицательных, либо СБ55/59 положительных клеток;
(6) перенос в липидные бляшки при связывании СБ38;
(7) наведение толерантности Т-клеток;
(8) ингибирование пролиферации Т- или В-клеток, экспрессирующих СБ38;
(9) интернализация СБ38;
(10) ингибирование индукции ферментативной активности СБ38;
(11) ингибирование индукции СБ38-индуцированного переноса сигнала;
(12) индукция или ингибирование продукции цитокинов;
(13) индукция или блокирование дифференциации Т- или В-клеток;
(14) индукция или спасение от апооптоза;
(15) аттенюация или наращивание индукции лизиса с помощью NК клеток;
(16) индукция или ингибирование продукции инсулина β клетками поджелудочной железы;
(17) продолженное выживание субъекта, несущего опухолевые клетки, экспрессирующие СБ38, и/или (18) индукция АЭСС мишеней СБ38 при смешивании с подходящими эффекторными клетками.
Настоящее изобретение также представляет СБ38ВР, которые охарактеризованы с точки зрения их способности конкурировать (конкурентно ингибировать) или перекрестно конкурировать (т.е. частично ингигибировать связывание эпитопа) с антителом, имеющим Уь последовательность согласно 8ЕО ΙΌ N0:2 и УΗ последовательность согласно 8Е0 ΙΌ N0:7 (как антитело -003), или с антителом, имеющим VI, последовательность согласно 8Е0 ΙΌ N0:12 и УΗ последовательность согласно 8Е0 ΙΌ N0:17 (как антитело -005), или с антителом, имеющим VI, последовательность согласно 8Е0 ΙΌ N0:22 и V!! последовательность согласно 8Е0 ΙΌ N0:27 (как антитело -024), за связывание СБ38.
- 43 015584
Такое СЭ38ВР может быть, например, РаЬ фрагментом, произведенным из антитела, которое связывается с эпитопом, идентичным или перекрывающимся с эпитопом, связывающимся антителом, имеющим Уь последовательность согласно 8ЕЦ ΙΌ N0:2 и Ун последовательность согласно 8Е0 ΙΌ N0:7, или с антителом, имеющим Уъ последовательность согласно 8ЕЦ ΙΌ N0:12 и Ун последовательность согласно 8Е0 ΙΌ N0:17, или с антителом, имеющим Уъ последовательность согласно 8ЕЦ ΙΌ N0:22 и Ун последовательность согласно 8ЕЦ ΙΌ N0:27. Такой РаЬ фрагмент благодаря своему относительно малому размеру по сравнению с молекулами тАЬ не может значительно конкурировать с упомянутыми антителами за связывание СЭ38, хотя антитело, от которого он произведен, конкурирует. Однако такое СЭ38ВР может быть полезным при нацеливании сходным образом на близкорасположенные районы СО 38 (например, при нацеливании цитотоксина, радиоактивного ядра или в составе иммуноконъюгата СЭ38ВР). Поэтому такие СЭ38ВР могут быть полезными среди способов настоящего изобретения и соответственно они также представлены настоящим изобретением.
Конкуренцию за связывание с С.П38 или частью СЭ38 для двух или более СЭ38ВР можно определять с помощью подходящей техники. В одном воплощении конкуренцию определяют, как описано в примерах 7-9.
Конкуренция в контексте настоящего изобретения относится к любому заметному уменьшению склонности отдельной молекулы связывать данный партнер связывания в присутствии другой молекулы, которая связывается с этим партнером связывания. Обычно конкуренция означает не менее чем приблизительно 10% уменьшение, например, не менее чем приблизительно 15% уменьшение или не менее чем приблизительно 20% уменьшение связывания между СЭ38ВР и (а) формой СЭ38 (например, обработанным, зрелым, необработанным, необработанным или незрелым СЭ38);
(б) формой свободного С.П38 (например, СЭ38 фрагмента, продуцируемого с помощью ίη νίνο процессинга (обработки));
(в) гетеродимерным пептидом, состоящим из другого пептида, связанного с 0038, например СЭ31, и С1У8;
(г) комплексом С.П38 с одним или более субстратом, например цАМФ, НАД+ и/или ЦАДФ;
(д) димеризованным, связанным и/или обработанным димером СО38 с растворимым лигандом, например СЭ3Е или (е) частью СЭ38, обусловленное присутствием другого СО38ВР, как определяют, например, с помощью анализа с ЕЫ8А или РАС8 анализа (как описано в разделе примеров), применяя достаточные количества двух или более конкурирующих СЭ38ВР и молекул СО38. Может также случиться, что конкуренция может существовать между СЭ38ВР по отношению к более чем одному СЭ38 и/или части СЭ38, например, когда свойства связывания антитела данного района СО38 сохраняются у его фрагментов, например, в случае хорошо представленного линейного эпитопа, расположенного на различных исследуемых фрагментах, или конформационного эпитопа, который присутствует у достаточно больших СЭ38 фрагментов, а также у СО38.
Оценка конкуренции обычно включает оценку относительного ингибирования связывания с применением первого количества первой молекулы, второго количества второй молекулы и третьего количества третьей молекулы (или стандарта, определенного посредством изучения связывания, которое можно приемлемым образом сравнить с новыми данными по связыванию по отношению к первой и второй молекулам в качестве заменителя действительных полученных одновременно данных), где первое, второе и третье количества являются достаточными для проведения сравнения, которое дает информацию об избирательности и/или специфичности рассматриваемых молекул по отношению к другим присутствующим молекулам. Первое, второе и третье количества могут варьировать в зависимости от природы рассматриваемых СЭ38ВР и потенциальных мишеней. Например, для оценки с помощью ЕЫ8А, сходных с описанными в разделе примеров, около 5-50 мкг (например, приблизительно 10-50 мкг, приблизительно 20-50 мкг, приблизительно 5-20 мкг, приблизительно 10-50 мкг и т.д.) СЭ38ВР и/или СЭ38 мишеней необходимо, чтобы определить наличие конкуренции. Условия также должны быть подходящими для связывания. Обычно физиологические или близкие к физиологическим условия (например, температуры около 20-40°С, рН около 7-8 и т.д.) годятся для СЭ38ВР:СО38 связывания.
Часто конкуренцию устанавливают как значительно большее относительное ингибирование, чем приблизительно 5%, как определяют с применением ЕЫ8А и/или РАС8 анализа. Может быть необходимым установить более высокий порог относительного ингибирования в качестве критерия/детерминанты необходимого уровня конкуренции в данном контексте (например, когда конкурентный анализ применяют для отбора или скрининга новых антител, созданных с целенаправленной функцией блокировки связывания другого пептида или молекулы с СЭ38 (например, природных партнеров связывания СЭ38, таких как ί'Ό3Ε также называемого СЭ31 антигеном, ЕпбоСАМ, ОРПА’, РЕСАМ-1, молекулы адгезии кровяных пластинок/эндотелиальных клеток или встречающегося в природе анти-СО38 антитела). Так, например, возможно установить критерий конкурентоспособности, где детектируется не менее приблизительно 10% относительного ингибирования, не менее приблизительно 15% относительного ингибиро
- 44 015584 вания или не менее приблизительно 20% относительного ингибирования, до того, как антитело считается достаточно конкурентоспособным. В тех случаях, когда эпитопы, принадлежащие конкурирующим антителам, близко расположены на антигене, конкуренция может быть установлена на величине больше приблизительно 40% относительного ингибирования связывания СЭ38 (например, не менее приблизительно 45% ингибирования, например, не менее приблизительно 50% ингибирования, например, не менее приблизительно 55% ингибирования, например, не менее приблизительно 60% ингибирования, например, не менее приблизительно 65% ингибирования, например, не менее приблизительно 70% ингибирования, например, не менее приблизительно 75% ингибирования, например, не менее приблизительно 80% ингибирования, например, не менее приблизительно 85% ингибирования, например, не менее приблизительно 90% ингибирования, например, не менее приблизительно 95% ингибирования или более высоким уровнем относительного ингибирования).
Конкуренцию можно считать обращением перекрестной реактивности между молекулой и двумя потенциальными партнерами связывания. В определенных воплощениях СЭ38ВР настоящего изобретения специфически связывается с одним или более остатками или районами СЭ38, а также не вступает в перекрестную реакцию с другими пептидами, пептидными районами или молекулами, например настоящее изобретение представляет анти-СЭ38 антитело, которое не вступает в перекрестную реакцию с белками, гомологичными СЭ38, например ВЗТ-1 (антиген 1 клетки стромы костного мозга) и Мо5, также называемым СЭ157; или анти-СЭ38 антитела, которые не вступают в перекрестную реакцию с СЭ38 в нормальной ткани, например ткани, не вовлеченной во множественную миелому. Обычно недостаток перекрестной реактивности означает менее чем приблизительно 5% относительного конкурентного ингибирования между молекулами при определении с помощью ЕЫЗА и/или ЕАС8 анализа с применением достаточных количеств молекул в подходящих условиях анализа.
В одном воплощении настоящее изобретение представляет СЭ38ВР, которое конкурирует с антителом, обладающим Уь последовательностью согласно 8ЕО ΙΌ ΝΌ:2 и УН последовательностью согласно 8ЕО ΙΌ ΝΌ:7, например антителом -003, за связывание СЭ38 или его части.
В одном воплощении настоящее изобретение представляет СЭ38ВР, которое конкурирует с антителом, обладающим Уъ последовательностью согласно 8ЕО ΙΌ ΝΌ:12 и УН последовательностью согласно 8ЕО ΙΌ ΝΌ:17, например антителом -005, за связывание СЭ38 или его части.
В одном воплощении настоящее изобретение представляет СЭ38ВР, которое конкурирует с антителом, обладающим Уь последовательностью согласно 8ЕО ΙΌ ΝΌ:22 и УН последовательностью согласно 8ЕО ΙΌ ΝΌ:27, например антителом -024, за связывание СЭ38 или его части.
Как обсуждается здесь в другом месте, если не указано обратное или не противоречит контексту, ссылки на связывание СЭ38ВР с СЭ38 относятся к связыванию в любом подходящем контексте, например в контексте конформации, когда присутствует структура СЭ38, или в контексте линейного эпитопа. Конечно, связывание в ограниченном наборе таких контекстов может быть важной характеристикой по отношению к СЭ38ВР предоставляемого настоящим изобретением.
Дополнительные способы определения специфичности СЭ38ВР с помощью конкурентного ингибирования можно найти, например, в Наг1оте е1 а1., АпбЬоб1ек: А ЬаЬогаФгу Мапиа1, Со1б 8рпп§ НагЬог БаЬогаЮгу Ргекк, Со1б 8рпп§ НагЬог, Ν.Υ. (1988), СоШдап е1 а1., ебк., СиггегИ Рго1осо1к ίη Iттиηο1οду, Сгеепе РиЬйкЫпд Аккос, апб ^11еу ШегЗаепсе Ν.Υ. (1992, 1993), апб Ми11ег, Ме111. Епхуто1. 92, 589-601 (1983).
СЭ38 человека включает большое число различных эпитопов, которые могут включать (1) пептидные антигенные детерминанты, заключенные внутри одной пептидной цепи в СЭ38 человека; (2) конформационные антигенные детерминанты, которые состоят из одной или более несоседних аминокислот на данной цепи и/или аминокислот, присутствующих на соседствующих в пространстве, но разных пептидных цепях (обычно, когда соответствующие аминокислотные последовательности цепей расположены разрозненно в полипептидной последовательности СЭ38 человека); (3) посттрансляционные антигенные детерминанты, которые состоят целиком или частично из молекулярных структур, ковалентно присоединенных к СЭ38 человека, например углеводородных групп, или (4) сочетаний по пп.(1)-(3).
Эпитоп в контексте настоящего изобретения включает любой пептид или произведенную из пептида детерминанту, способную специфически связываться и иммуноглобулином. Эпитоп может включать любое необходимое число аминокислот в любом необходимом положении (относительно линейной последовательности СЭ38), ориентации (относительно организованного в пространстве СЭ38 или его фрагмента), любого аминокислотного состава (и следовательно, по меньшей мере частично, заряда). Так, например, эпитоп может состоять из приблизительно 3-10 аминокислот, обычно из 3-8 аминокислот, в одном или более смежном или несмежном положении относительно первичной последовательности СЭ38 (например, эпитоп может состоять в основном из 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 аминокислотных остатков, распределенных по 1, 2, 3, 4 или 5 несмежным положениям в СЭ38). Альтернативно, например, эпитоп может считаться определенным районом из приблизительно 5-40 смежных аминокислотных остатков (например, приблизительно 7-30 аминокислотных остатков, приблизительно 5-20 аминокислотных остатков или приблизительно 3-15 аминокислотных остатков) в СЭ38 (отдельно или в сочетании с частью смежного домена СЭ38). В некоторых эпитопах может случиться, что только один аминокислотный ос
- 45 015584 таток или всего несколько аминокислотных остатков являются критическими для узнавания одного СОВ или ряда СОВ (и поэтому наиболее важными для ΟΌ38ΒΡ:ΟΌ38 антигенного сродства и авидности). Если так, эпитоп можно охарактеризовать на основе одного или более таких критических остатков с пониманием того, что другие остатки могут также вносить некий меньший вклад в эпитоп. В случае эпитопа, определенного районом аминокислот, может быть, что одна или более аминокислота района вносит очень малый или даже пренебрежимый вклад в связывание антитела, так что этот остаток может быть замещен другим подходящим остатком без потери эпитопа, по меньшей мере, для некоторых ΟΌ^^ΒΡ, для него специфичных.
В одном воплощении настоящее изобретение представляет С^38ΒΡ, например анти-С.'О38 антитело, которое специфически связывается с ί.Ό38 эпитопом, который также специфически связан с антителом, обладающим Уь последовательностью согласно 8Е0 ΙΌ N0:2 и Ун последовательностью согласно 8Е0 ΙΌ N0:7 (например, антителом -003), или с антителом, обладающим Уъ последовательностью согласно 8Е0 ΙΌ N0:12 и Ун последовательностью согласно 8Е0 ΙΌ N0:17 (например, антителом -005), или с антителом, обладающим Уъ последовательностью согласно 8Е0 ΙΌ N0:22 и Ун последовательностью согласно 8Е0 ΙΌ N0:27 (например, антителом -024). Возможно, что С^38ΒΡ, обладающие одним или более СОВ, которые отличаются от СОВ антитела, обладающего Уь последовательностью согласно 8Е0 ΙΌ N0:2 и Ун последовательностью согласно 8Е0 ΙΌ N0:7, или СОВ антитела, обладающего Уь последовательностью согласно 8Е0 ΙΌ N0:12 и Ун последовательностью согласно 8Е0 ΙΌ N0:17, или СОВ антитела, обладающего Уь последовательностью согласно 8Е0 ΙΌ N0:22 и Ун последовательностью согласно 8Е0 ΙΌ N0:27, могут тем не менее быть специфичными для того же эпитопа, как антитело, обладающее Уь последовательностью согласно 8Е0 ΙΌ N0:2 и Ун последовательностью согласно 8Е0 ΙΌ N0:7, и антитело, обладающее Уь последовательностью согласно 8Е0 ΙΌ N0:12 и Ун последовательностью согласно 8Е0 ΙΌ N0:17, и антитело, обладающее Уь последовательностью согласно 8Е0 ΙΌ N0:22 и Ун последовательностью согласно 8Е0 ΙΌ N0:27 соответственно. В некоторых из таких случаев рассматриваемые ί.Ό38ΒΡ могут узнавать или быть более специфичными/избирательными для отдельных структур или районов эпитопа, чем антитело, обладающее Уъ последовательностью согласно 8Е0 ΙΌ N0:2 и Ун последовательностью согласно 8Е0 ΙΌ N0:7, и антитело, обладающее Уъ последовательностью согласно 8Е0 ΙΌ N0:12 и Ун последовательностью согласно 8Е0 ΙΌ N0:17, и антитело, обладающее Уь последовательностью согласно 8Е0 ΙΌ N0:22 и Ун последовательностью согласно 8Е0 ΙΌ N0:27 соответственно.
ί.Ό38 эпитоп, связываемый антителом, обладающим Уъ последовательностью согласно 8Е0 ΙΌ N0:2 и Ун последовательностью согласно 8Е0 ΙΌ N0:7 (например, антителом -003), или с антителом, обладающим Уъ последовательностью согласно 8Е0 ΙΌ N0:12 и Ун последовательностью согласно 8Е0 ΙΌ N0:17 (например, антителом -005), или с антителом, обладающим Уъ последовательностью согласно 8Е0 ΙΌ N0:22 и Ун последовательностью согласно 8Е0 ΙΌ N0:27 (например, антителом -024), можно идентифицировать с помощью стандартных техник картирования и описания, дальнейшее усовершенствование которых можно идентифицировать с помощью любого подходящего подхода, многочисленные примеры которых доступны специалисту в данной области. Эти подходы можно также применять для идентификации и/или характеристики эпитопов для С^38ΒΡ, в основном. В качестве примера таких способов картирования/характеристики эпитоп для анти-СО38 антитела можно определить с помощью техники отпечатка эпитопа (ΓοοΙ-ρπηΙίηβ) с применением химической модификации доступных аминов/карбоксилов белка ί.Ό38. Одним из примеров такой техники отпечатка является применение нХМ8 (обмен водород-дейтерий, детектируемый с помощью масс-спектрометрии), где водород/дейтерий обмен амидных протонов белка рецептора и лиганда, связывание и обратный обмен происходят, когда амидные группы боковых цепей, участвующие в связывании белка, защищены от обратного обмена и поэтому остаются дейтерированными. Задействованные районы можно идентифицировать на этом этапе с помощью протеолиза пептидов, быстрой микроколоночной жидкостной хроматографии высокого разрешения и/или масс-спектрометрии с ионизацией в электроспрее; см., например, Ейппд н, Апа1уйса1 ΒίοοΠβ^βΐιγ, 267(2) 252-259 (1999) апй/ог Епдеп, 1. В. апй 8тйй, О.Ь. (2001) Апа1. Сйет. 73, 256Α-265Α. Другим примером подходящей техники идентификации эпитопа является картирование эпитопа с применением ядерного магнитного резонанса (ЯМР), где обычно сравнивают положение сигналов в двумерных спектрах ЯМР свободного антигена и антигена в комплексе с антигенсвязывающим пептидом, например антителом. Антиген обычно избирательно помечен с помощью изотопа 15Х так что в ЯМР-спектре видны только сигналы, соответствующие антигену, и никаких сигналов антигенсвязывающего пептида. У сигналов антигенов, принадлежащих аминокислотным остаткам, участвующим во взаимодействии с антигенсвязывающим пептидом, обычно сдвинуто положение в спектрах комплексов по сравнению со спектрами свободного антигена, и аминокислоты, участвующие в связывании, можно идентифицировать таким способом; см., например, Ετηβΐ 8сйеттд Вее Еоипй ХУогквйор. (44), 149-67 (2004), ниапд е1 а1., 1ошпа1 оГ Мо1еси1аг Βίο1ο§\· 281(1), 61-67 (1998) апй 8айо апй Ρаΐΐе^5οп, Мейойв. 9(3), 516-24 (1996). Картирование/характеристику эпитопа можно проводить с применением способов массспектрометрии; см., например, Эо^п^агй, 1. Маев 8рес1гот. 35(4), 493-503 (2000) апй К1ве1ат апй Όο\\пагй, Апа1 Сйет. 71(9), 1792-801 (1999).
- 46 015584
Техники обработки протеазами также являются полезными для картирования и идентификации эпитопа. Относящиеся к антигенным детерминантам районы/последовательности можно определять с помощью переваривания протеазами, например, применяя обработку трипсином в соотношении около 1:50 к СЭ38 в течение ночи (т/н) при 37°С и рН 7-8 с последующей масс-спектрометрическим (МС) анализом для идентификации пептидов. Пептиды, защищенные о расщепления трипсином в присутствии СЭ38ВР, можно далее идентифицировать посредством сравнения образцов, подвергнутых трипсиновой обработке, и образцов, инкубированных с СЭ38ВР, и затем подвергнутых перевариванию, например, трипсином (таким образом выявляя отпечатки мест связывания). Другие ферменты, например химотрипсин, пепсин и т.д., можно также или альтернативно применять для сходного способа характеристики эпитопа. СЭ38ВР, который дает в основном такой же результат, как антитело, обладающее Уъ последовательностью согласно 8ЕО ГО N0:2 и УН последовательностью согласно 8Е0 ГО N0:7 (например, антитело -003), или антитело, обладающее Уь последовательностью согласно 8Е0 ГО N0:12 и УН последовательностью согласно 8Е0 ГО N0:17 (например, антитело -005), или антитело, обладающее Уъ последовательностью согласно 8Е0 ГО N0:22 и УН последовательностью согласно 8Е0 ГО N0:27 (например, антитело -024), при таких измерениях, считаются антителом, которое связывает тот же эпитоп, как антитело, обладающее Уь последовательностью согласно 8Е0 ГО N0:2 и УН последовательностью согласно 8Е0 ГО N0:7 (например, антитело -003), или антитело, обладающее Уь последовательностью согласно 8Е0 ГО N0:12 и УН последовательностью согласно 8Е0 ГО N0:17 (например, антитело -005), или антитело, обладающее Уь последовательностью согласно 8Е0 ГО N0:22 и УН последовательностью согласно 8Е0 ГО N0:27 (например, антитело -024) соответственно; см., например, Маиса, Апп 151 8ирсг 8аийа. 27(1), 15-9 (1991) для обсуждения сходных техник.
Картирование эпитопа посредством конкурентного связывания СЭ38 с двумя антителами, где одно биотинилировано, является другим способом идентификации соответствующих районов антигенных детерминант.
Связывание антител с линейными или петлевыми пептидами СЭ38 с применением основанного на РЕР8САN связанного с ферментом иммуноанализа является другим способом идентификации соответствующих районов анигенных детерминант, см., например, 81οοΐ8ΐΓ3-ΐν с! а1. Мο1-^^νс^8. 1, 87-96 (1996).
Сайт-направленный мутагенез является другим способом идентификации соответствующих районов анигенных детерминант, см., например, Рο1уак апй Осаи8, В^й 99, 3956-3962 (2002).
Различные техники фагового дисплея также можно применять для идентификации эпитопов; см., например, νηηβ апй Υυ, Сигг Эгид Тагдс!8. 5(1), 1-15 (2004), ВигЮп, Iттипο!ссЬиο1οду. 1(2), 87-94 (1995 Аид), Ссг1с8с с! а1., Iттипο!ссЬиο1οду, 1(2), 87-94 (1995) апй Ьгшд с! а1., Сигг 0рт СЬет Вю1. 5(3), 314-24 (2001). Обобщающие типичные эпитопы можно также идентифицировать с помощью модифицированных техник фагового дисплея (см. 1Шр:/Лу\у\у.С8.птоп1апа.сйи/~1ии1иеу/рарег8/)сЬ03.рйГ) для обсуждения.
Другие способы, потенциально полезные для картирования эпитопов, включают кристаллографические техники, техники дифракции рентгеновских лучей (такие как техника исследования последовательности с помощью дифракции рентгеновских лучей, разработанная Поляк и другими в 1970-1980 гг.) и приложение многоштырьковой технологии пептидного синтеза (МиШрт Рсрййс 8уп111С818 ТссЬисЬду). Компьютерные способы, например анализ последовательности и трехмерный структурный анализ и анализ стыковки, можно также применять для идентификации антигенных детерминант. Например, эпитоп можно также определить с помощью молекулярного моделирования с применением структуры СЭ38 и стыковки со структурой РаЬ фрагмента индивидуального моноклонального антитела. Эти и другие способы картирования обсуждаются в Ер1Юрс Марртд А Ргасйса1 АрргоасН (Vс8!νοοй аий Нау Ей5.), 2001, 0χΓοΜ ип|усг511у Ргс88.
В одном воплощении настоящее изобретение представляет СЭ38ВР, обладающее в основном такими же характеристикам специфического связывания одного или более тАЬ8, выбранными из антител, имеющих Уь последовательность согласно 8Е0 ГО N0:2 и УН последовательность согласно 8Е0 ГО N0:7 (например, антитело -003), или антител, имеющих Уъ последовательность согласно 8Е0 ГО N0:12 и УН последовательность согласно 8Е0 ГО N0:17 (например, антитело -005), или антител, имеющих Уъ последовательность согласно 8Е0 ГО N0:22 и УН последовательность согласно 8Е0 ГО N0:27 (например, антитело -024).
Проведение картирования показывает, что несколько моноклональных антител, выработанных против СЭ38 человека, связываются с эпитопом на С-концевом районе СЭ38 (220-296) (Ήο81ιίηο с! а1. аий Рсггсго с! а1.). Внутри этого района обнаружены различия в три аминокислоты между последовательностями СЭ38 человека и ливанской макаки циномолгуса (супοтο1ди8): Т237, 0272 и 8274 у человека соответствуют А238, К273 и Р275 у обезьяны. -005 не связывается с тканью циномолгуса (см. примеры 10 и 11). Существует ограниченное число различающихся аминокислот между последовательностями СЭ38 у человека и обезьяны, например, в С-концевой части белка, например три следующие аминокислоты различаются в последовательностях СЭ38 человека и обезьяны: Т237, 0272 и 8274 в СЭ38 человека соответствуют А238, К273 и Р275 в СЭ38 циномолгуса (сравнить 8Е0 ГО N0:21 и 8Е0 ГО N0:22). -005 не связывается с мутантным белком йиСО38, где глутаминовый остаток в положении 272 8Е0 ГО N0:31 замещен остатком аргинина (О272К), или с мутантным белком йиСО38, где остаток серина в положении
- 47 015584
274 8Е0 ΙΌ N0:31 замещен остатком фениладанина (8274Е) (показано в примере 17) в той же степени, как оно связывается с СБ38 человека дикого типа. Связывание -005 в особенности изменяется при замещении аминокислоты в положении 8274Е.
Далее, настоящее изобретение представляет пептиды, которые связываются с СБ38 человека (8Еф ΙΌ N0:31) и которые не связываются с мутантным СБ38 человека, где остаток глутамина в положении 272 замещен остатком аргинина (8Еф ΙΌ N0:33) в той же степени, как они связываются с СБ38 человека (8ЕО ΙΌ N0:31).
Настоящее изобретение представляет пептиды, которые связываются с СБ38 человека (8Еф ΙΌ N0:31) и не связываются с мутантным СБ38 человека, где остаток серина в положении 274 замещен остатком фенилаланина (8Е0 ΙΌ N0:34) в той же степени, как они связываются с СБ38 человека (8Еф ΙΌ N0:31).
Термин в той же степени следует интерпретировать так, что связывание пептида с мутантным СБ38 человека значительно ниже, чем связывание пептида с диким типом СБ38 человека. Связывание пептида с молекулами СБ38 (дикого типа и мутанта) можно определить многими способами и определение того, считается ли связывание с мутантным белком значительно ниже, чем связывание с диким типом, находится в пределах обычных знаний специалиста в данной области. Большое число различных техник для определения связывания пептида с другим пептидом доступны специалисту в данной области, например ЕЫ8А. радиоиммуноанализ, ВМсоге или проточная цитометрия.
Одним способом определения связывания является определение ЕС50 для связывания пептида с мутантным белком и с белком дикого типа и сравнение полученных величин. Другим способом определения связывания является рассмотрение амплитуды связывания при насыщающей концентрации (например, на плато сигнала связывания) или посредством определения кинетических констант скорости коп и ко££, например, с помощью ВМсоге.
В одном воплощении связывание рассматриваемого пептида с СБ38 белками (мутантом или диким типом) проводят с помощью ΕΕΙ8Α, как описано в примере 17.
В одном воплощении ЕС50 для связывания пептида с мутантным СБ38 человека, где остаток серина в положении 274 замещен остатком фенилаланина (8Еф ГБ N0:34), составляет менее 50% ЕС50 для связывания пептида с СБ38 человека (8Еф ΙΌ N0:31). В одном воплощении ЕС50 для связывания пептида с мутантным СБ38 человека, где остаток серина в положении 274 замещен остатком фенилаланина (8Еф ΙΌ N0:34), составляет менее 10% ЕС50 для связывания пептида с СБ38 человека (8Еф ΙΌ N0:31). В одном воплощении ЕС50 для связывания пептида с мутантным СБ38 человека, где остаток серина в положении 274 замещен остатком фенилаланина (8Еф ΙΌ N0:34), составляет менее 5% ЕС50 для связывания пептида с СБ38 человека (8Еф ΙΌ N0:31). В одном воплощении ЕС50 для связывания пептида с мутантным СБ38 человека, где остаток серина в положении 274 замещен остатком фенилаланина (8Еф ΙΌ N0:34), составляет менее 1% ЕС50 для связывания пептида с СБ38 человека (8Еф ΙΌ N0:31).
В одном воплощении ЕС50 для связывания пептида с мутантным СБ38 человека, где остаток глутамина в положении 272 замещен остатком аргинина (8Еф ΙΌ N0:33), составляет менее 50% ЕС50 для связывания пептида с СБ38 человека (8Еф ΙΌ N0:31). В одном воплощении ЕС50 для связывания пептида с мутантным СБ38 человека, где остаток глутамина в положении 272 замещен остатком аргинина (8Еф ΙΌ N0:33), составляет менее 10% ЕС50 для связывания пептида с СБ38 человека (8Еф ΙΌ N0:31).
В одном воплощении пептиды согласно изобретению связываются с мутантным СБ38 человека, где остаток треонина в положении 237 замещен остатком аланина (8Еф ΙΌ N0:32) в той же степени, как они связываются с СБ38 человека (8Еф ΙΌ N0:31). В одном воплощении ЕС50 для связывания пептида с мутантным СБ38 человека, где остаток треонина в положении 237 замещен остатком аланина (8Еф ΙΌ N0:32), составляет более 75% величины ЕС50 для связывания пептида с СБ38 человека (8Еф ΙΌ N0:31). В одном воплощении ЕС50 для связывания пептида с мутантным СБ38 человека, где остаток треонина в положении 237 замещен остатком аланина (8Еф ΙΌ N0:32), составляет более 85% величины ЕС50 для связывания пептида с СБ38 человека (8Еф ΙΌ N0:31). В одном воплощении ЕС50 для связывания пептида с мутантным СБ38 человека, где остаток треонина в положении 237 замещен остатком аланина (8Еф ΙΌ N0:32), составляет более 90% величины ЕС50 для связывания пептида с СБ38 человека (8Еф ΙΌ N0:31). В одном воплощении ЕС50 для связывания пептида с мутантным СБ38 человека, где остаток треонина в положении 237 замещен остатком аланина (8Еф ΙΌ N0:32), составляет более 95% величины ЕС50 для связывания пептида с СБ38 человека (8Еф ΙΌ N0:31).
Чтобы идентифицировать более специфически возможные районы антигенных детерминант в СБ38, можно применять различные предсказательные аналитические подходы. В первом аналитическом подходе СБ38 можно анализировать на (1) районы с высокой гидропатичностью (применяя способ КайтДулитл (Ку!е-Боо11й1е)); (2) антигенность при определении по способу индекса выпячивания; (3) антигенность при определении по способу Паркера; (4) антигенность при определении по способу Хопп/Вуда и (5) гидрофильность при определении по способам Голдмана, Энглемана и Стайца. Последовательности в интервале длины 10-40 аминокислот можно выбирать на основе проявления одного или более из этих свойств. Обоснованием такого подхода является общепринятая идея, что многие идеальные эпитопы Вклеток являются гидрофильными, ориентированными на поверхность и гибкими последовательностями
- 48 015584 из приблизительно 8-10 аминокислот длиной.
Настоящее изобретение представляет СО38ВР, специфичные к СЭ3 8-районам СЭ38, идентифицированные таким образом. Далее, концы таких последовательностей можно сравнивать с предсказанными районами антигенных детерминант, локализованными с помощью других аналитических подходов, описанных здесь для предоставления дополнительных специфических районов, содержащих вероятные антигенные детерминанты. Другие похожие сравнения можно легко проделать, чтобы предоставить дополнительные районы возможных антигенных детерминант, где связывание СЭ38ВР с этими районами антигенных детерминант может считаться еще одним свойством настоящего изобретения.
В одном воплощении СЭ38ВР настоящего изобретения является антителом. Не накладывающие ограничений примеры СО38-связывающих молекул иммуноглобулина, представленных настоящим изобретением, включают (а) полную функциональную молекулу иммуноглобулина, содержащую: (1) две идентичные химерные тяжелые цепи, включающие вариабельный район с антигенной специфичностью поверхности В-клетки человека и константный район человека, и (2) две целиком идентичные (т. е. нехимерные) легкие цепи человека; (б) полную функциональную молекулу иммуноглобулина, включающую: (1) две идентичные химерные тяжелые цепи, включающие вариабельный район, как указано, и константный район человека и (2) две целиком идентичные (т.е. нехимерные) легкие цепи не-человека; (в) моновалентное антитело, т.е. полная функциональная молекула иммуноглобулина, включающее: (1) две идентичные химерные тяжелые цепи, включающие вариабельный район, как указано, и константный район человека и (2) две разные легкие цепи, только одна из которых обладает такой же специфичностью, как и вариабельный район тяжелых цепей. Получающаяся молекула антитела связывается только одним своим концом и поэтому неспособна к двухвалентному связыванию. В качестве другой иллюстрации, относящиеся к иммуноглобулинам пептиды, представленные настоящим изобретением, можно сказать, включают следующие: (а) целую молекулу иммуноглобулина; (б) 5сΡν; (в) моноклональное антитело; (г) химерное антитело; (д) гуманизированное антитело; (е) РаЬ фрагмент; (ж) РаЬ' фрагмент; (з) Р(аЬ') фрагмент; (и) Ρν молекулу; (к) Ρν молекулу, связанную дисульфидной связью.
В одном воплощении СЭ38ВР настоящего изобретения является поликлональным антителом. В одном воплощении СЭ38ВР настоящего изобретения является моноклональным антителом. В дальнейшем воплощении СЭ38ВР настоящего изобретения является моноклональным антителом человека. В другом дальнейшем воплощении СЭ38ВР настоящего изобретения является гуманизированным антителом. В другом дальнейшем воплощении СЭ38ВР настоящего изобретения является химерным антителом. В другом дальнейшем воплощении СЭ38ВР настоящего изобретения является моноклональным антителом, целиком происходящим из видов млекопитающих, отличных от человека. В другом дальнейшем воплощении С.О38ВР настоящего изобретения является целиком мышиным моноклональным антителом.
Моноклональное антитело относится к композиции, включающей гомогенную популяцию антител, обладающих единообразной структурой и специфичностью. Обычно моноклональное антитело является антителом, полученным из популяции в основном гомогенных антител, например индивидуальные антитела, составляющие популяцию, являются идентичными, за исключением возможных встречающихся в природе мутаций, которые могут присутствовать в небольших количествах. Моноклональные антитела являются высоко специфичными и каждое моноклональное антитело обычно направлено против единственного эпитопа в противоположность препаратам поликлональных антител, которые обычно включают различные антитела, направленные против различных эпитопов. Свойство моноклональности не следует толковать как требование производства антител неким особым способом. Например, моноклональные антитела настоящего изобретения можно продуцировать с помощью гибридомного способа, впервые описанного КоЫег е! а1., N311.^ 256, 495 (1975), или можно получать с помощью ДНК-рекомбинантных способов. Моноклональные антитела можно также изолировать из фаговых библиотек антител, применяя техники, описанные, например, в С1аскзоп е! а1., 352, 624-628 (1991) апб Магкз е! а1., 1. Мо1. Вю1.
222, 581-597 (1991).
Моноклональные антитела можно получать из любого подходящего источника. Так, например, моноклональные антитела можно получать из гибридом, полученных из В-клеток селезенки мыши, полученных из мыши, иммунизированной нужным антигеном, например в форме клеток, экспрессирующих антиген на поверхности, или нуклеиновой кислоты, кодирующей нужный антиген. Моноклональные антитела можно также получать из гибридом, произведенных из экспрессирующих антитела клеток иммунизированных людей или млекопитающих, отличных от человека, таких как крысы, собаки, приматы т.д.
Альтернативно, гены клонированных антител можно экспрессировать в других системах экспрессии, включая прокариотические клетки, например микроорганизмы, например, Е.соК для получения одноцепочечных Ρν антител, водоросли, а также клетки насекомых. Далее, антитела можно получать с помощью трансгенных животных, отличных от человека, например, в молоке овец или кроликов или в куриных яйцах, или в трансгенных растениях; см., например, Уе^та, Я., е! а1., 1. Iттиηо1. Ме111. 216, 165181 (1998); Ро11оск, е! а1., 1. ]ттипо1. МеШ 231, 147-157 (1999) и Р15сйег, Я., е! а1., Вю1. Скет. 380, 825839 (1999).
В одном воплощении моноклональные антитела человека, направленные на 0038, можно получать с помощью трансгенных или трансхромосомных мышей, несущих части иммунной системы человека, а
- 49 015584 не системы мыши. Такие трансгенные или трансхромосомные мыши называются здесь ниМАЬ мыши и КМ мыши соответственно, и все вместе называются трансгенные мыши. Моноклональные антитела человека, вырабатываемые у таких мышей, можно сокращенно называть ниМаЬ.
ниМАЬ мышь несет минилокусы гена иммуноглобулина человека, которые кодируют нереорганизованные последовательности тяжелой (μ и γ) и легкой (к) цепи иммуноглобулина человека вместе с направленными мутациями, которые инактивируют эндогенные локусы μ и к цепи (ЬопЬегд, N. е! а1., №1Шге 368, 856-859 (1994)). Соответственно мышь проявляет пониженную экспрессию мышиного ЦМ или к и в ответ на иммунизацию, внесенные трансгены тяжелой и легкой цепи человека претерпевают переключение класса и соматическую мутацию, чтобы вырабатывать моноклональные антитела Ι§Ο,κ с высоким сродством (ЬопЬегд, N. е! а1. (1994), кирга; ге\зе\\'ей ш ЬопЬегд, N. напйЬоок о£ Ехрептеп!а1 Ркагтасо1оду 113, 49-101 (1994), ЬопЬегд, N. апй Инк/аг Ό., Шет. Яеу. Штипо1. Уо1. 13, 65-93 (1995) апй нагйтд, Р. апй ЬопЬегд, N. Апп. КУ. Асай. δα 764 536-546 (1995)). Получение ниМАЬ детально описано в Тау1ог, Ь. е! а1., Шс1е1с Ас1йк Яекеагск 20, 6287-6295 (1992), Скеп, к е! а1., Шегпа!юпа1 Iттиηο1οду 5, 647-656 (1993), ТиаШоп е! а1., к Штипок 152, 2912-2920 (1994), Тау1ог, Ь. е! а1., Iη!етаΐ^οηа1 Штипо1оду 6, 579-591 (1994), Р1ккМ1й, Ό. е! а1., №ιΙιικ Вю!ескпо1оду 14, 845-851 (1996); см. также υδ 5545806, υδ 5569825, υδ 5625126, υδ 5633425, υδ 5789650, υδ 5877397, υδ 5661016, υδ 5814318, υδ 5874299, υδ 5770429, υδ 5545807, А0 98/24884, А0 94/25585, А0 93/1227, А0 92/22645, А0 92/03918 и А0 01/09187.
Мыши НСо7 несут нарушение кКЭ в своих эндогенных генах легких цепей (к) (как описано в Скеп е! а1., ЕМВ0 к 12, 821-830 (1993)), нарушение СМО в своих эндогенных генах тяжелых цепей (как описано в примере 1 А0 01/14424), КСо5 трансген к легкой цепи человека (как описано в Р1ккМ1й е! а1., №ιΙιικ Вю!ескпо1оду 14, 845-851 (1996)) и нСо7 трансген тяжелой цепи человека (как описано в υδ 5770429).
Мыши НСо12 несут нарушение кКО в своих эндогенных генах легких цепей (к) (как описано в Скеп е! а1., ЕМВ0 к 12, 821-830 (1993)), нарушение СМО в своих эндогенных генах тяжелых цепей (как описано в примере 1 А0 01/14424), КСо5 трансген к легкой цепи человека (как описано в Р1ккМ1й е! а1., №ιΙιικ Вю!ескпо1оду 14, 845-851 (1996)) и НСо12 трансген тяжелой цепи человека (как описано в примере 2 А0 01/14424). У штамма мышей КМ эндогенный ген к легкой цепи мыши был гомозиготно разрушен, как описано в Скеп е! а1., ЕМВ0 к 12, 821-830 (1993), и эндогенный ген тяжелой цепи мыши гомозиготно разрушен, как описано в примере 1 А0 01/09187. Этот мышиный штамм несет трансген к легкой цепи человека, КСо5, как описано в Р1ккМ1й е! а1., К-Шие Вю!ескпо1оду 14, 845-851 (1996). Этот мышиный штамм также несет трансхромосому тяжелой цепи человека, состоящую из фрагмента кСР 14-й хромосомы ^С20), как описано в А0 02/43478.
Мыши КМ несут трансхромосому тяжелой цепи человека и трансген к легкой цепи человека. Гены эндогенных тяжелой и легкой цепей мыши также нарушены у КМ мышей, так что иммунизация мышей приводит к продукции иммуноглобулинов человека, а не мыши. Конструкция КМ мышей и их применение для наработки иммуноглобулинов человека детально описаны в А0 02/43478.
Клетки селезенки таких трансгенных мышей можно применять для получения гибридом, которые секретируют моноклональные антитела человека, согласно хорошо известным техникам. Такие трансгенные млекопитающие, млекопитающие, включающие работающую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую экспрессию СО38ВР, млекопитающие, стабильно трансфицированные одной или более последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей 0038, и т.п., являются дополнительным свойством настоящего изобретения.
Моноклональные или поликлональные антитела человека согласно настоящему изобретению или антитела настоящего изобретения, происходящие из других видов, можно вырабатывать трансгенным способом посредством получения другого млекопитающего, отличного от человека, или растения, которое является трансгенным для рассматриваемых последовательностей тяжелой и легкой цепей, и продукции антитела в форме, пригодной для выделения. В связи с трансгенной продукцией у млекопитающих антитела можно производить и выделять из молока овец, коров или других млекопитающих; см, например, υδ 5827690, υδ 5756687, υδ 5750172 и υδ 5741957.
Далее, антитела человека согласно настоящему изобретению или антитела настоящего изобретения, происходящие из других видов, можно получать с помощью техник дисплея, включая без ограничений, фаговый дисплей, ретровирусный дисплей, рибосомальный дисплей и другие техники, хорошо известные в данной области и получающиеся молекулы можно подвергать дополнительному созреванию, такому как созревание сродства, с помощью техник, хорошо известных в данной области (см., например, ноодепЬоот е! а1., к Мо1. Вю1. 227, 381 (1991) (фаговый дисплей), Уаидкап е! а1., №ιΙιικ Вю!еск 14, 309 (1996) (ркаде й1кр1ау), напек апй Р1ис!каи, РNАδ υδΛ 94, 4937-4942 (1997) (рибосомальный дисплей), Рагт1еу апй δαίΐΗ, Оепе 73, 305-318 (1988) (фаговый дисплей), δ^!! ΤΕδ 17, 241-245 (1992), С\\зг1а е! а1., РNАδ ИЗА 87, 6378-6382 (1990), Яикке! е! а1., N^1. Ас1йк Яекеагск 21, 1081-1085 (1993), ноодепЬоот е! а1., Штипо1. Немей к 130, 43-68 (1992), СШкххеП апй МсСайейу ТШТЕСн 10, 80-84 (1992) и υδ 5733743). Если технологии дисплея применяются для продукции антител, которые не являются чело
- 50 015584 веческими, такие антитела можно гуманизировать, например, как описано здесь.
Гуманизированные моноклональные антитела по настоящему изобретению можно получать посредством соединения константных доменов антитела человека с вариабельными доменами из отличных от человека видов. Примеры того, как получить гуманизированные антитела, можно найти, например, в И8 6054297, И8 5886152 и И8 5877293. Гуманизированное антитело создают так, чтобы получить большую гомологию с иммуноглобулином человека, чем у произведенных из животных моноклональных антител. Аминокислотные остатки нечеловеческого происхождения из вносимого (животного) вариабельного домена обычно трансфицируют в скелетную человека. Гуманизацию в основном можно проводить по способу Винтера и соавторов (бопех е! а1., №11игс 321, 522-525 (1986), В1есЬтапп е! а1., №11игс 332, 323-327 (1988), Уегйоеуеп е! а1., 8с1епсе 239, 1534-1536 (1988)) посредством замещения определяющих комплементарность районов грызуна (СЭВк) или СОВ последовательностей на соответствующие последовательности антитела человека. Соответственно в таких гуманизированных антителах СЭВ части вариабельных районов человека замещены соответствующей последовательностью из видов, отличных от человека. Так, гуманизированные антитела являются обычно антителами человека, у которых некоторые остатки СЭВ и возможно некоторые остатки каркасного района замещены остатками из аналогичных участков антител грызунов. Выбор вариабельных районов человека как легкого, так и тяжелого для применения в получении гуманизированных антител является важным для уменьшения антигенности. Согласно так называемому способу наилучшего согласия последовательность вариабельного домена антитела грызуна подвергают скринингу против всей библиотеки известных последовательностей вариабельного домена человека. Последовательность человека, которая оказывается самой близкой к последовательности грызуна, далее применяют как каркасную последовательность человека (ЕВ) для гуманизированного антитела (811115 е! а1., Т Тштипок, 151, 2296 (1993), Сйо!Ыа е! а1., Т Μο1. Вю1. 196, 901 (1987)). Другой способ применяет отдельную каркасную часть, произведенную из обобщающей типичной последовательности антител человека отдельной подгруппы легкой и тяжелой цепей. Такую же каркасную часть можно применять для нескольких различных гуманизированных антител (Сайег е! а1., РNΑ8 И8А 89, 4285 (1992), Рге§1а е! а1., I Тшшипо1. 151, 2623 (1993)).
Обычно также важно, чтобы гуманизированные антитела сохраняли высокое сродство к антигену и другие благоприятные биологические свойства. Для достижения этой цели гуманизированные антитела можно получать посредством анализа родительских последовательностей и различных отвлеченных гуманизированных продуктов с применением трехмерных моделей родительских и гуманизированных последовательностей. Трехмерные модели иммуноглобулина доступны для всех и знакомы специалисту в данной области. Доступны компьютерные программы, которые иллюстрируют и предлагают вероятные трехмерные конформационные структуры последовательностей иммуноглобулина избранных кандидатов. Просмотр этих дисплеев позволяет проанализировать вероятную роль определенных остатков в функционировании последовательности иммуноглобулина кандидата, например анализ остатков, которые оказывают влияние на способность последовательности иммуноглобулина кандидата связывать свой антиген. Таким образом, остатки ЕВ можно выбирать и комбинировать из последовательностей реципиента и вносимых последовательностей, так чтобы желаемые характеристики антитела, такие как увеличенное сродство к антигену мишени, довести до максимума, хотя именно СЭВ остатки прямо и наиболее значительно влияют на связывание антигена.
Мышиные антитела или антитела из других видов можно гуманизировать или приматизировать с применением любой подходящей техники, большее число подходящих техник уже хорошо известно в данной области (см., например, \Ут1ег апб Иагп5 Тттипок Тобау 14, 43-46 (1993) и \Уп§111 е! а1., Сгб. Веу1ете ш ТттипоР 125-168 (1992)). Данное антитело можно построить с помощью ДНК рекомбинантных техник, чтобы заместить Сн1, Сн2, Сн3, районы связки и/или каркасные домены соответствующими последовательностями человека (см. \У0 92/02190 и И8 5530101, И8 5585089, И8 5693761, И8 5693792, И8 5714350 и И8 5777085).
Гуманизацию антител можно также проводить с помощью способа Винтера и соавторов (бопех е! а1., №11иге 321, 522-525 (1986), В1есЬтапп е! а1., №11иге 332, 323-327 (1988), Уегйоеуеп е! а1., 8аепсе 239, 1534-1536 (1988)) посредством замещения последовательностей СЭВ или СОВ грызунов соответствующими последовательностями антитела человека. Соответственно такие гуманизированные антитела являются, в известном смысле, химерными антителами (И8 4816567), где значительно меньше материала, чем интактный вариабельный район человека, замещено соответствующей последовательностью из вида, отличного от человека. На практике гуманизированные антитела являются обычно антителами человека, у которых некоторые СЭВ остатки и, вероятно, некоторые ЕВ остатки замещены остатками из аналогичных участков антител грызунов.
Также применение кДНК иммуноглобулина для конструкции генов химерного иммуноглобулина известно в данной области техники (см., например, Ьш е! а1., РNА8 И8А 84, 3439 (1987) и Т Тттипок 139, 3521 (1987)). мРНК изолируют из гибридомы или других клеток, продуцирующих антитело, и применяют для производства кДНК. Рассматриваемые кДНК можно амплифицировать с применением полимеразной цепной реакции с применением специфических праймеров (И8 4683195 и И8 4683202). Альтернативно, делают библиотеку и проводят скрининг, чтобы изолировать нужную последовательность.
- 51 015584
Последовательность ДНК, кодирующую вариабельный район антитела, далее соединяют с последовательностями константного района человека. Последовательности константных районов человека (а также вариабельных районов) можно найти в КаЬа! с! а1. (1991), 8сс.|испсск оГ Рго!с1П8 оГ [шшипо1од1са1 Шсгск!, N. Ι. Н. риЫюабоп по. 91-3242 и более недавние и относящиеся к делу данные можно найти на й!!р://тетете.Ь1осйст.ис1.ас.ик/~тагйп/аЬ5/6спсга11п£о.й!ш1. Выбор изотипа обычно направляется желаемыми функциями эффекторов, такими как фиксация комплемента или активность в зависимой от антитела клеточной цитотоксичности. Примерами изотипов являются Ι§ΟΙ, Ι§02, ΙβΟ3 и ΙβΟ4. Любой из константных районов легкой цепи человека, к или λ, можно применять. Химерное гуманизированное антитело можно затем экспрессировать с помощью общепринятых способов.
СЭ38ВР настоящего изобретения может быть в любой приемлемой форме с точки зрения мультимеризации. Анти-СЭ38 антитела и фрагменты антител могут быть, по меньшей мере, в гетеротримерной форме, если не в форме более высокой мультимерности, как такие, связанные с Ι§Μ антителами. В других воплощениях СЭ38ВР может присутствовать в виде димера или мономера. Мономерные СЭ38ВР по настоящему изобретению могут быть, например, модифицированы с помощью любой подходящей техники, так чтобы образовывать мультимерные пептидные композиции.
Если требуется, класс анти-СО38 антител настоящего изобретения можно переключить с помощью известных способов. Например, класс антитела настоящего изобретения, которое исходно принадлежало Ι§Μ классу, можно переключить на ΙβΟ антитело согласно настоящему изобретению. Далее, техники переключения класса можно применять для перевода одного подкласса ΙβΟ в другой, например Ι§61 в Ιβ62. Так, эффекторную функцию антител настоящего изобретения можно изменять с применением переключения изотипа, например, Ι§ΟΙ, Ι§02, Ι§03, Ι§04, Ι§ϋ, Ι&Λ., Ι§Ε или Ι§Μ антитела для различных терапевтических применений.
В одном воплощении антитело настоящего изобретения является Ι§01 антителом, например Ι§Ο1,κ или Ι§Ο1,λ изотипа. В другом воплощении антитело настоящего изобретения является ΙβΟ3 антителом, например Ι§Ο3,κ или Ι§Ο3,λ изотипа. В другом воплощении антитело настоящего изобретения является Ιβ64 антителом, например, Ι§Ο4,κ или Ι§Ο4,λ изотипа. В другом воплощении антитело настоящего изобретения является Ι§Ά1 или Ι^2 антителом. В другом воплощении антитело настоящего изобретения является Ι§Μ антителом.
Анти-СО38 антитела можно получать из библиотек рекомбинантных комбинаторных антител, таких как библиотека 5сΕν фагового дисплея, которые можно строить из Уь и УН кДНК человека, полученной из мРНК, произведенной из лимфоцитов человека. Способы получения и скрининга таких библиотек известны в данной области. Имеется большое число доступных в продаже наборов для получения библиотек фагового дисплея. Имеются также другие способы и реагенты, которые можно применять для получения и скрининга библиотек дисплея антител (см., например, И8 5223409, XV0 92/18619, ΧΧΌ 91/17271, XV0 92/20791, XV0 92/15679, XV0 93/01288, XV0 92/01047, \ν0 92/09690, Еисйк с! а1., Вю/Тсс11по1оду 9,1370-1372 (1991), Нау с! а1., Нит. АпйЬоб. НуЬпботак 3, 81-85 (1992), Никс с! а1., δοΐспсс 246, 1275-1281 (1989), МсСаГГсйу с! а1., №!игс 348, 552-554 (1990), СпГГййк с! а1., ЕМВ0 I. 12, 725734 (1993), НаМбпк с! а1., I. Мо1. Вю1. 226. 889-896 (1992), С1асккоп с! а1., ХаИис 352, 624-628 (1991), Сгат с! а1., РНА8 И8А 89, 3576-3580 (1992), Саггаб с! а1., Вю/Тссйпо1о§у 9, 1373-1377 (1991), НоодспЬоот с! ак, Ыис Ас1б Вск 19, 4133-4137 (1991) апб ВагЬак с! а1., РНА8 И8А 88, 7978-7982 (1991)). Подходящие последовательности нуклеиновых кислот Уъ и УН можно отбирать с применением подходящих способов. Например, Уь и УН нуклеиновые кислоты можно отбирать, применяя способы импринтинга эпитопа, описанные в Λ0 93/06213. Библиотеки антител, например, ксН' библиотеки, можно получать и подвергать скринингу с применением известных и подходящих способов (с пептидами, содержащими СЭ38 человека в качестве антигена(ов)), как описано, например, в Λ0 92/01047, МсСаГГсйу с! а1., ^Штс 348, 552-554 (1990) и бпГГййк с! а1., ЕМВ0 I. 12, 725-734 (1993). Такие библиотеки антител и другие комбинации СЭ38ВР (библиотеки, объединения и т.д.) являются свойствами настоящего изобретения, которые можно применять терапевтически для предоставления более полного иммунного ответа; в качестве подходов в способах скрининга иммуногенных пептидов, небольших молекул, других анти- СЭ38 антител (например, с помощью конкурентного анализа) и т. п. и/или в способах диагностики и в композициях (например, иммуноанадитический чип, включающий набор таких антител, при необходимости в связи с другими антителами, можно сделать с помощью стандартных техник). Как только начальные сегменты Уь и УН человека отобраны, можно проводить эксперименты смесь и соответствия, в которых разные пары исходно выбранных Уъ и УН сегментов подвергают скринингу на связывание СЭ38-содержащих пептидов, чтобы отобрать нужные комбинации Уь/УН пар. Например, реактивность пептидов можно определять с помощью ЕМЗА и других подходящих способов анализа эпитопа (см., например, тк!апсс 8со!!, 1.К. апб 8тйй, 6.Р. 8сюпсс 249, 386-390 (1990), С\\и1а с! а1., РНА8 И8А 87, 6378-6382 (1990), Ес1ю1 с! а1., I. Мо1. Вю1. 222, 301-310 (1991) и КитаЬага с! а1., Наиис Вю!ссйпо1о§у 15, 74-78 (1997) для обсуждения таких техник и принципов). Антитела можно отбирать по их сродству к антигену и/или кинетикам диссоциации их комплекса с антигеном (см., например, На\\'ктк с! а1., I. Мо1. Вю1. 226, 889-896 (1992)).
- 52 015584
Чтобы еще улучшить качество и/или разнообразие анти-СБ38 антител, Уь и νΗ сегменты У|./Уц пар(ы) можно подвергать случайным мутациям, например, внутри СБР3 района νΗ и/или У|, в процессе, аналогичном процессу соматических мутаций ίη νΐνο, ответственному за созревание сродства антител при развитии природного иммунного ответа. Такое созревание сродства ίη νίΙΐΌ можно получить посредством амплификации районов νΗ и Уъ с применением праймеров, комплементарных νΗ СБР3 или Уъ СБР3 соответственно, причем праймеры обычно обогащены произвольной смесью четырех нуклеотидных оснований по определенным положениям, так что получающиеся продукты ПЦР кодируют νΗ и Уь сегменты, в которых случайные мутации введены в νΗ и/или У|, СБР3 районы. Такие случайным образом мутированные νΗ и У|, сегменты можно повторно подвергнуть скринингу на связывание СБ38содержащих пептидов.
После скрининга нуклеиновые кислоты, кодирующие выбранное антитело, можно выделить из смеси дисплея (например, из фагового генома) и субклонировать в подходящий вектор с помощью стандартных техник рекомбинантных ДНК. Если требуется, с такими кодирующими антитело нуклеиновыми кислотами можно работать далее, чтобы создать другую форму антитела или СБ38ВР. Для экспрессии рекомбинантного антитела, изолированного с помощью скрининга из комбинаторной библиотеки, обычно нуклеиновую кислоту, включающую последовательность, кодирующую антитело, клонируют в рекомбинантный экспрессирующий вектор и вводят в подходящие клетки хозяина (клетки млекопитающих, клетки дрожжей и т.д.) в условиях, нужных для экспрессии нуклеиновой кислоты и продукции антитела.
Пептиды антитела с высоким сродством, например одноцепочечные фрагменты антитела человека Εν (κοΕν) и ЕаЬ, также можно изолировать из таких библиотек с помощью техник намывки/лотка, в которых нужный антиген иммобилизован на твердой поверхности, такой как пластины микрофильтра или бусины (см., например, ВагЬак апб Вийоп, Тгепбк. Вю!есйпо1. 14, 230-234 (1996) и Ащате с1 а1., Ηιιιη. ЛпбЬоб1С5 8, 155-68 (1997). Фаговый дисплей больших простых библиотек также делает возможным изоляцию антител человека непосредственно без иммунизации (см., например, бе Шипб е1 а1., Т Вю1. СНет. 274(26), 18218-18230 (1999)).
В одном воплощении настоящее изобретение представляет вариант анти-СБ38 антител. Вариант анти-СБ38 антитела является антителом, которое отличается от родительского антитела (обычно полученного посредством иммунизации) изменением одного или более нужного аминокислотного остатка, которым является замещение, делеция, вставка или добавление терминальных последовательностей в участках СБР или других νΗ и/или У|, последовательностей (предоставленных так, чтобы значительная часть эпитопсвязывающих характеристик родительского антитела сохранялась, если не улучшалась, посредством таких изменений).
Вариации вариантов антитела можно сделать в каждом из каркасных районов, константном домене и/или вариабельных районах (или одном или более СБР) у одного варианта антитела. Альтернативно, вариации можно делать только в одном из каркасных районов, вариабельных районов (или единственном СБР) или в константном домене антитела. Технику мутагенеза путем аланинового сканирования, как описано в Сипшпдйат апб Ае1к, 8с1епсе 244, 1081-1085 (1989), можно применять для идентификации остатков, подходящих для замещения или делеции при получении нужных вариантов СБ38ВР, включающих вариант Уъ, νΗ или отдельных СБР последовательностей, хотя также можно применять другие подходящие техники мутагенеза. Множественные замещения аминокислот также можно проводить и тестировать с помощью известных способов мутагенеза и скрининга, например, как раскрытые в Ре1бйааг-018оп апб 8аиег, 8с1епсе 241, 53-57 (1988) или Во\\'1е апб 8аиег, РNΑ8 И8А 86, 2152-2156 (1989).
Так, например, у варианта антитела один или более аминокислотный остаток можно ввести или вставить либо присоединить к одному или более гипервариабельному району родительского антитела, например одному или более СБР. Вариант анти-СБ38 антитела может включать любое число вставленных аминокислотных остатков, предоставленных опять так, чтобы, по меньшей мере, значительная часть эпитопсвязывающих характеристик родительского антитела сохранилась. Вариант анти-СБ38 антитела согласно настоящему изобретению может, например, включать от приблизительно 1-30 вставленных аминокислотных остатков, например, от приблизительно 1-10, например, от приблизительно 2-10, например, от приблизительно 2-5, например, от приблизительно 1-5 вставленных аминокислотных остатков. Сходным образом вариант анти-СБ38 антитела согласно настоящему изобретению может, например, включать от приблизительно 1-30 делетированных аминокислотных остатков, например, от приблизительно 1-10, например, от приблизительно 2-10, например, от приблизительно 2-5, например, от приблизительно 1-5 делетированных аминокислотных остатков. Сходным образом вариант анти-СБ38 антитела согласно настоящему изобретению может, например, включать от приблизительно 1-30 замещенных аминокислотных остатков, например, от приблизительно 1-10, например, от приблизительно 2-10, например, от приблизительно 2-5, например, от приблизительно 1-5 замещенных аминокислотных остатков. Сходным образом вариант анти-СБ38 антитела согласно настоящему изобретению может, например, включать от приблизительно 1-30 добавлений аминокислотных остатков терминальной последовательности, например, от приблизительно 1-10, например, от приблизительно 2-10, например, от приблизительно 2-5, например, от приблизительно 1-5 добавлений аминокислотных остатков терминальной по
- 53 015584 следовательности. Вариант антитела согласно настоящему изобретению может также включать комбинацию двух или более таких вставок, делеций и добавлений аминокислотных остатков терминальной последовательности, предоставленных так, что вариант обладает, по меньшей мере, значительной частью сродства, специфичности и/или избирательности родительских антител по отношению к одному или более СО38 эпитопу.
Соображения при выборе вариантов антитела (например, сохранение функциональных характеристик аминокислотных остатков, сохранение характеристик гидропатичности аминокислотных остатков и/или сохранение размера/веса аминокислотных остатков) описаны здесь в других местах. Обычно изменения аминокислотной последовательности, например вариации консервативных замещений, по возможности, не должны значительно менять структурные характеристики родительской последовательности (например, замена аминокислоты не должна приводить к нарушению вторичной структуры, которая характеризует функцию родительской последовательности). Примеры известных в данной области вторичных и третичных структур полипептида описаны, например, в Ρι^ΐ^ί, 81гис1игев апй Мо1еси1аг Ρπΐ'ΐάρΒβ (Сге18й1оп, Ей., \У.н. Ргеетап апй Сотрапу, №\ν Уогк (1984)), йИгойисПоп Ιο ΡιόΝΕι 81гис1иге (С. Βι-апйеп апй 1. Тоохе, ейв., 6аг1апй Ρώ^Εί^, №\ν Уогк, КУ. (1991)) и ТйопИоп е1 а!., №1иге 354, 105 (1991). Дополнительные принципы, относящиеся к созданию и конструкции вариантов пептидов, обсуждаются, например, в СоШпе! е! а1., 1. Βίο1. Сйет. 2Ζ5(23), 17428-33 (2000).
Варианты аминокислотной последовательности антитела можно получить с помощью введения подходящих изменений нуклеотидов в кодирующую антитело нуклеиновую кислоту (например, с помощью направленного мутагенеза) или посредством химического синтеза пептида. Такие варианты включают, например, делеции из и/или вставки в и/или замещения и/или добавления терминальных последовательностей остатков в аминокислотных последовательностях антител приведенных здесь примеров. Можно проводить любую комбинацию делеций, вставок и замещений, чтобы получить нужный вариант, предоставленный так, что вариант обладает, по меньшей мере, значительной частью эпитопсвязывающих характеристик родительского антитела. Изменения аминокислотной последовательности по отношению к родительскому антителу могут также менять посттрансляционный процессинг вариантов антитела по сравнению с родительским антителом, например, посредством изменения числа или положения участков гликозилирования.
Варианты антител согласно настоящему изобретению могут включать изменения в гипервариабельном районе, например в районах СОВ. Примеры С^38ΒΡ, включающие такие СОВ варианты, описаны здесь в другом месте и, как описано выше, такие ί.Ό38ΒΡ могут быть антителами.
Варианты антител согласно настоящему изобретению могут включать изменения каркасных районов (ЕВ), которые находятся вне гипервариабельных районов, например в Рс районе, где изменения могут быть связаны с благоприятными свойствами, например изменением функциональных и фармакокинетических свойств антител. Например, замещение или другая модификация (вставка, делеция, добавления терминальной последовательности или их комбинация) в каркасном районе или константном домене могут быть связаны с увеличением времени полужизни варианта антитела по сравнению с родительским антителом, или могут быть сделаны для изменения иммуногенности варианта антитела по сравнению с родительским антителом, для предоставления участка для ковалентного или нековалентного связывания другой молекулы, или для изменения такого свойства, как фиксация комплемента, например, приводя к уменьшению или увеличению связывания С.'1с.| и СЭС.' или РсуВ и зависящей от антитела клеточной цитотоксичности (АЭСС). Замещения могут быть сделаны, например, по одному или более аминокислотному остатку 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320 и 322 константного района тяжелой цепи, таким образом обусловливая изменение эффекторной функции при сохранении связывания с антигеном по сравнению с немодифицированным антителом, И8 5624821 и И8 5648260. Далее можно сослаться на \У0 00/42072, раскрывающий антитела с измененными Рс районами, что приводит к увеличению АЭСС, и \У0 94/29351, раскрывающее антитела с мутациями в ^концевом районе домена Сн2, которые изменяют способность антител связываться с РсВI и поэтому уменьшают способность антител связываться с С1ц, что, в свою очередь, приводит к уменьшению способности антител фиксировать комплемент. Далее, 81ие1йв е! а1. 1. Βίο1. Сйет. 276, 6591-6604 (2001) показывают комбинированные варианты с улучшенным связыванием РсуВШ, например Т256А/8298А, 8298А/Е333А и 8298А/Е333А/К334А.
Время полужизни антител ш νΐνο также можно улучшить посредством модификации эпитопа спасательного рецептора константного района иммуноглобулина или иммуноглобулин-подобного константного домена, так что молекула не включает интактный Сн2 домен или интактный Ι§ Рс район, см. и8 6121022 и и8 6194551. Время полужизни ш νΐνο можно еще увеличить, проводя мутации Рс района, например, посредством замещения треонином лейцина в положении 252, треонином серина в положении 254 и треонином фенилаланина в положении 256, см. И8 6277375.
В одном воплощении настоящее изобретение представляет варианты анти-СО38 антител, где потенциальные эпитопы Т-клеток у антитела уменьшены или удалены с помощью рационального конструирования. Так, например, в одном воплощении настоящее изобретение представляет деиммунизированное анти-С.'О38 антитело, у которого потенциальные эпитопы Т-клеток удалены. Создание и конструкцию деиммунизированных анти-СО38 антител можно осуществить с помощью любой подходящей
- 54 015584 техники (см., например, \У0 9852976 относительно способов получения деиммунизированных антител). Ожидается, что иммуногенность у человека устраняется или существенно уменьшается, когда такие СИ38ВР (например, вариант анти-СИ38 антитела) назначают согласно настоящему изобретению.
Другие мутации каркасных районов могут включать изменения последовательности, которые могут уменьшать подверженность протеолизу, уменьшать подверженность окислению и/или придавать или модифицировать другие физико-химические или функциональные свойства данного варианта антитела.
Вариации аминокислотной последовательности в каркасных районах могут также приводить к измененному профилю гликозилирования у варианта антитела относительно родительского антитела. Под изменением подразумевается устранение одного или более углеводородного звена, обнаруживаемого у родительского антитела, и/или добавление одного или более участка гликозилирования, которые отсутствовали у родительского антитела. Гликозилирование антител обычно является либо N опосредованным, либо 0-опосредованным. ^опосредованное относится к присоединению углеводородного звена к боковой цепи аспарагинового остатка. Трипептидные последовательности аспарагин-Хсерин и аспарагин-Х-треонин, где X является любой аминокислотой, кроме пролина, являются распространенными последовательностями узнавания для ферментативного присоединения углеводородного звена к боковой цепи аспарагина. Так, присутствие у полипептида любой из этих трипептидных последовательностей может создать потенциальный участок гликозилирования. О-опосредованное гликозилирование относится к присоединению таких сахаров, как №ацетилгалактозамин, галактоза или ксилоза к гидрокси-аминокислоте, чаще всего к серину или треонину, хотя 5-гидроксипролин или 5-гидроксилизин также могут применяться. Добавление участков гликозилирования можно легко произвести посредством изменения аминокислотной последовательности так, что она содержит одну или более вышеописанную трипептидную последовательность (для N-опосредованных участков гликозилирования). Изменение можно также сделать посредством добавления и/или замещения одним или более остатком серина или треонина последовательности исходного антитела (для О-опосредованных участков гликозилирования).
Антитела можно также экспрессировать в трансфектоме, которая не добавляет единицу фукозы, обычно присоединенную к углеводороду, соединенному с аспарагином в положении 297 Рс, для того чтобы увеличить сродство Рс к РсуЯШ, что, в свою очередь, приведет к увеличению ЛИСС антител в присутствии NΚ клеток, см. 81не1й с1 а1., 1. Вю1. СНет. 277, 26733 (2002). Другие способы модификации гликозилирования, сфокусированные на фукозилировании, описаны в XV0 00/61739 ίο Куо^а. Далее, можно проводить модификацию галактозилирования, чтобы модифицировать СИС. Далее можно сослаться на ν0 99/54342 и Итапа с1 а1., №11. Вю1сс1то1. 17, 176 (1999), раскрывающие линию клеток СНО, созданную для экспрессии Θηΐγ, что приводит к экспрессии моноклональных антител с измененными гликоформами и улучшенной активностью АИСС.
Другие потенциально пригодные подходы к получению новых анти-СИ38 антител включают мутагенез прогулка по СИЯ (ета1кшд), перетасовку (зкиГГНпд) цепи антитела, экономный мутагенез (рагатопюиз тн1адспс518) (Ва11п1 апб Ьатск, Сспс 137, 109-118 (1993)) и другие техники созревания сродства (см., например, νυ с1 а1., РХА8 И8А 95, 6037-42 (1998)). Процедуры клонирования набора (Верейоне) можно применять для получения вариантов антител (см., например, ν0 96/33279).
Имеется большое число техник, известных для получения СИЯ вариантов, любую подходящую технику или их комбинацию можно применять в контексте настоящего изобретения для получения СИЯ вариантов участков СИЯ антител примеров. Примеры таких техник включают удаление несущественных остатков, как описано в 81ийшска с1 а1., Рго1с1п Епщпееппд 7, 805-814 (1994) (см. также 8ойсг11пй с1 а1., [ттипо1сс11по1оду. 4(3-4), 279-85 (1999)), перемещающийся мутагенез СИЯ и другие техники искусственного созревания сродства (см., например, Уапд с1 а1., 1онгпа1 оГ Мо1еси1аг Вю1оду 254(3), 392-403 (1995)), техники смешивания (зкиГГНпд) СИЯ, где обычно амплифицируют СИЯ с набором разнообразных генов матриц, при необходимости включающих синтетические олигонуклеотиды, константные районы Уъ, Ун и/или СИЯ амплифицируются и различные фрагменты смешиваются (в виде одноцепочечных или двухцепочечных фрагментов) и объединяются с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) с получением набора генов продуктов, кодирующих фрагменты антител, несущие перемешанные СИЯ, вставленные в заданный каркас, которые амплифицируют с применением внешних праймеров, прилегающих к участкам вне внесенных участков рестрикции для обеспечения продукции полноразмерных продуктов, которые вставляют в выбранный вектор и применяют для экспрессии белков, содержащих варианты СИЯ. Нужные структуры можно определить посредством наложения вариант/подражающих структур и структур родительских последовательностей, например, посредством сравнения структур, полученных с помощью ЯМР. Полезные способы рационального конструирования вариантов СИЯ последовательностей описаны, например, в ν0 91/09967 и ν0 93/16184. Дополнительные примеры таких способов предоставлены здесь в других местах.
Настоящее изобретение также представляет фрагменты антител (включая варианты антител) согласно настоящему изобретению, где фрагменты обладают способностью связываться с СИ38 (СИ38связывающие фрагменты). СИ38ВР таким образом включают подобные антителу молекулы, которые включают менее чем полную тетрамерную структуру, связанную с антителами, встречающимися в природе. Фрагмент антитела может быть любым пептидом, который включает часть или полноразмерное
- 55 015584 антитело, в основном антигенсвязывающий или вариабельный район его (это включает, например, фрагменты гуманизированных антител, включающие СОК антитела настоящего изобретения, их варианты или другие СОК, которые позволяют фрагменту антигена конкурировать с антителом настоящего изобретения за связывание СЭ38). В одном воплощении фрагмент относится к пептиду, который состоит в основном только из части молекулы антитела. В одном воплощении настоящее изобретение представляет фрагмент антитела, включающий по меньшей мере часть вариабельного домена тяжелой цепи, включающего один или более Ун СОК антитела настоящего изобретения и при необходимости также вариабельный домен легкой цепи, включающий один или более Уь СОК антитела настоящего изобретения, где вариабельный домен тяжелой цепи и при необходимости вариабельный район легкой цепи при необходимости является (являются) соединенным с дополнительным звеном, например константным доменом иммуноглобулина. Последовательности константного района можно добавить к последовательностям тяжелой цепи и/или легкой цепи с образованием видов с частичной длиной тяжелой и/или легкой цепи(ей). Константные районы или их части любого изотипа антитела можно применять для этой цели, включая константные районы ^С, ^М, ^А, [дР и Ι§Ε.
Примеры СО38-связывающих фрагментов антител включают ЕаЬ, ЕаЬ', Е(аЬ')2 и Εν фрагменты. Фрагмент антитела в контексте настоящего изобретения может также включать пептид, включающий СОК и т.п. В одном воплощении настоящее изобретение представляет фрагмент антитела, включающий первую полипептидную цепь, которая включает любой из СОК тяжелой цепи, описанный здесь, и вторую полипептидную цепь, которая включает любой из СОК легкой цепи, описанный здесь, причем две полипептидные цепи ковалентно связаны посредством одной или более межцепочечных дисульфидных связей. В одном воплощении настоящее изобретение представляет двухцепочечный фрагмент антитела, обладающий такими свойствами, где фрагмент антитела выбирают из фрагментов ЕаЬ, ЕаЬ', ЕаЬ'-8Н, Εν и/или Е(аЬ')2.
Антитела можно фрагментировать с применением общепринятых техник и фрагменты подвергать скринингу на применимость таким же способом, как описано выше для целых антител. Например, фрагменты Е(аЬ')2 можно получать посредством обработки антитела пепсином. Получившийся фрагмент антитела можно обрабатывать с восстановлением дисульфидных связей для получения фрагментов ЕаЬ'. ЕаЬ фрагменты можно получать посредством обработки ^С антитела папаином; ЕаЬ' фрагменты можно получать с помощью переваривания пепсином ^С антитела. ЕаЬ' фрагмент можно также получать посредством связывания ЕаЬ', описанного ниже, через тиоэфирную связь или дисульфидную связь. ЕаЬ' фрагмент является фрагментом антитела, полученным посредством разрезания дисульфидной связи района связки (Ыпде) в Е(аЬ')2. ЕаЬ' фрагмент можно также получить посредством обработки Е(аЬ')2 фрагмента восстанавливающим агентом, например дитиотрейтолом. Пептиды фрагмента антитела можно также получить с помощью экспрессии нуклеиновых кислот, кодирующих эти пептиды в рекомбинантных клетках (см., например, Еуапк е! а1., I. Iттиηο1. Ме111. 184, 123-38 (1995)). Например, химерный ген, кодирующий часть Е(аЬ')2 фрагмента, может включать последовательности ДНК, кодирующие СН1 домен и район связки тяжелой цепи с последующим стоп-кодоном с получением усеченной молекулы фрагмента антитела.
СЭ38ВР также включают одновалентные антитела и одноцепочечные антитела. Одноцепочечные антитела являются пептидами, в которых Εν районы тяжелой и легкой цепи связаны. В одном воплощении настоящее изобретение представляет одноцепочечный Εν (ксЕу), где тяжелая и легкая цепи у Εν анти-СО38 антитела по настоящему изобретению соединены гибким пептидным линкером (обычно из приблизительно 10, 12, 15 или более аминокислотных остатков) в единственной цепи пептида. Способы получения таких антител описаны, например, в И8 4946778, Р1искШип ш Т1е Р1агтасо1оду ок Мопос1опа1 АпйЬоФеу νο1. 113, КокепЬигд апй Мооге ейк. Бр^де^ег^, №\ν Уогк, р. 269-315 (1994), Вий е! а1., 8аепсе 242, 423-426 (1988), Нийоп е! а1., Р^8 И8А 85, 5879-5883 (1988) и МсСайейу е! а1., №Фге 348, 552-554 (1990). Одноцепочечное антитело может быть одновалентным, если только один Ун и νι, район применяются, двухвалентным, если применяются два Ун и Уъ района, или поливалентным, если применяется более двух Ун и Уъ районов.
В одном воплощении настоящего изобретения СЭ38ВР можно дериватизировать или связать с другой функциональной молекулой, например другим пептидом или белком (например, ЕаЬ' фрагментом) для получения биспецифичной или мультиспецифичной молекулы, которая связывается с множественными участками связывания эпитопов мишени. Например, антитело настоящего изобретения может быть функционально связано (например, с помощью химического сопряжения, генетического соединения, нековалентной связи или т. п.) с одной или более связывающими молекулами, например антителом, пептидом или связывающим миметиком. В одном воплощении СЭ38ВР является антителом настоящего изобретения.
Соответственно настоящее изобретение представляет биспецифичные и мультиспецифичные молекулы, включающие по меньшей мере одну первую специфичность связывания с СЭ38 и вторую специфичность связывания со вторым эпитопом мишени. В одном воплощении настоящего изобретения вторым эпитопом мишени является Ес рецептор, например ЕсуК1 рецептор человека (СО64), или Еса рецептор человека (СО89), или рецептор Т-клеток, например СЭ3. В одном воплощении настоящее изобрете
- 56 015584 ние представляет биспецифичные и мультиспецифичные молекулы, способные связываться как с РсуЯ, РсаЯ, так и с РсеЯ экспрессирующими эффекторными клетками (например, моноцитами, макрофагами или полиморфоядерными клетками (РМ№)) и клетками мишени, экспрессирующими СЭ38. Эти биспецифичные и мультиспецифичные молекулы нацеливают СВ38-экспрессирующие клетки на эффекторные клетки и приводят в действие активности эффекторных клеток, опосредованные Рс рецептором, например фагоцитоз СЭ38-экспрессирующих клеток, зависимую от антител клеточную цитотоксичность (АОСС), высвобождение цитокинов или генерацию аниона супероксида.
Биспецифичные и мультиспецифичные молекулы согласно настоящему изобретению могут далее включать третью специфичность связывания в дополнение к специфичности анти-Рс связывания и специфичности анти-СЭ38 связывания. В одном воплощении третья специфичность связывания является частью против фактора усиления (ЕР), например молекулой, которая связывается с белком поверхности, вовлеченным в цитотоксическую активность, и таким образом увеличивает иммунный ответ против клеток мишени. Часть против фактора усиления может быть антителом, функциональным фрагментом антитела или лигандом, который связывается с данной молекулой, например антигеном или рецептором, и таким образом приводит к усилению эффекта связывания детерминант для Рс фактора или антигена клетки мишени. Часть против фактора усиления может связываться с Рс рецептором или антигеном клетки мишени. Альтернативно, часть против фактора усиления может связываться с единицей, отличной от единицы, с которой связываются первая и вторая специфичности. Например, часть против фактора усиления может связывать цитотоксическую Т-клетку (например, через СЭ2, СЭ3, СЭ8, СЭ28, СЭ4, СЭ40, ГСАМ-1 или другие иммунные клетки, что приводит к увеличенному иммунному ответу против клетки мишени).
В одном воплощении биспецифичные и мультиспецифичные молекулы по настоящему изобретению включают в качестве специфичности связывания по меньшей мере еще одно антитело, включая, например, РаЬ, РаЬ', Р(аЬ')2, Ρν или 5сΡν. Далее, антитело может также быть димером легких цепей или тяжелых цепей, или любым наименьшим их фрагментом, например Ρν или одноцепочечной конструкцией, как описано в Ьабпег е! а1., в И8 4946778. Антитело также может быть составным белком со связывающим доменом иммуноглобулина, как описано в И8 2003/0118592 и И8 2003/0133939.
В одном воплощении специфичность связывания для Рс рецептора предоставлена моноклональным антителом человека, связывание которого не блокируется иммуноглобулином С человека (Ι§6). Как применяется здесь, термин 'ЧдС рецептор относится к любому из восьми генов у-цепи, расположенных на хромосоме 1. Эти гены кодируют в общей сложности двенадцать трансмембранных или растворимых изоформ рецептора, которые объединены в три класса Рс* рецепторов: ЯБсуЯI (СО64), РсуЯП (СЭ32) и РсуЯШ (СЭ16). В одном воплощении Рсу рецептор является ЯРсуЯ! человека с высоким сродством. Получение и описание таких моноклональных антител приведены в Рапдег е! а1., в XV0 88/00052 и И8 4954617. Такие антитела связываются с эпитопом ЯРсуК!, РсуЯП или РсуЯШ на участке, который отличается от Рсу связывающего участка рецептора и, таким образом, их связывание не блокируется в значительной степени физиологическими уровнями ЦС. Специфические анти-ЯΕсуЯI антитела, применяемые в настоящем изобретении, являются тАЬ 22, тАЬ 32, тАЬ 44, тАЬ 62 и тАЬ 197. В других воплощениях анти-ЯРсуЯ[ рецепторное антитело является гуманизированной формой тАЬ 22 (Η22). Продукция и характеристика антитела Н22 описаны в Сп-Шапо, Я.Р. е! а1., 1. Iттипо1. 155(10), 4996-5002 (1995) и ν0 94/10332. Клеточная линия, продуцирующая антитело Н22, положена на хранение в Коллекцию культур американского типа (Атепсап Туре Си1!иге Со11есйоп) 4 ноября 1992 г. под названием 11.-^022(4.1 и номером №. СЯЬ 11177.
В одном воплощении специфичность связывания Рс рецептора предоставлена антителом, которое связывает ΙμΛ рецептор человека, например Рса рецептор (Рсо! (СЭ89)), связывание которого в одном воплощении не блокируется иммуноглобулином А человека (ЦА). Термин ЦА рецептор включает продукт одного α-гена (РсаЯ^, расположенного на хромосоме 19. Известно, что этот ген кодирует несколько трансмембранных изоформ с альтернативным сплайсингом от 55 до 110 кДа. ΡсαЯI (СЭ89) экспрессируется конститутивно у моноцитов/макрофагов, эозинофильных и нейтрофильных гранулоцитов, но не в неэффекторной популяции клеток. ΡсαЯI обладает средним сродством как к ЦА1, так и к ЦА2, которое возрастает под действием цитокинов, например С-С8Р или СМ-С8Р (Мойоп, Η.ί.’. е! а1., Сгйюа1 Яеу1е^5 1п Иптипокду 16, 423-440 (1996)). Описаны четыре РсаЯБспецифических моноклональных антитела, идентифицированные как А3, А59, А62 и А77, которые связывают РсаЯ! вне домена связывания ЦА лиганда (Моп!епо, Я.С. е! а1., 1. Iттиπо1. 148, 1764 (1992)).
РсаЯ^ ЯРсуЯ^ ЯРсуЯЛ и ЯРсуЯШ, особенно ЯРсуЯЛ и ЯРсуЯШ, являются примерами запускающих (триггерных) рецепторов для применения в настоящем изобретении, поскольку они (1) первично экспрессируются на иммунных эффекторных клетках, например моноцитах, РМК клетках, макрофагах и древовидных клетках; (2) экспрессируются на высоких уровнях (например, 5000-100000 на клетку); (3) являются медиаторами цитотоксических активностей (например, АОСС, фагоцитоза) и (4) опосредуют усиленную презентацию антигенов, включая собственный антиген нацеливания на них.
- 57 015584
В одном воплощении СЭ38ВР настоящего изобретения является мультиспецифичным анти-СЭ38 антителом или подобной антителу молекулой, частным примером которого является биспецифичное антитело, включающее по меньшей мере одну пару УН последовательности и Уъ последовательности цепей, специфичных для одного эпитопа, включенного, по меньшей мере, отчасти в СИ38, и по меньшей мере одну пару УН последовательности и Уъ последовательности цепей, специфичных для второго эпитопа. УН и Уъ последовательности биспецифичного антитела могут включать полные УН и Уъ последовательности, соответствующие районам УН и Уъ анти-СО38, варианты УН и/или Уъ последовательностей или необходимые части УН и/или Уъ районов, например, нужную комбинацию СОК последовательностей и других последовательностей, достаточных для предоставления связывания с нужными эпитопами.
Примеры молекул биспецифичного антитела включают (1) два антитела, одно со специфичностью к СЭ38 и другое ко второй мишени, которые связаны вместе, (2) одиночное антитело, у которого одна цепь специфична к СЭ38 и вторая цепь специфична ко второй молекуле и (3) одноцепочечное антитело, обладающее специфичностью к СЭ38 и ко второй молекуле. Обычно вторая мишень/вторая молекула является молекулой, отличной от СЭ38. В одном воплощении вторая молекула является раковым антигеном/связанным с опухолью антигеном, таким как карциноэмбриональный антиген (СЕА), антиген, специфичный для простаты (Р8А), КАСЕ (почечный антиген), α-фетопротеин, САМЕЬ (СТЬузнаваемый антиген меланомы), СТ антигены (например, МАСЕ-В5, -В6, -С2, -С3 и Ό; Маде-12; СТ10; ΝΥ-ЕЗО-Е 88Х-2, САСЕ, ВАСЕ, МАСЕ и 8АСЕ), мышиные антигены (например, МИС1, муцин-СА125 и т.д.), ганглиозидные антигены, тирозиназа, др75, С-тус, МагИ, Ме1апА, МИМ-1, МИМ-2, МИМ-3, НЬА-В7 и Ер-САМ. В одном воплощении вторая молекула является связанным с раком интегрином, например интегрином α5β3. В одном воплощении вторая молекула является ангиогенным фактором или другим связанным с раком фактором роста, например васкулярно-эндотелиальным фактором роста (УЕСЕ), фактором роста фибробластов (ЕСЕ), эпидермальным фактором роста (ЕСЕ), рецептором эпидермального фактора роста (ЕСЕК), ангиогенином и их рецепторами, в частности рецепторами, связанными с развитием рака (например, одним из НЕК1-НЕК4 рецепторов). Другие белки, связанные с развитием рака, обсуждаемые здесь, могут также быть подходящей второй молекулой. В одном воплощении вторая молекула является молекулой, экспрессируемой на поверхности клеток множественной миеломы, такая как СИ138.
В одном воплощении биспецифичное антитело настоящего изобретения является диателом.
Биспецифичные антитела также включают сшитые или гетероконъюгированные антитела. Например, одно из антител гетероконъюгата может быть сопряжено с авидином и другое - с биотином. Предполагается, что такие антитела, например, направляют клетки иммунной системы на нежелательные клетки (см., например, И8 4676980). Антитела гетероконъюгаты можно получать с применением любого общеизвестного способа сшивки. Подходящие агенты для сшивания пептидов и соответствующие техники хорошо известны в данной области и примеры таких агентов и техник раскрыты, например, в ИЗ 4676980.
Так, хотя обсуждение здесь может фокусироваться на антителах, следует понимать, что воплощения и свойства антител можно равным образом прилагать к фрагментам антител, например ЕаЬ фрагментам, ЕаЬ' фрагментам и ксЕν пептидам, антитело-подобным пептидам (пептидам, включающим СИК), бии мультиспецифичным антителам и другим СИ38ВР, если потребуется, предоставленным так, что СИ38ВР настоящего изобретения сохраняет по меньшей мере значительную часть антигенсвязывающих свойств соответствующего полного антитела. В некоторых случаях фрагменты антител могут обладать более низким сродством связывания антигена, но могут предлагать другие благоприятные свойства, которые могут возместить такую потерю сродства.
СИ38ВР настоящего изобретения и в особенности анти-СЭ38 антитела можно отбирать на основе того, могут ли они предоставить способность к фиксации комплемента или нет. Имеется большое число изотипов антител, которые способны к фиксации комплемента и СИС, включая, но не ограничиваясь этим, следующие: мышиный ^М, мышиный IдС2а, мышиный Ι^2Ε, мышиный Ι^3, ^М человека, ^С1 человека и ^С3 человека. Такие изотипы, которые не включают, не ограничиваясь этим, ^С2 человека и ^С4 человека. Определение изотипа и другие способы модификации фиксации комплемента и СЭС функциональные характеристики антител известны в данной области.
СИ38ВР настоящего изобретения также включают иммуноадгезины, которые являются молекулами, где один или более из СИК анти-СИ38 антитела ковалентно или нековалентно связан с молекулой. Иммуноадгезин может включать СИК в качестве части большей полипептидной цепи, может ковалентно связывать СИК с другой полипептидной цепью или может включать СИК нековалентно. СИК позволяют иммуноадгезину специфически связываться с СИ38.
Настоящее изобретение также представляет СИ38ВР составные белки. СИ38ВР составные белки могут включать любую подходящую аминокислотную последовательность или комбинацию последовательностей, которые являются специфичными и/или избирательными по меньшей мере для одного домена, который, по меньшей мере, отчасти включен в СИ38 (например, УН домен, Уъ домен анти-СЭ38 антитела или, в частности, их СИК) и по меньшей мере одну негомологичную и обычно неблизкую амино
- 58 015584 кислотную последовательность (обладающие, например, менее чем приблизительно 40%, менее чем приблизительно 35%, менее чем приблизительно 30%, менее чем приблизительно 25%, менее чем приблизительно 20% идентичности с последовательности аминокислот последовательности, специфичной/избирательной по СЭ38), что придает детектируемую биологическую функцию или характеристику составному белку, которую нельзя приписать только последовательности, специфичной/избирательной по ΟΩ38 (например, увеличенное время полужизни ш у1уо, флуоресценция, увеличенное нацеливание на определенный тип клеток и т.д.). Функциональные последовательности такого составного белка могут быть разделены гибким линкером(ами). Вторичная последовательность(и) может также быть произведена из цитотоксических или апоптических пептидов. Вторичные последовательности могут также придавать диагностические свойства. Примеры таких последовательностей включают таковые, произведенные из легко отслеживаемых ферментов, например пероксидазы хрена.
СЭ38ВР составные белки можно также характеризовать с помощью включения дополнительной эпитопной метки. Последовательность эпитопной метки является аминокислотной последовательностью, обладающей достаточным количеством остатков для предоставления эпитопа, против которого можно получить антитела, в контексте СЭ38ВР еще и достаточно короткая, так чтобы в основном не мешать активности (избирательности, специфичности, сродству и/или биологической активности) СЭ38ВР (по сравнению с родительским СЭ38ВР, лишенным эпитопной метки). Эпитоп хвостик, желательно, является достаточно уникальным, чтобы антитела к эпитопной метке не проявляли значительной перекрестной реактивности с другими эпитопами. Подходящие для эпитопной метки полипептиды обычно имеют по меньшей мере около шести аминокислотных остатков и обычно между приблизительно 8-50 аминокислотными остатками (например, приблизительно 9-30 остатков). Примеры эпитопной метки включают полипептидную метку НА вируса гриппа и его антитело 12СА5 (Е1е1й е! а1., Мо1. Се11. Вю1. 8, 2159-21б5 (1988)); с-тус таг и его антитела 8Е9, 3С7, бЕ10, С4, В7 и 9Е10 (Еуап е! а1., Мо1. Се11. Вю1. 5(12), 3б103б1б (1985)), таг гликопротеина Ό (§Ό) герпеса простого и его антитело (РаЬогвку е! а1., Рго!ет Епдтеегтд 3(б), 547-553 (1990)). В определенных воплощениях эпитопная метка является спасательным эпитопом связывания рецептора. Как применяется здесь, термин спасательный эпитоп связывания рецептора относится к эпитопу Ес района 1дС молекулы (например, 1дС1, 1дС2, 1дС3 или 1дС4), который отвечает за увеличение полужизни молекулы 1дС в сыворотке ш у1уо.
СО38ВР настоящего изобретения также включают производные СЭ38ВР. Производным является пептид, у которого один или более аминокислотный остаток пептида химически модифицирован (например, посредством алкилирования, ацилирования, образования сложного эфира, образования амида) или ковалентно связан с одним или более гетерологичным заместителем (например, липофильным заместителем группой полиэтиленгликоля (ПЭГ), пептидной боковой цепью, связанной с подходящим органическим звеном, линкером и т.д.). Пептид может также быть конъюгирован с терапевтическим звеном, например цитотоксином, химиотерапевтически лекарством, иммуносупрессантом или радиоизотопом (так называемый иммуноконъюгат). В основном СЭ38ВР, описанный здесь, можно модифицировать посредством включения любого подходящего числа таких модифицированных аминокислот и/или связей с такими конъюгированными заместителями. Пригодность в данном контексте в основном определяется способностью, по меньшей мере, по большей части сохранять ΟΩ38 избирательность и/или специфичность, присущие недериватизированному родительскому СЭ38ВР. Включение одной или более модифицированных аминокислот может давать преимущества, например, (а) увеличение полужизни пептида в сыворотке, (б) уменьшение антигенности полипептида или (в) увеличение способности полипептида к хранению. Аминокислоту(ы) модифицируют, например, во время трансляции или после трансляции в течение продукции рекомбинант (например, ^опосредованное гликозилирование по №Х-8/Т мотиву при экспрессии в клетках млекопитающих) или модифицируют синтетическими способами. Неограничивающие примеры модифицированных аминокислот включают гликозилированную аминокислоту, сульфатированную аминокислоту, пренилированную аминокислоту (например, фарнезилированную, геранилгеранилированную) аминокислоту, ацетилированную аминокислоту, ацилированную аминокислоту, ПЭГилированную аминокислоту, биотинилированную аминокислоту, карбоксилированную аминокислоту, фосфорилированную аминокислоту и т.п. Литература переполнена ссылками, достаточными для наставления специалиста в данной области при модификации аминокислот. Примеры протоколов находятся в \Уа1кег (1998), Рго!ет Рго!осо1в 0п Сй-Кот, Нитапа Ргевв, Тогоа!а, N1. Модифицированные аминокислоты можно выбирать из гликозилированной аминокислоты, ПЭГилированной аминокислоты, фарнезилированной, аминокислоты, ацетилированной аминокислоты, биотинилированной аминокислоты, аминокислоты, конъюгированной с липидной частью, и аминокислоты, конъюгированной с органическим дериватизующим агентом.
Дополнительно, антитела можно модифицировать химически посредством ковалентной конъюгации с полимером, чтобы, например, увеличить их циркуляторное время полужизни. Примеры полимеров и способов присоединения к ним проиллюстрированы, например, в И8 47бб10б, И8 4179337, И8 4495285 и И8 4б0954б. Дополнительные иллюстративные примеры включают полиоксиэтилированные полиолы и полиэтиленгликоль (ПЭГ) (например, ПЭГ с молекулярным весом между приблизительно 1000 и приблизительно 40000, например, между приблизительно 2000 и приблизительно 20000, например, между
- 59 015584 приблизительно 3000 и приблизительно 12000).
В одном воплощении настоящее изобретение представляет СБ38ВР, которое конъюгировано со второй молекулой, которая выбрана из радиоизотопа, фермента, субстрата фермента, кофактора, флуоресцентной метки, хемилюминесцентной метки, пептидного тага или магнитной частицы. В одном воплощении СБ38ВР может быть конъюгирован с одним или более фрагментом антитела, нуклеиновыми кислотами (олигоконъюгаты), нуклеазами, гормонами, иммуномодуляторами, хелаторами, соединениями бора, фотоактивными агентами, красителями и т.п. Эти и другие подходящие агенты можно соединять прямо или непрямо с СБ38ВР согласно настоящему изобретению. Одним примером непрямого соединения второго агента является соединение через звено разделителя. Такие разделители, в свою очередь, могут быть нерастворимыми или растворимыми (см., например, Б1епег е! а1., 8с1епсе 231, 148 (1986)) и могут выбираться, чтобы позволить высвобождение лекарства из СБ38ВР на участке мишени и/или при определенных условиях. Дополнительные примеры терапевтических агентов, которые могут быть соединены с СБ38ВР, включают лектины и флуоресцентные пептиды.
В одном воплощении предоставлены производные СБ38ВР, включающие одну или более аминокислоту, меченную радиоизотопом. Меченное радиоизотопом СБ38ВР можно применять как с диагностическими, так и с терапевтическими целями (конъюгация с радиоактивными молекулами является другим возможным свойством). Неограничивающие примеры меток для полипептидов включают, но не ограничиваются этим, 3Н, 14С, 15Н 358 , 90Υ, 99Тс, 125Ι, 131Ι и 186Ве. Способы получения радиоактивно меченых аминокислот и относящиеся к этому производные полипептидов известны в данной области (см., например, ЛнщНапк е! а1., ш Сапсег СЬешоЛетару апб ВюШегару 655-686 (2б ебШоп, СНаГпег апб Ьопдо, ебк., ЫрршсоИ Ка\'еп (1996)) и И8 4681581, И8 4735210, И8 5101827, И8 5102990 (И8 КЕ35500), И8 5648471 и и8 5697902. Например, радиоактивные изотопы могут быть присоединены способом с хлорамином Т.
Предпочтительными радиоизотопами для диагностики являются изотопы индия и для терапевтических приложений изотопы иттрия, которые являются цитотоксичными. Радиоизотопы, испускающие протон, в основном являются предпочтительными в диагностике (способы радиоиммуносцинтиографии (ΚΙ8)). У электронов Оже очень короткая длина пробега (5-10 нм) и они должны быть интернализованы, чтобы быть цитотоксичными (см., например, Абе1к!ет е! а1., №с1. Меб. Вю1. 14, 165-169 (1987)). Соответственно пептиды, конъюгированные с такими радиоизотопами, могут быть полезными для диагностических способов, но только интернализованные пептиды можно рассматривать для применения с радиоизотопами, испускающими электроны Оже, в целях терапии. Альфа-частицы должны испускаться близко к клетке (в пределах 3-4 диаметров клетки), чтобы быть эффективными в качестве терапевтических агентов (Упекепбогр е! а1., Кабю1шшипод1оЬи1т Легару, ш Ηί§1ι Боке Сапсег ТЬегару Атшйаде е! а1. (ебк) (^1Шашк & ХУПктк, ВаШшоте, Мб. 1992)). Предполагается, что излучатели как электронов Оже, так и альфа-частиц должны обладать высокой избирательностью, поскольку их излучение с коротким пробегом не будет облучать соседние нераковые клетки.
Радиоактивные металлы Чп и 90Υ являются соответственно чистым γ-излучателем и чистым βизлучателем. Иод-125, наиболее известный излучатель электронов Оже со временем полужизни около 60 дней, часто высвобождается иммуноконъюгатами ш νί\Ό (благодаря дегалогенизации). Наиболее часто применяемые альфа-излучатели для клинического применения, астат-211 и висмут-212 обладают сравнительно короткими временами полужизни (7,2 и 1,0 ч соответственно) и превращаются в радиоактивные изотопы, которые не могут удерживаться иммуноконъюгатом после первого альфа-излучения ХУПЬиг, АпйЬю!. Iшшипосоп^ид. ВабюрЬатш. 4, 5-97 (1991)). Для диагностических приложений можно применять СБ38ВР, меченный индием-111 или технецием-99ш. Оба эти изотопа испускают гамма-лучи с энергией в интервале, подходящем для получения имиджей (100-250 кЭв). Энергии ниже этого уровня обычно не являются достаточно проникающими, чтобы достигать внешних устройств для получения изображений. Энергии более высоких уровней трудно коллимировать и они дают изображения с низким разрешением. Короткоживущий 99Тс обычно ограничивает свое применение иммуноконъюгатами с быстрым поглощением опухолями.
В одном воплощении предоставлены первый и второй конъюгаты СБ38ВР с первым и вторым радиоизотопами. В другом воплощении предоставлен один СБ38ВР, конъюгированный с двумя радиоизотопами. Преимуществом применения двух отдельных радиоизотопов, например одного для получения изображения и другого для терапии, является то, что это облегчает амбулаторное лечение. Низкое количество радиоактивности, применяемое для диагностики, не представляет радиационной угрозы, тогда как радиация, излучаемая терапевтическим изотопом, таким как чистый β-излучатель, обычно по большей части поглощается в окружении клеток мишени.
Радиоизотопы могут быть присоединены к СБ38ВР прямо или непрямо. Радиоизотопы 125Ι, 131Ι, 99Тс, 186Ве и 188Ве могут быть, например, ковалентно связаны с белками (включая антитела) через функциональные группы аминокислот. Радиоактивный йод обычно связан через фенольную группу, находящуюся на тирозине. Есть множество методов для достижения этого: хроматин-Т (см., например, Сгееп\тооб е! а1., ВюсЬеш. I. 89, 114-123 (1963)) и йодоген (8а1асткк1 е! а1., Апа1. ВюсЬеш. ΗΖ, 136-146 (1981)). Изотопы Тс и Ке могут быть ковалентно связаны через сульфгидрильную группу цистеина (см., напри
- 60 015584 мер. 6πΓΓί11ΐ8 е! а1.. Сапсег Кек. 51. 4594-4602 (1991)). Однако такие композиции могут сравнительно лучше подходить для диагностических целей. поскольку организм часто может легко разбивать такие ковалентные связи. высвобождая радиоизотопы в циркуляторную систему.
СЭ38В можно также пометить ферментами. пригодными для детекции. например пероксидазой хрена. β-галактозидазой. люциферазой. щелочной фосфатазой. глюкозооксидазой и т.п. СЭ38ВР также можно пометить биотином и соответственно детектировать посредством непрямого измерения связывания авидина или стрептавидина. СЭ38ВР также можно пометить предопределенными полипептидными эпитопами. узнаваемыми вторичным репортером (например. последовательностью лейциновой застежки. участками связывания вторичных антител. доменами связывания металлов. эпитотами-тагами и т.д.). Дополнительные примеры ферментов кандидатов в конъюгаты включают малат-дегидрогеназу. нуклеазу стафилококка. дельта-У-стероид-изомеразу. алкогольдегидрогеназу дрожжей. α-глицерофосфатдегидрогеназу. триозофосфат-изомеразу. аспарагиназу. глюкозооксидазу. рибонуклеазу. уреазу. каталазу. гликозо-6-фосфат-дегидрогеназу. глюкоамилазу и ацетилхолинэстеразу.
Дополнительные примеры звеньев. которые могут быть метками. в основном включают. но не ограничиваются этим. спин-меченые молекулы и другие метки диагностического значения.
В одном воплощении настоящее изобретение представляет перекрестно сшитые производные СЭ38ВР. Например. такое производное СЭ38ВР можно получить посредством перекрестной сшивки двух или более антител. из которых по меньшей мере одно является специфичным/избирательным для СЭ38 (одного типа или разных типов. например. чтобы создать биспецифичные антитела). Подходящие перекрестно сшивающие агенты включают такие. которые являются гетеробифункциональными. обладая двумя четко различающимися реактивными группами. разделенными подходящим спейсером (например. м-малеимидобензоил-Ы-гидроксисукцинимидный эфир) или гомобифункциональными (например. дисукцинимидилсуберат). Такие сшивающие агенты можно купить у Р1егсе СКеш1са1 Сотрапу. КоскГогй. ΙΙΙ.
СЭ38ВР также можно конъюгировать с химической группой любого подходящего типа. например полиэтиленгиколем (ПЭГ). метильной или этильной группой или углеводородной группой. Эти и другие подходящие конъюгированные группы можно применять для улучшения биологических характеристик СЭ38ВР. например улучшения сывороточного времени полужизни. растворимости и/или связывания тканей.
Производные СЭ38ВР можно получать посредством химического присоединения радиоизотопа. белка или другого агента/звена/соединения к (а) Шконцевому участку или С-концевому участку СЭ38ВР или его субъединицы (например. тяжелой цепи анти-СЭ38ВР антитела. легкой цепи анти-СЭ38ВР антитела или его анти-СЭ38ВР специфичного/избирательного фрагмента). подходящей группе заместителя или боковой цепи или (б) цепи сахара в СЭ38ВР (например. см. ЛпЬЬойу Епщпееппд ЫапйЬоок. ейЬей Ьу 08311111 КапетДки. риЬЬкЬей Ьу СЬцш 8Ьокап (1994)). Производные также можно получать посредством присоединения по внутренним остаткам или сахарам. когда требуется.
СЭ38ВР также можно дериватизировать с помощью детектируемых агентов. например флуоресцентных соединений. включая флуоресцеин. флуоресцеинизотиоцианат. родамин. 5-диметиламин-1нафталинсульфонилхлорид. лантанидные фосфоры и т. п. Дополнительными примерами подходящих флуоресцентных меток являются 125Еи метка. изотиоцианатная метка. фикоэритриновая метка. фикоцианиновая метка. аллофикоцианиновая метка. о-фтальдегидная метка. флуорескаминовая метка и т. д. Примеры хемилюминесцентных меток включают люминальные метки. изолюминальные метки. метки с ароматическими эфирами акридиния. имидозольные метки. метки с солями акридиния. метки с эфирами оксалата. люцифериновые метки. люциферазные метки. эквориновые метки и т. д.
В одном воплощении производное СЭ38ВР включает конъюгированную нуклеиновую кислоту или связанную с нуклеиновой кислотой молекулу. В одном таком аспекте настоящего изобретения конъюгированная нуклеиновая кислота является цитотоксической рибонуклеазой. В одном воплощении настоящего изобретения конъюгированная нуклеиновая кислота является антисмысловой нуклеиновой кислотой (например. 8100Л10 нацеленная антисмысловая молекула. которая может быть независимым компонентом в составной композиции или комбинированном способе введения согласно настоящему изобретению. см.. например. Ζΐιιιιΐβ е! а1.. Г Вю1. СНет. 279(3). 2053-62 (2004)). В одном воплощении конъюгированная нуклеиновая кислота является ингибиторной РНК молекулой (например. 81РИК молекулой). В одном воплощении конъюгированная нуклеиновая кислота является иммуностимуляторной нуклеиновой кислотой (например. иммуностимуляторная молекула. содержащая ЦфГ-мотив молекула ДНК). В одном воплощении конъюгированная нуклеиновая кислота является экспрессирующей кассетой. кодирующей экспрессию гена супрессора опухоли. противораковую вакцину. противораковый цитокин или агент апоптоза. Такие производные могут также включать конъюгацию нуклеиновой кислоты. кодирующей экспрессию одного или более цитотоксических белков. таких как растительные или бактериальные токсины.
- 61 015584
В одном воплощении ΟΌ38ΒΡ конъюгирован с функциональной молекулой нуклеиновой кислоты. Функциональные нуклеиновые кислоты включают антисмысловые молекулы, взаимодействующие молекулы нуклеиновой кислоты (например, 51ΡΗΚ молекулы), аптамеры, рибозимы, триплексобразующие молекулы и внешние ведущие последовательности. Функциональные молекулы нуклеиновой кислоты могут действовать как эффекторы, ингибиторы, модуляторы и стимуляторы специфической активности, которой обладает молекула мишени, или функциональные молекулы нуклеиновой кислоты могут обладать бе ηονο активностью, независимой от любой другой молекулы. Представительные примеры способов и техник, имеющих целью создавать и применять антисмысловые молекулы, можно найти в следующем неограничивающем списке патентов: И8 5135917, И8 5294533, И8 5627158, И8 5641754, И8 5691317, И8 5780607, И8 5786138, И8 5849903, И8 5856103, И8 5919772, И8 5955590, И8 5990088, И8 5994320, И8 5998602, И8 6005095, И8 6007995, И8 6013522, И8 6017898, И8 6018042, И8 6025198, И8 6033910, И8 6040296, И8 6046004, И8 6046319 и И8 6057437.
В одном воплощении ΟΌ38ΒΡ конъюгирован с аптамером. Аптамеры являются молекулами, которые взаимодействуют с молекулой мишени, например, специфическим способом. Обычно аптамеры являются небольшими нуклеиновыми кислотами в интервале от 15-50 оснований длиной, которые скручены в определенные вторичные и третичные структуры, например стебли-петли или Г-квартеты. Аптамеры могут связывать маленькие молекулы, такие как АТФ (И8 5631146) и теофилин (И8 5580737), а также большие молекулы, как обратная транскриптаза (И8 5786462) и тромбин (И8 5543293). Представительные примеры того, как получать и применять аптамеры для связывания различных молекул мишени можно найти в списке следующих неограничивающих патентов: И8 5476766, И8 5503978, И8 5631146, И8 5731424, И8 5780228, И8 5792613, И8 5795721, И8 5846713, И8 5858660, И8 5861254, И8 5864026, И8 5869641, И8 5958691, И8 6001988, И8 6011020, И8 6013443, И8 6020130, И8 6028186, И8 6030776 и И8 6051698.
В одном воплощении настоящее изобретение представляет ΟΌ38ΒΡ, который конъюгирован с рибозимом. Рибозимы являются молекулами нуклеиновой кислоты, которые способны катализировать химические реакции, внутримолекулярные либо межмолекулярные. Рибозимы являются таким образом каталитическими нуклеиновыми кислотами. Имеется большое число разных типов рибозимов, которые катализируют реакции нуклеазного или нуклеополимеразного типа, которые основаны на рибозимах, обнаруженных в природных системах, например, в качестве (а) рибозимов с головкой молотка (описанных, например, в И8 5334711, И8 5436330, И8 5616466, И8 5633133, И8 5646020, И8 5652094, И8 5712384, И8 5770715, И8 5856463, И8 5861288, И8 5891683, И8 5891684, И8 5985621, И8 5989908, И8 5998193, И8 5998203, \\'0 9858058, \\'0 9858057 и \\'0 9718312), (б) шпилькообразных рибозимов (описанных, например, в И8 5631115, И8 5646031, И8 5683902, И8 5712384, И8 5856188, И8 5866701, И8 5869339 и И8 6022962) и (в) тетрагименовых рибозимов (описанных, например, в И8 5595873 и И8 5652107). Имеется также большое число рибозимов, которые не обнаруживаются в естественных системах, но которые созданы, чтобы катализировать специфические реакции бе ηονο (примеры которых описаны, например, в И8 5580967, И8 5688670, И8 5807718 и И8 5910408). Рибозимы обычно расщепляют субстраты РНК и ДНК и чаще расщепляют РНК. Рибозимы обычно расщепляют нуклеиновые кислоты посредством узнавания и связывания субстрата мишени и последующего расщепления. Это узнавание часто основано в основном на канонических или неканонических взаимодействиях пар нуклеотидов. Это свойство делает рибозимы особенно хорошими кандидатами для специфического расщепления мишеней нуклеиновых кислот потому, что узнавание субстрата мишени основано на последовательности субстрата мишени. Представительные примеры того, как получать и применять рибозимы для катализа разнообразия различных реакций, можно найти в следующем неограничивающем списке патентов США: И8 5646042, И8 5693535, И8 5731295, И8 5811300, И8 5837855, И8 5869253, И8 5877021, И8 5877022, И8 5972699, И8 5972704, И8 5989906 и И8 6017756.
В одном воплощении настоящее изобретение представляет ΟΌ38ΒΡ, который конъюгирован с нуклеиновой кислотой, образующей триплекс. Такие молекулы нуклеиновой кислоты могут взаимодействовать либо с двухцепочечной, либо с одноцепочечной нуклеиновой кислотой. Когда молекулы триплекса взаимодействуют с районом мишени, образуется структура, называемая триплексом, в которой три цепочки ДНК образуют комплекс, зависимый как от формирования пар оснований по Утсону-Крику, так и по Хугстину. Молекулы триплекса могут связывать районы мишени с высоким сродством и специфичностью. Представительные примеры того, как получать и применять образующие триплекс молекулы для связывания ряда различных молекул-мишеней можно найти в следующем неограничивающем списке патентов США: И8 5176996, И8 5645985, И8 5650316, И8 5683874, И8 5693773, И8 5834185, И8 5869246, И8 5874566 и И8 5962426.
В одном воплощении настоящее ΟΌ38ΒΡ конъюгировано с внешней ведущей последовательностью. Внешние ведущие последовательности (ЕС8б) являются молекулами, которые связывают молекулы нуклеиновой кислоты мишени с образованием комплекса, который узнается РНКазой Р, которая расщепляет молекулу мишени. ЕС8 можно конструировать так, чтобы специфически нацеливаться на выбранную молекулу РНК. РНКаза Р помогает при процессинге транспортных РНК (тРНК) в клетке. Бактериальная РНКаза Р может быть задействована для расщепления фактически любой последовательности
- 62 015584
РНК с помощью ЕС8, которая образует комплекс мишень РНК:ЕС8, имитирующий природный субстрат тРНК (см., например, XV0 92/03566 и Еогз!ег апб А11з1;ш 8аепсе 238, 407-409 (1990) для обсуждения). Представительные примеры того, как получать и применять ЕС8 молекулы для облегчения расщепления разнообразия различных молекул мишеней, предоставлены в следующем неограничивающем списке патентов: υδ 5168053, υδ 5624824, υδ 5683873, υδ 5728521, υδ 5869248 и υδ 5877162.
В одном воплощении СБ38ВР конъюгирован с взаимодействующей молекулой нуклеиновой кислоты, такой как з|РНК или другая молекула РНК (например, ингибиторная двухцепочечная (дц) молекула РНК из приблизительно 20-25 нуклеотидов), которая направлена на то, чтобы мешать действию продукта экспрессии гена мишени, например продукта экспрессии гена, вовлеченного в СБ38-опосредованное заболевание или состояние. Способы продукции и применения взаимодействующих молекул нуклеиновой кислоты предоставлены, например, в МзЫкига, Се11. 107(4), 415-8 (2001), Е_)озе е! а1., Вю!есбпо1 Аппи Веу. 7, 31-57 (2001), Напоп, Хпиге 418, 244-51 (2002), Вгап!1, ВюсЫт Вюрбуз Ас!а. 1575(1-3), 15-25 (2002), Тизсб1, СбетЬюсбет. 2(4), 239-45 (2001), Сар1еп, Ехрей 0рт Вю1 Тбег. 3(4), 575-86 (2003), Ьи е! а1., Сигг 0рт Мо1. Тбег. 5(3), 225-34 (2003), 8биеу е! а1., Бгад Э1зсо\ Тобау. 7(20), 1040-6 (2002), 8Ы, Тгепбз Сепе!. 19(1), 9-12 (2003), Коуаг е! а1., 8етт Сапсег Вю1. 13(4), 275-81 (2003), Ьаугеу е! а1., Сигг 0рт Бгад Б1зсоу Беуе1. 6(4), 561-9 (2003), С1е^еу, Соттип Б1з РиЬбс Неа1!б. 6(2), 162-3 (2003), БихЬигу е! а1., 1. 8игд. Вез. 117(2), 339-44 (2004), Сар1еп е! а1., Апп N Υ Асаб δα. 1002, 56-62 (2003), ΧΧΌ 01/75164, И8 6506559, И8 20040086884, υδ 20040077574, υδ 20040063654, υδ 20040033602, υδ 20030167490, υδ 20030157030, υδ 20030114409, υδ 20030108923, υδ 20040014113 и υδ 20020132788.
В одном воплощении СБ38ВР конъюгирован с доменом или молекулой пептида, нацеленным на опухоль. В одном воплощении СБ38ВР конъюгирован с последовательностью фактора V!, нацеленного на опухоль.
Любой известный в данной области способ для конъюгации СБ38ВР с конъюгированной молекулой можно применять, как, например, описанные выше, включая способы, описанные в Нип!ег е! а1., №1!иге. 144, 945 (1962), Бау|б е! а1., Вюсбеш1з!гу 13, 1014 (1974), Рат е! а1., I. Iттипо1. Ме!б. 40, 219 (1981) и Удо, 1. Шз!осбет. апб Су!осбет. 30, 407 (1982). Связывание/конъюгацию можно проводить любым подходящим способом. Например, ковадентная связь может принимать форму дисульфидной связи (если нужно и возможно, можно создать СБ38ВР, содержащий дополнительный кодон цистеина, который предпочтительно не мешает СБ3 8-связывающей активности молекулы. Молекула токсина, дериватизированная сульфгидрильной группой, реагирующей с цистеином СБ38ВР, может образовать иммуноконъюгат с СБ38ВР пептидом. Альтернативно, сульфгидрильную группу можно ввести непосредственно в СБ38ВР, применяя полипептидные техники в твердой фазе. Например, введение сульфгидрильных групп в пептиды описано в Шзкеу, Рер11без 3, 137 (1981). Введение сульфгидрильных групп в белки описано в Маазеп е! з1., Еиг. 1. ВюсНет. 134, 32 (1983). Как только нужная сульфгидрильная группа на месте, цитотоксин и СБ38ВР можно очистить, восстановить обе сульфгидрильные группы, смешать цитотоксин и лиганд (например, в соотношении приблизительно от 1:5 до 1:20) и оставить инкубироваться до завершения образования дисульфидной связи (в основном приблизительно 20-30 мин) при комнатной температуре. Смесь можно далее диализовать против фосфатного буфера с физиологическим раствором или хроматографировать на таком носителе, как сефадекс для удаления непрореагировавших молекул лиганда и токсина.
Многочисленные типы цитотоксических соединений можно присоединять к белкам с помощью применения реактивной группы цитотоксического соединения или с помощью применения сшивающего агента. Распространенной реактивной группой, которая образует стабильную ковалентную связь ΐπ угуо с амином, является изотиоцианат (Меапз е! а1., С6сшюз1 тобШса!юпз о£ рго1етз (Но1беп-Бау, δзπ Егапазсо 1971), р. 105-110). Эта группа предпочтительно реагирует с ε-аминогруппой лизина. Малеимид является широко применяемой реактивной группой для образования стабильной ш угуо ковалентной связи с сульфгидрильной группой цистеина (Л., Мебюбз Епхуто1. 91, 580-609 (1983)). Моноклональные антитела обычно неспособны образовывать ковалентные связи с ионами радиоактивных металлов, но они могут быть присоединены к антителу непрямо с помощью применения хелатирующих агентов, которые ковалентно связаны с антителами. Хелатирующие агенты могут быть присоединены через амины (Меагез е! а1., Апз1. Вюсбет. 142, 68-78 (1984)) и сульфгидрильные группы (Коуата, Сбет. АЬз!г. 120, 217262! (1994)) аминокислотных остатков и также через углеводородные группы (Воб^е11 е! а1., РNАδ ^А 83, 2632-2636 (1986), Оиабп е! а1., №с1. Меб. Вю1. 20, 559-570 (1993)). Поскольку такие хелатирующие агенты содержат два типа функциональных групп, одну для связывания ионов металла и другую для присоединения хелатора к антителу, они обычно называются бифункциональными хелатирующими агентами (ЬипбЬегд е! а1., Хпиге 250, 587-588 (1974)).
Сшивающие агенты с двумя реактивными функциональными группами подразделяются на гомоили гетеробифункциональные. Примерами гомобифункциональных сшивающих агентов являются бисмалеимидогексан (ВМН), который реагирует с сульфгидрильными группами (Сбеп е! з1., 1. Вю1. Сбет. 266, 18237-18243 (1991)) и этиленгликоль-бис-[сукцинимидилсукциат], (ЕСδ) который реагирует с аминогруппами (Вго^шпд е! а1., I. Iшшипо1. !43, 1859-1867 (1989)). Примером гетеробифункционального сшивающего агента являются т-малеимидобензоил-№гидроксисукцинимидный эфир (МВ δ) (Муегз е!
- 63 015584 а1., 1. Iттипο1. Мс!1. 161, 129-142 (1989)). Эти способы просты и часто применяются.
Терапевтический или диагностический агент можно также или альтернативно присоединять в районе связки восстановленного компонента антитела через образование дисульфидной связи. В качестве альтернативы такие пептиды можно присоединять к компоненту антитела с применением гетеробифункционального сшивающего агента, например №сукцинил-3-(2-пиридилдитио)пропионата (8РЭР). Υυ с! а1., Ш!. 1. Саиссг 56, 244 (1994). Основные способы такого присоединения хорошо известны в данной области; см., например, νοι^, СЬст18!гу 0Г Рго!ст Οορίι.^·!^!·! Аий Сго88-Ыпктд (СКС Ргс88 1991), Ирс81ас18 с! а1., Мοй^Γ^саί^οπ οΓ Аπί^Ьοй^с8 Ьу СЬстка1 Мсίйοй8, Σπ Мοпοс1οпа1 Аπί^Ьοй^с8: Ргтс1р1с8 Аий Арр1юа1юи8, В1гсЬ с! а1. (сй8.) ^11су-Ь188, Ьс. 1995), Рпсе, Ргойис1юп аий С11агас1спха1юп οΓ 8уп!йс!ю Рер!1йс- Оспуей Аπ!^Ьοй^С8, ίπ Мοποс1οπа1 Аπ!^Ьοй^С8: Ргойис!юи, Еидтсспид Аий Сйшса1 Арр1юа!юи, КШег с! а1. (сй8.) (СатЬпйдс ипАсг811у Ргс88 1995).
В некоторых воплощениях метки и другие конъюгированные заместители присоединены к аминокислотной последовательности СЭ38ВР при помощи разделительных рук разной длины для уменьшения потенциального стерического затруднения.
Немеченые СЭ38ВР можно применять в комбинации с другими мечеными антителами (вторичными антителами), которые реактивны с СЭ38ВР, например антитела, специфичные для константных районов иммуноглобулина человека, которые связываются с анти-СЭ38 тАЬ8. Альтернативно, СЭ38ВР можно пометить прямо. Широкое разнообразие меток можно применять для прямого или непрямого мечения СЭ38ВР, например мечения радиоизотопами, флуорофорами, ферментами, субстратами ферментов, кофакторами ферментов, ингибиторами ферментов, лигандами (особенно гаптенами) и т.д.
Вставки аминокислотных последовательностей включают амино- и/или карбоксиконцевые присоединения длиной от одного остатка до полипептидов, содержащих сотню или более остатков, а также внутренние вставки в последовательность из одной или многих аминокислотных остатков. Примеры концевых вставок включают антитело с ^концевым остатком метионила или антитело, присоединенное к эпитопной метке. Другие варианты молекул антител со вставкой включают присоединения к N или С-концу антитела фермента или полипептида, или ПЭГ, что увеличивает сывороточное время полужизни антитела. Такие составные с анти-СЭ38 антителом белки, включающие СЭ38ВР последовательности, являются другим свойством настоящего изобретения.
В одном воплощении настоящее изобретение представляет молекулы, включающие СЭ38ВР, например анти-СЭ38 антитело человека согласно настоящему изобретению, конъюгированное с терапевтическим звеном, таким как цитотоксин, химиотерапевтическое лекарство, иммуносупрессант или радиоактивный изотоп. Такие конъюгаты называются здесь иммуноконъюгатами. Иммуноконъюгаты, включающие один или более цитотоксин, называются иммунотоксинами.
Цитотоксин или цитотоксический агент включает любой агент, приносящий ущерб (т.е. убивающий) клеткам. Для описания таких классов лекарств, известных в данной области, и механизмов их действия см. 6οοйтаи с! а1., 6οοйтаπ аий 6йтаи'8 ТЬе РИата^^ю^ Ва818 0Г Тйсгарсийс8, 8(Н Ей., Мастй1ап РиЬ118Ыид Сй., 1990. Дополнительные способы, относящиеся к получению антител иммунотоксинов, предоставлены, например, в Уйейа, Iттиπο1. Шйау 14, 252 (1993) и И8 5194594.
Подходящие терапевтические агенты для образования иммуноконъюгатов согласно настоящему изобретению включают таксол, цитохалазин В, грамицидин Ό, этидий бромид, эметин, митомицин, этопозид, тенопозид, винкристин, винбластин, колхицин, доксорубицин, даунорубицин, дигидроксиантрациндион, митоксантрон, актиномицин Ό, 1-дегидрокситестостерон, глюкокортикоиды, прокаин, тетракаин, лидокаин, пропранолол и пуромицин, антиметаболиты (например, метотрексат, 6-меркаптопурин, 6-тиогуанидин, цитарабин, флюдарабин, 5-фторурацил, декарбазин, гидроксимочевина, аспарагиназа, гемцитабин, кладрибин), алкилирующие агенты (например, мехлоретамин, тиоепа, хлорамбуцил, мелфалан, кармустин (В8МИ), ломустин (ССИи), циклофосфамид, бусульфан, дибромманнит, стрептозотоцин, дакарбазин (ОТШ), прокарбазин, митомицин С, цисплатин и другие производные платины, например карбоплатин), антибиотики (например, дактиномицин (ранее актиномицин), блеомицин, даунорубицин (ранее дауномицин), доксорубицин, идарубицин, митрамицин, калихеамицин, митомицин, митоксантрон, пликамицин, антрамицин (АМС)), дифтерийный токсин и родственные молекулы (например, активные фрагменты А цепи дифтерийного токсина и гибридные молекулы), токсин рицин (например рицин А или дегликозилированный токсин цепи А рицина), токсин холеры, шигоподобный токсин (8ЬТ-[, 8ЬТ-П, 8ЬТ-ПУ), ЬТ токсин, С3 токсин, шига-токсин, токсин пертуссина, токсин столбняка, ингибитор протеаз Боумана-Бирка из соевых бобов, экзотоксин Р8сийοтοπа8, алорин, сапорин, модексин, геланин, цепь абрина А, модексина А цепь, альфа-сарцин, белки А1сшйс8 ΓοΜίί, белки диантина, белки Р11уЮ1асса Атепсаиа (РАРк РРП и РАР-8) ΙΠοιηοια^-ι сйагаийа ингибитор, курцин, кротин, ингибитор из 8араοπа^^а οΓΓίС1иа118, гелонин, митогеллин, рестриктоцин, феномицин и эномицин. Терапевтические агенты, которые можно назначать в комбинации с СЭ38ВР согласно настоящему изобретению, как описано в другом месте здесь, также могут быть кандидатами в терапевтические части для конъюгации с СЭ38ВР настоящего изобретения. Например, звено лекарства может быть белком или полипептидом, обладающим желаемой биологической активностью. Такие белки могут включать, например, ферментативно активные токсины или их активный фрагмент, например абрин, рицин А, экзотоксин Р8сийοтοπа8 или дифтерийный ток
- 64 015584 син; белок, например фактор некроза опухолей или интерферон-γ или модификаторы биологического ответа, например лимфокины, интерлейкин-1 (ΙΕ-1), интерлейкин-2 (ΙΕ-2), интерлейкин-6 (ΙΕ-6), фактор стимуляции колоний макрофагов гранулоцитов (СМ-С8Р), фактор стимуляции колоний гранулоцитов (С-С8Р) или другие факторы роста и белки, индуцирующие апоптоз, выделенные из митохондрий.
В одном воплощении цитотоксический агент является калихеамицином, 90Υ, 125Ι и 131Ι.
Другие примеры терапевтических цитотоксинов, которые можно конъюгировать с ί.Ό38ΒΡ настоящего изобретения, включают калихеамицины и дуокармицины. Как отмечалось выше, лекарственное звено не следует толковать как ограниченное классическими химическими терапевтическими агентами. Например, лекарственное звено может быть белком или полипептидом, обладающим желаемой биологической активностью. Такие белки могут включать, например, агент, активный на поверхности клеток, например ферменты фосфолипазы, например фосфолипазу С.
Лизирующую часть токсина можно легко присоединить к РаЬ фрагменту антитела или фрагменту антитела согласно настоящему изобретению. Другие подходящие для конъюгации молекулы включают рибонуклеазу (РНКазу), ДНКазу Ι, стафилококковый энтеротоксин А, антивирусный белок лаконоса, дифтерийный токсин и эндотоксин Ρ5еийοтοηа5; см., например, Ρа5ΐап е! а1., Се11. 47, 641 (1986) апй 6о1йепЬегд, СайГ. А Сапсег 1оита1 Гог Сйшс1апв 44, 43 (1994). Дополнительные токсины, подходящие для применения в настоящем изобретении, известны специалистам в данной области техники (см., например, И8 6077499).
Конъюгаты С^38ΒΡ, такие как антитела и такие как цитотоксические звенья, можно получать с применением бифункциональных агентов связывания белков. Примеры таких реагентов включают 8ΡΌΡ, ΙΤ, бифункциональные производные иммуноэфиров, например диметил адипимидат нС1, активные эфиры, например дисукцинимидинил суберат, альдегиды, например глутаральдегид, бис-азидосоединения, например бис-(р-азидобензоил)гександиамин, производные бис-диазония, например бис-(рдиазонийбензоил)этилендиамин, диизоцианаты, например толилен-2,6-диизоцианат, и бис-активные соединения фтора, например 1,5-дифтор-2,4-динитробензол и противомитотические агенты (например, винкристин, винбластин, доцетаксель, паклитаксель и винорелбин).
Способы конъюгации таких терапевтических звеньев с С^38ΒΡ, например антител, хорошо известны, см., например, Агпоп е! а1., Мопос1опа1 АпйЬой1ев Рог 1ттипо!агде!1пд 0Г Эгиде Ш Сапсег Тйегару, т Мопос1опа1 Ап!1Ьой1ев Апй Сапсег Тйегару, Ве1вГе1й е! а1. (ейв.), р. 243-56 (А1ап В. Ыев, Й1с. 1985), нейеЦот е! а1., АпйЬой1ев Рог Эгад Эейуегу, ш Соп1го11ей Эгид ЭеКгегу (2пй Ей.), ВоЬтвоп е! а1. (ейв.), р. 623-53 (Магсе1 Эеккег, йгс. 1987), Тйогре, АпйЬойу Сатегв 0Г Су!о!охю Адеп!в Ш Сапсег Тйегару: А Веν^еν, т Мопос1опа1 АпйЬой1ев '84: Β^ο1οд^са1 Апй С11шса1 Аррйсайопв, Ρ^псйе^а е! а1. (ейв.), р. 475-506 (1985), Апа1ув15, ВевиЙв, Апй Ри!иге Ρ^ο5рес!^νе 0Г Тйе Тйегареийс Иве 0Г Вайю1аЬе1ей АпйЬойу Ш Сапсег Тйегару, ш Мопос1опа1 АпйЬой1ев Рог Сапсег Эе!есйоп Апй Тйегару, Βа1йν^η е! а1. (ейв.), р. 303-16 (Асайетк Ρ^е55 1985) апй Тйогре е! а1., Тйе Ρ^ера^а!^οη Апй Су!о!охк Ρ^οре^ίк5 0Г Ап!1Ьойу-Тохт Соп_)ида!е5, Iттиηο1. Веν. 62, 119-58 (1982).
В одном воплощении настоящее изобретение представляет С^38ΒΡ, который конъюгирован со смешанным токсином. Молекулой смешанного токсина является молекула, произведенная из двух различных (обычно полипептидных) токсинов. В основном пептидные токсины включают один или более домен, ответственный за генерализованное связывание эукариотических клеток, по меньшей мере один ферментативно активный домен и по меньшей мере один транслокационный домен. Связывающие и транслоцирующие домены необходимы для узнавания клеток и входа токсина соответственно. Встречающие в природе белки, как известно, включающие домен транслокации, включают дифтерийный токсин, эндотоксин А Ρ5еийοтοηа5 и возможно другие пептидные токсины. Домены транслокации дифтерийного токсина и эндотоксина А Ρ5еийοтοηа5 хорошо охарактеризованы (см., например, носй е! а1., Ρ^ И8А 82, 1692 (1985), Со1отЬа!й е! а1., 1. Βίο1. Сйет. 261., 3030 (1986) апй Эе1еегв е! а1., РΕΒ8 Ьей. 160, 82 (1983)) и существование и расположение такого домена в других молекулах можно определить способами, например, примененными в Шгапд е! а1., Се11. 48, 129 (1987) апй С га у е! а1., ΡNΑ8 И8А 81.2645 (1984). Ввиду этих способов применимая молекула смешанного гибридного токсина может быть образована, например, посредством соединения ферментативно-активной А субъединицы шигаподобного токсина из Е.сой (С.’а1йег\уоой е! а1., ΡNΑ8 И8А 84, 4364 (1987)) с транслокационным доменом (аминокислотными остатками от 202 до 460) дифтерийного токсина и с молекулой, направленной на определенный тип клеток, как описано в И8 5906820. Направляющая часть такого трехчастного гибрида может обусловить специфическое присоединение молекулы к клеткам мишени и транслокационная часть дифтерийного токсина может действовать так, чтобы ввести ферментативно активную субъединицу А шигаподобного токсина в клетку мишени. Ферментативно активная часть шигаподобного токсина подобно дифтерийному токсину действует на механизм синтеза белка в клетке, предотвращая синтез белка, таким образом убивая клетку мишени.
Иммуноконъюгаты согласно настоящему изобретению могут также включать радиоизотопы, например йод-131, иттрий-90 или индий-111 для генерации цитотоксических радиоактивных лекарств для лечения связанных с ί.Ό38ΒΡ нарушений, например множественной миеломы.
- 65 015584
В одном воплощении СИ38ВР, такие как антитела человека, согласно настоящему изобретению присоединены к линкеру-хелатору, например тиуксетану, который позволяет конъюгировать антитело с радиоизотопом.
Дополнительно применимые конъюгируемые заместители включают противораковые ретиноиды. Конъюгаты таксана (см., например, шк!апсе Йипе е! а1., Апйсапсег Яек. 21(2А), 1119-28 (2001)), конъюгаты цисплатина, тапсигаргиновые конъюгаты, конъюгаты линоленовой кислоты, конъюгаты калихеамицина (см., например, Оат1е е! а1., Сигг 0рш Ркагтасо1. 3(4), 386-90 (2003)), конъюгаты доксорубицина, конъюгаты гелданамицина и т.п. также могут применяться для облегчения лечения рака (см. в основном Тгай е! а1., Сапсег Штипок ШтипоШег. 52(5), 328-37 (2003)).
В одном воплощении настоящее изобретение представляет вторичные и антиидиотипические антитела, выработанные против анти-СИ38 антител согласно настоящему изобретению. Вторичное антитело относится к антителу, специфическому к и обычно выработанному против анти-СЭ38 антитела. Антиидиотипическое антитело (й) является антителом, которое узнает уникальные детерминанты, в основном связанные с антигенсвязывающим участком антитела. й-антитело можно получать посредством иммунизации животного того же вида и генетического типа, как источник анти-СИ38 тАЬ с помощью тАЬ, к которому анти-й получают. Иммунизированное животное обычно может распознавать и отвечать на идиотипические детерминанты иммунизирующего антитела посредством продукции антитела к этим идиотипическим детерминантам (анти-й антитело). Такие антитела описаны, например, в υδ 4699880. Такие антитела являются еще одним свойством настоящего изобретения.
Анти-й антитело можно также применять в качестве иммуногена для индукции иммунного ответа у еще одного животного, продуцирующего так называемое антианти-й антитело. Антианти-й антитело может быть идентично по эпитопу, исходному тАЬ, который индуцировал анти-й антитело. Так, применяя антитела к идиотипическим детерминантам тАЬ, возможно идентифицировать другие клоны, экспрессирующие антитела с идентичной специфичностью. Анти-й антитела можно варьировать (таким способом производя варианты анти-й антитела) и/или дериватизировать любым подходящим способом, например, как описано здесь в другом месте относительно анти-СЭ38 антител согласно настоящему изобретению. Например, анти-й тАЬ можно соединять с переносчиком, например гемоцианином моллюска (кеуко1е йтре!) (КЬИ), и применять для иммунизации ВАЬВ/с мышей. Сыворотка таких мышей обычно содержит антианти-й антитела, которые обладают свойствами связывания сходными, если не идентичными таковым исходного/родительского СЭ38 антитела.
В одном воплощении настоящее изобретение представляет нуклеиновую кислоту, кодирующую СИ38ВР. Нуклеиновая кислота, кодирующая СИ38ВР, может обладать любыми подходящими характеристиками и включать любые подходящие свойства или их комбинацию. Так, например, нуклеиновая кислота, кодирующая СИ38ВР, может быть в форме ДНК, РНК или их гибрида и может включать невстречающиеся в природе основания, модифицированный скелет (например, фосфотиоатный скелет, который способствует стабильности нуклеиновых кислот) или оба. Нуклеиновая кислота преимущественно включает свойства, способствующие желаемой экспрессии в клетке хозяина мишени, репликации и/или отбору. Примеры таких свойств включают компонент начала репликации, компонент отбора гена, компонент промотора, компонент элемента усилителя, компонент последовательности полиаденилирования, компонент терминации и т.п.
В одном воплощении настоящее изобретение представляет вектор, включающий кодирующую СИ38ВР нуклеиновую кислоту. Вектор относится к средству доставки, которое способствует экспрессии кодирующей СИ38ВР нуклеиновой кислоты, продукции СИ38ВР пептида, трансфекции/трансформации клеток мишени, репликации кодирующей СИ38ВР нуклеиновой кислоты, способствует стабильности нуклеиновой кислоты, способствует детекции нуклеиновой кислоты и/или трансформированных/трансфицированных клеток или другим способом придает выгодную биологическую функцию кодирующей СИ38ВР нуклеиновой кислоте. Вектор в контексте настоящего изобретения может быть любым подходящим вектором, включая векторы, состоящие из хромосомной, нехромосомной и синтетической нуклеиновой кислоты (последовательность нуклеиновой кислоты, включающая необходимый набор элементов контроля экспрессии). Примеры таких векторов включают производные δУ40, бактериальные плазмиды, фаговую ДНК, бакуловирус, плазмиды дрожжей, векторы, произведенные из комбинации плазмиды и фаговой ДНК, и вирусную нуклеиновую кислоту (РНК или ДНК) векторы. В одном воплощении кодирующая СИ38ВР нуклеиновая кислота включает вектор из голой ДНК или РНК, включающий, например, линейный элемент экспрессии (как описано, например, в δукек апй ййпк!оп, №и Вю!еск Т7, 355-59 (1997)), вектор из сжатой нуклеиновой кислоты (как описано, например, в υδ 6077835 и/или А0 00/70087), плазмидный вектор как рВЯ322, рυС 19/18 или рυС 118/119, мошку вектор из нуклеиновой кислоты минимального размера (как описано, например, в δс11акο\νкк^ е! а1., Мо1. Ткег. 3, 793-800 (2001)), или осажденную конструкцию вектора из нуклеиновой кислоты, например СаР04-осажденная конструкция (как описано, например, в А0 00/46147, ВепуешЧу апй ЯеккеГ, РNАδ ^А 83, 9551-55 (1986), А1д1ег е! а1., Се11. 14, 725 (1978), и Согаго апй Реагкоп, δοтайс Се11. Сепейск 7, 603 (1981)). Такие векторы из нуклеиновой кислоты и их применение хорошо известны в данной области (см., например, υδ 5589466 и υδ 5973972).
- 66 015584
В одном воплощении вектор подходит для экспрессии СБ38ВР в бактериальной клетке. Примеры таких векторов включают, например, векторы, которые направляют высокий уровень экспрессии составных белков, которые легко очищать (например, мультифункциональные клонирующие и экспрессирующие векторы Е.со11, например, В1ие8спр1 (8!га!адепе), рШ векторы (Уап Шеке & 8сйик!ег, I. Вю1. СНет. 264, 5503-5509 (1989), рЕТ векторы (Штаден, Маб1коп А1) и т.п.).
Экспрессирующий вектор может также или альтернативно быть вектором, подходящим для экспрессии в дрожжевой системе. Любой вектор, подходящий для экспрессии в дрожжевой системе, можно применять. Подходящие векторы для применения, например, в Зассйаготусек сегеуыае включают, например, векторы, включающие конститутивные или индуцибельные промоторы, например альфа фактор, алкоголь-оксидаза и РСΗ (обзор в Ε. АикиЬе1 е! а1., еб. Сиггеп! РгоЮсо1к ш Мо1еси1аг Вю1оду, Сгеепе РиЬЕкЫпд апб АПеу [пЮгЗаепсе №\ν Уогк (1987), апб Сгап! е! а1., Ме!кобк шЕпхуто1 153. 516-544 (1987)).
Нуклеиновая кислота и/или вектор может также включать последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую последовательность секреции/расположения, которая может направлять полипептид, например рождающуюся полипептидную цепь, в нужный компартмент клетки, мембрану или органеллу, или который направляет секрецию полипептида в периплазматическое пространство или в культуральную среду клетки. Такие последовательности известны в данной области и включают секреторный лидер или сигнальные пептиды, последовательности, направляющие в органеллы (например, последовательности ядерной локализации, сигналы удержания в ЭР, последовательности переноса в хлоропласты), мембранные локализующие/якорные последовательности (например, последовательности остановки переноса, последовательности СРI якоря) и т.п.
СБ38ВР-кодирующие нуклеиновые кислоты могут включать или быть связанными с любым подходящим промотором, усилителем и другими облегчающими экспрессию элементами. Примеры таких элементов включают сильные промоторы экспрессии (например, СМУ Ш промотор/усилитель человека, а также РЗУ, ЗУ40, 8Ь3-3, ММТУ и ШУ ЬТР промоторы), эффективные поли(А) терминирующие последовательности, начало репликации плазмид в Е.со11, ген устойчивости к антибиотику в качестве маркера селективности и/или подходящий участок клонирования (например, полилинкер). Нуклеиновые кислоты также могут включать индуцибельный промотор в противоположность конститутивному промотору, такому как СМУ Ш (специалист в данной области поймет, что эти термины в действительности описывают степени экспрессии гена в определенных условиях).
В одном воплощении нуклеиновая кислота может находиться и/или доставляться в клетку хозяина или животное хозяин с помощью вирусного вектора. Любой подходящий вирусный вектор можно применять для этого и несколько таких векторов известны в данной области. Вирусный вектор может включать любое число вирусных полинуклеотидов отдельно или в сочетании с одним или более вирусным белком, облегчающим доставку, репликацию и/или экспрессию нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению в нужной клетке хозяина. Вирусный вектор может быть полинуклеотидом, включающим весь или часть вирусного генома, вирусным конъюгатом белок/нуклеиновая кислота, вирусоподобной частицей (УЪР), вектором, сходным с описанными в И8 5849586 и А0 97/04748, или интактной вирусной частицей, включающей вирусную нуклеиновую кислоту и нуклеиновую кислоту согласно настоящему изобретению. Вирусный вектор вирусной частицы может включать вирусную частицу дикого типа или модифицированную вирусную частицу. Вирусный вектор может быть вектором, который требует присутствия другого вектора или вируса дикого типа для репликации и/или экспрессии (например, он может быть зависимым от помощника вирусом), например, ампликона аденовирусного вектора. Обычно такие вирусные векторы состоят в основном из вирусной частицы дикого типа или вирусной частицы, модифицированной по своему белковому или нуклеиново-кислотному содержимому для увеличения трансгенной способности или помощи при трансфекции и/или экспрессии нуклеиновой кислоты (примеры таких векторов включают ампликоны вируса герпеса/ААУ). Обычно вирусный вектор похож на и/или произведен из вируса, который в норме инфицирует животных. Частицы подходящего вирусного вектора в этом отношении включают, например, частицы аденовирусного вектора (включая любой вирус или произведенный из вируса семейства аденовирусных), аденосвязанную вирусную частицу (ААУ вирусные частицы) или другие парвовирусы и парновирусные векторные частицы, папилломавирусные векторные частицы, флавивирусные векторы, альфавирусные векторы, векторы вируса герпеса, векторы вируса оспы, ретровирусные векторы, включая лентивирусные векторы. Примеры таких вирусов и вирусных векторов находятся, например, в Е1е1бк е! а1., ебк., Упо1оду Рауеп Ргекк, Ь!б., №\ν Уогк (3гб еб., 1996 апб 4111 еб., 2001), Епсус1ореб1а ок Уио1о§у, Р.С. АеЬк1ег е! а1., ебк., Асабетю Ргекк (2пб еб., 1999), Еипбатеп!а1 У1го1о§у, Е1е1бк е! а1., ебк., Ырртсо!!- Рауеп (3гб еб., 1995), ^еν^ηе, Уиикек, ЗаепРЕс Атепсап ЫЬгагу №. 37 (1992), Мебюа1 У1го1о§у, Б.0. А1и1е е! а1., ебк., Асаб. Ргекк (2пб еб. 1994) апб Ш!гобис!юп !о Мобегп У1го1о§у, Б1тоск, N.1. е! а1., ебк., В1аск\\'е11 ЗаепРЕс РиЫюаЕопк, Ь!б. (1994).
Вирусные векторы, которые можно применять вместе с полинуклеотидами согласно настоящему изобретению, и способы, описанные здесь, включают аденовирусный и аденосвязанные векторы, как, например, в Сайег, Сигг 0р1шоп Вю!есй 3, 533-539 (1992) и Ми/сухка, Сигг Тор МюгоЬюк Тттипок 158, 97-129 (1992). Дополнительные типы и аспекты ААУ векторов описаны, например, в Сайег, Соп!пЬ. МюгоЬю1. 4, 85-86 (2000), Зтйй-Апса, Сигг. Сагбю1. Рер. 3(1), 41-49 (2001), Та], I Вютеб. 8οΐ. 7(4), 279
- 67 015584 (2000), У1дпа е! а1., к Сепе Меб. 2(5), 308-16 (2000), Кйта!сйеуа е! а1., Егоп!. ВюбЫ. 4, И481-96 (1999), Ьеуег е! а1., Вюсйет. 8ос. Тгапх. 27(6), 841-47 (1999), 8пубег, I Сепе Меб. 1(3), 166-75 (1999), Сепсй е! а1., Кпее 8игд. 8рог!х Тгаита!о1. Аййгохс. 5(2), 118-23 (1998) и Ишгпд, Α6ν. И гад Иейу. Веу1еп 27(1), 83-94 (1997) и И8 4797368, И8 5139941, И8 5173414, И8 5614404, И8 5658785, И8 5858775 и И8 5994136. Аденосвязанные вирусные векторы можно конструировать и/или очищать с применением способов, описанных, например, в И8 4797368 и Ьаидй1ш е! а1., Сепе 23, 65-73 (1983).
Другой тип вирусного вектора, который можно применять с полинуклеотидами и способами согласно настоящему изобретению, является папилломавирусным вектором. Подходящие папилломавирусные векторы известны в данной области и описаны, например, в непхоп, Мо1. Меб Тобау 5(1), 8 (1999), 8!ерйепх, Вюсйет Σ. 248(1), 1-11 (1987) и И8 5719054. Примеры папилломавирусных векторов представлены, например, в XV0 99/21979. Альфавирусные векторы могут быть средствами доставки генов в другом контексте. Альфавирусные векторы известны в данной области и описаны, например, в Сайег, Сигг 0р1шоп Вю!есй 3, 533-539 (1992), Ми/су/ка, Сигг Тор М1сгоЫо1. Тттипок 158, 97-129 (1992), 8сй1ехтдег, Ехрег! 0рт Вю1 Тйег. 1(2), 177-91 (2001), Ро1о е! а1., Иеу Вю1 (Вахе1). 104, 181-5 (2000), Шййогх е! а1., Сепе Тйег. 7(6), 472-80 (2000), Со1отйаде е! а1., УнЫоду. 250(1), 151-63 (1998) и \ν0 01/81609, \ν0 00/39318, У0 01/81553, У0 95/07994 и У0 92/10578.
Другой группой вирусных векторов являются векторы вируса герпеса. Примеры векторов на основе вируса герпеса описаны, например, в Ьасйтапп е! а1., Сигг 0рт Мо1. Тйег 1(5), 622-32 (1999), ЕгаеГе1 е! а1., Абу У1гих Вех. 55, 425-51 (2000), ниагб е! а1., №иготихси1 Ζ(5), 299-313 (1997), С1опохо е! а1., Ати Веу МюгоЬю1. 49, 675-710 (1995), Ьа!сйтап, Мо1. Вю!есйпо1. 2(2), 179-95 (1994) и Егепке1 е! а1., Сепе Тйег. 1(8ирр1 1), 840-6 (1994), а также в И8 6261552 и И8 5599691.
Ретровирусные векторы, включая лентивирусные векторы, также могут быть полезными средствами доставки генов в отдельных случаях. Имеется множество ретровирусных векторов, известных в данной области. Примеры ретровирусных векторов описаны, например, в МШег, Сигг Тор МюгоЫок Тттипок 158. 1-24 (1992), 8а1топх апб Сип/Ьигд, нитап Сепе Тйегару 4, 129-141 (1993), МШег е! а1., Ме!йобх т ЕпхттоШхт 217, 581-599 (1994), ’№ейег е! а1., Сигг 0рт Мо1. Тйег. 3(5), 439-53 (2001), ни е! а1., Рйагтасо1 Веу. 52(4), 493-511 (2000), К1т е! а1., Абу У1гих Вех. 55, 545-63 (2000), Ра1и е! а1., Веу Меб У1го1. 10(3), 185-202 (2000) апб ТакеисЫ е! а1., Абу Ехр Меб Вю1. 465, 23-35 (2000), а также в И8 6326195, И8 5888502, И8 5580766 и И8 5672510.
Аденовирусные векторы также могут быть подходящими векторами для переноса генов. Аденовирусные векторы хорошо известны в данной области и описаны, например, в Сгайат е! а1., Мо1. Вю!есйпо1. 33(3), 207-220 (1995), 8!ерйепхоп, Сйп И1адп У1го1. 10(2-3), 187-94 (1998), ЫсоЬх, С1т 8с (Ьопб). 85(2), 117-22 (1993), И8 5922576, И8 5965358, И8 6168941 и \ν0 98/22588, \ν0 98/56937, \ν0 99/15686, ν0 99/54441 и ν0 00/32754. Аденовирусные векторы, векторы на основе вируса герпеса и 8тбЫх вирусные векторы, полезные в практике согласно настоящему изобретению, описаны, например, в бо11у Сапсег Сепе Тйегару 1, 51-64 (1994), Ьа!сйтап Мо1ес Вю!есйпо1 2, 179-195 (1994) и .Тойапптд е! а1., Шс1 Аабх Вех 23, 1495-1501 (1995).
Другие подходящие вирусные векторы включают векторы вируса оспы. Примеры таких векторов описаны, например, в Вегепсх1 е! а1., Σ. ЫГес!. И1х 183(8), 1171-9 (2001), ВохепМйй е! а1., Уассте 19(1314), 1661-70 (2001), Кййехеп е! а1., I Тттипок 164(8), 4204-11 (2000), Вгопп е! а1., Сепе Тйег 7(19), 1680-9 (2000), Капеха-!йахап е! а1., Уассте 19(4-5), 483-91 (2000), 8!еп, Игла 60(2), 249-71 (2000). Векторы вируса вакцинии могут быть векторами вируса оспы. Примеры таких векторов и их применение предоставлены, например, в Уепидора1 е! а1., Вех Уе! 8а 57(2), 188-193 (1994), Мохх Иеу Вю1. 8!апб 82, 55-63 (1994), Уе1х/ е! а1., Мо1. Се11. Вю1. 43, 137-159 (1994), Майг апб Раупе, ТшшипоЬюЬсу 184(2-3), 126-146 (1992), нгаЬу, Сйп МюгоЫок Веу. 3(2), 153-170 (1990) и \ν0 92/07944, \ν0 98/13500 и \ν0 89/08716.
Другие свойства настоящего изобретения включают рекомбинантные клетки, такие как дрожжевые, бактериальные или клетки млекопитающих (например, бессмертные клетки млекопитающих), включающие такую нуклеиновую кислоту, вектор или комбинацию с одним или с ними обоими. Например, в одном воплощении настоящее изобретение представляет клетку, включающую нуклеиновую кислоту, устойчиво интегрированную в клеточный геном, которая включает последовательность, кодирующую экспрессию СИ38ВР согласно настоящему изобретению. В одном воплощении настоящее изобретение представляет клетку, включающую неинтегрированную нуклеиновую кислоту, например плазмиду, космиду, фагемиду или линейный элемент экспрессии, которые включают последовательность, кодирующую экспрессию СИ38ВР.
Настоящее изобретение также представляет иммуногенные пептиды, включающие любую из вышеописанных частей антигенных детерминант СИ38-специфичных для СИ38ВР согласно настоящему изобретению, например части антигенных детерминант СИ38, специфичные для -003, и -005, и -023. Такие иммуногены можно применять для вызывания прямого иммунного ответа по способу, включающему режим активной иммунотерапии. Настоящее изобретение далее представляет составной белок, включающий такой СИ 38 иммуноген и последовательность партнера, которая улучшает время полужизни составного белка (например, посредством включения последовательности домена иммуноглобулина); упрощает детекцию и/или очистку составного белка (посредством включения, например, последователь
- 68 015584 ности флуоресцирующего белка, последовательности репортерного фермента, эпитопной метки, шестигистидиновой последовательности и т.п.); содействует нацеливанию составного белка (например, посредством включения лиганда или части лиганда, специфичного для рецептора клетки мишени); способствует индукции отчетливого иммунного ответа (например, соответствует раковому антигену или его иммуногенному фрагменту), является цитотоксическим агентом или обеспечивает любую их комбинацию (например, белок теплового шока в качестве партнера может увеличивать иммунный ответ, образованный против несходного, гетерологичного антигена части составного белка, в то же время увеличивая 1п νί\Ό время жизни составного белка). Составные белки могут также включать один или более участок расщепления, особенно между доменами.
Варианты таких пептидов и производные таких иммуногенных пептидов или варианты иммуногенных пептидов являются дополнительными свойствами настоящего изобретения (например, такие производные СЮ38 иммуногенные пептиды можно модифицировать с помощью химического сопряжения, генетического связывания, нековалентного связывания и т. п. с другими молекулярными модулями, например антителами, токсинами, радиоизотопами, цитотоксическими агентами или цитостатическими агентами). Пептидные мимитопы, включая последовательности СЭ38 эпитопа, можно также, например, применять в качестве кандидатов на роль вакцины. Такие пептиды можно также применять для очистки анти-СО38 антител. Дополнительно к последовательностям эпитопов В-клеток, описанным здесь, такие пептиды можно конструировать или выбирать также или альтернативно так, что они включают один или более анти-СО38 эпитоп Т-клетки. Такие эпитопы можно идентифицировать с помощью любой подходящей техники, известной в данной области (например, с помощью приложений программ предсказания эпитопа Т-клеток).
В одном воплощении настоящее изобретение представляет нуклеиновую кислоту, кодирующую такой иммуногенный пептид. Такую нуклеиновую кислоту можно доставлять хозяину с помощью любого подходящего вектора, например направленного вектора с нарушенной репликацией (например, направленный нуклеиново-кислотный вектор или направленный аденовирусный вектор с нарушенной репликацией). Настоящее изобретение также представляет композиции из одного или более таких иммуногенных пептидов и/или кодирующих иммуногенный пептид нуклеиновых кислот.
СО38ВР согласно настоящему изобретению включают нейтрализующие СЭ38ВР, например нейтрализующие антитела. Термин нейтрализующие СО38ВР и нейтрализующие антитела относится к СЭ38ВР или антителу, которое способно значительно ингибировать или уничтожать биологическую активность СО38-связанного пептида. Обычно нейтрализующее СЭ38ВР, например нейтрализующее антиСЭ38 антитело, могут ингибировать прямо или непрямо функцию СЭ38, например ферментативную активность, передачу сигнала, индукцию экспрессии цитокинов, индукцию пролиферации или дифференциации или индукцию лизиса в степени, которая приблизительно равна или больше ингибирования таких клеток благодаря применению приблизительно равного количества -003, или -005, или -024.
СЭ38ВР согласно настоящему изобретению может обладать любым подходящим сродством и/или авидностью к одному или более эпитопу, содержащемуся, по меньшей мере, отчасти в СЭ38. Сродство относится к силе связывания СЭ38ВР с таким эпитопом. Обычно сродство измеряют с помощью константы диссоциации Кй, определяемой как [АЬ]х[Ад]/[АЬ-Ад], где [АЬ-Ад] - молярная концентрация комплекса антитело-антиген (или комплекса СЭ38ВР-антиген), [АЬ] - молярная концентрация несвязанного антитела (или СЭ38ВР) и [Ад] - молярная концентрация несвязанного антигена. Константа сродства Ка определяется как 1/Кй. Подходящие способы определения специфичности и сродства посредством конкурентного ингибирования можно найти, например, в Наг1о\у е! а1., АпйЬоФек: А ЬаЬогаФгу Мапиа1, Со1й Зрппд НагЬог ЬаЬога!огу Ргекк, Со1й Зрппд НагЬог, КУ. (1988), СоШдап е! а1., ейк., Сиггеп! Рго!осо1к 1п ^типо^^у, Сгеепе РиЬйкЫпд Аккос, апй ^йеу ШегЗаепсе КУ. (1992, 1993) и Ми11ег, Ме!1. Епхуто1. 92, 589-601 (1983).
СЭ38ВР и, в частности, анти-СО38 антитела согласно настоящему изобретению могут обладать сродством по меньшей мере к одному эпитопу, по меньшей мере, частично включенному в СЭ38 в интервале от приблизительно 10-4 до приблизительно 10-10 М-1. Термин иммунореагирует обычно относится здесь к связыванию СЭ38ВР с СЭ38 эпитопом с константой диссоциации Кй ниже приблизительно 10-4 М-1.
СЭ38В может обладать сродством, которое, по меньшей мере, так же велико для СЭ38, как у антител -003, -005 и -024, и в некоторых воплощениях обладает сродством, которое, по меньшей мере, приблизительно так же велико, как у антител -003, -005 и -024. Сродство можно определять с помощью любого из способов, описанных здесь, или их известных в данной области эквивалентов. Пример способа, который можно применять для определения сродства, приведен в анализе по Скэтчарду в Мипкоп & Ро11агй, Апа1. Вюсйеш. 107, 220 (1980). Сродство связывания можно также определять с помощью равновесных способов, например анализа с помощью связанного с ферментом иммуноабсорбента (ЕЫ8А), или радиоиммунологического анализа (К1А), или кинетического анализа (например, ВIАС0КЕ™ анализа).
Обычно константа диссоциации для СЭ38ВР, например анти-СО38 антител, согласно настоящему изобретению составляет меньше приблизительно 100 нМ, меньше приблизительно 50 нМ, меньше при
- 69 015584 близительно 10 нМ, приблизительно 5 нМ или менее, приблизительно 1 нМ или менее, приблизительно 0,5 нМ или менее, приблизительно 0,1 нМ или менее, приблизительно 0,01 нМ или менее или даже приблизительно 0,001 нМ или менее.
СЭ38ВР, например анти-СЭ38 антитела, согласно настоящему изобретению могут проявлять сходные функциональные характеристики, как -003, и -005, и -024, как можно определить с помощью анализа зависимой от антитела клеточной цитотоксичности (АЭСС) и опосредованной комплементом цитотоксичности (СЭС) (см., например, И8 55003б2).
В одном воплощении пептид согласно настоящему изобретению не действует как агонист СЭ38 или антагонист СЭ38. Агонист СЭ38 является молекулой, которая активирует одну или более функцию, приписываемую СЭ38. Такие функции могут включать опосредование рецептора в адгезии и процессах передачи сигнала и (экто-) ферментативную активность. Далее, в качестве эктофермента, СЭ38 применяет НАД' в качестве субстрата для образования циклической АДФ-рибозы (цАДФР) и АДФР, а также никотинамида и адениндинуклеотидфосфата никотиновой кислоты (НКАДФ). Показано, что цАДФР действует как вторичный мессенджер для мобилизации Са2' из эндоплазматического ретикулюма. Дополнительно к передаче сигнала через Са2+, передача сигнала с помощью СЭ38 происходит через взаимодействие (сговв-!а1к) с антиген-рецепторными комплексами на Т- и В-клетках или другими типами рецепторных комплексов, например МНС молекулами, и таким образом вовлечена в несколько клеточных ответов, а также в переключение и секрецию 1дС1.
В одном воплощении пептид согласно настоящему изобретению не индуцирует значительной пролиферации РМВС. В одном воплощении пептид согласно настоящему изобретению не индуцирует высвобождение значительных уровней 1Ь-б. В одном воплощении пептид согласно настоящему изобретению не индуцирует высвобождение детектируемых уровней ΙΕΚγ. Такие анализы можно проводить, как описано в Аи51е11о е! а1., Т1ввие апйдепв 5б, 538-547 (2000).
Анти-СО38 антитела согласно настоящему изобретению, а также другие СЭ38ВР согласно настоящему изобретению можно получать с помощью рекомбинантной экспрессии в любом подходящем типе клеток или животных.
Рекомбинантные СЭ38ВР, например рекомбинантные антитела, например рекомбинантные антитела человека, включают СЭ38ВР, например антитела, например антитела человека, которые получают, экспрессируют, создают или выделяют с помощью рекомбинантных способов, например СЭ38ВР, например антитела, например антитела человека, экспрессируемые с применением рекомбинантного экспрессирующего вектора, трансфицированного в клетку хозяина.
Рекомбинантные антитела, например рекомбинантные антитела человека, также включают антитела, выделенные из рекомбинантных комбинаторных библиотек антител человека, антитела, выделенные из животных, например трансгенных животных, или антитела, полученные, экспрессированные, созданные или выделенные любым способом, который выключает сплайсинг последовательностей нуклеиновых кислот, кодирующих иммуноглобулин человека, с другими последовательностями нуклеиновых кислот экзогенных для нуклеиновых кислот, кодирующих иммуноглобулин человека, и генов, кодирующих иммуноглобулин человека. Рекомбинантные антитела человека обычно имеют вариабельные и константные районы, произведенные из последовательностей иммуноглобулина зародышевых линий человека. В определенных воплощениях, однако, такие рекомбинантные антитела человека подвергают мутагенезу ш У1!го (или в случае применения животного, трансгенного для последовательностей иммуноглобулина человека, соматическому мутагенезу ш у1уо) и таким образом аминокислотные последовательности УН и Уь районов рекомбинантных антител могут быть последовательностями, которые будучи произведенными и родственными УН и Уъ последовательностям зародышевых линий человека, могут не существовать в природе в репертуарах антител зародышевых линий человека ш у1уо. Оба типа антител человека представлены настоящим изобретением.
Подходящие способы продукции рекомбинантных белков известны в данной области, см., например, 8атЬгоок апй Кивве11 (ейв.), Мо1еси1аг с1ошпд, 11чгй ейШоп, 2001, Со1й 8рппд НагЬог ЬаЬога!огу Ргевв, Со1й 8рппд НагЬог, №\ν Уогк, И8А.
Сходным образом, подходящие способы продукции антител известны в данной области и включают такие, описанные, например, в Наг1ого е! а1., Ап!1Ьой1ев: А ЬаЬога!огу Мапиа1, Со1й 8рппд НагЬог ЬаЬога!огу Ргевв, Со1й 8рппд НагЬог, КУ. (1988), Наг1ого апй Ьапе: Ивтд АпЕЬоФев: А ЬаЬога!огу Мапиа1 (Со1й 8рппд НагЬог ЬаЬога!огу Ргевв (1999)), И8 437б110 и АивиЬе1 е! а1., ейв., Сштеп! Рго!осо1в 1п Мо1еси1аг В1о1оду, Сгеепе РиЬИвЫпд Аввос, апй ^11еу 1п!ег8аепсе КУ. (1987, 1992). Мооклональные антитела можно получать с помощью гибридомных способов, описанных впервые в КоЫег е! а1., №11иге 25б, 495 (1975), или с помощью других хорошо известных впоследствии разработанных способов (см., например, Сойтд, Мопос1опа1 АпЕЬоФев: Рппс1р1ев апй РгасЕсе, р. 59-103 (Асайетк Ргевв, 198б)). Гибридомы полезны для продукции анти-СО38 антител согласно настоящему изобретению и также представлены настоящим изобретением. Такие гибридомы можно получать с помощью химического слияния, электрического слияния или любой другой подходящей техники с любым подходящим типом миеломы, гетеромиеломы, фобластоидной клетки, плазмацитомы или других их эквивалентов и любого подходящего типа клетки, экспрессирующей антитела. Трансформированные бессмертные В-клетки можно также применять для эф
- 70 015584 фективной продукции антител согласно настоящему изобретению и они также представлены настоящим изобретением. Такие клетки можно получать с помощью стандартных техник, например трансформации вирусом Эпштейн-Барра или трансформирующего гена (см., например, Сопйпиоиз1у РгойГегайпд ΗνιππΗΐ Се11. Ыпез 8уп111ез1/тд АпйЬобу о£ Ргебе!егт1пеб 8рес1йсйу, 2ига\уакк У.Я. е! а1., 1п Мопос1опа1 АпйЬоб1ез, еб. Ьу Кеппей Я.Ш е! а1., Р1епит Ргезз, ΚΥ. 1980, р. 19-33). Так, устойчивые и непрерывные и/или бессмертные клетки и клеточные линии, экспрессирующие анти-СЭ38 антитела, являются свойством настоящего изобретения. Эукариотические и прокариотические клетки (например, дрожжевые клетки, непрерывные и/или бессмертные линии клеток млекопитающих (например, клеточные линии производные лимфоидных продуцирующих антитела клеток), растительные клетки, клетки насекомых и бактериальные клетки, например, клетки Е.соК и т.д.), включающие СО38ВР-кодирующие или кодирующие фрагмент СЭ38ВР нуклеиновые кислоты, представлены настоящим изобретением. Трансгенные животные, например нечеловеческие приматы, грызуны (например, хомячки, морские свинки и крысы, включая их модифицированные штаммы, например мыши с агаммаглобулинемией швейцарского типа (8СГО) и другие иммуноотягощенные штаммы животных), собаки и т.д., экспрессирующие анти-СЭ38 антитела человека, также представлены настоящим изобретением.
Рекомбинантные клетки, включающие экзогенные нуклеиновые кислоты, кодирующие СЭ38ВР, можно получать с помощью любой подходящей техники (например, трансфекции/трансформации голой ДНК плазмидного вектора, вирусным вектором, вектором инвазивной бактериальной клетки и другими векторами целых клеток и т.д., включающими СЭ38ВР-кодирующую последовательность (или последовательности), доставляемые в клетку с помощью облегченной преципитации с фосфатом кальция, трансфекции, опосредованного рецептором нацеливания и трансфекции, биолистической доставки, электропорации, опосредованной декстраном трансфекции, опосредованной липосомами тансформации, слияния протопластов, прямой микроинъекции и т.д.). Способы трансформации/трансфекции клеток хорошо известны в данной области техники (см., например, 8атЬгоок е! а1., Мо1еси1аг С1ошпд: А ЬаЬога!огу Мапиа1, Со1б 8рппд Η-гЬог ЬаЬога!огу Ргезз (2б Ебйюп, 1989 апб 3гб Ебйюп, 2001) и Р. Аи5иЬе1 е! а1., еб. Сиггеп! Рго!осо1з т Мо1еси1аг Вю1оду, Сгеепе РиЬйзЫпд апб \νίΕν йкгЗаепсе Хе\ν Υо^к (1987)). Такие рекомбинантные клетки являются свойством настоящего изобретения.
Клеточные линии, доступные в качестве хозяев для экспрессии рекомбинантных белков, хорошо известны в данной области и включают много бессмертных клеточных линий, доступных в Американской коллекции типов культур (АТСС). Они включают т!ег айа клетки яичника китайского хомяка (СНО), N80, 8Р2 клетки, ^Ьа клетки, клетки почек карликового (ЬаЬу) хомяка (ВНК), клетки почки обезьяны (С08), клетки печеночно-клеточной карциномы человека (например, №р С2), А549 клетки и большое число других клеточных линий. Другими клеточными линиями, которые можно применять, являются линии клеток насекомых, например 8£9 клетки. Когда нуклеиновые кислоты (или содержащие нуклеиновые кислоты векторы), кодирующие белки, например СЭ38ВР (включая анти-СЭ38 антитела), вводят в клетки хозяина млекопитающего, белки, например СЭ38ВР, можно продуцировать посредством культивирования клеток хозяина в течение периода времени, достаточного для экспрессии белка, например СЭ38ВР, в клетках хозяина или для секреции белка, например СЭ38ВР в культуральную среду, в которой клетки хозяина растут. СЭ38ВР можно получить из культуральной среды с применением стандартных способов очистки белка. СЭ38ВР можно также выделить из лизатов клеток хозяина, когда они экспрессируются прямо без секреторного сигнала.
СЭ38ВР, например анти-СЭ38 антитела, можно также продуцировать в бактериальных клетках и эукариотических одноклеточных организмах, например дрожжах. Бактериальные клетки, продуцирующие СЭ38ВР, например анти-СЭ38 антитела, обычно лишены нормального гликозилирования и бактериальные клетки, продуцирующие анти-СЭ38 антитела, могут таким образом быть более или менее дефицитными в терминах АОСС функций и других аспектов иммунного ответа, связанного с анти-СЭ38 антителами, продуцируемыми в клетках млекопитающих и/или животных (например, привлечение ХК клеток). Дрожжевые клетки, продуцирующие СЭ38ВР, например анти-СЭ38 антитела, обычно проявляют другие типы гликозилирования, чем у антител, продуцированных в клетках млекопитающих. Однако способы продукции антител с эффективным гликозилированием в дрожжах в настоящее время развиваются такими компаниями, как С1усой, йс. (ЬеЬапоп, N4, И8А); см. также νίΗΐ 8. е! а1., №! Яеν МюгоЬю1. 3(2), 119-28 (2005).
Когда рекомбинантные экспрессирующие векторы, кодирующие гены СЭ38ВР (включая гены антиСЭ38 антител), вводят в клетку хозяина млекопитающего, СЭ38ВР продуцируют посредством культивации клеток хозяина в течение периода времени, достаточного для экспрессии СЭ38ВР в клетках хозяина или для секреции антитела в культуральную среду, в которой клетки хозяина растут. Очистки антител и других СЭ38ВР из клеточных культур, клеточных лизатов и животных (например, асцитной жидкости трансгенного животного, продуцирующего анти-СЭ38 антитела) можно осуществлять с приложением большого числа разных техник, известных в данной области, включая, например, очистку на иммуноаффинных колонках, осаждение сульфатом, хроматофокусировку, препаративный электрофорез (8Ό8РАСЕ) и т.п.
- 71 015584
Моноклональные антитела человека согласно настоящему изобретению можно также продуцировать с помощью разнообразных техник, включая общепринятую методологию моноклональных антител, например стандартную технику соматической гибридизации клеток по КоЫег апб М11к1е1п, №11иге 256, 495 (1975). Другие техники получения моноклональных антител также можно применять, например техники фагового дисплея с применением библиотек генов антител человека. В одном воплощении антиСЭ38 антитела согласно настоящему изобретению продуцируют с применением гибридомы, образованной в мышиной системе. Гибридомная продукция у мыши является общепринятой процедурой. Протоколы иммунизации и техники выделения иммунизированных клеток селезенки для слияния известны в данной области техники. Партнеры слияния (например, клетки миеломы мыши) и процедура слияния также известны.
Для получения целиком человеческих моноклональных антител к СЭ38 можно иммунизировать трансгенных или трансхромосомных мышей, содержащих гены иммуноглобулинов человека (например, НСо12, НСо7 или КМ мышей) обогащенным препаратом СЭ38 антигена и/или клеток, экспрессирующих СО38, как описано, например, в ЬопЬегд е! а1. (1994), кирга, Е1кйМ1б е! а1. (1996), кирга и \УО 98/24884. Альтернативно, мышей можно иммунизировать ДНК, кодирующей СЭ38 человека. Мыши могут быть 616 недель от роду во время первой инфузии. Например, обогащенный препарат (5-50 мкг) СЭ38 антигена можно применять для иммунизации НиМАЬ мышей внутрибрюшинно. В том случае, если иммунизация с применением очищенного или обогащенного препарата СЭ38 антигена не приводит к выработке антител, мышей можно также иммунизировать клетками, экспрессирующими СЭ38, например клеточной линией, для ускорения иммунных ответов.
Накопительный опыт с различными антигенами показал, что НиМАЬ трансгенные мыши отвечают наилучшим образом, когда вначале иммунизированы внутрибрюшинно (1.р.) или подкожно (к.с.) экспрессирующими СЭ38 клетками в полном растворителе Фрейнда (Егеипб'к абщтагИ) с последующими 1.р. иммунизациями через неделю (всего до 10) СЭ38 экспрессирующими клетками в РВ8. За иммунным ответом можно следить по ходу протокола иммунизации с помощью образцов плазмы, полученных посредством ретроорбитального кровотечения. Плазму можно подвергать скринингу с помощью ЕАС8 анализа, и мышей с достаточным титром анти-СЭ38 иммуноглобулина человека можно применять для слияния. Мышей можно стимулировать внутривенно СО38-экспрессирующими клетками, например, в течение 4 и 3 дней до забивания и удаления печени.
Для получения гибридом, продуцирующих моноклональные антитела к СЭ38 человека клетки селезенки и клетки лимфатического узла от иммунизированных мышей, можно изолировать и соединять к подходящей бессмертной клеточной линией, например линией клеток мышиной миеломы. Образующиеся гибридомы можно затем подвергать скринингу на продукцию антиген-специфичных антител. Например, суспензии одиночных клеток селезеночных лимфоцитов из иммунизированных мышей можно соединить с 8Р2/0 несекретирующими клетками миеломы мыши (АТСС, СКЬ 1581) с помощью 50% ПЭГ (вес/объем). Клетки можно рассадить при приблизительно 1х105 на ячейку на плоскодонную микротитровую плату с последующей инкубацией в течение двух недель в селективной среде, содержащей помимо обычных реагентов 10% сыворотки клона плода, 5-10% оригинального фактора клонирования гибридомы (ЮЕ№) и 1Х НАТ (81дта). Через приблизительно две недели клетки можно культивировать в среде, в которой НАТ заменен на НТ. Отдельные ячейки можно затем подвергать скринингу с помощью ЕЫ8А на антитела, содержащие каппа-легкую цепь человека и с помощью ЕАС8 анализа, применяя СО38-экспрессирующие клетки на СЭ38 специфичность. Как только происходит обширный рост гибридомы, среду можно проверять обычно через 10-14 дней. Секретирующие антитела гибридомы можно пересевать, снова подвергать скринингу и при условии сохранения положительности относительно человеческих иммуноглобулинов, можно субклонировать анти-СЭ38 моноклональные антитела по меньшей мере дважды с помощью ограниченного разведения. Устойчивые субклоны можно затем культивировать 1п νίϋΌ для получения антитела в среде культуры ткани для характеризации.
Антитела человека согласно настоящему изобретению можно также продуцировать в клетке хозяина трансфектомы, применяя, например, комбинацию рекомбинантных техник ДНК и способов трансфекции генов, как хорошо известно в данной области, см., например, Моткоп, 8., 8с1епсе 229, 1202 (1985).
Например, для экспрессии антител или фрагментов антител ДНК, кодирующие части или полноразмерные тяжелую и легкую цепи, можно получать с помощью стандартных техник молекулярной биологии (например, ПЦР амплификации, направленного мутагенеза) и можно вставлять в экспрессирующие векторы, так что гены оказываются оперативно связанными с последовательностями контроля транскрипции и трансляции. В этом контексте термин оперативно связан означает, что ген антитела легирован в вектор так, что последовательности транскрипционного и трансляционного контроля вектора выполняют функции, для которых они предвведены, в регуляции транскрипции и трансляции гена антитела. Экспрессирующий вектор и последовательности контроля экспрессии выбирают так, чтобы они были совместимы с клеткой хозяина, применяемой для экспрессии. Ген легкой цепи антитела и ген тяжелой цепи антитела можно помещать в раздельные векторы или, более типично, оба гена помещают в один и тот же экспрессирующий вектор. Гены антител можно вставлять в экспрессирующий вектор с помощью стандартных способов (например, легирования комплементарных участков рестрикции во
- 72 015584 фрагмент гена антитела и вектор или легирования тупых концов, если нет участков рестрикции). Вариабельные районы легкой и тяжелой цепей антител, описанные здесь, можно применять для создания полноразмерных генов антител любого изотипа антитела посредством вставки их в экспрессирующие векторы, которые уже кодируют константный район тяжелой цепи и константный район легкой цепи нужного изотипа, например, Ун сегмент оперативно связан с Сн сегментом(ами) внутри вектора и Уъ сегмент оперативно связан с Сь сегментом внутри вектора. Дополнительно или альтернативно, рекомбинантный экспрессирующий вектор может кодировать сигнальный пептид, облегчающий секрецию цепи антитела из клетки хозяина. Ген цепи антитела можно клонировать в вектор, так что сигнальный пептид связан в рамке считывания с аминоконцом гена цепи антитела. Сигнальный пептид может быть сигнальным пептидом иммуноглобулина или гетерологичным сигнальным пептидом (например, сигнальный пептид из неиммуноглобулинового белка).
В дополнение к генам цепей антитела рекомбинантные экспрессирующие векторы согласно настоящему изобретению несут регуляторные последовательности, которые позволяют контролировать экспрессию генов цепей антитела в клетке хозяина.
В дополнение к генам цепей антитела и регуляторным последовательностям рекомбинантные экспрессирующие векторы согласно настоящему изобретению могут нести дополнительные последовательности, например последовательности, регулирующие репликацию вектора в клетке хозяина (например, начало репликации) и гены маркеров отбора. Гены маркеров отбора облегчают селекцию клеток хозяина, в который вектор попал (см., например, И8 4399216, И8 4634665 и И8 5179017). Например, обычно гены маркеров отбора придают устойчивость к лекарствам, например О418, гигромицину или метотрексату у клетки хозяина, в которую ввели вектор. Примеры генов маркеров отбора включают ген дигидрофолатредуктазы (ИнРЯ) (для применения в бНГг-клетке хозяина при селекции с помощью с метотриксата/амплификации) и ген нео (пео) (для селекции с С418).
Для экспрессии легкой и тяжелой цепей экспрессирующие векторы, кодирующие тяжелую и легкую цепи, трансфицируют в клетку хозяина с помощью стандартных техник. Клетки хозяина могут быть прокариотическими или эукариотическими клетками хозяина, например клетками млекопитающих. Например, антигенсвязывающие фрагменты можно экспрессировать в прокариотических клетках хозяина и полноразмерные антитела можно экспрессировать в эукариотических клетках хозяина.
В одном воплощении антитела экспрессируют в эукариотических клетках хозяина, например клетках млекопитающих. Примеры клеток хозяина млекопитающего для экспрессии рекомбинантных антител согласно настоящему изобретению включают клетки СНО (включая б11Гг-СИ0 клетки, описанные в Иг1аиЬ апб СНаЛи РNА8 И8А 77, 4216-4220 (1980), применяемые с маркером селекции ИнРЯ, например, как описано в ЯЛ. КаиГтап апб Р.А. 8йагр, Мо1. Вю1. 159, 601-621 (1982)), N8/0 клетки миеломы, С08 клетки, нЕК293 клетки и 8Р2.0 клетки. В частности, для применения с N8/0 клетками миеломы другим примером системы экспрессии является система экспрессии гена О8 (глутамин синтетазы), как раскрыто в У0 87/04462, У0 89/01036 и ЕР 338841.
Гены СИ38ВР можно экспрессировать в других системах экспрессии, включая прокариотические клетки, например микроорганизмы, например Е.со11 для продукции 8сРν антител, водоросли, а также клетки насекомых. Далее, СИ38ВР можно продуцировать в трансгенных животных, отличных от человека, например в молоке овец или кроликов или в куриных яйцах, или в трансгенных растениях; см., например, Уегта, Я. е! а1., 1. Iттиηο1. Ме111. 216, 165-181 (1998), Ро11оск е! а1., 1. Iттиηο1. Ме111. 23, 1., 147157 (1999) и Р18сЬег, Я. е! а1., Вю1. СНет. 380, 825-839 (1999).
Биспецифичные и мультиспецифичные СИ38ВР согласно настоящему изобретению можно получать с помощью химических способов (см., например, И.М. Кгапх е! а1., РNА8 И8А 78, 5807 (1981)), техник полидомы (см. и8 4474893) или техник рекомбинантных ДНК.
Биспецифичные антитела согласно настоящему изобретению можно получать с помощью разнообразных известных способов, включая слияние гибридом или связывание РаЬ’ фрагментов (см., например, 8опд§М1а1 & ЬасНтапп, С1т. Ехр. Iттиηο1. 79, 315-321 (1990) и Койе1пу е! а1., 1. Iттиηο1. М8, 15471553 (1992)). Традиционно, рекомбинантная продукция биспецифичных антител основана на коэкспрессии двух пар тяжелой цепи и легкой цепи иммуноглобулина, где у двух тяжелых цепей разные специфичности (см., например, М1Ыет апб Сие11о, №1иге 305, 537 (1983)). Из-за случайного объединения тяжелых и легких цепей такие гибридомы (квадромы) потенциально продуцируют смесь из 10 различных молекул антител, среди которых только одна обладает правильной биспецифичной структурой. Сходные процедуры раскрыты в ν0 93/08829 и Тгаипескег е! а1., ЕМВ0 1. 10, 3655 (1991).
Согласно другому подходу вариабельные домены антител с нужными специфичностями связывания (участками, комбинирующими антитело и антиген) соединены с последовательностями константных районов иммуноглобулина с помощью рекомбинантных или химических способов. Последовательность вариабельного домена обычно соединена с константным доменом тяжелой цепи иммуноглобулина, включающим по меньшей мере часть связки, Сн2 и Сн3 районами. Обычно также, что первый константный район тяжелой цепи (Сн1), содержащий участок, необходимый для связывания легкой цепи, также присутствует по меньшей мере в одном составном пептиде. В более специфическом примере подхода такого типа продуцируется биспецифичное антитело, включающее гибрид тяжелой цепи иммуноглобу
- 73 015584 лина с первой специфичностью связывания на одной руке и гибридную пару из тяжелой цепи и легкой цепи иммуноглобулина (предоставляющую вторую специфичность связывания) на другой руке. Такая асимметричная структура может облегчить отделение нужного биспецифичного соединения от нежелательных комбинаций цепей иммуноглобулина (например. как описано в \У0 94/04690). Более детальное описание получения биспецифичных антител см.. например. в 8игекй е! а1.. Ме!1ойк ш Епхуто1оду 121. 210 (1986).
При другом подходе поверхность контакта между парой молекул антител может быть построена так. чтобы сделать наибольшим процент гетеродимеров. которые находятся в культуре рекомбинантной клетки. чтобы образовать популяцию молекул биспецифичных антител. Обычно такая поверхность контакта включает по меньшей мере часть Сц3 домена константного района антитела. Обычно по такому способу один или более аминокислотный остаток с меньшим размеров боковой цепи с поверхности контакта молекулы первого антитела замещают аминокислотным остатком с боковой цепью большего размера (например. тирозином или триптофаном). Соответствующие пазы. идентичные или близкие по размеру большим боковым цепям аминокислотных остатков. создаются на поверхности контакта второй молекулы антитела посредством замещения аминокислотных остатков с большими боковыми цепями на меньшие (например. аланин или треонин). Это может предоставить механизм увеличения выхода гетеродимеров относительно других ненужных конечных продуктов. например гомодимерами.
Биспецифичные и мультспецифические молекулы согласно настоящему изобретению можно получать посредством конъюгации специфичностей связывания компонент. например анти-БсК и анти-СЭ38 специфичностей связывания. с помощью способов. известных в данной области. Например. каждую специфичность связывания биспецифичных и мультиспецифичных молекул можно получить по отдельности и затем конъюгировать друг с другом. Когда специфичности связывания осуществляются белками или пептидами. можно применять большое разнообразие сопрягающих или сшивающих агентов для ковалентной конъюгации. Примеры сшивающих агентов включают белок А. карбодиимид. N-сукцинимидил-8-ацетилтиоацетат (8АТА). 5.5'-дитио-бис-(2-наторбензойная кислота) (ОТЫВ).
о-фенилендималеимид (оРЭМ). N-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио)пропионат (8РЭР) и сульфосукцинимидил-4-(Я-малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилат (ки1Го-8МСС). см.. например. Кагроукку е! а1.. I. Ехр. Мей. 160. 1686 (1984). Ью. М.А. е! а1.. РNА8 И8А 82. 8648 (1985). В другом примере Вгеппап е! а1.. 8с1епсе 229. 81 (1985) описывают способ. где интактные антитела протеолитически расщепляют с получением Б(аЬ')2 фрагментов. Эти фрагменты восстанавливают в присутствии комплексующего дитиол агента арсенита натрия. чтобы стабилизировать соседние дитиолы и предотвратить образование внутримолекулярных дисульфидных связей. Полученные БаЬ' фрагменты можно затем превратить в тионитробензоатные (Т№В) производные. Одно из БаЬ'-ТМВ производных можно затем превратить опять в БаЬ'тиол посредством восстановления меркаптоэтиламином и смешать с эквимолярным количеством другого БаЬ'-Т№В производного с образованием биспецифичного антитела. 8йа1аЬу е! а1.. Р Ехр. Мей. 175. 217225 (1992) описывает продукцию молекулы целиком гуманизированного биспецифичного антитела Б(аЬ')2 согласно сходному способу. Другие способы включают описанные в Раи1ик (Вейппд йъ. М1й. №. 78. 118-132 (1985)) и 61епше е! а1.. I. Тттипо1. 139. 2367-2375 (1987). Примерами конъюгирующих агентов являются 8АТА и ки1Го-8МСС. оба доступные у Р1егсе Сйетка1 Со. (КоскГогй. ГЬ).
Когда специфичности связывания проявляются антителами. они могут быть конъюгированы через сульфгидрильные группы С-концевых районов связки на двух тяжелых цепях. В одном воплощении район связки модифицирован до конъюгации. чтобы содержать нечетное число сульфгидрильных групп. например одну.
Альтернативно. обе специфичности связывания могут кодироваться одним и тем же вектором и экспрессироваться и собираться в одной и той же клетке хозяина. Этот способ особенно применим. когда биспецифичные и мультипецифичные молекулы являются тАЬхтАЬ. тАЬхБаЬ. БаЬхБ(аЬ')2 или лигандхБаЬ составным белком.
Биспецифичные и мультипецифичные молекулы согласно настоящему изобретению могут быть одноцепочечной молекулой. например одноцепочечным биспецифичным антителом. одноцепочечной биспецифичной молекулой. включающей одно одноцепочечное антитело и связывающую детерминанту. или одноцепочечной биспецифичной молекулой. включающей две связывающие детерминанты. Биспецифичные и мультипецифичные молекулы могут также быть одноцепочечными молекулами или могут включать по меньшей мере две одноцепочечные молекулы. Способы получения би- и мультиспецифичных молекул описаны. например. в И8 5260203. И8 5455030. И8 4881175. И8 5132405. И8 5091513. И8 5476786. И8 5013653. И8 5258498 и И8 5482858.
Различные техники получения и выделения биспецифичных фрагментов антител прямо из культур рекомбинантных клеток также описаны. Например. биспецифичные антитела можно получать с помощью лещиновой застежки (см.. например. Кок!е1пу е! а1.. I. Iттипо1. 148(5). 1547-1553 (1992)). Пептиды лейциновой застежки из Бок и Л1п белков связывают с БаЬ' частями двух различных антител посредством соединения генов. и получающиеся гомодимеры антител восстанавливают в районе связки с образованием мономеров. которые можно опять окислить с образованием гетеродимеров антитела. Технология
- 74 015584 диатела, описанная Ηο11ίη^Γ е! а1., ΡΗΛ8 И8А 90, 6444-6448 (1993), также представляет альтернативный механизм получения биспецифичных фрагментов антитела. Другая стратегия получения биспецифичных фрагментов антитела с применением одноцепочечных Ρν (κΡν) димеров также описана; см., например, СгиЬег е! а1., I. Iттиηο1. 152, 5368 (1994).
К тому же, биспецифичные антитела можно образовывать как диатела (Ηο11ί^Γ е! а1., ΡNА8 И8А, 90, 6444-6448 (1993)) или Янусины ('ЧашБШБ) (Тгаипескег е! а1., ΞΜΒ0 I. 10, 3655-3659 (1991) и Тгаипескег е! а1., Ιη! I. Сапсег 8ирр1. 7, 51-52 (1992)). Биспецифичные антитела по определению не существуют в форме фрагментов, обладающих одиночным участком связывания (например, РаЬ, РаЬ' и Ρν фрагменты, которые также представлены настоящим изобретением).
Связывание биспецифичных и мультиспецифичных молекул с их специфическими мишенями можно подтверждать с помощью связанного с ферментом иммуносорбентного анализа (ЕЫ8А), радиоиммуноанализа (К1А), РАС8 анализа, биоанализа (например, ингибирования роста) или блоттинга (^е§!ет Β1ο! Аккау). Каждый из этих аналитических подходов в основном детектирует присутствие искомых комплексов белок-антитело с помощью метящего реагента (например, антитела), специфичного для искомого комплекса. Например, комплексы РсК-антитело можно детектировать с помощью, например, связанного с ферментом антитела или фрагмента антитела, который узнает и специфически связывается с комплексами РсК-антитело. Альтернативно, комплексы можно детектировать с помощью большого числа других иммуноанализов. Например, антитело можно радиоактивно пометить и применять в радиоиммуноанализе (ΡΙΛ) (см., например, ^ет!гаиЬ, В., ΡπικίρΕκ οί Ваб^ο^ттиηοаккаук, 8еуен1к Тгаиипд Сбитее οη Ваб^οЬдаηб Аккау ТесЬтциек, ТЬе Βη6ο^^ δο^Μ МагсЬ, 1986). Радиоактивный изотоп можно детектировать такими способами, как γ-счетчик или сцинтилляционный счетчик или ауторадиография.
Как утверждалось выше, антитела взаимодействуют с мишенями антигенами первично через аминокислотные остатки, находящиеся в шести районах тяжелых и легких цепей, определяющих комплементарность (СЭВ). Настоящее изобретение представляет антитела, обладающие СЭВ районами, идентичными или производными СЭК районов -003, или -005, или -024. Такие антитела можно получать посредством конструкции экспрессирующих векторов, включающих последовательности СЭК из -003, или -005, или -024, помещенные в каркасные последовательности из различных антител с различными свойствами.
Такие каркасные последовательности можно получить из общедоступных баз данных, включающих последовательности генов антител зародышевых линий. Эти последовательности зародышевых линий отличаются от зрелых последовательностей генов антител, потому что они не включают полностью собранные вариабельные гены, которые образуются посредством ν(Ό)ί соединения во время созревания Вклеток. Последовательности зародышевых линий также отличаются от последовательностей вторичного набора антитела высокого сродства, которые содержат мутации по всему вариабельному гену, но обычно расположенные кластерами в СЭК. Например, соматические мутации относительно редки в аминоконцевом отделе каркасного района 1 и в карбоксиконцевом отделе каркасного района 4. По этой причине не требуется получать всю последовательность ДНК данного антитела, чтобы воссоздать интактное рекомбинантное антитело, обладающее связывающими свойствами, сходными с исходным антителом (см. XV0 99/45962). Частичные последовательности тяжелой и легкой цепи, охватывающие СЭК районы, обычно достаточны для этой цели. Неполная последовательность применяется для определения того, какие вариабельные и соединительные сегменты гена зародышевые линии вносят вклад в вариабельные гены рекомбинантного антитела. Последовательности зародышевой линии затем применяются для заполнения пустующих участков в вариабельных районах. Лидерные последовательности тяжелой и легкой цепи отщепляются при созревании белка и не вносят вклада в свойства конечного антитела. Чтобы добавить отсутствующие последовательности, клонированные последовательности кДНК можно комбинировать с синтетическими олигонуклеотидами посредством лигирования или ПЦР амплификации. Альтернативно, весь вариабельный район можно синтезировать в виде набора коротких перекрывающихся олигонуклеотидов и комбинировать с помощью ПЦР амплификации для создания клона целиком синтетического вариабельного района. Этот процесс отличается определенными преимуществами, например удалением или введением отдельных участков рестрикции или оптимизацией отдельных кодонов.
Нуклеотидные последовательности транскриптов тяжелой и легкой цепей из гибридом применяют для создания набора перекрывающихся синтетических олигонуклеотидов для создания синтетических У последовательностей с возможностями кодирования аминокислот идентичными природным последовательностям. Синтетические последовательности тяжелой и каппа цепи могут отличаться от природных последовательностей по трем пунктам: протяженности повторяющихся нуклеотидных оснований прерваны, чтобы облегчить синтез олигонуклеотидов и ПЦР амплификацию; включены участки оптимальной инициации трансляции согласно правилам Козака (ΚοζηΚ ί. Βίο1. СЬет. 266, 19867-19870 (1991)); и Ηίη6ΙΙΙ участки вставлены выше участков инициации трансляции.
Для вариабельных районов как тяжелой, так и легкой цепей оптимизированные кодирующие и соответствующие некодирующие цепочки последовательностей разорваны на 30-50 нуклеотидов приблизительно в средней точке соответствующего некодирующего олигонуклеотида. Таким образом, для каж- 75 015584 дой цепи олигонуклеотиды могут собраться в перекрывающиеся двухцепочечные наборы, которые охватывают сегменты из 150-400 нуклеотидов. Набор затем применяют в качестве матриц для получения продукта РЦР амплификации из 150-400 нуклеотидов. Обычно один набор одноцепочечных олигонуклеотидов вариабельного района разбивают на две части, которые раздельно амплифицируют для получения двух перекрывающихся ПЦР продуктов. Такие перекрывающиеся продукты затем комбинируют посредством ПЦР амплификации для образования полного вариабельного района. Может быть также желательно включить перекрывающийся фрагмент константного района тяжелой или легкой цепи (включая ВЬП участок каппа легкой цепи или АдО участок гамма тяжелой цепи) в ПЦР амплификации для получения фрагментов, которые легко клонировать в конструкции экспрессирующих векторов.
Реконструированные вариабельные районы тяжелой и легкой цепи затем комбинируют с последовательностями клонированного промотора, лидера, инициации трансляции, константного района, 3'нетранслируемого участка, участка полиаденилирования и терминации транскрипции для образования конструкций экспрессирующего вектора. Экспрессирующие конструкции тяжелой и легкой цепи можно комбинировать в одиночном векторе, котрансфицировать, серийно трансфицировать или раздельно трансфицировать в клетки хозяина и затем объединить для образования клетки хозяина, экспрессирующей обе цепи.
Можно применять сходную процедуру, чтобы привить новую специфичность к антигену на существующее зрелое мышиное антитело. Обычно выбирают антитело акцептор, которое происходит из того же вариабельного гена зародышевой линии, как и СЭВ-донорное антитело, но другие акцепторные антитела тоже можно выбирать. Один или более СЭВ из донорного антитела затем переносят с применением техники, описанной выше.
В одном воплощении настоящего изобретения структурные свойства -003, и -005, и -024 применяют для создания структурно родственных анти-СЭ38 антител, например анти-СЭ38 антител человека, которые сохраняют по меньшей мере одно функциональное свойство -003, и -005, и -024, а именно связывание с СЭ38. Более специфично, один или более СЭВ район -003, или -005, или -024 можно комбинировать рекомбинантным способом с известными каркасными районными человека и СЭВ для создания дополнительных, созданных рекомбинантным способом, анти-СЭ38 антител человека согласно настоящему изобретению.
Примеры плазмид для применения в конструкции экспрессирующих векторов для ΙβΟκ человека описаны ниже. Плазмиды сконструированы так, что амплифицированные с помощью ПЦР кДНК последовательности У каппа тяжелой цепи и У каппа легкой цепи можно применять для реконструкции полных минигенов тяжелой и легкой цепи. Такие плазмиды можно применять для экспрессии полностью человеческих Ι§Ο1,κ или Ι§Ο4,κ антител. Сходные плазмиды можно конструировать для экспрессии других изотипов тяжелой цепи или для экспрессии антител, включающих лямбда легкие цепи.
СЭ38ВР согласно настоящему изобретению, например анти-СЭ38 антитела человека, согласно настоящему изобретению можно изолировать и характеризовать с помощью большого числа различных способов. Например, выбранные гибридомы можно выращивать в подходящих флаконах для очистки моноклональных антител. Супернатанты можно затем фильтровать и концентрировать перед афинной хроматографией с протеин-А-сефарозой (для антител изотипа Ι§61) (Рйагтааа, Р1кса!а^ау, N1) или покрытой противочеловеческим Ι§Ο сефарозой или протеин-С-сефарозой в случае антител изотипа Ι§Ο3. Элюированные ΙβΟ можно поверять с помощью гель-электрофореза и жидкостной хроматографии высокого разрешения для обеспечения чистоты. Буферный раствор можно заменить на РВ8 и концентрацию можно определять по 0Э280 применяя коэффициент экстинкции 1.43. Моноклональные антитела можно разделить на аликвоты и хранить при -80°С.
Чтобы определить, связываются ли выбранные СЭ38ВР, например анти-СЭ38 моноклональные антитела человека с уникальными эпитопами, можно применять сайт-направленный или мультисайтнаправленный мутагенез.
Для определения изотипа очищенного антитела можно проводить изотип ЕЫ8А. Ячейки микротитровых плат можно покрывать 10 мкг/мл античеловеческого Ιβ в течение ночи при 4°С. После блокирования 5% БСА (бычьим сывороточным альбумином) платы подвергают реакции с 10 мкг/мл моноклональных антител или очищенного изотипа контроля при комнатной температуре в течение 2 ч. Ячейки можно затем подвергать реакции с ΙβΟ1, ΙβΟ2, ΙβΟ3 или ΙβΟ4, ΙβΕ, ^АЕ IдА2 человека или со специфическими к ^М человека пробами, конъюгированными со щелочной фосфатазой. После промывки платы проявляют с помощью р№Р субстрата (1 мг/мл) и анализируют по оптическому поглощению при 405 нм.
Для демонстрации присутствия анти-СЭ38 антител в сыворотке иммунизированной мыши или связывания СЭ38ВР (включая анти-СЭ38 антитела) с живыми клетками, экспрессирующими СЭ38, можно применять проточную цитометрию. Вкратце, клеточные линии, экспрессирующие СЭ38 (выращенные в стандартных условиях роста), смешивают с различными концентрациями СЭ38ВР в РВ8, содержащем 0,1% БСА и 0,02% азида натрия и инкубируют при 4°С в течение 30 мин. После промывки клетки подвергают реакции с меченым флуоресцеином античеловеческим Ι§Ο антителом в тех же условиях, как взаимодействие с первичным антителом. Примеры можно анализировать с помощью проточной цито
- 76 015584 метрии, применяя проточный цитометр (например, Вес!оп Бюкткоп РАС8 ткйишеп!), применяя свет и свойства бокового светорассеяния для настройки прибора на одиночную живую клетку. В качестве альтернативного анализа можно применять флуоресцентную микроскопию дополнительно или вместо проточной цитометрии. Клетки можно окрашивать точно так, как описано выше, и анализировать с помощью флуоресцентной микроскопии. Этот способ позволяет наблюдать отдельные клетки, но обладает уменьшенной чувствительностью в зависимости от плотности антигена.
СБ38ВР, например анти-СБ38 ^С человека, можно далее тестировать на реактивность с СБ38 антигеном с помощью блоттинга. Вкратце, клеточные экстракты из клеток, экспрессирующих СБ38, можно получать и подвергать электрофорезу в полиакриламидном геле с ДСН. После электрофореза, разделенные антигены переносят на нитроцеллюлозные мембраны, блокируют 20% нежирным молоком и тестируют с СБ38ВР. Связывание ЛС человека можно детектировать с применением античеловеческого !дС со щелочной фосфатазой и проявлять с помощью таблетированного субстрата ВС'ЧР^ВТ (81§ша СЬеш. Со., 8ΐ. Ьошк, МО), а также можно применять детектирующие агенты, направленные на другие специфические части СБ38ВР.
В дополнение к специфическому связыванию с СБ38 СБ38ВР (включая анти-СБ38 антитела человека) можно тестировать на их способность ингибировать различные активности клеток, экспрессирующих СБ38, например, но не ограничиваясь этим, продукцию инсулина, высвобождение Са2+, продукцию цитокинов, индукцию лизиса и пролиферации.
В одном воплощении настоящее изобретение представляет трансгенных и трансхромосомных животных, отличных от человека, например трансгенных и трансхромосомных мышей, способных экспрессировать антитела человека, которые специфически связываются с СБ38. В отдельном воплощении настоящее изобретение представляет трансгенную или трансхромосомную мышь, обладающую геномом, включающим трансген тяжелой цепи человека, так что мышь продуцирует анти-СБ38 антитела при иммунизации клетками, экспрессирующими СБ38. Трансген тяжелой цепи человека может быть интегрирован в хромосомную ДНК мыши, как в случае трансгенных, например НиМАЬ мышей, как детально описано здесь. Альтернативно, трансген тяжелой цепи человека можно поддерживать внехромосомно, как в случае трансхромосомных мышей (например, КМ), как описано в \У0 02/43478. Такие трансгенные и трансхромосомные животные способны продуцировать множественные изотипы моноклональных антител человека к СБ38 (например, ^С, !дА и/или Ι§Ε), претерпевая У-Э-1/У-1 рекомбинацию и переключение изотипов. Создание трансгенных и трансхромосомных животных, отличных от человека, которые отвечают на стимуляцию чужеродным антигеном, продуцируя гетерологичный набор антител, требует, чтобы трансгены гетерологичных иммуноглобулинов, содержащиеся внутри трансгенного животного, функционировали правильно по ходу развития В-клеток. Это включает, например, переключение изотипа трансгена гетерологичной тяжелой цепи человека. Соответственно трансгены построены так, чтобы переключение изотипа можно было индуцировать и проявлялась одна или более из следующих характеристик генов антитела: (1) высокий уровень и специфичная к типу клетки экспрессия, (2) перестройка функционального гена, (3) активация ответа на исключение аллели, (4) экспрессия достаточного первичного набора, (5) передача сигнала, (6) соматическая гипермутация и (7) преобладание локуса трансгенного антитела во время иммунного ответа.
Не все из вышеперечисленных критериев надо выполнять. Например, в таких воплощениях, где локусы эндогенного иммуноглобулина трансгенного животного функционально нарушены, трансгену не надо активировать исключение аллеля. Далее, в таких воплощениях, когда трансген включает функционально перестроенный ген тяжелой и/или легкой цепи иммуноглобулина, второй критерий функциональной перестройки гена не является обязательным, по крайней мере, для такого трансгена, который уже перестроен. Основы молекулярной иммунологии см. в Рипбашеп!а1 ^шипо^^у, 2пб ебйюп (1989), Раи1 ^1Шаш Е., еб. Ка\'еп Ргекк, ΚΥ.
В некоторых воплощениях трансгенные или трансхромосомные животные, отличные от человека, применяемые для получения моноклональных антител человека согласно настоящему изобретению, содержат перестроенные, неперестроенные и комбинацию перестроенных и неперестроенных трансгенов тяжелой и легкой цепи гетерологичных иммуноглобулинов в зародышевой линии трансгенных животных. Каждый из трансгенов тяжелой цепи включает по меньшей мере один СН ген. Дополнительно, трансген тяжелой цепи может включать последовательности функционального переключения изотипа, способные поддерживать переключение изотипа гетерологичного трансгена, кодирующего множественные СН гены в В-клетках трансгенного животного. Такие последовательности переключения могут быть таковыми, встречающимися естественным образом в локусе иммуноглобулина зародышевой линии из видов, служащих источником трансгенных СН генов, или такие последовательности переключения могут быть произведены из таковых, встречающихся у видов, которые должны получить трансгенную конструкцию (трансгенных животных). Например, конструкция трансгена человека, которая применяется для получения трансгенной, может давать более высокую частоту событий переключения изотипа, если она включает последовательности переключения, сходные с таковыми, встречающимися в природе в локусе тяжелой цепи мыши, поскольку очевидно, что мышиные последовательности переключения оптимизированы для работы с мышиной системой рекомбиназных ферментов переключения, в то время как по
- 77 015584 следовательности переключения человека - нет. Последовательности переключения можно выделять и клонировать с помощью общепринятых способов или можно синтезировать йе ΐ'ίονο из перекрывающихся синтетических олигонуклеотидов, созданных на основе опубликованной информации о последовательностях, относящейся к последовательностям районов переключения иммуноглобулинов (МШв е! а1., Кис1. Ас1йв Вее. 15, 7305-7316 (1991) 81йегав е! а1., Ш. Iттиηο1. 1, 631-642 (1989)). Для каждого из вышеперечисленных трансгенных животных трансгены функционально перестроенных гетерологичных тяжелой и легкой цепи иммуноглобулина обнаружены в значительной фракции В-клеток трансгенного животного (по меньшей мере 10%).
Трансгены, применяемые для получения трансгенных животных, отличных от человека, согласно настоящему изобретению включают трансген тяжелой цепи, включающий ДНК, кодирующую по меньшей мере один вариабельный сегмент гена, один сегмент разнообразия, один соединительный сегмент гена и по меньшей мере один сегмент константного района гена. Трансген легкой цепи иммуноглобулина включает ДНК, кодирующую по меньшей мере один вариабельный сегмент гена, один соединительный сегмент гена и по меньшей мере один сегмент константного района гена. Сегменты гена, кодирующие легкую и тяжелую цепи, являются гетерологичными для трансгенного животного, в котором они получены, или соответствуют ДНК, кодирующей сегменты гена легкой и тяжелой цепи из видов, не включающих трансгенное животное, отличное от человека. В одном воплощении настоящего изобретения трансген составлен так, что индивидуальные сегменты гена не перестроены, т. е. не перестроены так, чтобы кодировать функциональную легкую или тяжелую цепь иммуноглобулина. Такой неперестроенный трансген поддерживает рекомбинацию У, Ό и 1 сегментов гена (функциональную перестройку) и может поддерживать включение всего или части Ό района сегмента гена в получающуюся перестроенную тяжелую цепь иммуноглобулина у трансгенного животного при воздействии СЭ38 антигена.
В альтернативном воплощении трансгены включают неперестроенный минилокус. Такие трансгены обычно включают значительную часть С, Ό и 1 сегментов, а также поднабор сегментов У гена. В таких трансгенных конструкциях различные регуляторные последовательности, например промоторы, усилители, районы переключения классов, последовательности доноров при сплайсинге и акцепторов при сплайсинге для получения РНК, сигналы рекомбинации и т.п. включают соответствующие последовательности, произведенные из гетерологичных ДНК. Такие регуляторные последовательности могут быть включены в трансген из того же или родственного вида животного, отличного от человека, применяемого согласно настоящему изобретению. Например, сегменты гена иммуноглобулина человека можно комбинировать в трансгене с последовательностью усилителя из грызуна для применения в трансгенной мыши. Альтернативно, в трансген можно включать синтетические регуляторные последовательности, где такие синтетические регуляторные последовательности не являются гомологичными функциональной последовательности ДНК, которая, как известно, находится естественным образом в геноме млекопитающих. Синтетические регуляторные последовательности создаются согласно общепринятым правилам, например, содержащим допустимые последовательности участка акцептора при сплайсинге или мотив промотора/усилителя. Например, минилокус включает часть геномного локуса иммуноглобулина, обладающего по меньшей мере одной внутренней (например, не на конце части) делецией несущественной части ДНК (например, промежуточной последовательности, интрона или его части) по сравнению с встречающимся в природе локусом иммуноглобулина зародышевой линии.
Примеры трансгенных и трансхромосомных животных, отличных от человека, например мыши, проявляют продукцию иммуноглобулина со значительным разнообразием в идеале, в основном сходную с таковой у человека после приведения к объему.
Набор/разнообразие идеально приблизится к таковому, показанному у человека, когда после приведения к объему проявляет отклонение по меньшей мере приблизительно 10%, например 25-50% или более. Обычно продуцируется по меньшей мере тысяча разных иммуноглобулинов (в идеале ΙβΟ), например 104-106 или более в зависимости от числа различных У, 1 и Ό районов, введенных в геном мыши и управляемых дополнительного разнообразия, образованного перестройками У(-Э-)1 сегмента гена и случайными добавлениями нуклеотидов в районах соединения. Обычно иммуноглобулины проявляют сродство (Кй) для предварительно отобранных антигенов ниже 10-8 М, например ниже 10-9 М, 10-10 М или 10-11 М либо еще ниже. Трансгенные и трансхромосомные животные, отличные от человека, например мыши, как описано выше, могут быть иммунизированы, например, клетками, экспрессирующими СЭ38. Альтернативно, трансгенные животные могут быть иммунизированы ДНК, кодирующей СЭ38 человека. Животные при этом будут продуцировать В-клетки, которые претерпевают переключение класса посредством переключательной рекомбинации (^-переключение) и экспрессируют иммуноглобулины, реактивные с СЭ38. Иммуноглобулины являются антителами человека (называемыми также антитела последовательностей человека), где полипептиды тяжелой и легкой цепей кодируются последовательно стями трансгена человека, которые могут включать последовательности, произведенные посредством соматической мутации и рекомбинаторных присоединений У районов, а также последовательностями из зародышевой линии; такие антитела человека можно называть в основном идентичными полипептидной последовательности, кодируемой Уъ и 1ъ или Ун, Эн и 1н сегментами гена, даже если другие последовательности не из зародышевой линии могут присутствовать в результате соматической мутации и различ
- 78 015584 ных Υ-1 и Υ-Ό-Ι рекомбинационных соединений. Вариабельные районы каждой цепи антитела обычно по меньшей мере на 80% сходны с V и 1 сегментами генов зародышевой линии человека и в случае тяжелых цепей - V, Ό и 1 сегментами зародышевой линии человека; часто по меньшей мере на 85% сходны с последовательностями зародышевой линии человека, присутствующими в трансгене, часто на 90 или 95% сходны с последовательностями зародышевой линии человека, присутствующими в трансгене. Однако поскольку последовательности не из зародышевой линии включены посредством соматических мутаций и VI и Υ^^ соединения, антитела последовательностей человека часто будут иметь некоторые последовательности вариабельного района, которые не кодируются V, Ό или 1 сегментами гена человека, как обнаружено в трансгене(ах) человека в зародышевой линии мыши. Обычно такие последовательности не зародышевой линии (или отдельные положения нуклеотидов) группируются в или поблизости от СБВ или в районах, где, как известно, группируются соматические мутации.
Настоящее изобретение также представляет В-клетки, произведенные из трансгенных или трансхромосомных животных, как описано здесь. В-клетки можно применять для получения гибридом, экспрессирующих моноклональные антитела человека, которые связываются с высоким сродством (например, с константой диссоциации (Кб) ниже 10-8 М) с СБ38 человека. Так, в одном воплощении настоящее изобретение представляет гибридому, которая продуцирует антитела человека со сродством (Кб) ниже 10-8 М, например ниже 10-9 М, ниже 10-10 М или 10-11 М либо еще ниже при определении с помощью анализа Скэтчарда у клеток, экспрессирующих СБ38, с применением радиоактивно-меченого моноклонального антитела или с помощью определения полумаксимальной концентрации связывания с применением ΕАСδ анализа, или с помощью анализа с помощью поверхностного плазмонового резонанса, как измеряют с помощью прибора ВМсоге.
Настоящее изобретение представляет анти-СБ38 антитело, включающее последовательность легкой цепи человека, состоящую из (1) вариабельного района легкой цепи с полипептидной последовательностью, которая в основном идентична полипептидной последовательности, кодируемой ΎΕ сегментом гена человека и Е, сегментом человека и (2) константного района легкой цепи, кодируемого Съ сегментом гена человека и последовательность тяжелой цепи человека, состоящую из (1) вариабельного района тяжелой цепи с полипептидной последовательностью, которая в основном идентична полипептидной последовательности, кодируемой ¥Н сегментом гена человека, Ό районом и сегментом человека и (2) константного района, кодируемого СН сегментом гена человека. Следует заметить, что Ό гены человека могут быть значительно изменены посредством рекомбинаций и соматических мутаций, так что исходные последовательности зародышевой линии человека могут не быть легко узнаваемыми.
Развитие моноклональных антител человека с высоким сродством против СБ38 можно облегчить с помощью способа для расширения набора сегментов вариабельного района гена у трансгенных животных, отличных от человека, обладающих геномом, включающим интегрированный трансген иммуноглобулина человека, упомянутый способ включает введение в геном трансгена V гена, включающего сегменты гена V района, которые отсутствуют у упомянутого интегрированного трансгена иммуноглобулина человека. Часто трансген V района является дрожжевой искусственной хромосомой (ΥΛί'), включающей часть матрицы (аггау) ¥Н или V,, (¥К) сегментов гена человека, которая может присутствовать естественным образом в геноме человека или может быть объединена посредством сплайсинга с помощью рекомбинантных способов, которые могут включать неисправные или пропущенные V сегменты гена. Часто по меньшей мере пять или более функциональных V сегментов гена содержатся в ΥΛС. В этом варианте возможно сделать трансгенное животное, полученное с помощью способа расширения V набора, где животное экспрессирует цепь иммуноглобулина, включающую последовательность вариабельного района, кодируемую V районом сегмента гена, присутствующим в трансгене V района, и С районом, кодируемым трансгеном иммуноглобулина человека. С помощью способа расширения V набора можно получить трансгенных животных, обладающих по меньшей мере пятью различными V генами, а также животных, содержащих по меньшей мере приблизительно 24 V гена или больше. Некоторые V сегменты гена могут быть нефункциональными (например, псевдогены и т.п.); эти сегменты можно оставить или можно избирательно удалить с помощью рекомбинантных способов, доступных специалисту в данной области, если требуется.
Как только создана зародышевая линия мыши, содержащая функциональный ΥΛС, обладающий расширенным набором V сегмента, в основном отсутствующего в трансгене иммуноглобулина человека, содержащем I и С сегменты гена, эту черту можно распространить и размножить на других генетических фонах, включая фоны, где функциональный ΥΛС, обладающий расширенным набором V сегмента, размножают в зародышевой линии животного, отличного от человека, обладающего другим трансгеном иммуноглобулина человека. Множественные функциональные ΥΛС, обладающие расширенным набором V сегмента, можно размножить в зародышевой линии, чтобы работать с трансгеном иммуноглобулина человека (или множественными трансгенами иммуноглобулина человека). Хотя они здесь и называются ΥΛС трансгенами, такие трансгены при интеграции в геном могут в значительной степени утрачивать последовательности дрожжей, например последовательности, необходимые для автономной репликации в дрожжах, такие последовательности можно при необходимости удалить с помощью подходов генной инженерии, (например, переваривания рестриктазами и электрофореза в импульсном поле или других
- 79 015584 подходящих способов) после репликации в дрожжах они больше не требуются (например, перед введением в Εδ клетку мыши или мышиную прозиготу). Способы распространения признака экспрессии последовательности иммуноглобулина человека включают разведение трансгенных животных, несущих трансген(ы) иммуноглобулина человека, и при необходимости имеющие также функциональные УАС с расширенным набором У сегментов. Оба сегмента гена Уь и Ун могут присутствовать в УАС. Трансгенное животное можно разводить на любом фоне, выбранном практиком, включая фоны, несущие другие трансгены человека, включая трансген иммуноглобулина человека и/или трансгены, кодирующие другие белки лимфоцитов человека. Настоящее изобретение также представляет последовательность иммуноглобулина человека с высоким сродством, продуцируемого трансгенной мышью, несущей УАС трансген с расширенным набором У района. Хотя выше описано специфическое воплощение трансгенного животного согласно настоящему изобретению, также рассматриваются другие воплощения, классифицированные по трем категориям.
(1) Трансгенные животные, содержащие трансген иммуноглобулина с неперестроенной тяжелой и перестроенной легкой цепью.
(2) Трансгенные животные, содержащие трансген иммуноглобулина с неперестроенной тяжелой и неперестроенной легкой цепью.
(3) Трансгенные животные, содержащие трансген иммуноглобулина с перестроенной тяжелой и неперестроенной легкой цепью.
В одном воплощении настоящее изобретение представляет фармацевтическую композицию, включающую терапевтически активное количество СЭ38ВР согласно настоящему изобретению. Фармацевтические композиции могут быть составлены с фармацевтически приемлемыми носителями или разбавителями, а также с другими известными вспомогательными веществами и наполнителями в соответствии с общепринятыми способами, как раскрытые в Яешшд!оп: Тке δ^ι^ апй Ргасйсе о£ Ркагтасу, 191к Ей1!1оп, Сеппаго, Ей., Маск РиЬйкЫпд Со., Еак!оп, РА1, 1995.
Фармацевтически приемлемые носители или разжижители, а также другие известные вспомогательные вещества и наполнители должны подходить для выбранного соединения согласно настоящему изобретению и избранному способу введения/дачи. Пригодность носителей и других компонентов фармацевтических композиций определяют на основе отсутствия значительного отрицательного воздействия на нужные биологические свойства выбранного соединения или фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению (например, меньше, чем значительное воздействие (10% или менее относительного ингибирования, 5% или менее относительного ингибирования и т.д.) на связывание антигена.
Фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению может также включать растворители, наполнители, соли, буферы, детергенты (например, неионный детергент как Тмееп- 80), стабилизаторы (например, сахара или очищенные от белка аминокислоты), консерванты, тканевые фиксативы, солюбилизаторы и/или другие материалы, подходящие для включения в фармацевтическую композицию.
Действительные уровни дозировки ингредиентов в фармацевтических композициях согласно настоящему изобретению могут варьировать, так чтобы получить количество активного ингредиента, которое эффективно для достижения желаемого терапевтического ответа у данного больного, композиции и способа введения, не будучи токсичным для больного. Выбранный уровень дозировки зависит от различных фармакокинетических факторов, включая активность данной применяемой композиции согласно настоящему изобретению или ее эфира, соли или амида, пути приема, времени приема, скорости выделения данного примененного соединения, продолжительности лечения, других лекарств, соединений и/или материалов, применяемых в комбинации с данной применяемой композицией, возраста, пола, веса, состояния, общего состояния здоровья и предыдущей истории болезни больного на лечении и подобных факторов, хорошо известных в области медицины.
Фармацевтическую композицию можно применять любым подходящим путем способом. Подходящие пути для применения соединения согласно настоящему изобретению ш у1уо и ш У1!го хорошо известны в данной области и могут быть выбраны обычными специалистами.
Соединения согласно настоящему изобретению можно давать любым подходящим путем, например, через рот, через нос, посредством ингаляции, топикальным (включая защечный, чрескожный и подъязычный), ректальным, вагинальным и/или парентеральным путем.
В одном воплощении фармацевтическую композицию согласно настоящему изобретению назначают через рот, например, с инертным растворителем или перевариваемым съедобным носителем. Активный ингредиент можно заключать в твердые или мягкие желатиновые капсулы, прессовать в таблетки или прямо включать в диету больного. Фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению, которые подходят для приема через рот, включают таблетки для глотания, защечные таблетки, таблетки, капсулы, эликсиры, суспензии, сиропы, вафли и т.п., содержащие носители, которые подходят для данного случая, как известно в данной области. Чтобы давать соединение согласно настоящему изобретению посредством введения через рот, может быть необходимым покрывать соединение или давать соединение вместе с материалом для предотвращения его инактивации.
В одном воплощении фармацевтическую композицию согласно настоящему изобретению назнача
- 80 015584 ют через нос. Фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению, подходящие для введения через нос, известны в данной области техники и обычно включают спреи, капли для носа и ингаляторы.
В одном воплощении фармацевтическую композицию согласно настоящему изобретению применяют топикально. Фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению, подходящие для топикального или чрескожного применения, известны в данной области техники и обычно включают порошки, спреи, мази, пасты, кремы, лосьоны, гели, растворы, пластыри и ингаляторы, содержащие такие носители, которые подходят для такого случая согласно данной области техники.
В одном воплощении фармацевтическую композицию согласно настоящему изобретению применяют ректально. Фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению, подходящие для ректального применения, известны в данной области техники и включают гели, пасты, спрейные рецептуры, суппозитории.
В одном воплощении фармацевтическую композицию согласно настоящему изобретению применяют вагинально. Фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению, подходящие для вагинального применения, известны в данной области техники и обычно включают пессарии, тампоны, кремы, гели, пасты, пены или спрейные рецептуры, содержащие такие носители, которые подходят для такого случая согласно данной области техники.
В одном воплощении фармацевтическую композицию согласно настоящему изобретению назначают парентерально.
Фразы парентеральное применение или назначается парентерально применяют здесь для обозначения способов введения, отличных от энтерального и топикального введения обычно посредством инъекции, и включают эпидермальную, внутривенную, внутримышечную, внутриартериальную, интратекальную, внутрисуставную, внутриглазничную, внутрисердечную, внутрикожную, интраперитональную, внутрисухожильную, транстрахеальную, подкожную, внутрисуставную, субкапсулярную, субарахноидную, интраспинальную, внутричерепную, внутригрудную, эпидуральную и интрастернальную инъекцию и инфузию.
В одном воплощении такую фармацевтическую композицию назначают посредством внутривенной или подкожной инъекции или инфузии.
В одном воплощении соединения согласно настоящему изобретению применяют в кристаллической форме посредством подкожной инъекции, см. Υηπμ е! а1., РNА8 И8А 100(12), 6934-6939 (2003).
Фармацевтические композиции можно давать с применением медицинских приспособлений, известных в данной области. Например, в одном воплощении фармацевтическую композицию согласно настоящему изобретению можно назначать с безыголочными приспособлениями для гиподермической инъекции, как приспособления, раскрытые в И8 5399163, И8 5383851, И8 5312335, И8 5064413, и8 4941880, И8 4790824 или И8 4596556. Примеры хорошо известных имплантов и модулей, применимых для настоящего изобретения, включают И8 4487603, которые раскрывают имплантируемый микроинфузионный насос для подачи лекарства с контролируемой скоростью; И8 4486194, которое раскрывает терапевтическое приспособление для подачи лекарств через кожу; И8 4447233, которое раскрывает медицинский инфузионный насос для доставки лекарства с точной скоростью инфузии; И8 4447224, которое раскрывает имплантируемое устройство для инфузии с переменной скоростью для постоянной доставки лекарств; И8 4439196, которое раскрывает осмотическую систему доставки лекарств, обладающую многокамерным отсеками; и И8 4475196, которое раскрывает осмотическую систему доставки лекарств. Много других имплантов, систем доставки и модулей известны специалисту в данной области.
Фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению можно составлять для особых путей введения, например для введения через рот, через нос, топикального (включая защечный, чрескожный и подъязычный), ректального, вагинального и/или парентерального введения. Фармацевтические композиции можно подходящим образом представлять в единицах формодозы и можно получать любым способом, известным в области фармацевтики. Количество активного ингредиента, которое можно комбинировать с материалом носителя для получения одной формодозы, варьирует в зависимости от объекта для излечения и данного способа введения. Количество активного ингредиента, которое можно комбинировать с материалом носителя для получения одиночной формодозы, в основном является тем количеством композиции, которое дает терапевтический эффект. В основном вне 100% такое количество находится в интервале от приблизительно 0,01 до приблизительно 99% активного ингредиента, например от приблизительно 0,1 до приблизительно 70%, например от приблизительно 1 до приблизительно 30%.
Независимо от избранного пути применения соединения согласно настоящему изобретению, которые можно применять в форме фармацевтически приемлемой соли или в подходящей гидратированной форме, и/или фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению формулируют в фармацевтически приемлемые формодозы с помощью общепринятых способов, известных специалисту в данной области. Фармацевтически приемлемая соль относится к соли, которая сохраняет нужную биологическую активность родительского соединения и не вносит никаких нежелательных токсических эффектов (см., например, Вегде, 8.М. е! а1., 1. РНагт. 8сг 66, 1-19 (1977)). Примеры таких солей включают дополнительные соли кислот и оснований. Дополнительные соли кислот включают таковые, произве
- 81 015584 денные из нетоксичных неорганических кислот, например соляной, азотной, фосфорной, серной, бромисто-водородной, йодисто-водородной, фосфористой кислоты и т.п., а также нетоксичных органических кислот, например алифатических моно- и дикарбоновых кислот, фенилзамещенных алкановых кислот, гидроксиалкановых кислот, ароматических кислот, алифатических и ароматических сульфоновых кислот и т.п. Дополнительные соли оснований включают таковые, произведенные из щелочных металлов, например натрия, калия, магния, кальция и т.п., а также нетоксических органических аминов, например КК-дибензилэтилендиамина, Кметилглюкамина, хлорпрокаина, холина, диэтаноламина, этилендиамина, прокаина и т. п.
Фармацевтически приемлемые носители включают любые и все подходящие растворители, диспергирующие среды, покрывающие, противобактериальные противогрибковые агенты, изотонические агенты, антиоксиданты и агенты, замедляющие адсорбцию и т.п., которые физиологически совместимы с соединением согласно настоящему изобретению.
Примеры подходящих водных и неводных носителей, которые можно применять в фармацевтических композициях согласно настоящему изобретению, включают воду, физиологический раствор, физиологический раствор на фосфатном буфере, этанол, декстрозу, полиолы (например, глицерин, пропиленгликоль, полиэтиленгликоль и т.п.) и их подходящие смеси, растительные масла, например оливковое масло, кукурузное масло, хлопковое масло и кунжутное масло, коллоидные растворы карбоксиметилцеллюлозы, смолу трагаканта и органические эфиры для инъекций, например этилолеат, и/или различные буферы. Другие носители хорошо известны в области фармацевтики.
Фармацевтически приемлемые носители включают стерильные водные растворы или дисперсии и стерильные порошки для немедленного приготовления стерильных растворов или дисперсий для инъекций. Применение таких сред и агентов для фармацевтически активных веществ известно в данной области. Кроме того и до тех пор пока общепринятая среда или агент не становится несовместимым с активным соединением, их применение в фармацевтических композициях охватывается изобретением.
Нужную текучесть можно поддерживать, например, с помощью покрывающих материалов, например лецитина, посредством поддержания нужного размера частиц в случае дисперсий и с помощью любого поверхностно-активного вещества.
Фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению могут также включать приемлемые антиоксиданты, например, (1) водорастворимые антиоксиданты, например аскорбиновую кислоту, цистеин гидрохлорид, бисульфат натрия, метабисульфат натрия, сульфит натрия и т. п., (2) жирорастворимые антиоксиданты, например аскорбилпальмитат, бутилированный гидроксианизол (ВНА), бутилированный гидрокситолуол (АНТ), лецитин, пропилгаллат, альфа-токоферол и т.п. и (3) агенты хелаторы металлов, например лимонная кислота, этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА), сорбит, виннокаменная кислота, фосфорная кислота и т.п.
Фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению могут также включать агенты, придающие изотоничность, например сахара, многоатомные спирты, например маннит, сорбит, глицерин или хлористый натрий в композициях.
Фармацевтически приемлемые разжижители включают физиологический раствор и водные буферные растворы.
Фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению могут также содержать одно или более вспомогательное вещество, подходящее для избранного пути приема, например консерванты, увлажняющие агенты, эмульсифицирующие агенты, диспергирующие агенты, консерванты или буферы, которые могут увеличивать время хранения или эффективность фармацевтических композиций. Соединения согласно настоящему изобретению, можно, например, смешивать с лактозой, сахарозой, порошками (например, порошком крахмала), эфирами целлюлозы и алкановых кислот, стеариновой кислотой, стеаратом магния, окисью магния, натриевыми и кальциевыми солями фосфорной и серной кислот, аравийской камедью, желатином, алгинатом натрия, поливинилпирролидоном и/или поливиниловым спиртом. Другими примерами адъювантов являются 0821, СМ-С8Е, 8КБ-172, гистамин дигидрохлорид, тимокартин, тиотепа, композиции монофосфорил-липид А/микобактерии, квасцы, неполный адъювант Фрейнда (Егеипй'к афиуап!), монтанид КА, адъювантная система риби (пЬ1), адъювант ТйегМах, адъювантные составы синтекс (куп!ех айщуап! когти1айопк), иммуностимулирующие комплексы (КС0Мк), адъювант гербу (дегЬи), ЦфГ (СрС) олиголезоксинуклеотиды, липополисахарид и полиинозиновая:полицитидиновая кислота.
Предотвращение присутствия микроорганизмов можно обеспечить как с помощью процедур стерилизации, так и с помощью включения различных противобактериальных и противогрибковых агентов, например парабена, хлорбутанола, фенола, сорбиновой кислоты и т.п. Дополнительно продолжительную абсорбцию фармацевтической форме для инъекции можно придать с помощью включения агентов, которые задерживают абсорбцию, например моностеарата алюминия и желатина.
Фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению, включающие соединение согласно настоящему изобретению, могут также включать его подходящую соль. Любая подходящая соль, например соль щелочного металла в любой подходящей форме (например, буферная соль) может применяться для стабилизации соединения согласно настоящему изобретению. Подходящие соли обычно
- 82 015584 включают хлорид натрия, сукцинат натрия, сульфат натрия, хлорид калия, хлорид магния, сульфат магния и хлорид кальция. В одном воплощении применяют соль алюминия для стабилизации соединения согласно настоящему изобретению в фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению, где соль алюминия может также служить в качестве разбавителя, когда композицию назначают больному.
Фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению могут существовать в разнообразных формах. Такие формы включают, например жидкую, полутвердую и твердую лекарственные формы, например жидкие растворы (например, растворы для инъекций и инфузий), дисперсии или суспензии, эмульсии, микроэмульсии, гели, кремы, гранулы, порошки, таблетки, пилюли, порошки, липосомы, дендримеры и другие наночастицы (см., например, Βаек е! а1., Ме!йойв Епхуто1. 362, 240-9 (2003), №дауекаг е! а1., Ρйа^т Вее. 21(3), 476-83 (2004), микрочастицы и суппозитории.
Оптимальная форма зависит от избранного способа применения, природы композиции и терапевтического приложения. Рецептуры могут включать, например, порошки, пасты, мази, желе, воски, масла, липиды, липид(катионный или анионный)содержащие пузырьки, ДНК конъюгаты, безводные абсорбционные пасты, эмульсии масло-в-воде и вода-в-масле, эмульсии карбовакса (полиэтиленгликоли разных молекулярных весов), полутвердые гели и полутвердые смеси, содержащие карбовакс. Любое из вышеперечисленных может подходить для лечения и терапии согласно настоящему изобретению, предоставляя активный ингредиент в фармацевтической композиции, который не является деактивированным рецептированием и рецептура является физиологически совместимой с путем введения; см., например, Ρο\\ό11 е! а1., Сотрепйшт оГ ехс1р1еп!в Гог рагеп!ега1 Гогти1а1юпв, Ρ^Α 1. Ρйа^т. 8а. Тесйпо1. 52, 238-311 (1998) и цитаты здесь для дополнительной информации, относящейся к вспомогательным веществам и носителям, известным химикам-фармацевтам.
Соединения согласно настоящему изобретению можно получать с носителями, которые будут защищать соединения от быстрого высвобождения, например рецептуры с контролируемым высвобождением, включая импланты, чрескожные накладки (пластыри) и микроинкапсулированные системы доставки. Такие носители могут включать желатин, глицерилмоностеарат, глицерилдистеарат, биодеградируемые биосовместимые полимеры, например этиленвинилацетат, полиангидриды, полигликолевая кислота, коллаген, полиортоэфиры и полимолочная кислота сами по себе или с воском или другие материалы, хорошо известные в данной области. Способы получения таких рецептур в основном известны специалисту в данной области; см., например, 8ив1ашей апй Соп1го11ей Ве1еаве Эгад Эейуегу 8ув!етв, ГВ. ВоЬшвоп, ей., Магсе1 Эеккег, Шс., №\ν ΥοΑ, 1978.
Чтобы вводить композиции согласно настоящему изобретению посредством определенных путей введения, может быть необходимым покрывать соединение или вводить соединение совместно с материалом для предотвращения его инактивации. Например, соединение согласно настоящему изобретению можно вводить субъекту вместе с подходящим носителем, например, в липосомах или растворителе. Липосомы включают вода-в-масле-в-воде ССР эмульсии, также как и общеизвестные липосомы (8!ге_)ап е! а1., 1. №иго1ттипо1. 7, 27 (1984)).
В зависимости от пути введения активное соединение можно покрывать материалом для защиты соединения от действия кислот и других естественных условий, которые могут инактивировать соединение. Например, соединение можно вводить субъекту с подходящим носителем, например липосомами. Липосомы включают вода-в-масле-в-воде ССР эмульсии, также как и общеизвестные липосомы (8!ге_)ап е! а1., 1. №иго1ттипо1. 7, 27 (1984)).
В одном воплощении соединения согласно настоящему изобретению можно включать в рецептуры для обеспечения правильного распределения ш νΐνο. Например, гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) исключает многие сильно гидрофильные соединения. Для обеспечения того, чтобы терапевтические соединения согласно настоящему изобретению пересекали ГЭБ (при необходимости), их надо включать в рецептуры, например, с липосомами. Способы получения липосом см., например, в и8 4522811, и8 5374548 и И8 5399331. Липосомы могут включать один или более компонент, который избирательно переносится в специфическую клетку или орган, что усиливает направленную доставку лекарства (см., например, У.У. Вапайе 1. С1ш. Ρйа^тасο1. 29, 685 (1989)). Примеры направляющих компонентов включают фолат или биотин (см., например, И8 5416016), маннозиды (итеха\\'а е! а1., Β^οсйет. Β^οрйу5. Вее. Соттип. 153, 1038 (1988)), антитела (ΡΌ. Β1οетап е! а1., РΕΒ8 Ьей. 357, 140 (1995), М. 0\\те е! а1., Ап!1т1сгоЬ. Адеп!в Сйето!йег. 39, 180 (1995)), поверхностный рецептор белка А (Ьпесое е! а1., Ат. 1. ΡΗν5ΐο1. 1233. 134 (1995)), различные виды которых могут включать фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению, а также соединения изобретенных молекул, р120 (8сйге1ег е! а1., 1. Βίο1. Сйет. 269, 9090 (1994)), см. также К. Кешапеп, М.Ь. Ьаиккапеп, РΕΒ8 Ье!!. 346, 123 (1994) апй 1.1. Кййоп, Ι.Ι. Р1й1ег, Iттипοтеΐйοй5 4, 273 (1994).
В одном воплощении настоящего изобретения соединения согласно настоящему изобретению включены в рецептуру с липосомами. В дальнейшем воплощении липосомы включают нацеливающий компонент. В дальнейшем воплощении соединения в липосомах доставляются с помощью болюсного вливания в участок, расположенный близко от нужной области, например участок воспаления или инфекции или участок опухоли. Композиция должна быть текучей в такой степени, чтобы с ней было легко
- 83 015584 управляться с помощью шприца. Она должна быть стабильной во время производства и хранения и должна быть предохранена от загрязняющего действия микроорганизмов, например бактерий и грибков.
В одном воплощении соединения согласно настоящему изобретению можно включать в рецептуру для уменьшения их переноса через плаценту. Это можно сделать с помощью способов, известных в данной области, например с помощью ПЭГилирования соединений или применения Е(аЬ')2 фрагментов. Далее, можно сослаться на СиптпдЬат-Кипй1ев С. е! а1., 1. 1ттипо1. Ме!1ойв. 152, 177-190 (1992) и Ьапйог М., Апп А11егду Ав!1та 1ттипо1. 74, 279-283 (1995).
Фармацевтически приемлемые носители для парентерального применения включают стерильные водные растворы или дисперсии или стерильные порошки для немедленного приготовления стерильных растворов или дисперсий для инъекции. Применение таких сред и агентов для фармацевтически активных веществ известно в данной области. Кроме тех случаев, когда общепринятая среда или агент не совместимы с активным соединением, их применение в фармацевтических композициях согласно настоящему изобретению охватывается изобретением. Дополнительные активные соединения также можно включать в композиции.
Фармацевтические композиции для инъекции обычно должны быть стерильными и стабильными в условиях производства и хранения. Композиции можно готовить в виде растворов, микроэмульсий, липосом и других организованных структур, подходящих для высокой концентрации лекарства. Носитель может быть водным или неводным растворителем или средой для дисперсии, содержащими, например, воду, этанол, полиолы (например, глицерин, пропиленгликоль, полиэтиленгликоль и т. п.) и их подходящие смеси, растительные масла, например оливковое масло, и органические эфиры для инъекций, например этилолеат. Нужную текучесть можно поддерживать, например, с помощью материалов покрытия, например лецитина, посредством поддержания нужного размера частиц в случае дисперсий и с помощью любого поверхностно-активного вещества. Во многих случаях предпочтительно включать в композиции изотонические агенты, например сахара, многоатомные спирты, например глицерин, маннит, сорбит или хлористый натрий. Продленную абсорбцию фармацевтической форме для инъекции можно придать с помощью включения агентов, которые задерживают абсорбцию, например солей моностеарата и желатина. Стерильные растворы для инъекций можно получать посредством включения активного соединения в требуемом количестве в подходящий растворитель с одним или комбинацией составляющих, например перечисленных выше, при необходимости с последующей стерилизацией посредством микрофильтрации. В основном дисперсии получают с помощью включения соединения в стерильное средство, содержащее основную среду для дисперсии и другие требуемые ингредиенты, например, из вышеперечисленных. В случае стерильных порошков для получения стерильного раствора для инъекций примерами способов получения являются вакуумная сушка и лиофилизация, что приводит к получению порошка активного ингредиенты плюс любой дополнительный нужный ингредиент из его предварительно стерилизованных с помощью стерильного фильтрования раствора.
Стерильные растворы для инъекций можно получать посредством включения активного соединения в требуемом количестве в подходящий растворитель с одним или комбинацией составляющих, например перечисленных выше, при необходимости с последующей стерилизацией посредством микрофильтрации. В основном дисперсии получают с помощью включения соединения в стерильное средство, содержащее основную среду для дисперсии и другие требуемые ингредиенты из вышеперечисленных. В случае стерильных порошков для получения стерильного раствора для инъекций примерами способов получения являются вакуумная сушка и лиофилизация, что приводит к получению порошка активного ингредиента плюс дополнительный нужный ингредиент из его предварительно стерилизованного с помощью стерильного фильтрования раствора.
Фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению может содержать одно соединение согласно настоящему изобретению или комбинацию соединений согласно настоящему изобретению. Так, в одном воплощении фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению включает комбинацию нескольких (например, двух или более) соединений согласно настоящему изобретению, действующих по различным механизмам, например одно соединение, которое в основном действует посредством включения СЭС, в комбинации с другим соединением, которое в основном действует посредством включения апоптоза.
СЭ38ВР (включая анти-СО38 антитела, иммуноконъюгаты, биспецифичные/мультиспецифичные молекулы, композиции и другие производные, описанные здесь) согласно настоящему изобретению имеют многочисленные ш νίΙΐΌ и ш у1уо диагностические и терапевтические приложения, включающие диагностику и лечение нарушений, включающих клетки, экспрессирующие СЭ38. Например, антитела можно давать клеткам в культуре, например, ш νίΙΐΌ или ех у1уо, или субъекта людям, например, ш у1уо для лечения, предотвращения и диагностики разнообразных нарушений. Как применяется здесь, термин субъект включает людей и животных, отличных от человека, которые отвечают на СЭ38ВР. Субъекты могут, например, включать больных людей с нарушениями, которые можно корректировать или устранить посредством ингибирования функции СЭ38, например ферментативной активности, передачи сигнала, индукции экспрессии цитокинов, индукции пролиферации или дифференциации и/или индукции лизиса и/или уничтожения/уменьшения числа экспрессирующих СЭ38 клеток.
- 84 015584
Например, СЭ38ВР можно применять для проявления ίπ νίνο или ίπ νίίτο одной или более из следующих биологических активностей: ингибирования функции СЭ38 (например, ферментативной активности, передачи сигнала, индукции экспрессии цитокинов, индукции пролиферации или дифференциации и/или индукции лизиса), уничтожения экспрессирующих СЭ38 клеток, опосредования фагоцитоза или АЭСС продуцирующих СЭ38 клеток в присутствии эффекторных клеток человека и с помощью опосредования СЭС экспрессирующих СЭ38 клеток в присутствии комплемента или с помощью уничтожения экспрессирующих СЭ38 клеток посредством апоптоза.
Любая композиция, включающая СЭ38ВР антитела согласно настоящему изобретению, обладающие участками связывания комплемента, например частями ^Ск -2, или -3, или ^М, которые связывают комплемент, может также применяться в присутствии комплемента. В одном воплощении обработку сх νίνο популяции клеток, включающей клетки мишени СЭ38ВР согласно настоящему изобретению и подходящие эффекторные клетки можно дополнять посредством добавления комплемента или сыворотки, содержащей комплемент. Фагоцитоз или лизис клеток мишени, покрытых СЭ38ВР согласно настоящему изобретению, можно улучшить посредством связывания белков комплемента. В одном воплощении клетки мишени, покрытые СЭ38ВР согласно настоящему изобретению, могут также лизироваться комплементом. В одном воплощении клетки, покрытые СЭ38ВР согласно настоящему изобретению, не активируют комплемент.
СЭ38ВР согласно настоящему изобретению можно также применять совместно с комплементом. Соответственно настоящее изобретение охватывает композиции, включающие СЭ38ВР с сывороткой или комплементом. В таких композициях комплемент находится в тесной близости от СЭ38ВР, например, за счет конъюгации или может подбираться для одновременного применения. Альтернативно, СЭ38ВР и сыворотку или комплемент можно применять по отдельности.
СЭ38ВР согласно настоящему изобретению также можно применять для нацеливания на экспрессирующие Рс';'К или СЭ38 клетки, например, чтобы пометить такие клетки. Для такого применения СЭ38ВР может быть связан с молекулой, которую можно детектировать. Так, настоящее изобретение представляет способы локализации ίπ νίνο или ίπ νίίτο клеток, экспрессирующих Рс рецепторы, например Рс';'К или СЭ38. Детектируемыми метками могут быть, например, радиоизотоп, флуоресцентное соединение, фермент или кофактор фермента.
Специфичные для мишени эффекторные клетки, например эффекторные клетки, связанные с СЭ38ВР согласно настоящему изобретению, можно также применять в качестве терапевтических агентов. Эффекторные клетки для нацеливания могут быть лейкоцитами человека, такими как макрофаги, нейтрофилы или моноциты. Другие клетки включают эозинофилы, природные клетки-убийцы и другие клетки, несущие ^С- или [дА рецепторы. Если требуется, эффекторные клетки можно получать у субъекта на лечении. Эффекторные клетки, специфичные для мишени, можно давать в виде суспензии клеток в физиологически приемлемом растворе. Число назначаемых клеток может быть порядка от 108 до 109, но варьирует в зависимости от терапевтической цели. В основном количество должно быть достаточным для получения локализации на клетке мишени, например раковой клетке, экспрессирующей СЭ38, и для эффективного уничтожения клетки, например, за счет фагоцитоза или лизиса.
Терапия специфичными для мишени эффекторными клетками может проводиться в сочетании с другими техниками для удаления клеток мишени. Например, противораковую терапию с применением СЭ38ВР согласно настоящему изобретению и/или эффекторных клеток, вооруженных такими композициями, можно применять в сочетании с химиотерапией. Дополнительно, комбинаторную иммунотерапию можно применять для направления двух различных цитотоксичных эффекторных популяций на отторжение опухолевой клетки. Например, СЭ38ВР, связанный с анти-Рс'/К или анти-СО38, можно применять в сочетании с агентами, специфически связывающими ^С- или ^А рецепторы. Биспецифичные и мультиспецифичные молекулы по настоящему изобретению также можно применять для модуляции уровней РсаК или Рс/К на эффекторных клетках, например, посредством покрытия и уничтожения рецепторов на поверхности клетки. Смеси анти-Рс рецепторов можно также применять для этой цели.
В одном воплощении настоящее изобретение представляет способы детектирования присутствия СЭ38 антигена в образце или измерения количества СЭ38 антигена, включающие контактирование образца и контрольного образца с СЭ38ВР, который специфически связывается с СЭ38, в условиях, позволяющих образование комплекса между СЭ38ВР или его частью и СЭ38. Образование комплекса далее детектируют, причем разница в образовании комплекса между образцом и контрольным образцом является указателем на присутствие СО38-антигена в образце. Примеры способов для детектирования при иммуноанализе включают без ограничения этим ЕЫ8А, ША, РАС8 анализ, анализ с помощью плазмонового резонанса, хроматографический анализ, иммуногистохимию тканей, блоттинг ^С81егп Ηο!) и/или иммунопреципитацию.
В одном воплощении СЭ38ВР согласно настоящему изобретению можно применять для детектирования уровней циркулирующего СЭ38 или уровней клеток, содержащих СЭ38 на поверхности своей мембраны, где эти уровни могут затем быть связаны с симптомами определенных заболеваний. Альтернативно, СЭ38ВР можно применять для истощения или взаимодействия с функцией экспрессирующих
- 85 015584
СБ38 клеток, таким образом определяя эти клетки как важные посредники заболевания. Этого можно достигнуть посредством контактирования образца и контрольного образца с анти-СБ38 антителом в условиях, позволяющих образование комплекса между антителом и СБ38В, детекции и сравнения контроля и образца.
СБ38ВР согласно настоящему изобретению можно исходно тестировать на присутствие активности связывания для терапевтического или диагностического применения ш νίΙΐΌ. Например, СБ38ВР можно тестировать с помощью проточной цитометрии. Далее, можно анализировать активность СБ38ВР в запуске по меньшей мере одной опосредованной эффектором активности эффекторной клетки. Например, можно анализировать способность анти-СБ38 антител согласно настоящему изобретению запускать СБС и/или апоптоз. Протоколы для анализа СБС, гомотипической адгезии, образования молекулярных кластеров или апоптоза хорошо известны в данной области техники.
В одном воплощении настоящее изобретение представляет способ детектирования присутствия или количественной оценки экспрессирующих СБ38 клеток ш νί\Ό или ш νίΙΐΌ. Способ включает (1) дачу субъекту СБ38ВР согласно настоящему изобретению, конъюгированного с детектируемым маркером, (2) обследование субъекта подходящим способом для детекции упомянутого детектируемого маркера для идентификации зон, содержащих экспрессирующие СБ38 клетки.
В одном воплощении иммуноконъюгаты согласно настоящему изобретению можно применять для нацеливания соединений (например, терапевтических агентов, меток, цитотоксинов, иммуносупрессантов и т.д.) на клетки, имеющие на своей поверхности СБ38, с применением таких нацеливающих соединений как терапевтические соединения в иммуноконъюгатах согласно настоящему изобретению.
В одном воплощении настоящее изобретение также представляет способы локализаци ех νί\Ό или ш У11го экспрессирующих СБ38 клеток (например, с помощью детектируемой метки, например, радиоизотопа, флуоресцентного соединения, фермента или кофактора фермента).
В одном воплощении настоящее изобретение представляет способы уничтожения клеток, имеющих СБ38, связанный с поверхностью, с помощью введения иммунотоксинов согласно настоящему изобретению.
Настоящее изобретение представляет способы лечения или предотвращения нарушений, включающих экспрессирующие СБ38 клетки у субъекта, где способ включает введение терапевтически активного количества СБ38ВР согласно настоящему изобретению субъекту, который в этом нуждается. Такие СБ38ВР применяют для ингибирования индуцированных СБ38 активностей, связанных с некоторыми нарушениями, чтобы уничтожить или уменьшить число экспрессирующих СБ38 клеток.
Такой способ включает введение субъекту композиции СБ38ВР согласно настоящему изобретению в количестве, эффективном для лечения или предотвращения нарушения. СБ38ВР композицию можно вводить саму по себе или с другим терапевтическим агентом, например, как описано здесь в другом месте, который действует в сочетании или синергистически с СБ38ВР композицией для лечения или предотвращения нарушения, вовлекающего экспрессирующие СБ38 клетки. Альтернативно, можно применять имммуноконъюгаты для уничтожения клеток, имеющих на своей поверхности экспрессированный СБ38, посредством нацеливания цитотоксинов или радитоксинов на СБ38.
В одном воплощении настоящего изобретения нарушение, включающее экспрессирующие СБ 38 клетки, может быть опухолегенным нарушением, например, нарушением, характеризуемым присутствием опухолевых клеток, экспрессирующих СБ38, например, лимфомой В-клеток, злокачественным перерождением плазматических клеток, лимфомой Т/ЫК клеток и миелоидными злокачественными нарушениями.
Примеры таких опухолегенных заболеваний включают лимфому/лейкозы В-клеток, включая лимфобластический лейкоз/лимфому предшественника В-клеток и неходжкинской лимфомы В-клеток, острый промиелоцитарный лейкоз, острый лимфобластозный лейкоз и неоплазмы зрелых В-клеток, например хронический лимфоцитарный лейкоз В-клеток/малая лимфоцитарная лимфома, острый лимфоцитарный лейкоз В-клеток, пролимфоцитарный лейкоз В-клеток, лимфопластическая лимфома, лимфома клеток мантии, фолликулярная лимфома, включая низкую степень, промежуточную степень и высокую степень, лимфома кожных фолликулярных центров, лимфома В-клеток маргинальной зоны (МАЬТ типа, узлового и селезеночного типа), лейкоз ворсистых клеток, диффузная лимфома больших В-клеток, лимфома Беркитта, плазмацитома, миелома плазматических клеток, лейкоз плазматических клеток, посттрансплантационное лимфопролиферативное нарушение, макроглобулинемия Вальденстрема, лейкоз плазматических клеток и анапластическая лимфома больших клеток.
В одном воплощении нарушение, включающее экспрессирующие СБ38 клетки, является множественной миеломой.
Примерами неходжкинских лимфом В-клеток являются лимфоматоидный лимфогрануломатоз, первичная эффузионая лимфома, интраваскулярная лимфома больших В-клеток, медиастинальная лимфома больших В-клеток, заболевание тяжелых цепей (включая γ, μ и α заболевания), лимфомы, индуцированные терапией иммуносупрессивными агентами, например лимфома, индуцированная циклоспорином, и лимфома, индуцированная метотриксатом.
В одном воплощении настоящего изобретения нарушение, включающее экспрессирующие СБ38
- 86 015584 клетки, может быть лимфомой Ходжкина.
Примерами нарушений, включающих экспрессирующие СИ38 клетки, могут быть злокачественные перерождения, произошедшие из Т- и ИК-клеток, включая неоплазмы зрелых Т-клеток и N К-клеток, включая пролимфоцитарный лейкоз Т-клеток, большой гранулярный лимфоцитарный лейкоз больших Тклеток, агрессивный лейкоз №К-клеток, лейкоз/лимфома Т-клеток взрослых, лимфома внеузловых ХК/Тклеток, лимфома Т-клеток назального типа, энтеропатического типа, лимфома печеночно-селезеночных Т-клеток, подкожная панникулитоподобная лимфома Т-клеток, бластическая лимфома НК-клеток, фунгоидный микоз/синдром Сезари, лимфопролиферативное нарушение первичных кожных СИ30 положительных Т-клеток (первичная кожная анапластическая лимфома больших клеток С-АЬСЬ, лимфоматоидный папулез, граничные повреждения) ангиоиммунобластическая лимфома Т-клеток, неспецифическая лимфома периферических Т-клеток и анапластическая лимфома больших клеток.
Примеры злокачественных заболеваний, произошедших из миелоидных клеток, включают острый миелоидный лейкоз, включая острый промиелоцитарный лейкоз и хронические миелопролиферативные заболевания, включая хронический миелоидный лейкоз.
В одном воплощении настоящего изобретения нарушение, включающее экспрессирующие СИ 38 клетки, может быть иммунным нарушением, при котором вовлечены экспрессирующие СИ38 В-клетки, моноциты и Т-клетки.
Примеры иммунных нарушений, при которых вовлечены экспрессирующие СИ38 В-клетки, моноциты и Т-клетки, включают аутоиммунные нарушения, например псориаз, псориатический артрит, дерматиты, системную склеродерму и склероз, воспалительное заболевание кишечника, болезнь крона, язвенный колит, синдром респираторного заболевания, менингит, энцефалит, увеит, гломерулонефрит, экзему, астму, атеросклероз, дефицит адгезии лейкоцитов, рассеянный склероз, синдром Рейно, синдром Шегрена, ювенильный начинающийся диабет, болезнь Рейтера, болезнь Бехчета, иммунный сложный нефрит, ЦА нефропатию, ЦМ полинейропатию, иммуноопосредованную тромбоцитопению, например острую идиопатическую тромбоцитопеническую пурпуру и хроническую идиопатическую тромбоцитопеническую пурпуру, гемолитическую анемию, миастению беременных, волчанку почки, системную красную волчанку, ревматоидный артрит, атопический дерматит, пузырчатку, болезнь Грейвса, тиреоидит Хашимото, грануломатоз Вегенера, синдром Оменна, хроническую почечную недостаточность, острый инфекционный мононуклеоз, рассеянный склероз, ШУ и заболевания, связанные с вирусом герпеса. Далее, примерами являются синдром тяжелого острого дыхательного затруднения и хореоретинит. Далее, включены другие заболевания и нарушения, например, такие, которые обусловлены или опосредованы инфекцией В-клеток вирусом, например вирусом Эпштейн-Барра.
В одном воплощении нарушение, вовлекающее экспрессирующие СИ38 клетки, является ревматоидным артритом.
Другие примеры воспалительных, иммунных и/или аутоиммунных нарушений, при которых аутоантитела и/или чрезмерная активность В и Т лимфоцитов являются значительными и которые можно лечить согласно настоящему изобретению, включают следующие:
васкулидиты и другие заболевания сосудов, например микроскопический полиангиит, синдром Чарг-Штрауса и другие АNСА-связанные васкулидиты, полиартрит узловатый, основной криоглобулинемический васкулидит, кожный лейкоцитокластический ангиит, болезнь Кавазаки, артерит Такаясу, артерит гигантских клеток, пурпура Енош-Шенлейна, первичный или изолированный церебральный ангиит, эритема узловатая, облитерирующий тромбангиит, тромботическая тромбоцитопеническая пурпура (включая гемолитический уремический синдром) и вторичные васкулидиты, включая кожный лейкоцитокластический васкулидит (например, вторичный при гепатите В, гепатите С, макроглобулинемии Вальденстрема, неоплазиях В-клеток, ревматоидном артрите, синдроме Шегрена или системной красной волчанке); далее примерами являются эритема узловатая, аллергический васкулит, панникулит, болезнь Вебер-Кристиана, гиперглобулинемическая пурпура и болезнь Бергера;
кожные нарушения, например контактные дерматиты, дерматоз линейного ЦА, витилиго, пиодерма гангренозная, приобретенный буллезный эпидермолиз (ер1бегто1у818 Ьи11о§а асди1811а), обыкновенная пузырчатка (включая рубцовый пемфигоид (сюайтсЫ ретрЫдо1б) и буллезный пемфигоид (Ьи11ои§ ретрЫдо1б)), круговая алопеция (включая общую плешивость (а1орес1а ипТСегкаШ) и полную плешивость (а1орес1а 1о1аШ)), герпесовидный дерматит (бегтаШк ЬегрейГогтЦ), полиморфная эритема и хроническая аутоиммунная крапивница (включая ангионевротическую эдему и связанный с крапивницей васкулит (шИсапа1 νа8си1^ΐ^8));
иммуноопосредованные цитопении, например аутоиммунная нейтропения и чистая аплазия эритроцитов;
нарушения соединительной ткани, например С№8 волчанка, дискоидная красная волчанка, СЯЕ8Т синдром, смешанное заболевание соединительной ткани, полиомиозит/дерматомиозит, миозит телец включения, вторичный амилоидоз, криоглобулинемия типа Ι и типа ΙΙ, фибромиаглия, синдром фосфолипидных антител, вторичная гемофилия, возвратный полихондрит, саркоидоз, синдром скованного человека и ревматическая лихорадка; далее примером является эозинофильный фасцилит;
артриты, например анкилоидный спондилит, ювенильный хронический артрит, болезнь Стилла
- 87 015584 взрослых и синдром 8ΛΡΗ0; далее примерами являются сарколеит, реактивный артрит, болезнь Стилла и подагра;
гематологические нарушения, например апластическая анемия, первичная гемолитическая анемия (включая синдром холодного агглютинина), гемолитическая анемия, вторичная для СЬЬ или системной красной волчанки, синдром Ρ0ΒΜ8, пернициозная анемия и гиперглобулинемическая пурпура Вальдемстрема; далее примеры включают агранулоцитоз, аутоиммунную нейтропению, болезнь Франклина, болезнь Селигмана, болезнь гамма тяжелой цепи, паранейропластический синдром вторичный для тимомы и лимфом, паранейропластический синдром, вторичный для тимомы и лимфом, и образование ингибитора фактора УШ;
эндокринопатии, например полиэндокринопатия и болезнь Адисона, далее примерами являются аутоиммунная гипогликемия, аутоиммунный гипотиреоидит, аутоиммунный инсулиновый синдром, тиреоидит де-Кервена и опосредованная антителом к рецептору инсулина устойчивость к инсулину;
гепето-гастроинтестинальные нарушения, например заболевание целиак, болезнь Виппла, первичный желчный цирроз, хронический активный гепатит и первичный склеротический холангиит, дальнейшим примером является аутоиммунный гастрит;
нефропатии, например быстрый прогрессирующий гломерулонефрит, постстрептококковый нефрит, синдром 6οοбρак!и^е, мембранный гломерулонефрит и криоглобулинемический нефрит, далее примером является болезнь минимального изменения;
нейрологические нарушения, например аутоиммунные нейропатии, тοηοηеи^^!^к ти1Пр1ех, миастенический синдром Ламберта-Итона, хорея Сиденхама, !аЬек 6οΓκη1ίκ и синдром Гийена-Барре, далее примерами являются миелопатический/тропикальный спастический парапарез, миастения беременных, острая воспалительная димиелинирующая полинейропатия и хроническая воспалительная димиелинирующая полинейропатия, рассеянный склероз;
сердечные и легочные нарушения, например 00ΡΩ, фиброзный альвеолит, облитерирующий бронхиолит, аллергический аспергиллоз, фиброзный цистит, синдром Леффлера, миокардит и перикардит, далее примерами являются гиперсенситивная пневмония и паранеопластический синдром, вторичный для рака легких;
аллергические нарушения, например бронхиальная астма, гиперЧдЕ синдром, далее пример включает атаигокЕ Гидах;
офтальмологические заболевания, например идиопатический хориоретинит;
инфекционные заболевания, например инфекция парвовирусом В (включая синдром рук-и-носков); гинекологические-родовспомогательные нарушения, например рецидивный аборт, рецидивная потеря плода и внутриматочное замедление роста, далее примером является паранеопластический синдром, вторичный для гинекологических неоплазм;
нарушения мужской репродуктивной системы, например паранеопластический синдром, вторичный для неоплазмы яичка, и нарушения, возникающие при трансплантации, например отторжение аллотрансплантата или ксенотрансплантата и болезнь трансплантат-против-хозяина.
Антитело можно также назначать профилактически, чтобы уменьшить риск развития рака, например, при опухолегенном нарушении, как описано выше, задержать наступление события при таком развитии рака и/или уменьшить риск рецидива во время ремиссии рака. Это может быть особенно полезным для больных, когда трудно локализовать опухоль, о присутствии которой известно благодаря другим биологическим факторам.
Композиции согласно настоящему изобретению могут включать терапевтически эффективное количество или профилактически эффективное количество ί.Ό38ΒΡ. Терапевтически эффективное количество относится к количеству, эффективному при необходимых дозировках и периоде времени применения для достижения терапевтического результата. Терапевтически эффективное количество ί.Ό38ΒΡ может варьировать в соответствии с такими факторами как стадия болезни, возраст, пол и вес индивидуума и способность ί.Ό38ΒΡ проявлять нужный ответ у индивидуума. Терапевтически эффективное количество является также таким, в котором любые токсические или вредные воздействия антитела или частей антитела перевешиваются терапевтическими благотворными воздействиями. Профилактически эффективное количество относится к количеству, эффективному в нужных дозировках и периоде времени применения для достижения желаемого профилактического результата (например, уменьшение вероятности развития нарушения, уменьшение интенсивности или распространения нарушения, увеличение вероятности выживания при угрозе нарушения, задержка наступления болезненного состояния и т.д.). Обычно поскольку профилактическая доза применяется у субъектов до или на ранней стадии болезни, профилактически эффективное количество будет ниже терапевтически эффективного количества.
Терапевтически эффективное количество для опухолевой терапии можно также измерять по их способности стабилизировать развитие болезни. Способность соединения ингибировать рак можно оценить в животной модельной системе, дающей прогноз эффективности для опухолей человека. Альтернативно, это свойство композиции можно оценить посредством исследования способности соединения ингибировать рост клеток или индуцировать апоптоз с помощью анализа ίη νίίτο, известного квалифициро
- 88 015584 ванному практическому специалисту. Терапевтически эффективное количество или терапевтическое соединение может уменьшить размер опухоли или каким-либо другим способом облегчить симптомы заболевания у субъекта. Специалист в данной области сможет определить такое количество, основываясь на таких факторах, как размер субъекта, тяжесть симптомов у субъекта и данная композиция или выбранный способ применения.
Терапевтически эффективное количество при ревматоидном артрите может приводить, по меньшей мере, к АСВ20 предварительного определения улучшения (Ргейштагу Бейшйоп оГ Iшр^оνешепΐ) у больных, например, по меньшей мере, к АСВ50 предварительного определения улучшения, например, по меньшей мере, к АСВ70 предварительного определения улучшения.
АСВ20 предварительного определения улучшения определяют как:
>20% улучшения в числе мягких суставов Тепбег Чо1п! Соип! (Т1С) и числе опухших суставов 8тео11еп 1ош! Соип! (81С) и >20% улучшения в трех из следующих 5 оценок: оценка боли больным (УА8)1, общая оценка больным (УА8), общая оценка терапевтом (УА8), немощность больного по его самооценке (НАф), реактант острой фазы (СКР или Е8К).
АСВ50 и АСВ70 определяются тем же способом с улучшениями >50 и >70% соответственно. Более детально см. Ре1коп е! а1., ш Ашепсап Со11еде оГ ВЬеиша!о1о§у РгеНштагу Бейпйоп оГ Iшр^оνешепΐ ш ВЬеиша!о1б АйЬпйк; АйЬпйк ВЬеишайкш 38, 727-735 (1995).
Альтернативно, терапевтически эффективное количество для ревматоидного артрита можно измерять с помощью БА8 (счет активности болезни), включая БА828 и/или БА856, как определено ЕиЬАВ.
Режимы дозировки подбирают так, чтобы предоставить оптимальный нужный ответ (например, терапевтический ответ). Например, можно назначать единственное болюсное вливание, можно назначать несколько разделенных доз в течение времени или дозу можно пропорционально уменьшить или увеличивать по показаниям терапевтической ситуации. Парентеральные композиции можно включать в единицы лекарственной формы для простоты применения и единообразия дозировки. Единица лекарственной формы, как применяется здесь, относится обычно к отдельным физическим единицам, подходящим в качестве единичных дозировок для субъектов на лечении; каждая единица содержит количество активного соединения, рассчитанное для получения нужного терапевтического воздействия в сочетании с необходимым фармацевтическим носителем. Спецификация единиц лекарственной формы согласно настоящему изобретению продиктовано и прямо зависит от (а) уникальных характеристик активного соединения и данного терапевтического эффекта, который требуется достигнуть, и (б) ограничений присущих данной области техники для расчета количеств такого активного соединения для лечения с учетом чувствительности индивидуумов.
Эффективные дозировки и схемы введения дозировок для СБ38ВР согласно настоящему изобретению зависят от заболевания или состояния, которое надо лечить, и могут быть определены специалистом в данной области. Например, неограничивающий интервал для терапевтически эффективного количества соединения согласно настоящему изобретению составляет приблизительно 0,1-100 мг/кг, например приблизительно 0,1-50 мг/кг, например приблизительно 0,1-20 мг/кг, например приблизительно 0,1-10 мг/кг, например приблизительно 0,5, например приблизительно 0,3, приблизительно 1 или приблизительно 3 мг/кг.
Терапевт или ветеринар, являющиеся обычными специалистами в данной области, легко определят и пропишут эффективное количество требуемой фармацевтической композиции; например, терапевт или ветеринар могут начать с доз СБ38ВР согласно настоящему изобретению, включенных в фармацевтические композиции на уровнях ниже необходимых для достижения нужного терапевтического действия, и постепенно увеличивать дозировку, пока не будет достигнуто нужное действие. В основном подходящей ежедневной дозой композиции согласно настоящему изобретению станет такое количество соединения, которое является наинизшей дозой, эффективной для оказания терапевтического воздействия. Такая эффективная доза в основном будет зависеть от вышеописанных факторов. Применение может быть внутривенным, внутримышечным, внутрибрюшинным или подкожным и, например, назначаться поблизости от участка мишени. При необходимости, эффективную ежедневную дозу фармацевтической композиции можно давать как две, три, четыре, пять, шесть или более поддоз, назначаемых по отдельности через нужные интервалы времени в течение дня при необходимости в единицах формодозы. Хотя для соединения согласно настоящему изобретению возможно назначение его одного, предпочтительно назначать соединение в виде фармацевтической композиции, как описано выше.
В одном воплощении СБ38ВР согласно настоящему изобретению можно назначать посредством инфузии при еженедельной дозировке от 10 до 500 мг/м2, например от 200 до 400 мг/м2. Такое применение можно повторять, например, от 1 до 8 раз, например 3-5 раз. Применять можно посредством непрерывной инфузии в течение периода времени от 2 до 24 ч, например от 2 до 12 ч.
В одном воплощении СБ38ВР согласно настоящему изобретению можно назначать посредством медленной инфузии в течение долгого периода времени, например более 24 ч, чтобы уменьшить токсические побочные эффекты.
- 89 015584
В одном воплощении СЭ38ВР согласно настоящему изобретению можно назначать при еженедельной дозировке от 250 до 2000 мг, например 300, 500, 700, 1000, 1500 или 2000 мг до 8 раз, например от 4 до 6 раз. Применять можно посредством непрерывной инфузии в течение периода времени от 2 до 24 ч, например от 2 до 12 ч. Такой режим можно повторять один или более раз при необходимости, через 6 или 12 месяцев. Дозировку можно определять посредством измерения количества соединения согласно настоящему изобретению в крови при проведении лечения с помощью, например, забора биологических образцов и применения антиидиотипических антител, которые нацелены на район связывания антигена СО38ВР согласно настоящему изобретению.
В одном воплощении СЭ38ВР согласно настоящему изобретению можно назначать посредством поддерживающей терапии, например, раз в неделю в течение 6 месяцев или более.
В одном воплощении СЭ38ВР согласно настоящему изобретению можно назначать по схеме, включающей одну инфузию СЭ38ВР согласно настоящему изобретению с последующей инфузией СЭ38ВР согласно настоящему изобретению, конъюгированного с радиоизотопом. Схему можно повторять, например, на 7-9 дней позже.
В качестве нелимитирующих примеров лечение согласно настоящему изобретению можно проводить в виде ежедневной дозировки соединения согласно настоящему изобретению в количестве приблизительно 0,1-100 мг/кг, например 0,5, 0,9, 1,0, 1,1, 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90 или 100 мг/кг в день по меньшей мере через один из дней 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 или 40, или, альтернативно, по меньшей мере через одну из недель 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 после начала лечения или любой их комбинации, применяя одиночную или разделенные дозы каждые 24, 12, 8, 6, 4 или 2 ч или любую их комбинацию.
Фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению можно также назначать в комбинационной терапии, например в комбинации с другими терапевтическими агентами, относящимися к заболеванию или состоянию, которое следует лечить. Такие введения могут быть одновременными, раздельными или последовательными. Для одновременного введения агенты можно давать в виде одной композиции или в виде отдельных композиций, как требуется.
Соответственно настоящее изобретение представляет способы лечение нарушения, вовлекающего экспрессирующие ΟΌ38 клетки, как описано выше, причем способы включают введение СЭ38ВР согласно настоящему изобретению в комбинации с одним или более терапевтическим агентом, как описано выше.
Настоящее изобретение также представляет применение СЭ38ВР согласно настоящему изобретению для получения фармацевтической композиции для введения по меньшей мере с одним химиотерапевтическим агентом при нарушении, вовлекающем экспрессирующие ΟΌ38 клетки, как описано выше.
В одном воплощении комбинированная терапия может включать введение композиции согласно настоящему изобретению вместе по меньшей мере с одним химиотерапевтическим агентом, по меньшей мере одним противовоспалительным агентом или по меньшей мере одним иммуносупрессивным и/или иммуномодуляторным агентом.
В одном воплощении настоящее изобретение представляет способ лечения нарушения, вовлекающего экспрессирующие ΟΌ38 клетки у субъекта, где способ включает введение терапевтически эффективного количества СЭ38ВР согласно настоящему изобретению и по меньшей мере одного химиотерапевтического агента субъекту, который в них нуждается.
В одном воплощении настоящее изобретение представляет способ лечения множественной миеломы, где способ включает введение терапевтически эффективного количества СЭ38ВР согласно настоящему изобретению и по меньшей мере одного химиотерапевтического агента субъекту, который в них нуждается.
В одном воплощении настоящее изобретение представляет применение СЭ38ВР согласно настоящему изобретению для получения фармацевтической композиции для введения по меньшей мере с одним химиотерапевтическим агентом для лечения множественной миеломы.
В одном воплощении такой химиотерапевтический агент можно выбрать из антиметаболитов, таких как метотриксат, 6-меркаптопурин, 6-тиогуанидин, цитарабин, флюдарабин, 5-фторурацил, декарбазин, гидроксимочевина, аспарагиназа, гемцитабин, кладротибин и сходные агенты.
В одном воплощении такой химиотерапевтический агент можно выбрать из алкилирующих агентов, таких как мехлоретамин, тиоепа, хлорамбуцил, мелфалан, кармустин (В8Ми), ломустин (ССКи), циклофосфамид, бусульфан, дибромманнит, стрептозотоксин, дакарбазин (ΌΤΙΟ, прокарбазин, митомицин С, цисплатин и другие производные платины, например карбоплатин и сходные агенты.
В одном воплощении такой химиотерапевтический агент можно выбрать из антибиотиков, таких как дактиномицин (ранее актиномицин), блеомицин, даунорубицин (ранее дауномицин), доксорубицин, идарубицин, митрамицин, калихеамицин, митомицин, митоксантрон, пликамицин, антрамицин (АМС) и сходные агенты.
В одном воплощении такой химиотерапевтический агент можно выбрать из противомитотических
- 90 015584 агентов, таких как таксаны, например доцетаксель и паклитаксель, и алкалоидов вьюнка, например виндезин, винкристин, винбластин и винорелбин.
В одном воплощении такой химиотерапевтический агент можно выбрать из ингибитора топоизомеразы, такого как топотекан.
В одном воплощении такой химиотерапевтический агент можно выбрать из ингибиторов фактора роста, таких как ЕгЬВ1 (ЕСРЯ) (например, гефитиниб (Еекка®), цетуксимаб (ЕгЬйих®), эрлотиниб (Тагсеуа®), ΗиМаx-ЕСΡ^ (2Р8 раскрытый в ν0 2002/100348) и сходные агенты), ингибитор ЕгЬВ2 (№γ2/ικιι) (например, трастузумаб (^гсер^®) и сходные агенты) и сходные агенты. В одном воплощении такой ингибитор фактора роста может быть ингибитором фарнезил-трансферазы, например 8ΘΗ-66336 и Я115777. В одном воплощении такой ингибитор фактора роста может быть ингибитором фактора роста эндотелия (УЕСР), например бевасизумаб (Аνа8!^π®).
В одном воплощении такой химиотерапевтический агент может быть ингибитором тирозин киназы, например иматиниб (Сйес, С1ееνес 8ΤΙ571), лапатиниб, РТК787/2К222584 и сходные агенты.
В одном воплощении такой химиотерапевтический агент может быть ингибитором гистондеацетилазы. Примеры таких ингибиторов гистон-деацетилазы включают основанные на гидроксамовой кислоте гибридные полярные соединения, например 8ΛΗА (субероиланилидгидроксамовой кислоты).
В одном воплощении такой химиотерапевтический агент может быть ингибитором Р38 МАР киназы, например 8СЮ-469.
В одном воплощении настоящее изобретение представляет способы лечения нарушения, включающего экспрессирующие СЭ38 клетки, где способ включает введение терапевтически эффективного количества СЭ38ВР согласно настоящему изобретению и по меньшей мере одного ингибитора ангиогенеза, неоваскуляризации и/или другой васкуляризации у субъекта, который в этом нуждается.
В одном воплощении настоящее изобретение представляет способы лечения множественной миеломы, где способ включает введение терапевтически эффективного количества СЭ38ВР согласно настоящему изобретению и по меньшей мере одного ингибитора ангиогенеза, неоваскуляризации и/или другой васкуляризации у субъекта, который в этом нуждается.
В одном воплощении настоящее изобретение представляет применение СЭ38ВР согласно настоящему изобретению для получения фармацевтической композиции для введения по меньшей мере с одним ингибитором ангиогенеза, неоваскуляризации и/или другой васкуляризации для лечения множественной миеломы.
Примерами таких ингибиторов ангиогенеза являются ингибиторы урокиназы, ингибиторы металлопротеазы матрикса (например, маримастат, неовастат, ВАУ 12-9566, АС 3340, ВМ8-275291 и сходные агенты), ингибиторы миграции и пролиферации эндотелиальной клетки (например, ΤХР-470, скваламин, 2-метоксиэстрадиол, комбретастатин, эндостатин, ангиостатин, пенициламин, 80Η66336 (8сЕегтдР1оид11 Согр., Мабкоп, N1), Я115777 (1ап§8еп РЕагшасеийса, йс, Тйи^Ше, N1) и сходные агенты), антагонисты ангиогенных факторов роста (например, ΖΌ6474, 8и6668, антитела против ангиогенных агентов и их рецепторов (например, УЕСР, ЬРСР и ангиопоэтин-1) талидомид (Тйа1ош1б®), аналоги талидомида (например, СС-5013 (леналидомид, ^νΚιι^™)) и СС4047 (Асйш1б™), 8идеп 5416, 8И5402, противоангиогенный рибозим (например, ангиозим), интерферон α (например, интерферон а2а), сурамин и сходные агенты), УЕСР-Я ингибиторы киназы и другие противоангиогенные ингибиторы тирозин-киназы (например, 8И011248), ингибиторы эндотелий-специфичного сигнала интегрин/выживания (например, витаксин и сходные агенты), хелаторы антагонисты меди (например, тетратиомолибдат, каптонрил и сходные агенты), карбоксиамидотриазол (САЦ, ΛВΤ-627, СМ101, интерлейкин-12, (ΙΕ-12), ^862, РNυ145156Е, а также молекулы нуклеотидов, ингибирующие ангиогенез (например, противосмысловаяУЕСР кДНК, кДНК, кодирующая ангиостатин, кДНК, кодирующая р53, и кДНК, кодирующая дефицитный рецептор-2) и сходные агенты.
Другими примерами таких ингибиторов ангиогенеза, неоваскуляризации и/или другой васкуляризации являются противоангиогенные производные гепарина и родственные молекулы (например, гепериназа ΙΙΙ), темолозомид, ЫК4, фактор ингибирования миграции макрофагов (МГР), ингибиторы циклооксигеназы 2, ингибиторы индуцируемого гипоксией фактора 1, противоангиогенные изофлавоны сои, олтипраз, фумагиллин и его аналоги, аналоги соматостатина, пентозан полисульфат, текогалан натрия, далтепарин, тумстаин, тромбоспондин, N^3, комбрестатин, канстатин, авастатин, антитела против других близких мишеней (например, анти-альфа-у/бэта-3 интегрин и антикининостатин шАЬк) и сходные агенты.
В одном воплощении настоящее изобретение представляет применение СЭ38ВР согласно настоящему изобретению для получения фармацевтической композиции для введения с талидомидом (Тйа1ош1б®), аналогами талидомида, например СС-5013 (леналидомид, ^νΚιι^™) и/или СС4047 (Асйш1б™). В дальнейшем воплощении настоящее изобретение представляет применение СЭ38ВР согласно настоящему изобретению для получения фармацевтической композиции для введения с талидомидом.
В одном воплощении настоящее изобретение представляет применение СЭ38ВР согласно настоя
- 91 015584 щему изобретению для получения фармацевтической композиции для введения с анти-СЭ20 антителом, например ритуксимаб (Яйихап®, МаЫЬега®) моноклональное анти-СЭ20 антитело, как раскрыто в А0 2004/035607, например 11В8, 2Р2 или 7Ό8.
В одном воплощении терапевтический агент для применения в комбинации с СО38ВР согласно настоящему изобретению для лечения нарушений, как описано выше, может быть ингибитором протеасомы, например бортазомибом (Уе1сайе®).
В одном воплощении терапевтический агент для применения в комбинации с СО38ВР согласно настоящему изобретению для лечения нарушений, как описано выше, может быть кортикостероидом, например преднизоном, преднизолоном, дексаметазоном и т. п.
В одном воплощении терапевтический агент для применения в комбинации с СО38ВР согласно настоящему изобретению для лечения нарушений, как описано выше, может быть противораковым иммуногеном, например антиген рака/связанный с опухолью антиген (например, молекула адгезии эпителиальной клетки (ΕрСАΜ/ΤАСδΤ^I), муцин 1 (МИО), карциноэмбриональный антиген (СЕА), связанный с опухолью гликопротеин 72 (ТАС-72), др100, Ме1ап-А, МАЯТ-1, КОЯ, ЯСАδ1, МОА7, связанные с раком вирусные вакцины (например, вакцины папилломавируса человека), произведенные из опухолей белки теплового шока и сходные агенты. Большое число других подходящих раковых антигенов/связанных с опухолью антигенов, описанных здесь, и сходных молекул, известных в данной области, можно также или альтернативно применять в таком воплощении. Противораковые иммуногенные пептиды также включают противоидиотипические вакцины, например ВЕС2 антиидиотипические антитела, митумомаб (МйитотаЬ), СеаУас и родственные антиидиотипические антитела, антиидиотипическое антитело к МС7 антителу и другие противораковые антиидиотипические антитела (см., например, В1геЬеп! е! а1., Уассше. 21(15), 1601-12 (2003), Ы е! а1., СЫп. Мей. 1. (Епд1). 114(9), 962-6 (2001), δсЬт^!! е! а1., нуЬпйота. 13(5), 389-96 (1994), Ма1опеу е! а1., ИуЬпйота. 4(3), 191-209 (1985), Яаускагйкшг е! а1., 1. Штипок 137(5), 1743-9 (1986), РоЫ е! а1., Ы! 1. Сапсег. 50(6), 958-67 (1992), ВоЫеп е! а1., Су!окшек Мо1. Ткег. 2(4), 231-8 (1996) и Магауата, 1. Штипок Ме!койк. 264(1-2). 121-33 (2002)). Такие антиидиотипические АЬк можно при необходимости конъюгировать с носителем, который может быть синтетической (обычно инертной) молекулой носителя, белком (например, гемоцианин моллюска (кеуко1е йтре!) (КЬн) (см., например, 0сЫ е! а1., Еиг. 1. Штипок 17(11), 1645-8 (1987)), или клеткой (например, эритроцитом, см., например, е! а1., 1. Штипок МеЫойк. 122(2), 227-34 (1989)).
В одном воплощении терапевтический агент для применения в комбинации с СО38ВР согласно настоящему изобретению для лечения нарушений, как описано выше, может быть бисфосфонатом. Примерами потенциально пригодных бисфосфонатов являются памидронат (Агей1а®), золедроновая кислота (2оте!а®), клодронат (ВопеГок®), ризендронат (Ас!опе1®), ибандронат (Вошуа®), этидронат (О1йгопе1®), алендронат (Рокатах®), титлудронат ^кейй®), инкадронат (УатапоисЫ Ркагтасеийса1) и минодронат (УМ529, УатапоисЫ).
В одном воплощении терапевтический агент для применения в комбинации с СО38ВР согласно настоящему изобретению для лечения нарушений, как описано выше, может быть фактором стимуляции колоний. Примерами пригодных факторов стимуляции колоний могут быть факторы стимуляции колоний гранулоцитов (С-СδР), например филграстим (№иродеп®), пегфилграстим (№и1ак!а®), и факторы стимуляции колоний макрофагов (СΜ-СδР), например саграмостин (Ьеикше®).
В одном воплощении терапевтическим агентом для применения в комбинации с СО38ВР согласно настоящему изобретению для лечения нарушений, как описано выше, может быть эритропоэтический агент. Примерами пригодных эритропоэтических агентов являются эритропоэтин (ЕРО), например эпоэтин альфа (например, Ргосгй®, Еродеп® и Ергех®) и эпоэтин бета (например, №оЯесогтоп®) и белки, стимулирующие эритропоэз (например, Агапекр®).
В одном воплощении терапевтическим агентом для применения в комбинации с СО38ВР согласно настоящему изобретению для лечения нарушений, как описано выше, может быть противораковый цитокин, хемокин или их сочетание. Примерами пригодных цитокинов являются факторы роста, включая Ш^, Ш-2, Ш-4, Ш-6, Ш-7, Ш-10, Ш-12, Ш-13, Ш-15, Ш-18, Ш-23, Ш-24, Ш-27, Ш-28а, Ш-28Ь, Ш-29, КСР, ЫК/. (например, ЮТа2Ь), Ш^, СΜ-СδР, СО40Ь, Ηΐδ лиганд, фактор стволовых клеток, анцестим и Т№а. Подходящими хемокинами могут быть Глу-Лей-Арг (ЕЬЯ)-отрицательные хемокины, например ГР-10, МСР-3, МЮ и δϋΕ-1α из семейства СХС и С-С хемокинов человека. Подходящие цитокины включают производные цитокина, варианты цитокина, фрагменты цитокина и составные белки с цитокином.
Эти и другие способы и применения, включающие нуклеиновые кислоты, кодирующие встречающиеся в природе пептиды, здесь можно альтернативно или дополнительно осуществлять с помощью генной активации и техник повышающего регулирования гомологичных рекомбинантных генов, например, как описано в υδ 5968502, υδ 6063630, υδ 6187305 и ЕР 0505500.
В одном воплощении терапевтический агент для применения в комбинации с СО38ВР согласно настоящему изобретению для лечения нарушений, как описано выше, может быть агентом, который модулирует, например, усиливает или ингибирует экспрессию или активность Рса или Рсγ рецепторов. При
- 92 015584 меры подходящих для такого применения агентов включают интерлейкин-1 (ГЕ-1), интерлейкин-2 (ΣΕ-2), интерлейкин-6 (ΣΕ-6), фактор стимуляции колоний гранулоцитов (С-С8Е), например филграстим (№иродеп®) и пегфилграстим (№и1ах!а®), факторы стимуляции колоний гранулоцитов марофагов (СМС8Е), например сарграмостим (Беикше®), интерферон-7 (ШЛу) и фактор некроза опухолей (ЮТ).
В одном воплощении терапевтический агент для применения в комбинации с СИ38ВР согласно настоящему изобретению для лечения нарушений, как описано выше, может быть регулятором контроля клеточного цикла/апоптоза (или регулирующим агентом). Регулятор контроля клеточного цикла/апоптоза может включать (1) молекулы, которые направляют и модулируют регуляторы контроля клеточного цикла/апоптоза, например сбс-25 (например, N80 663284); (2) циклинзависимые киназы, которые сверхстимулируют клеточный цикл (например, флавопиридол (И868275, нМВ1275), 7гидроксистауроспорин (υСN-01, КV-2401) и росковитин (В-росковитин, СУС202)); (3) модуляторы теломераз (например, В1ВВ1532, 80Т-095, СВМ63 и композиции, описанные, например, в И8 6440735 и и8 6713055). Нелимитирующие примеры молекул, которые взаимодействуют с путями апоптоза, включают Т№-связанный индуцирующий апоптоз лиганд (ТВАЕ Е)/апоптоз-2 лиганд (Аро-2И), агенты, индуцирующие №-кВ блокаду, приводящую к ингибированию продукции ΣΕ-6, антитела, активирующие ТВАЕИ рецепторы, ЕЕ№1, противосмысловые Вс1-2 и Ах203 (триоксид мышьяка, Тпхепох®).
В одном воплощении терапевтический агент для применения в комбинации с СИ38ВР согласно настоящему изобретению для лечения нарушений, как описано выше, может быть гормональным регулирующим агентом, например агентами, применимыми в противоандрогенной и противоэстрогенной терапии. Примерами таких гормональных регулирующих агентов являются тамоксифен, идоксифен, фулверстрант, дролоксифен, торемифен, ралоксифен, диэтилстильбестрол, этинилэстрадиол/эстинил, антиандроген (например, флутаминд/эулексин), прогестин (например, гидроксипрогестерон капроат, медроксипрогестерон/провера, мегестрол ацепат/мегас), адренокортикостероид (например, гидрокортизон, преднизон), гормон высвобождения лютеинизирующего гормона (и его аналоги и другие ИнВЫ агонисты, например, бузерелин и гозерелин), ингибитор ароматазы (например, анастразол/аримидекс, аминоглютетимид/цитраден, экземестан), ингибитор гормона (например, октреотид/сандостатин) и сходные агенты.
В одном воплощении терапевтический агент для применения в комбинации с СИ38ВР согласно настоящему изобретению для лечения нарушений, как описано выше, может быть противоанергическим агентом (например, соединения небольших молекул, белки, гликопротеины или антитела, которые нарушают толерантность к опухолям и раковым антигенам). Примерами таких соединений являются молекулы, блокирующие активность СТбА-4, например МИХ-010 (Рйап е! а1., РNΑ8 И8А 100, 8372 (2003)).
В одном воплощении терапевтический агент для применения в комбинации с СИ38ВР согласно настоящему изобретению для лечения нарушений, как описано выше, может быть нуклеиновой кислотой или вектором, содержащими ген супрессора опухоли, например аденовирус с нарушенной репликацией, кодирующий человеческий рекомбинантный дикий тип р53/8Сн58500 и т.д.; противосмысловые нуклеиновые кислоты, направленные на онкогены, мутированные или дерегулированные гены; или х1РнК, направленные на мутированные или дерегулированные гены. Примеры мишеней супрессоров опухолей включают, например, ВВСА1, ВВ1, ВВСА2, ИРС4 (8таб4), М8н2, М1.111 и ИСС.
В одном воплощении терапевтический агент для применения в комбинации с СИ38ВР согласно настоящему изобретению для лечения нарушений, как описано выше, может быть противораковой нуклеиновой кислотой, например генасенс (аугмерозен/С3139), ИУ900003 (Σ8Σ8 3521), Σ8Σ8 2503, 0СХ-011 (Σ8Σ8 112989), ЕЕ-А0Х/ЕЕгаГ-А0Х (инкапсулированный в липосомы с-гаГ противосмысловой олигонуклеотид/1818-5132), МС98 и другие противосмысловые нуклеиновые кислоты, направленные на РКСа, кластерин, ЕСЕВРх, протеинкиназу А, циклин И1 или Вс1-2й.
В одном воплощении терапевтический агент для применения в комбинации с СИ38ВР согласно настоящему изобретению для лечения нарушений, как описано выше, может быть противораковой ингибиторной молекулой РНК (см., например, Ит е! а1., Сигг Сапсег Игад Тагде!х. 1(3), 241-7 (2001), Егга!ит т: Сигг Сапсег Игид Тагде!х. 3(3), 237 (2003), И1та е! а1., Сапсег Сепе Тйег. 11(5), 309-16 (2004), СкшИ е! а1., Еп! Σ. 0псо1. 4(1), 97-105 (2004), СоШх е! а1., Еп! Σ. Ваб1а! 0псо1. Вю1. Рйух. 57(2 8ирр1), 8144 (2003), Уапд е! а1., 0псодепе. 22(36), 5694-701 (2003) и Ζйаηд е! а1., Вюсйет Вюрйух Вех Соттип. 303(4), 1169-78 (2003)).
Композиции и комбинации способов применения согласно настоящему изобретению также включают введение вакцин нуклеиновых кислот, например вакцин с голой ДНК, кодирующей такие раковые антигены/связанные с опухолями антигенов (см., например, И8 5589466, И8 5593972, И8 5703057, и8 5879687, И8 6235523 и И8 6387888). В одном воплощении комбинированный способ введения и/или комбинированная композиция включает композицию аутологичной вакцины. В одном воплощении комбинированная композиция и/или комбинированный способ введения включает вакцину целой клетки или цитокин-экспрессирующей клетки (например, фибробласт, экспрессирующий рекомбинантный ЕЕ-2, разветвленные клетки, экспрессирующие рекомбинантный цитокин и т.п.) (см., например, Ко\\'а1с/ук е! а1., Ас!а ВюсЫт Ро1. 50(3), 613-24 (2003), ВеШу е! а1., Ме!йобх Мо1. Меб. 69, 233-57 (2002) апб Тиари е! а1., Сигг Сепе Тйег. 2(1), 79-89 (2002)). Другим примером такого аутологического клеточного подхода, кото
- 93 015584 рый можно применять в комбинированных способах согласно настоящему изобретению. является МуУах(К) способ персонализированной иммунотерапии (ранее известный как СТ0Р-99) (Сепйоре Согрогайоп - Кей\уоой Сйу. СА. И8А).
В одном воплощении настоящее изобретение представляет комбинированные композиции и/или комбинированные способы введения. где СГО38ВР комбинируют или совместно назначают с вирусами. вирусными белками и т. п. Вирусы с нарушенной репликацией. которые обычно способны только к одному или нескольким циклам репликации ш у1уо и которые нацелены на опухолевые клетки. могут. например. быть полезными компонентами таких композиций и способов. Такие вирусные агенты могут включать или быть связанными с нуклеиновыми кислотами. кодирующими иммуностимуляторы. например СМ-С8Б и/или ΙΕ-2. Как природные онколитические. так и рекомбинантные онколитические вирусы (например. Ηδν-1 вирусы. реовирусы. аденовирусы с нарушенной репликацией и чувствительной репликацией и т.д.) могут быть полезными компонентами таких способов и композиций. Соответственно в одном воплощении настоящее изобретение представляет комбинированные композиции и/или комбинированные способы введения. где СЭ38ВР комбинируют или совместно назначают с онколитическим вирусом. Примеры таких вирусов включают онколитические аденовирусы и вирусы герпеса. которые могут быть или могут не быть модифицированными вирусами (см.. например. тк!апсе 8ЬаЬ е! а1.. Р №игоопсо1. 65(3). 203-26 (2003). 8!11ек е! а1.. 8иг§егу. 134(2). 357-64 (2003). 8ипагтига е! а1.. Рапсгеак. 28(3). 326-9 (2004). ТекЫдаЬага е! а1.. I. 8игд 0псо1. 85(1). 42-7 (2004). УагдЬеке е! а1.. Сапсег Сепе ТЬег. 9(12). 967-78 (2002). \11йпег е! а1.. Сапсег Кек. 59(2). 410-3 (1999). Уатапака. Ш! I. 0псо1. 24(4). 919-23 (2004) и Ζ\\Μκ1 е! а1.. 8етт 0псо1. 28(4). 336-43 (2001)).
Комбинированные композиции и комбинированные способы введения согласно настоящему изобретению могут также включать способы иммунотерапии с целой клеткой или адоптивные. Например. такие способы могут включать инфузию или повторную инфузию клеток иммунной системы (например. лимфоциты. инфильтрующие опухоль (ПЬк). например СЭ4' и/или СЭ8'Т клетки (например. Тклетки. усиленные опухолеспецифичными антигенами и/или генетическими усилителями). экспрессирующие антитела В-клетки или другие продуцирующие/представляющие антитела клетки. древовидные клетки. культивированные с Ό-усиливающим агентом. например СМ-С8Б и/или Б1!3-Ь и/или нагруженные связанным с опухолью антигеном древовидные клетки). противоопухолевые ПК клетки. так называемые гибридные клетки или их комбинации. Клеточные лизаты также можно применять в таких способах и композициях. Клеточные вакцины в клинических испытаниях. которые могут быть полезны в таких случаях. включают Сапуахт™. АРС-8015 (дендреон). ЖРРС-96 (антигеник) и Ме1асте® клеточные лизаты. Антигены. отпавшие от раковых клеток. и их смеси (см.. например. Вук!гуп е! а1.. С11шса1 Сапсег КекеагсН. Уо1. 7. 1882-1887. Йи1у 2001). при необходимости смешанные с вспомогательными веществами. как. например. квасцы. также могут быть компонентами в таких способах и композициях.
В одном воплощении СГО38ВР согласно настоящему изобретению можно доставлять больному в комбинации с приложением способа внутренней вакцинации. Внутренняя вакцинация относится к индуцированной гибели опухолевых или раковых клеток. как. например. индуцированная лекарством или индуцированная радиацией гибель опухолевых клеток у больного. которая обычно приводит к проявлению иммунного ответа. направленного против (1) опухолевых клеток как целого или (2) частей опухолевых клеток. включая (а) секретированные белки. гликопротеины и другие продукты. (б) мембраносвязанные белки или гликопротеины или другие продукты. связанные или погруженные в мембраны. и/или (в) внутриклеточные белки или другие внутриклеточные компоненты. Иммунный ответ. индуцированный внутренней вакцинацией. может быть гуморальным (например. антитело-комплемент опосредованным) или опосредованным клетками (например. развитие или увеличение эндогенных цитотоксических Т лимфоцитов. которые узнают убитые внутри опухолевые клетки или их части). В дополнение к радиотерапии нелимитирующими примерами лекарств и агентов. которые можно применять для индукции упомянутой гибели опухолевых клеток и внутренней вакцинации. являются общепринятые химиотерапевтические агенты. ингибиторы клеточного цикла. противоангиогенные лекарства. моноклональные антитела. агенты. индуцирующие апоптоз. и ингибиторы передачи сигнала.
Примерами других противораковых агентов. которые могут быть пригодными в качестве терапевтических агентов для применения в комбинации с СИ38ВР согласно настоящему изобретению для лечения нарушений. как описано выше. являются агенты. индуцирующие дифференциацию. ретиноевая кислота и аналоги ретиноевой кислоты (например. транс-ретиноевая кислота. 13-цис-ретиноевая кислота и сходные агенты). аналоги витамина Ό (например. сеокальцитол и сходные агенты)). ингибиторы ЕгЬВ3. ЕгЬВ4. ЮБ-ΙΕ. рецептора инсулина. РОСБРа. Б0СБИЬе1а. Б1к2. Б1!4. БСБК1. БСБК2. БСБК3. БСБК4. ТККА. ТККС. с-те!. Коп. 8еа. Т1е. Т1е2. ЕрЬ. Ке!. Кок. А1к. ЬТК. РТК7 и сходные агенты.
Примерами других противораковых агентов. которые могут быть пригодными в качестве терапевтических агентов для применения в комбинации с СИ38ВР согласно настоящему изобретению для лечения нарушений. как описано выше. являются катепсин В. модуляторы катепсин Ό-дегидрогеназной активности. глютатион-8-трансферазы (например. глютацилцистеин синтаза и лактат дегидрогеназа) и сходные агенты.
Примерами других противораковых агентов. которые могут быть пригодными в качестве терапев
- 94 015584 тических агентов для применения в комбинации с СЭ38ВР согласно настоящему изобретению для лечения нарушений, как описано выше, являются эстрамустин и эпирубицин.
Примерами других противораковых агентов, которые могут быть пригодными в качестве терапевтических агентов для применения в комбинации с СЭ38ВР согласно настоящему изобретению для лечения нарушений, как описано выше, являются ингибитор Н8Р90, как 17-аллил-аминогелд-анамицин, антитела, направленные против опухолевых антигенов, например Р8А, СА125, К8А и т.д., интегрины подобно интегрину β1, ингибиторы УСАМ и сходные агенты.
Примерами других противораковых агентов, которые могут быть пригодными в качестве терапевтических агентов для применения в комбинации с СЭ38ВР согласно настоящему изобретению для лечения нарушений, как описано выше, являются кальцинейрин-ингибиторы (например, валсподар, Р8С 833 и другие МОК-1 или р-гликопротеин ингибиторы), ТОК-ингибиторы (например, сиролимус, эверолимус и рапамицин) и ингибиторы механизмов наведения лимфоцитов (например, ЕТΥ720) и агенты, воздействующие на клеточные сигналы, например ингибиторы адгезии молекул (например, анти-ЬЕА и т.п.).
В одном воплощении настоящее изобретение представляет способ лечения нарушения, включающего экспрессирующие СЭ38 клетки у субъекта, где способ включает введение терапевтически эффективного количества СЭ38ВР согласно настоящему изобретению и радиотерапии субъекту, в них нуждающемуся.
В одном воплощении настоящее изобретение представляет способ лечения множественной миеломы, где способ включает введение терапевтически эффективного количества СЭ38ВР согласно настоящему изобретению и радиотерапии субъекту, в них нуждающемуся.
В одном воплощении настоящее изобретение представляет применение СЭ38ВР согласно настоящему изобретению для получения фармацевтической композиции, чтобы назначать вместе с радиотерапией для лечения множественной миеломы.
Радиотерапия может включать облучение или совместное введение радиоактивных фармацевтических веществ больному. Источник радиации может быть внешним или внутренним относительно больного на лечении (радиационное лечение может, например, быть в форме радиационной терапии с внешним лучом (ЕВКТ), брахитерапии (ВТ) или радиотерапии, нацеленной на скелет). Радиоактивные элементы, которые можно применять в практике таких способов, включают, например, радий, цезий-137, иридий-192, америций-241, золото-198, кобальт-57, медь-67, технеций-99, йод-131 и индий-111.
В одном воплощении настоящее изобретение представляет способ лечения нарушения, включающего экспрессирующие СЭ38 клетки у субъекта, где способ включает введение терапевтически эффективного количества СЭ38ВР согласно настоящему изобретению субъекту, который в этом нуждается, в комбинации с пересадкой аутологичных периферических стволовых клеток или костного мозга.
В одном воплощении настоящее изобретение представляет способ лечения множественной миеломы, где способ включает введение терапевтически эффективного количества СЭ38ВР согласно настоящему изобретению субъекту, который в этом нуждается, в комбинации с пересадкой аутологичных периферических стволовых клеток или костного мозга.
В одном воплощении настоящее изобретение представляет применение СЭ38ВР согласно настоящему изобретению для получения фармацевтической композиции для введения совместно пересадкой аутологичных периферических стволовых клеток или костного мозга для лечения множественной миеломы.
В одном воплощении настоящее изобретение представляет способ лечения нарушения, включающего экспрессирующие СЭ38 клетки у субъекта, где способ включает введение терапевтически эффективного количества СЭ38ВР согласно настоящему изобретению субъекту, который в этом нуждается, в комбинации с ортопедическим вмешательством.
В одном воплощении настоящее изобретение представляет применение СЭ38ВР согласно настоящему изобретению для получения фармацевтической композиции для введения совместно пересадкой аутологичных периферических стволовых клеток или костного мозга для лечения множественной миеломы.
Ортопедическое вмешательство можно применять для лечения нарушения, включающего экспрессирующие СЭ38, например, множественной миеломы для вспомоществования в контроле боли или сохранении функции или подвижности. Такие вмешательства могут включать физиотерапию, шинирование костей для предотвращения или лечения переломов или хирургические подходы (малые или большие) для лечения переломов.
В одном воплощении СЭ38ВР согласно настоящему изобретению можно назначать в связи с доставкой одного или более агента, которые способствуют доступу СЭ38ВР или комбинированной композиции к внутренности опухоли. Такие способы можно, например, осуществлять вместе с доставкой релаксина, который способен расслабить опухоль (см., например, И8 6719977). В одном воплощении СЭ38ВР согласно настоящему изобретению может быть привязан к проникающему в клетку пептиду (СРР). Проникающие в клетку пептиды или родственные пептиды (например, сконструированные проникающие в клетку антитела) описаны, например, в 2Ьао е! а1., 1. Iттиηο1. Ме!Ьобк. 254(1-2), 137-45 (2001), Нопд е! а1., Сапсег. Кек. 60(23), 6551-6 (2000). Ыпбдгеп е! а1., ВюсЬет 1. 377(Р! 1), 69-76 (2004),
- 95 015584
Виегдег е! а1., 1. Сапсег. Вез. С1т. 0псо1. 129(12), 669-75 (2003), Роода е! з1., ЕΛδЕΒ 1. 12(1), 67-77 (1998) и Тзепд е! а1., Мо1. Рбагтасо1. 62(4), 864-72 (2002).
В одном воплощении настоящее изобретение представляет способ лечения нарушения, включающего экспрессирующие СБ38 клетки у субъекта, где способ включает введение терапевтически эффективного количества СБ38ВР согласно настоящему изобретению и по меньшей мере одного противовоспалительного агента субъекту, в этом нуждающемуся.
В одном воплощении настоящее изобретение представляет способ лечения множественной миеломы, где способ включает введение терапевтически эффективного количества СБ38ВР согласно настоящему изобретению и по меньшей мере одного противовоспалительного агента субъекту, в этом нуждающемуся.
В одном воплощении настоящее изобретение представляет применение СБ38ВР согласно настоящему изобретению для получения фармацевтической композиции для введения совместно по меньшей мере с одним противовоспалительным агентом для лечения множественной миеломы.
В одном воплощении такой противовоспалительный агент можно выбирать из стероидных лекарств и УАГО (нестероидных противовоспалительных лекарств).
В одном воплощении такой противовоспалительный агент можно выбирать из аспирина и других салицилатов, Сох-2 ингибиторов (например, рофекоксиба и целекоксиба), УАЮ (таких как ибупрофен, фенопрофен, напроксен, сулиндак, диклофенак, пироксикам, кетопрофен, дифлунизал, набуметон, этодолак, оксапрозин и индометацин), анти-[Е6В антител, анти-ВЕ антител, анти-ШЕЗ антител, анти-ШЕЗВ антител, анти-СБ4 антител, анти-СБ11а антител (например, эфализумаб), анти-альфа-4/бета-1 интегрина (¥ьА4) антител (например, натализумаб), СТЬА4-1д для лечения воспалительных заболеваний, преднизолона, преднизона, модифицирующих заболевание противоревматических лекарств (БМАКБз), таких как метотрексат, гидроксихлорокин, сульфазалазин, ингибиторов синтеза пиримидинов (например, лефлуномид), агентов, блокирующих ΙΠ-1 рецепторы (например, анакинра), агентов, блокирующих ТУ-а (например, этанерсепт, инфликсимаб и адалимумаб) и сходные агенты.
В одном воплощении настоящее изобретение представляет способ лечения нарушения, включающего экспрессирующие СБ38 клетки у субъекта, где способ включает введение терапевтически эффективного количества СБ38ВР согласно настоящему изобретению и по меньшей мере одного иммуносупрессивного и/или иммуномодуляторного агента субъекту в этом нуждающемуся.
В одном воплощении настоящее изобретение представляет способ лечения множественной миеломы, где способ включает введение терапевтически эффективного количества СБ38ВР согласно настоящему изобретению и по меньшей мере одного иммуносупрессивного и/или иммуномодуляторного агента субъекту в этом нуждающемуся.
В одном воплощении настоящее изобретение представляет применение СБ38ВР согласно настоящему изобретению для получения фармацевтической композиции для введения совместно с по меньшей мере одним иммуносупрессивным и/или имуномодуляторным агентом для лечения множественной миеломы.
В одном воплощении такой иммуносупрессивный и/или иммуномодуляторный агент можно выбирать из циклоспорина, азатиоприна, микофеноловой кислоты, микофенолата мофетила, кортикостероидов, таких как преднизолон, метотриксат, соли золота, сульфасалазин, противомалярийные агенты, брекинар, мизорибин, 15-деокиспергуалин, 6-меркаптопурин, циклофосфамид, рапамицин, такролимус (ЕК506), ОКТ3, противотимоцитный глобулин, тимопентин, тимозин-α и сходных агентов.
В одном воплощении такой иммуносупрессивный и/или иммуномодуляторный агент можно выбирать из иммуносупрессивных антител, например антител, связывающихся с МНС, СБ2, СБ3, СБ4, СБ7, СБ28, В7, СБ40, СБ45, ^N7, Т№-а, ΙΕ-4, ΙΕ-5, Ш-6В, Ι6-6; ЮЕ, ЮЕВ1, ΙΕ-7, ΙΕ-8, ΙΕ-10, СБ11а, или СБ58, или антител, связывающихся с другими лигандами.
В одном воплощении такой иммуносупрессивный и/или иммуномодуляторный агент можно выбирать из растворимых I^-15В, ΙΠ-10, В7 молекул (В7-1, В7-2, их вариантов и их фрагментов), Κ'Όδ и ОХ40, ингибитора регулятора отрицательных Т клеток (например, антитела против СТБА4) и сходных агентов.
В одном воплощении СБ38ВР согласно настоящему изобретению можно назначать в комбинации с одним или двумя иммуносупрессивными или иммуномодуляторными агентами, например, в комбинации с преднизолоном и циклоспорином; преднизоном, циклоспорином и азатиоприном или преднизолоном, циклоспорином и микофенолат мофетилом.
В одном воплощении настоящее изобретение представляет способ лечения нарушения, включающего экспрессирующие СБ38 клетки у субъекта, где способ включает введение терапевтически эффективного количества СБ38ВР согласно настоящему изобретению и анти-С3Ь(|) антитела субъекту, который в этом нуждается.
В одном воплощении настоящее изобретение представляет способ лечения множественной миеломы, где способ включает введение терапевтически эффективного количества СБ38ВР согласно настоящему изобретению и анти-С3Ь(|) антитела субъекту, который в этом нуждается.
- 96 015584
В одном воплощении настоящее изобретение представляет применение ί.Ό38ΒΡ согласно настоящему изобретению для получения фармацевтической композиции для введения совместно с анти-С3Ь(1) антителом для лечения множественной миеломы.
В одном воплощении терапевтический агент для применения в комбинации с ί.Ό38ΒΡ согласно настоящему изобретению для лечения нарушений, как описано выше, можно выбирать из ингибиторов гистон-деацетилазы (например, фенилбутирата) и/или агентов залечивания ДНК (например, ферменты залечивания ДНК и родственные композиции, как димерицин).
Способы согласно настоящему изобретению для лечения нарушений, как описано выше, включающие введение терапевтически эффективного количества ί.Ό38ΒΡ согласно настоящему изобретению, могут также включать направленную против рака фотодинамическую терапию (например, противораковую лазерную терапию, которую при необходимости можно практиковать с применением фотосенсибилизирующего агента, см., например, Ζйапд е! а1., 1. Соп!го1 Ве1еаве. 93(2), 141-50 (2003), противораковые терапии с помощью звуковых волн и волновых скачков (см., например, КатЬе е! а1., нит Се11. 10(1), 8794 (1997)), и/или противораковую нутрацевтическую терапию (см., например, ВоийеЬивй е! а1., Уе! С1ш №йй Ат 8та11 Атт ΡπκΙ. 34(И), 249-69, νίίί (2004) и ВаГ1, МЦгШоп. 20(1), 78-82 (2004)). Сходным образом, ί.Ό38ΒΡ согласно настоящему изобретению можно применять для получения фармацевтической композиции для лечения нарушений, как описано выше, чтобы назначать вместе с направленной против рака фотодинамической терапией (например, противораковой лазерной терапией, которую при необходимости можно практиковать с применением фотосенсибилизирующего агента, противораковых терапий с помощью звуковых волн и волновых скачков и/или противораковой нутрацевтической терапии).
Как описано выше, фармацевтическую композицию согласно настоящему изобретению можно назначать в комбинированной терапии, например в комбинации с одним или более агентом, относящимся к заболеванию или состоянию, которое надо лечить, либо в виде отдельных фармацевтических композиций, либо в составе рецептур с соединением согласно настоящему изобретению вместе с одним или более дополнительным терапевтическим агентом, как описано выше. Такие комбинированные терапии могут требовать более низких дозировок соединения согласно настоящему изобретению и/или совместно назначаемых агентов, таким способом предотвращая возможные токсические действия или осложнения, связанные с различными монотерапиями.
В одном воплощении настоящее изобретение представляет С^38ΒΡ, который конъюгирован с иммуномодулятором, таким как цитокин, фактор роста стволовых клеток, лимфотоксин (например, ТИЕ, например ТПГа), или гематопоэтический фактор. Примеры таких молекул, которые можно применять в качестве конъюгатов, включают ΙΕ-1, ΙΕ-2, ΙΕ-3, ΙΕ-6, ГС-10, ΙΕ-12, ГС-18 и ΙΕ-21, факторы стимуляции роста колоний (например, фактор стимуляции роста колоний гранулоцитов (С-С8Р) и фактор стимуляции роста колоний гранулоцитов макрофагов (СМ-С8Р)), интерфероны (например, ШЫа, ШЫв и Ш^), фактор роста стволовых клеток, называемый 81 фактор, эритропоэтин и тромбопоэтин, их активные фрагменты, их производные или их любые комбинации.
В одном воплощении ί.Ό38ΒΡ согласно настоящему изобретению можно применять ш νΐνο или ш νί!Γο для диагностики заболеваний, где активированные экспрессирующие СЭ38 клетки играют активную роль в патогенезе, с помощью детектирования уровней СЭ38 или уровней клеток, содержащих СЭ38 на поверхности своей мембраны. Этого можно достигнуть, например, с помощью контактирования образца для тестирования при необходимости вместе с контрольным образцом, с ί.Ό38ΒΡ в условиях, позволяющих образование комплекса между антителом и СЭ38. Образование комплекса далее детектируют (например, с помощью ЕЫ8А). Когда применяют контрольный образец вместе с тестируемым образцом, комплекс определяют в обоих образцах и любая статистически значимая разница в образовании комплекса между образцами указывает на присутствие СЭ38 в тестируемом образце.
Более специфично, настоящее изобретение представляет способы идентификации и диагностики инвазивных клеток и тканей и других клеток, на которые направлены ί.Ό38ΒΡ согласно настоящему изобретению и мониторинга прогресса терапевтических лечений, состояния после проведения лечения, риска развития рака, прогрессии рака и т.п.
В одном примере такого диагностического анализа настоящее изобретение представляет способ диагностики уровня инвазивных клеток в ткани, включающий образование иммунокомплекса между ί.Ό38ΒΡ и потенциально содержащими С^38ΒΡ тканями и детектирования образования иммунокомплекса, где образование иммунокомплекса коррелирует с присутствием инвазивных клеток в ткани. Контактирование можно проводить ш νΐνο, применяя меченые изолированные антитела и стандартные техники получения изображений, или можно проводить ш νίΐτο на образцах ткани.
ί.Ό38ΒΡ можно применять для детектирования СЭ38-содержащих пептидов и пептидных фрагментов в любом подходящем биологическом образце с помощью пригодных подходов. Примеры общепринятых иммуноанализов, предоставляемые согласно настоящему изобретению, включают без ограничения ЕЫ8А, ША, РАС8 анализы, анализ с помощью плазмонового резонанса, хроматографические анализы, иммуногистохимию тканей, блоттинг и/или иммунопреципитацию с применением С^38ΒΡ. Анти-СЭ38 антитела согласно настоящему изобретению можно применять для детектирования СЭ38 и фрагментов
- 97 015584
СЭ38 из человека. Подходящие метки для СЭ38ВР и вторичных антител, применяемые в таких подходах, включают, не ограничиваясь этим, различные ферменты, простетические группы, флуоресцентные материалы, люминесцентные материалы и радиоактивные материалы. Примеры подходящих ферментов включают пероксидазу из хрена, щелочную фосфатазу, β-галактозидазу или ацетилхолин-эстеразу; примеры подходящих комплексов простетических групп включают стрептавидин/биотин и авидин/биотин; примеры подходящих флуоресцентных материалов включают умбеллиферон, флуоресцеин, флуоресцеин изотиоцианат, родамин, дихлортриазиниламин флуоресцеин, дансил хлорид или фикоэритрин; примеры люминесцентных материалов включают люминол, примеры подходящих радиоактивных материалов включают 125Ι, 131Ι, 358 и 3Н.
СЭ38ВР можно также анализировать в биологических образцах с помощью конкурентного иммуноанализа, применяя СО38-пептидные стандарты, меченные детектируемыми веществами, и немеченый СИ38ВР, например немеченое анти-СО38 антитело. В таком анализе биологический образец, меченый СО38-пептидный стандарт(ы) и СЭ38ВР комбинируют и измеряют количество меченого СЭ38 стандарта, связанного с немеченым СЭ38ВР. Количество СЭ38 пептида в биологическом образце обратно пропорционально количеству меченого СЭ38 стандарта, связанного с СЭ38ВР.
СЭ38ВР особенно полезны для получения изображений опухолей ш νί\Ό. Получать изображения связанных с СЭ38 опухолей ш νί\Ό можно с помощью любой подходящей техники. Например, можно применять 99Тс-метку или другую метку с помощью другого излучающего гамма-лучи изотопа, чтобы пометить анти-СО38 антитела в опухоли или вторичные меченые (например, НТС меченые) СЭ38ВР СЭ38 комплексы из опухолей и получать изображение с помощью гамма-сцинцилляционной камеры (например, устройство Е1ксш! Арех 409ЕСТ), обычно с применением коллиматора для низких энергий и высокого разрешения или коллиматора для низких энергий и всех целей. Окрашенные ткани можно далее анализировать на радиоактивный счет в качестве индикатора количества СИ38-связанных пептидов в опухоли. Изображения, полученные с применением таких техник, можно применять для анализа биологического распределения СЭ38 у больного, млекопитающего или в ткани, например, с применением СЭ38 или фрагментов СЭ38 в качестве биомаркеров присутствия инвазивных раковых клеток. Варианты такой техники могут включать применения получения изображений с помощью магнитного резонанса (МК1) для улучшения изображений по сравнению с техникой гамма-камеры. Сходные способы и принципы иммуносцинтиографии описаны, например, в 8пуак!ауа (ей.), Кайю1аЬе1ей Мопос1опа1 АпйЬоФек Еог Ипадтд Апй Тйегару (Р1епит Ргекк, 1988), С1аке, Мейюа1 Аррйсайопк ок Кайю1ко!орек, ш Кетшд!оп'к Р1агтасеийса1 8с1епсек, 1811 Еййюп, Сеппаго е! а1. (ейк.), р. 624-652 (Маск РиЬйкЫпд Со., 1990), апй Вго^п, С11шса1 Ике ок Мопос1опа1 АпйЬоФек, ш Вю!ес1то1оду Апй РНагтасу 227-49, Реххи!о е! а1. (ейк.) (Сйартап & На11, 1993). Такие изображения можно также применять для целевой доставки противораковых агентов, примеры которых описаны здесь (например, агенты апоптоза или СН0Р химиотерапевтические композиции). Далее, такие изображения могут также или альтернативно служить основой для хирургических подходов к удалению опухолей. Далее, такое получение изображений ш νί\Ό может позволять идентифицировать и локализовать опухоли в случае, когда у пациента признано наличие опухоли (из-за присутствия других биомаркеров, метастаз и т. д.), но рак нельзя идентифицировать с помощью традиционных аналитических подходов. Все эти способы являются свойствами настоящего изобретения.
Получение изображений ш νί\Ό и другие диагностические способы, предоставленные настоящим изобретением, особенно полезны при детектировании микрометастаз у больного человека (например, больного, у которого ранее не диагностировали рак, или больного в периоде выздоровления/ремиссии от рака). Показано, что раковые клетки карциномы, которые могут составлять до 90% всех раковых клеток, окрашиваются очень хорошо с помощью композиций с конъюгатами СЭ38 антитела. Детектирование с помощью моноклональных анти-СИ38 антител и других СИ38ВР, описанных здесь, может указывать на присутствие карцином, являющихся агрессивными/инвазивными, и также или альтернативно предоставлять индикацию осуществимости применения родственных моноклональных анти-СИ38 антител, СЭ38ВР или родственных композиций против таких микрометастаз. Далее, моноклональные анти-СИ38 антитела, направленные на раковые клетки, в большей степени способны отличать такие связанные с раком ткани и клетки от нормальных клеток, с которыми могут быть связаны другие формы СЭ38.
В одном воплощении настоящее изобретение представляет способ получения изображений ш νίνΌ, где СИ38ВР, например анти-СИ38 антитело согласно настоящему изобретению, конъюгировано со способствующим детектированию радионепроницаемым агентом, конъюгированное антитело дают хозяину, например, посредством инъекции в кровоток и анализируют наличие и расположение меченых антител у хозяина. С помощью этой техники и любого другого диагностического подхода, предоставленного здесь, настоящее изобретение представляет способ скрининга на наличие связанных с заболеванием клеток у больного человека или в биологическом образце, взятом у больного человека.
Для получения изображений с целью диагностики радиоизотопы могут быть связаны с СЭ38ВР прямо или непрямо с применением промежуточной функциональной группы. Применимые промежуточные функциональные группы включают хелаторы, например этилендиаминтетрауксусную кислоту и диэтилентриаминпентауксусную кислоту (см., например, И8 5057313). В таких диагностических анализах, включающих конъюгированные с радиоизотопом СИ38ВР, дозировку конъюгированного пептида, дос
- 98 015584 тавляемого больному, обычно поддерживают на возможно наиболее низком уровне посредством подбора изотопа для лучшего сочетания минимального времени полужизни, минимального удержания в организме и минимального количества изотопа, которое позволит детекцию и точное измерение.
В дополнение к радиоизотопам и непроницаемым для радиации агентам диагностические способы можно проводить с применением СЭ38ВР, конъюгированных с красителями (например, с комплексом биотин-стрептавидин), контрастирующими агентами, флуоресцентными соединениями или молекулами и усиливающими агентами (например, парамагнитными ионами) для получения изображений с помощью магнитного резонанса (МК1) (см., например, И8 Ра!. №. б331175, описывающий техники МК1 и получение антител, конъюгированных с усиливающими МК1 агентами). Такие агенты для диагностики/детектирования можно выбирать из агентов для применения в получении изображений с помощью магнитного резонанса и флуоресцентных соединений. Чтобы нагрузить СО38ВР, например антитело, соединением с радиоактивными металлами или парамагнитными ионами, может потребоваться взаимодействие его с реагентом, обладающим длинным хвостом, к которому присоединены множественные или хелатирующие группы для связывания ионов. Такой хвост может быть полимером, таким как полилизин, полисахарид или другие дериватизированные или дериватизируемые цепи с подвешенными группами, к которым можно присоединять хелатирующие группы, например порфирины, полиамины, краун-эффиры, бистиосемикарбазоны и подобные группы, известные для применения с такой целью. Хелаторы можно присоединить к СЭ38ВР с помощью стандартных химических подходов. Хелаторы обычно связаны с СЭ38ВР, например, анти-СО38 тАВ с помощью группы, позволяющей образование связи с молекулой при минимальной потере иммунореактивности и минимальной агрегации и/или внутренней сшивкой. Другие более обычные способы и реагенты для конъюгирования хелаторов с антителами раскрыты, например, в И8 4824б59. Примеры потенциально пригодных сочетаний металл-хелатор включают 2бензил-ДТПА и его монометильный и циклогексильный аналоги, применяемые с изотопами для диагностики в основном интервале энергии от б0 до 4000 кЭв, например 125Ι, 123Ι, 124Ι, б2Си, б4Си, 18Е, 1П1п, б7Са, б7Са, 99Тс, 94Тс, С 13К 1и 7бВК для получения радиоизображений. Такие и сходные с ними хелаторы при образовании комплексов с нерадиоактивными металлами, такими как марганец, железо и гадолиний, могут применяться для МК1 диагностических подходов в связи с СЭ38ВР. Макроциклические хелаторы, например NОТА, Э0ТЛ и ТЕТА, применимы с разными металлами и радиоактивными металлами, в особенности с радиоактивным галлием, иттрием и медью соответственно. Такие комплексы металл-хелатор можно сделать очень стабильными посредством подбора размера цикла для рассматриваемого металла. Другие хелаторы циклического типа, например макроциклические полиэфиры, которые нужны для стабильного связывания изотопов, например 223Ка для КА1Т, также могут подходить для диагностических способов.
Таким образом, настоящее изобретение представляет диагностические конъюгаты СЭ38ВР, где СЭ38ВР конъюгирован с контрастным агентом (например, для получения изображений с помощью магнитного резонанса, компьютерной томографии или агентом, усиливающим ультразвуковой контраст) или радиоактивным изотопом, который может быть, например, излучателем гамма-, бета-, альфа-лучей, электронов Оже или позитронов. Дополнительные применимые конъюгированные СЭ38ВР описаны здесь в другом месте, которые также могут применяться в диагностических подходах и композициях (например, наборах для диагностики), предоставляемых данным изобретением.
В одном воплощении настоящее изобретение представляет набор для диагностики рака, включающий контейнер с СЭ38ВР, например с анти-СО38 антителом, и один или более реагент для детектирования связывания СЭ38ВР с СЭ38 пептидом. Реагенты могут включать, например, флуоресцентные довески (таги), ферментативные таги и другие детектируемые таги. Реагенты могут также включать вторичные или третичные антитела или реагенты для ферментативных реакций, где ферментативная реакция производит продукт, который можно увидеть. В одном воплощении настоящее изобретение представляет набор для диагностики, включающий один или более СЭ38ВР, например анти-СО38 антитела согласно настоящему изобретению в меченой или немеченой форме в подходящем контейнере(ах), реагенты для инкубации для непрямого анализа и субстраты или дериватизующие агенты для детекции при таком анализе в зависимости от природы метки. Контрольные реагенты и инструкции по применению также могут быть включены.
Диагностические наборы можно поставлять для применения с СЭ38ВР, например, конъюгированным/меченым анти-СО38 антителом для детектирования клеточной активности или для детектирования наличия СЭ38 пептидов в образце ткани или организме хозяина. В таких диагностических наборах, а также в наборах для терапевтического применения, описанных здесь, СЭ38ВР обычно предоставлен в лиофилизованной форме в контейнере один или вместе с дополнительными антителами, специфичными для клетки или пептида мишеней. Обычно фармацевтически приемлемый носитель (например, инертный растворитель) и/или его компоненты, например Трис, фосфатный или карбонатный буфер, стабилизаторы, консерванты, биоциды, инертные белки, например бычий сывороточный альбумин и т. п., также включены (обычно в отдельном контейнере для смешивания), а также дополнительные реагенты (также обычно в отдельном контейнере(ах)). В определенных наборах вторичное антитело, способное связываться с анти-СО38 антителом или другими СЭ38ВР, которое обычно находится в отдельном контейне
- 99 015584 ре, также включено. Вторичное антитело обычно конъюгировано с меткой и включено в рецептуру по способу, сходному с таковым для анти-СО38 антитела или другого СЭ38ВР согласно настоящему изобретению.
С помощью способов, описанных выше и в других местах текста, СЭ38ВР можно применять для определения подмножества раковых/опухолевых клеток и характеризовать такие клетки и родственные ткани/разрастания.
В одном примере СЭ38ВР или анти-СО38 антитело можно добавлять к нитроцеллюлозе или к другой твердой подложке, способной к иммобилизации клеток, клеточных частиц или растворимых белков. Такую подложку можно затем промыть подходящими буферами с последующей обработкой меченым ί.Ό38 пептидом или антителом. Твердую подложку можно затем промыть буфером второй раз для удаления несвязанного пептида или антитела. Количество связанной метки на твердой подложке можно затем определить с помощью известных способов.
Связанные ферменты, которые реагируют с доступным субстратом, можно применять для получения химического звена, которое можно детектировать, например, спектрофотометрически, флуориметрически или визуальными способами в окружении СЭ38ВР конъюгатов и/или составных белков. Ферменты, которые можно применять для детектируемого мечения СЭ38ВР и анти-С.'О38 антител, включают малат-дегидрогеназу, стафилококковую нуклеазу, дельта-5-стероид изомеразу, дрожжевую алкогольдегидрогеназу, альфа-глицерофосфад-дегидрогеназу, триозофосфат-изомеразу, пероксидазу из хрена, щелочную фосфатазу, аспарагиназу, глюкозоксидазу, бета-галактозидазу, рибонуклеазу, уреазу, каталазу, глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназу, глюкоамилазу и ацетилхолинэстеразу. Можно также пометить СЭ38ВР флуоресцентным соединением. Когда антитело с флуоресцентной меткой освещают светом нужной длины волны, его присутствие можно детектировать по флуоресценции. Среди наиболее широко применяемых флуоресцентных метящих агентов находятся флуоресцеин изотиоцианат, родамин, фикоэритрин, фикоцианин, аллофикоцианин, о-фтальдегид и флуорескамин.
СО38ВР, например, анти-С.'О38 антитела можно также детектируемым способом метить с помощью излучающих флуоресценцию металлов, например 152Еи или других из серии лантанидов. Такие металлы можно присоединять к анти-С.'О38 антителу, например, с помощью таких хелатирующих металлы групп, как диэтилентриаминпентауксусная кислота (ДТПА) или этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА).
СЭ38ВР и анти-С.'О38 антитела можно также детектируемым способом пометить с помощью соединения с хемилюминесцентным соединением. Присутствие хемилюминесцентно-меченого СЭ38ВР далее определяют с помощью детектирования наличия люминесценции, которая появляется по ходу химической реакции. Примерами особенно применимых хемилюминесцентных меток являются люминол, изолюминол, тероматический эфир акридиния, имидазол, соль акридиния и эфир оксалата.
Сходным образом можно применять биолюминесцентные соединения, чтобы пометить СЭ38ВР. Биолюминесценция является типом хемилюминесценции, обнаруженной в биологических системах, при которой каталитический белок увеличивает эффективность хемилюминесцентной реакции. Присутствие биолюминесцентного белка определяют по наличию биолюминесценции. Важными биолюминесцентными соединениями для целей внесения метки являются люциферин, люцифераза и экворин.
Детектирование меченого пептида или антитела, фрагмента антитела или производного можно проводить с помощью сцинтилляционного счетчика, например, если детектируемая метка является гаммаизлучателем, или с помощью флуориметра, например, если метка является флуоресцентным материалом. В случае ферментативной метки детектирование можно проводить с помощью колориметрических способов, включающих субстрат фермента. Детектирование можно также проводить с помощью зрительного сравнения степени ферментативного превращения субстрата по сравнению со сходным образом полученным стандартом.
Эти и другие диагностические приемы можно применять для скрининга любого подходящего материала на ί.Ό38 пептиды или ί.Ό38 фрагменты. Примеры материалов, которые можно подвергать скринингу, включают, например, кровь, сыворотку, лимфу, мочу, воспалительный экссудат, спинномозговую жидкость, околоплодную жидкость, экстракт или гомогенат ткани и т. п. Однако настоящее изобретение не ограничивается анализом с применением только этих образцов, для специалиста в данной области возможно определить условия, позволяющие применять другие образцы.
Детектирование 1п кйи можно проводить посредством взятия у больного биологического образца и добавления комбинации меченых СО38ВР, например, анти-СО38 антител согласно настоящему изобретению такому образцу. СО38ВР, анти-С.'О38 антитело (или фрагмент) согласно настоящему изобретению можно добавлять посредством приложения или наложения меченого СО38ВР, например, меченого антиί.Ό38 антитела (или фрагмента) согласно настоящему изобретению на биологический образец. С помощью такой процедуры можно определять не только наличие ί.Ό38 или фрагментов СО38, а также распределение таких пептидов в исследуемой ткани (например, для анализа распространения раковых клеток). Применяя настоящее изобретение, рядовые специалисты в данной области легко поймут, что любой из широкого разнообразия гистологических подходов (например, процедуры окрашивания) можно модифицировать, чтобы получить такое детектирование 1п кйи.
Настоящее изобретение далее представляет способ содействия продаже и/или применению СЭ38ВР
- 100 015584 согласно настоящему изобретению, включающий распространение информации (например, с помощью печатных материалов, которые раздаются, рассылаются и т. п. с помощью рекламы, телевизионных программ и объявлений, с помощью радиопрограмм и объявлений, рассылки участка в Интернете, по электронной почте и посредством телемаркета, с помощью распространения по квартирам и людям, с помощью финансовой поддержки и проведения конференций, панелей, форумов и т.д., посредством найма разносчиков и продавцов и/или медицинских/научных связей, посредством финансирования и проведения научных исследований и публикаций, относящихся к применению и т.д.), относящейся к применению соединения для предотвращения или лечения любого состояния или комбинации состояний, как описано здесь, среди любых людей и сообществ возможного интереса (например, фармацевтических цепей, менеджеров формуляров, страховых компаний, ΗΜ0, больниц и больничных цепей, других организаций здравоохранения, менеджеров аптечного дела, потенциальных больных, больных раком, ранее больных раком, больных в состоянии ремиссии, терапевтов первого обращения, врачей или фармацевтов и/или лидеров общественного мнения).
Настоящее изобретение также представляет наборы, включающие фармацевтические композиции с соединением согласно настоящему изобретению и инструкции для применения. Набор может еще содержать один или более дополнительный агент, например иммуносупрессивный реагент, химиотерапевтический реагент, противовоспалительный агент или радиоизотопный агент, как описано выше, или один или более дополнительный ί.Ό38ΒΡ согласно настоящему изобретению (например, ΟΩ38ΒΡ, обладающий комплементарной активностью). Набор согласно настоящему изобретению может также включать диагностические агенты и/или другие терапевтические агенты. В одном воплощении набор согласно настоящему изобретению включает ί.Ό38ΒΡ согласно настоящему изобретению и диагностический агент для диагностики состояния или наличия нарушения, включающего экспрессирующие СЭ38 клетки у субъекта. В одном воплощении набор включает ί.Ό38ΒΡ согласно настоящему изобретению в высокостабильной форме (например, в лиофилизированной форме) в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем(ями), который можно смешивать с высокостабильной композицией для получения композиции для инъекций.
Все ссылки, включая публикации, патентные заявки и патенты, процитированные здесь, являются таким образом включенными в той же степени, как если бы каждая ссылка была индивидуально и специфично отмечена, как включенная посредством ссылки, и приведенной здесь полностью.
Все заголовки и подзаголовки применяются здесь для удобства только и не могут рассматриваться как ограничивающие изобретение никоим образом.
Все комбинации вышеописанных элементов во всех возможных вариантах охвачены настоящим изобретением, если не указано противное или если нет ясного противоречия контексту.
Применение терминов а и ;·ιη и !Ье и сходных ссылок в контексте описания настоящего изобретения следует рассматривать распространяющимися как на единственное, так и на множественное число, если не указано противное или если нет ясного противоречия контексту.
Указание интервалов и величин здесь просто служит как стенографический способ ссылки на каждую отдельную величину, попадающую в интервал, если не указано противное, и каждая отдельная величина включена в описание, как если бы она была индивидуально упомянута. Если не указано противное, все точные величины, предоставленные здесь, являются представительными для соответствующих приблизительных величин (например, все примерные величины, предоставленные по отношению к отдельному фактору или измерению, могут считаться предоставляющими соответствующее приблизительное измерение, модифицированное с помощью приблизительно, если требуется).
Все способы, описанные здесь, можно проводить в любом подходящем порядке, если не указано противное или если нет ясного противоречия контексту.
Применение любого и всех примеров или примерного языка (например, такой как, например), предоставленные здесь, должны просто лучше освещать настоящее изобретение и не накладывают ограничения на область притязаний настоящего изобретения, если не указано противное. Никакой язык в описании на должен рассматриваться как указующий на важность какого-либо элемента для практики настоящего изобретения, пока это не выражено ясно.
Цитирование и включение документов патентов здесь производится только для удобства и не отражает какого-либо вида на ценность, патентоспособность и/или возможность принудительного воплощения таких патентных документов.
Описание здесь любого воплощения настоящего изобретения с применением таких терминов, как составляющий, обладающий, включающий или содержащий по отношению к элементу или элементам должно предоставлять поддержку для сходного воплощения настоящего изобретения, которое состоит из, состоит в основном из или в основном включает этот отдельный элемент или элементы, если не указано противное или если нет ясного противоречия контексту (например, композицию, описанную здесь, включающую отдельный элемент, следует понимать как описывающую также композицию, состоящую из этого элемента, если не указано противное или если нет ясного противоречия контексту).
Настоящее изобретение включает все модификации и эквиваленты предмета рассмотрения, упомяну
- 101 015584 тые в воплощениях, представленных здесь в максимальной степени, разрешенной применимым законом.
Все патенты, использованные патенты и другие публикации, процитированные здесь, включены в описание посредством ссылки полностью.
Настоящее изобретение далее проиллюстрировано следующими примерами, которые не следует рассматривать как лимитирующие.
Примеры
Пример 1.
Получение трансфицированных люциферазой (Баиб1-1ис) клеток.
Культуру клеток Баиб1 (происходящих из лимфомы Беркитта) культивируют в культуральной среде РРМI 1640, дополненной 10% ЕС8 (0р!1тит С241, А1кеп! Шс., 81. Вгипо, ОС, Сапаба), 2 мМ Ь-глютамина, 100 ГО/мл пенициллина, 100 мг/мл стрептомицина, 1 мМ пирувата натрия (все получены из С1Ьсо ВРБ, ЫГе ТесНпо1од1ек, Ра1к1еу, 8со!1апб). Среду обновляют дважды в неделю. Перед трансфекцией клетки разделяют и рассевают при 1-1,5х106 клеток/мл для обеспечения жизнеспособности и оптимального роста.
Трансфекция люциферазой.
8,2х106 СБ38+ клеток Баиб1 отбирают в 300 мкл РРМI (дополненной 10% бЕС8, С1Ьсо ВРБ) и переносят в кювету для электропорации (Вюгаб, №те1 Ηетрк!еаб, №1!^ ИК). Затем добавляют 40 мкг βΑΙΖ люциферазы из СТ8 (А^беν^οη, Еагдо, N0, И8А) и 10 мкг рРиг вектора (ВБ Вюкс1епсек, А1рНеп а/б Руп, ТНе №1Нег1апбк), придающего устойчивость к пуромицину. После выдерживания клеток на льду в течение 10 мин клетки подвергают электропорации (250 В, 950 мкФ; Сепе Ри1кег ΙΙ, Вюгаб БаЬога!ог1ек СтЬИ МипсНеп, Сегтапу). Клетки опять выдерживают на льду и отбирают в 40 мл РРМI (дополненной 10% ЕС8). Затем клетки рассевают на плате для культуры тканей на 96 ячеек (100 мкл/ячейку). Через 48 ч добавляют пуромицин (конечная концентрация 1 мкг/мл 8|§та-А1бпс11 СНет1е ВУ, Ζνί^κΛ!, ТНе №!Нег1апбк). Устойчивые к пуромицину клоны далее выращивают на платах для культуры тканей на 24 ячейки.
Определение люциферазной активности.
Люциферазную активность клеток определяют с помощью системы анализа люциферазы (#Е4030, Рготеда, Маб1коп, А1, И8А), 1х105 клеток центрифугируют (13500 об/мин, 1 мин) в центрифуге фирмы Эппендорф и осадок промывают в 100 мкл РВ8. После центрифугирования (13500 об/мин, 1 мин) осадок лизируют с 20 мкл Реройег Бук1к ВиГГег (Рготеда), замораживают и оттаивают. После центрифугирования (13500 об/мин, 1 мин) 20 мкл супернатанта отбрасывают и добавляют 100 мкл реагента для люциферазного анализа (в специальных люминометрических пробирках, Рготеда). Люминесценцию измеряют (10 с) в люминометре (БВ9507, ВеШо1б, У1Роогбе, Ве1дшт).
Пример 2.
Иммунизация мышей и получение гибридом.
Протокол иммунизации для -003.
Мышей Η^12 иммунизируют каждые две недели с помощью 20 мкг очищенного ΗΛ-ΕΌ38. Первую иммунизацию проводят интраперитонеально (1.р.) в присутствии 100 мкл РВ8, смешанного с 100 мкл полного адъюванта Фрейнда (СЕА). После первой иммунизации последующие поддерживающие введения (13х) очищенного ΗΛ-С^38 проводят в присутствии 100 мкл РВ8, смешанного с 100 мкл ^сотрШе Егеипб'к Аб^ап! (ША), чередуя к.с. и Бр. После развития титра мышей поддерживают с помощью 20 мкг ΗΛ-С^38 в РВ8, ί.ν.
Протокол иммунизации для -005 и -024.
Мышей Η^12 иммунизируют каждые две недели с помощью 20 мкг очищенного ΗΛ-С^38, чередуя с МШ-3Т3-СБ38 трансфицированными клетками. Первую иммунизацию проводят с помощью 5х106 клеток в 100 мкл РВ8, смешанного с 100 мкл СЕА, 1.р., вторую и последующие иммунизации с применением ΗΛ-С^38 к.с, в присутствии 100 мкл РВ8, смешанного с 100 мкл РА. Следующие иммунизации трансфицированными клетками проводят в присутствии 200 мкл РВ8. После развития титра мышей поддерживают с помощью 20 мкг ΗΛ-С^38 в РВ8, ί.ν.
Генерация гибридом, продуцирующих моноклональные антитела человека к СБ38.
Клетки селезенки мыши изолируют из Η^12 мышей и вводят вместе с ПЭГ в клеточную линию миеломы мыши, основываясь на стандартных протоколах. Получающиеся гибридомы подвергают скринингу на продукцию антител человека с помощью БЫЗА и на СБ38-специфичность с помощью СБ38трансфицированных N8/0 клеток с помощью ЕАС8 анализа и на связывание рекомбинантного белка ΗΛСБ38 с помощью ЕМЗА. Отбирают три клеточные линии гибридомы, экспрессирующие моноклональные анти-СБ38 антитела человека, -003, -005 и -024 соответственно.
Пример 3.
Трансфекция NIΗ клеток с помощью СБ38.
Вектор рс1рцгоСБ38 для продукции N^-^№3-6^38 получают от РгоГ. М. С1епше (Тепот РекеагсН ЬаЬога!огу, 8ои!Натр!оп Сепега1 ^крйаЬ 8ои!Натр!оп, ИК). NIΗ-3Т3 клетки (^8МΖ, АСС 59; 150000 клеток/ячейку; 0,5 мл; плоскодонная плата на 96 ячеек, Сгетег) культивируют в БМЕМ (допол
- 102 015584 ненной глюкозой (4,5 г/л), 10% РС8, Ь-глютамин, №-пируват; ВюХУНШакег) в течение 24 ч. Затем ДНК (0,8 мкг) и липофектамин (ТвдИгодеп, Вгеба, ТЬе №!Ьег1апбк) разводят в БМЕМ и смешивают (20 мин, комн. темп). Далее смесь (100 мкл) добавляют в каждую ячейку и инкубируют (в течение ночи, 37°С).
Скрининг на экспрессию СБ38.
Клетки №Н-3Т3-СБ38 промывают (в 1 мл РВ8) и обрабатывают трипсином (200 мкл, трипсинЭДТА, ВюХУНШакег). Затем добавляют 1 мл БМЕМ и смесь переносят пипеткой в пробирки для РАС8. После центрифугирования (1200 об/мин, 5 мин) клетки промывают в РАС8 буфере (РВ; РВ8, 0,05% БСА, 0,02% NаNз) и суспендируют в 1 мл РВ. После центрифугирования (1200 об/мин, 5 мин) супернатант удаляют и добавляют мышиные античеловеческие СБ38-РЕ (разведение 1/50, 8апдшп, Ашк!егбаш, ТЬе №!Ьег1апбк). После промывки клеток два раза в РВ клетки ресуспендируют в РВ для проведения проточной цитометрии.
Разведение и селекция.
После обработки трипсином клетки переносят во флаконы Т25 (Сгетег) в БМЕМ (дополненной глюкозой 4,5 г/л, 2 мМ Ь-глутамином и пуромицином (2 мкг/мл) ВюХУНШакег). Устойчивые к пуромицину клетки тестируют на стабильность экспрессии СБ38 с помощью проточной цитометрии через две недели на среде с пуромицином. Отобранные МН-3Т3-СБ38 клетки субклонируют с помощью ограниченного разведения. После размножения клеток все 15 МН-3Т3-СБ38 подвергают скринингу на экспрессию СБ38. №Н-3Т3-СБ38 клетки с высокой экспрессией СБ38 замораживают в жидком азоте (-80°С) до применения.
Культура МН-3Т3-С’Б38 клеток.
Клетки культивируют в БМЕМ (дополненной глюкозой (4,5 г/л), 10% РС8, 2 мМ Ь-глютамином, №-пируватом, пенициллином, стрептомицином). Клетки пассируют дважды в неделю с применением трипсина/ЭДТА и рассевают в концентрации 1 х 106 клеток/флакон Т25. МН-3Т3-СБ38 клетки с высокой экспрессией СБ38 замораживают в жидком азоте (-80°С) до применения.
Очистка НА-СБ38 антигена.
Сефарозу 4В (АшегкЬаш Вюкаепсе, Иррка1а, 8\\'ебеп) сопрягают с анти-СБ38 антителом (8его!ес, 0хГогб, ИК). Колонку (колоночная трубка НК5/20 упакована на 12 см носителя в высоту, объем колонки 2,4 мл; максимальная скорость тока 0,5 мл/мин) уравновешивают по меньшей мере 5 объемами колонки (СУ) буфера РВ8. Образцы фильтруют и наносят на колонку. Колонку промывают РВ8, пока сигнал не вернется на базовую линию (приблизительно 3 СУ). Элюцию проводят 0,1 М глицином при рН 2. Элюированные фракции нейтрализуют 1% (ν/ν) 2 М Трис-НС1, рН 9.
Очистка анти-СБ38 антител.
Анти-СБ38 антитела человека очищают из супернатантов культуры ткани. Во-первых, супернатанты фильтруют через 0,2 мкМ фильтр с прямым потоком. Затем супернатант наносят на 5 мл колонку с белком А (гРго!ет А РР, АшегкЬаш Вюкаепсе) и элюируют 0,1 М лимонной кислотой-№0Н, рН 3. Элюат немедленно нейтрализуют с помощью 2М Трис-НС1, рН 9 и диализуют в течение ночи против 12,6 мМ фосфата натрия, 140 мМ №С1, рН 7,4 (В. Вгаип, 0кк, ТЬе №!Ьег1апбк). После диализа образцы стерилизуют фильтрованием через 0,2 мкм фильтр с прямым током.
Очистка объемов Н1к-СБ38.
Белок находится в супернатанте клеточной культуры клеток, экспрессирующих Н1к-СБ38 с конструкцией ДНК, содержащей последовательность для внеклеточного домена СБ38. Дополнительная последовательность из нескольких остатков гистидина (ро1у-Н1к-1ад) включена в конструкцию и находится на №конце белка. Такой таг позволяет очищать с помощью хроматографии на аффинной колонке с иммобилизованным металлом. В этом процессе хелатор, зафиксированный на хроматографическом носителе, заряжен катионами Со2+. В частности, последовательность, которая включает 6 аминокислотных остатков гистидина, прочно связывает Со2+. Поэтому СБ38 белки с гистидиновым тагом прочно связываются с такой колонкой, в то время как другие присутствующие в культуральном супернатанте белки проходят сквозь колонку или вымываются. Прочносвязанные белки СБ38 с гистидиновым тагом затем элюируют буфером, содержащим имидазол, который конкурирует с гистидином за связывание с Со2+. Когда очищено достаточно Н1к-СБ38, элюент удаляют из белка с помощью замены буфера на колонке для обессоливания.
Пример 4.
Связывание -003, -005 и -024 с СБ38-трансфицированными СНО (СН0-СБ38) клетками, с Баиб1-1ис клетками и свежими опухолевыми клетками множественной миеломы (ММ).
После сбора и подсчета Баиб1-1ис клетки СНО клетки, трансфицированные СБ38, и контрольные клетки ресуспендируют в РВ8 (1х 106 клеток/мл). Затем клетки помещают на платы с У-образным дном на 96 ячеек (100 мкл/ячейку) и дважды промывают в РВ8-БСА (РВ8, дополненный 0,1% БСА и 0,02% азида натрия). Затем 50 мкл раствора антитела в РВ8-БСА добавляют к клеткам (4°С, 30 мин). После трехкратной промывки в РВ8-БСА добавляют 50 мкл (1:400 разведение) кроличьего античеловеческого [дС-РИС в РВ8-БСА (4°С в темноте 30 мин). Клетки промывают три раза и специфическое связывание СБ38-антител с СН0-СБ38 и Баиб1-1ис клетками детектируют с помощью проточной цитометрии.
- 103 015584 ниМаЬ-КЬн (моноклональное антитело человека против КЬн (гемоцианина моллюска морское блюдечко), полученное в СептаЬ В.У., И1гесЫ, ТНе №111ег1апб5 с помощью протоколов иммунизации, описанных здесь в другом месте, применяют в качестве контроля. Фиг. 1 и 2 показывают, что -003, -005 и -024 связываются с СНО-СИ38 клетками и с ИаибМис клетками, хотя и с разными ЕС50 (табл. 1). Никакого связывания с контрольными СНО клетками не наблюдалось (данные не показаны). Свежие ММ опухолевые клетки получают от Иг. ЬокНогЦ (ИптегШу Мебюа1 Сеп1ег ЫгесНЕ ИГгесЫ, ТНе №111ег1апб5). Клетки опухоли изолируют из костного мозга больных множественной миеломой с помощью центрифугирования в градиенте фикола (Вю VН^ΐίаке^; среда разделения лимфоцитов, номер по каталогу 17-829Е). После сбора и подсчета клетки ММ (100,000 клеток/ячейку) ресуспендируют с 25 мкл НТС-меченых СИ38специфичных антител и 25 мкл СИ138. После инкубации (4°С, 30 мин) клетки промывают в РВ8-БСА и добавляют РЕ-меченый козий антимышиный иммуноглобулин (1:200 Басккоп IттиηοЯе8еа^ск Еигоре Ыб. 8оНат, ИК). После инкубации (4°С, 30 мин) и промывки клеток в РВ8-БСА измеряют флуоресценцию с помощью проточной цитометрии.
Фиг. 3 показывает, что -003, -005 и -024 связываются с ММ клетками.
Таблица 1 Величины ЕС50 для связывания анти-СИ3 антител на СИ0-СИ38 клетках, Иаиб1-1ис клетках и свежих ММ опухолевых клетках
СО38-специфичные антитела ЕС50 СНО-СО38 (мкг/мл) ЕС,5(> ОаисЫис (мкг/мл) ЕС?!} ММ клетки (мкг/мл)
-003 0,54 0,26 0,56
-005 0,23 0,09 0,04
-024 0,08 0,05 0,02
Пример 5.
Зависимая от антитела опосредованная клеткой цитотоксичность.
Клетки Иаиб1-1ис, свежие опухолевые клетки множественной миеломы, свежие опухолевые клетки лейкоза плазматических клеток и клетки множественной миеломы Л<6Ь и АМО-1 собирают (5х106 клеток) в ЯРМЕ' (культуральная среда ΚРМI 1640, дополненная 10% большой сыворотки теленка (ИуС1опе, Ьодап, ИТ, И8А)), к которой добавляют 100 μθ 51Сг (С11готшт-51; АтегкНат Вюкаепсек Еигоре СтЬн, Яоо§епбаа1, ТНе №4Нег1апб§) и смесь инкубируют в водяной бане на 37°С в течение 1 ч. После промывки клеток (дважды в РВ8, 1500 об/мин, 5 мин) клетки суспендируют в ЯРМЕ' и считают с помощью эксклюзии трипанового синего. Клетки доводят до концентрации 1х 105 клеток/мл.
Получение эффекторных клеток.
Свежие мононуклеарные клетки периферической крови (здоровые добровольцы, ИМС МгесНЕ И1гесН1, ТНе NеιНе^1аηб5) изолируют из 40 мл гепариновой крови с помощью фикола (Вю VН^ΐίаке^; среда разделения лимфоцитов, кат. № 17-829Е) согласно инструкции производителя. После суспендирования клеток в ЯРМЕ' клетки считают с помощью эксклюзии трипанового синего и доводят до концентрации 1 х107 клеток/мл.
Постановка АИСС.
мкл 51Сг-меченых клеток мишени помещают с помощью пипетки на плату на 96 ячеек и добавляют 50 мкл антитела, разведенного средой ЯРМЕ' (конечные концентрации 10, 1, 0,1, 0,01 мкг/мл). Клетки инкубируют (комн. темп., 15 мин) и добавляют 50 мкл эффекторных клеток, что приводит к соотношению эффектора к мишени 100:1 (для определения максимального лизиса добавляют 100 мкл 5% Тритона Х-100 вместо эффекторных клеток; для определения спонтанного лизиса добавляют 50 мкл клеток мишени и 100 мкл ЯРМГ++). Клетки центрифугируют (500 об/мин, 5 мин) и инкубируют (37°С, 5% СО2, 4 ч). После осаждения клеток (1500 об/мин, 5 мин) собирают 100 мкл супернатанта в пробирки тюгошс и считают с помощью гамма-счетчика. Процент специфического лизиса рассчитывают следующим способом:
(срт образца-срт только клеток мишени)/(срт максимального лизиса-срт только клеток мишени), где срт означает импульсы в минуту.
В клетках ИаибМис (фиг. 4 и табл. 2) -003, -005 и -024 индуцируют лизис с помощью АИСС, -003 и -005 проявляют себя несколько лучше, чем ритуксимаб (анти-СИ38 тАЬ). Интересно, что при применении свежих опухолевых клеток множественной миеломы (полученных от Иг. н. ЬокНогЦ ИМСИ, ТНе №4Нег1апб§) в качестве клеток мишени, АИСС индуцируется антителами -003, -005 и -024 (фиг. 5 и табл. 2).
Таблица 2
Величины ЕС50 для СО38-специфичных антител, полученные в АЭСС
СОЗ 8-специфичные антитела ЕС;о Ваи<й-1ис (нг/мл) ЕС50 ММ клетки (нг/мл)
-003 9,0 27
-005 4,5 5,7
-024 9,7 56
Обогащение мононуклеарных клеток Ег1апдеп периферической крови человека.
Кровь людей-добровольцев (университет Эрланген, Ег1апдеп, Сегшапу) разводят дважды средой
- 104 015584
1640 и наслаивают клетки крови на фикол (среда разделения лимфоцитов 1077 г/мл, 710 г, комн. темп., 20 мин; Вю VЬ^!ίакс^, СатЬгсх Вю 8с1спсс Усгу1Сг8, Усгу1Сг8, Вс1дшт, са!. 17-829Е, 1ο! πο. 014832). Мононуклеарные клетки периферической крови (МКС8) собирают из интерфазы, промывают и суспендируют в культуральной среде КРМ4 1640, дополненной 10% РС8, 2 мМ Ь-глютамином, 5 ед./мл пенициллин, 50 мкг/мл стрептомицина (все от Β^οVЬ^!ίакс^), к которой добавляют 25 мМ НЕРЕ8 (ΠίονΗΚΕ-ιΙ^ι·).
Постановка АЭСС II.
Клетки мишени (свежие опухолевые клетки лейкоза плазматических клеток, Ж6Й и АМО-1 линии В-клеток от Όγ. Т. Уа1сгш8, ипАсгеОу οΓ Ег1аидсп, Ег1апдсп, Сегтаиу) метят с помощью 20 μΕί 51Сг (Атсг8Йат Вю8С1епсс8, ирр8а1а, 8\\'сйсп) в течение 2 ч. После промывки большим количеством КРМЕ10 клетки доводят до 1х105 клеток/мл. МАСА (50 мкл), сенсибилизированные антитела (50 мкл) и КРМЫ0 (50 мкл) помещают на круглодонные платы для микротитра (Сгетег Вю-0пс СтЬН, Рпскспйаи8сп, Ссгтапу). Анализ начинают добавлением свежих опухолевых клеток лейкоза плазматических клеток, Ж6Й или АМО-1 клеток (50 мкл) с получением конечного объема 200 мкл. Применяют соотношение эффектора к мишени (Э:Т) 40:1. После инкубации (3 ч, 37°С) реакцию останавливают посредством центрифугирования и высвобождение 51Сг измеряют с тройным повтором в импульсах в минуту (срт) в сцинтилляционном счетчике. Процент клеточной токсичности рассчитывают с помощью следующей формулы:
% специфического лизиса=(экспериментальный срт-базовый срт)/(максимальный срт-базовый срт)х 100, где максимальное высвобождение 51Сг определяют с помощью добавления перхлорной кислоты (3% конечная концентрация) к клеткам мишени и базовое высвобождение измеряют в отсутствие сенсибилизированных антител и эффекторных клеток.
У обеих клеточных линий множественной миеломы (Ж6Ь и АМО-1) лизис индуцируется как -003, так и -005 (фиг. 6 и 7), даже когда экспрессия СО38 низкая (АМО-1 линия клеток).
-003, -005 и -024 индуцируют АЭСС первичных опухолевых клеток лейкоза плазматических клеток (фиг. 5Б).
Пример 6.
Зависимая от комплемента цитотоксичность.
После сбора и подсчета клеток ЭаийЫис жизнеспособность клеток должна быть >90%. После промывки (РВ8) клетки суспендируют при концентрации 2х106 клеток/мл в КРМЕВ (КРМк дополненная 1% БСА). Затем помещают в круглодонные платы на 96 ячеек при концентрации 1х105 клеток/мл (50 мкл/ячейку). Затем добавляют 50 мкл антител на ячейку (конечная концентрация в интервале 0-100 мкг/мл (трехразовое разведение в КРМЕВ)). После инкубации (комн. темп., 15 мин) добавляют 11 мкл объединенной сыворотки человека (от 18 здоровых доноров) в каждую ячейку (37°С, 45 мин). Содержимое ячеек суспендируют один раз и 120 мкл переносят в пробирки для РАС8 (Сгетег). Затем добавляют к этой суспензии 10 мкл пропидий йодида (И; 8|дта-А1йпс11 СОстю В.У.) (10 мкг/мл раствора). Лизис детектируют с помощью проточной цитометрии (РАС8са11Ьиг(ТМ), ВесЮп ΌκΗπ8οπ, 8аи Ό^ο, СА, и8А) с помощью измерения процента мертвых клеток (соответствующего Р1-положительным клеткам).
Фиг. 8 и табл. 2 показывают, что лизис ЭаийМис клеток индуцируется -005 (около 60% максимального лизиса) и что лизис за счет -003 наблюдается только при очень высоких концентрациях антитела. -024 не индуцирует СЭС на ЭаийМис клетках (данные не приведены). У СНО СЭ38 клеток лизис индуцируется как -003, -005, так и -024 (фиг. 9 и табл. 3). Лизис с помощью -003 индуцируется при высоких концентрациях. В опухолевых клетках (все получены от Όγ. ΕοΙιΙιοιέΙ аий Όγ. В^ст, ипАсгеОу Мсйюа1 Ссп!сг Шгссй!, ТЬе №!1сг1апй8), полученных от разных больных с ММ (А: 3% упорных опухолевых клеток, Б: 9% упорных опухолевых клеток, В: 30-40% опухолевых клеток и Г: 70% опухолевых клеток) СОС-опосредованный лизис наблюдается в присутствии -005, но не в присутствии -003 (фиг 10). -024 также индуцируют лизис ММ опухолевых клеток (фиг. 10Д).
Таблица 3
Величины ЕС50 для СР38-специфичных антител, полученные в СРС
СПЗ 8-специфичные антитела ЕСзо ПаМЫис (мкг/мл) ЕС50 СР38-СНО (мкг/мл)
-003 >90 3,14
-005 0,33 0,14
-024 >90 0,24
Пример 7.
Исследования перекрестного блокирования с применением РАС8/
СН0-СО38 клетки инкубируют с избытком немеченого СО3 8-специфичного антитела (4°С, 15 мин). Затем клетки инкубируют с НТС-мечеными СО38-специфичными антителами (концентрации приблизительно ЕС90, 4°С, 45 мин). После двукратной промывки клеток РВ8-БСА измеряют флуоресценцию с помощью проточной цитометрии. Фиг. 11 показывает, что немеченые -003 блокируют связывание
- 105 015584
ПТС-меченых -003, в то же время связывание ПТС-меченых -005 не блокируется. Так же немеченые 005 блокируют связывание ПТС-меченых -005, в то же время связывание ПТС-меченых -003 не блокируется. -003 и -005 связываются с различными эпитопами, поскольку они не конкурируют за связывание.
Пример 8.
Исследования перекрестного блокирования с помощью ЕЫ8А.
Растворимыми человеческими СО38 покрывают поверхность пластины ЕЫ8А. Такие СЭ38 инкубируют с избытком немеченых СЭ38-специфичных антител в течение приблизительно 15 мин и затем добавляют биотинилированные СО38-специфичные антитела (концентрации приблизительно ЕСд0, комн. темп., 1 ч). После трехкратной промывки с помощью РВ8/Т\уееп добавляют стрептавидин, конъюгированный с пероксидазой из хрена (КЯР) и смесь инкубируют при комн. темп. в течение 1 ч. Комплекс можно детектировать с помощью добавления раствора АВТ8 и превращение субстрата, опосредованное ЫЯР измеряют с помощью регистрирующего устройства ЕЫ8А при 405 нм.
Пример 9.
Исследования перекрестного блокирования с помощью сэндвич-ЕЫ8А.
СЭ8-специфичными антителами покрывают поверхность пластины ЕЫ8А. Связанные с пластиной антитела инкубируют с биотинилированными растворимыми СЭ38 в присутствии СО38-специфичных антител в жидкой фазе. После промывки с помощью РВ8/Т\хееп связанные биотинилированные СО38 детектируют с помощью стрептавидина, конъюгированного с КЯР, в течение 1 ч при комн. темп. Этот комплекс можно детектировать с помощью добавления раствора АВТ8 (после промывки РВ8-Тетееп) и превращение субстрата, опосредованное ЫЯР измеряют с помощью регистрирующего устройства ЕЫ8А при 405 нм.
Пример 10.
Реактивность с рядом тканей человека и перекрестная реактивность с тканями обезьяны супото1дик, определяемая с помощью иммуногистохимии.
Секции замороженных тканей человека (полученные от Όγ. Η. №еккеп, Ргее ишхегйу Мебюа1 Сеп!ег, Атк!егбат, Тйе Nе!йе^1аπбк) или тканей обезьяны (^егекк Яекеагсй, С1акдоте, 8со!1апб) разрезают на 6 мкм и сушат на воздухе в течение ночи. Такие криостат-секции фиксируют в ацетоне (комн. темп., 10 мин) и сушат на воздухе (около 5 мин). Затем секции инкубируют с 1хбуфером лимонная кислота/фосфат, содержащим 0,1% Н2О2 (рН 5,8; 81дша) для блокирования эндогенной пероксидазы. Через 20 мин при комн. темп. секции промывают два раза в РВ8 и 0,05% Тетееп-20 (РВ8Т, комн. темп., 5 мин, Я1ебе1 бе-Ыаеп, Сегшапу). Затем секции инкубируют с авидином (комн. темп., 15 мин, ^ΛΚ0, С1ок1гир, Оепшагк), промывают два раза в РВ8Т и инкубируют с биотином (комн. темп., 15 мин, 0АК0) для блокирования эндогенного биотина. После промывки секций два раза в РВ8Т секции преинкубируют с РВ8Т++ (РВ8Т, дополненный 10% нормальной сывороткой человека (N48, СЬВ, Атк!егбат, Nе!йе^1аπбк) и 10% нормальной сывороткой козы ^С8; ОАК0)) (комн. темп., 20 мин). После удаления преинкубированной сыворотки секции инкубируют с ПТС-мечеными первичными антителами, разведенными 2% РВ8Т++ при указанных концентрациях (комн. темп., 60 мин). Далее секции инкубируют с кроличьими анти-ЕГТС (1:1000, 0АК0) в 2% РВ8Т++ (комн. темп., 30 мин). После промывки в Рв8т секции инкубируют с козьими анти-кроличьими биотинилированными антителами (1:400, ОАК0) в 2% РВ8Т++ (комн. темп., 30 мин). Затем секции промывают и инкубируют с 8ΛВС-ΗКР (1:100; 0АК0) в 2% РВ8Т++ (комн. темп., 30 мин). После промывки секций в РВ8Т два раза их инкубируют (комн. темп., 10 мин) с аминоэтилкарбазол (АЕС)-проявляющим раствором (50 мМ ацетатный буфер, рН 4,9, 0,01% Н2О2, Я1ебе1-беΗаеπ). Под конец секции промывают на миллипоре водой (5 мин) и окрашивают гематоксилином (ОАК0). С помощью глицергеля (37°С) секции фиксируют под покровными стеклами и исследуют с помощью световой микроскопии (Ахюу1кюп-2; Ζе^кк. Тйошетооб, ХΥ, И8А).
Бронхиальный эпителий окрашивается с помощью -003 и -005 (фиг. 12Б и 13Б), а также поперечнополосатые мышцы (миоциты, фиг. 12В и 13В), макрофаги, лимфоциты и плазматические В-клетки (фиг. 12А и 13А). -024 проявляет сходное окрашивание поперечнополосатых мышц и бронхиального эпителия, но окрашивание менее интенсивно. Никакого окрашивания эндотелиальных клеток не наблюдается ни с -003 (фиг. 14Г), -005 (фиг. 14Д), ни с -024 (данные не приведены), в то время как отчетливое окрашивание наблюдается с антителами положительного контроля против маркеров эндотелиальных клеток СЭ31 (фиг. 14А) и νVΡ (фиг. 14Б). Анти-ΚΕΗ применяют как антитело отрицательного контроля (фиг. 14В). -003 (фиг. 12Г) и -024 (данные не приведены), но не -005 (фиг. 13Г), проявляют перекрестную реактивность с лимфоидной тканью обезьяны.
Пример 11.
Перекрестная реактивность с мононуклеарными клетками периферической крови обезьян циномолгус или резус (РВМСк), измеряемая с помощью проточной цитометрии.
мл периферической крови обезьяны циномолгус (Шмегекк Яекеагсй) лизируют с помощью добавления 4,5 мл шок-буфера (1,7 мМ N4^1, 1 мМ ЭДТА), 40 мл Н2О и 450 мкл 10% ΚΗΡΌ,’,. После гемолиза клетки центрифугируют (12000 об/мин, 10 мин) и трижды промывают в РВ8. После подсчета клеток с помощью эксклюзии трипанового синего клетки суспендируют в РВ8-БСА (1х 106 клеток/мл).
- 106 015584
17,5 мл периферической крови обезьяны резус (ВРКС, Кук^ук, ТЬе Ые!Ьет1апбк) разводят 1:1 в КРМ! 1640 и наслаивают на фикол (1,077 г/мл; ВюХУЬШакег са!. 17-829Е, 1о! по. 014832). После центрифугирования (710 д, комн. темп., 20 мин) интерфазу собирают и дважды промывают в ВРМк После последней промывки клетки суспендируют в КРМI при концентрации 1 х 105 клеток/50 мкл.
Далее клетки переносят на плату на 96 ячеек (100000 РВМСк/ячейку), промывают ЕАС8 буфером (РВ8, 0,05% БСА, 0,02% №1Ν3,) и инкубируют с первичными антителами (4°С, 30 мин). После промывки в РВ8-БСА добавляют 50 мкл НТС-меченых гЬ-апб-ЫдС (ОАКО, С1ок1гир, Ьепшагк) (4°С, 30 мин). Под конец клетки собирают в ЕАС8 пробирках в общем объеме 150 мкл. Образцы измеряют и анализируют с помощью ЕАС8са11Ьиг(ТМ) (Вес!оп Оюкшкоп, 8ап О1едо, СА, И8А).
Измеренная с помощью проточной цитометрии перекрестная реактивность -003, но не -005 показана с лимфоцитами циномолгус (фиг. 15А) и моноцитами (фиг. 15Б). Также в случае обезьяны резус наблюдается перекрестная реактивность -003, но не -005 на мононуклеарных клетках (фиг. 15В).
Пример 12.
Эксперименты по интернализации.
СНО-СЭ38 клетки окрашивают при насыщающей концентрации НТС-меченых СЭ38-специфичных антител (на льду, 30 мин). После помывки клеток (в КРМП640 дополненной 10% ЕС8) одну порцию клеток согревают до 37°С для проведения интернализации и другую порцию оставляют на льду. Через определенные интервалы времени (0-120 мин) аликвоты клеток отбирают и переносят в охлажденный на льду РВ8-БСА, чтобы остановить интернализацию. После промывки образцов два раза в РВ8-БСА добавляют этидий бромид (разведенный в РВ8-БСА, конечная концентрация 2 мг/мл) для тушения мембраносвязанного НТС. Флуоресценцию измеряют с помощью проточной цитометрии.
Фиг. 16А и 16Б показывают, что -003 и -005 интернализованы СНО-СЭ38 клетками в течение 5 мин при 37°С.
Пример 13.
Эксперименты ш νί\Ό со 8С'.Ч Ό-люциферазой.
В этой модели опухолевые клетки трансфицируют люциферазой светляков. При даче люциферина (Мо1еси1аг РгоЬек, Ье1беп, ТЬе №!Ьет1апбк) мышам меченые клетки можно детектировать ш νί\Ό с помощью получения биолюминесцентных изображений с применением высокочувствительной ССЬ камеры, см. ^е!!етгеа1б е! а1., Атепсап 1оитпа1 о£ Ра!Ьо1оду 160(3), 1143-1153 (2002).
Клетки Ьанб! трансфицируют дХУК люциферазой из Сепе ТЬегару 8ук!етк (8ап О1едо, СА) и культивируют в КРМI с 10% ЕС81 пенициллин/стрептомицин, пируват натрия и 1 мкг/мл пуромицина (81дта). Клетки анализируют на экспрессию люциферазы (выраженной в КЬЬ/1х 105 клеток) в люминометре и на экспрессию СЭ38 с помощью ЕАС8. 2,5х106 трансфицированных люциферазой клеток Ьанб! на мышь впрыскивают ί.ν. 8СШ мышам. Мышей обрабатывают -003, -005, антителом контрольного изотипа (НиМаЬ-КЬН) или ритуксимабом (анти-СЬ20 антителом). Антитела вводят внутрибрюшинно. Применяют четыре постановки обработки антителом (см. табл. 4). При превентивной постановке антитело (100 мкг/мышь) и клетки дают одновременно. При терапевтической постановке Ι антитела (300 мкг/мышь) вводят через 7 дней после введения клеток. При терапевтической постановке ΙΙ антитела (10 мкг/мышь) вводят через 14 дней после введения клеток. При терапевтической постановке ΙΙΙ антитела (100 мкг/мышь) вводят через 7 дней после введения клеток. Для получения изображений мышей подвергают анестезии 1.р. с помощью, например, инъекции смеси кетамин/ксилазин/атропин. Синтетический Ό-люциферин (натриевая соль, Мо1еси1аг РгоЬек) дают 1.р., например, в дозе 25 мг/мл. Мышей затем помещают в освещенный закрытый ящик и через 3 мин начинают снимать изображение с помощью УегкАггау 1300В охлаждаемого жидким азотом ССЬ детектора (Корег 8с1епДйс). Фотоны, испускаемые люциферином, считают при времени экспозиции 5 мин. При освещении делают черно-белые изображения для сравнения. Для сбора данных и анализа изображений применяют программный пакет Ме!аУие койгате (Ипкегка1 Ипадшд Согр). Статистическую значимость разницы между группами устанавливают с помощью одностороннего анализа отклонения с помощью теста Ньюмана-Койлс (№^тап-Кеи1к рок! !ек!), применяя СгарЬРаб РШ8М хегкюп 3.02 (СгарЬраб 8ой^ате Шс).
Таблица 4 Постановки обработки антителом для экспериментов с люциферазой ш νί\Ό
Постановка эксперимента Обработка антителом (дни после инокуляции клеток) Доза антитела (мкг/мышь)
Превентивная постановка 0 100
Терапевтическая постановка I 7 300
Терапевтическая постановка II 14 10
Терапевтическая постановка Ш 7 100
Фиг. 17А и 17Б показывают, что -003 и -005 ингибируют рост опухолевых клеток при превентивной постановке и терапевтической постановке Ι, сходным образом с ингибированием, наблюдаемым для анти-СЬ38 антитела. Оба антитела проявляют себя значительно лучше, чем антитело контрольного изотипа. Также при терапевтической постановке ΙΙ СЭ38 антитела замедляют рост опухолевых клеток Ьаиб|1ис (фиг. 17В). При терапевтической постановке ΙΙΙ -003 и -024 показывают ясное ингибирование роста
- 107 015584 опухолевых клеток ЭанйЫис (фиг. 17Г).
Пример 14.
Апоптоз.
Анализ апоптоза проводят согласно инструкциям производителя (Аппехш-У Арор!ов1в кй, ΒΌ Βίοваепсев, А1рйеп а.й. ВЦп, №!йег1апйв). Вкратце, СЭ38 тАЬв добавляют к 2х105 клеток (трансфицированных люциферазой клеток Эаий1 в 0,5 мл КБМС на плате на 24 ячейки) в концентрации 5 мкг/мл -003 или -005, или анти-СЭ38 антител самих по себе или в присутствии перекрестно-блокирующих гЬ-апй-ЫдС (50 мкг/мл).
После инкубации (37°С, 5% СО2, 20 ч) клетки осторожно собирают и промывают буфером связывания (1200 об/мин, 4°С, 5 мин, ΒΌ Βίοδ^ικχδ). Осадок суспендируют в 100 мкл буфера связывания. Затем к суспензии добавляют 5 мкл Аппехт-У-РП'С (ΒΌ Β^05С^еηсе5) и 10 мкл ΡΙ (ΒΌ Β^ο5с^епсе5) и инкубируют в течение 15 мин при комн. темп. Добавляют 400 мкл буфера связывания и образцы промеряют (Р1 считывание в РЬ2). Для анализа апоптических клеток все Аппехш-У-положительные клетки считают с помощью проточной цитометрии с помощью прибора РАС8сайЬиг Πο\ν су!оте!ег с программным пакетом С.’е110иее1 рго (ΒΌ Β^05С^еηсе5). Для анализа собирают по меньшей мере 10000 событий. Такая популяция включает как Р1-положительные, так и Р1-отрицательные клетки.
Фиг. 18 показывает, что -003 и -005 не индуцируют апоптоз. Однако после сшивки апоптоз клеток мишени наблюдается. -003 после сшивки индуцируют апоптоз, который близок к апоптозу, индуцированному анти-СЭ20 антителом (ритуксимаб). -005 менее способен к индукции апоптоза после сшивки. Сходные результаты получены с ВАМ08 клетками в качестве мишени (данные не приведены).
Пример 15.
Действие -005 на тканевой трансплантат В-клеток в ВА-8СГО мышиной модели.
Имплантация синовиальной ткани.
Мышей 8СГО, штамм СВ.-ПЛсгСп^СГО-Ьд, самцов/самок, 4-12 недель, полученных от Сйаг1ев Р|уег ЬаЬога!опев №йег1апй (Маавйгсй!, !йе №1йег1апйв) держат в ЙУС клетках в стандартных условиях температуры и освещения, кормят лабораторным кормом и поят водой по потребности. Перед имплантацией мышей (три мыши в каждой опытной группе, день 0) анестезируют с помощью внутрибрюшинной инъекции кетамина (ММАТЕК, ЕигоУе!) и ксилазина (Вотрип, Βауе^) в соотношении 1:1. Делают небольшие надрезы кожи с помощью хирургических ножниц. Воспаленную синовиальную ткань от больного ревматоидным артритом, претерпевшего замену сустава, имплантируют подкожно в виде кластера из шести небольших фрагментов (всего 2-3 мм3) на каждый бок мыши. Раны закрывают с помощью цианоакрилатного клея Ρе^тасο1. На 1-й день эксперимента оставшуюся синовиальную ткань анализируют, чтобы проверить на В-клетки в воспаленных синовиальных трансплантатах. -005 (12 мкг/кг) или контрольное антитело (анти КЬн, 30 мг/кг) вводят посредством инъекции ί.ν. в объеме 200 мкл на 8-й день эксперимента. Под конец эксперимента (14-й день) мышей умерщвляют с помощью ингаляции углекислого газа и извлекают синовиальные трансплантаты. Один из трансплантатов быстро замораживают в соединении ОСТ (Т15виеТек, 8асига Рше!ек Еигоре) для дальнейшего иммуногистохимического анализа и другой замораживают посредством погружения в жидкий азот для дальнейшего анализа РНК.
Иммуногистохимия.
Готовят 5 мкм криосекции на 8ирегРгов! (Мепхе1 СтЬн, Β^аии5сйνе^д) слайдах с помощью ЬЕЮА СМ1900 криостата и хранят при -80°С. Размороженные секции фиксируют в ацетоне в течение 10 мин, сушат при комн. темп. и промывают 3x5 мин в ΡΒ8. Все этапы проводят при комнатной температуре. Эндогенную пероксидазную активность блокируют посредством инкубации с ΡΒ8, дополненной 0,3% перекисью водорода и 0,1% азидом натрия в течение 20 мин. Слайды затем промывают 3x5 мин в ΡΒ8 и инкубируют с 10% нормальной сывороткой человека (N48)40% нормальной сывороткой кролика (N№8) в ΡΒ8/1% БСА в течение 30 мин. Далее, первичные антитела (мышиные тАЬ), разведенные в ΡΒ8, дополненном 10% NN8/10% NВЬ8 инкубируют в течение 60 мин. После 3x5 мин промывок в ΡΒ8 добавляют н^ конъюгаты (козьи антимышиные Ε^Ρ; ЭАК0 Ρ0447), разведенные 1:50 в ΡΒ8 (дополненной 1% БСА/10% N№/10% N№8) в течение 30 мин. Сигнал пероксидазы усиливают с помощью Т8А™ биотиновой системы (Гегкт Е1тег ЫГе 8с1епсе5, НЕЙ700). Слайды промывают 3x2 мин в ΡΒ8 и инкубируют с биотинил тирамидом, разведенным 1:1600 буфером для амплификации в течение 30 мин. После 3x5 мин промывок в ΡΒ8 добавляют стрептавидин-нКВ, разведенные 1:400 в ΡΒ8 (дополненной 1% БСА) на 30 мин. Слайды промывают 3x5 мин в ΡΒ8 и инкубируют с раствором ^ΑΒ (ЭАК0 Су!отайоп К3465) в течение 5 мин. Цветную реакцию останавливают с помощью дистиллированной воды. Под конец слайды окрашивают гематоксилином (МЕВСК), промывают под струей воды и покрывают глицерином Кайзера и покровным стеклом.
Оценка интенсивности окрашивания.
Оценку окрашенных трансплантатов синовиальной ткани проводят слепым способом с помощью двух тренированных людей. Вначале выбирают сильнее всего окрашенную секцию из серии секций и этой секции сравнения придают максимальный балл 8. Интенсивность окрашивания других секций оценивают по шкале от 0 до 8 относительно секции сравнения.
- 108 015584
Статистический анализ.
Оценку (баллы) интенсивности окрашивания анализируют с помощью Кгизка1-ХаШз одностороннего теста ΛN0VΛ с последующим тестом множественного сравнения Данна (Бипп'з тиШр1е сотрапзоп !ез!), применяя Сгарб Раб Рпзт уегзюп 4.01 (Сгарб Раб зой^аге, йс., δаπ ^^едо, СА, ША).
Фиг. 19 и 21 показывают, что число анти-СБ38-положительных плазматических клеток уменьшено после обработки -005. Окрашивание плазматических клеток анти-СБ138 подтверждает, что -005 приводят к уменьшению числа плазматических клеток (фиг. 20 и 22).
Пример 16.
Секвенирование кодирующих последовательностей человеческих антител против СБ38.
Получение РНК.
Общую РНК получают из 5х106 клеток клеточной линии гибридомы, экспрессирующей моноклональные антитела -003, -005 и -024 соответственно, с помощью набора В№азу кй ^адеп, Хез!Ьигд, Ьеизбеп, №!бег1апбз) согласно инструкции производителя.
Получение кДНК -003, -005 и -024.
5'-ВАСЕ-комплементарную ДНК (кДНК) из РНК получают из 100 нг общей РНК, применяя набор δМАΚТ ВАСЕ с^NΛ Атрийсайоп кй (С1оп!есб) согласно протоколу производителя.
Олигонуклеотидные праймеры синтезируют и оценивают количественно с помощью 1зодеп Вюзаепсе (Маагззеп, Тбе №111сг1зп6з). Праймеры растворяют в воде в концентрации 100 пмоль/мкл и хранят при -20°С. Все ПЦР праймеры и праймеры для секвенирования приведены в таблице (табл. 5). Для ПЦР применяют ДНК полимеразу РГиТигЬо(В) Но!з!ай ^!га1адепе, Атз^гбат, Тбе №1йег1апбз; ргобис! # 600322) согласно инструкции производителя. Каждая реакционная смесь содержит 200 мкМ смешанных дНТФ (Восбе ^^адпозί^сз, А1 теге, Тбе №!бег1апбз; ргобис! 1814362), 12 пмоль обратного праймера (НАСЕСТ для ^3003-005, ВАС^АраТ для ^3003-003 и ВΛСЕV^Βз^ΧI для ^3003-003 и 005), 7,2 пмоль к.Т\1-\11.х ШРМ-М|.х: 2 мкМ δбоήυРМΗ3 и 0,4 мкМ ЕопдОТМЮ), 0,6 мкл 5'ВАСЕ кДНК матрицы и 1,5 единицы ДНК полимеразы РГиТигЬо(В) Но!з!ай в буфере для ПЦР реакции (поставляемом с полимеразой) в общем объеме 30 мкл. ПЦР реакции проводят в аппарате ТСгаб1еп1 Тбегтосус1ег 96 (Хба!тап Вюте!га, Соейтдеп, Сегтапу; ргобис! 050-801), применяя программу из 35 циклов: денатурация при 95°С в течение 2 мин; 35 циклов из 95°С в течение 30 с, 55°С в течение 30 с и 72°С в течение 1,5 мин; конечное наращивание при 72°С в течение 10 мин. Если требуется, ПЦР смеси хранят при 4°С до следующего анализа или обработки.
Таблица 5
Праймеры
название последовательность
81ЮЦЦРМНЗ ТОАААОСТТСТААТАСОАСТСАСТАТАОООС
КАСЕУьВзда ОААОАТСААОАСАОАТСОТОСАОССАССОТАСО
ИАСЕУнАра1 О&АОООТОССАОССООААСАССОАТООаСССТТ
КАСЕО1А1 СООАСТАОАОТССТОАООАСТО
М13геуегзе СОАТААСАЛТТТСАСАСЛСС
ЬогщЦРМНЗ ТОАААССТТСТААТАСОАСТСАСТАТА6СОСААОСАО ТСОТАТСААСОСАОАОТ
НСзецЗ ООТСАСООСОССТОАОТТССАСО
УНЗООЗ-ООЗГог ОАТААОСТТСгССбССАССАТСОАСТОСАССТСОАСОТ тсстс
УН3003-5Тог ОАТААбСТТаСССгССАССАТааАОТТТОбОСТОАОСТ оастт
УЬ3003-5ехГог ОАТААОСТТСССОССАССАТООААОССССАССТСАОС ттстс
УЬЗООЗ-ООЗГог НАТААОСТТСССаССАССАТОАОаОТССТСаСТСАОС тсстс
УН300324ехГог ОАТААОСТТСССаССАССАТОСООТСААССаССАТСС тсссс
УЬ3003-24-5ех£ог ОАТААОСТТСгССОССАССАТОСгААбССССАСгСТСАОС ттстс
Клонирование -003-2Е5 ¥Н и ¥|. и -005 ¥|. и -024 ¥Н и ¥|. в рСЕМТ-вектор системы ΙΙ.
Продукты реакции разделяют с помощью электрофореза на 1% ТАЕ агарозном геле и окрашивают с помощью этидий бромида. Полосы правильного размера вырезают из геля и выделяют ДНК из агарозы с помощью набора для экстракции 01зсх11 де1 ехйас!юп кй ^адеп, са! по 20021).
К изолированным из геля ПЦР фрагментам добавляют концевые А посредством инкубации в течение 10 мин при 72°С с 200 мкМ дАТФ и 2,5 ед. Атр1йад (Регкш Е1тег) и очищают с помощью колонок для миниэлюции (0138сп). ПЦР фрагменты с концевыми А клонируют в вектор рСЕМТеазу (Рготеда), применяя набор рСЕМТ еазу уес!ог зуз!ет Ι1 кй и протокол (Ы270, раде 3/4). 2 мкл смеси после лигирования трансформируют в компетентные клетки Е.сой Οηеδбо! ПН5[а1рба]Т1В Цпуйгодеп) и рассевают на чашках со средой ЕВ/ампициллинДРТС/Хдак
- 109 015584
Секвенирование.
У районы -003, -024 и -005 Уъ район секвенируют с помощью АС0АА (Вег1ш, Сегтапу) после захвата соответственно 20 (Ун -003), 16 (Уъ -003), 15 (Уъ -005) и 6 (Ун и Уъ -024) белых колоний, выделения плазмид и секвенирования с обратным праймером М13. Ун район секвенируют прямо с ПЦР продуктом, применяя праймер ИСкеср. Последовательности секвенируют с применением системы Уес!ог КП айуапсей кш!е Цпуйгодеп).
Получение экспрессирующих векторов для антител -003, -005, -024 и Могркокук антитела 3079.
Район, кодирующий Ун -003, амплифицируют с помощью ПЦР из клона плазмиды рСетТ, содержащего Ун район -003, применяя праймеры Ун3003-003Гог и ЯАСЕУнАраЦ вводящие нужные участки рестрикции (ЫтйШ и АраЦ для клонирования в рСопС1Г0.4 (Ьопха Вю1од1ек, 81оидк, ИК) и идеальную последовательность Кохак (ССССССАСС). Вектор рСопС1Г0.4 содержит константный район тяжелой цепи человеческого ΙβΟΙ. Ун ПЦР фрагмент вставляют в рамке считывания в рСопС1Г0.4, применяя ЫшйШ и Арак Конструкцию проверяют с помощью анализа последовательности.
Район, кодирующий Ун -005, амплифицируют с помощью ПЦР из клона плазмиды рСетТ, содержащего Ун район -005, применяя праймеры Ун3003-5Гог и ЯАСЕУнАраЦ вводящие нужные участки рестрикции (ЫтйШ и АраЦ для клонирования в рСопС1Г0.4 и идеальную последовательность Козака. Ун ПЦР фрагмент вставляют в рамке считывания в вектор рСопС1Г0.4, применяя ШпйШ и Арак Конструкцию проверяют с помощью анализа последовательности.
Район, кодирующий Ун -024, амплифицируют с помощью ПЦР из клона плазмиды рСетТ, содержащего Ун район -024, применяя праймеры Ун300324ехГог и ЯАСЕУнАраЦ вводящие нужные участки рестрикции (ШпйШ и АраЦ для клонирования в рСопС1Г0.4 и идеальную последовательность Козака. Ун ПЦР фрагмент вставляют в рамке считывания в вектор рСопС1Г0.4, применяя ШпйШ и Арак Конструкцию проверяют с помощью анализа последовательности.
Район, кодирующий Ун Могркокук антитела 3079, синтезируют с помощью СепеАй (ЯедепкЬигд, Сегтапу), основываясь на данных, опубликованных в патенте А0 2005/103083 А2. Кодирующий район оптимизируют по кодонам для экспрессии в нЕК клетках для усиления уровней экспрессии и вводят нужные участки рестрикции (ШпйШ и АраЦ для клонирования в рСопС1Г0.4 м идеальную последовательность Козака. Плазмиду, содержащую синтетический Ун район, обрабатывают Ара!: и ШпйШ и Ун фрагмент вставляют в рамке считывания в вектор рСопС1Г0.4.
Район, кодирующий Уъ -005, амплифицируют с помощью ПЦР на клоне плазмиды рСетТ, содержащей Уь район -005, применяя праймеры УЪ3003-5ехГог и ЯАСЕУЬВЦАЦ вводящие нужные участки рестрикции (ШпйШ и РГ12311) для клонирования в рСопКарра0.4 (Ьоп/а Вю1од1ек) и идеальную последовательность Козака. Вектор рСопКарра0.4 содержит константный район каппа легкой цепи. Уъ ПЦР фрагмент вводят в рамке считывания в вектор рСопКарра0.4 с помощью ШпйШ и РГ12311. Конструкцию проверяют с помощью анализа последовательности.
Район, кодирующий Уъ -003, амплифицируют с помощью ПЦР на клоне плазмиды рСетТ, содержащей Уъ район -003, применяя праймеры УЬ3003-003Гог и ЯАСЕУЬВЦАЦ вводящие нужные участки рестрикции (ШпйШ и РГ12311) для клонирования в рСопКарра0.4 и идеальную последовательность Козака. Уъ ПЦР фрагмент вводят в рамке считывания в вектор рСопКарра0.4 с помощью ШпйШ и РГ12311. Конструкцию проверяют с помощью анализа последовательности.
Район, кодирующий Уъ -024, амплифицируют с помощью ПЦР на клоне плазмиды рСетТ, содержащей Уь район -024, применяя праймеры Уь3003-24-5ехГог и ЯАСЕУЬВЦАЦ вводящие нужные участки рестрикции (ШпйШ и РГ12311) для клонирования в рСопКарра0.4 и идеальную последовательность Козака. Уь ПЦР фрагмент вводят в рамке считывания в вектор рСопКарра0.4 с помощью ШпйШ и РГ12311. Конструкцию проверяют с помощью анализа последовательности.
Район, кодирующий Уъ Могркокук антитела 3079, синтезируют с помощью СепеАй, основываясь на данных, опубликованных в А0 2005/103083. Кодирующий район оптимизируют по кодонам для экспрессии в нЕК клетках для усиления уровней экспрессии и вводят нужные участки рестрикции (ШпйШ и РГ12311) для клонирования в рСопКарра0.4 и идеальную последовательность Козака. Плазмиду, содержащую синтетический Уъ район, обрабатывают РГ12311 и ШпйШ и Ун фрагмент вставляют в рамке считывания в вектор рСопКарра0.4.
Антитела временно экспрессируют в клетках нЕК-293Р, как описано в примере 17, с помощью котрансфекции их векторов тяжелой и легкой цепей.
Получение устойчивых клеточных линий в Сн0-КШУ клетках.
Для получения устойчивых клеточных линий векторы тяжелой и легкой цепей -003 и -005 комбинируют в одном векторе с двумя генами с помощью стандартных техник клонирования. Векторы с двойными генами -003 и -005 линеаризуют и трансфицируют в клетки Сн0-КШУ (Ьоп/а Вю1од1ек) в основном, как описано производителем. Устойчивые клеточные линии отбирают с помощью селекции с 25 мкМ Ь-метионин-сульфомиксина ^δΧ), как описано в Боп/а Вю1од1ек. Клоны с наибольшей продуктивностью отбирают и размножают в среде ί.Ό-ί.Ή0 Цпуйгодеп) и антитела очищают из клеточного супернатанта, как описано в примере 3.
- 110 015584
Пример 17.
Картирование эпитопа с помощью сайт-направленного мутагенеза.
Олигонуклеотидные праймеры синтезируют и количество их оценивают с помощью 1водеп В1овс1епсе (Маагввеп, Т1е №!йег1апйв). Праймеры растворяют в воде в концентрации 100 пмоль/мкл и хранят при -20°С. Все ПЦР праймеры и праймеры для секвенирования приведены в табл. б. Для ПЦР применяют ДНК полимеразу РГиТигЬо(К) Но!в!аг! (§1га!адепе, Атв!егйат, Т1е №1йег1апйв; ргойис! # б00322) согласно инструкции производителя. Каждая реакционная смесь содержит 200 мкМ смешанных дНТФ (Косйе О1адпов!юв, А1теге, Т1е №!йег1апйв), 10 пмоль прямого и обратного праймера, 100 нг геномной ДНК или 1 нг ДНК плазмиды и 1 единицу ДНК полимеразы РГиТигЬо Но!в!аг! в буфере для ПЦР реакции (поставляемом с полимеразой) в общем объеме 20 мкл. ПЦР реакции проводят в аппарате ТСгай1еп! ТНегтосус1ег 9б (^йа!тап Вюте!га, Соейшдеп, Сегтапу; ргойис! 050-801), применяя программу на 32 циклов: денатурации при 95°С в течение 2 мин; 30 циклов из 95°С в течение 30 с, градиент б070°С (или другая специфическая температура прилегания) в течение 30 с и 72°С в течение 3 мин; конечное наращивание при 72°С в течение 10 мин. Если требуется, ПЦР смеси хранят при 4°С до следующего анализа или обработки.
Электрофорез в агарозном геле проводят по Самбруку (8атЬгоок, Кивве11 е! а1. 2000), применяя гели из 50 мл на 1хтрис-ацетат-ЭДТА буфер. ДНК определяют с помощью включения в гель этидий бромида и наблюдения в УФ-свете. Изображения гелей записывают с помощью ССЬ камеры и системы анализа изображений (СепеСпоте; 8упдепе, У1а ^ев!Ьигд В.У., Ьеивйеп, Т1е №!1ег1апйв).
Очистку нужных фрагментов ПЦР проводят с помощью набора МшЕ1и!е РСК РипГюа!юп Кй (Ц1адеп, У1а ^ев!Ьигд, Ьеивйеп, Т1е №!1ег1апйв; ргойис! 2800б) по инструкции производителя. Выделенные ДНК количественно оценивают с помощью УФ-спектроскопии (см. ниже) и анализируют качество с помощью электрофореза в агарозном геле.
Альтернативно, продукты ПЦР или переваривания разделяют с помощью электрофореза в агарозном геле (например, когда присутствуют множественные фрагменты), применяя 1% трис-ацетат-ЭДТА агарозный гель. Нужный фрагмент иссекают из геля и выделяют ДНК с помощью набора Ц1АЕХ II Се1 Ех!гас!юп Кй (Ц1адеп; ргойис! # 20051) по инструкции производителя.
Оптическую плотность нуклеиновых кислот определяют с помощью спектрофотометра №поИгор N0-1000 8рес!горйо!оте!ег (1водеп ЫГе 8аепсе, Маагввеп, Т1е №!1ег1апйв) по инструкции производителя. Концентрацию ДНК определяют с помощью анализа оптической плотности (0Ό) при 2б0 нм (1 единица 0И2б0=50 мкг/мл). Для всех образцов в качестве сравнения применяют буфер, в котором растворены нуклеиновые кислоты.
Ферменты рестрикции и дополнительные вещества получены от №\ν Епд1апй Вю1аЬв (Веуег1у, МА, И8А) или Еегте!ав (Уйшив, Ьййиаша) и применяются согласно инструкциям поставщиков. ДНК (100 нг) обрабатывают 5 единицами фермента(ов) в подходящем буфере в конечном объеме 10 мкл (объем реакции увеличивают в нужное количество раз, если требуется). Обработку (переваривание) проводят при рекомендуемой температуре в течение не менее б0 мин. В случае фрагментов, требующих двойного переваривания рестриктазами, которые предъявляют несовместимые требования к буферам или температурам, обработки проводят последовательно. При необходимости продукты переваривания очищают с помощью электрофореза в агарозном геле и экстракции из геля.
Лигирование фрагментов ДНК поводят с помощью Цшск Ыдайоп Кй (№\ν Епд1апй Вю1аЬв) согласно инструкциям поставщика. Для каждого лигирования ДНК вектора смешивают с приблизительно трехкратным избытком ДНК вставки.
Плазмидную ДНК (1-5 мкл раствора ДНК обычно 2 мкл смеси ДНК после лигирования) трансформируют в клетках 0пе 8йо! ИН5а-Т1® Е.со11 (1пуйгодеп, Вгейа, Т1е №1йег1апйв; ргойис! 12297-01б) с применением способа теплового шока согласно инструкциям поставщика. Далее клетки рассевают на чашках с агаризованной средой Лурия-Бертани (ЬВ), содержащих 50 мкг/мл ампициллина. Чашки инкубируют в течение 1б-18 ч при 37°С, пока колонии бактерий не станут заметными.
Бактериальные колонии подвергают скринингу на присутствие векторов, содержащих нужные последовательности, с помощью ПЦР колоний с применением смеси для ПЦР Тйегто8!ай РСК Мав!ег М1х (АЬдепе, У1а ^е!вЬигд, Ьеивйеп, Т1е №1йег1апйв; ргойис!* АВ-938-ОС15/Ь) и праймеров рСопС1вец1 и рЕЕ13.4вес.|геу2 (табл. б). Отобранных колоний слегка касаются наконечником для пипетки на 20 мкл и быстро касаются им же 2 мл ЬВ для малых культур и затем суспендируют в смеси для ПЦР. ПЦР проводят в аппарате ТСгай1еп! Тйегтосус1ег 9б с применением программы на 35 циклов: денатурации при 95°С в течение 15 мин; 35 циклов из 94°С в течение 30 с, 55°С в течение 30 с и 72°С в течение 2 мин; с последующим этапом конечного наращивания в течение 10 мин при 72°С. Если требуется, ПЦР смеси хранят при 4°С до следующего анализа или обработки.
Плазмидную ДНК изолируют из культур Е.соН с помощью следующих наборов от Ц1адеп (у1а ^ев!Ьигд, Ьеивйеп, Т1е №!1ег1апйв) согласно инструкциям поставщика. Для получения больших препаратов плазмид (из 50-150 мл культуры) применяют Н18реей Р1авш1й Мах1 Кй (ргойис! 12бб3) или Н18реей Р1авш1й М1й1 Кй (ргойис! 12б43). Для получения небольших количеств плазмид (около 2 мл культуры)
- 111 015584 применяют ΟίηρίΌρ δρίη МШргер Κι! (ргобис! 27106) и ДНК элюируют в 50 мкл буфера для элюции (предоставленного в наборе).
Конструкция экспрессирующего НА-СЭ38 вектора ρΒΒ13.4ΗАС^38.
Внеклеточный домен СЭ38 человека амплифицируют с плазмиды рС1ригоСЭ38 (полученной от ΡγοΓ. Μ. С1епп1е, Теηονик КекеагсЬ ^аЬο^а!ο^у, δοиΐЬатρ!οη Сепега1 Ηο^^οί, δοи!Ьатρ!οη, ИК) с помощью праймеров сб38йгЬа и сб38ехгеу. Посредством этой ПЦР реакции вводят НА-таг. Такой продукт ПЦР применяют в качестве матрицы для второй реакции ПЦР с праймерами δΡΗΜΜ38еx и сб38ехгеу. Посредством этой реакции ПЦР вводят сигнальный пептид δΡΗΜΜ, участки рестрикции и идеальную последовательность Козака (ССССССАСС) для оптимальной экспрессии. После очистки такой продукт ПЦР клонируют в экспрессирующий вектор рЕЕ13.4 (Εοπζο Β^ο1οд^ек) и полную кодирующую последовательность подтверждают с помощью секвенирования с праймерами р^пК^д^ ρΒΒ13.4ке^^еν, сб38ке^1Гο^ и сб38кес.|2геу (табл. 6). Эту конструкцию называют ρΒΒ13.4ΗАС^38.
Сайт-направленный мутагенез.
Конструируют три одиночные мутантные белка из 1шСЭ38 у которых Т мутирован в А в положении 237 (Т237А, 8ЕО ΙΌ N0:32), О мутирован в К в положении 272 (О272К, 8Е0 ΙΌ N0:33) или δ мутирован в Р в положении 274 (δ274Ρ, δΒ^ ΙΌ N0:34). Сайт-направленный мутагенез проводят с помощью набора ОшскСЬапде ΙΙ ХЬ δίΧ- Э1гес!еб Ми!адепек1к Κι! ^!га!адепе, Атк!егбат, ТЬе №!Ьег1апбк) согласно инструкциям поставщика. Этот способ включает введение дополнительного молчащего участка рестрикции для скрининга успешных мутантов (дополнительный ХЬа1 участок для Т237А мутанта, дополнительный Есд1 участок для О272К мутанта и потеря δ^1 участка для δ274Ρ мутанта). Вкратце, 5 мкл 10х реакционного буфера, 1 мкл олигонуклеотида ΗΛС^38Т237ΛГο^2. ΗАС^38^272КГο^ или ΗАС^38δ274ΡГο^ (100 пмоль/мкл), 1 мкл олигонуклеотида ΗАС^38Т237А^еν2, ΗАС^38^272В^еν или ΗАС^38δ274Ρ^еν (100 пмоль/мкл), 1 мкл смеси дНТФ, 3 мкл Ρπκ^ο1πΐίοη, 1 мкл плазмиды ρΒΒ13.4ΗАС^38 (50 нг/мкл) и 1 мкл ДНК полимеразы Ρ^υΠι^ ΗΡ ЭХА смешивают в конечном объеме 50 мкл и амплифицируют в аппарате ТСгаб1еп! ТЬе^тοсус1е^ 96 ^Ьа!тап Β^οтеΐ^а, Сοе!ΐ^ηдеη, Сегтапу; ргобис! 050-801) с применением программы из 18 циклов: денатурации при 95°С в течение 1 мин; 18 циклов из 95°С в течение 50 с, 60°С в течение 50 с и 68°С в течение 10 мин. ПЦР смеси хранят при 4°С до последующего применения. Далее, смеси ПЦР инкубируют с 1 мкл ПриИот в течение 60 мин при 37°С для переваривания вектора ρΒΒ13.4ΗАС^38 дикого типа и хранят при 4°С до последующего применения. ДНК из реакционной смеси осаждают с помощью 5 мкл ацетата натрия и 125 мкл этанола, инкубируют в течение 20 мин при -20°С и собирают центрифугированием в течение 20 мин при 4°С при 14000 об/мин. Осадок ДНК промывают 70% этанолом, сушат и растворяют в 4 мкл воды. 4 мкл объема реакции целиком трансформируют в компетентные клетки 0пе δΗοΙ %р 10ΌΗ5α Т1К (^йгодеп, Бгеба, ТЬе №!Ьег1апбк) согласно инструкциям поставщика (й1уйгодеп). Далее, клетки рассевают на чашках с агаризованной средой Лурия-Бертани (ΌΒ), содержащих 50 мкг/мл ампициллина. Чашки инкубируют в течение 16-18 ч при 37°С, пока колонии бактерий не станут заметными. Колонии подвергают скринингу с помощью ПЦР колоний, применяя праймеры рС.опС1кед1 и ρΒΒ13.4ке^^еν2 (табл. 5) и обрабатывают соответствующими ферментами рестрикции для скрининга на включение мутагенного олигонуклеотида. Два положительных клона для каждого мутанта выращивают и выделяют плазмидную ДНК. Полную НАСЭ38-кодирующую нуклеотидную последовательность определяют с помощью праймеров сб38ке^1Гο^, ρСοηС1ке^1 и ρΒΒ13.4ке^^еν2, чтобы подтвердить присутствие мутаций и отсутствие дополнительных нежелательных мутаций.
Секвенирование ДНК.
Образцы плазмидной ДНК посылают в АСОVА (БегИп, Сегтапу) для анализа последовательностей. Последовательности анализируют с помощью современной программы УесЮг N1! (Шюттах, 0хГэгб, ик).
Временная экспрессия в клетках нЕК-293Р.
Клетки Ргеек!у1е™ 293-Р (субклон НЕК-293, приспособленный к росту в суспензии и в химически определенной среде Ргеек!у1е, (НЕК-293Р)) получают из йл'йгодеп и трансфицируют ρΒΒ13.4ΗАС^38 и тремя конструкциями, несущими мутации Т237А, О272К и δ274Ρ, согласно протоколу поставщика с применением 293-фектина (Iην^!^οдеη). Клеточные супернатанты от трансфицированных клеток применяют в ЕЬ^А для исследования связывания анти-СЭ38.
Связывание анти-СЭ38 антител.
Пластины ЕЬ^А (Сгешег, # 655092) покрывают в течение ночи при 4°С 1 мкг анти-НА антитела ^1дта, # Н-9658) и далее блокируют с помощью 2% сыворотки цыпленка. Культуральные супернатанты от трансфицированных клеток НЕК293Р разводят, наносят на пластины ЕЬКА и инкубируют в течение 1 ч при комн. темп. После промывки добавляют серийные разведения НиМаЬк -003 и -005 и инкубируют в течение 1 ч при комн. темп. Связанные антитела детектируют с помощью ΗΡΡ-конъюгированных козьих античеловеческих ^С антител. Анализ проявляют с помощью АΒТδ (ВοсЬе, # 1112597) и оптическое поглощение измеряют при 405 нм с помощью спектрофотометра.
Как можно видеть на фиг. 23А-23В, как -003, так и -005 связываются с диким типом СЭ38 человека.
- 112 015584
На связывание -003 не влияет введение мутаций Т237А (фиг. 23А), 0272В (фиг. 23Б) или 8274Е (фиг. 23В). -005 способен связывать СИ38, несущее мутацию Т237А (фиг. 23А). Связывание -005 с СИ38 с мутацией 0272В серьезно изменено (фиг. 23Б) как с точки зрения ЕС50, так и максимальной емкости связывания. -005 не способен связываться с мутантом СИ38, у которого серин в положении 274 замещен фенилаланином (фиг. 23 В).
Эти данные показывают, что -003 и -005 связываются с разными эпитопами. Далее эти исследования выявляют, что связывание -005 с СИ38 является чувствительным к мутациям по положениям 272 и 274. В особенности 8274 важен для связывания -005 с СИ38.
Таблица 6
Праймеры название с<138ГогЬа сс138ехгеу $РНММ38ех ρΟοηΟΙββςΙ рСопКзед1 рЕЕ13.4зедгеу рЕЕ13.4зеягеу2 ссШкедИог с438вея2геу ΗΑΟΌ38Τ237Ατβν2
НАСР38Т237А£ог2
НАСО389272Вгет
НАСО3892721<Ьг
НАСЕ>388274Ггеу
НАСО388274РЙГ последовательность
СТССТОТООСССАТСОТСТСССССТАСССТТАСОАСа ТаССТОАСТАССССАООТбОСОССАОАСбТССАСС АС0ТСА00ТАССТСА6АТСТСАСАТСТССААС ТАТАСССССбОССССССАССАТОТССТСОСОССТСТС СТСбСТОСТОСТОСТССТОСТССТССТСТСССССАТО отстсоасс
СААСАСТТААС0СА0ССССА6АА СТАОТСТОАССАОТАСТСеТТОС ТОСАТТСАТТТТАТСПТСАСаТ ТСООАСАТСТСАТСАСТТТСТТТ АООАСАСОСТССТАООСТАССТТ СТССТТТСТССАОТСТСООСААО ТССАССАТОТАТСАСССАОСССТСТАСАОССТОААСС ттстстоотто СААССАОАОААООТТСАСССТСТАОАССССТСССТО АТАСАТСОТОСА САТАТТСТТССАООААААТСОААТАТТССТТТТОСТТ АТ АТААССААААССААТАТТСОАТТТТССТаСААСААТА ТС ТСТОТАСАТАТТСТТОСАОАААААТТОААТСТТССТТ ТТОСТТАТА
ТАТАА6СААААССААСАТТСААТТТТТСТССААСААТ АТСТАСАОА
Пример 18.
Индукция пролиферации РВМС.
-003, -005 и -024 тестируют в анализе в основном, как описано в Аик1с11о с! а1., Т1ккис апйдспк 56, 538-547 (2000). Вкратце, РМВС от здоровых доноров культивируют при концентрации 1х105 клеток/ячейку на плоскодонных платах на 96 ячеек в присутствии антител (конечные концентрации: 1,1-3,310-30 мкг/мл) в 200 мкл ВРМГ++. Стимуляцию клеток ΙΠ-15 (при 333 нг/мл; Атдсп Шс., ТНоикапб 0акк, СА, И8А) применяют как положительный контроль. Через 4 дня инкубации при 37°С добавляют 30 мкл 3Н-тимидина (16,7 мкКи/мл) и культивирование продолжают в течение ночи. Включение 3Н-тимидина анализируют с помощью гамма-счетчика Раскагб СоЬга датта соип!сг (Раскагб Iηκί^итсη!κ, Мспбсп, ИТ, И8А) согласно инструкциям поставщика. Данные показаны в виде средних значений счета в срт (±8ЕМ) РВМС, полученного от 10 доноров. Результаты показывают, что -003 и -005 не индуцируют значительной пролиферации РВМС (фиг. 24А). Также -024 не индуцируют значительной пролиферации РВМС (данные не приведены).
Пример 19.
Индукция ΙΕ-6.
-003, -005 и -024 тестируют в анализе, как описано в Аик1с11о с! а1., Т1ккис апйдспк 56, 538-547 (2000). Вкратце, РМВС культивируют при концентрации 1х106 клеток/ячейку на платах на 48 ячеек в присутствии 20 мкг/мл антител и 10 нг/мл ЬР8 (8|дта-А1бпсН СНсти, 2\уцпбгссН1 ТНс Nс!йс^1аηбк) в 500 мкл ВРМ0. После инкубации в течение ночи при 37°С супернатант собирают и хранят при -20°С. Концентрацию Ш-6 определяют с помощью ЕЫ8А (Ш-6 ЕЫ8А кй, И-СуТссй Вюксюпсск, и!гссй!, ТНс №11κγΗιι'168) согласно инструкциям поставщика. Данные представляют средние концентрации с пг/мл (±8ЕМ) от 7 доноров. Результаты показывают, что -003 и -005 не индуцируют высвобождение значительных уровней Ш-6 (фиг. 24Б). Также -024 не индуцирует высвобождение значительных уровней Ш-6 (данные не приведены).
Пример 20.
Индукция высвобождения ГЕИ-у.
-003, -005 и -024 тестируют в анализе, как описано в Аик1с11о с! а1., Т1ккис апйдспк 56, 538-547 (2000). Вкратце, РМВС от здоровых доноров культивируют при концентрации 1х105 клеток/ячейку на платах на 48 ячеек в присутствии 20 мкг/мл антител и 1 мкг/мл ОКТ-3 (8апдшп, Атк!сгбат, ТНс №(Ηο 1апбк) в 500 мкл ВРМ^. После инкубации в течение ночи при 37°С супернатант собирают и хранят при
-20°С. Концентрацию №N-7 определяют с помощью ЕЫ8А (№N-7 ЕЫ8А кй, И-СуТссй Вюксюпсск,
- 113 015584
Шгесй!, Тйе №!йег1апбх) согласно инструкциям поставщика. Данные представляют средние концентрации с пг/мл (±8ЕМ) от 9 доноров. Результаты показывают, что -003 и -005 не индуцируют высвобождение детектируемых уровней ЕΕN-γ (фиг. 24Б). Также -024 не индуцирует высвобождение значительных уровней ЕΕN-γ (данные не приведены).
Пример 21.
Сродство связывания -003 и -005 с рекомбинантным СИ38.
Связывание -003 и -005 с СИ38 тестируют с помощью поверхностного плазмонового резонанса. Вкратце, очищенные антитела иммобилизуют на сенсорных чипах СМ-5 хепхог сЫр (В1асоге, Иррха1а, 8\\'ебеп) через аминную связь. СИ38 с НА-тагом (см. пример 3) протекают над чипом и связывание антигена с тАЬ детектируют по изменению показателя преломления на поверхности чипа с помощью установки В1асоге 3000 (В1асоге). Константы ассоциации и скорости для -003 (табл. 7) и -005 (табл. 8) суммированы ниже (среднее по трем экспериментам ±СИ) и показывают, что -003 и -005 обладают высоким сродством к СИ38.
Таблица 7
Константы ассоциации и скорости при 25°С для -003
-003 ка(1/Мс) 2,17х103±2,б5х104 к4 (1/с) 1,9х10‘4 + 4,51x10'6
КА(1/М) 1,14х109± 1,58x10® Ко (М) 8,85х1О’10 ± 1,2хЮ’10
Таблица 8
Константы ассоциации и скорости при 25°С для -005
-005 ка(1/Мс) 8,88х104 ± 1,95х104 ка (1/с) 5,22х10‘4± 1,16х10'5
КА(1/М) 1,7x10® ± Зэ68х107 КО(М) 6,06х10'9± 1,21х10’9
Пример 22.
Картирование эпитопа.
Картирование эпитопа с помощью подхода РЕР8САК
Согласно известным процедурам (Сеухеп е! а1. 1984. Ихе оГ рерйбе хуп!йех1х !о ргоЬе у1га1 апйдепх Гог ерйорех !о а гехо1и!юп оГ а хшд1е ашпо ас1б. Ргос. №111. Асаб. 8с1 И8А, 81:3998; 81оо!х!га е! а1. 1996. 81гис!ига1 ахрес!х оГ апОЬобу-апйдеп т!егас!юп геуеа1еб 1йгоидй хта11 гапбот рерйбе НЬгапех. Мо1. Игуегх 1:87; Ри1|к е! а1. 2001. 8едтеп! хуп!йех1х. Еп РСТ, Тйе №!йег1апбх, р. 1), перекрывающиеся 20-мерные линейные и 15-мерные петлевые пептиды синтезируют, охватывая 138 аминокислот на С-конце СИ38 человека. Далее, основываясь на последовательности С-конца, делают однопетлевые пептиды различного размера, покрывающие район К№УВРПКЕЬрСУКМРЕП88СТ8ЕЕ, район СУнХЕОРЕКУОТЕЕАУУЕнСС и район С^Е8ЕЕ8КВNЕ^Ε8ΑКNЕΥВС. Дополнительно созданы дополнительные наборы для реконструкции районов с двойными петлями, которые состоят из 8КВNЕ^Ε8СКNЕΥВ и ЕКУрТЬЕА^УШСС. Природные цистеины заменены на аланины. Пептиды подвергнуты скринингу с помощью анализа ЕЫ8А с применением карт 1пйн-РЕР8САХ размером с кредитную карту.
Синтез пептидов.
Пептиды синтезируют с помощью стандартной химии Етос и защиту снимают с применением ТЕА с поглотителями. Далее пептиды со снятой защитой подвергают реакции с микроматрицей с 0,5 мМ раствором 2,6-бис-(бромметил)пиридина или 2,4,6-трис-(бромметил)мезитилена в бикарбонате аммония (20 мМ, рН 7,9), дополненной ацетонитрилом (1:1 объем/объем). Микроматрицы осторожно встряхивают в растворе в течение 30-60 мин при полном покрытии раствором. Под конец микроматрицы промывают большим количеством воды из М1Шроге и озвучивают в буфере для разрушения, содержащем 1% додецилсульфат натрия, 0,1% β-меркаптоэтанол в РВ8 (рН 7,2) при 70°С в течение 30 мин с последующим озвучиванием в воде из М1Шроге в течение еще 45 мин.
Анализ РЕР8СΑN ЕБЕ8А.
Полиэтиленовую карту на 445 ячеек размера кредитной карты, содержащую ковалентно-связанные пептиды, инкубируют с сывороткой (например, разведенной 1:1000 блокирующим раствором, который содержит 5% лошадиную сыворотку (объем/объем) и 5% овальбумин (вес/объем) (4°С в течение ночи)). После промывки пептиды инкубируют с кроличьим античеловеческим Ед, связанным с пероксидазой, (разведение 1:1000, 25°С, 1 ч) и после промывки добавляют субстрат пероксидазы (2,2-азиноди-3этилбензилтиазолин сульфонатом и 2 мкл/мл 3% Н2О2). Через 1 ч развитие окраски измеряют с помощью ССИ камеры и системы обработки изображений. Установка состоит из ССИ камеры с 55 мм линзами (8опу ССИ У1бео Сатега ХС-77ВВ, №коп тюго-шкког 55 тт Г/2.8 1епх), адаптера камеры (8опу Сатега абар!ог ИС-77ВВ) и программы Етаде Ргосеххтд 8ойпаге раскаде 0рйтах, уегхюп 6.5 (Меб1а СуЬегпейсх, 811уег 8рппд, МИ 20910, И.8.А.; 0р!1тах работает на компьютере реп!шт ЕЕ).
- 114 015584
Способ презентации эпитопа.
Индивидуальные аминокислоты идентифицируют по дипептидным мотивам. которые представляют наименьшие уникальные единицы в аминокислотной последовательности СГО38 человека. Всем дипептидным мотивам. присутствующим в каждом из 1164 тестируемых пептидов. придаются ЕЫ§А значения. полученные для соответствующего полного пептида. Чтобы выстроить ряд дипептидных мотивов от сильного до слабого связывания. рассчитывают относительный сигнал посредством деления ЕЬРЗА значений. полученных для каждого индивидуального мотива. на усредненные ЕЬРЗА значения от всех 1164 линейных и петлевых пептидов и их сортируют по уменьшению величин. Таким образом определяют вклады аминокислот в конформационные эпитопы. Для каждого тестированного тАЬ отбирают все дипептидные мотивы. получившие выше 2.5 балла (например. ЕЫ8А значения пептидов. содержащих эти мотивы по меньшей мере в 2.5 раза больше усредненной ЕЬРЗА величины. полученной со всеми 1164 пептидами). Данные разлагают на вклады одиночных аминокислот. представленные в линейной последовательности СГО38 с помощью системы баллов. Перемещаясь вдоль линейной последовательности СГО38 и применяя уникальные дипептидные единицы в качестве точки отсчета. придают один балл каждый раз. когда аминокислота СЭ38 присутствуют в этом наборе пептидов с высокими баллами.
Обнаружено. что -003. -005 и -024 связываются с районом 8КК№рБ8СКМУК и ЕКУОТБЕА\\УШ66 в СЭ38 человека. -003 в особенности узнает мотивы КМОЕ и \ννΙΗ. -005 в особенности узнает мотивы ККЫ и УОТБ.
Пример 23.
Ферментативная активность.
Ферментативную активность СГО38 человека измеряют в анализе в основном. как описано в СгаеГГ е! а1.. I. Вю1. СЬет. 269. 30260-30267 (1994). Вкратце. субстрат N60+ (80 мкМ) инкубируют с СО38 (0.6 мкг/мл внеклеточного домена СГО38 с Гис-тагом. см. пример 3 относительно очистки И|к-СО38) в буфере. содержащем 20 мМ Трис-ИС1. рН 7.0. Продукцию цГДФР можно наблюдать спектрофотометрически с длиной волн эмиссии 410 нм (возбуждение при 300 нм). В этом примере применяют фильтр на возбуждении 340±60 нм и фильтр на эмиссии 430±8 нм.
Чтобы тестировать действие -003. -005 и -024 на ферментативную активность С.ГО38. рекомбинантный белок Шк-СП38 преинкубируют в течение 15 мин при комн. темп. с различными концентрациями (30. 3. 0.3 и 0.03 мкг/мл) различных антител перед добавлением субстрата N60'. Продукцию циклической ГДФ-рибозы (цГДФР) регистрируют в различные моменты времени после добавления антител (3. 6. 9. 12. 30. 45. 60. 75 и 90 мин).
Фиг. 26Б показывает. что -005 обладает значительным ингибиторным действием на продукцию цГДФР. Через 90 мин добавление 30 и 3 мкг/мл -005 приводит к уменьшению на 32 и 34% продукции цГДФР (табл. 9). Сходные результаты наблюдаются в независимых экспериментах с применением разных партий -005.
Никакого ингибиторного действия на продукцию цГДФР не наблюдается после добавки -003 (фиг. 25Б. табл. 9). -024 (фиг. 25Г. табл. 9) или анти-КБ-Η (фиг. 25А. табл. 9).
На основании этих данных ожидается. что -005 также ингибирует синтез циклической АДФ-рибозы (цАДФР) из НАД+. Ингибирование синтеза цАДФР можно определять согласно способу ВЭЖХ. описанному в МипкЬ е! а1.. I. Вю1. СЬет. 275. 21566-21571 (2000).
Таблица 9 Продукция цГДФ-рибозы в присутствии СО38-специфических антител или анти-ΗΒΗ
продукция (% ΝΟΠ контроля)
30 мкг/мл 3 мкг/мл 0,3 мкг/мл 1 0,03 мкг/мл
кьн по 99 108 111
-003 99 100 107 107
-005 68 66 98 102
-024 99 100 104 105
Пример 24.
Сравнение -003 и -005 с МогрЬокук антителом 3079.
Антитела -003 и -005 функционально сравнивают с МогрЬокук антителом 3079 (ТН-3079). Способы клонирования и экспрессии МогрЬокук антитела 3079 описаны в примере 16. Способы проведения СЭС описаны в примере 6. Способы проведения АТОСС описаны в примере 5.
Фиг. 26А показывает. что -003 и -005 и ТН-3079 индуцируют СЭС-опосредованный лизис трансфицированных ί.Ό38-ί.Ή0 клеток со сходными значениями максимального лизиса. При сравнении величин ЕС50. -005 антитело оказывается лучше. чем ТН3079. в индукции лизиса СЭ38-СИ0 клеток. причем ЕС50 в два раза ниже (см. табл. 10).
Фиг. 26Б показывает. что -005 превосходит ТН-3079 в индукции СЭС-опосредованного лизиса ЭанйЫис клеток. причем максимальный лизис с помощью -005 в 2-3 раза выше. чем с помощью ТН3079. При сравнении величин ЕС50 антитела -005 сходны с ТН-3079 в индукции лизиса ЭанйМис клеток (см. табл. 10). -003 не индуцируют значительного СЭС-опосредованного лизиса ЭанйМис клеток.
Фиг. 26В показывает. что в этом эксперименте -005. -003 и ТН-3079 опосредуют лизис Оаий| клеток
- 115 015584 мишеней через АЭСС. Никакой разницы не обнаружено в значениях логарифма ЕС50 и максимального лизиса (табл. 11, п=5).
Таблица 10 Максимальный лизис и значения ЕС50 для СЭ38-специфических антител в реакции СЭС
СНО-С1)38 клетки (п~2) ОаисБЗис клетки (п=2)
ЕС50 мкг/мл % Макс, лизиса ЕСзо мкг/мл % Макс, лизиса
-005 0,15 ±0,007 76,5 ± 3,54 0,39 ± 0,00 70,5 ± 7,78
ТН-3079 0,31 ±0,021 81,5 ±7,78 0,34 ± 0,26 25,5 ± 12,02
-003 4,5± 0,933 62,0 ± 16,79 ПС 12 ± 8,49
Таблица 11 Максимальный лизис и значения ЕС50 для СЭ38-специфических антител в реакции СЭС
Бод ЕС50 8ТО 1о§ ЕСзо Макс, лизис (%) 5ТП макс. лизиса
-005 0,76 0,18 49,2 12,8
-003 1,17 0,23 64 14,2
ТН3079 0,96 0,10 43,8 12,0
- 116 015584
Список последовательностей <110> бептаЬ А/5 <120> нитап мопос1опа1 Ап11ЬосНе5 адатпзт СР38 <130> Р/18.ИО <160>34 <170> РаГепТШ уегзтоп 3.2 <210> 1 <211>321 <212> ΡΝΑ <213> Ното зартепз <400>1
дасагссада Тдасссадгс ЁссаТссСса сЁдЁсТдсаЁ сЁдЁаддада сададЁсасс 60
агсасггдгс дддсдадЁса дддгаттадс адсТддЁЁад ссЁддЁаЁса дсадааасса 120
дадааадссс сгаадТсссТ даТсЁаТдсЁ дсГЁссадЁЁ Ёдсааадгдд ддЁссса+са 180
аддГИсадсд дсадьддагс ЁдддасадаЁ ЁЁсасгсЁса ссаЁсадсад ссЁдсадссЁ 240
даадамгтд саасЁЁаЁЁа сТдссаасад ЁаЁааЁадГЁ асссЁсддас дЁЁсддссаа 300
дддассаадд Ёддааатсаа а 321
<210> 2 <211>107 <212> РКТ <213> Кото эартепз <400>2
Азр 11е 61л Μβΐ ТЬг 61 п Зег рго Зег зег ьеи Зег А1а зег Уа1 61 у
1 5 10 15
А5р Агд Уа1 ТЬг Не ТЬг Суз Агд А1а зег с1п 61 у 11 е Зег зег тгр
20 25 30
Ьеи А1а Тгр 35 Туг 61 η 61 η Ьуз Рго 40 61 и ьуз А1а Рго ьуз 45 Зег ьеи 11 е
Туг А1а А1а Зег зег ьеи 61 η зег 61у Уа1 Рго зег Агд РКе Бег 61 у
50 55 60
Зег 61 у Зег 61 у тЬг АЗр рНе тЬг Ьеи тИг 11 е Зег зег ьеи 61л Рго
65 70 75 80
61 и Азр РЬе А1а тпг туг туг Суз 61л 61л туг АЗП зег Туг РГО Агд
85 90 95
тНг РИе б1у 61 η 61 у тНг ЬУЗ уа! б1и 11е ьуз
100 105
<210;·3 <211> 11
- 117 015584 <212> РКТ
<213> <400> Агд А1г 1 Ното 3 ι 5ег 5ар1€П5
61η <з1у 5 11е 5ег 5ег
<210> 4
<211> 7
<212> РКТ
<213> Ното зарпепз
<400> 4
А1а А1а Бег Бег Геи <31 η Бег
1 5
<210> 5
<211> 9
<212> РКТ
<213> Ното зарпепз
<400> . 5
<31п 61 г 1 ту г А5п Бег Туг Рго Агд
1 5
<210> 6
<211> 366
<212> ϋΝΑ
<213> Ното зарЧ еп5
<400> 6
саддкссадс кддкдсадкс кддддскдад дкдаадаадс скдддксскс ддкдааддкс 60
ксскдсаадд сккскддадд сасскксадс адскакдскк ксадскдддк дсдасаддсс 120
сскддасаад дасккдадкд дакдддаадд дксакссскк кссккддкак адсааасксс 180
дсасадааак кссадддсад адксасаакк ассдсддаса аакссасдад сасадсскас 240
акддасскда дсадсскдад акскдаддас асддссдкак аккаскдкдс дададакдак 300
акадсадсас ккддкссккк кдаскаскдд ддссадддаа ссскддксас сдксксскса 360
дссксс 366
<210> 7 <211> 122 <212> РКТ <213> Ното зарпепз
<400> 7
<31 η Уа1 <31 η 1_еи Уа1 <31п Бег <31у А1а (31и Уа1 1-У5 1-У5 РГО <31 у Бег
1 5 10 15
Бег Уа1 куз Уа1 Бег Суз 1_уз А1а Бег <31у С1у ТНг РНе Бег Бег туг
20 25 30
А1а РНе Бег тгр Уа1 Агд <31 η А1а 1 эго <31у <31 η <31 у ьеи <31 и тгр мег
- 118 015584
35 40 45
61 у дгд \/аТ 11 е рго рНе ьеи 61 у Не А1а АЗП Бег А1а 61η ьуз РНе
50 55 60
61 η С1у Агд Уа1 тНг Не ТНг А1а Азр ьуз Бег ТНг Бег тНг А1а туг
65 70 75 80
МеЕ Азр Ьеи Бег Бег Ьеи Агд Бег 61 и А5Р ТНг А1а Уа1 Туг туг Суз
85 90 95
А1а Агд Азр Азр 11е А1а А1а ьеи 61 у Рго РНе Азр туг тгр 61 у 61 η
100 105 110
61 у ТНг Ьеи Уа1 тНг Уа1 Бег Бег А1а Бег
115 120 <210> 8 <211> 5 <212> РРТ <213> Ното зартелз <400> 8
Бег туг А1а рНе Бег
5 <210> 9 <211> 17 <212> РРТ
<213> Ното эартепз
<400> 9 Агд Уа1 Не рго РНе Ьеи 61 у 11 е А1а Азп Бег А1а 61 п Ьуз РНе 61 η
1 5 10 15
61 у
<210> <211> <212> <213> 10 11 РРТ Ното зартепз
<400> 10
Азр Азр 11е А1а А1а ьеи б!у Рго РНе Азр Туг
1 5 10
<210> <211> <212> <213> 11 321 ϋΝΑ Ното зартепз
<400> 11 .
даааЕЕдЕдЕ ЕдасасадЕс Ессадссасс сЕдЕсЕЕЕдЕ сЕссадддда аададссасс 60
- 119 015584 схсхссхдса дддссадхса дадхдххадс адсхасххад ссхддхасса асадааассх120 ддссаддсхс ссаддсхссх сахсхахдах дсахссааса дддссасхдд сахсссадсс180 аддххсадхд дсадхдддхс хдддасадас ххсасхсхса ссахсадсад ссхададссх240 даадаххххд садхххахха схдхсадсад сдхадсаасх ддссхссдас дххсддссаа300 дддассаадд ХддаааХсаа а321 <210> 12 <211>107 <212> РКТ <213> Ното зарзепз <400>12
01 и 1 Не уа! хеи тНг 61η Зег Рго А1а тНг ьеи Зег Ьеи 5ег РГО 15 61 у
5 10
61 и лгд А1а ТНг Хеи Зег Су5 Агд А1а Зег 61 η Зег Уа! Зег зег туг
20 25 30
ьеи А1а Тгр туг 61 η 61п ХуЗ РГО 61 у 61 η А1а РГО Агд ьеи хеи Не
35 40 45
туг АЗр А1а зег Азп Агд А1а ТНг 61 у Не РГО А1а Агд РНе зег 61 у
50 55 60
Бег б1у Зег б1у тНг Азр РНе ТНг ьеи тНг 11 е Зег Зег ьеи 61 и РГО
65 70 75 80
61 и Азр рНе А1а уа! туг Туг суз 61 η 61 η Агд Зег АЗП тгр Рго Рго
85 90 95
тНг рНе 61 у 61 η 61у ТНг Ьуз Уа1 61 и Не Ьуз
100 105 <210>13 <211> 11 <212> РКТ <213> Ното 5ар1’еп5 <400>13
Агд А1а Зег С1п 5ег Уа1 Зег Зег Туг Хеи А1а
1510
<210> <211> <212> <213> 14 7 РКТ Ното зартепз
<400> 14
лар А1а Зег Азп Агд А1а тНг
- 120 015584
<210> 15
<211> 10
<212> РКТ
<213> Ьото 5ар1еп5
<400> 15
С1п 61 η Агд Зег Азп Тгр Рго Рго ТЬг РЬе 1510 <210> 16 <211>372 <212> РКТ <213> Ьото заргепз <40016
С1 у А1 а 61 у 61 у ТЬг 61у Суз А1а С1у суз ТЬг 61 у ТЬг ТЬг 61 у 61 у
1 5 10 15
А1а 61 у ТЬг Суз ТЬг С1у 61 у 61 у 61 у 61 у А1а 61 у 61 у Су5 ТЬг ТЬг
20 25 30
С1у 61 у ТЬг А1а суз А1а 61 у суз Су5 ТЬг 61 у 61 у 51у 61 у 61 у 61 у
35 40 45
ТЬг Суз Суз Суз тЬг б1у А1 а б1у А1а суз тЬг Су 5 тЬг суз А1а тЬг
50 55 60
61 у ТЬг 61у Су5 А1а 61 у ТЬг Суз ТЬг Суз ТЬг 61у 61у А1а ТЬг тЬг
65 70 75 80
Суз А1а Суз суз ТЫ 85 тЬг тЬг А1а А1а суз 90 А1а б1у суз тЬг тЬг 95 тЬг
61 у суз суз А1а ТЬг 61 у А1а 61 у Суз тЬг 61 у 61у 61 у тЬг суз Су 5
100 105 110
61 у суз СУ5 А1 а 61 у 61 у суз тЬг суз суз А1а 61 у 61 у 61 у А1а А1а
115 120 125
61 у 61у 61 у 61 у суз ТЬг 61 у 61у А1а 61 у ТЬг 61 у 61у 61у ТЬг Суз
130 135 140
ТЬг суз А1а б1у Суэ ТЬг А1а ТЬг ТЬг А1 а 61 у ТЬг 61 у 61 у ТЬг А1а
145 150 155 160
61 у тЬг 61 у 61 у ТЬг 61у 61у ТЬг 61 у 61 у Суз А1 а Суз А1а ТЬг А1а
165 170 175
Суз ТЬг А1а Суз 61у суз А1а 61 у А1а Суз тЬг Суз суз 61 у ТЬг 61у
180 185 190
а! а А1а б1у 61 у 61 у суз Суз с1 у 61 у тЬг тЬг суз А1а суз суз А1а
195 200 205
- 121 015584
тНг Суз Ткг суз суз А1а 61 у А1а 61у А1а суз А1а А1а ткг ТНг суз
210 215 220
СУ5 А1а А1а 61у А1а А1а Суз А1а Суз 61у Суз Ткг 61у Ткг А1а ткг
225 230 235 240
Суз ткг 61 у суз А1а 245 А1а А1а ткг б!у А1а 250 А1а Суз А1а б!у суз 255 суз
ткг 61 у А1а 61у А1а 61 у суз суз 61 у А1а 61 у 61 у А1а Су5 А1а суз
260 265 270
61у 61 у Суэ Суз 61 у Тпг А1а ТЬг А1а Ткг ткг тИг Суз ткг 61у ткг
275 280 285
61у Суз 61 у А1а А1а А1а 61 у А1а ТНг А1а А1а 61 у А1а тпг ткг Суз
290 295 300
тКг Суз тНг 61 у б!у ткг ТНг суз 61 у 61у 61 у 61у А1а С1у Суз Суз
305 310 315 320
Суз 61 у ТНг Суз ТНг Ткг ТЬг 61 у А1а суз ткг А1а Суз ткг 61 у б1у
325 330 335
61 у 61 у Суз Суэ А1а 61 у 61 у 61 у А1а А1а суз суз Су 5 ткг 61 у 61 у
340 345 350
ткг суз А1а суз Суз 61 у Ткг Суз ТЬг суз Суз ткг Суз А1а 61 у суз
355 360 365
Су$ ТЙГ Суз Су5
370
<210> 17
<211> 124
<212> РКТ
<213> кото зартепз
<400> 17
61 и Уа1 61 η ьеи ьеи С1и 5ег 61у 61у 61у Ьеи Уа1 61п Рго 61у 61у
5 10 15
Бег Ьеи Агд ьеи Бег суз А1а Уа1 Зег С1у РКе ткг Рке азп Зег Рке
25 30
А1 а меь зег 35 тгр Уа! Агд 61η А1а Рго 61у 40 Ьуз 61 у ьеи 45 61 и Тгр Уа1
зег А1а 11е Зег 61 у Бег 61 у 61у 61 у ТЬг Туг туг л!а Аэр Бег Уа1
55 60
- 122 015584
бЗу Агд РЬе ТЬг 11 е Зег Агд Азр Азп Зег гуз Азп тНг геи туг
65 70 75 80
Геи бЗп мег АЗП Зег геи лгд л1а с1и АЗр ТЬг лЗа УаЗ туг РЬе суз
85 90 95
АЗ а Агр гуь 11е геи тгр РЬе сЗу бЗи Рго УаЗ РЬе Азр туг тгр
100 105 110
бЗу С1 η бЗу ТЬг геи УаЗ тЬг УаЗ 5ег Зег АЗа зег
115 120 <210> 18 <211>5 <212> РКТ <213> Ното зартепэ <400>18
Зег рЬе дЗа Мег Зег <210> 19 <211> 17 <212> РКТ
<213> Ьоша зартепз
<400> 19
АЗа 13е Зег бЗу Зег бЗу бЗу бЗу ТЬг Туг Туг АЗа Азр зег УаЗ гуз
1 5 10 15
бЗу
<210> 20
<211> 13
<212> РКТ
<213> Ното 5арт епэ
<400> 20
дзр гуз , 11е геи тгр РЬе С1у 31и рго уа! РЬе дзр туг
1 5 10
<210>
<211>
<212>
<213>
321 ϋΝΑ Ьото
5арЗепз <400> даааггдгдг гдасасадгс гссадссасс сгдгсгггдг сгссадддда аададссасс сгсгссгдса дддссадгса дадгдггадс адсгасггад ссгддгасса асадааассг
120 ддссаддсгс ссдддсгссг сагсгагдаг дсггссааса дддссхсгдд сагсссадсс
180 аддТТсадТд дсадХдддРс
Тдддасадас гтсасгсгса ссагсадсад ссгададссг
240
- 123 015584 даадаттссд садтсгаста стдтсадсад сдсадсааст ддссссссас ссссддсдда дддассаадд сддадатсаа а
300
321 <210> 22 <211>107 <212> РКТ <213> Кото зартепз <400>22
С1и 11е 1 Уа1 ьеи тКг 5 С1п Зег РГО А1а тКг Геи 10 Зег геи зег Рго 15 61 у
61 и Агд А1а тКг ьеи Зег Суз Агд А1а 5ег 61 η зег Уа1 зег Зег туг
20 25 30
ьеи А1а тгр Туг С1п 61 η Ьуз Рго 61 у б1п А1а РГО 61у геи Геи Не
35 40 45
Туг А5р А1а Зег А5П Агд А1 а зег 61 у Не рго А1а Агд рКе 5ег 61 у
50 55 60
Зег 65 С1у 5ег 61 у тКг АЗр 70 РКе тКг геи тКг Не 75 Зег 5ег геи 61 и РГО 80
б!и АЗр РКе А1 а Уа1 туг туг суз 61 п 61 п Агд Зег АЗП тгр Рго Геи
85 90 95
ТКг рКе 61 у 61 у С1у ТЬг иуз Уа1 61 и 11е гуз
100 105 <210>23 <211> 11 <212> РКТ <213> Кото Бартелз <400>23
Агд д1а Зег σΐη Зег Уа1 зег Зег Туг геи А1а
510
<210> 24
<211> 7
<212> РКТ
<213> Кото зар1епз
<400> 24
Азр А1а . Зег А5П Агд А1а зег
1 5
<210> 25
<211> 9
<212> РКТ
<213> Кото
<400> 25
епз
- 124 015584 η 61 η Агд зег азп тгр Рго ьей тКг <210> 26 <211>366 <212> ϋΝΑ <213> Ното зартепз <400> 26
даддтдсадс ТддТдсадТс тддадсадад дГдааааадс ссддддадТс ГсТдаадаТс 60
тсстдтаадд дттстддата садсгтсс аастастдда тсддстдддт дсдссадатд 120
сссдддааад дсстддадтд датддддатс атстатссхс атдастстда тдссадатас 180
адсссдтссг гссааддсса ддтсассттс тсадссдаса адтссатсад сассдсстас 240
сгдсадгдда дсадссгдаа ддсстсддас ассдссаТдТ аТТасТдгдс дадасатдта 300
дддгддддаг сдсддГастд дТасТТсдаТ сТсТддддсс дТддсасссТ ддТсасТдТс 360
ТссГса 366
<210>27 <211> 122 <212> РИТ <213> Ното зартепз <400>27
61и 1 Уа! 61 η геи уа! 5 61 л Зег 61 у А1а 61 и Уа1 10 ьуз ьуз РГО 61 у 15 61 и
Зег Геи ьуз Не Зег Су 5 ГУ5 61 у 5ег <31 у Туг Зег РЬе Зег Азп Туг
20 25 30
тгр Не 61 у тгр Уа1 Агд с! η мег РГО 61у ьуз 61 у геи 61и тгр мет
35 40 45
61 у Не Не Туг Рго ΗΪ5 Азр Зег АЗр А1а Агд Туг зег Рго Зег РЬе
50 55 60
61 п 61у 61п Уа1 ТЬг Рпе зег А1а А5р Ьуз Зег 11 е зег ТНг А1а туг
65 70 75 80
ьей 61 п Тгр 5ег Зег 85 Ьей ьуз А1а Зег Азр 90 ТНг А1а Мег Туг Туг 95 Суз
А1 а Агд Нт 5 Уа1 61у тгр 61 у Зег Агд туг тгр туг рНе А5Р Ьей тгр
100 105 но
61 у Агд 61 у тЬг Ьей Уа! ТНг Уа1 Зег зег
115 120
<210> 28 <211>5 <212> РКТ
- 125 015584
<213> Ното зарт епз
<400> 28
АЗП ТуГ тгр 11 е 61 у
1 5
<210> 29
<211> 17
<212> РКТ
<213> Ното эартепз
<400> 29 е Не Туг Рго Нтз Аэр 5ег Азр А1а Агд Туг Зег Рго Зег рКе 01 η
1015
О1у <210>30 <211>13 <212> РКТ <213> Кото зартепз.
<400>30 нтз Уа1 С1у тгр с1у зег Агд туг тгр туг РНе дзр ьеи
5Ю <210>31 <211>300 <212> РКТ <213> Ното гартепз <400>31
мет А1а азп суз 61 и РНе зег РГО Уа1 Зег 10 61у Азр Ьуз Рго Суз 15 Суз
1 5
Агд Ьеи Зег Агд 20 Агд А1а 61 П Ьеи Су 5 25 ьеи 61 у Уа1 Зег Не 30 Ьеи Уа!
Ьеи 11е ьеи Уа1 Уа1 Уа1 Ьеи А1а Уа1 Уа1 Уа! Рго Агд тгр Агд 61п
35 40 45
61л тгр Зег 61 у Рго 61 у тНг тНг ьуз Агд рНе Рго 61 и ТНг Уа1 Ьеи
50 55 60
А1а Агд Суз Уа1 Ьуз Туг ТНг 61 и 11е Нтз рго 61 и мет Агд НТ 5 Уа!
65 70 75 80
АЗр суз 61 п зег Уа1 тгр Азр А1а рНе Ьуз 61 у А1 а РНе 11е Зег ьуз
85 90 95
НТ 5 РГО суз Азп 11е тНг 61 и 61 и Аэр Туг 61 п Рго ьеи Мет Ьуз ьеи
100 105 110
- 12б 015584
61 у ТН г 61η тНг Уа1 Рго суз Авп Ьу5 11е Ьеи ьеи Тгр Зег Агд 11 е
115 120 125
ьуз Азр Ьеи А1а Н1з 61 п РНе ТНг 61п Уа1 61 п Агд Азр Мек РНе ТНг
130 135 140
ьеи С1и Азр ТНг ьеи ьеи С1у Туг Ьеи А1а А5р А5р ьеи ТЬг Тгр Суэ
145 150 155 160
61 у 61 и РНе АЗП ТНг Зег ьуз 11е Азп туг 61 п зег Суз РГО АЗр Тгр
165 170 175
Агд ьуз Азр 180 Зег Азп Азп Рго Уа1 185 Зег Уа1 РНе Тгр ЬУ5 190 ТЬг Уа1
5ег Агд Агд РНе А1а 61и А1а А1 а СУ5 Азр Уа1 Уа1 Нт 5 Уа1 Мек Ьеи
195 200 205
АЗП 61 у 5ег Агд Зег Ьуз 11 е РНе Азр ьуз АЗП зег тНг РНе 61 у Зег
210 215 220
Уа1 61 и Уа1 Нт 5 Азп Ьеи 61 п РГО 61 и ьуз Уа1 61 п тНг ьеи 61 и А1а
225 230 235 240
Тгр Уа1 11е НТ 5 61у 61 у Агд 61 и Азр Зег Агд Азр Ьеи Суз 61 п АЗр
245 250 255
Рго тНг 11е ьуз 61 и ьеи 61 и Зег 11е 11е 5ег ьуз Агд А5П Не 61 п
260 265 270
РНе Зег Суз ьуз АЗП 11 е туг Агд РГО Азр ьуз РЬе Ьеи 61 п Суз Уа1
275 280 285
Ьуз Азп Рго 61 и АЗр Зег зег суз ТНг Зег 61 и 11е
290 295 300
<2ΐο> : 32
<2ΐι> : 300
<212> 1 РКТ
<213> 1 тото зартепз
<4оо> : 32
Мек А1а А5П суз 61и РНе Зег РГО Уа1 Зег 61 у АЗр ЬУ5 РГО суз суз
1 5 10 15
Агд Ьеи Зег Агд Агд А1а 61 п ьеи суз ьеи 61 у Уа1 зег Пе ьеи Уа1
20 25 30
ьеи 11е ьеи Уа1 Уа1 Уа1 ьеи А1а Уа1 Уа1 Уа1 Рго Агд Тгр Агд 61 п
35 40 45
- 127 015584
с!п тгр зег С1у Рго б!у тНг тНг Ьуз Агд РНе РГО 60 61 и ТНг Уа! ьеи
50 55
А1 а Агд Суз Уа! Ьуз туг тНг 61 и Не Нтз Рго 61 и меЕ лгд НТЗ Уа!
65 70 75 80
Азр Суз 61 п Зег Уа1 85 Тгр А5Р А1а РНе Ьуз 90 61 у А1а РНе Не Зег 95 Ьуз
НТЗ Рго Суз А5П 11 е тНг 61 и 61 и Аэр Туг 61 п РГО Ьеи Мет ьуз Ьеи
100 105 110
61 у ТНг 61 п ТНг уа! РГО Суз АЗП Ьуз Не ьеи ьеи тгр зег Агд Не
115 120 125
Ьуз Азр ьеи а! а нтз 61 п РНе тНг б1п Уа1 61 п Агд Азр мет РНе тНг
130 135 140
ьеи 61 и А5р тНг ьеи ьеи 61 у туг ьеи А1а А5Р Азр Ьеи тНг тгр суз
145 150 155 160
61у 61и РНе АЗП тНг Зег ьуз 11 е АЗП туг 61п Зег Су5 РГО АЗр тгр
165 170 175
Агд Ьуз АЗр суз 180 зег Азп АЗП РГО Уа! 185 Зег Уа! РЬе тгр ьуз 190 ТНг уа!
Зег Агд Агд РНе А1 а 61 и А1а А1а Суз Азр Уа1 Уа! нтз Уа! мет ьеи
195 200 205
АЗП <31 у Зег Агд зег ьуз 11 е РНе А5Р Ьуз Азп Зег ТНг РНе 61 у Зег
210 215 220
Уа1 61 и Уа1 НТ 3 АЗП ьеи 61 п Рго 61 и Ьуз Уа! 61 п А1а Ьеи 61 и А1а
225 230 235 240
Тгр Уа1 11 е Нт 5 01 у С1 у 245 Агд 61 и А5Р Зег 250 Агд Азр ьеи Суз б!п 255 АЗр
РГО тНг 11е ьуз 61 и Ьеи 61 и Зег 11е 11е Зег ьуз Агд АЗП Не 61п
260 265 270
РНе Зег Суз ьуз А5П Не Туг Агд Рго Азр Ьуз РНе ьеи 61 π Суз Уа!
275 280 285
ьуз АЗП РГО 61 и Азр Зег Зег СУ5 ТНг Зег 61и 11 е
290 295 300
<210> 33 <211> 300 <212> РР.т <213> Ното зартепз
- 128 015584 <400> 33
Μβΐ А1а АЗП суз С1и РЬе Зег РГО уа1 Зег б!у Азр Ьуз РГО суз суз
1 5 10 15
Агд Ьеи Зег Агд 20 Агд А1а 61 п ьеи Суз 25 ьеи 61 у Уа1 Зег Пе 30 ьеи Уа1
Ьеи 13 е ьеи Уа1 Уа1 Уа1 Ьеи А1а Уа1 Уа1 Уа! Рго Агд Тгр Агд 61 п
35 40 45
61 η тгр Бег б1у РГО 61 у ТЬг тКг Ьуз Агд РЬе Рго 61 и ТЙГ уа1 ьеи
50 55 60
А1а Агд Суз Уа1 Ьуз Туг ТЬг с1и 11 е Н15 РГО 61 и меь Агд НТ 5 уа!
65 70 75 80
АЗр СУ5 61 п Зег Уа1 Тгр А5р А1а РЬе ьуз 61 у А1а РЬе Не 5ег Ьуз
85 90 95
НТ 5 РГО суз Азп Не ТЬг 61 и 61 и азр туг 61 п Рго Ьеи меТ ьуз ьеи
100 105 110
61 у тКг 61П тйг Уа1 Рго Суз А5П Ьуз Не Ьеи Ьеи Тгр Зег Агд Не
115 120 125
ьуз Азр Ьеи А1а НТ 5 61 п РЬе тЬг 61 п Уа1 61 π Агд Азр меТ рНе ТЬг
130 135 140
ьеи 61 и АЗр тНг ьеи Ьеи 61у туг Ьеи А1а Азр Азр Ьеи ТЬг тгр СУ5
145 150 155 160
С1у ΰΐυ РЬе АЗП ТНг Зег ьуз 11е АЗП Туг 61 п Зег Суз РГО Азр тгр
165 170 175
Агд Ьуз АЗр Суз Зег АЗП АЗП РГО Уа! Зег Уа1 РЬе тгр ьуз ТЬг уа!
180 185 190
Зег Агд Агд РЬе А1а 61и А1а А1а Суз Азр Уа1 Уа! Нт 5 Уа1 МеТ Ьеи
195 200 205
АЗП 61у зег Агд Бег ьуз 11 е РЬе Азр ьуз Азп Зег ТЬг РЬе б1у Зег
210 215 220
Уа1 61и уа! Нт 5 А5П ьеи 61 п РГО 61 и ьуз Уа1 61 п ТЙГ Ьеи 61 и А1а
225 230 235 240
Тгр Уа! 11 е НТ 5 61 у 245 61 у Агд 61 и Азр Зег 250 Агд АЗр ьеи Су5 61 п 255 Азр
РГО ТЬг 11е ьуз 61 и Ьеи 61 и Зег Не Не Зег Ьуз Агд АЗП 11 е Агд
- 129 015584
260 265 270
РЬе бег Суз Ьуз АЗП Не Туг Агд рго Азр ьуз РЬе Ьеи 61 п Суз Уа1
275 280 285
ьуз А5П РГО 61 и Азр Зег Зег Суз ТЬг Зег 61υ Не
290 295 300
<210> 34
<211> 300
<212> РКТ
<213> Ното 5ар1еп5
<400> 34
Μβΐ А1а АЗП Суз 61 и РЬе Зег Рго уа1 Зег 61 у Азр Ьуз Рго Суз Суз
1 5 10 15
Агд Ьеи Зег Агд Агд А1а 61 п ьеи Суз Ьеи 61 у Уа1 зег Не Ьеи Уа!
20 25 30
Ьеи 11 е Ьеи Уа1 Уа1 Уа1 Ьеи А1а уа! Уа1 Уа1 РГО Агд Тгр Агд 61 п
35 40 45
61 η тгр 50 Зег б1у Рго б1у ТНг 55 ТНг Ьуз Агд РНе Рго 60 61 и ТНг Уа! Ьеи
А1а 65 Агд Суз Уа! ьуз Туг 70 ТНг 61 и 11 е НТ 5 РГО 75 61 и Мес Агд НТ 5 Уа1 80
Азр Суз 61п зег Уа! тгр Азр А1а РЬе ьуз 61 у А1а РНе Не Зег ьуз
85 90 95
Нт5 РГО Суз АЗП Не ТНг 61 и 61 и Азр туг 61 п Рго ьеи мег ьуз ьеи
100 105 110
61 у ТЬг 61 п ТНг Уа! РГО Суз Азп ЬУ5 Не Ьеи Ьеи Тгр Зег лгд Не
115 120 125
Ьуз Азр ьеи А1а нт 5 61η Рйе ТЬг 61 п Уа1 61 п лгд Азр МеС РНе ТЬг
130 135 140
ьеи 61 и Азр тИг ьеи ьеи 61 у туг ьеи А1а Азр Азр Ьеи тИг тгр Суз
145 150 155 160
61 у 61 и РНе АЗП ТНг Зег Ьуз Не Азп Туг 61 п Зег СУ5 Рго Азр Тгр
165 170 175
лгд ьуз АЗр Суз 180 Зег Азп АЗП рго Уа1 185 Зег Уа1 РНе Тгр ьуз 190 ТЬг Уа1
Зег Агд Агд РНе А1 а 61 и А1а А1 а Суз АЗр Уа1 уа! НТ 5 Уа1 мес Ьеи
195 200 205
- 130 015584
АЗП 61 у Зег Агд Зег ьуз Не рНе А$р ЬУ5 АЗП Зег тИг РЬе 61 у зег
210 215 220
уа1 61 и Уа1 НтЗ А5П Ьеи 61 п РГО б!и ьуз Уа1 61п ТЬг ьеи б!и А1а
225 230 235 240
Тгр Уа1 Не Нт з 61 у 61у Агд 61 и Азр зег Агд Азр ьеи Суз 61п Азр
245 250 255
РГО Тб г 11 е ьуз 61 и Ьеи 61 и Зег Не 11 е Зег ьуз Агд АЗП Не 61 п
260 265 270
РЬе Рбе Суз ьуз АЗП Не туг Агд РГО АЗр Ьуз РЬе ьеи 61 η Су5 Уа1
275 280 285
ьуз Азп Рго 61 и АЗр 5ег зег Суз тКг Зег 61 и 11е
290 295 300
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Claims (79)

1. Антитело, связывающееся с СИ38 человека, или его фрагмент, содержащее:
(а) вариабельные участки легкой и тяжелой цепи антитела человека, кодируемые нуклеотидными последовательностями δΞΟ ΙΌ N0:1 и δΞΟ ΙΌ N0:6 соответственно; или (б) вариабельные участки легкой и тяжелой цепи антитела человека, кодируемые нуклеотидными последовательностями δΞΟ ΙΌ N0:11 и δΞΟ ΙΌ N0:16 соответственно; или (в) вариабельные участки легкой и тяжелой цепи антитела человека, кодируемые нуклеотидными последовательностями δΞΟ ΙΌ N0:21 и δΞΟ ΙΌ N0:26 соответственно; или (г) вариабельные участки легкой и тяжелой цепи антитела человека, которые содержат консервативные модификации по сравнению с участками (а), (б) или (в).
2. Антитело, связывающееся с СИ38 человека, включающее ¥Η СИВ3 с последовательностью δΞΟ ΙΟ N0:10.
3. Антитело по п.2, дополнительно включающее ¥^ СОВ3 с последовательностью δΞΟ ΙΌ N0:5.
4. Антитело по п.2, дополнительно включающее ¥^ СОВ1 с последовательностью δΞΟ ΙΌ N0:3, ¥^ СОВ2 с последовательностью δΞΟ ΙΟ N0:4 и ¥^ СОВ3 с последовательностью δΞΟ ГО N0:5, а также ¥Η СОВ1 с последовательностью δΞΟ ГО N0:8 и ¥Η СОВ2 с последовательностью δΞΟ ГО N0:9.
5. Антитело, связывающееся с СО38 человека, включающее ¥^ район с последовательностью δΞΟ ГО N0:2.
6. Антитело, связывающееся с СО38 человека, включающее ¥^ район, обладающий по меньшей мере приблизительно 90%-ной, например приблизительно 95%-ной идентичностью с последовательностью δΙΗ ГО N0:2.
7. Антитело, связывающееся с СО38 человека, включающее ¥Η район с последовательностью δΞΟ ГО N0:7.
8. Антитело, связывающееся с СО38 человека, включающее участок ¥Η С^В1-¥Η СОВ3 в δΞΟ ГО N0:7.
9. Антитело, связывающееся с СО38 человека, включающее ¥Η район или его участок, обладающие по меньшей мере приблизительно 90%-ной, например приблизительно 95%-ной идентичностью с аминокислотной последовательностью δΞΟ ГО N0:7 или с участком ¥Η С^В1-¥Η СОВ3 в δΞΟ ГО N0:7.
10. Антитело, связывающееся с СО38 человека, включающее ¥Η район, имеющий 1-5, например 13, аминокислотных замен, делеций или добавлений по сравнению с последовательностью δΞΟ ГО N0:7 или с участком ¥Η С^В1-¥Η СОВ3 в δΞΟ ГО N0:7.
11. Антитело, связывающееся с СО38 человека, включающее ¥^ район, как определено в п.5, и ¥Η район, как определено в п.7.
12. Антитело, связывающееся с СО38 человека, включающее ¥Η СОВ3 с последовательностью δΞΟ ГО N0:20.
13. Антитело по п.12, дополнительно включающее VI, СОВ3 с последовательностью δΞΟ ГО N0:15.
14. Антитело по п.12, дополнительно включающее VI, СОВ1 с последовательностью δΞΟ ГО N0:13, VI. СОВ2 с последовательностью δΞΟ ГО N0:14, V!. СОВ3 с последовательностью δΞΟ ГО N0:15, ¥Η СОВ1 с последовательностью δΞΟ ГО N0:18 и ¥Η СОВ2 с последовательностью δΞΟ ГО N0:19.
15. Антитело, связывающееся с СО38 человека, включающее VI, район с последовательностью δΞΟ ГО N0:12.
16. Антитело, связывающееся с СО38 человека, включающее VI, район, обладающий по меньшей мере приблизительно 90%-ной, например приблизительно 95%-ной идентичностью с последовательностью δΙΗ ГО N0:12.
- 131 015584
17. Антитело, связывающееся с СБ38 человека, включающее νΗ район с последовательностью 8ЕЦ ΙΌ N0:17.
18. Антитело, связывающееся с СБ38 человека, включающее участок νΗ С0Е1-Уц СБЕ3 в 8ЕЦ ΙΌ N0:17.
19. Антитело, связывающееся с СБ38 человека, включающее νΗ район или его участок, обладающие по меньшей мере приблизительно 90%-ной, например приблизительно 95%-ной идентичностью с последовательностью 8ЕЦ ΙΌ N0:17 или с участком νΗ СБГО-Ун СБЕ3 в 8ЕЦ ΙΌ N0:17.
20. Антитело, связывающееся с СБ38 человека, включающее νΗ район, имеющий 1-5, например 13, аминокислотных замен, делеций или добавлений по сравнению с последовательностью 8ЕЦ ΙΌ N0:17 или с участком νΗ СБЕ1-У|, СБЕ3 в 8ЕЦ ΙΌ N0:17.
21. Антитело, связывающееся с СБ38 человека, включающее Уь район, как определено в п.15, и νΗ район, как определено в п.17.
22. Антитело, связывающееся с СБ38 человека, включающее νΗ СБЕ3 с последовательностью 8ЕЦ ΙΌ N0:30.
23. Антитело по п.22, дополнительно включающее У|, СБР3 с последовательностью 8ЕЦ ΙΌ N0:25.
24. Антитело по п.22, дополнительно включающее Уь СБР1 с последовательностью 8ЕЦ ΙΌ N0:23, Уь СБЕ2 с последовательностью 8ЕЦ ΙΌ N0:24, У|. СБЕ3 с последовательностью 8ЕЦ ΙΌ N0:25, νΗ СБР1 с последовательностью 8ЕЦ ΙΌ N0:28 и νΗ СБЕ2 с последовательностью 8ЕЦ ΙΌ N0:29.
25. Антитело, связывающееся с СБ38 человека, включающее Уь район с последовательностью 8ЕЦ ΙΌ N0:22.
26. Антитело, связывающееся с СБ38 человека, включающее Уь район, обладающий по меньшей мере приблизительно 90%-ной, например приблизительно 95%-ной идентичностью с последовательностью 8ЕЦ ΙΌ N0:22.
27. Антитело, связывающееся с СБ38 человека, включающее νΗ район с последовательностью 8ЕЦ ΙΌ N0:27.
28. Антитело, связывающееся с СБ38 человека, включающее участок νΗ ί.ΌΕ1-νΗ СБЕ3 в 8ЕЦ ΙΌ N0:27.
29. Антитело, связывающееся с СБ38 человека, включающее νΗ район или его участок, обладающие по меньшей мере приблизительно 90%-ной, например приблизительно 95%-ной идентичностью с последовательностью 8ЕЦ ΙΌ N0:27 или с участком νΗ ΕΌΕ1-νΗ СБЕ3 в 8ЕЦ ΙΌ N0:27.
30. Антитело, связывающееся с СБ38 человека, включающее νΗ район, имеющий 1-5, например 13, аминокислотных замен, делеций или добавлений по сравнению с последовательностью 8ЕЦ ΙΌ N0:27 или с участком νΗ ΕΌΕ1-νΗ СБЕ3 в 8ЕЦ ΙΌ N0:27.
31. Антитело, связывающееся с СБ38 человека, включающее Уь район, как определено в п.25, и νΗ район, как определено в п.27.
32. Антитело по любому из пп.1-31, которое связывается с СБ38 человека (8ЕЦ ΙΌ N0:31) и которое не связывается с мутантным СБ38 человека, в котором остаток серина в положении 274 замещен остатком фенилаланина (8ЕЦ ΙΌ N0:34), в той же степени, в какой оно связывается с СБ38 человека (8ЕС) ΙΌ N0:31).
33. Антитело по п.32, ЕС50 которого по отношению к мутантному СБ38 человека, в котором остаток серина в положении 274 замещен остатком фенилаланина (8ЕЦ ΙΌ N0:34), составляет менее 50%, например менее 10, менее 5 или менее 1% величины ЕС50 для СБ38 человека (8ЕЦ ΙΌ N0:31).
34. Антитело по любому из пп.1-31, которое связывается с СБ38 человека (8ЕЦ ΙΌ N0:31) и которое не связывается с мутантным СБ38 человека, в котором остаток глутамина в положении 272 замещен остатком аргинина (8ЕЦ ΙΌ N0:33), в той же степени, в какой оно связывается с СБ38 человека (8ЕЦ ΙΌ N0:31).
35. Антитело по п.34, ЕС50 которого по отношению к мутантному СБ38 человека, в котором остаток глутамина в положении 272 замещен остатком аргинина (8ЕЦ ΙΌ N0:33), составляет менее 50%, например менее 10, менее 5 или менее 1% величины ЕС50 для СБ38 человека (8ЕЦ ΙΌ N0:31).
36. Антитело по любому из пп.32-35, которое связывается с мутантным СБ38 человека, в котором остаток треонина в положении 237 замещен остатком аланина (8ЕЦ ΙΌ N0:32), в той же степени, в какой оно связывается с СБ38 человека (8ЕЦ ΙΌ N0:31).
37. Антитело по любому из пп.32-35, ЕС50 которого по отношению к мутантному СБ38 человека, в котором остаток треонина в положении 237 замещен остатком аланина (8ЕЦ ΙΌ N0:32), соответствует 75-125% величины ЕС50 для СБ38 человека (8ЕЦ ΙΌ N0:31).
38. Антитело по любому из пп.33, 35 или 37, где ЕС50 определяют с помощью ЕМЗА, как раскрыто в примере 17 описания.
39. Антитело по любому из пп.1-31, которое специфически связывается с районом ЗКЕМЦЕЗСКМУР. и районом ЕКУфТЕЕААУШСС в СБ38 человека (8ЕО ΙΌ N0:31).
40. Антитело по любому из пп.1-31, связывающееся с СБ38 человека, где антитело обладает одной или более из следующих характеристик связывания:
(а) действует как антагонист СБ38;
- 132 015584 (б) не индуцирует значительную пролиферацию мононуклеарных клеток периферической крови, как определяют способом, раскрытым в примере 18 описания;
(в) не индуцирует высвобождение значительного количества ΙΌ-6 моноцитами человека или мононуклеарными клетками периферической крови, как определяют способом, раскрытым в примере 19 описания;
(г) не индуцирует высвобождение детектируемого количества Т-клетками человека или мононуклеарными клетками периферической крови человека, как определяют способом, раскрытым в примере 20 описания;
(д) интернализуется клетками, экспрессирующими ΕΌ38, например интернализуется клетками ΕΗ0-ΕΌ38 в течение 5-15 мин при 37°С, как определяют способом, раскрытым в примере 12 описания;
(е) индуцирует АОСС, например, со значением ЕС50 ниже 15 нг/мл, например ниже 10 нг/мл в клетках Оаиб1-1ис и со значением ЕС50 ниже 75 нг/мл, например ниже 50, 30 или 10 нг/мл в клетках ММ, как определяют способом, раскрытым в примере 5 описания;
(ж) индуцирует СЭС в присутствии комплемента, например, со значением ЕС50 ниже 5 мкг/мл, например ниже 1 мкг/мл в клетках Оаиб1-1ис или 040+038, как определяют способом, раскрытым в примере 6 описания;
(з) ингибирует синтез цГДФР;
(и) ингибирует синтез цАДФР;
(к) связывается с 0Ό38 человека со сродством (Кс) ниже 10-8 М, например в интервале от 10-8 до 10-11 М, например в интервале от 7х10-9 до 10-10 М, как определяют с помощью поверхностного плазмонного резонанса согласно примеру 20 описания.
41. Антитело по п.40, которое ингибирует синтез цГДФР по меньшей мере на 25%, например на 30%, через 90 мин в концентрации 3 мкг/мл, как определяют с помощью спектрофотометрического способа согласно примеру 24 описания.
42. Антитело по п.40, которое ингибирует синтез цАДФР по меньшей мере на 25%, например на 30%, через 90 мин в концентрации 3 мкг/мл, как определяют с помощью ВЭЖХ.
43. Антитело по любому из пп.32-42, которое является моноклональным антителом человека.
44. Антитело по любому из пп.1-31 или 43, характеризующееся тем, что оно является полноразмерным антителом ЦС1, ЦС2, ЦС3, ЦС4, Ι§Ό, ЦА, ЦЕ или ЦМ, например антителом ЦС1, предпочтительно антителом ЦС1,к или антителом ЦМ, предпочтительно антителом ЦМ,к.
45. Антитело по любому из пп.1-44, которое подвергается гликозилированию в эукариотической клетке.
46. Антитело по любому из пп.1-31 или 43, 44, которое является одноцепочечным антителом.
47. Антитело по любому из пп.1-46, дополнительно включающее хелатирующий линкер для присоединения радиоизотопа.
48. Антитело по любому из пп.1-47, которое находится, по существу, в изолированной форме.
49. Изолированная нуклеиновая кислота, кодирующая антитело по любому из пп.1-48.
50. Экспрессирующий вектор, включающий последовательность нуклеиновой кислоты по п.49.
51. Экспрессирующий вектор, кодирующий антитело по п.1, включающий:
(а) нуклеотидную последовательность Уъ 8ЕЦ ΙΌ N0:1, или (б) нуклеотидную последовательность νΗ 8ЕЦ ΙΌ N0:6, или (в) нуклеотидную последовательность Уъ 8ЕЦ ΙΌ N0:1 и нуклеотидную последовательность νΗ 8ЕЦ ΙΌ N0:6, или (г) нуклеотидную последовательность Уъ 8ЕЦ ΙΌ N0:11, или (д) нуклеотидную последовательность νΗ 8ЕЦ ΙΌ N0:16, или (е) нуклеотидную последовательность Уъ 8ЕЦ ΙΌ N0:11 и нуклеотидную последовательность νΗ 81 Ε) ΙΌ N0:16, или (ж) нуклеотидную последовательность Уъ 8ЕЦ ΙΌ N0:21, или (з) нуклеотидную последовательность νΗ 8ЕЦ ΙΌ N0:26, или (и) нуклеотидную последовательность Уъ 8ЕЦ ΙΌ N0:21 и нуклеотидную последовательность νΗ 81 Ε) ΙΌ N0:26.
52. Экспрессирующий вектор по п.50 или 51, дополнительно включающий нуклеотидную последовательность, кодирующую константный район легкой цепи, тяжелой цепи или как легкой, так и тяжелой цепей антитела человека.
53. Экспрессирующий вектор по п.52, в котором нуклеотидная последовательность, кодирующая константный район легкой цепи, тяжелой цепи или как легкой, так и тяжелой цепей антитела человека, кодирует антитело ЦС1.
54. Трансфектома, которая продуцирует моноклональное анти-СО38 антитело человека по п.1.
55. Трансфектома, которая продуцирует моноклональное анти-СО38 антитело человека по п.1, имеющее вариабельные участки тяжелой и легкой цепи антитела человека, выбранные из группы, включающей:
- 133 015584 (а) последовательность вариабельной области легкой цепи 8Еф ΙΌ N0:2 и последовательность вариабельной области тяжелой цепи 8Еф ΙΌ N0:7, (б) последовательность вариабельной области легкой цепи 8Еф ΙΌ N0:12 и последовательность вариабельной области тяжелой цепи 8Еф ΙΌ N0:17, (в) последовательность вариабельной области легкой цепи 8Еф ΙΌ N0:22 и последовательность вариабельной области тяжелой цепи 8Еф ΙΌ N0:27 и (г) последовательности вариабельных областей легкой и тяжелой цепей, которые содержат консервативные модификации, согласно (а), (б) или (в).
56. Эукариотическая или прокариотическая клетка-хозяин, которая продуцирует антитело по любому из пп.1-48.
57. Эукариотическая или прокариотическая клетка-хозяин, содержащая экспрессирующий вектор по любому из пп.50-53.
58. Трансгенное животное, отличное от человека, включающее нуклеиновую кислоту по п.49, которое продуцирует детектируемое количество антитела по любому из пп.1-48.
59. Трансгенное растение, включающее нуклеиновую кислоту по п.49, которое продуцирует детектируемое количество антитела по любому из пп.1-48.
60. Иммуноконъюгат, включающий антитело по любому из пп.1-48, связанное с цитотоксическим агентом, радиоизотопом или лекарственным средством.
61. Иммуноконъюгат, включающий антитело по любому из пп.1-48, где антитело является мономерным антителом ^М, связанным с цитотоксическим агентом, радиоизотопом или лекарственным средством.
62. Биспецифичная или мультиспецифичная молекула, включающая антитело по любому из пп.1-48 и одновременно связывающая эффекторную клетку человека.
63. Биспецифичная или мультиспецифичная молекула, включающая антитело по любому из пп.1-48 и одновременно связывающая СБ3, СБ4, СБ138, ΙΕ-15Β, мембраносвязанный или связанный с рецептором Т№-а, человеческий Рс-рецептор или мембраносвязанный или связанный с рецептором ΙΕ-15.
64. Фармацевтическая композиция, включающая антитело по любому из пп.1-48 или иммуноконъюгат по п.60 или 61 и фармацевтически приемлемый носитель.
65. Фармацевтическая композиция по п.64, включающая один или более дополнительных терапевтических агентов.
66. Способ ингибирования роста и/или пролиферации клеток, экспрессирующих СБ38, включающий введение антитела по любому из пп.1-48, иммуноконъюгата по п.60 или 61, фармацевтической композиции по п.64 или 65 или экспрессирующего вектора по любому из пп.50-53, так что рост и/или пролиферации клеток ингибируются.
67. Способ лечения заболевания или нарушения, вовлекающего экспрессирующие СБ38 клетки, у субъекта, где способ включает введение антитела по любому из пп.1-48, иммуноконъюгата по п.60 или 61, фармацевтической композиции по п.64 или 65 или экспрессирующего вектора по любому из пп.50-53 субъекту, в этом нуждающемуся.
68. Способ профилактики заболевания или нарушения, вовлекающего экспрессирующие СБ38 клетки, у субъекта, где способ включает введение антитела по любому из пп.1-48, иммуноконъюгата по п.60 или 61, фармацевтической композиции по п.64 или 65 или экспрессирующего вектора по любому из пп.50-53 субъекту, в этом нуждающемуся.
69. Способ по п.67 или 68, где заболевание или нарушение является ревматоидным артритом.
70. Способ по п.67 или 68, где заболевание или нарушение является множественной миеломой.
71. Способ по любому из пп.66-70, где способ включает введение одного или более дополнительных терапевтических агентов субъекту.
72. Способ по п.71, где один или более дополнительных терапевтических агентов выбирают из химиотерапевтического агента, противовоспалительного агента или иммуносупрессивного агента и/или иммуномодуляторного агента.
73. Способ по п.71, где один или более дополнительных терапевтических агентов выбирают из группы, состоящей из цисплатина, гефитиниба, цетуксимаба, ритуксимаба, бевацизумаба, эрлотиниба, бортезомиба, талидомида, памидроната, золедроновой кислоты, клодроната, ризендроната, ибадроната, этидроната, алендроната, тилудроната, триоксида мышьяка, леналидомида, филграстима, пегфилграстима, сарграмостима, субероиланилида гидроксамовой кислоты и 8СЮ-469.
74. Способ ш νίΙΐΌ для детектирования присутствия СБ38-антигена или клеток, экспрессирующих СБ38, в образце, включающий:
(а) контактирование образца с антителом по любому из пп.1-48 в условиях, позволяющих образование комплекса между антителом и СБ38, и (б) детектирование образования комплекса.
75. Набор для детектирования присутствия СБ38-антигена или клеток, экспрессирующих СБ38, в образце, включающий антитело по любому из пп.1-48.
76. Способ 1п у1уо для детектирования присутствия СБ38-антигена или клеток, экспрессирующих
- 134 015584
СЭ38, у субъекта, включающий:
(а) введение антитела по любому из пп.1-48 в условиях, позволяющих образование комплекса между антителом и СЭ38, (б) детектирование образовавшегося комплекса.
77. Антиидиотипическое антитело, связывающееся с антителом по любому из пп.1-31, 43-44 или 46.
78. Применение антиидиотипического антитела по п.77 для детектирования уровня антитела по любому из пп. 1-31, 43-44 или 46 в образце.
79. Применение антиидиотипического антитела по п.77 для детектирования уровня моноклонального антитела человека против СЭ38 в образце.
EA200702053A 2005-03-23 2006-03-23 Антитело к cd38 человека и его применение EA015584B1 (ru)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DKPA200500429 2005-03-23
US66757905P 2005-04-01 2005-04-01
US69616305P 2005-07-01 2005-07-01
US72856105P 2005-10-20 2005-10-20
PCT/DK2006/000166 WO2006099875A1 (en) 2005-03-23 2006-03-23 Antibodies against cd38 for treatment of multiple myeloma

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA200702053A1 EA200702053A1 (ru) 2008-02-28
EA015584B1 true EA015584B1 (ru) 2011-10-31

Family

ID=36617365

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201100694A EA037929B1 (ru) 2005-03-23 2006-03-23 Антитела к cd38 человека и их применение
EA200702053A EA015584B1 (ru) 2005-03-23 2006-03-23 Антитело к cd38 человека и его применение

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201100694A EA037929B1 (ru) 2005-03-23 2006-03-23 Антитела к cd38 человека и их применение

Country Status (26)

Country Link
US (4) US7829673B2 (ru)
EP (6) EP1866338B1 (ru)
JP (11) JP5225069B2 (ru)
KR (1) KR101433381B1 (ru)
CN (3) CN112480257A (ru)
AU (1) AU2006226733C9 (ru)
CA (1) CA2602375C (ru)
CY (3) CY1118369T1 (ru)
DK (1) DK2567976T3 (ru)
EA (2) EA037929B1 (ru)
ES (1) ES2716874T3 (ru)
HK (1) HK1107826A1 (ru)
HR (2) HRP20161766T1 (ru)
IL (6) IL296666A (ru)
LT (1) LTC2567976I2 (ru)
LU (1) LUC00053I9 (ru)
ME (1) ME03528B (ru)
MX (1) MX2007011064A (ru)
NL (1) NL300915I2 (ru)
NZ (2) NZ586780A (ru)
PL (1) PL2567976T3 (ru)
RS (1) RS59399B1 (ru)
SG (1) SG10201912554TA (ru)
SI (1) SI2567976T1 (ru)
WO (1) WO2006099875A1 (ru)
ZA (1) ZA200709003B (ru)

Cited By (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10556961B2 (en) 2014-02-28 2020-02-11 Janssen Biotech, Inc. Anti-CD38 antibodies for treatment of acute lymphoblastic leukemia
US10604580B2 (en) 2014-09-09 2020-03-31 Janssen Biotech, Inc. Combination therapies with anti-CD38 antibodies
US10668149B2 (en) 2015-06-22 2020-06-02 Janssen Biotech, Inc. Combination therapies for heme malignancies with anti-CD38 antibodies and survivin inhibitors
US10766965B2 (en) 2015-05-20 2020-09-08 Janssen Biotech, Inc. Anti-CD38 antibodies for treatment of light chain amyloidosis and other CD38-positive hematological malignancies
US10781261B2 (en) 2015-11-03 2020-09-22 Janssen Biotech, Inc. Subcutaneous formulations of anti-CD38 antibodies and their uses
US10793630B2 (en) 2014-12-04 2020-10-06 Janssen Biotech, Inc. Anti-CD38 antibodies for treatment of acute myeloid leukemia
US10800851B2 (en) 2014-02-28 2020-10-13 Janssen Biotech, Inc. Combination therapies with anti-CD38 antibodies
US11021543B2 (en) 2015-06-24 2021-06-01 Janssen Biotech, Inc. Immune modulation and treatment of solid tumors with antibodies that specifically bind CD38
US11566079B2 (en) 2015-11-03 2023-01-31 Janssen Biotech, Inc. Subcutaneous formulations of anti-CD38 antibodies and their uses
US11618787B2 (en) 2017-10-31 2023-04-04 Janssen Biotech, Inc. Methods of treating high risk multiple myeloma

Families Citing this family (211)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2371861B1 (en) 2002-01-25 2017-08-09 Novo Nordisk A/S Monoclonal antibodies against extracellular loops of C5aR
CA2555185C (en) * 2004-02-06 2020-03-24 Morphosys Ag Anti-cd38 human antibodies and uses therefor
US9200061B2 (en) 2004-02-06 2015-12-01 Morpho Sys AG Generation and profiling of fully human HuCAL gold®-derived therapeutic antibodies specific for human CD3i
EA037929B1 (ru) * 2005-03-23 2021-06-08 Генмаб А/С Антитела к cd38 человека и их применение
CN106434683B (zh) 2005-10-12 2020-03-13 莫佛塞斯公司 特异性针对人CD38的完全人HuCAL GOLD-衍生治疗抗体的生成和鉴定
JP2009518025A (ja) * 2005-12-06 2009-05-07 ドマンティス リミテッド 細胞表面標的に対して結合特異性を有する二重特異性リガンドおよびその使用方法
WO2008003319A1 (en) 2006-07-04 2008-01-10 Genmab A/S Cd20 binding molecules for the treatment of copd
US20090029904A1 (en) * 2006-07-21 2009-01-29 Sean Oldham Compositions and methods for treatment of insulin-resistance diseases
US20080317745A1 (en) * 2006-09-15 2008-12-25 Boruchov Adam M Methods of diagnosing, treating, or preventing plasma cell disorders
CA2664740C (en) 2006-09-26 2021-11-16 Genmab A/S Combination treatment of cd38-expressing tumors
WO2008040348A2 (en) * 2006-10-03 2008-04-10 Genmab A/S High througput methods for characterization of antibodies
EP1914242A1 (en) 2006-10-19 2008-04-23 Sanofi-Aventis Novel anti-CD38 antibodies for the treatment of cancer
AU2013209322A1 (en) * 2006-10-19 2013-08-15 Sanofi-Aventis Novel anti-cd38 antibodies for the treatment of cancer
US8143014B2 (en) * 2007-10-02 2012-03-27 Mayo Foundation For Medical Education And Research CD38 and obesity
WO2009080829A1 (en) 2007-12-26 2009-07-02 Biotest Ag Agents targeting cd138 and uses thereof
CN101945892B (zh) 2007-12-26 2017-11-24 生物测试股份公司 用于改进对表达cd138的肿瘤细胞的靶向的方法和试剂
SI2242772T1 (sl) * 2007-12-26 2015-03-31 Biotest Ag Imunokonjugati, ki ciljajo v CD138, in njihova uporaba
AR069979A1 (es) 2007-12-26 2010-03-03 Biotest Ag Metodo para disminuir los efectos secundarios citotoxicos y mejorar la eficacia de los inmunoconjugados
KR20100117120A (ko) 2008-02-20 2010-11-02 지투 인플레메이션 피티와이 엘티디 인간화된 항-Ｃ5ａＲ 항체
GB0808350D0 (en) * 2008-05-09 2008-06-18 Airbus Uk Ltd Self-cleaning surfaces
WO2009142460A2 (en) * 2008-05-23 2009-11-26 Samsung Electronics Co., Ltd. Antibody-peptide fused synergibody
US8188235B2 (en) * 2008-06-18 2012-05-29 Pfizer Inc. Antibodies to IL-6 and their uses
EP2191843A1 (en) * 2008-11-28 2010-06-02 Sanofi-Aventis Antitumor combinations containing antibodies recognizing specifically CD38 and cyclophosphamide
EP2191840A1 (en) * 2008-11-28 2010-06-02 Sanofi-Aventis Antitumor combinations containing antibodies recognizing specifically CD38 and melphalan
EP2191842A1 (en) * 2008-11-28 2010-06-02 Sanofi-Aventis Antitumor combinations containing antibodies recognizing specifically CD38 and cytarabine
EP2191841A1 (en) * 2008-11-28 2010-06-02 Sanofi-Aventis Antitumor combinations containing antibodies recognizing specifically CD38 and vincristine
AU2013201618B2 (en) * 2009-05-06 2016-06-02 Biotest Ag Uses of immunoconjugates targeting CD138
JP2012526079A (ja) * 2009-05-06 2012-10-25 バイオテスト・アクチエンゲゼルシヤフト Ｃｄ１３８を標的とする免疫複合体の使用
WO2011047228A1 (en) * 2009-10-16 2011-04-21 Cornell University Measuring subcellular concentrations in vivo
US8585588B2 (en) 2009-11-18 2013-11-19 Nohands, Llc Method and system for preventing virus-related obesity and obesity related diseases
RS59769B1 (sr) 2010-06-09 2020-02-28 Genmab As Antitela protiv humanog cd38
MX350540B (es) 2010-09-27 2017-09-08 Morphosys Ag Anticuerpo anti-cd38 y lenalidomida o bortezomib para el tratamiento del mieloma múltiple y nhl.
UA112170C2 (uk) 2010-12-10 2016-08-10 Санофі Протипухлинна комбінація, що містить антитіло, яке специфічно розпізнає cd38, і бортезоміб
JOP20210044A1 (ar) * 2010-12-30 2017-06-16 Takeda Pharmaceuticals Co الأجسام المضادة لـ cd38
PL3424953T3 (pl) * 2011-06-06 2021-01-25 Novo Nordisk A/S Lecznicze przeciwciała
EP2729496B8 (en) 2011-07-06 2017-10-18 Genmab A/S Modulation of complement-dependent cytotoxicity through modifications of the c-terminus of antibody heavy chains
UA117901C2 (uk) 2011-07-06 2018-10-25 Ґенмаб Б.В. Спосіб посилення ефекторної функції вихідного поліпептиду, його варіанти та їх застосування
CN104114579B (zh) 2011-10-27 2020-01-24 健玛保 异二聚体蛋白的生成
EA201700111A1 (ru) 2011-10-28 2018-02-28 Тева Фармасьютикал Австралия Пти Лтд Полипептидные конструкции и их применение
WO2013075740A1 (en) * 2011-11-23 2013-05-30 Sanofi Antibody purification method
SG11201402887SA (en) 2011-12-08 2014-07-30 Biotest Ag Uses of immunoconjugates targeting cd138
US10704021B2 (en) 2012-03-15 2020-07-07 Flodesign Sonics, Inc. Acoustic perfusion devices
WO2013188864A2 (en) * 2012-06-15 2013-12-19 Sinomab Bioscience Limited Anti-cd22 anti-idiotypic antibodies and uses thereof
SG11201408646VA (en) 2012-07-06 2015-01-29 Genmab Bv Dimeric protein with triple mutations
EP3632462A1 (en) 2012-07-06 2020-04-08 Genmab B.V. Dimeric protein with triple mutations
EP2900232B1 (en) 2012-09-25 2017-11-15 MorphoSys AG Combinations and uses thereof
EP2914278B1 (en) * 2012-11-05 2021-06-02 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Xbp1, cd138, and cs1 peptides, pharmaceutical compositions that include the peptides, and methods of using such peptides and compositions
WO2014068114A1 (en) 2012-11-05 2014-05-08 Morphosys Ag Radiolabelled antibody and uses thereof
UA118255C2 (uk) * 2012-12-07 2018-12-26 Санофі Композиція, яка містить антитіло до cd38 і леналідомід
US10342869B2 (en) 2012-12-07 2019-07-09 The Regents Of The University Of California Compositions comprising anti-CD38 antibodies and lenalidomide
EA201500741A1 (ru) * 2013-01-10 2016-01-29 Генмаб Б.В. ВАРИАНТЫ Fc-ОБЛАСТИ IGG1 ЧЕЛОВЕКА И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ
CN103103197A (zh) * 2013-01-30 2013-05-15 百奇生物科技（苏州）有限公司 抗cd138单克隆抗体可变区序列及其制备方法和应用
CA2902432A1 (en) 2013-03-12 2014-10-09 Molecular Templates, Inc. Cytotoxic proteins comprising cell-targeting binding regions and shiga toxin a subunit regions for selective killing of specific cell types
FR3003171B1 (fr) * 2013-03-15 2015-04-10 Lab Francais Du Fractionnement Nouveaux medicaments comprenant une composition d'anticorps enrichie en isoforme de charge majoritaire
US11117975B2 (en) 2013-04-29 2021-09-14 Teva Pharmaceuticals Australia Pty Ltd Anti-CD38 antibodies and fusions to attenuated interferon alpha-2B
CA2909952C (en) * 2013-04-29 2021-10-12 Teva Pharmaceuticals Australia Pty Ltd. Anti-cd38 antibodies and fusions to attenuated interferon alpha-2b
DK2994485T3 (en) 2013-05-06 2018-04-23 Sanofi Sa CONTINUOUS MULTIPLE STEP PROCEDURE FOR PURIFICATION OF ANTIBODIES
JP2016534090A (ja) * 2013-07-15 2016-11-04 ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ レランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティー Ｃｄ３８アゴニストの医学的使用
EP3805266A1 (en) * 2013-10-31 2021-04-14 Sanofi Specific anti-cd38 antibodies for treating human cancers
BR112016009919A2 (pt) 2013-11-04 2017-12-05 Glenmark Pharmaceuticals Sa imunoglobulina hetero-dimérica ou fragmento da mesma e método para produzir in vitro uma imunoglobulina hetero-dimérica ou fragmento da mesma
CA2935960C (en) 2014-01-08 2023-01-10 Bart Lipkens Acoustophoresis device with dual acoustophoretic chamber
EP3868776A1 (en) 2014-01-27 2021-08-25 Molecular Templates, Inc. Mhc class i epitope delivering polypeptides
EP3104882B1 (en) * 2014-02-14 2019-06-05 Centrose, Llc Extracellular targeted drug conjugates
MX2016011821A (es) * 2014-03-11 2017-04-27 Molecular Templates Inc Proteinas que comprenden regiones efectoras de subunidad a de toxina shiga proximas a amino terminal y regiones de union de tipo inmunoglobulina de direccionamiento selectivo celular.
US11142584B2 (en) 2014-03-11 2021-10-12 Molecular Templates, Inc. CD20-binding proteins comprising Shiga toxin A subunit effector regions for inducing cellular internalization and methods using same
JP6935195B2 (ja) * 2014-03-11 2021-09-15 モレキュラー テンプレーツ, インク.Molecular Templates, Inc. 結合領域、志賀毒素ａサブユニットのエフェクター領域、及びカルボキシ末端小胞体局在化シグナルモチーフを含むタンパク質
UA119352C2 (uk) * 2014-05-01 2019-06-10 Тева Фармасьютикалз Острейліа Пті Лтд Комбінація леналідоміду або помалідоміду і конструкції анти-cd38 антитіло-атенуйований інтерферон альфа-2b та спосіб лікування суб'єкта, який має cd38-експресуючу пухлину
IL286804B (en) 2014-06-11 2022-08-01 Molecular Templates Inc Polypeptides of cleavage-resistant protease, activator subunit shiga toxin, and cell-targeting molecules containing them
WO2015195556A1 (en) 2014-06-16 2015-12-23 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health & Human Services Blocking cd38 using anti-cd38 f(ab')2 to protect nk cells
WO2015195555A1 (en) * 2014-06-16 2015-12-23 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health & Human Services Blocking cd38 using anti-cd38 antibody conjugated to protein g to protect nk cells
PL3157561T3 (pl) * 2014-06-17 2020-06-29 Medimmune Limited Ulepszone przeciwciała alfa-v beta-8
CN107075483A (zh) 2014-07-15 2017-08-18 朱诺治疗学股份有限公司 用于过继细胞治疗的工程改造的细胞
WO2016027668A1 (ja) * 2014-08-22 2016-02-25 株式会社村田製作所 触覚提示装置
WO2016065409A1 (en) 2014-10-29 2016-05-06 Teva Pharmaceuticals Australia Pty Ltd INTERFERON α2B VARIANTS
MA40894A (fr) * 2014-11-04 2017-09-12 Glenmark Pharmaceuticals Sa Immunoglobulines hétéro-dimères reciblant des lymphocytes t cd3/cd38 et leurs procédés de production
US11773166B2 (en) 2014-11-04 2023-10-03 Ichnos Sciences SA CD3/CD38 T cell retargeting hetero-dimeric immunoglobulins and methods of their production
US10392425B2 (en) 2015-02-05 2019-08-27 Molecular Templates, Inc. Multivalent CD20-binding molecules comprising Shiga toxin A subunit effector regions and enriched compositions thereof
MA41555A (fr) * 2015-02-17 2017-12-26 Millennium Pharm Inc Polythérapie pour le traitement du cancer
EP4180058A1 (en) * 2015-04-08 2023-05-17 Sorrento Therapeutics, Inc. Antibody therapeutics that bind cd38
US11708572B2 (en) 2015-04-29 2023-07-25 Flodesign Sonics, Inc. Acoustic cell separation techniques and processes
MX2017014396A (es) * 2015-05-13 2018-03-23 Morphosys Ag Tratamiento de mieloma multiple.
UY36687A (es) * 2015-05-29 2016-11-30 Bristol Myers Squibb Company Una Corporación Del Estado De Delaware Anticuerpos contra ox40 y sus usos
WO2016196344A1 (en) * 2015-05-30 2016-12-08 Molecular Templates, Inc. De-immunized, shiga toxin a subunit scaffolds and cell-targeting molecules comprising the same
PE20181090A1 (es) * 2015-06-24 2018-07-09 Janssen Biotech Inc Modulacion y tratamiento inmunes de tumores solidos con anticuerpos que se unen especificamente a cd38
MA42895A (fr) 2015-07-15 2018-05-23 Juno Therapeutics Inc Cellules modifiées pour thérapie cellulaire adoptive
WO2017025323A1 (en) 2015-08-11 2017-02-16 Cellectis Cells for immunotherapy engineered for targeting cd38 antigen and for cd38 gene inactivation
AR106188A1 (es) 2015-10-01 2017-12-20 Hoffmann La Roche Anticuerpos anti-cd19 humano humanizados y métodos de utilización
IL305540A (en) * 2016-03-04 2023-10-01 Morphosys Ag Clinical evaluation of protein-M response in multiple myeloma
SG10201601719RA (en) 2016-03-04 2017-10-30 Agency Science Tech & Res Anti-LAG-3 Antibodies
US11505616B2 (en) * 2016-03-25 2022-11-22 Biomunex Pharmaceuticals Binding molecules to CD38 and PD-L1
US11214789B2 (en) 2016-05-03 2022-01-04 Flodesign Sonics, Inc. Concentration and washing of particles with acoustics
SG10201603721TA (en) 2016-05-10 2017-12-28 Agency Science Tech & Res Anti-CTLA-4 Antibodies
EP3474895A1 (en) * 2016-06-28 2019-05-01 UMC Utrecht Holding B.V. TREATMENT OF IgE-MEDIATED DISEASES WITH ANTIBODIES THAT SPECIFICALLY BIND CD38
CA3030834A1 (en) * 2016-07-15 2018-01-18 Takeda Pharmaceutical Company Limited Methods and materials for assessing response to plasmablast- and plasma cell-depleting therapies
JP2019521171A (ja) 2016-07-20 2019-07-25 ヒブリジェニクス・エスアー 抗ｃｄ３８薬剤とのイネカルシトールの組み合わせ、及び癌を治療するためのその使用
MA46700A (fr) 2016-11-01 2021-05-19 Genmab Bv Variants polypeptidiques et ses utilisations
US11124577B2 (en) 2016-11-02 2021-09-21 Engmab Sàrl Bispecific antibody against BCMA and CD3 and an immunological drug for combined use in treating multiple myeloma
EP3330712A1 (en) 2016-12-01 2018-06-06 imusyn GmbH & Co. KG Analysis of anti-erythrocyte antibody in the presence of antibody directed against a surface-bound erythrocyte antigen
CN110494443A (zh) 2016-12-07 2019-11-22 分子模板公司 用于位点特异性缀合的志贺毒素a亚基效应子多肽、志贺毒素效应子支架和细胞靶向分子
ES2746856T3 (es) 2016-12-09 2020-03-09 Onk Therapeutics Ltd Células asesinas naturales manipuladas y usos de las mismas
EP3573648B1 (en) 2017-01-25 2023-11-22 Molecular Templates, Inc. Cell-targeting molecules comprising de-immunized, shiga toxin a subunit effectors and cd8+ t-cell epitopes
US20190048055A1 (en) 2017-03-31 2019-02-14 Altor Bioscience Corporation Alt-803 in combination with anti-cd38 antibody for cancer therapies
CA3066547A1 (en) 2017-06-08 2018-12-13 Black Belt Therapeutics Limited Cd38 modulating antibody
CA3066553A1 (en) * 2017-06-08 2018-12-13 Black Belt Therapeutics Limited Cd38 modulating antibody
WO2018234370A1 (en) 2017-06-20 2018-12-27 Institut Curie DEFECTIVE IMMUNE CELLS AGAINST SUV39H1
EP3668896A1 (en) 2017-08-16 2020-06-24 Black Belt Therapeutics Limited Cd38 modulating antibody
SG11202000484TA (en) 2017-08-16 2020-02-27 Black Belt Therapeutics Ltd Cd38 antibody
WO2019035938A1 (en) 2017-08-16 2019-02-21 Elstar Therapeutics, Inc. MULTISPECIFIC MOLECULES BINDING TO BCMA AND USES THEREOF
SG11202002093TA (en) 2017-09-13 2020-04-29 Teneobio Inc Heavy chain antibodies binding to ectoenzymes
CN111183157A (zh) 2017-10-02 2020-05-19 威特拉公司 Cd138抗体分子及其用途
MX2020004129A (es) * 2017-10-10 2020-08-20 Sanofi Sa Anticuerpos anti-cd38 y metodos de uso.
WO2019089848A1 (en) 2017-11-01 2019-05-09 Juno Therapeutics, Inc. Methods associated with tumor burden for assessing response to a cell therapy
KR20200074997A (ko) 2017-11-01 2020-06-25 주노 쎄러퓨티크스 인코퍼레이티드 B-세포 성숙 항원에 특이적인 항체 및 키메릭 항원 수용체
CA3080509A1 (en) 2017-11-01 2019-05-09 Juno Therapeutics, Inc. Process for producing a t cell composition
WO2019089858A2 (en) 2017-11-01 2019-05-09 Juno Therapeutics, Inc. Methods of assessing or monitoring a response to a cell therapy
CA3084514A1 (en) 2017-11-01 2019-05-09 Juno Therapeutics, Inc. Process for generating therapeutic compositions of engineered cells
EP3703750A1 (en) 2017-11-01 2020-09-09 Juno Therapeutics, Inc. Chimeric antigen receptors specific for b-cell maturation antigen and encoding polynucleotides
CA3080109A1 (en) 2017-11-03 2019-05-09 Sorrento Therapeutics, Inc. Cd38-directed chimeric antigen receptor constructs
CN107936110B (zh) * 2017-11-07 2021-06-22 潍坊医学院 突变基因Nasp在狼疮性模型小鼠自身免疫病发病中的作用及机制
US11944644B2 (en) 2017-12-05 2024-04-02 The Medical Research Infrastructure And Health Services Fund Of The Tel Aviv Medical Center T-cells comprising anti-CD38 and anti-CD138 chimeric antigen receptors and uses thereof
JP2021505168A (ja) 2017-12-08 2021-02-18 ジュノー セラピューティクス インコーポレイテッド 操作されたｔ細胞の組成物を製造するための方法
MA51105A (fr) 2017-12-08 2020-10-14 Juno Therapeutics Inc Formulation de milieux sans sérum pour la culture de cellules et ses procédés d'utilisation
AU2018379094A1 (en) 2017-12-08 2020-06-25 Juno Therapeutics, Inc. Phenotypic markers for cell therapy and related methods
AU2018385759B2 (en) 2017-12-14 2021-10-21 Flodesign Sonics, Inc. Acoustic transducer driver and controller
WO2019149743A1 (en) 2018-01-30 2019-08-08 Cellectis Combination comprising allogeneic immune cells deficient for an antigen present on both t-cells and pathological cells and therapeutic antibody against said antigen
JP6648171B2 (ja) * 2018-02-02 2020-02-14 テバ・ファーマシューティカルズ・オーストラリア・ピーティワイ・リミテッド 抗ｃｄ３８抗体及び弱毒化インターフェロンアルファ−２ｂとの融合物
CN110144008B (zh) * 2018-02-12 2021-03-19 杭州尚健生物技术有限公司 Cd38蛋白抗体及其应用
JP2021517144A (ja) * 2018-03-13 2021-07-15 トリリアム・セラピューティクス・インコーポレイテッドＴｒｉｌｌｉｕｍ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｉｎｃ． Ｃｄ４７遮断療法およびｃｄ３８抗体の組み合わせ
JP2021519295A (ja) * 2018-03-28 2021-08-10 武田薬品工業株式会社 抗ｃｄ３８抗体の皮下投薬
CN108593912A (zh) * 2018-04-09 2018-09-28 北京大学深圳研究生院 一种可溶性cd38浓度的检测方法
AU2019257343A1 (en) 2018-04-17 2020-09-10 Molecular Templates, Inc. HER2-targeting molecules comprising de-immunized, Shiga toxin A Subunit scaffolds
BR112020023187A2 (pt) 2018-05-16 2021-04-20 Janssen Biotech, Inc. métodos para tratamento de cânceres e de aumento da eficácia de agentes terapêuticos de redirecionamento de células t
JP2021526845A (ja) 2018-07-13 2021-10-11 ゲンマブ エー／エス Ｃｄ３８抗体を使用したトロゴサイトーシスを介した治療
SG11202012993SA (en) 2018-07-13 2021-02-25 Genmab As Variants of cd38 antibody and uses thereof
KR20210059715A (ko) 2018-08-09 2021-05-25 주노 쎄러퓨티크스 인코퍼레이티드 통합된 핵산 평가 방법
BR112021004130A2 (pt) * 2018-09-11 2021-05-25 Jiangsu Hengrui Medicine Co., Ltd. anticorpo anti-cd38, fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, e uso farmacêutico
CN109053892B (zh) * 2018-09-19 2021-03-26 苏州思坦维生物技术股份有限公司 特异结合人及猴cd38抗原的单克隆抗体及其制备方法与应用
CN109265551B (zh) * 2018-09-25 2020-09-15 华东师范大学 Cd38抗体、嵌合抗原受体和药物
JP2022512722A (ja) 2018-10-17 2022-02-07 ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド 抗ｃｄ３８抗体の皮下投与を提供する方法
AU2019367218A1 (en) 2018-10-26 2021-06-03 TeneoFour, Inc. Heavy chain antibodies binding to CD38
CN111116743B (zh) * 2018-10-30 2022-01-28 迈威(上海)生物科技股份有限公司 Hsp90抗体及其在抗真菌感染中的应用
EP3873937A2 (en) 2018-11-01 2021-09-08 Juno Therapeutics, Inc. Chimeric antigen receptors specific for g protein-coupled receptor class c group 5 member d (gprc5d)
WO2020092848A2 (en) 2018-11-01 2020-05-07 Juno Therapeutics, Inc. Methods for treatment using chimeric antigen receptors specific for b-cell maturation antigen
KR20210116437A (ko) 2018-11-20 2021-09-27 코넬 유니버시티 방사성핵종의 마크로사이클릭 복합체 및 암의 방사선 요법에서의 이의 용도
AU2019395841A1 (en) 2018-12-14 2021-05-20 Morphosys Ag Antibody formulations
AU2019410073A1 (en) 2018-12-21 2021-06-10 F. Hoffmann-La Roche Ag Tumor-targeted agonistic CD28 antigen binding molecules
GB201900530D0 (en) * 2019-01-15 2019-03-06 Bicyclerd Ltd Bicyclic peptide ligands specific for CD38
US20220213223A1 (en) 2019-02-12 2022-07-07 Prothena Biosciences Limited Treatment of Al Amyloidosis with the Combination of Monoclonal Antibodies Agains Immunoglobulin Light Chains and the CD38 Cell Membrane Molecule on Antibody-Producing And Other Immune Cells
AU2020225202B2 (en) 2019-02-18 2023-10-26 Eli Lilly And Company Therapeutic antibody formulation
US20220098307A1 (en) * 2019-02-22 2022-03-31 Wuhan Yzy Biopharma Co., Ltd. Modified fc fragment, antibody comprising same, and application thereof
CA3130695A1 (en) 2019-02-27 2020-09-03 Genentech, Inc. Dosing for treatment with anti-tigit and anti-cd20 or anti-cd38 antibodies
WO2020178638A1 (en) 2019-03-05 2020-09-10 Prothena Biosciences Limited Methods of treating al amyloidosis
WO2020187718A1 (en) 2019-03-15 2020-09-24 Morphosys Ag Anti-cd38 antibodies and pharmaceutical compositions thereof for the treatment of autoantibody-mediated autoimmune disease
EP3947465A4 (en) * 2019-03-29 2023-01-04 Sorrento Therapeutics, Inc. ANTIBODIES MANIPULATED VARIANTS BINDING TO CD38
WO2020212914A1 (en) * 2019-04-19 2020-10-22 Janssen Biotech, Inc. Combination therapies comprising daratumumab, bortezomib, thalidomide and dexamethasone and their uses
MX2021013219A (es) 2019-05-01 2022-02-17 Juno Therapeutics Inc Celulas que expresan un receptor recombinante de un locus de tgfbr2 modificado, polinucleotidos relacionados y metodos.
AU2020265749A1 (en) 2019-05-01 2022-01-06 Juno Therapeutics, Inc. Cells expressing a chimeric receptor from a modified CD247 locus, related polynucleotides and methods
CN113993543A (zh) 2019-06-10 2022-01-28 武田药品工业株式会社 使用抗cd38抗体的组合疗法
US11655302B2 (en) 2019-06-10 2023-05-23 Sanofi Anti-CD38 antibodies and formulations
AU2020307667A1 (en) 2019-06-27 2022-01-20 Crispr Therapeutics Ag Use of chimeric antigen receptor T cells and NK cell inhibitors for treating cancer
US20220251234A1 (en) 2019-07-16 2022-08-11 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Antibodies having specificity for cd38 and uses thereof
KR20220042161A (ko) 2019-07-23 2022-04-04 엥스띠뛰 퀴리 Suv39h1에 결함이 있는 면역 세포
JP2022553803A (ja) 2019-11-06 2022-12-26 ジェネンテック， インコーポレイテッド 血液がんの処置のための診断方法及び治療方法
US20210188996A1 (en) 2019-12-05 2021-06-24 Sanofi-Aventis U.S. Llc Formulations of anti-cd38 antibodies for subcutaneous administration
CN115023441A (zh) 2019-12-18 2022-09-06 特诺福尔股份有限公司 与cd38结合的重链抗体
AU2020412805A1 (en) * 2019-12-26 2022-07-14 Hendrix College Methods and compositions for inhibition of dihydroorotate dehydrogenase in combination with an anti-CD38 therapeutic agent
EP4087922A4 (en) 2020-01-07 2024-01-10 Univ Texas HUMAN ADENOSINE/METHYLTHIOADENOSINE DEPLETING ENZYME VARIANTS FOR CANCER TREATMENT
JP6853392B2 (ja) * 2020-01-15 2021-03-31 テバ・ファーマシューティカルズ・オーストラリア・ピーティワイ・リミテッド 抗ｃｄ３８抗体及び弱毒化インターフェロンアルファ−２ｂとの融合物
US20230272105A1 (en) 2020-01-16 2023-08-31 Genmab A/S Formulations of cd38 antibodies and uses thereof
BR112022020333A2 (pt) 2020-04-10 2022-11-22 Juno Therapeutics Inc Métodos e usos relacionados à terapia celular projetada com um receptor de antígeno quimérico que alveja o antígeno de maturação de células b
WO2021231657A1 (en) 2020-05-13 2021-11-18 Juno Therapeutics, Inc. Methods of identifying features associated with clinical response and uses thereof
JP2023106636A (ja) * 2020-05-22 2023-08-02 国立研究開発法人医薬基盤・健康・栄養研究所 ヒト抗破傷風毒素抗体
EP4168450A2 (en) 2020-06-17 2023-04-26 Y-Mabs Therapeutics, Inc. Cd38 antibodies for the treatment of human diseases
WO2021259227A1 (zh) * 2020-06-23 2021-12-30 江苏康缘药业股份有限公司 抗cd38抗体及其用途
CN116234558A (zh) 2020-06-26 2023-06-06 朱诺治疗学有限公司 条件性地表达重组受体的工程化t细胞、相关多核苷酸和方法
US20220023344A1 (en) 2020-06-26 2022-01-27 Crispr Therapeutics Ag Allogeneic cell therapy of acute lymphoblastic leukemia using genetically engineered t cells targeting cd19
US20230303974A1 (en) 2020-07-30 2023-09-28 Institut Curie Immune Cells Defective for SOCS1
CN114075283A (zh) * 2020-08-12 2022-02-22 三生国健药业（上海）股份有限公司 结合人cd38的抗体、其制备方法和用途
CN116406291A (zh) 2020-10-05 2023-07-07 基因泰克公司 用抗fcrh5/抗cd3双特异性抗体进行治疗的给药
WO2022097047A1 (en) * 2020-11-04 2022-05-12 Medimmune, Llc Treatment methods using anti-bcma antibody-drug conjugates
US20230398148A1 (en) 2020-11-04 2023-12-14 Juno Therapeutics, Inc. Cells expressing a chimeric receptor from a modified invariant cd3 immunoglobulin superfamily chain locus and related polynucleotides and methods
WO2022112469A1 (en) 2020-11-27 2022-06-02 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods for diagnosis and monitoring of toxic epidermal necrolysis
WO2022137186A1 (en) 2020-12-23 2022-06-30 Crispr Therapeutics Ag Cancer treatment using cd38 inhibitor and/or lenalidomide and t-cells expressing a chimeric antigen receptor
AU2022208200A1 (en) 2021-01-14 2023-07-20 Morphosys Ag Anti-cd38 antibodies and their uses
US20220275090A1 (en) 2021-02-22 2022-09-01 Janssen Biotech, Inc. Combination Therapies with Anti-CD38 Antibodies and PARP or Adenosine Receptor Inhibitors
TW202302642A (zh) 2021-03-01 2023-01-16 德商莫菲西斯公司 用於治療抗體介導移植物排斥用途之抗ｃｄ３８抗體
JP2024509853A (ja) 2021-03-03 2024-03-05 ジュノー セラピューティクス インコーポレイテッド Ｔ細胞療法およびｄｇｋ阻害剤の組合せ
WO2022234009A2 (en) 2021-05-06 2022-11-10 Juno Therapeutics Gmbh Methods for stimulating and transducing t cells
WO2022238386A1 (en) 2021-05-10 2022-11-17 Institut Curie Methods for the treatment of cancer, inflammatory diseases and autoimmune diseases
TW202310870A (zh) 2021-05-12 2023-03-16 瑞士商Ｃｒｉｓｐｒ治療公司 用於治療造血惡性腫瘤之靶向ｃｄ７０的基因工程化免疫細胞
WO2022238963A2 (en) 2021-05-12 2022-11-17 Crispr Therapeutics Ag Genetically engineered immune cells targeting cd70 for use in treating solid tumors
EP4346912A1 (en) 2021-05-25 2024-04-10 Institut Curie Myeloid cells overexpressing bcl2
WO2022271987A1 (en) 2021-06-23 2022-12-29 TeneoFour, Inc. Anti-cd38 antibodies and epitopes of same
TW202321303A (zh) 2021-07-19 2023-06-01 德商莫菲西斯公司 抗pla2r自體抗體媒介膜性腎病變之治療
AU2022320793A1 (en) 2021-07-28 2024-02-01 Genentech, Inc. Il15/il15r alpha heterodimeric fc-fusion proteins for the treatment of blood cancers
TW202321308A (zh) 2021-09-30 2023-06-01 美商建南德克公司 使用抗ｔｉｇｉｔ抗體、抗ｃｄ３８抗體及ｐｄ—１軸結合拮抗劑治療血液癌症的方法
US20230134748A1 (en) 2021-11-03 2023-05-04 Janssen Biotech, Inc. Corticosteriod Reduction in Treatment with Anti-CD38 Antibody
WO2023126458A1 (en) 2021-12-28 2023-07-06 Mnemo Therapeutics Immune cells with inactivated suv39h1 and modified tcr
WO2023147515A1 (en) 2022-01-28 2023-08-03 Juno Therapeutics, Inc. Methods of manufacturing cellular compositions
TW202342520A (zh) 2022-02-18 2023-11-01 美商樂天醫藥生技股份有限公司 抗計畫性死亡配體１（ｐｄ—ｌ１）抗體分子、編碼多核苷酸及使用方法
WO2023178323A1 (en) * 2022-03-18 2023-09-21 Henry Ford Health System Therapeutic inhibition of cd38 to treat hidradenitis suppurativa
WO2023187024A1 (en) 2022-03-31 2023-10-05 Institut Curie Modified rela protein for inducing interferon expression and engineered immune cells with improved interferon expression
WO2023191816A1 (en) 2022-04-01 2023-10-05 Genentech, Inc. Dosing for treatment with anti-fcrh5/anti-cd3 bispecific antibodies
WO2023213969A1 (en) 2022-05-05 2023-11-09 Juno Therapeutics Gmbh Viral-binding protein and related reagents, articles, and methods of use
WO2023219613A1 (en) 2022-05-11 2023-11-16 Genentech, Inc. Dosing for treatment with anti-fcrh5/anti-cd3 bispecific antibodies
WO2023220655A1 (en) 2022-05-11 2023-11-16 Celgene Corporation Methods to overcome drug resistance by re-sensitizing cancer cells to treatment with a prior therapy via treatment with a t cell therapy
WO2023230548A1 (en) 2022-05-25 2023-11-30 Celgene Corporation Method for predicting response to a t cell therapy
WO2023230581A1 (en) 2022-05-25 2023-11-30 Celgene Corporation Methods of manufacturing t cell therapies
WO2024015897A1 (en) 2022-07-13 2024-01-18 Genentech, Inc. Dosing for treatment with anti-fcrh5/anti-cd3 bispecific antibodies
WO2024020432A1 (en) 2022-07-19 2024-01-25 Genentech, Inc. Dosing for treatment with anti-fcrh5/anti-cd3 bispecific antibodies
WO2024054944A1 (en) 2022-09-08 2024-03-14 Juno Therapeutics, Inc. Combination of a t cell therapy and continuous or intermittent dgk inhibitor dosing

Family Cites Families (331)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5922A (en) 1848-11-14 Improvement in hillside-plows
US5672A (en) 1848-07-18 Mark wilder
US6168A (en) 1849-03-13 Horizontal spark-arrester
US510A (en) 1837-12-07 soeel
US576A (en) 1838-01-20 Ftjbnace of stoves fob bubning anthracite
US835A (en) 1838-07-12 X i i i x
US54A (en) 1836-10-15 Art of managing and supplying fie-e for generating steam in locomotive
US5719A (en) 1848-08-22 Ditching-machine
US6077A (en) 1849-01-30 Improved hinged claw-wrench
US941A (en) 1838-09-22 Machine for sawing shingles and staves
US4179337A (en) 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
US4634665A (en) 1980-02-25 1987-01-06 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US5179017A (en) 1980-02-25 1993-01-12 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4399216A (en) 1980-02-25 1983-08-16 The Trustees Of Columbia University Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4376110A (en) 1980-08-04 1983-03-08 Hybritech, Incorporated Immunometric assays using monoclonal antibodies
US4475196A (en) 1981-03-06 1984-10-02 Zor Clair G Instrument for locating faults in aircraft passenger reading light and attendant call control system
US4447233A (en) 1981-04-10 1984-05-08 Parker-Hannifin Corporation Medication infusion pump
US4474893A (en) 1981-07-01 1984-10-02 The University of Texas System Cancer Center Recombinant monoclonal antibodies
JPS5896026A (ja) 1981-10-30 1983-06-07 Nippon Chemiphar Co Ltd 新規ウロキナ−ゼ誘導体およびその製造法ならびにそれを含有する血栓溶解剤
US4439196A (en) 1982-03-18 1984-03-27 Merck & Co., Inc. Osmotic drug delivery system
US4609546A (en) 1982-06-24 1986-09-02 Japan Chemical Research Co., Ltd. Long-acting composition
US4522811A (en) 1982-07-08 1985-06-11 Syntex (U.S.A.) Inc. Serial injection of muramyldipeptides and liposomes enhances the anti-infective activity of muramyldipeptides
US4447224A (en) 1982-09-20 1984-05-08 Infusaid Corporation Variable flow implantable infusion apparatus
US4487603A (en) 1982-11-26 1984-12-11 Cordis Corporation Implantable microinfusion pump system
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4486194A (en) 1983-06-08 1984-12-04 James Ferrara Therapeutic device for administering medicaments through the skin
US4681581A (en) 1983-12-05 1987-07-21 Coates Fredrica V Adjustable size diaper and folding method therefor
CA1282721C (en) 1984-06-04 1991-04-09 Bernard Roizman Herpes simplex virus as a vector
JPS6147500A (ja) 1984-08-15 1986-03-07 Res Dev Corp Of Japan キメラモノクロ−ナル抗体及びその製造法
EP0173494A3 (en) 1984-08-27 1987-11-25 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Chimeric receptors by dna splicing and expression
GB8422238D0 (en) 1984-09-03 1984-10-10 Neuberger M S Chimeric proteins
US4699880A (en) 1984-09-25 1987-10-13 Immunomedics, Inc. Method of producing monoclonal anti-idiotype antibody
JPS61134325A (ja) 1984-12-04 1986-06-21 Teijin Ltd ハイブリツド抗体遺伝子の発現方法
US4797368A (en) 1985-03-15 1989-01-10 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Adeno-associated virus as eukaryotic expression vector
US4596556A (en) 1985-03-25 1986-06-24 Bioject, Inc. Hypodermic injection apparatus
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US5374548A (en) 1986-05-02 1994-12-20 Genentech, Inc. Methods and compositions for the attachment of proteins to liposomes using a glycophospholipid anchor
US4824659A (en) 1985-06-07 1989-04-25 Immunomedics, Inc. Antibody conjugates
US4766106A (en) 1985-06-26 1988-08-23 Cetus Corporation Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation
MX9203291A (es) 1985-06-26 1992-08-01 Liposome Co Inc Metodo para acoplamiento de liposomas.
US5776093A (en) 1985-07-05 1998-07-07 Immunomedics, Inc. Method for imaging and treating organs and tissues
US5101827A (en) 1985-07-05 1992-04-07 Immunomedics, Inc. Lymphographic and organ imaging method and kit
US4735210A (en) 1985-07-05 1988-04-05 Immunomedics, Inc. Lymphographic and organ imaging method and kit
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
US5139941A (en) 1985-10-31 1992-08-18 University Of Florida Research Foundation, Inc. AAV transduction vectors
DE3689123T2 (de) 1985-11-01 1994-03-03 Xoma Corp Modulare einheit von antikörpergenen, daraus hergestellte antikörper und verwendung.
US5618920A (en) * 1985-11-01 1997-04-08 Xoma Corporation Modular assembly of antibody genes, antibodies prepared thereby and use
GB8601597D0 (en) 1986-01-23 1986-02-26 Wilson R H Nucleotide sequences
US5057313A (en) 1986-02-25 1991-10-15 The Center For Molecular Medicine And Immunology Diagnostic and therapeutic antibody conjugates
US4954617A (en) 1986-07-07 1990-09-04 Trustees Of Dartmouth College Monoclonal antibodies to FC receptors for immunoglobulin G on human mononuclear phagocytes
US4881175A (en) 1986-09-02 1989-11-14 Genex Corporation Computer based system and method for determining and displaying possible chemical structures for converting double- or multiple-chain polypeptides to single-chain polypeptides
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US5260203A (en) 1986-09-02 1993-11-09 Enzon, Inc. Single polypeptide chain binding molecules
US5834185A (en) 1986-10-28 1998-11-10 Johns Hopkins University Formation of triple helix complexes of single stranded nucleic acids using nucleoside oligomers which comprise pyrimidine analogs, triple helix complexes formed thereby and oligomers used in their formation
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
JP3101690B2 (ja) 1987-03-18 2000-10-23 エス・ビィ・２・インコーポレイテッド 変性抗体の、または変性抗体に関する改良
US5013653A (en) 1987-03-20 1991-05-07 Creative Biomolecules, Inc. Product and process for introduction of a hinge region into a fusion protein to facilitate cleavage
US5091513A (en) 1987-05-21 1992-02-25 Creative Biomolecules, Inc. Biosynthetic antibody binding sites
US5132405A (en) 1987-05-21 1992-07-21 Creative Biomolecules, Inc. Biosynthetic antibody binding sites
US5258498A (en) 1987-05-21 1993-11-02 Creative Biomolecules, Inc. Polypeptide linkers for production of biosynthetic proteins
ATE120761T1 (de) 1987-05-21 1995-04-15 Creative Biomolecules Inc Multifunktionelle proteine mit vorbestimmter zielsetzung.
US4941880A (en) 1987-06-19 1990-07-17 Bioject, Inc. Pre-filled ampule and non-invasive hypodermic injection device assembly
US4790824A (en) 1987-06-19 1988-12-13 Bioject, Inc. Non-invasive hypodermic injection device
US5750172A (en) 1987-06-23 1998-05-12 Pharming B.V. Transgenic non human mammal milk
GB8717430D0 (en) 1987-07-23 1987-08-26 Celltech Ltd Recombinant dna product
US5648471A (en) 1987-12-03 1997-07-15 Centocor, Inc. One vial method for labeling antibodies with Technetium-99m
HUT53672A (en) 1988-02-25 1990-11-28 Gen Hospital Corp Quick immunoselective cloning process
AU629828B2 (en) 1988-03-18 1992-10-15 United States of America, as represented by the Secretary, U.S. Department of Commerce, The Novel recombinant vaccinia virus expression vectors and method of selecting same
US5716826A (en) 1988-03-21 1998-02-10 Chiron Viagene, Inc. Recombinant retroviruses
GB8809129D0 (en) 1988-04-18 1988-05-18 Celltech Ltd Recombinant dna methods vectors and host cells
US5614404A (en) 1988-06-10 1997-03-25 Theriod Biologics, Incorporated Self-assembled, defective, non-self-propagating lentivirus particles
US5294533A (en) 1988-07-05 1994-03-15 Baylor College Of Medicine Antisense oligonucleotide antibiotics complementary to the macromolecular synthesis operon, methods of treating bacterial infections and methods for identification of bacteria
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
US5866701A (en) 1988-09-20 1999-02-02 The Board Of Regents For Northern Illinois University Of Dekalb HIV targeted hairpin ribozymes
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
US5176996A (en) 1988-12-20 1993-01-05 Baylor College Of Medicine Method for making synthetic oligonucleotides which bind specifically to target sites on duplex DNA molecules, by forming a colinear triplex, the synthetic oligonucleotides and methods of use
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5703055A (en) 1989-03-21 1997-12-30 Wisconsin Alumni Research Foundation Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery
US5624824A (en) 1989-03-24 1997-04-29 Yale University Targeted cleavage of RNA using eukaryotic ribonuclease P and external guide sequence
US5168053A (en) 1989-03-24 1992-12-01 Yale University Cleavage of targeted RNA by RNAase P
US5108921A (en) 1989-04-03 1992-04-28 Purdue Research Foundation Method for enhanced transmembrane transport of exogenous molecules
DK0486622T3 (da) 1989-08-09 1999-07-19 Rhomed Inc Direkte radiomærkning af antistoffer og andre proteiner med technetium eller rhenium
ATE199398T1 (de) 1989-10-24 2001-03-15 Chiron Corp Sekretion vom mit gamma-interferon signalpeptid gebundenen humänen protein
US5064413A (en) 1989-11-09 1991-11-12 Bioject, Inc. Needleless hypodermic injection device
US5312335A (en) 1989-11-09 1994-05-17 Bioject Inc. Needleless hypodermic injection device
US5633076A (en) 1989-12-01 1997-05-27 Pharming Bv Method of producing a transgenic bovine or transgenic bovine embryo
JP2507895B2 (ja) 1989-12-19 1996-06-19 工業技術院長 リボザイムの新規合成系
GB8928874D0 (en) 1989-12-21 1990-02-28 Celltech Ltd Humanised antibodies
DK0505500T3 (da) 1989-12-22 1997-08-25 Applied Research Systems Modificering af endogen genekspression med regulatorisk element ved hjælp af homolog rekombination
US5672510A (en) 1990-01-19 1997-09-30 Genetic Therapy, Inc. Retroviral vectors
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
US5795721A (en) 1990-06-11 1998-08-18 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. High affinity nucleic acid ligands of ICP4
US6011020A (en) 1990-06-11 2000-01-04 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Nucleic acid ligand complexes
US5580737A (en) 1990-06-11 1996-12-03 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. High-affinity nucleic acid ligands that discriminate between theophylline and caffeine
US6001988A (en) 1990-06-11 1999-12-14 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. High affinity nucleic acid ligands to lectins
US5723289A (en) 1990-06-11 1998-03-03 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Parallel selex
US5780228A (en) 1990-06-11 1998-07-14 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. High affinity nucleic acid ligands to lectins
US6030776A (en) 1990-06-11 2000-02-29 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Parallel SELEX
US5869641A (en) 1990-06-11 1999-02-09 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. High affinity nucleic acid ligands of CD4
US5660985A (en) 1990-06-11 1997-08-26 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. High affinity nucleic acid ligands containing modified nucleotides
US5476766A (en) 1990-06-11 1995-12-19 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Ligands of thrombin
US5861254A (en) 1997-01-31 1999-01-19 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Flow cell SELEX
US5543293A (en) 1990-06-11 1996-08-06 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. DNA ligands of thrombin
US5731424A (en) 1990-06-11 1998-03-24 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. High affinity TGFβ nucleic acid ligands and inhibitors
US5864026A (en) 1990-06-11 1999-01-26 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: tissue selex
US5846713A (en) 1990-06-11 1998-12-08 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. High affinity HKGF nucleic acid ligands and inhibitors
US5503978A (en) 1990-06-11 1996-04-02 University Research Corporation Method for identification of high affinity DNA ligands of HIV-1 reverse transcriptase
GB9014932D0 (en) 1990-07-05 1990-08-22 Celltech Ltd Recombinant dna product and method
DK0585287T3 (da) 1990-07-10 2000-04-17 Cambridge Antibody Tech Fremgangsmåde til fremstilling af specifikke bindingsparelementer
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
US5135917A (en) 1990-07-12 1992-08-04 Nova Pharmaceutical Corporation Interleukin receptor expression inhibiting antisense oligonucleotides
WO1992001049A2 (en) 1990-07-13 1992-01-23 The General Hospital Corporation Cd53 cell surface antigen and use thereof
US5165424A (en) 1990-08-09 1992-11-24 Silverman Harvey N Method and system for whitening teeth
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5814318A (en) 1990-08-29 1998-09-29 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US6255458B1 (en) 1990-08-29 2001-07-03 Genpharm International High affinity human antibodies and human antibodies against digoxin
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
EP0546073B1 (en) 1990-08-29 1997-09-10 GenPharm International, Inc. production and use of transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5877397A (en) 1990-08-29 1999-03-02 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5874299A (en) 1990-08-29 1999-02-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5789650A (en) 1990-08-29 1998-08-04 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
WO1994025585A1 (en) 1993-04-26 1994-11-10 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US6300129B1 (en) 1990-08-29 2001-10-09 Genpharm International Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5194594A (en) 1990-09-07 1993-03-16 Techniclone, Inc. Modified antibodies
GB9023352D0 (en) 1990-10-26 1990-12-05 Lynxvale Ltd Vaccinia vectors,vaccinia genes and expression products thereof
US5173414A (en) 1990-10-30 1992-12-22 Applied Immune Sciences, Inc. Production of recombinant adeno-associated virus vectors
US5271941A (en) 1990-11-02 1993-12-21 Cho Chung Yoon S Antisense oligonucleotides of human regulatory subunit RI.sub.α of cAMP-dependent protein kinases
DK0564531T3 (da) 1990-12-03 1998-09-28 Genentech Inc Berigelsesfremgangsmåde for variantproteiner med ændrede bindingsegenskaber
SE9003978D0 (sv) 1990-12-13 1990-12-13 Henrik Garoff Dna expressionssystem baserade paa ett virus replikon
ES2287206T3 (es) 1991-03-01 2007-12-16 Dyax Corporation Proceso para el desarrollo de mini-proteinas de union.
GB9105383D0 (en) 1991-03-14 1991-05-01 Immunology Ltd An immunotherapeutic for cervical cancer
US5683874A (en) 1991-03-27 1997-11-04 Research Corporation Technologies, Inc. Single-stranded circular oligonucleotides capable of forming a triplex with a target sequence
IE921169A1 (en) 1991-04-10 1992-10-21 Scripps Research Inst Heterodimeric receptor libraries using phagemids
US6028186A (en) 1991-06-10 2000-02-22 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. High affinity nucleic acid ligands of cytokines
WO1992022645A1 (en) 1991-06-14 1992-12-23 Genpharm International, Inc. Transgenic immunodeficient non-human animals
WO1994004679A1 (en) 1991-06-14 1994-03-03 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
DE4216134A1 (de) 1991-06-20 1992-12-24 Europ Lab Molekularbiolog Synthetische katalytische oligonukleotidstrukturen
EP0603194A4 (en) 1991-07-05 1994-12-07 Seragen Inc TO THE RECEPTOR OF THE EPIDERMAL GROWTH FACTOR TARGETED MOLECULES FOR TREATING INFLAMMABLE ARTHRITIS.
DE4122599C2 (de) 1991-07-08 1993-11-11 Deutsches Krebsforsch Phagemid zum Screenen von Antikörpern
WO1993001227A1 (en) 1991-07-08 1993-01-21 University Of Massachusetts At Amherst Thermotropic liquid crystal segmented block copolymer
WO1993006213A1 (en) 1991-09-23 1993-04-01 Medical Research Council Production of chimeric antibodies - a combinatorial approach
WO1993008829A1 (en) 1991-11-04 1993-05-13 The Regents Of The University Of California Compositions that mediate killing of hiv-infected cells
US6063630A (en) 1991-11-05 2000-05-16 Transkaryotic Therapies, Inc. Targeted introduction of DNA into primary or secondary cells and their use for gene therapy
US5733761A (en) 1991-11-05 1998-03-31 Transkaryotic Therapies, Inc. Protein production and protein delivery
AU3222793A (en) 1991-11-26 1993-06-28 Gilead Sciences, Inc. Enhanced triple-helix and double-helix formation with oligomers containing modified pyrimidines
JPH05244982A (ja) 1991-12-06 1993-09-24 Sumitomo Chem Co Ltd 擬人化ｂ−ｂ１０
US5777085A (en) 1991-12-20 1998-07-07 Protein Design Labs, Inc. Humanized antibodies reactive with GPIIB/IIIA
US5652094A (en) 1992-01-31 1997-07-29 University Of Montreal Nucleozymes
SK280610B6 (sk) 1992-02-06 2000-05-16 Schering Corporation Monoklonálna a humanizovaná monoklonálna protilátk
EP0592677B1 (en) 1992-02-18 2001-11-07 Otsuka Kagaku Kabushiki Kaisha Beta-LACTAM COMPOUND AND CEPHEM COMPOUND, AND PRODUCTION THEREOF
US5714350A (en) 1992-03-09 1998-02-03 Protein Design Labs, Inc. Increasing antibody affinity by altering glycosylation in the immunoglobulin variable region
US5733743A (en) 1992-03-24 1998-03-31 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
US5610054A (en) 1992-05-14 1997-03-11 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Enzymatic RNA molecule targeted against Hepatitis C virus
US5646020A (en) 1992-05-14 1997-07-08 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Hammerhead ribozymes for preferred targets
US5693535A (en) 1992-05-14 1997-12-02 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. HIV targeted ribozymes
US5989906A (en) 1992-05-14 1999-11-23 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Method and reagent for inhibiting P-glycoprotein (mdr-1-gene)
US5972699A (en) 1992-05-14 1999-10-26 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Method and reagent for inhibiting herpes simplex virus replication
US6017756A (en) 1992-05-14 2000-01-25 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Method and reagent for inhibiting hepatitis B virus replication
EP0653488B1 (en) 1992-07-02 2003-04-09 Sankyo Company Limited Looped, hairpin ribozyme
US5383851A (en) 1992-07-24 1995-01-24 Bioject Inc. Needleless hypodermic injection device
DE69308573T2 (de) 1992-08-17 1997-08-07 Genentech Inc Bispezifische immunoadhesine
US5646042A (en) 1992-08-26 1997-07-08 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. C-myb targeted ribozymes
US5891684A (en) 1992-10-15 1999-04-06 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Base-modified enzymatic nucleic acid
GB9223377D0 (en) 1992-11-04 1992-12-23 Medarex Inc Humanized antibodies to fc receptors for immunoglobulin on human mononuclear phagocytes
US5612215A (en) 1992-12-07 1997-03-18 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Stromelysin targeted ribozymes
US5811300A (en) 1992-12-07 1998-09-22 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. TNF-α ribozymes
JPH08505531A (ja) 1993-01-15 1996-06-18 ザ パブリック ヘルス リサーチ インスティチュート オブ ザ シティー オブ ニューヨーク インク Ｒｎａバイナリ・プローブとリボザイムリガーゼを用いたｒｎａ検定法
US5593972A (en) 1993-01-26 1997-01-14 The Wistar Institute Genetic immunization
WO1994017184A1 (en) 1993-01-29 1994-08-04 Schering Corporation Modulation of physiological responses of lymphocytes by cd38 or antibodies thereto
US5786138A (en) 1993-01-29 1998-07-28 Board Of Supervisors Of Louisiana State University And Agricultural And Mechanical College Hyperstabilizing antisense nucleic acid binding agents
PT804070E (pt) 1993-03-09 2000-11-30 Genzyme Corp Isolamento de componentes de interesse a partir do leite.
CA2161122A1 (fr) 1993-04-21 1994-10-27 Philippe Moullier Implant biocompatible pour l'expression et secretion in vivo d'un compose therapeutique
DE69425890D1 (de) 1993-06-04 2000-10-19 Us Health Verfahren zur behandlung von kaposi-sarcoma mit antisense-oligonukleotide
WO1994029351A2 (en) 1993-06-16 1994-12-22 Celltech Limited Antibodies
US5962426A (en) 1993-06-25 1999-10-05 Yale University Triple-helix forming oligonucleotides for targeted mutagenesis
PT748382E (pt) 1993-09-02 2003-03-31 Ribozyme Pharm Inc Acidos nucleicos enzimaticos contendo nao-nucleotidos
DE69435224D1 (de) 1993-09-15 2009-09-10 Novartis Vaccines & Diagnostic Rekombinante Alphavirus-Vektoren
US5861288A (en) 1993-10-18 1999-01-19 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Catalytic DNA
US5616466A (en) 1993-11-05 1997-04-01 Cantor; Glenn H. Ribozyme-mediated inhibition of bovine leukemia virus
US5578716A (en) 1993-12-01 1996-11-26 Mcgill University DNA methyltransferase antisense oligonucleotides
US5827690A (en) 1993-12-20 1998-10-27 Genzyme Transgenics Corporatiion Transgenic production of antibodies in milk
US5712384A (en) 1994-01-05 1998-01-27 Gene Shears Pty Ltd. Ribozymes targeting retroviral packaging sequence expression constructs and recombinant retroviruses containing such constructs
US5641754A (en) 1994-01-10 1997-06-24 The Board Of Regents Of The University Of Nebraska Antisense oligonucleotide compositions for selectively killing cancer cells
US5580766A (en) 1994-01-14 1996-12-03 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Retroviral vector particles for transducing non-proliferating cells
US5631359A (en) 1994-10-11 1997-05-20 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Hairpin ribozymes
US5639647A (en) 1994-03-29 1997-06-17 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. 2'-deoxy-2'alkylnucleotide containing nucleic acid
US5869248A (en) 1994-03-07 1999-02-09 Yale University Targeted cleavage of RNA using ribonuclease P targeting and cleavage sequences
US6077835A (en) 1994-03-23 2000-06-20 Case Western Reserve University Delivery of compacted nucleic acid to cells
US5879687A (en) 1994-04-22 1999-03-09 Corixa Corporation Methods for enhancement of protective immune responses
US5683902A (en) 1994-05-13 1997-11-04 Northern Illinois University Human papilloma virus inhibition by a hairpin ribozyme
US5580967A (en) 1994-05-13 1996-12-03 The Scripps Research Institute Optimized catalytic DNA-cleaving ribozymes
US5595873A (en) 1994-05-13 1997-01-21 The Scripps Research Institute T. thermophila group I introns that cleave amide bonds
US5658785A (en) 1994-06-06 1997-08-19 Children's Hospital, Inc. Adeno-associated virus materials and methods
US5650316A (en) 1994-06-06 1997-07-22 Research Development Foundation Uses of triplex forming oligonucleotides for the treatment of human diseases
US5998193A (en) 1994-06-24 1999-12-07 Gene Shears Pty., Ltd. Ribozymes with optimized hybridizing arms, stems, and loops, tRNA embedded ribozymes and compositions thereof
US5633133A (en) 1994-07-14 1997-05-27 Long; David M. Ligation with hammerhead ribozymes
AU3222795A (en) 1994-08-09 1996-03-07 Ciba-Geigy Ag Antitumor antisense oligonucleotides
US5688670A (en) 1994-09-01 1997-11-18 The General Hospital Corporation Self-modifying RNA molecules and methods of making
US5989908A (en) 1994-09-12 1999-11-23 City Of Hope Modulation of drug and radiation resistant genes
US5599706A (en) 1994-09-23 1997-02-04 Stinchcomb; Dan T. Ribozymes targeted to apo(a) mRNA
US5856103A (en) 1994-10-07 1999-01-05 Board Of Regents The University Of Texas Method for selectively ranking sequences for antisense targeting
JPH08113591A (ja) 1994-10-14 1996-05-07 Taiho Yakuhin Kogyo Kk オリゴヌクレオチド及びこれを有効成分とする制癌剤
GB9424449D0 (en) 1994-12-02 1995-01-18 Wellcome Found Antibodies
US5807718A (en) 1994-12-02 1998-09-15 The Scripps Research Institute Enzymatic DNA molecules
US20020164788A1 (en) * 1994-12-02 2002-11-07 The Wellcome Foundation Limited Humanized antibodies to CD38
US5683873A (en) 1995-01-13 1997-11-04 Innovir Laboratories, Inc. EGS-mediated inactivation of target RNA
US5631146A (en) 1995-01-19 1997-05-20 The General Hospital Corporation DNA aptamers and catalysts that bind adenosine or adenosine-5'-phosphates and methods for isolation thereof
US5994320A (en) 1995-02-06 1999-11-30 Regents Of The University Of Minnesota Antisense oligonucleotides and methods for treating central nervous system tumors
IT1275862B1 (it) 1995-03-03 1997-10-24 Consiglio Nazionale Ricerche Trascritto antisenso associato ad alcuni tipi di cellule tumorali ed oligodeossinucleotidi sintetici utili nella diagnosi e nel trattamento
US5770715A (en) 1995-03-22 1998-06-23 Toagosei Co., Ltd. Hammerhead-like nucleic acid analogues and their synthesis
US5703057A (en) 1995-04-07 1997-12-30 Board Of Regents The University Of Texas System Expression library immunization
US6121022A (en) 1995-04-14 2000-09-19 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
CA2218651A1 (en) 1995-04-21 1996-10-24 Abbott Laboratories Repertoire cloning process, products derived therefrom and uses for said products
US6013443A (en) 1995-05-03 2000-01-11 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: tissue SELEX
US5646031A (en) 1995-05-16 1997-07-08 Northern Illinois University SArMV and sCYMVI hairpin ribozymes
US5693773A (en) 1995-06-07 1997-12-02 Hybridon Incorporated Triplex-forming antisense oligonucleotides having abasic linkers targeting nucleic acids comprising mixed sequences of purines and pyrimidines
US5910408A (en) 1995-06-07 1999-06-08 The General Hospital Corporation Catalytic DNA having ligase activity
EP0833944B1 (en) 1995-06-07 2009-01-07 Gilead Sciences, Inc. Nucleic acid ligands that bind to and inhibit dna polymerases
US6040296A (en) 1995-06-07 2000-03-21 East Carolina University Specific antisense oligonucleotide composition & method for treatment of disorders associated with bronchoconstriction and lung inflammation
US5877021A (en) 1995-07-07 1999-03-02 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. B7-1 targeted ribozymes
WO1997004748A2 (en) 1995-08-01 1997-02-13 Advanced Therapies, Inc. Enhanced artificial viral envelopes for cellular delivery of therapeutic substances
NO953680D0 (no) 1995-09-18 1995-09-18 Hans Prydz Cellesyklusenzymer
WO1997014709A1 (en) 1995-10-13 1997-04-24 F. Hoffmann-La Roche Ag Antisense oligomers
KR970029803A (ko) 1995-11-03 1997-06-26 김광호 반도체 메모리장치의 프리차지 회로
ATE213019T1 (de) 1995-11-14 2002-02-15 Vimrx Holdings Ltd Chimäre oligomere mit einer rns- spaltungsaktivität
JPH11507245A (ja) 1995-11-21 1999-06-29 アイシーエヌ・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド Ｉｌ―８およびｉｌ―８受容体に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドによる睡瘍増殖の阻害
US5998203A (en) 1996-04-16 1999-12-07 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Enzymatic nucleic acids containing 5'-and/or 3'-cap structures
WO1997029757A1 (en) 1996-02-15 1997-08-21 National Institutes Of Health Rnase l activators and antisense oligonucleotides effective to treat rsv infections
US5877162A (en) 1996-03-14 1999-03-02 Innovir Laboratories, Inc. Short external guide sequences
JP2000510119A (ja) 1996-05-03 2000-08-08 イムノメディクス，インコーポレイテッド ガンに対する標的コンビネーション免疫療法
US6261552B1 (en) 1997-05-22 2001-07-17 University Of Pittsburgh Of The Commonwealth System Of Higher Education Herpes simplex virus vectors
US5792613A (en) 1996-06-12 1998-08-11 The Curators Of The University Of Missouri Method for obtaining RNA aptamers based on shape selection
US5955590A (en) 1996-07-15 1999-09-21 Worcester Foundation For Biomedical Research Conjugates of minor groove DNA binders with antisense oligonucleotides
US6869793B2 (en) 1996-09-24 2005-03-22 Bavarian Nordic Research Institute Recombinant MVA virus expressing dengue virus antigens, and the use thereof in vaccines
JP4233608B2 (ja) 1996-10-15 2009-03-04 塩野義製薬株式会社 自己抗体測定方法
PT932417E (pt) 1996-10-17 2003-07-31 Immunomedics Inc Conjugado de toxina nao antigenico e proteina de fusao de sistema receptor de interiorizacao
US5874566A (en) 1996-10-25 1999-02-23 Hisamitsu Pharmaceutical Co. Inc. Il-15 triplex oligonucleotides
US6051698A (en) 1997-06-06 2000-04-18 Janjic; Nebojsa Vascular endothelial growth factor (VEGF) nucleic acid ligand complexes
CA2272820C (en) 1996-11-20 2012-09-11 Introgen Therapeutics, Inc. An improved method for the production and purification of adenoviral vectors
US7732129B1 (en) 1998-12-01 2010-06-08 Crucell Holland B.V. Method for the production and purification of adenoviral vectors
WO2000006194A2 (en) 1997-02-05 2000-02-10 Biotransplant, Inc. Depletion of cells responsible for antibody-mediated graft rejection
US6046004A (en) 1997-02-27 2000-04-04 Lorne Park Research, Inc. Solution hybridization of nucleic acids with antisense probes having modified backbones
US6277375B1 (en) 1997-03-03 2001-08-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobulin-like domains with increased half-lives
ATE302217T1 (de) 1997-05-02 2005-09-15 Us Gov Health & Human Serv Immuntoxine, die ein onc protein enthalten, gegen bösartige zellen
CA2290485C (en) 1997-05-21 2008-08-05 Biovation Limited Method for the production of non-immunogenic proteins
EP0996735B1 (en) 1997-06-09 2003-12-10 Genvec, Inc. Chimeric vectors comprising a phage packaging site and a portion derived from the genome of a eukaryotic virus
US6171586B1 (en) * 1997-06-13 2001-01-09 Genentech, Inc. Antibody formulation
US6300483B1 (en) 1997-06-19 2001-10-09 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Compositions inducing cleavage of RNA motifs
WO1998058058A1 (en) 1997-06-19 1998-12-23 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Hammerhead ribozymes with extended cleavage rule
JPH1142091A (ja) 1997-07-25 1999-02-16 Toagosei Co Ltd アンチセンス核酸化合物
DE69831417T2 (de) 1997-09-23 2006-06-22 Genvec, Inc. Duale selektionkassette und sie enthaltende plasmide
US6046319A (en) 1997-10-22 2000-04-04 University Technologies International, Inc. Antisense oligodeoxynucleotides regulating expression of TNF-α
US6399383B1 (en) 1997-10-28 2002-06-04 Maxygen, Inc. Human papilloma virus vectors
US5994136A (en) 1997-12-12 1999-11-30 Cell Genesys, Inc. Method and means for producing high titer, safe, recombinant lentivirus vectors
US6506559B1 (en) 1997-12-23 2003-01-14 Carnegie Institute Of Washington Genetic inhibition by double-stranded RNA
US6719977B1 (en) 1998-02-12 2004-04-13 The General Hospital Corporation Methods to potentiate cancer therapies
US5922576A (en) 1998-02-27 1999-07-13 The John Hopkins University Simplified system for generating recombinant adenoviruses
EP1068296B1 (en) 1998-03-31 2011-08-10 Geron Corporation Compositions for eliciting an immune response to a telomerase antigen
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
DK1071700T3 (da) 1998-04-20 2010-06-07 Glycart Biotechnology Ag Glykosylerings-modifikation af antistoffer til forbedring af antistofafhængig cellulær cytotoksicitet
ATE303434T1 (de) 1998-04-22 2005-09-15 Genvec Inc Effiziente reinigung von adenovirus
CA2329940A1 (en) 1998-06-05 1999-12-09 Mayo Foundation For Medical Education And Research Use of genetically engineered antibodies to cd38 to treat multiple myeloma
US6007995A (en) 1998-06-26 1999-12-28 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense inhibition of TNFR1 expression
NZ573838A (en) * 1998-08-11 2011-01-28 Biogen Idec Inc Combination therapies for b-cell lymphomas comprising administration of anti-cd20 antibody
US5965358A (en) 1998-08-26 1999-10-12 Genvec, Inc. Method for assessing the relative purity of viral gene transfer vector stocks
US6875741B2 (en) 1998-09-02 2005-04-05 Renuka Pillutla Insulin and IGF-1 receptor agonists and antagonists
US6235523B1 (en) 1998-09-04 2001-05-22 Connaught Laboratories Limited Vectors for DNA immunization against cervical cancer
US6387888B1 (en) 1998-09-30 2002-05-14 American Foundation For Biological Research, Inc. Immunotherapy of cancer through expression of truncated tumor or tumor-associated antigen
AU2220800A (en) 1998-12-31 2000-07-31 Chiron Corporation Compositions and methods for packaging of alphavirus vectors
US7223397B1 (en) * 1999-01-07 2007-05-29 Research Development Foundation Potentiation of anti-CD38-Immunotoxin cytotoxicity
EP1141024B1 (en) 1999-01-15 2018-08-08 Genentech, Inc. POLYPEPTIDE COMPRISING A VARIANT HUMAN IgG1 Fc REGION
DE60013773T2 (de) 1999-02-03 2005-11-10 Biosante Pharmaceuticals, Inc. Methoden zur Herstellung von therapeutischen Kalziumphosphat Partikeln
US6013522A (en) 1999-02-23 2000-01-11 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense inhibition of human Smad1 expression
DK2270150T4 (da) 1999-04-09 2019-08-26 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd Fremgangsmåde til at kontrollere aktiviteten af immunologisk funktionelt molekyle.
US20050037969A1 (en) * 1999-05-14 2005-02-17 Arbor Vita Corporation Molecular interactions in hematopoietic cells
US6281005B1 (en) 1999-05-14 2001-08-28 Copernicus Therapeutics, Inc. Automated nucleic acid compaction device
US6025198A (en) 1999-06-25 2000-02-15 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense modulation of Ship-2 expression
US6033910A (en) 1999-07-19 2000-03-07 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense inhibition of MAP kinase kinase 6 expression
KR20020047098A (ko) 1999-07-29 2002-06-21 추후제출 ＨＥＲ2/ｎｅｕ에 대한 인간 모노클로날 항체
CN1371416B (zh) 1999-08-24 2012-10-10 梅达里克斯公司 人ctla-4抗体及其应用
EP1272630A2 (en) 2000-03-16 2003-01-08 Genetica, Inc. Methods and compositions for rna interference
AU2001249380A1 (en) 2000-03-22 2001-11-07 Chiron Corporation Compositions and methods for generating an immune response utilizing alphavirus-based vector systems
ES2336887T5 (es) 2000-03-30 2019-03-06 Whitehead Inst Biomedical Res Mediadores de interferencia por ARN específicos de secuencias de ARN
US6168941B1 (en) 2000-04-07 2001-01-02 Genvec, Inc. Method of producing adenoviral vector stocks
WO2001081553A1 (en) 2000-04-25 2001-11-01 Chiron Corporation Alphavirus-based vectors for persistent infection
EP1174440A1 (en) 2000-07-19 2002-01-23 U-BISys B.V. A selectively-expressed epitope on the human CD38 molecule detected by a phage display library-derived human scFv antibody fragment
US20070042436A1 (en) 2000-10-17 2007-02-22 Lund Frances E CD38 modulated chemotaxis
CA2424643A1 (en) 2000-10-17 2002-04-25 Trudeau Institute, Inc. Cd38 modulated chemotaxis
CN1205479C (zh) * 2000-10-31 2005-06-08 杨梦甦 免疫学诊断蛋白芯片制备方法
US20020132788A1 (en) 2000-11-06 2002-09-19 David Lewis Inhibition of gene expression by delivery of small interfering RNA to post-embryonic animal cells in vivo
WO2002042468A2 (en) 2000-11-27 2002-05-30 Geron Corporation Glycosyltransferase vectors for treating cancer
DE60131456T2 (de) 2000-11-30 2008-07-10 Medarex, Inc., Milpitas Transchromosomale transgen-nagetiere zur herstellung von humanen antikörpern
US7754208B2 (en) 2001-01-17 2010-07-13 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
US20030133939A1 (en) 2001-01-17 2003-07-17 Genecraft, Inc. Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
IL159225A0 (en) 2001-06-13 2004-06-01 Genmab As Human monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor (egfr)
US20040166490A1 (en) * 2002-12-17 2004-08-26 Morris David W. Novel therapeutic targets in cancer
US20040063654A1 (en) 2001-11-02 2004-04-01 Davis Mark E. Methods and compositions for therapeutic use of RNA interference
EP2325193A3 (en) 2001-11-02 2012-05-02 Insert Therapeutics, Inc. Methods and compositions for therapeutic use of RNA interference
AR039067A1 (es) * 2001-11-09 2005-02-09 Pfizer Prod Inc Anticuerpos para cd40
AU2002360394A1 (en) 2001-11-16 2003-06-10 University Of Massachusetts Facilitation of rna interference
US20030167490A1 (en) 2001-11-26 2003-09-04 Hunter Craig P. Gene silencing by systemic RNA interference
WO2003048185A2 (en) 2001-11-30 2003-06-12 Genvec, Inc. Angiopioetin related factors
US20040009498A1 (en) 2002-01-14 2004-01-15 Diversa Corporation Chimeric antigen binding molecules and methods for making and using them
EP1532175B1 (en) 2002-03-22 2012-10-17 Aprogen, Inc. Humanized antibody and process for preparing the same
US20040019915A1 (en) * 2002-04-01 2004-01-29 Challita-Eid Pia M. Nucleic acid and corresponding protein entitled 213P1F11 useful in treatment and detection of cancer
WO2004016735A2 (en) 2002-05-23 2004-02-26 Ceptyr, Inc. Modulation of biological signal transduction by rna interference
JP2005536195A (ja) 2002-05-31 2005-12-02 ザ リージェント オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア 哺乳動物細胞における効率的なｒｎａ干渉のための方法
EP1532271A4 (en) 2002-06-12 2006-10-18 Ambion Inc METHODS AND COMPOSITIONS RELATED TO POLYPEPTIDES WITH RNASE III DOMAINS THAT TRANSFER RNA INTERFERENCE
EP1393720A1 (en) 2002-08-27 2004-03-03 Universiteit Utrecht Vesicle-encapsulated corticosteroids for treatment of cancer
PL216630B1 (pl) * 2002-10-17 2014-04-30 Genmab As Izolowane ludzkie przeciwciało monoklonalne wiążące ludzki CD20, związane z tym przeciwciałem transfektoma, komórka gospodarza, transgeniczne zwierzę lub roślina, kompozycja, immunokoniugat, cząsteczka bispecyficzna, wektor ekspresyjny, kompozycja farmaceutyczna, zastosowanie medyczne, zestaw oraz przeciwciało antyidiotypowe i jego zastosowanie
CA2505991C (en) * 2002-11-15 2018-02-27 Genmab A/S Human monoclonal antibodies against cd25
UA99933C2 (ru) * 2003-04-09 2012-10-25 Дженентек, Инк. Лечение аутоиммунных заболеваний у пациента с неадекватным ответом на ингибитор tnf-альфа
EP2216342B1 (en) * 2003-07-31 2015-04-22 Immunomedics, Inc. Anti-CD19 antibodies
CA2542840A1 (en) 2003-10-22 2005-05-12 University Of Rochester Anti-thymocyte antiserum and use thereof to trigger b cell apoptosis
KR101128777B1 (ko) 2003-11-04 2012-04-13 조마 테크놀로지 리미티드 다발성 골수종을 치료하기 위한 길항제 항-ｃｄ４０단클론성 항체의 용도
SG142330A1 (en) 2004-02-06 2008-05-28 Morphosys Ag De Anti-cd38 human antibodies and uses therefor
CA2555185C (en) * 2004-02-06 2020-03-24 Morphosys Ag Anti-cd38 human antibodies and uses therefor
WO2006125640A2 (en) 2005-05-24 2006-11-30 Morphosys Ag Generation and profiling of fully human hucal gold®-derived therapeutic antibodies specific for human cd38
US20050266008A1 (en) * 2004-03-29 2005-12-01 Medarex, Inc. Human anti-IRTA-5 antibodies
US20060019303A1 (en) * 2004-07-23 2006-01-26 Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals, Inc. Method to identify and analyze genes having modified expression in stimulated T cells
EA037929B1 (ru) * 2005-03-23 2021-06-08 Генмаб А/С Антитела к cd38 человека и их применение
CA2664740C (en) * 2006-09-26 2021-11-16 Genmab A/S Combination treatment of cd38-expressing tumors
US20090076249A1 (en) * 2007-09-19 2009-03-19 Michel De Weers Antibodies against CD38 for treatment of multiple myeloma
AU2015315396B2 (en) * 2014-09-09 2020-10-08 Janssen Biotech, Inc. Combination therapies with anti-CD38 antibodies
PE20171094A1 (es) * 2014-12-04 2017-08-07 Janssen Biotech Inc Anticuerpos anti-cd38 para el tratamiento de la leucemia linfoblastica aguda
CA2990406A1 (en) * 2015-06-22 2016-12-29 Janssen Biotech, Inc. Combination therapies for heme malignancies with anti-cd38 antibodies and survivin inhibitors
PE20181090A1 (es) * 2015-06-24 2018-07-09 Janssen Biotech Inc Modulacion y tratamiento inmunes de tumores solidos con anticuerpos que se unen especificamente a cd38

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
AUSIELLO S.M. ET AL.: "Functional topography of discrete domains of human CD38". TISSUE ANTIGENS. DEC 2000, vol. 56, no. 6, December 2000 (2000-12), pages 539-547, XP002389874, ISSN: 0001-2815, the whole document, especially table 1 *
DATABASE BIOSIS [Online]. BIOSCIENCES INFORMATION SERVICE, PHILADELPHIA, PA, US; November 2005 (2005-11), PEIPP MATTHIAS ET AL.: "Fully human CD38 antibodies efficiently trigger ADCC of multiple myeloma cell lines and primary tumor cells". XP002389878. Database accession no. PREV200600185745, abstract & BLOOD, vol. 106, no. 11, Part 1, November 2005 (2005-11), page 944A, 47TH ANNUAL MEETING OF THE AMERICAN-SOCIETY-OF-HEMATOLOGY; ATLANTA, GA, USA; DECEMBER 10-13, 2005, ISSN: 0006-4971 *
ELLIS JONATHAN H. ET AL.: "Engineered anti-CD38 monoclonal antibodies for immunotherapy of multiple myeloma". JOURNAL OF IMMUNOLOGY, THE WILLIAMS AND WILKINS CO. BALTIMORE, US, vol. 155, no. 2, 1995, pages 925-937, XP002146232, ISSN: 0022-1767, the whole document *
HOSHINO S. ET AL.: "Mapping of the catalytic and epitopic sites of human CD38/NAD+ glycohydrolase to a functional domain in the carboxyl terminus". JOURNAL OF IMMUNOLOGY (BALTIMORE, MD.: 1950) 15 JAN 1997, vol. 158, no. 2, 15 January 1997 (1997-01-15), pages 741-747, XP002389875, ISSN: 0022-1767, the whole document, especially figure 9 *

Cited By (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11713355B2 (en) 2014-02-28 2023-08-01 Janssen Biotech, Inc. Anti-CD38 antibodies for treatment of acute lymphoblastic leukemia
US10556961B2 (en) 2014-02-28 2020-02-11 Janssen Biotech, Inc. Anti-CD38 antibodies for treatment of acute lymphoblastic leukemia
US10800851B2 (en) 2014-02-28 2020-10-13 Janssen Biotech, Inc. Combination therapies with anti-CD38 antibodies
US10604580B2 (en) 2014-09-09 2020-03-31 Janssen Biotech, Inc. Combination therapies with anti-CD38 antibodies
US10793630B2 (en) 2014-12-04 2020-10-06 Janssen Biotech, Inc. Anti-CD38 antibodies for treatment of acute myeloid leukemia
US10766965B2 (en) 2015-05-20 2020-09-08 Janssen Biotech, Inc. Anti-CD38 antibodies for treatment of light chain amyloidosis and other CD38-positive hematological malignancies
US10668149B2 (en) 2015-06-22 2020-06-02 Janssen Biotech, Inc. Combination therapies for heme malignancies with anti-CD38 antibodies and survivin inhibitors
US11021543B2 (en) 2015-06-24 2021-06-01 Janssen Biotech, Inc. Immune modulation and treatment of solid tumors with antibodies that specifically bind CD38
US10781261B2 (en) 2015-11-03 2020-09-22 Janssen Biotech, Inc. Subcutaneous formulations of anti-CD38 antibodies and their uses
US11566079B2 (en) 2015-11-03 2023-01-31 Janssen Biotech, Inc. Subcutaneous formulations of anti-CD38 antibodies and their uses
US11708419B2 (en) 2015-11-03 2023-07-25 Janssen Biotech, Inc. Subcutaneous formulations of anti-CD38 antibodies and their uses
US11708420B2 (en) 2015-11-03 2023-07-25 Janssen Biotech, Inc. Subcutaneous formulations of anti-CD38 antibodies and their uses
US11732051B2 (en) 2015-11-03 2023-08-22 Janssen Biotech, Inc. Subcutaneous formulations of anti-CD38 antibodies and their uses
US11618787B2 (en) 2017-10-31 2023-04-04 Janssen Biotech, Inc. Methods of treating high risk multiple myeloma

Also Published As

Publication number Publication date
JP2014110800A (ja) 2014-06-19
EP2567976A3 (en) 2013-04-03
EP2535355A2 (en) 2012-12-19
HRP20161766T1 (hr) 2017-02-24
JP2020141689A (ja) 2020-09-10
NZ561883A (en) 2010-11-26
EA037929B1 (ru) 2021-06-08
JP2019146560A (ja) 2019-09-05
JP5971918B2 (ja) 2016-08-17
US20200283542A1 (en) 2020-09-10
KR101433381B1 (ko) 2014-10-02
JP5225069B2 (ja) 2013-07-03
JP2008533977A (ja) 2008-08-28
EP2551282A3 (en) 2013-02-13
HK1107826A1 (zh) 2008-04-18
US7829673B2 (en) 2010-11-09
JP6494053B2 (ja) 2019-04-03
AU2006226733B2 (en) 2012-12-06
NL300915I1 (ru) 2017-12-06
LUC00053I2 (fr) 2018-02-21
EP2535355A3 (en) 2013-02-20
IL304150A (en) 2023-09-01
JP2020028294A (ja) 2020-02-27
EP2567976B1 (en) 2017-07-19
AU2006226733A8 (en) 2013-01-10
EP3312196B1 (en) 2019-07-17
JP2012070737A (ja) 2012-04-12
NZ586780A (en) 2012-02-24
MX2007011064A (es) 2008-02-19
CN107033243A (zh) 2017-08-11
JP6578423B2 (ja) 2019-09-18
EP2567976A2 (en) 2013-03-13
US20090148449A1 (en) 2009-06-11
US20110099647A1 (en) 2011-04-28
ES2716874T3 (es) 2019-06-17
JP6777779B2 (ja) 2020-10-28
CN107033243B (zh) 2020-12-15
PL2567976T3 (pl) 2018-01-31
NL300915I2 (nl) 2020-10-26
US9187565B2 (en) 2015-11-17
JP2021121195A (ja) 2021-08-26
HRP20191768T1 (hr) 2019-12-27
AU2006226733B8 (en) 2013-01-10
LTC2567976I2 (lt) 2019-06-25
WO2006099875A1 (en) 2006-09-28
WO2006099875A8 (en) 2007-05-03
AU2006226733C1 (en) 2019-02-14
EP2551282A2 (en) 2013-01-30
EA200702053A1 (ru) 2008-02-28
JP2018080171A (ja) 2018-05-24
JP6952088B2 (ja) 2021-10-20
IL296666A (en) 2022-11-01
JP2016169226A (ja) 2016-09-23
LTPA2017040I1 (lt) 2018-01-10
IL284991A (en) 2021-08-31
SI2567976T1 (sl) 2017-11-30
US20160130362A1 (en) 2016-05-12
DK2567976T3 (en) 2017-10-23
EP1866338B1 (en) 2016-09-21
ME03528B (me) 2020-04-20
EA201100694A1 (ru) 2012-02-28
CA2602375C (en) 2018-07-24
CN101218256A (zh) 2008-07-09
KR20070116137A (ko) 2007-12-06
CY2017044I1 (el) 2018-09-05
JP2023017781A (ja) 2023-02-07
IL185751A (en) 2014-04-30
IL231919A0 (en) 2014-05-28
AU2006226733C9 (en) 2019-03-14
JP2019037228A (ja) 2019-03-14
IL231919B (en) 2020-02-27
EP3312196A1 (en) 2018-04-25
SG10201912554TA (en) 2020-02-27
IL185751A0 (en) 2008-01-06
IL272273A (en) 2020-02-27
CN112480257A (zh) 2021-03-12
CY1119454T1 (el) 2018-03-07
CY2017044I2 (el) 2018-09-05
CY1118369T1 (el) 2017-06-28
ZA200709003B (en) 2009-05-27
CA2602375A1 (en) 2006-09-28
EP1866338A1 (en) 2007-12-19
LUC00053I9 (fr) 2018-07-03
CN101218256B (zh) 2017-04-19
EP2535355B1 (en) 2019-01-02
EP3153525A1 (en) 2017-04-12
LUC00053I1 (ru) 2017-12-07
BRPI0608927A2 (pt) 2010-11-09
RS59399B1 (sr) 2019-11-29
AU2006226733A1 (en) 2006-09-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA015584B1 (ru) Антитело к cd38 человека и его применение
JP6665139B2 (ja) 新規ＶＩＳＴＡ−Ｉｇコンストラクト及び自己免疫、アレルギー性及び炎症性障害の処置のためのＶＩＳＴＡ−Ｉｇの使用
EP2892558B1 (en) Vista modulators for diagnosis and treatment of cancer
CN107810011A (zh) 使用抗ox40抗体治疗癌症的方法
US8524454B2 (en) Transcobalamin receptor polypeptides, nucleic acids, and modulators thereof, and related methods of use in modulating cell growth and treating cancer and cobalamin deficiency
TW201622746A (zh) 改善或加速髖部骨折術後身體復原之方法
EA020465B1 (ru) ИЗОЛИРОВАННЫЕ МОНОКЛОНАЛЬНЫЕ АНТИТЕЛА, КОТОРЫЕ СВЯЗЫВАЮТСЯ С ErbB3, НАБОРЫ И КОМПОЗИЦИИ, ИХ СОДЕРЖАЩИЕ, И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ
EA030777B1 (ru) Анти-альфа-синуклеинсвязывающие молекулы
EA016186B1 (ru) Человеческие моноклональные антитела к cd70 и их применение
US20220396627A1 (en) Anti-siglec-9 compositions and methods for modulating myeloid cell inflammatory phenotypes and uses thereof
KR20220115572A (ko) 항-b7-h3 단클론성 항체 및 이의 사용 방법
WO2020247371A1 (en) Anti-psgl-1 compositions and methods for modulating myeloid cell inflammatory phenotypes and uses thereof
CN114423452A (zh) 用于调节髓系细胞炎性表型的抗lrrc25组合物和方法及其用途
CA2476555A1 (en) Methods of therapy and diagnosis
AU2003213064B2 (en) Methods of therapy and diagnosis
UA116520C2 (uk) Антитіло проти cd38 для лікування множинної мієломи
BRPI0608927B1 (pt) Anticorpo que se liga a cd38 humano, vetor de expressão, célula hospedeira procariótica, imunoconjugado, molécula bi-específica ou multi-específica, composição farmacêutica, uso de um anticorpo, de um imunoconjugado, de uma composição farmacêutica e de um vetor de expressão, método in vitro para detectar a presença de antígeno de cd38, ou uma célula que expresse cd38, em uma amostra, e, kit

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ KZ KG MD TJ TM