CN106434683B

CN106434683B - 特异性针对人CD38的完全人HuCAL GOLD-衍生治疗抗体的生成和鉴定

Info

Publication number: CN106434683B
Application number: CN201510918061.0A
Authority: CN
Inventors: 迈克尔·特萨; 尤特·加格尔
Original assignee: Morphosys AG
Current assignee: Morphosys AG
Priority date: 2005-10-12
Filing date: 2006-10-12
Publication date: 2020-03-13
Anticipated expiration: 2026-10-12
Also published as: KR101512853B1; CN101287764A; US20120052078A1; PL2860192T3; US8088896B2; ZA200803208B; EP3284756B1; RU2425841C2; RS56677B1; US20210292431A1; JP5752667B2; HRP20171978T1; EP2860192A2; CN103554259B; HUE035250T2; EP3284756A1; BRPI0618399A2; US20190077877A1; CN101287764B; US11059902B2

Abstract

本发明提供了使用特异性针对CD38的重组抗原结合区和含有所述抗原结合区的抗体和功能性片段的新型抗体以及方法，CD38在各种病症或疾患中具有重要作用。这些方法利用了新发现的抗体和所述抗体惊人的性质，例如结合迷你猪来源CD38的能力和通过交联诱导特异性杀伤表达CD38的细胞的能力。这些抗体以及使用这些抗体的新方法可用以治疗例如血液恶性肿瘤，例如多发性骨髓瘤。

Description

特异性针对人CD38的完全人HuCAL GOLD-衍生治疗抗体的生成和鉴定

本申请是申请日为2006年10月12日，申请号为201310495574.6，发明名称为“特异性针对人CD38的完全人HuCAL GOLD-衍生治疗抗体的生成和鉴定”的申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及新抗体和使用抗体的方法。

背景技术

本领域中仍存在对新的抗体及其在治疗中应用的需求。

发明概述

本发明涉及特异性针对CD38的分离的抗原结合区，所述抗原结合区包含：(i)SEQID NO:16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,92,93,94,95,96,97,98,99,100,101,102,103,104,105或106中描述的H-CDR3区，或者(ii)与SEQ ID NO:16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,92,93,94,95,96,97,98,99,100,101,102,103,104,105或106中描述的H-CDR3区具有至少60％同一性的H-CDR3区。在一些实施方案中，所述特异性针对CD38的分离的抗原结合区还可包含：(i)SEQ ID NO:16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,92,93,94,95,96,97,98,99,100,101,102,103,104,105或106中描述的H-CDR2区，或者(ii)与SEQ ID NO:16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,92,93,94,95,96,97,98,99,100,101,102,103,104,105或106中描述的H-CDR2区具有至少60％同一性的H-CDR2区。

在一些实施方案中，所述特异性针对CD38的分离的抗原结合区还可包含：(i)SEQID NO:16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,92,93,94,95,96,97,98,99,100,101,102,103,104,105或106中描述的H-CDR1区，或者(ii)与SEQ ID NO:16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,92,93,94,95,96,97,98,99,100,101,102,103,104,105或106中描述的H-CDR1区具有至少60％同一性的H-CDR1区。

本发明还涉及特异性针对CD38的分离的抗体或其功能性片段，其包含：(i)SEQ IDNO:16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,92,93,94,95,96,97,98,99,100,101,102,103,104,105或106中描述的可变重链，或者(ii)与SEQ ID NO:16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,92,93,94,95,96,97,98,99,100,101,102,103,104,105或106中描述的可变重链具有至少60％同一性的可变重链。

另外，本发明涉及特异性针对CD38的分离的抗原结合区，所述抗原结合区包含：(i)SEQ ID NO:46,47,48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59,60,109或110中描述的L-CDR3区，或(ii)与SEQ ID NO:46,47,48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59,60,109或110中描述的L-CDR3区具有至少60％同一性的L-CDR3区。

在一些实施方案中，所述分离的抗原结合区还可包含：(i)SEQ ID NO:46,47,48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59,60,109或110中描述的L-CDR2区，或(ii)与SEQ IDNO:46,47,48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59,60,109或110中描述的L-CDR2区具有至少60％同一性的L-CDR2区。

在一些实施方案中，所述分离的抗原结合区还可包含：(i)SEQ ID NO:46,47,48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59,60,109或110中描述的L-CDR1区，或(ii)与SEQ IDNO:46,47,48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59,60,109或110中描述的L-CDR1区具有至少60％同一性的L-CDR1区。

在一些实施方案中，所述分离的抗原结合区可包含(i)SEQ ID NO:51或52中描述的L-CDR3区或(ii)与所述L-CDR3区具有至少60％同一性的L-CDR3区；并且其特异性针对人CD38和狨猴CD38。

在一些实施方案中，在所述分离的抗原结合区中，所述序列同一性可为至少80％。

而且，本发明涉及分离的抗体或其功能性片段，其包含(i)SEQ ID NO:46,47,48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59,60,109或110中描述的可变轻链，或(ii)与SEQ IDNO:46,47,48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59,60,109或110中描述的可变轻链具有至少60％同一性的可变轻链。

在一些实施方案中，所述分离的抗体或其功能性片段可以是IgG。

在一些实施方案中，所述分离的抗体或其功能性片段可以是IgG1。

本发明还涉及一种诊断组合物，其包含上述抗体或其功能性片段；和可接受的载体或赋形剂。

本发明又涉及一种分离的抗原结合区的可变重链，其由如下序列编码：(i)包含SEQ ID NO:1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,77,78,79,80,81,82,83,84,85,86,87,88,89,90或91的核酸序列，或(ii)与SEQ ID NO:1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,77,78,79,80,81,82,83,84,85,86,87,88,89,90或91的互补链在高严紧条件下杂交的核酸序列，其中所述抗原结合区特异性针对CD38。

在一些实施方案中，所述可变重链可由(i)包含SEQ ID NO:6或7的核酸序列或(ii)在高严紧性条件下与其互补链杂交的核酸序列所编码，其抗原结合区特异性针对人CD38和狨猴CD38。

本发明又涉及分离的抗原结合区的可变轻链，其由下述序列编码：(i)包含SEQ IDNO:31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,107或108的核酸序列，或者(ii)与SEQ ID NO:31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,107或108的互补链在高严紧条件下杂交的核酸序列，其中所述抗体或其功能性片段特异性针对CD38。

在一些实施方案中，所述可变轻链可由由(i)包含SEQ ID NO:36或37的核酸序列或(ii)在高严紧性条件下与其互补链杂交的核酸序列所编码，其抗原结合区特异性针对人CD38和狨猴CD38。

本发明又涉及编码特异性针对CD38的人抗体或其功能性片段的抗原结合区的分离的核酸序列。

本发明又涉及编码分离的抗原结合区的可变重链的核酸序列，所述核酸序列包含：(i)选自SEQ ID NO:1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,77,78,79,80,81,82,83,84,85,86,87,88,89,90和91的序列，或(ii)与SEQ ID NO:1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,77,78,79,80,81,82,83,84,85,86,87,88,89,90或91的互补链在高严紧条件下杂交的核酸序列，其中所述抗原结合区特异性针对CD38。

本发明又涉及编码分离的抗原结合区的可变轻链的核酸序列，所述核酸序列包含：(i)选自SEQ ID NO:31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,107和108的序列，或(ii)与SEQ ID NO:31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,107或108的互补链在高严紧条件下杂交的核酸序列，其中所述抗原结合区特异性针对CD38。

本发明还涉及包含上述核酸序列的载体。

本发明还涉及包含上述载体的分离的细胞。

在一些实施方案中，所述细胞可以是细菌细胞。

在一些实施方案中，所述细胞可以是哺乳动物细胞。

本发明还涉及一种药物组合物，其包含上述抗体或其功能性片段以及为此使用的药学可接受的载体或赋形剂。

本发明还涉及一种用于治疗与不希望的CD38+细胞存在相关联的病症或疾患的方法，该方法包括为需要其的患者施用有效量的上述药物组合物。

在一些实施方案中，所述病症或疾患可以是血液疾病。

在一些实施方案中，所述血液疾病可选自多发性骨髓瘤、慢性淋巴细胞性白血病、慢性骨髓性白血病、急性骨髓性白血病和急性淋巴细胞性白血病。

在一些实施方案中，所述病症或疾患可以是炎性疾病。

在一些实施方案中，所述炎性疾病可选自类风湿性关节炎和系统性红斑狼疮。

本发明进一步涉及诱导特异性杀伤表达CD38的肿瘤细胞的方法，其中所述特异性杀伤通过CD38交联而发生，所述方法包括在足量分离的人或人源化抗CD38抗体或其功能性片段存在下培养所述细胞的步骤，其中所述人或人源化抗CD38抗体包含：(i)编码SEQ IDNO:1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,77,78,79,80,81,82,83,84,85,86,87,88,89,90或91中描述的重链的核酸序列，或(ii)与SEQ ID NO:1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,77,78,79,80,81,82,83,84,85,86,87,88,89,90或91的互补链在高严紧条件下杂交的核酸序列，其中所述抗体或其功能性片段特异性针对CD38。

本发明又涉及诱导特异性杀伤表达CD38的肿瘤细胞的方法，其中所述特异性杀伤通过CD38交联而发生，所述方法包括在足量分离的人或人源化抗CD38抗体或其功能性片段存在下培养所述细胞的步骤，其中所述人或人源化抗CD38抗体包含：(i)编码SEQ ID NO:31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,107或108中描述的轻链的核酸序列，或(ii)与SEQ ID NO:31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,107或108的互补链在高严紧条件下杂交的核酸序列，其中所述抗体或其功能性片段特异性针对CD38。

本发明又涉及诱导特异性杀伤表达CD38的肿瘤细胞的方法，其中所述特异性杀伤通过CD38交联而发生，所述方法包括在足量分离的人或人源化抗CD38抗体或其功能性片段存在下培养所述细胞的步骤，其中所述人或人源化抗CD38抗体或其功能性片段包含：(i)SEQ ID NO:16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,92,93,94,95,96,97,98,99,100,101,102,103,104,105或106中描述的重链氨基酸序列，或(ii)与SEQ ID NO:16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,92,93,94,95,96,97,98,99,100,101,102,103,104,105或106中描述的可变重链具有至少60％同一性的可变重链。

本发明又涉及诱导特异性杀伤表达CD38的肿瘤细胞的方法，其中所述特异性杀伤通过CD38交联而发生，所述方法包括在足量分离的人或人源化抗CD38抗体或其功能性片段存在下培养所述细胞的步骤，其中所述人或人源化抗CD38抗体包含：(i)和/或SEQ ID NO:46,47,48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59,60,109或110中描述的轻链氨基酸序列，或(ii)与SEQ ID NO:46,47,48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59,60,109或110中描述的可变轻链具有至少60％同一性的可变轻链。

进一步地，本发明涉及检测通过CD38交联特异性杀伤表达CD38的肿瘤细胞的方法，所述方法包括如下步骤：

(i)为需要其的患者施用有效量的人或人源化抗CD38抗体或其功能性片段，和

(ii)检测所述人或人源化抗CD38抗体或其功能性片段的特异性杀伤活性。

在一些实施方案中，所述肿瘤细胞可以是人、迷你猪或兔来源的。

本发明又涉及检测迷你猪来源的组织或细胞中CD38存在的方法，所述方法包括如下步骤：

(i)使人或人源化抗CD38抗体或其功能性片段与所述CD38形成接触，和

(ii)检测所述人或人源化抗CD38抗体或其功能性片段与所述CD38迷你猪细胞的特异性结合，其中所述抗体或其功能性片段还能特异性结合人来源的CD38。

在一些实施方案中，所述迷你猪来源的CD38可包括在选自下述组的分离的细胞类型中：外周血液单核细胞、红细胞、淋巴细胞、胸腺细胞、肌肉细胞、小脑细胞、胰腺细胞、淋巴结细胞、扁桃体细胞、脾细胞、前列腺细胞、皮肤细胞和视网膜细胞。

在一些实施方案中，所述人或人源化抗CD38抗体或其功能性片段可包含：(i)编码SEQ ID NO:1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,77,78,79,80,81,82,83,84,85,86,87,88,89,90或91中描述的重链的核酸序列和/或编码SEQ ID NO:31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,107或108中描述的轻链的核酸序列，或者(ii)与SEQ ID NO:1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,77,78,79,80,81,82,83,84,85,86,87,88,89,90或91中描述的重链区具有至少60％同一性的序列和/或与SEQ ID NO:31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,107或108中描述的轻链区具有至少60％同一性的序列。进一步地，本发明涉及检测表达CD38的红细胞中CD38的方法，所述方法包括如下步骤：

(i)使人或人源化抗CD38抗体或其功能性片段与所述表达CD38的红细胞相接触，和

(ii)检测所述人或人源化抗CD38抗体或其功能性片段与所述表达CD38的红细胞的特异性结合，其中所述抗体或其功能性片段还能特异性结合来自不同于人红细胞的细胞或组织的人CD38。

在一些实施方案中，所述抗体或其功能性片段还能特异性结合来自人类淋巴细胞的人CD38。

在一些实施方案中，所述人或人源化抗CD38抗体或其功能性片段可包含：(i)编码SEQ ID NO:1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,77,78,79,80,81,82,83,84,85,86,87,88,89,90或91中描述的重链的核酸序列和/或编码SEQ ID NO:31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,107或108中描述的轻链的核酸序列，或者(ii)与SEQ ID NO:1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,77,78,79,80,81,82,83,84,85,86,87,88,89,90或91中描述的重链区具有至少60％同一性的序列和与SEQ ID NO:31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,107或108中描述的轻链区具有至少60％同一性的序列。

在一些实施方案中，所述人或人源化抗CD38抗体或其功能性片段可包含：(i)SEQID NO:16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,92,93,94,95,96,97,98,99,100,101,102,103,104,105或106中描述的重链氨基酸序列，和/或SEQ ID NO:46,47,48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59,60,109或110中描述的轻链氨基酸序列；或(ii)与SEQ ID NO:16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,92,93,94,95,96,97,98,99,100,101,102,103,104,105或106中描述的重链区具有至少60％同一性的序列，和与SEQID NO:46,47,48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59,60,109或110中描述的轻链区具有至少60％同一性的序列。

本发明又涉及根据本发明的分离的抗体或其功能性片段，其包含：(i)SEQ ID NO:21或22中描述的H-CDR3区，或(ii)与所述H-CDR3区具有至少60％同一性的H-CDR3区；并且其特异性针对人CD38和狨猴CD38。

附图简述

图1a提供了用于本发明的各种抗体重链可变区的核酸序列。

图1b提供了用于本发明的各种抗体重链可变区的氨基酸序列。CDR区HCDR1、HCDR2和HCDR3从N端至C端加粗显示。

图2a提供了用于本发明的各种抗体轻链可变区的核酸序列。

图2b提供了用于本发明的各种抗体轻链可变区的氨基酸序列。CDR区LCDR1、LCDR2和LCDR3从N端至C端加粗显示。

图3提供了各种基于共有的HuCAL抗体主基因序列的重链可变区的氨基酸序列。CDR区HCDR1、HCDR2和HCDR3从N端至C端加粗显示。

图4提供了各种基于共有的HuCAL抗体主基因序列的轻链可变区的氨基酸序列。CDR区LCDR1、LCDR2和LCDR3从N端至C端加粗显示。

图5提供了CD38(SWISS-PROT原始登录号P28907)的氨基酸序列。

图6提供了嵌合OKT10的重链和轻链的核苷酸序列。

图7提供了

_h_IgG1_1(bp 601-2100)(SEQ ID NO:74)的DNA序列：该载体是基于pcDNA3.1+载体(Invitrogen)。VH-填充序列的氨基酸序列加粗显示，而VH-前导序列和恒定区基因的最终阅读框非加粗打印。在所述序列上方指出限制位点。测序引物的引发位点加下划线。

图8提供了Igκ轻链表达载体

_h_Igκ_1(bp 601-1400)(SEQ ID NO:75)的DNA序列：该载体基于pcDNA3.1+载体(Invitrogen)。Vκ-填充序列的氨基酸序列加粗显示，而Vκ-前导序列和恒定区基因的最终阅读框非加粗打印。在所述序列上方指出限制位点。测序引物的引发位点加下划线。

图9提供了HuCAL Igλ轻链载体

_h_Igλ_1(bp 601-1400)(SEQ ID NO:76)的DNA序列：Vλ-填充序列的氨基酸序列加粗显示，而Vλ-前导序列和恒定区基因的最终阅读框非加粗打印。在所述序列上方指出限制位点。测序引物的引发位点加下划线。

图10提供了用于本发明的Fab/IgG样式(format)中重链和轻链的不同组合。

图11提供了通过FACS获得的淋巴细胞和红细胞的CD38表达分析。PBMC和红细胞通过密度梯度离心从短尾猴、猕猴和狨猴的全血分离，随后使用抗CD38 Fab抗体MOR03087(A,直方图右侧,淡色箭头)和MOR03088(B,直方图右侧；淡色箭头)进行FACS分析。使用不相关的Fab-抗体(A&B,直方图左侧；黑色箭头)作为阴性对照。

图12提供了通过FACS获得的淋巴细胞和红细胞的CD38表达分析。PBMC和红细胞通过密度梯度离心从人、短尾猴和狨猴的全血分离，随后使用抗CD38 IgG1 MOR03087(直方图右侧；白色箭头)进行FACS分析。使用不相关的IgG1对照抗体(A&B,直方图左侧；黑色箭头)作为阴性对照。

图13提供了不同抗CD38抗体的交叉反应性对比概况。

图14(a)和14(b)描绘了用于本发明的某些抗体的CDR区和FR区，并比较了彼此和相应共有序列的给定位置的氨基酸。

发明详述

本发明基于发现了新抗体和使用抗体的方法，所述抗体对CD38具有特异性或高亲和力，并能够为患者带来治疗益处。可以是人的或人源化的所述抗体可用于本文更全面描述的许多情况中。用于本发明的适当抗体公开于US 60/614,471，其通过引用结合入本文。

“人”抗体或功能性人抗体片段在这里定义为不是嵌合的(例如，非“人源化的”)且不是全部或部分来自非人类物种。人抗体或功能性抗体片段可源自人，或者可以是合成的人抗体。“合成的人抗体”在本文定义为序列全部或部分电子(in silico)衍生自合成序列的抗体，所述合成序列基于已知的人抗体序列分析。可以实现人抗体序列或其片段的电子设计，例如，通过分析人抗体或抗体片段序列的数据库并利用从中获得的数据来设计多肽序列。人抗体或功能性抗体片段的另一实例是从人源抗体序列库(即，基于取自人固有来源的抗体的文库)分离的核酸所编码的人抗体或功能性抗体片段。

“人源化抗体”或功能性人源化抗体片段在本文定义为：(i)衍生自非人类来源(例如，具有异源免疫系统的转基因小鼠)的，其抗体基于人种系序列；或者(ii)嵌合的，其中可变区衍生自非人类来源，而恒定区衍生自人类来源；或者(iii)CDR移植的，其中可变区的CDR来自非人类来源，而可变区的一个或多个构架是人类来源的，并且恒定区(如果有)是人类来源的。

如本文所使用的，抗体“特异性结合”是“特异性针对”或“特异性识别”抗原(这里指CD38)，假设这种抗体能够区别所述抗原和一种或多种参考抗原，因为结合特异性不是绝对而是相对的性质。最普遍形式(当没有提及确定的参考时)的“特异性结合”是指抗体区别目标抗原和无关抗原的能力，例如根据下述方法之一所测定的。所述方法包括但不限于Western印迹、ELISA检测、RIA检测、ECL检测、IRMA检测、FACS、IHC和肽扫描。例如，可以进行标准的ELISA测定。可以通过标准显色(例如，带有辣根过氧化物的第二抗体和带有过氧化氢的四甲基联苯胺)进行评分。某些孔中的反应通过例如在450nm的光密度评分。典型背景(＝阴性反应)可以是0.1OD；典型的阳性反应可以是1OD。这表示阳性/阴性差异可以大于10倍。通常，结合特异性的测定使用的不是单个参考抗原，而是约3至5个无关的一组抗原，例如奶粉、BSA、转铁蛋白等。抗体有可能“特异性针对”2种或更多种细胞/组织和/或2个或更多物种的抗原，条件是例如所述抗体满足所述细胞/组织和物种中每一种的结合标准。因此，抗体可以特异性结合各种细胞类型和/或组织(例如，红细胞、从外周血液分离的淋巴细胞、脾或淋巴结)上的靶抗原CD38。另外，抗体还可以特异性针对一个物种的CD38和另一物种的CD38。

“特异性结合”还可以指抗体区别靶抗原和作为参考点的一种或多种密切相关抗原的能力，例如区别CD38和CD157的能力。另外，“特异性结合”可以涉及抗体区别其靶抗原不同部分(例如CD38的不同结构域或区域，例如CD38的N端或C端区域中的表位)的能力，或者区别CD38的氨基酸残基的一个或多个关键氨基酸残基或氨基酸残基序列(stretch)。

而且，如本文所使用的“免疫球蛋白”(Ig)在本文定义为属于IgG、IgM、IgE、IgA或IgD类(或其任何亚类)的蛋白质，并且包括所有常规已知的抗体和其功能性片段。抗体/免疫球蛋白的“功能性片段”在本文定义为保留了抗原结合区的抗体/免疫球蛋白的片段(例如，IgG的可变区)。抗体的“抗原结合区”通常位于抗体的一个或多个超变区，即CDR-1、-2和/或-3区；但是，可变的“框架”区也能在抗原结合中起重要作用，例如为CDR提供支架。优选地，“抗原结合区”至少包含可变轻(VL)链的氨基酸残基4至103以及可变重(VH)链的5至109，更优选VL的氨基酸残基3至107以及VH的4至111，特别优选的是完整的VL和VH链(VL的氨基酸位置1至109和VH的1至113；根据WO 97/08320编号)。用于本发明的优选的免疫球蛋白类别是IgG。本发明的“功能性片段”包括F(ab')₂片段、Fab片段和scFv的结构域。F(ab')₂或Fab可以设计为最小化或完全除去发生在C_H1和C_L结构域之间的分子间二硫化物相互作用。

本发明使用的术语“亲本结合剂”指未经历优化过程的任何结合剂。优化过程在本说明书其他地方描述。

本发明使用的术语“结合剂”可以与术语“免疫球蛋白”或“抗体”同义的方式使用。

用于本发明的抗体可以衍生自基于氨基酸序列的重组抗体库，所述氨基酸序列经电子设计并由合成产生的核酸编码。例如，通过分析人类序列数据库并使用从中获得的数据设计多肽序列来实现抗体序列的电子设计。用于设计和获得电子生成序列的方法描述于例如Knappik等,J.Mol.Biol.(2000)296:57；Krebs等,J.Immunol.Methods.(2001)254:67；和授予Knappik等的美国专利6,300,064号，其通过引用整体结合入本文。

用于本发明的抗体

整个该文件中，提到了下述用于本发明的代表性抗体："抗体号"或"LACS"或"MOR"3076或03076,3078或03078,3081或03081,3085或03085,3086或03086,3087或03087,3088或03088,3089或03089,3101或03101,3102或03102,3127或03127,3128或03128,3129或03129,3130或03130,3131或03131,6183或06183,6184或06184,6185或06185,6186或06186,6187或06187,6188或06188,6189或06189,6190或06190,6192或06192,6195或06195,6197或06197,6200或06200,6201或06201,6204或06204,6214或06214,6278或06278,6279或06279。LAC 3076表示具有对应于SEQ ID NO:1(DNA)/SEQ ID NO:16(蛋白质)的重链可变区和对应于SEQ ID NO:31(DNA)/SEQ ID NO:46(蛋白质)的轻链可变区的抗体。LAC 3078代表具有对应于SEQ ID NO:2(DNA)/SEQ ID NO:17(蛋白质)的重链可变区和对应于SEQ ID NO:32(DNA)/SEQ ID NO:47(蛋白质)的轻链可变区的抗体。LAC 3081代表具有对应于SEQ ID NO:3(DNA)/SEQ ID NO:18(蛋白质)的重链可变区和对应于SEQ ID NO:33(DNA)/SEQ ID NO:48(蛋白质)的轻链可变区的抗体。LAC 3085代表具有对应于SEQ ID NO:4(DNA)/SEQ ID NO:19(蛋白质)的重链可变区和对应于SEQ ID NO:34(DNA)/SEQ ID NO:49(蛋白质)的轻链可变区的抗体。LAC 3086代表具有对应于SEQ ID NO:5(DNA)/SEQ ID NO:20(蛋白质)的重链可变区和对应于SEQ ID NO:35(DNA)/SEQ ID NO:50(蛋白质)的轻链可变区的抗体。LAC 3087代表具有对应于SEQ ID NO:6(DNA)/SEQ ID NO:21(蛋白质)的重链可变区和对应于SEQ ID NO:36(DNA)/SEQ ID NO:51(蛋白质)的轻链可变区的抗体。LAC3088代表具有对应于SEQ ID NO:7(DNA)/SEQ ID NO:22(蛋白质)的重链可变区和对应于SEQ ID NO:37(DNA)/SEQ ID NO:52(蛋白质)的轻链可变区的抗体。LAC 3089代表具有对应于SEQ ID NO:8(DNA)/SEQ ID NO:23(蛋白质)的重链可变区和对应于SEQ ID NO:38(DNA)/SEQ ID NO:53(蛋白质)的轻链可变区的抗体。LAC 3101代表具有对应于SEQ ID NO:9(DNA)/SEQ ID NO:24(蛋白质)的重链可变区和对应于SEQ ID NO:39(DNA)/SEQ ID NO:54(蛋白质)的轻链可变区的抗体。LAC 3102代表具有对应于SEQ ID NO:10(DNA)/SEQ ID NO:25(蛋白质)的重链可变区和对应于SEQ ID NO:40(DNA)/SEQ ID NO:55(蛋白质)的轻链可变区的抗体。LAC 3127代表具有对应于SEQ ID NO:11(DNA)/SEQ ID NO:26(蛋白质)的重链可变区和对应于SEQ ID NO:41(DNA)/SEQ ID NO:56(蛋白质)的轻链可变区的抗体。LAC3128代表具有对应于SEQ ID NO:12(DNA)/SEQ ID NO:27(蛋白质)的重链可变区和对应于SEQ ID NO:42(DNA)/SEQ ID NO:57(蛋白质)的轻链可变区的抗体。LAC 3129代表具有对应于SEQ ID NO:13(DNA)/SEQ ID NO:28(蛋白质)的重链可变区和对应于SEQ ID NO:43(DNA)/SEQ ID NO:58(蛋白质)的轻链可变区的抗体。LAC 3130代表具有对应于SEQ ID NO:14(DNA)/SEQ ID NO:29(蛋白质)的重链可变区和对应于SEQ ID NO:44(DNA)/SEQ ID NO:59(蛋白质)的轻链可变区的抗体。LAC 3131代表具有对应于SEQ ID NO:15(DNA)/SEQ IDNO:30(蛋白质)的重链可变区和对应于SEQ ID NO:45(DNA)/SEQ ID NO:60(蛋白质)的轻链可变区的抗体。进一步地，衍生自亲本结合剂MOR03087和MOR03088的优化克隆包括：MOR06183代表具有对应于SEQ ID NO:77(DNA)/SEQ ID NO:92(蛋白质)的重链可变区的抗体。MOR06184代表具有对应于SEQ ID NO:78(DNA)/SEQ ID NO:93(蛋白质)的重链可变区的抗体。MOR06185代表具有对应于SEQ ID NO:79(DNA)/SEQ ID NO:94(蛋白质)的重链可变区的抗体。MOR06186代表具有对应于SEQ ID NO:80(DNA)/SEQ ID NO:95(蛋白质)的重链可变区的抗体。MOR06187代表具有对应于SEQ ID NO:81(DNA)/SEQ ID NO:96(蛋白质)的重链可变区的抗体。MOR06188代表具有对应于SEQ ID NO:82(DNA)/SEQ ID NO:97(蛋白质)的重链可变区的抗体。MOR06189代表具有对应于SEQ ID NO:83(DNA)/SEQ ID NO:98(蛋白质)的重链可变区的抗体。MOR06190代表具有对应于SEQ ID NO:84(DNA)/SEQ ID NO:99(蛋白质)的重链可变区的抗体。MOR06192代表具有对应于SEQ ID NO:85(DNA)/SEQ ID NO:100(蛋白质)的重链可变区的抗体。MOR06195代表具有对应于SEQ ID NO:86(DNA)/SEQ ID NO:101(蛋白质)的重链可变区的抗体。MOR06197代表具有对应于SEQ ID NO:87(DNA)/SEQ ID NO:102(蛋白质)的重链可变区的抗体。MOR06200代表具有对应于SEQ ID NO:88(DNA)/SEQ IDNO:103(蛋白质)的重链可变区的抗体。MOR06201代表具有对应于SEQ ID NO:89(DNA)/SEQID NO:104(蛋白质)的重链可变区的抗体。MOR 06204代表具有对应于SEQ ID NO:90(DNA)/SEQ ID NO:105(蛋白质)的重链可变区的抗体。MOR06214代表具有对应于SEQ ID NO:91(DNA)/SEQ ID NO:106(蛋白质)的重链可变区的抗体。MOR06278代表具有对应于SEQ IDNO:107(DNA)/SEQ ID NO:109(蛋白质)的轻链可变区的抗体。MOR 06279代表具有对应于SEQ ID NO:108(DNA)/SEQ ID NO:110(蛋白质)的轻链可变区的抗体。

本发明的抗体特征在于Fab和/或IgG样式，并包括优化结合剂和亲本结合剂的轻链和重链的各种组合。图10显示了可用于本发明的几种非限制性组合。

一方面，本发明提供了使用具有抗原结合区的抗体的方法，所述抗原结合区能够特异性结合CD38的一个或多个区域，或者对CD38的一个或多个区域具有高亲和力，所述CD38的氨基酸序列描述为SEQ ID NO:71。据说，如果抗体的亲和力测量值为至少100nM(Fab片段的单价亲和力)，则该抗体具有对抗原的“高亲和力”。用于本发明的抗体或抗原结合区优选能以约小于600nM的亲和力与CD38结合。优选地，用于本发明的抗体或抗原结合区能以约小于100nM的亲和力与CD38结合，更优选小于约60nM，更优选小于约30nM。更优选的是使用以小于约10nM、更优选小于约3nM的亲和力与CD38结合的抗体。例如，用于本发明的抗体对CD38的亲和力可以是约10.0nM或2.4nM(Fab片段的单价亲和力)。

表1总结了代表性抗体的亲和力，通过表面等离子体共振(Biacore)和FACSScatchard分析测定：

表1：抗体亲和力

^a:Fab样式；对人类CD38Fc融合aa 45-300的分析

^b:IgG1样式；Raji细胞分析

^c:标准偏差(n＝3)

^d:标准偏差(n＝4)

参考表1，LACs亲和力的测量通过对人类CD38Fc融合的表面等离子体共振(Biacore)和使用表达CD38的人类Raji细胞系的流式细胞计量术进行。Biacore研究直接在固定抗原(CD38-Fc融合蛋白)上进行。Fab样式的LACs对固定CD38-Fc融合蛋白表现出范围约30nM至596nM的单价亲和力。

IgG1样式用于基于细胞的亲和力测定(FACS Scatchard)。表1右栏指示了该样式的LACS的结合强度。

用于本发明的优选抗体的另一优选特征是其对CD38的N端区的特异性。例如，本发明LACs可以特异性结合CD38的N端区。

本发明优化抗体的进一步特征如表2和3所示。提供了通过表面等离子体共振(Biacore)和FACS Scatchard分析测定的亲和力概况。另外，还确定了对人类红细胞的FACS结合以及对CD38Fc融合蛋白的ELISA结合研究。鉴定表明，与亲本克隆相比较，几种优化结合剂显示了减弱的对人类红细胞的结合以及更高的ELISA信号。另外，FACS Scatchards和亲和力测定所显示，MOR03088衍生物具有提高的亲和力。

表2：亲和力成熟克隆的总体表征：

^a:Fab样式

^b:IgG样式

^c:人类效应细胞&RPMI8226靶细胞(E:T比＝30:1)

+:以ADCC杀伤RPMI8226细胞

n.d.:未测定

*:不同的实验

表3：FACS Scatchard、ADCC和CDC中的EC₅₀

^a:单次测量

^b:两次测量平均

用于本发明的抗体所结合的表位类型可以是线性的(即，一个连续的氨基酸序列)或构象的(即，多个氨基酸序列)。为了测定特定抗体的表位是线性的还是构象的，技术人员可以分析抗体与覆盖不同的CD38区域的重叠肽(例如，具有11个氨基酸重叠的13-mer肽)的结合。LACS可以识别CD38的N端区中不连续或线性的表位。结合本文提供的知识，本领域技术人员会知道如何使用一个或多个分离的CD38表位，来生成具有特异性针对所述表位的抗原结合区的抗体(例如使用CD38的表位的合成肽或者表达CD38表位的细胞)。

用于本发明的抗体优选是与人类和至少一种其他非人类物种具有物种交叉反应性的。非人类物种可以是非人类的灵长类，例如猕猴、狒狒和/或短尾猴。其他非人类物种可以是迷你猪、兔、小鼠、大鼠和/或仓鼠。与至少一种除人类外的其他物种具有交叉反应性的抗体可以提供比已知抗CD38抗体更大的灵活性和益处，用于在多个物种中对相同抗体进行体内研究。例如，与迷你猪和/或兔具有交叉反应性的抗体可以是毒理学和安全性研究的候选物。

优选地，用于本发明的抗体不仅能够结合CD38，而且能够介导杀伤表达CD38的细胞。更具体地，用于本发明的抗体能够通过抗体-效应子功能清除CD38阳性(例如，恶性)细胞，从而介导其治疗作用。这些功能包括抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和补体依赖性细胞毒性(CDC)。

但是，CD38表达不仅存在于骨髓(例如，单核细胞、粒细胞)和淋巴谱系(例如，活化的B细胞和T细胞；浆细胞)中的免疫细胞，而且存在于各自的前体细胞。因为关键是这些细胞不受抗体介导杀伤恶性细胞的影响，所以本发明抗体优选对前体细胞没有细胞毒性。

除了作为环状ADP核糖环化酶和水解酶的催化活性外，CD38还具有转导生物相关信号的能力(Hoshino等,1997；Ausiello等,2000)。这些功能可以在体内诱导，例如，通过受体-配体相互作用或者通过与激发型抗CD38抗体的交联，导致例如钙动员、淋巴细胞增殖和细胞因子释放。优选地，本发明抗体是非激发型抗体。

肽变体

用于本发明的抗体不限于本文提供的特定肽序列。进一步地，本发明还实现了这些多肽的变体的使用。参考本发明和常规可用的技术和参考文献，技术人员能够制备、测试和使用本文公开的抗体的功能性变体，同时理解，具有介导杀伤CD38+靶细胞的能力的变体落入本发明范围内。这里使用的“介导杀伤CD38+靶细胞的能力”指用于本发明的抗CD38抗体的功能性特征。因此，介导杀伤CD38+靶细胞的能力包括例如通过ADCC和/或CDC，或者通过与用于本发明的抗体轭合的毒性构建体来介导杀伤CD38+靶细胞的能力。

例如，变体可以包括具有至少一个改变的互补决定区(CDR)(超变)和/或框架(FR)(可变)结构域/位置，相对于(vis-à-vis)本文公开的肽序列的抗体。为更好地描述这个概念，下面简要描述了抗体结构。

抗体的组成为两条肽链，每条肽链含有一个(轻链)或三个(重链)恒定区和一个可变区(VL,VH)，每个可变区组成为四个FR区和三个间隔的CDR。抗原结合位点由一个或多个CDR形成，而FR区为CDR提供了结构框架并因此在抗原结合中起重要作用。通过改变CDR或FR区中一个或多个氨基酸残基，技术人员通常可产生突变或多变的抗体序列，从中可根据抗原筛选例如具有新性质或改良性质的抗体序列。

图14a(VH)和14b(VL)描绘了用于本发明的某些抗体的CDR区和FR区，并彼此以及与相应的共有或“主基因”序列比较了给定位置的氨基酸(如美国专利6,300,064号所描述的)。

技术人员能够设计肽变体，其用途落入本发明范围内。优选的是，通过改变一个或多个CDR区的氨基酸来构建变体；变体还可以具有一个或多个改变的框架区。也可以在框架区内作出改变。例如，可以改变肽FR区，此时与种系序列相比较存在残基差异。

进一步地，可以使用一个LAC作为起始点来获得变体以实现优化，通过改变LAC中一个或多个氨基酸残基、优选一个或多个CDR中的氨基酸残基，并从得到的抗体变体混合物筛选具有改良性质的变体。特别优选的是改变VL的CDR-3、VH的CDR-3、VL的CDR-1和/或VH的CDR-2中一个或多个氨基酸残基。可以通过合成DNA分子混合物来进行改变，使用三核苷酸诱变(TRIM)技术(

B.,Ge,L.,Plückthun,A.,Schneider,K.C.,Wellnhofer,G.,和Moroney S.E.(1994)Trinucleotide phosphoramidites:ideal reagents for thesynthesis of mixed oligonucleotides for random mutagenesis(三核苷酸亚磷酰胺：用于合成混合的寡核苷酸以随机诱变的理想试剂)Nucl.Acids Res.22,5600)。

保守氨基酸变体

多肽变体可以制成保留本文描述的抗体肽序列的整体分子结构。基于单个氨基酸的性质，本领域技术人员将理解一些合理的置换。可以例如根据有关残基的极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性和/或两性性质做出氨基酸置换，即“保守置换”。

例如，(a)非极性(疏水)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸；(b)极性中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺；(c)带正电的(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸；(d)带负电的(酸性)氨基酸包括天冬氨酸、谷氨酸。置换通常发生在组(a)-(d)中。另外，甘氨酸和脯氨酸可以根据其破坏α-螺旋的能力而相互置换。类似地，某些氨基酸，例如丙氨酸、半胱氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、组氨酸和赖氨酸，更常见于α-螺旋，而缬氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸和苏氨酸更常见于β-折叠片。甘氨酸、丝氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺和脯氨酸常见于转角。一些优选的置换可以发生在下述组中：(i)S 和T；(ii)P和G；和(iii)A、V、L和I。基于已知的遗传密码和重组及合成DNA技术，技术人员可以容易构建编码保守氨基酸变体的DNA。在一个特定实施例中，SEQ ID NO:5,6,7,和/或8的3位氨基酸可以从Q变为E。

如本文使用的，两个多肽序列之间的“序列同一性”表示序列间相同的氨基酸的百分比。“序列相似性”表示相同或者代表保守氨基酸置换的氨基酸的百分比。本发明优选的多肽序列的CDR区的序列同一性为至少60％，更优选至少70％或80％，更优选至少90％，最优选至少95％。而且优选抗体的CDR区的序列相似性为至少80％，更优选90％，最优选95％。本发明优选多肽序列的可变区序列同一性为至少60％，更优选至少70％或80％，更优选至少90％，最优选至少95％。而且优选抗体的可变区序列相似性为至少80％，更优选90％，最优选95％。

本发明的DNA分子

本发明还涉及编码用于本发明的抗体的DNA分子的用途。这些序列包括但不限于图1a和2a所列的那些DNA分子。

本发明的DNA分子不限于本文公开的序列，而是还包括其变体。本发明的DNA变体可以参考其在杂交中的物理性质来描述。技术人员将理解，使用核酸杂交技术，DNA可用来鉴定其互补体(因为DNA是双链结构)、其等同物或同系物。还理解，杂交可以以小于100％互补性发生。但是，基于适当的条件选择，可以根据DNA序列与特定探针的结构亲缘关系，使用杂交技术来区别所述DNA序列。有关所述条件的指导，参见Sambrook等,1989(Sambrook,J.,Fritsch,E.F.和Maniatis,T.(1989)Molecular Cloning:A laboratory manual,ColdSpring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,USA)以及Ausubel等,1995(Ausubel,F.M.,Brent,R.,Kingston,R.E.,Moore,D.D.,Sedman,J.G.,Smith,J.A.,&Struhl,K.eds.(1995).Current Protocols in Molecular Biology.New York:JohnWiley和Sons)。

两个多核苷酸序列之间的结构相似性可以表示为这两个序列能相互杂交的条件下的“严紧性”的函数。本文使用的术语“严紧性”指不利于杂交的条件的程度。严紧的条件非常不利于杂交，因此只有结构上最相关的分子在这种条件下相互杂交。相反，非严紧的条件有利于结构亲缘关系较远的分子的杂交。因此，杂交严紧性与两个核酸序列的结构关系直接相关。下述关系式用于联系杂交和亲缘性(其中T_m是核酸双链体的解链温度)：

a.T_m＝69.3+0.41(G+C)％

b.错配碱基对的数目每增加1％，则双链DNA的T_m下降1℃。

c.(T_m)_μ2-(T_m)_μ1＝18.5log₁₀μ2/μ1，其中μ1和μ2是两种溶液的离子强度。

杂交严紧性是许多因素的函数，所述因素包括DNA总浓度、离子强度、温度、探针大小和破坏氢键的物质的存在。促进杂交的因素包括高DNA浓度、高离子强度、低温、更长的探针和不存在破坏氢键的物质。杂交通常以两个阶段进行：“结合”阶段和“洗涤”阶段。

首先，在结合阶段，探针在有利于杂交的条件下与靶结合。通常在该阶段通过改变温度来控制严紧性。为了高严紧性，温度通常为65℃至70℃，除非使用短的(<20nt)寡核苷酸探针。代表性的杂交溶液包含6X SSC、0.5％SDS、5X Denhardt's溶液和100μg非特异性载体DNA。参见Ausubel等，section 2.9,supplement 27(1994)。当然，已知许多不同但功能等价的缓冲液条件。当亲缘关系较低时，可以选择较低的温度。低严紧性结合温度为约25℃至40℃。中等严紧性为至少约40℃到小于约65℃。高严紧性为至少约65℃。

然后，通过洗涤除去过量探针。在该阶段，通常使用更严紧的条件。因此，该“洗涤”阶段在通过杂交确定亲缘关系中是最重要的。洗涤溶液通常含有较低的盐浓度。一种示例性中等严紧性溶液含有2X SSC和0.1％SDS。高严紧性洗涤溶液含有小于约0.2X SSC的等价物(在离子强度上等价)，且优选的严紧溶液含有约0.1X SSC。与各种严紧性相关的温度与上述“结合”的温度相同。而且洗涤溶液通常在洗涤过程中更换数次。例如，通常的高严紧性洗涤条件包括在55℃洗涤两次持续30分钟和在60℃洗涤3次持续15分钟。

因此，本发明包括与图1a和2a所列分子在高严紧性结合和洗涤条件下杂交的核酸分子的用途，其中所述核酸分子编码如本文使用的抗体或其功能性片段。优选的分子(就mRNA而言)是与本文描述的DNA分子之一具有至少75％或80％(优选至少85％，更优选至少90％，最优选至少95％)的同源性或序列同一性的那些。

功能等价变体

另一类DNA变体可参考它们的编码产物(见图1b和2b所列的肽)来描述，所述DNA变体的用途在本发明范围内。这些功能等价基因特征为，由于遗传密码的简并，它们编码与图1b和2b中相同的肽序列。

已知本文提供的DNA分子的变体能够以几种不同的方式构建。例如，它们可以构建为完全合成的DNA。有效合成范围为20至约150个核苷酸的寡核苷酸的方法是普遍可用的。参见Ausubel等,section 2.11,Supplement21(1993)。重叠的寡核苷酸可以以Khorana等,J.Mol.Biol.72:209-217(1971)首次报道的方式合成并组装；还参见Ausubel等,同上,Section 8.2。合成的DNA优选设计为具有设置在基因5'端和3'端的常规的限制位点，以利于克隆至适当的载体。

如表明的，生成变体的方法开始于本文公开的DNA之一，然后进行定向位点诱变。参见Ausubel等,同上,chapter 8,Supplement 37(1997)。在一种通常方法中，靶DNA被克隆入单链DNA噬菌体载体。单链DNA经分离后与含有所需核苷酸改变的寡核苷酸杂交。合成互补链并将双链噬菌体导入宿主。得到的一些子代将含有需要的突变体，所述突变体可以使用DNA测序进行确认。另外，各种方法可用于提高子代噬菌体为所需突变体的可能性。这些方法对于本领域技术人员而言是公知的，并且可商业途径获得用于产生这种噬菌体的试剂盒。

重组DNA构建体和表达

本发明进一步提供了含有一种或多种本发明核苷酸序列的重组DNA构建体的用途。所述重组构建体用于连接载体，例如质粒或病毒载体，其中插入编码用于本发明的抗体的DNA分子。

编码基因可以通过Sambrook等,1989和Ausubel等,1989描述的技术生成。或者，DNA序列可以使用例如合成仪化学合成。参见，例如OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS(1984,Gait,ed.,IRL Press,Oxford)中描述的技术，其通过引用整体结合入本文。本发明的重组构建体包含能够表达编码DNA的RNA和/或蛋白质产物的表达载体。所述载体可以进一步包含调控序列，包括可操作连接至开放阅读框(ORF)的启动子。所述载体可以进一步包含选择性标记序列。还可能需要特定的起始和细菌分泌信号，以有效翻译被插入的编码序列的靶基因。

本发明进一步提供了含有至少一种本文公开的DNA的宿主细胞的用途。所述宿主细胞可以实际为可应用表达载体的任何细胞。例如，它可以是高级真核宿主细胞(例如哺乳动物细胞)、低级真核宿主细胞(例如酵母细胞)，但优选是原核细胞，例如细菌细胞。重组构建体至宿主细胞的引入可以通过磷酸钙转染、DEAE、右旋糖介导的转染、电穿孔或噬菌体感染来实现。

细菌表达

细菌使用的有效表达载体如下构建：在带有功能性启动子的可操作阅读框中插入编码所需蛋白质的结构性DNA序列以及适当的翻译起始和终止信号。所述载体将包含一种或多种表型选择性标记和复制起始点，复制起始点保证载体维持并且按需要提供在宿主内的扩增。用于转化的适当的原核宿主包括大肠杆菌、枯草杆菌、鼠伤寒沙门氏菌以及假单胞菌属、链霉菌属和葡萄球菌属内的各个种。

细菌载体可以是例如基于噬菌体、质粒或噬菌粒的。这些载体可以含有选择性标记和衍生自可商业途径获得的质粒的细菌复制起始点，所述质粒通常含有公知的克隆载体pBR322(ATCC 37017)的元件。在转化适当宿主菌株且所述宿主菌株生长至适当细胞密度之后，通过适当方式(例如，变温或化学诱导)去抑制/诱导选择的启动子，并培养细胞额外的时期。细胞通常经离心收集，通过物理或化学方式破碎，得到的粗提取液留待进一步纯化。

在细菌系统中，可以根据表达蛋白质的预期用途而有利地筛选许多表达载体。例如，当生成大量的所述蛋白质以产生抗体或筛选肽文库时，可能需要引导高水平的容易纯化的融合蛋白产物的表达的载体。

治疗方法

治疗方法涉及为需要治疗的患者施用治疗有效量的本发明涵盖的抗体。“治疗有效量”定义为：作为单次剂量或者根据多次剂量方案单独或与缓解不利疾患的其他物质联合使用，足以清除患者受治疗区域中CD38阳性细胞但在毒理学上耐受的抗体量。所述患者可以是人类或非人类动物(例如，兔、大鼠、小鼠、猴或其他低等灵长类)。

用于本发明的抗体可以与已知药物共同给药，并且所述抗体在一些情况下自身被改变。例如，抗体可以轭合至免疫毒素或放射性同位素，可能进一步提高效力。

特别适合用抗体治疗的病症和疾患是多发性骨髓瘤(MM)和其他血液疾病，例如慢性淋巴细胞白血病(CLL)、慢性骨髓性白血病(CML)、急性骨髓性白血病(AML)和急性淋巴细胞性白血病(ALL)。抗体还可以用于治疗炎性疾病，例如类风湿性关节炎(RA)或系统性红斑狼疮(SLE)。

为了治疗任何前述疾患，可以使用一种或多种生理学可接受的载体或赋形剂，以常规方式配制根据本发明使用的药物组合物。用于本发明的抗体可以通过任何适当方式给药，这可以根据受治疗疾患的类型而变化。可能的给药途径包括胃肠外(例如，肌内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下)、肺内和鼻内，如果需要局部免疫抑制治疗，则局部给药。另外，用于本发明的抗体可以通过例如使用逐步降低的抗体剂量脉冲输注给药。优选地，剂量给药通过注射进行，最优选通过静脉内或皮下注射，部分取决于所述给药是短期的还是长期的。给药量将取决于多种因素，例如临床症状、个体体重、是否施用其他药物。技术人员将理解，给药途径将根据受治疗病症或疾患而变化。

确定根据本发明的新型多肽的治疗有效量将主要取决于特定患者特点、给药途径和受治疗疾患的性质。一般原则可以参考例如International Conference onHarmonisation出版物和REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES,chapters 27and 28,pp.484-528(18th ed.,Alfonso R.Gennaro,Ed.,Easton,Pa.:Mack Pub.Co.,1990)。更具体地，确定治疗有效量将根据例如毒性和药物疗效等因素。毒性可以使用现有技术公知的和前述参考文献记载的方法来测定。疗效可以使用下述实施例中有关方法的相同指导来测定。

诊断方法

CD38在某些恶性肿瘤中血液细胞上高度表达；因此，用于本发明的抗CD38抗体可用以使患者中可能的恶性细胞聚集位点成像或显影。在这方面，抗体可通过使用放射性同位素、亲和标记(例如生物素、卵白素等)、荧光标记、顺磁原子等进行可检测标记。实现所述标记的方法是本领域公知的。抗体在诊断成像中的临床应用综述为Grossman,H.B.,Urol.Clin.North Amer.13:465-474(1986)),Unger,E.C.等,Invest.Radiol.20:693-700(1985)),和Khaw,B.A.等,Science 209:295-297(1980))。用作诊断化合物的本发明优选的抗体或抗原结合区包含：重链可变区序列，选自SEQ ID NO:16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,92,93,94,95,96,97,98,99,100,101,102,103,104,105和106；和/或轻链可变区序列，选自SEQ ID NO:46,47,48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59,60,109和110。

这种可检测标记抗体的聚集的检测可以指示肿瘤进展部位，例如，在一个实施方案中，这种检验通过取出组织或血液样品并在所述可检测标记抗体存在下培养所述样品来进行。在优选实施方案中，该技术以非侵入方式进行，通过使用磁成像、荧光照相等。这种诊断测定可以用于监测疾病治疗的成功，其中CD38阳性细胞的存在或不存在是相关指示。本发明还包括抗CD38抗体的用途，如本文描述的，用于体外环境的诊断。

治疗和诊断组合物

用于本发明的抗体可根据已知方法配制，以制备药学有用的组合物，其中用于本发明的抗体(包括其任何功能性片段)以混合物形式与药学可接受的载体结合。例如，REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES(18th ed.,Alfonso R.Gennaro,Ed.,Easton,Pa.:Mack Pub.Co.,1990)中描述了适当的载体及其制剂。为了生成适合有效给药的药学可接受的组合物，所述组合物将含有有效量的一种或多种用于本发明的抗体以及适当量的载体。本发明优选的用作诊断化合物的抗体或抗原结合区包含：重链可变区序列，选自SEQ IDNO:16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,92,93,94,95,96,97,98,99,100,101,102,103,104,105和106；和/或轻链可变区序列，选自SEQ ID NO:46,47,48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59,60,109和110。

制剂可适当地配制以产生控制释放的活性化合物。可使用聚合物以复合或吸收抗CD38抗体实现控释制剂。通过选择适当的大分子(例如聚酯、聚氨基酸、聚乙烯、吡咯烷酮、乙烯乙酸乙烯酯、甲基纤维素、羧甲基纤维素或硫酸鱼精蛋白)和大分子浓度以及为控制释放的掺入方法，可以实施控制给药。控制控释制剂作用持续时间的另一可能方法是将抗CD38抗体掺入聚合物材料颗粒，所述聚合物材料例如聚酯、聚氨基酸、水凝胶、聚乳酸或乙烯乙酸乙烯酯共聚物。或者，除了将这些物质掺入聚合物颗粒，还可能将这些物质包入微胶囊或胶体药物递送系统或粗乳液中，所述微胶囊例如通过凝聚技术制备的羟甲基纤维素或明胶微胶囊和例如通过界面聚合法制备的聚甲基丙烯酸甲酯微胶囊，所述胶体药物递送系统例如脂质体、白蛋白微球、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊。这些技术公开于Remington'sPharmaceutical Sciences(1980)。

化合物可配制成用于通过注射胃肠外给药，例如通过快速浓注或连续输注。用于注射的制剂可以添加有防腐剂的单位剂量形式存在，例如安瓿或多剂量容器中。组合物可以采用例如于油或水载体中的混悬剂、溶液剂或乳剂形式，并且可以包含配制剂，例如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。或者，活性成分可以为粉末形式，在使用前用适当载体例如无菌无热原水配制。

组合物可以按需要以包装或分配器装置提供，所述包装或分配器装置可以包含一个或多个含有活性成分的单位剂量形式。所述包装可以例如包括金属或塑料箔，例如泡罩包装。所述包装或分配器装置可以附带给药说明书。

本发明通过参考下述工作实施例进一步得到理解，所述实施例意在描述而非限制本发明。

实施例

细胞系

下述细胞系获自欧洲细胞培养物保藏中心(ECACC)、德国微生物保藏中心(DSMZ)或美国典型培养物保藏中心(ATCC)：产生CD38小鼠IgG1单克隆抗体OKT10的杂交瘤细胞系(ECACC,#87021903)、Jurkat细胞(DSMZ,ACC282)、LP-1(DSMZ,ACC41)、RPMI8226(ATCC,CCL-155)、HEK293(ATCC,CRL-1573)、CHO-K1(ATCC,CRL-61)、Raji(ATCC,CCL-86)和OPM2(DSMZ,ACC50)。

细胞和培养条件

所有细胞于加湿培养箱中在37℃和5％CO₂标准条件下培养。细胞系LP-1、RPMI8226、Jurkat和Raji培养于添加了10％FCS(PAN biotech GmbH,#P30-3302)、50U/ml青霉素、50μg/ml链霉素(Gibco,#15140-122)和2mM谷氨酰胺(Gibco,#25030-024)的RPMI1640(Pan biotech GmbH,#P04-16500)中，在Jurkat细胞和Raji细胞的情况中，额外添加了10mMHepes(Pan biotech GmbH,#P05-01100)和1mM丙酮酸钠(Pan biotech GmbH,#P04-43100)。

CHO-K1和HEK293生长于添加了2mM谷氨酰胺和10％FCS的DMEM(Gibco,#10938-025)中。稳定的CD38CHO-K1转染子在G418(PAA GmbH,P11-012)存在下维持，而对于HEK293必须添加1mM丙酮酸钠。瞬时转染HEK293后，用超低IgG FCS(Invitrogen,#16250-078)替换10％FCS。细胞系OKT10培养于添加了2mM谷氨酰胺和20％FCS的IDMEM(Gibco,#31980-022)中。

从外周血液制备单细胞混悬液

所有血液样品在征得同意后采集。根据生产商说明书通过

(Sigma)从健康供体分离外周血液单核细胞(PBMC)。通过在RT下于ACK裂解缓冲液(0.15MNH4Cl,10mM KHCO₃,0.1M EDTA)或商业诱导剂(Bioscience,#00-4333)中培养5分钟，从这些细胞混悬液中清除红细胞。细胞用PBS洗涤两次，然后进一步处理，用于流式细胞计量或ADCC(见下文)。

流式细胞计量术("FACS")

所有染色在圆底96孔培养板(Nalge Nunc)中进行，每孔2x 10⁵个细胞。细胞在4℃下的50μl FACS缓冲液(PBS,3％FCS,0.02％NaN₃)中用指定浓度的Fab或IgG抗体培养40分钟。细胞经两次洗涤，然后在4℃下用1:200稀释于FACS缓冲液中的R-藻红蛋白(PE)轭合的山羊抗人或山羊抗小鼠IgG(H+L)F(ab')₂(Jackson Immuno Research)培养30分钟。细胞经再次洗涤，重悬于0.3ml FACS缓冲液，然后在FACSCalibur(Becton Dickinson,San Diego,CA)中进行流式细胞计量术分析。

对于基于FACS的Scatchard分析，RPMI8226细胞以12个不同的稀释液(1:2ⁿ)染色，所述稀释液开始于12.5μg/ml(IgG)的终浓度。每个浓度进行至少两次独立测量，根据Chamow等(1994)从中位荧光强度外推出K_D值。

表面等离子体共振

使用BIAcore 3000仪器(Biacore,Uppsala,Sweden)测定各自Fab的系列稀释液动力学常数k_on和k_off，所述Fab与共价固定的CD38-Fc融合蛋白结合。对于共价抗原固定，使用了标准EDC-NHS胺偶联化学。对于CD38Fc融合蛋白的直接偶联，CM5传感器(senor)芯片(Biacore)用10mM乙酸盐缓冲液(pH 4.5)中的～600-700RU涂布。对于参考流动细胞，使用各自量的HSA(人血清白蛋白)。使用1.5-500nM的Fab浓度范围在流速为20μl/min的PBS(136mM NaCl,2.7mM KCl,10mM Na₂HPO₄,1.76mM KH₂PO₄pH 7.4)中进行动态测量。每个浓度的注射时间为1分钟，随后是2分钟的解离期。使用5μl 10mM HCl进行再生。使用BIA评价软件3.1(Biacore)局部拟合所有sensograms。

实施例1:从HuCAL文库生成抗体

为产生抗CD38的治疗性抗体，进行了对MorphoSys HuCAL

噬菌体展示文库的筛选。HuCAL

是基于

概念(Knappik等,2000；Krebs等,2001)的Fab文库，其中全部六个CDR是不同的，并且采用了CysDisplay^TM技术将Fab片段连接至噬菌体表面(

2001)。

A.噬菌粒提取、噬菌体扩增与纯化

HuCAL

噬菌粒文库在含有34μg/ml氯霉素和1％葡萄糖的2x TY培养基(2xTY-CG)中扩增。在辅助噬菌体(VCSM 13)以0.5的OD600感染(37℃下30分钟，无振摇；37℃下30分钟，以250rpm振摇)后，细胞经离心沉淀(4120g；5min；4℃)，重悬于2x TY/34μg/ml氯霉素/50μg/ml卡那霉素并在22℃生长过夜。噬菌体从上清液PEG沉淀，重悬于PBS/20％甘油并于-80℃保存。在两次淘选之间的噬菌体扩增如下进行：对数期TG1细胞用洗脱的噬菌体感染并涂板于添加了1％葡萄糖和34μg/ml氯霉素的LB琼脂(LB-CG)上。在30℃过夜培养后，菌落被刮去并调为0.5的OD600，然后如上添加辅助噬菌体。

B.用HuCAL

淘选

为了选择，HuCAL

抗体-噬菌体被分成与不同VH主基因相对应的三个池(池1:VH1/5λκ，池2:VH3λκ，池3:VH2/4/6λκ)。这些池各自在表达CD38的CHO-K1细胞上进行3轮全细胞淘选，随后进行pH洗脱和在CD38阴性CHO-K1细胞上后吸附步骤，用于清除无关的抗体-噬菌体。最后，使用剩余的抗体噬菌体来感染大肠杆菌TG1细胞。离心后，细菌沉淀(pellet)重悬于2x TY培养基，涂布于琼脂平板并在30℃过夜培养。然后，从所述平板刮取选定的菌落，提取噬菌体并进行扩增。如首轮筛选一样进行第二轮和第三轮筛选。

将选定HuCAL

噬菌体的编码Fab的插入物亚克隆入表达载体

x9_Fab_FS(Rauchenberger等,2003)，以促进可溶性Fab的快速表达。选定克隆的DNA用XbaI和EcoRI消化，由此切出编码Fab的插入物(ompA-VLCL和phoA-Fd)，并克隆入经XbaI/EcoRI切割的载体

x9_Fab_FS。在该载体中表达的Fab具有用于检测和纯化的两个C端标签(FLAG^TM和

II)。

实施例2:生物测定

根据基于流式细胞计量分析(Naundorf等,2002)的公开方案测定抗体依赖型细胞毒性(ADCC)和补体依赖型细胞毒性如下：

ADCC：

对于ADCC测定，靶细胞(T)被调节为2.0E+05细胞/ml并在RPMI1640培养基(Panbiotech GmbH)中用100ng/ml钙黄绿素AM(Molecular Probes,C-3099)室温标记2分钟。通过在RPMI 1640培养基中洗涤3次来去除残留的钙黄绿素。与此同时，PBMC作为(自然杀伤)效应细胞(E)的来源被制备，调节至1.0E+07，并与标记的靶细胞混合，以根据测定条件产生最终50:1或更小的E:T比。细胞洗涤一次，细胞混合物重新悬浮于200μl含有各种不同稀释抗体的RPMI 1640培养基。平板在标准化条件下于37℃、5％CO₂的加湿培养箱中培养4小时。在FACS分析之前，细胞用碘化丙锭(PI)标记并通过流式细胞计量仪(Becton-Dickinson)分析。每次测定计数50.000至150.000。

下述方程式给出杀伤活性[％]：

其中ED^A＝死亡细胞数目(钙黄绿素+PI染色的细胞)，且

EL^A＝活细胞数目(钙黄绿素染色的细胞)

CDC:

对于CDC测定，将5.0E+04CD38CHO-K1转染子以及人类血清(Sigma,#S-1764)的1:4稀释液与各抗体添加至微量滴定孔板(Nunc)。所有试剂和细胞稀释于添加了10％FCS的RPMI 1640培养基(Pan biotech GmbH)。反应混合物在标准化条件下于37℃、5％CO₂的加湿培养箱中培养2小时。热灭活的补体或无抗体的CD38转染子用作阴性对照。细胞用PI标记并进行FACS分析。

总共计数5000，不同抗体浓度下的死亡细胞数目用于确定EC50值。下述方程式给出了杀伤活性[％]:

其中ED ^C＝死亡细胞数目(PI染色的细胞)，且

EL^C＝活细胞数目(未被染色的)

针对每种抗体，来自共12个不同的抗体稀释液(1:2ⁿ)的细胞毒性值在ADCC中采用三次实验，而在CDC采用两次实验，以使用标准分析软件(

Graph Pad Software)获得EC-50值。

实施例3:稳定CD38-转染子和CD38Fc融合蛋白的产生

为了产生供淘选和筛选的CD38蛋白，必须建立两个不同的表达系统。第一种策略包括产生CD38-Fc融合蛋白，该蛋白在瞬时转染HEK293细胞之后从上清液纯化。第二种策略包括产生供高CD38表面表达的稳定的CHO-K1细胞系，用以通过全细胞淘选来选择抗体-噬菌体。

作为起始步骤，Jurkat细胞(DSMZ ACC282)用于产生cDNA(Invitrogen)，随后使用分别互补于CD38的前7个和后9个密码子的引物(引物MTE001&MTE002rev；表4)扩增整个CD38编码序列。CD38插入物的序列分析证实了Jackson等(1990)公开的氨基酸序列，除了如Nata等(1997)所描述的，49位显示谷氨酰胺取代了酪氨酸。为了引入限制性内切核酸酶位点并克隆入表达载体pcDNA3.1(Stratagene)的不同衍生物，经纯化的PCR产物用作整个基因(引物MTE006&MTE007rev,表4)或其部分(引物MTE004&MTE009rev,表4)再扩增的模板。在后一情况中，编码细胞外域(aa 45至300)的片段经扩增后克隆入人Vκ前导序列和人Fc-γ1序列之间的框架。该载体作为产生可溶性CD38-Fc融合蛋白的表达载体。另一种没有前导序列的pcDNA3.1衍生物用来插入CD38全长基因。这种情况下，Fc编码区前面的终止密码子和缺失的前导序列产生CD38表面表达。HEK293细胞用Fc融合蛋白载体瞬时转染以产生可溶性CD38Fc融合蛋白，如果是全长衍生物，则转染CHO-K1细胞以产生稳定的CD38表达细胞系。

表4：

引物#	序列(5’-＞3’)
		MTE001	ATG GCC AAC TGC GAG TTC AGC(SEQ ID NO：123)
MTE002rev	TCA GAT CTC AGA TGT GCA AGA TGA ATC(SEQ ID NO：124)
		MTE004	TTGGT ACC AGG TGG CGC CAG CAG TG(SEQ ID NO：125)
MTE006	TT GGT ACC ATG GCC AAC TGC GAG(SEQ ID NO：126)
		MTE007rev	CCG ATA TCA＊GAT CTC AGA TGT GCA AGA TG(SEQ ID NO：127)
MTE009rev	CCG ATA TC GAT CTC AGA TGT GCA AGA TG(SEQ ID NO：128)

*在有义方向形成终止密码子(TGA)

实施例4：

IgG1的克隆、表达和纯化：

为了表达全长IgG，重链(VH)和轻链(VL)的可变区片段从Fab表达载体亚克隆入适当的

_hIg载体(参见图7至9)。使用限制性内切核酸酶对BlpI/MfeI(插入物制备)和BlpI/EcoRI(载体制备)将VH结构域片段亚克隆入

_hIgG1。使用酶对EcoRV/HpaI(λ-插入物)和EcoRV/BsiWI(κ-插入物)将VL结构域片段亚克隆入各自的

_hIgκ1或

_h_Igλ_1载体。得到的IgG构建体通过瞬时转染在HEK293细胞(ATCC CRL-1573)中表达，使用了标准磷酸钙-DNA共沉淀技术。

通过经由蛋白质A琼脂糖柱的亲和层析，从细胞培养上清液纯化IgG。进一步的下游加工包括凝胶过滤交换缓冲液和无菌过滤经纯化的IgG。质量控制显示经由还原SDS-PAGE的＞90％的纯度，分析性尺寸排阻色谱测定＞90％的单体IgG。物质的内毒素含量通过基于动态LAL的测定法(Cambrex European Endotoxin Testing Service，Belgium)来测定。

实施例5：嵌合OKT10(chOKT10；SEQ ID NO：72和73)的产生和制备

为构建chOKT10，使用从鼠OKT10杂交瘤细胞系(ECACC#87021903)制备的cDNA，通过PCR扩增小鼠的VH和VL区。如Dattamajumdar等,1996；Zhou等,1994所公开的使用一组引物。PCR产物用于Topo克隆(Invitrogen；pCRII载体)并对单克隆进行序列分析(M 13反向引物)，揭示了两种不同的κ轻链序列和一个重链序列。根据序列比对(EMBL-核苷酸序列数据库)和文献(Krebber等,1997)，κ序列之一属于肿瘤细胞融合配偶体X63Ag8.653的内在组分，并因此不属于OKT10抗体。因此，只有新κ序列和单VH片段用于进一步克隆。两种片段再扩增以增加限制性内切核酸酶位点，随后克隆入各自的

IgG1表达载体。重链序列(SEQ ID NO:72)和轻链序列(SEQ ID NO:73)列于图6。HEK293细胞经瞬时转染，FACS分析上清液中与CD38过表达的Raji细胞系(ATCC)结合的嵌合OKT10抗体。

实施例6:FACS分析交叉反应性(MOR 03087和MOR 03088)

1.材料与方法:

图11和12显示淋巴细胞和红细胞的FACS分析：EDTA处理的血液样品从健康人(在征得同意之后)和非人灵长类(猕猴、短尾猴和狨猴)获得，并根据提供商(Sigma)说明书使用Histopaque细胞分离系统进行密度梯度离心。为FACS分析，来自相界面(PBMC部分)和沉淀(红细胞部分)的细胞用不同样式的抗CD38

抗体培养。

不同抗CD38抗体的交叉反应性特征概况显示于图13。

2.总结与结论:

结果显示，在所有CD38抗体中，仅MOR03087和MOR03088显示了对狨猴PBMC的交叉反应性。令人惊讶的是，与短尾猴和猕猴红细胞上的强表达相比较，狨猴红细胞上的CD38表达几乎不可检测。因此，狨猴红细胞和PBMC上的CD38表达更体现了人类的情况，其中CD38在红细胞上弱表达而在PBMC上中至高表达。因此，狨猴被认为适合作为结合CD38的分子的毒性研究模型。

基于上述研究，决定进一步优化结合剂MOR 03087和MOR 03088，如本文其他地方所描述的，参见例如涉及“用于本发明的抗体”的段落。本领域技术人员将理解，亲本的衍生抗体也将显示相当的交叉反应性特征。

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