RU2205874C2 - Нуклеотидная последовательность, способная ингибировать активность il-6, плазмидный вектор для трансфекции в клетки млекопитающих, нуклеотидная последовательность, используемая при терапии, фармацевтическая композиция (варианты) - Google Patents
Нуклеотидная последовательность, способная ингибировать активность il-6, плазмидный вектор для трансфекции в клетки млекопитающих, нуклеотидная последовательность, используемая при терапии, фармацевтическая композиция (варианты) Download PDFInfo
- Publication number
- RU2205874C2 RU2205874C2 RU97120584/13A RU97120584A RU2205874C2 RU 2205874 C2 RU2205874 C2 RU 2205874C2 RU 97120584/13 A RU97120584/13 A RU 97120584/13A RU 97120584 A RU97120584 A RU 97120584A RU 2205874 C2 RU2205874 C2 RU 2205874C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- nucleotide sequence
- plasmid
- activity
- inhibitory
- cells
- Prior art date
Links
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 title claims abstract description 40
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 title claims abstract description 39
- 238000001890 transfection Methods 0.000 title claims abstract description 31
- 230000000694 effects Effects 0.000 title claims abstract description 30
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 title claims abstract description 6
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 title claims abstract description 6
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 4
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 title claims description 3
- 102000004889 Interleukin-6 Human genes 0.000 claims abstract description 93
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 claims abstract description 93
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 claims abstract description 17
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 claims abstract description 17
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims abstract description 14
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 claims abstract description 7
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims description 64
- 206010048998 Acute phase reaction Diseases 0.000 claims description 21
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims description 8
- 230000009471 action Effects 0.000 claims description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 3
- 108010086512 Hepatocyte Nuclear Factor 1 Proteins 0.000 claims description 2
- 102000006754 Hepatocyte Nuclear Factor 1 Human genes 0.000 claims description 2
- 102100035593 POU domain, class 2, transcription factor 1 Human genes 0.000 claims description 2
- 101710084414 POU domain, class 2, transcription factor 1 Proteins 0.000 claims description 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims 2
- 101000700937 Amsacta albistriga Sex-specific storage protein 1 Proteins 0.000 claims 1
- 102000003945 NF-kappa B Human genes 0.000 claims 1
- 108010057466 NF-kappa B Proteins 0.000 claims 1
- 108010018242 Transcription Factor AP-1 Proteins 0.000 claims 1
- 101710189834 Transcription factor AP-2-alpha Proteins 0.000 claims 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 abstract description 21
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 133
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 69
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 41
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 38
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 32
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 25
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 21
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 21
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 21
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 17
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 15
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 14
- 102220497176 Small vasohibin-binding protein_T47D_mutation Human genes 0.000 description 9
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 7
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 6
- 230000004044 response Effects 0.000 description 6
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 6
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 5
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 description 5
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 5
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102100026189 Beta-galactosidase Human genes 0.000 description 4
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 4
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 4
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 4
- 101001078385 Homo sapiens Haptoglobin Proteins 0.000 description 4
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108050005077 Haptoglobin Proteins 0.000 description 3
- 101000826373 Homo sapiens Signal transducer and activator of transcription 3 Proteins 0.000 description 3
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 3
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 3
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 3
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 3
- 102100024040 Signal transducer and activator of transcription 3 Human genes 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 3
- 238000002337 electrophoretic mobility shift assay Methods 0.000 description 3
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 3
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 208000025113 myeloid leukemia Diseases 0.000 description 3
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 3
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 3
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 2
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 2
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 108010049003 Fibrinogen Proteins 0.000 description 2
- 102000014702 Haptoglobin Human genes 0.000 description 2
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 2
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 2
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 2
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 238000000034 method Methods 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 230000004043 responsiveness Effects 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 2
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 2
- HRGUSFBJBOKSML-UHFFFAOYSA-N 3',5'-di-O-methyltricetin Chemical compound COC1=C(O)C(OC)=CC(C=2OC3=CC(O)=CC(O)=C3C(=O)C=2)=C1 HRGUSFBJBOKSML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000011767 Acute-Phase Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010062271 Acute-Phase Proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- 108010074051 C-Reactive Protein Proteins 0.000 description 1
- 102100032752 C-reactive protein Human genes 0.000 description 1
- 208000005024 Castleman disease Diseases 0.000 description 1
- RGJOEKWQDUBAIZ-IBOSZNHHSA-N CoASH Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCS)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 RGJOEKWQDUBAIZ-IBOSZNHHSA-N 0.000 description 1
- 102000005754 Cytokine Receptor gp130 Human genes 0.000 description 1
- 108010006197 Cytokine Receptor gp130 Proteins 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N D-Luciferin Chemical compound OC(=O)[C@H]1CSC(C=2SC3=CC=C(O)C=C3N=2)=N1 IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 description 1
- CYCGRDQQIOGCKX-UHFFFAOYSA-N Dehydro-luciferin Natural products OC(=O)C1=CSC(C=2SC3=CC(O)=CC=C3N=2)=N1 CYCGRDQQIOGCKX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BJGNCJDXODQBOB-UHFFFAOYSA-N Fivefly Luciferin Natural products OC(=O)C1CSC(C=2SC3=CC(O)=CC=C3N=2)=N1 BJGNCJDXODQBOB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010018364 Glomerulonephritis Diseases 0.000 description 1
- 101000942118 Homo sapiens C-reactive protein Proteins 0.000 description 1
- 101001076408 Homo sapiens Interleukin-6 Proteins 0.000 description 1
- 208000037147 Hypercalcaemia Diseases 0.000 description 1
- 102000010781 Interleukin-6 Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010038501 Interleukin-6 Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102100037792 Interleukin-6 receptor subunit alpha Human genes 0.000 description 1
- DDWFXDSYGUXRAY-UHFFFAOYSA-N Luciferin Natural products CCc1c(C)c(CC2NC(=O)C(=C2C=C)C)[nH]c1Cc3[nH]c4C(=C5/NC(CC(=O)O)C(C)C5CC(=O)O)CC(=O)c4c3C DDWFXDSYGUXRAY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000034578 Multiple myelomas Diseases 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 208000001132 Osteoporosis Diseases 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- IDDMFNIRSJVBHE-UHFFFAOYSA-N Piscigenin Natural products COC1=C(O)C(OC)=CC(C=2C(C3=C(O)C=C(O)C=C3OC=2)=O)=C1 IDDMFNIRSJVBHE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000004681 Psoriasis Diseases 0.000 description 1
- 108091027981 Response element Proteins 0.000 description 1
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 description 1
- 101800001271 Surface protein Proteins 0.000 description 1
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000012131 assay buffer Substances 0.000 description 1
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- RGJOEKWQDUBAIZ-UHFFFAOYSA-N coenzime A Natural products OC1C(OP(O)(O)=O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)C(O)C(=O)NCCC(=O)NCCS)OC1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 RGJOEKWQDUBAIZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005516 coenzyme A Substances 0.000 description 1
- 229940093530 coenzyme a Drugs 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- KDTSHFARGAKYJN-UHFFFAOYSA-N dephosphocoenzyme A Natural products OC1C(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)C(O)C(=O)NCCC(=O)NCCS)OC1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 KDTSHFARGAKYJN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- KCFYHBSOLOXZIF-UHFFFAOYSA-N dihydrochrysin Natural products COC1=C(O)C(OC)=CC(C2OC3=CC(O)=CC(O)=C3C(=O)C2)=C1 KCFYHBSOLOXZIF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 239000011536 extraction buffer Substances 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 230000009454 functional inhibition Effects 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 230000002489 hematologic effect Effects 0.000 description 1
- 210000005096 hematological system Anatomy 0.000 description 1
- 230000011132 hemopoiesis Effects 0.000 description 1
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 1
- 102000050796 human HP Human genes 0.000 description 1
- 102000052611 human IL6 Human genes 0.000 description 1
- 230000000148 hypercalcaemia Effects 0.000 description 1
- 208000030915 hypercalcemia disease Diseases 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 208000027866 inflammatory disease Diseases 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 238000003670 luciferase enzyme activity assay Methods 0.000 description 1
- 210000004324 lymphatic system Anatomy 0.000 description 1
- 230000004899 motility Effects 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 238000013492 plasmid preparation Methods 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000003571 reporter gene assay Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000036962 time dependent Effects 0.000 description 1
- 238000011200 topical administration Methods 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- BMCJATLPEJCACU-UHFFFAOYSA-N tricin Natural products COc1cc(OC)c(O)c(c1)C2=CC(=O)c3c(O)cc(O)cc3O2 BMCJATLPEJCACU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JLEXUIVKURIPFI-UHFFFAOYSA-N tris phosphate Chemical compound OP(O)(O)=O.OCC(N)(CO)CO JLEXUIVKURIPFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
- C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
- C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
- C07K14/4705—Regulators; Modulating activity stimulating, promoting or activating activity
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для ингибирования активности IL-6. Нуклеотидная последовательность, способная ингибировать активность IL-6, содержит I) восьмикратный повтор нуклеотидной последовательности, которая является APRE-элементом общей формулы ZXMYKGKAA, где Z представляет Т или G или может также отсутствовать, Х представляет Т или может также отсутствовать, М представляет С или A, Y представляет С или Т и К представляет Т или G, в сочетании с II) по меньшей мере одной нуклеотидной последовательностью, составляющей сайт связывания фактора транскрипции иной, чем APRE-элемент, такой как сайты, присутствующие в промоторных областях. На основе полученной нуклеотидной последовательности конструируют плазмидный вектор для трансфекции в клетки млекопитающих. Изобретение позволяет разрабатывать фармацевтические композиции для ингибирования активности IL-6. 4 с. и 7 з.п.ф-лы, 8 ил., 2 табл.
Description
Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к нуклеотидной последовательности, которая способна ингибировать активность IL-6, ее применению в терапии, а также к содержащим ее фармацевтическим композициям.
Настоящее изобретение относится к нуклеотидной последовательности, которая способна ингибировать активность IL-6, ее применению в терапии, а также к содержащим ее фармацевтическим композициям.
Предпосылки создания изобретения
IL-6 является белком, принадлежащим к группе цитокинов, которые призваны играть ключевую роль в иммунной реакции организма и стимуляции гематопоэз.
IL-6 является белком, принадлежащим к группе цитокинов, которые призваны играть ключевую роль в иммунной реакции организма и стимуляции гематопоэз.
Действительно, обнаружено много биологических функций IL-6 в гематологической и лимфатической системах, в печени и других мишенных органах и тканях. Некоторые из этих функций являются благоприятными, в то время как другие относятся к патологическим состояниям. К числу последних относится, как обнаружено, то, что IL-6 является фактором роста для клеток множественной миеломы; показано, что антитела против IL-6 временно блокируют пролиферацию миеломных клеток у пациента с лейкемией (см., например, Klein et al. , Blood, 78, (5), pp.1198-1204, 1991, и Lu et al., Eur. J.Immunol., 22, pp.2819-24, 1992).
Найдена взаимосвязь оцененных уровней IL-6 с аутоиммунными и воспалительными заболеваниями, такими как ревматоидный артрит, гломерулонефрит, псориаз и болезнь Кастлемена (см., например, Graeve et al., Clin. Investig., 71, pp.664-71, 1993). Также показано, что IL-6 играет явную роль в остеопорозе и гиперкальциемии (см., например, Poli et al., Embo J., 13, (5), pp. 1189-96, и Yoneda et al., Cancer Res., 53, pp.737-40, Feb.1993).
Поэтому разработка ингибиторов активности IL-6 была предметом активных исследований. Для этих целей были выбраны различные подходы, в том числе, применение антител против IL-6 gp130 или gp80 (как сообщают Klein et al., см. выше); применение растворимого gp130; или применение мутеинов для IL-6, или рецептора IL-6.
Так как такие подходы могут ассоциироваться со специфическими нежелательными эффектами при клиническом применении (как сообщают Lu et al., см. выше), может быть полезным выдвижение других стратегий ингибирования активности IL-6.
Поэтому Заявитель провел исследования при другом подходе к ингибированию активности IL-6, а именно путем блокирования внутриклеточных белков, опосредующих сигнал IL-6.
Трансдукция сигнала IL-6 в отвечающих клетках тщательно исследована. Fowlkes et al. (PNAS USA, 81, pp.2313-6, 1984) первыми предположили, что существуют отвечающие элементы ДНК, специфические для IL-6, фланкирующие фибриногенные гены крысы.
Позднее Kunz et al. (Nuc. Ac. Res., 17, (3), 1121-37, 1989) показали отвечающий элемент с коровой последовательностью, идентичной последовательности генов крысиного фибриногена (CTGGGA), который отвечает на IL-6 в гене крысиного α2-макроглобулина.
Отвечающие элементы ДНК с последовательностями, родственными вышеупомянутым последовательностям, также определены в генах, кодирующих человеческий С-реактивный белок (CRP) (см. Toniatti et al., Mol. Biol. Med., 7, pp.199-212, 1990), человеческий гаптоглобин (см. Oliviero et al., Embo J. 6, (7), pp. 1905-12, 1987), и в других генах, кодирующих добавочные белки острой фазы, индуцированные IL-6 (см. Heinrich et al., Biochem. J., 265, pp.621-36, 1990), что приводит к определению коровой консенсусной последовательности CTGGGAW или CTGGRAA, где W представляет А или Т, и R представляет А или G.
Hocke et al. (Mol. Cell. Biol., 12, (5), pp.2282-94, 1992) показали, что многие родственные коровые последовательности, подобные коровой последовательности, упомянутой выше, могут присутствовать в регуляторных областях генов дикого типа, отвечающих IL-6, и что эта множественность ведет к амплификации ответа, что анализируется функционально с помощью анализа репортерного гена.
Wenenka et al. (Mol. Cell. Biol., 13, (1), pp.276-88, 1993) недавно предложили расширенную версию коровой консенсусной последовательности как элемента реакции острой фазы (APRE), активного в клетках гепатомы, которую можно представить формулой KTMYKGKAA, где М представляет С или А, К представляет Т или G, Y представляет С или Т.
Показано (Yuan et al., Mol. Cell. Biol., 14, (3), pp.1657-68, 1994), что такие APRE-подобные последовательности связывают белковый фактор транскрипции с молекулярной массой порядка 90 кД, названный APRE, который недавно клонирован (см. Akira et al., Cell, 77, pp.63-71, 1994). На практике, связывание активированного APRF с APRE-последовательностями приводило бы к активации IL-6-индуцибельных генов (содержащих такие APRE-последовательности) в отвечающих на IL-6 клетках.
Вследствие этого APRE-элемент можно использовать в качестве энхансера гена-мишени в отвечающих на IL-6 клетках следующим образом: в отвечающих на IL-6 клетках обработка IL-6 индуцирует синтез APRF-белков, которые связываются с APRE-элеменом, и такое связывание активирует экспрессию гена-мишени.
Serlupi Crescenzi et al. (сообщение на 12-й Европейской конференции по иммунологии, Барселона, 14-17 июня 1994) показали, что 8-кратный повтор ДНК-последовательности APRE (M8) отвечает за 50-100-кратную индукцию с помощью IL-6 репортерного гена в клетках гепатомы человека HepG2. В случае таких отдельных транскрипционных факторов действительно выявлены двухцепочечные олигонуклеотиды.
Краткое изложение сущности изобретения
Основным предметом настоящего изобретения является нуклеотидная последовательность, способная ингибировать активность IL-6, которая включает
I) по меньшей мере одну нуклеотидную последовательность, которая является APRE-элеменом общей формулы ZXMYKGKAA, где Z представляет Т или G или может также отсутствовать, Х представляет Т или также может отсутствовать, М представляет С или A, Y представляет С или Т и К представляет Т или G,
в сочетании с
II) по меньшей мере одной нуклеотидной последовательностью, составляющей сайт связывания транскрипционного фактора иной, чем APRE-элемент, такой как сайты, присутствующие в промоторных областях.
Основным предметом настоящего изобретения является нуклеотидная последовательность, способная ингибировать активность IL-6, которая включает
I) по меньшей мере одну нуклеотидную последовательность, которая является APRE-элеменом общей формулы ZXMYKGKAA, где Z представляет Т или G или может также отсутствовать, Х представляет Т или также может отсутствовать, М представляет С или A, Y представляет С или Т и К представляет Т или G,
в сочетании с
II) по меньшей мере одной нуклеотидной последовательностью, составляющей сайт связывания транскрипционного фактора иной, чем APRE-элемент, такой как сайты, присутствующие в промоторных областях.
Примерами нуклеотидных последовательностей последнего типа являются блок ТАТА и сайты связывания факторов транскрипции, таких как АР-1 (см. Riabowol et al., PNAS USA, 89, pp.157-61, 1992), AP-2, HNF-1 (см. Clusel et al., Nuc. Ac. Res. , 21 (15), pp.3405-11), SP-1 (см. Wu et al., Gene, 89, pp.203-9, 1990), NF-kB (см. Bielinska et al., Science, 250, pp.997-1000, 1990), Oct-1, E-2 и факторов транскрипции SRF.
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения как APRE-элемент (I), так и/или нуклеотидная последовательность (II) приведенной выше общей формулы повторяются по меньшей мере 2 раза, предпочтительнее - от 3 до 10 раз, еще предпочтительнее - 8 раз.
В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения элемент (I) содержит по меньшей мере два различных APRE-элемента, и/или нуклеотидная последовательность (II) содержит по меньшей мере две различные олигонуклеотидные последовательности, составляющие сайт связывания фактора транскрипции иной, чем APRE-элемент.
Нуклеотидная последовательность (II) является предпочтительно ранним промотором SV40.
APRE-элемент (I) содержит, например, нуклеотидную последовательность TTCTGGGAA.
На фиг. 2 приводится нуклеотидная последовательность, которая входит в объем изобретения, в соответствии с предпочтительными вариантами его осуществления. Такая последовательность также обозначается как послед. 1, и составляет предмет настоящего изобретения.
Другим предметом настоящего изобретения является плазмидный вектор, содержащий нуклеотидную последовательность настоящего изобретения.
Дополнительным аспектом настоящего изобретения является применение нуклеотидной последовательности настоящего изобретения в качестве терапевтического средства для ингибирования действия IL-6 в условиях, когда IL-6 играет патологическую роль.
Настоящее изобретение также относится к фармацевтическим композициям, содержащим нуклеотидную последовательность или плазмидный вектор по настоящему изобретению. Такие композиции могут быть составлены для перорального, ректального, внутривенного или местного применения. Составы настоящего изобретения могут включать использование любого сочетания переноса вирусоопосредованного гена, липосомной композиции, опосредованной рецептором доставки ДНК и/или гантельных структур активной нуклеотидной ингибирующей последовательности по настоящему изобретению.
Ингибирующее действие нуклеотидной последовательности настоящего изобретения определяют с помощью анализа репортерного гена.
Анализ репортерного гена настоящего изобретения основан на способности APRE-элемента функционировать в качестве энхансера любого гена в отвечающих на IL-6 клетках (как сообщалось выше). В этом случае APRE-элемент используют как энхансер репортерного гена-мишени (которым является, например, ген люциферазы) в отвечающих на IL-6 клетках (которыми являются, например, гепатоциты, такие как HepG2). Затем клетки обрабатывают IL-6: если достаточное количество продуцированных APRF-белков захватывается избытком нуклеотидной последовательности настоящего изобретения, ген-мишень не будет активироваться.
В соответствии с этим анализом строят ингибирующие плазмиды, которые содержат нуклеотидную последовательность настоящего изобретения. Пример такой плазмиды дается на фиг.1 вместе со стратегией ее построения.
Также подразумевается, что эта и другие плазмиды, содержащие нуклеотидную последовательность настоящего изобретения, составляют другой вариант осуществления настоящего изобретения.
В дальнейшем настоящее изобретение будет описываться с помощью примеров, которые не следует рассматривать как ограничивающие настоящее изобретение в какой-либо степени. В примерах будут даваться ссылки на чертежи, описанные здесь далее.
Краткое описание чертежей
Фиг. 1. Построение плазмиды pM8SV. pM8SVL переваривают с Sal I и Hind III, и липкие концы трансформируют в тупые концы посредством реакции Кленова. Получающийся в результате фрагмент ДНК в 3,2 т.п.н. очищают с помощью электрофореза в агарозном геле, и затем его аутолигируют. Затем генерируют плазмиду pM8SV, содержащую последовательность М8 (170 п.н.) и последовательность от раннего промотора вируса SV40 (190 п.н.), но не имеющую гена люциферазы.
Фиг. 1. Построение плазмиды pM8SV. pM8SVL переваривают с Sal I и Hind III, и липкие концы трансформируют в тупые концы посредством реакции Кленова. Получающийся в результате фрагмент ДНК в 3,2 т.п.н. очищают с помощью электрофореза в агарозном геле, и затем его аутолигируют. Затем генерируют плазмиду pM8SV, содержащую последовательность М8 (170 п.н.) и последовательность от раннего промотора вируса SV40 (190 п.н.), но не имеющую гена люциферазы.
Фиг. 2. Последовательность фрагмента BamH I-Hind III ингибирующей ДНК плазмиды pM8SV. Непрерывная линия над верхней частью приведенной нуклеотидной последовательностью представляет последовательность М8. Четкая непрерывная линия над нижней частью нуклеотидной последовательности представляет промоторную последовательность SV40. Также указаны сайты рестрикции BamH I и Hind III.
Фиг.3. Анализ репортерного гена в клетках T47D и M1. Испытание различных плазмид, содержащих М8. Приведенные величины светового излучения являются средними значениями двукратного определения чос (cps) за период 30 секунд (AUC= площадь под кривой, ППК) из трансфектированных клеток. Каждый прямоугольник представляет среднее трех трансфекций ± ст.откл.
Фиг. 4. Зависимость от времени люциферазной индуцибельности трансфектированных клеток Нер G2 после обработки IL-6. Плазмиду pM8SVL используют в качестве позитивной плазмиды репортерного гена. Каждый прямоугольник представляет среднее из двух трансфекций ± ст.откл. На чертеже показаны результаты двух экспериментов.
Фиг. 5. Анализ репортерного гена HepG2 для IL-6. Испытания рМ8 как ингибирующей плазмиды против pM8SVL как плазмиды репортерного гена. Каждый прямоугольник представляет среднее из трех трансфекций ± ст.откл. На чертеже показаны результаты четырех экспериментов.
Фиг. 6. Анализ репортерного гена HepG2 для IL-6. Испытания pN8SV как ингибирующей плазмиды против pN8SVL как плазмиды репортерного гена. Каждый прямоугольник представляет среднее из трех трансфекций ± ст.откл. Результаты выражаются в виде % ингибирования по отношению к клеткам HepG2, трансфектированным плазмидой-носителем рС без ингибирующей плазмиды.
Фиг. 7. Анализ репортерного гена HepG2 для IL-6. Испытания pSV и pM8SV как ингибирующих плазмид против pN8SVL как плазмиды репортерного гена. Каждый прямоугольник представляет среднее из трех трансфекций ± ст.откл. Результаты выражаются в виде % инигибированя по отношению к клеткам HepG2, трансфектированным плазмидой-носителем рС без ингибирующей плазмиды.
Фиг.8. Испытания ингибирования активности IL-6 инигибирующими плазмидами рМ8 и pM8SV при анализе репортерного гена HepG2 на основе люциферазного гена под контролем индуцибельных регуляторных последовательностей IL-6 из промотора гена человеческого гаптоглобина. Каждый прямоугольник представляет среднее из трех трансфекций ± ст.откл. Результаты выражаются в виде % инигибирования по отношению к клеткам HepG2, трансфектированным плазмидой-носителем рС без ингибирующей плазмиды. Трансфекцию осуществляют 0,1 мкг репортерной плазмидной ДНК и указанным молярным избытком ингибирующей плазмиды. Общее количество трансфектированной ДНК поддерживают постоянным с помощью плазмиды-носителя. Трансфектированные клетки обрабатывают в течение 18 часов 1 нг/мл IL-6.
Подробное описание изобретения
Пример 1. Построение плазмид. Отвечающую на IL-6 плазмиду репортерного гена люциферазы конструируют, получая, сначала, путем химического синтеза двухцепочечный олигонуклеотид с 38 п.н. с невырезанным сайтом ВаmН I на его 5' тупом конце, и формируя выступ нижней цепочки в 4 нуклеотида, совместимых с сайтами Вgl II и ВаmН I на 3'-конце. Этот синтетический олигонуклеотид называют М2, и он содержит две идентичные APRE-последовательности из промоторной области гена крысиного α2-макроглобулина. Последовательность олигонуклеотида (верхняя цепочка, 5'-3') имеет вид GGATCCTTCTGGGAATTCTGATCCTTCTGGGAATTCTG (послед. 2). Этот олигонуклеотид клонируют в сайтах Sma I-Bgl II плазмиды pGL2-pv (от Promega Corporation), где экспрессия люциферазного репортерного гена производится ранним промотором вируса SV40, формируя, таким образом, после аутолигирования плазмиду pM2SVL.
Пример 1. Построение плазмид. Отвечающую на IL-6 плазмиду репортерного гена люциферазы конструируют, получая, сначала, путем химического синтеза двухцепочечный олигонуклеотид с 38 п.н. с невырезанным сайтом ВаmН I на его 5' тупом конце, и формируя выступ нижней цепочки в 4 нуклеотида, совместимых с сайтами Вgl II и ВаmН I на 3'-конце. Этот синтетический олигонуклеотид называют М2, и он содержит две идентичные APRE-последовательности из промоторной области гена крысиного α2-макроглобулина. Последовательность олигонуклеотида (верхняя цепочка, 5'-3') имеет вид GGATCCTTCTGGGAATTCTGATCCTTCTGGGAATTCTG (послед. 2). Этот олигонуклеотид клонируют в сайтах Sma I-Bgl II плазмиды pGL2-pv (от Promega Corporation), где экспрессия люциферазного репортерного гена производится ранним промотором вируса SV40, формируя, таким образом, после аутолигирования плазмиду pM2SVL.
Синтетический олигонуклеотид также лигируют, через его 5' тупой конец, с сайтом Sma I той же плазмиды pGL2-pv, и получающийся в результате линейный продукт лигирования затем разрезают Hind III. Получающийся в результате линейный вектор используют в качестве реципиента для клонирования следующих фрагментов ДНК: 1) фрагмента BamH I - Hind III с 238 п.н. из плазмиды pM2SVL с образованием, таким образом, после аутолигированя плазмиды pM4SLV; 2) фрагмента BamH I-Hind III с 280 п.н. из pM4SLV с образованием, таким образом, после аутолигирования плазмиды pM6SLV; и 3) фрагмента BamH I - Hind III с 322 п. н. из pM6SLV с образованием, таким образом, после аутолигирования плазмиды pM8SLV.
Плазмиду pM8L конструируют путем переваривания pM8SLV с Sfan I и путем конвертирования липких концов в тупые концы с помощью реакции вставки с ферментом Кленова. После переваривания BamH I получающийся в результате фрагмент ДНК М8 в 163 п.н. лигируют с синтетическим адаптором BamH I-KpnI с 16 п. н. и клонируют во фрагменте ДНК в 5,6 т.п.н., получающемся при переваривании Sma I + Крn I вектора pGL2-b (от Promega Corporation). Плазмида pGL-2b идентична вышеупомянутой плазмиде pGL2-pv, за исключением отсутствия промоторной последовательности SV40 в pDL2-b. Адаптор с 16 п.н. содержит сайт множественного клонирования, и его получают путем химического синтеза со следующией последовательностью:
верхняя цепочка:
5'CGCGGCCGCCTCGAGG3' (послед. 3);
нижняя цепочка:
5'GATCCCTCGAGGCGGCCGCGGTAC3' (послед. 4).
верхняя цепочка:
5'CGCGGCCGCCTCGAGG3' (послед. 3);
нижняя цепочка:
5'GATCCCTCGAGGCGGCCGCGGTAC3' (послед. 4).
Плазмида, получающаяся из вышеуказанной конструкции, представляет собой pM8L, и она имеет последовательность ДНК М8 без промотора, вставленную в сайт множественного клонирования, в обратном направлении люциферазного гена.
Плазмиду люциферазного репортерного гена pM8TKL получают путем разрезания плазмиды pGEM-TK-CAT (описанной в Cohen et al., EMBO J., 7(5), pp. 1411-9, 1988) Xba I и Bgl II. Получающийся в результате фрагмент в 181 п.н., содержащий ТК-промоторную последовательность гена тимидинкиназы вируса HSV, лигируют с фрагментом Nhe I-Bgl II с 5,8 т.п.н. вектора pM8L между последовательностями М8 и ДНК люциферазы. Плазмиду люциферазного репортерного гена pHPSVL конструируют сначала путем PCR-амплификации 841 п.н. из промоторной области гена гаптоглобина из человеческой геномной ДНК. Конец 3' амплифицированного PCR фрагмента соответствует позиции 36 от начала транскрипции гена человеческого гаптоглобина (как сообщается в Maeda et al., J. Biol. Chem. , 260(11), pp. 6698-709, 1985). Этот PCR-продукт получают с верхней и нижней затравками, содержащими, соответственно, сайты рестрикции Mlu I и Вgl II. ДНК-затравки, синтезированные для геномной амплификации промоторной области гаптоглобина, имеют следующую последовательность:
верхняя затравка:
5'CTACGCGTGCAGTATTGACCCTTCCTCCT3' (послед. 5);
нижняя затравка:
5'CGCAGATCTAGCTCACTTCTCCCCCTTC3' (послед. 6).
верхняя затравка:
5'CTACGCGTGCAGTATTGACCCTTCCTCCT3' (послед. 5);
нижняя затравка:
5'CGCAGATCTAGCTCACTTCTCCCCCTTC3' (послед. 6).
Полученный таким образом PCR-фрагмент вставляют в сайты Mlu I и Вgl II указанной выше плазмиды люциферазного репортерного гена pGL2-pv, в обратном направлении раннего промотора SV40. Получающаяся в результате плазмида представляет собой pHPSVL.
Чтобы сконструировать ингибирующую плазмиду рМ8, вышеуказанную плазмиду pM8L переваривают с Sal I и Вgl II, и полученные таким образом липкие концы исправляют в тупые концы с помощью реакции Кленова. Получающийся в результате фрагмент в 3,1 т.п.н., не имеющий последовательности гена люциферазы, очищают с помощью электрофореза в агарозном геле, затем его аутолигируют, и генерируют ингибирующую плазмиду рМ8.
Игнибирующую плазмиду pM8SV получают так, как показано на фиг.1. Переваривают pM8SVL с Sal I и Hind III, и липкие концы трансформируют в тупые концы с помощью реакции Кленова. Получающийся в результате фрагмент ДНК в 3,2 т. п. н. очищают с помощью электрофореза в агарозном геле, затем его аутолигируют. Генерируют, таким образом, плазмиду pM8SV, содержащую последовательность М8 (170 п. н.) и последовательность из раннего промотора вируса SV40 (190 п.н.), но не имеющую люциферазного гена.
Ингибирующую плазмиду pSV конструируют посредством вырезания фрагмента Sal I - Hind III, содержащего люциферазный ген, из указанной выше плазмиды pGL2-pv. Получающийся в результате фрагмент в 3,1 т.п.н. подвергают реакции вставки с ферментом Кленова, очищают с помощью электрофореза в агарозном геле, и затем его аутолигируют, получая, таким образом, плазмиду pSV, которая содержит промотор SV40, но не имеет люциферазного гена.
Плазмиду-носитель рС получают путем разрезания указанной выше плазмиды pGL2-b ферментами рестрикции Sal I и Hind III. Получающийся в результате фрагмент в 2,9 т.п.н. подвергают реакции вставки с ферментом Кленова, очищают с помощью электрофореза в агарозном геле, и затем его аутолигируют, получая, таким образом, плазмиду рС.
Все описанные выше плазмидные конструкции используют для трансформации штамма Е. Coli XL1-Blue обычными способами (Ausubel R. et al., Current Protocols in Molecular Biology. Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, New York). Плазмидную ДНК экстрагируют из трансформированных клонов с помощью минипрепаративного метода щелочного лизиса (по Ausubel, цит. выше). Плазмидную ДНК проверяют с помощью рестрикционного анализа и электрофореза в агарозном геле. Отбирают клоны с предполагаемой картиной. Чтобы получить очищенные плазмидные препараты для применения при трансфекции клеток млекопитающих, получают 300 мл культур отобранных трансформантов Е. Coli XL1-Blue. Затем плазмиды очищают с помощью ионообменных миниколонок 500 с наконечником QIAGEN в соответствии с инструкциями изготовителя.
Пример 2. Клеточные линии и условия культивирования. Клетки гепатомы человека HepG2 (ATCC) культивируют в минимальной поддерживающей среде (MEM) с добавлением 10% FCS, 5 мМ L-глутамина, 20 мМ HEPES, 100 Е/мл пенициллина/стрептомицина. Клетки рака молочной железы человека T47D (ATCC) культивируют в модифицированной по способу Дульбекко среде Игла (DMEM) с добавлением 10% FCS, 5 мМ L-глутамина, 20 мМ HEPES, 100 Е/мл пенициллина/стрептомицина. Клетки миелоидного лейкоза мыши M1 (ATCC) культивируют в RPMI с добавлением 10% FCS, 5 мМ L-глутамина, 20 мМ HEPES, 100 Е/мл пенициллина/стрептомицина. Культивирование вышеуказанных клеточных линий осуществляют в присутствии или в отсутствие соответствующий дозы IL-6 (производный СНО h IL-6 от Interpharm Laboratories), как описано ниже.
Пример 3. Промежуточная трансфекция и анализы люциферазы и β-галактозидазы. Промежуточную трансфекцию клеток гепатомы человека HepG2 и клеток рака молочной железы человека T47D осуществляют с использованием преципитации ДНК фосфатом кальция в буфере HEPES, по стандартным процедурам (Ausubel R. et al., Current Protocols in Molecular Biology. Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, New York). Промежуточную трансфекцию клеток миелоидного лейкоза мыши M1 осуществляют с использованием DEAE-декстрана обычными процедурами (по Ausubel, цит. выше).
Чтобы обнаружить активность люциферазы и β-галактозидазы, клетки экстрагируют in situ путем инкубации в течение 15 минут при комнатной температуре с 1 мл/106 клеток буфере для экстракции (25 мМ трис-фосфата, рН 7,8, 2 мМ DTT, 2 мМ ЭДТК, 10% глицерина, 1% тритона Х-100). В случае люциферазной активности непосредственно анализируют 20 мкл клеточного экстракта со 100 мкл буфера для анализа люциферазы (20 мМ трицина, 1,07 мМ (МgСО3)4Mg(ОН)2 • 5Н2О, 2,67 мМ МgSO4, 0,1 мМ ЭДТК, 33,3 мМ DTT, 0,27 мМ кофермента А, 0,47 мМ люциферина, 0,53 мМ АТФ). В случае активности β-галактозидазы 10 мкл клеточного экстракта инкубируют в течение 1 часа при 37oС со 100 мкл субстрата Lumigal (от Lumigen). Считывание данных с Lumigal и люциферазы осуществляют с помощью люменметра Berthold Autolumat LB953, причем излучаемая мощность представляет число отсчетов за секунды (чос), взятое за период 30 секунд в случае люциферазы и за период 15 секунд в случае β-галактозидазы.
Показано, что репортерная плазмида pM8SVL предоставляет IL-6-отвечаемость после промежуточной трансфекции клеток HepG2, повышая экспрессию люциферазной активности в 50-100 раз (Serlupi Crescenzi et al., сообщение на 12-й Европейской конференции по иммунологии, Барселона, 14-17 июня 1994).
Эту плазмиду также испытывают в клетках рака молочной железы человека T47D и в клетках миелоидного лейкоза мыши M1. Клетки M1 трансфектируют 0,5 мкг ДНК на 106 клеток с использованием DEAE-декстрана, в то время как для кальцийфосфатной трансфекции клеток T47D используют 2,5 мкг ДНК на 105 клеток.
Только весьма ограниченные признаки разделяются этими двумя клеточными линиями, кроме их обычной реакции на человеческий IL-6. Результаты (фиг.3) показывают, что молекула ДНК М8 в плазмиде pM8SVL существенно активна в обеих клеточных линиях после обработки IL-6. Как показывает фиг.3, значительная реакцию на IL-6 также наблюдается в клетках M1 с плазмидой репортерного гена pM8TKL, где молекула М8 фланкирована тимидинкиназным промотором, который отличается от промотора SV40, присутствующего в pM8SVL.
Зависимость от времени люциферазной индуцибельности трансфектированных клеток HepG2 проверяют после обработки IL-6 (1 нг/мл). Плазмиду pM8SVL используют в качестве позитивной плазмиды репортерного гена (при 0,2 мкг/105 клеток). Клетки трансфектируют в течение ночи, расщепляют и затем подвергают обработке IL-6. Результаты приводятся на фиг.4, и они показывают, что почти полного ответа на IL-6 можно достичь спустя только два часа после обработки IL-6.
Пример 4. Испытание ингибирующей плазмиды рМ8. Ингибирование активности IL-6 молекулами ДНК М8 измеряют после котрансфекции в клетки HepG2 I) плазмиды репортерного гена pM8SVL, отвечающей на IL-6, и II) молекулы М8, вставленной в ингибирующую плазмиду М8. Эта последняя плазмида выступает в роли хозяина последовательности М8, но она не обладает способностью предоставлять отвечаемость на IL-6. Клетки HepG2 трансфектируют 2,5 мкг/105 клеток отвечающей на IL-6 репортерной плазмиды pM8SVL (содержащей М8 и ген люциферазы) и 10- или 50-кратным молярным избытком рМ8, в присутствии различных доз IL-6. Общее количество ДНК на трансфекцию поддерживают постоянным, используя плазмиду-носитель рС, которая идентична рМ8, за исключением отсутствия в первой плазмиде специфического фрагмента ДНК М8 длиной в 165 п. н.
Как видно из фиг.5, ингибирующая плазмида не показывает существенного и воспроизводимого специфического ингибирования активности IL-6 в четырех экспериментах, даже при 50-кратном молярном избытке ингибирующей плазмиды рМ8. В этих экспериментах отвечающую на IL-6 плазмиду репортерного гена используют при дозе 0,1 мкг/105 клеток, в то время как постоянное количество общей ДНК, используемой при трансфекции, составляет 5 мкг/105 клеток. Субоптимальная доза IL-6, использованная в этих экспериментах, составляет 1 нг/мл. Как показывает фиг.5, изменчивость при этих условиях эксперимента приемлема, исходя из факта, что различные трансфекции сами по себе являются неизбежным источником изменчивости.
Пример 5. Испытание инигибирующей плазмиды pM8SV. Результаты, приведенные на фиг.5, являются несколько неожиданными, поскольку активная ингибирующая ДНК-последовательность М8 ингибирующей плазмиды рМ8 идентична активной последовательности плазмиды репортерного гена pM8SVL. Поэтому после котрансфекции следовало бы ожидать конкуренции между двумя идентичными М8 последовательностями, присутствующими в различных плазмидах, приводящей к ингибированию активности IL-6 при анализе репортерного гена.
Кроме того, описанные выше результаты нельзя объяснить с помощью присутствия избытка активированного IL-6-специфического фактора (факторов) транскрипции, которые недостаточно нейтрализованы молекулами ингибирующей ДНК М8, так как данные получают в присутствии ограниченного количества IL-6. Кроме того, опубликованные данные о подобных экспериментах с сайтами связывания ДНК для известных факторов транскрипции (26-30) не совместимы с результатами, приведенными на фиг.5.
Другим объяснением результатов, показанных на фиг.5, может быть то, что отличающиеся от М8 последовательности в плазмиде репортерного гена могут вносить вклад в IL-6-специфическую сигнальную трансдукцию. Эти последовательности должны отсутствовать в ингибирующей последовательности рМ8, но они должны присутствовать в позитивной плазмиде репортерного гена pM8SVL (например, последовательности раннего генного промотора SV40, которые могут связывать общие факторы транскрипции). Ингибирующая плазмида рМ8 поэтому может быть неэффективной при конкуренции с плазмидой репортерного гена pM8SVL.
Чтобы проверить эту гипотезу, конструируют ингибирующую плазмиду (pM8SV), содержащую в качестве ингибирующих IL-6 ДНК-последовательностей как последовательность М8, так и промоторную последовательность SV40 (см. фиг. 1). Эту ингибирующую плазмиду проверяют при анализе репортерного гена IL-6 с клетками HepG2. Осуществляют четыре независимых эксперимента, при двукратном повторении трансфекции на эксперимент. Трансфекцию осуществляют 0,1 мкг репортерной плазмидной ДНК и молярным избытком инигибирующей плазмиды, как показано на фиг. 6. Общее количество трансфектированной ДНК поддерживают постоянным с помощью плазмиды-носителя. Трансфектированные клетки обрабатывают в течение 18 часов 1 нг/мл IL-6.
Результаты, приведенные на фиг.6, показывают четкое зависимое от дозы ингибирование активности IL-6 ингибирующей плазмидой pM8SV. Необработанные данные для фиг.6 приводятся в табл.1. При каждом эксперименте осуществляют три повторных трансфекции на дозу ингибирующей плазмиды. Для каждого эксперимента величины в случае индуцирования и без индуцирования, приведенные в отдельной колонке, приводят к одной и той же трансфекции. Данные значения светового излучения представляют чос за период в 30 секунд. Как можно видеть из табл.1, наблюдается некоторое непостоянство в этих экспериментах, особенно, при более низких дозах ингибирующей плазмиды, но обычно коэф. вариации повторных трансфекций твердо составляет ниже 20%.
Чтобы исключить предположение, что ингибирование активности IL-6, обеспеченное ингибирующей плазмидой pM8SV, происходит исключительно благодаря ДНК-последовательности промотора SV40, а не сочетанию последовательностей М8 и SV40, конструируют дополнительную ингибирующую плазмиду, и испытывают ее при анализе репортерного гена. Эта плазмида содержит в качестве инигибитора активности IL-6 только ДНК-последовательность SV40, без последовательности М8, а также люциферазного гена.
Трансфекцию осуществляют 0,1 мкг репортерной плазмидной ДНК и молярным избытком ингибирующей плазмиды, как показано на фиг.7. Общее количество трансфектированной ДНК поддерживают постоянным с помощью плазмиды-носителя. Трансфектированные клетки обрабатывают в течение 18 часов 1 нг/мл IL-6. Результаты, приведенные на фиг. 7, показывают, что эта ингибирующая плазмида (pSV) демонстрирует только частичное ингибирование активности IL-6, которое никогда не превышает 40% и не зависит от дозы. Это позволяет сделать вывод, что одной ДНК-последовательности SV40 недостаточно для эффективного ингибирования активности IL-6. С другой стороны, содержащая люциферазу репортерная плазмида pGL2-pv содержит промоторную последовательность SV40, но не содержит последовательность М8, давая, таким образом, в результате, основной уровень экспрессии люциферазы, более не индуцируемый IL-6. В этой плазмиде основной уровень экспрессии люциферазы не ингибируется ингибирующей плазмидой pM8SV, показывая, таким образом, что факторы транскрипции, которые специфически связываются только промоторной областью SV40 pGL2-pv, не удаляются эффективно ингибирующей плазмидой pM8SV. В действительности, в присутствии последней ингибирующей плазмиды активность люцеферазы из репортерной плазмиды pGL2-pv даже выше, чем в отсутствие указанной инигибирующей плазмиды (не показано).
Пример 6. Игибирование pM8SV активности IL-6, предоставленной плазмидой репортерного гена pHPSVL. Авторы затем пожелали проверить ингибирующую плазмиду pM8SV при дополнительном анализе репортерного гена для IL-6, когда последовательность ДНК-мишени, опосредующей сигнал IL-6 в плазмиде репортерного гена, не вполне соответствует ингибирующей последовательности М8. Поэтому клетки HepG2 трансфектируют плазмидой pHPSVL, которая содержит 841 пару оснований из промоторной последовательности гена человеческого гаптоглобина, фланкированную промотором SV40 и люциферазным геном. В этой плазмиде присутствует один сайт APRE из гаптоглобиновой промоторной последовательности (согласно Maeda at al., J. Biol. Chem., 260 (11), pp.6698-709, June 10, 1985). Авторы предварительно показали, что эта плазмида отвечает на IL-6 6-8-кратным увеличением экспрессии люциферазы (Surlupi Crescenzi et al., сообщение на 12-й Европейской конференции по иммунологии, Барселона, 14-17 июня 1994).
Результаты одного из экспериментов при трехкратном повторе трансфекции приводятся на фиг.8. После котрансфекции плазмиды репортерного гена pHPSVL с 50-кратным молярным избытком плазмиды-носителя индуцибельность за счет IL-6 дает, в результате, экспрессию люциферазы в 4 раза выше основного уровня. Напротив, котрансфекция с 50-кратным молярным избытком ингибирующей плазмиды pM8SV полностью разрушает индуцибельность за счет IL-6. Следовательно, ингибирующая плазмида pM8SV способна ингибировать активность IL-6 также тогда, когда испытывают отвечающую на IL-6 плазмиду репортерного гена, отличающуюся от pM8SVL (например, репортерную плазмиду pHPSVL).
Пример 7. Испытание ингибирующей плазмиды pM8SV в клетках T47D. Ингибирующую плазмиду рМ8SV также испытывают при анализе репортерного гена pM8SVL, используя клетки рака молочной железы человека T47D, где трансдукция сигнала IL-6 может быть иной, чем в клетках гепатомы. Как упоминалось ранее, анализ репортерного гена IL-6 с плазмидой репортерного гена pM8SVL работает в этой клеточной линии, хотя он не оптимизирован. Так как чувствительность анализа с клетками T47D иногда ниже, трансфекцию осуществляют с 1 мкг позитивной плазмиды репортерного гена на 105 клеток, что является относительно высоким уровнем плазмидной ДНК. Поэтому в этом эксперименте наблюдают неспецифическое ингибирование в присутствии избытка плазмиды-носителя или инигибирующей плазмиды, приводящее, в результате, к более высокой изменчивости IL-6-специфического ингибирования.
Результаты приводятся в табл.2. Показаны средние (ср) и стандартные отклонения (ст.откл.) трехкратно повторенной трансфекции в двух экспериментах.
Средние величины кратной индукции вычисляют из необработанных значений каждой трансфекции. В экспериментах 1 и 2 используют 1 и 0,5 мкг плазмиды репортерного гена, соответственно, на 105 трансфектированных клеток.
В этих экспериментах осуществляют отдельную трансфекцию плазмиды-носителя и ингибирующей плазмиды, причем обе плазмиды используют при указанном молярном избытке по отношению к репортерной плазмиде.
После трансфекции клетки индуцируют в течение 18 часов 1 нг/мл IL-6. Приведенные величины светового излучения являются чос за период в 30 секунд. Специфическое ингибирование IL-6 в этих экспериментах оценивают путем сравнения индукции, полученной в присутствии избытка ингибирующей плазмиды, и индукции, полученной в присутствии соответствующей дозы плазмиды-носителя.
Кроме того, из-за неспецифического ингибирования основной уровень экспрессии люциферазы приближается к количественному пределу анализа. Результаты, приведенные в табл. 2 (см. эксперимент 1), показывают, что после трансфекции, повторенной трижды, релевантное специфическое ингибирование активности IL-6 получают при 20-кратном молярном избытке ингибирующей плазмиды pM8SV, а не при 10-кратном молярном избытке. В этом эксперименте нельзя провести испытания при 50-кратном молярном избытке ингибирующей плазмиды, поскольку неспецифическое ингибирование становится слишком высоким.
Эти результаты нельзя воспроизвести в дополнительном эксперименте, когда используют 0,5 мкг ДНК на 105 клеток (табл.2, см. эксперимент 2). Причиной такого отсутствия воспроизводимости может быть относительно высокая изменчивость и низкая чувствительность анализа репортерного гена T47D. С другой стороны, эти результаты может объяснить различная селективность клеток-мишеней.
Пример 8. Определение минимальной ингибирующей последовательности ДНК. Чтобы идентифицировать минимальную ДНК-последовательность, которая сохраняет способность ингибировать связывание факторов транскрипции, релевантных для IL-6-индуцибельности, можно использовать экспериментальный подход анализа сдвига электрофоретической подвижности (EMSA) (по Ausubel). Испытание на функциональное ингибирование, сообщенное этой минимальной последовательностью, можно осуществить с использованием анализа репортерного гена, указанного в примере 3 и последующих примерах. Авторы показали, что минимальная ДНК-последовательность, которая функционально ингибирует активность IL-6 при анализе репортерного гена, является фрагментом Bam I-Hind III в 350 п.н. ингибирующей плазмиды pM8SV, которая содержит 8-кратный повтор APRE-ДНК-последовательности и ранней промоторной последовательности SV40. Известно, что эта последняя последовательность содержит сайты связывания для общих факторов транскрипции, такие как АР-1-подобный сайт (как сообщают Zenke et al. , EMBA J. , 5(2), pp.387-97, 1986), и 6-кратный повтор сайта Sp-1 (как сообщают Dynan et al., Cell, 35, pp.79-87, 1983). Фрагмент ДНК Bam I-Hind III может быть удален из ее 5'- и/или 3'-концов с помощью обычных методов, таких как PCR или обработка нуклеазой (по Ausubel), чтобы последовательность содержала, например, две APRE-последовательности и только один или несколько сайтов связывания для специфических факторов транскрипции из раннего промотора SV40. Получающиеся в результате ДНК-последовательности можно использовать для испытаний на ингибирование при анализе репортерного гена на основе pSVM8L в клетках HepG2.
Кроме того, минимальный фрагмент ДНК, который сохраняет полную способность функционально ингибировать сигнал IL-6, может быть использован при EMSA путем мечения этой ДНК 32P-нуклеотидом посредством обычных способов, таких как концевое мечение или вставка при реакциях Кленова. Получающийся в результате меченый ДНК-фрагмент можно инкубировать с нуклеарными экстрактами из клеток HepG2 после обработки IL-6.
Увеличивающееся количество конкурирующей ДНК-последовательности также можно коинкубировать, как какой-нибудь из немеченых ДНК-фрагментов, который образовался в результате вышеуказанных делеций фрагмента ингибирующей ДНК Bam I-Hind III. После инкубации смесь можно подвергнуть электрофорезу в неденатурирующем геле. Связывание релевантных факторов транскрипции с испытываемым меченым фрагментом ДНК будет обнаруживаться по сдвигу в подвижности геля (замедлению), ожидаемому для несвязанной меченой ДНК. Ингибирование этого связывания в присутствии конкурирующих немеченых ДНК-последовательностей будет обнаруживаться по специфическому исчезновению сдвинутых полос в геле.
Claims (11)
1. Нуклеотидная последовательность, способная ингибировать активность IL-6, которая содержит i) восьмикратный повтор нуклеотидной последовательности, которая представляет собой последовательность элемента реакции острой фазы (APRE-элемент) общей формулы ZXMYKGKAA, где Z представляет Т, или G, или может отсутствовать; Х представляет Т или может отсутствовать; М представляет С или А; Y представляет С или Т и К представляет Т или G, в сочетании с ii) по меньшей мере, одной нуклеотидной последовательностью, составляющей сайт связывания фактора транскрипции иной, чем APRE-элемент, и такой, что присутствует в области промотора.
2. Нуклеотидная последовательность по п.1, где (i) является последовательностью TTCTGGGAA.
3. Нуклеотидная последовательность по любому из предшествующих пунктов, где (ii) выбирают из группы, состоящей из блока ТАТА и сайтов связывания для следующих факторов транскрипции: АР-1, АР-2, HNF-1, SP-1, NF-kB, Oct-1, E-2 и SRF.
4. Нуклеотидная последовательность по любому из предшествующих пунктов, где последовательность (i) содержит, по меньшей мере, два различных APRE- элемента.
5. Нуклеотидная последовательность по любому из предшествующих пунктов, где последовательность (ii) содержит, по меньшей мере, две различные олигонуклеотидные последовательности, составляющие сайт связывания фактора транскрипции.
6. Нуклеотидная последовательность по п.5, где последовательность (ii) является ранним промотором SV40.
7. Нуклеотидная последовательность по п.1, имеющая вид SEQ ID N 1.
8. Плазмидный вектор для трансфекции в клетки млекопитающих, содержащий нуклеотидную последовательность по п.1, функционально связанную с регуляторными участками.
9. Нуклеотидная последовательность по любому из пп.1-7 для ингибирования действия IL-6 при терапии.
10. Фармацевтическая композиция для ингибирования действия IL-6, содержащая эффективное количество нуклеотидной последовательности по любому из пп. 1-7 вместе с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми носителями и/или эксципиентами.
11. Фармацевтическая композиция для ингибирования IL-6, содержащая эффективное количество плазмидного вектора по п.8 вместе с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми носителями и/или эксципиентами.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PCT/EP1995/001778 WO1996035782A1 (en) | 1995-05-11 | 1995-05-11 | Il-6 activity inhibitor |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU97120584A RU97120584A (ru) | 1999-08-27 |
| RU2205874C2 true RU2205874C2 (ru) | 2003-06-10 |
Family
ID=8166014
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU97120584/13A RU2205874C2 (ru) | 1995-05-11 | 1995-05-11 | Нуклеотидная последовательность, способная ингибировать активность il-6, плазмидный вектор для трансфекции в клетки млекопитающих, нуклеотидная последовательность, используемая при терапии, фармацевтическая композиция (варианты) |
Country Status (17)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6004813A (ru) |
| EP (1) | EP0824588B1 (ru) |
| JP (1) | JP4173539B2 (ru) |
| KR (1) | KR100449677B1 (ru) |
| AT (1) | ATE271128T1 (ru) |
| AU (1) | AU715125B2 (ru) |
| CA (1) | CA2220433C (ru) |
| DE (1) | DE69533264T2 (ru) |
| DK (1) | DK0824588T3 (ru) |
| ES (1) | ES2220929T3 (ru) |
| HK (1) | HK1016213A1 (ru) |
| IL (1) | IL118158A (ru) |
| MX (1) | MX9708663A (ru) |
| RU (1) | RU2205874C2 (ru) |
| UA (1) | UA63888C2 (ru) |
| WO (1) | WO1996035782A1 (ru) |
| ZA (1) | ZA963593B (ru) |
Families Citing this family (42)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6727230B1 (en) | 1994-03-25 | 2004-04-27 | Coley Pharmaceutical Group, Inc. | Immune stimulation by phosphorothioate oligonucleotide analogs |
| US6429199B1 (en) | 1994-07-15 | 2002-08-06 | University Of Iowa Research Foundation | Immunostimulatory nucleic acid molecules for activating dendritic cells |
| US6207646B1 (en) | 1994-07-15 | 2001-03-27 | University Of Iowa Research Foundation | Immunostimulatory nucleic acid molecules |
| US6239116B1 (en) | 1994-07-15 | 2001-05-29 | University Of Iowa Research Foundation | Immunostimulatory nucleic acid molecules |
| CA2237114A1 (en) * | 1995-11-07 | 1997-05-15 | Kaneka Corporation | Autoantigens |
| EP0855184A1 (en) * | 1997-01-23 | 1998-07-29 | Grayson B. Dr. Lipford | Pharmaceutical composition comprising a polynucleotide and an antigen especially for vaccination |
| CA2281838A1 (en) | 1997-02-28 | 1998-09-03 | University Of Iowa Research Foundation | Use of nucleic acids containing unmethylated cpg dinucleotide in the treatment of lps-associated disorders |
| US6406705B1 (en) | 1997-03-10 | 2002-06-18 | University Of Iowa Research Foundation | Use of nucleic acids containing unmethylated CpG dinucleotide as an adjuvant |
| US6339068B1 (en) | 1997-05-20 | 2002-01-15 | University Of Iowa Research Foundation | Vectors and methods for immunization or therapeutic protocols |
| ATE356630T1 (de) | 1998-04-03 | 2007-04-15 | Univ Iowa Res Found | Verfahren und produkte zur stimulierung des immunsystems mittels immunotherapeutischer oligonukleotide und zytokine |
| EP0972780A1 (en) * | 1998-05-18 | 2000-01-19 | Applied Research Systems ARS Holding N.V. | Il-6 antagonist peptides |
| BR9913562A (pt) | 1998-09-11 | 2001-05-22 | Ajinomoto Kk | Derivados de benzeno, inibidor de ativação de ap-1 e nf-capa b, inibidor de produção de citoquina inflamatória, inibidor de produção de metaloprotease matricial ou inibidor de aparecimento de fator de adesão de célula inflamatório, e, agente antiinflamatório, anti-reumático, imunossupressor, inibidor de metástase cancerosa, remédio para arterioesclerose e agente antiviral |
| WO2001016166A2 (en) | 1999-08-27 | 2001-03-08 | The United States Of America, Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Polypeptides, comprising il-6 ligand-binding receptor domains, and related nucleic acids, antibodies, compositions, and methods of use |
| US6949520B1 (en) | 1999-09-27 | 2005-09-27 | Coley Pharmaceutical Group, Inc. | Methods related to immunostimulatory nucleic acid-induced interferon |
| WO2003084936A2 (en) * | 2002-04-10 | 2003-10-16 | Orchid Chemicals & Pharmaceuticals Limited | Amino substituted pyrimidinone derivatives useful in the treatment of inflammation and immunological |
| US6794401B2 (en) * | 2003-01-17 | 2004-09-21 | Bexel Pharmaceuticals, Inc. | Amino acid phenoxy ethers |
| US7781464B2 (en) * | 2003-01-17 | 2010-08-24 | Bexel Pharmaceuticals, Inc. | Heterocyclic diphenyl ethers |
| US7521465B2 (en) * | 2003-01-17 | 2009-04-21 | Bexel Pharmaceuticals, Inc. | Diphenyl ether derivatives |
| US7087576B2 (en) * | 2003-10-07 | 2006-08-08 | Bexel Pharmaceuticals, Inc. | Dipeptide phenyl ethers |
| MXPA06008700A (es) | 2004-02-06 | 2007-01-19 | Morphosys Ag | Anticuerpos anti-cd38 humanos y usos para los mismos. |
| EP1858845A2 (en) * | 2005-03-18 | 2007-11-28 | Orchid Chemicals and Pharmaceuticals Limited | Novel tyrosine derivatives |
| US20080267888A1 (en) * | 2005-05-26 | 2008-10-30 | Pandey Surendrakumar Satyanara | Heterocyclic Derivatives |
| EP1896476A2 (en) * | 2005-06-28 | 2008-03-12 | Orchid Research Laboratories Limited | Novel pyrazolopyrimidinone derivatives |
| CA2625681C (en) | 2005-10-12 | 2016-08-02 | Morphosys Ag | Generation and profiling of fully human hucal gold-derived therapeutic antibodies specific for human cd38 |
| US7863446B2 (en) * | 2006-01-19 | 2011-01-04 | Orchid Research Laboratories Limited | Heterocycles |
| CN101360717B (zh) * | 2006-01-19 | 2014-04-16 | 幽兰化学医药有限公司 | 包含嘧啶环的化合物 |
| US20080221103A1 (en) * | 2007-03-09 | 2008-09-11 | Orchid Research Laboratories Ltd. | New heterocyclic compounds |
| EP2158316B1 (en) | 2007-05-11 | 2015-04-15 | Adynxx, Inc. | Gene expression and pain |
| WO2009095773A2 (en) | 2008-02-01 | 2009-08-06 | Orchid Research Laboratories Limited | Novel heterocycles |
| BRPI0923225A2 (pt) | 2008-12-02 | 2016-10-04 | Chiralgen Ltd | metodo para sintese de acidos nucleicos modificados no atomo de fosforo |
| CN102596204B (zh) | 2009-07-06 | 2016-11-23 | 波涛生命科学有限公司 | 新的核酸前药及其使用方法 |
| JP5868324B2 (ja) | 2010-09-24 | 2016-02-24 | 株式会社Ｗａｖｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｊａｐａｎ | 不斉補助基 |
| US9605019B2 (en) | 2011-07-19 | 2017-03-28 | Wave Life Sciences Ltd. | Methods for the synthesis of functionalized nucleic acids |
| RU2668136C2 (ru) | 2012-05-10 | 2018-09-26 | Эйдинкс, Инк. | Композиции для доставки активных ингредиентов |
| ES2862073T3 (es) | 2012-07-13 | 2021-10-06 | Wave Life Sciences Ltd | Grupo auxiliar asimétrico |
| DK2872147T3 (da) | 2012-07-13 | 2023-02-20 | Wave Life Sciences Ltd | Fremgangsmåde til fremstilling af kirale oligonukleotider |
| CN104684923B (zh) | 2012-07-13 | 2018-09-28 | 株式会社新日本科学 | 手性核酸佐剂 |
| JPWO2015108047A1 (ja) | 2014-01-15 | 2017-03-23 | 株式会社新日本科学 | 免疫誘導活性を有するキラル核酸アジュバンド及び免疫誘導活性剤 |
| WO2015108048A1 (ja) | 2014-01-15 | 2015-07-23 | 株式会社新日本科学 | 抗腫瘍作用を有するキラル核酸アジュバンド及び抗腫瘍剤 |
| JPWO2015108046A1 (ja) | 2014-01-15 | 2017-03-23 | 株式会社新日本科学 | 抗アレルギー作用を有するキラル核酸アジュバンド及び抗アレルギー剤 |
| KR20220106232A (ko) | 2014-01-16 | 2022-07-28 | 웨이브 라이프 사이언시스 리미티드 | 키랄 디자인 |
| US10287583B2 (en) | 2014-08-15 | 2019-05-14 | Adynxx, Inc. | Oligonucleotide decoys for the treatment of pain |
-
1995
- 1995-05-11 DE DE69533264T patent/DE69533264T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1995-05-11 MX MX9708663A patent/MX9708663A/es unknown
- 1995-05-11 CA CA2220433A patent/CA2220433C/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-05-11 KR KR1019970708022A patent/KR100449677B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1995-05-11 RU RU97120584/13A patent/RU2205874C2/ru active
- 1995-05-11 AU AU25267/95A patent/AU715125B2/en not_active Expired
- 1995-05-11 ES ES95919438T patent/ES2220929T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1995-05-11 AT AT95919438T patent/ATE271128T1/de active
- 1995-05-11 EP EP95919438A patent/EP0824588B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-05-11 WO PCT/EP1995/001778 patent/WO1996035782A1/en active IP Right Grant
- 1995-05-11 DK DK95919438T patent/DK0824588T3/da active
- 1995-05-11 JP JP53368396A patent/JP4173539B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1995-05-11 US US08/945,726 patent/US6004813A/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-11-05 UA UA97126018A patent/UA63888C2/uk unknown
-
1996
- 1996-05-06 IL IL11815896A patent/IL118158A/en not_active IP Right Cessation
- 1996-05-07 ZA ZA963593A patent/ZA963593B/xx unknown
-
1998
- 1998-11-09 HK HK98111831A patent/HK1016213A1/xx not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| A. RAY et al. On the mechnism for efficient repression of the IL-6 promotor by glucocorticoids: enhancer, TATA box and RNA start site occlusion. Molecular and Cellular Biology. 1990, v.10, № 11, p.5736-5746. H.WU et al. Inhibition of in vitro transcription by specific double-stranded oligodeoxyribonucleotides. Gene, 1990, v.89, p.203-209. C.CLUESL et al. Ex vivo regulation of specific gene expression of nanomolar concentration of double-stranded duble oligonucleotides. Nucleic Acids Research. 1993, v.21, n.15, p.3405-3411. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU2526795A (en) | 1996-11-29 |
| JP4173539B2 (ja) | 2008-10-29 |
| KR19990014681A (ko) | 1999-02-25 |
| WO1996035782A1 (en) | 1996-11-14 |
| KR100449677B1 (ko) | 2004-11-20 |
| IL118158A (en) | 2004-07-25 |
| IL118158A0 (en) | 1996-09-12 |
| AU715125B2 (en) | 2000-01-20 |
| US6004813A (en) | 1999-12-21 |
| DK0824588T3 (da) | 2004-08-16 |
| ATE271128T1 (de) | 2004-07-15 |
| UA63888C2 (en) | 2004-02-16 |
| EP0824588B1 (en) | 2004-07-14 |
| ZA963593B (en) | 1996-11-25 |
| ES2220929T3 (es) | 2004-12-16 |
| HK1016213A1 (en) | 1999-10-29 |
| DE69533264D1 (de) | 2004-08-19 |
| CA2220433A1 (en) | 1996-11-14 |
| DE69533264T2 (de) | 2004-11-25 |
| EP0824588A1 (en) | 1998-02-25 |
| JPH11504816A (ja) | 1999-05-11 |
| MX9708663A (es) | 1998-02-28 |
| CA2220433C (en) | 2010-02-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2205874C2 (ru) | Нуклеотидная последовательность, способная ингибировать активность il-6, плазмидный вектор для трансфекции в клетки млекопитающих, нуклеотидная последовательность, используемая при терапии, фармацевтическая композиция (варианты) | |
| MXPA97008663A (en) | Activity inhibitor i | |
| Wilson et al. | A nonerythroid GATA-binding protein is required for function of the human preproendothelin-1 promoter in endothelial cells | |
| Woloshin et al. | MSX1 inhibits MyoD expression in fibroblast× 10T½ cell hybrids | |
| US6238918B1 (en) | DNA sequence encoding the tumor suppressor gene ING1 | |
| Koyano-Nakagawa et al. | Molecular cloning of a novel human cDNA encoding a zinc finger protein that binds to the interleukin-3 promoter | |
| McCracken et al. | An alternative pathway for expression of p56lck from type I promoter transcripts in colon carcinoma | |
| Rothofsky et al. | CROC-1 encodes a protein which mediates transcriptional activation of the human FOS promoter | |
| Jackson et al. | Transcriptional regulation of the PCNA promoter by p53 | |
| Houglum et al. | LAP (NF-IL6) transactivates the collagen alpha 1 (I) gene from a 5'regulatory region. | |
| Falzon et al. | Multiple protein-binding sites in an intracisternal A particle long terminal repeat | |
| Pierrou et al. | Selection of high-affinity binding sites for sequence-specific, DNA binding proteins from random sequence oligonucleotides | |
| Dehbi et al. | Transcriptional activation of the CEF-4/9E3 cytokine gene by pp60v-src | |
| Neims et al. | Identification of a second inducible DNA-protein interaction in the kappa immunoglobulin enhancer | |
| US5912168A (en) | CD95 regulatory gene sequences | |
| Piatak et al. | Sequences locating the 5'ends of the major simian virus 40 late mRNA forms | |
| US7053194B2 (en) | Compositions and methods for p53-mediated repression of gene expression | |
| EP0846761A1 (en) | A novel transcription factor expressed in cycling cells, nucleic acid molecules encoding said transcription factor and its promoter region and uses thereof | |
| Brockmann et al. | A multiprotein complex consisting of the cellular coactivator p300, AP-1/ATF, as well as NF-κB is responsible for the activation of the mouse major histocompatibility class I (H-2Kb) enhancer A | |
| Nolan et al. | Transcriptional regulation of the human chromogranin A gene by its 5′ distal regulatory element: novel effects of orientation, structure, flanking sequences, and position on expression | |
| Toutant et al. | Promoter elements and transcriptional control of the chicken β tropomycin gene | |
| Chen et al. | Promoter analysis of interleukin 19 | |
| KR0158430B1 (ko) | p53 단백질을 이용한 B형 간염 바이러스의 복제 억제방법 | |
| EP1164198B1 (en) | Method for screening anticancer agent | |
| US5534631A (en) | Cellular factor ILF |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PC4A | Invention patent assignment |
Effective date: 20080721 |
|
| PC43 | Official registration of the transfer of the exclusive right without contract for inventions |
Effective date: 20100531 |