BRPI0618399B1

BRPI0618399B1 - Anticorpo específico anti-cd38 humano, composição de ácido nucleico, vetor de expressão, composição farmacêutica, uso do anticorpo e uso de uma composição farmacêutica

Info

Publication number: BRPI0618399B1
Application number: BRPI0618399-9A
Authority: BR
Inventors: Ute Jager; Michael Tesar
Original assignee: Morphosys Ag
Priority date: 2005-10-12
Filing date: 2006-10-12
Publication date: 2023-10-03
Also published as: KR101512853B1; CN101287764A; US20120052078A1; PL2860192T3; US8088896B2; ZA200803208B; EP3284756B1; RU2425841C2; RS56677B1; US20210292431A1; JP5752667B2; HRP20171978T1; EP2860192A2; CN103554259B; HUE035250T2; EP3284756A1; BRPI0618399A2; US20190077877A1; CN101287764B; US11059902B2

Abstract

região de ligação de antígeno isolada que é específica para cd38, anticorpo isolado ou um fragmento funcional do mesmo que é específico para cd38, anticorpo isolado ou um fragmento funcional do mesmo, imunoglobulina isolada, cadeia pesada variável de uma região de ligação de antígeno isolada, cadeia leve variável de uma região de ligação de antígeno isolada, sequência isolada de ácido nucléico, sequência de ácido nucléico que codifica uma cadeia pesada variável de uma região de ligação de antígeno isolada, sequência de ácido nucleico, vetor, célula isolada, composição farmacêutica, uso da composição farmacêutica, método de indução de mortandade específica das células de tumor que expressam cd38, método de detecção da mortandade específica das células de tumor que expressam cd38, método de detecção da presença de cd38 em um tecido ou em uma célula de origem de miniporco, método de detecção de cd38 em um eritrócito que expressa cd38 e composição de diagnóstico a presente invenção apresenta novos anticorpos e métodos para a utilização de regiões de ligação de antígeno recombinante e anticorpos e fragmentos funcionais que contêm tais regiões de ligação de antígeno que são específicas para cd38, que desempenha um papel integral em vários distúrbios ou condições. esses métodos se beneficiam dos anticorpos recentemente descobertos e das propriedades surpreendentes de tais anticorpos, tais como a capacidade de se ligar ao cd38 de origem de miniporco e a capacidade de induzir, por reticulação, uma mortandade específica de células que expressam cd38. esses anticorpos, bem como os novos métodos para a utilização desses anticorpos, podem ser utilizados para o tratamento, por exemplo, de malignidades hematológicas tais como o mieloma múltiplo.

Description

DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção refere-se a uma região de ligação de antígeno isolada que é específica para CD38, que compreende (i) uma região H-CDR3 indicada nas SEQ ID NO.: 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105 ou 106 ou (ii) uma região H-CDR3 que tem uma identidade de pelo menos sessenta por cento com uma região H- CDR3 indicada nas SEQ ID NO.: 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 92, 93, 94 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105 ou 106.

[002] A presente invenção refere-se adicionalmente a um 30 anticorpo isolado ou fragmento funcional do mesmo que é específico para CD38, que compreende (i) uma cadeia pesada variável indicada nas SEQ ID NO.: 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105 ou 106 ou (ii) uma cadeia pesada variável que tem uma identidade de pelo menos sessenta por cento com uma cadeia pesada variável indicada nas SEQ ID NO.: 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 92, 93, 94, 95, 961 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105 ou 106.

[003] Adicionalmente, a presente invenção refere-se a uma região de ligação de antígeno isolada que é específica para CD38, que compreende (i) uma região L-CDR3 indicada nas SEQ ID NO.: 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 109 ou 110 ou (ii) uma região L-CDR3 que tem uma identidade de pelo menos sessenta por cento com uma região LCDR3 indicada nas SEQ ID NO.: 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 109 ou 110.

[004] Além disso, a presente invenção refere-se a um anticorpo isolado ou fragmento funcional do mesmo, que compreende (i) uma cadeia leve variável indicada nas SEQ ID NO.: 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 109 ou 110 ou (ii) uma cadeia leve variável que tem uma identidade de pelo menos sessenta por cento com uma cadeia leve variável indicada nas SEQ ID NO.: 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 109 ou 110.

[005] A presente invenção refere-se adicionalmente a uma cadeia pesada variável de uma região de ligação isolada do antígeno que é codificada por (i) uma sequência de ácido nucléico que compreende as SEQ ID NO.: 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90 ou 91 ou (ii) uma sequência de ácido nucléico que é hibridizada sob condições de estringência 30 elevada para a fita complementar das SEQ ID NO.: 1, 2, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90 ou 91, em que a dita região de ligação de antígeno é específica para CD38.

[006] A presente invenção também se refere a uma cadeia leve variável de uma região de ligação de antígeno isolada que é codificada por (i) uma sequência de ácido nucléico que compreende as SEQ ID NO.: 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 107 ou 108 ou (ii) uma sequência de ácido nucléico que é hibridizada sob condições de estringência elevada para a fita complementar das SEQ ID NO.: 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 107 ou 108, em que o dito anticorpo ou fragmento funcional do 10 mesmo é específico para CD38.

[007] Além disso, a presente invenção refere-se a uma sequência de ácido nucléico isolada que codifica uma região de ligação de antígeno de um anticorpo humano ou fragmento funcional do mesmo que é específico para CD38.

[008] Adicionalmente, a invenção refere-se a uma sequência de ácido nucléico que codifica uma cadeia pesada variável de uma região de ligação de antígeno isolada, que compreende (i) uma sequência selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NO: 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90 e 91 ou (ii) uma sequência de ácido nucléico que é hibridizada sob condições de estringência elevada para a fita complementar das SEQ ID NO.: 1, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 25 87, 88, 89, 90 ou 91, em que a dita região de ligação de antígeno é específica para CD38.

[009] A presente invenção também se refere a uma sequência de ácido nucleico que codifica uma cadeia leve variável de uma região de ligação de antígeno isolada, que compreende (i) uma sequência selecionada do grupo que considere nas SEQ. ID NO.: 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 107 e 108 ou (ii) uma sequência de ácido nucléico que é hibridizada sob condições de estringência elevada para a fita complementar das SEQ ID NO.: 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44 45, 107 ou 108 em que a dita região de ligação de antígeno é específica para CD38.

[010] A presente invenção refere-se adicionalmente a um método para induzir a mortandade específica de células de tumor que expressam CD38, em que a dita mortandade específica ocorre através da reticulação de CD38, o qual compreende a etapa de incubação das ditas células na presença de uma quantidade suficiente de um anticorpo humano isolado ou anticorpo anti-CD38 humanizado ou um fragmento funcional do mesmo, em que o dito anticorpo humano ou anti-CD38 humanizado compreende (i) uma sequência de ácido nucléico que codifica uma cadeia pesada indicada nas SEQ ID NO.: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90 ou 91 ou (ii) uma sequência de ácido nucleico que é hibridizada sob condições de que é hibridizada sob condições de estringência elevada para a fita complementar das SEQ ID NO.: 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90 ou 91, em que o dito anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo é . específico para CD38.

[011] Adicionalmente, a presente invenção refere-se a um método para induzir a mortandade específica de células de tumor que expressam CD38, em que a dita mortandade específica ocorre por meio da reticulação de CD38, o qual compreende a etapa de incubação das ditas células na presença de uma quantidade suficiente de um anticorpo humano isolado ou anticorpo anti-CD38 humanizado ou um fragmento funcional do mesmo, em que o dito anticorpo humano ou anticorpo anti-CD38 humanizado compreende (i) uma sequência de ácido nucléico que codifica uma cadeia leve indicada nas SEQ ID NO.: 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 107 ou 108 ou(ii) uma sequência de ácido nucléico que é hibridizada sob condições de estringência elevada para a fita complementar das SEQ ID NO.: 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44 45, 107 ou 108, em que o dito anticorpo ou um -5 fragmento funcional do mesmo é específico para CD38.

[012] Além disso, a presente invenção refere-se a um método para induzir a mortandade específica de células de tumor que expressam CD38, em que a dita mortandade específica ocorre através da reticulação de CD38, o qual compreende a etapa de incubação das ditas células na presença de uma quantidade suficiente de um anticorpo humano isolado ou anticorpo anti- CD38 humanizado ou um fragmento funcional do mesmo, em que o dito anticorpo anti-CD38 humano ou humanizado ou o dito fragmento funcional do mesmo compreende (i) uma sequência de aminoácido de cadeia pesada indicada nas SEQ ID NO.: 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105 ou 106 ou (ii) uma cadeia pesada variável que tem uma identidade de pelo menos sessenta por cento com uma cadeia pesada variável indicada nas SEQ ID NO.: 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105 ou 106. Além disso, a presente invenção refere-se a um método para induzir a mortandade específica de células de tumor que expressam CD38, em que a dita mortandade específica ocorre por meio da reticulação de CD38, o qual compreende a etapa de incubação das ditas células na presença de uma quantidade suficiente de um anticorpo humano isolado ou anticorpo anti-CD38 humanizado ou um fragmento funcional do mesmo, em que o dito anticorpo humano ou anti - CD38 humanizado compreende (i) e/ou uma sequência de aminoácido de cadeia leve indicada nas SEQ ID NO.: 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 109 ou 110 ou (ii) uma cadeia leve variável que tem uma identidade de pelo menos sessenta por cento com uma cadeia leve variável indicada nas SEQ ID NO.: 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 109 ou 110.

[013] Adicionalmente, a presente invenção refere-se a um método para detectar a mortandade específica de células de tumor que expressam CD38, por meio da reticulação de CD38, o qual compreende as etapas de: (i) administração a um indivíduo com necessidade do mesmo de uma quantidade eficaz de um anticorpo humano ou anti- CD38 humanizado ou um fragmento funcional dos mesmos e (ii) detecção da atividade de mortandade específica do dito anticorpo humano ou anti-CD38 humanizado ou do dito fragmento funcional dos mesmos.

[014] Além disso, a presente invenção refere-se a um método para detectar a presença de CD38 em um tecido ou em uma célula de origem de miniporco, o qual compreende as etapas de: (i) permissão para que um anticorpo humano ou antiCD38 humanizado ou um fragmento funcional dos mesmos entre em contato com o dito CD38, e (ii) detecção da ligação específica do dito anticorpo humano ou anti-CD38 humanizado ou do fragmento funcional do mesmo às ditas células de miniporco CD38, em que o dito anticorpo ou fragmento funcional dos mesmos também 25 podem se ligar especificamente a CD38 de origem humana.

[015] Além disso, a presente invenção refere-se a um método para detectar CD38 em um eritrócito que expressa CD38, o qual compreende as etapas de: (i) permissão para que um anticorpo humano ou anti30 CD38 humanizado ou um fragmento funcional dos mesmos entre em contato com o dito eritrócito que expressa CD38, e (ii) detecção da ligação específica do dito anticorpo humano ou anti-CD38 humanizado ou do fragmento funcional dos mesmos aos ditos eritrócitos que expressam CD38, em que o dito anticorpo ou fragmento funcional do mesmo também pode se ligar especificamente a CD38 humano de uma célula ou um tecido à exceção dos eritrócitos humanos.

[016] A presente invenção também se refere a um anticorpo isolado ou fragmento funcional do mesmo de acordo com a presente invenção, o qual compreende (i) uma região H- CDR3 indicada nas SEQ ID NO.: 21 ou 22 ou (ii) uma região H- CDR3 com uma identidade de pelo menos sessenta por cento com a mesma e que é específica para CD38 humano e sagui CD38.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[017] A Figura 1a - Cadeia Pesada Variável de DNA apresenta sequências de ácidos nucléicos de várias regiões pesadas variáveis de anticorpos para a utilização na presente invenção.

[018] A Figura 1b - Cadeia Pesada Variável de Peptídeo apresenta sequências de aminoácidos de várias regiões pesadas variáveis de anticorpos para a utilização na presente invenção. As regiões CDR de HCDRI, HCDR2 e HCDR3 são 20 designadas do N- ao C-terminal em negrito ou sublinhadas.

[019] A Figura 2a - Cadeia Leve Variável de DNA _ apresenta sequências de ácido nucléico de várias regiões leves variáveis de anticorpos para a utilização na presente invenção.

[020] A Figura 2b - Cadeia Leve Variável de Peptídeo .apresenta sequências de aminoácidos de várias regiões leves variáveis de anticorpos para a utilização na presente invenção. As regiões CDR de LCDRI, LCDR2 e LCDR3 são designadas do N ao C-terminal em negrito ou sublinhadas.

[021] A Figura 3 - Sequências de Consenso de Cadeias Pesadas Variáveis apresenta sequências de aminoácido de várias regiões pesadas variáveis de várias sequências de genes mestras de anticorpos HuCAL com base em consenso. As regiões CDR de HCDRI, HCDR2 e HCDR3 são designadas do N- ao C-terminal em negrito.

[022] A Figura 4 - Sequências de Consenso de Cadeias Leves Variáveis apresenta sequências de aminoácidos de 5 regiões leves variáveis de várias sequências de genes mestras de anticorpos HuCAL com base em consenso. As regiões CDR de CDRI, LCDR2 e LCDR3 são designadas do N- ao C-terminal em negrito.

[023] A Figura 5 - Sequência de Peptídeo de CD3 8 10 apresenta a sequência de aminoácidos de CD38 (número de acesso primário SWISS-PROT P28907).

[024] A Figura 6 - apresenta sequências de nucleotídeos de cadeias pesadas e leves de OKTIO quimérico.

[025] A Figura 7 - apresenta a sequência de DNA de pMORPH@ _h_IgG1_1 (bp 601-2100) (SEQ ID NO.: 74): O vetor tem base nos vetores de pcDNA3. 1+ (Invitrogen). A sequência de aminoácido da sequência VH- stuffer é indicada em negrito, visto que os quadros de leitura final da sequência VH-1eader e do gene constante da região não são impressos em negrito. Os sítios de restrição são indicados acima da sequência. Os sítios de preparação da sequenciação de primers estão sublinhados.

[026] A Figura 8 - apresenta a sequência de DNA do vetor de expressão de cadeia leve de Ig kappa pMORPH@_h_IgK_1 (bp 6015 1400) (SEQ ID NO.: 75): O vetor tem base nos vetores de pcDNA3. 1+ (Invitrogen). As sequências de aminoácidos da sequência de VK-stuffer são indicadas em negrito, ao passo que os quadros de leitura final da sequência VK-1eader e do gene constante da região não são impressos em negrito. Os sítios de restrição são indicados acima da sequência. Os sítios de preparação da sequenciação de primers estão sublinhados.

[027] A Figura 9 apresenta a sequência de DNA do vetor da cadeia leve de Ig lambda HuCAL pMORPH@_h_Ign_1 (bp 601-1400) (SEQ ID NO.: 76): A sequência de aminoácido da sequência de Vi-stuffer é indicada em negrito, visto que os quadros de leitura final da sequência Vi-leader e do gene constante da região não são impressos em negrito, Os sítios de restrição são indicados acima da sequência. Os sítios de preparação da sequenciação de primers estão sublinhados.

[028] A Figura 10 apresenta combinações diferentes de 10 cadeias pesadas e leves no formato de Fab/IgG para a utilização na presente invenção.

[029] A Figura 11 apresenta a análise da expressão de CD38 dos Linfócitos e Eritrócitos obtidos por FACS. PBMCs e eritrócitos foram isolados do sangue integral de cinomolgo, rhesus e sagui por meio de centrifugação por gradiente de densidade seguida pela análise de FACS utilizando os anticorpos de Fab anti-CD38 MOR03 087 (A, histogramas à direita, seta clara) e MORO 3088 (B, histogramas à direita; seta clara). Um anticorpo de Fab irrelevante (A & B, 20 histogramas à esquerda; seta preta) foi utilizado como um controle negativo.

[030] A Figura 12 apresenta a análise da expressão de CD38 dos Linfócitos e Eritrócitos obtidos por FACS. PBMCs e eritrócitos foram isolados do sangue integral de humano, cinomolgo e sagui por meio de centrifugação por gradiente de densidade seguida pela análise de FACS utilizando anti-CD38 IgG1 MOR03087 (histogramas à direita; seta branca). Um anticorpo de controle de IgG1 irrelevante (A & B, histogramas à esquerda; seta preta) foi utilizado como um controle 30 negativo.

[031] A Figura 13 apresenta uma vista geral comparativa da reatividade cruzada de anticorpos anti-CD38 diferentes. O sinal de positivo (+) significa "tingimento positivo"; o sinal de mais ou menos (+/-) significa "tingimento positivo fraco", o sinal negativo (-) significa "tingimento negativo" e a abreviação "n.d. " significa "não determinado" .

[032] As Figuras 14 (a) e 14 (b) delineiam as regiões de CDR e FR para determinados anticorpos para a utilização na invenção e comparam aminoácidos em uma determinada posição entre si e às sequências de consenso correspondentes.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[033] A presente invenção é baseada na descoberta de novos anticorpos e métodos para a utilização dos anticorpos que são específicos ou têm uma grande afinidade com CD38 e podem aplicar um benefício terapêutico a um indivíduo. Os anticorpos, que podem ser humanos ou humanizados, podem ser utilizados em muitos contextos, os quais são descritos de maneira mais completa na presente invenção. Os anticorpos apropriados para a utilização na presente invenção são descritos na Patente U.S. NO. 60/614. 471, que é aqui incorporada a título de referência.

[034] Um anticorpo "humano" ou um fragmento de anticorpo humano funcional é aqui definido como aquele que não é quimérico (por exemplo, não" humanizado") e não é de espécies não-humanas (por inteiro ou em parte). Um anticorpo humano ou um fragmento de anticorpo funcional pode ser derivado de um ser humano ou podem ser um anticorpo humano sintético. Um "anticorpo humano sintético" é definido na presente invenção como um anticorpo que tem uma sequência derivada, por inteiro ou em parte, in silico das sequências sintéticas que são baseadas na análise das sequências de anticorpo humanas conhecidas. O desenho in silico de uma sequência de anticorpo ou de um fragmento humano da mesma pode ser conseguido, por exemplo, ao analisar um banco de dados de sequências de anticorpos humanos ou de fragmentos de anticorpos e ao planejar uma sequência de polipeptídeo que utiliza os dados obtidos da mesma. Um outro exemplo de um anticorpo humano ou de um fragmento de anticorpo funcional é aquele que é codificado por um ácido nucléico isolado de uma biblioteca de sequências de anticorpo de origem humana (isto é, tal biblioteca é baseada nos anticorpos tirados de uma fonte natural humana).

[035] Um "anticorpo humanizado" ou fragmento de anticorpo humanizado funcional é definido na presente invenção como aquele que é (i) derivado de uma fonte não-humana (por exemplo, um rato transgênico que tenha um sistema imunológico heterólogo) cujo anticorpo seja baseado em uma sequência de linhagem embrionária humana; ou (ii) quimérica, em que o domínio variável é derivado de uma origem não-humana e o domínio constante é derivado de uma origem humana, ou (iii) enxertada por CDR, em que as CDRs do domínio variável são de uma origem não-humana, sendo que uma ou mais estruturas do domínio variável são de origem humana e o domínio constante(se houver) é de origem humana.

[036] Conforme utilizado na presente invenção, um anticorpo "se liga especificamente a" é "específico a/ para" ou l' reconhece especificamente" um antígeno (aqui, CD38) se tal anticorpo puder discriminar entre tal antígeno e um ou mais antígeno (s) de referência, uma vez que a especificidade de ligação não é uma propriedade absoluta, mas relativa. Em sua forma mais geral (e quando nenhuma referência definida é mencionada), a "ligação específica" refere-se à capacidade do anticorpo de discriminar entre o antígeno de interesse e um antígeno não- relacionado, tal como determinado, por exemplo, de acordo com um dos seguintes métodos. Tais métodos compreendem, mas sem ficar a eles limitados, transferência Western, testes ELISA, RIA, ECL, IRMA, FACS, IHC e varreduras de peptídeos. Por exemplo, um ensaio ELISA padrão pode ser executado. A pontuação pode ser realizada pelo desenvolvimento de cor padrão (por exemplo, anticorpo secundário com peróxido de raiz-forte e tetrametil benzidina com peróxido de hidrogênio). A reação em determinadas cavidades é pontuada pela densidade óptica, por exemplo, a 450 nm. O fundo típico (reação negativa) pode ser 0,1 OD; a reação positiva típica pode ser 1 OD. Isto significa que a diferença positiva/ negativa pode ser de mais de dez vezes. Tipicamente, a determinação da especificidade de ligação é executada ao utilizar não um único antígeno de referência, mas um conjunto de aproximadamente três a cinco antígenos não-relacionados, tais como o leite em pó, BSA, transferrina ou similares. É possível que um anticorpo seja "específico a” ou ”específico para" um antígeno de duas ou mais células/ tecidos e/ou duas ou mais espécies, contanto que o anticorpo satisfaça os critérios de ligação para cada uma das tais células/ tecidos espécies, por exemplo. Consequentemente, um anticorpo pode se ligar especificamente ao antígeno CD38 alvo em vários tipos de células e/ou tecidos, por exemplo, eritrócitos, linfócitos isolados do sangue periférico, do baço ou linfonodos. Além disso, um anticorpo pode ser específico para CD38 de uma espécie e para CD38 de uma outra espécie.

[037] A ligação específica" também pode se referir à 25 capacidade de um anticorpo de discriminar entre o antígeno alvo e um ou mais antígeno (s) intimamente relacionados, que são utilizados como pontos de referência, por exemplo, entre CD38 e CDI 57. Além disso, a "ligação específica" pode se relacionar à capacidade de um anticorpo de discriminar entre 30 partes diferentes de seu antígeno alvo, por exemplo, domínios ou regiões diferentes de CD38, tais como epítopos na região de N-terminal ou na região de C-terminal de CD38 ou entre um ou mais resíduos de aminoácido chaves ou estiramentos de resíduos de aminoácido de CD38

[038] Além disso, tal como utilizado na presente invenção, uma "imunoglobulina" (Ig) é aqui definida como uma proteína que pertence à classe IgG, IgM, IgE, IgA ou IgD (ou alguma subclasse destas) e inclui todos os anticorpos convencionalmente conhecidos e fragmentos funcionais dos mesmos. Um “fragmento funcional” de um anticorpo/ imunoglobulina é aqui definido como um fragmento de .um anticorpo/ imunoglobulina (por exemplo, uma região variável de uma IgG) que retém a região de ligação de antígeno. Uma "região de ligação de antígeno" de um anticorpo é encontrada tipicamente em uma ou mais região (ões) hipervariáveis de um anticorpo, isto é, as regiões CDR-I, 2 e/ou 3; no entanto, as regiões de "estrutura" variável também podem desempenhar um papel importante na ligação de antígeno, tal como ao fornecer uma estrutura de suporte para CDRs. De preferência, a "região de ligação de antígeno" compreende pelo menos os resíduos de aminoácido 4 a 103 da cadeia leve variável (VL) e 5 a 109 da cadeia pesada variável (VH), com mais preferência os resíduos de aminoácido 3 a 107 de VL e 4 a 111 de VH, e são particularmente preferidas as cadeias completas de VL e de VH :as posições do aminoácido de 1 a 109 de VL e 1 a 113 de VH; numeração de acordo com o pedido de patente WO 97/08320).

[039] Uma classe preferida de imunoglobulinas para a utilização na presente invenção é a IgG. Os “fragmentos funcionais” da invenção incluem o domínio de um fragmento Fab e scFv. O F (ab’)2 ou o Fab podem ser projetados para minimizar ou remover completamente as interações intermoleculares de bissulfeto que ocorrem entre os domínios de CH1 e CL.

[040] O termo “aglutinante parental”, tal como utilizado em conexão com a presente invenção, denota qualquer aglutinante que não se submeta ao processo de otimização. Um processo de otimização é descrito em outra parte no presente relatório descritivo.

[041] O termo “aglutinante” tal como utilizado em conexão com a presente invenção, pode ser utilizado de uma maneira sinônima como o termo “imunoglobulina” ou “anticorpo”.

[042] Um anticorpo para a utilização na invenção pode ser derivado de uma biblioteca de anticorpo recombinante que é baseada nas sequências de aminoácidos que foram projetadas in silico e são codificadas pelos ácidos nucléicos que são criados sinteticamente. O desenho in silico de uma sequência de anticorpo é conseguido, por exemplo, polipeptídeo que utiliza os dados obtidos da mesma. Os métodos para projetar e obter as sequências criadas in silico são descritos, por exemplo, em Knappik et a I., J. Mol. Biol, (2000) 296:57; Krebs et al. J. Immunol. Methods. (2001) 254: 67; e a Patente U. S. NO. 6.300. 064 concedida a Knappik et al. os quais são aqui incorporados a título de referência em sua totalidade. Anticorpos Para Serem Utilizados na Invenção

[043]Em todo o presente documento, é feita referência aos seguintes anticorpos representativos para a utilização na e uma região leve variável que corresponde á SEQ ID NO.: 31(DNA)/SEQ ID NO.: 46 (proteína).LAC 3078 representa um anticorpo que tem uma região pesada variável que corresponde à SEQ ID NO.: 2 (DNA)/SEQ ID NO.: 17 (proteína) e uma região leve variável que corresponde à SEQ ID NO.: 32 (DNA)/SEQ ID NO.: 47 (proteína). LAC 3081 representa um anticorpo que tem uma região pesada variável que corresponde à SEQ ID NO.: 3 (DNA)/SEQ ID NO.: 18 (proteína) e uma região leve variável que corresponde à SEQ ID NO.: 33 (DNA)/SEQ ID NO.: 48(proteína). LAC 3085 representa um anticorpo que tem uma região pesada variável que corresponde à SEQ ID NO.: 4 (DNA)/SEQ ID NO.: 19 (proteína) e uma região leve variável que corresponde à SEQ ID NO.: 34 (DNA)/SEQ ID NO.: 49 (proteína). LAC 3086 representa um anticorpo que tem uma região pesada variável que corresponde à SEQ ID NO.: 5 (DNA)/SEQ ID NO.: 20 (proteína) e uma região leve variável que corresponde à SEQ ID NO.: 35(DNA)/SEQ ID NO.: 50 (proteína). LAC 3087 representa um anticorpo que tem uma região pesada variável que corresponde à SEQ ID NO.: 6 (DNA)/SEQ ID NO.: 21 (proteína) e uma região leve variável que corresponde à SEQ ID NO.: 36 (DNA)/SEQ ID NO.: 51 (proteína). LAC 3088 representa um anticorpo que tem uma região pesada variável que corresponde à SEQ ID NO.: 7 (DNA)/SEQ ID NO.: 22 (proteína) e uma região leve variável que corresponde à SEQ ID NO.: 37(DNA)/SEQ ID NO.: 52 (proteína). LAC 3089 representa um anticorpo que tem uma região pesada variável que corresponde à SEQ ID NO.: 8 (DNA)/SEQ ID NO.: 23 (proteína) e uma região leve variável que corresponde à SEQ ID NO.: 38(DNA)/SEQ ID NO.: 53 (proteína) . LAC 3101 representa um anticorpo que tem uma região pesada variável que corresponde à SEQ ID NO.: 9 (DNA)/SEQ ID NO.: 24 (proteína) e uma região leve variável que corresponde à SEQ ID NO.: 39 (DNA)/SEQ ID NO.: 54 (proteína). LAC 3102 representa um anticorpo que tem uma região pesada variável que corresponde à SEQ ID NO.: 10 (DNA)/SEQ ID NO.: 25 (proteína) e uma região leve variável que corresponde à SEQ ID NO.: 40 (DNA)/SEQ ID NO.: 55 (proteína). LAC 3127 representa um anticorpo que tem uma região pesada variável que corresponde à SEQ ID NO.: 11 (DNA)/SEQ ID NO.: 26 (proteína) e uma região leve variável que corresponde à SEQ ID NO.: 41 (DNA)/SEQ ID NO.: 56 (proteína). LAC 3128 representa um anticorpo que tem uma região pesada variável que corresponde à SEQ ID NO.: 12 (DNA)/SEQ ID NO.: 27 (proteína) e uma região leve variável que corresponde à SEQ ID NO.: 42 (DNA)/SEQ ID NO.: 57 (proteína). LAC 3129 Representa um anticorpo que tem uma região pesada variável que corresponde à SEQ ID NO.: 13 (DNA)/SEQ ID NO.: 28 (proteína) e uma região leve variável que corresponde à SEQ ID NO.: 43 (DNA)/SEQ ID NO. : 58 (proteína). LAC 3130 representa um anticorpo que tem uma região pesada variável que corresponde à SEQ ID NO.: 14 (DNA)/SEQ ID NO.: 29 (proteína) e uma região leve variável que corresponde à SEQ ID NO.: 44 (DNA)/SEQ ID NO.: 59 (proteína). LAC 3131 Representa um anticorpo que tem uma região pesada variável que corresponde à SEQ ID NO.: 15 (DNA)/SEQ ID NO.: 30 (proteína) e uma região leve variável que corresponde à SEQ ID NO.: 45(DNA)/SEQ ID NO.: 60 (proteína). Além disso, os clones otimizados, que foram derivados dos aglutinantes parentais MOR03087 e MOR03088, compreendem o seguinte: MOR06183 representa um anticorpo que tem uma região pesada variável que corresponde à SEQ ID NO.: 77 (DNA)/SEQ ID NO.: 92 (proteína). MOR06184 representa um anticorpo que tem uma região pesada variável que corresponde à SEQ ID NO.: 78 (DNA)/SEQ ID NO.: 93 (proteína). MOR06185 representa um anticorpo que tem uma região pesada variável que corresponde à SEQ ID NO.: 79 (DNA)/SEQ ID NO.: 94 (proteína). MOR06186 representa um anticorpo que tem uma região pesada variável que corresponde à SEQ ID NO.: 80 (DNA)/SEQ ID NO.: 95 (proteína). MOR06187 representa um anticorpo que tem uma região pesada variável que corresponde à SEQ ID NO.: 81 (DNA)/SEQ ID NO.: 96 (proteína). MOR06188 representa um anticorpo que tem uma região pesada variável que corresponde à SEQ ID NO.: 82 (DNA)/SEQ ID NO.: 97. MOR06189 representam um anticorpo que tem uma região pesada variável que corresponde à SEQ ID NO.: 83 (DNA)/SEQ ID NO.: 98 (proteína). MOR06190 representa um anticorpo que tem uma região pesada variável que corresponde à SEQ ID NO.: 84 (DNA)/SEQ ID NO.: 99 (proteína). MOR06192 representa um anticorpo que tem uma região pesada variável que corresponde à SEQ ID NO.: 85 (DNA)/SEQ ID NO.: 100 (proteína). MOR06195 representa um anticorpo que tem uma região pesada variável que corresponde à SEQ ID NO.: 86 (DNA)/SEQ ID NO.: 101 (proteína). MOR06197 representa um anticorpo que tem uma região pesada variável que corresponde à SEQ ID NO.: 87 (DNA)/SEQ ID NO.: 102 (proteína). MOR06200 representa um anticorpo que tem uma região pesada variável que corresponde à SEQ ID NO.: 88 (DNA)/SEQ ID NO.: 103 (proteína). MOR06201 representa um anticorpo que tem uma região pesada variável que corresponde à SEQ ID NO.: 89 (DNA)/SEQ ID NO.: 104 (proteína). MOR06204 representa um anticorpo que tem uma região pesada variável que corresponde à SEQ ID NO.: 90 (DNA)/SEQ ID NO.: 105 (proteína). MOR06214 representa um anticorpo que tem uma região pesada variável que corresponde à SEQ ID NO.: 91 (DNA)/SEQ ID NO.: 106 (proteína). MOR06278 representa um anticorpo que tem uma região leve variável que corresponde à SEQ ID NO.: 107 (DNA)/SEQ ID NO.: 109 (proteína). MOR06279 representa um anticorpo que tem uma região leve variável que corresponde à SEQ ID NO.: 108 (DNA)/SEQ ID NO.: 110 (proteína).

[044] Os anticorpos da invenção foram caracterizados no formato de Fab e/ou IgG e compreendem várias combinações das cadeias leves e pesadas de aglutinantes otimizados e parentais. A Figura 10 mostra diversas combinações não limitadoras que podem ser utilizadas em conexão com a presente invenção.

[045] Em um aspecto, a invenção apresenta métodos para utilizar os anticorpos que têm uma região de ligação de antígeno que pode se ligar especificamente a ou tem uma afinidade elevada com uma ou mais regiões de CD38, cuja sequência de aminoácido é descrita pela SEQ ID NO.: 71. Afirma- se que um anticorpo tem uma "grande afinidade" com um antígeno se a medição da afinidade for de pelo menos 100 nM (afinidade monovalente do fragmento de Fab). Um anticorpo ou uma região de ligação de antígeno para a utilização na presente invenção pode se ligar de preferência a CD38 com uma afinidade de aproximadamente menos de 600 nM. De preferência, o anticorpo ou a região de ligação de antígeno para a utilização na presente invenção pode se ligar a CD38 com uma afinidade de aproximadamente menos de 100 nM, com mais preferência menos do que aproximadamente 60 nM, e ainda com mais preferência menos do que aproximadamente 30 nM. São adicionalmente preferidas as utilizações dos anticorpos que se ligam a CD38 com uma afinidade menor do que aproximadamente 10 nM, e com mais preferência menor do que aproximadamente 3 nM. Por exemplo, a afinidade de um anticorpo para a utilização na invenção contra CD38 pode ser 30 de aproximadamente 10, 0 nM ou 2,4 nM (afinidade monovalente do fragmento de Fab).

[046] A Tabela 1 fornece um sumário das afinidades de anticorpos representativos, tal como determinado pela ressonância de superfície de plásmon (Biacore) e pela análise de FACS Scatchard:Tabela 1: Afinidades do Anticorpo a: formato de Fab; análise em fusão Fc CD38 humano como 45-300 b: Formato IgG1; análise com células de Raji c: desvio padrão (n = 3) d: desvio padrão (n = 4)

[047] Com referência à Tabela 1, a afinidade de LASCs foi medida pela ressonância de superfície de plásmon (Biacore) na fusão Fc de CD38 humano e por um procedimento de citometria de fluxo que utiliza a linhagem de células Raji humanas que expressa CD38. Os estudos de Biacore foram realizados diretamente no antígeno imobilizado (proteína de fusão de CD38- Fc). O formato de Fab de LACs exibe uma faixa de afinidade monovalente entre aproximadamente 30 e 596 nM na proteína de fusão Fc de CD38 imobilizada.

[048] O formato IgG1 foi utilizado para a determinação da afinidade com base em células (FACS Scatchard). A coluna direita da Tabela 1 denota a força de ligação dos LACS neste formato.

[049] Uma outra característica preferida dos anticorpos preferidos para a utilização na invenção a sua especificidade para uma área dentro da região de N-terminal de CD38. Por exemplo, os LACs da invenção podem se ligar especificamente à região de N-terminal de CD38.

[050] Os anticorpos otimizados da presente invenção foram caracterizados adicionalmente tal como mostrado nas Tabelas 2 e 3. Os sumários das afinidades são fornecidos tal como determinado pela ressonância de superfície de plásmon (Biacore) e pela análise de FACS Scatchard. Adicionalmente, os estudos sobre a ligação de FACS a eritrócitos humanos e a ligação de ELISA à proteína de fusão FC CD38 também foram determinados. As caracterizações mostram que diversos aglutinantes otimizados mostram uma ligação reduzida aos eritrócitos humanos e um sinal de ELISA mais elevado em comparação ao clone parental. Além disso, os derivados de MORO 3088 têm uma afinidade incrementada tal como mostrado por FACS Scatchards e pelas determinações de afinidade.Tabela 2: Caracterizações globais de clones maturados por afinidade: a: formato de Fab formato de IgG b Células efetoras humanas & células alvo RPM18226 (relação E:T =3 0: 1) +: Mortandade de células RPM18226 em ADCC n.d.: não-determinado *: experiência diferente Tabela 3: EC50 em FACS-Scatchard, ADCC e CDC a: medição única b: média de duas medições

[0051] O tipo de epítopo ao qual um anticorpo para a utilização na invenção se liga pode ser linear (isto é, um estiramento consecutivo de aminoácidos) ou conformacional (isto é, estiramentos múltiplos de aminoácidos). A fim de determinar se o epítopo de um anticorpo particular é linear ou conformacional, o técnico no assunto pode analisar a ligação dos anticorpos aos peptídeos sobrepostos (por exemplo, peptídeos 13-mer com uma sobreposição de 11 aminoácidos) cobrindo domínios diferentes de CD38.

[0052] LACS pode reconhecer epítopos descontínuos ou lineares na região de N-terminal de CD38. Combinado com o conhecimento fornecido na presente invenção, o técnico no assunto irá saber se deve utilizar um ou mais epítopos isolados de CD38 para gerar os anticorpos que têm uma região de ligação de antígeno que é específica para os ditos epítopos (por exemplo, utilizando peptídeos sintéticos dos epítopos de CD38 ou de células que expressam epítopos de CD38).

[0053] Um anticorpo para a utilização na invenção é de preferência de uma espécie que reage de modo cruzado com humanos e pelo menos uma outra espécie não-humana. A espécie não-humana pode ser um primata não-humano, por exemplo, rhesus, babuíno e/ou cinomolgo. A outra espécie não-humana pode ser miniporco, coelho, camundongo, rato e/ou hamster. Um anticorpo que reage cruzado com pelo menos uma outra espécie além da humana pode propiciar uma flexibilidade maior e benefícios sobre os anticorpos anti-CD38 conhecidos, para as finalidades da condução de estudos in vivo em espécies múltiplas com o mesmo anticorpo. Um anticorpo que reage cruzado com coelho e/ou miniporco, por exemplo, pode ser um candidato para estudos sobre toxicologia e segurança.

[0054] De preferência, um anticorpo para a utilização na invenção pode não somente se ligar a CD38, mas também pode mediar a mortandade de células que expressam CD38. Mais especificamente, um anticorpo para a utilização na invenção pode mediar o seu efeito terapêutico ao esgotar as células positivas para CD38 (por exemplo, malignas) através das funções efetoras do anticorpo. Essas funções incluem a citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC) e a citotoxicidade dependente de complemento (CDC).

[0055] No entanto, a expressão de CD38 é encontrada não somente em células imunes dentro da linhagem mielóide (por exemplo, monócitos, granulócitos) e linfóide (por exemplo, células B e T ativadas; células plasmáticas) mas também nas células precursoras respectivas. Uma vez que é importante que essas células não sejam afetadas pela mortandade mediada por anticorpos de células malignas, os anticorpos da presente invenção são de preferência não-citotóxicos às células precursoras.

[0056] Além de suas atividades catalíticas como uma ciclase e hidrolase de ADP-ribose cíclica, CD38 exibe a capacidade de transduzir sinais de relevância biológica (Hoshino et a 1.,1997; Ausiello et a 1., 2000). Essas funções podem ser induzidas in vivo, por exemplo, pelas interações de receptor-ligante ou pela reticulação com os anticorpos antiCD38 agonísticos, conduzindo, por exemplo, à mobilização de cálcio, proliferação de linfócitos e liberação de citocinas. De preferência, os anticorpos da presente invenção são anticorpos não-agonísticos. Variantes de Peptídeos

[0058] Os anticorpos para a utilização na invenção não ficam limitados às sequências de peptídeos específicas fornecidas na presente invenção. Em vez disso, a invenção também incorpora utilização de variantes desses polipeptídeos. Com referência à presente descrição e às tecnologias e às referências convencionalmente disponíveis, o técnico no assunto poderá preparar, testar e utilizar os variantes de anticorpos funcionais descritos na presente invenção, ainda que seja apreciado que os variantes que têm a capacidade de mediar a mortandade de células alvo CD38+ estejam dentro do âmbito da presente invenção. Conforme utilizado neste contexto, a " capacidade de mediar a mortandade de células alvo CD38+, significa uma característica funcional atribuída a um anticorpo anti-CD38 para a utilização na invenção. A capacidade de mediar a mortandade de células alvo CD38+, desse modo, inclui a capacidade de mediar a mortandade de células alvo CD38+, por exemplo, por CDC e/ou ADCC ou pelos construtos de toxina conjugados a um anticorpo para a utilização na invenção.

[0059] Uma variante pode incluir, por exemplo, um anticorpo que tenha pelo menos uma região determinante de complementariedade alterada (CDR) (hipervariável) e/ou um domínio/posição (variável) de estrutura (FR), vis-à-vis uma sequência de peptídeo descrita na presente invenção. Para ilustrar melhor este conceito, segue uma breve descrição da estrutura do anticorpo. Um anticorpo é composto por duas cadeias de peptídeo, sendo que cada uma delas contém um domínio (cadeia leve) ou três domínios constantes (cadeia pesada) e uma região variável (VL, VH), sendo que a última destas é em cada caso composta por quatro regiões de FR e três CDRs inter25 espaçadas. O sítio de ligação de antígeno é formado por uma ou mais CDRs, contudo, as regiões de FR fornecem o quadro estrutural para as CDRs e, desse modo, desempenham um papel importante na ligação de antígeno. Ao alterar um ou mais resíduos de aminoácidos em uma região de CDR ou de FR, o técnico no assunto pode rotineiramente gerar as sequências de anticorpo mutacionadas ou diversificadas, que podem ser selecionadas contra o antígeno, para propriedades novas ou incrementadas, por exemplo.

[0060] As Figuras 14a (VH) e 14b (VL) delineiam as regiões de CDR e FR para determinados anticorpos para a utilização na invenção e comparam aminoácidos em uma determinada posição entre si e as sequências de consenso correspondentes ou de “gene mestre” (tal como descrito na Patente U. S. NO. 6. 3 00. 064).

[0061] O técnico no assunto poderá proj etar as variantes de peptídeos, cuja utilização se enquadra dentro do âmbito da presente invenção. É preferível que as variantes sejam construídas ao alterar os aminoácidos dentro de uma ou mais regiões de CDR; uma variante também pode ter uma ou mais regiões com estrutura alterada. As alterações também podem ser feitas nas regiões de estrutura. Por exemplo, um domínio de FR do peptídeo pode ser alterado onde há um desvio em um resíduo comparado a uma sequência de linhagem embrionária.

[0062] Além disso, as variantes podem ser obtidas ao utilizar um LAC como o ponto inicial para a otimização ao diversificar um ou mais resíduos de aminoácidos no LAC, de preferência os resíduos de aminoácidos em uma ou mais CDRs e ao selecionar a coleção resultante de variantes de anticorpos para variantes com propriedades incrementadas. É particularmente preferida a diversificação de um ou mais resíduos de aminoácidos em CDR-3 de VL, CDR-3 de VH, CDR-1 de VL e/ou CDR-2 de VH. A diversificação pode ser feita ao sintetizar uma coleção de moléculas de DNA utilizando a tecnologia de mutagênese de trinucleotídeo (TR IM) (Virnekàs,B., Ge, L. Pluckthun, A., Schneider, K.C., Wellnhofer, G. e Moroney S. E.(1994) Trinucleotide phosphoramidites: ideal reagents for the synthesis of mixed oligonucleotides for random mutagenesis. Nucl. Acids Res. 22, 5600). Variantes de Aminoácidos Conservadores

[064] As variantes de polipeptídeos podem ser feitas para conservar a estrutura molecular total de uma sequência de peptídeos de anticorpos descrita na presente invenção. Dadas as propriedades dos aminoácidos individuais, algumas substituições racionais serão reconhecidas pelo técnico no assunto. As substituições de aminoácidos, as “substituições conservadoras", podem ser feitas, por exemplo, com base na similaridade de polaridade, carga, solubilidade, capacidade hidrofóbica, capacidade hidrofílica e/ou a natureza anfipática dos resíduos envolvidos.

[065] Por exemplo, (a) os aminoácidos (hidrofóbicos) não10 polares incluem a alanina, a leucina, a isoleucina, a valina, a prolina, a fenilalanina, o triptofano e a metionina; (b) os aminoácidos neutros polares incluem a glicina, a serina, a treonina, a cisteína, a tirosina, a asparagina e a glutamina; (c) os aminoácidos (básicos) positivamente carregados incluem a arginina, a lisina e a histidina; e (d) os aminoácidos negativamente carregados (ácidos) incluem o ácido aspártico e o ácido glutâmico. As substituições podem ser tipicamente feitas dentro dos grupos (a) - (d). Além disso, a glicina e a prolina podem ser substituídas uma pela outra com base em sua capacidade de romper hélices a. Similarmente, determinados aminoácidos, tais como a alanina, a cisteína, a leucina, a metionina, o ácido glutâmico, a glutamina, a histidina e a lisina são encontrados mais geralmente nas hélices Q', sendo que a valina, a isoleucina, a fenilalanina, a tirosina, o triptofano e a treonina são encontrados mais geralmente em folhas plissadas p. A glicina, a serina, o ácido aspártico, a asparagina a prolina são encontrados geralmente alternadamente. Algumas substituições preferidas podem ser feitas entre os seguintes grupos: (i) S e T (iii) A, V, L e I. Dado o código genético conhecido e as técnicas de DNA sintético e recombinante, o técnico no assunto pode facilmente construir DNAs que codificam as variantes de aminoácidos conservadores. Em um exemplo particular, a posição 3 do aminoácido na SEQ ID NOS.: 5, 7 e/ou 8 pode ser alterada de um Q a um E.

[066] Conforme utilizado na presente invenção, a “identidade de sequência” entre duas sequências de polipeptídios indica a porcentagem dos aminoácidos que são idênticos entre as sequências. A "similaridade de sequência" indica a porcentagem dos aminoácidos que são idênticos ou que representam substituições de aminoácidos conservadores. As sequências de polipeptídeo preferidas da invenção têm uma identidade de sequência nas regiões de CDR de pelo menos 60%, com mais preferência, de pelo menos ou, ainda com mais preferência de pelo menos e com a máxima preferência de pelo menos 95 96. Os anticorpos preferidos também têm uma similaridade de sequência nas regiões de CDR de pelo menos 80%, com mais preferência de, e com a máxima preferência de. As sequências de polipeptídeo preferidas da invenção têm uma identidade de sequência nas regiões variáveis de pelo menos 60%, com mais preferência de pelo menos ou 80%, ainda com mais preferência de pelo menos 0, e com a máxima preferência de pelo menos. Os anticorpos preferidos também têm uma similaridade de sequência nas regiões variáveis de pelo menos 80%, com mais preferência de 90%, e com a máxima preferência de 95%. Moléculas de DNA da Invenção

[067] A presente invenção também se refere às utilizações das moléculas de DNA que codificam um anticorpo para a utilização na invenção. Essas sequências incluem, mas sem ficar a elas limitadas, as moléculas de DNA apresentadas nas Figuras 1a e 2a.

[068] As moléculas de DNA da invenção não ficam limitadas às sequências descritas na presente invenção, mas também incluem variantes das mesmas. As variantes de DNA dentro da invenção podem ser descritas a título de referência por suas propriedades físicas na hibridização. O técnico no assunto irá reconhecer que o DNA pode ser utilizado para identificar o seu complemento e, uma vez que o DNA é de dupla fita, o seu equivalente ou homólogo, utilizando técnicas de hibridização de ácido nucléico. Também será reconhecido que a hibridização pode ocorrer com menos de 100% de complementariedade. No entanto, dada a escolha apropriada de condições, as técnicas de hibridização podem ser utilizadas para se diferenciar entre as sequências de DNA com base em sua relação estrutural a uma sonda particular. Para orientação a respeito de tais condições, consultar Sambrook et a 1., 1989 (Sambrook, J., Fritsch, E. F. e Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, EUA) e Ausubel et a 1. 1995 (Ausubel, F. M., Brent, R. Kingston, R. E., Moore, D. D., Sedman, J. G., Smith, J. A., & Struhl, K. eds. (1995). Current Protocols in Molecular Biology. New York: John Wiley and Sons).

[069] A similaridade estrutural entre duas sequências de polinucleotídeos pode ser como uma função da "estringência" das condições sob as quais as duas sequências irão se hibridizar uma com a outra. Conforme utilizado na presente invenção, o termo "estringência" refere-se ao ponto em que as condições desfavorecem a hibridização. As condições de estringência desfavorecem bastante a hibridização e somente as moléculas mais estruturalmente relacionadas se hibridizam umas com as outras sob tais condições. Por outro lado, as condições de não-estringência favorecem a hibridização das moléculas que indicam pouco grau de relação estrutural. A estringência de hibridização, portanto, está diretamente correlacionada às relações estruturais de duas sequências de ácido nucléico. As seguintes relações são úteis na hibridização correlacionada e na relação (onde Tm é atemperatura de fusão de um duplex de ácido nucléico): a. Tm = 69, 3 + 0, 41 (G+C)% b. A Tm de um DNA duplex diminui em 1°C com cada aumento de 1% no número de pares bases incompatíveis. c. (Tm) μ2 (Tm) μi — 18,5 logioμ2/μi onde μl e μ2 são as resistências iônicas de duas soluções.

[0070] A estringência de hibridização é uma função de muitos fatores, incluindo a concentração de DNA total, a resistência iônica, a temperatura, o tamanho da sonda e a presença de agentes que rompem a ligação do hidrogênio. Os fatores que promovem a hibridização incluem concentrações de DNA elevadas, resistências iônicas elevadas, baixas temperaturas, um tamanho de sonda mais longo e a ausência de agentes que rompem a ligação de hidrogênio. A hibridização é executada tipicamente em duas fases: a fase de "ligação" e a fase de “lavagem”.

[0071] Primeiramente, na fase de ligação, a sonda é ligada ao alvo sob condições que favorecem a hibridização. A estringência é geralmente controlada nesse estágio ao alterar a temperatura. Para uma estringência elevada, a temperatura fica geralmente compreendida entre 65 0 C e 70 0 C, a menos que sondas curtas de oligonucleotídeo (< 20 nt) sejam utilizadas. Uma solução de hibridização representativa compreende 6X de SSC, de SDS, 5X de solução de Denhardt e 100 μg de DNA com veículo não-específico. Vide Ausubel et a 1., seção 2.9, suplemento 27 (1994). Naturalmente que muitas condições de tamponamento diferentes, ainda que funcionalmente equivalentes, são conhecidas. Onde o grau de relação é mais baixo, uma temperatura mais baixa pode ser escolhida. As temperaturas de ligação com pouca estringência ficam compreendidas entre aproximadamente 25 0 C e 40 0 C. Uma estringência média aproximadamente 40 0 C estringência elevada fica compreendida entre pelo menos e até menos de aproximadamente 65 0 C. Uma é de pelo menos aproximadamente 650 C.

[0072] Em segundo lugar, a sonda em excesso é removida por meio de lavagem. É nesta fase que condições mais intensas são geralmente aplicadas. Desse modo, é este estágio de " lavagem" que é o mais importante na determinação da relação através da hibridização. As soluções de lavagem contêm tipicamente concentrações de sal inferiores. Uma solução com estringência média exemplificadora contém 2 X de SSC e de SDS. Uma solução de lavagem com estringência elevada contém o equivalente (em resistência iônica) menos de aproximadamente 0, 2X de SSC, com uma solução severa preferida contendo aproximadamente 0, IX de SSC. As temperaturas associadas com várias estringências são as mesmas que aquelas discutidas acima para a "ligação". A solução de lavagem também é substituída tipicamente uma série de vezes durante a lavagem. Por exemplo, as condi ções de lavagem com estringência elevada típicas compreendem a lavagem duas vezes por trinta minutos a 55 0 C e três vezes por quinze minutos a 60 cC.

[0073] Consequentemente, a presente invenção inclui a 20 utilização das moléculas de ácido nucléico que se hibridizam nas moléculas determinadas nas Figuras 1a e 2a sob condições de ligação e de lavagem com estringência elevada, onde tais moléculas de ácido nucléico codificam um anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo para utilizações tais como aquelas descritas na presente invenção. As moléculas preferidas (a partir da perspectiva do mRNA) são aquelas que têm pelo menos ou de homologia (de preferência pelo menos, com mais preferência pelo menos, e com a máxima preferência pelo menos 95 96) ou identidade de sequência com uma das moléculas de DNA descritas na presente invenção. Variantes Funcionalmente Equivalentes

[0074] Ainda uma outra classe de variantes de DNA cuja utilização se enquadra dentro do âmbito da invenção pode ser descrita com referência ao produto que elas codificam (vide os peptídeos relacionados nas Figuras Ib e 2b). Esses genes funcionalmente equivalentes são caracterizados pelo fato de que codificam as mesmas sequências de peptídeo encontradas .5 nas Figuras Ib e 2b devido à degeneração do código genético.

[0075] É reconhecido que os variantes das moléculas de DNA fornecidos na presente invenção podem ser construídos de diversas maneiras diferentes. Por exemplo, eles podem ser construídos como DNAs completamente sintéticos. Os métodos de sintetização de oligonucleotídeos eficiente na faixa de 20 a aproximadamente 150 nucleotídeos estão extensamente disponíveis. Vide Ausubel et a 1., seção 2. 11, suplemento 21(1993) Os oligonucleotídeos de sobreposição podem ser sintetizados e montados de urna forma primeiramente relatada por Khorana et al., J. Mol e Biol. 72:209-217 (1971); vide também Ausubel et a 1., supra, seção 8. 2. Os DNAs sintéticos são projetados de preferência com sítios de restrição convenientes projetados nas extremidades 5' e 3' do gene para facilitar a clonagem em um vetor apropriado.

[0076] Conforme indicado, um método para gerar variantes consiste em começar com um dos DNAs descritos na presente invenção e executar então a mutagênese dirigida por sítio. Vide Ausubel et a 1., supra, capítulo 8, suplemento 37 (1997). Em um método típico, um DNA alvo é clonado em um veículo de bacteriófago de DNA de fita única. O DNA de fita única é isolado e hibridizado com um oligonucleotídeo que contém a (s) alteração (ões) nucleotídeo(s) desejada(s). A fita complementar é sintetizado e o fago de fita única é introduzido em um hospedeiro. Parte da progênie resultante irá conter o mutante desejado, o que pode ser confirmado utilizando a sequenciação de DNA. Além disso, vários métodos estão disponíveis para aumentar a probabilidade de que o fago da progênie seja o mutante desejado. Esses métodos são bem conhecidos pelos elementos versados na técnica e os kits estão comercialmente disponíveis para gerar tais mutantes. Construtos e expressão do DNA recombinante

[0077] A presente invenção apresenta adicionalmente a utilização de construtos de DNA recombinante que compreendem uma ou mais das sequências de nucleotídeos da presente ■ invenção. Os construtos recombinantes são utilizados em conexão a um vetor, tal como um plasmídeo ou um vetor viral, no qual uma molécula de DNA que codifica um anticorpo para a 10 utilização na invenção é introduzida.

[0078] O gene codificado pode ser produzido pelas técnicas descritas em Sambrook et al., 1989 e Ausubel et al., 1989. Alternativamente, as sequências de DNA podem ser quimicamente sintetizadas utilizando, por exemplo, sintetizadores. Vide, por exemplo, as técnicas descritas em OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS (1984, Gait, IRL Press, Oxford), que é incorporado a título de referência na presente invenção em sua totalidade. Os construtos recombinantes da invenção são compreendidos com vetores de expressão que são capazes de expressar os produtos do RNA e/ou da proteína do (s) DNA (s) codificado(s) O vetor pode compreender adicionalmente sequências reguladoras, incluindo um promotor ligado de modo operável á estrutura de leitura aberta (ORF). O vetor pode compreender adicionalmente uma sequência de marcador selecionável. A iniciação específica e os sinais secretores bacterianos também podem ser requeridos para a tradução eficiente das sequências de codificação de genes alvo introduzidas.

[0079] A presente invenção apresenta adicionalmente a utilização de células hospedeiras que contêm pelo menos um dos DNAs descritos na presente invenção. A célula hospedeira pode ser virtualmente qualquer célula para a qual os vetores de expressão estejam disponíveis. Pode ser, por exemplo, uma célula hospedeira eucariótica superior, tal como uma célula de mamífero, uma célula hospedeira eucariótica inferior, tal como uma célula de levedura, mas é de preferência uma célula procariótica, tal como uma célula bacteriana. A introdução do construto recombinante na célula hospedeira pode ser efetuada pela transfecção de fosfato de cálcio, por DEAE, transfecção mediada por dextrano, eletroporação ou infecção por fago. Expressão Bacteriana

[0080] Os vetores de expressão úteis para utilização bacteriana são construídos ao introduzir uma sequência de DNA estrutural que codifica uma proteína desejada juntamente com os sinais de iniciação e de terminação da tradução apropriados na fase de leitura operável com um promotor funcional. O vetor irá compreender um ou mais marcadores selecionáveis fenotípicos e uma origem de replicação para assegurar a manutenção do vetor e, caso desejável, para propiciar a amplificação dentro do hospedeiro, Os hospedeiros procarióticos apropriados para a transformação incluem as espécies E. col i, Bacillus subtilis, Salmonella typhimuriun e 20 várias dentro dos gêneros Pseudomonas, Streptomyces e Staphylococcus.

[0081] Os vetores bacterianos podem ser, por exemplo, baseados em bacteriófagos, plasmídeos ou fagomídios. Esses vetores podem conter um marcador selecionável e uma origem de replicação bacteriana derivada dos plasmídeos comercialmente disponíveis que contêm tipicamente elementos do vetor de clonagem pBR322 bem conhecido (ATCC 37017). Depois da transformação de uma cepa do hospedeiro e do crescimento apropriado da cepa do hospedeiro até uma densidade celular apropriada, o promotor selecionado é desreprimido/induzido através de meios apropriados (por exemplo, por deslocamento de temperatura ou por indução química) e as células são cultivadas por um período adicional. As células são colhidas tipicamente por centrifugação, são rompidas por um dispositivo físico ou químico e o extrato bruto resultante é retido para uma purificação adicional.

[0082] Em sistemas bacterianos, uma série de vetores de expressão pode ser vantajosamente selecionada dependendo da utilização pretendida para a proteína que está sendo expressa. Por exemplo, quando uma grande quantidade de tal proteína deve ser produzida, para a geração de anticorpos ou para selecionar bibliotecas de peptídeo, por exemplo, os vetores que dirigem a expressão de níveis elevados de produtos da proteína de fusão que são facilmente purificados podem ser desejáveis. Métodos Terapêuticos

[0083] Os métodos terapêuticos envolvem a administração a um indivíduo com necessidade de tratamento de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo contemplado pela invenção. Uma quantidade “terapeuticamente eficaz” é a definida como a quantidade de um anticorpo que é a quantidade suficiente para esgotar as células positivas de CD38 em uma área tratada de um indivíduo, como uma dose única ou de acordo com um regime de dosagens múltiplas, sozinho ou em combinação com outros agentes, que conduzem ao alívio de uma condição adversa, sendo que tal quantidade é toxicologicamente tolerável. O indivíduo pode ser um ser humano ou um animal não-humano (por exemplo, coelho, rato, camundongo, macaco ou outro primata de ordem inferior).

[0084] Um anticorpo para a utilização na invenção pode ser co-administrado com medicamentos conhecidos, e em alguns casos o anticorpo pode ser ele próprio modificado. Por exemplo, um anticorpo poderia ser conjugado a uma imunotoxina ou radioisótopo para aumentar potencialmente a sua eficácia.

[0085] Os distúrbios e as condições particularmente apropriados para o tratamento com um anticorpo incluem o mieloma múltiplo (MM) e outras doenças hematológicas, tais como a leucemia linfocítica crônica (LLC) a leucemia mielógena crônica (LMC), a leucemia mielógena aguda (LMA) e a leucemia linfocítica aguda (LLA). Um anticorpo também pode ser utilizado para o tratamento de uma doença inflamatória tal como a artrite reumatóide (AR) ou olúpus eritematoso sistêmico (LES).

[0086] Para o tratamento de alguns dos distúrbios antecedentes, as composições farmacêuticas para a utilização de acordo com a presente invenção podem ser formuladas de uma maneira convencional utilizando um ou mais veículos ou excipientes fisiologicamente aceitáveis. Um anticorpo para a utilização na invenção pode ser administrado por meio de qualquer dispositivo apropriado, que pode variar, dependendo do tipo de distúrbio que está sendo tratado. As vias de administração possíveis incluem a administração parenteral (por exemplo intramuscular, intravenosa, intra-arterial, intraperitoneal ou subcutânea) intrapulmonar e intranasal, e, caso desejado, para o tratamento imunossupressor local, a administração intralesional. Além disso, um anticorpo para a utilização na invenção pode ser administrado por meio de infusão de pulso, por exemplo, com doses que vão diminuindo do anticorpo. De preferência, a dosagem é aplicada por meio de injeção, com a máxima preferência por meio de injeção intravenosa ou subcutânea, dependendo em parte se a administração é breve ou crônica. A quantidade a ser administrada irá depender de uma variedade de fatores tais como os sintomas clínicos, o peso do indivíduo e se outras drogas são administradas. O técnico no assunto irá reconhecer que a via de administração vai variar dependendo do distúrbio ou da condição a ser tratada.

[0087] A determinação de uma quantidade terapeuticamente eficaz do novo polipeptídeo, de acordo com a presente invenção, irá depender em sua maior parte das características particulares do paciente, da via de administração e da natureza do distúrbio que está sendo tratado. Orientação geral pode ser encontrada, por exemplo, nas publicações da conferência Internacional sobre Harmonização e em REMINGTON' S PHARMACEUTICAL SCIENCES, capítulos 27 e 28, pp. 484-528 (18 a . ed., Alfonso R. Gennaro, Ed., Easton, Pa. Mack Pub. co., 1990). Mais especificamente, a determinação de uma quantidade terapeuticamente eficaz irá depender de fatores tais como a toxicidade e a eficácia do medicamento. A toxicidade pode ser determinada utilizando os métodos bem conhecidos no estado da técnica e encontrados nas referências antecedentes. A eficácia pode ser determinada utilizando a mesma orientação conjuntamente com os métodos descritos abaixo nos Exemplos. Métodos de Diagnóstico

[0088] O CD38 altamente expresso nas células hematológicas em determinadas malignidades; desse modo, um anticorpo anti-CD38 para a utilização na invenção pode ser empregado ou a fim de gerar imagens ou visualizar um sítio de 20 acumulação de células malignas possível em um paciente.

[0089] A este respeito, um anticorpo pode ser detectavelmente etiquetado, através da utilização de radioisótopos, etiquetas de afinidade (tais como a biotina, avidina, etc., etiquetas fluorescentes, átomos paramagnéticos, os procedimentos para realizar tal etiquetação são bem conhecidos no estado da técnica. A aplicação clínica dos anticorpos na obtenção de imagens diagnóstica é revista por Grossman, H. B, Urol. Cl in. North Amer. 13:465-474 (1986)), Unger, E. C. et a 1., Invest. Radiol. 20: 693-700 (1985)) e Khaw, B, A. et ai., Science 2 09: 295-297 (1980)). Os anticorpos ou as regiões de ligação de antígeno preferidas da invenção para a utilização como um composto para diagnóstico compreendem uma sequência de cadeia pesada variável selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NO: 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105 e 106 e/ou uma sequência de cadeia leve variável selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NO.: 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 109 e 110.

[0090] A detecção de focos de tais anticorpos detectavelmente etiquetados pode ser indicativa de um sítio de desenvolvimento de tumor, por exemplo. Em uma realização, esse exame é feito ao remover amostras de tecido ou de sangue e incubar tais amostras na presença dos anticorpos detectavelmente etiquetados. Em uma realização preferida, essa técnica é praticada de uma maneira não-invasiva através da utilização de obtenção de imagens magnéticas, fluorografia, etc. Tal teste de diagnóstico pode ser empregado no monitoramento do sucesso do tratamento de doenças, onde a presença ou a ausência de células positivas de CD38 é um indicador relevante. A invenção também contempla a utilização de um anticorpo anti-CD38, tal como descrito na presente invenção, para o diagnóstico em um ambiente in vivo e ex vivo. Composições Terapêuticas e Diagnósticas

[0091] Os anticorpos para a utilização na presente invenção podem sem formulados de acordo com os métodos conhecidos para a preparação de composições farmaceuticamente úteis, em que um anticorpo para a utilização na invenção (incluindo qualquer fragmento funcional do mesmo) é combinado em uma mistura com um veículo transportador farmaceuticamente aceitável. Os veículos apropriados e a sua formulação são descritos, por exemplo, em REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES (18 a ed., Alfonso R. Gennaro, Ed., Easton, Pa.: Mack Pub. CO. 1990). A fim de formar uma composição farmaceuticamente aceitável apropriada para a administração eficaz, tais composições deverão conter uma quantidade eficaz de um ou mais dos anticorpos para a utilização na presente invenção, juntamente com uma quantidade apropriada de veículo transportador. Os anticorpos ou as regiões de ligação de antígeno preferidas da invenção para a utilização como um composto para diagnóstico compreendem uma sequência de cadeia pesada variável selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NO.: 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 10 105 e 106 e/ou uma sequência de cadeia leve variável selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NO.: 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 109 e 110.

[0092] Os preparados podem ser apropriadamente formulados para propiciar liberação controlada do composto ativo. Os preparados de liberação controlada podem ser obtidos através da utilização de polímeros para complexar ou absorver o anticorpo anti-CD38. A aplicação controlada pode ser exercitada ao selecionar macromoléculas apropriadas (por exemplo, poliésteres, poli aminoácidos, polivinila, pirrolidona, etileno vinil acetato, metil celulose, carbóximetil celulose ou protamina, sulfato) e a concentração de macromoléculas, assim como os métodos de incorporação a fim de controlar a liberação. Um outro método possível para controlar a duração da ação por preparados de liberação controlada é a incorporação do anticorpo anti-CD38 em partículas de um material polimérico tais como poliésteres, poliaminoácidos, hidrogéis, ácido poli (láctico ou copolímeros de etileno acetato de vinila. Alternativamente, em vez de incorporar esses agentes em partículas poliméricas, é possível capturar esses materiais em microcápsulas preparadas, por exemplo, por técnicas de coacervação ou pela polimerização interfacial, por exemplo, cápsulas de hidróxi metil celulose ou de gelatina e microcápsulas de poli (metilmetacilato), respectivamente ou em sistemas de aplicação de drogas coloidais, por exemplo, lipossomos, microesferas de albumina, microemulsões, nanopartículas e nanocápsulas ou macroemulsões. Tais técnicas são descritas em Remington’s Pharmaceutical Sciences (1980).

[0093] Os compostos podem ser formulados para administração parenteral por meio de injeção, por exemplo, por meio de injeção de bolus ou infusão contínua. As formulações para injeção podem ser apresentadas na forma de dosagem unitária, por exemplo, em ampolas ou em recipientes de múltiplas doses, com um conservante adicionado. As composições podem assumir formas tais como suspensões, soluções ou emulsões em veículos oleosos ou aquosos e podem conter agentes formulatórios tais como agentes de suspensão, de estabilização e/ou de dispersão. Alternativamente, o ingrediente ativo pode estar na forma de pó para constituição com um veículo apropriado, por exemplo, água estéril livre de pirogênio, antes do uso.

[0094] As composições podem, caso desejado, ser apresentadas em um dispositivo de embalagem ou de distribuição, que pode conter uma ou mais formas de dosagem unitária que contêm o ingrediente ativo. O dispositivo de embalagem pode, por exemplo, compreender uma folha de metal ou de plástico, tal como uma embalagem de bolhas. O dispositivo de embalagem ou de distribuição pode ser acompanhado por instruções para a administração.

[0095] A invenção compreende adicionalmente a título de referência os seguintes exemplos de trabalho, os quais se prestam a ilustrar e, desse modo, não limitam a invenção.

EXEMPLOS

[0096] Linhagens de células seguintes linhagens de células foram obtidas junto à European Collection of Cell Cultures (ECACC), à German Collection of Microorganisms (DSMZ) ou à American Type Culture Collection (ATCC): a linhagem de células de hibridoma que produz o anticorpo monoclonal OKT1O de IgG1 de camundongo de CD38 (ECACC, #87021903), as células de Jurkat (DSMZ, ACC282), LP-1 (DSMZ, ACC41), RPMI8226 (ATCC, CCL-155), HEK293 (ATCC, CRL-1573), CHO-KI (ATCC, CRL-61), Raji (ATCC, CCL-86) e OPM2 (DSMZ, ACC50). Células e condições de cultura

[0097] Todas as células foram cultivadas sob condições padronizadas a 370 C e com de CO2 em um incubador umidificado. As linhagens de células LP-I, RPMI8226, Jurkat e Raji foram cultivadas em RPMI1640 (Pan biotech GmbH, #P0416500) suplementadas com 10% de FCS (Pan biotech GmbH #P303302), 50 U/ml de penicilina, 50 μg/ml de estreptomicina(Gibco, #15140- 122) e 2 mM de glutamina (Gibco, #25030-024) e, no caso de das células Jurkat e Raji, adicionalmente 10 mM de Hepes (Pan biotech GmbH, #P05-01100) e 1 mM de piruvato de sódio (Pan biotech GmbH, #P04-43100) tiveram que ser adicionados.

[0098] CHO-K1 e HEK293 cresceram em DMEM (Gibco, #1093820 025) suplementado com 2 mM de glutamina e de FCS. os transfectantes estáveis de CD38 CHO-K1 foram mantidos na presença de G418 (PAA GmbH, P11-012) sendo que para HEK293, a adição de 1 mM de piruvato de sódio era essencial. Após a transfecção transiente de HEK293, de FCS foram substituídos por FCS com IgG ultra baixo (Invitrogen, #16250078). A linhagem de células OKT10 foi cultivada em IDMEM (Gibco, #31980-022) suplementado com 2 mM de glutamina e 20 96 de FCS.

[0099] Preparação de suspensões de células únicas de sangue periférico.

[00100] Todas as amostras de sangue foram tiradas após consentimento informado. As células mononucleares de sangue periférico (PBMC) foram isoladas por Histopaque®-1077 (Sigma) de acordo com as instruções do fabricante de doadores saudáveis. As células vermelhas do sangue foram esgotadas dessas suspensões de células pela incubação em ACK Lysis Buffer (0,15 M de NH4C1, 10 mM de KHCO3, 0,1 M de EDTA) por cinco minutos à temperatura ambiente ou um derivado comercial (Bioscience, #00-4333). As células foram lavadas duas vezes com PBS e foram então adicionalmente processadas por meio de citometria de fluxo ou ADCC (vide abaixo). Citometria de fluxo (“FACS”)

[00101] Todos os tingimentos foram executados em placas de cultura de fundo redondo com 96 cavidades (Nalge Nunc) com 2 x 105 células por cavidade. As células foram incubadas com os anticorpos Fab ou IgG nas concentrações indicadas em 1.11 de tampão de FACS (PBS, 3% de FCS, 0,02% de NaN3) por quarenta minutos a 40 C. As células foram lavadas duas vezes e foram então incubadas com R-Ficoeritrina (PE) conjugada com IgG de cabra-anti-camundongo ou de cabra-anti- humano (H+L) F (ab’) 2 (Jackson Immuno Research), diluídas 1: 200 em tampão de FACS, por trinta minutos a 4 0 C. As células foram lavadas outra vez, novamente suspensas em 0,3 ml de tampão FACS e então analisadas por meio de citometria de fluxo em um FACSCa1ibur (Becton Dickinson, San Diego, CA).

[00102] Para as análises de Scatchard com base em FACS as células RPMI8226 foram tingidas com doze diluições diferentes começando em uma concentração final de 12,5μg/ml(IgG). Pelo menos duas medições independentes foram utilizadas para cada concentração e os valores de KD foram extrapolados a partir das intensidades de fluorescência medianas de acordo com Chamow et a1. (1994). Ressonância de superfície de plásmon

[00103] As constantes cinéticas kon e koff foram determinadas com diluições em série do Fab respectivo que se liga à proteína de fusão FC CD38 imobilizada de modo covalente utilizando o instrumento BIAcore 3000 (Biacore, Uppsala, Suécia). Para a imobilização de antígeno covalente, foi utilizada química de acoplamento de amina EDC-NHS padrão. Para o acoplamento direto da proteína de fusão FC CD38, chips senor CM5 (Biacore) foram revestidos com ~600-700 RU em 10 mM de tampão de acetato, pH 4,5. Para um fluxo celular de referência, uma quantidade respectiva de HSA (albumina de soro humano) foi utilizada. As medições cinéticas foram feitas em PBS (136 mM de NaCl, 2,7 mM de KCI, 10 mM de Na2HPO4, 1,76 mM de KH2P04, pH 7,4) em uma vazão de 20 μl/ min utilizando uma faixa de concentração de Fab de 1, 5-500 nM. O tempo de injeção para cada concentração foi de um minuto, seguido por uma fase de dissociação de dois minutos. Para uma regeneração de 5μl, 10 mM de HCI foram utilizados. Todos os sensogramas foram adaptados localmente utilizando o software de avaliação BIA 3.1 (Biacore).

EXEMPLO 1: Geração de Anticorpos a partir de Bibliotecas de HuCAL

[00104] Para a geração de anticorpos terapêuticos contra CD38, foram feitas seleções com a biblioteca de exibição de fago MorphoSys HuCAL GOLD®. HuCAL GOLD® é uma biblioteca de Fab baseada no conceito HuCAL® (Knappik et al., 2000; Krebs et al., 2001), em que todas as seis CDRs são diversificadas e empregam a tecnologia de CysDisp1ayTM para ligar os fragmentos de Fab à superfície do fago (Lóhning, 2001).

A. Salvamento de fagomídeo, amplificação purificação de fag

[00105] A biblioteca de fagomídeo HuCAL GOLD® foi amplificada em 2 x TY médio contendo 34 μg/ml de cloranfenicol e 1% de glicose (2 x TY-CG). Após a infecção do fago assistente (VCSM13) em uma OD600 de 0,5 (trinta minutos a 37 ° C sem agitação; trinta minutos a 37° C agitando a 250 rpm), as células foram giradas para baixo (4120 g; cinco 4 °C), novamente suspensas em 2 x T Y/ 34 μg/ml de cloranfenicol/ 50 μg/ml de canamicina e cresceram até a manhã seguinte a 22°C. Os fagos foram precipitados em PEG do sobrenadante, novamente suspensos em PBS/20% de glicerol, e foram armazenados a -80 0 C. A amplificação de fago entre dois ciclos de bateia foi realizada tal como segue: as células TG1 da fase de mid-log foram infectadas com fagos e luídos e foram chapeadas em LB- ágar suplementado com de glicose e 34 μg/ml de cloranfenicol (LB-CG). Após a incubação até a manhã seguinte a 30°C, as colônias foram raspadas, ajustadas a um valor de OD600 de 0,5 e o fago assistente foi adicionado como descrito acima.

B. Lavagem em bateia com HuCAL GOLD®

[00106] Para as seleções, os fagos do anticorpo HuCAL GOLD® foram divididos em três agrupamentos que correspondem aos genes mestres diferentes de VH (agrupamento 1: VH1/5ÀK, agrupamento 2: VH3 ÀK, agrupamento 3: VH2/4/6 ÀK) . Esses agrupamentos foram submetidos individualmente a 3 ciclos de bateia de células inteira nas células CHO-KI que expressam CD38 seguido pela eluição de pH e uma etapa de pós-adsorção em células de CHO-K1 de CD38 negativas para o esgotamento de fagos do anticorpo irrelevantes. Finalmente, os fagos do anticorpo restantes foram utilizados para infectar as células TG1 de E. coli. Após a centrifugação, a pelota bacteriana foi novamente suspensa em 2 x TY médio, foi chapeada nas placas de ágar e foi incubada até a manhã seguinte a 30°C. Os clones selecionados foram então raspados das placas, os fagos foram resgatados e amplificados. O segundo e terceiro ciclos de seleções foram executados tal como o ciclo inicial.

[00107] As inserções de encodificação de Fab dos fagos selecionados de HuCAL GOLD® foram subclonadas no vetor de expressão pMORPH@x9 Fab FS (Rauchenberger et al., 2003) para facilitar a expressão rápida de Fab solúvel. O DNA dos clones selecionados foi digerido com XbaI e EcoRI cortando desse modo a inserção de encodificação de Fab (ompA-VLCL e phoA- Fd) e foi clonado no vetor de corte de XbaI/EcoRI de pMORPHx9®_Fab_FS. O Fab expresso neste vetor carrega dois tags de C-terminal (FLAGTM e Strep-tag® II) para detecção e purificação.

EXEMPLO 2: Ensaios biológicos

[00108] A citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC) e a citotoxicidade dependente de complemento foram medidas de acordo com um protocolo publicado com base na análise de citometria de fluxo (Naundorf et a 1., 2002) como segue: ADCC:

[00109] Para as medições de ADCC, as células alvo (T) foram ajustadas para 2, OE+05 células e etiquetadas com 100 ng/ml de Calceína AM (Molecular Probes, C-3099) no meio de RPMI1640 (Pan biotech GmbH) por dois minutos à temperatura ambiente, A calceína residual foi removida por três etapas de lavagem no 20 meio de RPMI1640. Em paralelo, as PBMCs foram preparadas como a fonte para as células efetoras (E) (assassinas naturais), ajustadas a 1,0E+07 e misturadas com as células alvo etiquetadas para resultar em uma relação final de E: T de 50: 1 ou menos, dependendo das condições do ensaio. As células foram lavadas uma vez e a mistura de células foi novamente suspensa em um meio com 200 PI de RPMI1640 contendo o anticorpo respectivo em diluições diferentes. A placa foi incubada por quatro horas sob condições padronizadas a 370 C e com 5% de C°2 em uma incubadora umidificada. Antes da análise de FACS, as células foram etiquetadas com iodeto de propídio (PI) e analisadas por meio de citometria de fluxo (BectonDickinson). Entre 50.000 e 150.000 eventos foram contados para cada ensaio.

[00110] A seguinte equação fez surgir a atividade de mortandade [em %]: EDA x 100 ELA + EDA com EDA = eventos de células mortas (calceína + células tingidas com PI) e ELA = eventos de células vivas (células tingidas com calceína) CDC:

[00111] Para as medições de CDC, os transfectantes CHO-K1 de 5,0E+04 CD38 foram adicionados a uma placa com cavidade microtitulada (Nunc) junto com uma diluição de 1:4 de soro humano (Sigma, #S-1764) e o anticorpo respectivo. Todos os reagentes e as células foram diluídos no meio de RPMI1640 (Pan biotech GmbH) suplementado com de FCS. A mistura de reação foi incubada por duas horas sob condições padronizadas a 37 0C e com 5% de CO2 em uma incubadora umidificada. Como controles negativos, serviam tanto o complemento inativado pelo calor quanto os transfectantes de CD38 sem anticorpo. As 20 células foram etiquetadas com PI e foram submetidas a análise de FACS.

[00112] No total, 5.000 eventos foram contados e o número de células mortas em concentrações de anticorpo diferentes foi utilizado para a determinação dos valores de EC50. A seguinte equação fez surgir a atividade de mortandade [em %]: EDC x 100 ELC + EDC com EDc eventos de células mortas (células tingidas com PI) e ELC = eventos de células vivas (não-tingidas)

[00113] Os valores de citotoxicidade de um total de doze diluições de anticorpo diferentes (1: 2n) em triplicatas foram utilizados na ADCC e as duplicatas em CDC para cada anticorpo a fim de obter os valores de EC50 com um software de análise padrão (PRISM®, Graph Pad Software).

EXEMPLO 3: Geração de transfectantes de CD38 estáveis e de proteínas de fusão FC CD38

[00114] A fim de gerar a proteína CD38 para a lavagem em bateia e a seleção, dois sistemas de expressão diferentes tiveram que ser estabelecidos. A primeira estratégia incluiu a geração da proteína de fusão FC CD38, que foi purificada a partir dos sobrenadantes após a transfecção transiente das células HEK293. A segunda estratégia envolveu a geração de uma linhagem de células de CHO-K1 estável para que a expressão da superfície CD38 elevada fosse utilizada para a seleção de fagos do anticorpo através da lavagem em bateia de células inteiras.

[00115] Como uma etapa inicial, as células de Jurkat (DSMZ ACC282) foram utilizadas para a geração de cDNA (Invitrogen) seguido pela amplificação da sequência de codificação de CD38 inteira utilizando os primers complementares aos primeiros aos últimos nove códons de CD38, respectivamente (primer MTEOO1 & MTE002rev; Tabela 4). A análise da sequência da inserção de CD38 confirmou a sequência de aminoácido publicada por Jackson et al. (1990) à exceção da posição 49 que revelou uma glutamina em vez de uma tirosina como descrito por Nata et a1. (1997). Para a introdução de sítios de endonuclease de restrição e a clonagem em derivados do vetor de expressão pcDNA3. 1 diferentes (Stratagene), o produto de PCR purificado serviu como um molde para a reamplificação do gene inteiro (primers MTE006 & MTE007rev, Tabela 4) ou uma parte (primers MTE004 & MTE009rev, Tabela 4) do mesmo. No último caso, uma encodificação do fragmento para o domínio extracelular (aa 45 a 300) foi amplificada e clonada na estrutura entre uma sequência líder humana de Vkappa e uma sequência Fc-gama humana. Esse vetor serviu como o vetor de expressão para a geração proteína de fusão de FC CD38 solúvel. Um outro derivado de pcDNA3.1 sem a sequência líder foi utilizado para a inserção do gene CD38 de comprimento cheio. Neste caso, um códon de interrupção na frente da região de codificação Fc e a sequência líder faltante fez surgir a expressão da superfície de CD38. As células HEK293 foram transfectadas de modo transiente com o vetor da proteína de fusão Fc para a geração da proteína de fusão Fc CD38 solúvel e, no caso do derivado de comprimento cheio, as células CHO- K1 foram transfectadas para a geração de uma linhagem estável de células que expressam CD38.Tabela 4: * conduzindo a um códon de interrupção (TGA) na orientação do sentido.

EXEMPLO 4: Clonagem, expressão e purificação de IgG1 HuCAL®:

[00116] A fim de expressar a IgG de comprimento total, fragmentos do domínio variáveis de cadeias pesadas (VH) e foram subclonados a partir dos vetores de .expressão de Fab em vetores de pMORPH®_hIg apropriados (vide as Figuras 7 a 9). Os pares de endonuclease de restrição de BlpI/MfeI (preparação da inserção) e BlpI/EcoRI (preparação do vetor) foram utilizados para a subclonagem do fragmento do domínio de VH em pMORPH hIgG1. Os pares de enzimas EcoRV/HpaI (inserção de lambda) e EcoRV/BsiWI (inserção de kappa) foram utilizados para a subclonagem do fragmento do domínio de VL nos vetores pMORPH® hlgK_1 ou pMORPH®_h_IgÀ_1 respectivos. Os construtos de IgG resultantes foram expressos nas células HEK2 93 (ATCC CRL-1573) pela transfecção transiente utilizando a técnica de co-precipitação de DNA-fosfato de cálcio padrão.

[00117] As IgGs foram purificadas a partir dos sobrenadantes da cultura de células pela cromatografia. De afinidade através da coluna de Sefarose de Proteína A. O processamento de corrente a jusante adicional incluiu uma troca do tampão pela filtração em gel e filtração estéril da IgG purificada. O controle de qualidade revelou uma pureza de >90% reduzindo a SDS-PAGE e de IgG monomérica como determinado pela cromatografia de exclusão de tamanho analítica. O teor de endotoxina do material foi determinado por um ensaio com base em LAL cinético (Cambrex European Endotoxin Testing Service, Bélgica).

EXEMPLO 5: Geração e produção de OKTIO quimérico (chOKT10; SEQ ID NOS.: 72 e 73)

[00118] Para a construção de chOKT10, as regiões de VH e VL de camundongo foram amplificadas por PCR utilizando o cDNA preparado a partir da linhagem de células de hibridoma murino OKT1O (ECACC #87021903). Um conjunto de primers foi utilizado 20 como publicado (Dattamajumdar et al. 1996; Zhou et al. 1994) . Os produtos de PCR foram utilizados para a clonagem Topo (Invitrogen; vetor pCRII) e colônias únicas foram submetidas à análise de sequência (primer reverso M13), que revelou duas sequências de cadeia leve de kapa diferentes e uma sequência de cadeia pesada. De acordo com os alinhamentos de sequência (banco de dados da sequência de nucleotídeo EMBL) e a literatura (Krebber 1997) uma das sequências de kapa pertence ao repertório intrínseco do parceiro de fusão das células de tumor X63Ag8.653 e desse modo não pertence ao anticorpo de OKT10. Portanto, somente a nova sequência de kappa e o fragmento único de VH foram utilizados para uma clonagem adicional. Ambos os fragmentos foram novamente amplificados para a adição de sítios de endonuclease de restrição seguida pela clonagem nos vetores de expressão do pMORPH® IgG1 respectivos. As sequências para a cadeia pesada (SEQ ID NO.: 72) e a cadeia leve (SEQ ID NO.:73) são fornecidas na Figura 6. As células HEK293 foram transfectadas de modo transiente e o sobrenadante foi analisado em FACS para o anticorpo de OKTIO quimérico que se liga à linhagem de células Raji que superexpressam CD38 (ATCC).

Exemplo 6: Análise da reatividade cruzada por FACS (MOR 03087 e MOR 03088) a. Materiais e métodos:

[00119] As Figuras 11 e 12 mostram as análises de FACS de linfócitos e eritrócitos: as amostras de sangue tratadas com EDTA foram obtidas a partir de seres humanos saudáveis (após a obtenção de consentimento informado) e de primatas não humanos (Rhesus, Cinomolgo e Sagui) e foram submetidas à centrifugação por gradiente de densidade utilizando o sistema de separação de células Histopaque de acordo com as instruções do fornecedor (Sigma). Para a análise de FACS, as células da interfase (fração de PBMCs) e a pelota (f ração de eritrócitos) foram incubadas com anticorpos anti- CD38 HuCAL® em formatos diferentes.

[00120] Uma visão geral dos perfis de reatividade cruzada de anticorpos anti-CD38 diferentes é mostrada na Figura 13.

2. Sumário e conclusão:

[00121] Os resultados mostram que entre todos os anticorpos de CD38 somente MORO 3087 e MOR03088 mostraram uma reatividade cruzada às PBMCs de sagui. Surpreendentemente, a expressão de CD38 em eritrócitos de sagui é quase indetectável em comparação à forte expressão em eritrócitos de cinomolgo e de rhesus. Desse modo, a expressão de CD38 em eritrócitos de sagui e as PBMCs refletem mais a situação humana, onde a expressão de CD38 é baixa nos eritrócitos e de média a elevada nas PBMCs. O sagui é considerado, portanto, como sendo adequado como um modelo para o estudo da toxicidade das moléculas que se ligam a CD38.

[00122] Com base no estudo acima, foi decidido otimizar adicionalmente os aglutinantes MOR 03087 e MOR 03088, tal como descrito em outra parte no relatório descritivo, vide, por exemplo, o parágrafo relacionado aos "Anticorpos para a utilização na invenção". Um técnico no assunto também deve esperar que os anticorpos derivados dos parentais mostrem um perfil de reatividade cruzada comparável. REFERÊNCIAS Antonelli, A., Baj., G., Marchetti., Fallahi Surico, N., Pupilli, C., Malavasi, F. Ferrannini, P. (2001), Human anti-CD38 autoantibodies raise intracellular 15 calcium and stimulate insulin release in human pancreatic islets. Diabetes 50: 985-991. Ausiello C.M., Urbani F., Lande R., la Sala A., Di Carlo B., Baj G., Surico N., Hilgers J., Deaglio S., Funaro A., Malavasi F. (2000) Functional topography of discretedomains of human CD38. Tissue Antigens. 2000 Dec;56(6):539-47. Junghans, R.P (1994). humanized, bispecific immunoadhesin25 antibody that retargets CD3+ effectors to kill HIV-1-infected cells. J Immunol. 1994 Nov 1; 153 (9) :4268-80. Dattamaj urndar, A. K., Jacobsen, D. P., Hood, Osman, G. E. (1996) Rapid cloning of rearranged mouse immunoglobulin variable genes, Immunogentetics 43, 141-151. Ellis J. H., Barber, K. A., Tutt, Hale, c., Lewis, A, P ., Glennie, M, J., Stevenson, G. T., and Crowe, J. 1995) Engineered anti -CD38 monoclonal antibodies for immunotherapy of multiple myeloma. J. Immunol. 155: 925-937. Ferrero, E Orciani, M., Vacca, P., Ortolan, E., Crovella, S., Titti, Saccucci, F., Malavasi, F. (2004). Characterization and phylogenetic epitope mapping of CD38 ADPR cyclase in the cynomolgus macaque. BMC Immunology 5:21. Flavell, D. J., Boehm, D. A., Noss, A., Warnes, S. L., and Flavell, S. U. Therapy of human T-cell acute lymphoblastic leukaemia with a combination of anti-CD 7 and anti-CD38 - saporin immunotoxins is significantly better than therapy with each individual immunotoxin, Br. J. Cancer.84:571-578 (2001). Funaro, A., Spagnoli, G.C., Ausiello, C.M, Alessio, M., Roggero, S., Delia, D. Zaccolo, M., and Malavasi, F (1990) Involvement of the multi lineage CD38 molecule in a unique pathway of cell activation and proliferation. J. Immunol. 145, 2390-2396. Golay, J., Zaffaroni, Luisella, Vaccari,T., Lazzari, Borleri, G.-M., Bernasconi, S., Tedesco, F., Rambaldi, Al, Introna, M. (2000). Biological response of B lymphoma to anti-CD20 monoclonal antibody in vitro: CD55 and CD59 regulate complement-mediated cell lysis. Blood 95:3900-3908. Hayashi, T., Treon, S.P., Hideshima, T., Tai, Y-T., Akiyama, M., Richardson, R., Chauhan, D., Grewal, Anderson I.S, (2003). 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Claims

1. ANTICORPO ESPECÍFICO ANTI-CD38 HUMANO, caracterizado por compreender: (i) uma região H-CDR1, H-CDR2 e H-CDR3 indicada na SEQ ID NO: 21 e uma região L-CDR1, LCDR2 e L-CDR3 indicada na SEQ ID NO: 51; ou (ii) uma cadeia pesada variável indicada na SEQ ID NO: 21 e uma cadeia leve variável indicada na SEQ ID NO: 51.

2. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo anticorpo ser uma IgG, de preferência uma IgG1.

3. COMPOSIÇÃO DE ÁCIDO NUCLEICO, caracterizada por compreender a sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 6 e SEQ ID NO: 36 que codificam o anticorpo, conforme definido por qualquer uma das reivindicações 1 ou 2.

4. COMPOSIÇÃO DE ÁCIDO NUCLEICO, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por compreender uma sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO:6 que codifica a cadeia pesada variável, e uma sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO:36 que codifica a cadeia leve variável do anticorpo conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 ou 2.

5. VETOR DE EXPRESSÃO, caracterizado por compreender uma composição de ácido nucleico, conforme definida pelas reivindicações 3 ou 4, e uma sequência reguladora, incluindo um promotor ligado de modo operável.

6. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, caracterizada por compreender o anticorpo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, e um veículo ou excipiente farmaceuticamente aceitável do mesmo.

7. USO DO ANTICORPO, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, caracterizado por ser para fabricação de um medicamento para o tratamento de uma doença hematológica ou uma doença inflamatória.

8. USO, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pela dita doença hematológica ser selecionada a partir de mieloma múltiplo, leucemia linfocítica crônica, leucemia mieloide crônica, leucemia mieloide aguda e leucemia linfocítica aguda.

9. USO, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pela dita doença inflamatória ser selecionada entre artrite reumatoide e lúpus eritematoso sistêmico.

10. USO DE UMA COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, conforme definido pela reivindicação 6, caracterizada por ser para fabricação de um medicamento para o tratamento de uma doença hematológica ou uma doença inflamatória.