KR20050036852A - 항-ｈｌａ-ｄｒ 항체 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 항-HLA-DR 모노클로날 항체를 제공한다. 본 발명은 (a) HLA-DR 발현 세포를 담지한 비인간 동물에 있어서 수명 연장 효과를 나타내고, 또한 (b) L243과 비교해서 면역반응에 대한 억제활성이 약한 것을 포함하는 성질을 가지는, HLA-DR과 결합하는 항체 또는 그의 기능적 단편, 또는 마우스 항-HLA-DR 모노클로날 항체 L243(ATCC HB-55)과 비교해서 L243과 동등하거나 또는 L243보다 강한 면역억제활성을 나타내는, HLA-DR과 결합하는 항체 또는 그의 기능적 단편에 관한 것이다.

Description

항-ＨＬＡ-ＤＲ 항체{ANTI-HLA-DR-ANTIBODY}
본 발명은 면역에 관여하는 세포막 분자인 HLA-DR(human leucocyte antigen-DR)을 인식하는 항-HLA-DR 항체에 관한 것이다. 또한 본 발명은 항-HLA-DR 항체를 유효성분으로 하는 다음 2가지의 약제에 관한 것이다: (1) HLA-DR을 발현하고 있는 세포에 기인하는 질환에 대한 예방 또는 치료제, 특히 악성 종양 치료제, 및 (2) HLA-DR을 발현하고 있는 세포에 기인하는 면역반응에 대한 예방 또는 치료제, 특히 만성 관절 류머티즘 치료제.
세포표면에 발현되는 단백질에 결합하여, 세포에 대해서 세포사 또는 상해성을 유도하는 작용을 가지는 항체를 암 등의 치료에 이용하는 것이 시도되고 있다. 현재, 세포막 위에 존재하는 수용체인 CD20을 표적으로 한 키메라 항체(Rituximab), Her2/neu를 표적으로 한 인간화 항체 등의 모노클로날 항체가, 악성 종양을 대상 질환으로 하여 사용되고 있고 그 치료효과가 인정을 받고 있다. 항체는 혈중 반감기가 길고, 항원에 대한 특이성이 높다고 하는 특징을 가져서 항종양제로서 특히 유용하다. 예를 들면, 종양 특이적인 항원을 표적으로 한 항체이면, 투여한 항체는 종양에 집적되는 것으로 추정되므로, 보체 의존성 세포 상해활성(CDC)이나 항체 의존적 세포성 세포 상해활성(ADCC)에 의한, 면역계의 암 세포에 대한 공격을 기대할 수 있다. 또한, 그의 항체에 방사성 핵종이나 세포 독성물질 등의 약제를 결합시켜 놓음으로써, 결합한 약제를 효율적으로 종양부위에 송달하는 것이 가능해지고, 동시에 비특이적인 타조직에의 상기 약제 도달량이 감소함으로써 부작용의 경감도 예상할 수 있다. 종양 특이적 항원에 세포사를 유도하는 활성이 있는 경우는 효능제 활성을 가지는 항체를 투여함으로써, 또한 종양 특이적 항원이 세포의 증식 및 생존에 관여하는 경우는 중화 활성을 가지는 항체를 투여함으로써, 종양 특이적인 항체의 집적과 항체의 활성에 의한 종양의 증식정지 또는 퇴축(退縮)이 기대된다. 항체는 상기한 바와 같이 그 특징으로부터 항종양제로서 적용하는데 적절하다고 생각된다.
최근 리툭시맵(Rituximab)에 의해, B세포 림프종에 있어서 유의한 항종양 효과를 발휘하고 있고, 부작용도 한정되어 있다. 그렇지만 리툭시맵은 인간-마우스의 키메라 단백질이기 때문에, 리툭시맵 자체의 항원성이 높고, 체내에서 마우스 부위에 대한 항체가 생산되어 효과가 감약할 가능성도 있다. 또한, 리툭시맵 단독으로는 효과가 낮은 암도 있어, 항암제와의 병용에 대해서는 현재 임상시험이 행하여지고 있다[McLaughlin P. et. al., J Clin Oncol.(1998), 16, 2825-2833; Coiffer B. et. al., B100d(1998), 92, 1927-81 참조]. 따라서, 새로운 항원을 표적으로 한 항종양 항체가 필요한 실정이고, 클래스 Ⅱ 주요조직 적합 유전자 복합체(MHC) 분자의 일종인 HLA-DR에 대한 모노클로날 항체에는 리툭시맵과 다른 항원을 인식하는 항체로서 임상에 있어서의 항종양 활성이 기대된다.
한편, 클래스 Ⅱ 주요조직 적합 유전자 복합체(MHC) 분자는, 항원 펩티드 단편에 결합하고, 이들 항원 펩티드 단편을 헬퍼(CD4+) T세포(「Th」세포)에 제시한다(Babbin B. et al., Nature(1985), 317, 359-361 참조). 클래스 Ⅱ MHC분자에 특이적인 모노클로날 항체는 시험관내에서 Th세포의 면역 반응이 대단히 강력한 선택적 저해제인 것으로 보고되어 있다[Baxevanis CN, et. al., Immunogentics(1980), 11, 617-625 참조]. 이러한 모노클로날 항체는 발견된 이래, 만성 관절 류머티즘 등의 자기면역질환의 선택적 면역억제 치료에 사용할 수 있는 가능성이 있는 약품으로서 여겨지고 있다. 초기의 생체내에서의 연구에 의해, 이들 모노클로날 항체가 Th세포성 이종 및 자기 면역 반응에 대해서 주는 유용한 영향이 밝혀졌다[Rosenbaum JT. et al., J. Exp. Med.(1981), 154, 1694-1702; Waldor MK. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1983), 80, 2713-2717; Jonker M. et., J. Autoimmun.(1988), 1, 399-414; Stevens HP. et. al., Transplant. Proc.(1990), 22, 1783-1784 참조]. 또한 영장류에 있어서의 연구에 의해, 동종이식에 있어서의 이식편대숙주 반응을 억제하는 것이 밝혀졌다[Billing R. ＆ Chatterjee S. (1983), Transplant. Proc., 15, 649-650; Jonker M. et. al., Transplant Proc. (1991), 23, 264-265].
현재 임상적으로는 장기 이식시의 거부반응의 억제에는, 시클로스포린 A 또는 FK506이라고 하는 면역억제제가 이용되고 있지만, 이들 면역억제제의 문제점은 면역반응을 비특이적으로 억제해 버리기 때문에 강한 부작용이 일어난다.
이상에서 항체는 그 특징으로부터 부작용이 적은 면역억제제로서 적용하는데 적절하다고 생각된다.
도 1은 정제 인간 항-HLA-DR 모노클로날 항체의 MLR에 대한 면역억제활성을 나타내는 도이다.
도 2는 정제 인간 항-HLA-DR 모노클로날 항체의 암에 걸린 마우스 모델에 대한 수명 연장 효과를 나타내는 도이다.
도 2A는 투여용량 1㎍/마리의 경우, 도 2B는 투여용량 0.1㎍/마리의 경우의 효과를 나타내는 도이다.
도 3은 정제 인간 항-HLA-DR 모노클로날 항체의 세포의존성(ADCC) 및 보체의존성 (CDC)의 세포상해활성을 나타내는 도이다.
도 3A는 HD8G1Ser 및 HD8G1의 ADCC활성을, 도 3B는 HD8G2CH0, HD8G1, HD8G1Ser 및 HD8G4의 CDC활성을, 도 3C는 HD8G1, HD8G2, HD8G2Ser, HD8G4, HD4G1, HD4G2Ser 및 HD4G4의 ADCC활성을, 도 3D는 HD8G1, HD8G2, HD8G2Ser, HD8G4, HD4G1, HD4G2Ser 및 HD4G4의 CDC활성을 나타낸다.
도 4는 암에 걸린 마우스 모델에 대한 본 발명의 항체 HD8G1Ser, HD8G2Ser 및 HD8G1의 수명 연장 효과를 나타내는 도이다.
도 4A는 투여량 0.1㎍/마리의 경우의 결과, 도 4B는 투여량 1.0㎍/마리의 경우의 결과를 나타내는 도이다.
도 5는 HLA-DRβ쇄 서열의 합성 펩티드를 이용한 정제 인간 항-HLA-DR 모노클로날 항체 에피토프 해석을 나타내는 도이다.
도 5A, 도 5B 및 도 5C는 각각 HD4, HD6 및 HD8에 관한 해석을 나타내는 도이다.
도 6은 HLA-DRβ쇄 에피토프 서열부분의 다형 서열의 합성 펩티드를 이용한 정제 인간 항-HLA-DR 모노클로날 항체 에피토프 해석을 나타내는 도이다.
<서열목록 설명>
서열 1 내지 15 - 인공서열의 설명 : 프라이머
서열 24 내지 145 - 인공서열의 설명 : 펩티드
면역억제활성이 높고, 그 자신의 면역원성이 낮은 인간 항체를 이용한 면역억제제의 개발에 대해서도 미해결이다.
본 발명은 이러한 항체를 제작하고, 항종양제 또는 면역억제제로서 사용하는 것을 목적으로 한다.
본 발명자들은, 인간 HLA-DR에 대한 항체의 제작에 관해서 예의 연구한 결과, HLA-DR을 발현하는 암세포에 대단히 저농도로 항종양 효과를 나타내는 모노클로날 항체, 및 HLA-DR을 통한 면역활성을 특이적으로 억제하는 모노클로날 항체의 취득에 성공하고, 또한 상기 모노클로날 항체의 가변영역의 서열을 특정하고, 상기 모노클로날 항체가 결합하는 에피토프를 결정하여, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
즉, 본 발명은 이하와 같다.
본 발명은 그 제1의 양태에 있어서, 마우스-마우스 하이브리도마에 의해 생산되는 HLA-DR과 결합하는 모노클로날 항체, 예를 들면 HD4, HD6, HD8 또는 HD10에 의해 생산되는 바람직하게는 인간 항체인 모노클로날 항체 또는 그의 기능적 단편을 제공한다. HD4, HD6, HD8 또는 HD10에 의해 생산되는 모노클로날 항체의 타입은 면역글로불린G(IgG)형이다. 여기에서 하이브리도마 HD8은 수탁번호가 FERM BP-7773으로서, 하이브리도마 HD10은 수탁번호가 FERM BP-7774로서, 2001년 10월 11일자로 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁 센터(일본 이바라끼껭 쯔꾸바시 히가시 1-쪼메 1반지 1 주오 다이6)에 국제기탁되어 있다. 하이브리도마 HD4는 수탁번호가 FERM BP-7771로서, 2001년 10월 11일자로 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁 센터(일본 이바라끼껭 쯔꾸바시 히가시 1-쪼메 1반지 1 주오 다이6)에 국제기탁되어 있다. 하이브리도마 HD6은, 수탁번호가 FERM BP-7772로서, 2001년 10월 11일자로 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁 센터(일본 이바라끼껭 쯔꾸바시 히가시 1-쪼메 1반지 1 주오 다이6)에 국제기탁되어 있다.
본 발명의 실시형태에 있어서, 본 발명의 항체는 상기 하이브리도마가 생산하는 항체의 가변영역을 가지는 항체 또는 그의 기능적 단편이다.
본 발명의 다른 실시형태에 있어서, 본 발명의 항체는 서브클래스가 개변된 항체도 포함하고, 하이브리도마 HD8이 생산하는 항체이며 서브클래스가 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4인 항체 또는 그의 기능적 단편, 하이브리도마 HD4가 생산하는 항체이며 서브클래스가 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4인 항체 또는 그의 기능적 단편, 하이브리도마 HD10이 생산하는 항체이며 서브클래스가 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4인 항체 또는 그의 기능적 단편, 또는 하이브리도마 HD6이 생산하는 항체이며 서브클래스가 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4인 항체 또는 그의 기능적 단편이다. 본 발명의 또 다른 실시형태에 있어서, 본 발명의 항체는 중쇄 불변영역의 아미노산 서열이 개변된 항체 또는 그의 기능적 단편이며, 예를 들면 중쇄 불변영역의 EU 넘버링 시스템(Sequences of proteins of immunological interest, NIH Publication N0. 91-3242를 참조)에 있어서의 331번째 아미노산을 Ser으로 치환한 항체 또는 그의 기능적 단편이다.
본 발명의 다른 실시형태에 있어서, 항체 또는 그의 기능적 단편은 IgG1, IgG2, 또는 IgG4에 서브클래스를 재조합하고, 여기에 중쇄 불변영역의 EU 넘버링 시스템에 있어서의 331번째 아미노산을 Ser으로 치환하여 IgG1, IgG1Ser, IgG2, IgG2Ser 또는 IgG4로 개변한 결과, IgG1 및 IgG1Ser 타입만이 ADCC를 발현하고, IgG1 및 IgG2만이 CDC활성을 발현하는 항체 또는 그의 기능적 단편이다.
또한, 본 발명의 다른 양태에 있어서, 본 발명은 하이브리도마 HD4, HD6, HD8 또는 HD10이 생산하는 항체의 가변영역을 포함하는, HLA-DR과 결합하는 항체 또는 그의 기능적 단편을 제공한다. 본 발명의 실시형태에 있어서, 본 발명의 항체는 서열 21 및 23에 나타내어지는 아미노산 서열 중 가변영역의 성숙체 부분의 아미노산 서열을 가지는, 하이브리도마 HD8이 생산하는 항체의 가변영역을 포함하는 항체 또는 그의 기능적 단편이다.
본 발명의 다른 실시형태에 있어서, 본 발명의 항체는 서열 17 및 19에 나타내어지는 아미노산 서열 중 가변영역의 성숙체 부분의 아미노산 서열을 가지는, 하이브리도마 HD4가 생산하는 항체의 가변영역을 포함하는 항체 또는 그의 기능적 단편이다.
또한 본 발명의 다른 양태에 있어서, 본 발명은 HLA-DR의 특정한 에피토프에 결합할 수 있는 항체 또는 그의 기능적 단편이다. 본 발명의 실시형태에 있어서, 본 발명의 항체는 HLA-DR의 β쇄(DRB1*15011)의 세포외 영역 아미노산(서열 147에 아미노산 서열, 서열 146에 염기서열을 나타낸다)에 대해서 13-mer 펩티드를 2개의 아미노산씩 이동(shift)시켜 펩티드를 제조하고(서열 147의 아미노산 서열 중 제29번째부터 제227번째의 199 아미노산에 대해서 13-mer 펩티드를 제조한다), 상기 펩티드를 셀룰로오스막 위에 C 말단을 통해 결합시키고 N 말단을 아세틸화하여 생성된 펩티드 중, 서열 82로 나타내어지는 펩티드와 가장 강력하게 결합하는, HLA-DR에 결합하는 항체 및 그 기능적 단편; HLA-DR의 β쇄(DRB1*15011)의 세포외 영역 아미노산에 대해서 13-mer 펩티드를 2개의 아미노산씩 이동시켜 펩티드를 제조하고, 상기 펩티드를 셀룰로오스막 위에 C 말단을 통해 결합시키고 N 말단을 아세틸화하여 생성된 펩티드 중, 서열 82, 83 및 84로 나타내어지는 3종류의 펩티드 전부와 강력하게 결합하는, HLA-DR에 결합하는 항체 및 그 기능적 단편; 및 HLA-DR의 β쇄(DRB1*15011)의 세포외 영역 아미노산에 대해서 13-mer 펩티드를 2개의 아미노산씩 이동시켜 펩티드를 제조하고, 상기 펩티드를 셀룰로오스막 위에 C 말단을 통해 결합시키고 N 말단을 아세틸화하여 생성된, 서열 24 내지 39로 나타내어지는 모든 펩티드와 유의하게 결합하고, 또한 서열 40 내지 43으로 나타내어지는 모든 펩티드와 유의하게 결합하는, HLA-DR에 결합하는 항체 또는 그의 기능적 단편이다.
본 발명의 다른 양태에 있어서, 본 발명의 항체 또는 그의 기능적 단편은, 종양(예를 들면 SCID 마우스에 이식된 Raji 세포에서 유래한 것)의 증식을 억제함으로써 마우스 개체의 생존율을 연장시킬 수 있는 항체 또는 그의 기능적 단편을 제공한다. 종양을 담지하는 피검동물(예를 들면 림프종 세포의 암에 걸린 마우스 모델 등의 암에 걸린 실험동물, 체중 20g으로 한다)에 본 발명의 항체 또는 그의 기능적 단편을 투여하는 양은, 0.1㎍/개체 내지 1㎍/개체 또는 5㎍/kg 내지 50㎍/㎏이다. 예를 들면, 투여량으로서 1㎍/개체 또는 50㎍/㎏, 바람직하게는 0.1㎍/개체 또는 5㎍/㎏을 들 수 있다.
본 발명의 실시형태에 있어서, 본 발명의 항체는 이하의 성질 (a) 및 (b):
(a) 6주령의 SCID 마우스에 항-아시알로(anti-asialo) GM1 항혈청을 10㎕/마우스 개체로 정맥내 투여하고, 항-아시알로 GM1 항혈청 투여 다음날에 버키트 림프종 세포 Raji(ATCC CCL-86)을 5×1O6/마우스 개체로 정맥내 투여하고, Raji 투여 5일 후에 투여량 50㎍/kg 체중 내지 5㎍/㎏ 체중으로 투여한 경우의 마우스의 생존율이, 인간 항-HSA 항체를 동량 투여한 경우의 생존율보다도 높다고 하는 성질; 및
(b) 1O％ FCS를 포함하는 RPMI1640 배지를 이용해서 8㎍/mL로 조제한 항체 50㎕와 10％ FCS를 포함하는 RPMI1640 배지를 이용해서 2×105개/mL로 조제한 제1의 인간 도너 유래 성숙 수상세포 부유액 50㎕를 96웰 플레이트의 웰중에서 혼합하여 4℃에서 30분간 방치하고, 이어서 10％ FCS를 포함하는 RPMI1640 배지를 이용해서 1×106개/mL로 조제한 상기 제1의 인간 도너와 조직 적합 항원이 다른 제2의 인간 도너 유래의 순도 99％ 이상의 T세포 부유액 100㎕를 혼합하고, 37℃, 5％ CO2 존재하에서 5일간 배양하고, 다시 3H 티미딘을 1.0μCi/웰로 첨가하고, 다시 37℃, 5％ CO2 존재하에서 16 내지 20시간 배양한 후, 세포에 혼입된 3H 티미딘을 회수해서 상기 3H 티미딘을 섬광계수기로 측정하고, 3H 티미딘의 세포에의 혼입을 지표로 하여 면역억제활성을 측정한 경우의 면역억제활성이 동농도의 마우스 항-HLA-DR 모노클로날 항체 L243(ATCC HB-55)을 이용한 경우의 면역억제활성과 비교해서 약하다고 하는 성질
을 가지는, HLA-DR과 결합하는 항체 및 그 기능적 단편이다.
본 발명은 또한, 다른 양태에 있어서, 마우스 항-HLA-DR 모노클로날 항체 L243(ATCC HB-55)과 비교해서 L243과 동등하거나 또는 L243보다 강한 면역억제활성 을 나타내는, HLA-DR을 인식하는 항체 또는 그의 기능적 단편을 제공한다. 본 발명의 실시형태에 있어서, 본 발명의 항체는 1O％ FCS를 포함하는 RPMI1640 배지를 이용해서 8㎍/mL로 조제한 항체 50㎕와 10％ FCS를 포함하는 RPMI1640 배지를 이용해서 2×105개/mL로 조제한 제1의 인간 도너 유래 성숙 수상세포 부유액 50㎕를 96웰 플레이트의 웰중에서 혼합하여 4℃에서 30분간 방치하고, 이어서 1O％ FCS를 포함하는 RPMI1640 배지를 이용해서 1×106개/mL로 조제한 상기 제1의 인간 도너와 조직 적합 항원이 다른 제2의 인간 도너 유래의 순도 99％ 이상의 T세포 부유액 100㎕를 혼합하고, 37℃, 5％ CO2 존재하에서 5일간 배양하고, 다시 3H 티미딘을 1.0μCi/웰로 첨가하고, 다시 37℃, 5％ CO2 존재하에서 16 내지 20시간 배양한 후, 세포에 혼입된 3H 티미딘을 회수해서 상기 3H 티미딘을 섬광계수기로 측정하고, 3 H 티미딘의 세포에의 혼입을 지표로 하여 면역억제활성을 측정한 경우의 면역억제활성이 동농도의 마우스 항-HLA-DR 모노클로날 항체 L243(ATCC HB-55)을 이용한 경우의 면역억제활성과 비교해서 동등 또는 강하다고 하는 성질을 가지는, 항체 또는 그의 기능적 단편을 제공한다.
본 발명은 또한, 다른 양태에 있어서, 하이브리도마 HD8(수탁번호 FERM BP-7773), 하이브리도마 HD10(수탁번호 FERM BP-7774), 하이브리도마 HD4(수탁번호 FERM BP-7771) 및 HD6(수탁번호 FERM BP-7772)을 포함하는 군으로부터 선택되는 하이브리도마가 보유하는 핵산으로, 상기 하이브리도마가 생산하는 항체의 가변영역을 포함하는 항체를 코딩하는 핵산 또는 상기 항체의 기능적 단편을 코딩하는 핵산, 상기 핵산에 의해 코딩되는 단백질, 상기 핵산을 가지는 발현 벡터, 상기 발현 벡터를 가지는 대장균, 효모세포, 곤충세포, 포유동물세포 및 식물세포 및 포유동물을 포함하는 군으로부터 선택되는 숙주를 제공한다. 본 발명의 실시형태에 있어서, 본 발명의 항체는 가변영역이 서열 17 및 19로 나타내어지는 아미노산 서열 중 가변영역의 성숙체 부분의 아미노산서열을 가지는 가변영역을 포함하는 상기 항체를 코딩하는 핵산 또는 상기 항체의 기능적 단편을 코딩하는 핵산이며, 가변영역이 서열 21 및 23으로 나타내어지는 아미노산 서열 중 가변영역의 성숙체 부분의 아미노산 서열을 가지는 가변영역을 포함하는 상기 항체를 코딩하는 핵산 또는 상기 항체의 기능적 단편을 코딩하는 핵산이며, 서브클래스가 IgG1이며 EU 넘버링 시스템에 있어서의 331번째 아미노산이 Ser으로 치환된 항체 HD8인 항체 HD8G1Ser, 서브클래스가 IgG2이며 EU 넘버링 시스템에 있어서의 331번째 아미노산이 Ser으로 치환된 항체 HD8인 항체 HD8G2Ser 및 서브클래스가 IgG2이며 EU 넘버링 시스템에 있어서의 331번째 아미노산이 Ser으로 치환된 항체 HD4인 항체 HD4G2Ser을 포함하는 군으로부터 선택되는 항체를 코딩하는 핵산 또는 상기 항체의 기능적 단편을 코딩하는 핵산이다.
본 발명은 또한, 다른 양태에 있어서, 하이브리도마 HD8(수탁번호 FERM BP-7773), 하이브리도마 HD10(수탁번호 FERM BP-7774), 하이브리도마 HD4(수탁번호 FERM BP-7771) 및 HD6(수탁번호 FERM BP-7772)을 포함하는 군으로부터 선택된 하이브리도마로부터 항-HLA-DR 모노클로날 항체를 코딩하는 유전자를 단리하고, 상기 유전자를 가지는 발현 벡터를 구축하고, 상기 발현 벡터를 숙주에 도입해서 상기 모노클로날 항체를 발현시키고, 얻어지 숙주, 숙주의 배양 상청 또는 숙주의 분비물로부터 항-HLA-DR 모노클로날 항체를 채취하는 것을 포함하는, 항-HLA-DR 모노클로날 항체의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 다른 양태에 있어서, 상기 항체 또는 그의 기능적 단편을 유효성분으로서 함유하는 종양의 예방, 치료 또는 진단제를 제공한다.
예방 또는 치료 가능한 종양의 예는, 백혈병(만성 림프성 백혈병, 급성 림프성 백혈병을 포함한다), 림프종(비호지킨 림프종, 호지킨 림프종, T세포계 림프종, B세포계 림프종, 버키트 림프종, 악성 림프종, 미만성 림프종, 여포성 림프종을 포함한다), 골수종(다발성 골수종을 포함한다), 유방암, 대장암, 신장암, 위암, 난소암, 췌장암, 자궁경부암, 자궁내막암, 식도암, 간암, 두경부 편평 상피암, 피부암, 요로암, 전립선암, 융모암, 인두암, 후두암, 흉막종, 남성배(胚)종, 자궁내막 과형성, 자궁내막증, 배아종, 섬유육종, 카포시 육종(Kaposi's sarcoma), 혈관종, 해면상 혈관종, 혈관아종, 망막아종, 성상 세포종, 신경섬유종, 희돌기 교종, 수아종, 신경아종, 신경아교종, 횡문근육종, 교아종, 골원성 육종, 평활근육종, 갑상육종 및 윌름스 종양(Wilm's tumor)을 포함하는 군으로부터 선택되는 하나 이상이다.
본 발명은 또한, 다른 양태에 있어서, 본 발명의 항체 또는 그의 기능적 단편을 유효성분으로서 함유하는 면역억제제를 제공하고, 또한 본 발명의 항체 또는 그의 기능적 단편을 유효성분으로서 함유하는 자기면역질환 또는 알레르기의 예방, 치료 또는 진단제를 제공한다.
본 발명의 실시형태에 있어서, 예방 또는 치료제는 장기 이식시에 있어서의 면역억제제(췌장도 이식이나 신장 등의 이식시에 있어서의 거부반응, GVHD의 예방 또는 치료제), 또는 자기면역질환(예를 들면, 류머티즘, 동맥 경화증, 다발성 경화증, 전신성 홍반, 특발성 혈소판 감소증, 크론병(Crohn's disease) 등) 치료제, 천식 등 알레르기 치료제의 예방 또는 치료를 위한 것이다. 본 발명의 또 다른 실시형태에 있어서, 본 발명의 항체 또는 그의 기능적 단편은, Raji 세포가 이식된 암에 걸린 SCID 마우스에 있어서, 종양 이식 5일 후에 상기 항체 또는 그의 기능적 단편의 투여량 5㎍/㎏ 이하에서 수명 연장 효과가 인정을 되는 것을 특징으로 한다.
본 발명은 또한 서열 17 및 19에 각각 나타내어지는, 하이브리도마 HD4가 생산하는 항체의 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역, 서열 21 및 23에 각각 나타내어지는, 하이브리도마 HD8가 생산하는 항체의 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역의 성숙체 부분의 아미노산 서열을 가지는 항체 또는 그의 기능적 단편을 포함한다.
상기 항체 또는 그의 기능적 단편은, 예를 들면, 서열 16 및 18에 각각 나타내어지는, 하이브리도마 HD4로부터 단리된 핵산 서열에 의해 코딩되는 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역, 서열 20 및 22에 각각 나타내어지는, 하이브리도마 HD8로부터 단리된 핵산 서열에 의해 코딩되는 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역의 성숙체 부분의 아미노산 서열을 가지는 것이다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
항-HLA-DR 모노클로날 항체에, 면역반응에 대해서 억제활성이 있는 것도 보고되어 있다. 초기의 생체내에서의 연구에 의해, 항-HLA-DR 모노클로날 항체가 Th세포성 이종 및 자기 면역 반응에 대해서 주는 유용한 영향이 밝혀졌다[Rosenbaum JT. et al., J. Exp. Med. (1981), 154, 1694-1702; Wa1dor MK. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1983), 80, 2713-2717; Jonker M. et al., J. Autoimmun. (1988), 1, 399-414; Stevens HP. et. al., Transplant. Proc. (1990), 22, 1783-1784 참조]. 또한 영장류에 있어서의 연구에 의해, 동종이식에 있어서의 이식편대숙주 반응을 억제하는 것이 밝혀졌다[Billing R. ＆ Chatterjee S. (1983), Transplant.Proc., 15, 649-650; Jonker M. et. al., Transplant Proc. (1991), 23, 264-265]. 그러나 이들 보고되어 있는 항체는 마우스 항체다. 최근들어 프로테인 디자인 라보라토리사가 ID10이라고 하는 마우스 항-HLA-DR 항체를 이용하여, 그들이 가지는 인간화 기술에 의해 가변부위 이외를 유전자 재조합에 의해 인간 항체의 서열로 한 인간화 HLA-DR 항체가 개발되어[Sheri AK. et. al., Int. J. Cancer (2001), 93, 556-565 참조], 미국에서 임상시험을 실시하고 있다.
본 발명의 신규 인간 항-HLA-DR 모노클로날 항체는 완전 인간 항체이며, 마우스 항체에서는 항상 문제가 되는 마우스의 서열에 대한 항원성에 대해서는 이미 회피되어 있다.
상기 항체로서는 면역글로불린G(IgG), 면역글로불린A(IgA), 면역글로불린E(IgE) 및 면역글로불린M(IgM)의 어느 형도 바람직하게 이용할 수 있지만, 통상은 IgG가 보다 바람직하다.
이하, 본 발명에서 이용하는 어구의 의미를 밝힘으로써 본 발명을 상세하게 설명한다.
1.HLA-DR 및 그의 항체
본 발명의 항체는 클래스 Ⅱ의 주요조직 특이성 복합체(MHC)의 하나인 HLA-DR에 대한 항체, 즉 HLA-DR을 인식하여 결합하는 항체, HLA-DR에 반응성을 가지는 항체이다.
본 발명에 있어서의 「HLA-DR과 결합하는 항체」란, 인간 HLA-DR 또는 그의 일부에 반응성을 가지는 항체 또는 항체의 일부이며, 이들 항체의 기능적 단편도 포함한다. 「기능적 단편」이란, 항체의 일부분(부분단편)이며, 항체의 항원에의 작용을 1개 이상 보유하는 것을 의미하고, 구체적으로는 F(ab')2, Fab', Fab, Fv, 디술피드 결합 Fv, 단일쇄 Fv(scFv), 및 이것들의 중합체 등을 들 수 있다[D. J. King., Applications and Engineering of Monclonal Antibodies., 1998 T. J. International Ltd]. 또는, 「기능적 단편」은 항체의 단편이며 항원과 결합할 수 있는 단편이다. 본 발명의 항체의 기능적 단편은 HLA-DR과 결합하고, 항종양 효과를 나타내거나, 또는 강한 면역억제활성을 나타낸다.
본 발명에서 「인간 항체」란, 인간 유래의 항체 유전자의 발현산물인 항체를 의미한다. 인간 항체는 후술하는 바와 같이 인간 항체 유전자좌를 도입하고, 인간 유래 항체를 생산하는 능력을 가지는 트랜스제닉 동물에게 항원을 투여함으로써 얻을 수 있다. 상기 트랜스제닉 동물로서 마우스를 들 수 있고, 인간 항체를 생산할 수 있는 마우스의 제조방법은, 국제공개 WO02/43478호 공보에 기재되어 있다.
본 발명의 항체로서는 예를 들면, 하기 실시예에 기재되는, 인간 HLA-DR의 발현되는 암 세포에 저농도로 항종양 효과를 나타내는 각종의 항체를 들 수 있다.
본 발명의 항체에는, 항체를 구성하는 중쇄 및(또는) 경쇄의 각각의 아미노산 서열에 있어서, 1개 또는 몇 개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 가지는 중쇄 및(또는) 경쇄를 포함하는 모노클로날 항체도 포함된다. 본 발명의 항체의 아미노산 서열 중에, 상기와 같은 아미노산의 부분적 개변(결실, 치환, 삽입, 부가)은, 그 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열을 부분적으로 개변함으로써 도입할 수 있다. 이 염기서열의 부분적 개변은, 기지의 부위 특이적 변이 도입법(site specific mutagenesis)을 이용해서 통상의 방법에 의해 도입할 수 있다[Proc Natl Acad Sci USA., 1984 Vol81:5662]. 여기에서 항체란, 면역글로불린을 구성하는 중쇄 가변영역 및 중쇄 불변영역, 및 경쇄의 가변영역 및 경쇄의 불변영역을 포함하는 모든 영역이, 면역글로불린을 코딩하는 유전자에서 유래하는 면역글로불린이다.
본 발명의 항체는 어느 면역글로불린 클래스 및 이소타입을 가지는 항체도 포함한다.
본 발명의 항-HLA-DR 항체는 하기와 같은 제조방법에 의해 제조할 수 있다. 즉, 예를 들면, 인간 HLA-DR, 그의 일부 또는 그의 일부와 항원의 항원성을 높이기 위한 적당한 캐리어 물질(예를 들면, 소혈청 알부민 등)과의 결합물을, 필요에 따라 면역강화제(프로인트의 완전 또는 불완전 면역보강제 등)과 함께, 인간 항체 생산 트랜스제닉 마우스 등의 비인간 포유동물에게 면역화한다. 또는, 인간 HLA-DRα쇄 및 β쇄를 코딩하는 유전자를 도입하고, HLA-DR을 세포표면에 과잉으로 발현하고 있는 동물세포를 투여함으로써 면역화를 행할 수 있다. 모노클로날 항체는 면역화 동물로부터 얻은 항체 생산세포와, 자기항체 생산능력이 없는 골수종계 세포(미엘로마 세포)를 융합함으로써 얻어지는 하이브리도마를 배양하고, 면역화에 이용한 항원에 대해서 특이적 친화성을 나타내는 모노클로날 항체를 생산하는 클론을 선택함으로써 취득할 수 있다.
본 발명의 항체는 당업자에게 공지된 유전자 공학적 개변(예를 들면, 유럽 특허 EP314161공보를 참조)에 의해 다른 서브클래스의 것으로 변환된 것도 포함한다. 즉, 본 발명의 항체의 가변부를 코딩하는 DNA를 이용해서 유전자 공학적 수법을 이용해서 원래의 서브클래스와는 다른 서브클래스의 항체를 얻을 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 항체의 서브클래스를 IgG2 또는 IgG4로 변환함으로써, Fc 수용체에 대한 결합도가 낮은 항체를 취득할 수 있다. 반대로, 본건 발명의 항체의 서브클래스를 IgG1 또는 IgG3으로 변환함으로써, Fc 수용체에 대한 결합도가 높은 항체를 취득할 수 있다. 또한 본 발명의 항체의 불변영역의 아미노산 서열을 유전자 공학적으로 개변하는 것, 또는 그러한 서열을 가지는 불변영역 서열과 결합함으로써, Fc 수용체에 대한 결합도를 변화시키는 것(Janeway CA. Jr. and Travers P. (1997), Immunobiology, Third Edition, Current Biology Ltd./Garland Phulishing Inc. 참조), 또는 보체에 대한 결합도를 변화시키는 것(Mi-Hua Tao, et al. 1993. J. Exp. Med 참조)은 가능하고, 본 발명의 항체는 이들 불변영역의 아미노산 서열을 개변한 항체도 포함한다. 여기에서 아미노산 서열의 개변이란 아미노산 서열에 있어서 1개 또는 몇 개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 말한다. 예를 들면, 중쇄 불변부분의 EU 넘버링 시스템(Sequences of proteins of immunological interest, NIH Publication N0. 91-3242를 참조)에 있어서의 331번째의 프롤린(P)을 코딩하는 서열 CCC를 세린(S)을 코딩하는 TCC로 변이화시켜 프롤린을 세린으로 치환함으로써 보체에 대한 결합도를 변화시킬 수 있다. 만일 항암제에 대해서 생각했을 경우, 항체 단독으로 세포사 유도활성이 없는 경우는, Fc 수용체를 통한 항체의존성 세포장해활성(ADCC)이나 보체 의존성 세포 상해활성(CDC)에 의한 항종양 활성을 가지는 항체가 바람직하지만, 항체 단독으로 세포사 유도활성이 있는 경우는 Fc 수용체와의 결합도가 낮은 항체가 보다 바람직한 경우도 있다. 또 면역억제제에 대해서 생각했을 경우, T세포와 항원제시세포의 결합만을 입체적으로 저해하는 경우 등 ADCC활성 또는 CDC활성을 가지지 않는 항체가 바람직하다. 또한, ADCC활성 또는 CDC활성이 독성의 원인이 될 수 있는 경우, 독성의 원인이 되는 활성을 Fc부분의 변이 또는 서브클래스 변경에 의해 회피한 항체가 바람직한 경우도 있다.
본 발명의 항체는 IgG1, IgG2,또는 IgG4에 서브클래스를 재조합한 개변항체, 또는 다시 IgG1 또는 IgG2에 서브클래스를 재조합한 개변항체의 중쇄 불변영역의 EU 넘버링 시스템에 있어서의 331번째 아미노산을 Ser으로 치환하여 IgG1Ser 또는 IgG2Ser로 한 개변항체, 즉 IgG1, IgG1Ser, IgG2, IgG2Ser 또는 IgG4로 개변한 결과, IgG1 및 IgG1Ser 타입만이 ADCC를 발현하고, IgG1 및 IgG2만이 CDC활성을 발현하는 항체도 포함한다.
또한, 본 발명의 항체에, 요오드, 이트륨, 인듐, 테크네툼 등의 방사성 핵종[J.W. Goding, Momoclonal Antibodies:principles and practice., 1993 Academic Press], 녹농균 독소, 디프테리아 독소, 리신(ricin)과 같은 세균독소, 및 메토트렉세이트, 마이토마이신, 칼리케아미신 등의 화학요법제[D. J. King, Applications and Engineering of Monoclonal Antibodies., 1998 T. J. International Ltd.; M. L. Grossbard., Monoclonal Antibody-BasedTherapy of Canccr., 1998 Marcel DekkerInc], 또한 메이탄시노이드(Maytansinoid) 등의 전구약물[Chari et al., Cancer Res., 1992 Vol. 52:127; Liuet al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996 Vol. 93:8681]등을 결합시킴으로써 암 등의 질환의 치료효과를 더욱 증강시키는 것도 가능하다.
본 발명에 있어서, 모노클로날 항체의 제조에 있어서는, 하기의 작업공정을 포함한다. 즉, (1) 면역원으로서 사용하는, 생체 고분자의 조제 및(또는) 항원 단백질을 세포표면에 과잉으로 발현하고 있는 세포의 제작, (2) 항원을 동물에게 주사함으로써 면역화한 후, 혈액을 채취해서 그의 항체가를 검정해서 비장 등의 적출의 시기를 결정하고 나서, 항체 생산세포를 조제하는 공정, (3) 골수종 세포(미엘로마)의 조제, (4) 항체 생산세포와 미엘로마의 세포융합, (5) 목적으로 하는 항체를 생산하는 하이브리도마군의 선별, (6) 단일세포 클론으로의 분할(클로닝), (7) 경우에 따라서는, 모노클로날 항체를 대량으로 제조하기 위한 하이브리도마의 배양, 또는 하이브리도마를 이식한 동물의 사육, (8) 이렇게 해서 제조된 모노클로날 항체의 생리활성 및 그 인식 특이성의 검토, 또는 표식시약으로서의 특성의 검정 등을 포함한다.
이하, 항-HLA-DR 모노클로날 항체의 제작법을 상기 공정에 따라 상술하는데, 상기 항체의 제작법은 이것으로 제한되지 않고, 예를 들면 비장세포 이외의 항체 생산세포 및 미엘로마를 사용할 수도 있다.
(1) 항원의 정제
항원으로서는 HLA-DRα쇄 및 β쇄를 코딩하는 DNA를 동물세포용 발현 벡터에 넣고, 상기 발현 벡터를 동물세포에 도입하고, 취득한 형질전환주 자체를 사용할 수 있다. 부가해서 HLA-DRα쇄 및 β쇄의 1차 구조는 공지[Steven GE, et a l., (2000) The HLA Facts Book, Academic Press 발행 참조]이므로, 당업자에게 주지의 방법에 의해, HLA-DR의 아미노산 서열로부터 펩티드를 화학합성하고, 이것을 항원으로서 사용할 수도 있다.
또한, 면역원으로서는 인간 HLA-DR의 전장 α쇄 및 β쇄를 L929세포에 도입하여 세포표면에 HLA-DR 헤테로다이머를 과잉으로 발현하고 있는 세포도 유효하다. pEF-neo-HLA-DRα 및 pEF-neo-HLA-DRβ는, 각각 인간 HLA-DRα쇄 단백질을 코딩하는 DNA 및 인간 HLA-DRβ쇄 단백질을 코딩하는 DNA를, 동물세포용 발현 벡터 pEF-neo에 넣음으로써 제작할 수 있다. pEF-neo는 개변 pEF-BOS[Mizushima S. ＆ Nagata S., Nucleic Acids Res (1990), 18, 5332 참조]에 네오마이신(neomycin) 내성 유전자를 넣은 벡터이다. 단, HLA-DR을 코딩하는 DNA, 벡터, 숙주 등은 이것들로 한정되지 않는다.
구체적으로는 pEF-neo-HLA-DRα 및 pEF-neo-HLA-DRβ로 L929세포를 형질전환해서 얻어진 형질전환주를 배양하고, pEF-neo 벡터가 삽입된 세포에 획득되는 네오마이신 내성의 형질 및 염소 항-HLA-DR 폴리클로날 항체(DAK0사제)를 이용한 HLA-DR 발현의 확인을 지표로, 인간 HLA-DR를 그 세포표면에 과잉으로 발현하고 있는 L929세포를 제작할 수 있다.
(2) 항체 생산세포의 제조공정
(1)에서 얻어진 항원과, 프로인트의 완전 또는 불완전 면역보강제, 또는 포타쉬 알룸(potash alum)과 같은 조제를 혼합하여 면역원으로서 실험동물에게 면역화한다. 실험동물로서는 인간 유래의 항체를 생산하는 능력을 가지는 트랜스제닉 마우스를 가장 바람직하게 이용할 수 있지만, 그러한 마우스는 토미즈카 등의 문헌[Tomizuka. et al., Proc Natl Acad Sci USA., 2000 Vol 97:722]에 기재되어 있다.
마우스 면역화시의 면역원 투여법은, 피하 주사, 복강내 주사, 정맥내 주사, 피내 주사, 근육내 주사, 발바닥 주사 등 어느 것이라도 좋지만, 복강내 주사, 발바닥 주사 또는 정맥내 주사가 바람직하다.
면역화는 1회 또는 적당한 간격으로(바람직하게는 2주 내지 4주 간격으로) 복수회 반복해서 행할 수 있다. 그 후, 면역화한 동물의 혈청중의 항원에 대한 항체가를 측정하고, 항체가가 충분히 높아진 동물을 항체 생산세포의 공급원으로서 이용하면 이후의 조작의 효과를 높일 수 있다. 일반적으로는 최종 면역화 후 3 내지 5일 후의 동물유래의 항체 생산세포를, 이후의 세포융합에 이용하는 것이 바람직하다.
여기에서 이용되는 항체가의 측정법으로서는 방사성 동위원소 면역 정량법(이하 「RIA법」이라고 한다), 고상 효소 면역 정량법(이하 「ELISA법」이라고 한다), 형광항체법, 수신 혈구 응집반응법 등 여러 가지 공지기술을 들 수 있지만, 검출감도, 신속성, 정확성, 및 조작의 자동화 가능성 등의 관점에서 RIA법 또는 ELISA법이 보다 바람직하다.
본 발명에 있어서의 항체가의 측정은, 예를 들면 ELISA법에 따르면, 이하에 기재하는 순서에 의해 행할 수 있다. 우선, 인간 항체에 대한 항체를 ELISA용 96웰 플레이트 등의 고상 표면에 흡착시키고, 다시 항원이 흡착되어 있지 않은 고상 표면을 항원과 무관계한 단백질, 예를 들면 소 혈청 알부민(BSA)으로 블로킹하고, 상기 표면을 세정 후, 1차 항체로서 단계 희석한 시료(예를 들면, 마우스 혈청)에 접촉시켜 상기 항원에 시료중의 항-HLA-DR 항체를 결합시킨다. 또한 ２차 항체로서 효소 표식된 인간 항체에 대한 항체를 가해서 인간 항체에 결합시켜 세정 후 상기 효소의 기질을 가하고, 기질분해에 기초하는 발색에 의한 흡광도의 변화 등을 측정함으로써 항체가를 산출한다.
(3) 미엘로마의 조제공정
미엘로마로서는 마우스, 래트, 모르모트, 햄스터, 토끼 또는 인간 등의 포유동물에서 유래하는 자기항체 생산능력이 없는 세포를 이용할 수 있는데, 일반적으로는 마우스로부터 얻어진 주화(株化)세포, 예를 들면 81-아자구아닌 내성 마우스(BALB/c유래) 미엘로마 주 P3X63Ag8U.1(P3-Ul)[Yelton, D.E. et al. Current Topics in Microbiology and Immunology, 81, 1-7 (1978)], P3/NSI/1-A94-1(NS-1) [Kohler, G. et al. European J. Immunology, 6, 511-519(1976)], Sp2/0-Ag14(SP-2) [Shulman, M. et al. Nature, 276, 269-270 (1978)], P3X63Ag8.653(653) [Kearney, J. F. et al. J. Immunology, 123, 1548-1550(1979)], P3X63Ag8(X63)[Horibata, K. and Harris, A. W. Nature, 256, 495-497(1975)] 등을 이용하는 것이 바람직하다. 이들 세포주는 적당한 배지, 예를 들면 8-아자구아닌 배지[글루타민, 2-메르캅토에탄올, 젠타마이신 및 소 태아 혈청(이하 「FCS」라고 한다)을 가한 RPMI-1640 배지에 8-아자구아닌을 가한 배지], 이스코프 개변 덜베코 배지(Iscove's Modified Dulbecco's Medium; 이하 「IMDM」이라고 한다), 또는 덜베코 개변 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle Medi㎜:이하 「DMEM」라고 한다)에서 계대 배양하는데, 세포융합의 3 내지 4일 전에 정상 배지(예를 들면, 1O％ FCS를 포함하는 DMEM 배지)에서 계대 배양하고, 융합 당일에 2×107 이상의 세포수를 확보해 둔다.
(4) 세포융합
항체 생산세포는 형질세포, 및 그의 전구세포인 림프구이며, 이것은 개체의 어느 부위로부터 얻을 수 있고, 일반적으로는 비장, 림프절, 골수, 편도, 말초혈, 또는 이것들을 적당히 조합시킨 것 등으로부터 얻을 수 있는데, 비장세포를 가장 일반적으로 이용할 수 있다.
최종 면역화 후, 소정의 항체가가 얻어진 마우스로부터 항체 생산세포가 존재하는 부위, 예를 들면 비장을 적출하고, 항체 생산세포인 비장세포를 조제한다. 이 비장세포와 공정 (3)에서 얻어진 미엘로마를 융합시키는 수단으로서 현재 가장 일반적으로 행하여지고 있는 것은, 세포독성이 비교적 적고 융합조작도 간단한, 폴리에틸렌글리콜을 이용하는 방법이다. 이 방법은 예를 들면 이하의 순서로 이루어진다.
비장세포와 미엘로마를 무혈청 배지(예를 들면 DMEM), 또는 인산 완충 생리식염액(이하 「PBS」라고 한다)으로 잘 세정하고, 비장세포와 미엘로마의 세포수 비율이 5:1 내지 10:1 정도가 되도록 혼합하고 원심분리한다. 상청을 제거하고, 침전된 세포군을 잘 현탁한 후, 교반하면서 1mL의 50％(w/v) 폴리에틸렌글리콜(분자량 1000 내지 4000)을 포함하는 무혈청 배지를 적가한다. 그 후, 1OmL의 무혈청 배지를 천천히 가한 후 원심분리한다. 다시 상청을 버리고, 침전된 세포를 적량의 히포크산틴·아미노프테린·티미딘(이하 「HAT」라고 한다) 액 및 인간 인터류킨-6(이하 「IL-6」이라고 한다)을 포함하는 정상 배지(이하 「HAT 배지」라고 한다) 중에 현탁해서 배양용 플레이트(이하 「플레이트」라고 한다)의 각 웰에 분주하고, 5％ 탄산가스 존재하, 37℃에서 2주일 정도 배양한다. 도중에 적당히 HAT 배지를 보충한다.
(5) 하이브리도마군의 선택
상기 미엘로마 세포가, 8-아자구아닌 내성주인 경우, 즉, 히포크산틴·구아닌·포스폴리보실트랜스페라아제(HGPRT) 결손주인 경우, 융합하지 않은 상기 미엘로마 세포, 및 미엘로마 세포끼리의 융합세포는, HAT함유 배지중에서는 생존할 수 없다. 한편, 항체 생산세포끼리의 융합세포, 또는, 항체 생산세포와 미엘로마 세포의 하이브리도마는 생존할 수 있지만, 항체 생산세포끼리의 융합세포에는 수명이 있다. 따라서, HAT함유 배지중에서의 배양을 계속함으로써, 항체 생산세포와 미엘로마세포의 하이브리도마만이 살아 남고, 결과적으로 하이브리도마를 선택할 수 있다.
콜로니상으로 생육해 온 하이브리도마에 대해서, HAT 배지에서 아미노프테린을 제외한 배지(이하 「HT 배지」라고 한다)로 배지를 교환한다. 이후, 배양 상청의 일부를 채취하고, 예를 들면, ELISA법에 의해 항-HLA-DR 항체가를 측정한다. 단, ELISA용의 항원으로서 상기 융합 단백질을 이용하는 경우는 인간 IgG의 Fc영역에 특이적으로 결합하는 항체를 생산하는 클론을 선택하지 않도록, 상기 클론을 제외하는 조작이 필요하다. 그러한 클론의 유무는 예를 들면 인간 IgG의 Fc영역을 항원으로 이용한 ELISA 등에 의해 확인할 수 있다.
이상, 8-아자구아닌 내성의 세포주를 이용하는 방법을 예시했지만, 그 밖의 세포주도 하이브리도마의 선택방법에 따라서 사용할 수 있고, 그 경우 사용하는 배지조성도 변화된다.
(6) 클로닝 공정
(2)의 기재와 동일한 방법으로 항체가를 측정함으로써, 특이적 항체를 생산하는 것으로 판명된 하이브리도마를 다른 플레이트에 옮겨 클로닝을 행한다. 이 클로닝법으로서는 플레이트의 1웰에 1개의 하이브리도마가 포함되도록 희석해서 배양하는 한계희석법, 연한천 배지중에서 배양하여 콜로니를 회수하는 연한천법, 현미경조작기(micromanipulator)에 의해 1개씩의 세포를 꺼내 배양하는 방법, 세포 소터(cell sorter)에 의해 1개의 세포를 분리하는 「소터 클론(sorter clone)」등을 들 수 있지만, 한계희석법이 간편해서 자주 이용된다.
항체가가 인정된 웰에 대해서, 예를 들면 한계희석법에 의한 클로닝을 2 내지 4회 반복하여 안정되게 항체가가 인정되는 것을 항-HLA-DR 모노클로날 항체 생산 하이브리도마주로서 선택한다.
또한, 본 발명의 인간 항-HLA-DR 모노클로날 항체의 생산세포인 마우스-마우스 하이브리도마 HD8, HD10, HD4 및 HD6은, 2001년 10월 11일자로 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁 센터(일본 이바라끼껭 쯔꾸바시 히가시 1-쪼메 1반지 1 주오 다이6)에 국제기탁되어 있다. 하이브리도마 HD8은 수탁번호가 FERM BP-7773이고, 하이브리도마 HD10은 수탁번호가 FERM BP-7774이고, 하이브리도마 HD4는 수탁번호가 FERM BP-7771이고, 하이브리도마 HD6은 수탁번호가 FERM BP-7772이다.
(7) 하이브리도마 배양에 의한 모노클로날 항체의 조제
클로닝을 완료한 하이브리도마는, 배지를 HT 배지에서 정상 배지로 바꿔서 배양된다. 대량 배양은, 대형 배양병을 이용한 회전 배양, 스피너 배양, 또는 중공 섬유 시스템을 이용한 배양으로 행하여진다. 이 대량 배양에 있어서의 상청을, 겔 여과 등, 당업자에게 주지의 방법을 이용해서 정제함으로써, 본 발명의 예방 또는 치료제를 유효성분으로서 함유하는 항-HLA-DR 모노클로날 항체를 얻을 수 있다. 또한, 동계통의 마우스(예를 들면 BALB/c) 또는 nu/nu 마우스, 래트, 모르모트, 햄스터 또는 토끼 등의 복강내에서 상기 하이브리도마를 증식시킴으로써, 본 발명의 예방 또는 치료제를 유효성분으로서 함유하는 항-HLA-DR 모노클로날 항체를 대량으로 포함하는 복수를 얻을 수 있다. 정제의 간편한 방법으로서는 시판의 모노클로날 항체 정제 키트(예를 들면, MAbTrap GII 키트; 아머샴파머시아바이오테크사제)등을 이용할 수도 있다.
이렇게 해서 얻어지는 모노클로날 항체는 인간 HLA-DR에 대해서 높은 항원특이성을 가진다.
(8) 모노클로날 항체의 검정
이렇게 해서 얻어진 모노클로날 항체의 이소타입 및 서브클래스의 결정은 아래와 같이 행할 수 있다. 우선, 동정법으로서는 오크터로니(Ouchterlony)법, ELISA법, 또는 RIA법을 들 수 있다. 오크터로니법은 간편하지만, 모노클로날 항체의 농도가 낮은 경우에는 농축조작이 필요하다. 한편, ELISA법 또는 RIA법을 이용한 경우는, 배양 상청을 그대로 항원흡착 고상과 반응시키고, 다시 ２차 항체로서 각종 면역글로불린 이소타입, 서브클래스에 대응하는 항체를 이용함으로써, 모노클로날 항체의 이소타입, 서브클래스를 동정하는 것이 가능하다.
또한 단백질의 정량, 폴린로우리(Folin-Lowry)법, 및 280㎚에 있어서의 흡광도[1.4.(0D280)=면역글로불린 1㎎/mL]로부터 산출하는 방법에 의해 행할 수 있다.
모노클로날 항체의 인식 에피토프의 동정은 아래와 같이 해서 행할 수 있다. 우선, 모노클로날 항체의 인식하는 분자의 여러 가지 부분구조를 제작한다. 부분구조의 제작에 있어서는, 공지의 올리고펩티드 합성기술을 이용해서 그 분자의 여러 가지 부분 펩티드를 제조하는 방법, 유전자 재조합 기술을 이용해서 원하는 부분 펩티드를 코딩하는 DNA서열을 바람직한 발현 플라스미드에 넣고, 대장균 등의 숙주 내외에서 생산하는 방법 등이 있지만, 상기 목적을 위해서는 양자를 조합시켜 이용하는 것이 일반적이다. 예를 들면, 항원 단백질의 C 말단 또는 N 말단으로부터 적당한 길이로 순차 짧게 한 일련의 폴리펩티드를 당업자에게 주지의 유전자 재조합 기술을 이용해서 제작한 후, 그것들에 대한 모노클로날 항체의 반응성을 검토하고, 대충 인식부위를 결정한다.
그 후, 다시 세밀하게 그 대응부분의 올리고펩티드, 또는 상기 펩티드의 변이체 등을, 당업자에게 주지의 올리고펩티드 합성기술을 이용해서 여러 가지 합성하고, 본 발명의 예방 또는 치료제가 유효성분으로서 함유하는 모노클로날 항체의 펩티드에 대한 결합성을 조사하거나, 또는 상기 모노클로날 항체와 항원의 결합에 대한 펩티드의 경합 저해활성을 조사함으로써 에피토프를 한정한다. 다종의 올리고펩티드를 얻기 위한 간편한 방법으로서, 시판의 키트(예를 들면, SPOTs키트(제노시스·바이오테크놀러지즈사제), 멀티 핀 합성법을 이용한 일련의 멀티 핀·펩티드 합성 키트(카이론사제) 등)을 이용할 수도 있다.
또는, 하이브리도마 등의 항체 생산세포로부터 인간 모노클로날 항체를 코딩하는 유전자를 클로닝하여 적당한 벡터에 넣고, 이것을 숙주(예를 들면 포유류세포 세포주, 대장균, 효모세포, 곤충세포, 식물세포 등)에 도입하고, 유전자 재조합 기술을 이용해서 생산한 재조합형 항체를 조제할 수도 있다(P. J. Delves., ANTIBODY PRODUCTION ESSENTIAL TECHNIQUES., 1997 WILEY, P. Shepherd and C. Dean., Monoclonal Antihodies., 2000 0XF0RD UNIVERSITY PRESS, J.W, Goding., Monoclonal Antibodies:Principles and Practice., 1993 ACADEMIC PRESS).
본 발명은 본 발명의 항체를 생산하는 하이브리도마가 보유하는 항체의 유전자 서열을 포함하는 핵산, 특히 후술의 본 발명의 하이브리도마가 생산하는 항체의 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역의 성숙체 부분에 대응하는 핵산도 포함한다. 여기에서 핵산에는 DNA 및 RNA가 포함된다. 또한, 본 발명은 본 발명의 항체를 생산하는 하이브리도마가 보유하는 항체의 유전자 서열을 포함하는 핵산에 있어서, 중쇄 또는 경쇄의 가변영역의 부분의 프레임 부분(FR1, FR2, FR3 및 FR4:Sequences of proteins of immunological interest, NIH Publication No. 91-3242를 참조)의 염기의 1개 이상의 염기가 치환, 결실 및(또는) 부가에 의해 서열이 개변되고, 서열이 개변되기 전의 핵산에 상보적인 핵산과 엄격한 조건으로 혼성화시키고, HLA-DR과 결합하여 (a) HLA-DR 발현 암 세포를 담지한 비인간 동물에 있어서 수명 연장 효과를 나타내고, 또한 (b) L243과 비교해서 면역반응에 대한 억제활성이 약한 것을 포함하는 성질을 가지거나, 또는 마우스 항-HLA-DR 모노클로날 항체 L243(ATCC HB-55)과 비교해서 L243과 동등하거나 또는 L243보다 강한 면역억제활성을 나타내는 항체를 코딩하는 핵산도 포함한다. 여기에서 항체란, 면역글로불린을 구성하는 중쇄 가변영역 및 중쇄 불변영역, 및 경쇄의 가변영역 및 경쇄의 불변영역을 포함하는 모든 영역이, 면역글로불린을 코딩하는 유전자에서 유래하는 면역글로불린이다. 또한, 엄격한 조건이란, 본 발명의 항체를 코딩하는 DNA 서열과 90％ 이상의 상동성, 바람직하게는 95％ 이상의 상동성, 보다 바람직하게는 97％ 이상의 상동성이 서열간에 존재할 때 혼성화가 일어나는 것을 의미한다. 통상 완전 하이브리드의 융해 온도보다 약 5℃ 내지 약 30℃, 바람직하게는 약 10℃ 내지 약 25℃ 낮은 온도로 혼성화가 일어나는 경우를 말한다. 엄격한 조건에 대해서는, 문헌 [J. Sambrook 등, Molecular Cloning, A Laboratory Mannual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)]에 기재되어 있으며, 여기에 기재된 조건을 사용할 수 있다.
하이브리도마에서 모노클로날 항체를 코딩하는 유전자를 조제하기 위해서는, 모노클로날 항체의 L쇄 V영역, L쇄 C영역, H쇄 V영역 및 H쇄 C영역을 각각 코딩하는 DNA를 PCR법 등에 의해 조제하는 방법이 채용된다. 프라이머는 항-HLA-DR 항체 유전자 또는 아미노산 서열로부터 설계한 올리고 DNA를, 주형으로는 하이브리도마로부터 조제한 DNA를 사용할 수 있다. 이들 DNA를 1개의 적당한 벡터에 넣고, 이것을 숙주에 도입해서 발현시키거나, 또는 이들 DNA를 각각 적당한 벡터에 넣고 함께 발현시킨다.
벡터에는 숙주 미생물로 자율적으로 증식할 수 있는 파지 또는 플라스미드가 사용된다. 플라스미드 DNA로서는 대장균, 고초균 또는 효모 유래의 플라스미드 등을 들 수 있고, 파지 DNA로서는 λ파지를 들 수 있다.
형질전환에 사용하는 숙주으로서는 원하는 유전자를 발현할 수 있는 것이면 특별히 한정되는 것이 아니다. 예를 들면, 세균(대장균, 고초균 등), 효모, 동물세포(COS세포, CHO세포 등), 곤충세포를 들 수 있다.
숙주에의 유전자의 도입방법은 공지이며, 임의의 방법(예를 들면 칼슘 이온을 이용하는 방법, 전기천공법, 스페로플라스트(spheroplast)법, 아세트산 리튬법, 인산 칼슘법, 리포펙션(lipofection)법 등)을 들 수 있다. 또한, 후술의 동물에게 유전자를 도입하는 방법으로서는 미세주입법, ES세포에 전기천공법이나 리포펙션법을 사용해서 유전자를 도입하는 방법, 핵이식법 등을 들 수 있다.
본 발명에 있어서, 항-HLA-DR 항체는 형질전환체를 배양하고, 그 배양물로부터 채취함으로써 얻을 수 있다. 「배양물」이란, (a) 배양 상청, (b) 배양세포 또는 배양균체 또는 그의 파쇄물, (c) 형질전환체의 분비물 중 어느 것을 의미하는 것이다. 형질전환체를 배양하기 위해서는, 사용하는 숙주에 적합한 배지를 이용하고, 정치 배양법, 롤러 병에 의한 배양법 등이 채용된다.
배양 후, 목적 단백질이 균체 내 또는 세포 내에 생산될 경우에는, 균체 또는 세포를 파쇄함으로써 항체를 채취한다. 또한, 목적항체가 균체 외 또는 세포 외에 생산될 경우에는, 배양액을 그대로 사용하거나, 원심분리 등에 의해 균체 또는 세포를 제거한다. 그 후, 단백질의 단리 정제에 이용되는 각종 크로마토그래피를 이용한 일반적인 생화학적 방법을 단독으로 또는 적당히 조합시켜 이용함으로써, 상기 배양물 중에서 원하는 항체를 단리 정제할 수 있다.
또한 트랜스제닉 동물 제작기술을 이용하여, 목적항체의 유전자가 내재성 유전자에 갖추어진 동물숙주, 예를 들면 트랜스제닉 소, 트랜스제닉 염소, 트랜스제닉 양 또는 트랜스제닉 돼지를 제작하고, 그 트랜스제닉 동물로부터 분비되는 밀크 중에서 그의 항체 유전자에서 유래하는 모노클로날 항체를 대량으로 취득하는 것도 가능하다(Wright, G., et al. (1991) Bio/Technology 9, 830-834). 하이브리도마를 시험관내에서 배양하는 경우에는, 배양하는 세포종의 특성, 시험연구의 목적 및 배양방법 등의 여러 가지 조건에 맞춰 하이브리도마를 증식, 유지 및 보존시켜, 배양 상청 중에 모노클로날 항체를 생산시키기 위해서 이용되는 기지 영양 배지, 또는 기지의 기본 배지에서 유도 조제되는 모든 영양 배지를 이용해서 실시하는 것이 가능하다.
(9) 항체의 성질
본 발명의 항체는 하기의 a) 및 b)의 기능적 특성을 가지는 것으로, 각각의 특성은 예를 들면 각 항목에 기재된 방법에 의해 확인할 수 있다:
a) SCID 마우스 등의 면역부전 마우스에 HLA-DR을 발현하고 있는 인간 암 세포를 이식하고, 본 발명의 항체를 투여했을 때의 마우스 생존율을 조사한 결과, 마우스의 생존일수가 연장된다.
b) 동종이계 림프구 혼합에 의한 면역반응에의 억제활성이 L243과 비교해서 약하다. 또한, a) 및 b)의 특성은 상세하게는,
(a) 6주령의 SCID 마우스에 항-아시알로 GM1 항혈청을 10㎕/마우스 개체로 정맥내 투여하고, 항-아시알로 GM1 항혈청 투여 다음날에 버키트 림프종 세포 Raji(ATCC CCL-86)을 5×106/마우스 개체로 정맥내 투여하고, Raji 투여 5일 후에 투여량 5 내지 50㎍/kg 체중, 바람직하게는 5㎍/㎏ 체중으로 1회 투여한 경우의 마우스의 생존율이, 인간 항-HSA 항체를 동량 투여한 경우의 90일 후의 생존율보다도 높다고 하는 성질; 및
(b) 10％ FCS를 포함하는 RPMI1640 배지를 이용해서 8 내지 200㎍/mL, 바람직하게는 8㎍/mL로 조제한 항체 50㎕와 10％ FCS를 포함하는 RPMI1640 배지를 이용해서 2×105개/mL로 조제한 제1의 인간 도너 유래 성숙 수상세포 부유액 50㎕를 96웰 플레이트의 웰중에서 혼합하여 4℃에서 30분간 방치하고, 그 다음에 10％ FCS를 포함하는 RPMI1640 배지를 이용해서 1×106개/mL로 조제한 상기 제1의 인간 도너와 조직 적합 항원이 다른 제2의 인간 도너 유래의 순도 99％ 이상의 T세포 부유액 100㎕를 혼합하고, 37℃, 5％ CO2 존재하에서 5일간 배양하고, 다시 3H 티미딘을 1.0μCi/웰로 첨가하고, 다시 37℃, 5％ CO2 존재하에서 16 내지 20시간 배양한 후, 세포에 혼입된 3H 티미딘을 회수해서 상기 3H 티미딘을 섬광계수기로 측정하고, 3 H 티미딘의 세포에의 혼입을 지표로 하여 면역억제활성을 측정한 경우의 면역억제활성이 동농도의 마우스 항-HLA-DR 모노클로날 항체 L243(ATCC HB-55)을 이용한 경우의 면역억제활성과 비교해서 약하다고 하는 성질이다.
이러한 항체로서, 예를 들면 하이브리도마 HD4(수탁번호 FERM BP-7771)가 생산하는 항체, 하이브리도마 HD8(수탁번호 FERM BP-7773)가 생산하는 항체 및 하이브리도마 HD10(수탁번호 FERM BP-7774)가 생산하는 항체를 들 수 있다.
상기 a)의 성질은 상기 항체가 강한 항종양 활성을 가지는 것을 의미한다.
또한 본 발명의 항체는 동종이계 림프구 혼합에 의한 면역반응에의 억제활성이 L243과 동등 또는 그 이상의 면역억제활성을 가진다고 하는 기능적 특성을 가지기도 한다. 이 특성은 상세하게는, 10％ FCS를 포함하는 RPMI1640 배지를 이용해서 8 내지 200㎍/mL, 바람직하게는 8㎍/mL로 조제한 항체 50㎕와 10％ FCS를 포함하는 RPMI1640 배지를 이용해서 2×105개/mL로 조제한 제1의 인간 도너 유래 성숙 수상세포 부유액 50㎕를 96웰 플레이트의 웰중에서 혼합하여 4℃에서 30분간 방치하고, 그 다음에 1O％ FCS를 포함하는 RPMI1640 배지를 이용해서 1×106개/mL로 조제한 상기 제1의 인간 도너와 조직 적합 항원이 다른 제2의 인간 도너 유래의 순도 99％ 이상의 T세포 부유액 100㎕를 혼합하고, 37℃, 5％ CO2 존재하에서 5일간 배양하고, 다시 3H 티미딘을 1.0μCi/웰로 첨가하고, 다시 37℃, 5％ CO2 존재하에서 16 내지 20시간 배양한 후, 세포에 혼입된 3H 티미딘을 회수해서 상기 3H 티미딘을 섬광계수기로 측정하고, 3H 티미딘의 세포에의 혼입을 지표로 하여 면역억제활성을 측정한 경우의 면역억제활성이 동농도의 마우스 항-HLA-DR 모노클로날 항체 L243(ATCC HB-55)을 이용한 경우의 면역억제활성과 비교해서 동등 또는 강하다고 하는 특성이다. 이러한 항체로서, 예를 들면 하이브리도마 HD6(수탁번호 FERM BP-7772)가 생산하는 항체를 들 수 있다.
본 발명의 상기의 활성을 가지는 항체는 악성 종양에 대한 예방 또는 치료제에 함유시키기 위한 성분 또는 면역억제제에 함유시키기 위한 성분으로서 유용하다.
본 발명의 항체는 놀랍게도 0.1㎍/마우스 개체(5㎍/㎏ 체중)라고 하는 저용량으로 암에 걸린 마우스 모델에 있어서의 종양세포증식에 의한 생존율의 저하를 현저하게 억제하고, 마우스 모델에 있어서 수명 연장 효과를 나타낸다. 본 발명의 항체와 동시에 대조군으로서 인간 항-인간 혈청 알부민(HSA) 항체를 투여한 경우에 본 발명의 항체를 투여한 마우스의 생존율이 대조군 마우스의 생존율에 비교해서 유의하게 향상된 경우, 수명 연장 효과를 나타낸다고 판단할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 항체 및 항-HSA 항체를 림프종 세포를 이식한 암에 걸린 마우스 모델 5마리씩에 투여한 경우에, 항-HSA 항체 투여 마우스 군이 멸종한 시점에서, 본 발명 항체를 투여한 마우스가 1마리 이상 생존하고 있으면, 암에 걸린 마우스 모델에 있어서 수명 연장 효과를 나타낸다고 할 수 있다.
면역억제효과는 상술한 바와 같이 동종이계 림프구 혼합(MLR)에 의한 면역반응에의 억제활성을 측정함으로써 평가할 수 있고, MLR은 공지의 방법으로 행할 수 있다.
또한, 본 발명의 항체가 인식하는 HLA-DR의 에피토프는 공지의 방법에 의해 결정할 수 있다. 예를 들면, HLA-DR의 β쇄(DRB1*15011)의 세포외 영역 199 아미노산(서열 147에 나타내는 아미노산 서열 중 제29번째로부터 제227번째의 199 아미노산, 서열 146에는 서열 147에 나타내는 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열을 나타낸다)에 대해서, 13-mer 펩티드를 1개의 아미노산씩 이동시켜 펩티드를 제조하고(예를 들면, 서열 52 내지 145에 나타내어지는 아미노산 서열을 가지는 펩티드), 반응성을 보았을 경우, 본 발명의 항체는 서열 82에 나타내어지는 아미노산 서열을 가지는 펩티드와 가장 강력하게 결합하고, 또는 서열 82, 83 및 84로 나타내어지는 3종류의 펩티드의 하나 이상과 강력하게 결합하는 항체이다. 여기서 「강력하게 결합」한다고 하는 것은, 실시예 17(2)로 나타내어지는 방법에 있어서 백그라운드에 비해서 10배 이상의 형광강도를 나타내는 결합이다. 본 발명의 항체는 HLA-DR의 β쇄의 61번째 내지 71번째의 펩티드에 반응성을 가진다. 또한 HLA-DR에는 약 350종류의 다형이 있는 것이 알려져 있다(EMBL-EBI의 IMGT/HLA 데이타베이스 등 참조). 본 발명의 항체는 이들 다형의 실질적으로 거의 모두를 인식할 수 있다. 여기에서 다형의 실질적으로 거의 모두를 인식할 수 있는 것은, 약 350종류의 다형의 거의 전부를 포함하는 펩티드 군을 제작하고, 이 펩티드 군의 거의 모두가 반응하는지의 여부를 측정함으로써 결정할 수 있다. 예를 들면, 서열 24 내지 39에 나타내는 16종류의 펩티드 중 12종류 이상과 반응한 경우, 그 항체는 HLA-DR의 실질적으로 거의 모든 다형을 인식하는 항체다. 본 발명의 항체는 서열 24 내지 39로 나타내어지는 모든 펩티드와 유의하게 결합하고, 또한 서열 40 내지 43으로 나타내어지는 모든 펩티드와 유의하게 결합한다. 여기에서 「유의하게 결합」한다고 하는 것은, 실시예 17(3)으로 나타내어지는 방법에 있어서 백그라운드에 비해서 10％ 이상의 형광강도를 나타내는 결합이다.
2. 의약 조성물
본 발명의 인간 항-HLA-DR 항체의 정제된 제제를 함유하는 제제도 또한, 본 발명의 범위내에 포함된다. 이러한 제제는 바람직하게는, 항체에 부가해서, 생리학적으로 허용될 수 있는 희석제 또는 담체를 포함하고 있고, 다른 항체 또는 항생 물질과 같은 다른 약제와의 혼합물일 수 있다. 적절한 담체에는, 생리적 식염수, 인산 완충 생리 식염수, 인산 완충 생리 식염수 글루코오스액, 및 완충 생리 식염수가 포함되지만, 이것들로 한정되는 것은 아니다. 또는, 항체는 동결건조(freeze-dry)하고, 필요한 경우 상기와 같은 완충 수용액을 첨가함으로써 재구성해서 사용할 수 있다. 이러한 예방 또는 치료제는, 여러 가지 형태로 투여할 수 있고, 그것들의 투여형태로서는 정제, 캡슐제, 과립제, 가루약, 시럽제 등에 의한 경구투여, 또는 주사제, 점적제, 좌약 등에 의한 비경구투여를 들 수 있다.
그 투여량은, 증상, 연령, 체중 등에 따라 다르지만, 통상 경구투여에서는 성인에 대해서, 1일 약 0.01㎎ 내지 1000㎎이며, 이것들을 1회 또는 수회로 나눠서 투여할 수 있다. 또한, 비경구투여에서는, 1회 약 0.01㎎ 내지 1000㎎를 피하 주사, 근육 주사 또는 정맥 주사에 의해 투여할 수 있다.
본 발명의 항체 또는 의약 조성물은, HLA-DR를 발현하고 있는 세포에 기인할 가능성을 가지는 여러 가지 질환 또는 증상의 치료 또는 예방에의 적용이 가능하다. 그 질환 또는 증상으로서는 각종 악성 종양, 장기 이식시에 있어서의 면역억제제(췌장도 이식이나 신장 등의 이식시에 있어서의 거부반응, GVHD의 예방 또는 치료제)로서, 또는 자기면역질환(예를 들면, 류머티즘, 동맥 경화증, 다발성 경화증, 전신성 홍반, 특발성 혈소판 감소증, 크론병 등) 치료제, 천식등 알레르기 치료제를 들 수 있다.
예를 들면, 하기의 a) 및 b)의 기능적 특성을 가지는 본 발명의 항체 및 상기 항체를 포함하는 의약 조성물은, 각종 악성 종양의 예방 또는 치료에 이용할 수 있다.
a) SCID 마우스 등의 면역부전 마우스에 HLA-DR을 발현하고 있는 인간 암 세포를 이식하고, 본 발명의 항체를 투여했을 때의 마우스 생존율을 조사한 결과, 마우스의 생존일수가 연장된다.
b) 동종이계 림프구 혼합에 의한 면역반응에의 억제활성이 L243과 비교해서 약하다.
또한, 동종이계 림프구 혼합에 의한 면역반응에의 억제활성이 L243과 동등 또는 그 이상의 면역억제활성을 가지는 본 발명의 항체 및 상기 항체를 포함하는 의약 조성물은, 류머티즘, 이식편대숙주질환(GVHD)의 예방 또는 치료에 이용할 수 있다.
본 발명은 본 발명의 항체 또는 의약 조성물을 이용한 상기 질환의 예방 또는 치료법도 포함하고, 또한 본 발명은 본 발명의 항체의 상기 질환의 예방 또는 치료제의 제조에의 용도도 포함한다.
종양의 종류는, 백혈병(만성 림프성 백혈병, 급성 림프성 백혈병을 포함한다), 림프종(비호지킨 림프종, 호지킨 림프종, T세포계 림프종, B세포계 림프종, 버키트 림프종, 악성 림프종, 미만성 림프종, 여포성 림프종을 포함한다), 골수종(다발성 골수종을 포함한다), 유방암, 대장암, 신장암, 위암, 난소암, 췌장암, 자궁경부암, 자궁 내막암, 식도암, 간장암, 두경부 편평 상피암, 피부암, 요로암, 전립선암, 융모암, 인두암, 후두암, 흉막종, 남성배종, 자궁내막 과형성, 자궁내막증, 배아종, 섬유육종, 카포시 육종, 혈관종, 해면상 혈관종, 혈관아종, 망막아종, 성상 세포종, 신경섬유종, 희돌기 교종, 수아종, 신경아종, 신경아교종, 횡문근육종, 교아종, 골원성육종, 평활근육종, 갑상육종 및 윌름스 종양이며, 본 발명의 항체를 적용할 때의 종양은 1종류로 한정되지 않고, 복수종류의 종양이 병발한 것일 수도 있다.
3. 제제예
본 발명의 분자는 물 또는 그 이외의 약리학적으로 허용할 수 있는 용액에 용해시킨 무균성 용액 또는 현탁액의 앰플로서 사용에 제공된다. 또한, 무균 분말제제(본 발명의 분자를 동결건조하는 것이 바람직하다)를 앰플에 충전해 두고, 사용시에 약리학적으로 허용할 수 있는 용액으로 희석할 수 있다.
이하, 실시예를 들어 본 발명을 더욱 상세하게 설명하는데, 본 발명이 그 실시예에 기재되는 양태만으로 한정되는 것은 아니다.
실시예 1 항원의 조제
인간 HLA-DR이 세포막 위에 과잉 발현하고 있는 세포를 얻기 위해서, 인간 HLA-DRα쇄 및 β쇄 전장 아미노산의 발현 플라스미드 벡터를 제작했다. HLA-DRα쇄 및 β쇄를 코딩하는 DNA는 PCR법에 의해 제작했다.
a) 전장 인간 HLA-DRα쇄 및 β쇄 발현 벡터의 조제
주형 PCR를 행함에 있어서 주형으로 이용한 것은, 인간 HLA-DRα쇄 및 β쇄를 코딩하는 cDNA를 보유하는 플라스미드 벡터 pEF-neo-HLA-DRα 및 pEF-neo-HLA-DRβ였다. pEF-neo-HLA-DRα 및 pEF-neo-HLA-DRβ는 이하의 방법으로 제작되었다. 전장 인간 HLA-DRα쇄 DNA 및 HLA-DRβ쇄 DNA를, 그 5'말단에 EcoRI서열을, 그 3'말단에 NotI서열과 종지 코돈을 부가하기 위한 중합효소 연쇄반응(PCR)을 행하여 수식했다. 인간 말초혈 단핵구 유래 cDNA를 주형으로 하여 HLA-DRα에 대해서는 프라이머로서: 5'-CCGGAATTCCCACCATGGCCATAAGTGGAGTCCCTGTG-3'(서열 1) 및 5'-AAAGCGGCCGCTCATTACAGAGGCCCCCTGCGTTCTGC-3'(서열 2)을, HLA-DRβ에 대해서는 프라이머로서: 5'-CCGGAATTCCTGGTCCTGTCCTGTTCTCCAGCA-3'(서열 3) 및 5'-AAAGCGGCCGCTCATCAGCTCAGGAATCCTGTTGGCTG-3'(서열 4)을 합성하고, LA-Taq DNA 중합효소(기브코·비알엘사제)을 사용하고, (94℃ 15초; 55℃ 30초; 72℃ 60초간)×30사이클의 PCR반응을 행했다. 합성된 서열을, EcoRI-NotI 단편으로서 단리하고, 동일효소로 분해되어 있는 pEF-neo 벡터(개변 pEF-BOS[Mizushima S. ＆ Nagata S., Nucleic Acids Res (1990), 18, 5332참조]에 네오마이신 내성 유전자를 넣은 벡터)에 연결했다. 얻어진 플라스미드를 pEF-neo-HLA-DRα 및 pEF-neo-HLA-DRβ라고 명명했다. pEF-neo-HLA-nRα에 갖추어진 HLA-DRα는 765bp의 cDNA가 코딩되고, pEF-neo-HLA-DRβ에 갖추어진 HLA-DRβ는 801bp의 cDNA가 코딩되어 있다. 이하, 실시예 중의 모든 PCR 반응 온도조절은, 진앰프(Gene Amp) PCR 시스템 9700((주)퍼킨엘머·재팬사제)를 사용했다.
c) 인간 HLA-DR 발현세포의 제작
b)에서 제작한 pEF-neo-HLA-DRα 및 pEF-neo-HLA-DRβ를, LipofectAMINE Plus(기브코·비알엘사제)를 이용하여, L929세포(American Type Culture Collection (ATCC) No. CCL-1)에 도입했다. 유전자 도입은 매뉴얼의 방법으로 행했다. 세포배양용 플라스크(배양면적 75㎠) 중에서 37℃, 5.0％ 탄산가스하에서 24시간 배양한 후, G418(기브코·비알엘사제)을 1㎎/mL가 되도록 가하고, 1주간 배양했다. 그 다음에 R-피코에리트린(R-phycoerythrin) 표식한 마우스 항-인간 HLA-DR 항체(BD 파민젠사제)를 이용한 유동세포계수기(FCM; 벡톤디킨슨사제) 해석을 행하고, 유전자 도입된 세포로 G418 내성의 형질을 획득한 것 중, 세포막 표면상에 HLA-DR을 발현하고 있는 세포를 선택적으로 분류했다.
PCR용 프라이머 등의 올리고뉴클레오티드의 합성은, 모두 DNA 자동합성기(모델 3948;(주)퍼킨엘머·재팬·어플라이드바이오시스템즈사업부제)를 이용하여, 그 매뉴얼에 따라 행했다[Matteucci, M.D. and Caruthers, M.H. (1981) J. Am. Chem. Soc. 103, 3185-3191 참조]. 각 올리고뉴클레오티드는 합성 종료 후, 지지체로부터 개열시켜 탈(脫)보호를 행하고, 얻어진 용액을 건고한 후, 증류수에 용해시켜 사용할 때까지 120℃로 동결보존했다.
실시예 2 인간 항체 생산 마우스의 제작
면역화에 이용한 마우스는, 내인성 Ig 중쇄 및 κ경쇄 파괴의 양자에 대해서 호모 접합체의 유전적 배경을 가지고 있고, 또한 인간 Ig 중쇄 유전자좌를 포함하는 14번 염색체 단편(SC20) 및 인간 Igκ쇄 트랜스진(transgene; KCo5)을 동시에 보유한다. 이 마우스는 인간 Ig 중쇄 유전자좌를 가지는 계통 A의 마우스와, 인간 Igκ쇄 트랜스진을 가지는 계통 B의 마우스의 교배에 의해 제작되었다. 계통 A는, 내인성 Ig 중쇄 및 κ경쇄 파괴의 양자에 대해서 호모 접합체이며, 자손전달 가능한 14번 염색체 단편(SC20)을 보유하는 마우스 계통이며, 예를 들면 토미즈카 등의 보고 [Tomizuka. et al., Proc Natl Acad Sci USA., 2000 Vol 97:722]에 기재되어 있다. 또한, 계통 B는 내인성 Ig 중쇄 및 κ경쇄 파괴의 양자에 대해서 호모 접합체이며, 인간 Igκ쇄 트랜스진(KCo5)을 보유하는 마우스 계통(트랜스제닉 마우스)이며, 예를 들면 피쉬윌드(Fishwild) 등의 보고[NatBiotechnol, (1996), 114:845]에 기재되어 있다.
계통 A의 수컷 마우스와 계통 B의 암컷 마우스, 또는 계통 A의 암컷 마우스와 계통 B의 수컷 마우스의 교배에 의해 얻어진, 혈청중에 인간 Ig 중쇄 및 κ경쇄 이 동시에 검출되는 개체[Ishida ＆ Lonberg, IBC's 11th Antibody Engineering, Abstract 2000]을 이하의 면역실험에 이용했다. 또한, 상기 인간 항체 생산 마우스(KM 마우스라고 칭한다)는, 계약을 맺음으로써 기린 비루 가부시끼 가이샤에서 입수 가능하다.
실시예 3 인간 HLA-DR에 대한 인간 모노클로날 항체의 조제
본 실시예에 있어서의 모노클로날 항체의 제작은, 모노클로날 항체 실험조작 입문(안도 타미에이지 등 저작, 고단사 발행 1991)등에 기재되어 있는 일반적 방법에따라서 조제했다. 면역원으로서의 인간 HLA-DR은, 실시예 1에서 조제한 HLA-DR 발현 L929세포를 이용했다. 피면역동물은, 실시예 2에서 제작한 인간 면역글로불린을 생산하는 인간 항체 생산 마우스를 이용했다.
인간 HLA-DR에 대한 인간 모노클로날 항체의 조제를 목적으로서, 인간 항체 생산 마우스에, 실시예 1에서 제작한 HLA-DR 발현 L929세포(5×106세포/마리)를 복강내에 첫회 면역화했다. 첫회 면역화 이후, 동세포를 2, 4, 8주일 후에 면역화했다. 이하에 기술하는 비장 및 림프절의 취득 3일전에, 1×106세포/마우스 개체의 세포를 꼬리정맥 투여하고 5ng/마우스 개체의 재조합 인간 IL-6(이하, IL-6, 기린 비루사 의약탐색연구소에서 조제)을 피하투여했다.
면역화된 마우스로부터 비장 및(또는) 림프절을 외과적으로 취득하고, 350㎎/mL 염화수소나트륨, 50단위/mL 페니실린, 50㎍/mL 스트렙토마이신을 포함하는 무혈청 DMEM 배지(기브코·비알엘사제)(이하 「무혈청 DMEM 배지」라고 한다) 10mL중에 넣고, 메쉬(셀스트레이너(cell strainer); 팔콘사제)상에서 압설기(spatular)를 이용해서 으깼다. 메쉬를 통과한 세포 현탁액을 원심분리해서 세포를 침전시킨 후, 이 세포를 무혈청 DMEM 배지로 2회 세정하고 나서, 무혈청 DMEM 배지에 현탁해서 세포수를 측정했다. 한편, 1O％ FCS(시그마사제)를 포함하는 DMEM 배지(기브코·비알엘사제)(이하 「혈청이 들어간 DMEM 배지」라고 한다)에서, 37℃, 5％ 탄산가스 존재하에서 세포농도가 1×106세포/mL를 초과하지 않도록 배양한 미엘로마 세포 SP2/0(ATCC No. CRL-1581)을 마찬가지로 무혈청 DMEM 배지로 세정하고, 무혈청 DMEM 배지에 현탁해서 세포수를 측정했다. 회수한 세포의 현탁액과 마우스 미엘로마 현탁액을 세포수 5:1로 혼합하고, 원심분리 후, 상청을 완전히 제거했다. 이 펠렛에, 융합제로서 50％(w/v) 폴리에틸렌글리콜 1500(베링거 만하임사제) 1mL를, 피펫의 끝으로 펠렛을 교반하면서 천천히 첨가한 후, 미리 37℃로 가온해 둔 무혈청 DMEM 배지 1mL를 2회로 나눠서 천천히 첨가하고, 다시 7mL의 무혈청 DMEM 배지를 첨가했다. 원심분리 후, 상청을 제거해서 얻어진 융합세포를, 이하에 기재하는 한계희석법에 의한 스크리닝에 제공했다. 하이브리도마의 선택은, 1O％ FCS, IL-6(10ng/mL) 및 히포크산틴(H), 아미노프테린(A) , 티미딘(T)(이하 「HAT」라고 한다; 시그마사제)을 함유하는 DMEM 배지중에서 배양함으로써 행했다. 또한 HT(시그마사제), 1O％ FCS, IL-6함유 DMEM 배지를 이용해서 한계희석법에 의해 단일 클론을 얻었다. 배양은 96웰 마이크로타이터 플레이트(벡톤디킨슨사제) 중에서 행했다. 항-인간 HLA-DR 인간 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마 클론의 선택(스크리닝) 및 각각의 하이브리도마가 생산하는 인간 모노클로날 항체의 특성 규명은, 후술하는 효소 표식 면역흡착 분석(ELISA) 및 FCM에 의해 측정함으로써 행했다.
인간 모노클로날 항체 생산 하이브리도마의 스크리닝은, 실시예 4 및 5에 기술하는 세포 ELISA에 의해, 인간 면역글로불린 γ쇄(hIgγ) 및 인간 면역글로불린 경쇄κ를 가지고, 또한 인간 HLA-DR에 특이적인 반응성을 가지는 인간 모노클로날 항체를 생산하는 다수의 하이브리도마를 얻었다.
실시예 4 인간 면역글로불린 경쇄κ(Igκ)을 가지는, 인간 항-HLA-DR 모노클로날 항체 생산 클론의 선택
버키트 림프종 세포 Daudi(ATCC No. CCL-213)를 각 웰에 1×105개 가한 후, 하이브리도마 상청을 가하고, 4℃에서 20분간 인큐베이션했다. 그 다음에 1％ FCS가 들어있는 PBS로 2회 세정하고, 서양 고추냉이 퍼옥시다아제로 표식된 염소 항-인간 면역글로불린 경쇄κ(Igκ) 항체(50㎍/웰; DAKO사제)를 가하고, 4℃에서 20분간 인큐베이션했다. 1％ FCS가 들어있는 PBS로 2회 세정하고, TMB 발색 기질(DAK0사제)을 각 웰에 100㎕씩 가하고, 실온하에서 20분간 인큐베이션했다. 각 웰에 0.5M 황산(1OO㎕/웰)을 가하여 반응을 중지시켰다. 파장 450㎚(참조파장 570㎚)에서의 흡광도를 마이크로플레이트 판독기(1420 ARVO 멀티라벨카운터; WALLAC사제)로 측정해서 양성반응을 나타낸 항체 생산 클론을 선택했다.
실시예 5 각 모노클로날 항체의 서브클래스 동정
Daudi를 각 웰에 1×105개 가한 후, 하이브리도마 상청을 가하고, 4℃에서 20분간 인큐베이션했다. 그 다음에 1％ FCS가 들어있는 PBS로 2회 세정하고, 각 웰에 각각 서양 고추냉이 퍼옥시다아제로 표식된 양 항-인간 IgG1항체, 양 항-인간 IgG2 항체, 양 항-인간 IgG3 항체 또는 양 항-인간 IgG4 항체(각 2000배 희석, 50㎕/웰, The Binding Site사제)를 가하고, 실온하에서 1시간 인큐베이션했다. 1％ FCS가 들어간 PBS로 3회 세정 후, 기질 완충액(TMB, 100㎕/웰; DAK0사제)을 각 웰에 가하고, 실온하에서 20분간 인큐베이션했다. 그 다음에 0.5M 황산(1OO㎕/웰)을 가하여 반응을 중지시켰다. 파장 450㎚(참조파장 570㎚)에서의 흡광도를 마이크로플레이트 판독기(1420 ARVO 멀티라벨카운터; WALLAC사제)로 측정하고, 각 클론의 서브클래스를 결정했다. 어느 서브클래스에도 양성반응이 없었던 클론에 대해서는, IgG가 아니기 때문에 선택에서 제외했다.
결과 중 최종적으로 선택한 클론만의 결과를 표 1에 나타낸다.
선발한 항-HLA-DR 모노클로날 항체의 성질
서브클래스 동종이계 림프구 혼합에 의한 면역반응에 대한 억제 활성 L929에 대한 반응 L929/HLA-DR에 대한 반응
인간 IgG poly - - -
HD3 IgG1 ++ - +
HD4 IgG1 ++ - +
HD6 IgG1 +++ - +
HD7 IgG3 + - +
HD8 IgG2 + - +
HD9 IgG2 + - +
실시예 6 정상 인간 단핵구 및 정상 인간 수상세포의 취득방법
정상 인간 말초혈 유래 단핵구를 Ficoll(Ficoll-Paque PLUS; Amersham Phamacia Biotcch사제)을 이용해서 통상의 방법에 따라 조제했다. 항응고제로서 시트르산나트륨액을 포함한 채혈 백(데루모사제)에 채취한 정상 인간 혈액을 원심분리(600G, 실온, 5분)하고, 세포분획과 혈장을 분리했다. 세포분획을 PBS로 희석해서 Ficoll에 중층하고, 비중 원심분리(400G, 실온, 30분간)에 의해 단핵세포를 분리했다. 중간층을 단핵구로서 추출해서 PBS로 2회 세정한 뒤, 다시 PBS로 희석해서 100G로 1O분간 원심분리하여 상청 중에 잔류한 혈소판을 제거했다. 이상의 방법으로 정상 인간 말초혈 유래 단핵구(PBMC)를 취득했다.
다음에 취득한 PBMC를 자기 비드 부착 CD14 항체(밀테니바이오테크(MB)사제)로 30분간 4℃에서 반응시키고, MACS분리 컬럼(MB사제)을 통해서 CD14 양성 세포의 양성 선별(positive selection)을 행했다. MACS분리 컬럼의 사용방법은 설명서에서 배워 행했다. 얻어진 CD14 양성 세포를 GM-CSF(최종농도 50ng/mL; 기린 비루사 의약탐색연구소에서 조제) 및 인터류킨 4(최종농도 200ng/mL; 젠자임사제)를 포함하는 10％ FCS함유 RPMI 배지에서 5일 내지 8일 배양했다. 또한 그 후, 리포폴리사카라이드(LPS, 최종농도 40ng/mL; 데이프코사제)를 첨가해서 하룻밤 배양하고, 성숙 수상세포(성숙 DC)로서 사용했다.
실시예 7 동종이계 림프구 혼합에 의한 면역반응에 대한 억제활성
주요조직 적합 항원(MHC)의 다른 동종이계의 이식에 있어서는, T세포가 비자기(조직 부적합)의 MHC분자 복합체(알로항원)를 인식함으로써 활성화하여 거부반응을 야기한다. 인간의 MHC는 HLA(인간 백혈구 항원)라 불리고, HLA-A, B, C가 속하는 클래스 I 항원과, HLA-DP, DQ, DR이 속하는 클래스 Ⅱ 항원이 있고, 또한 각각의 분자가 다형성을 가지기 때문에, 인간의 HLA의 조합은 수천가지가 가능해지고, 타인 사이에서는 조직 부적합이 될 가능성이 지극히 높아져 있다. 동종이계 림프구 혼합배양은, 조직 적합 항원의 다른(이하 편의상 도너 A, 도너 B라고 한다) 림프구를 혼합배양함으로써 알로항원에 반응하는 T세포의 증식을 시험관내에서 조사하는 시험이다.
그래서 실시예 4 내지 5로부터 선택된 하이브리도마의 배양 상청을 이용해서 동종이계 림프구 혼합에 의한 면역반응에 대한 억제활성을 측정했다. 실험예 6 기재의 방법으로 정상 인간 말초혈 단핵구를 취득했다. 도너 A 단핵구는 마이토마이신C를 포함하는 RPMI1640 배지(25㎍/mL, 37℃, 30분)와 반응시켜서 세포증식을 제압하고, 반응 후 3회 이상 RPMI1640 배지로 세정하고, 1×106/mL가 되도록 RPMI1640 배지에 현탁했다. 도너 B 단핵구는 1×105개/웰이 되도록 96웰 플레이트에 분주하고, 원심분리해서 배지를 제거한 후, 배양 상청을 100㎕/웰로 첨가하고, 4℃ 하에서 30분 방치했다.
다음에 도너 A 단핵구를 100㎕/웰로 도너 B와 배양 상청이 들어간 96웰 플레이트에 분주하고, 37℃, 4일간, 5％ CO2 존재하에서 배양한 후, 3H 티미딘(Amersham Phamacia Biotech사제)을 1.0μCi/웰이 되도록 첨가하고, 다시 37℃, 16 내지 20시간, 5％ CO2 존재하에서 배양했다. 마이크로 96 수확기(Micro 96 Harvester; SKATRON사제)를 이용해서 세포에 혼입된 3H 티미딘을 유리 필터매트(Printed Filtermat; Wallac사제)에 회수하고, 건조 후 섬광계수액(Betap;Scint; Wallac사제)에 침지시키고, 패키징 후, β선량을 액체 섬광계수기(1205BETAPLATE; Wallac사제)로 활성측정했다.
그 결과, 선발한 항-인간 HLA-DR 항체의 성질을 표 1에 나타낸다. 그것들 중, HD8, HD10, HD4 및 HD6은, 2001년 1O월 11일자로 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁 센터(일본 이바라끼껭 쯔꾸바시 히가시 1-쪼메 1반지 1 주오 다이6)에 국제기탁했다. 수탁번호는, HD8은 FERM BP-7773, HD10은 FERM BP-7774, HD4는 FERM BP-7771, HD6은 FERM BP-7772이다.
실시예 8 각 항체의 조제
실시예 4 내지 5로부터 얻어진 하이브리도마의 배양 상청으로부터의 인간 항-HLA-DR 모노클로날 항체의 정제는 이하의 방법으로 행했다. 인간 항-HLA-DR 모노클로날 항체를 포함하는 배양 상청을 rmp Protein A(아머샴 파머시아 바이오테크사제) 및 0.8×40㎝ 컬럼(바이오래드사제)을 이용하고, 흡착 완충액으로서 PBS, 용출완충액으로서 0.02M 글리신 완충액(pH3)을 이용해서 친화도 정제했다. 용출분획은 1M Tris(pH9.0)를 첨가해서 pH7.2 부근으로 조정했다. 조제된 항체용액은, 투석막(10000컷트, Spectrum Laboratories사제)을 이용해서 PBS로 치환하고, 공경 0.22㎛의 막 필터 MILLEX-GV(밀리포어사제)로 여과멸균하고, 정제 인간 항-HLA-DR 모노클로날 항체를 얻었다. 정제항체의 농도는 280㎚의 흡광도를 측정하고, 1mg/mL를 1.4 OD로서 산출했다.
인간 항-HLA-DR 모노클로날 항체를 포함하는 배양 상청의 조제는 이하의 방법으로 했다. 우선 인간 항-HLA-DR 모노클로날 항체 생산 하이브리도마를 10ng/㎖ IL-6, 1O％ 소 태아 혈청(FCS; SIGMA사제) 함유 eRDF 배지(극동제약사제)에 순화시켰다. 다음에 그의 일부를 항체 정제를 목적으로 하여, 소 인슐린(5㎍/mL, 기브코·비알엘사제), 인간 트랜스페린(5㎍/mL, 기브코·비알엘사제), 에탄올 아민 (0.01mM, 시그마사제), 아셀렌산나트륨(2.5×10-5mM, 시그마사제), 1％ 저 IgG FCS(HyClone사제) 함유 eRDF 배지(극동제약사제)에 순화시켰다. 이 순화된 하이브리도마를 동결보존했다. 플라스크에서 배양하여 하이브리도마의 생세포율이 90％가된 시점에서 배양 상청을 회수했다. 회수한 상청은, 10㎛과 0.2㎛의 필터(게르만 사이언스사제)에 제공하여 하이브리도마 등의 잡배물을 제거했다.
실시예 9 정제 인간 항-HLA-DR 모노클로날 항체에 의한 동종계 림프구 혼합에 의한 면역반응에 대한 억제활성
동종이계 림프구 혼합배양은, 조직 적합 항원의 다른(이하 편의상 도너 A, 도너 B라고 한다) 림프구를 혼합배양함으로써, 알로항원에 반응하는 T세포의 증식을 시험관내에서 조사하는 시험이지만, 또한, 도너 A의 말초혈로부터 시험관내에서 유도한 단구 유래의 성숙 수상세포(DC)와 도너 B의 말초혈로부터 분리한 T세포만을 혼합배양함으로써, 대식세포 등에 의한 항체 의존성 세포상해활성(ADCC)을 제외한 조건하에서 같은 알로항원에 대한 T세포의 반응성을 조사할 수 있다. 그래서 항-HLA-DR 모노클로날 항체의 존재하에서 동종이계의 DC와 T세포를 이용한 혼합배양을 행하고, T세포의 알로항원반응성에 대한 항-HLA-DR 모노클로날 항체의 작용을 조사했다. 구체적으로는 환저 96웰 플레이트(Falon사제)에 도너 A의 성숙 DC를 2×105개/mL가 되도록 10％ FCS를 포함하는 RPMI1640 배지(RPMI-10％ FCS)에 부유시켰다. 항-HLA-DR 모노클로날 항체, 음성 대조군으로서 인간 폴리클로날 IgG(hIgG) 및 양성 대조군으로서 마우스 항-HLA-DR 모노클로날 항체 L243(ATCC HB-55)은, 200, 40, 8㎍/mL가 되도록 RPMI-10％ FCS로 희석했다. 또한, 도너 B의 말초혈로부터 분리한 순도 99％ 이상의 T세포를 1×1O6개/mL가 되도록 RPMI-1O％ FCS에 부유시켰다. 최초에 도너 A 유래의 성숙 DC와 항-HLA-DR 모노클로날 항체를 각 50㎕씩 96웰 플레이트에서 혼합하고, 4℃로 30분 방치했다. 다음에 도너 B 유래의 T세포 100㎕를 혼합하고, 37℃, 5일간, 5％ CO2 존재하에서 배양한 후, 3H 티미딘(Amersham Pharmacia Biotech사제)을 1.0μCi/웰이 되도록 첨가하고, 다시 37℃, 16 내지 20시간, 5％ CO2 존재하에서 배양했다. 마이크로 96 수확기(SKATRON사제)를 이용해서 세포에 혼입 3H 티미딘을 유리 필터매트(Printed Filtermat; Wallac사제)에 회수하고, 건조 후 섬광계수액(Betap;Scint; Wallac사제)에 침지시키고, 패키징 후, β선량을 액체 섬광계수기(1205BETAPLATE; Wallac사제)로 활성측정했다.
그 결과를 도 1에 나타낸다. HD4, HD6, HD8, HD10은 hIgG군과 비교해서 용량 의존적인 면역억제활성을 나타냈지만, HD8, HD4 및 HD10은 L243과 비교해서 약하고, HD6은 양성 대조군 항체인 L243과 동등 또는 그 이상의 억제활성을 나타냈다.
이상으로부터 HD8, HD4 및 HD10은 면역억제활성이 약한 항체로서, 또 HD6은 면역억제제로서의 가능성이 시사되었다.
실시예 10 HLA-DR 발현 세포에 대한 각 모노클로날 항체의 반응시험
실시예 1에서 제조한 HLA-DR 발현 L929세포에 대해, 실시예 3에서 취득한 정제 모노클로날 항체의 반응성 검토를 FCM해석으로 행했다. 2×107/mL의 농도로, L929세포 및 HLA-DR 발현 L929세포를, 0.1％ 나트륨 아자이드 및 1％ 소 태아 혈청 함유한 PBS(Staining Medium, 이하 SM)에 부유시키고, 96웰 환저 플레이트에 100㎕/웰로 분주했다. 원심분리(600G, 4℃, 2분) 한 후, 상청을 제거하고, 실시예 3에서 배양한 하이브리도마의 배양 상청(50㎕)을 가해서 교반한 후, 빙온하 30분간 정치하고 나서, 원심분리(600G, 4℃, 2분)해서 상청을 제거했다. 펠렛을 100㎕/웰의 SM으로 2회 세정한 후, 0.0125㎎/mL의 RPE 형광표식 토끼 항-인간 Igκ F(ab')2 항체(EAK0사제) 30㎕를 가하고, 빙온하 30분간 인큐베이션했다. SM으로 2회 세정한 후, SM에 현탁하고 FCM으로 각 세포의 형광강도를 측정했다.
그 결과는 전술의 표 1에 나타낸다. 어느 항체나 HLA-DR 발현 L929세포에만 강한 결합활성을 가지고, L929세포에의 결합활성은 인지되지 않았기 때문에, HLA-DR과 특이적으로 결합하는 항체인 것이 밝혀졌다.
실시예 11 암에 걸린 마우스 모델에 대한 정제 인간 항-HLA-DR 모노클로날 항체의 효과
실시예 8로부터 얻어진 정제 인간 항-HLA-DR 모노클로날 항체의 효과를, 이하에 기재하는 방법에 따라 암에 걸린 마우스 모델을 이용해서 검토했다.
우선 5주령의 C.B-7/ICR-SCID 마우스(일본 구레아(주)사제)를 구입하고, 6주령일 때에 항-아시알로 GM1 항혈청(와코 화학사제)을 10㎕/마우스 개체로 희석해서 정맥내 투여했다. 다음날, 버키트 림프종 세포 Raji(ATCC CCL-86)를 5×106/마우스 개체로 정맥내 투여했다. Raji 이식으로부터 5일 후, 마우스의 꼬리정맥내에 정제 인간 항-HLA-DR 모노클로날 항체를 0.1, 1㎍/마우스 개체의 용량으로 1회 투여했다. 항체의 음성 대조군으로서 동량의 인간 항-HSA 항체를 사용했다. 이식 후의 생존율을 약 3개월 이상 관찰했다.
이상의 실험의 결과를 도 2에 나타낸다. 정제 인간 항-HLA-DR 모노클로날 항체를 0.1㎍/마우스 개체로 투여한 군에서는, 90일 후의 생존수가 1군당 5마리 중, HD8은 3마리, HD1O 및 HD4는 1마리였다(도 2B). 한편, 1.0㎍/마우스 개체로 투여한 군에서는, 생존수가 1군당 5마리 중, HD8은 3마리, HD10은 5마리, HD4는 2마리였다(도 2A). 음성 대조군인 항-HSA 항체 투여군에서는, Raji 이식 후 60일 이내에 모두 사망했다.
항체 투여시의 마우스 체중은 약 20g이기 때문에, 0.1 및 1㎍/마우스 개체는 5 및 50㎍/kg 체중이 되고, HD8은 대단히 저용량으로 항종양 효과를 발휘하는 것이 밝혀졌다. 또한 실시예 9의 결과를 종합하면, HD8은 면역억제활성이 약한 동시에항종양 활성이 강한 항체이며, 부작용이 적은 항암제로서의 가능성이 시사되었다.
실시예 12 모노클로날 항체를 코딩하는 유전자의 조제 및 재조합 항체 발현 벡터의 구축
(1)HD4, HD8 항체 유전자의 cDNA 클로닝과 발현 벡터 제작
하이브리도마 HD4, HD8을 1Ong/mL IL-6(R＆D Systems사제), 10％ 소과 태아 혈청 (Fetal Bovine Serum; SIGMA사제) 함유 eRDF 배지(극동제약사제)에서 배양하고, 원심분리에 의해 세포를 모은 후 TRIZOL(기브코 비알엘사제)을 첨가하고, 취급설명서에 따라 전체 RNA를 추출했다. 항체 cDNA의 가변영역의 클로닝은, 스마트 레이스 cDNA 증폭 키트(SMART RACE cDNA amplification Kit; 클론테크사제)를 이용하고, 첨부의 설명서에 따라 행했다.
5㎍의 전체 RNA를 주형으로 하여 1차 가닥 cDNA를 제작했다.
1)1차 가닥 cDNA의 합성
전체 RNA 5㎍/3㎕
5' CDS 1㎕,
SMART 올리고 1㎕
상기 조성의 반응액을 70℃에서 2분간 인큐베이션한 후,
5×완충액 2㎕
DTT 1㎕
dNTP 혼합물 1㎕
수퍼스크립트(Superscript) Ⅱ 1㎕
를 가해 42℃에서 1.5시간 인큐베이션했다.
또한 100㎕의 트리신(Tricine) 완충액를 가한 후, 72℃에서 7분간 인큐베이션하고, 1차 가닥 cDNA를 취득했다.
2)PCR에 따른 중쇄 유전자, 경쇄 유전자의 증폭 및 재조합 항체 발현 벡터의 구축
cDNA의 증폭에는, 다까라(Takara)사의 Z-Taq를 이용했다.
cDNA 2㎕
10×Z-Taq 완충액 5㎕
dNTP 혼합물 4㎕
Z-Taq 1㎕
프라이머 1
프라이머 2
상기 조성의 반응액을 2차증류수로 최종 용량 50㎕로 해서 PCR에 제공했다.
중쇄의 증폭에는, UMP(SMART RACE cDNA amplification Kit;클론테크사제)와 hh-6프라이머(5'-GGT CCG GGA GAT CAT GAG GGT GTC CTT-3')(서열 5)를 이용하고, 98℃ 1초, 68℃ 30초의 사이클을 30회 반복했다. 또한 이 반응액 1㎕를 주형으로 하고, NUMP(SMART RACE cDNA amplification Kit;클론테크사제)와 hh-3프라이머(5'-GTG CAC GCC GCT GCT CAG GGC GCC TG-3')(서열 6)을 이용하여, 98℃ 1초, 68℃ 30초의 사이클을 20회 반복했다. 이 다음, 증폭한 PCR산물을 PCR 정제 키트(퀴아젠사제)에 의해 정제하고, hh-4(5'-GGT GCC AGG GGG AAG ACC GAT GG-3')(서열 7)을 프라이머로 하여 염기서열을 결정했다. 서열정보를 기초로, HD4 중쇄 특이적 프라이머 tnHD4Sal(5'-ata tgt cga cCC AGC CCT GGG ATT TTC AGG TGT TTT C-3')(서열 8)과, HD8 중쇄 특이적 프라이머 tnHD8Sal(5'-ata tgt cga cTGG CTG ACC AGG GCA GTC ACC AGA G-3')(서열 9)을 합성하고, 이 프라이머를 이용해서 반대방향에서도 서열을 결정했다. 특이적 프라이머와 tnCHNhe(5'-gat ggg ccc ttg gtg cta gct gag gag acg g-3')(서열 10)을 이용해서 PCR를 행하고(98℃ 1초, 60℃ 30초, 72℃ 30초), 중쇄 증폭 cDNA단편을 SalI, NheI으로 분해하고, 동일효소로 분해되어 있는 N5KG1-Val Lark벡터(IDEC Phamaceuticals, N5KG1(US 특허 6001358)의 개변 벡터)에 도입했다. 삽입된 서열이 직접 서열분석에 의해 결정된 것과 동일하다는 것을, 벡터를 주형으로 하여 서열을 결정함으로써 확인했다.
경쇄는 UMP(SMART RACE cDNA amplification Kit;클론테크사제)와 hk-2(5'-GTT GAA GCT CTT TGT GAC GGG CGA GC-3')(서열 11) 프라이머를 사용하고, 98℃ 1초, 68℃ 30초의 사이클을 30회 반복해서 증폭했다. 또한 이 반응액 1㎕를 주형으로 하고, NUMP(SMART RACE cDNA amplification Kit; 클론테크사제)와 hk-6(5'-TGGC GGG AAG ATG AAG ACA GAT GGT G-3')(서열 12)을 이용하여, 98℃ 1초, 68℃ 30초의 사이클을 20회 반복했다. 이 다음, 증폭한 PCR산물을 PCR 정제 키트(퀴아젠사제)에 의해 정제하고, hk-6프라이머(서열 12)를 이용해서 염기서열을 결정했다. 서열정보를 기초로, HD4 경쇄 특이적 프라이머 nHD4Bgl(5'-ata tag atc tGC TGC TCA GTT AGG ACC CAG AGG GAA CC-3')(서열 13)과 HD8 경쇄 특이적 프라이머 tnHD8Bgl(5'-ata tag atc tGC GAG TCA GAC CCA CTC AGG ACA CAG C-3')(서열 14)을 합성하고, 이 프라이머를 이용하여 반대방향에서도 서열을 결정했다. 특이적 프라이머와 tnCkBsi(5'-aag aca gat ggt gca gcc acc gta cgt ttg at-3')(서열 15)을 이용해서 PCR를 행하고(98℃ 1초, 60℃ 30초, 72℃ 30초), 경쇄 증폭 cDNA단편을 Bg1II, BsiWI으로 분해하고, 동일효소로 분해되어 있는 N5KG1-Val Lark벡터에 도입했다. 삽입된 서열이 직접 서열분석에 의해 결정된 것과 동일하다는 것을, 벡터를 주형으로 하여 서열을 결정함으로써 확인했다.
HD4의 중쇄 가변영역, 및 경쇄 가변영역을 코딩하는 DNA 및 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역의 아미노산 서열을 각각 이하에 나타낸다.
<HD4 중쇄 가변영역>(서열 16)
GTCGACCCAGCCCTGGGATTTTCAGGTGTTTTCAGGTGTTTTCATTTGGTGATCAGGACTGAACAGAGAGAACTCACCATGGAGTTTGGGCTGAGGTGGCTTTTCTTGTGGCTATTTTAAAAGGTGTCCAGTGTGAGGTGCAACTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGCAGCTATGCCATGACCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGGTATTAGTGGTGGTGGTGATAGCACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAGAGATCATGGTTCGGGGAGTTATTATCCCTACTGGTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCTAGC
<HD4 중쇄 가변영역> (서열 17)
MEFGLSWLFLVAILKGVQCEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMTWVRQAPGKGLEWVSGISGGGDSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLTLQMNSLRAEDTAVYYCARDHGSGSYYPYWFDYWGQGTLVTVSSA
<HD4 경쇄 가변영역> (서열 18)
AGATCTGCTGCTCAGTTAGGACCCAGAGGGAACCATGGAAACCCCAGCGCAGCTTCTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAGATACCACCGGAGAACTTGTGTTGACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACC CTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCCGCTACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGTGCATCCAGCAGGGCCACTGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAGCCTGAAGATTTTGCAGTGTATTACTGTCAGCAGTATGGTAGCTCACCGCTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAACGTACG
<HD4 경쇄 가변영역>(서열 19)
METPAQLLFLLLLWLPDTTGELVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSRYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPLTFGGGTKVEIKRT
중쇄 DNA의 번역 개시점은 서열 16의 5'말단에서 79번째의 아데닌(A) 로부터 시작되는 ATG 코돈이며, 항체 가변영역과 불변영역의 경계는 5'말단에서 504번째의 아데닌(A) 와 505번째의 구아닌(G) 사이에 위치한다. 아미노산 서열에 있어서, 중쇄 가변영역은 서열 17의 N 말단에서 142번째의 세린(S) 잔기까지이며, 143번째의 알라닌(A) 이후가 불변영역이다. 정제된 중쇄 단백질의 N 말단 분석에 의해, 중쇄 신호 서열은 서열 17의 N 말단에서 19번째의 시스테인(C)까지이며, 성숙체의 N 말단은 서열 17의 20번째의 글루탐산(E)인 것이 밝혀졌다. 따라서, 서열 17의 아미노산 서열 중 성숙체 부분은 20번째의 글루탐산에서 142번째의 세린까지의 부분이다.
경쇄 DNA의 번역 개시점은, 서열 18의 5'말단에서 35번째의 A로부터 시작되는 ATG 코돈이며, 가변영역은 5'말단에서 418번째의 아데닌(A) 까지이다. 아미노산 서열에 있어서, 가변영역은 서열 19의 N 말단에서 128번째의 리신(K)까지이다. 정제된 경쇄 단백질의 N 말단 분석에 의해, 경쇄 신호 서열은 서열 19의 N 말단에서 20번째의 글리신(G)까지이며, 성숙체의 N 말단은 서열 19의 21번째의 글루탐산(E)인 것이 밝혀졌다. 따라서, 서열 20의 아미노산 서열 중 성숙체 부분은 21번째의 글루탐산에서 128번째의 리신까지의 부분이다.
HD8 중쇄 가변영역, 및 경쇄 가변영역을 코딩하는 DNA 및 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역의 아미노산 서열을 각각 이하에 나타낸다.
<HD8 중쇄 가변영역>(서열 20)
GTCGACTGGCTGACCAGGGCAGTCACCAGAGCTCCAGACAATGTCTGTCTCCTTCCTCATCTTCCTGCCCGTGCTGGGCCTCCCATGGGGTGTCCTGTCACAGGTTCAGCTGCAGCACTCAGGTCCAGGACTGGTGAAGCCCTCGCAGACCCTCTCACTCACCTGTGCCATCTCCGGGGACAGTGTCTCTAGCAACAGTGCTTCTTGGAACTGGATCAGGCAGTCCCCATCGAGGGGCCTTGAGTGGCTGGGAAGGACATACTACAGGTCCAAGTGGTATAATGATTATGCAGTATCTGTGAAAAGTCGAATAGTCATCAACCCAGACACATCCAAGAACCAGTTCTCCCTGCAGCTGAACTCTGTGACTCCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGAAAATTTCTATGGTTCGGAGACTTGTCATAAGAAGTATTACTGCTACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGCTAGC
<HD8 중쇄 가변영역>(서열 21)
MSVSFLIFLPVLGLPWGVLSQVQLQHSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSNSASWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYNDYAVSVKSRIVINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCARENFYGSETCHKKYYCYGMDVWGQGTTVTVSSAS<HD8 경쇄 가변영역>(서열 22)
AGATCTGGGAGTCAGACCCACTCAGGACACAGCATGGACATGAGGGTCCCCGCTCAGCTGCTGGGGCTTCTGCTGCTCTGGCTCCCAGGTGCCAGATGTGCCATCCAGTTGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGGGCATTAGCAGTGCTTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCTCCTAAACTCCTGATCTATGATGCCTCCAGTTTGGAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGCAACTTATTACTGTCAACAGTTTAATAGTTTCCCGCTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAACGTACG
<HD8 경쇄 가변영역>(서열 23)
MDMRVPAQLLGLLLLWLPGARCAIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISSALAWYQQKPGKAPKLLIYDASSLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQFNSFPLTFGGGTKVEIKRTV
중쇄 DMA의 번역 개시점은 서열 20의 5'말단에서 41번째의 아데닌(A)로부터 시작되는 ATG 코돈이며, 항체 가변영역과 불변영역의 경계는 5'말단에서 496번째의 아데닌(A) 와 497번째의 구아닌(G) 사이에 위치한다. 아미노산 서열에 있어서, 중쇄 가변영역은 서열 21의 N 말단에서 152번째의 세린(S) 잔기까지이며, 153번째의 알라닌(A) 이후가 불변영역이다. 정제된 중쇄 단백질의 N 말단 분석에 의해, 중쇄 신호 서열은 서열 21의 N 말단에서 20번째의 세린(S)까지이며, 성숙체의 N 말단은 서열 21의 21번째의 글루타민(Q)인 것이 밝혀졌다. 따라서, 서열 21의 아미노산 서열 중 성숙체 부분은 21번째의 글루탐산으로부터 152번째의 세린까지의 부분이다.
경쇄 DNA의 번역 개시점은, 서열 22의 5'말단에서 34번째의 A로부터 시작되는 ATG 코돈이며, 가변영역은 5'말단에서 420번째의 아데닌(A) 까지이다. 아미노산 서열에 있어서, 가변영역은 서열 23의 N 말단에서 129번째의 리신(K)까지이다. 정제된 경쇄 단백질의 N 말단 분석에 의해, 경쇄 신호 서열은 서열 23의 N 말단에서 22번째의 시스테인(C)까지이며, 성숙체의 N 말단은 서열 23의 23번째의 아데닌(A) 인 것이 밝혀졌다. 따라서, 서열 23의 아미노산 서열 중 성숙체 부분은 23번째의 아데닌로부터 129번째의 리신까지의 부분이다.
실시예 13 서브클래스 재조합형 벡터의 제조
HD4 및 HD8에 대해서는, 각 항체의 가변영역을 이하의 각종 벡터에 넣었다. IgG1타입에는 N5KG1-Val Lark벡터, IgG4타입에는 N5KG4 Lark(모두 IDEC Pharmaceutialss제로, US 특허 6001358에 기재되어 있는 N5KG1의 개변 벡터이다. N5KG1-Val Lark에 대해서는 N5KG1과 같이 IgG1을 보유한 채로의 개변, N5KG4 Lark에 대해서는 IgG4타입으로 재조합한 것이다.), IgG2타입에는 N5KG1-Val Lark의 중쇄 불변 서열부분을 IgG2타입으로 재조합한 벡터(N5KG2)를 이용하여, 실시예 12의 방법과 같이 벡터에 HD4 및 HD8의 가변영역을 넣었다. 새롭게 IgG1타입 또는 IgG2타입의 벡터에 갖추어져 있는 중쇄 불변부분의 EU 넘버링 시스템에 있어서의 331번째의 프롤린(P)을 코딩하는 서열 CCC를 세린(S)을 코딩하는 TCC로 변이화시켜(Mi-Hua Tao, et al. 1993. J. Exp. Med) 벡터를 제조(이하, 순서대로 N5KG1Ser, N5KG2Ser이라고 기록한다)하고, 실시예 12의 방법과 같이 벡터에 HD4 및 HD8의 가변영역을 넣었다. 이하에 설명하는 도 3 및 표 3 중, 예를 들면 서브클래스를 IgG1의 HD4 항체는 HD4IgG1 또는 HD4G1이라고 기록하고, 다시 중쇄 불변부분의 EU 넘버링 시스템에 있어서의 331번째의 프롤린(P)을 코딩하는 서열 CCC를 세린(S)을 코딩하는 TCC로 변이화시킨 유전자의 발현항체는 HD4IgG1Ser 또는 HD4G1Ser라고 기록한다.
재조합형 벡터 및 생산되는 재조합 항체의 명칭 (재조합 항체와 그 세포 상해성 활성)
항체 벡터 명칭 서브클래스 재조합 항체의 명칭 ADCC 활성 CDC 활성
HD4 N5KG1-Val Lark IgG1 HD4G1 + +
HD4 N5KG2Ser IgG2Ser HD4G2Ser - -
HD4 N5KG4 Lark IgG4 HD4G4 - -
HD8 N5KG1-Val Lark IgG1 HD8G1 + +
HD8 N5KG1Ser IgG1Ser HD8G1Ser + -
HD8 N5KG2 IgG2 HD8G2 - +
HD8 N5KG2Ser IgG2Ser HD8G2Ser - -
HD8 N5KG4 Lark IgG4 HD8G4 - -
실시예 14 재조합형 항체의 제작
실시예 12 및 13에서 구축한 재조합형 항체 발현 벡터를 숙주세포에 도입하고, 재조합형 항체 발현세포를 제작했다. 발현을 위한 숙주세포에는, 예를 들면 CHO세포의 dhfr 결손주(ATCC CRL-9096), CH0-Ras(Katakura Y, et al., Cytotechnology, 31:103-109, 1999), HEK293T(ATCC CRL-11268) 등을 이용할 수 있다.
숙주세포에의 벡터의 도입은 전기천공법이나 리포펙션법 등에 의해 실시했다. 전기천공법은 항체 발현 벡터 약 2㎍을 제한효소로 선형화하고, 바이오-래드(Bio-Rad) 전기천공기를 이용해서 350V, 500μF의 조건으로, 4×106개의 CHO세포에 유전자를 도입하고, 96웰 배양 플레이트에 접종했다. 리포펙션은, LipofectAMINE Plus(기브코·비알엘사제)를 이용해서 매뉴얼에 따라 실시했다. 벡터의 도입처리 후, 발현 벡터의 선택 마커에 대응한 약제를 첨가해서 배양을 계속했다. 콜로니를 확인한 후, 실시예 4에 나타낸 방법에 의해 항체 발현주를 선별했다. 선별한 세포로부터의 항체 정제는 실시예 8에 따라 행했다.
실시예 15 세포 상해성 활성의 검토
항체를 통한 세포 상해성 활성은, NK세포 또는 호중구 등의 킬러 활성을 가지는 세포와 항체의 존재하에서 표적 세포에의 상해활성(항체 의존성 세포성 세포상해 활성(Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity), 이하 ADCC), 및 보체와 항체의 존재하에서 표적 세포에의 상해활성(보체 의존성 세포 상해활성(Complement-Dependent Cytotoxicity), 이하 CDC)의 측정을 실시했다. 항체는 실시예 8에서 제조한 하이브리도마 유래 HD4 및 HD8, 실시예 14에서 제조한 각 CHO세포 유래의 재조합 항체를 사용했다. 이 때, 대조군으로서 hIgG를 이용했다.
방법은 간단하게는, 표적 세포에 방사성 크롬(Cr51)을 세포질 내에 넣고, 세포사에 의해 배양액 중에 유리되는 Cr51양을 γ선량으로 측정했다.
구체적으로는 표적 세포로서 버키트 림프종 세포주 Raji(ATCC CCL-86) 106개를 15㎕의 소 태아 혈청(FCS)에 현탁하고, 50㎕(37MBq/mL)의 Cr51 표식된 크롬산나트륨(퍼킨엘머사제, 이하 Cr51이라고 기록한다)을 첨가하고, 1시간 37℃에서 배양했다. 다음에 배지를 10mL 첨가하고, 원심분리해서 배지를 버리는 것을 3회 반복함으로써 세포내에 혼입되지 않은 Cr51을 제거했다.
ADCC 분석은 Cr51 표식한 표적 세포 2000개에 대해서, 실시예 6 기재의 방법으로 취득한 건강한 보통사람 말초혈 단핵구 200000개를, 환저 96웰 플레이트(Falcon사제) 중에서 전체 용량 200㎕로, 각 항체농도와 함께 37도, 5％ CO2 존재하에서 4시간 배양했다.
CDC 분석은 Cr51 표식한 표적 세포 2000개에 대해서, 최종농도 5％의 인간 혈청 유래 보체(SIGMA사제)를, 환저 96웰 플레이트 중에서 전체 용량 200㎕로, 각 항체농도와 함께 37도, 5％ C02 존재하에서 2시간 배양했다.
ADCC·CDC 분석 모두, 배양 후 플레이트를 원심분리해서 세포를 침전시킨 후, 상청 50㎕를 분말 섬광계수체 함유의 96웰 플레이트(LumaplateTM-96; 패커드사제)에 옮기고, 55℃, 1.5시간으로 건조시켰다. 건조를 확인 후, 전용 커버(TopSealTM-A, 96-well Microplates; 패커드사제)로 플레이트를 덮고, 섬광계수기(탑 카운트; 패커드사제)로 γ선량을 측정했다.
그 결과를 도3, 표 3에 나타낸다. CDC활성에 대해서는 HD8IgG1Ser, HD8IgG2Ser, HD8IgG4, HD4G2Ser, HD4G4는 활성이 없고, HD8IgG1, HD8IgG2, HD4G1에서는 활성을 가지고 있는 것을 확인했다. 또 ADCC활성은, HD8IgG1, HD8IgG1Ser, HD4G1만 활성을 가지고 있는 것을 확인했다.
실시예 16 암에 걸린 마우스 모델에 대한 재조합형 항체의 효과
실시예 11과 동일한 모델을 사용하고, HD8 재조합형 항체의 암에 걸린 마우스 모델을 이용한 약리작용을 검토했다.
우선 5주령의 C.B-17/ICR-SCID 마우스(일본 크레아(주)사제)를 구입하고, 6주령일 때에 항-아시알로 GM1 항혈청(와코 화학사제)을 10㎕/마우스 개체로 희석해서 정맥내 투여했다. 다음날, 버키트 림프종 세포 Raji(ATCC No. CCL-86)를 5×106/마우스 개체로 정맥내 투여했다. Raji 이식으로부터 3일 후, 마우스의 꼬리정맥내에 각 항체를 0.1 또는 1㎍/마우스 개체의 용량으로 1회 투여했다. 이식 후의 생존수를 관찰했다.
실시예 14에서 제조한 HD8G1S6r 및 HD8G2Ser에 대해서는 0.1, 1㎍/마우스 개체의 용량으로 1회 투여했다. 항체의 음성 대조군으로서 실시예 9에서 음성 대조군으로서 사용한 hIgG항체를 1㎍/마리의 용량으로 투여한 군을, 양성 대조군으로서 HD8G1을 1㎍/마우스 개체의 용량으로 투여한 군을 준비했다.
이상의 실험의 결과를 도 4에 나타낸다. 음성 대조군인 hIgG 투여군에서는 Raji 이식 후 16일 이내에 전례 사망했다. 20일 후의 생존수는, 1㎍/마우스 개체에 있어서는 hIgG군 이외 6마리 모두 생존하고(도 4A), 0.1㎍/마우스 개체에 있어서는 HD8G2Ser군에서는 6마리 모두, HD8G1Ser군에서는 2마리 생존하고 있었다(도 4B). 25일 후의 생존수는, 1㎍/마우스 개체에 있어서는 HD8G1Ser군은 2마리, HD8G1은 1마리, HD8G2Ser군은 4마리 생존하고(도 4A), 0.1㎍/마우스 개체에 있어서는 HD8G2Ser군만 1마리 생존하고 있었다(도 4B).
이 결과, HD8 재조합 항체인 HD8G1Ser 및 HD8G2Ser에 있어서도, HD8과 같이 대단히 저용량으로 항종양 효과를 발휘하는 것이 밝혀졌다. HD8G2Ser은 ADCC·CDC양쪽의 활성이 없는데도 불구하고, 동물 모델에 있어서 약효를 나타내는 것을 알 수 있었다.
실시예 17 HD4, HD6 및 HD8의 에피토프 해석
통상의 방법에 따라 웨스턴 해석을 실시함으로써 각 항체의 에피토프 해석을 실시했다. 간단하게는 셀룰로오스 또는 PVDF막은 블록에이스(Block Ace; 유끼지루시사제) 등으로 블록킹 후, 각 항체를 1차 항체로서 1㎍/mL의 농도로, ２차 항체로서 HRP 접합 항-토끼 IgG(DAK0사제)를 이용해서 0.5㎍/mL의 농도로 반응시켜, HRP표식 항-인간 항체(예:DAK0사제)와 반응시켜, 화학발광 시약(예:ECL 웨스턴 블롯팅 검출시약; 아머샴바이오사이언스사)을 이용하여, 화학발광 검출장치(예:LAS-1000; 후지필름사제)로 화학발광을 검출했다.
(1) HLA-DR을 발현하고 있는 림프종 세포주 SKW6.4(ATCC TIB-215)로부터 막 분획을 추출하고, 항-HLA-DR 항체(K28N, 생산세포명 마우스-마우스 하이브리도마 K28, 수탁번호 FERM BP-4577로 1994년 2월 22일에 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁 센터에 국제기탁되어 있다)의 친화도 컬럼을 이용해서 HLA-DR 단백질을 정제했다. 취득한 단백질을 4/20 구배 겔(제일화학약품제)을 이용해서 비환원 조건으로 비등(95℃, 5분)하고, 겔 1매당 25mA의 정전류로 1.5hr 영동 후, PVDF막에 겔 1매당 150mA의 정전류로 1hr 전사했다. 그 다음에 통상의 방법에 따라 웨스턴 해석을 행한 결과, HD4, HD6, HD8은 모두 약 30kDa의 위치에 있는 HLA-DRβ쇄를 인식하고 있는 것이 밝혀졌다.
(2) 다음에, HLA-DR의 β쇄(DRB1*15011)의 세포외 영역 199 아미노산(서열 147에 나타내는 아미노산 서열 중 제29번째로부터 제227번째의 199 아미노산, 서열 146에는 서열 147에 나타내는 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열을 나타낸다)에 대해서, 13-mer 펩티드를 2개의 아미노산씩 이동시켜 합계 94종의 펩티드(서열 52 내지 145)를 셀룰로오스막 위에 C 말단으로부터 스폿(spot)상으로 합성하고, N 말단을 아세틸화했다(JERINI사, 독일). 이후의 반응은 통상의 방법에 따른 웨스턴 해석(Reineke, U. 외. (2001). "Epitope mapping with synthetic peptides prepared by SPOT synthesis." Antibody Engineering (Springer Lab Manual〕Eds.:Kontermann/Dubel, 433-459. 등 참조)을 바탕으로 실시했다. 해석은 루미이미저(LumiImager, 상표명; Boehringer-Mannheim사)을 사용하고, 각 스폿의 발색강도를 수치화했다.
그 결과를 도 5에 나타낸다. HD4(도 5A)는 아미노산 61번째 내지 73번째에강한 반응, 17번째 내지 29번째, 63번째 내지 75번째, 65번째 내지 77번째에 약한 반응을 나타내고, 서열 82로 나타내어지는 아미노산 서열을 가지는 펩티드와 가장 강력하게 결합했다. HD6(도 5B)은 61번째 내지 73번째에 강한 반응, 57번째 내지 69번째, 59번째 내지 71번째에 약한 반응을 나타내고, 서열 82로 나타내어지는 아미노산 서열을 가지는 펩티드와 가장 강력하게 결합했다. HD8(도 5C)은 61번째 내지 73번째, 63번째 내지 75번째, 65번째 내지 77번째에 대단히 강한 반응을 나타내고, 서열 82, 83 및 84로 나타내어지는 아미노산 서열을 가지는 펩티드의 하나 이상과 강력하게 결합했다. 한편, HLA-DR의 입체구조(예:Dessen A et. Al., Immunity(1997), 7, 473-481 참조)로부터, 61번째 내지 73번째의 아미노산은 항원을 제시하는 펩티드를 보유하는 부위에서, α 나선구조를 구성하고 있는 것이 판명되었다.
(3)HD4·HD6·HD8에 공통해서 가장 강한 반응을 나타내는 13개의 아미노산(61번째 내지 73번째)에 대해서, β쇄의 다형을 고려하여, 현재 알려져 있는 다형 약 350종류(EMBL-EBI의 IMGT/HLA 데이타베이스 등 참조)의 거의 전부를 포함하는 16종류의 펩티드를 제조했다. 또한 각 아미노산의 알라닌(원래 알라닌의 경우 구아니딘) 치환한 12종류의 펩티드(서열 40 내지 서열 51)에 대해서, 같은 조건으로 웨스턴 블롯팅을 실시했다. 해석은, LAS2000 및 해석 소프트 이미지게이지(ImageGauge; 후지사진필름 주식회사)를 사용하고, 각 스폿의 발색강도를 수치화했다. 도 6에 28종류의 펩티드의 서열과 HD4, HD6 및 HD8과의 반응성을 나타낸다. 각 항체가 양성반응을 나타낸 서열에는 그 강함에 따라 + 내지 ++++, 음성의 경우는 -로 표시했다.
양성, 음성의 판정은 이하의 기준으로 행했다.
백그라운드의 5％ 미만 : -
백그라운드의 5％ 이상 10％ 미만 : +/-
백그라운드의 10％ 이상 20％ 미만 : +
백그라운드의 20％ 이상 30％ 미만 : ++
백그라운드의 30％ 이상 50％ 미만 : +++
백그라운드의 50％ 이상 : ++++
HD8은, 65, 66, 69, 72번째의 아미노산을 알라닌으로 치환한 서열 48 내지 51 이외에는 모두 양성반응을 나타냈다. 65, 66, 69, 72번째의 아미노산은 발견되어 있는 HLA-DRβ쇄의 거의 모든 HLA-DR의 β쇄에 있어서 보존되어 있다(EMBL-EBI의 IMGT/HLA 데이타베이스 등 참조). 또한 서열 24 내지 39에서 주된 서열을 포함하는 대부분의 HLA-DRβ쇄 서열을 망라하고 있기 때문에, HD8은 실질적으로 거의 모든 HLA-DRβ쇄에 결합하는 Pan-HLA-DR 항체일 가능성이 대단히 높다.
또한 HLA-DR 양성 세포주를 이용해서 실시예 10과 동일한 방법으로 HD8의 반응성을 검토한 바, ARH77(ATCC CRL-1621), Daudi(ATCC CCL-213), HS-Sultan(ATCC CRL-1484), IM-9(ATCC CCL-159), MC/CAR(ATCC CRL-8083), Raji(ATCC CCL-86), Ramos(ATCC CRL-1596), RL(ATCC CRL-2261), SKW6,4(ATCC TIB-215), DRB1*15011/DRA*0101을 강제 발현시킨 L세포(L세포, ATCC CCL-1), 인간 건강한 보통 일본인의 말초혈 단핵구 5검체와 반응하는 것도 확인되어 있고, 반응하지 않는 HLA-DR을 발현하고 있는 세포에는 현재시점에서 발견되어 있지 않다. 또한 필리핀 원숭이(crab-eating monkey)에 있어서도 15검체 중 15검체, 침팬지는 1검체 중 1검체에 반응하고 있다. 한편, B세포계 세포주로 HLA-DR을 발현하고 있지 않은 RPMI8226(ATCC CCL-155)에는 반응하지 않았다.
본 발명에 의해, HLA-DR을 발현하고 있는 세포에 기인하는 질환에 대한 예방 또는 치료제, 특히 악성 종양 치료약으로서 거의 모든 HLA-DR 다형을 가지는 환자에게 유용한 분자가 제공되었다.
또한 HLA-DR이 관여하는 면역활성을 억제하는 것에 의한 면역억제약, 특히 류머티즘 치료약으로서 유용한 분자가 제공되었다.
본 명세서에 인용된 모든 간행물은, 그 내용의 전체를 본 명세서에 포함시키는 것으로 한다. 또한, 첨부의 청구의 범위에 기재되는 기술사상 및 발명의 범위를 일탈하지 않는 범위내에서 본 발명의 여러 가지 변형 및 변경이 가능한 것은 당업자에게는 용이하게 이해될 것이다. 본 발명은 이러한 변형 및 변경도 포함하는 것으로 의도하고 있다.
SEQUENCE LISTING <110> KIRIN BEER KABUSHIKI KAISHA <120> Anti HLA-DR antibody <130> PH-1646-PCT <140> <141> <150>JP2001/317054 <151>2001-10-15 <160> 147 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 1 ccggaattcc caccatggcc ataagtggag tccctgtg 38 <210> 2 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 2 aaagcggccg ctcattacag aggccccctg cgttctgc 38 <210> 3 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 3 ccggaattcc tggtcctgtc ctgttctcca gca 33 <210> 4 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 4 aaagcggccg ctcatcagct caggaatcct gttggctg 38 <210> 5 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 5 ggtccgggag atcatgaggg tgtcctt 27 <210> 6 <211> 26 <212> DNA <213> 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Description of Artificial Sequence:peptide <400> 25 Trp Asn Ser Gln Lys Asp Phe Leu Glu Arg Arg Arg Ala 1 5 10 <210> 26 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:peptide <400> 26 Trp Asn Ser Gln Lys Asp Phe Leu Glu Asp Glu Arg Ala 1 5 10 <210> 27 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:peptide <400> 27 Trp Asn Ser Gln Lys Asp Phe Leu Glu Gln Ala Arg Ala 1 5 10 <210> 28 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:peptide <400> 28 Trp Asn Ser Gln Lys Asp Ile Leu Glu Asp Glu Arg Ala 1 5 10 <210> 29 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:peptide <400> 29 Trp Asn Ser Gln Lys Asp Ile Leu Glu Gln Lys Arg Gly 1 5 10 <210> 30 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:peptide <400> 30 Trp Asn Ser Gln Lys Asp Ile Leu Glu Asp Arg Arg Ala 1 5 10 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Artificial Sequence:peptide <400> 87 Ala Arg Ala Ala Val Asp Thr Tyr Cys Arg His Asn Tyr 1 5 10 <210> 88 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:peptide <400> 88 Ala Ala Val Asp Thr Tyr Cys Arg His Asn Tyr Gly Val 1 5 10 <210> 89 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:peptide <400> 89 Val Asp Thr Tyr Cys Arg His Asn Tyr Gly Val Val Glu 1 5 10 <210> 90 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:peptide <400> 90 Thr Tyr Cys Arg His Asn Tyr Gly Val Val Glu Ser Phe 1 5 10 <210> 91 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:peptide <400> 91 Cys Arg His Asn Tyr Gly Val Val Glu Ser Phe Thr Val 1 5 10 <210> 92 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:peptide <400> 92 His Asn Tyr Gly Val Val Glu Ser Phe Thr Val Gln Arg 1 5 10 <210> 93 <211> 13 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Claims (93)

  1. 하이브리도마 HD8(수탁번호 FERM BP-7773)이 생산하는, HLA-DR과 결합하는 항체 또는 그의 기능적 단편.
  2. 하이브리도마 HD8(수탁번호 FERM BP-7773)이 생산하는 항체의 가변영역을 가지는, HLA-DR과 결합하는 항체 또는 그의 기능적 단편.
  3. 제2항에 있어서, 항체의 서브클래스가 IgG인 항체 또는 그의 기능적 단편.
  4. 제3항에 있어서, IgG가 IgG1인 항체 또는 그의 기능적 단편.
  5. 제4항에 있어서, 중쇄 불변영역의 아미노산 서열을 개변한 항체 또는 그의 기능적 단편.
  6. 제5항에 있어서, 중쇄 불변영역의 아미노산 서열의 개변이, EU 넘버링(numbering) 시스템에 있어서의 331번째 아미노산을 Ser으로 치환시킨 것인 항체 또는 그의 기능적 단편.
  7. 제3항에 있어서, IgG가 IgG2인 항체 또는 그의 기능적 단편.
  8. 제7항에 있어서, 중쇄 불변영역의 아미노산 서열을 개변한 항체 또는 그의 기능적 단편.
  9. 제8항에 있어서, 중쇄 불변영역의 아미노산 서열의 개변이 EU 넘버링 시스템에 있어서의 331번째 아미노산을 Ser으로 치환시킨 것인 항체 또는 그의 기능적 단편.
  10. 제3항에 있어서, IgG가 IgG3인 항체 또는 그의 기능적 단편.
  11. 제10항에 있어서, 중쇄 불변영역의 아미노산 서열을 개변한 항체 또는 그의 기능적 단편.
  12. 제3항에 있어서, IgG가 IgG4인 항체 또는 그의 기능적 단편.
  13. 제12항에 있어서, 중쇄 불변영역의 아미노산 서열을 개변한 항체 또는 그의 기능적 단편.
  14. 하이브리도마 HD8(수탁번호 FERM BP-7773).
  15. 하이브리도마 HD4(수탁번호 FERM BP-7771)가 생산하는, HLA-DR과 결합하는 항체 또는 그의 기능적 단편.
  16. 하이브리도마 HD4(수탁번호 FERM BP-7771)가 생산하는 항체의 가변영역을 가지는, HLA-DR과 결합하는 항체 또는 그의 기능적 단편.
  17. 제16항에 있어서, 항체의 서브클래스가 IgG인 항체 또는 그의 기능적 단편.
  18. 제17항에 있어서, IgG가 IgG1인 항체 또는 그의 기능적 단편.
  19. 제18항에 있어서, 중쇄 불변영역의 아미노산 서열을 개변한 항체 또는 그의 기능적 단편.
  20. 제17항에 있어서, IgG가 IgG2인 항체 또는 그의 기능적 단편.
  21. 제20항에 있어서, 중쇄 불변영역의 아미노산 서열을 개변한 항체 또는 그의 기능적 단편.
  22. 제21항에 있어서, 중쇄 불변영역의 아미노산 서열의 개변이 EU 넘버링 시스템에 있어서의 331번째 아미노산을 Ser으로 치환시킨 것인 항체 또는 그의 기능적 단편.
  23. 제17항에 있어서, IgG가 IgG3인 항체 또는 그의 기능적 단편.
  24. 제23항에 있어서, 중쇄 불변영역의 아미노산 서열을 개변한 항체 또는 그의 기능적 단편.
  25. 제17항에 있어서, IgG가 IgG4인 항체 또는 그의 기능적 단편.
  26. 제25항에 있어서, 중쇄 불변영역의 아미노산 서열을 개변한 항체 또는 그의 기능적 단편.
  27. 하이브리도마 HD4(수탁번호 FERM BP-7771).
  28. 하이브리도마 HD10(수탁번호 FERM BP-7774)이 생산하는, HLA-DR과 결합하는 항체 또는 그의 기능적 단편.
  29. 하이브리도마 HD10(수탁번호 FERM BP-7774).
  30. 하이브리도마 HD6(수탁번호 FERM BP-7772)이 생산하는, HLA-DR과 결합하는 항체 또는 그의 기능적 단편.
  31. 하이브리도마 HD6(수탁번호 FERM BP-7772)이 생산하는 항체의 가변영역을 가지는, HLA-DR과 결합하는 항체 또는 그의 기능적 단편.
  32. 제31항에 있어서, 항체의 서브클래스가 IgG인 항체 또는 그의 기능적 단편.
  33. 제32항에 있어서, IgG가 IgG1인 항체 또는 그의 기능적 단편.
  34. 제33항에 있어서, 중쇄 불변영역의 아미노산 서열을 개변한 항체 또는 그의 기능적 단편.
  35. 제32항에 있어서, IgG가 IgG2인 항체 또는 그의 기능적 단편.
  36. 제35항에 있어서, 중쇄 불변영역의 아미노산 서열을 개변한 항체 또는 그의 기능적 단편.
  37. 제32항에 있어서, IgG가 IgG3인 항체 또는 그의 기능적 단편.
  38. 제37항에 있어서, 중쇄 불변영역의 아미노산 서열을 개변한 항체 또는 그의 기능적 단편.
  39. 제32항에 있어서, IgG가 IgG4인 항체 또는 그의 기능적 단편.
  40. 제39항에 있어서, 중쇄 불변영역의 아미노산 서열을 개변한 항체 또는 그의 기능적 단편.
  41. 하이브리도마 HD6(수탁번호 FERM BP-7772).
  42. 서열 21 및 23으로 나타내어지는 아미노산 서열 중 가변영역의 성숙체 부분의 아미노산 서열을 가지는 가변영역을 포함하는, HLA-DR과 결합하는 항체 또는 그의 기능적 단편.
  43. 서열 20 및 22로 나타내어지는 염기서열이 코딩하는 펩티드 중 가변영역의 성숙체 부분을 포함하는 가변영역을 포함하는, HLA-DR과 결합하는 항체 또는 그의 기능적 단편.
  44. 제42항에 있어서, 항체의 서브클래스가 IgG인 항체 또는 그의 기능적 단편.
  45. 제44항에 있어서, IgG가 IgG1인 항체 또는 그의 기능적 단편.
  46. 제45항에 있어서, 중쇄 불변영역의 아미노산 서열을 개변한 항체 또는 그의 기능적 단편.
  47. 제46항에 있어서, 중쇄 불변영역의 아미노산 서열의 개변이 EU 넘버링 시스템에 있어서의 331번째 아미노산을 Ser으로 치환시킨 것인 항체 또는 그의 기능적 단편.
  48. 서브클래스가 IgG1이며 EU 넘버링 시스템에 있어서의 331번째 아미노산이 Ser으로 치환된 항체 HD8인, 항체 HD8G1Ser 또는 그 기능적 단편.
  49. 제44항에 있어서, IgG가 IgG2인 항체 또는 그의 기능적 단편.
  50. 제49항에 있어서, 중쇄 불변영역의 아미노산 서열을 개변한 항체 또는 그의 기능적 단편.
  51. 제50항에 있어서, 중쇄 불변영역의 아미노산 서열의 개변이 EU 넘버링 시스템에 있어서의 331번째 아미노산을 Ser으로 치환시킨 것인 항체 또는 그의 기능적 단편.
  52. 서브클래스가 IgG2이며 EU 넘버링 시스템에 있어서의 331번째 아미노산이 Ser으로 치환된 항체 HD8인, 항체 HD8G2Ser 또는 그 기능적 단편.
  53. 제44항에 있어서, IgG가 IgG3인 항체 또는 그의 기능적 단편.
  54. 제53항에 있어서, 중쇄 불변영역의 아미노산 서열을 개변한 항체 또는 그의 기능적 단편.
  55. 제44항에 있어서, IgG가 IgG4인 항체 또는 그의 기능적 단편.
  56. 제55항에 있어서, 중쇄 불변영역의 아미노산 서열을 개변한 항체 또는 그의 기능적 단편.
  57. 서열 17 및 19로 나타내어지는 아미노산 서열 중 가변영역의 성숙체 부분의 아미노산 서열을 가지는 가변영역을 포함하는, HLA-DR와 결합하는 항체 또는 그의 기능적 단편.
  58. 서열 16 및 18로 나타내어지는 염기서열이 코딩하는 펩티드 중 가변영역의 성숙체 부분을 포함하는 가변영역을 포함하는, HLA-DR과 결합하는 항체 또는 그의 기능적 단편.
  59. 제57항에 있어서, 항체의 서브클래스가 IgG인 항체 또는 그의 기능적 단편.
  60. 제59항에 있어서, IgG가 IgG1인 항체 또는 그의 기능적 단편.
  61. 제60항에 있어서, 중쇄 불변영역의 아미노산 서열을 개변한 항체 또는 그의 기능적 단편.
  62. 제59항에 있어서, IgG가 IgG2인 항체 또는 그의 기능적 단편.
  63. 제62항에 있어서, 중쇄 불변영역의 아미노산 서열을 개변한 항체 또는 그의 기능적 단편.
  64. 제63항에 있어서, 중쇄 불변영역의 아미노산 서열의 개변이 EU 넘버링 시스템에 있어서의 331번째 아미노산을 Ser으로 치환시킨 것인 항체 또는 그의 기능적 단편.
  65. 서브클래스가 IgG2이며 EU 넘버링 시스템에 있어서의 331번째 아미노산이 Ser으로 치환된 항체 HD4인, 항체 HD4G2Ser 또는 그 기능적 단편.
  66. 제59항에 있어서, IgG가 IgG3인 항체 또는 그의 기능적 단편.
  67. 제66항에 있어서, 중쇄 불변영역의 아미노산 서열을 개변한 항체 또는 그의 기능적 단편.
  68. 제59항에 있어서, IgG가 IgG4인 항체 또는 그의 기능적 단편.
  69. 제68항에 있어서, 중쇄 불변영역의 아미노산 서열을 개변한 항체 또는 그의 기능적 단편.
  70. HLA-DR의 β쇄(DRB1*15011)의 세포외 영역 아미노산에 대해서 13-mer 펩티드를 2개의 아미노산씩 이동(shift)시켜 펩티드를 제조하고, 상기 펩티드를 셀룰로오스막 위에 C 말단을 통해 결합시키고 N 말단을 아세틸화하여 생성된 펩티드 중, 서열 82로 나타내어지는 펩티드와 가장 강력하게 결합하는, HLA-DR에 결합하는 항체 또는 그의 기능적 단편.
  71. HLA-DR의 β쇄(DRB1*15011)의 세포외 영역 아미노산에 대해서 13-mer 펩티드를 2개의 아미노산씩 이동시켜 펩티드를 제조하고, 상기 펩티드를 셀룰로오스막 위에 C 말단을 통해 결합시키고 N 말단을 아세틸화하여 생성된 펩티드 중, 서열 82, 83 및 84로 나타내어지는 3종류의 펩티드 모두와 강력하게 결합하는, HLA-DR에 결합하는 항체 또는 그의 기능적 단편.
  72. HLA-DR의 β쇄(DRB1*15011)의 세포외 영역 아미노산에 대해서 13-mer 펩티드를 2개의 아미노산씩 이동시켜 펩티드를 제조하고, 상기 펩티드를 셀룰로오스막 위에 C 말단을 통해 결합시키고 N 말단을 아세틸화하여 생성된, 서열 24 내지 39로 나타내어지는 모든 펩티드와 유의하게 결합하고 또한 서열 40 내지 43으로 나타내어지는 모든 펩티드와 유의하게 결합하는, HLA-DR에 결합하는 항체 또는 그의 기능적 단편.
  73. (a) 6주령의 SCID 마우스에 항-아시알로(anti-asialo) GM1 항혈청을 10㎕/마우스 개체로 정맥내 투여하고, 항-아시알로 GM1 항혈청 투여 다음날에 버키트 림프종 세포 Raji(ATCC CCL-86)을 5×106/마우스 개체로 정맥내 투여하고, Raji 투여 5일 후에 투여량 5㎍/㎏ 체중으로 1회 투여한 경우 마우스의 투여 90일 후의 생존율이, 인간 항-HSA 항체를 동량 투여한 경우의 생존율보다 높다고 하는 성질; 및
    (b) 10％ FCS를 포함하는 RPMI1640 배지를 이용해서 8㎍/mL로 조제한 항체 50㎕와 10％ FCS를 포함하는 RPMI1640 배지를 이용해서 2×105개/mL로 조제한 제1의 인간 도너 유래 성숙 수상세포 부유액 50㎕를 96웰 플레이트의 웰중에서 혼합하여 4℃에서 30분간 방치하고, 이어서 1O％ FCS를 포함하는 RPMI1640 배지를 이용해서 1×106개/mL로 조제한 상기 제1의 인간 도너와 조직 적합 항원이 다른 제2의 인간 도너 유래의 순도 99％ 이상의 T세포 부유액 100㎕를 혼합하고, 37℃, 5％ CO2 존재하에서 5일간 배양하고, 다시 3H 티미딘을 1.0μCi/웰로 첨가하고, 다시 37℃, 5％ CO2 존재하에서 16 내지 20시간 배양한 후, 세포에 혼입된 3H 티미딘을 회수해서 상기 3H 티미딘을 섬광계수기로 측정하고, 3H 티미딘의 세포에의 혼입을 지표로 하여 면역억제활성을 측정한 경우의 면역억제활성이 동농도의 마우스 항-HLA-DR 모노클로날 항체 L243(ATCC HB-55)을 이용한 경우의 면역억제활성과 비교해서 약하다고 하는 성질
    을 가지는, HLA-DR와 결합하는 항체 또는 그의 기능적 단편.
  74. 제73항에 있어서, 항체가 모노클로날 항체인 항체 또는 그의 기능적 단편.
  75. 제73항에 있어서, 항체가 인간 항체인 항체 또는 그의 기능적 단편.
  76. 제73항에 있어서, 마우스-마우스 하이브리도마에 의해 생산되는 항체 또는 그의 기능적 단편.
  77. 10％ FCS를 포함하는 RPMI1640 배지를 이용해서 8㎍/mL로 조제한 항체 50㎕와 1O％ FCS를 포함하는 RPMI1640 배지를 이용해서 2×105개/mL로 조제한 제1의 인간 도너 유래 성숙 수상세포 부유액 50㎕를 96웰 플레이트의 웰중에서 혼합하여 4℃에서 30분간 방치하고, 이어서 10％ FCS를 포함하는 RPMI1640 배지를 이용해서 1×106개/mL로 조제한 상기 제1의 인간 도너와 조직 적합 항원이 다른 제2의 인간 도너 유래의 순도 99％ 이상의 T세포 부유액 100㎕를 혼합하고, 37℃, 5％ CO2 존재하에서 5일간 배양하고, 다시 3H 티미딘을 1.0μCi/웰로 첨가하고, 다시 37℃, 5％ CO2 존재하에서 16 내지 20시간 배양한 후, 세포에 혼입된 3H 티미딘을 회수해서 상기 3H 티미딘을 섬광계수기로 측정하고, 3H 티미딘의 세포에의 혼입을 지표로 하여 면역억제활성을 측정한 경우의 면역억제활성이 동농도의 마우스 항-HLA-DR 모노클로날 항체 L243(ATCC HB-55)을 이용한 경우의 면역억제활성과 비교해서 동등 또는 강하다고 하는 성질을 가지는, HLA-DR과 결합하는 항체 또는 그의 기능적 단편.
  78. 제77항에 있어서, 항체가 모노클로날 항체인 항체 또는 그의 기능적 단편.
  79. 제77항에 있어서, 항체가 인간 항체인 항체 또는 그의 기능적 단편.
  80. 제77항에 있어서, 마우스-마우스 하이브리도마에 의해 생산되는 항체 또는 그의 기능적 단편.
  81. 하이브리도마 HD8(수탁번호 FERM BP-7773), 하이브리도마 HD1O(수탁번호 FERM BP-7774), 하이브리도마 HD4(수탁번호 FERM BP-7771) 및 HD6(수탁번호 FERM BP-7772)을 포함하는 군으로부터 선택된 하이브리도마에 보유되며, 상기 하이브리도마가 생산하는 항체의 가변영역을 포함하는 항체 또는 상기 항체의 기능적 단편을 코딩하는 핵산.
  82. 제81항에 있어서, 서열 17 및 19로 나타내어지는 아미노산 서열 중 가변영역의 성숙체 부분의 아미노산 서열을 가지는 가변영역을 포함하는 항체 또는 상기 항체의 기능적 단편을 코딩하는 핵산.
  83. 제81항에 있어서, 서열 21 및 23으로 나타내어지는 아미노산 서열 중 가변영역의 성숙체 부분의 아미노산 서열을 가지는 가변영역을 포함하는 항체 또는 상기 항체의 기능적 단편을 코딩하는 핵산.
  84. 서브클래스가 IgG1이며 EU 넘버링 시스템에 있어서의 331번째 아미노산이 Ser으로 치환된 항체 HD8인 항체 HD8G1Ser, 서브클래스가 IgG2이며 EU 넘버링 시스템에 있어서의 331번째 아미노산이 Ser으로 치환된 항체 HD8인 항체 HD8G2Ser, 및 서브클래스가 IgG2이며 EU 넘버링 시스템에 있어서의 331번째 아미노산이 Ser으로 치환된 항체 HD4인 항체 HD4G2Ser을 포함하는 군으로부터 선택된 항체 또는 상기 항체의 기능적 단편을 코딩하는 핵산.
  85. 제81항 내지 제84항 중 어느 한 항 기재의 핵산에 의해 코딩되는 단백질.
  86. 제81항 내지 제84항 중 어느 한 항 기재의 핵산을 가지는 발현 벡터.
  87. 제86항 기재의 발현 벡터를 가지는 숙주.
  88. 제87항에 있어서, 대장균, 효모세포, 곤충세포, 포유동물세포 및 식물세포 및 포유동물을 포함하는 군으로부터 선택된 숙주.
  89. 하이브리도마 HD8(수탁번호 FERM BP-7773), 하이브리도마 HD10(수탁번호 FERM BP-7774), 하이브리도마 HD4(수탁번호 FERM BP-7771) 및 HD6(수탁번호 FERM BP-7772)을 포함하는 군으로부터 선택된 하이브리도마로부터 항-HLA-DR 모노클로날 항체를 코딩하는 유전자를 단리하고, 상기 유전자를 가지는 발현 벡터를 구축하고, 상기 발현 벡터를 숙주에 도입해서 상기 모노클로날 항체를 발현시키고, 얻어지는 숙주, 숙주의 배양 상청 또는 숙주의 분비물로부터 항-HLA-DR 모노클로날 항체를 채취하는 것을 포함하는 항-HLA-DR 모노클로날 항체의 제조방법.
  90. 제1항 내지 제26항, 제28항 및 제42항 내지 제76항 중 어느 한 항 기재의 항체 또는 그의 기능적 단편을 유효성분으로서 함유하는 종양의 예방, 치료 또는 진단제.
  91. 제90항에 있어서, 종양이 백혈병(만성 림프성 백혈병, 급성 림프성 백혈병을 포함한다), 림프종(비호지킨 림프종, 호지킨 림프종, T세포계 림프종, B세포계 림프종, 버키트 림프종, 악성 림프종, 미만성 림프종, 여포성 림프종을 포함한다), 골수종(다발성 골수종을 포함한다), 유방암, 대장암, 신장암, 위암, 난소암, 췌장암, 자궁경부암, 자궁내막암, 식도암, 간장암, 두경부 편평 상피암, 피부암, 요로암, 전립선암, 융모암, 인두암, 후두암, 흉막종, 남성배(胚)종, 자궁내막 과형성, 자궁내막증, 배아종, 섬유육종, 카포시 육종(Kaposi's sarcoma), 혈관종, 해면상 혈관종, 혈관아종, 망막아종, 성상 세포종, 신경섬유종, 희돌기 교종, 수아종, 신경아종, 신경아교종, 횡문근육종, 교아종, 골원성 육종, 평활근육종, 갑상육종 및 윌름스 종양(Wilm's tumor)을 포함하는 군으로부터 선택된 1개 이상인 종양의 예방, 치료 또는 진단제.
  92. 제30항 내지 제40항 및 제77항 내지 제80항 중 어느 한 항 기재의 항체 또는 그의 기능적 단편을 유효성분으로서 함유하는 면역억제제.
  93. 제30항 내지 제40항 및 제77항 내지 제81항 중 어느 한 항 기재의 항체 또는 그의 기능적 단편을 유효성분으로서 함유하는, 자기면역질환 또는 알레르기의 예방, 치료 또는 진단제.
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