WO2005056602A1 - アゴニスト活性を有する改変抗体のスクリーニング方法 - Google Patents

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WO2005056602A1
WO2005056602A1 PCT/JP2004/018499 JP2004018499W WO2005056602A1 WO 2005056602 A1 WO2005056602 A1 WO 2005056602A1 JP 2004018499 W JP2004018499 W JP 2004018499W WO 2005056602 A1 WO2005056602 A1 WO 2005056602A1
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antibody
activity
cells
cell
mpl
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PCT/JP2004/018499
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English (en)
French (fr)
Inventor
Kiyotaka Nakano
Junichi Nezu
Takeshi Yoshino
Mikiyoshi Saito
Tetsuro Orita
Original Assignee
Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/74—Inducing cell proliferation

Definitions

  • the present invention relates to a method for screening for a modified antibody having agonist activity.
  • Antibodies have attracted attention as pharmaceuticals because of their high stability in blood and low antigenicity.
  • an agonistic antibody capable of recognizing a protein such as a receptor expressed on the cell surface and generating a specific reaction in a cell is considered to be useful as a pharmaceutical.
  • Several agonist antibodies have already been reported, including agonist antibodies against erythropoietin receptor (see Non-Patent Document 1), agonist antibodies against thrombopoietin receptor and agonist antibodies against CD47 (see Patent Documents 1 and 2). Have been.
  • modified antibodies having undergone some modification such as amino acid sequence substitution
  • modified antibodies having undergone some modification, such as amino acid sequence substitution
  • modified antibodies such as low molecular weight antibodies and humanized'chimerized antibodies are considered to have excellent properties as pharmaceuticals.
  • modified antibodies having agonist activity are considered to be very useful for treatment and diagnosis of diseases, and an efficient screening method for obtaining such antibodies is desired. .
  • Patent Document 1 International Publication No. 02/33072
  • Patent Document 2 WO 02/33073
  • Non-Patent Document 1 Elliott S et al., J. Biol. Chem., 1996, Vol.271 (40), p.24691-24697 Disclosure of the invention
  • an object of the present invention is to provide a method for screening for a modified antibody having agonist activity. More specifically, an object of the present invention is to provide a screening method characterized by measuring agonist activity after modifying an antibody screened using antigen-binding activity as an index.
  • the present inventors have conducted intensive studies in order to solve the above problems. Specifically, we prepared an anti-human Mpl antibody, and constructed a single-chain antibody expression system by genetic engineering techniques for antibodies with high binding activity. Using BaF3-human Mpl, which shows TPO-dependent growth, the TPO-like agonistic activity of full-length anti-human Mpl antibody and low-molecular-weight anti-human Mpl-chain antibody was evaluated. The human Mpl antibody showed no agonist activity, whereas the low molecular weight anti-human Mpl-chain antibody showed the agonist activity.
  • the present inventors have found that there is a difference in agonist activity between before and after modification of an antibody, and even if an antibody does not have agonist activity before modification, it can be obtained by modifying the antibody such as by reducing its molecular weight. Focusing on the fact that the antibody has an agonistic activity, in screening for a modified antibody having an agonistic activity, the antibody having antigen-binding activity is modified, and then the agonist activity is measured. It was found that antibodies that could not be selected can be selected.
  • the agonist activity is measured before modifying the antibody, and the agonist activity is not detected at that time. If the antibody is excluded, the conventional screening method has the agonist activity before the modification. However, it was not possible to find an antibody that would have agonist activity by modification, but before the modification of the antibody, a screening method that does not exclude antibodies using agonist activity as an index was used. In addition, it is possible to find antibodies that are overlooked by conventional methods.
  • the present invention relates to a method for screening agonist antibodies, and more specifically, (1) comprising the following steps, a method for screening agonist antibodies,
  • the modified antibody is a low-molecular-weight antibody, the screening method according to (1),
  • the antibody is an antibody against a protein expressed on a cell membrane
  • the modified antibody is a low-molecular-weight antibody
  • the low-molecular-weight antibody is sc (Fv) 2
  • the antibody is an antibody against a protein expressed on a cell membrane, (7) the production method according to (10), wherein [12] a method for screening an agonistic antibody comprising the following steps, wherein the method does not measure the agonistic activity of the test antibody before the step (a);
  • FIG. 1 is a view showing a process for producing a single-chain antibody sc (Fv) 2.
  • FIG. 2 is a graph showing the results of evaluating the binding activity of VA130 sc (Fv) 2 using an Mpl-expressing CHO cell line. VA130 sc (Fv) 2 purified product was used.
  • FIG. 3 is a graph showing the results of evaluation of the antibody activity of VA130 antibody using BaF3-human Mpl.
  • the present invention provides a method for screening for a modified antibody having agonist activity.
  • the screening method of the present invention is characterized in that after modifying an antibody screened using antigen-binding activity as an index, the agonist activity of the modified antibody is measured, and a modified antibody having agonist activity is selected.
  • the antigen-binding activity of a test antibody is measured, and an antibody having the antigen-binding activity is selected. Then, the selected antibody is modified. Next, the agonist activity of the modified antibody is measured, and a modified antibody having the agonist activity is selected.
  • modification of an antibody means to change the amino acid sequence, molecular weight, three-dimensional structure, etc. of the antibody.
  • Specific examples of antibody modifications include, for example, low molecular weight, chimerization, humanization, modification, substitution of sugar chains, and addition and deletion.
  • the antibody may be modified by a plurality of modifications or a single modification.
  • the modification is to reduce the molecular weight of the antibody.
  • the preference for low molecular weight As an embodiment, it is a diabody or sc (Fv) 2 dani, particularly preferably sc (Fv) 2 dani.
  • the low molecular weight antibody is not particularly limited as long as it includes an antibody fragment in which a part of a full-length antibody (for example, whole IgG or the like) is deleted and has a binding ability to an antigen.
  • the antibody fragment of the present invention is not particularly limited as long as it is a part of a full-length antibody, but preferably contains a heavy chain variable region (VH) or Z and a light chain variable region (VL).
  • VH heavy chain variable region
  • VL light chain variable region
  • the amino acid sequence of VH or VL may have substitution, deletion, addition and / or insertion.
  • VH and / or VL may be partially deleted as long as they have the ability to bind to the antigen.
  • the variable region may be chimerized or humanized.
  • antibody fragment examples include Fab, Fab ', F (ab') 2, and Fv.
  • the low molecular weight antibody examples include Fab, Fab ', F (ab') 2, Fv, scFv (single chain Fv), Diabody, sc (Fv) 2 and the like.
  • it is Diabody or sc (Fv) 2, particularly preferably sc (Fv) 2.
  • Such a low molecular weight antibody can be produced by a method known to those skilled in the art.
  • Diabody is a dimer obtained by linking two fragments (for example, scFv or the like) in which a variable region and a variable region are linked by a linker or the like, and usually has two VLs and two VHs.
  • sc (Fv) 2 is an antibody in which two heavy chain variable regions and two light chain variable regions are linked to each other with a linker or the like to form a single-chain polypeptide (Hudson et al, J Immunol. Methods 1999; 231: 177-189), for example, by combining two sc (Fv) with a linker.
  • the order of the two heavy chain variable regions and the two light chain variable regions to be linked is not particularly limited, and they may be arranged in any order. it can.
  • sc (Fv) 2 having an arrangement of [VH] linker- [VL] linker- [VH] linker- [VL] is preferable.
  • the linker may be any peptide linker that can be introduced by genetic engineering, or a linker disclosed in Synthetic Compound Linker (see, for example, Protein Engineering, 9 (3), 299-305, 1996). Can be used.
  • a preferred linker in the present invention is a peptide linker.
  • the length of the peptide linker is not particularly limited and can be appropriately selected by those skilled in the art according to the purpose. Usually, the length is 1 to 100 amino acids, preferably 5 to 30 amino acids, and particularly preferably 12 to 18 amino acids. Amino acids (eg, 15 amino acids).
  • amino acid sequence of the peptide linker examples include the following sequences.
  • Synthetic chemical linkers are commonly used crosslinking agents for peptide crosslinking, for example, N-hydroxysuccinimide (NHS) disuccinimidyl suberate (DSS), bis (Sulfosuccinimidyl) suberate (BS 3 ), dithiobis (succinimidyl propionate) (DSP), dithiopis (sulfosuccinimidyl propionate) (DTSSP), ethylene glycol Bis (succinimidyl succinate) (EGS), ethylene glycol bis (sulfosuccinimidyl succinate) (sulfo EGS), disuccinimidyl tartrate (DST), disulfosuccinimidyl tartrate (Sulfo DST), bis [2- (succinimidoxycarbo-roxy) ethyl] sulfone (BSOCOES), bis [2- (sulfosuccinimidoxycarbo-roxy)
  • the antibody is treated with an enzyme, for example, papain, pepsin, or the like, to generate an antibody fragment, or a gene encoding these antibody fragments is constructed, and After introduction into an expression vector, expression may be carried out in an appropriate host cell (for example, Co, MS et al, J. Immunol. (1994) 152, 2968-2976; Better, M. and
  • the minibodies of the present invention preferably have a smaller molecular weight than full-length antibodies, but may form multimers such as dimers, trimers and tetramers, and have a higher molecular weight than full-length antibodies. It can be.
  • a chimeric antibody is an antibody produced by combining sequences derived from different animals.
  • the chimeric antibody is composed of the variable regions of the heavy and light chains of a mouse antibody and the constant regions of the heavy and light chains of a human antibody.
  • the production of a chimeric antibody can be performed using a known method. It can be obtained by ligating the DNA encoding the body V region to the DNA encoding the human antibody C region, incorporating the DNA into an expression vector, introducing it into a host, and producing it.
  • a humanized antibody is also referred to as a reshaped human antibody, which is used to determine the complementarity determining region (CDR) of a non-human mammal, for example, a mouse antibody. It has been transplanted into a region, and its general gene recombination technique is also known (see European Patent Application Publication No. EP 125023, WO 96/02576).
  • a DNA sequence designed to ligate to FR is synthesized by a PCR method using as primers several oligonucleotides prepared to have overlapping portions in both CDR and FR terminal regions (W098 / 13388).
  • the framework region of a human antibody to be linked via CDR is selected so that the complementarity-determining region forms a favorable antigen-binding site. If necessary, amino acids in the framework region in the variable region of the antibody may be substituted so that the complementarity determining region of the reshaped human antibody forms an appropriate antigen-binding site (Sato, K. et al., CancerRes. (1993) 53, 851-856).
  • a human antibody is used for the C region of the chimeric antibody and the humanized antibody.
  • C ⁇ 1, C ⁇ 2, C ⁇ 3, and C ⁇ 4 are used for the H chain, and C ⁇ , C ⁇ can be used.
  • the human antibody C region may be modified in order to improve the stability of the antibody or its production.
  • a chimeric antibody comprises a variable region of an antibody derived from a non-human mammal and a constant region derived from a human antibody.
  • a humanized antibody is composed of a complementarity determining region of an antibody derived from a mammal other than human, a framework region and a C region derived from a human antibody.
  • variable region for example, FR
  • amino acids in the variable region can be further substituted with another amino acid.
  • the antibody can be modified and modified by adding another molecule to the antibody.
  • the antibody can be modified by a method known to those skilled in the art.
  • Specific examples of antibody modification include, for example, addition of a polymer such as PEG.
  • test antibody is not particularly limited, and any antibody may be used. Good.
  • test antibody is not limited by its origin and the like, and may be any animal-derived antibody such as a mouse antibody, a human antibody, a rat antibody, a rabbit antibody, and a camel antibody.
  • the test antibody is preferably an unmodified antibody (for example, a full-length antibody), but a modified antibody may be used as the test antibody.
  • a modified antibody may be used as the test antibody.
  • another modification is performed in the course of the screening of the present invention. In this case, the same type of modification may be performed, or a different type of modification may be performed.
  • antibodies having amino acid sequence substitutions such as chimeric antibodies and human antibodies, modified antibodies to which various molecules are bound, antibodies with controlled sugar chain addition, low molecular weight antibodies, etc. It is also possible.
  • a low molecular weight antibody it is preferable to use Diabody or sc (Fv) 2 after modification. Therefore, the test antibody before modification is preferably other than Diabody or sc (Fv) 2!
  • the antigen recognized by the antibody of the present invention is not particularly limited, and any antigen may be recognized.
  • a protein expressed on a cell membrane or in a cell may be mentioned.
  • the protein expressed on the cell membrane or in the cell include a receptor, a cell surface antigen, a major histocompatibility antigen, and the like.
  • Examples of the receptor include hematopoietic factor receptor family, cytokinin receptor family, tyrosine kinase receptor family, serine Z threonine kinase receptor family 1, TNF receptor family, and G protein-coupled receptor.
  • Receptor family GPI-anchored receptor family, tyrosine phosphatase receptor family, adhesion factor family, hormone receptor family, and other receptor families. Numerous documents exist regarding the receptors belonging to these receptor families and their characteristics. Row f shows Cooke BA., King RJB., Van aer Molen HJ. Ed.
  • Specific receptors belonging to the above receptor family include, for example, human or mouse erythropoietin (EPO) receptor, human or mouse granulocyte colony stimulating factor (G-CSF) receptor, human or mouse thrombopoi Etin (TPO) receptor, human or mouse insulin receptor, human or mouse Flt-3 ligand receptor, human or mouse platelet derived growth factor (PDGF) receptor, human or mouse interferon (IFN)-a, j8 receptor Human or mouse leptin receptor, human or mouse growth hormone (GH) receptor, human or mouse interleukin (IL) -10 receptor, human or mouse insulin-like growth factor (IGF) -I receptor, human or mouse Examples include leukemia inhibitory factor (LIF) receptor, human or mouse ciliary neurotrophic factor (CNTF) receptor (hEPOR: Simon, S.
  • EPO erythropoietin
  • G-CSF granulocyte colony stimulating factor
  • TPO thrombopoi Etin
  • human or mouse insulin receptor
  • hlnsR Ullrich, A. et al. (1985) Nature 313, 756-761 .
  • hFlt-3 Small, D. et al. (1994) Proc. Natl Acad. Sci. USA. 91, 459-463 .
  • hPDGFR Gronwald, RGK. Et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85, 3435-3439 .
  • hlFN a / j8 R Uze , G. et al. (1990) Cell 60, 225-234. And Novick, D. et al. (1994) Cell 77, 391-400.).
  • MHC class I antigens HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-E, HLA-F, HLA-G, HLA-H
  • MHC class II antigens HLA-DR, -DQ, -DP
  • the antibody is modified before measuring the binding activity, and then the agonist activity or the binding activity is measured.
  • a modified antibody having ghost activity may be selected.
  • the order of measurement of agonist activity and binding activity is not limited, and only agonist activity may be measured.
  • a screening is performed in which a low-molecular-weight antibody (for example, Diabody or sc (Fv) 2) is used in the modification step using a full-length antibody that has not been reduced in molecular weight as a test antibody.
  • a low-molecular-weight antibody for example, Diabody or sc (Fv) 2
  • Fv sc
  • the agonist activity means that a specific reaction is caused in a cell by the binding of an antibody (for example, a change in some physiological activity by transmitting a signal into a cell or the like).
  • Activity include, for example, proliferation activity, proliferation-inducing activity, survival activity, differentiation activity, differentiation-inducing activity, transcription activity, membrane transport activity, binding activity, proteolytic activity, phosphorylation and dephosphorylation.
  • Activity redox activity, transfer activity, nucleolytic activity, dehydration activity, cell death inducing activity, apoptosis inducing activity, and the like, but are not limited thereto.
  • the measurement of the agonist activity can be performed by a method known to those skilled in the art.
  • Cells exhibiting an agonist-dependent proliferation can also be prepared by a method known to those skilled in the art.
  • the receptor Cells expressing the body may be used.
  • the antigen is a receptor that does not emit a cell proliferation signal
  • a chimeric receptor comprising an intracellular region of a receptor that emits a cell proliferation signal and an extracellular region of a receptor that does not emit a cell proliferation signal is used.
  • Examples of the receptor that emits a cell proliferation signal include, for example, G-CSF receptor, mpl, neu, GM-CSF receptor, EPO receptor, c-kit, FLT-3 and the like.
  • Examples of cells that express the receptor include BaF3, NFS60, FDCP-1, FDCP-2, CTLL-2, DA-1, KT-3 and the like.
  • any quantitative and Z- or qualitative change can be used as long as it can be measured.
  • an index of a cell-free system (cell free assay), an index of a cell system (ceU-based assay), an index of a ligamentous system, and an index of a biological system can be used.
  • an enzymatic reaction or a quantitative and Z- or qualitative change of protein, DNA, or RNA can be used.
  • an enzymatic reaction for example, an amino acid transfer reaction, a sugar transfer reaction, a dehydration reaction, a dehydrogenation reaction, a substrate cleavage reaction and the like can be used.
  • protein phosphorylation, dephosphorylation, dimerization, multimerization, degradation, dissociation, etc., and amplification, cleavage, and extension of DNA and RNA can be used.
  • phosphorylation of a protein existing downstream of the signal transduction pathway can be used as a detection index.
  • Changes in cell phenotype, such as quantitative and Z or qualitative changes in product, changes in proliferation activity, changes in cell number, changes in morphology, changes in characteristics, etc. should be used as indicators of cell lines.
  • the produced substance include secretory proteins, surface antigens, intracellular proteins, mRNA, and the like.
  • Changes in morphology include protrusion formation and changes in the number of Z or protrusions, changes in flatness, changes in elongation Z, changes in aspect ratio, changes in cell size, changes in internal structure, abnormalities in cell populations Z uniformity, changes in cell density, etc. can be used. These morphological changes can be confirmed by observation under a microscope. As the change in properties, scaffold dependency, site force-in response, hormone dependency, drug resistance, cell motility, cell migration activity, pulsatility, changes in intracellular substances, and the like can be used. Cell motility includes cell infiltration activity and cell migration activity.
  • an enzyme activity for example, an enzyme activity, an mRNA amount, an intracellular information transmitting substance amount such as Ca 2+ and cAMP, an intracellular protein amount, and the like can be used.
  • an intracellular information transmitting substance amount such as Ca 2+ and cAMP
  • an intracellular protein amount and the like can be used.
  • a change in cell growth activity can be used as an index.
  • an index of the organization system a change in function according to the organization to be used can be used as a detection index.
  • Indices of the biological system include changes in tissue weight, changes in the blood system, such as changes in the number of blood cells, changes in protein levels, enzyme activities, and changes in electrolyzed mass, and changes in the circulatory system, such as blood pressure and heart rate. Can be used.
  • Methods for measuring these detection indices include, but are not particularly limited to, absorption, luminescence, color development, fluorescence, radioactivity, fluorescence polarization, surface plasmon resonance signal, time-resolved fluorescence, mass, absorption spectrum, light Scattering, fluorescence resonance energy transfer, and the like can be used. These measurement methods are well known to those skilled in the art, and can be appropriately selected according to the purpose. For example, the absorption spectrum can be measured by a commonly used photometer or plate reader, the luminescence can be measured by a luminometer, and the fluorescence can be measured by a fluorimeter. Mass can be measured using a mass spectrometer.
  • the radioactivity is measured using a measuring device such as a gamma force center according to the type of radiation.
  • the degree of fluorescence polarization is BEACON (Takara Shuzo)
  • the surface plasmon resonance signal is BIACORE
  • the time-resolved fluorescence is ARVO, etc.
  • a flow cytometer or the like can be used for the measurement. In these measurement methods, it is sufficient to measure two or more types of detection indices by one measurement method.If it is convenient, two or more types of measurement can be performed simultaneously and Z or consecutively. It is also possible to measure an index. For example, fluorescence and fluorescence resonance energy transfer can be measured simultaneously with a fluorimeter.
  • the binding activity of the antibody can be measured by a method known to those skilled in the art.
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
  • EIA enzyme-linked immunosorbent assay
  • RIA radioimmunoassay
  • fluorescent antibody method can be used to measure the antigen-binding activity of the antibody.
  • an enzyme immunoassay a sample containing an antibody, for example, a culture supernatant of antibody-producing cells or a purified antibody is added to a plate coated with the antigen. After adding a secondary antibody labeled with an enzyme such as phosphatase, incubating and washing the plate, adding an enzyme substrate such as trophinyl phosphate to evaluate the antigen-binding activity by measuring the absorbance Can be.
  • the present invention also provides a method for producing an antibody having agonist activity.
  • Production of the present invention In the method, first, a modified antibody having an agonistic activity is screened as described above. Next, a vector containing the DNA encoding the modified antibody is prepared, and the vector is introduced into a host cell. Then, the host cell is cultured.
  • the vector of the present invention is used to amplify the vector in large amounts with Escherichia coli (eg, JM109, DH5a, HB101, XLlBlue), etc. Ori to be amplified in E. coli, and a transformed gene selected from Escherichia coli (eg, a drug resistance gene that can be distinguished by any drug (ampicillin, tetracycline, kanamycin, kufa ramuecole)) ), There is no particular limitation. Examples of vectors include M13-based vectors, pUC-based vectors, pBR322, pBluescript, pCR-Script, and the like. Further, in the case of subcloning and excision of cDNA, for example, pGEM-T, pDIRECT, pT7 and the like can be mentioned in addition to the above vectors.
  • Escherichia coli eg, JM109, DH5a, HB101, XLlBlue
  • an expression vector is particularly useful.
  • the expression vector when the expression vector is intended for expression in Escherichia coli, in addition to having the above characteristics such that the vector is amplified in Escherichia coli, the host can be used in combination with Escherichia coli such as JM109, DH5a, HB101, and XL1-Blue.
  • Escherichia coli such as JM109, DH5a, HB101, and XL1-Blue.
  • promoters that can be efficiently expressed in E. coli such as the lacZ promoter (Ward et al., Nature (1989) 341, 544-546; FASEB J.
  • Such vectors include pGEX-5X-1 (Pharmacia), “QIAexpress system” (Qiagen), pEGFP, or pET (in this case, the host expresses T7 RNA polymerase in addition to the above vectors).
  • BL21 is preferred).
  • the vector contains a signal sequence for polypeptide secretion!
  • a signal sequence for protein secretion a pelB signal sequence (Lei, SP, et al J. Bacteriol. (1987) 169, 4379) may be used for production in E. coli periplasm.
  • the introduction of the vector into the host cell can be performed using, for example, the Shii-Dani calcium method or the electroporation method.
  • the vectors of the present invention include mammalian expression vectors (for example, pcDNA3 (manufactured by Invitrogen) and pEGF-BOS (Nucleic Acids. Res. 1990, 18 (17), p5322), pEF, pCDM8), insect cell-derived expression vectors (for example,
  • Bac-to-BAC baculovairus expression systemj (manufactured by Gibco BRL), pBacPAK8), plant-derived expression vectors (eg, ⁇ 1, pMH2), animal virus-derived expression vectors (eg, pHSV, pMV, pAdexLcw), retrovirus-derived (E.g., pZIPneo), yeast-derived expression vectors (e.g., "Pichia Expression KitJ (manufactured by Invitrogen), pNVll, SP-Q01), and Bacillus subtilis-derived expression vectors (e.g., pPL608, pKTH50).
  • plant-derived expression vectors eg, ⁇ 1, pMH2
  • animal virus-derived expression vectors eg, pHSV, pMV, pAdexLcw
  • retrovirus-derived E.g., pZIPneo
  • yeast-derived expression vectors e.g., "Pichia Expression Kit
  • promoters required for expression in cells for example, SV40 promoter (Muligan et al., Nature (1979) 277, 108), the MMTV-LTR promoter, the EF1 ⁇ promoter (Mizushima et al., Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322), and the CMV promoter are essential, in order to select for transformation into cells.
  • SV40 promoter Muligan et al., Nature (1979) 277, 108
  • the MMTV-LTR promoter the EF1 ⁇ promoter
  • the CMV promoter are essential, in order to select for transformation into cells.
  • a drug resistance gene that can be distinguished by a drug neomycin, G418, etc.
  • Vectors having such properties include, for example, pMAM, pDR2, pBK-RSV, pBK-CMV, pOPRSV, pOP13, and the like.
  • a DHFR gene that complements the gene in a CHO cell deficient in a nucleic acid synthesis pathway is used.
  • MTX methotrexate
  • a method of using a COS cell having a gene expressing the SV40 T antigen on the chromosome and transforming it with a vector having a replication origin of SV40 is used.
  • a replication origin of SV40 such as pcD
  • those derived from poliovirus, adenovirus, ⁇ papilloma virus (BPV) and the like can also be used.
  • the expression vector is selected as a selection marker for aminoglycoside transferase (APH) gene, thymidine kinase (TK) gene, Escherichia coli xanthinguanine phosphoribosyltransferase (Ecogpt) gene, It can contain the folate reductase (dhfr) gene and the like.
  • the vector is introduced into host cells in the following!
  • the host cell into which the vector is introduced is not particularly limited.
  • E. coli or various animal cells may be used. Is possible.
  • the host cell can be used, for example, as a production system for producing or expressing the antibody of the present invention.
  • Production systems for producing antibodies include in vitro and in vivo production systems. Examples of the in vitro production system include a production system using eukaryotic cells and a production system using prokaryotic cells.
  • animal cells for example, animal cells, plant cells, and fungal cells can be used as hosts.
  • Animal cells include mammalian cells, for example, CH0 (J. Exp. Med. (1995) 108, 945), COS-3T3, myeloma, BHK (baby hamster kidney), HeLa, Vero, amphibian cells, for example, African Megafrog oocytes (Valle, et al., Nature (1981) 291, 338-340) or insect cells such as S19, Sf21, and Tn5 are known.
  • CH0 J. Exp. Med. (1995) 108, 945
  • myeloma myeloma
  • BHK baby hamster kidney
  • HeLa human hamster kidney
  • Vero amphibian cells
  • African Megafrog oocytes valle, et al., Nature (1981) 291, 338-340
  • insect cells such as S19, Sf21, and Tn5 are known
  • CHO cells are particularly preferred for the purpose of large-scale expression.
  • the vector can be introduced into a host cell by, for example, a calcium phosphate method, a DEAE dextran method, a method using Cationic ribosome DOTAP (manufactured by Boehringer Mannheim), an electoral poration method, a Lipofexion method, or the like. .
  • a cell power S protein production system derived from Nicotiana tabacum (Nicotiana tabacum) is known, and it may be callus-cultured.
  • Fungal cells include yeast, for example, Saccharomyces, for example, Saccharomyces cerevisiae, Saccharo; Saccharomyces pombe, filamentous fungi, for example, Aspergillus, for example. Aspergillus nigerj is known.
  • bacterial cells When using prokaryotic cells, there is a production system using bacterial cells.
  • bacterial cells include Escherichia coli (E. coli), for example, JM109, DH5a, HB101, and the like, and Bacillus subtilis.
  • the host cell is then cultured.
  • An antibody can be obtained by culturing cells transformed with the target DNA in vitro.
  • the culturing can be performed according to a known method.
  • DMEM, MEM, RPMI1640, IMDM can be used as a culture solution of animal cells.
  • a serum replacement fluid such as FBS or fetal calf serum (FCS) can be used together, or serum-free culture may be performed.
  • the pH during culture is about 6-8 Preferably it is.
  • Culture is usually performed at about 30-40 ° C for about 15-200 hours, and the medium is replaced, aerated, and agitated as necessary.
  • examples of a system for producing a polypeptide in vivo include a production system using an animal and a production system using a plant.
  • the desired DNA is introduced into these animals or plants, and the polypeptide is produced in the animals or plants and collected.
  • the “host” in the present invention includes these animals and plants.
  • mice When animals are used, there are production systems using mammals and insects. Goats, pigs, sheep, mice, and pests can be used as mammals (Vicki Glaser, SPECTRUM Biotechnology Applications, 1993). When a mammal is used, a transgenic animal can be used.
  • the target DNA is prepared as a fusion gene with a gene encoding a polypeptide uniquely produced in milk, such as goat j8 casein.
  • the DNA fragment containing the fusion gene is injected into a goat embryo, and the embryo is transplanted into a female goat.
  • the desired antibody can be obtained from milk produced by the transgenic goat born from the goat that has received the embryo or its progeny. Hormones may optionally be used in transgenic goats to increase the amount of milk containing antibodies produced by transgenic goats (Ebert, KM et al, Bio / Technology (1994) 12 , 699—702).
  • a silkworm can be used as an insect.
  • the antibody of interest can be obtained from the body fluid of the silkworm by infecting the silkworm with a baculovirus into which DNA encoding the antibody of interest has been inserted (Susumu, M. et al., Nature (1985). ) 315, 592-594) o
  • tobacco when using a plant, for example, tobacco can be used.
  • a DNA encoding the antibody of interest is introduced into a plant expression vector, for example, pMON530, and this vector is introduced into a bacterium such as Agrobacterium tumefaciens.
  • the bacteria are infected with tobacco, for example, Nicotiana tabacum, and the desired antibody can be obtained from the leaves of the tobacco (Julian K.-C. Ma et al "Eur. J. Immunol. (1994) 24, 131-138).
  • the antibody thus obtained is isolated from inside or outside the host cell (such as a medium), It can be purified as a highly pure and homogeneous antibody.
  • the separation and purification of the antibody is not limited at all, provided that the separation and purification methods used in ordinary purification of polypeptides are used. For example, select chromatography column, filter, ultrafiltration, salting out, solvent precipitation, solvent extraction, distillation, immunoprecipitation, SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, isoelectric focusing, dialysis, recrystallization, etc. If combined, antibodies can be separated and purified.
  • chromatography examples include affinity chromatography, ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, gel filtration, reverse-phase chromatography, and adsorption chromatography, and the like (Strategies for Protein Purification and
  • protein modifying enzyme for example, trypsin, chymotrypsin, lysyl endopeptidase, protein kinase, dalcosidase and the like are used.
  • the present invention also provides a modified antibody having an agonist activity obtained by the screening method of the present invention, and a modified antibody produced by the production method of the present invention.
  • the screening method or production method of the present invention is not only used for screening or production of an antibody having agonist activity, but also for screening for antibodies having other activities such as neutralizing activity, cytotoxic activity, binding activity, antagonist activity and enzyme activity. It can also be used for screening or production.
  • Each vector was prepared (20 mu g) was mixed with BaF3 cells (lxl0 7 cells / mL) suspended into PBS, using Karoe, Gene Pulser II a (Bio- manufactured Rad) in Gene Pulser cuvettes A pulse was produced with a capacity of 0.33 kV and 950 ⁇ FD.
  • BaF3 cells transfected by electoral poration were transformed with Ing / mL mouse interleukin 3 (hereinafter, mIL-3, manufactured by Peprotech), 500 g / mL Geneticin (manufactured by Invitrogen), and 10% FBS (manufactured by Invitrogen)
  • mIL-3 mouse interleukin 3
  • FBS 10% FBS
  • a human Mpl-expressing BaF3 cell line (hereinafter, BaF3-human Mpl) was established in addition to the RPMI1640 medium (manufactured by Invitrogen). After the selection, the cells were cultured and maintained using RPMI1640 medium containing Ing / mL rhTPO (R & D) and 10% FBS.
  • a CHO cell line expressing the full-length Mpl gene was established.
  • the DHFR gene expression site of pCHOI was inserted into the Hindlll site of pCXN2 (Niwa et al., Gene 1991; 108: 193-199) to produce an expression vector PCXND3.
  • each Mpl gene amplified by PCR using a Primer containing His-tag sequence was cloned into pCXND3 to construct pCXND3-hMpH "Iis and pCXND3-monkey Mp His .
  • Each vector was prepared (25 mu g) were mixed in suspended CHO- DG44 cells (lxl0 7 cells / mL) into PBS, added to the Gene Pulser cuvette, the Gene Pulser II (Bio- manufactured Rad) 1.5kV using Pulses were generated with a capacity of 25 ⁇ FD.
  • CHO cells transfected by electoral poration were added to a CHO-S-SFMII medium (Invitrogen) containing 500 ⁇ g / mL Geneticin and lxHT (Invitrogen) and selected, and a human Mpl-expressing CHO cell line was selected.
  • CHO-human Mpl and a monkey Mpl-expressing CHO cell line (hereinafter, CHO-monkey Mpl) were established.
  • a gene was prepared by adding a FLAG tag downstream of the extracellular region of human Mpl (Gln26 force Trp491), and inserted into the Pstl-Smal site of pBACSurf-1 Transfer Plasmid (Novagen) to form pBACSurfl- hMp FLAG was prepared. Subsequently, 4 g of pBACSurfl-hMp-to-FLAG was introduced into S19 cells using the Bac-N-Blue Transfection Kit (Invitrogen). After 3 days of culture, the culture supernatant was collected, and the recombinant virus was isolated by plaque assay. After preparing the virus stock, S19 cells were infected and the culture supernatant was collected.
  • a soluble human Mpl protein was purified as follows. After adsorbing the culture supernatant to Q Sepharose Fast Flow (manufactured by Amersham Biosciences), the culture supernatant was eluted using 50 mM Na-Phosphate Buffer, 0.01% (v / v) Tween 20, 500 mM NaCl (pH 7.2). After adsorbing the eluate to FLAG M2-Agarose (manufactured by SIGMA-ALDRICH), elution was carried out using lOOmM Glycine-HC1, 0.01% (v / v) Tween20 (pH 3.5).
  • the human MpHgG Fc fusion protein gene was prepared according to the method of Bennett et al. (Bennett et al., J. Biol. Chem. 1991; 266: 23060-23067).
  • the nucleotide sequence encoding the extracellular region of human Mpl (Gln26 to Trp491) is linked to the nucleotide sequence encoding the Fc region of human IgG- ⁇ 1 (the region downstream from Asp216), and BstEII is used as a fusion linker at the junction.
  • a sequence (amino acid VaKThr) was added.
  • the signal sequence used was 19 amino acids of the signal peptide of the human IgG heavy chain variable region.
  • Each vector was prepared (25 mu g) were mixed in suspended CHO- DG44 cells (lxl0 7 cells / mL) into PBS, added to the Gene Pulser cuvette, the Gene Pulser II (Bio- manufactured Rad) Pulses were obtained at a capacity of 1.5 kV and 25 ⁇ FD.
  • CHO cells transfected by electoral poration were added to a CHO-S-SFMII medium containing 500 g / mL Geneticin, ⁇ , and selected to establish a shMPL-Fc-expressing CHO cell line (CHO-hMpFc). did.
  • a human MpHgG Fc fusion protein was purified as follows. After adsorbing the culture supernatant to Q Sepharose Fast Flow (manufactured by Amersham Biosciences), it was eluted using 50 mM Na-Phosphate Buffer, 0.01% (v / v) Tween20, 1M NaCl (pH 7.6).
  • the eluate was eluted using 0.1 M Glycine-HC1, 150 mM NaCl, 0.01% (v / v) Tween20 (pH 2.7). Immediately after elution, neutralize with 1 M Tris-Cl (pH 8.0), and replace with PBS (-), 0.01% (v / v) Tween20 using PD-10 column (Amersham Biosciences). Was.
  • the purified soluble Mpl protein is called hMp to Fc.
  • MRL / MpJUmmCrj-lpr / lpr mice purchased from Nippon Charles' Riva.
  • MRL / lpr mice purchased from Nippon Charles' Riva.
  • 100 / z g / animal shMPL-FLAG was supplemented with Freund's complete adjuvant (H37 Ra, manufactured by Betaton's Dickinson), and the emulsion was subcutaneously administered.
  • a booster immunization was performed by adding 50 g / animal shMPL-FLAG to Freund's incomplete adjuvant (Betaton-Dickinson) and subcutaneously administering the emulsified preparation.
  • a final immunization was performed by intravenously administering shMPL-FLAG to each animal.
  • P3-X63Ag8Ul (P3U1, purchased from ATCC) and mouse spleen cells were mixed, and cell fusion was performed by mixing Polyethylene Glycol 1500 (manufactured by Roche Diagnostics) while mixing. From the next day, selection was performed using a HAT medium, and the culture supernatant was used as an indicator for ELISA using an immunoplate with immobilized shMp FLAG or hMp Fc and cell growth activity using BaF3-hMpl as an index. Screening was performed. After the positive clones were subjected to monoclonal dilution by the limiting dilution method, expansion culture was performed, and the culture supernatant was recovered. [0078] 1.6 Analysis of anti-human Mpl antibody
  • the antibody concentration was determined by performing a mouse IgG sandwich ELISA using goat anti-mouse IgG (gamma) (manufactured by ZYMED) and alkaline phosphatase-goat anti-mouse IgG (manufactured by gammaXZYMED). A calibration curve was prepared using GraphPad Prism (GraphPad Software, USA), and the antibody concentration was converted.
  • the antibody isotype was determined by an antigen-dependent ELISA using an isotype-specific secondary antibody. Adjust the coating buffer (O.lmM NaHCO) so that the hMp Fc becomes 1 ⁇ g / mL.
  • the absorbance at 405 nm was measured using Benchmark Plus (manufactured by BioRad).
  • shMp FLAG and hMPL-Fc The binding activity to shMp FLAG and hMPL-Fc was evaluated by ELISA.
  • the purified shMp FLAG and hMPL-Fc were coated at a concentration of 1 ⁇ g / mL, and blocking treatment was performed with a Diluent buffer.
  • the culture supernatant of the hybridoma was dried and left at room temperature for 1 hour, and an anti-mouse IgG antibody (Zymed) labeled with Alkaline Phosphatase was added thereto, followed by color development in the same manner as described above. After color development at room temperature for 1 hour, the absorbance at 405 was measured, and the EC value was calculated using GraphPad Prism.
  • CHO- human Mp Fireflys is recovered CHO- monkey Mpl, and suspended in FACS Buffer (1% FBS / PBS ) so as to lxl0 6 cells / mL.
  • FACS Buffer 1% FBS / PBS
  • the solution was dispensed into Multiscreen (manufactured by Millipore) at 100 L / well, and the culture supernatant was removed by centrifugation.
  • the culture supernatant diluted to 5 g / mL was added and reacted on ice for 30 minutes.
  • the cells were washed once with FACS buffer, added with FITC-labeled anti-mouse IgG antibody (manufactured by Beckman Coulter), and allowed to react on ice for 30 minutes.
  • the mixture was centrifuged at 500 rpm for 1 minute, the supernatant was removed, the cells were suspended in 400 ⁇ l of FACS Buffer, and subjected to flow cytometry using EPICS ELITE ESP (Beckman Coulter). Gates were set on the live cell population using histograms of forward scatter and side scatter.
  • Mouse monoclonal antibodies VA130, VB16, and VB157 that bind to Mpl were obtained by binding activity evaluation by Flow Cytometry using CHO-monkey Mpl.
  • Anti-human Mpl antibody was purified using the culture supernatant of hybridoma as described below.
  • the culture supernatant was adsorbed on a HiTrap protein G HP column (Amersham Biosciences) and eluted with 0.1 M Glycine-HCl (pH 2.7). After elution, the mixture was immediately neutralized with 1M Tris-CI (pH 9.0), dialyzed with PBS for 24 hours, and replaced with a buffer.
  • single-chain antibody expression systems were constructed by genetic engineering for three types of antibodies with high binding activity.
  • the following shows an example of preparing a single-chain antibody of the anti-human Mpl antibody VA130.
  • dNTPs 0.2 mM dNTPs (dATP, dGTP, dCTP, dTTP),
  • reaction temperature conditions are as follows.
  • reaction product was heated at 72 ° C for 7 minutes.
  • the PCR product was purified by agarose gel using a QIAquick Gel Extraction Kit (manufactured by QIAGEN), and then cleaved into a pGEM-T Easy vector (manufactured by Promega). Furthermore, the nucleotide sequence was determined using ABI 3700 DNA Analyzer (manufactured by Perkin Elmer).
  • VA130-VH The nucleotide sequence of the cloned VA130 H chain variable region (hereinafter, VA130-VH) is represented by SEQ ID NO: 3, the amino acid sequence is represented by SEQ ID NO: 4, and the nucleotide sequence of the L chain variable region (hereinafter, VA130-VL) is represented by: SEQ ID NO: 5, and the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 6.
  • VA130 a single-chain Fv (hereinafter, VA130 Diabody) using a linker sequence consisting of 5 amino acids is composed of the 3 ′ end of the gene encoding VA130-VH and the gene encoding VA130-VL. 'A linker with a (Gly Ser) force at the end
  • the genes to which the nucleotide sequence encoding 411 was added were amplified by PCR and ligated, respectively, and constructed.
  • VA264-feco SEQ ID NO: 7
  • VA264-rL5 SEQ ID NO: 8
  • VA264-1L5 SEQ ID NO: 9
  • VA130-VL a nucleotide sequence encoding the N-terminus of VA130-VL and a phosphorylase that also has (Gly Ser) power.
  • VA130-VL Has a nucleotide sequence encoding the C-terminal of VA130-VH Designed.
  • the rear primer VA264-rflag (SEQ ID NO: 10) of VA130-VL is
  • composition of the PCR reaction solution (50 L) is shown below.
  • dNTPs dATP, dGTP, dCTP, dTTP
  • VA264-rflag oligonucleotide of lOpmole VA264-feco, VA264-rL5 or VA264-1L5, VA264-rflag
  • reaction temperature conditions are as follows.
  • reaction product was heated at 72 ° C for 5 minutes.
  • the agarose gel was also purified from the approximately 400 bp PCR product using the QIAquick Gel Extraction Kit (manufactured by QIAGEN), and a second PCR was performed using a part of each PCR product as follows.
  • composition of the PCR reaction solution (50 L) is shown below.
  • dNTPs dATP, dGTP, dCTP, dTTP
  • reaction temperature conditions are as follows.
  • reaction product was heated at 72 ° C for 5 minutes.
  • the PCR product of about 800 bp was also purified using a QIAquick Gel Extraction Kit (manufactured by QIAGEN) to purify agarose gel, and then digested with EcoRI (Takara Shuzo) and Notl (Takara Shuzo). After that, the resultant was purified using a QIAquick PCR Purification Kit (manufactured by QIAGEN) and cloned into pCXND3 to prepare pCXND3-VA130 db.
  • QIAquick Gel Extraction Kit manufactured by QIAGEN
  • FIG. 1 shows the construction process of the sc (Fv) 2 gene.
  • the rear primer sc-rL15 (primer B, SEQ ID NO: 12) of VA130-VH hybridizes to the DNA encoding the C-terminus of VA130-VH and encodes a linker consisting of (Glv Ser).
  • the sequence was designed to have a base sequence that hybridizes to the DNA encoding the N-terminus of VA130-VL.
  • the forward primer sc-! L15 (primer C, SEQ ID NO: 13) of VA130-VL is a linker consisting of the nucleotide sequence encoding the N-terminus of VA130-VL and (Gly Ser).
  • composition of the PCR reaction solution (50 L) is shown below.
  • dNTPs dATP, dGTP, dCTP, dTTP
  • reaction temperature conditions are as follows.
  • reaction product was heated at 72 ° C for 5 minutes.
  • the PCR product of about 400 bp was also purified using a QIAquick Gel Extraction Kit (manufactured by QIAGEN) for agarose gel, and then a second PCR was performed using a part of each PCR product as follows.
  • composition of the PCR reaction solution (50 L) is shown below.
  • dNTPs dATP, dGTP, dCTP, dTTP
  • reaction temperature conditions are as follows.
  • reaction product was heated at 72 ° C for 5 minutes.
  • a PCR product of about 800 bp was purified using a QIAquick Gel Extraction Kit (manufactured by QIAGEN) to purify agarose gel, and then digested with EcoRI (Takara Shuzo) and Notl (Takara Shuzo). After that, the product was purified using a QIAquick PCR Purification Kit (manufactured by QIAGEN) and cloned into pBacPAK9 (manufactured by CLONTECH) to prepare pBacPAK9-scVA130.
  • Two new primers were newly designed, and this fragment was produced using the PCR method.
  • the forward primer Fv2-f (Primer E, SEQ ID NO: 14) of the target fragment was designed to have a PvuII site at the 5 ′ end and a sequence at the 5 ′ end of VA130-VH.
  • the rear primer Fv2-r (Primer F, SEQ ID NO: 15) of the fragment of interest hybridizes to the DNA encoding the C-terminus of VA130-VL and encodes a linker consisting of (Glv Ser).
  • the sequence was designed to have a base sequence that hybridizes to DNA encoding the N-terminus of VA130-VH, and a PvuII site.
  • PCR was performed as follows.
  • dNTPs dATP, dGTP, dCTP, dTTP
  • reaction temperature conditions are as follows.
  • reaction product was heated at 72 ° C for 5 minutes.
  • a PCR product of about 800 bp was purified from agarose gel using the QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN) and then cloned into a pGEM-T Easy vector (Promega). After determining the nucleotide sequence, the target fragment was recovered after digestion with the restriction enzyme PvuII (Takara Shuzo). After digestion with restriction pBacPAK9_scVA130 enzyme PvuII (manufactured by Takara Shuzo) was ligated to recovered fragment to prepare a P BacPAK9-VA130 sc (Fv) 2.
  • the digested vector was digested with EcoRI (Takara Shuzo) and Notl (Takara Shuzo), and the approximately 1800 bp fragment was purified from agarose gel using QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN).
  • the expression vector pCXND3 was cloned to prepare pCXND3-VA130 sc (Fv) 2.
  • the production of a cell line stably expressing a single-chain antibody using CHO-DG44 cells was performed as follows.
  • the gene was introduced by an electoral-portation method using Gene Pulserll (BioRad).
  • a mixture of the expression vector (25 ⁇ g) and 0.75 mL of CHO-DG44 cells (1 ⁇ 10 7 cells / mL) suspended in PBS was cooled on ice for 10 minutes, transferred to a cuvette, and then transferred to a 1.5 kV, A pulse was given at the capacity of the FD.
  • electroporated cells should contain 500 ⁇ g / mL Geneticin (Invitrogen).
  • a CHO-S-SFMII medium (manufactured by Invitrogen) was selected for selection to establish an expression CHO cell line.
  • VA130 sc (Fv) 2 a cell line stably expressing and a culture supernatant thereof were prepared by this method.
  • Transient expression of a single-chain antibody using COS7 cells was performed as follows. A mixture of expression vector (10 ⁇ g) and 0.75 mL of CHO-DG44 cells (1 ⁇ 10 7 cells / mL) suspended in PBS was cooled on ice for 10 minutes, transferred to a cuvette, and then transferred to a 1.5 kV Pulses were given at a volume of 25 ⁇ FD. After a 10-minute recovery period at room temperature, the electorated port The cells were caloried in a DMEM medium (manufactured by Invitrogen) containing 10% FBS, cultured for 1 hour, washed with PBS, added with a CHO-S-SFMII medium, and cultured for about 3 days. For VA130 Diabody, a culture supernatant was prepared by this method.
  • DMEM medium manufactured by Invitrogen
  • the concentration of the anti-human Mpl-chain antibody transiently expressed in COS cells in the culture supernatant was measured using surface plasmon resonance. That is, the Sensor Chip CM5 (Biacore) was set on BIAcore2000 (Biacore), and ANTI-FLAG M2 Monoclonal Antibody
  • Diabody by SIGMA-ALDRICH. An appropriate concentration sample was flowed at a flow rate of 5 mL / sec, and 50 mM getylamine was flowed to dissociate the bound antibody. The change in mass when the sample was flowed was measured, and the concentration was calculated using a calibration curve created based on the change in mass of the standard product.
  • the standard for Diabody is dbl2E10 (WO 02/33072 and WO
  • Anti-Flag M2 Affinity Gel (SIGMA-ALDRICH) column prepared by equilibrating the culture supernatant of VA130 Diabody expressing COS7 cells or CHO cells with 50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 150 mM NaCl, 0.05% Tween20 And eluted with 100 mM Glycine-HCl (pH 3.5). The eluted fraction was immediately neutralized with 1 M Tris-HCl (pH 8.0), and subjected to gel filtration chromatography using a HiLoad 26/60 Superdex200pg (Amersham-Bioscience) column. As a buffer for gel filtration chromatography, PBS and 0.01% Tween20 were used.
  • the culture supernatant of VA130 sc (Fv) 2 expressing COS7 cells or CHO cells was purified under the same conditions as for Diabody purification.
  • confirmation of Diabody and sc (Fv) 2 was performed using SDS-PAGE and Western Blotting using an anti-Flag antibody (SIGMA-ALDLICH).
  • CH0-human Mpl, CHO-monkey Mpl and CHO-mouse Mpl were collected and suspended in FACS Buffer (1% FBS / PBS) to lxlO 6 cells / mL.
  • FACS Buffer 1% FBS / PBS
  • the solution was dispensed into Multiscreen-HV Filter Plates (Millipore) at 100 L / well, and the supernatant was removed by centrifugation.
  • An appropriate concentration of Diabody or sc (Fv) 2 was added and allowed to react on ice for 30 minutes.
  • the cells were washed once with 200 ⁇ L of FACS buffer, 10 ⁇ g / mL of ⁇ -FLAG M2 Monoclonal Antibody (manufactured by SIGMA-ALDRICH) was added, and reacted on ice for 30 minutes.
  • FIG. 2 shows the results of evaluating the binding activity to CHO cells expressing various Mpls using the purified VA130 sc (Fv) 2. It showed no binding activity to CHO, which is a host cell, and was found to specifically bind to CHO-human Mpl and CHO monkey Mpl. Since the tendency of the binding activity was not different from that of VA130 IgG, it was inferred that the binding site of the antibody was changed by the reduction in molecular weight.
  • the binding activity of anti-human Mpl-chain antibody to hMPL-Fc was evaluated by ELISA.
  • the purified hMPL-Fc was coated to a concentration of 0.5 ⁇ g / mL, and subjected to a blocking treatment with a Diluent buffer. After adding VA130 purified product diluted to an appropriate concentration, leaving it at room temperature for 1 hour, washing with Rinse buffer, then diluting the ANTI-FLAG M2 Monoclonal Antibody (manufactured by SIGMA-ALDRICH) diluted 1000 times, For 1 hour.
  • FIG. 3 shows the results of evaluating TPO-like agonist activity using BaF3-human Mpl.
  • VA130 IgG has no agonizing activity (BaF3-human Mpl EC: MOOnM)
  • the agonist activity (BaF3-human Mpl EC: 222 pM and 1023 pM, respectively) was detected in VA130 Diabody and VA130 sc (Fv) 2.
  • Table 1 shows the evaluation of the activities of VA130, VB16, and VB157. Similar to VA130, VB16 and VB157 also show strong binding activity with IgG, and no agonist activity is detected.However, it can be seen that when converted to a low molecular weight antibody, the agonist activity is recognized. Helped.
  • the agonist activity is measured before the modification. Those that did not have been excluded at that time and only those that were active had been modified. In such a case, it is impossible to find an antibody that has an agonistic activity only by modifying it into a small molecule, and as a result, a low-molecularized antibody derived from such an antibody is also selected. It was a powerful thing to do. The present inventors have found that even if their full-length agonist activity is weak or hardly detectable, it is possible to increase the activity by reducing the molecular weight.
  • selection is not performed using agonist activity as an index before antibody modification, so that agonist activity is not detected in the full length, or an antibody with weak activity is not detected. Is not excluded. Thus, it is possible to find antibodies that have the potential to increase activity, which were overlooked by conventional methods.

Abstract

　抗ヒトMpl抗体を作製し、その中で結合活性が高かった３種類の抗体について、遺伝子工学的手法により一本鎖抗体の発現系を構築した。TPO依存性増殖を示すBaF3-human Mplを用いて、抗ヒトMpl抗体および抗ヒトMpl一本鎖抗体のTPO様アゴニスト活性の評価を行なったところ、抗ヒトMpl抗体はアゴニスト活性を示さなかったのに対し、抗ヒトMpl一本鎖抗体ではアゴニスト活性を示すことが分かった。 　このことは、アゴニスト活性を有する改変抗体のスクリーニングにおいて、抗原結合活性を有する抗体を改変した後に、アゴニスト活性を測定することが有効であることを示している。

Description

ァゴニスト活性を有する改変抗体のスクリーニング方法
技術分野
[0001] 本発明は、ァゴニスト活性を有する改変抗体のスクリーニング方法に関する。
背景技術
[0002] 抗体は血中での安定性が高ぐ抗原性も少ないことから医薬品として注目されてい る。その中でも、受容体などの細胞表面に発現するタンパク質を認識し、特異的反応 を細胞に生じさせることが可能なァゴ-スト抗体は医薬品として有用であると考えられ ている。エリスロポエチン受容体に対するァゴ-スト抗体 (非特許文献 1参照)、トロン ボポェチン受容体に対するァゴニスト抗体や CD47に対するァゴニスト抗体 (特許文献 1および 2参照)など、既に幾つかのァゴ-スト抗体が報告されている。
[0003] 又、近年、ヒトに対する抗原性、血中半減期、製造における簡便性、などの観点か らアミノ酸配列の置換など、何らかの改変が行われた改変抗体が医薬品として開発さ れている。例えば、低分子化抗体や、ヒト化'キメラ化抗体など、改変抗体は医薬品と して優れた性質を有して 、ると考えられて 、る。
以上のようにァゴニスト活性を有する改変抗体は疾患の治療 ·診断などに非常に有 用であると考えられており、そのような抗体を取得する為の効率的なスクリーニング方 法が望まれている。
[0004] 従来のァゴニスト活性を有する改変抗体のスクリーニングは、通常、（1)抗体作製、 (2)作製された抗体の結合活性及びァゴ-スト活性の測定、（3)結合活性及びァゴ- スト活性を有する抗体の選択、（4)抗体の改変、（5)改変抗体の結合活性及びァゴニス ト活性の測定、（6)結合活性及びァゴニスト活性を有する抗体の選択、という流れで行 われており、抗体を改変する前の段階でァゴ-スト活性がない又は低い抗体は、そ の段階で除外されてしまい、改変されることはな力つた。
従って、改変前の段階ではァゴ-スト活性を有していないが、潜在的にァゴ-スト 活性を有する抗体を、従来のスクリーニング方法で見出すことは不可能であった。
[0005] 特許文献 1 :国際公開第 02/33072号 特許文献 2：国際公開第 02/33073号
非特許文献 1 : Elliott Sら著、 J.Biol.Chem., 1996年、 Vol.271(40)、 p.24691-24697 発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0006] 本発明はこのような状況に鑑みて為されたものであり、その目的は、ァゴニスト活性 を有する改変抗体のスクリーニング方法を提供することにある。より具体的には、抗原 結合活性を指標にスクリーニングした抗体を改変した後に、ァゴニスト活性を測定す ることを特徴とするスクリーニング方法を提供することを目的とする。
課題を解決するための手段
[0007] 本発明者らは上記課題を解決するために鋭意研究を行なった。詳しくは抗ヒト Mpl 抗体を作製し、その中で結合活性が高力つた抗体について、遺伝子工学的手法に より一本鎖抗体の発現系を構築した。 TPO依存性増殖を示す BaF3-human Mplを用 V、て、全長抗ヒト Mpl抗体および低分子化抗ヒト Mpl—本鎖抗体の TPO様ァゴ-スト活 性の評価を行なったところ、全長抗ヒト Mpl抗体はァゴニスト活性を示さな力つたのに 対し、低分子化抗ヒト Mpl—本鎖抗体ではァゴ-スト活性を示して ヽた。
[0008] 本発明者らは、抗体の改変前と改変後ではァゴニスト活性に差があり、改変前にァ ゴニスト活性を有していない抗体でも、抗体に低分子化などの改変をすることによりァ ゴニスト活性を有するようになることに着目し、ァゴ-スト活性を有する改変抗体のスク リーニングにおいて、抗原結合活性を有する抗体を改変した後に、ァゴニスト活性を 測定することで、従来のスクリーニングでは選択が不可能であった抗体も選択するこ とが可能であることを見出した。
[0009] つまり、抗体を改変する前にァゴニスト活性を測定し、その時点でァゴニスト活性が な 、抗体を除外する t 、う従来のスクリ一ユング方法では、改変前にはァゴニスト活 性を有して 、な 、が改変によりァゴニスト活性を有するようになる抗体を見出すことは 不可能であつたのに対し、抗体の改変前にはァゴニスト活性を指標として抗体を除外 しな 、スクリーニング方法であれば、従来の方法では見落とされてしまう抗体を見出 すことが可能となる。
[0010] すなわち本発明はァゴニスト抗体のスクリーニング方法に関し、より具体的には、 〔1〕 以下の工程を含む、ァゴニスト抗体のスクリーニング方法、
(a) 被験抗体の結合活性を測定し、結合活性を有する抗体を選択する工程、
(b) (a)で選択された抗体を改変する工程、
(c) (b)の改変抗体のァゴニスト活性を測定し、ァゴニスト活性を有する改変抗体を選 択する工程
〔2〕 改変抗体が低分子化抗体であることを特徴とする、〔1〕に記載のスクリーニング 方法、
〔3〕 低分子化抗体が sc(Fv)2であることを特徴とする、〔2〕に記載のスクリーニング方 法、
〔4〕 被験抗体を改変する前に、ァゴニスト活性を測定しないことを特徴とする、〔1〕 一〔3〕のいずれかに記載のスクリーニング方法、
〔5〕 抗体が細胞膜上に発現するタンパク質に対する抗体であることを特徴とする、〔
1〕一〔4〕の 、ずれかに記載のスクリーニング方法、
〔6〕 〔1〕一〔5〕の 、ずれかに記載の方法により得られた抗体、
〔7〕 以下の工程を含む、ァゴニスト活性を有する抗体の製造方法、
(a) 抗体の結合活性を測定し、結合活性を有する抗体を選択する工程、
(b) (a)で選択された抗体を改変する工程、
(c) (b)の改変抗体のァゴ-スト活性を測定し、ァゴニスト活性を有する抗体を選択す る工程、
(d) (c)で選択された抗体をコードする DNAを含むベクターを宿主細胞に導入するェ 程、
(e) (d)の宿主細胞を培養する工程
〔8〕 改変抗体が低分子化抗体であることを特徴とする、〔7〕に記載の製造方法、 〔9〕 低分子化抗体が sc(Fv)2であることを特徴とする、〔8〕に記載の製造方法、 〔10〕 抗体を改変する前に、ァゴニスト活性を測定しないことを特徴とする、〔7〕一〔9 〕の 、ずれかに記載の製造方法、
〔11〕 抗体が細胞膜上に発現するタンパク質に対する抗体であることを特徴とする、 〔7〕一〔10〕の 、ずれかに記載の製造方法、 〔12〕 以下の工程を含むァゴ-スト抗体のスクリーニング方法であって、（a)の工程の 前に被験抗体のァゴ-スト活性を測定しないことを特徴とする方法、
(a) 被験抗体を改変する工程、
(b) (a)の改変抗体のァゴニスト活性を測定し、ァゴニスト活性を有する改変抗体を選 択する工程
〔13〕 改変抗体が低分子化抗体であることを特徴とする、〔12〕に記載のスクリー二 ング方法、
〔14〕 低分子化抗体が sc(Fv)2であることを特徴とする、〔13〕に記載のスクリーニン グ方法、に関する。
図面の簡単な説明
[0011] [図 1]一本鎖抗体 sc(Fv)2の作製過程を示す図である。
[図 2]Mpl発現 CHO細胞株を用いた VA130 sc(Fv)2の結合活性評価の結果を示すグ ラフである。 VA130 sc(Fv)2精製品を使用した。
[図 3]BaF3-human Mplを用いた VA130抗体のァゴ-スト活性評価の結果を示すグラ フである。
発明を実施するための最良の形態
[0012] 本発明は、ァゴニスト活性を有する改変抗体のスクリーニング方法を提供する。本 発明のスクリーニング方法は、抗原結合活性を指標にスクリーニングした抗体を改変 した後に、該改変抗体のァゴニスト活性を測定し、ァゴニスト活性を有する改変抗体 を選択することを特徴とする。
[0013] 本発明の方法は、まず、被験抗体の抗原結合活性を測定し、抗原結合活性を有す る抗体を選択する。次いで、選択された抗体を改変する。次いで、該改変抗体のァゴ 二スト活性を測定し、ァゴ-スト活性を有する改変抗体を選択する。
[0014] 本発明にお 、て、抗体の改変とは、抗体のアミノ酸配列、分子量、立体構造などを 変化させることをいう。抗体の改変の具体例としては、例えば、低分子化、キメラ化'ヒ ト化、修飾、糖鎖の置換 '付加'欠失などを挙げることができる。抗体の改変は、複数 の改変が行われて 、てもよ 、し、単一の改変が行われてもよ 、。
[0015] 本発明にお 、ては好ま U、改変は、抗体の低分子化である。低分子化の好ま 、 態様としては、 Diabody化又は sc(Fv)2ィ匕であり、特に好ましくは sc(Fv)2ィ匕である。
[0016] 低分子化抗体は、全長抗体 (whole antibody,例えば whole IgG等)の一部分が欠損 している抗体断片を含み、抗原への結合能を有していれば特に限定されない。本発 明の抗体断片は、全長抗体の一部分であれば特に限定されないが、重鎖可変領域 (VH)又は Z及び軽鎖可変領域 (VL)を含んで 、ることが好ま 、。 VHまたは VLのァ ミノ酸配列は、置換、欠失、付加及び/又は挿入がされていてもよい。さらに抗原へ の結合能を有する限り、 VH又は/及び VLの一部を欠損させてもよい。又、可変領域 はキメラ化ゃヒト化されて 、てもよ 、。
[0017] 抗体断片の具体例としては、 Fab、 Fab'、 F(ab')2、 Fv等を挙げることができる。
[0018] 低分子化抗体の具体例としては、例えば、 Fab, Fab'、 F(ab')2、 Fv、 scFv (シングル チェイン Fv)、 Diabody、 sc(Fv)2などを挙げることができる力 好ましくは Diabody又は sc(Fv)2であり、特に好ましくは sc(Fv)2である。このような低分子化抗体は、当業者に 公知の方法によって製造することができる。
[0019] Diabodyは、可変領域と可変領域をリンカ一等で結合したフラグメント (例えば、 scFv 等）を 2つ結合させて二量体化させたものであり、通常、 2つの VLと 2つの VHを含む (P.Holliger et al, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 90, 6444-6448 (1993)、 EP404097号、 W093/11161号、 Johnson et al., Method in Enzymology, 203, 88—98, (1991)、 Holliger et al., Protein Engineering, 9, 299-305, (1996)、 Perisic et al., Structure, 2, 1217-1226, (1994)、 John et al" Protein Engineering, 12(7), 597-604, (1999)、 Holliger et al,. Proc.Natl.Acad.Sci.USA., 90, 6444-6448, (1993)、 Atwell et al., Mol.Immunol. 33, 1301-1312, (1996》。
[0020] sc(Fv)2は、 2つの重鎖可変領域及び 2つの軽鎖可変領域をリンカ一等で結合し、 一本鎖ポリペプチドにした抗体であり (Hudson et al、 J Immunol. Methods 1999 ; 231： 177-189)、例えば、 2つの sc(Fv)をリンカ一で結合すること等により作製することが可 能である。
[0021] 結合される 2つの重鎖可変領域と 2つの軽鎖可変領域の順序は特に限定されず、 どのような順序で並べられていてもよぐ例えば、以下のような配置を挙げることがで きる。 [VL]リンカ一 [VH]リンカ一 [VH]リンカ一 [VL]
[VH]リンカ一 [VL]リンカ一 [VL]リンカ一 [VH]
[VH]リンカ一 [VH]リンカ一 [VL]リンカ一 [VL]
[VH]リンカ一 [VL]リンカ一 [VH]リンカ一 [VL]
[VL]リンカ一 [VL]リンカ一 [VH]リンカ一 [VH]
[VL]リンカ一 [VH]リンカ一 [VL]リンカ一 [VH]
[0022] 本発明にお 、ては、 [VH]リンカ一 [VL]リンカ一 [VH]リンカ一 [VL]の配置を有す る sc(Fv)2が好ましい。
[0023] リンカ一は、遺伝子工学により導入し得る任意のペプチドリンカ一、又は合成化合 物リンカ一（例えば、 Protein Engineering, 9(3), 299-305, 1996参照）に開示されるリン カーを用いることができる。
[0024] 本発明において好ましいリンカ一はペプチドリンカ一である。ペプチドリンカ一の長 さは特に限定されず、 目的に応じて当業者が適宜選択することが可能であるが、通 常、 1一 100アミノ酸、好ましくは 5— 30アミノ酸、特に好ましくは 12— 18アミノ酸 (例えば 、 15アミノ酸)である。
[0025] ペプチドリンカ一のアミノ酸配列としては、例えば、以下のような配列を挙げることが できる。
Ser
GlySer
GlyGly^er
Sef GlyGly
GlyGlyuly* 'Ser
Sef GlyGly Gly
GlyGlyuly* •GlySer
Sef GlyGly Gly Gly
GlyGlyGly* •Gly Gly Ser
Sef GlyGly ulyGlyGly
GlyGlyGly* •Gly Gly Gly Ser Ser · Gly · Gly · Gly · Gly · Gly · Gly
(Gly · Gly · Gly · Gly · Ser)n
(Ser · Gly · Gly · Gly · Gly)n
[nは 1以上の整数である]等を挙げることができる。
[0026] 合成化学物リンカ一 (ィ匕学架橋剤）は、ペプチドの架橋に通常用いられている架橋 剤、例えば、 N-ヒドロキシスクシンイミド（NHS)ジスクシンイミジルスべレート（DSS)、ビ ス（スルホスクシンィミジル)スべレート（BS3)、ジチォビス（スクシンィミジルプロビオネ ート）（DSP)、ジチオピス（スルホスクシンィミジルプロピオネート）（DTSSP)、エチレン グリコールビス（スクシンイミジルスクシネート）（EGS)、エチレングリコールビス（スルホ スクシンイミジルスクシネート）（スルホー EGS)、ジスクシンィミジル酒石酸塩（DST)、ジ スルホスクシンィミジル酒石酸塩 (スルホー DST)、ビス [2- (スクシンイミドォキシカルボ -ルォキシ）ェチル]スルホン（BSOCOES)、ビス [2- (スルホスクシンイミドォキシカル ボ -ルォキシ）ェチル]スルホン (スルホ— BSOCOES)などであり、これらの架橋剤は 市販されている。
[0027] 抗体断片又は低分子化抗体を得るには、抗体を酵素、例えば、パパイン、ペプシン などで処理し抗体断片を生成させるか、又は、これら抗体断片をコードする遺伝子を 構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させればよい (例 えば、 Co, M. S. et al, J. Immunol. (1994) 152, 2968-2976； Better, M. and
Horwitz, A. H., Methods Enzymol. (1989) 178, 476—496； Pluckthun, A. and Skerra, A., Methods Enzymol. (1989) 178, 497-515； Lamoyi, E., Methods Enzymol. (1986) 121, 652-663； Rousseaux, J. et al., Methods Enzymol. (1986) 121, 663—669； Bird, R. E. and Walker, B. W" Trends Biotechnol. (1991) 9, 132- 137参照）。
本発明における低分子化抗体は、全長抗体よりも分子量が小さくなることが好まし いが、例えば、ダイマー、トリマー、テトラマーなどの多量体を形成すること等もあり、 全長抗体よりも分子量が大きくなることもある。
[0028] キメラ抗体は、異なる動物由来の配列を組み合わせて作製される抗体であり、例え ば、マウス抗体の重鎖、軽鎖の可変領域とヒト抗体の重鎖、軽鎖の定常領域からなる 抗体などである。キメラ抗体の作製は公知の方法を用いて行うことができ、例えば、抗 体 V領域をコードする DNAをヒト抗体 C領域をコードする DNAと連結し、これを発現べ クタ一に組み込んで宿主に導入し産生させることにより得られる。
[0029] ヒト化抗体は、再構成 (reshaped)ヒト抗体とも称され、これは、ヒト以外の哺乳動物、 例えばマウス抗体の相補性決定領域（CDR; complementarity determining region)を ヒト抗体の相補性決定領域へ移植したものであり、その一般的な遺伝子組換え手法 も知られている（欧州特許出願公開番号 EP 125023号公報、 WO 96/02576号公報参 照)。
[0030] 具体的には、マウス抗体の CDRとヒト抗体のフレームワーク領域（framework region;
FR)とを連結するように設計した DNA配列を、 CDR及び FR両方の末端領域にオーバ 一ラップする部分を有するように作製した数個のオリゴヌクレオチドをプライマーとして 用いて PCR法により合成する (W098/13388号公報に記載の方法を参照)。
CDRを介して連結されるヒト抗体のフレームワーク領域は、相補性決定領域が良好 な抗原結合部位を形成するものが選択される。必要に応じ、再構成ヒト抗体の相補 性決定領域が適切な抗原結合部位を形成するように、抗体の可変領域におけるフレ ームワーク領域のアミノ酸を置換してもよい（Sato, K.etal., CancerRes. (1993) 53, 851-856)。
[0031] キメラ抗体及びヒト化抗体の C領域には、ヒト抗体のものが使用され、例えば H鎖で は、 C γ 1、 C γ 2、 C γ 3、 C γ 4を、 L鎖では C κ、 C λを使用することができる。また、 抗体またはその産生の安定性を改善するために、ヒト抗体 C領域を修飾してもよ 、。 一般的に、キメラ抗体は、ヒト以外の哺乳動物由来抗体の可変領域とヒト抗体由来 の定常領域とからなる。一方、ヒト化抗体は、ヒト以外の哺乳動物由来抗体の相補性 決定領域と、ヒト抗体由来のフレームワーク領域および C領域とからなる。
なお、キメラ抗体やヒト化抗体を作製した後に、さらに可変領域 (例えば、 FR)ゃ定 常領域中のアミノ酸を他のアミノ酸で置換等することも可能である。
[0032] 抗体に他の分子を付加することにより、抗体を修飾し、改変することも可能である。
抗体の修飾は当業者に公知の方法により行うことができる。抗体の修飾の具体例とし ては、例えば、 PEGなどの高分子の付加を挙げることができる。
又、抗体の糖鎖を置換 '付加'欠失させることにより改変することも可能であり、糖鎖 改変技術は当業者に既に知られている（例えば、 WO00/61739、 WO02/31140など） [0033] 本発明のスクリーニング方法において、被験抗体は特に限定されず、どのような抗 体を用いてもよい。
被験抗体は、その由来等で限定されず、例えば、マウス抗体、ヒト抗体、ラット抗体、 ゥサギ抗体、ラクダ抗体など、どのような動物由来の抗体でもよい。
本発明において被験抗体は、非改変抗体 (例えば、全長抗体)であることが好まし いが、改変された抗体を被験抗体としてもよい。改変抗体を被験抗体として用いる場 合、本発明のスクリーニングの過程において、さらに他の改変が行われる。この場合 、同じ種類の改変がおこなわれてもよいし、異なる種類の改変がおこなわれてもよい
[0034] 従って、例えば、キメラ抗体、ヒトイ匕抗体などのアミノ酸配列を置換した抗体、各種 分子を結合させた抗体修飾物、糖鎖の付加を制御した抗体、低分子化抗体などを被 験抗体とすることも可能である。但し、低分子化抗体を被験抗体として用いる場合に は、改変後は Diabody又は sc(Fv)2とすることが好ましい。従って、改変前の被験抗体 は、 Diabody又は sc(Fv)2以外であることが好まし!/、。
[0035] 本発明の抗体が認識する抗原は特に限定されず、どのような抗原を認識してもよい 力 例えば、細胞膜上又は細胞内に発現するタンパク質を挙げることができる。細胞 膜上又は細胞内に発現するタンパク質としては、例えば、受容体、細胞表面抗原、 主要組織適合抗原などを挙げることができる。
[0036] 受容体としては、例えば、造血因子受容体ファミリー、サイト力イン受容体ファミリー 、チロシンキナーゼ型受容体ファミリー、セリン Zスレオニンキナーゼ型受容体ファミリ 一、 TNF受容体ファミリー、 Gタンパク質共役型受容体ファミリー、 GPIアンカー型受容 体ファミリー、チロシンホスファターゼ型受容体ファミリー、接着因子ファミリー、ホルモ ン受容体ファミリー、等の受容体ファミリーに属する受容体などを挙げることができる。 これら受容体ファミリーに属する受容体、及びその特徴に関しては多数の文献が存 在し、 f列 は、 Cooke BA., King RJB., van aer Molen HJ. ed. Newし omprehesive Biochemistry V0I.I8B "Hormones and their Actions Part II〃pp.l- 46 (1988) Elsevier Science Publishers BV., New York, USAゝ Patthy L. (1990) Cell, 61: 13-14.、 Ullrich A" et al. (1990) Cell, 61 : 203— 212.、 Massagul J. (1992) Cell, 69: 1067— 1070.、 Miyajima A. , et al. (1992) Annu. Rev. Immunol , 10: 295- 331.、 Taga T. and
Kishimoto T. (1992) FASEB J" 7: 3387-3396.、 Fantl WL , et al. (1993) Annu. Rev. Biochem. , 62: 453- 481.、 Smith CA" et al. (1994) Cell, 76: 959-962.、 Flower DR. (1999) Biochim. Biophys. Acta, 1422: 207- 234.、宫坂昌之監修，細胞工学別冊ハン ドブックシリーズ「接着因子ハンドブック」（1994) (秀潤社，東京， 日本)等が挙げられ る。
[0037] 上記受容体ファミリーに属する具体的な受容体としては、例えば、ヒト又はマウスェ リスロポェチン (EPO)受容体、ヒト又はマウス顆粒球コロニー刺激因子 (G-CSF)受容 体、ヒト又はマウストロンボポイエチン (TPO)受容体、ヒト又はマウスインスリン受容体、 ヒト又はマウス Flt-3リガンド受容体、ヒト又はマウス血小板由来増殖因子 (PDGF)受 容体、ヒト又はマウスインターフェロン（IFN) - a、 j8受容体、ヒト又はマウスレプチン受 容体、ヒト又はマウス成長ホルモン (GH)受容体、ヒト又はマウスインターロイキン (IL) -10受容体、ヒト又はマウスインスリン様増殖因子 (IGF) -I受容体、ヒト又はマウス白血 病抑制因子 (LIF)受容体、ヒト又はマウス毛様体神経栄養因子 (CNTF)受容体等を 例示することができる（hEPOR: Simon, S. et al. (1990) Blood 76, 31-35. ; mEPOR: D 'Andrea, AD. et al. (1989) Cell 57, 277—285. ; hG— CSFR: Fukunaga, R. et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 87, 8702— 8706.； mG— CSFR: Fukunaga, R. et al. (1990) Cell 61 , 341- 350.； hTPOR: Vigon, I. et al. (1992) 89, 5640-5644. ; mTPOR: Skoda, RC. et al. (1993) 12, 2645-2653. ; hlnsR: Ullrich, A. et al. (1985) Nature 313, 756-761. ; hFlt- 3: Small, D. et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91 , 459-463. ; hPDGFR: Gronwald, RGK. et al. (1988) Proc. Natl. acad. Sci. USA. 85, 3435-3439. ; hlFN a / j8 R: Uze, G. et al. (1990) Cell 60, 225- 234.及び Novick, D. et al. (1994) Cell 77, 391—400.)。
[0038] 主要組織適合抗原の例としては、 MHC class I抗原（HLA-A、 HLA-B、 HLA-C、 HLA- E、 HLA- F、 HLA- G、 HLA- H)、 MHC class II抗原（HLA- DR，- DQ，- DP)を挙 げることができる。
糸田胞表面抗原の f列としては、 f列えば、 CD 1、 CD2、 CD3、 CD4、 CD5、 CD6、 CD7、 CD8、 CD10、 CDlla、 CDllb、 CDllc、 CD13、 CD14、 CD15s、 CD16、 CD18、 CD19、 CD20、 CD21、 CD23、 CD25、 CD28、 CD29、 CD30、 CD32、 CD33、 CD34、 CD35、 CD38、 CD40、 CD41a、 CD41b、 CD42a、 CD42b、 CD43、 CD44、 CD45、 CD45RO、 CD48、 CD49a、 CD49b、 CD49c、 CD49d、 CD49e、 CD49f、 CD51、 CD54、 CD55、 CD56、 CD57、 CD58、 CD61、 CD62E、 CD62し、 CD62P、 CD64、 CD69、 CD71、 CD73 、 CD95、 CD102、 CD106、 CD122、 CD126、 CDwl30などを挙げること力 ^できる。
[0039] 本発明のスクリーニング方法にぉ 、て、例えば被験抗体の数が少な 、場合などに は、結合活性を測定する前に抗体を改変し、その後ァゴニスト活性や結合活性を測 定し、ァゴ-スト活性を有する改変抗体を選択してもよい。その場合、ァゴニスト活性 と結合活性の測定の順序は限定されず、又、ァゴニスト活性のみの測定でもよい。
[0040] 本発明のスクリーニング方法の好ましい態様の一つとして、被験抗体として低分子 化されていない全長抗体を用い、改変の工程において低分子化（例えば、 Diabody 又は sc(Fv)2)するスクリーニング方法が挙げられる。
[0041] 本発明において、ァゴニスト活性とは、抗体が結合することにより、特異的反応を細 胞に生じさせる（例えば、細胞内にシグナルが伝達される等して、何らかの生理的活 性の変化を誘導する)活性である。生理的活性としては、例えば、増殖活性、増殖誘 導活性、生存活性、分化活性、分化誘導活性、転写活性、膜輸送活性、結合活性、 タンパク質分解活性、リン酸ィ匕 Z脱リン酸ィ匕活性、酸化還元活性、転移活性、核酸 分解活性、脱水活性、細胞死誘導活性、アポトーシス誘導活性、などを挙げることが できるが、これらに限定されるわけではない。
[0042] ァゴ-スト活性の測定は当業者に公知の方法により行うことが可能である。
例えば、実施例に記載のように細胞増殖を指標にァゴニスト活性を測定する方法に より判定することが可能である。より具体的には、ァゴニスト依存性増殖を示す細胞に ァゴ-スト活性を測定したい抗体を添加し、培養する。その後、 WST-8のような生細 胞数に応じて特定の波長において発色反応を呈する試薬を添加して吸光度を測定 し、得られた吸光度を指標にァゴ-スト活性を測定することが可能である。
[0043] ァゴ-スト依存性増殖を示す細胞も当業者に公知の方法により作製することが可能 であり、例えば、抗原が細胞増殖シグナルを発する受容体である場合には、該受容 体を発現している細胞を用いればよい。又、抗原が細胞増殖シグナルを出さない受 容体である場合には、細胞増殖シグナルを発する受容体の細胞内領域と、細胞増殖 シグナルを出さな ヽ受容体の細胞外領域からなるキメラ受容体を作製し、該キメラ受 容体を細胞で発現させればよ!ヽ。細胞増殖シグナルを発する受容体の例としては、 例えば、 G- CSF受容体、 mpl、 neu、 GM- CSF受容体、 EPO受容体、 c-kit、 FLT-3等を 挙げることができる。受容体を発現させる細胞としては、例えば、 BaF3、 NFS60、 FDCP- 1、 FDCP- 2、 CTLL- 2、 DA- 1、 KT- 3等を挙げることができる。
その他、ァゴ-スト活性を測定する為に用いる検出指標としては、量的及び Z又は 質的な変化が測定可能である限り使用することができる。例えば、無細胞系 (cell free assay)の指標、細胞系 (ceU-based assay)の指標、糸且織系の指標、生体系の指標を用 いることができる。無細胞系の指標としては、酵素反応やタンパク質、 DNA、 RNAの量 的及び Z又は質的な変化を用いることができる。酵素反応としては、例えば、アミノ酸 転移反応、糖転移反応、脱水反応、脱水素反応、基質切断反応等を用いることがで きる。また、タンパク質のリン酸化、脱リン酸化、二量化、多量化、分解、乖離等や、 DNA、 RNAの増幅、切断、伸長を用いることができる。例えばシグナル伝達経路の下 流に存在するタンパク質のリン酸ィ匕を検出指標とすることができる。細胞系の指標とし ては、細胞の表現型の変化、例えば、産生物質の量的及び Z又は質的変化、増殖 活性の変化、細胞数の変化、形態の変化、特性の変化等を用いることができる。産 生物質としては、分泌タンパク質、表面抗原、細胞内タンパク質、 mRNA等を用いるこ とができる。形態の変化としては、突起形成及び Z又は突起の数の変化、偏平度の 変化、伸長度 Z縦横比の変化、細胞の大きさの変化、内部構造の変化、細胞集団と しての異形性 Z均一性、細胞密度の変化等を用いることができる。これらの形態の変 化は検鏡下での観察で確認することができる。特性の変化としては、足場依存性、サ イト力イン依存応答性、ホルモン依存性、薬剤耐性、細胞運動性、細胞遊走活性、拍 動性、細胞内物質の変化等を用いることができる。細胞運動性としては、細胞浸潤活 性、細胞遊走活性がある。また、細胞内物質の変化としては例えば、酵素活性、 mRNA量、 Ca2+や cAMP等の細胞内情報伝達物質量、細胞内タンパク質量等を用い ることができる。また、細胞膜受容体の場合には、受容体の刺激によって誘導される 細胞の増殖活性の変化を指標とすることができる。組織系の指標としては、使用する 組織に応じた機能変化を検出指標とすることができる。生体系の指標としては組織重 量変化、血液系の変化、例えば血球細胞数の変化、タンパク質量や、酵素活性、電 解質量の変化、また、循環器系の変化、例えば、血圧、心拍数の変化等を用いること ができる。
[0045] これらの検出指標を測定する方法としては、特に制限はなぐ吸光、発光、発色、蛍 光、放射活性、蛍光偏光度、表面プラズモン共鳴シグナル、時間分解蛍光度、質量 、吸収スペクトル、光散乱、蛍光共鳴エネルギー移動、等を用いることができる。これ らの測定方法は当業者にとっては周知であり、目的に応じて、適宜選択することがで きる。例えば、吸収スペクトルは一般的に用いられるフォトメータやプレートリーダ等、 発光はルミノメータ等、蛍光はフルォロメータ等で測定することができる。質量は質量 分析計を用いて測定することができる。放射活性は、放射線の種類に応じてガンマ力 ゥンターなどの測定機器を用いて、蛍光偏光度は BEACON (宝酒造）、表面ブラズモ ン共鳴シグナルは BIACORE、時間分解蛍光、蛍光共鳴エネルギー移動などは ARVOなどにより測定できる。さらに、フローサイトメータなども測定に用いることができ る。これらの測定方法は、一つの測定方法で 2種以上の検出指標を測定しても良ぐ 簡便であれば、 2種以上の測定を同時及び Z又は連続して測定することによりさらに 多数の検出指標を測定することも可能である。例えば、蛍光と蛍光共鳴エネルギー 移動を同時にフルォロメータで測定することができる。
[0046] 抗体の結合活性の測定は当業者に公知の方法により行うことが可能である。例え ば、抗体の抗原結合活性を測定する方法として、 ELISA (酵素結合免疫吸着検定法) 、 EIA (酵素免疫測定法)、 RIA (放射免疫測定法)あるいは蛍光抗体法を用いること ができる。例えば、酵素免疫測定法を用いる場合、抗原をコーティングしたプレートに 、抗体を含む試料、例えば、抗体産生細胞の培養上清や精製抗体を加える。アル力 リフォスファターゼ等の酵素で標識した二次抗体を添加し、プレートをインキュベート し、洗浄した後、 トロフ ニル燐酸などの酵素基質を加えて吸光度を測定するこ とで抗原結合活性を評価することができる。
[0047] 本発明はァゴニスト活性を有する抗体の製造方法もまた提供する。本発明の製造 方法は、まず、ァゴ-スト活性を有する改変抗体を上述のようにスクリーニングする。 次いで、該改変抗体をコードする DNAを含むベクターを作製し、該ベクターを宿主細 胞に導入する。次いで、宿主細胞を培養する。
[0048] 本発明のベクターとしては、例えば、大腸菌を宿主とする場合には、ベクターを大 腸菌（例えば、 JM109, DH5 a、 HB101、 XLlBlue)などで大量に増幅させ大量調製す るために、大腸菌で増幅されるための「ori」をもち、さらに形質転換された大腸菌の選 抜遺伝子 (例えば、なんらかの薬剤（アンピシリンやテトラサイクリン、カナマイシン、ク 口ラムフエ-コール）により判別できるような薬剤耐性遺伝子)を有すれば特に制限は ない。ベクターの例としては、 M13系ベクター、 pUC系ベクター、 pBR322、 pBluescript 、 pCR-Scriptなどが挙げられる。また、 cDNAのサブクロー-ング、切り出しを目的とし た場合、上記ベクターの他に、例えば、 pGEM- T、 pDIRECT、 pT7などが挙げられる。
[0049] 本発明のベクターとしては、特に、発現ベクターが有用である。発現ベクターとして は、例えば、大腸菌での発現を目的とした場合は、ベクターが大腸菌で増幅されるよ うな上記特徴を持つほかに、宿主を JM109、 DH5 a、 HB101、 XLl-Blueなどの大腸菌 とした場合においては、大腸菌で効率よく発現できるようなプロモーター、例えば、 lacZプロモーター（Wardら， Nature (1989) 341, 544- 546； FASEB J. (1992) 6, 2422- 2427)、 araBプロモーター（Betterら， Science (1988) 240, 1041- 1043 )、または T7プロモーターなどを持っていることが不可欠である。このようなベクターとしては、上 記ベクターの他に pGEX- 5X- 1 (フアルマシア社製）、「QIAexpress system] (キアゲン 社製）、 pEGFP、または pET (この場合、宿主は T7 RNAポリメラーゼを発現している BL21が好ましい)などが挙げられる。
[0050] また、ベクターには、ポリペプチド分泌のためのシグナル配列が含まれて!/、てもよ!/ヽ 。タンパク質分泌のためのシグナル配列としては、大腸菌のペリブラズムに産生させ る場合、 pelBシグナル配列（Lei, S. P. et al J. Bacteriol. (1987) 169, 4379)を使用す ればよい。宿主細胞へのベクターの導入は、例えば塩ィ匕カルシウム法、エレクトロボ レーシヨン法を用いて行うことができる。
[0051] 大腸菌以外にも、例えば、本発明のベクターとしては、哺乳動物由来の発現べクタ 一（例えば、 pcDNA3 (インビトロゲン社製）や、 pEGF- BOS (Nucleic Acids. Res.1990, 18(17),p5322)、 pEF、 pCDM8)、昆虫細胞由来の発現ベクター（例えば「
Bac-to-BAC baculovairus expression systemj (ギブコ BRL社製)、 pBacPAK8)、植物 由来の発現ベクター（例えば ρΜΗ1、 pMH2)、動物ウィルス由来の発現ベクター（例え ば、 pHSV、 pMV、 pAdexLcw)、レトロウイルス由来の発現ベクター（例えば、 pZIPneo) 、酵母由来の発現ベクター（例えば、「Pichia Expression KitJ (インビトロゲン社製）、 pNVll、 SP-Q01)、枯草菌由来の発現ベクター（例えば、 pPL608、 pKTH50)が挙げ られる。
[0052] CHO細胞、 COS細胞、 NIH3T3細胞等の動物細胞での発現を目的とした場合には 、細胞内で発現させるために必要なプロモーター、例えば SV40プロモーター（ Mulliganら， Nature (1979) 277, 108)、 MMTV-LTRプロモーター、 EF1 αプロモータ 一（Mizushimaら， Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322)、 CMVプロモーターなどを持 つていることが不可欠であり、細胞への形質転換を選抜するための遺伝子 (例えば、 薬剤 (ネオマイシン、 G418など）により判別できるような薬剤耐性遺伝子)を有すれば さらに好ましい。このような特性を有するベクターとしては、例えば、 pMAM、 pDR2、 pBK- RSV、 pBK-CMV, pOPRSV、 pOP13などが挙げられる。
[0053] さらに、遺伝子を安定的に発現させ、かつ、細胞内での遺伝子のコピー数の増幅を 目的とする場合には、核酸合成経路を欠損した CHO細胞にそれを相補する DHFR遺 伝子を有するベクター（例えば、 pCHOIなど）を導入し、メトトレキセート (MTX)により 増幅させる方法が挙げられ、また、遺伝子の一過性の発現を目的とする場合には、
SV40 T抗原を発現する遺伝子を染色体上に持つ COS細胞を用いて SV40の複製起 点を持つベクター (pcDなど)で形質転換する方法が挙げられる。複製開始点として は、また、ポリオ一マウィルス、アデノウイルス、ゥシパピローマウィルス（BPV)等の由 来のものを用いることもできる。さらに、宿主細胞系で遺伝子コピー数増幅のため、発 現ベクターは選択マーカーとして、アミノグリコシドトランスフェラーゼ (APH)遺伝子、 チミジンキナーゼ (TK)遺伝子、大腸菌キサンチングァニンホスホリボシルトランスフエ ラーゼ (Ecogpt)遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素（dhfr)遺伝子等を含むことができる。
[0054] 本方法にお!、ては次!、で、該ベクターを宿主細胞に導入する。ベクターが導入さ れる宿主細胞としては特に制限はなぐ例えば、大腸菌や種々の動物細胞などを用 いることが可能である。宿主細胞は、例えば本発明の抗体の製造や発現のための産 生系として使用することができる。抗体製造のための産生系は、 in vitroおよび in vivo の産生系がある。 in vitroの産生系としては、真核細胞を使用する産生系や原核細胞 を使用する産生系が挙げられる。
[0055] 真核細胞を使用する場合、例えば、動物細胞、植物細胞、真菌細胞を宿主に用い ることができる。動物細胞としては、哺乳類細胞、例えば、 CH0 (J. Exp. Med. (1995) 108, 945)、 COSゝ 3T3、ミエローマ、 BHK (baby hamster kidney)、 HeLa、 Vero、両生 類細胞、例えばアフリカッメガエル卵母細胞（Valle, et al.， Nature (1981) 291, 338-340)、あるいは昆虫細胞、例えば、 S19、 Sf21、 Tn5が知られている。本発明にお いては、 CHO-DG44, CH0-DXB11、 COS7細胞、 BHKが好適に用いられる。動物細 胞において、大量発現を目的とする場合には特に CHO細胞が好ましい。宿主細胞 へのベクターの導入は、例えば、リン酸カルシウム法、 DEAEデキストラン法、カチォ ニックリボソーム DOTAP (ベーリンガーマンハイム社製）を用いた方法、エレクト口ポー レーシヨン法、リポフエクシヨンなどの方法で行うことが可能である。
[0056] 植物細胞としては、例えば、ニコチアナ 'タパカム（Nicotiana tabacum)由来の細胞 力 Sタンパク質生産系として知られており、これをカルス培養すればよい。真菌細胞とし ては、酵母、例えば、サッカロミセス（Saccharomyces)属、例えば、サッカロミセス'セレ ヒンェ (saccharomyces cerevisiae)、サッカロ；セス-ホンへ (Saccharomyces pombe)、 糸状菌、例えば、ァスペルギルス（Aspergillus)属、例えば、ァスペルギルス '二ガー（ Aspergillus nigerjが知られている。
原核細胞を使用する場合、細菌細胞を用いる産生系がある。細菌細胞としては、大 腸菌（E. coli)、例えば、 JM109, DH5 a、 HB101等が挙げられ、その他、枯草菌が知 られている。
[0057] 本方法においては次いで上記宿主細胞を培養する。 目的とする DNAにより形質転 換された細胞を in vitroで培養することにより、抗体が得られる。培養は、公知の方法 に従い行うことができる。例えば、動物細胞の培養液として、例えば、 DMEM、 MEM, RPMI1640、 IMDMを使用することができる。その際、 FBS、牛胎児血清（FCS)等の血 清補液を併用することもできるし、無血清培養してもよい。培養時の pHは、約 6— 8で あるのが好ましい。培養は、通常、約 30— 40°Cで約 15— 200時間行い、必要に応じて 培地の交換、通気、攪拌を加える。
[0058] 一方、 in vivoでポリペプチドを産生させる系としては、例えば、動物を使用する産生 系や植物を使用する産生系が挙げられる。これらの動物又は植物に目的とする DNA を導入し、動物又は植物の体内でポリペプチドを産生させ、回収する。本発明におけ る「宿主」とは、これらの動物、植物を包含する。
[0059] 動物を使用する場合、哺乳類動物、昆虫を用いる産生系がある。哺乳類動物として は、ャギ、ブタ、ヒッジ、マウス、ゥシを用いることができる（Vicki Glaser, SPECTRUM Biotechnology Applications, 1993)。また、哺乳類動物を用いる場合、トランスジェ- ック動物を用いることができる。
例えば、目的とする DNAを、ャギ j8カゼインのような乳汁中に固有に産生されるポリ ペプチドをコードする遺伝子との融合遺伝子として調製する。次いで、この融合遺伝 子を含む DNA断片をャギの胚へ注入し、この胚を雌のャギへ移植する。胚を受容し たャギから生まれるトランスジエニックャギ又はその子孫が産生する乳汁から、目的の 抗体を得ることができる。トランスジエニックャギカゝら産生される抗体を含む乳汁量を 増加させるために、適宜ホルモンをトランスジエニックャギに使用してもよい（Ebert, K.M. et al, Bio/Technology (1994) 12, 699—702)。
[0060] また、昆虫としては、例えばカイコを用いることができる。カイコを用いる場合、目的 の抗体をコードする DNAを挿入したバキュロウィルスをカイコに感染させることにより、 このカイコの体液から目的の抗体を得ることができる（Susumu, M. et al., Nature (1985) 315, 592-594) o
[0061] さらに、植物を使用する場合、例えばタバコを用いることができる。タバコを用いる場 合、目的とする抗体をコードする DNAを植物発現用ベクター、例えば pMON 530に揷 入し、このベクターをァグロバタテリゥム'ッメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens )のようなバクテリアに導入する。このバクテリアをタバコ、例えば、ニコチアナ 'タパ力 ム（Nicotiana tabacum)に感染させ、本タバコの葉より所望の抗体を得ることができる（ Julian K.-C. Ma et al" Eur. J. Immunol. (1994) 24, 131—138)。
[0062] これにより得られた抗体は、宿主細胞内または細胞外 (培地など)から単離し、実質 的に純粋で均一な抗体として精製することができる。抗体の分離、精製は、通常のポ リペプチドの精製で使用されている分離、精製方法を使用すればよぐ何ら限定され るものではない。例えば、クロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、溶 媒沈殿、溶媒抽出、蒸留、免疫沈降、 SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点 電気泳動法、透析、再結晶等を適宜選択、組み合わせれば抗体を分離、精製するこ とがでさる。
[0063] クロマトグラフィーとしては、例えばァフィユティークロマトグラフィー、イオン交換クロ マトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、吸着ク 口マトグラフィ一等が挙げられる（Strategies for Protein Purification and
Characterization: A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak et al" Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996)。これらのクロマトグラフィーは、液ネ目クロマト グラフィー、例えば HPLC、 FPLC等の液相クロマトグラフィーを用いて行うことができる 。ァフィユティークロマトグラフィーに用いるカラムとしては、プロテイン Aカラム、プロテ イン Gカラムが挙げられる。例えば、プロテイン Aを用いたカラムとして、 Hyper D, POROS, Sepharose F. F. (Pharmacia)等が挙げられる。
[0064] なお、抗体の精製前又は精製後に適当なタンパク質修飾酵素を作用させることによ り、任意に修飾を加えたり部分的にペプチドを除去することもできる。タンパク質修飾 酵素としては、例えば、トリプシン、キモトリブシン、リシルエンドべプチダーゼ、プロテ インキナーゼ、ダルコシダーゼなどが用いられる。
[0065] また、本発明は、本発明のスクリーニング方法により得られるァゴニスト活性を有す る改変抗体、および本発明の製造方法によって製造された改変抗体を提供するもの である。
さらに本発明のスクリーニング方法又は製造方法は、ァゴニスト活性を有する抗体 のスクリーニング又は製造のみならず、中和活性、細胞傷害活性、結合活性、アンタ ゴニスト活性、酵素活性などの他の活性を有する抗体のスクリーニング又は製造に用 いることも可能である。
なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に 組み入れられる。 実施例
[0066] 以下、実施例に基づいて本発明を更に具体的に説明する。
[0067] 〔実施例 1〕 抗ヒト Mpl抗体の作製
1.1 Mpl発現 BaF3細胞株の榭立
TPO依存増殖性細胞株を得るために、全長 Mpl遺伝子を発現する BaF3細胞株の 榭立を行った。全長ヒト Mpl cDNA (Palaciosら、 Cell 1985 ;41 : 727-734)
(GenBank#NM— 005373)を PCRにより増幅し、 pCHOI(Hirataら、 FEBS Letter 1994; 356 : 244- 248)の DHFR遺伝子発現部位を除去し、 HEF- VH- l(Satoら、 Mol Immunol. 1994 ;31 : 371-381)の Neomycin而性遺伝子発現部位を挿入した発現べクタ 一 PCOS2にクロー-ングし、 pCOS2- hMplfollを構築した。
[0068] 作製した各ベクター (20 μ g)を PBSに懸濁した BaF3細胞 (lxl07cells/mL)に混合し、 Gene Pulserキュベットにカロえ、 Gene Pulser II (Bio— Rad社製)を用いて 0.33kV, 950 ^ FDの容量でパルスをカ卩えた。エレクト口ポーレーシヨン処理により遺伝子導入した BaF3細胞を Ing/mLマウスインターロイキン 3 (以下、 mIL- 3、 Peprotech社製）、 500 g/mL Geneticin(Invitrogen社製)、 10% FBS(Invitrogen社製)を含む RPMI1640培地（ Invitrogen社製）に加えて選抜し、ヒト Mpl発現 BaF3細胞株（以下、 BaF3-human Mpl) を榭立した。選抜後は、 Ing/mL rhTPO(R&D社製)、 10% FBSを含む RPMI1640培地を 用いて培養、維持した。
[0069] 1.2 Mpl発現 CHO細胞株の榭立
Flow Cytometryを用いた結合活性評価用の細胞株を得るために、全長 Mpl遺伝子 を発現する CHO細胞株の榭立を行った。はじめに、 pCXN2(Niwaら、 Gene 1991 ; 108 ： 193-199)の Hindlll部位に pCHOIの DHFR遺伝子発現部位を挿入して、発現べクタ 一 PCXND3を作製した。 pCOS2- hMplfoll、 pCOS2- monkeyMplfollおよび
pCOS2- mouseMpllUllを铸型にして、 His- tag配列を含む Primerを用いて PCRにより増 幅した各 Mpl遺伝子を pCXND3にクロー-ングし、 pCXND3-hMpH"Iisおよび pCXND3- monkey Mp卜 Hisを構築した。
[0070] 作製した各ベクター (25 μ g)を PBSに懸濁した CHO- DG44細胞 (lxl07cells/mL)に 混合し、 Gene Pulserキュベットに加え、 Gene Pulser II (Bio- Rad社製)を用いて 1.5kV, 25 μ FDの容量でパルスをカ卩えた。エレクト口ポーレーシヨン処理により遺伝子導入し た CHO細胞を 500 μ g/mL Geneticin、 lxHT (Invitrogen社製)を含む CHO- S- SFMII 培地 (Invitrogen社製)に加えて選抜し、ヒト Mpl発現 CHO細胞株（以下、 CHO-human Mpl)およびサル Mpl発現 CHO細胞株（以下、 CHO- monkey Mpl)を榭立した。
[0071] 1.3 可溶型ヒト Mplタンパク質の調製
可溶型ヒト Mplタンパク質を調製するため、昆虫細胞 S19細胞で分泌産生する発現 系を以下のように構築した。
[0072] ヒト Mplの細胞外領域（Gln26力 Trp491)の下流に FLAGタグを付カ卩した遺伝子を 作製し、 pBACSurf- 1 Transfer Plasmid (Novagen社製）の Pstl- Smal部位に挿入し、 pBACSurfl- hMp卜 FLAGを作製した。続いて、 Bac- N- Blue Transfection Kit ( Invitrogen)を用いて、 4 gの pBACSurfl- hMpト FLAGを S19細胞に導入した。培養 3 日後に培養上清を回収し、プラークアツセィにより組換えウィルスを単離した。ウィル スストックを調製後に S19細胞に感染させて培養上清を回収した。
[0073] 得られた培養上清を用いて、以下のように可溶型ヒト Mplタンパク質を精製した。培 養上清を Q Sepharose Fast Flow (Amersham Biosciences社製)に吸着させた後に、 50mM Na- Phosphate Buffer, 0.01%(v/v) Tween20, 500mM NaCl (pH 7.2)を用いて溶 出した。溶出液を FLAG M2 - Agarose (SIGMA-ALDRICH社製)に吸着させた後に、 lOOmM Glycine- HC1, 0.01%(v/v) Tween20 (pH 3.5)を用いて溶出した。溶出後、直ち に 1M Tris-Cl (pH8.0)により中和し、 PD- 10 column (Amersham Biosciences社製)を 用いて、 PBS(-), 0.01% (v/v) Tween20に置換を行った。精製した可溶型 Mplタンパク 質を shMp卜 FLAGと称する。
[0074] 1.4 ヒト MpHgG Fc融合タンパク質の調製
ヒト MpHgG Fc融合タンパク質遺伝子は Bennettらの方法 (Bennettら、 J.Biol.Chem. 1991 ;266 : 23060-23067)に従って作製した。ヒト Mplの細胞外領域 (Gln26から Trp491) をコードする塩基配列をヒト IgG- γ 1の Fc領域 (Asp216よりの下流の領域）をコードす る塩基配列に連結し、連結部に Fusion Linkerとして BstEII配列（アミノ酸 VaKThr)を 付加した。シグナル配列は、ヒト IgG H鎖可変領域のシグナルペプチド 19アミノ酸を使 用した。得られたヒト MpHgG Fc融合タンパク質遺伝子を pCXND3にクローユングし、 pCXND3- hMp卜 Fcを構築した。
[0075] 作製した各ベクター (25 μ g)を PBSに懸濁した CHO- DG44細胞 (lxl07cells/mL)に 混合し、 Gene Pulserキュベットに加え、 Gene Pulser II (Bio- Rad社製)を用いて 1.5kV, 25 μ FDの容量でパルスをカ卩えた。エレクト口ポーレーシヨン処理により遺伝子導入し た CHO細胞を 500 g/mL Geneticin, ΙχΗΤを含む CHO- S- SFMII培地に加えて選抜 し、 shMPL- Fc発現 CHO細胞株（CHO- hMp卜 Fc)を榭立した。
[0076] 得られた培養上清を用いて、以下のようにヒト MpHgG Fc融合タンパク質を精製し た。培養上清を Q Sepharose Fast Flow (Amersham Biosciences社製)に吸着させた後 に、 50mM Na- Phosphate Buffer, 0.01%(v/v) Tween20, 1M NaCl (pH 7.6)を用いて溶 出した。溶出液を HiTrap proteinG HPカラム（Amersham Biosciences社製）に吸着さ せた後に、 0.1 M Glycine— HC1, 150 mM NaCl, 0.01%(v/v) Tween20 (pH 2.7)を用い て溶出した。溶出後、直ちに 1M Tris-Cl (pH8.0)により中和し、 PD- 10 column (Amersham Biosciences社製)を用いて、 PBS (-) , 0.01% (v/v) Tween20に置換を行つ た。精製した可溶型 Mplタンパク質を hMpト Fcと称する。
[0077] 1.5 shMp卜 FLAGの免疫およびハイプリドーマの選抜
MRL/MpJUmmCrj- lpr/lprマウス（以下、 MRL/lprマウス、 日本チヤ一ルス'リバ一よ り購入)を用いて、 8週令より免疫を開始した。初回免疫は 100 /z g/匹の shMPL-FLAG にフロイント完全アジュバント（H37 Ra、ベタトン'ディッキンソン社製）をカ卩え、ェマル ジョン化したものを皮下に投与した。追加免疫は 50 g/匹の shMPL-FLAGにフロイン ト不完全アジュバント（ベタトン'ディッキンソン社製）を加え、ェマルジヨン化したものを 皮下に投与した合計 6回免疫を行ったマウス 3匹に対し、 g/匹の shMPL-FLAG を尾静脈内投与することにより最終免疫を行った。マウスミエローマ細胞
P3-X63Ag8Ul (P3U1、 ATCCより購入）とマウス脾臓細胞を混合し、 Polyethylene Glycol 1500 (Roche Diagnostics社製）をカ卩えながら混合することにより細胞融合を行 つた。翌日より HAT培地を用いて選抜を行 、、培養上清を用いて shMp卜 FLAGまた は hMpト Fcを固相化したィムノプレートを用いた ELISAおよび BaF3-hMplを用いた細 胞増殖活性を指標としたスクリーニングを実施した。陽性クローンについて、限界希 釈法によりモノクローンィ匕した後に、拡大培養を行い、培養上清を回収した。 [0078] 1.6 抗ヒト Mpl抗体の解析
抗体濃度はャギ抗マウス IgG (gamma) (ZYMED社製)とアルカリフォスファターゼ - ャギ抗マウス IgG (gammaXZYMED社製)を用いたマウス IgGサンドイッチ ELISAを行い 、 Isotypeの等しい巿販抗体をスタンダードにして、 GraphPad Prism (GraphPad Software, USA)を用いて検量線を作成し、抗体濃度の換算を行った。
[0079] 抗体のアイソタイプは、アイソタイプ特異的な二次抗体を用いた抗原依存的 ELISA にて決定した。 hMp卜 Fcを 1 μ g/mLとなるように coating buffer (O.lmM NaHCO
3
(pH9.6), 0.02%(w/v) NaN )で希釈したものを加え、 4°Cにてー晚反応し、コーティング
3
した。 Diluent buffer (50mM Tris- HCl(pH8.1), ImM MgCl , 150mM NaCl, 0.05%(v/v)
2
Tween20, 0.02%(w/v) NaN , l%(w/v) BSA)にてブロッキング処理を行った後、ハイブ
3
リドーマの培養上清をカ卩え、室温で 1時間放置した。 Rinse buffer (0.05%(v/v) Tween20, PBS)にて洗浄した後、 Alkaline phosphatase標識したアイソタイプ特異的二 次抗体を加え、室温で 1時間放置した。発色は SIGMA104(SIGMA-ALDRICH社製)を lmg/mLとなるように Substrate Buffer (50mM NaHCO (pH9.8), lOmM MgCl )に希釈
3 2 したものを用い、 405nmの吸光度を Benchmark Plus (BioRad社製）にて測定した。
[0080] shMp卜 FLAGおよび hMPL-Fcに対する結合活性は、 ELISAにより評価した。精製し た shMp卜 FLAGおよび hMPL- Fcを 1 μ g/mLになるようにコーティングし、 Diluent bufferにてブロッキング処理を行った。ハイプリドーマの培養上清をカ卩え、室温で 1時 間放置した後、 Alkaline Phosphatase標識した抗マウス IgG抗体 (Zymed社製）を加え、 上記方法と同様に発色を行った。室温で 1時間発色させた後に 405應の吸光度を測 定し、 GraphPad Prismを用いて EC 値を算出した。
50
[0081] CHO- human Mpほたは CHO- monkey Mplを回収し、 lxl06cells/mLになるように FACS Buffer (1% FBS/ PBS)に懸濁した。 100 L/wellとなるように Multiscreen (Millipore社製)に分注し、遠心操作にて培養上清を除去した。 5 g/mLになるように 希釈した培養上清を加え、氷上にて 30分間反応させた。細胞を FACS bufferにて 1回 洗浄し、 FITC標識抗マウス IgG抗体（Beckman Coulter社製）を添カ卩し、氷上にて 30分 間反応させた。反応後、 500rpmで 1分間遠心し、上清を除き、 FACS Buffer 400 μしに 懸濁し、 EPICS ELITE ESP (Beckman Coulter)を用いてフローサイトメトリーを行った。 前方散乱光（forward scatter)及び側方散乱光（side scatter)のヒストグラムにて生細 胞集団にゲートを設定した。
[0082] Mp卜 Fcを固相化したプレートを用いた ELISAおよび CHO- human Mpl,
CHO-monkey Mplを用いた Flow Cytometryによる結合活性評価により、 Mplに結合 するマウスモノクローナル抗体 VA130, VB16, VB157を取得した。
[0083] 1.7 抗ヒト Mpl抗体の精製
ノ、イブリドーマの培養上清を用いて、以下のように抗ヒト Mpl抗体を精製した。培養 上清を HiTrap proteinG HPカラム（Amersham Biosciences社製）に吸着させた後に、 0.1 M Glycine- HCl (pH 2.7)を用いて溶出した。溶出後、 1M Tris- CI (pH9.0)により直 ちに中和し、 PBSで一昼夜透析を行い、バッファー置換を行った。
[0084] 〔実施例 2〕 抗ヒト Mpl—本鎖抗体の作製
取得した抗ヒト Mpl抗体の中で、結合活性が高かった 3種類の抗体について、遺伝 子工学的手法により一本鎖抗体の発現系を構築した。以下に抗ヒト Mpl抗体 VA130 の一本鎖抗体作製例について示す。
2.1 抗ヒト Mpl抗体可変領域のクローニング
抗ヒト Mpl抗体を産生するハイブリドーマより抽出した Total RNAを用いて、 RT- PCR 法によって増幅した。 Total RNAは、 RNeasy Plant Mini Kits (QIAGEN社製）を用いて lxlO7細胞のハイプリドーマより抽出した。
[0085] 1 μ gの Total RNAを使用して、 SMART RACE cDNA Amplification Kit (
CLONTECH社製)を用いて、マウス IgGl定常領域配列に相補的な合成オリゴヌタレ ォチド MHC-IgGl (配列番号： 1)またはマウス κ鎖定常領域塩基配列に相補的な合 成オリゴヌクレオチド kappa (配列番号： 2)を用いて、 5 '末端側遺伝子断片を増幅した 。逆転写反応は 42°Cで 1時間 30分間反応させた。
[0086] PCR反応溶液 (50 μ L)の組成を次に示す。
5 μ Lの 10 X Advantage 2 PCR Buffer,
5 μ Lの 10 X Universal Primer A Mix、
0.2mM dNTPs (dATP, dGTP, dCTP, dTTP)、
1 μ Lの Advantage 2 Polymerase Mix (以上の成分は!、ずれも CLONTECH社製）
2.5 Lの逆転写反応産物、
1 Opmoleの合成オリゴヌクレオチド MHC-IgGlまたは kappa
[0087] また反応温度条件は次のとおりである。
94°Cの初期温度にて 30秒間、
94°C/5秒間、 72°C/3分間のサイクルを 5回反復
94°C/5秒間、 70°C/10秒間、 72°C/3分間のサイクルを 5回反復、
94°C/5秒間、 68°C/10秒間、 72°C/3分間のサイクルを 25回反復
最後に反応産物を 72°Cで 7分間加熱した。
[0088] PCR産物は QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN社製）を用いて、ァガロースゲル 力 精製した後、 pGEM- T Easyベクター（Promega社製）へクローユングした。さらに、 ABI 3700 DNA Analyzer (Perkin Elmer社製)を用いて塩基配列を決定した。クロー- ングした VA130 H鎖可変領域（以下、 VA130-VH)の塩基配列を配列番号： 3、ァミノ 酸配列を配列番号: 4、および L鎖可変領域 (以下、 VA130-VL)の塩基配列を配列 番号： 5、アミノ酸配列を配列番号: 6に示す。
[0089] 2.2 抗ヒト Mpl抗体 Diabody発現ベクターの作製
5アミノ酸からなるリンカ一配列を用いた VA130—本鎖 Fv (以下、 VA130 Diabody)を コードする遺伝子は、 VA130- VHをコードする遺伝子の 3'末端および VA130- VLをコ ードする遺伝子の 5'末端に (Gly Ser)力も成るリンカ
4 1 一をコードする塩基配列を付カロ させた遺伝子について、それぞれ PCR法を用いて増幅し、連結することにより構築し た。
[0090] VA130-VHの前方プライマー VA264-feco (配列番号： 7)は、 EcoRI部位を有するよ うに設計し、 VA130- VHの後方プライマー VA264- rL5 (配列番号： 8)は、 VA130- VH の C末端をコードする DNAにハイブリダィズし、かつ（Gly Ser)力 成るリンカ
4 1 一をコー ドする塩基配列ならびに VA130-VLの N末端をコードする DNAにハイブリダィズする 塩基配列を有するように設計した。 VA130-VLの前方プライマー VA264-1L5 (配列番 号： 9)は、 VA130-VLの N末端をコードする塩基配列ならびに（Gly Ser)力も成るリン
4 1
カーをコードする塩基配列、 VA130-VHの C末端をコードする塩基配列を有するよう に設計した。 VA130-VLの後方プライマー VA264-rflag (配列番号： 10)は、
VA130- VLの C末端をコードする DNAにハイブリダィズし、かつ FLAGタグ
(AspTyrLysAspAsp AspAspLysZ配列番号： 11)をコードする塩基配列を有し、さらに Notl部位を有するように設計した。
[0091] 第一 PCRにおいて、 VA130- VHおよびリンカ一配列と VA130- VLおよびリンカ一配 列を含む 2つの PCR反応物を以下のように合成した。
PCR反応溶液 (50 L)の組成を次に示す。
5 ;z L 10 X PCR Bufferゝ
0.4mM dNTPs (dATP, dGTP, dCTP, dTTP)、
2.5ユニットの DNAポリメラーゼ TaKaRa Ex Taq
(以上の成分は!、ずれも宝酒造社製)、
lOngの VA130- VHまたは VA130- VL遺伝子を含む pGEM- T Easyベクター、 lOpmoleの合成オリゴヌクレオチド VA264- feco、 VA264- rL5または VA264- 1L5、 VA264- rflag
[0092] また反応温度条件は次のとおりである。
94°Cの初期温度にて 30秒間、
94°C/15秒間、 72°C/2分間のサイクルを 5回反復
94°C/15秒間、 70°C/2分間のサイクルを 5回反復、
94°C/ 15秒間、 68°C/2分間のサイクルを 28回反復
最後に反応産物を 72°Cで 5分間加熱した。
[0093] 約 400bpの PCR産物を QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN社製）を用いて、ァガ ロースゲル力も精製した後、各 PCR産物の一部を用いて以下のように第二 PCRを行 つた o
PCR反応溶液 (50 L)の組成を次に示す。
5 ;z L 10 X PCR Bufferゝ
0.4mM dNTPs (dATP, dGTP, dCTP, dTTP)、
2.5ユニットの DNAポリメラーゼ TaKaRa Ex Taq
(以上の成分は!、ずれも宝酒造社製)、 1 μ Lの第一 PCR産物（2種類)、
lOpmoleの合成オリゴヌクレオチド VA264- feco、 VA264- rflag
[0094] また反応温度条件は次のとおりである。
94°Cの初期温度にて 30秒間、
94°C/15秒間、 72°C/2分間のサイクルを 5回反復
94°C/15秒間、 70°C/2分間のサイクルを 5回反復、
94°C/ 15秒間、 68°C/2分間のサイクルを 28回反復
最後に反応産物を 72°Cで 5分間加熱した。
[0095] 約 800bpの PCR産物を QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN社製）を用いて、ァガ ロースゲル力も精製した後、制限酵素 EcoRI (宝酒造社製)および制限酵素 Notl (宝 酒造社製）で消化した後に、 QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN社製）を用いて 精製し、 pCXND3にクローユングし、 pCXND3- VA130 dbを作製した。
[0096] 2.3 抗ヒト Mpl抗体 sc(Fv)2発現ベクターの作製
VA130由来の 2つの H鎖可変領域および 2つの L鎖可変領域を含む改変抗体
[sc(Fv)2]を発現するプラスミドを作製するために、前述の pCXND3-VA130 dbを用い て以下のように PCR法により修飾した。 sc(Fv)2遺伝子の構築過程について、図 1に示 した。
[0097] はじめに、 VA130-VHをコードする遺伝子の 3'末端および VA130-VLをコードする 遺伝子の 5'末端に 15アミノ酸力も成るリンカ一（Gly Ser)をコードする塩基配列を付
4 3
カロさせた遺伝子について、それぞれ PCR法を用いて増幅し、連結することにより構築 した。この構築過程において、 2種類のプライマーを新たに設計した。 VA130-VHの 後方プライマー sc-rL15 (プライマー B,配列番号： 12)は、 VA130-VHの C末端をコー ドする DNAにハイブリダィズし、かつ（Glv Ser)から成るリンカ一をコードする塩基配
4 3
列ならびに VA130-VLの N末端をコードする DNAにハイブリダィズする塩基配列を有 するように設計した。 VA130-VLの前方プライマー sc-!L15 (プライマー C,配列番号： 13)は、 VA130-VLの N末端をコードする塩基配列ならびに（Gly Ser)から成るリンカ
4 3
一をコードする塩基配列、 VA130-VHの C末端をコードする塩基配列を有するように
5X十し 7 。 [0098] 第一 PCRにおいて、 VA130- VHおよびリンカ一配列と VA130- VLおよびリンカ一配 列を含む 2つの PCR反応物を以下のように合成した。
PCR反応溶液 (50 L)の組成を次に示す。
5 ;z L 10 X PCR Bufferゝ
0.4mM dNTPs (dATP, dGTP, dCTP, dTTP)、
2.5ユニットの DNAポリメラーゼ TaKaRa Ex Taq
(以上の成分は!、ずれも宝酒造社製)、
10ngの pCXND3— VA130 db、
lOpmoleの合成オリゴヌクレオチド VA264-feco (プライマー A)、 sc-rL15または sc- 1L15、 VA264- rflag (プライマー D)
[0099] また反応温度条件は次のとおりである。
94°Cの初期温度にて 30秒間、
94°C/15秒間、 72°C/2分間のサイクルを 5回反復
94°C/15秒間、 70°C/2分間のサイクルを 5回反復、
94°C/ 15秒間、 68°C/2分間のサイクルを 28回反復
最後に反応産物を 72°Cで 5分間加熱した。
[0100] 約 400bpの PCR産物を QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN社製）を用いて、ァガ ロースゲル力も精製した後、各 PCR産物の一部を用いて以下のように第二 PCRを行 つた o
PCR反応溶液 (50 L)の組成を次に示す。
5 ;z L 10 X PCR Bufferゝ
0.4mM dNTPs (dATP, dGTP, dCTP, dTTP)、
2.5ユニットの DNAポリメラーゼ TaKaRa Ex Taq
(以上の成分は!、ずれも宝酒造社製)、
1 μ Lの第一 PCR産物（2種類)、
lOpmoleの合成オリゴヌクレオチド VA264- feco、 VA264- rflag
[0101] また反応温度条件は次のとおりである。
94°Cの初期温度にて 30秒間、 94°C/15秒間、 72°C/2分間のサイクルを 5回反復
94°C/15秒間、 70°C/2分間のサイクルを 5回反復、
94°C/ 15秒間、 68°C/2分間のサイクルを 28回反復
最後に反応産物を 72°Cで 5分間加熱した。
[0102] 約 800bpの PCR産物を QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN社製）を用いて、ァガ ロースゲル力も精製した後、制限酵素 EcoRI (宝酒造社製)および制限酵素 Notl (宝 酒造社製）で消化した後に、 QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN社製）を用いて 精製し、 pBacPAK9(CLONTECH社製)にクローユングし、 pBacPAK9- scVA130を作製 した。
[0103] 次に、 pBacPAK9-scVA130の PvuII部位に挿入する断片を作製した。すなわち N末 端が欠けた VA130-VHと VA130-VLを（Gly Ser)力 成るリンカ一で連結したアミノ酸
4 3
をコードする遺伝子を、さらに VA130-VHの N末端をコードする遺伝子と（Gly Ser)
4 3 ら成るリンカ一をコードする塩基配列で連結する断片で、両末端が PvuII認識配列と なる断片である。 2種類のプライマーを新たに設計し、 PCR法を用いて、この断片を作 製した。目的断片の前方プライマー Fv2-f (プライマー E,配列番号：14)は、 5'末端 に PvuII部位を有し、 VA130-VHの 5'末端側の配列を持つように設計した。目的断片 の後方プライマー Fv2-r (プライマー F,配列番号： 15)は、 VA130-VLの C末端をコー ドする DNAにハイブリダィズし、かつ（Glv Ser)から成るリンカ一をコードする塩基配
4 3
列ならびに VA130-VHの N末端をコードする DNAにハイブリダィズする塩基配列、さら に PvuII部位を有するように設計した。 pBacPAK9_scVA130を铸型にして、以下のよう に PCRを行った。
[0104] PCR反応溶液 (50 IX L)の組成を次に示す。
5 ;z L 10 X PCR Bufferゝ
0.4mM dNTPs (dATP, dGTP, dCTP, dTTP)、
2.5ユニットの DNAポリメラーゼ TaKaRa Ex Taq
(以上の成分は!、ずれも宝酒造社製)、
10 μ gの pBacPAK9— scVA130、
lOpmoleの合成オリゴヌクレオチド Fv2-f、 Fv2-r [0105] また反応温度条件は次のとおりである。
94°Cの初期温度にて 30秒間、
94°C/15秒間、 72°C/2分間のサイクルを 5回反復
94°C/15秒間、 70°C/2分間のサイクルを 5回反復、
94°C/ 15秒間、 68°C/2分間のサイクルを 28回反復
最後に反応産物を 72°Cで 5分間加熱した。
[0106] 約 800bpの PCR産物を QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN社製）を用いて、ァガ ロースゲルから精製した後、 pGEM- T Easyベクター（Promega社製）へクローユングし た。塩基配列の決定後、制限酵素 PvuII (宝酒造社製)で消化した後に、 目的断片を 回収した。 pBacPAK9_scVA130を制限酵素 PvuII (宝酒造社製）で消化した後に、回 収した断片を連結し、 PBacPAK9-VA130 sc(Fv)2を作製した。作製したベクターを制 限酵素 EcoRI (宝酒造社製)および制限酵素 Notl (宝酒造社製)で消化した後に、 QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN社製）を用いて、約 1800bpの断片をァガロー スゲルから精製し、発現ベクター pCXND3にクローユングし、 pCXND3- VA130 sc (Fv)2を作製した。
[0107] 2.4 動物細胞を用いた抗ヒト Mpl—本鎖抗体の発現
CHO-DG44細胞を用いた一本鎖抗体の安定発現細胞株の作製は次のようにして 行った。 Gene Pulserll (BioRad社製）を用いたエレクト口ポレーシヨン法により遺伝子 導入した。発現ベクター (25 μ g)と PBSに懸濁した CHO- DG44細胞（1 X 107細胞/ mL )の 0.75mLを混合したものを氷上で 10分間冷却し、キュベットに移した後に 1.5kV、 25 FDの容量にてパルスを与えた。室温にて 10分間の回復期間の後、エレクトロボレ ーシヨン処理された細胞を、 500 μ g/mL Geneticin (Invitrogen社製）を含む
CHO-S-SFMII培地（Invitrogen社製）に加えて選抜し、発現 CHO細胞株を榭立した。 VA130 sc(Fv)2は、この方法で安定発現細胞株およびその培養上清を調製した。
[0108] COS7細胞を用いた一本鎖抗体の一過性発現は次のようにして行った。発現べクタ 一 (10 μ g)と PBSに懸濁した CHO- DG44細胞（1 X 107細胞/ mL)の 0.75mLを混合した ものを氷上で 10分間冷却し、キュベットに移した後に 1.5kV、 25 μ FDの容量にてパル スを与えた。室温にて 10分間の回復期間の後、エレクト口ポレーシヨン処理された細 胞を、 10% FBSを含む DMEM培地（Invitrogen社製）にカロえ、ー晚培養した後に、 PBS で洗浄後に CHO-S-SFMII培地を加えて約 3日間培養した。 VA130 Diabodyは、この 方法で培養上清を調製した。
[0109] 2.5 培養上清中の抗ヒト Mpl—本鎖抗体の定量
COS細胞に一過性発現させた抗ヒト Mpl—本鎖抗体の培養上清中の濃度は、表面 プラズモン共鳴を利用して測定した。すなわち BIAcore2000(Biacore社製)に Sensor Chip CM5 (Biacore社製）をセットし、 ANTI- FLAG M2 Monoclonal Antibody
(SIGMA-ALDRICH社製)を結合した。流速 5mL/secで適濃度のサンプルを流し、 50mMジェチルァミンを流して結合した抗体を解離させた。サンプルを流したときの質 量変化を測定し、標準品の質量変化に基づいて作成した検量線を用いて、濃度を 算出した。 Diabodyについての標準品は、 dbl2E10(WO 02/33072および WO
02/33073参照)を使用し、 sc(Fv)2についての標準品は同じ遺伝子構造を持つ 12E10 sc(Fv)2を使用した。
[0110] 2.6 抗 Mpl Diabodyおよび一本鎖抗体の精製
VA130 Diabody発現 COS7細胞あるいは CHO細胞の培養上清を、 50 mM Tris-HCl(pH7.4), 150 mM NaCl, 0.05% Tween20で平衡化した Anti- Flag M2 Affinity Gel (SIGMA- ALDRICH社製)カラムに吸着させ、 100 mM Glycine- HCl(pH 3.5)で溶 出させた。溶出画分は、直ちに 1M Tris-HCl (pH8.0)で中和を行い、 HiLoad 26/60 Superdex200pg (Amersham- Bioscience社製)カラムを用いてゲルろ過クロマトグラフィ 一を行った。ゲルろ過クロマトグラフィーのバッファ一は、 PBS、 0.01% Tween20を使用 した。
[0111] VA130 sc(Fv)2発現 COS7細胞あるいは CHO細胞の培養上清を Diabody精製と同 一条件で精製を行った。各精製ステップにおいて、 Diabodyおよび sc(Fv)2の確認は、 SDS- PAGEおよび抗 Flag抗体（SIGMA- ALDLICH社）を用いた Western Blottingを用 いて行った。
それぞれ、分取したピーク画分を Laemliの方法に準じて電気泳動し、クマシ一ブリリ アントブルーで染色した結果、 Diabodyでは、見かけ上の分子量約 28kDaに、また sc(Fv)2では、見かけ上の分子量約 58kDaに、それぞれ単一のバンドが検出された。 [0112] 2.7 Flow Cytometryによる抗ヒト Mpl—本鎖抗体の結合活性の評価
CH0— human Mpl、 CHO— monkey Mplおよび CHO— mouse Mplを回収し、 lxlO6 cells/mLになるように FACS Buffer (1% FBS/ PBS)に懸濁した。 100 L/wellとなるよう に Multiscreen - HV Filter Plates (Millipore社製）に分注し、遠心操作にて上清を除 去した。適濃度の Diabodyまたは sc(Fv)2を加え、氷上にて 30分間反応させた。細胞を 200 μ Lの FACS bufferにて 1回洗浄し、 10 μ g/mLの ΑΝΉ- FLAG M2 Monoclonal Antibody (SIGMA-ALDRICH社製）を添加し、氷上にて 30分間反応させた。
[0113] 次に 200 μ Lの FACS bufferにて細胞を 1回洗浄した後、 100倍希釈した FITC標識抗 マウス IgG抗体 (Beckman Coulter社製）を添カ卩し、氷上にて 30分間反応させた。最後 に遠'、し上清を除き、 FACS Buffer 400 μ Lに懸淘し、 EPICS ELITE ESP (Beckman Coulter社)を用いて Flow Cytometryに供した。前方散乱光（forward scatter)及び側 方散乱光 (side scatter)のヒストグラムにて生細胞集団にゲートを設定した。
[0114] 精製した VA130 sc(Fv)2を用いて、各種 Mplを発現させた CHO細胞に対する結合活 性を評価した結果を図 2に示す。宿主細胞である CHOに対しては結合活性を示さず 、 CHO-human Mplおよび CHO- monkey Mplに特異的に結合することが確認された。 この結合活性の傾向は、 VA130 IgGと変わらないことから、低分子化により抗体の結 合部位は変化して 、な 、ことが推測された。
[0115] 2.8 ELISAによる抗ヒト Mpl—本鎖抗体の結合活性の評価
ELISAにより抗ヒト Mpl—本鎖抗体の hMPL- Fcに対する結合活性を評価した。精製 した hMPL- Fcを 0.5 μ g/mLになるようにコーティングし、 Diluent bufferにてブロッキン グ処理を行った。適濃度に希釈した VA130精製品を加え、室温で 1時間放置した後、 Rinse bufferにて洗浄した後、 1000倍希釈した ANTI- FLAG M2 Monoclonal Antibody (SIGMA-ALDRICH社製)をカ卩え、室温で 1時間反応させた。さらに Rinse bufferにて 洗浄した後、 1000倍希釈した Alkaline Phosphatase標識した抗マウス IgG抗体（Zymed 社製)をカ卩え、室温で 1時間放置した。 Rinse bufferにて洗浄した後、発色は
SIGMA104(SIGMA- ALDRICH社製)を lmg/mLとなるように Substrate)に希釈したもの を用い、室温で 15分間発色させた後に 405nmの吸光度を Benchmark Plusにて測定し [0116] 2.9 抗ヒト Mpl—本鎖抗体の TPO様ァゴニスト活性の評価
ΤΡ0依存性増殖を示す BaF3-human Mplを用いて TPO用ァゴ-スト活性を評価した 。各細胞を 1% Fetal Bovine Serum(Invitrogen社製)を含む RPMI1640 (Invitrogen社製) で 2回洗浄した後、 4xl05cells/mLとなるように 10% Fetal Bovine Serumを含む
RPMI1640に懸濁し、 60 μ L/wellで 96well plateに分注した。 rhTPO (R&D社製)、 COS7培養上清または精製品の濃度を振り、各 wellに 40 Lカ卩え、 37°C、 5%CO条件
2 下で、 24時間培養した。 10 L/wellで WST- 8試薬（Cell Count Reagent SF、ナカライ テスタ社製）をカ卩え、直後に Benchmark Plusを用いて 450 nmの吸光度 (対照 655nm) を測定し、 2時間培養後に、再度 450 nmの吸光度 (対照 655nm)を測定した。 WST-8試 薬は生細胞数に応じて 450應の発色反応を呈することから、 2時間の吸光度変化を 指標に TPO様ァゴ-スト活性を評価した。また、 GraphPad Prismを用いて EC 値を算
50 出した。
[0117] 精製した VA130 IgG、 VA130 Diabodyおよび VA130 sc(Fv)2を使用して、
BaF3-human Mpl、を用いて TPO様ァゴ-スト活性を評価した結果を図 3に示す。
[0118] VA130 IgGは、全くァゴ-スト活性が見られない（BaF3- human Mpl EC ： MOOnM)
50
のに対して、低分子化抗体に変換することにより、 VA130 Diabodyおよび VA130 sc(Fv)2ではァゴ-スト活性（BaF3-human Mpl EC ：それぞれ 222pM, 1023pM)が検
50
出された。また、 VA130, VB16, VB157の活性評価について表 1に示した。 VB16, VB157も VA130と同様に IgGで強い結合活性を示し、ァゴ-スト活性は検出されない ものの、低分子化抗体に変換することにより、ァゴ-スト活性が認められる性質を持つ ことが分力つた。
[0119] この結果から、ァゴ-スト抗体の創製において、ハイプリドーマが産生する IgGを用 V、たァゴ-スト活性を指標にしたスクリーニングは重要ではなぐ受容体に結合する 抗体を低分子化抗体に変換することによりァゴニスト抗体をスクリーニングすることが 重要であるといえる。
[0120] 〔表 1〕
VA130, VB16, VB157の活性結果
[表 1] 抗体名 igG Diabody sc(Fv)2
結合活性 結合活性 アコ'二スト活性 結合活性 アコ'二スト活性 hMpl-Fcを用 hMphFcを用 BaF-h plを hMphFcを用 BaF-hMplを いた ELISA いた ELISA 用いた解析 いた ELISA 用いた解析
VA130 0.38nM 0.11 nM 222pM 0.27nM 1023pM
VB16 0.15nM N . 190pM NT. 95pM
VB157 0.15M NT. 465pM NT. NT.
N.T.: Not tested
産業上の利用可能性
[0121] 全長抗体を改変する前にァゴ-スト活性を測定し、その時点でァゴ-スト活性がな い抗体を除外するという従来のスクリーニング方法では、改変前にァゴ-スト活性を 有していないものは、その時点で除外され、活性のあるもののみが改変されていた。 その場合には、低分子に改変することによって初めてァゴ-スト活性を有するように なる抗体を見出すことは不可能であるため、結果として、そのような抗体由来の低分 子化抗体も選択されることはな力つた。本発明者らは、それらの完全長ではァゴニス ト活性が弱いか、あるいはほとんど検出されないものでも、低分子化することによって 、活性を上昇させることが可能であることを見出した。
[0122] 一方、当方法によるスクリーニング法であれば、抗体の改変前にはァゴニスト活性を 指標として選択を行わないため、全長ではァゴ-スト活性が検出されないか、あるい は活性が弱い抗体も除外されない。従って、従来の方法では見落とされていた潜在 的に活性上昇の能力を持つ抗体を見出すことが可能となる。

Claims

請求の範囲
[I] 以下の工程を含む、ァゴ-スト抗体のスクリーニング方法。
(a) 被験抗体の結合活性を測定し、結合活性を有する抗体を選択する工程、
(b) (a)で選択された抗体を改変する工程、
(c) (b)の改変抗体のァゴニスト活性を測定し、ァゴニスト活性を有する改変抗体を選 択する工程
[2] 改変抗体が低分子化抗体であることを特徴とする、請求項 1に記載のスクリーニン グ方法。
[3] 低分子化抗体が sc(Fv)2であることを特徴とする、請求項 2に記載のスクリーニング 方法。
[4] 被験抗体を改変する前に、ァゴ-スト活性を測定しな 、ことを特徴とする、請求項 1 一 3のいずれかに記載のスクリーニング方法。
[5] 抗体が細胞膜上に発現するタンパク質に対する抗体であることを特徴とする、請求 項 1一 4のいずれかに記載のスクリーニング方法。
[6] 請求項 1一 5のいずれかに記載の方法により得られた抗体。
[7] 以下の工程を含む、ァゴニスト活性を有する抗体の製造方法。
(a) 抗体の結合活性を測定し、結合活性を有する抗体を選択する工程、
(b) (a)で選択された抗体を改変する工程、
(c) (b)の改変抗体のァゴ-スト活性を測定し、ァゴニスト活性を有する抗体を選択す る工程、
(d) (c)で選択された抗体をコードする DNAを含むベクターを宿主細胞に導入するェ 程、
(e) (d)の宿主細胞を培養する工程
[8] 改変抗体が低分子化抗体であることを特徴とする、請求項 7に記載の製造方法。
[9] 低分子化抗体が sc(Fv)2であることを特徴とする、請求項 8に記載の製造方法。
[10] 抗体を改変する前に、ァゴ-スト活性を測定しな 、ことを特徴とする、請求項 7— 9 の！、ずれかに記載の製造方法。
[II] 抗体が細胞膜上に発現するタンパク質に対する抗体であることを特徴とする、請求 項 7— 10のいずれかに記載の製造方法。
[12] 以下の工程を含むァゴ-スト抗体のスクリーニング方法であって、（a)の工程の前に 被験抗体のァゴニスト活性を測定しないことを特徴とする方法。
(a) 被験抗体を改変する工程、
(b) (a)の改変抗体のァゴニスト活性を測定し、ァゴニスト活性を有する改変抗体を選 択する工程
[13] 改変抗体が低分子化抗体であることを特徴とする、請求項 12に記載のスクリーニン グ方法。
[14] 低分子化抗体が sc(Fv)2であることを特徴とする、請求項 13に記載のスクリーニング 方法。
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