JPWO2006106903A1 - sc(Fv)2構造異性体 - Google Patents
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Abstract
Description
〔1〕以下の工程を含むsc(Fv)2医薬組成物の製造方法。
(a)sc(Fv)2組成物中の構造異性体を分離する工程
(b)分離された構造異性体のうち、特定の構造異性体を取得する工程
〔2〕以下の工程を含むsc(Fv)2医薬組成物の製造方法。
(a)sc(Fv)2の構造異性体の活性を比較して高活性の構造異性体をあらかじめ決定する工程
(b)sc(Fv)2組成物中の構造異性体を分離する工程
(c)工程(a)により決定された高活性の構造異性体を取得する工程
〔3〕以下の工程を含むsc(Fv)2医薬組成物の製造方法。
(a)sc(Fv)2組成物中の構造異性体の比率が好ましい値になるようにリンカーの長さを決定する工程
(b)工程(a)で決定されたリンカーの長さを有するsc(Fv)2組成物を作製する工程
(c)作製されたsc(Fv)2組成物中の構造異性体を分離する工程
(d)分離された構造異性体のうち、特定の構造異性体を取得する工程
〔4〕以下の工程を含むsc(Fv)2医薬組成物の製造方法。
(a)リンカーの長さが異なる複数のsc(Fv)2組成物を作製する工程
(b)sc(Fv)2組成物中の構造異性体の比率が好ましい値となるリンカーを有するsc(Fv)2を選択する工程
(c)工程(b)で選択されたsc(Fv)2のリンカーと同じ長さのリンカーを有するsc(Fv)2組成物を作製する工程
(d)作製されたsc(Fv)2組成物中の構造異性体を分離する工程
(e)分離された構造異性体のうち、特定の構造異性体を取得する工程
〔5〕構造異性体がsingle chain diabody型又はbivalent scFv型である〔1〕〜〔4〕のいずれかに記載の方法。
〔6〕構造異性体がアゴニスト活性を有することを特徴とする〔1〕〜〔5〕のいずれかに記載の製造方法。
〔7〕sc(Fv)2のリンカーが15アミノ酸であることを特徴とする〔1〕〜〔6〕のいずれかに記載の製造方法。
〔8〕〔1〕〜〔7〕のいずれかに記載の製造方法により作製された医薬組成物。
〔9〕sc(Fv)2組成物中の特定の構造異性体の割合が80%以上であることを特徴とする医薬組成物。
〔10〕構造異性体がsingle chain diabody型又はbivalent scFv型である〔9〕に記載の医薬組成物。
〔11〕構造異性体が受容体に結合することを特徴とする〔9〕または〔10〕に記載の医薬組成物。
〔12〕構造異性体がアゴニスト活性を有することを特徴とする〔9〕〜〔11〕のいずれかに記載の医薬組成物。
〔13〕sc(Fv)2のリンカーが15アミノ酸である〔9〕〜〔12〕のいずれかに記載の医薬組成物。
〔14〕sc(Fv)2組成物中の構造異性体の割合を変化させる工程を含む、sc(Fv)2組成物の活性を調節する方法。
〔15〕sc(Fv)2組成物中の特定の構造異性体の割合を増加させる工程を含む、sc(Fv)2組成物の活性を増加させる方法。
〔16〕以下の工程を含むsc(Fv)2組成物の活性を増加させる方法。
(a)sc(Fv)2組成物中の構造異性体を分離する工程
(b)分離された構造異性体のうち、特定の構造異性体を取得する工程
〔17〕以下の工程を含むsc(Fv)2組成物の活性を増加させる方法。
(a)sc(Fv)2の構造異性体の活性を比較して高活性の構造異性体をあらかじめ決定する工程
(b)sc(Fv)2組成物中の構造異性体を分離する工程
(c)工程(a)により決定された高活性の構造異性体を取得する工程
〔18〕以下の工程を含むsc(Fv)2組成物の活性を増加させる方法。
(a)sc(Fv)2組成物をイオン交換カラムにかける工程
(b)特定の構造異性体を除去する工程
〔19〕構造異性体がsingle chain diabody型又はbivalent scFv型である〔14〕〜〔18〕のいずれかに記載の方法。
〔20〕sc(Fv)2組成物を加熱する工程を含む、sc(Fv)2組成物中の特定の構造異性体の含有割合を増加させる方法。
〔21〕構造異性体がsingle chain diabody型又はbivalent scFv型である〔20〕に記載の方法。
〔22〕sc(Fv)2組成物を15℃〜50℃でインキュベートする工程を含む、sc(Fv)2組成物中のsingle chain diabody型の含有割合を増加させる方法。
〔23〕sc(Fv)2の重鎖可変領域と軽鎖可変領域が界面を形成しているアミノ酸残基を、電荷を有するアミノ酸残基に置換する工程を含むsc(Fv)2組成物中の特定の構造異性体の含有割合を増加させる方法。
〔24〕以下の(1)および(2)に記載のアミノ酸残基を、同種の電荷を有するアミノ酸残基に置換する工程を含む、sc(Fv)2組成物中の特定の構造異性体の含有割合を増加させる方法。
(1)sc(Fv)2の重鎖可変領域に含まれるアミノ酸残基であって、重鎖可変領域の39位に相当するアミノ酸残基
(2)sc(Fv)2の軽鎖可変領域に含まれるアミノ酸残基であって、軽鎖可変領域のアミノ酸配列における38位に相当するアミノ酸残基
〔25〕以下の(1)および(2)に記載のアミノ酸残基を、同種の電荷を有するアミノ酸残基に置換する工程を含む、sc(Fv)2組成物中の特定の構造異性体の含有割合を増加させる方法。
(1)sc(Fv)2の重鎖可変領域に含まれるアミノ酸残基であって、重鎖可変領域のアミノ酸配列における45位に相当するアミノ酸残基
(2)sc(Fv)2の軽鎖可変領域に含まれるアミノ酸残基であって、軽鎖可変領域のアミノ酸配列における44位に相当するアミノ酸残基
〔26〕以下の(1)および(2)のいずれか一方のアミノ酸残基を、電荷を有するアミノ酸残基に置換する工程を含む、sc(Fv)2組成物中の特定の構造異性体の含有割合を増加させる方法。
(1)sc(Fv)2の重鎖可変領域に含まれるアミノ酸残基であって、重鎖可変領域のアミノ酸配列における45位に相当するアミノ酸残基
(2)sc(Fv)2の軽鎖可変領域に含まれるアミノ酸残基であって、軽鎖可変領域のアミノ酸配列における44位に相当するアミノ酸残基
〔27〕sc(Fv)2の重鎖可変領域と軽鎖可変領域が界面を形成しているアミノ酸残基を、電荷を有するアミノ酸残基に置換する工程を含むsc(Fv)2組成物の活性を増加させる方法。
〔28〕以下の(1)および(2)に記載のアミノ酸残基を、同種の電荷を有するアミノ酸残基に置換する工程を含む、sc(Fv)2組成物の活性を増加させる方法。
(1)sc(Fv)2の重鎖可変領域に含まれるアミノ酸残基であって、重鎖可変領域の39位に相当するアミノ酸残基
(2)sc(Fv)2の軽鎖可変領域に含まれるアミノ酸残基であって、軽鎖可変領域のアミノ酸配列における38位に相当するアミノ酸残基
〔29〕以下の(1)および(2)に記載のアミノ酸残基を、同種の電荷を有するアミノ酸残基に置換する工程を含む、sc(Fv)2組成物中の活性を増加させる方法。
(1)sc(Fv)2の重鎖可変領域に含まれるアミノ酸残基であって、重鎖可変領域のアミノ酸配列における45位に相当するアミノ酸残基
(2)sc(Fv)2の軽鎖可変領域に含まれるアミノ酸残基であって、軽鎖可変領域のアミノ酸配列における44位に相当するアミノ酸残基
〔30〕以下の(1)および(2)のいずれか一方のアミノ酸残基を、電荷を有するアミノ酸残基に置換する工程を含む、sc(Fv)2組成物の活性を増加させる方法。
(1)sc(Fv)2の重鎖可変領域に含まれるアミノ酸残基であって、重鎖可変領域のアミノ酸配列における45位に相当するアミノ酸残基
(2)sc(Fv)2の軽鎖可変領域に含まれるアミノ酸残基であって、軽鎖可変領域のアミノ酸配列における44位に相当するアミノ酸残基
〔31〕sc(Fv)2の重鎖可変領域と軽鎖可変領域が界面を形成しているアミノ酸残基を、電荷を有するアミノ酸残基に置換する工程を含むsc(Fv)2組成物中の構造異性体の異性化反応を抑制する方法。
〔32〕以下の(1)および(2)に記載のアミノ酸残基を、同種の電荷を有するアミノ酸残基に置換する工程を含む、sc(Fv)2組成物中の構造異性体の異性化反応を抑制する方法。
(1)sc(Fv)2の重鎖可変領域に含まれるアミノ酸残基であって、重鎖可変領域の39位に相当するアミノ酸残基
(2)sc(Fv)2の軽鎖可変領域に含まれるアミノ酸残基であって、軽鎖可変領域のアミノ酸配列における38位に相当するアミノ酸残基
〔33〕以下の(1)および(2)に記載のアミノ酸残基を、同種の電荷を有するアミノ酸残基に置換する工程を含む、sc(Fv)2組成物中の構造異性体の異性化反応を抑制する方法。
(1)sc(Fv)2の重鎖可変領域に含まれるアミノ酸残基であって、重鎖可変領域のアミノ酸配列における45位に相当するアミノ酸残基
(2)sc(Fv)2の軽鎖可変領域に含まれるアミノ酸残基であって、軽鎖可変領域のアミノ酸配列における44位に相当するアミノ酸残基
〔34〕以下の(1)および(2)のいずれか一方のアミノ酸残基を、電荷を有するアミノ酸残基に置換する工程を含む、sc(Fv)2組成物中の構造異性体の異性化反応を抑制する方法。
(1)sc(Fv)2の重鎖可変領域に含まれるアミノ酸残基であって、重鎖可変領域のアミノ酸配列における45位に相当するアミノ酸残基
(2)sc(Fv)2の軽鎖可変領域に含まれるアミノ酸残基であって、軽鎖可変領域のアミノ酸配列における44位に相当するアミノ酸残基
〔35〕sc(Fv)2のリンカーの長さを調節する工程を含む、sc(Fv)2組成物中の構造異性体の割合を調節する方法。
〔36〕構造異性体がsingle chain diabody型又はbivalent scFv型である〔35〕に記載の方法。
〔37〕sc(Fv)2の両端のリンカーを0〜12アミノ酸、中央のリンカーを10〜30アミノ酸に調節する工程を含む、sc(Fv)2組成物中のsingle chain diabody型の割合を増加させる方法。
〔38〕sc(Fv)2の両端のリンカーを12〜30アミノ酸、中央のリンカーを0〜10アミノ酸に調節する工程を含む、sc(Fv)2組成物中のbivalent scFv型の割合を増加させる方法。
〔39〕sc(Fv)2の両端のリンカーを0〜12アミノ酸、中央のリンカーを0〜10アミノ酸に調節する工程を含む、single chain diabody型の含有割合が80%以上であるsc(Fv)2組成物を製造する方法。
〔40〕sc(Fv)2の両端のリンカーを12〜30アミノ酸、中央のリンカーを0〜10アミノ酸に調節する工程を含む、bivalent scFv型の含有割合が80%以上であるsc(Fv)2組成物を製造する方法。
〔41〕sc(Fv)2のリンカー又はリンカー近傍領域を切断する工程を含む、sc(Fv)2組成物中の構造異性体を分析する方法。
〔42〕酵素で処理することによりリンカー又はリンカー近傍領域を切断することを特徴とする〔41〕に記載の方法。
〔43〕構造異性体がsingle chain diabody型又はbivalent scFv型である〔41〕または〔42〕に記載の方法。
〔44〕以下の工程を含む、sc(Fv)2組成物中の構造異性体を分析する方法。
(a)sc(Fv)2組成物を酵素で処理する工程
(b)処理後の生成物の分子量または構造を測定する工程
[VL]リンカー[VH]リンカー[VH]リンカー[VL]
[VH]リンカー[VL]リンカー[VL]リンカー[VH]
[VH]リンカー[VH]リンカー[VL]リンカー[VL]
[VL]リンカー[VL]リンカー[VH]リンカー[VH]
[VL]リンカー[VH]リンカー[VL]リンカー[VH]
また本発明のsc(Fv)2は、PEG等のキャリアー高分子や抗がん剤等の有機化合物をコンジュゲートしてもよい。また糖鎖付加配列を挿入し、糖鎖を付加してもよい。
Ser
Gly・Ser
Gly・Gly・Ser
Ser・Gly・Gly
Gly・Gly・Gly・Ser(配列番号:9)
Ser・Gly・Gly・Gly(配列番号:10)
Gly・Gly・Gly・Gly・Ser(配列番号:11)
Ser・Gly・Gly・Gly・Gly(配列番号:12)
Gly・Gly・Gly・Gly・Gly・Ser(配列番号:13)
Ser・Gly・Gly・Gly・Gly・Gly(配列番号:14)
Gly・Gly・Gly・Gly・Gly・Gly・Ser(配列番号:15)
Ser・Gly・Gly・Gly・Gly・Gly・Gly(配列番号:16)
(Gly・Gly・Gly・Gly・Ser(配列番号:11))n
(Ser・Gly・Gly・Gly・Gly(配列番号:12))n
[nは1以上の整数である]等を挙げることができる。但し、ペプチドリンカーの長さや配列は目的に応じて当業者が適宜選択することができる。
(1)sc(Fv)2のVHに含まれるアミノ酸残基であって、重鎖のアミノ酸配列における39位に相当するアミノ酸残基
(2)sc(Fv)2のVLに含まれるアミノ酸残基であって、重鎖のアミノ酸配列における38位に相当するアミノ酸残基
(3)sc(Fv)2のVHに含まれるアミノ酸残基であって、重鎖のアミノ酸配列における45位に相当するアミノ酸残基
(4)sc(Fv)2のVLに含まれるアミノ酸残基であって、重鎖のアミノ酸配列における44位に相当するアミノ酸残基
(1)sc(Fv)2のVHに含まれるアミノ酸残基であって、重鎖のアミノ酸配列における39位に相当するアミノ酸残基
(2)sc(Fv)2のVLに含まれるアミノ酸残基であって、重鎖のアミノ酸配列における38位に相当するアミノ酸残基
(3)sc(Fv)2のVHに含まれるアミノ酸残基であって、重鎖のアミノ酸配列における45位に相当するアミノ酸残基
(4)sc(Fv)2のVLに含まれるアミノ酸残基であって、重鎖のアミノ酸配列における44位に相当するアミノ酸残基
sc(Fv)2の重鎖可変領域と軽鎖可変領域が界面を形成しているアミノ酸残基を、電荷を有するアミノ酸残基に置換することで、sc(Fv)2組成物中の後述される構造異性体の異性化反応を抑制することもできる。本発明は、sc(Fv)2の重鎖可変領域と軽鎖可変領域が界面を形成しているアミノ酸残基を、電荷を有するアミノ酸残基に置換する工程を含むsc(Fv)2組成物中の構造異性体の異性化反応を抑制する方法もまた提供するものである。sc(Fv)2の重鎖可変領域と軽鎖可変領域が界面を形成しているアミノ酸残基を、電荷を有するアミノ酸残基に置換する工程の具体的な態様は上述の通りである。
(a)sc(Fv)2組成物中のsc(Fv)のリンカー部位を切断する工程、
(b)切断後の生成物の分子量または構造を測定する工程、
を含む方法である。
なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
1-1. 抗ヒトMpl抗体VB22B sc(Fv)2の作製
抗ヒトMpl抗体VB22B sc(Fv)2は、PCT/JP2004/18506(国際公開WO2005/56604)に示す通りに作製した。具体的には、抗ヒトMpl抗体を産生するマウスハイブリドーマVB22Bの抗体可変領域cDNAをクローニングし、リンカー配列(GlyGlyGlyGlySer)x3(配列番号:1)をコードする塩基配列およびFLAG配列(AspTyrLysAspAspAspAspLys)(配列番号:2)をコードする塩基配列を用いて、VH−リンカー配列−VL−リンカー配列−VH−リンカー配列−VL−Flagタグ配列で構成される塩基配列(配列番号:3)を持つようなDNAを作製した。このDNA断片を発現ベクターpCXND3にクローニングしてVB22B sc(Fv)2発現ベクターを構築し、CHO-DG44細胞に遺伝子導入することで、安定発現細胞株を作製した。具体的には、発現ベクター(25μg)とPBSに懸濁したCHO-DG44細胞(1×107細胞/mL)の0.75mLを混合したものを氷上で10分間冷却し、キュベットに移した後にGene PulserII(BioRad)を用いて1.5kV、25μFDの容量にてパルスを与えた。室温にて10分間の回復期間の後、エレクトロポレーション処理された細胞を、500μg/mL Geneticin(Invitrogen)を含むCHO-S-SFMII培地(Invitrogen)に加えて選抜し、VB22B sc(Fv)2産生CHO細胞株を樹立した。
VB22B sc(Fv)2はVH1-linker-VL2-linker-VH3-linker-VL4の配列を有するsc(Fv)2であることから、Fv(VH,VL間で非共有結合した分子)の組み合わせにより、構造はVH1とVL2、VH3とVL4がそれぞれFvを形成するbivalent scFv型と、VH1とVL4、VH2とVL3がそれぞれFvを形成するsingle chain diabody型の2種類の構造異性体が存在すると考えられる(図1)。VB22B sc(Fv)2の構造異性体の分離を検討した結果、下記の溶離条件下で陰イオン交換クロマトグラフィーMONO Q (Amersham Bioscience)を用いることによりVB22B sc(Fv)2の各種構造異性体の分離に成功した。
<溶離条件>
移動相A : 20mM Tris-HCl, pH8.0
移動相B : 20mM Tris-HCl, 500mM NaCl, pH8.0
流速 : 1.0ml/min
グラジエント : B0%→B35%(30min)
VB22B sc(Fv)2はVH1-linker-VL2-linker-VH3-linker-VL4の配列を有するsc(Fv)2であることから、Fv(VH,VL間で非共有結合した分子)の組み合わせにより、VH1とVL2、VH3とVL4がそれぞれFvを形成するbivalent scFv型、VH1とVL4、VH2とVL3がそれぞれFvを形成するsingle chain diabody型の2種類の構造異性体が存在すると予想されることから、peak1とpeak2はこれらの構造異性体であると考えられた。
<反応条件>
20mM sodium citrate, 150mM NaCl, pH7.5
VB22B sc(Fv)2 peak1 or peak2 : 0.14mg/mL
Subtilisin A : 1ug/mL
37℃, 30min
移動相 : DPBS(-) pH7.4
流速 : 0.2ml/min
その結果、図5に示すように、peak2では低分子量のピークが全く確認されなかったのに対して、peak1は低分子量(約半分の分子量)のピークが確認された。peak1とpeak2の混合物であるVB22B sc(Fv)2 bulkは、peak1の存在比に相当する量の低分子量のピークが確認された。よって、peak1はbivalent scFv型、peak2はsingle chain diabody型であると同定された。
抗ヒトMpl抗体VB22B sc(Fv)2は、文献(Blood 2005;105:562-566)においてTPO様アゴニスト活性を示すことが報告されている。そこで、TPO依存性増殖を示すBaF3-human MplまたはBaF3-monkey Mplを用いて分離した構造異性体のTPO様アゴニスト活性を評価した。
2-1. ヒト化抗ヒトMpl抗体hVB22B u2-wz4 sc(Fv)2の作製
実施例1で作製したVB22B sc(Fv)2の可変領域のフレームワーク領域(以下、FR)に相補性抗原決定領域(以下、CDR)を移植したヒト化抗体を作製した。具体的には、リンカー配列(GlyGlyGlyGlySer)x3(配列番号:1)をコードする塩基配列をコードする塩基配列を用いて、VH−リンカー配列−VL−リンカー配列−VH−リンカー配列−VLで構成される塩基配列(配列番号:4)を持つような遺伝子になるように、50base程度の合成オリゴDNAを約20base程度ハイブリダイズするように設計し、これらの合成オリゴDNAをPCR法によりアッセンブリさせて各可変領域をコードする遺伝子を作製した。得られた遺伝子を動物細胞で発現するように、実施例1-1の方法と同様に発現ベクター構築、定常発現CHO-DG44細胞株の作製を行い、培養上清を回収した。ヒト化抗体 hVB22B u2-wz4 sc(Fv)2はFlagタグを付加していないことから、培養上清からの精製は、VB22B sc(Fv)2が認識するエピトープであるMG10(ヒトMplアミノ酸配列のGln213からAla231)とGST融合蛋白質を利用して行った。MG10とGST融合蛋白質の精製は、Glutathione Sepharose 4B(Amersham Biosciences社製)を用いて、メーカーのプロトコールに従って精製した。さらに、精製したMG10 とGST融合蛋白質をメーカーのプロトコールに従って、HiTrap NHS-activated HP(Amersham Biosciences社製)に固定化し、アフィニティカラムを作製した。ヒト化抗体 hVB22B u2-wz4 sc(Fv)2発現CHO細胞の培養上清をMG10-GST融合蛋白質固定化カラムに流し、ヒト化抗体 hVB22B u2-wz4 sc(Fv)2を吸着させ、100mM Glycine-HCl(pH3.5),0.01% Tween80で溶出させた。溶出画分は直ちに1M Tris-HCl(pH7.4)で中和を行い、HiLoad 16/60 Superdex200pg(Amersham Biosciences社製)を用いてゲルろ過クロマトグラフィーを行った。ゲルろ過クロマトグラフィーの緩衝液は、20mMクエン酸緩衝液(pH7.5), 300mM NaCl, 0.01% Tween 80を使用した。
hVB22B u2-wz4 sc(Fv)2はVH1-linker-VL2-linker- VH3-linker-VL4の配列を有するsc(Fv)2であることから、VB22B sc(Fv)2と同様に構造はFv(VH,VL間で非共有結合した分子)の組み合わせにより、VH1とVL2、VH3とVL4がそれぞれFvを形成するbivalent scFv型と、VH1とVL4、VH2とVL3がそれぞれFvを形成するsingle chain diabody型の2種類の構造異性体が存在すると考えられる(図1)。
移動相A : 20mM sodium phosphate, pH7.5
移動相B : 20mM sodium phosphate, 500mM NaCl, pH7.5
流速 : 0.8ml/min
グラジエント : B0%→B35%(30min)
20mM sodium citrate, 150mM NaCl, pH7.5
hVB22B u2-wz4 sc(Fv)2 peak1 or peak2 : 0.15mg/mL
Subtilisin A : 10ug/mL
37℃, 30min
移動相 : DPBS(-) pH7.4
流速 : 0.2ml/min
その結果、図10に示すように、peak2においては低分子量のピークが全く確認されなかったのに対して、peak1においては低分子量(約半分の分子量)のピークが確認された。peak1とpeak2の混合物であるhVB22B sc(Fv)2 u2-wz4 bulkは、peak1の存在比に相当する量の低分子量のピークが確認された。よって、本結果より、peak1がbivalent scFv型であり、peak2がsingle chain diabody型であると同定された。
hVB22B u2-wz4 sc(Fv)2より分離したpeak1、peak2及びhVB22B u2-wz4 sc(Fv)2の結合活性の評価を以下のとおり行った。Biacore 3000(Biacore社製)にSensor Chip CM5(Biacore社製)を装着し、アミンカップリング法にて2-1で示したMG10(ヒトMplのGln213からAla231とGST融合蛋白質)を固定化した。測定のランニングバッファーはHBS-EP Buffer(Biacore社製)を使用し、流速は20μL/minとした。HBS-EP Bufferにより、およそ5 nMから150 nM程度の6点の濃度になるように、ヒト化VB22B u2-wz4 sc(Fv)2 bulk, peak1, peak2を調製し、前述のMG10固定化セルに、これらのサンプルをそれぞれ、2分間添加して結合領域を得た後に、解離領域を2分間測定した。MG10-GST融合蛋白質に結合したVB22B sc(Fv)2は、20mM HClを1分間添加して除去し、固定化セルを再生した。得られたセンサーグラムより、BIAevaluation ver.3.1ソフトウェア(Biacore社製)を用いて、Bivalent analyte modelを適用し、結合速度定数(ka)・解離速度定数(kd)を算出した。その結果、表1に示すとおり、hVB22B u2-wz4 sc(Fv)2 bulk, peak1, peak2の解離定数(KD)は、それぞれ 1.02x10-8 M, 1.24x10-8 M, 9.92 x10-9 Mであり、ほぼ2つの構造異性体はほぼ同等の結合活性を持つことが分かった。
peak1及びpeak2及びhVB22B u2-wz4 sc(Fv)2のアゴニスト活性の評価を行った。図11に示すように、アゴニスト活性は構造異性体間で大きく異なり、single chain diabody構造のpeak2が非常に高いアゴニスト活性を示したのに対して、bivalent scFv構造のpeak1の活性は極めて小さかった。2つの構造異性体は、結合活性はほぼ同程度であったのに対して、アゴニスト活性は著しく異なった。公知文献においては構造異性体の分離・同定が行われていなかったため、本検討で初めて2種類の構造異性体の間で生物学的な活性が異なることが見出された。
VB22B sc(Fv)2はVH1-linker-VL2-linker- VH3-linker-VL4の配列を有するsc(Fv)2であることから、構造はFv(VH,VL間で非共有結合した分子)の組み合わせにより、VH1とVL2、VH3とVL4がそれぞれFvを形成するbivalent scFv型と、VH1とVL4、VH2とVL3がそれぞれFvを形成するsingle chain diabody型の2種類の構造異性体が存在すると考えられる。
カラム : MONO Q (Amershambioscience)
移動相A : 20mM Tris-HCl, pH8.0
移動相B : 20mM Tris-HCl, 500mM NaCl, pH8.0
流速 : 1.0ml/min
グラジエント : B0%→B35%(30min)
実施例2-1で使用したhVB22B u2-wz4 sc(Fv)2発現CHO細胞の培養上清から精製を行った。培養上清は、精製水で3倍に希釈した後、1 M酢酸でpHを6.0に調整した。この後、20 mM 酢酸ナトリウム緩衝液、pH 6.0で平衡化したSP Sepharose Fast Flow column(Amersham Biosciences社製)にかけ、同緩衝液でカラムを洗浄後、同緩衝液中0 Mから0.5 MまでのNaClの直線濃度勾配で、カラムに吸着したポリペプチドを溶出した(第一工程)。得られた画分をTrisGlycine SDS gel 12%を用いた還元SDS-PAGEで分析し、hVB22B u2-wz4 sc(Fv)2を含む画分を集めた。
5-1. VH/VL界面改変型sc(Fv)2の作製
実施例2で作製したhVB22B u2-wz4 sc(Fv)2(以下、u2-wz4)のVH/VL界面を形成するアミノ酸であるVHの39番目(WO2005/56604の配列番号:289に記載のアミノ酸配列における39位)のGlnとVLの38番目(WO2005/56604の配列番号:291に記載のアミノ酸配列における43位)のGlnを以下のようにして改変した。u2-wz4は[VH1]リンカー[VL2]リンカー[VH3]リンカー[VL4]の順にアミノ酸リンカー配列(GlyGlyGlyGlySer)x3(配列番号:1)で連結されており、配列番号4で記載した塩基配列で転写、翻訳される。はじめに、VH1の39番目のGln(遺伝子コドンCAG)をGlu(遺伝子コドンGAG)に、VL2の38番目のGln(遺伝子コドンCAG)をGlu(遺伝子コドンGAG)に、VH3の39番目のGln(遺伝子コドンCAG)をLys(遺伝子コドンAAG)に、VL4の38番目のGln(遺伝子コドンCAG)をLys(遺伝子コドンAAG)に改変した遺伝子hVB22B u2-wz4(v1) sc(Fv)2(以下v1、塩基配列を配列番号:5に、アミノ酸配列を配列番号:6に示す)を作製した。さらに、VH1の39番目のGln(遺伝子コドンCAG)をGlu(遺伝子コドンGAG)に、VL2の38番目のGln(遺伝子コドンCAG)をLys(遺伝子コドンAAG)に、VH3の39番目のGln(遺伝子コドンCAG)をLys(遺伝子コドンAAG)に、VL4の38番目のGln(遺伝子コドンCAG)をGlu(遺伝子コドンGAG)に改変した遺伝子hVB22B u2-wz4(v3) sc(Fv)2(以下v3、塩基配列を配列番号:7に、アミノ酸配列を配列番号:8に示す)を作製した。遺伝子の改変はQuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit(STRATAGENE社製)を用いてメーカーのプロトコールに従い、点突然変異を導入した。各遺伝子の塩基配列を確認した後、DNA断片を発現ベクターpCXND3にクローニングして発現ベクターを構築し、CHO-DG44細胞に遺伝子導入することで、安定発現細胞株を作製した。具体的には、発現ベクター(20μg)とPBSに懸濁したCHO-DG44細胞(1×107細胞/mL)の0.75mLを混合したものを氷上で10分間冷却し、キュベットに移した後にGene Pulser Xcell(BioRad)を用いて1.5kV、25μFDの容量にてパルスを与えた。室温にて10分間の回復期間の後、エレクトロポレーション処理された細胞を、500μg/mL Geneticin(Invitrogen)を含むCHO-S-SFMII培地(Invitrogen)に加えて選抜し、v1産生CHO細胞株およびv3産生CHO細胞株を樹立した。
得られたVH/VL界面改変体であるv1、v3および未改変体であるu2-wz4の構造異性体存在比を陽イオン交換クロマトグライフィーおよび等電点電気泳動により分析した。また、プロテアーゼ限定分解法による構造同定を実施した。
陽イオン交換クロマトグラフィーは以下のとおり実施した。
カラム:TSK-gel Bioassist S,4.6 mmφ×50 mm(TOSOH社製)
流速:0.8mL/min
検出波長:220nm
溶出条件:
Eluent A:20 mmol/L Phosphate buffer(pH 7.0)
Eluent B:20 mmol/L Phosphate buffer / 500 mmol/L NaCl(pH7.0)
グラジエント:
Time(min) B%
0 0
5 0
25 30
25.1 100
35 100
35.1 0
<ゲル膨潤液>
Pharmalyte 8.5-10 80μL
Biolyte 7-9 10μL
Biolyte 3-9 10μL
20% Glycerol 2.0mL
<電気泳動プログラム>
SAMPLE APPLICATION DOWN AT step2 0Vh
SAMPLE APPLICATION UP AT step3 0Vh
Step 1 2000V 2.5mA 3.5W 15℃ 75Vh
Step 2 200V 2.5mA 3.5W 15℃ 15Vh
Step 3 2000V 2.5mA 3.5W 15℃ 410Vh
20mM sodium citrate, 150mM NaCl, pH7.5
hVB22B u2-wz4 sc(Fv)2 peak1 or peak2 : 0.15mg/mL
Subtilisin A : 10ug/mL
37℃, 30min
Column : TSKgel Super2000sw (TOSOH)
Eluent : 50mM sodium phosphate, 300mM KCl, pH7.0
Flow rate : 0.2ml/min
Detection : 220nm
6-1. VH/VL界面改変型sc(Fv)2の生物活性評価
実施例1に示す方法に従って、VH/VL界面改変体v1およびv3のアゴニスト活性の評価を行った。アゴニスト活性は構造異性体間で大きく異なり図11に示すように、single chain diabody構造のpeak2が非常に高いアゴニスト活性を示すのに対して、bivalent scFv構造のpeak1の活性は極めて低下する。図23に示すとおり、改変体v1はpeak2と同等の活性を示し、改変体v3はpeak1とほぼ同等の活性を示した。以上のことから生物活性においても、改変体v1がsingle chain diabody構造を、改変体v3がbivalent scFv構造を形成していることが確認された。
u2-wz4精製peak1とu2-wz4精製peak2、および、改変体v1と改変体v3の安定性評価として、示走査型熱量測定(Differential Scanning Calorimetry)を用いて変性中間温度(Tm値)の測定を以下の条件下で行った。
DSC : N-DSCII (Applied Thermodynamics社製)
溶液条件:20mM sodium citrate, 300mM NaCl, pH7.0
タンパク質濃度:0.1mg/mL
スキャニング速度:1℃/分
<熱加速条件>
溶液条件:20mM sodium citrate, pH6.0
タンパク質濃度:0.25mg/mL
加速条件:40℃-6day, 12day
熱加速サンプルは、ゲルろ過クロマトグラフィーおよび陽イオン交換クロマトグラフィーにより以下の条件で分析した。
6-1. ヒト化抗ヒトIL-6受容体抗体sc(Fv)2の作製
Sato K.ら(Cancer Research 1993;53:851-856)により報告されているヒト化抗ヒトIL-6受容体抗体のVHとVLを用いて、リンカー配列(GlyGlyGlyGlySer)x3(配列番号:1)をコードする遺伝子を用いて、VH−リンカー配列−VL−リンカー配列−VH−リンカー配列−VLで構成されるように連結したsc(Fv)2遺伝子(アミノ酸配列;配列番号:18、塩基配列;配列番号:19)を作製した。得られた遺伝子を動物細胞で発現するように、発現ベクターpMCDNに挿入した。本ベクターpMCDNの構築の流れについて、以下に述べる。pUC19ベクターにマウスサイトメガロウイルス(mCMV)エンハンサーおよびプロモーター、シミアンウイルス-40(SV40)の後期ポリアデニル部位を挿入したベクターをpMCと命名した。次に、DHFR-ΔE-rVH-PM1-f(WO92/ 19759参照)の抗体H鎖遺伝子とベクターを分割するために、制限酵素EcoRI, SmaI部位で消化し、ベクター側のみ回収した後に、EcoRI-NotI-BamHI adaptor(宝酒造)をクローニングした。このベクターをpCHOIと命名した。pCHOIのDHFR遺伝子発現部位とpCXN(Niwaら、Gene 1991;108:193-200)の制限酵素のNeomycin耐性遺伝子発現部位をpMCベクターに挿入した発現ベクターをpMCDNと命名した。構築したヒト化抗ヒト IL-6受容体抗体 sc(Fv)2発現ベクターを制限酵素で直鎖上にしたのちに、CHO-DG44細胞に遺伝子導入して抗体発現細胞株を樹立した。
ヒト化抗ヒト IL-6受容体抗体 sc(Fv)2はVH1-linker-VL2-linker-VH3-linker-VL4の配列を有するsc(Fv)2であることから、実施例1のVB22B、実施例2のhVB22Bと同様にFv(VH,VL間で非共有結合した分子)の組み合わせにより、構造はVH1とVL2、VH3とVL4がそれぞれFvを形成するbivalent scFv型と、VH1とVL4、VH2とVL3がそれぞれFvを形成するsingle chain diabody型の2種類の構造異性体が存在すると考えられる(図1)。ヒト化抗ヒト IL-6受容体抗体 sc(Fv)2の構造異性体の分離を検討した結果、下記の溶離条件下で陽イオン交換クロマトグラフィーBioAssist S (TOSOH)を用いることによりヒト化抗ヒト IL-6受容体抗体 sc(Fv)2の構造異性体の分離に成功した。
<溶離条件>
移動相 : 20mM Tris-HCl pH8.5, 75 mM NaCl
流速 : 0.8ml/min
グラジエント : イソクラティック(グラジエント無し)
上記条件により、ヒト化抗ヒト IL-6受容体抗体 sc(Fv)2は2つのピークに分離した。図27に示すようなクロマトグラムが得られ、保持時間の短いピークをpeak1、長いピークをpeak2と命名した。同方法によりPeak1とpeak2を精製することができた。精製後のpeak1とpeak2の陽イオン交換クロマトグラフィー分析の結果を図28に示した。
分取したヒト化抗ヒト IL-6受容体抗体 sc(Fv)2のpeak1とpeak2は構造異性体と考えられたためで、2種類の構造異性体を同定する分析法として、実施例1、2、3で実施したプロテアーゼ限定分解法を用いた。以下の条件でヒト化抗ヒト IL-6受容体抗体 sc(Fv)2のpeak1およびpeak2と反応させた。
PBS (pH7.4)
ヒト化抗ヒト IL-6受容体抗体 sc(Fv)2 peak1 or peak2 : 0.05mg/mL
Subtilisin A : 0.5ug/mL
37℃, 60min
上記反応後、Phastgel Homogeneous 12.5%を用いて、還元SDS-PAGEを行った。その結果、図29に示すとおり、peak1、peak2いずれも同様のバンドパターンを示した。上記反応条件により部分的にリンカーを切断した、peak1、peak2を以下の条件でTSK SuperSW2000(TOSOH)を用いてゲルろ過クロマトグラフィー分析を行った。
移動相 : 50mM sodium phosphate, 300mM KCl, pH7.0
流速 : 0.2ml/min
7-1. ヒトgp130発現BaF3細胞株、ヒトgp130/ヒトIL-6受容体共発現BaF3細胞株の樹立
IL-6依存増殖性を示す細胞株を得るために、以下に示すとおり、ヒトgp130を発現したBaF3細胞株の樹立を行った。
全長ヒトgp130 cDNA (Hibiら、Cell 1990;63:1149-1157 (GenBank # NM_002184))をPCRにより増幅し、pCHOI (Hirataら、FEBS Letter 1994;356:244-248)のDHFR遺伝子発現部位を除去し、Zeocin耐性遺伝子発現部位を挿入した発現ベクターpCOS2Zeoにクローニングし、pCOS2Zeo/gp130を構築した。
10μgのpCOS2Zeo/gp130をPBSに懸濁したBaF3細胞(0.8x107cells) に混合し、Gene Pulser (Bio-Rad)を用いて0.33kV, 950μFDの容量でパルスを加えた。エレクトロポーレーション処理により遺伝子導入したBaF3細胞を0.2ng/mLのmouse interleukin-3(Peprotech)、10% Fetal Bovine Serum(以下FBS、HyClone)を含むRPMI1640培地(Invitrogen)で一昼夜培養し、100ng/mLのhuman interleukin-6(R&D)、100ng/mL のhuman interleukin-6 soluble receptor (R&D systems)および10%FBSを含むRPMI1640培地を加えて選抜し、ヒトgp130発現BaF3細胞株(以下、BaF3/gp130)を樹立した。
IL-6依存性増殖を示すBaF3/gp130を用いて、以下に示すとおり、IL-6中和活性を評価した。精製したヒト化抗ヒト IL-6受容体抗体 sc(Fv)2の構造異性体を10μg/mLになるように10% FBSを含むRPMI1640に希釈した。この溶液を用いて希釈公比3、合計6系列の希釈液を調製し、96well-plate(FALCON)の各wellに50μLずつ分注した。次に、BaF3/gp130を10% FBS (HyClone)を含むRPMI1640培地で3回洗浄した後に、5x104cells/mLとなるように60ng/mLのhuman interleukin-6 (R&D systems)、60ng/mL の可溶性ヒトIL-6受容体(自社調製品)および10% FBSを含むRPMI1640培地に懸濁し、抗体サンプルを分注したwellに50μLずつ混合した。ヒト可溶性IL-6受容体は以下に示す方法で調製した。ヒト可溶性IL-6受容体(Yamasakiら、Science 1988;241:825-828 (GenBank # X12830))の1番目から344番目のアミノ酸をコードする遺伝子をCHO細胞に導入後に培養上清から精製して調製した。
37℃、5%CO2条件下で、72時間培養し、PBSで2倍に希釈したWST-8試薬(Cell Counting Kit-8、株式会社同仁化学研究所)を20μL/wellで加え、直後にSUNRISE CLASSIC(TECAN)を用いて450nmの吸光度(参照波長620nm)を測定した。2時間培養した後に、再度450 nmの吸光度(参照波長620nm)を測定し、2時間の吸光度変化を指標にIL-6中和活性を評価した。
VB22B sc(Fv)2より精製したsingle chain diabody (peak2)とbivalent scFv (peak1)をそれぞれ、20mM sodium acetate, 150mM NaCl, pH6.0の条件下、40℃においてインキュベートした。実施例1に示した陰イオン交換クロマトグラフィーの方法でpeak1とpeak2比を測定した結果、図32に示したように、peak1のピークエリアが減少し、それに代わって、peak2のピークエリアが増大した。そこで、peak1を同条件下で6日間インキュベートしたサンプルを実施例1に示した方法でアゴニスト活性を評価したところ、図33に示したようにincubateする前のサンプルに比べて大幅にアゴニスト活性が増大した。実施例1に示したとおりpeak1はsingle chain diabodyであるpeak2に比べて著しく活性が低いことから、bivalent scFvであるpeak1は、20mM sodium acetate, 150mM NaCl, pH6.0, 40℃でインキュベートすることによって、高活性のsingle chain diabodyであるpeak2に構造変換する(構造異性体が異性化する)ことが分かった。すなわち、これによりbivalent scFvとsingle chain diabodyの混合物を適当な条件下に暴露することによって、bivalent scFvであるpeak1をsingle chain diabodyであるpeak2に変換することが可能であり、peak2の含有率を増加させることが可能であることが示された。peak1からpeak2に異性化させる本方法を用いることで、細胞より産生されたpeak1とpeak2の混合物からpeak1をpeak2に異性化させることによって、高収率でsingle chain diabodyであるpeak2を得ることが可能である。
実施例4においてhVB22B u2-wz4 sc(Fv)2より精製したbivalent scFv (peak1)を20mM sodium citrate, 0mM/150mM/300mM NaCl, pH3.0/3.5/4.0/4.5/5.0/5.5/6.0/6.5/7.0/7.5の計30条件下、25℃において10日間インキュベートした。実施例1に示した陽イオン交換クロマトグラフィーの方法でpeak1とpeak2比を測定した結果、図34に示したように、 インキュベート前に比べてpeak2存在比が増大した。これよりhVB22B u2-wz4 sc(Fv)2においても、bivalent scFvであるpeak1は、single chain diabodyであるpeak2に構造変換することを見出した。その異性化速度は、低pH及び低塩濃度ほど早いことを見出した。Peak1からpeak2に異性化させる本方法を用いることで、細胞より産生されたpeak1とpeak2の混合物からpeak1をpeak2に異性化させることによって、高収率でsingle chain diabodyであるpeak2を得ることが可能である。
Claims (44)
- 以下の工程を含むsc(Fv)2医薬組成物の製造方法。
(a)sc(Fv)2組成物中の構造異性体を分離する工程
(b)分離された構造異性体のうち、特定の構造異性体を取得する工程 - 以下の工程を含むsc(Fv)2医薬組成物の製造方法。
(a)sc(Fv)2の構造異性体の活性を比較して高活性の構造異性体をあらかじめ決定する工程
(b)sc(Fv)2組成物中の構造異性体を分離する工程
(c)工程(a)により決定された高活性の構造異性体を取得する工程 - 以下の工程を含むsc(Fv)2医薬組成物の製造方法。
(a)sc(Fv)2組成物中の構造異性体の比率が好ましい値になるようにリンカーの長さを決定する工程
(b)工程(a)で決定されたリンカーの長さを有するsc(Fv)2組成物を作製する工程
(c)作製されたsc(Fv)2組成物中の構造異性体を分離する工程
(d)分離された構造異性体のうち、特定の構造異性体を取得する工程 - 以下の工程を含むsc(Fv)2医薬組成物の製造方法。
(a)リンカーの長さが異なる複数のsc(Fv)2組成物を作製する工程
(b)sc(Fv)2組成物中の構造異性体の比率が好ましい値となるリンカーを有するsc(Fv)2を選択する工程
(c)工程(b)で選択されたsc(Fv)2のリンカーと同じ長さのリンカーを有するsc(Fv)2組成物を作製する工程
(d)作製されたsc(Fv)2組成物中の構造異性体を分離する工程
(e)分離された構造異性体のうち、特定の構造異性体を取得する工程 - 構造異性体がsingle chain diabody型又はbivalent scFv型である請求項1〜4のいずれかに記載の方法。
- 構造異性体がアゴニスト活性を有することを特徴とする請求項1〜5のいずれかに記載の製造方法。
- sc(Fv)2のリンカーが15アミノ酸であることを特徴とする請求項1〜6のいずれかに記載の製造方法。
- 請求項1〜7のいずれかに記載の製造方法により作製された医薬組成物。
- sc(Fv)2組成物中の特定の構造異性体の割合が80%以上であることを特徴とする医薬組成物。
- 構造異性体がsingle chain diabody型又はbivalent scFv型である請求項9に記載の医薬組成物。
- 構造異性体が受容体に結合することを特徴とする請求項9または10に記載の医薬組成物。
- 構造異性体がアゴニスト活性を有することを特徴とする請求項9〜11のいずれかに記載の医薬組成物。
- sc(Fv)2のリンカーが15アミノ酸である請求項9〜12のいずれかに記載の医薬組成物。
- sc(Fv)2組成物中の構造異性体の割合を変化させる工程を含む、sc(Fv)2組成物の活性を調節する方法。
- sc(Fv)2組成物中の特定の構造異性体の割合を増加させる工程を含む、sc(Fv)2組成物の活性を増加させる方法。
- 以下の工程を含むsc(Fv)2組成物の活性を増加させる方法。
(a)sc(Fv)2組成物中の構造異性体を分離する工程
(b)分離された構造異性体のうち、特定の構造異性体を取得する工程 - 以下の工程を含むsc(Fv)2組成物の活性を増加させる方法。
(a)sc(Fv)2の構造異性体の活性を比較して高活性の構造異性体をあらかじめ決定する工程
(b)sc(Fv)2組成物中の構造異性体を分離する工程
(c)工程(a)により決定された高活性の構造異性体を取得する工程 - 以下の工程を含むsc(Fv)2組成物の活性を増加させる方法。
(a)sc(Fv)2組成物をイオン交換カラムにかける工程
(b)特定の構造異性体を除去する工程 - 構造異性体がsingle chain diabody型又はbivalent scFv型である請求項14〜18のいずれかに記載の方法。
- sc(Fv)2組成物を加熱する工程を含む、sc(Fv)2組成物中の特定の構造異性体の含有割合を増加させる方法。
- 構造異性体がsingle chain diabody型又はbivalent scFv型である請求項20に記載の方法。
- sc(Fv)2組成物を15℃〜50℃でインキュベートする工程を含む、sc(Fv)2組成物中のsingle chain diabody型の含有割合を増加させる方法。
- sc(Fv)2の重鎖可変領域と軽鎖可変領域が界面を形成しているアミノ酸残基を、電荷を有するアミノ酸残基に置換する工程を含むsc(Fv)2組成物中の特定の構造異性体の含有割合を増加させる方法。
- 以下の(1)および(2)に記載のアミノ酸残基を、同種の電荷を有するアミノ酸残基に置換する工程を含む、sc(Fv)2組成物中の特定の構造異性体の含有割合を増加させる方法。
(1)sc(Fv)2の重鎖可変領域に含まれるアミノ酸残基であって、重鎖可変領域の39位に相当するアミノ酸残基
(2)sc(Fv)2の軽鎖可変領域に含まれるアミノ酸残基であって、軽鎖可変領域のアミノ酸配列における38位に相当するアミノ酸残基 - 以下の(1)および(2)に記載のアミノ酸残基を、同種の電荷を有するアミノ酸残基に置換する工程を含む、sc(Fv)2組成物中の特定の構造異性体の含有割合を増加させる方法。
(1)sc(Fv)2の重鎖可変領域に含まれるアミノ酸残基であって、重鎖可変領域のアミノ酸配列における45位に相当するアミノ酸残基
(2)sc(Fv)2の軽鎖可変領域に含まれるアミノ酸残基であって、軽鎖可変領域のアミノ酸配列における44位に相当するアミノ酸残基 - 以下の(1)および(2)のいずれか一方のアミノ酸残基を、電荷を有するアミノ酸残基に置換する工程を含む、sc(Fv)2組成物中の特定の構造異性体の含有割合を増加させる方法。
(1)sc(Fv)2の重鎖可変領域に含まれるアミノ酸残基であって、重鎖可変領域のアミノ酸配列における45位に相当するアミノ酸残基
(2)sc(Fv)2の軽鎖可変領域に含まれるアミノ酸残基であって、軽鎖可変領域のアミノ酸配列における44位に相当するアミノ酸残基 - sc(Fv)2の重鎖可変領域と軽鎖可変領域が界面を形成しているアミノ酸残基を、電荷を有するアミノ酸残基に置換する工程を含むsc(Fv)2組成物の活性を増加させる方法。
- 以下の(1)および(2)に記載のアミノ酸残基を、同種の電荷を有するアミノ酸残基に置換する工程を含む、sc(Fv)2組成物の活性を増加させる方法。
(1)sc(Fv)2の重鎖可変領域に含まれるアミノ酸残基であって、重鎖可変領域の39位に相当するアミノ酸残基
(2)sc(Fv)2の軽鎖可変領域に含まれるアミノ酸残基であって、軽鎖可変領域のアミノ酸配列における38位に相当するアミノ酸残基 - 以下の(1)および(2)に記載のアミノ酸残基を、同種の電荷を有するアミノ酸残基に置換する工程を含む、sc(Fv)2組成物中の活性を増加させる方法。
(1)sc(Fv)2の重鎖可変領域に含まれるアミノ酸残基であって、重鎖可変領域のアミノ酸配列における45位に相当するアミノ酸残基
(2)sc(Fv)2の軽鎖可変領域に含まれるアミノ酸残基であって、軽鎖可変領域のアミノ酸配列における44位に相当するアミノ酸残基 - 以下の(1)および(2)のいずれか一方のアミノ酸残基を、電荷を有するアミノ酸残基に置換する工程を含む、sc(Fv)2組成物の活性を増加させる方法。
(1)sc(Fv)2の重鎖可変領域に含まれるアミノ酸残基であって、重鎖可変領域のアミノ酸配列における45位に相当するアミノ酸残基
(2)sc(Fv)2の軽鎖可変領域に含まれるアミノ酸残基であって、軽鎖可変領域のアミノ酸配列における44位に相当するアミノ酸残基 - sc(Fv)2の重鎖可変領域と軽鎖可変領域が界面を形成しているアミノ酸残基を、電荷を有するアミノ酸残基に置換する工程を含むsc(Fv)2組成物中の構造異性体の異性化反応を抑制する方法。
- 以下の(1)および(2)に記載のアミノ酸残基を、同種の電荷を有するアミノ酸残基に置換する工程を含む、sc(Fv)2組成物中の構造異性体の異性化反応を抑制する方法。
(1)sc(Fv)2の重鎖可変領域に含まれるアミノ酸残基であって、重鎖可変領域の39位に相当するアミノ酸残基
(2)sc(Fv)2の軽鎖可変領域に含まれるアミノ酸残基であって、軽鎖可変領域のアミノ酸配列における38位に相当するアミノ酸残基 - 以下の(1)および(2)に記載のアミノ酸残基を、同種の電荷を有するアミノ酸残基に置換する工程を含む、sc(Fv)2組成物中の構造異性体の異性化反応を抑制する方法。
(1)sc(Fv)2の重鎖可変領域に含まれるアミノ酸残基であって、重鎖可変領域のアミノ酸配列における45位に相当するアミノ酸残基
(2)sc(Fv)2の軽鎖可変領域に含まれるアミノ酸残基であって、軽鎖可変領域のアミノ酸配列における44位に相当するアミノ酸残基 - 以下の(1)および(2)のいずれか一方のアミノ酸残基を、電荷を有するアミノ酸残基に置換する工程を含む、sc(Fv)2組成物中の構造異性体の異性化反応を抑制する方法。
(1)sc(Fv)2の重鎖可変領域に含まれるアミノ酸残基であって、重鎖可変領域のアミノ酸配列における45位に相当するアミノ酸残基
(2)sc(Fv)2の軽鎖可変領域に含まれるアミノ酸残基であって、軽鎖可変領域のアミノ酸配列における44位に相当するアミノ酸残基 - sc(Fv)2のリンカーの長さを調節する工程を含む、sc(Fv)2組成物中の構造異性体の割合を調節する方法。
- 構造異性体がsingle chain diabody型又はbivalent scFv型である請求項35に記載の方法。
- sc(Fv)2の両端のリンカーを0〜12アミノ酸、中央のリンカーを10〜30アミノ酸に調節する工程を含む、sc(Fv)2組成物中のsingle chain diabody型の割合を増加させる方法。
- sc(Fv)2の両端のリンカーを12〜30アミノ酸、中央のリンカーを0〜10アミノ酸に調節する工程を含む、sc(Fv)2組成物中のbivalent scFv型の割合を増加させる方法。
- sc(Fv)2の両端のリンカーを0〜12アミノ酸、中央のリンカーを0〜10アミノ酸に調節する工程を含む、single chain diabody型の含有割合が80%以上であるsc(Fv)2組成物を製造する方法。
- sc(Fv)2の両端のリンカーを12〜30アミノ酸、中央のリンカーを0〜10アミノ酸に調節する工程を含む、bivalent scFv型の含有割合が80%以上であるsc(Fv)2組成物を製造する方法。
- sc(Fv)2のリンカー又はリンカー近傍領域を切断する工程を含む、sc(Fv)2組成物中の構造異性体を分析する方法。
- 酵素で処理することによりリンカー又はリンカー近傍領域を切断することを特徴とする請求項41に記載の方法。
- 構造異性体がsingle chain diabody型又はbivalent scFv型である請求項41または42に記載の方法。
- 以下の工程を含む、sc(Fv)2組成物中の構造異性体を分析する方法。
(a)sc(Fv)2組成物を酵素で処理する工程
(b)処理後の生成物の分子量または構造を測定する工程
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