DE60035337T2 - Humane Peptide/Proteine, die das Töten von Zellen, einschliesslich lymphoider Tumorzellen, herbeiführen oder bewirken - Google Patents

Humane Peptide/Proteine, die das Töten von Zellen, einschliesslich lymphoider Tumorzellen, herbeiführen oder bewirken Download PDF

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Description

  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf menschliche Peptide/Proteine, wie in den beigefügten Patentansprüchen spezifiziert, die den Tod von Zellen, einschließlich lymphoider Tumorzellen, verursachen oder zum Tod der Zellen führen. Die Erfindung bezieht sich weiter auf Nucleinsäuren, welche die Peptide/Proteine codieren, Verfahren für die Herstellung der Peptide/Proteine, pharmazeutische, diagnostische und multivalente Zusammensetzungen und Kits, welche die Peptide/Proteine umfassen, und Verwendungen der Peptide/Proteine. Darüber hinaus werden Verfahren zum Abtöten der Zellen beschrieben.
  • Jede Säugerart, welche bis heute studiert wurde, trägt ein Cluster von Genen, die für den sogenannten Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC) codieren. Dieses fest verbundene Gencluster codiert für Oberflächenantigene, die eine zentrale Rolle bei der Entwicklung von sowohl humoralen als auch zellvermittelten Immunantworten spielt. Bei Menschen werden die vom MHC codierten Produkte als humane Leukozytenantigene oder HLA bezeichnet. Die MHC-Gene werden in Regionen organisiert, die drei Klassen von Molekülen, Klasse I bis III, codieren.
  • Die Klasse-I-MHC-Moleküle sind Transmembran-Glycoproteine von 45 kD, die mit einem anderen Glycoprotein, dem beta-2-Microglobulin von 12 kD, nicht kovalent assoziiert sind (Brown et al., 1993). Das letztere wird nicht in die Zellmembran eingefügt, und wird außerhalb des MHC codiert. Die Moleküle der menschlichen Klasse I haben drei unterschiedlichen Isotypen, genannt HLA-A, -B und -C, die in getrennten Orten codiert werden. Die Expression von Klasse I-Molekülen im Gewebe ist allgegenwärtig und codominant. Die MHC-Klasse-I-Moleküle präsentieren Peptidantigene, die für die Aktivierung der cytotoxischen T-Zellen notwendig sind.
  • Die Klasse-II-MHC-Moleküle sind nicht kovalent assoziierte Heterodimere von zwei Transmembran-Glycoproteinen, der α-Kette von 35 kD und der β-Kette von 28 kD (Brown et al., 1993). Bei Menschen treten Klasse-II-Moleküle als drei unterschiedliche Isotypen auf, genannt menschliches Leukozytenantigen DR (HLA-DR), HLA-DP und HLA-DQ. Der Polymorphismus in DR wird auf die β-Kette begrenzt, während beide Ketten in den DP- und DQ-Isotypen polymorph sind. Die Klasse-II-Moleküle werden codominant exprimiert, aber im Gegensatz zur Klasse I weisen sie eine begrenzte Gewebeverteilung auf: sie sind nur auf der Oberfläche von Zellen des Immunsystems vorhanden, zum Beispiel auf dentritischen Zellen, Makrophagen, B-Lymphozyten und aktivierten T-Lymphozyten. Sie werden auch auf menschlichen Nebennierenrindenzellen in der Zona reticularis der normalen Nebennieren und auf Granulosa-Lutein-Zellen in der Corpora lutea der normalen Eierstöcke exprimiert (Kahoury et al., 1990). Ihre biologische Hauptfunktion ist, an antigene Peptide zu binden und sie auf der Oberfläche der Antigen präsentierenden Zellen (APC) für die Erkennung durch die CD4-Helfer-T (Th)-Lymphozyten zu präsentieren (Babbitt et al., 1985). Die MHC-Klasse-II-Moleküle können auch auf der Oberfläche von Nicht-Immunsystemzellen exprimiert werden, zum Beispiel von Zellen, die MHC-Klasse-II-Moleküle während einer pathologischen Entzündungsreaktion exprimieren. Diese Zellen können Synovialzellen, Endothelzellen, Schilddrüsen-Bindegewebszellen und Gliazellen beinhalten.
  • Die Klasse-III-MHC-Moleküle werden auch mit Immunantworten assoziiert, aber codieren etwas unterschiedliche Produkte. Diese beinhalten eine Anzahl von löslichen Serumproteinen, Enzymen und Proteinen wie den Tumornekrosefaktor oder die Steroid-21-Hydroxylase-Enzyme. Bei Menschen treten die Klasse-III-Moleküle als drei unterschiedliche Isotypen auf, Ca, C2 und Bf bezeichnet (Kuby, 1994).
  • Da die Th-Zellaktivierung ein kritisches Ereignis bei der Initiierung von praktisch allen Immunantworten ist und durch Klasse-II-Moleküle vermittelt wird, bietet sich der Klasse-II-MHC selbst als Ziel für die Immunmodulation an (Baxevanis et al., 1980, Rosenbaum et al., 1981; Adorini et al., 1988). Neben der Peptidpräsentation können Klasse-II-Moleküle verschiedene Signale, die die Physiologie der APC beeinflussen, transduzieren. Solche Signale entstehen bei der Wechselwirkung der multiplen Klasse-II-Moleküle mit einem Antikörper oder mit dem Antigenrezeptor der Th-Zellen (Vidovic et al., 1995a; Vidovic et al., 1995b), und können die B-Zellaktivierung und Immunglobulinsekretion (Cambier et al., 1991; Palacios et al., 1983), die Cytokinproduktion durch Monozyten (Palacios, 1985) sowie die Hochregulierung von costimulatorischen (Navabi et al., 1992) und Zelladhäsionsmolekülen (Mourad et al., 1990) beinhalten.
  • Es gibt auch eine Reihe von Beobachtungen, die nahe legen, dass die Klasse-II-Ligation unter bestimmten Bedingungen zum Stillstand des Zellwachstums führen oder cytotoxisch sein kann. Die Ligation unter diesen Bedingungen ist die Wechselwirkung eines Peptids/Proteins mit einem Klasse-II-MHC-Molekül. Es gibt einen wesentlichen Widerspruch über die letzteren Effekte und ihrer möglichen Mechanismen. Bestimmte Autoren beanspruchen, dass die Bildung eines Komplexes von Klasse-II-Molekülen auf B-Zellen zu Wachstumshemmung führt (Vaickus et al., 1989; Kabelitz et al., 1989), während gemäß der anderen die Klasse-II-Komplexbildung zum Zelltod führt (Vidovic et al., 1995a; Newell et al., 1993; Truman et al., 1994; Truman et al., 1997; Drenou et al., 1999). In bestimmten experimentellen Systemen wurde das Phänomen nur mit ruhenden B-Zellen (Newell et al., 1993) oder in anderen Systemen nur mit aktivierten B-Zellen (Vidovic et al., 1995a; Truman et al., 1994) beobachtet.
  • Auf Grundlage dieser Beobachtungen wurden monoclonale Anti-Klasse-II-Antikörper (mAbs) für eine Anzahl von Jahren als Kandidaten für die Therapie in Betracht gezogen. Tatsächlich wurde dieser Vorschlag durch den günstigen Effekt der von der Maus abgeleiteten anti-Klasse-II-mAbs in einer Reihe von Tiererkrankungsmodellen unterstützt (Waldor et al., 1983; Jonker et al., 1988; Stevens et al., 1990; Smith et al., 1994).
  • Trotz dieser früh unterstützenden Daten wurde bis heute kein anti-MHC-Klasse-II-mAb von menschlicher Zusammensetzung beschrieben, der die gewünschten cytotoxischen und anderen biologischen Eigenschaften zeigt. Obwohl es relativ leicht ist, von der Maus abgeleitete mAbs zu erhalten, zeigte die tatsächliche Arbeit unter Verwendung der von der Maus abgeleiteten mAbs die Schwierigkeit, einen Antikörper mit den gewünschten biologischen Eigenschaften zu erhalten. Zum Beispiel wurden signifikante und nicht vollständig verstandene Unterschiede bei der T-Zell-Hemmungskapazität von unterschiedlichen anti-Klasse-II-mAbs beobachtet (Naquet et al., 1983). Darüber hinaus war die Anwendung von bestimmten von der Maus abgeleiteten mABs in vivo mit unerwarteten Nebenwirkungen verbunden, die manchmal zum Tod der Laborprimaten führten (Billing et al., 1983; Jonker et al., 1991).
  • Es wird allgemein angenommen, dass die von der Maus abgeleiteten mAbs (einschließlich chimäre und so genannte ,humanisierte' mAbs) ein erhöhtes Risiko tragen, eine ungünstige Immunantwort bei Patienten zu erzeugen, verglichen mit der Behandlung eines menschlichen mAb. Dieses Risiko wird möglicherweise während der Behandlung von chronischen Erkrankungen wie rheumatoider Arthritis oder multipler Sklerose mit irgendeinem von der Maus abgeleiteten mAB erhöht; verlängertes Aussetzen des menschlichen Immunsystems einem nicht-menschlichen Molekül führt oft zu der Entwicklung einer ungünstigen Immunreaktion. Darüber hinaus ist es maßgeblich schwierig, die von der Maus abgeleiteten Antikörper mit der gewünschten Spezifität oder Affinität zu dem gewünschten Antigen zu erhalten. Eine derartige Beachtung kann einen maßgeblichen Einfluss auf die gesamte therapeutische Wirkung oder den Vorteil haben, der durch die von der Maus abgeleiteten mAbs bereitgestellt wird. Schließlich werden diese gewünschten Merkmale oft während der ,Humanisierungs-' oder der ,Chimärisierungs-' Verfahren, die notwendig sind, um das immunogene Potential zu reduzieren, schädlich beeinflusst, sogar wenn ein Maus-mAb identifiziert werden konnte, der die gewünschte Spezifität oder Affinität zeigte. Wenn einmal ein von der Maus abgeleiteter mAb ,humanisiert' oder chimärisiert wurde, dann ist es maßgeblich schwierig, seine Spezifität oder Affinität zu optimieren.
  • Das Fachgebiet strebte über eine Anzahl von Jahren nach anti-MHC-Klasse-II-mAbs von menschlicher Zusammensetzung, die biologische Eigenschaft zeigen, die für die Verwendung in einem Arzneimittel für die Behandlung von Menschen geeignet sind. Arbeiter auf dem Fachgebiet übten die Verfahrensschritte aus, indem sie einen von der Maus abgeleiteten mAb zuerst identifizierten und dann die Struktur dieses mAb modifizierten mit dem Zweck, die Immuntoleranz dieses nicht menschlichen Moleküls für menschliche Patienten zu verbessern (für weitere Details, s. Jones et al., 1986; Riechmann et al., 1988; Presta, 1992). Diese Modifikation wird normalerweise unter Verwendung so genannter ,Humanisierungs'-Verfahren oder durch die Herstellung eines chimären Mensch-Maus-mAb durchgeführt. Andere Arbeiter versuchten, menschliche Antikörper zu identifizieren, die an menschliche Antigene mit den gewünschten Eigenschaften innerhalb des natürlichen Repertoires der menschlichen Antikörper-Vielfalt binden. Zum Beispiel durch Untersuchung des Mechanismus der fötalen Toleranz bei schwangeren Frauen (Bonagura et al., 1987) oder durch Panning-Bibliotheken der natürlichen Verschiedenheiten der Antikörper (Stausbøl-Grøn et al., 1996; Winter et al., 1994). Jedoch wurde bis heute kein anti-MHC-Klasse-II-mAB von menschlicher Zusammensetzung beschrieben, der die gewünschten biologischen Eigenschaften von Cytotoxizität, Tumorselektivität, Spezifität, geringer Immunogenität und Affinität zeigt.
  • Darüber hinaus wird auf dem Stand der Technik der menschliche monoclonale Antikörper UL-5A1 beschrieben, welcher mit den DR1 (Dra/DRB1*0101)-Molekülen auf lymphoblastoiden Zelllinien interagiert und dabei die Lyse der Zellen induziert, s. Wölpl et al., Tissue Antigens, 1998, Seiten 258 bis 269. Der Antikörper reagiert spezifisch mit Zellen, die aktiviert worden waren (Zusammenfassung). Die Reaktivität des Antikörpers wird durch die Aktivierung der Zellen moduliert, d.h. nicht aktivierte Zellen werden von dem markierten Antikörper nicht gefärbt, während aktivierte Zellen gefärbt werden (Seite 262, Tabelle 3 und Seite 267, rechte Sp., 2. Absatz). Der F-Wert ist das Maß für die Bindung an aktivierte Zellen im Vergleich zu nicht aktivierten Zellen (s. Seite 259, rechte Sp., 4. Absatz – Seite 260, linke Sp., 1. Absatz). Man nimmt an, dass der F-Wert einen Hinweis für den IC50-Wert des Antikörpers gibt. Es wird vorgeschlagen, UL-5A1 für die Therapie der EBV-induzierten polyclonalen lymphoproliferativen Erkrankung zu verwenden (Seite 267, rechte Sp., 4. Absatz).
  • Zusätzlich wird in Bunce et al., Tissue Antigens, 1990, Seiten 100 bis 102, ein menschlicher monoclonaler Antikörper NDS40 beschrieben, welcher HLA-Drw13b auf B-Zellen von Patienten mit chronisch lymphatischer Leukämie erkennt (Seite 100, linke Sp., 2. Absatz). Der Antikörper ist cytotoxisch und ist von der Lambda-IgM- Klasse (Zusammenfassung). Darüber hinaus wird der Antikörper als diagnostisches Hilfsmittel verwendet, um HLA-DRw12 und HLA-DRw13b zu unterscheiden.
  • Schließlich beschreibt Viken et al., Human Immunology, 1995, Seiten 200 bis 206 den cytotoxischen menschlichen IgM(kappa) mAb 5643, welcher mit dem HLA-DR (α, β 1*0801)-Subtyp von DR8 interagiert. Das mit dem Antikörper wechselwirkende Epitop wird innerhalb der α-Helix der DR-β-Kette, einschließlich der Aminosäurereste 57 und 67 lokalisiert (Zusammenfassung). Der Antikörper wird verwendet, um die Subtypen von DR8 zu benachteiligen (Seite 202, rechte Sp., 4. Absatz).
  • Für therapeutische Zwecke würde ein Peptid/Protein, das mit den meisten oder allen allelen Formen eines menschlichen Klasse-II-MHC-Moleküls reagiert, wünschenswert sein. Außerdem sollte das Kandidaten-Peptid/-Protein einen cytotoxischen Mechanismus auslösen, der von einem weiten Bereich lymphoider Tumoren geteilt wird, oder sollte unterschiedliche cytotoxische Mechanismen aktivieren können. Um einen weiten Bereich von möglichen Anwendungen zu berücksichtigen, sollte das gewünschte Peptid/Protein seinen cytotoxischen Effekt ohne die Abhängigkeit von weiteren Komponenten des Immunsystems vermitteln. Für therapeutische Zwecke erhalten die meisten Patienten für die Behandlung von z.B. Krebs Standard-Chemo- oder Radiotherapie. Die meisten dieser Behandlungen lassen den Patienten immunsupprimiert. Es ist daher wahrscheinlich, dass eine zusätzliche Behandlung, die auf ein intaktes Immunsystem beruht, versagt. Das grundlegende Problem wird weiter bei Menschen gezeigt, die an einer Erkrankung leiden, die das Immunsystem zerstört, z.B. HIV. Opportunistische Infektionen und maligne Transformationen können der Immunüberwachung entfliehen und weitere Komplikationen verursachen.
  • So ist das technische Problem, das der vorliegenden Erfindung zugrunde liegt, Mittel, die den Tod der Zellen verursachen oder zum Tod der Zellen führen, vorzugsweise von lymphoiden Tumorzellen, für therapeutische Zwecke mit einem Minimum von unerwünschten Nebenwirkungen bereitzustellen.
  • Die Lösung der vorstehenden technischen Probleme wird von den in den Patentansprüchen charakterisierten Ausführungsformen erreicht. Insbesondere wird das vorstehende Problem von einem Peptid/Protein, wie in den beigefügten Patentansprüchen spezifiziert, gelöst, das zumindest eine auf einem Antikörper basierende Antigen-Bindungsdomäne von menschlicher Zusammensetzung mit der Bindungsspezifität für ein auf der Oberfläche einer menschlichen Zelle exprimiertes Antigen umfasst, wobei die Bindung einer multivalenten Zusammensetzung von einem oder mehreren der Peptide/Proteine an das Antigen, das auf der Oberfläche einer Zelle exprimiert wird, den Tod der Zelle verursacht oder zum Tod der Zelle führt.
  • Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff „Peptid" auf Moleküle, die aus einer oder mehreren Ketten von vielfachen, d.h. zwei oder mehreren Aminosäuren, über Peptidbindungen verbunden, bestehen. Der Begriff „Protein" bezieht sich auf Peptide, wo zumindest ein Teil des Peptids eine definierte dreidimensionale Anordnung durch Bildung von Sekundär-, Tertiär- oder Quartärstrukturen innerhalb und/oder zwischen seiner/seinen Peptidkette(n) hat oder erwerben kann. Diese Definition umfasst Proteine, wie natürlich vorkommende oder zumindest teilweise künstliche Proteine, sowie Fragmente oder Domänen ganzer Proteine, solange diese Fragmente oder Domänen eine definierte dreidimensionale Anordnung, wie vorstehend beschrieben, erwerben können.
  • In diesem Zusammenhang bezieht sich „Peptid/Protein, das zumindest eine auf einem Antikörper basierende Antigen-Bindungsdomäne umfasst" auf ein Immunglobulin (oder Antikörper) oder auf ein funktionelles Fragment davon. Der Begriff „funktionelles Fragment" bezieht sich auf ein Fragment eines Immunglobulins, das die Antigen-Bindungseinheit eines Immunglobulins beibehält. Die funktionellen Immunglobulinfragmente gemäß der vorliegenden Erfindung können Fv (Skerra und Plückthun, 1988), scFv (Bird et al., 1988; Huston et al., 1988), über Disulfid verbundenes Fv (Glockshuber et al., 1992; Brinkmann et al., 1993), Fab, F(ab')2-Fragmente oder andere Fragmente sein, die dem gelernten Praktiker auf dem Fachgebiet gut bekannt sind, welche die variablen Domänen eines Immunglobulins oder eines funktionellen Immunglobulinfragments umfassen.
  • Beispiele von Peptiden/Proteinen, die aus einer Kette bestehen, sind die Fragmente des Einzelketten-Fv-Antikörpers, und Beispiele für Peptide/Proteine, die aus mehreren Ketten bestehen, sind die Fab-Antikörperfragmente.
  • Wie hierin verwendet, bedeutet eine „auf einem Antikörper basierende Antigen-Bindungsdomäne von menschlicher Zusammensetzung" ein Peptid/Protein, das zumindest eine Antikörper-VH-Domäne und eine Antikörper-VL-Domäne umfasst, wobei eine Homologiesuche in einer Proteinsequenz-Datenbank, die Immunglobulin-Sequenzen umfasst, für sowohl die VH- als auch die VL-Domäne, als Treffer mit dem höchsten Grad von Sequenzidentität in einer Immunglobulindomäne von menschlichem Ursprung resultiert. Eine derartige Homologiesuche kann eine BLAST-Suche sein, z.B. durch Aufrufen von http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST und Durchführung einer „BasicBLAST"-Suche unter Verwendung des „blastp"-Programms. Vorzugsweise führt solch eine Zusammensetzung dabei nicht zu einer ungünstigen Immunantwort, wenn sie einem menschlichen Empfänger verabreicht wird.
  • Wie hierin verwendet, bedeutet eine „multivalente Zusammensetzung" eine Zusammensetzung, die zumindest zwei der Antigen-Bindungsdomänen umfasst. Vorzugsweise sind die zumindest zwei Antigen-Bindungsdomänen in nächster Nähe, so dass sie die strukturelle Anordnung, relativ zu jeder anderen Bindungsstelle, die in einem vollständigen Immunglobulin-Molekül umfasst werden, imitieren. Beispiele für multivalente Zusammensetzungen sind vollständige Immunglobulin-Moleküle (z.B. IgG-, IgA- oder IgM-Moleküle) oder multivalente Fragmente davon (z.B. F(ab')2). Zusätzlich können multivalente Zusammensetzungen von höheren Valenzen aus zwei oder mehreren multivalenten Zusammensetzungen (z.B. zwei oder mehrere vollständige Immunglobulin-Moleküle), z.B. durch Vernetzung gebildet werden. Multivalente Zusammensetzungen können jedoch auch aus zwei oder mehreren monovalenten Immunglobulin-Fragmenten, z.B. durch Selbst-Assoziation wie in Miniantikörpern, oder durch Vernetzung gebildet werden.
  • Wie hierin verwendet, bedeutet der Begriff „Miniantikörperfragment" ein multivalentes Antikörperfragment, das zumindest zwei Antigen-Bindungsdomänen umfasst, die durch selbst-assoziierende Domänen, die mit jeder der Domänen fusioniert sind, multimerisiert werden (Pack, 1994), z.B. Dimere, die zwei scFv-Fragmente umfassen, jede mit einer selbst-assoziierenden Dimerisierungsdomäne fusioniert. Die Dimerisierungsdomänen, welche besonders bevorzugt werden, beinhalten jene, die von einem Leucin-Zipper (Pack und Plückthun, 1992) oder einem Helix-Turn-Helix-Motiv (Packet al., 1993) stammen.
  • Wie hierin verwendet, bedeutet „aktivierte Zellen" Zellen einer bestimmten Population von Interesse, welche nicht ruhen. Die Aktivierung könnte durch Mitogene (z.B. Lipopolysaccharid, Phytohämagglutinin) oder Cytokine (z.B. Interferon-gamma) verursacht werden. Vorzugsweise tritt die Aktivierung während der Tumortransformation (z.B. durch das Epstein-Barr-Virus oder „spontan") auf. Vorzugsweise werden aktivierte Zellen durch die Merkmale von MHC-Klasse-II-Molekülen, die auf der Zelloberfläche exprimiert werden, und durch ein oder mehrere zusätzliche Merkmale, die erhöhte Zellgröße, Zellteilung DNA-Replikation, Expression von CD45 oder CD11 und Produktion/Sekretion von Immunglobulin beinhalten, charakterisiert.
  • Wie hierin verwendet, bedeutet „nicht aktivierte Zellen" Zellen einer Population von Interesse, welche ruhen und sich nicht teilen. Die nicht aktivierten Zellen können ruhende B-Zellen, wie aus gesundem menschlichem Blut gereinigt, beinhalten. Solche Zellen können vorzugsweise durch den Mangel oder durch das reduzierte Niveau der MHC-Klasse-II-Moleküle, die auf der Zelloberfläche exprimiert werden, und durch den Mangel oder durch das reduzierte Niveau von einem oder mehreren zusätzlichen Merkmalen, die erhöhte Zellgröße, Zellteilung, DNA-Replikation, Expression von CD45 oder CD11 und die Produktion/Sekretion von Immunglobulin beinhalten, charakterisiert werden.
  • „Zumindest 5-fach niedrigerere IC50" bedeutet, dass die Konzentration einer multivalenten Zusamensetzung, die zumindest ein Peptid/Protein der vorliegenden Erfindung umfasst, das benötigt wird, um 50% der aktivierten Zellen abzutöten, zumindest fünfmal geringer ist als die Konzentration der multivalenten Zusammensetzung, die benötigt wird, um nicht aktivierte Zellen abzutöten. Vorzugsweise kann die Konzentration, die benötigt wird, um 50% der nicht aktivierten Zellen zu töten, nicht mit therapeutisch geeigneten Konzentrationen der multivalenten Zusammensetzung erreicht werden. Am meisten bevorzugt wird der IC50-Wert in dem nachstehend in Beispiel G beschriebenen Test bestimmt.
  • Wenn „lymphoide Zellen" unter Bezugnahme einer Zelllinie oder einer Zelle verwendet werden, bedeutet es, dass die Zelllinie oder Zelle von der lymphoiden Abstammungslinie abgeleitet wird. "Lymphoide Zellen" beinhalten Zellen der B- und T-Lymphozyten-Abstammungslinie und der Makrophagen-Abstammungslinie.
  • Zellen, die „keine lymphoide Zellen sind und MHC-Klasse-II exprimieren" sind Zellen, die andere sind als lymphoiden Zellen, die MHC-Klasse-II-Moleküle exprimieren, z.B. während einer pathologischen Entzündungsreaktion. Zum Beispiel können die Zellen Synovialzellen, Endothelzellen, Schilddrüsen-Stromazellen und Gliazellen beinhalten, und es kann auch genetisch veränderte Zellen umfassen, die in der Lage sind, MHC-II-Klasse-Moleküle zu exprimieren.
  • Die Begriffe „Apoptose" und „apoptotische Aktivität" beziehen sich auf die geordnete oder kontrollierte Form des Zelltods bei Säugern, der von einer oder mehreren charakteristischen Zellveränderungen begleitet wird, einschließlich der Verdichtung des Cytoplasmas, dem Verlust der Plasmamembran-Microvilli, der Aufteilung des Zellkerns, dem Abbau von chromosomaler DNA oder dem Verlust der mitochondrialen Funktion. Die Apoptose folgt einem sehr stringenten Zeitverlauf und wird von Caspasen, einer spezifischen Gruppe von Proteasen, ausgeführt. Die apoptotische Aktivität kann zum Beispiel durch Zelllebensfähigkeit-Tests, Annexin V-Färbung oder Caspasehemmung-Tests bestimmt und gemessen werden. Die Apoptose kann unter Verwendung eines vernetzenden Antikörpers wie anti-CD95 induziert werden, wie in Beispiel H beschrieben.
  • Wie hierin verwendet, bedeutet der Begriff „erste Domäne der α-Kette von HLA-DR" die N-terminale Domäne der alpha-Kette des DR-Moleküls der MHC-Klasse II.
  • Wie hierin verwendet, bedeutet der Begriff „erste Domäne der β-Kette von HLA-DR" die N-terminale Domäne der beta-Kette des DR-Moleküls der MHC-Klasse II.
  • Der Begriff „eigenes vorprogrammiertes Verfahren" bezieht sich auf ein Verfahren, das, wenn es einmal gestartet wird, einer autonomen Kaskade von Mechanismen innerhalb einer Zelle folgt, welche keine weitere Hilfsunterstützung aus der Umgebung der Zelle benötigt, um das Verfahren abzuschließen.
  • Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff „HuCAL" auf eine vollständig synthetische menschliche kombinatorische Antikörperbibliothek, wie in Knappik et al. (2000) beschrieben.
  • Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff „CDR3" auf die dritte Komplementarität bestimmende Region der VH- und VL-Domänen der Antikörper oder der Fragmente davon, wobei die VH-CDR3 die Positionen 95 bis 102 (mögliche Insertionen nach den Positionen 100, gelistet als 100a bis 100z), und die VL-CDR3 die Positionen 89 bis 96 (mögliche Insertionen in Vλ nach Position 95, gelistet als 95a bis 95 c) (s. Knappik et al., 2000) abdeckt.
  • Wie hierin verwendet, ist unter dem Begriff „hybridisiert unter stringenten Bedingungen" zu verstehen, dass Bedingungen für die Hybridisierung und das Waschen beschrieben werden, unter denen die zumindest 60% zueinander homologen Nucleotidsequenzen normalerweise zueinander hybridisiert bleiben. Vorzugsweise sind die Bedingungen so, dass die Sequenzen, die zumindest 65%, bevorzugter zumindest 70% und sogar bevorzugter zumindest 75% homolog zueinander sind, normalerweise zueinander hybridisiert bleiben. Solche stringenten Bedingungen sind den Fachleuten bekannt und können in Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York (1989), 6.3.1-6.3.6 gefunden werden. Ein bevorzugtes, nicht begrenzendes Beispiel von stringenten Hybridisierungsbedingungen ist die Hybridisierung in 6 × Natriumchlorid/Natriumcitrat (SSC) bei etwa 45°C, gefolgt von einer oder mehreren Waschungen in 0.2 × SSC, 0.1% SDS bei 50°-65°C.
  • Eine multivalente Zusammensetzung von zumindest einem Peptid/Protein gemäß der Erfindung, und wie in den beigefügten Patentansprüchen spezifiziert, ist in der Lage, den Zelltod von aktivierten Zellen, vorzugsweise lymphoiden Tumorzellen ohne irgendwelche weiteren zusätzlichen Maßnahmen wie Chemotherapie und mit begrenzten immunogenen Nebenwirkungen am behandelten Patienten zu verursachen. Weiter hat die multivalente Zusammensetzung, die ein Peptid/Protein gemäß der Erfindung umfasst, die Fähigkeit, an zumindest einem Epitop des Zielantigens zu binden, jedoch könnten mehrere Epitop-Bindungsstellen in einem Molekül kombiniert werden. Vorzugsweise zeigt die multivalente Zusammensetzung, die ein Peptid/Protein gemäß der Erfindung umfasst, eine zumindest 5-fach oder bevorzugter 10-fach höhere Tötungsaktivität gegen die aktivierten Zellen, verglichen zu den nicht aktivierten Zellen. Diese höhere Aktivität auf aktivierte Zellen kann als zumindest 5-fach niedrigerer IC50-Wert an aktivierten versus nicht aktivierten Zellen oder als höherer Anteil der Abtötung von aktivierten Zellen versus nicht aktivierten Zellen bei Verwendung der gleichen Proteinkonzentration ausgedrückt werden. Unter der letzteren Alternative tötet die multivalente Zusammensetzung, die ein Peptid/Protein gemäß der Erfindung, und wie in den beigefügten Patentansprüchen spezifiziert, umfasst, bei einer gegebenen Peptid-/Protein-Konzentration zumindest 50% vorzugsweise zumindest 80% der aktivierten Zellen, während die gleiche Konzentration einer multivalenten Zusammensetzung, die ein Peptid/Protein gemäß der Erfindung umfasst, unter den gleichen Inkubationsbedingungen weniger als 15%, vorzugsweise weniger als 10% der nicht aktivierten Zellen tötet. Die Test-Bedingungen für die Bestimmung des IC50-Werts und der Anteil der Tötungsaktivität werden nachstehend beschrieben.
  • Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform ist das Peptid/Protein, wie in den beigefügten Patentansprüchen spezifiziert, auf eine lymphoide Zelle oder nicht lymphoiden Zelle, die MHC-Klasse-II-Moleküle exprimiert, gerichtet. Der letztere Zelltyp tritt zum Beispiel bei pathologischen Stellen von Entzündung und/oder von Autoimmunkrankheiten auf, z.B. Synovialzellen, Endothelzellen, Schilddrüsen-Stromazellen und Gliazellen, oder er kann auch genetisch veränderte Zellen umfassen, die in der Lage sind, MHC-Klasse-II-Moleküle zu exprimieren.
  • Vorzugsweise ist das Peptid/Protein, wie in den beigefügten Patentansprüchen spezifiziert, auf lymphoide Tumorzellen gerichtet. Bevorzugter sind lymphoide Tumorzellen, die eine Erkrankung darstellen, die aus B-Zell-Non-Hodgkin-Lymphom, B-Zell-Lymphom, akute lymphoide Leukämie der B-Zellen, Burkitt-Lymphom, Hodgkin-Lymphom, Haarzell-Leukämie, akute myeloische Leukämie und B-Zell-Vorläufer-Leukämie ausgewählt ist. Am meisten bevorzugt sind lymphoide Tumorzellen aus einer Zelllinie, die der Liste von GRANTA-519-, KARPAS-422-, DOHH-2-, MHH-CALL-4-, MN-60-, BJAB-, L-428-, BONNA-12-, EOL-1-, MHH-PREB-1- und MHH-CALL-2-Zelllinien entnommen wurden.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform bindet das Peptid/Protein, wie in den beigefügten Patentansprüchen spezifiziert, zumindest ein Antigen, das Epitope umfasst, die von HLA-DR-Molekülen ausgewählt sind.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform bindet das Peptid/Protein, wie in den beigefügten Patentansprüchen spezifiziert, zumindest ein Epitop in der alpha-Kette eines HLA-DR-Moleküls.
  • Vorzugsweise bindet das Peptid/Protein, wie in den beigefügten Patentansprüchen spezifiziert, zumindest ein Epitop in der ersten Domäne der alpha-Kette von HLA-DR, der ersten Domäne, welche die N-terminale Domäne der Kette ist.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform bindet das Peptid/Protein, wie in den beigefügten Patentansprüchen spezifiziert, zumindest ein Epitop innerhalb der alpha-Helix, die von Glu55 bis Tyr79 der alpha-Kette von HLA-DR reicht.
  • Alternativ bindet das Peptid/Protein, wie in den beigefügten Patentansprüchen spezifiziert, zumindest ein Epitop in der beta-Kette eines HLA-DR-Moleküls. Vorzugsweise bindet das Peptid/Protein, wie in den beigefügten Patentansprüchen spezifiziert, zumindest ein Epitop in der ersten Domäne der beta-Kette von HLA-DR, der ersten Domäne, welche die N-terminale Domäne der Kette ist.
  • In einer Ausführungsform schließt der Mechanismus der Tötung der Zielzellen, die durch das Peptid/Protein induziert wird, ein eigenes vorprogrammiertes Verfahren der Zelle ein.
  • Vorzugsweise induziert das Peptid/Protein, wie in den beigefügten Patentansprüchen spezifiziert, einen Tötungsmechanismus, der kein apoptotischer Zelltod-Prozess ist.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform induziert das Peptid/Protein, wie in den beigefügten Patentansprüchen spezifiziert, einen Tötungsmechanismus, der von der Wirkung der Proteasen, mit Ausnahme von Caspasen, abhängig ist.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform zeigt das Peptid/Protein, wie in den beigefügten Patentansprüchen spezifiziert, als multivalente Zusammensetzung einen IC50-Wert für aktivierte Zellen, vorzugsweise lymphoide Tumorzellen, in dem nachstehend beschriebenen Test, welcher niedriger als 100 nM, vorzugsweise niedriger als 40 nM, am meisten bevorzugt niedriger als 20 nM ist.
  • In einer weiteren Ausführungsform umfasst die multivalente Zusammensetzung zumindest einen vollständigen Antikörper, welcher aus den Klassen IgG1, 2a, 2b, 3, 4, IgA und IgM ausgewählt ist.
  • In einer weiteren Ausführungsform umfasst die multivalente Zusammensetzung zumindest eines des F(ab')2-Antikörperfragments oder Miniantikörperfragments.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die multivalente Zusammensetzung zumindest zwei monovalente Antikörperfragmente, ausgewählt aus Fv, scFv, dsFv und Fab-Fragmenten, und umfasst außerdem eine Vernetzungseinheit oder Vernetzungseinheiten.
  • Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird die multivalente Zusammensetzung vor der Bindung an die Zelle gebildet. Dies kann z.B. durch Vernetzung des multiplen Peptids/Proteins der vorliegenden Erfindung erreicht werden.
  • In einer alternativen Ausführungsform wird eine multivalente Zusammensetzung nach Bindung an die Zelle gebildet. Dies kann zum Beispiel durch Bindung des Peptids/Proteins an Epitope, die in nächster Nähe auf der Zelle sind, gefolgt von Vernetzung des Peptids/Proteins erreicht werden.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Peptid/Protein eine Antigen-Bindungsdomäne, welche aus einer Kombination einer VH-Domäne und einer VL-Domäne besteht, wobei die Kombination in einem der aus der Liste MS-GPC-1, MS-GPC-6, MS-GPC-8, MS-GPC-10, MS-GPC-8-6 und MS-GPC-8-17 ausgewählten Clone, wie in Tabelle 1 und 11 gezeigt, gefunden wird.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfasst das Peptid/Protein, wie in den beigefügten Patentansprüchen spezifiziert, eine Antigen-Bindungsdomäne, welche aus einer Kombination von HuCAL-VH2 und HuCAL-Vλ1 besteht, wobei die VH-CDR3-Sequenz von der Konsensus-CDR3-Sequenz
    nnnnRGnFDn|
    genommen wird, wobei jedes n unabhängig einen Aminosäurerest darstellt; und wobei die VL-CDR3-Sequenz von der Konsensus-CDR3-Sequenz
    QSYDnnnn|
    genommen wird, wobei jedes n unabhängig einen Aminosäurerest darstellt.
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf eine Nucleinsäure, die ein Peptid/Protein, wie in den beigefügten Patentansprüchen spezifiziert, gemäß der Erfindung codiert. Auch werden Varianten dieser Nucleinsäure umfasst, die unter stringenten Bedingungen mit einer Nucleinsäure, wie vorstehend beschrieben, hybridisieren, wobei die Varianten ein Peptid/Protein gemäß der Erfindung codieren. Ein Vektor, der zumindest eine Nucleinsäure gemäß der Erfindung oder eine Variante davon umfasst, wird ebenfalls in Erwägung gezogen.
  • Die Erfindung bezieht sich außerdem auf eine Wirtszelle, die Nucleinsäuren oder Vektoren beherbergt, wie vorstehend beschrieben.
  • Gemäß der Erfindung wird das Peptid/Protein durch ein Verfahren hergestellt, das den Schritt der Expression von zumindest einer Nucleinsäure oder einer Variante davon, wie vorstehend beschrieben, in einem geeigneten Expressionssystem, das ein zellfreies Expressionssystem sein kann, aber vorzugsweise ein zellenthaltendes Expressionssystem ist, und die Isolierung des Proteins davon, umfasst. Die Nucleinsäure für die Herstellung der Proteine gemäß der Erfindung kann durch Standard-Laborverfahren, die dem Fachmann gut bekannt sind, erhalten werden (s. z.B. Ausubel et al., 1998).
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich außerdem auf ein Arzneimittel, das zumindest ein Peptid/Protein gemäß der Erfindung enthält, gegebenenfalls zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger und/oder einem pharmazeutisch verträglichen Verdünnungsmittel.
  • Das Peptid/Protein gemäß der Erfindung wird vorzugsweise für die Herstellung eines Arzneimittels für die Behandlung von Lebewesen, vorzugsweise Menschen, verwendet.
  • Das Peptid/Protein gemäß der Erfindung ist besonders nützlich bei der Behandlung von Krebsarten, vorzugsweise Krebs, der Zellen umfasst, die MHC-Klasse-II-Antigene exprimieren. Solche Krebsformen beinhalten Hodgkin-, Non-Hodgkin- und Burkitt-Lymphom, B- und bestimmte T-Zell-Lymphome, akute lymphoide Leukämie der B-Zellen, akute myeloische Leukämien und Haarzell-Leukämie.
  • In einer weiteren Ausführungsform wird das Protein/Peptid gemäß der Erfindung zur Herstellung eines Arzneimittels für die Behandlung von Erkrankungen des Immunsystems verwendet, die Zustände wie rheumatoide Arthritis, juvenile Arthritis, multiple Sklerose, Morbus Basedow, insulinabhängigen Diabetes, Narkolepsie, Psoriasis, systemischen Lupus erythematodes, Spondylitis ankylosans, Transplantat- Abstoßung, Graft-versus-Host-Erkrankung, Hashimoto-Thyreoiditis, Myasthenia gravis, Pemphigus vulgaris, Glomerulonephritis, Thyroiditis, Pankreatitis, Insulitis, primäre biliäre Zirrhose, Reizdarm-Erkrankung und Sjögren-Syndrom einschließen.
  • Die Erfindung bezieht sich außerdem auf eine diagnostische Zusammensetzung, die zumindest ein Peptid/Protein und/oder eine Nucleinsäure gemäß der Erfindung, gegebenenfalls zusammen mit weiteren Reagenzien, wie Puffer, zur Durchführung der Diagnose enthält.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform enthält die diagnostische Zusammensetzung das Peptid/Protein gemäß der Erfindung, das zumindest durch eine Einheit vernetzt ist. Solche Einheiten können zum Beispiel Antikörper sein, die ein auf dem Peptid/Protein vorhandenes Epitop wie das FLAG-Peptid-Epitop erkennen (Hopp et al., 1988; Knapppik und Plückthun, 1994), oder bifunktionelle chemische Verbindungen, die mit einer nucleophilen Aminosäureseitenkette, wie in Cystein oder Lysin vorhanden, reagieren (King et al., 1994). Verfahren zum Vernetzen von Peptiden/Proteinen sind dem gewöhnlichen Praktiker gut bekannt.
  • Eine diagnostische Zusammensetzung, die zumindest eine Nucleinsäure und/oder eine Variante davon gemäß der Erfindung enthält, wird auch in Erwägung gezogen.
  • Auch wird ein Verfahren beschrieben, um aktivierte Zellen selektiv abzutöten, das den Schritt des In-Kontakt-Bringens der Zielzellen mit einer multivalenten Zusammensetzung umfasst, die zumindest ein Peptid/Protein gemäß der Erfindung umfasst.
  • Darüber hinaus bezieht sich die vorliegende Erfindung auf einen Kit, der zumindest ein Peptid/Protein gemäß der vorliegenden Erfindung und eine Vernetzungseinheit umfasst.
  • Zusätzlich bezieht sich die vorliegende Erfindung auf einen Kit, umfassend (i) ein Peptid/Protein gemäß der vorliegenden Erfindung, (ii) eine nachweisbare Einheit oder nachweisbare Einheiten, und (iii) Reagenzien und/oder Lösungen, um die Bindung von (i) an ein Antigen zu erreichen und/oder nachzuweisen.
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich außerdem auf eine multivalente Zusammensetzung, die zumindest ein Peptid/Protein umfasst und zumindest zwei Antigen-Bindungsdomänen umfasst.
  • Beschreibungen der Figuren
  • 1
  • Die Spezifität der Anti-HLA-DR-Antikörperfragmente MS-GPC-1, 6, 8 & 10, die aus der HuCAL-Bibliothek zum HLA-DR-Protein isoliert wurden, eines Maus-Mensch chimären HLA-Proteins und Proteine der Negativkontrolle (Lysozym, Transferrin, BSA und menschliches β-Globulin). Die Spezifität wurde unter Verwendung von Standard-ELISA-Verfahren bewertet. Ein nicht zugehöriges Antikörperfragment (irr.scFv) wurde als Kontrolle verwendet.
  • 2
  • Die Reaktivität der Anti-HLA-DR-Antikörperfragmente (MS-GPC-1, 6, 8 und 10) an verschiedene Zelllinien, die die MHC-Klasse-II-Moleküle exprimieren. "+" repräsentiert starke Reaktivität, wie unter Verwendung des Standard-Immunfluoreszenz-Verfahrens nachgewiesen. "+/–" repräsentiert eine schwache Reaktivität und "–" keine nachgewiesene Reaktivität zwischen einem anti-HLA-DR-Antikörperfragment und einer bestimmten Zelllinie.
  • 3
  • Die Lebensfähigkeit der Tumorzellen in Anwesenheit der monovalenten und vernetzten anti-HLA-DR-Antikörperfragmente, wie durch die Färbung mit Trypanblau bestimmt. Die Lebensfähigkeit der GRANTA-519-Zellen wurde 4 h nach Inkubation mit den anti-HLA-DR-Antikörperfragmenten (MS-GPC-1, 6, 8 und 10) mit und ohne anti-FLAG-M2-mAb als Vernetzungsmittel getestet.
  • 4
  • Das Abtöten der aktivierten versus der nicht aktivierten Zellen. MHH-PREB-1-Zellen werden mit Lipopolysaccharid und Interferon-gamma aktiviert und anschließend 4 h mit 200 nM anti-HLA-DR-Antikörperfragment MS-GPC-8, vernetzt unter Verwendung von 100 nM anti-FLAG-M2-mAB, inkubiert. Die Abtötung der nicht aktivierten MHH-PREB-1-Zellen als Kontrolle wird kaum beobachtet.
  • 5
  • Die IC50-Werte für aktivierte und nicht aktivierte Zellen. Die Verdünnungsreihe der vier anti-HLA-DR-Antikörperfragmente (MS-GPC-1, 6, 8 und 10), vernetzt unter Verwendung des anti-FLAG-M2-mAb, zeigt, dass 50%ige Abtötung der aktivierten GRANTA-519-Zellen bei weniger als 100 nM bivalenter equivalenter Konzentration des anti-HLA-DR-Antikörperfragments erreicht wird. Eine 50%ige Abtötung ist für nicht aktivierte ruhende B-Zellen über einen Bereich von 2 bis 200 nM bivalenter equivalenter Konzentration des anti-HLA-DR-Antikörperfragments nicht messbar.
  • 6
    • a. Die Inkubation von Priess-Zellen mit dem anti-HLA-DR-Antikörperfragment MS-GPC-8, vernetzt unter Verwendung des anti-FLAG-M2-mAb, zeigt eine schnellere Abtötung als eine Züchtung von Priess-Zellen, die unter Verwendung von anti-CD95-mAB in die Apoptose induziert wurden. Eine Annexin V/PI färbende Technik identifiziert tote Zellen.
    • b. Die Inkubation der Priess-Zellen mit dem anti-HLA-DR-Antikörperfragment MS-GPC-8, vernetzt unter Verwendung des anti-FLAG-M2-mAb, zeigt kaum einen Hinweis auf einen apoptotischen Mechanismus, verglichen mit einer apoptotischen Züchtung von Priess-Zellen, die unter Verwendung von anti-CD95-mAb induziert wurden. Eine Annexin V/PI färbende Technik identifiziert apoptotische Zellen.
  • 7
  • Die Vektorkarte und die Sequenz des scFv-Phagen-Display-Vektors pMORPH13_scFv.
  • Der Vektor pMORPH13_scFv ist ein Phagemid-Vektor, der ein Gen umfasst, das eine Fusion zwischen der C-terminalen Domäne des Gen-III-Proteins des filamentösen Phagen und einem HuCAL-scFv codiert. In 7 wird ein Vektor gezeigt, der ein Modell-scFv-Gen (Kombination von VH1A und Vλ3 (Knappik et al., 2000) umfasst.
  • 8
  • Die Vektorkarte und die Sequenz des scFv-Expressionsvektors pMx7_FS_5D2.
  • Der Expressionsvektor pMx7_FS-5D2 führt zu der Expression der HuCAL-scFv-Fragmente (in 8 umfasst der Vektor ein Gen, das ein „unechtes" Antikörperfragment, "5D2" genannt, codiert), wenn VH-CH1 mit einer Kombination eines FLAG-Tags (Hopp et al., 1988; Knappik und Plückthun, 1994) und eines STREP-Tags II (WSHPQFEK) (IBA GmbH, Göttingen, Deutschland; s. http://www.iba-go.de und Schmidt und Skerra, 1993; Schmidt und Skerra, 1994; Schmidt et al., 1996; Voss und Skerra, 1997) fusioniert wird.
  • 9
  • Die Vektorkarte und die Sequenz des Fab-Expressionsvektors pMx9_Fab_GPC8.
  • Der Expressionsvektor pMx9_Fab_GPC8 führt zu der Expression der HuCAL-Fab-Fragmente (in 9 umfasst der Vektor das Fab-Fragment MS-GPC8), wenn VH-Ch1 mit einer Kombination eines FLAG-Tags (Hopp et al., 1988; Knappik und Plückthun, 1994) und eines STREP-Tags II (WSHPQFEK) (IBA GmbH, Göttingen, Deutschland; s: http://www.iba-go.de und Schmidt und Skerra, 1993; Schmidt und Sekra, 1994; Schmidt et al., 1996; Voss und Skerra, 1997).
  • 10
  • Die Vektorkarte und die Sequenz des Fab-Phagen-Display-Vektors pMORPHI8_Fab_GPC8.
  • Die Derivate des Vektors PMORPH18 sind Phagemid-Vektoren, die ein Gen umfassen, das eine Fusion zwischen der C-terminalen Domäne des Gen-III-Proteins des filamentösen Phagen und der VH-CH1-Kette eines HuCAL-Antikörpers codiert.
  • Zusätzlich umfasst der Vektor die getrennt codierte VL-CL-Kette. In 10 wird ein Vektor gezeigt, der das Fab-Fragment MS-GPC-8 umfasst.
  • 11
  • Die Aminosäuresequenzen der VH- und VL-Domänen von MS-GPC-1, MS-GPC-6, MS-GPC-8, MS-GPC-10, MS-GPC-8-6 und MS-GPC-8-17.
  • Die folgenden Beispiele veranschaulichen die Erfindung.
  • Beispiele
    • (Alle Puffer, Lösungen oder Verfahren ohne ausdrücklicher Bezugnahme können in Standard-Fachbüchern, zum Beispiel in Current Protocols of Immunology (1997 und 1999) oder in Sambrook et al., 1989 gefunden werden.)
  • A. Die Herstellung eines menschlichen Antigens
  • Um zu zeigen, dass wir cytotoxische Antigen-Bindungsdomänen von menschlicher Zusammensetzung identifizieren konnten, präparierten wir zuerst eine gereinigte Form eines menschlichen Antigens, das menschliche MHC-Klasse-II-DR-Protein (DRA*0101/DRB1*0401) aus Priess-Zellen (Gorga et al., 1984; Gorga et al., 1986; Gorga et al., 1987; Stern et al., 1992), wie folgt.
  • Erstens wurden PRIESS-Zellen (ECACC, Salisbury UK) in RPMI und 10% FCS unter Verwendung von Standardbedingungen gezüchtet und 1010 Zellen wurden in 200 ml PBS (pH 7.5), das 1% NP-40, 25 mM Iodacetamid, 1 mM PMSF und 10 mg/l jeden der Proteaseinhibitoren Chymostatin, Antipain, Pepstatin A, Trypsin-Inhibitor aus Sojabohne und Leupeptin enthielt, lysiert. Das Lysat wurde bei 10.000 g (30 Minuten, 4°C) zentrifugiert und der resultierende Überstand wurde mit 40 ml einer wässrigen Lösung, die 5% Natriumdesoxycholat, 5mM Iodacetamid und 10 mg/l jeden der vorstehenden Proteaseinhibitoren enthielt, ergänzt und zwei Stunden bei 100.000 g (4°C) zentrifugiert. Um das Material zu entfernen, das nicht spezifisch und endogene Antikörper band, wurde der resultierende Überstand 0.2 mM mit PMSF gemacht und über Nacht (4°C) durch eine Kaninchenserum-Affigel-10-Säule (5 ml) passiert, gefolgt von einer Protein-G-Sepharose-Fast-Flow-Säule (2 ml; Pharmacia) unter Verwendung einer Durchflussgeschwindigkeit von 0.2 ml/min.
  • Zweitens wurde das vorbehandelte Lysat chargenweise mit 5 ml LB3.1-Protein-G-Sepharose-Fast-Flow-Kügelchen (Stern et al., 1993) über Nacht bei 4°C unter Verwendung von sanftem Vermischen inkubiert, und dann auf eine kleine Säule übertragen, die dann ausgiebig mit drei Lösungen gewaschen wurde: (1) 100 ml einer Lösung, die aus 50 mM Tris/HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 0.5% NP-40, 0.5% Natriumdesoxycholat, 10% Glycerol und 0.03% Natriumazid besteht, bei einer Durchflussgeschwindigkeit von 0.6 ml/min). (2) 25 ml einer Lösung, die aus 50 mM Tris/HCl (pH 9.0), 0.5 M NaCl, 0.5% NP-40, 0.5% Natriumdesoxycholat, 10% Glycerol und 0.03% Natriumazid besteht, bei einer Durchflussgeschwindigkeit von 0.9 ml/min; (3) 25 ml einer Lösung, die aus 2 mM Tris/HCl (pH 8.0), 1% Octyl-β-D-Glucopyranosid, 10% Glycerol und 0.03% Natriumazid besteht, bei einer Durchflussgeschwindigkeit von 0.9 ml/min.
  • Drittens wurde das MHC-Klasse-II-DR-Protein (DRA*0101/DRB1*0401) unter Verwendung von 15 ml einer Lösung, die aus 50 mM Diethylamin/HCl (pH 11.5), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% Octyl-β-D-Glucopyranosid, 10% Glycerol, 10 mM Iodacetamid und 0.03% Natriumazid besteht, bei einer Durchflussgeschwindigkeit von 0.4 ml/min eluiert. 800 μl-Fraktionen wurden unmittelbar mit 100 μl 1 M Tris/HCl (pH 6.8), 150 mM NaCl und 1% Octyl-β-D-Glucopyranosid neutralisiert. Die Inkubation des Lysats mit den LB3.1-Protein-G-Sepharose-Fast-Flow-Kügelchen wurde wiederholt bis das Lysat von MHC-Protein aufgebraucht war. Die reinen eluierten Fraktionen des MHC-Klasse-II-DR-Proteins (wie durch SDS-PAGE analysiert) wurden zusammengefasst und zu 1.0-1.3 g/l unter Verwendung von Vivaspin-Konzentratoren mit einer Abgrenzung von einem Molekulargewicht von 30 kDa konzentriert. Ungefähr 1 mg MHC-Klasse-II-DR-Präparation wurde mit PBS, das 1 % Octyl-β-D-Gucopyranosid enthielt, unter Verwendung des gleichen Vivaspin-Konzentrators neu gepuffert, um die direkte Kopplung des Proteins an BIAcore-CM5-Chips zu ermöglichen.
  • B. Das Durchmustern von HuCAL
  • B.1. Einführung
  • Wir identifizierten Antigen bindende Antikörperfragmente von menschlicher Zusammensetzung gegen das menschliche Antigen (DRA*0101/DRB1*0401) von einer menschlichen Antikörperbibliothek, auf der Grundlage eines neuen Konzepts, das neulich entwickelt wurde (Knappik et al., 2000). Ein Konsensus-Rahmen, der in insgesamt 49 unterschiedliche Rahmen resultiert, stellt hier jede der bei menschlichen Immunantworten häufig verwendete VH- und VL-Unterfamilien dar. Diese Meistergene wurden entworfen, um ungünstige Reste zu berücksichtigen und zu entfernen, die die Proteinaggregation fördern, sowie einzigartige Restriktionsstellen zu schaffen, die zu modularer Zusammensetzung der Gene führt. In HuCAL-scFv wurden sowohl die VH- als auch die VL-CDR3 codierenden Regionen der 49 Mastergene randomisiert.
  • B.2. Phagemid-Regenerierung, Phagenamplifikation und Reinigung
  • Die HuCAL-scFv-Bibliothek (Knappik et al., 2000), die in einen auf einem Phagemid basierenden Phage-Display-Vektor pMORPH13_scFv (s. 7) cloniert wurde, wurde in E. coli TG-1 in 2 × TV-Medium, das 34 μg/ml Chloramphenicol und 1% Glucose enthielt (2 × TV-CG), amplifiziert. Nach Infektion des Helfer-Phagen (VCSM13) bei 37°C bei einer OD600 von etwa 0.5, Zentrifugation und Resuspension in 2 × TV/34 μg/ml Chloramphenicol/50 μg/ml Kanamycin/0.1 mM IPTG wurden die Zellen über Nacht bei 30°C gezüchtet. Die Phagen wurden aus dem Überstand mit PEG gefällt (Ausubel et al., 1998), in PBS/20% Glycerol resuspendiert und bei –80°C gelagert. Die Phagenamplifikation zwischen zwei Panning-Runden wurde wie folgt ausgeführt: TG1-Zellen der mid-log Phase wurden mit dem eluierten Phagen infiziert und auf LB-Agar, ergänzt durch 1% Glucose und 34 μg/ml Chloramphenicol, plattiert. Nach Inkubation über Nacht bei 30°C wurden die Kolonien abgekratzt, zu einer OD600 von 0.5 angepasst und der Helferphage wurde hinzugefügt, wie vorstehend beschrieben.
  • B.3. Das manuelle Festphasen-Panning
  • Die Vertiefungen der MaxiSorpTM-Mikrotiterplatten (Nunc) wurden mit MHC-Klasse-II-DRA*0101/DRB1*0401 (wie vorstehend präpariert), gelöst in PBS, beschichtet (2 μg/Well). Nach Blockierung mit einer 5%igen fettfreien getrockneten Milch in PBS wurden 1-5 × 1012 HuCAL-sdFv-Phagen, wie vorstehend gereinigt, 1h bei 20°C hinzugefügt. Nach mehreren Waschsstufen wurden die gebundenen Phagen durch pH-Elution mit 100 mM Triethylamin und anschließender Neutralisation mit 1 M TRIS-Cl pH 7.0 eluiert. Drei Panning-Runden wurden durchgeführt, die, wie vorstehend beschrieben, zwischen jeder Runde mit der Phagen-Amplifikation durchgeführt wurde.
  • B.4. Das gemischte Festphasen/Gesamtzell-Panning
  • Drei Panning-Runden und Phagenamplifikation wurden durchgeführt, wie in B.3. und B.2. beschrieben, mit der Ausnahme, dass bei der zweiten Runde zwischen 1 × 107 und 5 × 107 PRIESS-Zellen in 1 ml PBS/10% FCS in 10 ml Falcon-Röhrchen für das Gesamtzell-Panning verwendet wurden. Nach 1h Inkubation bei 20°C mit der Phagen-Präparation wurde die Zellsuspenison zentrifugiert (2000 Upm für 3 min), um den nicht bindenden Phagen zu entfernen, die Zellen wurden dreimal mit 10 ml PBS gewaschen, jedes Mal gefolgt von einer Zentrifugation, wie beschrieben. Der Phage, der spezifisch an die Zellen band, wurde durch die pH-Elution unter Verwendung von 100 mM HCl weg eluiert. Alternativ konnte der bindende Phage durch direktes Hinzufügen von E. coli zu der Suspension nach Triethylamin-Behandlung (100 mM) und anschließender Neutralisation amplifiziert werden.
  • B.5. Die Identifizierung der HLA-DR bindenden scFv-Fragmente
  • Die nach drei Runden Festphasen-Panning (B.3) oder gemischtes Festphasen/Gesamtzell-Panning (B.4) erhaltene Clone wurden durch die FACS-Analyse auf PRIESS-Zellen für die Bindung an HLA-DR auf der Zelloberfläche durchmustert. Für die Expression wurden die scFv-Fragmente über XbaI/EcoRI in das pMx7_FS als Expressionsvektor cloniert (s. 8). Die Expressionsbedingungen werden nachstehend in Beispiel C.2. gezeigt.
  • Aliquots von 106 Priess-Zellen wurden bei 4°C in die Wells einer 96-Well-Mikrotiterplatte übertragen. ScFv im Blockierungspuffer (PBS/5% FCS) wurden 60 min hinzugefügt und mit der Verwendung eines anti-FLAG-M2-Antikörpers (Kodak) (1:5000 Verdünnung), gefolgt von einem polyclonalen anti-Maus-IgG-Antikörper-R-Phycoerythrin-Konjugat der Ziege (Jackson ImmunoResearch, 115-116-146, F(ab')2- Fragment) (1:200 Verdünnung) nachgewiesen. Die Zellen wurden in 4%igem Paraformaldehyd für die Lagerung bei 4°C fixiert. 104 Ereignisse wurden für jeden Assay auf dem FACS-Calibur (Becton Dickinson) gesammelt. Nur fünfzehn aus über 500 mutmaßlichen Bindern, die spezifisch an Priess-Zellen banden, wurden identifiziert. Diese Clone wurden außerdem auf ihre Tötungsaktivität analysiert, wie nachstehend beschrieben. Tabelle 1 enthält die Sequenzmerkmale der dadurch identifizierten Clone MS-GPC-1, MS-GPC-6, MS-GPC-8 und MS-GPC-10. Die gelisteten VK- und VL-Familien und die gelisteten CDR3s beziehen sich auf die auf HuCAL-Konsensus basierenden Antikörpergene, wie beschrieben (Knappik et al., 2000), die vollständigen Sequenzen der VL- und VL-Domänen werden in 11 gezeigt.
  • C. Die Herstellung der Fab-Fragmente
  • C.1. Die Umwandlung von scFv zu Fab
  • Die variablen Domänen der scFv-Fragmente der sowohl schweren als auch der leichten Kette wurden in pMx9_Fab cloniert (9), die variablen Domänen der schweren Kette als MfeI/StyI-Fragmente, die variablen Domänen der kappa leichten Ketten als EcoRV/BsiWI-Fragmente. Die lambda-Ketten wurden zuerst aus dem entsprechenden pMORPH13_scFv-Vektor als Matrize mit den PCR-Primern CRT5 (5'-Primer) und CRT6 (3'-Primer) amplifiziert, wobei CRT6 eine einzigartige DraIII-Restriktions-Endonuclease-Stelle einführt.
    CRT5: 5' GTGGTGGTTCCGATATC 3'
    CRT6: 5' AGCGTCACACTCGGTGCGGCTTTCGGCTGGCCAAGAACGGGTTA 3'
  • Das PCR-Produkt wird mit EcoRV/DraIII) geschnitten und in pMx9_Fab cloniert (s. 9). Die leichten Fab-Ketten konnten mit einem polyclonalem anti-Mensch-IgG-Antikörper-R-Phycoerythrin-Konjugat der Ziege (Jackson ImmunoResearch, 109-116-088, F(ab')2-Fragment) (Verdünnung 1:200) nachgewiesen werden.
  • C.2. Die Expression und die Reinigung der HuCAL-Antikörperfragmente in E. coli
  • Die Expression der scFv- und Fab-Fragmente von jeweils pMx7_FS oder pMx9-Fab in E.coli-Zellen (JM83) wurden in einem Liter 2 × TV-Medium, ergänzt durch 34 μg/ml Chloramphenicol, ausgeführt. Nach Induktion mit 0.5 mM IPTG (scFv) oder 0.1 mM IPTG (Fab) wurden die Zellen bei 22°C 12 Stunden gezüchtet. Die Zellpellets wurden in einer French-Presse (Aminco) in 20 mM Natriumphosphat, 0.5 M NaCl und 10 mM Imidazol (pH 7.4) lysiert. Die Zellbruchstücke wurden durch Zentrifugation entfernt und der klare Überstand durch 0.2 μm-Poren gefiltert, bevor mit ihm eine STREP-Tag-Reinigung unter Verwendung einer Streptactin-Matrix und Reinigungsbedingungen gemäß des Lieferanten (IBA GmbH, Göttingen, Deutschland) durchgeführt wurde. Die Reinigung durch Größenauschluß-Chromatographie (SEC) wurde durchgeführt, wie von Rheinnecker et al. (1996) beschrieben. Die ersichtlichen Molekulargewichte wurden durch die SEC mit Kalibrationsstandards bestimmt und in einigen Fällen durch gekoppelte Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie (TopLab GmbH, München, Deutschland) bestätigt.
  • D. Die HLA-DR-Spezifitäts-Tests und die Epitopkartierung
  • Wir führten einen Bindungsspezifitätstest durch, um zu zeigen, dass die aus der HuCAL-Bibliothek ausgewählten Antigen-Bindungssdomänen spezifisch an das menschliche Antigen banden. Unter Verwendung eines Standard-ELISA-Verfahrens wurden die aus der HuCAL-Bibliothek ausgewählten scFv- und Fab-Fragmente auf Reaktivität mit den folgenden Antigenen getestet: HLA-DR (DRA*0101/DRB1*0401), chimäres DR-IE (das aus den N-terminalen Domänen von DRA*0101 und DRB1*0401 mit dem verbleibenden Molekül, das aus einem Klasse-II-Homolog led abgeleitet wird (Ito et al., 1996), und ein Satz von Proteinen für die Negativkontrolle, die Lysozym, Transferrin, BSA und menschliches γ-Globulin umfassen. 1 zeigt, dass alle vier anti-HLA-DR-Antikörperfragmente (MS-GPC-1, 6, 8 & 10) bessere Spezifität für die HLA-DR-Proteine zeigten als für die Kontrollproteine. Ein nicht zugehöriges Antikörperfragment (Irr.scFv) zeigte kaum spezifische Reaktivität mit den HLA-DR-Proteinen. Tatsächlich wurde gezeigt, dass irgendeine beobachtete Reaktivität von verunreinigenden IgG innerhalb der Präparation von MHC-Klasse-II-Molekülen resultiert.
  • Wir schlussfolgerten, dass die spezifischen anti-HLA-DR-Antikörperfragmente, die aus der HuCAL-Bibliothek ausgewählt wurden, zumindest ein Epitop auf dem N-terminalen extrazellulären Protein des menschlichen Antigens erkannten. Wir führten eine Reihe von Experimenten durch, um diese Annahme zu bestätigen und um außerdem das Bindungsepitop für diese anti-HLA-DR-Antikörperfragmente zu definieren.
  • Erstens wurden die vier anti-HLA-DR-Antikörperfragmente (MS-GPC-1, 6, 8 & 10) auf die Reaktivität gegen ein Feld der durch Epstein-Barr-Virus transformierten B-Zelllinien getestet, die von ECACC (Salisbury UK) erhalten wurden, jede homozygot für eines der häufigsten DR-Allelen in menschlichen Populationen, und zu einer Reihe von L-Zellen transfiziert, um menschliche Klasse-II-Isotypen außer DRB1 zu exprimieren: L105.1, 1257.6, 125.4, 1256.12 & 121.3, die jeweils die Moleküle DRB3*0101, DRB4*0101, DP0103/0402, DP 0202/0201 beziehungsweise DQ0201/0602 exprimieren (Klohe et al., 1988).
  • Die Reaktivität der Antigen bindenden Fragmente zu dem Feld der Zelllinien, die verschiedene MHC-Klasse-II-Moleküle exprimieren, wurde unter Verwendung eines Immunfluoreszenz-Verfahrens gezeigt, wie zum Beispiel von Otten et al (1997) beschrieben. Die Färbung wurde auf 2 × 105 Zellen unter Verwendung eines anti-FLAG-M2-Antikörpers (Sigma) als zweites Reagenz gegen das M2-Tag, das von jedem anti-HLA-DR-Antikörperfragment getragen wird, und einem mit Fluorescein markierten anti-Maus-Ig der Ziege (Pharmingen) als färbendes Reagenz durchgeführt. Die Zellen wurden bei 4°C 60 min mit einer vorbestimmten Verdünnung des anti-HLA-DR-Antikörperfragments, gefolgt von dem zweiten und dem dritten Antikörper bei Konzentrationen inkubiert, die von den Herstellern bestimmt wurden. Die Zellen wurden zwischen den inkubationsschritten gewaschen. Schließlich wurden die Zellen gewaschen, und eine Analyse mit einem FACS-Calibur (Becton-Dickinson) wurde durchgeführt.
  • 2 zeigt, dass die ausgewählten anti-HLA-DR-Antikörperfragmente mit allen getesteten DRB1-Allotypen reagieren. Diese Beobachtung zusammengenommen mit der Beobachtung, dass alle anti-HLA-DR-Antikörperfragmente mit dem chimären DR-IE reagieren, legt nahe, dass alle ausgewählten anti-HLA-DR-Antikörperfragmente die erste Domäne der monomorphen Drα-Kette oder ein monomorphes Epitop auf der ersten Domäne der DRβ-Kette erkennen.
  • Zweitens wurde das Fragment MS-GPC-8 als ein Beispiel verwendet, um weiter das von jedem anti-HLA-DR-Antikörperfragment erkannte Epitop zu lokalisieren. MS-GPC-8 erkennt alle DR-Moleküle, das DQ-Molekül, aber nicht die zwei getesteten DP-Moleküle (2). Ein Sequenzvergleich der α-Ketten dieser Moleküle und das Computermodell der dreidimensionalen Struktur der DR-Moleküle offenbarte, dass das Epitop in dem C-terminalen Ende der α-helicalen Region liegt, die von Glu55 bis Tyr79 der N-terminalen Domäne der α-Kette von HLA-DR lokalisiert ist.
  • Drittens wird die PepSpot-Technik ( US 6040423 ; Heiskanen et al., 1999) verwendet, um überlappende synthetische Peptide herzustellen, die der Sequenz der Drα1- und Drβ1-Domänen entsprechen. Die Kreuzreaktivitätstests zwischen dem MS-GPC-8-anti-HLA-DR-Antikörperfragment und diesem Set von einem überlappendem Satz von Peptiden lokalisieren das Epitop für dieses Antikörperfragment innerhalb der α-Kette oder β-Kette des HLA-DR-Moleküls exakter.
  • E. Die Tötungsaktivität der mAb-Fragmente
  • Wir zeigten dass eine multivalente Zusammensetzung, die zumindest zwei anti-HLA-DR-Antikörperfragmente umfasst, das Abtöten von aktivierten Zellen verursachte, die das HLA-DR-Antigen exprimierten. Die Tötungseffizienz der anti-HLA-DR-Antikörperfragmente, die aus der HuCAL-Bibliothek ausgewählt wurden, wurde auf der HLA-DR positive Tumorzelllinie GRANTA-519 (DSMZ, Deutschland) getestet. 2 × 105 Zellen wurden 4 h bei 37°C unter 6% CO2 mit 200 nM anti-HLA-DR-Antikörperfragmenten in RPMI 1640 (PAA, Deutschland), ergänzt durch 2,5% hitzeinaktiviertes FBS (Biowhittaker Europe, Belgien), 2mM L-Glutamin, 1% nicht-essentielle Aminosäuren, 1 mM Natriumpyruvat und 0,1 mg/ml Kanamycin, inkubiert. Jedes anti-HLA-DR-Antikörperfragment wurde auf seine Fähigkeit getestet, aktivierte Tumorzellen als monovalentes anti-HLA-DR-Antikörperfragment oder als bivalente Zusammensetzung durch die Zugabe zu 100 nM eines bivalenten vernetzenden anti-FLAG-M2-mAb (Sigma) zu töten. Nach 4 h Inkubation bei 37°C unter 6% CO2 wurde die Zelllebensfähgkeit durch Färbung mit Trypanblau und anschließender Zählung der verbleibenden lebensfähigen Zellen bestimmt (Current Protocols in Immunology, 1997).
  • Die anti-HLA-DR-Antikörperfragmente aus der HuCAL-Bibliothek zeigten eine viel höhere cytotoxische Aktivität, wenn sie durch Co-Inkubation mit dem anti-FLAG-M2-mAb vernetzt wurden, um eine bivalente Zusammensetzung zu bilden (3). Die Inkubation der Zelllinien alleine oder nur in Anwesenheit des anti-FLAG-M2-mAb ohne Co-Inkubation der anti-HLA-DR-Antikörperfragmente führte nicht zur Cytotoxizität, wie durch die Zelllebensfähgikeit gemessen. Wir beobachten, dass Valenzen höherer Ordnung der anti-HLA-DR-Antikörperfragmente außerdem signifikant die Zelllebensfähgkeit verringern. Bei der Zugabe zu der Inkubationsmischung von Protein G verringern die so gebildeten multivalenten Komplexe, welche die anti-HLA-DR-Antikörperfragmente umfassen, außerdem die Zelllebensfähigkeit, verglichen mit der bivalenten Zusammensetzung, die aus der Inkubation der anti-HLA-DR-Antikörperfragmente mit nur dem anti-FLAG-M2-mAb gebildet wird.
  • Ähnliche Experimente zeigen, dass andere Tumorzelllinien, die HLA-DR-Moleküle exprimieren, auch unter Verwendung einer vernetzten bivalenten Zusammensetzung des anti-HLA-DR-Antikörper-Fab-Fragments MS-GPC8 abgetötet wurden. Die Tumorzelllinien, die mehr als 50% Zelltod nach 4 h Inkubation zeigen, beinhalten MHH-CALL4, MN 60, BJAB, BONNA-12, die jeweils die Erkrankungen akute lymphoide Leukämie der B-Zellen, Burkitt-Lymphom und Haarzell-Leukämie darstellen.
  • Die Verwendung der Fab-Form der anti-HLA-DR-Antikörperfragmente MS-GPC-1, 6, 8 und 10 zeigen auch ähnliche cytotoxische Aktivität zu den vorstehenden Tumorzelllinien, wenn sie als bivalente Zusammensetzung unter Verwendung des vernetzenden anti-FLAG-M2-mAb gebildet werden.
  • Das vorstehend beschriebene Verfahren, um die Tötungsaktivität zu testen, wurde verwendet, um die maximale Tötungskapazität für jedes der vernetzten bivalenten anti-MHC-DR-Antikörperfragmente gegen Priess-Zellen zu bestimmen. Die für MS-GPC-1, MS-GPC-6, MS-GPC-8 & MS-GPC-10 beobachtete maximale Tötungskapazität wurde jeweils als 83%, 88%, 84% und 88% gemessen.
  • F. Die Tötungsselektivität der Antigen-Bindungsdomänen gegen ein menschliches Antigen für aktivierte versus nicht aktivierte Zellen
  • Menschliche periphere B-Zellen werden verwendet, um zu zeigen, dass die durch den menschlichen anti-HLA-DR-mAb vermittelte Zelltötung abhängig von der Zellaktivierung ist. Ungefähr 50 ml heparinisiertes venöses Blut wird einem HLA-DR-typisiertem gesunden Spender entnommen und die mononuclearen Zellen des frischen peripheren Bluts (PBMC) werden durch die Ficoll-Hypaque-Gradientenzentrifugation (Histopaque-1077; Sigma) isoliert, wie in Current Protocols in Immunology (John Wiley & Sons, Inc.; 1999) beschrieben. Die gereinigten B-Zellen (~5% der peripheren Blut-Leukozyten) werden aus ungefähr 5 × 107 PBMCs unter Verwendung des B-Zell-Isolations-Kits und der MACS LS+/VS+-Säulen (Miltenyi Biotec, Deutschland) gemäß der Hersteller-Anleitungen erhalten. Das erfolgreiche Aufbrauchen der Nicht-B-Zellen wird durch die FACS-Analyse eines Aliquots der isolierten B-Zellen (HLA-DR-positiv und CD45-positiv) verifiziert. Die Doppelfärbung und die Analyse werden mit kommerziell erhältlichen Antikörpern (Beckton Dickinson) unter Verwendung von Standardverfahren ausgeführt, wie zum Beispiel in Current Protocols in Immunology (John Wiley & Sons, Inc.; 1999) beschrieben. Ein Aliquot der isolierten B-Zellen wird auf die Fähigkeit der Zellen getestet, durch Stimulation mit Pokeweed-Mitogen (PWM) (Sigma) bei einer Konzentration von 2,5 μg/ml in RPMI 1640 (PAA, Deutschland), ergänzt durch 5% menschliches AB-Serum (Sigma, Deutschland), 2mM L-Glutamin, 1% nicht-essentielle Aminosäuren, 1 mM Natriumpyruvat und 0,1 mg/ml Kanamycin, durch Inkubation bei 37°C unter 6% CO2 vier Tage aktiviert zu werden. Die erfolgreiche Aktivierung wird durch Standardverfahren, zum Beispiel Morphologie, durch Messung der 3H-Thymidin-Aufnahme in die wachsenden Zellen, oder durch die FACS-Analyse der HLA-DR-Expression auf der Zelloberfläche verifiziert (Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Inc.; 1999).
  • Die Selektivität für die Abtötung der aktivierten Zellen versus der nicht aktivierten Zellen wird durch Inkubation von 1 × 106/ml B-Zellen, aktiviert wie vorstehend verglichen mit nicht aktivierten Zellen, mit jeweils 200 nM eines der anti-HLA-DR-Antikörperfragmente MS-GPC-1, 6, 8 & 10 zusammen mit 100 nM des vernetzenden anti-FLAG-M2-mAb in dem vorstehend beschriebenen Medium, aber ergänzt durch 2.5% hitzeinaktiviertes FBS (Biowhittaker Europe, Belgien) anstatt mit menschlichem Serum, gezeigt. Nach Inkubation bei 37°C unter 6% CO2 für 1, 2, 4 und 6 h wird die Zelllebensfähigkeit durch Fluoresceindiacetat-Färbung (FDA, Sigma) und anschließender Zählung der grünen fluoreszierenden Zellen unter Verwendung eines Fluoreszenzmikroskops (Leica, Deutschland) unter Verwendung von Standardverfahren (Current Protocols in Immunology, 1997) bestimmt.
  • Es wird gezeigt, dass die B-Zell-Aktivierung für die Zelltötung notwendig ist. Nach nur 4 h nach Inkubation mit den vernetzten anti-HLA-DR-Antikörperfragmenten werden über 50% der durch PWM aktivierten B-Zellen abgetötet. Im Gegensatz sind nicht aktivierte B-Zellen (nicht durch PWM stimuliert) nicht so empfindlich zur Abtötung durch die vernetzten anti-HLA-DR-Antikörperfragmente – weniger als 15% tote Zellen konnten nach 4h gesehen werden.
  • Wir waren überrascht, zu sehen, dass unsere vernetzten anti-HLA-DR-Antikörperfragmente nicht leicht eine spezielle Tumorzelllinie abtöten. Wir nahmen an, dass Zellen in dieser Züchtung nicht ausreichend aktiviert wurden, obwohl sie als eine stabile Zelllinie etabliert wurden. Daher führen wir unter Verwendung einer erhöhten Zelloberflächen-Expression des HLA-DR-Moleküls als Aktivierungsmarker ein Experiment aus, um die Aktivität der MHH-preB1-Zelllinie zu stimulieren, wie folgt.
  • Nicht adherent wachsende MHH-preB1-Zellen werden in RPMI-Medium gezüchtet, das die folgenden Zusätze enthält (alle von Gibco BRL und PAA): 10% fötales Kälberserum (FCS), 2 mM L-Glutamin, 1% nicht-essentielle Aminosäuren, 1 mM Natriumpyruvat und 1 × Gentamycin. Die Zellen werden durch Inkubation für zwei Tage mit Lipopolysaccharid (LPS, Sigma, 10 μg/ml) und Interferon-gamma (IFN-γ, Roche, 40 ng/ml) aktiviert, um die Expression des HLA-DR-Moleküls zu erhöhen. Die Zelloberflächenexpression der HLA-DR-Moleküle wird durch Durchflusszytometrie mit dem FITC-konjugiertem mAb L243 (Beckton Dickinson) überwacht. Nach der Aktivierung wird die Zelltötung 4 h in dem vorstehenden Medium durchgeführt, das aber eine reduzierte FCS-Konzentration (2,5%) mit einer Antikörper-Endkonzentration von 200 nM enthält.
  • Die Inkubation von MHH-preB1 für zwei Tage in der Anwesenheit von LPS und IFN-γ führt zu einem 2-fachen Anstieg in der HLA-DR-Oberflächendichte (mittlere Fluoreszenz-Verschiebung von 123 zu 260). Entsprechend ist der Anteil der toten Zellen nach 4 h Inkubation mit 100 nM Konzentration der IgG-Form von MS-GPC-8 (hergestellt wie nachstehend beschrieben) größer als 60%, verglichen zu der nicht aktivierten Kultur, für die weniger als 15% tote Zellen beobachtet werden (4). Lebensfähige Zellen werden mikroskopisch durch Ausschluss von Trypanblau identifiziert. Daher verstärkt die Aktivierung von MHH-preB1-Zellen durch LPS und IFN-γ die Zelltötung durch Bindung der IgG-Form von MS-GPC-8 an die HLA-DR-Moleküle.
  • G. Die Bestimmung von IC50 für die anti-HLA-DR-Antikörperfragmente
  • Die IC50 für die aus der HuCAL-Bibliothek ausgewählten anti-HLA-DR-Antikörperfragmente werden unter Verwendung der HLA-DR-positiven Tumorzelllinie GRANTA-519 (DSMZ, Deutschland) bestimmt. 2 × 105 Zellen werden 4 h bei 37°C unter 6% CO2 mit einer Verdünnungsreihe von anti-HLA-DR-Antikörperfragmenten und geeigneter Konzentration von anti-FLAG-M2-mAb inkubiert, um eine bivalente Vernetzung in RPMI 1640 (PAA, Deutschland), ergänzt durch 2,5% hitzeinaktiviertes FBS (Biowhittaker Europe, Belgien), 2mM L-Glutamin, 1% nicht-essentielle Aminosäuren, 1 mM Natriumpyruvat und 0,1 mg/ml Kanamycin, zu verursachen. Die geeigneten Endkonzentrationen der bivalenten Zusammensetzung reichen von 2 bis 200 nM. Als Kontrolle werden nicht aktivierte B-Zellen aus ungefähr 50 ml heparinisiertem venösem Blut gereinigt, das einem HLA-DR-typisiertem gesunden Spender entnommen wurde, wie vorstehend beschrieben, und gleichermaßen unter Verwendung einer Verdünnungsreihe der bivalenten mAb-Zusammensetzung MS-GPC-8/anti-FLAG-M2-mAb behandelt. Nach 4 h Inkubation bei 37°C unter 6% CO2 wurde die Zelllebensfähigkeit durch Fluoresceindiacetat-Färbung und anschließender Zählung der verbleibenden lebensfähigen Zellen bestimmt (Current Protocols in Immunology, 1997). Die Konzentration der bivalenten mAB-Zusammensetzung, die 50% Zelltötung für die aktivierten Tumorzellen verursacht, ist kleiner als 100 nM. Im Gegensatz wird 50% Abtötung für die nicht aktivierten Zellen nach 4 h Inkubation unter Verwendung dieses Konzentrationsbereiches für die bivalente mAb-Zusammensetzung, welche maximal 200 nM war, nicht gesehen (5).
  • Das vorstehend beschriebene Verfahren verwendete zur Bestimmung der IC50 für jedes der vernetzten scFv anti-MHC-DR-Antikörperfragmente. Die durchgeführten IC50-Bestimmungen für MS-GPC-1, MS-GPC-6, MS-GPC-8 & MS-GPC-10 wurden jeweils als 100, 55, 20-40 und 55 nM gemessen – wo jede IC50-Konzentration die Konzentration der resultierenden bivalenten Zusammensetzung darstellt.
  • H. Der Mechanismus der Zelltötung
  • Die vorstehend beschriebenen Beispiele zeigen, dass der Zelltod auftritt – wobei nur bestimmte multivalente anti-HLA-DR-Antikörperfragmente benötigt werden, um den Tod der aktivierten Zellen zu verursachen. Keine weiteren cytotoxischen Einheiten oder immunologischen Mechanismen wurden benötigt, um den Zelltod zu verursachen, was daher zeigt, dass der Zelltod durch einen eigenen vorprogrammierten Mechanismus der aktivierten Zellen vermittelt wird. Der Mechanismus der Apoptose ist ein weithin verstandenes Verfahren des vorprogrammierten Zelltods. Wir waren durch bestimmte Merkmale der Zelltötung, die wir beobachteten, überrascht, dass der vorgeschlagene Tötungsmechanismus für aktivierte Zellen, wenn sie unseren menschlichen anti-HLA-DR-Antikörperfragmenten ausgesetzt wurden, nicht die Apoptose war. Zum Beispiel erschien die Geschwindigkeit, bei der wir die Zellen, die abgetötet wurden, beobachteten, signifikant schneller zu sein, als für die Apoptose berichtet wurde. Zwei Experimente werden durchgeführt, um zu zeigen, dass der Mechanismus der Zelltötung durch einen nicht-apoptotischen Mechanismus abläuft.
  • Erstens verwenden wir die Färbetechniken mit Annexin-V-FITC und Propidiumiodid (PI), um zwischen apoptotischen und nicht apoptotischen Zelltod zu unterscheiden – apoptotische Zellen (Annexin-V positiv/PI-negativ) können von toten (Annexin-V positiv/PI positiv) und vollständig funktionellen Zellen (Annexin-V negativ/PI negativ) unterschieden werden (unter Verwendung des vom Hersteller empfohlenen Verfahrens). 1 × 106/ml Priess-Zellen werden bei 37°C unter 6%CO2 mit oder ohne 200 nM anti-HLA-DR-Antikörperfragment MS-GPC-8 zusammen mit 100 nM vernetzenden anti-FLAG-M2-mAB in RPMI 1640 (PAA, Deutschland), ergänzt durch 2,5% hitzeinaktiviertes FBS (Biowhittaker Europe, Belgien), 2mM L-Glutamin, 1% nicht-essentielle Aminosäuren, 1 mM Natriumpyruvat und 0,1 mg/ml Kanamycin, inkubiert. Um eine apoptotische Zellkultur als Kontrolle bereitzustellen, wurden 1 × 106/ml Priess-Zellen durch Inkubation in dem vorstehenden Medium bei 37°C unter 6%CO2 mit 50 μg/ml Apoptose induzierendem anti-CD95-mAb DX2 (Pharmingen, Kalifornien), mit 10 μg/ml Protein-G (Sigma, Deutschland) vernetzt, induziert, in die Apoptose einzutreten. Bei verschiedenen Inkubationszeiten (1, 15 und 60 min, 3 und 5 h) werden 200 μl-Proben genommen, zweimal gewaschen und mit Annexin-V-FITC (Pharmingen, Kalifornien) und PI (Sigma, Deutschland) unter Verwendung des Annexin-V-Bindungspuffer nach dem Hersteller-Protokoll gefärbt. Die Menge der Färbung mit Annexin-V-FITC und PI für jeder Zellgruppe wird mit einem FACS-Calibur (Beckton Dickinson, Deutschland) analysiert.
  • Der durch die vernetzten anti-HLA-DR-Fragmente induzierte Zelltod zeigt ein signifikant unterschiedliches Muster des Zelltods als der des anti-CD95-Apoptose induzierenden Antikörpers oder der mit anti-FLAG-M2-mAb alleine inkubierten Zellkultur. Der Anteil der toten Zellen (wie durch die Annexin-V positive/PI positive Färbung gemessen) für die mit anti-HLA-DR-Antikörperfragment/anti-FLAG-M2-mAb behandelten Zellen erhöht sich weit schneller als der Anteil der anti-CD95- oder der Kontrollzellen (6a). Im Gegensatz erhöht sich der Anteil der apoptotischen Zellen (wie durch die Annexin-V positive/Pi negative Färbung gemessen) schneller für die anti-CD95 behandelten Zellen verglichen zu den vernetzten anti-HLA-DR-Antikörperfragmenten oder den Kontrollzellen (6b).
  • Zweitens hemmen wir die Caspase-Aktivität unter Verwendung von zDEVD-fmk, einem irreversiblen Caspase-3-Inhibitor, und zVAD-fmk, einem Breitspektrum-Caspase-Inhibitor (beide von Bio-Rad erhalten). Der Mechanismus der Apoptose wird durch die Caspase-Aktivität charakterisiert, und wir nahmen an, dass wir keine Änderung in der Lebensfähigkeit der Zellen beobachten würden, die den Zelltod in der Anwesenheit von diesen Caspase-Inhibitoren durchmachen, verglichen zu jenen ohne, wenn Caspasen nicht notwendig für den anti-HLA-DR vermittelten Zelltod waren. 2 × 105 Priess-Zellen werden 3 h bei 37°C unter 6% CO2 mit seriellen Verdünnungen der zwei Caspase-Inhibitor vorinkubiert, die von 180 μM bis 10 mM in RPMI 1640 (PAA, Deutschland), ergänzt durch 2,5% hitzeinaktiviertes FBS (Biowhittaker Europe, Belgien), 2mM L-Glutamin, 1% nicht-essentielle Aminosäuren, 1 mM Natriumpyruvat und 0,1 mg/ml Kanamycin, reichen. Der HLA-DR vermittelte Zelltod wird durch Hinzufügen von 200 nM menschliches anti-HLA-DR-Antikörperfragment MS-GPC-8 und 100 nM vernetzender anti-M2-mAb induziert. Eine durch anti-CD95 induzierte apoptotische Zellkultur dient als Kontrolle für die Aktivität der Inhibitoren (Drenou et al., 1999). Nach weiterer Inkubation bei 37°C und 6% CO2 wird die Zelllebensfähgkeit nach 4 und 24 h durch Färbung mit Trypanblau und anschließender Zählung der nicht gefärbten Zellen bestimmt. Wie wir annahmen, ist die Zelllebensfähigkeit der mit anti-HLA-DR behandelten Zellkultur nicht signifikant durch die Anwesenheit der Caspase-Inhibitoren verändert, während der durch die anti-CD95-Behandlung induzierte Zelltod für die mit den Caspase-Inhibitoren vorinkubierte Zellkultur signifikant verringert wird. Diese Beobachtung stützt unsere Annahme, dass der durch HLA-DR vermittelte Zelltod durch einen nicht apoptotischen Mechanismus abläuft, der unabhängig von Caspase-Proteasen ist.
  • I. Die Antikörper-Optimierung
  • Um bestimmte biologische Merkmale der HLA-DR bindenden Antikörperfragmente zu optimieren, wurde eines der Fab-Fragmente, MS-GPC8-Fab, verwendet , um eine Bibliothek der Fab-Antikörperfragmente durch Ersetzung der elterlichen VL-λ1-Kette durch den Vorrat aller lambda-Ketten λ 1-3 zu konstruieren, die in CDR3 aus der HuCAL-Bibliothek randomisiert wurden (Knappik et al., 2000)
  • Das Fab-Fragment MS-GPC-8-Fab (s. C.1) wurde über XbaI/EcoRI aus pMx9_Fab_GPC8 in pMORPH18_Fab, einem auf einem Phagemid basierenden Vektor für den Phagen-Display der Fab-Fragmente cloniert, um pMORPH18_Fab_GPC8 herzustellen (s. 10). Der lambda-Ketten-Vorrat wurde aus HuCAL-scFv in pMORPH13_scFv (s. B.2 vorstehend und 7) mit den PCR-Primern CRT5 und CRT6 (welches eine einzigartige DraIII-Restriktionsendonuclease-Stelle einführt) amplifiziert und in pMORPH18_Fab_GPC8 cloniert, das mit NsiI und DraIII geschnitten wurde (s. Vektorkarte von pMORPH18_Fab_GPC8 in 10).
  • Die resultierende Fab-Optimierungsbibliothek wurde durch zwei Panning-Runden gegen MHC-Klasse-II-DRA*0101/DRB1*0401 (wie vorstehend präpariert) durchmustert, wie in B.3 beschrieben mit der Ausnahme, dass bei der zweiten Runde die Antigenkonzentration für die Beschichtung zu 12 ng/Well verringert wurde. FACS identifizierte die optimierten Clone, wie vorstehend in B.5 beschrieben. Zwei dieser Clone, MS-GPC-8-6 und MS-GPC-8-17, wurden außerdem charakterisiert und zeigten die Zelltötungsaktivität, wie für das Anfangsfragment MS-GPC-8 gefunden wurde. Tabelle 1 enthält die Sequenzmerkmale von MS-GPC-8-6 und MS-GPC-8-17. Die VH- und VL-Familien und die gelisteten CDR3s beziehen sich auf die auf HuCAL-Konsensus basierenden Antikörpergene, wie beschrieben (Knappik et al., 2000), die vollständigen Sequenzen der VH- und VL-Domänen werden in 11 gezeigt.
  • Die optimierten Fab-Formen der anti-HLA-DR-Antikörperfragmente MS-GPC-8-6 und MS-GPC-8-17 zeigten verbesserte Merkmale über das anfängliche MS-GPC-8. Zum Beispiel war die IC50 der optimierten Antikörper 15-20 und 5-15 nM (verglichen mit 20-40 nM für MS-GPC-8) und die maximale Tötungskapazität der MHH-Call-4-Zellen wurde als 76 und 78% für MS-GPC-8-6 bzw. MS-GPC-8-17 bestimmt (verglichen mit 65% für MS-GPC-8).
  • J. Die Herstellung von IgG
  • J.1. Die Konstruktion von HuCAL-Immunglobulin-Expressionsvektoren
  • a) Die Clonierung der schweren Kette
  • Die multiple Clonierungsstelle von pcDNA3.1+ (Invitrogen) wurde entfernt (NheI/ApaI), und ein mit den Restriktionsstellen kompatibler Stuffer, der für den HuCAL-Ansatz verwendet wurde, wurde für die Ligation der Leitsequenzen (NheI/EcoRI), der VH-Domänen (EcoRI/BlpI) und der konstanten Immunglobulin-Regionen (BlpI/ ApaI) eingefügt. Die Leitsequenz (EMBL M83133) wurde mit einer Kozak-Sequenz (Kozak, 1987) ausgestattet. Die konstanten Regionen von menschlichem IgG1 (PIR J00228), IgG4 (EMBL K01316) und Serum-IgA1 (EMBL J00220) wurden in überlappende Oligonucleotide mit Längen von etwa 70 Basen zerlegt. Stumme Mutationen wurden eingeführt, um die mit dem HuCAL-Entwurf nicht kompatiblen Restriktionsstellen zu entfernen. Die Oligonucleotide wurden durch Overlap-Extension-PCR gespleißt.
  • b) Die Clonierung der leichten Kette
  • Die multiple Clonierungsstelle von pcDNA3.1/Zeo+ (Invitrogen) wurde durch zwei unterschiedliche Stuffer ersetzt. Der κ-Stuffer stellte die Restriktionsstellen für die Insertion eines κ-Leiters (NheI/EcoRV), der HuCAL-scFv Vκ-Domänen (EcoRV/BsiWI) und der konstanten Region der κ-Kette (BsiWI/ApaI) bereit. Die entsprechenden Restriktionsstellen in dem λ-Stuffer waren NheI/EcoRV (λ-Leiter), EcoRV/HpaI (Vλ-Domänen) und HpaI/ApaI (konstante Region der λ-Kette). Der κ-Leiter (EMBL Z00022) sowie der λ-Leiter (EMBL 127692) wurden beide mit Kozak-Sequenzen ausgestattet. Die konstanten Regionen der menschlichen κ-(EMBL J00241) und λ-Kette (EMBL M18645) wurden durch die Overlap-Extension-PCR zusammengefügt, wie vorstehend beschrieben.
  • J.2. Die Herstellung der IgG exprimierenden CHO-Zellen
  • Alle Zellen wurden bei 37°C in einer feuchten Atmosphäre mit 5% CO2 in von dem Lieferanten empfohlenen Medien beibehalten. CHO-K1 (CRL-9618) waren von ATCC und wurden mit einer equimolaren Mischung von Expressionsvektoren der schweren und leichten Kette von IgG co-transfiziert. Die doppelt-resistenten Transfektanten wurden mit 600 μg/ml G418 und 300 μg/ml Zeocin (Invitrogen) ausgewählt, gefolgt von begrenzender Verdünnung. Der Überstand der einzelnen Clone wurde für die IgG-Expression durch Capture-ELISA bewertet (s. nachstehend). Die positiven Clone wurden in RPMI-1640-Medium, ergänzt durch 10% Ultra Low IgG-FCS (Life Technologies), erweitert. Nach Einstellung des pH-Werts des Überstands auf 8.0 und. steriler Filtration wurde mit der Lösung eine Standard-Protein-A-Säulenchromatographie (Poros 20A, PE Biosystems) durchgeführt.
  • Die IgG-Formen der anti-HLA-DR-Antigen-Bindungsdomänen zeigen verbesserte Merkmale über die Antikörperfragmente. Zum Beispiel war der IC50-Wert der IgG-Form von MS-GPC-8 10 nM und die maximale Tötungskapazität wurde als 84% für MHH-Call4 und 89% für GRANTA 519 bestimmt. Beachten Sie, dass alle gegebenen IC50-Konzentrationen (auch für Fab und scFv-Fragmente) als molares Äquivalent des bivalenten IgG gezeigt werden, um den Vergleich zu vereinfachen.
  • K. Die in vivo-Therapie gegen Krebs unter Verwendung eines HLA-DR-spezifischen Antikörpers
  • Wir zeigen, dass Antigen-Bindungsdomänen von menschlicher Zusammensetzung erfolgreich als Therapeutikum für die Behandlung von Krebs verwendet werden können. Immunsupprimierte Mäuse – wie SCID-, nackte oder Rag-1-Knockout- – werden mit einem DR+ menschlichen Lymphom- oder (einer) Leukämie-Zelllinie(n) von Interesse beimpft. Die Tumorzelldosis, üblicherweise 1 × 104 bis 1 × 106/Maus wird für jeden getesteten Tumor etabliert und subkutan (s.c.) oder intravenös (i.v.) verabreicht. Eine Dauer von 2 bis 7 Tagen wird dann benötigt, damit der Tumor sich selbst in den Mäusen etabliert, wo die genaue Länge dieser Dauer für jeden gegebenen Tumor zu seiner bestimmten Dosis etabliert wird. Wenn einmal der Tumor etabliert wird, werden die Mäuse i.v. oder s.c mit der IgG-Form des anti-HLA-DR-Antikörperfragments MS-GPC-8, präpariert wie vorstehend beschrieben, unter Verwendung von Dosierungen von 1 bis 5 mg/kg über 1 bis 5 Tage behandelt. Das Überleben der mit anti-HLA-DR-behandelten und der unbehandelten Kontrollmäuse wird für bis zu 8 Wochen nach Beendigung der Behandlung überwacht. Die Tumorprogression in den s.c. beimpften Mäusen wird zusätzlich durch Messung des Flächeninhalts der Tumoroberfläche quantifiziert. Signifikante Verlängerung des Überlebens von bis zu 80% der mit anti-HLA-DR behandelten Mäuse wird während des Experiments beobachtet, und bis zu 50% Mäuse überleben am Ende des Experiments. Bei den s.c. beimpften und unbehandelten Mäusen erreicht der Tumor einen Flächeninhalt der Oberfläche von 2-3 cm2, während bei den mit anti-HLA-DR behandelten Tieren der Flächeninhalt der Tumoroberfläche signifikant geringer ist.
  • L. Die Immunsuppression unter Verwendung eines HLA-DR-spezifischen Antikörpers, gemessen durch die T-Zell-Proliferation
  • Der IgG und die monovalenten Formen des anti-HLA-DR-Antikörperfragments MS-GPC-8, präpariert wie vorstehend beschrieben, können auf ihre Fähigkeit getestet werden, die proliferative T-Zell-Antwort der mit Antigen präparierten Lymphknotenzellen von Mäusen zu hemmen, die ein chimäres Maus-Mensch-Klasse-II-Transgen mit einer RA-verbundenen Peptid-Bindungsstelle tragen und denen Klasse-II-Moleküle der Maus fehlen (Muller et al., 1990; Woods et al., 1994; Current Protocols in Immunology, Bd. 2, 7.21; Ito et al., 1996). Hier erfolgt die Immunisierung in vivo, aber die Hemmung und die Ablesung sind ex vivo. Transgene Mäuse, die MHC-Klasse-II-Moleküle mit Bindungsstellen von zwei RA verbundenen Molekülen, DRB1*0401 und 00404 exprimieren, wurden vorher hergestellt (Ito et al 1996). Den Mäusen fehlt die MHC-Klasse-II der Maus, und so werden alle Th-Antworten durch ein einzelnes menschliches RA verbundenes MHC-Klasse-II-Molekül geleitet (Ito et al. 1996). Diese transgenen Mäuse stellen ein Modell dar, um den menschlichen Klasse-II-Antagonisten zu testen.
  • Der inhibitorische Effekt des anti-HLA-DR-Antikörperframgents MS-GPC-8 und seiner IgG-Form auf die T-Zell-Proliferation wird unter Verwendung chimärer T-Zellen und Antigen präsentierender Zellen gemessen, die aus den Lymphknoten von chimären transgenen 0401-IE- und 0404-IE-Mäusen isoliert wurden, die vorher mit Hühnerei-Lysozym bzw. Ovalbumin immunisiert wurden (Ito et al. 1996). 1.5 × 105 Zellen werden in 0.2 ml Wells von 96-Well-Gewebe-Kulturplatten in der Anwesenheit des Antigens (halbmaximale stimulatorische Konzentration) und entweder des anti-HLA-DR-Antikörperfragments MS-GPC-8 oder seiner IgG-Form (1 nM-200 nM) in serumfreien HL-1-Medium, das 2 mM L-Glutamin und 0.1 g/l Kanamycin enthält, drei Tage inkubiert. Die Antigen spezifische Proliferation wird durch den 3H-Methylthymidin-Einbau während der letzten 16h Züchtung gemessen (Falcioni et al., 1999). Die Hemmung der T-Zell-Proliferation auf die Behandlung mit dem anti-HLA-DR-Antikörperfragment und seiner IgG-Form kann durch den Vergleich beobachtet werden, die Antigen enthaltenden Wells zu kontrollieren.
  • M. Die Auswahl des für die Behandlung von Krebsarten nützlichen Peptids/Proteins
  • Um das am meisten geeignete Protein/Peptid auszuwählen, in weitere Experimente einzutreten, um seine Eignung für die Verwendung in einer therapeutischen Zusammensetzung für die Behandlung von Krebsarten, zu bewerten, werden zusätzliche Daten gesammelt. Solche Daten für jede IgG-Form der anti-HLA-Antigen-Antikörperfragmente können die in vitro-Tötungseffizienz, wie durch IC50 gemessen, den maximalen Anteil der Zelltötung, wie in vitro bestimmt, und die Daten der Tumorreduktion und die Daten des Überlebens der Maus von den in vivo-Tiermodellen beinhalten.
  • Das IgG für die anti-HLA-Antigen-Antikörperfragmente, das die niedrigste IC50 für die Abtötung, den höchsten Maximalanteil für die Zelltötung, die beste Tumorreduktionsdaten und/oder die besten Maus-Überlebensdaten zeigt, wird gewählt, um in weitere Experimente einzutreten. Solche Experimente können zum Beispiel klinische Phase I-Studien an Menschen beinhalten.
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Claims (37)

  1. Peptid/Protein, das zumindest eine auf einem Antikörper basierende Antigen-Bindungsdomäne von menschlicher Zusammensetzung mit Bindungsspezifität für ein auf der Oberfläche einer menschlichen Zelle exprimiertes Antigen umfasst, wobei die Bindung einer multivalenten Zusammensetzung von einem oder mehreren des Peptids/Proteins an das Antigen, das auf der Oberfläche einer Zelle exprimiert wird, den Tod der Zelle verursacht oder zum Tod der Zelle führt, wobei die Antigen-Bindungsdomäne aus einer Kombination einer VH-Domäne und einer VL-Domäne besteht, wobei die Kombination in einem der Clone aus der Liste MS-GPC-1, MS-GPC-6, MS-GPC-8, MS-GPC-10, MS-GPC-8-6 und MS-GPC-8-17, wie in Tabelle 1 und 11 gezeigt, gefunden wird.
  2. Peptid/Protein, das zumindest eine auf einem Antikörper basierende Antigen-Bindungsdomäne von menschlicher Zusammensetzung mit Bindungsspezifität für ein auf der Oberfläche einer menschlichen Zelle exprimiertes Antigen umfasst, wobei das Antigen Epitope umfasst, die aus HLA-DR-Molekülen ausgewählt sind, wobei die Bindung einer multivalenten Zusammensetzung von einem oder mehreren des Peptids/Proteins an das Antigen, das auf der Oberfläche einer aktivierten Zelle exprimiert wird, in Abwesenheit von weiteren cytotoxischen Einheiten oder immunologischen Mechanismen den Tod der aktivierten Zelle verursacht oder zum Tod der aktivierten Zelle führt, wobei die Antigen-Bindungsdomäne aus einer Kombination von HuCAL-VH2 und HuCAL-Vλ1 besteht, wobei die VH-CDR3-Sequenz von der Konsensus-CDR3-Sequenz nnnnRGnFDn genommen wird, wobei jedes n unabhängig einen Aminosäurerest darstellt; und wobei die VL-CDR3-Sequenz von der Konsensus-CDR3-Sequenz QSYDnnnn genommen wird, wobei jedes n unabhängig einen Aminosäurerest darstellt.
  3. Peptid/Protein nach Anspruch 2, wobei der VH-CDR3 das als SEQ ID NO: 10 identifizierte SPRYRGAFDY ist.
  4. Verfahren zur Produktion eines Peptids/Proteins, das zumindest eine auf einem Antikörper basierende Antigen-Bindungsdomäne von menschlicher Zusammensetzung mit Bindungsspezifität für ein auf der Oberfläche einer menschlichen Zelle exprimiertes Antigen umfasst, wobei die Bindung einer multivalenten Zusammensetzung von einem oder mehreren des Peptids/Proteins an das Antigen, das auf der Oberfläche einer Zelle exprimiert wird, den Tod der Zelle verursacht oder zum Tod der Zelle führt, und wobei das Peptid/Protein ein menschlicher IgG-Antikörper ist, wobei das Verfahren die Schritte umfasst: (a) Clonieren von zumindest einer Nucleinsäure, die eine Antigen-Bindungsdomäne codiert, die von einem Peptid/Protein aus einem der Ansprüche 1 bis 3 umfasst wird, in zumindest einen Immunglobulin-Expressionsvektor; (b) Transfektion des zumindest einen Vektors in eine Wirtszelle; und (c) Expression des IgGs von der zumindest einen Nucleinsäure.
  5. Peptid/Protein, wobei das Peptid/Protein ein menschlicher IgG-Antiköper ist, der eine Antigen-Bindungsdomäne des Peptids/Proteins umfasst, das in einem der Ansprüche 1 bis 3 definiert oder durch das Verfahren nach Anspruch 4 erhältlich ist.
  6. Peptid/Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 3, das eine multivalente Zusammensetzung ist, die zumindest ein F(ab')2-Antikörperfragment oder ein Miniantikörperfragment umfasst.
  7. Peptid/Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 3, das eine multivalente Zusammensetzung ist, die zumindest zwei monovalente Antikörperfragmente ausgewählt aus Fv-, scFv-, dsFv- und Fab-Fragmenten umfasst, und das außerdem eine Vernetzungseinheit oder Vernetzungseinheiten umfasst.
  8. Peptid/Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 3, das eine multivalente Zusammensetzung ist, die zumindest einen vollständigen Antikörper ausgewählt aus den Antikörpern der Klassen IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgG4, IgA und IgM umfasst.
  9. Peptid/Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 3 und 5 bis 8, wobei das Antigen Epitope ausgewählt aus HLA-DR-Molekülen umfasst.
  10. Peptid/Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 3 und 5 bis 9, wobei der Tod mit einem IC50-Wert für die multivalente Zusammensetzung eintritt, der niedriger als 100 nM für das Abtöten von GRANTA-519 Zellen unter den nachstehend beschriebenen Assay-Bedingungen ist: (a) 2 × 105 GRANTA-519-Zellen werden in Medium (RPMI 1640; ergänzt durch 2.5% hitzeinaktiviertes FBS, 2mM L-Glutamin, 1% nicht-essentielle Aminosäuren, 1 mM Natriumpyruvat und 0.1 mg/ml Kanamycin) mit einer Verdünnungsreihe der multivalenten Zusammensetzung (2 bis 200 nM) inkubiert; (b) nach 4 h Inkubation bei 37°C unter 6% CO2 wird die Zelllebensfähigkeit durch Fluoresceindiacetat-Färbung und anschließende Zählung der verbleibenden lebensfähigen Zellen bestimmt; (c) die Konzentration der multivalenten Zusammensetzung, die 50% Zelltötung verursacht (IC50), wird bestimmt.
  11. Nucleinsäure, die eine oder mehrere Nucleinsäuresequenzen umfasst, die ein Peptid/Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 3 und 5 bis 10 codieren.
  12. Variante der Nucleinsäure nach Anspruch 11, die unter stringenten Bedingungen mit der Nucleinsäuresequenz nach Anspruch 11 hybridisiert, wobei die Variante ein Peptid/Protein gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 und 5 bis 10 codiert.
  13. Vektor, der zumindest eine Nucleinsäure nach Anspruch 11 und/oder zumindest eine Variante davon gemäß Anspruch 12 umfasst.
  14. Wirtszelle, die zumindest eine Nucleinsäure nach Anspruch 11 und/oder zumindest eine Variante davon gemäß Anspruch 12 und/oder einen Vektor nach Anspruch 13 beherbergt.
  15. Verfahren zur Produktion eines Peptids/Proteins gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 und 5 bis 10, das den Schritt umfasst, zumindest eine Nucleinsäure nach Anspruch 11 oder zumindest eine Variante davon gemäß Anspruch 12 in einem geeigneten Expressionssystem, bevorzugt in einer Wirtszelle, zu exprimieren.
  16. Arzneimittel, das zumindest ein Peptid/Protein gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 und 5 bis 10 umfasst, und gegebenenfalls einen pharmazeutisch verträglichen Träger und/oder ein pharmazeutisch verträgliches Verdünnungsmittel.
  17. Verwendung eines Peptids/Proteins gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 und 5 bis 10 für die Herstellung eines Arzneimittels für die Behandlung von Lebewesen.
  18. Verwendung gemäß Anspruch 17, wobei das Lebewesen ein Mensch ist.
  19. Verwendung gemäß Anspruch 17 oder 18, wobei die Behandlung die Behandlung von Krebs ist.
  20. Verwendung gemäß Anspruch 19, wobei die Behandlung die Behandlung von Krebsarten ist, die Zellen umfassen, die MHC-Klasse-II-Antigene exprimieren.
  21. Verwendung gemäß Anspruch 20, wobei die Zellen lymphoide Tumorzellen sind.
  22. Verwendung gemäß Anspruch 19 oder 20, wobei der Krebs ausgewählt ist aus Hodgkin-, Nicht-Hodgkin- und Burkitt-Lymphom, B-Zell-Lymphom, B-Zell-Vorläufer-Leukämie, akute lymphoide Leukämie der B-Zellen, akute myeloische Leukämien und Haarzell-Leukämie.
  23. Verwendung gemäß Anspruch 20, wobei die Zellen keine lymphoiden Zellen sind.
  24. Verwendung gemäß Anspruch 17 oder 18, wobei die Behandlung die Behandlung von Erkrankungen ist, die das Immunsystem einbeziehen.
  25. Verwendung gemäß Anspruch 24, wobei die Behandlung die Behandlung eines Zustandes ist, der ausgewählt ist aus rheumatoider Arthritis, juveniler Arthritis, multipler Sklerose, Morbus Basedow, insulinabhängigem Diabetes, Narkolepsie, Psoriasis, systemischem Lupus erythematodes, Morbus Bechterew, Transplantat-Abstoßung, Graft-versus-Host-Erkrankung, Hashimoto-Thyreoiditis, Myasthenia gravis, Pemphigus vulgaris, Glomerulonephritis, Thyroiditis, Pankreatitis, Insulitis, primär biliärer Zirrhose, irritable Darmerkrankung und Sjögren-Syndrom.
  26. Verwendung gemäß Anspruch 25, wobei die Erkrankung ausgewählt ist aus Myasthenia gravis, rheumatoider Arthritis, multipler Sklerose, Transplantat-Abstoßung und Graft-versus-Host-Erkrankung.
  27. Diagnostische Zusammensetzung, die zumindest ein Peptid/Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 3 und 5 bis 10 enthält.
  28. Diagnostische Zusammensetzung nach Anspruch 27, die außerdem eine Vernetzungseinheit oder Vernetzungseinheiten umfasst.
  29. Verwendung einer multivalenten Zusammensetzung, die zumindest ein Peptid/Protein gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 und 5 bis 10 umfasst, für die Herstellung eines Arzneimittels für das Abtöten einer Zelle.
  30. Verwendung nach Anspruch 29, wobei die Zelle eine lymphoide Zelle ist.
  31. Verwendung nach Anspruch 30, wobei die lymphoide Zelle eine lymphoide Tumorzelle ist.
  32. Verwendung nach Anspruch 29, wobei die Zelle eine nicht-lymphoide Zelle ist und MHC-Klasse-II-Moleküle exprimiert.
  33. Verwendung nach Anspruch 29, wobei das Arzneimittel verwendbar ist für die Behandlung einer Krankheit ausgewählt aus B-Zell-nicht-Hodgkin-Lymphom, B-Zell-Lymphom, akuter lymphoider Leukämie der B-Zellen, Burkitt-Lymphom, Hodgkin-Lymphom, Haarzell-Leukämie, akuter myeloischer Leukämie und B-Zell-Vorläufer-Leukämie.
  34. Kit umfassend: (i) ein Peptid/Protein gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 und 5 bis 10, und (ii) eine Vernetzungseinheit.
  35. Kit umfassend (i) ein Peptid/Protein gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 und 5 bis 10, und (ii) eine nachweisbare Einheit oder nachweisbare Einheiten, und (iii) Reagenzien und/oder Lösungen, um die Bindung von (i) an ein Antigen zu erreichen und/oder nachzuweisen.
  36. Multivalente Zusammensetzung, die zumindest ein Peptid/Protein gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 und 5 bis 10 und zumindest zwei der Antigen-Bindungsdomänen umfasst.
  37. Multivalente Zusammensetzung nach Anspruch 36, wobei die multivalente Zusammensetzung ein IgG-Antikörper ist.
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