CN116262787A - 一种抗人lag-3单克隆抗体及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种抗人LAG‑3单克隆抗体及其制备方法和应用，同时提供了该抗体的编码核酸分子、表达载体、宿主细胞、以及用于表达该抗体的方法，还提供了包含本发明抗体的药物组合物及用途。本发明的抗人LAG‑3单克隆抗体与人LAG‑3结合亲和力较高，可阻断人LAG‑3与MHCII蛋白的结合，但具备差异特性即不阻断或弱阻断人LAG‑3与人FGL1蛋白的结合。

Description

一种抗人LAG-3单克隆抗体及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种抗人LAG-3单克隆抗体及其制备方法和应用。
背景技术
淋巴细胞活化基因-3或LAG-3(也称作CD223)是免疫球蛋白超基因家族的成员并且在活化的T细胞(Huard等人(1994)Immunogenetics 39:213)、NK细胞(Triebel等人(1990)J.Exp.Med.171:1393-1405)、调节型T细胞(Huang等人(2004)Immunity 21:503-513；Camisaschi等人(2010)J Immunol.184:6545-6551；Gagliani等人(2013)Nat Med 19:739-746)和浆细胞样树突细胞(DCs)(Workman等人(2009)J Immunol 182:1885-1891)上表达。LAG-3是位于第12号染色体上的基因编码的膜蛋白并且在结构和遗传上与CD4相关。
LAG-3作为T-细胞应答的负调节剂的作用基于用LAG-3敲除小鼠的研究和在体外和体内系统模型中使用阻断性抗LAG-3抗体。
LAG-3最具特征的配体是MHCII(Major Histocompatibility Complex classII)，在细胞表面，LAG-3被表达为二聚体，这对于形成稳定的MHCII类结合位点是需要的(Huard B等人(1997)Proc Natl Acad Sci USA 94:5744-9)。MHCII transactivator(CIITA)已被证实是LAG-3配体的关键调控因子。CIITA诱导MHCII和MHCII辅助分子的表达，包括CD74(invariant chain,Ii)和H2-DM。
LAG-3另一个配体是纤维蛋白原样蛋白-1(FGL1)(Jun Wang等人(2019)Cell176:1-14)。FGL1是一种主要在肝脏表达的蛋白，被认为是肝保护剂和肝细胞有丝分裂原。有研究发现缺乏FGL1的小鼠(FGL1基因敲除小鼠)，使用化学致癌剂(二乙基亚硝胺)诱导发生肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)的几率是野生型小鼠的两倍多，表明FGL1通过Akt依赖机制在肝癌中起抑癌基因的作用，支持其作为肝癌潜在治疗的靶点(Hamed Nayeb等人(2015)Biochemical and Biophysical Research Communications 465:167-173)。
目前，临床产品较少，还需开发能够结合LAG-3且能够阻断LAG-3与MHCII相互作用的抗原结合蛋白，且同时不阻断或弱阻断LAG-3与FGL1的结合。
发明内容
本发明提供了一种抗人LAG-3单克隆抗体及其制备方法和应用，该单克隆抗体与人LAG-3具有较高的结合亲和力，同时能够阻断LAG-3与MHCII的相互作用，同时不阻断LAG-3与FGL1的相互作用。
本发明提供的技术方案如下：
本发明提供了一种抗人LAG-3单克隆抗体，所述抗体包含重链可变区和轻链可变区；
所述重链可变区包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，所述轻链可变区包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；
所述的CDR-H1的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示；
所述的CDR-H2的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示；
所述的CDR-H3的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示；
所述的CDR-L1的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示；
所述的CDR-L2的氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示；
所述的CDR-L3的氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示。
优选地，重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
优选地，重链和轻链都包括恒定区，重链恒定区氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示；轻链恒定区氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示。
优选地，所述的重链和轻链都还包括恒定区，该恒定区为鼠或人IgG的恒定区，优选为IgG1的恒定区。
本发明进一步提供了一种编码所述的抗人LAG-3单克隆抗体的核苷酸分子。
优选地，所述核苷酸分子的序列选自SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12；
序列SEQ ID NO：11编码所述抗体的重链可变区；
序列SEQ ID NO：12编码所述抗体的轻链可变区。
本发明进一步提供了一种含有所述的核苷酸分子的表达载体。
本发明进一步提供了一种含有所述的表达载体的宿主细胞。
优选地，所述宿主细胞为真核细胞，优选为哺乳动物细胞。
本发明进一步提供了一种抗人LAG-3单克隆抗体的制备方法，包含如下步骤：
(1)制备含有表达所述的抗人LAG-3单克隆抗体的核苷酸分子的表达载体；
(2)用步骤(1)得到的表达载体转染真核宿主细胞并培养；
(3)分离纯化，获得抗人LAG-3单克隆抗体。
本发明进一步提供了包括所述的抗人LAG-3单克隆抗体的抗体免疫偶联缀合物、双特异性分子、嵌和抗原受体或药物组合物。
进一步地，所述的药物组合物，包含治疗有效量的所述的抗人LAG-3单克隆抗体，以及一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
本发明进一步提供了所述的抗人LAG-3单克隆抗体在制备抗肿瘤、抗感染或自身免疫疾病药物中的应用。
优选地，所述自身免疫疾病包括银屑病、克罗恩病、类风湿性关节炎、原发性胆汁性肝硬化、系统性红斑狼疮(SLE)、
Figure BDA0003407262360000031
氏综合征、多发性硬化、溃疡性结肠炎和自身免疫性肝炎。
优选地，所述肿瘤包括卵巢癌、黑色素瘤、前列腺癌、肠癌、胃癌、食管癌、乳腺癌、肺癌、肾癌、胰腺癌、子宫癌、肝癌、膀胱癌、子宫颈癌、口腔癌、脑癌、睾丸癌、皮肤癌、甲状腺癌。
有益效果：
本发明的抗人LAG-3单克隆抗体与人LAG-3具有较高的结合亲和力，同时具有较强的LAG-3-MHCII阻断活性。另外，由于FGL1具有抑癌作用，因此本发明的抗体对LAG-3-FGL1较弱的阻断能力，在肿瘤治疗过程中是具有潜在优势的。可用于治疗自身免疫疾病、感染性疾病、过敏性疾病和癌症。
附图说明
图1为捕获ELISA测定抗体对人LAG-3蛋白的结合能力；
图2为间接ELISA测定抗体对鼠LAG-3蛋白的结合能力；
图3为间接ELISA测定抗体对食蟹猴LAG-3蛋白的结合能力；
图4为流式细胞术测评抗体与表面过表达人LAG-3的293T细胞的结合；
图5为配体结合阻断ELISA测评抗体对人LAG-3和人FGL1相互结合的阻断能力；
图6为流式细胞术测评抗体对人LAG-3与Daudi细胞表面表达的MHCII蛋白结合的阻断能力。
具体实施方式
术语
“LAG-3”是指淋巴细胞活化基因-3。术语“LAG-3”包含变体、同等型(isoform)、同源物、直系同源体(ortholog)及旁系同源体(paralog)。举例而言，在某些情形下，人LAG-3蛋白的特异性抗体可与来自人外的物种的LAG-3蛋白交叉反应。在其他实施方案中，人LAG-3蛋白的特异性抗体可对人LAG-3蛋白具有完全特异性且不表现物种或其他类型的交叉反应性，或可与来自某些其他物种(但并非所有其他物种)的LAG-3交叉反应(例如与猴LAG-3交叉反应但不与小鼠LAG-3交叉反应)。术语“人LAG-3”指人序列LAG-3，例如人LAG-3具有序列号P18627(Leu23-Val450)的氨基酸序列。
“抗原结合位点”指抗原上不连续的，由本文的抗体或抗原结合片段识别的三维空间位点。
“单克隆抗体”指具有单一氨基酸组成的抗体分子的制备物，而不指其产生的方法。单克隆抗体或其抗原结合片段可以例如通过杂交瘤技术、重组技术、噬菌体展示技术、合成技术例如CDR嫁接、或此类或其它本领域已知的技术的组合来产生。
“亲和力”是指分子(例如抗体)的单一结合位点与其结合配偶体(例如抗原)之间全部非共价相互作用总和的强度。除非另有说明，本文中，“结合亲和力”指反映抗体与抗原之间1∶1相互作用的内在结合亲和力。亲和力可通过本领域知道的常用方法来测量，包括现有技术已知以及本文中所描述的方法。
术语“竞争”用于竞争相同表位的抗原结合蛋白(例如中和抗原结合蛋白或中和抗体)的情况时，意指在抗原结合蛋白之间竞争，其通过以下测定法来测定：在所述测定法中，待检测的抗原结合蛋白(例如抗体或其免疫学功能片段)防止或抑制(例如降低)参考抗原结合蛋白(例如配体或参考抗体)与共同抗原(例如LAG-3或其片段)的特异性结合。众多类型的竞争性结合测定可用于确定一种抗原结合蛋白是否与另一种竞争。通过测量在所测抗原结合蛋白存在下结合固态表面或细胞的标记的量来测量竞争性抑制。通常所测抗原结合蛋白过量存在。由竞争性测定(竞争抗原结合蛋白)鉴定的抗原结合蛋白包括：结合与参考抗原结合蛋白同一表位的抗原结合蛋白；和结合充分接近参考抗原结合蛋白的结合表位的邻近表位的抗原结合蛋白，所述两个表位在空间上互相妨碍发生结合。
生产和纯化抗体和抗原结合片段的方法在现有技术中熟知和公开的，如冷泉港的抗体实验技术指南。如小鼠可以用人LAG-3或其片段免疫，所得到的抗体能被复性、纯化，并且可以用常规的方法进行氨基酸测序。抗原结合片段同样可以用常规方法制备。
“治疗”意指给予患者内用或外用治疗剂，诸如包含LAG-3抗体或其抗原结合片段的组合物，所述患者具有一种或多种疾病症状。通常，在受治疗患者或群体中以有效缓解一种或多种疾病症状的量给予治疗剂，无论是通过诱导这类症状退化还是抑制这类症状发展到任何临床可测量的程度。有效缓解任何具体疾病症状的治疗剂的量(也称作“治疗有效量”)可根据多种因素变化，例如患者的疾病状态、年龄和体重，以及药物对患者产生需要疗效的能力。通过医生或其它专业卫生保健人士通常用于评价该症状的严重性或进展状况的任何临床检测方法，可评价疾病症状是否已被减轻。
“有效量”包含足以改善或预防医学病症的症状或病症的量。有效量还意指足以允许或促进诊断的量。用于特定患者或兽医学受试者的有效量可依据以下因素而变化：如待治疗的病症、患者的总体健康情况、给药的方法途径和剂量以及副作用严重性。有效量可以是避免显著副作用或毒性作用的最大剂量或给药方案。
“药物组合物”表示含有一种或多种本文所述LAG-3抗体或其抗原结合片段与其他药学组分的混合物，其他药学组分如生理学/可药用的载体和赋形剂。药物组合物的目的是促进对生物体的给药，利于活性成分的吸收进而发挥生物活性。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。未注明具体来源的试剂，为市场购买的常规试剂。
实施例1通过融合杂交瘤技术获得特异性抗LAG-3的小鼠单克隆抗体
1.1动物免疫
根据文献中(E Harlow,D.Lane,Antibody:A Laboratory Manual,Cold SpringHarbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1998)通用的方法免疫小鼠LAG-3KO(上海南方模式生物科技股份有限公司)。以人LAG-3蛋白(内部制备，序列号P18627,Leu23-Val450)作为免疫原。
为了增加免疫应答，首次免疫和增强免疫分别使用弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂(Sigma,St.Louis,Mo.，USA)。简单地说，佐剂-抗原混合物的制备首先使用旋涡法在小瓶中轻轻混合佐剂。从小瓶中取出所需量的佐剂，放入高压灭菌的1.5mL微型离心管中。抗原在PBS或浓度为0.5-1.0mg/ml的生理盐水中制备。将计算量的抗原与佐剂一起加入微离心管中，轻轻搅拌2分钟，重复乳化混匀形成油包水的溶液。然后将佐剂-抗原溶液吸入适当的注射器进行动物注射。每只动物进行免疫，然后根据抗血清滴度进行2～3次加强免疫。滴度好的动物在融合前通过腹腔注射进行终免。
1.2杂交瘤融合和筛选
细胞融合前，培养小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0-Ag14,ATCC#CRL-1581)处于对数生长期。根据Kohler G和Milstein C在“Continuous cultures of fused cells secretingantibody of predefined specificity,”Nature,256:495-497(1975)所述的方法，处死免疫后小鼠无菌环境取脾，并与骨髓瘤细胞融合。
融合的“杂交细胞”随后被分配到含有HAT的96孔细胞板培养基中。通常融合后7-10天后显微镜下可观察到存活的杂交瘤细胞生长出来。细胞铺板两周后，收集各孔培养上清，以ELISA方法用重组人LAG-3-Fc蛋白抗原进行杂交瘤筛选。简单地说，ELISA板在4℃条件下用人LAG-3-Fc蛋白(cat#16498-H02H,Sino Biological Inc.，2.0μg/ml in PBS)包被过夜。用PBST洗板4次，再用封闭缓冲液(含5％脱脂奶粉的PBST)进行封闭。每孔加入稀释的小鼠免疫血清(用于测定小鼠血清效价)或杂交瘤上清，37℃孵育40分钟。再用PBST洗板4次，用GAM(Fc)-HRP(Jackson ImmunoResearch,cat#115-035-071)进行检测并测定450纳米处各孔的吸收值。然后选择分泌与人LAG-3-Fc结合抗体的阳性杂交瘤并转移到24孔板。
将产生高特异性结合人LAG-3且具有LAG-3/MHCII配体阻断活性抗体的杂交瘤克隆通过有限稀释法亚克隆，以确保细胞系的单克隆性，获得小鼠单克隆杂交瘤细胞株，而后采用细胞培养表达分泌小鼠单克隆抗体，然后进行纯化。
实施例2小鼠抗LAG-3单克隆抗体的结合活性研究
将实施例1中杂交瘤克隆产生的小鼠抗LAG-3单克隆抗体(mAbs)进一步用以下方法测试其结合活性。
将Relatlimab(BRISTOL-MYERS SQUIBB COMPANY,BMS)作为参照抗体(内部制备，重链氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示，轻链氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示)。
2.1基于捕获ELSIA测定抗体的结合能力
96-孔ELISA板用PBS配制的终浓度为2μg/ml的GAM-Fab(Jackson immunoResearch，cat#115-005-072)或GAH-Fab(Jackson immuno Research，cat#109-005-097)以100μl/孔进行包被，并于4℃孵育过夜。ELISA板用洗脱缓冲液(PBS+0.05％v/v吐温-20,PBST)清洗1次，然后加入200μl/孔的5％w/v的脱脂奶粉PBST缓冲液置于4℃封闭过夜。再次清洗平板，并用100μl/孔不同浓度的LAG-3鼠单克隆抗体或对照抗体(从66.7nM开始,用含2.5％脱脂奶粉的PBST连续5倍稀释)于37℃孵育40分钟，然后再洗板4次。将含有捕获LAG-3抗体的酶标板与100μl/孔的生物素标记的人LAG-3蛋白(LAG-3-Fc-bio，cat#LA3-H82Fb，Acro)在37℃下孵育40分钟，再洗板4次，并用链霉亲和素结合的辣根过氧化物酶SA-HRP(用PBST进行1:10000的稀释,Jackson Immuno Research，cat#016-030-084,100μl/孔)于37℃孵育40分钟。终洗后，用100μl/孔ELISA底物TMB(Innoreagents，#TMB-S-002)孵育ELISA板。15分钟内用50μl/孔1M H2SO4在25℃下终止反应，并测定450-630nm处的吸收值，测定结果见图1和表1。
图1和表1的结果表明，本发明的抗体G1A7对人LAG-3蛋白具有较好的结合能力，结合能力强于参照抗体Relatlimab。
2.2基于间接ELSIA测定抗体的结合能力
检测LAG-3抗体与鼠LAG-3蛋白和食蟹猴LAG-3蛋白的交叉反应活性。
简要的说，96-孔ELISA板中加入100μl/孔的2μg/ml小鼠LAG-3-his(内部制备，小鼠LAG-3蛋白序列参照Uniprot数据库#Q61790，Gly24-Leu442)或2μg/ml猴LAG-3-his(cat#90841-C08H,Sino Biological Inc)于37℃孵育2h。用PBST(PBS+0.05％吐温-20)洗板1次，并用200μl封闭缓冲液(含5％w/v脱脂奶粉的PBST)于37℃封闭2h。再次清洗平板，用100μl/孔连续稀释的抗LAG-3抗体或对照抗体(从66.7nM开始,用含2.5％脱脂奶粉的PBST连续5倍稀释)于37℃孵育2h。ELISA板清洗4次，分别加入的GAM(Fab)-HRP或GAH(Fab)-HRP(cat#115-035-006或cat#109-035-097,Jackson ImmunoResearch Laboratories,Inc.,100μl/孔)于37℃孵育40分钟。终洗后,加入100μl/孔的TMB(cat#TMB-S-002,Innoreagents)室温下反应40分钟。然后用1M H2SO4终止反应，测定450-630nm处的吸收值。使用Graphpad Prism软件对数据进行分析，得出EC50值，具体结果见图2、图3和表1。
结果表明本发明的抗体G1A7对鼠LAG-3和食蟹猴LAG-3蛋白都不结合，与参照抗体表现一致。
2.3用流式细胞术(FACS)测定LAG-3单克隆抗体与表面过表达人LAG-3的293T细胞系的结合
首先，用插入含有人LAG-3蛋白编码序列的质粒转染293T细胞，构建表面过表达LAG-3的293T细胞系。然后，从细胞培养瓶中收集表面过表达人LAG-3的稳定细胞系293T，洗两次，并用含有2％v/v胎牛血清的PBS磷酸盐缓冲液(FACS缓冲液)重悬。96孔板中每孔的1×l05个细胞与含不同浓度LAG-3抗体或参照抗体(从10μg/ml开始，连续5倍稀释)的FACS缓冲液置于冰上孵育40分钟。用FACS缓冲液洗细胞2次，并添加100μL/孔的GAM-PE或GAH-PE(cat#115-116-146或cat#109-115-098，Jackson Immunoresearch，用FACS缓冲液按1:1000进行稀释)。4℃孵育40分钟后，洗细胞2次，再用FACS缓冲液重悬。使用Becton DickinsonFACS Canto II-HTS设备进行荧光测量。使用Graphpad Prism软件分析数据，得出抗体结合细胞的EC50浓度值，即LAG-3抗体与过表达LAG-3的细胞达到最大荧光结合信号50％时对应的抗体浓度值，测定结果见图4和表1。
结果表明，本发明的抗体G1A7与表面过表达人LAG-3的293T细胞的结合能力强于参照抗体Relatlimab。
表1.小鼠抗LAG-3抗体的结合活性
Figure BDA0003407262360000091
实施例3小鼠抗LAG-3单克隆抗体对LAG-3-FGL1或对LAG-3与表面表达MHCII的Daudi细胞相互作用的竞争性功能阻断能力
3.1配体阻断ELISA
使用竞争ELISA检测本发明的抗LAG-3抗体对LAG-3-FGL1相互作用的阻断能力。简单地说，用人FGL1-Fc蛋白(内部制备，FGL1的氨基酸序列参照NCBI数据库#NP_004458.3,Glu19-Ile312)以100μg/孔包被平板，并于37℃孵育2h。然后，用清洗缓冲液(PBS+0.05％吐温-20,PBST)清洗平板，再用含5％w/v脱脂奶粉的PBST在37℃下封闭2h。将12μg/ml的LAG-3抗体、hIgG和Relatlimab用DMEM连续4倍稀释后，分别与3μg/ml的生物素标记的人LAG-3蛋白(LAG-3-Fc-bio)混合，然后进行预孵室温1h。将孵育后的混合物加入FGL1-Fc包覆的平板，于37℃孵育1h。再洗板4次，然后加入SA-HRP，于37℃孵育1h，检测生物素标记的人LAG-3-Fc-bio与底板FGL1的结合，再用清洗缓冲液洗板。最后，加入TMB，用1M H2SO4终止反应，测定450-630nm处的吸收值。使用Graphpad Prism软件对数据进行分析，得出IC50值，具体结果见图5。
结果表明本发明的抗体G1A7对LAG-3-FGL1的阻断活性较弱，而参照抗体能够阻断LAG-3-FGL1的相互作用。由于FGL1具有抑癌作用，可以阻止肿瘤的快速生长，因此本发明的抗体对LAG-3-FGL1较弱的阻断能力，在肿瘤治疗过程中是具有潜在优势的。
3.2基于细胞的配体阻断FACS
LAG-3抗体阻断人LAG-3和Daudi细胞表面表达的MHCII蛋白的结合能力通过流式细胞术(FACS)进行评估,使用表面表达人MHCII的Daudi细胞(购自上海中科院细胞库)。
抗LAG-3抗体、参照抗体(抗体浓度从66.67nM开始5倍连续稀释)与0.4μg/ml的LAG-3-Fc(cat#16498-H02H,Sino Biological Inc.)混合,然后室温条件下孵育40分钟。Daudi细胞在对数生长期从细胞培养瓶中获得，洗涤两次并在含2％v/v胎牛血清的PBS(FACS缓冲液)中重悬。96孔板，每孔1xl05 Daudi细胞,然后加入100μl/孔的LAG-3抗体/LAG-3-Fc的混合物，4℃下孵育40分钟。细胞用FACS缓冲液洗2次,然后加入100μl/孔的GAH-PE(1:1000稀释在FACS缓冲液中)用以检测LAG-3-Fc结合Daudi细胞,并于4℃避光孵育40分钟。细胞洗两次，在FACS缓冲液中重新悬。使用Becton Dickinson FACS Canto II-HTS设备进行荧光测量。采用Graphpad Prism软件进行数据分析，并报告IC50值。结果如图6所示。
结果表明本发明的抗体G1A7能够阻断人LAG-3与Daudi细胞表面表达的MHCII蛋白的结合，阻断能力与参照抗体Relatlimab相当。
实施例4 DNA克隆及测序，抗LAG-3抗体的序列分析
使用Trizol试剂(Invitrogen,catalog#15596-018)从实施例1的杂交瘤细胞中提取总RNA。
过程简述如下，离心收集5×106的细胞到1.5ml离心管中，吸干上清。添加1ml的Trizol试剂并反复吹打数次后25℃放置5分钟用于裂解细胞。紧接着，每管加入0.2ml的氯仿溶液，剧烈震荡15秒后室温放置3分钟。而后，离心管4℃12000g离心10分钟，取出离心管，吸取上层水相溶液到新的1.5ml离心管中，再加入0.4ml的异丙醇用于从水相中沉淀RNA。手动混匀EP管并放置25℃下10min后，4℃12000g离心10分钟，弃上清。加入1ml 75％的乙醇，再次4℃7500rpm离心5min，弃上清。管底RNA沉淀于室温干燥10分钟后，加入30到50ul的无菌DEPC处理水溶解RNA样品。
紧接着，选用Taraka的逆转录cDNA试剂盒(catalog#6110A)把总RNA变为cDNA。实验体系配制如下：5μl的总RNA+0.5μl Oligo(dT)+8.5μl RNase-free水(共14μl)先置于65度5min预变性，而后放冰上2分钟。进一步加入4μl的5×缓冲液+1μl的dNTP混合物+0.5μl的RNase抑制剂+1μl逆转录酶(总共20.5μl体系)，混匀，于40℃度孵育50分钟，然后70℃10min，完成cDNA合成。cDNA进一步在3’端加poly-G，反应体系配制如下：5μl的cDNA样品+33.5μl的ddH2O+5μl的10×TdT缓冲液+5μl的CoCl2+1μl的dGTP+0.5μl的末端脱氧核苷酸转移酶(总体积50ul)，于37℃孵育30分钟，然后70℃10min，完成poly-G加尾。
进一步，以加尾的cDNA为模板进行抗体可变区的基因扩增。对于扩增抗体重链可变区序列，配制PCR反应体系：10×Taq酶缓冲液5μl+通用poly C引物(正向引物)0.5μl+小鼠IgG1反向引物0.5μl+dNTP 1μl+Taq聚合酶1μl+cDNA1μl+ddH2O 41μl。对于扩增抗体轻链可变区序列，配制PCR反应体系：10×Taq酶缓冲液5μl+通用poly C引物(正向引物)0.5μl+小鼠IgG kappa链反向引物0.5μl+dNTP 1μl+Taq聚合酶1μl+cDNA1μl+ddH2O 41μl。抗体重链和轻链可变区PCR扩增的温度循环如下(其中步骤2到4，重复25个循环)：
1)预变性95℃，5min；
2)变性95℃，20sec；
3)退火56℃，20sec；
4)延伸72℃，30sec；
5)保存25℃，60min。
PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳分析，切出对应大小的DNA区段条带(VH约600bp，VK约500bp)，用QIAquick的凝胶DNA回收试剂盒(catalog#28704)进行DNA的抽提。简述如下：凝胶称重，加3倍凝胶体积的QG缓冲液，而后50℃孵育10分钟直到凝胶完全溶解。加入1倍胶体积的异丙醇混匀后，样品移至QIA纯化柱，13000rpm离心1分钟。加入750μl的PE缓冲液到柱中，而后13000rpm离心1分钟。并再次13000rpm离心去除柱中液体残留。加入30μl水13000rpm离心1分钟进行洗脱，获得制备的DNA样品，纯化的PCR产物经测序获得抗体的可变区序列。
本发明克隆的序列信息见表2。
表2.抗人LAG-3抗体G1A7的氨基酸序列
Figure BDA0003407262360000121
抗人LAG-3抗体G1A7的VH核苷酸序列：
GAGGTCCAGCTGCAACAGTCTGGACCTGTGCTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGATGTCCTGTAAGGCTTCTGGATACACTTTCACTCACTACTATATGAACTGGGTGAAACAGAGCCATGGAAAGAGCCTTGAATGGATTGGAGTTATTAATCCTTACAACGGTGATACTAGCTACAAGCAGAACTTCAAGGGCAAGGCCACATTGACTGTTGACAAGACCTCCAGCACAGCCTACATGGACCTCAACAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTACTGTGCAAGAGATGATGGTTACTACCAGTGGTACTTCGATGTCTGGGGCACAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCG(SEQ ID NO:11)
抗人LAG-3抗体G1A7的VL核苷酸序列：
GACATCCAGCTGACCCAGTCTCCATCCTCCTTATCTGCCTCTCTGGGAGAAAGAGTCAGTCTCACTTGTCGGGCAAGTCAGGACATTGGTAGTAGGTTAATCTGGCTTCAGCAGGGACCAGATGGAACTATTAAACGCCTGATCTTCGCCACATCCAGTTTAGATTCTGGTGTCCCCAAAAGGTTCAGTGGCAGTAGGTCTGGGTCAGATTATTCTCTCACCATCAGCAGCCTTGAGTCTGAAGATTTTGTCGACTATTACTGTCTACAATGTGCTAGTTCTCCTCCGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAA(SEQ ID NO:12)
Relatlimab的重链氨基酸序列：
QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSDYYWNWIRQPPGKGLEWIGEINHRGSTNSNPSLKSRVTLSLDTSKNQFSLKLRSVTAADTAVYYCAFGYSDYEYNWFDPWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ ID NO:13)
Relatlimab的轻链氨基酸序列：
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSISSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPLTFGQGTNLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ IDNO:14)
尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。
序列表
<110> 博奥信生物技术（南京）有限公司
<120> 一种抗人LAG-3单克隆抗体及其制备方法和应用
<160> 14
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Val Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr His Tyr
20 25 30
Tyr Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Val Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Lys Gln Asn Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Thr Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Asp Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Asp Gly Tyr Tyr Gln Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Thr
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 2
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Ser Leu Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Gly Ser Arg
20 25 30
Leu Ile Trp Leu Gln Gln Gly Pro Asp Gly Thr Ile Lys Arg Leu Ile
35 40 45
Phe Ala Thr Ser Ser Leu Asp Ser Gly Val Pro Lys Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Ser Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Val Asp Tyr Tyr Cys Leu Gln Cys Ala Ser Ser Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 3
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
His Tyr Tyr Met Asn
1 5
<210> 4
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Val Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Lys Gln Asn Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 5
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Asp Asp Gly Tyr Tyr Gln Trp Tyr Phe Asp Val
1 5 10
<210> 6
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Arg Ala Ser Gln Asp Ile Gly Ser Arg Leu Ile
1 5 10
<210> 7
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Ala Thr Ser Ser Leu Asp Ser
1 5
<210> 8
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Leu Gln Cys Ala Ser Ser Pro Pro Thr
1 5
<210> 9
<211> 335
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly
1 5 10 15
Gly Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Leu Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Leu Leu Gln Ser Gly Leu Tyr Thr Leu
50 55 60
Ser Ser Ser Val Thr Val Thr Ser Asn Thr Trp Pro Ser Gln Thr Ile
65 70 75 80
Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys
85 90 95
Ile Glu Ser Arg Arg Pro Ile Pro Pro Asn Ser Cys Pro Pro Cys Lys
100 105 110
Glu Cys Ser Ile Phe Pro Ala Pro Asp Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser
130 135 140
Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp
145 150 155 160
Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln
165 170 175
Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser
180 185 190
Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys
195 200 205
Cys Lys Val Asn Asn Arg Ala Leu Pro Ser Pro Ile Glu Lys Thr Ile
210 215 220
Ser Lys Pro Arg Gly Pro Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro
225 230 235 240
Pro Pro Ala Glu Glu Met Thr Lys Lys Glu Phe Ser Leu Thr Cys Met
245 250 255
Ile Thr Asp Phe Leu Pro Ala Glu Ile Ala Val Asp Trp Thr Ser Asn
260 265 270
Gly His Lys Glu Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Ala Pro Val Leu Asp Thr
275 280 285
Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Gln Lys Ser Thr
290 295 300
Trp Glu Lys Gly Ser Leu Phe Ala Cys Ser Val Val His Glu Gly Leu
305 310 315 320
His Asn His His Thr Thr Lys Thr Ile Ser Arg Ser Leu Gly Lys
325 330 335
<210> 10
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu
1 5 10 15
Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg
35 40 45
Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu
65 70 75 80
Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser
85 90 95
Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 11
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gaggtccagc tgcaacagtc tggacctgtg ctggtgaagc ctggggcttc agtgaagatg 60
tcctgtaagg cttctggata cactttcact cactactata tgaactgggt gaaacagagc 120
catggaaaga gccttgaatg gattggagtt attaatcctt acaacggtga tactagctac 180
aagcagaact tcaagggcaa ggccacattg actgttgaca agacctccag cacagcctac 240
atggacctca acagcctgac atctgaggac tctgcagtct attactgtgc aagagatgat 300
ggttactacc agtggtactt cgatgtctgg ggcacaggga ccacggtcac cgtctcctcg 360
<210> 12
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
gacatccagc tgacccagtc tccatcctcc ttatctgcct ctctgggaga aagagtcagt 60
ctcacttgtc gggcaagtca ggacattggt agtaggttaa tctggcttca gcagggacca 120
gatggaacta ttaaacgcct gatcttcgcc acatccagtt tagattctgg tgtccccaaa 180
aggttcagtg gcagtaggtc tgggtcagat tattctctca ccatcagcag ccttgagtct 240
gaagattttg tcgactatta ctgtctacaa tgtgctagtt ctcctccgac gttcggtgga 300
ggcaccaagc tggaaatcaa a 321
<210> 13
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asn His Arg Gly Ser Thr Asn Ser Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Leu Ser Leu Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Arg Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Phe Gly Tyr Ser Asp Tyr Glu Tyr Asn Trp Phe Asp Pro Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro
210 215 220
Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val
225 230 235 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu
260 265 270
Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
275 280 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
290 295 300
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305 310 315 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
340 345 350
Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
355 360 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
370 375 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
385 390 395 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
405 410 415
Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
420 425 430
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
435 440 445
<210> 14
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Asn Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210

Claims (10)

1.一种抗人LAG-3单克隆抗体，其特征在于，所述抗体包含重链可变区和轻链可变区；
所述重链可变区包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，所述轻链可变区包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；
所述的CDR-H1的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示；
所述的CDR-H2的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示；
所述的CDR-H3的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示；
所述的CDR-L1的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示；
所述的CDR-L2的氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示；
所述的CDR-L3的氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示。
2.根据权利要求1所述的一种抗人LAG-3单克隆抗体，其特征在于，重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
3.根据权利要求1所述的一种抗人LAG-3单克隆抗体，其特征在于，重链和轻链都包括恒定区，重链恒定区氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示；轻链恒定区氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示。
4.一种核苷酸分子，其特征在于，所述核苷酸分子编码如权利要求1～3中任一项所述的抗人LAG-3单克隆抗体。
5.根据权利要求4所述的核苷酸分子，其特征在于，所述核苷酸分子的序列选自SEQ IDNO：11和SEQ ID NO：12；
序列SEQ ID NO：11编码所述抗体的重链可变区；
序列SEQ ID NO：12编码所述抗体的轻链可变区。
6.一种表达载体，其特征在于，该表达载体含有如权利要求4或5所述的核苷酸分子。
7.一种宿主细胞，其特征在于，该宿主细胞含有如权利要求6所述的表达载体。
8.如权利要求1～3中任一项所述抗人LAG-3单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包含如下步骤：
制备含有表达如权利要求1～3任一项所述的抗人LAG-3单克隆抗体的核苷酸分子的表达载体；
将得到的表达载体转染真核宿主细胞并培养；
分离纯化，获得抗人LAG-3单克隆抗体。
9.包括如权利要求1～3中任一项所述的抗人LAG-3单克隆抗体的抗体免疫偶联缀合物、双特异性分子、嵌和抗原受体或药物组合物。
10.如权利要求1～3中任一项所述的抗人LAG-3单克隆抗体在制备抗肿瘤、抗感染或自身免疫疾病药物中的应用。
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