CN115947845A - 一种具有cd47结合活性的单克隆抗体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种具有CD47结合活性的单克隆抗体，还提供了本发明抗体在制备抗肿瘤药物或纤维化疾病的药物中的用途。本发明所述的具有CD47结合活性的单克隆抗体与人CD47亲和力较高，相较于现有抗人CD47单克隆抗体，具有较强的促肿瘤细胞吞噬作用。

Description

一种具有CD47结合活性的单克隆抗体及其应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种具有CD47结合活性的单克隆抗体，以及其在制备抗肿瘤药物或纤维化疾病的药物中的用途。

背景技术

分化抗原簇47(cluster of differentiation 47，CD47)是肿瘤细胞上过度表达的免疫调节分子，其分子结构包括N末端的细胞外可变结构域，五个疏水的跨膜螺旋结构，以及一个非常短的C末端的细胞内信号序列。与PD-1等直接作用于T细胞的免疫检查点不同，CD47主要通过与信号调节蛋白α(Signal-regulatory protein，SIRPα)结合，抑制巨噬细胞的吞噬作用。

CD47与SIRPα结合后，引起ITIMs(免疫受体酪氨酸抑制基序)酪氨酸磷酸化，磷酸化的ITIMs募集后激活蛋白酪氨酸磷酸酶SHP-1/2，抑制下游肌球蛋白IIA，阻止巨噬细胞吞噬。CD47-SIRPα还会抑制树突状细胞的成熟，进而抑制其产生细胞因子，阻止将肿瘤抗原递呈给CD8⁺T细胞。CD47在乳腺癌、非小细胞型肺癌和胃癌等实体瘤和血液系统恶性肿瘤中过表达，通常与不良预后相关。

IgG4在血浆中的含量为1％-4％，以该亚型制备的CD47抗体红细胞的毒副作用有限。莫洛利单抗(Hu5F9-G4，Magrolimab)最初由Forty Seven公司(现被吉利德公司收购)研发，就是将人源化5F9可变片段连接到IgG4骨架上，以减少对红细胞的杀伤作用。莫洛利单抗是目前进展最快的人源化抗CD47单克隆抗体，联合阿扎胞苷(Azacytidine)治疗骨髓增生异常综合征的Ⅲ期临床试验正在进行中(NCT04313881)。

近年来，针对CD47-SIRPα信号通路介导的免疫逃逸进行的药物研发成为了肿瘤免疫治疗的热点。然而，目前已开发的抗人CD47单克隆抗体还存在亲和力较低或作用靶点如抗原表位不明确的问题。因此，亟需一种能诱导巨噬细胞吞噬癌细胞，且亲和力较高的新型治疗性候选CD47抗体。

发明内容

本发明的目的是为了解决以上现有技术的不足，提供一种具有CD47结合活性的新型单克隆抗体，该单克隆抗体具有较好的CD47-SIRPα阻断活性，同时具有较强促肿瘤细胞吞噬作用。

本发明提供了一种具有CD47结合活性的单克隆抗体，所述抗体包含重链可变区和轻链可变区；

所述重链可变区包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，所述轻链可变区包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；

所述的CDR-H1的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示；

所述的CDR-H2的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示；

所述的CDR-H3的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示；

所述的CDR-L1的氨基酸序列如SEQ ID NO：12所示；

所述的CDR-L2的氨基酸序列如SEQ ID NO：14所示；

所述的CDR-L3的氨基酸序列如SEQ ID NO：16所示。

优选地，重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示；轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：18所示。

优选地，重链氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示；轻链氨基酸序列如SEQ ID NO：20所示。

优选地，所述的重链和轻链都还包括恒定区，该恒定区为鼠或人IgG的恒定区，优选为IgG4的恒定区。

本发明进一步提供了一种编码上述单克隆抗体的核苷酸分子。

优选地，所述核苷酸分子的序列选自SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：17；

序列SEQ ID NO：7编码所述的抗体的重链可变区；

序列SEQ ID NO：17编码所述的抗体的轻链可变区。

本发明进一步提供了一种含有所述的核苷酸分子的表达载体。

本发明进一步提供了一种含有所述的表达载体的宿主细胞。

优选地，所述宿主细胞为真核细胞，优选为哺乳动物细胞。

本发明进一步提供了上述单克隆抗体的制备方法，包含如下步骤：

(1)制备含有表达所述的单克隆抗体的核苷酸分子的表达载体；

(2)用步骤(1)得到的表达载体转染真核宿主细胞并培养；

(3)分离纯化，获得具有CD47结合活性的单克隆抗体。

本发明进一步提供了包括上述单克隆抗体的抗体免疫偶联缀合物、双特异性分子、嵌和抗原受体或药物组合物。

进一步地，所述的药物组合物，包含治疗有效量的所述的具有CD47结合活性的单克隆抗体，以及一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

本发明进一步提供了上述单克隆抗体在制备抗肿瘤药物或纤维化疾病的药物中的应用。

优选地，所述肿瘤为血液瘤或实体瘤，包括非霍奇金淋巴瘤(NHL)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、急性髓母细胞白血病(AML)、卵巢癌、输卵管癌、结直肠癌、膀胱癌、乳腺癌、头颈部癌、胰腺癌、肺癌、胶质瘤和胶质母细胞瘤。

优选地，所述纤维化疾病包括心绞痛、骨关节炎、肺纤维化、哮喘和支气管炎。

有益效果：

本发明的具有CD47结合活性的单克隆抗体与人CD47亲和力较高，同时相较于现有抗人CD47单克隆抗体，具有较好的CD47-SIRPα阻断活性，以及较强的促肿瘤细胞吞噬作用。

附图说明

图1为捕获ELISA测定抗体对人CD47蛋白的结合能力；

图2为捕获ELISA测定抗体对食蟹猴CD47蛋白的结合能力；

图3为流式细胞术测评抗体与表面过表达人CD47的293F细胞的结合；

图4为配体结合阻断ELISA；

图5为参照抗体阻断ELISA；

图6A-6B为流式细胞术测评抗体诱导巨噬细胞吞噬肿瘤细胞的能力。

具体实施方式

术语

“结合CD47”或“与CD47结合”，指能与人CD47相互作用。

“抗原结合位点”指抗体上具有与抗原(例如CD47蛋白)特异性结合能力的一个或多个片段。

“单克隆抗体”指具有单一氨基酸组成的抗体分子的制备物，呈现出对特定表位的单一结合特异性和亲和力，而不指其产生的方法。单克隆抗体或其抗原结合片段可以例如通过杂交瘤技术、重组技术、噬菌体展示技术、合成技术例如CDR嫁接、或此类或其它本领域已知的技术的组合来产生。

“亲和力”是指分子(例如抗体)的单一结合位点与其结合配偶体(例如抗原)之间全部非共价相互作用总和的强度。除非另有说明，本文中，“结合亲和力”指反映抗体与抗原之间1∶1相互作用的内在结合亲和力。亲和力可通过本领域知道的常用方法来测量，包括现有技术已知以及本文中所描述的方法。

术语“竞争”用于竞争相同表位的抗原结合蛋白(例如中和抗原结合蛋白或中和抗体)的情况时，意指在抗原结合蛋白之间竞争，其通过以下测定法来测定：在所述测定法中，待检测的抗原结合蛋白(例如抗体或其免疫学功能片段)防止或抑制(例如降低)参考抗原结合蛋白(例如配体或参考抗体)与共同抗原(例如CD47或其片段)的特异性结合。众多类型的竞争性结合测定可用于确定一种抗原结合蛋白是否与另一种竞争。通过测量在所测抗原结合蛋白存在下结合固态表面或细胞的标记的量来测量竞争性抑制。通常所测抗原结合蛋白过量存在。由竞争性测定(竞争抗原结合蛋白)鉴定的抗原结合蛋白包括：结合与参考抗原结合蛋白同一表位的抗原结合蛋白；和结合充分接近参考抗原结合蛋白的结合表位的邻近表位的抗原结合蛋白，所述两个表位在空间上互相妨碍发生结合。

生产和纯化抗体和抗原结合片段的方法在现有技术中熟知和公开的，如冷泉港的抗体实验技术指南。如小鼠可以用人CD47或其片段免疫，所得到的抗体能被复性、纯化，并且可以用常规的方法进行氨基酸测序。抗原结合片段同样可以用常规方法制备。

“治疗”意指给予患者内用或外用治疗剂，诸如包含CD47抗体或其抗原结合片段的组合物，所述患者具有一种或多种疾病症状。通常，在受治疗患者或群体中以有效缓解一种或多种疾病症状的量给予治疗剂，无论是通过诱导这类症状退化还是抑制这类症状发展到任何临床可测量的程度。有效缓解任何具体疾病症状的治疗剂的量(也称作“治疗有效量”)可根据多种因素变化，例如患者的疾病状态、年龄和体重，以及药物对患者产生需要疗效的能力。通过医生或其它专业卫生保健人士通常用于评价该症状的严重性或进展状况的任何临床检测方法，可评价疾病症状是否已被减轻。

“有效量”包含足以改善或预防医学病症的症状或病症的量。有效量还意指足以允许或促进诊断的量。用于特定患者或兽医学受试者的有效量可依据以下因素而变化：如待治疗的病症、患者的总体健康情况、给药的方法途径和剂量以及副作用严重性。有效量可以是避免显著副作用或毒性作用的最大剂量或给药方案。

“药物组合物”表示含有一种或多种本文所述CD47抗体或其抗原结合片段与其他药学组分的混合物，其他药学组分如生理学/可药用的载体和赋形剂。药物组合物的目的是促进对生物体的给药，利于活性成分的吸收进而发挥生物活性。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。未注明具体来源的试剂，为市场购买的常规试剂。

实施例1通过融合杂交瘤技术获得特异性抗CD47的小鼠单克隆抗体

1.1动物免疫

根据文献中(E Harlow,D.Lane,Antibody:A Laboratory Manual,Cold SpringHarbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1998)通用的方法免疫小鼠。以重组人CD47蛋白(Sino biological inc.，cat#12283-H02H)为免疫原。

为了增加免疫应答，首次免疫和增强免疫分别使用弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂(Sigma，St.Louis,Mo.，USA)。简单地说，佐剂-抗原混合物的制备首先使用旋涡法在小瓶中轻轻混合佐剂。从小瓶中取出所需量的佐剂，放入高压灭菌的1.5mL微型离心管中。抗原在PBS或浓度为0.5-1.0mg/ml的生理盐水中制备。将计算量的抗原与佐剂一起加入微离心管中，轻轻搅拌2分钟，重复乳化混匀形成油包水的溶液。然后用注射器吸入适量的佐剂-抗原混合液对每只动物进行注射免疫。根据抗血清效价进行2～3次加强免疫。在细胞融合前，通过腹腔注射对具有较好抗血清效价的动物进行加强免疫。

1.2杂交瘤融合和筛选

培养小鼠骨髓瘤细胞系(SP2/0-Ag14，ATCC#CRL-1581)的细胞，在细胞融合前达到对数生长期。根据文献(Kohler G,and Milstein C,“Continuouscultures of fusedcells secreting antibody of predefined specificity,”Nature,256:495-497(1975).)中所述的方法与骨髓瘤细胞融合。

融合的“杂交细胞”随后被分配到含有DMEM/20％FCS/HAT培养基的96孔细胞板中。通常融合后7-10天在显微镜下可观察到存活的杂交瘤细胞生长出来。细胞铺板两周后，使用重组人CD47-his蛋白对各孔的上清液进行ELISA检测。简单地说，ELISA板在4℃条件下用人CD47-his蛋白(ACRO biosystems，cat#CD7-H5227，2.0μg/ml in PBS)包被过夜。用PBST洗板4次，再用封闭缓冲液(含5％脱脂奶粉的PBST)进行封闭。每孔加入稀释的小鼠免疫血清(用于测定小鼠血清效价)或杂交瘤上清，37℃孵育40分钟。再用PBST洗板4次，用辣根过氧化物酶-山羊抗小鼠IgG(Jackson Immuno research,cat#115-036-071)进行检测并测定450纳米处各孔的吸收值。然后选择分泌与人CD47-his结合的抗体的阳性杂交瘤，转移到24孔板。

将产生高特异性结合人CD47且具有CD47/SIRPα配体阻断活性的抗体的杂交瘤克隆通过有限稀释法进行亚克隆，然后进行纯化。简而言之，使用5-10倍柱体积的PBS缓冲液冲洗蛋白A琼脂糖色谱柱。杂交瘤单克隆抗体的细胞上清液通过色谱柱，然后用PBS缓冲液冲洗柱子，直至蛋白吸光度达到基线。用洗脱缓冲液(0.1M甘氨酸-HCl，pH 2.7)洗脱柱子，并立即收集到含有中性缓冲液(1M Tris-HCl，pH 9.0)的1.5ml管中。将含有免疫球蛋白的部分混合，并于4℃在PBS中透析过夜。随后，如下所述对纯化单克隆抗体的功能活性进行体外表征。

实施例2使用BIACORE表面等离子体共振技术测定小鼠抗CD47单克隆抗体的亲和力

将实施例1中杂交瘤克隆产生的抗CD47小鼠单克隆抗体(mAbs)通过Biacore T200系统(GE healthcare，Pittsburgh，PA，USA)进行亲和力动力学表征测定。

简单地说，使用Biacore提供的标准胺偶联试剂盒，将山羊抗小鼠IgG通过伯胺共价连接到CM5芯片(羧基甲基葡聚糖包被芯片)。生物传感器表面未反应的部分用乙醇胺封闭。纯化实施例1中产生的小鼠抗CD47抗体，并将参照抗体CC-9000(Celgene)和Hu5F9-G4(Forty Seven)以66.7nM的浓度，10μL/min的流速流到芯片上。然后，将HBS EP缓冲液(Biacore提供)中的重组人CD47-his蛋白(Acro biosystems，cat#CD7-H5227，MW:15.6kDa)或食蟹猴CD47-his蛋白(Acro biosystems，cat#CD7-C52H1，MW:15.8kDa)以30μL/min的流速流到芯片上。抗原-抗体结合动力学观测2分钟，解离动力学观测10分钟。用BIAcore评价软件拟合出结合与解离为1:1的Langmuir结合模型曲线。

其中k_a，k_d和K_D的值见表1。

表1.Biacore测定小鼠抗CD47单克隆抗体结合人或食蟹猴CD47的动力学参数

本发明的单克隆抗体1H4与人CD47的结合K_D值和参照抗体处于相同的数量级，表明其对人CD47具有较高的亲和力。

实施例3小鼠抗CD47单克隆抗体的结合活性研究

通过捕获ELISA和流式细胞术(FACS)，进一步对实施例1中产生的小鼠抗CD47单克隆抗体的结合活性进行测试。

3.1基于捕获ELSIA测定抗体的结合能力

96孔ELISA板用PBS配制的终浓度为2μg/ml的Fcγ片段特异的山羊抗小鼠IgG抗体(Jackson immuno Research，cat#115-006-071，100μl/孔)进行包被，于4℃孵育过夜。ELISA板用洗脱缓冲液(PBS+0.05％v/v Tween-20，PBST)清洗4次，然后加入200μl/孔的5％w/v的脱脂奶粉PBST缓冲液，置于37℃封闭2小时。再次清洗平板，加入100μl/孔不同浓度的CD47小鼠单克隆抗体，于37℃孵育40分钟，然后再洗板4次。将含有捕获CD47抗体的酶标板与生物素标记的人CD47蛋白(ACRO Biosystems，cat#CD7-H5227)或猴CYNO-CD47-HIS-BIO(ACRO Biosystems，cat#CD7-C52H1)(60nM，2.5％脱脂奶粉PBST缓冲液，100μl/孔)在37℃下孵育40分钟，再洗板4次，并用链霉亲和素结合的辣根过氧化物酶(SA-HRP，1:10000稀释于PBST缓冲液，Jackson Immuno Research，cat#016-030-084，100μl/孔)于37℃孵育40分钟。终洗后，用100μl/孔ELISA底物TMB(Innoreagents，cat#TMB-S-002)孵育平板。15分钟后用50μl/孔1M H₂SO₄在25℃下终止反应，并测定450nm处的吸收值，测定结果见图1、图2和表2。

图1和图2结果表明，本发明的抗体1H4对人和食蟹猴CD47蛋白都具有较好的结合能力。

3.2用FACS测定抗CD47单克隆抗体与表面过表达人CD47的293F细胞的结合活性

从细胞培养瓶中收集表面过表达人CD47的稳定293F细胞系，洗两次，并在含有2％v/v胎牛血清的PBS磷酸盐缓冲液(FACS缓冲液)中重悬。96孔板中每孔加入2×l0⁵个细胞，与含不同浓度CD47抗体的FACS缓冲液置于冰上孵育40分钟。用FACS缓冲液洗细胞3次，并继续添加100μL/孔的R-藻红蛋白亲和纯化F(ab')₂片段特异的山羊抗小鼠IgG(1:1000稀释于FACS缓冲液，Jackson Immunoresearch，cat#115-116-072)。4℃避光孵育40分钟后，洗细胞3次，然后用FACS缓冲液重悬。使用Becton Dickinson FACS Canto II-HTS设备进行荧光测量。使用Graphpad Prism软件分析数据，得出抗体结合细胞的EC₅₀浓度值，即CD47抗体与过表达CD47的细胞达到最大荧光结合信号50％时对应的抗体浓度值，测定结果见图3和表2。

图3结果表明，本发明的抗体1H4与表面过表达人CD47的293F细胞的结合能力更强。

表2.小鼠抗CD47抗体的结合活性

实施例4小鼠抗CD47单克隆抗体对CD47-SIRPα相互作用的竞争性功能阻断能力

采用竞争ELISA检测抗体对CD47-SIRPα相互作用的阻断能力。

4.1配体阻断ELISA

使用竞争ELISA检测本发明的抗CD47抗体阻断CD47-SIRPα相互作用的能力。简单地说，用人SIRPα-his蛋白(Sino biological inc.，cat#11612-H08H)以200ng/孔添加于96孔微孔板，并于4℃孵育过夜。第二天，用清洗缓冲液(PBS+0.05％Tween-20，PBST)清洗平板，再用含5％w/v脱脂奶粉的PBST在37℃下封闭2小时。然后用清洗缓冲液清洗平板。

用生物素标记的人CD47(ACRO biosystems，cat#CD7-H5227)溶液稀释CD47抗体或参照抗体(抗体从66.7nM开始，连续4倍稀释)，室温孵育40分钟，然后将抗体/CD47-生物素混合物加入至SIRPα包覆的平板。于37℃孵育40分钟后，用清洗缓冲液洗板4次。然后加入SA-HRP，于37℃孵育40分钟，检测生物素标记的人CD47与底板SIRPα的结合。再用清洗缓冲液洗板。最后，加入TMB，用1M H₂SO₄终止反应，用酶标仪测定450nm处的吸收值。使用Graphpad Prism软件对数据进行分析，得出IC₅₀值，具体结果见图4和表3。

4.2参照抗体阻断ELISA

本发明的抗CD47抗体阻断参照抗体(Hu5F9-G4，Forty Seven)与人CD47蛋白结合的能力，采用竞争ELISA法测定。简单地说，用含1μg/mL的CD47参照抗体的PBS包被96孔微孔板，并于4℃孵育过夜。第二天，用清洗缓冲液清洗平板，用含5％脱脂奶粉的PBST在37℃下封闭2小时。阻断时，将生物素标记的人CD47(ACRO biosystems，cat#CD7-H5227)(10nM，含2.5％脱脂奶粉的PBST)与抗体混合(1.2pM-100nM，连续5倍稀释)，然后在25℃下孵育40分钟。洗板后，将抗体/人CD47混合物(100μl/孔)加入至含Hu5F9-G4的平板，37℃孵育40分钟。用清洗缓冲液再次洗板，加入100μl/孔的SA-HRP，然后37℃孵育40分钟，检测结合于平板的生物素标记的人CD47。用清洗缓冲液进行终洗。加入TMB，用1M H₂SO₄终止反应，测定450nm处的吸收值。使用Graphpad Prism软件对数据进行分析，得出IC₅₀值，具体结果见图5和表3。

由表3可以看出，本发明的抗体能够阻断人CD47-SIRPα相互作用，同时表明本发明的抗体具有与参照抗体相似的抗原结合表位。与参照抗体相比，本发明的抗体1H4具有较好的CD47-SIRPα阻断活性。

表3.抗CD47抗体阻断CD47-SIRPα和CD47参照抗体相互作用的能力

实施例5小鼠抗CD47单克隆抗体诱导巨噬细胞吞噬肿瘤细胞

采用体外细胞实验检测抗CD47抗体诱导巨噬细胞吞噬肿瘤细胞的生物活性。采用Ficoll(GE Healthcare，cat#17-1440-02)从人新鲜血液中提取人外周血单核细胞(PBMC)。为了将PBMC分化为单核来源的巨噬细胞(monocyte-derived macrophages，MDM)，单核细胞在人M-CSF存在下接种RPMI 1640+10％FBS+1％青霉素-链霉素(Peprotech，cat#300-25-100)。在第2天和第4天，清洗细胞，更换新鲜的含细胞因子的培养基。第6天，分离贴壁细胞，用PBS洗2次。

从板上分离MDMs，置于96孔板中过夜。收集Jurkat细胞并用CFSE(5(6)-羧基荧光素N-羟基琥珀酰亚胺酯)(Sigma，cat#87444)标记。将抗CD47单抗进行稀释。向MDM中加入100uL用CFSE标记的Jurkat肿瘤细胞和稀释后的CD47单抗混合物，37℃孵育4h。分离所有细胞，再用FACS缓冲液清洗一次。用抗人CD14 APC(eBioscience，cat#17-0149-42)进行细胞染色，用流式细胞仪(FACS)检测CD14+CFSE+细胞。使用Graphpad Prism软件分析数据(CD14+CFSE+细胞占CD14+细胞的百分比)，得到EC₅₀值和吞噬百分比，测定结果分别见表4和图6A-6B。

表4和图6A-6B结果显示，本发明的抗体能够诱导巨噬细胞吞噬肿瘤细胞，其EC₅₀值低于两个参照抗体，显示出比参照抗体更强的促肿瘤细胞吞噬作用。

表4.抗CD47抗体诱导巨噬细胞吞噬肿瘤细胞的能力

实施例6DNA克隆及测序，抗CD47抗体的序列分析

使用Trizol试剂(Invitrogen，cat#15596-018)从实施例1的杂交瘤细胞中提取总RNA。

过程简述如下，离心收集5×10⁶的细胞到1.5ml离心管中，移除上清液。添加1ml的Trizol试剂并反复吹打数次后于25℃放置5分钟用于裂解细胞。随后，每管加入0.2ml的氯仿溶液，剧烈震荡15秒后室温放置3分钟。4℃离心管12000g离心10分钟，取出离心管，吸取上层水相溶液到新的1.5ml离心管中，再加入0.4ml的异丙醇用于从水相中沉淀RNA。手动混匀EP管并放置25℃下10分钟后，4℃12000g离心10分钟，弃上清。加入1ml 75％的乙醇，再次4℃7500rpm离心5分钟，弃上清。管底RNA沉淀，于室温干燥10分钟后，加入30到50ul的无菌DEPC处理水溶解RNA样品。

紧接着，选用Taraka的逆转录cDNA试剂盒(cat#6110A)把总RNA变为cDNA。实验体系配制如下：5μl的总RNA+0.5μl Oligo(dT)+8.5μl RNase-free水(共14μl)先置于65℃5分钟预变性，而后放冰上2分钟。进一步加入4μl的5×缓冲液+1μl的dNTP混合物+0.5μl的RNase抑制剂+1μl逆转录酶(总共20.5μl体系)，混匀，于40℃孵育50分钟，然后70℃孵育10分钟，完成cDNA合成。cDNA进一步在3’端加poly-G，反应体系配制如下：5μl的cDNA样品+33.5μl的ddH₂O+5μl的10×TdT缓冲液+5μl的CoCl₂+1μl的dGTP+0.5μl的末端脱氧核苷酸转移酶(总体积50ul)，于37℃孵育30分钟，然后70℃孵育10分钟，完成poly-G加尾。

进一步，以加尾的cDNA为模板进行抗体可变区的基因扩增。对于扩增抗体重链可变区序列，配制PCR反应体系：10×Taq酶缓冲液5μl+通用poly C引物(正向引物)0.5μl+小鼠IgG1反向引物0.5μl+dNTP 1μl+Taq聚合酶1μl+cDNA 1μl+ddH₂O 41μl。对于扩增抗体轻链可变区序列，配制PCR反应体系：10×Taq酶缓冲液5μl+通用poly C引物(正向引物)0.5μl+小鼠IgG kappa链反向引物0.5μl+dNTP 1μl+Taq聚合酶1μl+cDNA 1μl+ddH₂O 41μl。抗体重链和轻链可变区PCR扩增的温度循环如下(其中步骤2到4，重复25个循环)：

1)预变性95℃，5分钟；

2)变性95℃，20秒；

3)退火56℃，20秒；

4)延伸72℃，30秒；

5)保存25℃，60分钟。

PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳分析，切出对应大小的DNA区段条带(VH约600bp，VK约500bp)，用QIAquick的凝胶DNA回收试剂盒(cat#28704)进行DNA的抽提。简述如下：凝胶称重，加3倍凝胶体积的QG缓冲液，而后50℃孵育10分钟直到凝胶完全溶解。加入1倍胶体积的异丙醇混匀后，样品移至QIA纯化柱，13000rpm离心1分钟。加入750μl的PE缓冲液到柱中，而后13000rpm离心1分钟。并再次13000rpm离心去除柱中液体残留。加入30μl水13000rpm离心1分钟进行洗脱，获得制备的DNA样品，纯化的PCR产物经测序获得抗体的可变区序列。

本发明克隆的序列信息见表5-表7。

表5.抗CD47抗体的序列信息

NA:核苷酸；AA:氨基酸。

表6.抗CD47抗体的氨基酸序列

表7.抗CD47抗体的核苷酸序列

Claims (10)

1.一种具有CD47结合活性的单克隆抗体，其特征在于，所述抗体包含重链可变区和轻链可变区；

所述重链可变区包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，所述轻链可变区包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；

所述的CDR-H1的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示；

所述的CDR-H2的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示；

所述的CDR-H3的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示；

所述的CDR-L1的氨基酸序列如SEQ ID NO：12所示；

所述的CDR-L2的氨基酸序列如SEQ ID NO：14所示；

所述的CDR-L3的氨基酸序列如SEQ ID NO：16所示。

2.根据权利要求1所述的具有CD47结合活性的单克隆抗体，其特征在于，重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示；轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：18所示。

3.根据权利要求1所述的具有CD47结合活性的单克隆抗体，其特征在于，重链氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示；轻链氨基酸序列如SEQ ID NO：20所示。

4.一种核苷酸分子，其特征在于，所述核苷酸分子编码如权利要求1～3中任一项所述的单克隆抗体。

5.根据权利要求4所述的核苷酸分子，其特征在于，所述核苷酸分子的序列选自SEQ IDNO：7和SEQ ID NO：17；

序列SEQ ID NO：7编码所述的抗体的重链可变区；

序列SEQ ID NO：17编码所述的抗体的轻链可变区。

6.一种表达载体，其特征在于，该表达载体含有如权利要求4或5所述的核苷酸分子。

7.一种宿主细胞，其特征在于，该宿主细胞含有如权利要求6所述的表达载体。

8.如权利要求1～3中任一项所述具有CD47结合活性的单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包含如下步骤：

制备含有表达如权利要求1～3任一项所述单克隆抗体的核苷酸分子的表达载体；

将得到的表达载体转染真核宿主细胞并培养；

分离纯化，获得具有CD47结合活性的单克隆抗体。

9.包括如权利要求1～3中任一项所述的单克隆抗体的抗体免疫偶联缀合物、双特异性分子、嵌和抗原受体或药物组合物。

10.如权利要求1～3中任一项所述的单克隆抗体在制备抗肿瘤药物或纤维化疾病的药物中的应用。

Images