KR102536145B1 - 항-pd-1 항체 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

항-PD-1 항체 또는 이의 단편이 제공된다. 다양한 실시예에서, 항체 또는 이의 단편은 중쇄 상보성 결정 영역 HCDR1(서열번호 1, 7 또는 13), HCDR2(서열번호 : 2, 8 또는 14) 및 HCDR3(서열번호 3, 9 또는 15)을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 상보성 결정 영역 LCDR1(서열번호 4, 10 또는 16), LCDR2(서열번호 5, 11 또는 17) 및 LCDR3(서열번호 6, 12 또는 18)을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 암, 감염 또는 면역 질환과 같은 질병을 치료 및 진단하기 위한 항체 또는 그 단편을 사용하는 방법은 또한 제공된다.

Description

항-PD-1 항체 및 이의 용도{ANTI-PD-1 ANTIBODIES AND USES THEREOF}
세포예정사 1(programmed cell death 1, PD-1)의 cDNA는 1992년에 마우스 T 세포 하이브리도마 및 세포예정사를 겪는 중인 조혈전구세포주로부터 분리되었다. 유전적 절제 연구는 PD-1의 결핍이 다양한 마우스 계통에서 상이한 자가 면역 표현형을 초래한다는 것을 보여 주었다. 형질전환 T 세포 수용체(TCRs)를 가진 PD-1 결핍 동종이계 T 세포는 동종 항원에 대한 증강된 반응을 나타내며, 이는 T 세포상의 PD-1이 항원에 대한 반응에서 부정적인 조절 역할을 한다는 것을 나타낸다.
여러 연구는 PD-1과 상호 작용하는 분자의 발견에 기여했다. 1999년에, B7 동족체(B7-H1, 또한 세포예정사-리간드 1[PD-L1]로도 불림)는 B7 패밀리 분자와의 동일성을 기반으로 분자적 클로닝 및 인간 발현 서열 태그 데이터베이스 검색을 사용하여 PD-1과 독립적으로 동정되었고, 이것은 B7-H1이 시험관 내에서 인간 T 세포 반응의 억제제로서 작용하는 것을 나타냈다. Freeman, Wood 및 Honjo의 실험실에서 B7-H1(이하 PD-L1이라고 함)이 PD-1의 결합 및 기능적 파트너라는 것을 보여준지 1년 후 두 독립적인 연구가 합병되었다. 다음으로, PD-L1-결핍 마우스(PD-L1 KO 마우스)는 자가면역질환을 유도하기 쉽다는 것이 밝혀졌지만, 이 마우스는 자발적으로 그러한 질병을 발병하지 않았다. PD-L1/PD-1 상호작용이 생체 내, 특히 종양 미세 환경에서의 T 세포 반응의 억제에서 중요한 역할을 한다는 것이 나중에 밝혀졌다.
즉각적인 초기 연구는 종양 관련 PD-L1이 활성화된 T 세포의 세포예정사를 촉진하고(Dong H. et al. Tumor-associated B7-H1 promotes T-cell apoptosis: a potential mechanism of immune evasion. Nature medicine. 2002;8(8):793-800) 또한 면역 억제를 중재하기 위해 인간 말초 혈액 T 세포에서 IL-10 생성을 자극한다는 것을 보여줬다(Dong H, et al., B7-H1, a third member of the B7 family, co-stimulates T-cell proliferation and interleukin-10 secretion. Nature medicine. 1999;5(12):1365-9). 현재는 면역 억제에 대한 PD-L1의 효과가 훨씬 더 복잡하다는 것이 현재 알려졌다. T 세포 세포예정사 및 IL-10 유도뿐만 아니라, PD-L1은 또한 다양한 기작을 통해 T 세포 기능 장애를 유도할 수 있다. 또한 PD 경로는 T 세포 아네르기를 시험관 내 및 생체 내에서 촉진시키는 것으로 나타났다.
최근 FDA는 Bristol-Myers Squibb(Opdivo, nivolumab, MDX-1106, BMS-936558, ONO-4538) 및 Merck(Keytruda, pembrolizumab, lambrolizumab, MK-3475)로 부터의 2 개의 다른 인간 암 치료용 PD-1 mAb를 승인했다. 또한 수천 명의 환자를 대상으로 한 수백 건의 임상 시험에서 PD-1 또는 PD-L1에 대한 여러 mAb가 활발히 개발되고 있다. 지금까지 항 PD 치료법은 진행성 및 전이성 종양의 퇴행을 유도하고 생존율을 향상시킴으로써 상당한 임상 효과를 만들었다. 더욱 중요한 것은 항 PD 치료법이 지속성이 있는 효과, 내독성을 지니며, 특히 고형 종양에서 광범위한 암 유형에 적용 가능하다는 것을 보여준다. 이러한 임상 결과는 PD 경로 차단의 원리를 검증하고 항 PD 약물 치료를 개인별 또는 종양 유형별 치료와는 다른 독특한 범주에 추가하였다. 다른 암 치료법과의 명확하고 중첩되지 않는 메커니즘으로 인해, 항 PD 치료는 치료 효능을 더욱 증폭시키는 시도에서 거의 모든 암 치료방법과 병용하고 있다. 암 백신, 동시자극 및 동시억제 항체 및 적응 세포 치료와 같은 다양한 암 면역 요법과의 병용 외에도 항 PD 치료와 화학 요법, 방사선 요법 및 표적 치료를 병용하기 위한 다양한 임상시험이 시작되었다.
항-PD 치료는 특히 고형 종양에서, 인간 암에 대한 면역 요법에서 주요 위치를 차지했다. 이 치료는 전신 면역 반응을 향상시키거나 암에 대한 신생 면역을 생성하는 것을 주된 목적으로 하는 이전의 면역 치료제와는 다르다; 대신에, 항 PD 치료는 종양 부위에서 면역 반응을 조절하고, 종양에 의해 유발된 면역 결함을 표적으로 하며, 진행중인 면역 반응을 회복시킨다. 다양한 인간 암 치료를 위한 항 PD 치료법의 임상적 성공이 이 접근법을 검증하였지만, 우리는 암 면역 요법에서 임상적으로 적용 가능한 새로운 접근법을 발견하고 설계하는데 도움이 되는 이 경로와 관련 면역 반응을 여전히 연구하고 있다.
본 발명은 PD-1 단백질에 우수한 결합 및 억제 활성을 나타내는 항 PD-1 항체를 제공한다. 시험된 것들 중 하나는 조절력이 입증된 두 개의 PD-1 항체 제품보다 강한 결합 활성을 나타냈다.
따라서, 본 발명의 일 구현예에 따라, 인간 세포예정사 단백질 1(PD-1)에 대한 특이성을 갖는 분리된 항체 또는 그 단편이 제공되며, 상기 항체 및 그 단편은 중쇄 상보성 결정 영역 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 상보성 결정 영역 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고, 상기 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3은 (a) HCDR1: GFTFSSYT(서열번호 1), HCDR2: ISHGGGDT(서열번호 2), HCDR3: ARHSGYERGYYYVMDY(서열번호 3), LCDR1: ESVDYYGFSF(서열번호 4), LCDR2: AAS(서열번호 5), LCDR3: QQSKEVPW(서열번호 6); (b) HCDR1: GYTFTSYT(서열번호 7), HCDR2: INPTTGYT(서열번호 8), HCDR3: ARDDAYYSGY(서열번호 9), LCDR1: ENIYSNL(서열번호 10), LCDR2: AAK(서열번호 11), LCDR3: QHFWGTPWT(서열번호 12); 및 (c) HCDR1: GFAFSSYD(서열번호 13), HCDR2: ITIGGGTT(서열번호 14), HCDR3: ARHRYDYFAMDN(서열번호 15), LCDR1: ENVDNYGINF(서열번호 16), LCDR2: VSS(서열번호 17), LCDR3: QQSKDVPW(서열번호 18)로 구성되는 군으로부터 선택된다.
일 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 그 단편은 중쇄 불변 영역, 경쇄 불변 영역, Fc 영역, 또는 이들의 조합을 더 포함한다. 일 구현예에서, 경쇄 불변 영역은 카파 또는 람다 사슬 불변 영역이다.
일 구현예에서, 항체 또는 그 단편은 IgG, IgM, IgA, IgE 또는 IgD의 이소타입일 수 있다. 일 구현예에서, 이소타입은 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4이다. 일 구현예에서, 항체 또는 그 단편은 키메라 항체, 인간화 항체 또는 완전 인간 항체이다.
일 구현예에서, 항체 또는 이의 단편은 서열번호 35, 서열번호 37, 서열번호 39의 아미노산 서열, 또는 서열번호 35, 서열번호 37 또는 서열번호 39와 적어도 95 %의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일 구현예에서, 항체 또는 이의 단편은 서열번호 41, 서열번호 43, 서열번호 45의 아미노산 서열, 또는 서열번호 41, 서열번호 43 또는 서열번호 45와 적어도 95 %의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 중쇄 상보성 결정 영역 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 상보성 결정 영역 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하며, 상기 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3은 다음으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 인간 세포예정사 단백질 1(PD-1)에 특이성을 갖는 분리된 항체 또는 그 단편을 제공한다 : (a) HCDR1: GFTFSSYT(서열번호 1), HCDR2: ISHGGGDT(서열번호 2), HCDR3: ARHSGYERGYYYVMDY(서열번호 3), LCDR1: ESVDYYGFSF(서열번호 4), LCDR2: AAS(서열번호 5), LCDR3: QQSKEVPW(서열번호 6); (b) HCDR1: GYTFTSYT(서열번호 7), HCDR2: INPTTGYT(서열번호 8), HCDR3: ARDDAYYSGY(서열번호 9), LCDR1: ENIYSNL(서열번호 10), LCDR2: AAK(서열번호 11), LCDR3: QHFWGTPWT(서열번호 12); (c) HCDR1: GFAFSSYD(서열번호 13), HCDR2: ITIGGGTT(서열번호 14), HCDR3: ARHRYDYFAMDN(서열번호 15), LCDR1: ENVDNYGINF(서열번호 16), LCDR2: VSS(서열번호 17), LCDR3: QQSKDVPW(서열번호 18); 및 (d) HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3은 (a) 내지 (c)에 나타낸 바와 같으나 그 중 적어도 하나는 1 개, 2 개 또는 3 개의 아미노산 부가, 결실, 보존적 아미노산 치환 또는 이들의 조합을 포함함.
일 구현예에서, HCDR1, HCDR2, HCDR3 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3은 (a) - (c) 중 어느 하나에 도시된 바와 같지만, 그 중 하나는 보존적 아미노산 치환을 포함한다. 일 구현예에서, HCDR1, HCDR2, HCDR3 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3은 (a) - (c) 중 어느 하나에 도시된 바와 같지만, 그 중 2 개는 보존적 아미노산 치환을 포함한다. 일 구현예에서, HCDR1, HCDR2, HCDR3 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3은 (a) - (c) 중 어느 하나에 도시된 바와 같지만, 그 중 3 개는 보존적 아미노산 치환을 포함한다.
또한, 일 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 그 단편 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물이 제공된다. 또한, 일 구현예에서, 항체 또는 그의 단편을 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 분리된 세포가 제공된다.
또한 용도 및 방법이 제공된다. 일 구현예에서, 암 치료를 위한 의약의 제조를 위한 본 발명의 항체 또는 그 단편의 용도가 제공된다. 암은 방광암, 간암, 결장암, 직장암, 자궁내막암, 백혈병, 림프종, 췌장암, 소세포 폐암, 비소세포 폐암, 유방암, 요도암, 두경부암, 위장암, 위암, 식도암, 난소암, 신장암, 흑색종, 전립선암 및 갑상선암으로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있다. 또한 본 발명의 항체 또는 그 단편을 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 이를 필요로 하는 환자에서 암을 치료하는 방법이 제공된다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 항체 또는 그 단편으로 세포를 처리하는 단계; 및 (b) 처리된 세포를 환자에게 투여하는 단계;를 포함하는 이를 필요로 하는 환자에서 암 또는 감염을 치료하는 방법을 제공한다. 일 구현예에서, 세포는 T 세포이다.
또 다른 구현예에서, 감염의 치료를 위한 의약의 제조를 위한, 본 발명의 어느 하나의 항체 또는 그 단편의 용도가 제공된다. 일 구현예에서, 감염은 바이러스 감염, 세균 감염, 진균 감염 또는 기생충에 의한 감염이다.
또 다른 구현예에서, 면역질환 치료를 위한 의약의 제조를 위한, 본 발명의 항체 또는 그 단편의 용도가 제공된다. 일 구현예에서, 상기 면역질환은 감염, 감염과 관련된 내독소 쇼크, 관절염, 류마티스성 관절염, 천식, COPD, 골반 염증성 질환, 알츠하이머병, 염증성 장질환, 크론병, 궤양성 대장염, 페이로니병(Peyronie's Disease), 만성 소화장애증, 담석증, 모소의 질병, 복막염, 건선, 혈관염, 수술 유착, 뇌졸중, I 형 당뇨병, 라임병, 관절염, 뇌수막염, 자가 면역 포도막염, 중추 및 말초 신경계의 면역 매개 염증 장애, 다발성 경화증, 루푸스 및 길랑-바르 증후군, 아토피성 피부염, 자가 면역 간염, 섬유성 폐렴, 그레이브병, IgA 신장병증, 특발성 혈소판 감소 자반증, 메니에르병, 천포창, 원발성 담즙성 경변증, 사르코이드종, 피부경화증, 베게너 육아종증, 췌장염, 정신적 외상, 이식 편대 숙주 질환, 이식 거부반응, 허혈성 질환, 심근경색, 죽상동맥경화증, 혈관 내 응고, 골 흡수, 골다공증, 골관절염, 치주염, 위산저하증 및 태아-모성 내성 결여와 관련된 불임으로 구성되는 군으로부터 선택된다.
도 1은 5 개의 hPD-1 mAb 이소타입이 모두 hPD-1에 높은 특이성으로 결합할 수 있음을 나타낸다.
도 2는 항-hPD-1이 hB7-1, hPD-L1, hB7-H3, hB7-H4 및 hCD137과 결합하지 않음을 나타낸다.
도 3은 hPD-1 단일클론항체는 mPD-1에 대한 교차 결합을 나타내지 않고 인간 및 게잡이 원숭이 세포 PD-1 단백질 모두에 결합할 수 있음을 나타낸다.
도 4는 hPD-1 단일클론항체가 투여량에 의존적으로 hPD-L1에 대한 hPD-1의 결합에 대한 차단 효과를 가질 수 있음을 나타낸다.
도 5는 경쟁-결합 환경에서 관찰된 hPD-1 mAb의 폐색 및 차단 효과를 나타낸다.
도 6은 RACE 생성물을 확인하는 겔 전기영동 분석의 결과를 나타낸다.
도 7은 PD-1에 결합하는 재조합 DNA 항체의 능력(A), 및 이의 hPD-L1에 대한 hPD-1의 결합에 대한 차단 효과(B)를 나타낸다.
도 8은 9 개의 인간화 항체가 모항체보다 높거나 낮은 것을 포함하여 PD-1에 대해 다양한 결합 친화도를 보여준다는 것을 나타낸다.
도 9는 인간화 항체가 hPD-L1에 대한 hPD-1의 결합 능력에 대한 차단 효과를 가질 수 있음을 나타낸다.
도 10은 인간화 항체가 hPD-L2에 대한 hPD-1의 결합 능력에 대한 차단 효과를 가질 수 있음을 나타낸다.
도 11은 인간화 mAb가 시험관 내에서 암세포에 대한 allo CD8+CTL 세포의 세포독성을 증가시킨다는 것을 나타낸다.
도 12는 항-hPD-1 항체에 대한 MLR의 증식 반응을 나타낸다.
도 13은 MLR 배양 상등액에서 IL-2 및 IFNγ 발현 프로파일을 나타낸다.
도 14는 림프구에서 PD-L1의 발현이 PD-1 mAb에 의해 억제되었음을 나타낸다.
도 15는 인간화 PD-1 항체의 생체 내 항종양 활성을 나타낸다.
도 16은 항체 결합 친화도 및 반응속도의 비교를 나타낸다.
도 17은 PD-1/PD-L1 차단에서 PD-1 항체의 비교를 나타낸다.
도 18은 시험관 내에서 암세포에 대한 allo CD8+CTL 세포의 세포 독성을 증가시키기 위한 mAb의 비교를 나타낸다.
도 19는 hPD-1 또는 mPD-1에 대한 시험 물질의 결합(ELISA 분석)을 나타낸다.
도 20은 유세포 분석을 사용한 hPD-1- 또는 cPD-1-발현 CHOK1 세포에 대한 시험 물질의 결합을 나타낸다.
도 21은 hPD-L1-발현 CHOK1 세포에 결합하는 hPD-L1(좌측) 및 hPD-L2(우측)에서의 시험 물질의 차단 활성을 나타낸다.
도 22는 인간 MLR 분석에서 IL-2(좌측) 및 IFN-γ(우측) 농도를 나타낸다.
도 23은 조작된 종양 및 T 세포 동시 배양 분석에서의 IFN-γ 농도를 나타낸다.
도 24는 ELISA 결과에 의한 에피토프 결합(상부 패널) 및 다른 시험 물질의 에피토프 겹침에 대한 개략도(하부 패널)를 나타낸다.
도 25는 낮은 고정화 농도(60 RU, 좌측 패널) 및 높은 고정화 농도(960RU, 우측)에서 재조합 hPD-1에 대한 Nivolumab(상부 패널) 또는 TY101-04-T3-05(하부 패널)의 결합을 나타낸다.
정의
용어 "하나의(a)", "하나의(an)" 자체는 그 자체 중 하나 이상을 지칭한다는 점에 유의해야한다; 예를 들어, "항체"는 하나 이상의 항체를 나타내는 것으로 이해된다. 이와 같이, “하나의(a)”(또는 “하나의(an)”), “하나 이상” 및 “적어도 하나”는 여기서 상호교환적으로 사용될 수 있다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, 용어 “폴리펩티드”는 단일 “폴리펩티드” 또는 복수의 “폴리펩티드”를 포함하는 것으로 의도되고, 아미드 결합(펩티드 결합으로도 알려짐)에 의해 선형으로 연결된 단량체(아미노산)로 구성된 분자를 지칭한다. 용어 “폴리펩티드”는 2 이상의 아미노산의 임의의 사슬 또는 사슬들을 지칭하며, 생성물의 특정 길이를 지칭하지 않는다. 따라서, 펩티드, 디펩티드, 트리펩티드, 올리고펩티드, “단백질”, “아미노산 사슬”, 또는 2 이상의 아미노산의 임의의 사슬 또는 사슬들을 지칭하는데 사용되는 용어는 “폴리펩티드”의 정의에 포함되고, 용어 “폴리펩티드”는 상기 용어 대신에 또는 상호교환적으로 사용될 수 있다. 용어 “폴리펩티드”는 또한 보호/차단기, 단백질 분해 절단, 비-천연 발생 아미노산에 의한 변형으로 알려진 당화, 아세틸화, 인산화, 아미드화, 유도체화를 제한없이 포함하는 폴리펩티드의 후-발현 변형의 산물을 지칭하는 것으로 의도된다. 폴리펩티드는 천연 생물학적 원천으로부터 유래되거나 재조합 기술에 의해 생산될 수 있지만, 반드시 지정된 핵산 서열로부터 번역될 필요는 없다. 이는 화학적 합성을 포함하는 임의의 방식으로 생성될 수 있다.
본 발명에서 세포, DNA 또는 RNA와 같은 핵산과 관련하여 사용된 “분리된”은 거대분자의 천연 자원에 존재하는 다른 DNA 또는 RNA로부터 각각 분리된 분자를 지칭한다. 또한 본 발명에서 사용된 용어 “분리된”은 재조합 DNA 기술에 의해 제조될 때 세포 물질, 바이러스 물질, 또는 배양 배지 또는 화학적으로 합성될 때 화학적 전구체 또는 다른 화학물질을 실질적으로 함유하지 않는 핵산 또는 펩티드를 지칭한다. 또한 “분리된 핵산”은 단편으로서 자연적으로 발생되지 않고 자연 상태에서 발견되지 않는 핵산 단편을 포함하는 것을 의미한다. 또한 용어 “분리된”은 다른 세포 단백질 또는 조직으로부터 분리된 세포 또는 폴리펩티드를 지칭하기 위해 사용된다. 분리된 폴리펩티드는 정제된 폴리펩티드 및 재조합 폴리펩티드를 모두 포함한다.
본 발명에서 사용된, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드와 관련된 용어 “재조합”은 자연적으로 존재하지 않는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드의 형태를 의미하며, 이의 비-제한적 예는 일반적으로 함께 발생하지 않는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 조합함으로써 생성될 수 있다.
"상동성" 또는 "동일성" 또는 "유사성"은 두 펩타이드 사이 또는 두 핵산 분자 사이의 서열 유사성을 지칭한다. 상동성은 비교를 위해 정렬될 수 있는 각 서열 내의 위치를 비교함으로써 결정될 수 있다. 비교된 서열의 위치가 동일한 염기 또는 아미노산에 의해 점유될 때, 분자는 그 위치에서 상동이다. 서열 간의 상동성 정도는 서열에 의해 공유되는 일치 또는 상동성 위치의 수의 함수이다. "비관련" 또는 "비-상동" 서열은 본 발명의 서열 중 하나와 40 % 미만의 동일성, 바람직하게는 25 % 미만의 동일성을 공유한다.
폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 영역(또는 폴리펩티드 또는 폴리 펩타이드 영역)은 다른 서열에 대한 "서열 동일성"의 특정 비율(예 : 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % 또는 99 %)을 가지며, 정렬 시 그 퍼센트의 염기(또는 아미노산)가 두 서열을 비교할 때 동일하다는 것을 의미한다. 이러한 정렬 및 퍼센트 상동성 또는 서열 동일성은 당업계에 공지된 소프트웨어 프로그램, 예를 들어, Ausubelet al. eds.(2007)에서 분자생물학의 최신 프로토콜을 사용하여 결정될 수 있다. 바람직하게는, 기본 매개 변수는 정렬을 위해 사용된다. 하나의 정렬 프로그램은 기본 매개 변수를 사용하는 BLAST이다. 특히 BLASTN 및 BLASTP 프로그램은 다음 기본 매개 변수를 사용한다: 유전자 코드 = 표준; 필터 = 없음; 가닥 = 둘 다; 컷오프 = 60; 기대 = 10; 매트릭스 = BLOSUM62; 설명 = 50 시퀀스; 정렬 기준 = HIGH SCORE; 데이터베이스 = 비 중복, GenBank + EMBL + DDBJ + PDB + GenBank CDS 번역 + SwissProtein + SPupdate + PIR. 생물학적으로 동등한 폴리뉴클레오티드는 위에서-언급된 특정 퍼센트 상동성을 갖고, 동일하거나 유사한 생물학적 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 것들이다.
용어 "동등한 핵산 또는 폴리뉴클레오티드"는 핵산 또는 이의 상보물의 뉴클레오티드 서열과 일정 정도의 상동성 또는 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산을 의미한다. 이중 가닥 핵산의 상동은 그 상보물과의 일정 정도의 상동성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산을 포함하도록 의도된다. 일 측면에서, 핵산의 상동은 핵산 또는 그 상보물에 혼성화할 수 있다. 마찬가지로, “동등한 폴리펩티드”는 기준 폴리펩티드의 아미노산 서열과 일정 정도의 상동성 또는 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 지칭한다. 일 측면에서, 서열 동일성은 적어도 약 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % 또는 99 %이다. 일 측면에서, 동등한 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드는 기준 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드와 비교하여 1, 2, 3, 4 또는 5 개의 부가, 결실, 치환 및 이의 조합을 갖는다. 일 측면에서, 동등한 서열은 참조 서열의 활성(예를 들어, 에피토프-결합) 또는 구조(예를 들어, 염-다리)를 보유한다.
혼성화 반응은 상이한 "엄격성" 조건하에서 수행될 수 있다. 일반적으로, 약 10 x SSC 또는 동등한 이온 세기/온도의 용액에서 약 40 ℃에서 저 엄격성 혼성화 반응이 수행된다. 중간 정도의 엄격성 혼성화는 전형적으로 약 6 x SSC에서 약 50 ℃에서 수행되고, 고 엄격성 혼성화 반응은 약 1 x SSC에서 약 60 ℃에서 일반적으로 수행된다. 혼성화 반응은 또한 당업자에게 공지된 "생리학적 조건" 하에서 수행될 수 있다. 생리학적 조건의 비제한적 예는 온도, 이온 세기, pH 및 세포에서 통상 발견되는 Mg2+의 농도이다.
폴리뉴클레오티드는 4 개의 뉴클레오티드 염기의 특정 서열로 구성된다: 아데닌(A); 시토신(C); 구아닌(G); 티민(T); 및 폴리뉴클레오티드가 RNA일 때 티민에 대한 우라실(U)을 포함한다. 따라서, 용어 "폴리뉴클레오티드 서열"은 폴리뉴클레오티드 분자의 알파벳순 표현이다. 이 알파벳 표현은 중앙 처리 장치가 있는 컴퓨터의 데이터베이스에 입력될 수 있으며 기능 유전체학 및 상동성 검색과 같은 생물정보학 응용 프로그램에 사용된다. 용어 "다형성"은 하나 이상의 형태의 유전자 또는 그의 일부가 공존하는 것을 의미한다. 적어도 2 개 이상의 상이한 형태, 즉, 2 개의 상이한 뉴클레오티드 서열이 존재하는 유전자의 부분은 "유전자의 다형성 영역"으로 지칭된다. 다형성 영역은 단일 뉴클레오티드일 수 있으며, 그 대립 유전자는 상이한 대립 형질에서 상이하다.
용어 "폴리뉴클레오티드" 및 "올리고뉴클레오티드"는 상호교환적으로 사용되며, 임의 길이의 뉴클레오티드의 중합체 형태, 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 또는 그의 유사체를 지칭한다. 폴리뉴클레오티드는 임의의 3 차원 구조를 가질 수 있고 공지되거나 알려지지 않은 임의의 기능을 수행할 수 있다. 다음은 폴리뉴클레오티드의 비제한적 예이다: 유전자 또는 유전자 단편(예를 들어, 프로브, 프라이머, EST 또는 SAGE 태그), 엑손, 인트론, 메신저 RNA(mRNA), 트랜스퍼 RNA, 리보솜 RNA, 리보자임, cDNA, dsRNA, siRNA, miRNA, 재조합 폴리뉴클레오티드, 가지가 있는 폴리뉴클레오티드, 플라스미드, 벡터, 임의의 서열의 분리된 DNA, 임의의 서열의 분리된 RNA, 핵산 프로브 및 프라이머. 폴리뉴클레오티드는 메틸화 뉴클레오티드 및 뉴클레오티드 유사체와 같은 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 존재한다면, 뉴클레오티드 구조에 대한 변형은 폴리뉴클레오티드의 조립 전 또는 후에 부여될 수 있다. 뉴클레오티드의 서열은 비 뉴클레오티드 성분에 의해 차단될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 표지 성분과의 접합에 의해 중합 후 더 변형될 수 있다. 상기 용어는 또한 이중 가닥 및 단일 가닥 분자 모두를 지칭한다. 다르게 특정되거나 요구되지 않는 한, 폴리뉴클레오티드인 본 발명의 임의의 구현예는 이중 가닥 형태를 이루는 것으로 예측되거나 알려진 이중 가닥 형태 및 두 개의 상보적 단일 가닥 형태의 각각을 모두 포함한다
폴리뉴클레오티드에 적용되는 것과 같은 용어 "코딩"은 천연 상태 또는 당업자에게 공지된 방법에 의해 조작되는 경우 폴리펩티드를 "코딩"한다고 언급되는 폴리뉴클레오티드를 나타내고, 이는 폴리펩티드 및/또는 그 단편에 대한 mRNA를 생산하도록 전사 및/또는 번역될 수 있다. 안티센스 가닥은 이러한 핵산의 상보물이며, 코딩 서열은 이로부터 추론될 수 있다.
본 발명에 사용된 바와 같이, "항체" 또는 "항원-결합 폴리펩티드"는 항원을 특이적으로 인식하고 결합하는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체를 지칭한다. 항체는 전체 항체 및 임의의 항원 결합 단편 또는 그의 단일 사슬일 수 있다. 따라서, 용어 "항체"는 항원에 결합하는 생물학적 활성을 갖는 면역글로불린 분자의 적어도 일부를 포함하는 임의의 단백질 또는 펩티드를 포함하는 분자를 포함한다. 그러한 예로는 중쇄 또는 경쇄의 상보성 결정 영역(CDR) 또는 이의 리간드 결합 부분, 중쇄 또는 경쇄 가변 영역, 중쇄 또는 경쇄 불변 영역, 골격(FR) 영역, 또는 이의 임의의 부분, 또는 결합 단백질의 적어도 한 부분을 들 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용되는 바와 같이, 용어 "항체 단편" 또는 "항원 결합 단편"은 F(ab')2, F(ab)2, Fab', Fab, Fv, scFv 및 기타와 같은 항체의 일부분이다. 구조와 상관없이, 항체 단편은 온전한 항체에 의해 인식되는 동일한 항원과 결합한다. 용어 “항체 단편”은 압타머, 스피겔머 및 디아바디를 포함한다. 또한 용어 “항체 단편”은 복합체를 형성하기 위해 특정 항원에 결합함으로써 항체와 같이 작용하는 합성 또는 유전학적으로 조작된 단백질을 포함한다.
"단일-사슬 가변 단편" 또는 "scFv(single-chain variable fragment)"는 면역글로불린의 중쇄(VH) 및 경쇄(VL)의 가변 영역의 융합 단백질을 지칭한다. 일 측면에서, 상기 영역은 10 개 내지 약 25 개의 아미노산의 짧은 링커 펩티드로 연결된다. 링커는 유연성을 위해 글리신이 풍부할 뿐만 아니라 용해성을 위해 세린 또는 트레오닌이 풍부할 수 있고, VH의 N-말단을 VL의 C-말단 또는 그 반대로 연결할 수 있다. 이 단백질은 불변 영역의 제거 및 링커의 도입에도 불구하고 원래 면역글로불린의 특이성을 유지한다. ScFv 분자는 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어, 미국 특허 제5,892,019호에 기재되어 있다.
용어 "항체"는 생화학적으로 구별될 수 있는 다양한 종류의 폴리펩티드를 포함한다. 당업자는 중쇄가 감마, 뮤, 알파, 델타 또는 엡실론(γ, μ, α, δ, ε) 및 이들 중 몇몇 하위 클래스(예를 들어, γ l- γ 4)로 분류됨을 인식할 것이다. 각각 IgG, IgM, IgA IgG 또는 IgE로서 각 항체의 "클래스"를 결정하는 것은 이 사슬의 특성이다. IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgG5 등의 면역글로불린 서브 클래스(이소타입)는 기능적인 특성 전문화를 부여하는 것으로 잘 알려져있다. 상기 클래스 및 이소타입의 각각의 변형된 버전은 본 발명의 내용을 고려하여 당업자에게 용이하게 식별 가능한바, 본 개시의 범위 내에 있다. 모든 면역글로불린 클래스는 분명히 본 발명의 범위 내에 있으며, 이하의 논의는 일반적으로 면역글로블린 분자의 IgG 클래스에 관한 것이다. IgG와 관련하여, 표준 면역글로불린 분자는 분자량 약 23,000 달톤의 2 개의 동일한 경쇄 폴리펩티드 및 분자량 53,000-70,000의 2 개의 동일한 중쇄 폴리펩티드를 포함한다. 4 개의 사슬은 전형적으로 "Y"배열의 이황화 결합에 의해 연결되며, 여기서 경쇄는 "Y"의 입구에서 시작하여 가변 영역을 통해 계속되는 중쇄를 감싸넣는다.
본 발명의 항체, 항원 결합 폴리펩티드, 변이체 또는 이의 유도체는 다클론, 단일클론, 다중특이적, 인간, 인간화, 영장류화 또는 키메라 항체, 단일사슬 항체, 에피토프-결합 단편, 예를 들어, Fab, Fab' 및 F(ab')2, Fd, Fvs, 단일-사슬 Fvs(scFv), 단일사슬 항체, 디설파이드-결합된 Fvs(sdFv), VK 또는 VH 도메인을 포함하는 단편, Fab 발현 라이브러리에 의해 생산된 단편 및 항-유전자형(anti-Id) 항체(예를 들어, 본 발명에 개시된 LIGHT 항체에 대한 항-Id 항체를 포함함)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 면역글로불린 또는 항체 분자는 임의의 타입(예를 들어, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA, 및 IgY), 클래스(예를 들어, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl 및 IgA2) 또는 서브클래스의 면역글로불린 분자일 수 있다.
경쇄는 카파 또는 람다(κ,λ)로 분류된다. 각 중쇄 클래스는 카파 또는 람다 경쇄와 함께 결합될 수 있다. 일반적으로, 경쇄 및 중쇄는 서로 공유결합되어있고, 두 개의 중쇄의 "꼬리" 부분은 면역글로불린이 하이브리도마, B 세포 또는 유전적으로 조작된 숙주 세포에 의해 생성될 때 공유결합인 디설파이드 결합 또는 비공유 결합에 의해 서로 결합되어있다. 중쇄에서, 아미노산 서열은 Y 배열의 포크형 말단에 있는 N 말단으로부터 각 사슬의 저부에 있는 C 말단으로 이어져 있다.
경쇄 및 중쇄는 모두 구조적 및 기능적 상동성의 영역으로 나뉜다. "불변" 및 "가변"라는 용어는 기능적으로 사용된다. 이와 관련하여, 경쇄(VK) 및 중쇄(VH)의 가변 영역은 항원 인식 및 특이성을 결정한다는 것은 이해될 것이다. 반대로, 경쇄(CK) 및 중쇄(CH1, CH2 또는 CH3)의 불변 영역은 분비, 태반을 통과하는 이동성, Fc 수용체 결합, 상보적인 결합 등과 같은 중요한 생물학적 특성을 부여한다. 관례상 불변 영역의 번호는 항체의 항원-결합 부위 또는 아미노-말단으로부터 멀어질수록 증가한다. N-말단 부분은 가변 영역이고 C-말단 부분은 불변 영역이다; CH3 및 CK 영역은 실제로 각 중쇄 및 경쇄의 카르복시-말단을 포함한다.
위에서 언급한 바와 같이, 가변 영역은 항체가 항원 상의 에피토프를 선택적으로 인식하고 특이적으로 결합시키는 것을 허용한다. 즉, 항체의 VK 영역 및 VH 영역, 또는 상보성 결정 영역(CDR)의 서브 세트가 결합하여 3 차원 항원 결합 부위를 한정하는 가변 영역을 형성한다. 이 4 차 항체 구조는 Y의 각 팔 끝에 존재하는 항원 결합 부위를 형성한다. 보다 구체적으로, 항원-결합 부위는 각각의 VH 및 VK 사슬(즉, CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3)상의 3 개의 CDR에 의해 정의된다. 어떤 경우, 예를 들어, 낙타과 종으로부터 유도되거나 낙타과 면역글로불린을 기반으로 하여 조작된 어떤 면역글로불린 분자와 같은 완전 면역글로불린 분자는 경쇄없이 중쇄만으로 구성될 수 있다. 예컨대, Hamers-Castermanet al., Nature 363:446-448(1993).
자연 발생 항체에서, 각각의 항원-결합 도메인에 존재하는 6 개의 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"은 항체가 수용성 환경에서 3차원 배열을 띌 때 항원-결합 영역을 형성하도록 특이적으로 배치되는 아미노산의 짧고 인접하지 않은 서열이다. "프레임워크" 영역으로 언급된, 항원-결합 영역의 나머지 아미노산은 분자간 가변성이 적다. 프레임워크 영역은 주로 β-시트 구조를 채택하고, CDR은 β-시트 구조를 연결하고 일부 경우에는 그 일부를 형성하는 루프를 형성한다. 따라서, 프레임워크 영역은 사슬 간, 비-공유 결합에 의한 상호작용에 의해 CDR을 정확한 배향으로 위치시키는 것을 제공하는 스캐폴드를 형성하도록 작용한다. 위치된 CDR에 의해 형성된 항원-결합 도메인은 면역반응 항원 상의 에피토프에 상보적인 표면을 정의한다. 이 상보적인 표면은 이의 인지체 에피토프에 대한 항체의 비공유 결합을 촉진한다. 각각의 CDR 및 프레임워크 영역을 포함하는 아미노산은 정확하게 정의되었기 때문에 당업자에 의해 임의로 주어진 중쇄 또는 경쇄 가변 영역에 대해 용이하게 확인될 수 있다(“Sequences of Proteins of Immunological Interest,” Kabat, E., et al., U.S. Department of Health and Human Services,(1983); 및 Chothia and Lesk, J. MoI. Biol., 196:901-917 (1987)).
당업계에서 사용 및/또는 받아들여지는 용어의 정의가 2 개 이상인 경우, 본 발명에서 사용되는 용어의 정의는 명시적으로 반대되는 경우를 제외하고 그러한 모든 의미를 포함하는 것으로 의도된다. 특정 예는 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드의 가변 영역 내에서 발견되는 비-인접 항원 결합 부위를 기술하기 위해 용어 "상보성 결정 영역"("CDR")의 이용이다. 상기 특정 영역은 본 발명에 참고로 인용되어 있는 Kabat 등, 미국 보건복지부의 “Sequences of Proteins of Immunological Interest” (1983) 및 Chothiaet al., J. MoI. Biol. 196:901-917 (1987)에 의해 기술되어 있고, 이는 그 전체가 참조로서 본 발명에 포함된다. Kabat 및 Chothia에 따른 CDR 정의는 서로 비교할 때 아미노산 잔기의 중첩 또는 서브세트를 포함한다. 그럼에도 불구하고, 항체 또는 그 변이체의 CDR을 지칭하기 위한 어느 한 정의의 적용은 본 발명에서 정의되고 사용되는 용어의 범위 내에 있는 것으로 의도된다. 상기 언급된 각각의 참고문헌에 의해 정의된 대로 CDR을 포함하는 적절한 아미노산 잔기를 비교로서 아래 표에 나타낸다. 특정 CDR을 포함하는 정확한 잔기 번호는 CDR의 서열 및 크기에 따라 변할 것이다. 당업자는 항체의 가변 영역 아미노산 서열이 주어진 특정 CDR을 포함하는 잔기를 관례적으로 결정할 수 있다.
Figure 112022017788717-pat00001
또한 Kabat et al.은 임의의 항체에 적용 가능한 가변 도메인 서열에 대한 번호 시스템을 정의하였다. 당업자는 서열 그 자체를 이상의 어떠한 실험 데이터에도 의존하지 않고, 임의의 가변영역 서열에 "카밧 넘버링" 시스템을 분명하게 부여할 수 있다. 본 발명에서 사용된 바와 같이, "카밧 넘버링"은 미국 보건복지부의 “Sequences of Proteins of Immunological Interest” (1983)에 기술되어 있는 넘버링 시스템 세트를 지칭한다.
상기 표에 더하여, 카밧 넘버 시스템은 다음과 같이 CDR 영역을 설명한다:CDR-H1은 대략 아미노산 31에서 시작하고(즉, 제1 시스테인 잔기 후 약 9 잔기), 약 5-7 개의 아미노산을 포함하며, 다음 트립토판 잔기에서 끝난다. CDR-H2는 CDR-H1 말단의 15 번째 잔기에서 시작하고, 약 16-19 개의 아미노산을 포함하며, 다음 아르기닌 또는 라이신 잔기에서 끝난다. CDR-H3은 CDR-H2 말단의 약 30 번째 아미노산 잔기에서 시작되고; 3-25 아미노산을 포함하며; 서열 W-G-X-G에서 끝나며, 상기 X는 임의의 아미노산이다. CDR-L1은 약 잔기 24에서 시작하고(즉, 시스테인 잔기를 따라); 대략 10-17 잔기를 포함하고; 다음 트립토판 잔기에서 끝난다. CDR-L2는 CDR-L1 말단의 약 16 번째 잔기에서 시작하고 약 7 잔기를 포함한다. CDR-L3은 CDR-L2의 말단(즉, 시스테인 잔기를 따르는) 후 약 30 번째 잔기에서 시작하고; 약 7-11 잔기를 포함하고 서열 F 또는 W-G-X-G에서 끝나며, 상기 X는 임의의 아미노산이다.
본 발명에 개시된 항체는 조류 및 포유류를 비롯한 임의의 동물 유래일 수 있다. 바람직하게는, 항체는 인간, 쥐, 당나귀, 토끼, 염소, 기니피그, 낙타, 라마, 말 또는 닭 항체이다. 또 다른 구현예에서, 가변 영역은 기원(예컨대, 상어)에서 콘드릭토이드(condricthoid)일 수 있다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, 용어 "중쇄 불변 영역"은 면역글로불린 중쇄로부터 유래된 아미노산 서열을 포함한다. 중쇄 불변 영역을 포함하는 폴리펩티드는 CH1 도메인, 힌지 도메인(예를 들어, 상부, 중간 및/또는 하부 힌지 도메인), CH2 도메인, CH3 도메인, 또는 그의 변이체 또는 단편 중 적어도 하나를 포함한다. 예를 들어, 본 발명에서 사용하기 위한 항원-결합 폴리펩티드는 CH1 도메인; CH1 도메인, 적어도 일부의 힌지 도메인, 및 CH2 도메인을 포함하는 폴리펩티드 사슬; CH1 도메인 및 CH3 도메인을 포함하는 폴리펩티드 사슬; CH1 도메인, 적어도 일부의 힌지 도메인, CH3 도메인을 포함하는 폴리펩티드 사슬, 또는 CH1 도메인, 적어도 일부의 힌지 도메인, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하는 폴리펩티드 사슬을 포함할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 폴리펩티드는 CH3 도메인을 포함하는 폴리펩티드 사슬을 포함한다. 또한, 본원에서 사용하기 위한 항체는 CH2 도메인(예를 들어, CH2 도메인의 전부 또는 일부)의 적어도 일부가 결손될 수 있다. 전술한 바와 같이, 중쇄 불변 영역이 자연 발생 면역글로불린 분자로부터 아미노산 서열을 바꾸기 위해 변형될 수 있다는 것은 당업자에게 이해될 것이다.
본 발명에 개시된 항체의 중쇄 불변 영역은 상이한 면역글로불린 분자로부터 유도될 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드의 중쇄 불변 영역은 IgGl 분자로부터 유도된 CH1 도메인 및 IgG3 분자로부터 유도된 힌지 도메인을 포함할 수 있다. 또 다른 실시예에서, 중쇄 불변 영역은 IgG1 분자로부터 부분적으로 및 IgG3 분자로부터 부분적으로 유도된 힌지 도메인을 포함할 수 있다. 또 다른 실시예에서, 중쇄 부분은 IgG1 분자로부터 부분적으로 및 IgG4 분자로부터 부분적으로 유도된 키메라 힌지를 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, 용어 "경쇄 불변 영역"은 항체 경쇄로부터 유래된 아미노산 서열을 포함한다. 바람직하게는, 경쇄 불변 영역은 불변 카파 도메인 또는 불변 람다 도메인 중 적어도 하나를 포함한다.
"경쇄-중쇄 쌍"은 경쇄의 CL 도메인과 중쇄의 CH1 도메인 사이의 디설파이드 결합을 통해 이량체를 형성할 수 있는 경쇄 및 중쇄의 집합을 지칭한다.
앞서 설명한대로, 서브 유닛 구조 및 다양한 면역글로불린 클래스의 불변 영역의 3 차원 배열은 잘 알려져있다. 본 발명에서 사용된 용어 "VH 도메인"은 면역글로불린 중쇄의 아미노 말단 가변 영역을 포함하고, 용어 "CH1 도메인"은 면역글로불린 중쇄의 제1(대부분의 아미노 말단) 불변 영역 도메인을 포함한다. CH1 도메인은 VH 도메인에 인접하고, 면역글로불린 중쇄 분자의 힌지 도메인에 대한 아미노 말단이다.
본 발명에서 사용된 용어 "CH2 도메인"은 통상적인 넘버링 방식을 사용하여 예를 들어 항체의 잔기 약 244 내지 잔기 360까지 연장되는 중쇄 분자의 부분을 포함한다(잔기 244 내지 360, 카밧 넘버링 시스템; 및 잔기 231 내지 340, EU 넘버링 시스템; Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, “Sequences of Proteins of Immunological Interest” (1983)). CH2 도메인은 다른 도메인과 밀접하게 연결되어 있지 않다는 점에서 독특하다. 오히려, 2 개의 N- 연결된 분지형 탄수화물 사슬이 손상되지 않은 천연 IgG 분자의 2 개의 CH2 도메인 사이에 배치된다. 또한, CH3 도메인이 CH2 도메인에서 IgG 분자의 C-말단까지 연장되고 약 108 잔기를 포함한다는 것은 잘 보고되어 있다.
본 발명에서 사용된 용어 "힌지 도메인"은 CH1 도메인과 CH2 도메인을 연결하는 중쇄 분자의 부분을 포함한다. 이 힌지 도메인은 대략 25 잔기를 포함하고 유연성이 있어, 2 개의 N-말단 항원-결합 영역을 독립적으로 움직일 수 있게 한다. 힌지 도메인은 상위, 중간 및 하위 힌지 도메인의 세 가지 개별 도메인으로 세분화될 수 있다(Roux et al., J. Immunol 161:4083 (1998)).
본 발명에서 사용된 용어 "디설파이드 결합"은 2 개의 황 원자 사이에 형성된 공유 결합을 포함한다. 아미노산 시스테인은 제2 티올 그룹과 함께 디설파이드 결합 또는 브릿지를 형성할 수 있는 티올 그룹을 포함한다. 대부분의 자연 발생 IgG 분자에서, CH1 및 CK 영역은 디설파이드 결합에 의해 연결되고, 2 개의 중쇄는 카밧 넘버링 시스템을 사용하여 239 및 242에 대응되는 위치에서 2 개의 디설파이드 결합에 의해 연결된다(위치 226 또는 229, EU 넘버링 시스템).
본 발명에서 사용된, 용어 "키메라 항체"는 면역 반응성 영역 또는 부위가 제1의 종으로부터 수득되거나 유래된 임의의 항체를 의미하는 것으로 간주될 것이고, 불변 영역(본 발명의 내용에 따라 온전하거나, 부분적이거나 변형될 수 있음)은 제2의 종으로부터 얻어진다. 특정 구현예에서, 표적 결합 영역 또는 부위는 비-인간 공급원(예를 들어, 마우스 또는 영장류)으로부터 유래하고 불변 영역은 인간이다.
본 발명에서 사용된, "인간화 백분율"은 인간화 도메인과 생식계열 도메인 사이의 프레임워크 아미노산 차이(즉, 비 CDR 차이)의 수를 결정하고, 총 아미노산 수에서 그 수를 빼고, 이를 총 아미노산 수로 나눈 다음 100을 곱함으로써 계산된다.
"특이적으로 결합한다" 또는 "특이성을 갖는다"는 것은 일반적으로 항체가 그 항원-결합 도메인을 통해 에피토프에 결합하고, 그 결합은 항원-결합 도메인과 에피토프 사이의 일부 상보성을 수반한다는 것을 의미한다. 이 정의에 따르면, 항체는 관련이 없는 임의의 에피토프에 결합하는 것보다 더 쉽게 그 항원-결합 도메인을 통해 해당 에피토프에 결합할 때 에피토프에 "특이적으로 결합한다"고 말한다. 용어 "특이성"은 특정 항체가 특정 에피토프에 결합하는 상대적인 친화도를 분석하기 위해 본 발명에서 사용된다. 예를 들어, 항체 "A"는 항체 "B"보다 주어진 에피토프에 대해 더 높은 특이성을 갖는 것으로 여겨질 수 있거나, 항체 "A"는 연관된 에피토프 "D"에 대해 갖는 것보다 더 높은 특이성을 갖는 에피토프 "C"에 결합한다고 할 수 있다.
본 발명에서 사용된, 용어 "치료하다" 또는 "치료"는 치료방법 및 예방적 또는 방지적 수단 모두를 지칭하며, 목적은 암의 진행과 같은 바람직하지 않은 생리학적 변화 또는 장애를 예방 또는 감속(경감)시키는 것이다. 유익하거나 바람직한 임상 결과는 증상 완화, 질병 범위의 축소, 질병의 안정화된(즉, 악화되지 않은) 상태, 질병 진행의 지연 또는 감속, 질병 상태의 개선 또는 완화, 및 검출 가능하거나 또는 검출 불가능한 차도(부분적 또는 전체적이든)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 또한 "치료"는 치료를 받지 않을 경우 예상되는 생존과 비교하여 생존 기간을 연장시키는 것을 의미한다. 치료가 필요한 사람들은 이미 상태 또는 장애가 있는 사람들뿐만 아니라 상태 또는 장애를 가진 경향이 있는 사람들 또는 상태 또는 장애가 예방되어야 하는 사람들을 포함한다.
"대상" 또는 "개체" 또는 "동물" 또는 "환자" 또는 "포유류"는 진단, 예후 또는 치료가 필요한 모든 대상, 특히 포유류 대상을 의미한다. 포유류 대상은 인간, 가축, 농장 동물, 및 개, 고양이, 기니피그, 토끼, 쥐, 말, 소, 젖소 등과 같은 동물원, 스포츠 또는 애완동물을 포함한다.
본 발명에서 사용된, "치료가 필요한 환자에게" 또는 "치료가 필요한 대상에게"와 같은 구는 본 발명의 항체 또는 조성물의 투여로부터 예를 들어, 검출, 진단 절차 및/또는 치료를 위한 이익을 얻을 수 있는 포유류 대상과 같은 대상을 포함한다.
항-PD-1 항체
본 발명은 인간 PD-1 단백질에 고 친화성을 갖는 항-PD-1 항체를 제공한다. 시험된 항체는 강력한 결합 및 억제 활성을 나타내며 치료 및 진단 용도로 유용하다. 또한, 시험된 인간화 항체 중 하나(TY101)는 2 개의 FDA 승인된 항-hPD-1 항체보다 유의하게 높은 결합 친화도를 나타냈다.
따라서, 본 발명의 일 구현예는 인간 세포예정사 1(PD1) 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 항-PD-1 항체 또는 그 단편을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 따라, 표 1의 CDR 그룹 중 하나로서 CDR 영역을 갖는 중쇄 및 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항체가 제공된다.
[표 1]
CDR 영역의 서열
Figure 112022017788717-pat00002
예를 들어, 일 구현예에서, 인간 세포예정사 1(PD-1) 단백질에 특이성을 갖는 분리된 항체 또는 그 단편이 제공되며, 상기 항체 또는 그 단편은 중쇄 상보성 결정 영역 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 경쇄 상보성 결정 영역 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고, 상기 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3은 HCDR1 : GFTFSSYT(서열번호 1), HCDR2 : ISHGGGDT(서열번호 2), HCDR3 : ARHSGYERGYYYVMDY(서열번호 3), LCDR1 : ESVDYYGFSF(서열번호 4), LCDR2 : AAS(서열번호 5), LCDR3 : QQSKEVPW(서열번호 6)이다.
예를 들어, 일 구현예에서, 인간 세포예정사 1(PD-1) 단백질에 특이성을 갖는 분리된 항체 또는 그 단편이 제공되며, 상기 항체 또는 그 단편은 중쇄 상보성 결정 영역 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 경쇄 상보성 결정 영역 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고, 상기 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3은 HCDR1 : GYTFTSYT(서열번호 7), HCDR2 : INPTTGYT(서열번호 8), HCDR3 : ARDDAYYSGY(서열번호 9), LCDR1 : ENIYSNL(서열번호 10), LCDR2 : AAK(서열번호 11), LCDR3 : QHFWGTPWT(서열번호 12)이다.
예를 들어, 일 구현예에서, 인간 세포예정사 1(PD-1) 단백질에 특이성을 갖는 분리된 항체 또는 그 단편이 제공되며, 상기 항체 또는 그 단편은 중쇄 상보성 결정 영역 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 경쇄 상보성 결정 영역 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고, 상기 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3은 HCDR1 : GFAFSSYD(서열번호 13), HCDR2 : ITIGGGTT(서열번호 14), HCDR3 : ARHRYDYFAMDN(서열번호 15), LCDR1 : ENVDNYGINF(서열번호 16), LCDR2 : VSS(서열번호 17), LCDR3 : QQSKDVPW(서열번호 18)이다.
실험예에서 입증된 바와 같이, 마우스, 인간화 또는 키메라에 관계없이 이 CDR 영역을 함유하는 항체는 강력한 PD-1 결합 및 억제 활성을 가졌다. 게다가 컴퓨터 모델링은 CDR 내의 특정 잔기가 항체의 성질을 유지하거나 향상시키도록 변형할 수 있음을 나타낸다. 일 구현예에서, 본 발명의 항-PD-1 항체는 표 1에 나열된 바와 같은 VH 및 VL CDR을 포함하며, 1, 2 또는 3 개의 추가 변형을 포함한다. 그러한 변형은 아미노산의 부가, 결실 또는 치환이 될 수 있다.
일 구현예에서, 변형은 각각의 CDR로부터 하나 이상의 핫스폿 위치에서의 치환이다. 일 구현예에서, 변형은 1, 2 또는 3 개의 핫스폿 위치에서의 치환이다. 일 구현예에서, 변형은 핫스폿 위치들 중 하나에서의 치환이다. 이러한 치환은 일부 구현예에서 보존적 치환이다.
"보존적 아미노산 치환"은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 치환된 것이다. 염기성 측쇄(예를 들어, 라이신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄(예, 아스파르트산, 글루탐산), 비전하 극성 측쇄(예를 들어, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인), 비극성 측쇄(예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 이소루이신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 베타- 분지된 측쇄(예를 들어, 트레오닌, 발린, 이소루이신) 및 방향족 측쇄(예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)를 포함하는 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 패밀리는 당업계에 정의되어있다. 따라서, 면역글로불린 폴리펩티드의 비 필수 아미노산 잔기는 바람직하게는 동일한 측쇄 패밀리로부터의 또 다른 아미노산 잔기로 대체된다. 또 다른 구현예에서, 아미노산의 일련은 순서가 다른 구조적으로 유사한 일련 및/또는 측쇄 패밀리의 구성원의 조성으로 대체될 수 있다.
보존적 아미노산 치환의 비-제한적 예가 하기 표에 제공되며, 유사성 스코어 0 이상은 2 개의 아미노산 간의 보존적 치환을 나타낸다.
아미노산 유사성 매트릭스
Figure 112022017788717-pat00003
보존적 아미노산 치환
Figure 112022017788717-pat00004
VH의 비-제한적인 예는 서열번호 27, 서열번호 31, 서열번호 35, 서열번호 37 및 서열번호 39로 제공된다. 서열번호 27은 마우스 VH이다. 서열번호 31은 키메라 항체의 VH이고, 서열번호 35, 서열번호 37 및 서열번호 39는 인간화이다.
VL의 비-제한적 예는 서열번호 29, 서열번호 33, 서열번호 41, 서열번호 43 및 서열번호 45로 제공된다. 서열번호 29는 마우스 VL이다. 서열번호 33은 키메라 항체의 VL이고, 서열번호 41, 서열번호 43 및 서열번호 45는 인간화이다.
일 구현예에서, 본 발명의 항-PD-1 항체는 서열번호 27, 서열번호 31, 서열번호 35, 서열번호 37 또는 서열번호 39의 VH, 서열번호 29, 서열번호 33, 서열번호 41, 서열번호 43 또는 서열번호 45의 VL, 또는 그 각각의 생물학적 동등물을 포함한다. VH 또는 VL의 생물학적 동등물은 전체 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % 또는 99 %의 서열 동일성을 가지면서 지정된 아미노산을 포함하는 서열이다. 예를 들어, 서열번호 27의 생물학적 등가물은 서열번호 27에 대해 전체 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % 또는 99 % 서열 동일성을 가지나 CDRs를 보유하는 VH일 수 있다.
본 발명에 개시된 바와 같은 항체는 그들이 유도된 천연 발생 결합 폴리펩티드로부터 아미노산 서열이 다양하게 변형될 수 있다는 것이 또한 당업자에 의해 이해될 것이다. 예를 들어, 지정된 단백질로부터 유래된 폴리펩티드 또는 아미노산 서열은 유사할 수 있으며, 예를 들어 스타트 서열과 일정 퍼센트의 동일성을 가질 수 있으며, 예를 들어 스타트 서열에 대해 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 % 90 %, 95 %, 98 % 또는 99 % 동일하다.
특정 구현예에서, 항체는 아미노산 서열 또는 항체와 보통 연관되지 않은 하나 이상의 부분을 포함한다. 예시적인 변형은 이하에서보다 상세히 설명된다. 예를 들어, 본 발명의 항체는 가용성 링커 서열을 포함할 수 있거나, 또는 기능성 부분(예를 들어, PEG, 약물, 독소, 또는 표지)를 부가하도록 변형될 수 있다.
본 발명의 항체, 변이체 또는 이의 유도체는 예를 들어, 공유 결합이 에피토프에 결합하는 항체를 방해하지 않도록 항체 분자에 대한 임의의 유형의 분자의 공유 결합에 의해, 변형된 유도체를 포함한다. 비제한적으로, 예를 들어, 항체는 당화, 아세틸화, 페길레이션, 인산화, 인산화, 아미드화, 보호/차단기에 의한 유도체화, 단백질 분해성 절단, 세포 리간드 또는 다른 단백질과의 결합 등에 의해 변형될 수 있다. 임의의 다양한 화학적 변형이 비제한적으로 특정 화학적 절단, 아세틸화, 포르밀화, 튜니카마이신의 생합성 등을 포함하는 공지된 기술에 의해 수행될 수 있다. 또한, 항체는 하나 이상의 비-전형적 아미노산을 함유할 수 있다.
일 구현예에서, 항체는 치료제, 전구 약물, 펩티드, 단백질, 효소, 바이러스, 지질, 생물학적 반응 조절제, 약제 또는 PEG에 접합될 수 있다.
항체는 방사성 표지와 같은 검출 가능한 표지를 포함하는 치료제, 면역 조절제, 호르몬, 효소, 올리고뉴클레오티드, 광활성 치료제 또는 진단제, 약물 또는 독소와 같은 세포 독성제, 초음파 증강제 비-방사성 표지, 이들의 조합 및 다른 공지된 이러한 제제와 접합되거나 융합될 수 있다.
항체는 화학발광 화합물과 결합시켜 검출 가능하게 표지될 수 있다. 화학발광- 표지된 항원-결합 폴리펩티드의 존재는 화학 반응 과정에서 발생하는 발광의 존재를 검출함으로써 결정된다. 특히 유용한 화학발광 표지 화합물의 예는 루미놀, 이소루미놀, 방향족 아크릴리디늄 에스터, 이미다졸, 아크리디늄 염 및 옥살레이트 에스터이다.
항체는 152Eu와 같은 형광 방출 금속 또는 란탄 계열의 다른 것들을 사용하여 검출 가능하게 표지할 수 있다. 상기 금속은 디에틸렌트리아민펜타아세트산(DTPA) 또는 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)과 같은 금속 킬레이트 그룹을 사용하여 항체에 부착될 수 있다. 다양한 부분을 항체에 접합시키는 기술은 잘 알려져 있으며, 예를 들어, Arnonet al., “Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy”, in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeldet al. (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. (1985); Hellstrom et al., “Antibodies For Drug Delivery”, in Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al., (eds.), Marcel Dekker, Inc., pp. 623- 53 (1987); Thorpe, “Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review”, in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pincheraet al. (eds.), pp. 475-506 (1985); “Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy”, in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), Academic Press pp. 303-16 (1985), 및 Thorpe et al., “The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates”, Immunol. Rev. (52:119-58 (1982)).
이중-기능성 분자
PD-1은 면역 체크포인트 분자이며, 또한 종양 항원이기도 하다. 종양 항원 표적화 분자로서, PD-1에 특이적인 항체 또는 항원 결합 단편은 이중 특이성 항체를 생성을 위해 면역세포에 특이적인 제2 항원-결합 단편과 결합될 수 있다.
일 구현예에서, 면역세포는 T 세포, B 세포, 단핵구, 대식세포, 호중구, 수상 세포, 식세포, 자연 살해 세포, 호산구, 호염기구 및 비만 세포로 이루어진 군으로부터 선택된다. 표적될 수 있는 면역세포의 분자는 CD3, CD16, CD19, CD28 및 CD64와 같은 분자를 포함한다. 다른 예는 PD-1, CTLA-4, LAG-3(CD223으로도 알려짐), CD28, CD122, 4-1BB(CD137로도 알려짐), TIM3, OX-40 또는 OX40L, CD40 또는 CD40L, LIGHT, ICOS / ICOSL, GITR / GITRL, TIGIT, CD27, VISTA, B7H3, B7H4, HEVM 또는 BTLA(CD272라고도 함), 살해-세포 면역글로불린-유사 수용체(KIR) 및 CD47를 포함한다. 이중특이성의 구체적인 예는 PD-L1/PD-1, PD-1/LAG3, PD-1/TIGIT 및 PD-1/CD47가 포함되나 이에 한정되지 않는다.
면역 체크포인트 억제제로서, PD-1에 특이적인 항체 또는 항원-결합 단편은 이중특이적 항체를 생산하기 위한 종양 항원에 특이적인 제2 항원-결합 단편과 결합될 수 있다. "종양 항원"은 종양 세포에서 생성되는 항원 물질, 즉 숙주에서 면역 반응을 유발하는 물질이다. 종양 항원은 종양 세포를 확인하는데 유용하며, 암 치료에서 사용을 위한 잠재적인 후보이다. 신체의 정상 단백질은 항원성이 아니다. 그러나 특정 단백질은 종양 형성 중에 생성되거나 과발현되어 신체에 "외래"로 보인다. 이는 면역 시스템으로부터 잘 격리된 정상 단백질, 일반적으로 극소량으로 생산되는 단백질, 일반적으로 특정 발달 단계에서만 생산되는 단백질, 또는 돌연변이로 인해 구조가 변형된 단백질이 포함된다.
종양 항원의 존재는 당업계에 알려져 있고, 새로운 종양 항원은 스크리닝에 의해 쉽게 동정될 수 있다. 종양항원의 비-제한적인 예는 EGFR, Her2, EpCAM, CD20, CD30, CD33, CD47, CD52, CD133, CD73, CEA, gpA33, 뮤신, TAG-72, CIX, PSMA, 엽산-결합 단백질, GD2, GD3, GM2, VEGF, VEGFR, 인테그린, αVβ3, α5β1, ERBB2, ERBB3, MET, IGF1R, EPHA3, TRAILR1, TRAILR2, RANKL, FAP 및 테나신을 포함한다.
일 측면에서, 1가 단위는 상응하는 비-종양 세포와 비교하여 종양 세포에서 과발현되는 단백질에 대한 특이성을 갖는다. 여기서 사용된 "상응하는 비-종양 세포"는 종양 세포의 기원과 동일한 세포 유형인 비-종양 세포를 의미한다. 이와 같은 단백질은 반드시 종양 항원과 다를 필요는 없음을 유의해야 한다. 비-제한적인 예는 대부분의 결장, 직장, 유방, 폐, 췌장 및 위장관 암종에서 과발현되는 암배 항원(carcinoembryonic antigen,CEA); 유방, 난소, 결장, 폐, 전립선 및 자궁경부의 암에서 빈번히 과발현된 헤레귤린 수용체(HER-2, neuor c-erbB-2); 유방, 두경부, 비소세포 폐 및 전립선을 포함하는 고형암의 범위에서 높게 발현되는 상피 세포 성장 인자 수용체(epidermal growth factor receptor. EGFR); 아시알로글리코단백질 수용체; 트랜스페린 수용체; 간세포에서 발현되는 세르핀 효소 복합 수용체; 췌장관 선암 세포에서 과발현되는 섬유아세포 성장 인자 수용체(fibroblast growth factor receptor, FGFR); 항-혈관 신생 유전자 치료를 위한 혈관 내피 성장 인자 수용체(vascular endothelial growth factor receptor, VEGFR); 비점액성 난소암의 90 %에서 선택적으로 과발현되는 엽산 수용체; 세포 표면 당질피질; 탄수화물 수용체; 및 호흡기 상피 세포로의 유전자 전달 및 낭포성섬유증과 같은 폐 질환 치료에 유용한 고분자 면역글로불린 수용체를 포함한다. 이 점에 있어서 이중특이성의 비-제한적인 예는 PD-1/EGFR, PD-1/Her2, PD-1/CD33, PD-1/CD133, PD-1/CEA 및 PD-1/VEGF를 포함한다.
또한 이중 특이적 항체의 상이한 형태도 제공된다. 일 구현예에서, 각각의 항-PD-1 단편 및 제2 단편은 각각 Fab 단편, 단일 사슬 가변 단편(scFv) 또는 단일 도메인 항체로부터 독립적으로 선택된다. 일 구현예에서, 이중 특이적 항체는 Fc 단편을 추가로 포함한다.
항체 또는 항원 결합 단편을 포함하지 않는 이중 기능성 분자도 제공된다. 종양 항원 표적화 분자로서, 본원에 기술된 바와 같은 PD-1에 특이적인 항체 또는 항원 결합 단편은 펩티드 링커를 통해 선택적으로 면역 사이토카인 또는 리간드와 결합될 수 있다. 연결된 면역 사이토카인 또는 리간드는 IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, GM-CSF, TNF-α, CD40L, OX40L, CD27L, CD30L, 4-1BBL, LIGHT 및 GITRL을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 이러한 이중-기능성 분자는 종양 부위 국소 면역요법과 함께 면역 체크포인트 차단 효과와 결합될 수 있다.
항체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 및 항체 제조 방법
또한 본 발명은 본 발명의 항체, 변이체 또는 이의 유도체를 코딩하는 단리 된 폴리뉴클레오티드 또는 핵산 분자(예를 들어, 서열 번호 22, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44 및 46)를 제공한다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 동일한 폴리뉴클레오티드 분자 또는 별도의 폴리 뉴클레오티드 분자 상에 항원-결합 폴리펩티드의 전체 중쇄 및 경쇄 가변 영역, 이의 변이체 또는 유도체를 코딩할 수 있다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 동일한 폴리 뉴클레오티드 분자 또는 별도의 폴리뉴클레오타이드 분자 상에서 항원-결합 폴리펩티드의 부분 중쇄 및 경쇄 가변 영역, 이의 변이체 또는 유도체를 코딩할 수 있다.
항체를 제조하는 방법은 당해 기술 분야에 잘 알려져 있고 본 발명에 기술되어있다. 특정 구현예에서, 본 발명의 항원-결합 폴리펩티드의 가변 및 불변 영역은 모두 완전하게 인간의 것이다. 완전 인간 항체는 당해 기술 분야에 기재된 기술 및 본 발명에 기술된 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 특정 항원에 대한 완전 인간 항체는 항원성 공격에 반응하여 이에 대한 항체를 생산하도록 변형되었지만, 그 내인성 유전자 좌가 손상된 형질전환 동물에게 항원을 투여함으로써 제조될 수 있다. 이러한 항체를 제조하는데 사용될 수 있는 예시적인 기술은 미국 특허 제6,150,584호; 6,458,592; 6,420,140에 개시되어 있다.
특정 구현예에서, 제조된 항체는 치료될 동물, 예를 들어 사람에게서 유해한 면역 반응을 유도하지 않을 것이다. 일 구현예에서, 본 발명의 항원-결합 폴리펩티드, 변이체 또는 이의 유도체는 당업계에서 인정된 기술을 사용하여 면역 원성을 감소 시키도록 변형된다. 예를 들어, 항체는 인간화, 영장류화, 탈면역화되거나, 또는 키메라 항체가 제조될 수 있다. 항체의 상기 유형은 비인간 항체, 전형적으로 모항체의 항원-결합 특성을 보유하거나 실질적으로 보유하지만, 인간에서는 낮은 면역원성을 갖는 쥐 또는 영장류 항체로부터 유래된다. 이것은 (a) 키메라 항체를 생성하기 위해 인간 불변 영역에 전체 비-인간 가변 영역을 이식하는 것; (b) 중요한 프레임워크 잔기의 보유 또는 보유없이 인간 프레임워크 및 불변 영역에 적어도 하나 이상의 비-인간 상보성 결정 영역(CDR) 부분을 이식하는 것; 또는 (c) 전체 비 - 인간 가변 영역을 이식하지만, 표면 잔기의 치환에 의해 인간-유사 섹션으로 그 것들을 "클로킹(cloaking)"를 포함하는 다양한 방법으로 달성될 수 있다. 이러한 방법은 Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 57:6851-6855 (1984); Morrison et al., Adv. Immunol. 44:65-92 (1988); Verhoeyenet al.,Science 239:1534-1536 (1988); Padlan, Molec. Immun. 25:489-498 (1991); Padlan, Molec. Immun. 31:169-217 (1994), 및 미국 특허 제5,585,089호, 제5,693,761호, 제5,693,762호 및 제6,190,370호에 개시되어 있으며, 이들 모두는 그 전체가 본 발명에 참고로 인용되어 있다.
탈 면역화는 또한 항체의 면역 원성을 감소시키는데 사용될 수 있다. 본 발명에 사용된 바와 같이, 용어 "탈 면역화"는 T- 세포 에피토프를 변형시키기 위한 항체의 변형을 포함한다(예를 들어, 국제 출원 공개 번호 WO/9852976 A1 및 WO/0034317 A2 참조). 예를 들어, 시작 항체로부터의 가변 중쇄 및 가변 경쇄 서열은 분석되고, 인간 T-세포 에피토프가 상보성 결정 영역(CDRs)과 관련하여 에피토프의 위치를 나타내는 각 V 영역으로부터 "맵핑"되고, 서열 내의 다른 중요한 잔기가 생성된다. T- 세포 에피토프 맵으로부터의 개별적인 T- 세포 에피토프는 최종 항체의 활성의 변화 위험이 적은 대안적인 아미노산 치환의 확인을 위해 분석된다. 대안적인 가변 중쇄 및 가변 경쇄 서열의 범위는 아미노산 치환의 조합을 포함하도록 고안되었고, 이어서 상기 서열은 결합 폴리펩티드의 범위에 포함된다. 전형적으로, 12 내지 24 변이체 항체가 생성되고 결합 및/또는 기능에 대해 시험된다. 변형된 가변 및 인간 불변 영역을 포함하는 완전한 중쇄 및 경쇄 유전자는 발현 벡터 내로 클로닝되고, 이후의 플라스미드는 전체 항체 생산을 위해 세포주 내로 도입된다. 그런 다음 항체는 적절한 생화학적 및 생물학적 분석법에서 비교되고, 최적의 변이체가 확인된다.
본 발명의 항원-결합 폴리펩티드의 결합 특이성은 면역침강반응, 방사면역측정법(RIA) 또는 효소-결합 면역 흡착 분석법(ELISA)과 같은 시험관 내 시험에 의해 결정될 수 있다.
대신에, 단일-사슬 유닛의 생산에 대해 기술된 기술(미국 특허 제4,694,778호; Bird, Science 242:423-442 (1988); Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 55:5879- 5883 (1988); 및 Ward et al., Nature 334:544-554 (1989))은 본 발명의 단일 사슬 유닛를 생산하기 위해 적용될 수 있다. 아미노산 가교를 통해 Fv 영역의 중쇄 및 경쇄 단편을 연결함으로써 단일 사슬 유닛이 형성되어, 단일-사슬 융합 펩티드가 형성된다. 또한 대장균에서의 기능적 Fv 단편의 조립 기술이 사용될 수 있다(Skerraet al., Science 242: 1038-1041 (1988)).
단일 사슬 Fv(scFvs) 및 항체를 생산하는데 사용될 수 있는 기술의 예는 미국 특허 제4,946,778호 및 제5,258,498호; Huston et al., Methods in Enzymology 203:46-88 (1991); Shu et al., Proc. Natl. Sci. USA 90:1995-1999 (1993); 및 Skerraet al., Science 240:1038-1040 (1988)에 기재된 것들을 포함한다. 인체 내 항체의 생체 내 사용과 시험관 내 검출 분석을 포함한 일부 용도의 경우, 키메라, 인간화 또는 인간 항체를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 키메라 항체는 항체의 상이한 부분이 상이한 동물 종으로부터 유래된 분자, 예를 들어, 마우스 단일클론항체로부터 유래된 가변 영역 및 인간 면역글로불린 불변 영역을 갖는 항체이다. 키메라 항체를 생산하는 방법은 당업계에 공지되어있다. Morrison, Science 229:1202(1985); Oi et al., BioTechniques 4:214(1986); Gillies et al., J. Immunol. Methods 125:191-202(1989); 미국 특허 제5,807,715호; 제4,816,567호; 및 제4,816,397호와 같고, 이들 모두는 그 전체가 본 발명에 참고로 인용되어 있다.
인간화 항체는 비-인간 종의 하나 이상의 상보성 결정 영역(CDR) 및 인간 면역글로불린 분자의 프레임워크 영역을 가진 비-인간 종 항체로부터 유래된 항체 분자이다. 종종, 인간 프레임워크 영역의 프레임워크 잔기는 항원-결합을 변화시키고, 바람직하게는 향상시키기 위해 CDR 공여자 항체의 상응하는 잔기로 치환될 것이다. 상기 프레임워크 치환은 당업계에 널리 공지된 방법에 의해, 예를 들어 항원 - 결합에 중요한 프레임워크 잔기를 확인하기 위해 CDR 및 프레임워크 잔기의 상호 작용의 모델링 및 특정 위치에서 비정상적인 프레임워크 잔기를 확인하기 위한 서열 비교에 의해 확인된다.(예를 들어, Queen et al., U.S. Pat. No. 5,585,089; Riechmannet al., Nature 332:323 (1988)와 같고, 이들 모두는 그 전체가 본 발명에 참고로 인용되어 있다.) 항체는 예를 들어 CDR-이식(EP 239,400; PCT publication WO 91/09967; U.S. Pat. Nos. 5,225,539; 5,530,101; and 5,585,089), 베니어링 또는 리서페이싱(EP 592,106; EP 519,596; Padlan, Molecular Immunology 28(4/5):489-498 (1991); Studnickaet al., Protein Engineering 7(6):805-814 (1994); Roguska. et al., Proc. Natl. Sci. USA 91:969-973 (1994)) 및 사슬 셔플링(U.S. Pat. No. 5,565,332, 전체가 참고 문헌으로 포함됨)과 같은 당업계에 공지된 다양한 기술을 사용하여 인간화될 수 있다.
완전 인간 항체는 인간 환자의 치료법에 특히 바람직하다. 인간 항체는 인간 면역글로불린 서열로부터 유래된 항체 라이브러리를 사용하는 파지 디스플레이 방법을 포함하는 당업계에 공지된 다양한 방법에 의해 제조될 수 있다. 또한 미국 특허 제4,444,887호 및 제4,716,111호; 및 PCT 출원 WO 98/46645, WO 98/50433, WO 98/24893, WO 98/16654, WO 96/34096, WO 96/33735, 및 WO 91/10741와 같고, 이들 모두는 그 전체가 본 발명에 참고로 인용되어 있다.
인간 항체는 또한 기능적 내인성 면역글로불린을 발현할 수 없지만 인간 면역글로불린 유전자를 발현할 수 있는 형질전환 마우스를 사용하여 생산될 수 있다. 예를 들어, 인간 중쇄 및 경쇄 면역글로불린 유전자 복합체는 무작위로 또는 상동 재조합에 의해 마우스 배아 줄기세포에 도입될 수 있다. 대신에, 인간 가변 영역, 불변 영역 및 다양성 영역이 인간 중쇄 및 경쇄 유전자에 더하여 마우스 배아 줄기세포에 도입될 수 있다. 마우스 중쇄 및 경쇄 면역글로불린 유전자는 상동 재조합에 의한 인간 면역글로불린 유전자 좌의 도입과는 별도로 또는 동시에 비-기능성이 될 수 있다. 특히, JH 영역의 동형 접합체 결실은 내인성 항체 생산을 방지한다. 변형된 배아 줄기세포가 확장되고 배반포로 미량주사되어 키메라 마우스를 생산한다. 키메라 마우스는 인간 항체를 발현하는 동형 접합 자손을 생산하기 위해 자란다. 형질전환 마우스는 정상적인 방식으로 선택된 항원, 예를 들어 원하는 표적 폴리펩티드의 전부 또는 일부로 면역화된다. 항원에 대한 단일클론항체는 통상적인 하이브리도마 기술을 사용하여 면역화된 형질전환 마우스로부터 수득될 수 있다. 형질전환 마우스가 보유하고 있는 인간 면역글로불린 형질도입 유전자는 B 세포 분화 과정에서 재배열되며, 클래스 전환 및 체세포 돌연변이를 겪는다. 따라서, 이러한 기술을 사용하여, 치료적으로 유용한 IgG, IgA, IgM 및 IgE 항체를 생산하는 것이 가능하다. 인간 항체 생산을 위한 이 기술의 개요는 Lonberg 및 HuszarInt. Rev. Immunol. 73:65-93 (1995)에 기재되어있다. 인간 항체 및 인간 단일클론항체를 생산하는 기술 및 이러한 항체를 생산하기 위한 프로토콜에 대한 상세한 설명은 예를 들어 PCT 출원 WO 98/24893; WO 96/34096; WO 96/33735; 미국 특허 제5,413,923호; 제5,625,126호; 제5,633,425호; 제5,569,825호; 제5,661,016호; 제5,545,806호; 제5,814,318호; 및 제5,939,598호와 같고, 이들 모두는 그 전체가 본 발명에 참고로 인용되어 있다.
선택된 에피토프를 인식하는 완전 인간 항체는 또한 "유도 선별법"이라는 기술을 사용하여 생성될 수 있다. 이 접근에서 선택된 비인간 단일클론항체, 예를 들어, 마우스 항체는 동일한 에피토프를 인식하는 완전한 인간 항체의 선택을 유도하기위해 사용된다(Jesperset al., Bio/Technology 72:899-903 (1988). U.S. Patent No. 5,565,332, 참조. 그 전체가 본 발명에 참고로 인용되어 있다.).
또 다른 구현예에서, 원하는 단일클론항체를 암호화하는 DNA는 통상적인 절차를 사용하여 용이하게 분리되고 시퀀싱될 수 있다(예를 들어, 쥐 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용함). 분리 및 서브클로닝된 하이브리도마 세포는 상기 DNA의 바람직한 공급원으로서 작용한다. 일단 분리되면, DNA는 발현 벡터에 위치할 수 있고, 면역글로불린을 생산하지 않는 E. coli 세포, 원숭이 COS 세포, 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포 또는 골수종 세포와 같은 원핵 또는 진핵 숙주 세포로 형질주입된다. 보다 구체적으로, 분리된 DNA(본 발명에 기술된 바와 같이 합성된)는 그 전체가 본 발명에 참고로 인용된 1995년 1월 25일에 출원한 Newman et al., 미국 특허 제5,658,570호에 기술된 바와 같이, 항체에 대한 불변 영역 및 가변 영역 서열을 클로닝하는데 사용될 수 있다. 근본적으로, 이것은 선택된 세포로부터의 RNA 추출, cDNA로의 전환 및 Ig 특이적 프라이머를 사용하는 PCR에 의한 증폭을 수반한다. 또한 이 목적을 위한 적절한 프라이머는 미국 특허 제5,658,570호에 기재되어 있다. 하기에서 더 상세히 논의되는 바와 같이, 원하는 항체를 발현하는 형질전환된 세포는 면역글로불린의 임상적 및 상업적 공급을 위해 상대적으로 대량으로 자랄 수 있다.
또한, 통상적인 재조합 DNA 기술을 사용하여, 본 발명의 항원-결합 폴리펩티드의 CDR 중 하나 이상이 프레임워크 영역, 예를 들어 인간 프레임워크 영역에 삽입되어 비인간 항체를 인간화할 수 있다. 프레임워크 영역은 자연 발생 또는 컨센서스 프레임워크 영역 및 바람직하게는 인간 프레임워크 영역일 수 있다(예를 들어, 인간 프레임워크 영역의 리스팅에 대해서는 Chothiaet al.,J. Mol. Biol. 278:457-479 (1998) 참조). 바람직하게는, 프레임워크 영역과 CDR의 조합에 의해 생성된 폴리뉴클레오티드는 원하는 폴리펩티드의 적어도 하나의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체, 예를 들어, LIGHT를 코딩한다. 바람직하게는, 프레임워크 영역 내에서 하나 이상의 아미노산 치환이 이루어질 수 있으며, 바람직하게는 아미노산 치환은 이의 항원과 그 항체의 결합을 개선시킨다. 추가적으로, 이러한 방법은 하나 이상의 사슬 내 이황화 결합이 없는 항체 분자를 생성하기 위해 사슬 내 이황화 결합에 참여하는 하나 이상의 가변 영역 시스테인 잔기의 아미노산 치환 또는 결실을 만드는 데 사용될 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 다른 변형은 본 발명 및 기술 분야의 기술 범위 내에 포함된다.
또한, 적절한 생물학적 활성의 인간 항체 분자로부터의 유전자와 함께 마우스 항체 분자로부터 유전자를 스플라이싱함으로써 적절한 항원 특이성의 "키메라 항체"의 생산을 위해 개발된 기술(Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA:851-855 (1984); Neuberger et al., Nature 372:604-608 (1984); Takeda et al., Nature 314:452-454 (1985))이 사용될 수 있다. 본 발명에서 사용된 바와 같이, 키메라 항체는 예를 들어, 마우스 단일클론항체로부터 유래된 가변 영역 및 인간 면역글로불린 불변 영역을 갖는 것과 같이 상이한 부분이 상이한 동물 종으로부터 유래된 분자이다.
하지만, 재조합 항체를 생성하기 위한 고효율 수단이 Newman, Biotechnology 10 : 1455-1460 (1992)에 개시되어 있다. 특히, 이 기술은 원숭이 가변 영역 및 인간 불변 서열을 포함하는 영장류 항체의 생성을 야기한다. 이 참고 문헌은 그 전체가 본원에 참고로 인용되어있다. 또한 이 기술은 본 출원인에게 양도된 미국 특허 제5,002,943호, 제5,693,780호 및 제5,756,096호에 기술되어있고, 이들 각각은 본원에 참고로 인용된다.
대신에, 항체 생산 세포주는 당업자에게 공지된 기술을 사용하여 선택 및 배양될 수 있다. 이러한 기술은 다양한 실험실 매뉴얼 및 기본 발행물에 설명되어 있다. 이와 관련하여, 하기 기술된 바와 같은 개시에서의 사용에 적합한 기술은 Current Protocols in Immunology, Coliganet al., Eds., Green Publishing Associates and Wiley-Interscience, John Wiley and Sons, New York (1991)에 개시되어 있고, 보충물을 포함하여, 그 전체가 참고로 본 발명에 인용된다.
또한, 당업자에게 공지된 표준 기술을 사용하여 본 발명의 항체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 돌연변이를 도입할 수 있는데, 이에 한정되는 것은 아니지만, 아미노산 치환을 야기하는 부위 특이적 돌연변이 예를 들어, 유발 및 PCR 매개 돌연변이 유발을 포함한다. 바람직하게는, 변이체(유도체 포함)는 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, 가변 경쇄 영역, CDR-L1, CDR-L2 또는 CDR-L3에 비해 50 개 미만의 아미노산 치환, 40 개 미만의 아미노산 치환, 30 개 미만의 아미노산 치환, 25 개 미만의 아미노산 치환, 20 개 미만의 아미노산 치환, 15 개 미만의 아미노산 치환, 10 개 미만의 아미노산 치환, 5 개 미만의 아미노산 치환, 4 개 미만의 아미노산 치환, 3 개 미만의 아미노산 치환, 또는 2 개 미만의 아미노산 치환을 코딩한다. 대신에, 돌연변이는 포화 돌연변이 유발과 같이 코딩 서열의 전부 또는 일부를 따라 무작위로 도입될 수 있고, 생성된 돌연변이체는 활성을 보유하는 돌연변이체를 동정하기 위해 생물학적 활성에 대해 스크리닝될 수 있다.
암 치료
본 발명에 기재된 바와 같이, 본 발명의 항체, 변이체 또는 유도체는 특정 치료 및 진단 방법에 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명에 기재된 하나 이상의 장애 또는 상태를 치료하기 위해 동물, 포유동물 및 인간과 같은 환자에게 본 발명의 항체를 투여하는 것을 포함하는 항체-기반 요법에 관한 것이다. 본 발명의 치료 화합물은 본 발명(본 발명에 기재된 바와 같은 그의 변이체 및 유도체를 포함하는)의 항체 및 본 발명(본 발명에 기재된 바와 같은 그의 변이체 및 유도체를 포함하는)의 항체를 코딩하는 핵산 또는 폴리뉴클레오티드를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 항체는 또한 암 치료 또는 억제에 사용될 수 있다. PD-1은 종양 세포에서 과발현될 수 있다. 종양 유도 PD-1은 면역 세포 상의 PD-L1에 결합하여 항 종양 T 세포 면역을 제한할 수 있다. 마우스 종양 모델에서 PD-1을 표적으로 하는 소분자 억제제 또는 단일 클론 항체를 사용한 결과는 표적화된 PD-1 치료가 종양 성장의 효과적인 제어에 대한 중요한 대안 및 현실적인 접근법임을 나타낸다. 실험예에서 입증된 바와 같이, 항 -PD-1 항체는 적응 면역 반응 시스템을 활성화시켜 암 환자의 생존율을 향상시킬 수 있다.
따라서, 일 구현예에서, 이를 필요로 하는 환자에서 암을 치료하는 방법이 제공된다. 일 구현예에서, 본 방법은 유효량의 본 발명의 항체를 환자에게 투여하는 것을 수반한다. 일 구현예에서, 환자의 암세포(예를 들어, 기질 세포) 중 적어도 하나는 PD-1을 발현, 과발현 또는 발현하기 위해 유도된다. 예를 들어, PD-1 발현 유도는 종양 백신 또는 방사선 요법의 투여에 의해 수행될 수 있다.
PD-1 단백질을 발현하는 종양은 방광암, 비소세포 폐암, 신장암, 유방암, 요도암, 결장암, 두경부암, 편평세포암, 메르켈 세포 암종, 위장암, 위암, 식도암, 난소암, 신장암 및 소세포 폐암을 포함한다. 따라서, 현재 개시된 항체는 임의의 하나 이상의 암을 치료하는데 사용될 수 있다.
키메라 항원 수용체(CAR) T- 세포 요법과 같은 세포 치료법 또한 본 발명에서 제공된다. 본 발명의 항 -PD-1 항체와 접촉시킨(또는 선택적으로 본 발명의 항 -PD-1 항체를 발현하도록 조작된) 적합한 세포를 사용할 수 있다. 이러한 접촉 또는 조작시, 세포는 치료가 필요한 암 환자에게 도입될 수 있다. 암 환자는 본 발명에 개시된 바와 같은 유형의 암을 가질 수 있다. 예를 들어, 세포(예를 들어, T 세포)는 종양 침윤 T 림프구, CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, 또는 이들의 조합일 수 있으나, 제한되지 않는다.
일 구현예에서, 세포는 암환자 본인으로부터 분리된다. 일 구현예에서, 세포는 기증자 또는 세포 은행에 의해 제공된다. 세포가 암환자에서 분리될 때, 원하지 않는 면역 반응을 최소화할 수 있다.
본 발명의 항체 또는 이의 변형체 또는 이의 유도체로 치료, 예방, 진단 및/또는 예측될 수 있는, 증가된 세포 생존과 관련된 추가적인 질병 또는 상태는 악성 종양의 증식 및/또는 전이, 및 백혈병과 같은 질환(예를 들어, 급성 림프구성 백혈병, 소아 급성 백혈병(골수아구성, 전골수구성, 골수단핵구성, 단핵구성, 및 적백혈병을 포함하는)), 및 만성 백혈병(예를 들어, 만성 골수성(과립구성) 백혈병 및 만성 림프구성 백혈병)), 진성 적혈구 증가증, 림프종(예를 들어, 호지킨병 및 비-호지킨병), 다발성 골수종, 왈덴스트룀 마크로글로불린혈증, 중쇄병, 및 섬유육종, 점액육종, 지방육종, 연골육종, 골육종, 척색종, 혈관육종, 내피종, 림프관육종, 림프관내피종, 활막종, 악성중피종, 유잉 육종, 평활근육종, 횡문근육종, 결장암, 췌장암, 유방암, 갑상선암, 자궁내막암, 흑색종, 전립선암, 난소암, 전립선암, 편평상피암, 기저세포암, 땀샘암, 피지선암, 유두암, 유선암, 낭선암, 수질암, 기관지원성암, 신장세포암, 간암, 담도암, 융모막암, 정상피종, 태생기암, 빌름스 종양, 자궁경부암, 고환암, 폐암, 소세포 폐암, 방광암, 상피암, 신경교종, 별아교세포종, 수모세포종, 두개인두종, 뇌실막세포종, 송과체부종양, 혈관모세포종, 청신경종, 핍지교종, 수막종, 흑색종, 신경모세포종 및 망막모세포종과 같은 육종 및 암종을 포함하나 이에 한정되지 않는 고형암을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
감염 및 면역 질환 치료
실험예에서 입증된 바와 같이, 본 발명의 항체는 감염을 치료하는데 유용한 면역 반응을 활성화시킬 수 있다.
감염은 질병 유발 인자, 이들의 증식 및 이들 유기체와 그들이 생산하는 독소에 대한 숙주 조직의 반응에 의한 유기체의 체내 조직의 침입이다. 감염은 바이러스, 비로이드, 프리온, 박테리아, 췌장 회충 및 요충과 같은 선충류, 참진드기, 진드기, 머릿니와 같은 절지동물류, 백선과 같은 곰팡이, 및 촌충 및 다른 기생충과 같은 대형기생충과 같은 감염 물질에 의해 발생할 수 있다. 일 측면에서, 감염원은 그람 음성 박테리아와 같은 박테리아이다. 일 측면에서, 감염원은 DNA 바이러스, RNA 바이러스 및 역전사 바이러스와 같은 바이러스이다. 바이러스의 비-제한적인 예는 아데노바 바이러스, 콕삭키 바이러스, 엡스타인-바 바이러스, A형 간염 바이러스, B형 간염 바이러스, C형 간염 바이러스, 1형 단순 헤르페스 바이러스, 2형 단순 헤르페스 바이러스, 거대세포 바이러스, 8형 인간 헤르페스 바이러스, HIV, 인플루엔자 바이러스, 홍역 바이러스, 유행성이하선염 바이러스, 인유두종 바이러스, 파라인플루엔자 바이러스, 폴리오바이러스, 광견병 바이러스, 호흡기 세포 융합 바이러스, 풍진 바이러스, 수두-대상포진 바이러스를 포함한다.
또한 일 구현예에서, 면역 질환의 치료를 위한 항체 또는 이의 단편의 방법 또는 용도이다. 면역질환의 비-제한적인 예는 감염, 감염과 관련된 내독소 쇼크, 관절염, 류마티스성 관절염, 천식, COPD, 골반 염증성 질환, 알츠하이머병, 염증성 장질환, 크론병, 궤양성 대장염, 페이로니병(Peyronie's Disease), 만성 소화장애증, 담석증, 모소의 질병, 복막염, 건선, 혈관염, 수술 유착, 뇌졸중, I 형 당뇨병, 라임병, 관절염, 뇌수막염, 자가 면역 포도막염, 중추 및 말초 신경계의 면역 매개 염증 장애, 다발성 경화증, 루푸스 및 길랑-바르 증후군, 아토피성 피부염, 자가 면역 간염, 섬유성 폐렴, 그레이브병, IgA 신장병증, 특발성 혈소판 감소 자반증, 메니에르병, 천포창, 원발성 담즙성 경변증, 사르코이드종, 피부경화증, 베게너 육아종증, 췌장염, 정신적 외상, 이식 편대 숙주 질환, 이식 거부반응, 허혈성 질환, 심근경색, 죽상동맥경화증, 혈관 내 응고, 골 흡수, 골다공증, 골관절염, 치주염, 위산저하증 및 태아-모성 내성 결여와 관련된 불임을 포함한다.
본 발명의 항체는 미생물을 표적화함으로써 미생물에 의해 야기되는 감염 질환을 치료하거나, 미생물을 제거할 수 있다. 일 측면에서, 미생물은 RNA 및 DNA 바이러스를 포함하는 바이러스, 그람 양성 박테리아, 그람 음성 박테리아, 원생 동물 또는 곰팡이이다.
임의의 특정 환자에 대한 특정 투여량 및 치료 요법은 사용된 특정 항체, 이의 변형 또는 유도체, 환자의 연령, 체중, 일반적인 건강, 성 및 식이 및 투여 시간, 배설율, 약물 조합 및 치료되는 특정 질병의 중증도를 포함하는 다양한 인자에 의존될 것이다. 의료 종사자에 의한 상기 인자의 판단은 당업자에게 자명하다. 양은 또한 치료할 개별 환자, 투여 경로, 제제의 유형, 사용된 화합물의 특성, 질병의 중증도 및 원하는 효과에 의존할 것이다. 사용된 양은 당업계에 공지된 약리학적 및 약동학적 원리에 의해 결정될 수 있다.
항체, 변이체의 투여 방법은 피부 내, 근육 내, 복강 내, 정맥 내, 피하, 비내, 경막 외 및 구강 경로를 포함하지만 이에 한정되지는 않는다. 항원-결합 폴리펩티드 또는 조성물은 임의의 편리한 경로, 예를 들어, 주입 또는 볼루스 주사, 상피 또는 점막피부 조직(예를 들어, 구강 점막, 직장 및 장 점막 등)을 통한 흡수에 의해 투여될 수 있고, 다른 생물학적 활성제와 함께 투여될 수 있다. 따라서, 본 발명의 항원-결합 폴리펩티드를 함유하는 약학적 조성물은 경구, 직장 내, 비경구, 낭 내, 질 내, 복강 내, 국부(파우더, 연고, 물약, 경피 패치로), 구강, 또는 경구 또는 비강 분무로 투여될 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어 "비경구"는 정맥 내, 근육 내, 복강 내, 흉부 내, 피하 및 관절 내 주사 및 주입을 포함하는 투여 방식을 의미한다.
투여는 전신적 또는 국부적일 수 있다. 또한, 뇌실 내 및 척수강 내 주사를 포함하는 임의의 적합한 경로에 의해 본 발명의 항체를 중추 신경계에 도입하는 것이 바람직할 수 있다; 예를 들어, 심실 내 주입은 Ommaya 저장조와 같은 저장조가 부착된 심실 내 카테터에 의해 가능해질 수 있다. 또한 폐 투여는 예를 들어 흡입기 또는 분무기의 사용 및 에어로졸제 제형을 쓸 수 있다.
본 발명의 항체 폴리펩티드 또는 조성물을 치료가 필요한 영역에 국소적으로 투여하는 것이 바람직할 수 있다; 이것은 예를 들어 수술 중 국소 주입, 예를 들어 수술 후 상처 드레싱과 함께 국소 적용, 주사에 의해, 카테터에 의해, 좌제에 의해 또는 실라스틱 멤브레인 또는 섬유와 같은 멤브레인을 포함하는 다공성, 비-다공성 또는 젤라틴성 물질인 주입 수단에 의해 달성될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 본 발명의 항체를 포함하는 단백질을 투여할 때, 단백질이 흡수되지 않는 물질을 사용하도록 주의해야 한다.
또 다른 구현예에서, 항체 또는 조성물은 소포, 특히 리포솜으로 전달될 수 있다(Langer, 1990, Science 249:1527-1533; Treat et al., in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein and Fidler (eds.), Liss, New York, pp. 353-365 (1989); Lopez-Berestein, ibid., pp. 317-327; 일반적으로 같은 내용 참조.).
또 다른 구현예에서, 항원-결합 폴리펩티드 또는 조성물은 제어 방출 시스템으로 전달될 수 있다. 일 구현예에서, 펌프가 사용될 수 있다(Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201; Buchwald et al., 1980, Surgery 88:507; Saudeket al., 1989, N. Engl. J. Med. 321:574). 일 구현예에서, 고분자 물질이 사용될 수 있다(Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Fla. (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley, New York (1984); Ranger and Peppas, J., 1983, Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61; Levy et al., 1985, Science 228:190; During et al., 1989, Ann. Neurol. 25:351; Howard et al., 1989, J. Neurosurg. 71:105 참조). 또 다른 구현예에서, 제어 방출 시스템은 치료 표적, 즉 뇌에 근접하여 배치될 수 있으므로, 전신 투여량의 일부만을 필요로 한다(예를 들어, Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, pp. 115-138 (1984)). 다른 제어 방출 시스템은 Langer(1990, Science 249 : 1527-1533)의 리뷰에서 논의되었다.
특정 구현예에서 본 발명의 조성물이 단백질을 코딩하는 핵산 또는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 경우, 핵산은 적절한 핵산 발현 벡터의 일부로서 핵산을 구축하고, 그것이 세포 내에 있도록 투여함으로써, 예를 들어 레트로바이러스 벡터(U.S. Pat. No. 4,980,286)의 사용에 의해, 직접 주입함으로써, 또는 미립자 충격법(예를 들어, 유전자 총; Biolistic, Dupont) 또는 지질 또는 세포 표면 수용체 또는 형질감염 제제를 사용함으로써, 또는 핵 등에 들어가는 것으로 알려진 호메오 박스- 유사 펩티드와 결합된 것을 투여함으로써, 등에 의해 생체 내에서 그 암호화된 단백질의 발현을 촉진시키기 위해 투여될 수 있다. 대신에, 핵산은 세포 내로 도입되고, 상동 재조합에 의해 발현을 위해 숙주세포 DNA에 포함될 수 있다.
염증성, 면역성 또는 악성 질환, 장애 또는 상태의 치료, 억제 및 예방에 효과적인 본 발명의 항체의 양은 표준 임상 기술에 의해 결정될 수 있다. 또한, 시험관 분석은 최적의 투여량 범위를 확인하는 것을 돕기 위해 선택적으로 사용될 수 있다. 또한 제제에 사용되는 정확한 투여량은 투여 경로 및 질병, 장애 또는 상태의 심각성에 의존할 것이고, 의사의 판단과 각 환자의 상황에 따라 결정되어야 한다. 유효량은 시험관 내 또는 동물모델 시험 시스템에서 유도된 용량-반응 곡선으로부터 추론될 수 있다.
일반적인 제안으로서, 본 발명의 항원-결합 폴리펩티드가 환자에게 투여되는 투여량은 환자의 체중에 대해 0.1 mg/kg 내지 100 mg/kg, 환자의 체중에 대해 0.1 mg/kg 내지 20 mg/kg, 또는 환자의 체중에 대해 1 mg/kg 내지 10 mg/kg이다. 일반적으로, 인간 항체는 이종 폴리펩티드에 대한 면역 반응으로 인하여 다른 종으로부터의 항체보다 인체 내에서보다 긴 반감기를 갖는다. 따라서, 인간 항체의 보다 낮은 투여량 및 덜 빈번한 투여가 종종 가능하다. 또한, 본 발명의 항체의 투여량 및 빈도는 예를 들어 지질화와 같은 변형에 의해 항체의 흡수 및 조직 침투(예를 들어, 뇌 내로의 침투)를 증가시킴으로써 감소될 수 있다.
본 발명의 항체, 변이체 또는 이의 유도체의 투여를 포함하는 전염성 또는 악성 질환, 상태 또는 장애의 치료 방법은 통상적으로 인체에서 사용하기 전 원하는 치료 또는 예방 활성을 위해 시험관 내에서, 그리고 나서 수용 가능한 동물 모델의 생체 내에서 시험된다. 형질전환 동물을 포함하는 적합한 동물 모델은 당업자에게 잘 알려져 있다. 예를 들어, 본 발명에 기재된 항원-결합 폴리펩타이드의 치료적 유용성을 입증하기 위한 시험관 내 분석은 세포주 또는 환자 조직 샘플에 대한 항원-결합 폴리펩티드의 효과를 포함한다. 세포주 및/또는 조직 샘플에 대한 항원-결합 폴리펩티드의 효과는 본원의 다른 곳에서 개시된 분석과 같은 당업자에게 공지된 기술을 이용하여 결정될 수 있다. 본 발명에 따르면, 특정 항원-결합 폴리펩티드의 투여가 지시되는지 여부를 결정하는데 사용될 수 있는 시험관 내 분석에는 환자 조직 샘플이 배양물에서 성장하고 화합물에 노출되거나 다른 방식으로 투여되는 시험 관내 세포 배양 분석이 포함되고, 이와 같은 화합물이 조직 샘플에 미치는 영향이 관찰된다.
예를 들어, 리포좀 내 캡슐화, 미세입자, 미세캡슐, 화합물을 발현할 수 있는 재조합 세포, 수용체-매개 내포작용(Wu and Wu, 1987, J. Biol. Chem. 262:4429-4432), 레트로 바이러스 또는 기타 벡터의 일부로서 핵산의 구조 등과 같은 다양한 전달 시스템이 공지되어 있으며, 본 발명의 항체 또는 본 발명의 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 투여하는데 사용될 수 있다.
진단방법
PD-1의 과발현은 특정 종양 샘플에서 관찰되며, PD-1 과발현 세포를 갖는 환자는 본 발명의 항 -PD-1 항체로의 치료에 반응할 가능성이 있다. 따라서, 본 발명의 항체는 또한 진단 및 예후 목적으로 사용될 수 있다.
바람직하게는 세포를 포함하는 샘플은 암 환자 또는 진단을 원하는 환자로부터 수득될 수 있다. 세포는 종양 조직 또는 종양 블록의 세포, 혈액 샘플, 소변 샘플 또는 환자의 임의의 샘플일 수 있다. 샘플의 선택적인 전처리 시, 샘플은 항체가 샘플에 잠재적으로 존재하는 PD-1 단백질과 상호작용할 수 있는 조건하에 본 발명의 항체와 배양될 수 있다. 샘플에서 PD-1 단백질의 존재를 검출하기 위해 항-PD-1 항체를 이용하여 ELISA와 같은 방법을 사용할 수 있다. 샘플에서 PD-1 단백질의 존재(양 또는 농도에 선택적으로)는 환자가 항체 치료에 적합하다는 표시 또는 환자가 암 치료에 반응했다(또는 반응하지 않았다.)는 표시로서 암의 진단에 사용될 수 있다. 예후 방법의 경우, 치료의 진행을 나타내기 위해 암 치료를 개시할 때, 특정 단계에서 즉시, 2 회 또는 그 이상으로 검출이 수행될 수 있다.
조성물
본 발명은 또한 약학적 조성물을 제공한다. 이러한 조성물은 항체의 유효량 및 허용가능한 담체를 포함한다. 일 구현예에서, 조성물은 제2 항암제(예를 들어, 면역 체크포인트 억제제)를 추가로 포함한다.
특정 구현예에서, 용어 "약학적으로 허용 가능한"은 연방 또는 주정부의 규제 당국에 의해 승인되거나, 동물, 특히 인간에서의 사용을 위해 미국 약전 또는 기타 일반적으로 인정되는 약전에 기재된 것을 의미한다. 또한, "약학적으로 허용되는 담체"는 일반적으로 임의의 유형의 비독성 고체, 반고체 또는 액체 충진제, 희석제, 캡슐화 물질 또는 제형 보조제일 것이다.
용어 "담체"는 치료제가 투여되는 희석제, 보조제, 부형제 또는 비히클을 의미한다. 이러한 약학적 담체는 물 및 오일과 같은 무균 액체일 수 있으며, 석유 또는 땅콩유, 대두유, 광유, 참기름 등과 같은 동물성, 식물성 또는 합성 유래의 것일 수 있다. 물은 약학적 조성물이 정맥 내 투여될 때 바람직한 담체이다. 식염수 및 수용성 덱스트로스 및 글리세롤 용액은 또한 특히 주사 가능한 용액을 위한 액체 담체로서 사용될 수 있다. 적합한 약학적 부형제는 전분, 포도당, 락토오스, 수 크로스, 젤라틴, 맥아, 쌀, 밀가루, 초크, 실리카겔, 스테아르산나트륨, 글리세롤 모노스테아레이트, 활석, 염화나트륨, 건조 탈지유, 글리세롤, 프로필렌글리콜, 같은 것을 포함한다. 조성물은 필요하다면, 또한 아세트산염, 시트르산염 또는 인산염과 같은 습윤 또는 유화제, 또는 pH 완충제를 소량 포함할 수 있다. 항균제, 예컨대 벤질알콜 또는 메틸파라벤; 아스코르브산 또는 아황산수소나트륨과 같은 항산화제; 에틸렌디아민테트라 아세트산과 같은 킬레이트제; 및 염화나트륨 또는 덱 스트로스와 같은 장력 조절제도 또한 구상된다. 이러한 조성물은 용액, 현탁액, 유제, 정제, 환제, 캡슐, 분말, 서방형 제형 등의 형태를 취할 수 있다. 상기 조성물은 전통적인 결합제 및 트리글리세라이드와 같은 담체와 함께 좌제로서 제제화될 수 있다. 경구용 제제는 약학적 등급의 만니톨, 락토오스, 전분, 마그네슘 스테아 레이트, 나트륨 사카린, 셀룰로오스, 탄산마그네슘 등과 같은 표준 담체를 포함할 수 있다. 적합한 약학적 담체의 예는 E. W. Martin에 의한 Remington 's Pharmaceutical Sciences에 기재되어 있으며, 본 발명에 참조로 인용된다. 이러한 조성물은 치료적 유효량의 항원 - 결합 폴리펩티드, 바람직하게는 정제된 형태를 적절한 양의 담체와 함께 함유하여 환자에게 적절한 투여 형태로 제공될 것이다. 제형은 투여 방식에 적합해야 한다. 보조제는 앰플, 일회용 주사기 또는 유리 또는 플라스틱으로 제조된 다중 용량 약병으로 포장될 수 있다.
일 구현예에서, 조성물은 인간에게 정맥 투여용으로 적합한 약학적 조성물로서 통상적인 절차에 따라 제형화된다. 일반적으로, 정맥 내 투여용 조성물은 무균 등장성 수용성 완충액 중의 용액이다. 필요한 경우, 조성물은 또한 주입 부위에서 통증을 완화시키기 위해 용해제 및 리그노카인과 같은 국소 마취제를 포함할 수 있다. 일반적으로, 성분은 개별적으로 공급되거나, 활성제의 양을 나타내는 앰플 또는 사셋과 같은 밀봉된 용기에서 동결건조 분말 또는 무수 농축물과 같은 단위 투약 형태로 함께 혼합된다. 조성물을 주입에 의해 투여하는 경우, 멸균 약학적 등급의 물 또는 식염수를 함유하는 주입병에 분배될 수 있다. 조성물을 주사로 투여하는 경우, 투여하기 전에 성분을 혼합할 수 있도록 주사용 멸균수 또는 식염수의 앰플을 제공할 수 있다.
본 발명의 화합물은 중성 또는 염 형태로 제제화될 수 있다. 약학적으로 허용되는 염은 염화수소, 인산, 아세트산, 옥살산, 타르타르산 등으로부터 유래된 것과 같은 음이온으로 형성된 염 및 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘, 수산화3가철, 이소프로필아민, 트리네틸아민, 2-에틸아미노 에탄올, 히스티딘, 프로카인 등에서 유래된 것과 같은 양이온으로 형성된 염을 포함한다.
실시예 1: 인간 PD-1에 대한 인간 단일클론항체의 생성
전장 인간 PD-1 cDNA의 클로닝
인간 T 림프구를 MACS 비드(MiltenyiBiotec)로 인간 말초 혈액 단핵세포(PBMC)로부터 분리하였다. RNeasy 미니 키트(QIAGEN)를 사용하여 인간의 T 세포에서 총 RNA를 추출하고 역전사 PCR(SuperScript First-Strand Synthesis System, Invitrogen)에 의해 cDNA를 얻었다. 인간 T 세포 mRNA로부터 센스 프라이머(5'-CTGTCTAGAATGCAGATCCCACAGGCGCC, 서열번호 47) 및 안티센스 프라이머(5'-GGATCCTCAGAGGGGCCAAGAGCAGT, 서열번호 48)를 사용하여 RT-PCR에 의해 hPD-1을 코딩하는 전장 cDNA를 생성시켰다. 서열은 DNA 시퀀싱에 의해 확인되었고 NCBI 데이터베이스(NM-005018.2)와 비교하였다.
hPD-1 안정 발현 세포주 확립 : XbaI 및 BamHI로 소화시킨 후 hPD-1 PCR 단편을 pcDNA3.1(-) 벡터 (Invitrogen)에 클로닝하였다. 그 다음, pcDNA-hPD-1 전장 플라스미드를 리포펙타민 2000(Invitrogen)을 사용하여 중국 햄스터 난소(CHO) 세포에 형질감염시켰다. hPD-1(CHO / hPD-1)을 안정하게 발현하는 세포주를 G418에 의해 선택하고 유세포 분석으로 스크리닝하였다.
인간 PD-1 Ig 융합 단백질의 생산 : hPD-1의 세포외 도메인을 함유하는 hPD-1mIg 및 hPD-1hIg 융합 단백질의 cDNA를 특이적 프라이머에 의해 pcDNA-hPD-1 전장으로부터 PCR을 통해 증폭시켰다. EcoR I 및 Bgl II로 절단된 PCR 단편은 발현 플라스미드 pmIgG 내의 마우스 IgG2a 중쇄 또는 발현 플라스미드 phIgG 내의 인간 IgG1 중쇄의 CH2-CH3 도메인에 융합시켰다(H Dong et al., Nat Med. 1999; 5 : 1365-1369). 배양 상층액 중의 단백질은 단백질 A 세파로즈 컬럼(HiTrap Protein A HP, GE healthcare)으로 정제하였다. 정제된 단백질을 SDA-PAGE 전기영동으로 확인하였다.
단일클론항체의 생성 : 8-10 주령의 암컷 Balb/c 마우스를 100μg의 hPD-1mIg 융합 단백질 및 완전프로인트보강제(CFA)(Sigma-Aldrich)를 포함하는 200μl의 에멀젼으로 여러 부위에 피하(s.c.) 면역시켰다. 3주 후, 마우스는 불완전프로인트보강제(IFA)(Sigma-Aldrich)와 함께 50-100g의 단백질로 s.c.에 의해 총 3회 면역화시켰다. 마우스는 혈청 역가 테스트를 위해 각 면역 2 주 후에 출혈시켰다. 역가가 충분하면, 복강 내 주사(i.p.)를 통해 PBS 중의 60μg의 단백질로 마우스를 부스팅시켰다. 하이브리도마는 면역화된 마우스 비장세포 및 SP2/0-Ag14 골수종 세포주(ATCC로 부터)를 융합시켜 수득하였다. 부스트된 마우스를 이산화탄소로 희생시키고 비장을 수확하였다. 전체 비장을 단일 세포 현탁액으로 분리하고 적혈구를 ACK 완충액으로 용해시켰다. SP2/0-Ag14 골수종 세포와 비장세포를 50ml 코니칼 원심분리 튜브에서 1:1 비율로 혼합하였다. 원심분리 후, 상등액을 버리고 세포 융합이 50% 폴리에틸렌글리콜(Roche)과 함께 수행되었다. 융합된 세포를 HAT 선택 배지에서 8-10일 동안 배양하고, 하이브리도마 배양 상등액을 고수율 형질감염 및 스크리닝 시스템(S Yao et al. Immunity. 2011; 34(5):729-40)으로 hPD-1 발현 세포에 대한 결합에 대해 스크리닝하고, 양성 클론을 유세포 분석을 통해 확인하였다. 양성 하이브리도마의 서브 클로닝은 한계 희석 기술을 사용하여 순수한 단일클론성 배양을 달성하기 위해 적어도 5회 수행하였다.
실시예 2 : PD-1 단일클론항체의 특징
MAb의 이소타입 : 마우스 면역글로불틴(Immunoglobutin) 이소타이핑 키트(BD Biosciences)를 사용하여 단일클론항체의 이소타입을 동정하였다. 5개의 PD-1 mAb는 모두 IgG1 이소타입 및 ĸ 사슬로 확인되었다.
항-hPD-1의 결합 특이성 : 표면 상에 hPD-1(CHO/hPD-1)을 발현하는 CHO 세포를 유세포 분석에 의한 PD-1mAbs의 특이성을 측정하는데 사용하였다. CHO/hPD-1 세포를 항-PD-1 mAb와 얼음 상에서 배양하였다. 배양 후, 세포를 세척하고 항-mIgG-APC(eBiosciences)와 함께 추가 배양하였다. 유세포 분석은 FACSVerse(BD Biosciences)를 사용하여 수행되었다. 이 데이터는 5 개의 hPD-1 mAb가 모두 hPD-1에 높은 특이성으로 결합함을 보여준다(도 1). hPD-1 mAb가 다른 단백질에 결합할 가능성을 배제하기 위해, hB7-1, hPD-L1, hB7-H3, hB7-H4, hCD137 또는 다른 단백질 분자로 형질감염시킨 CHO 세포를 유세포 분석을 통해 항 hPD-1 단일클론항체로 염색하였다. 이 세포들은 또한 양성 대조군으로서 각각의 양성 항체로 각각 염색되었다. 상기 데이터는 항-PD-1 단일클론항체가 이들 시험된 단백질에 결합하지 않음을 입증하였다(도 2).
종 교차 반응성 : 항-hPD-1mAbs의 종 특이성을 평가하기 위해, 게잡이 원숭이(Guangdong landau Biotechnology Company로부터)의 말초 혈액 단핵세포(PBMC)는 Ficoll(Sigma-Aldrich)를 써서 말초 혈액으로부터 분리되었다. PBMC를 10 % FCS를 함유하는 RPMI 1640 배지에 현탁시키고 1 μg/ml의 항-hCD3을 미리 코팅한 24 웰 플레이트에 넣었다. 세포는 이틀 동안 배양되었다. 먼저 세포를 항-hPD-1으로 염색하였다. 세척 후, 세포를 항-mIgG-APC 및 CD3-FITC로 염색하였다; 유세포 분석을 위한 CD8-PerCP.추가로, 마우스 PD-1에 대한 단일클론항체의 교차 반응성을 마우스 PD-1으로 형질감염된 CHO 세포(CHO/mPD-1)를 사용하여 유세포 분석을 통해 측정하였다.
상기 데이터는 항-hPD-1mAb가 인간 및 게잡이 원숭이의 T 세포 모두에서 PD-1 단백질에 결합할 수 있음을 보여주었으나 마우스 PD-1에는 교차 결합이 발견되지 않았다(도 3).
리간드 차단 : 리간드 결합의 차단을 조사하기 위해, 100 ng의 hPD1hIg 융합 단백질을 표시된 단일클론항체(400, 300, 200, 100, 50 ng/10 μl) 또는 대조 Ig와 함께 4 ℃에서 30분 동안 전배양하였고, 그 다음 CHO/hB7-H1 세포를 염색하는데 사용하였다. 세포를 세척하고 염소 항-hIgG-APC로 추가 염색하였다. 블로킹 효과는 유세포 분석으로 평가하였다.
상기 데이터는 항-hPD-1mAbs 1 및 2(Ab1 및 Ab2)가 리간드 차단에 영향을 미치지 않는다는 것을 입증하였다. Ab3, Ab4 및 Ab5는 hPD-L1에 hPD-1 융합 단백질이 농도 의존적으로 결합하는 것을 차단할 수 있다(도 4).
경쟁적 결합 분석 : 경쟁적 결합 분석은 상기 mAb가 hPD-1 단백질의 동일하거나 상이한 결합 부위를 인식하는지를 조사하기 위해 수행되었다. CHO/hPD-1 세포를 5 개의 PD-1 mAb 과량(10μg)과 함께 각각 4 ℃에서 30 분간 전배양하였다. 세척 후, 세포를 4 ℃에서 20 분 동안 50 ng의 다른 비오틴 표지된 단일클론항체로 배양하였다. mAb의 결합 효과는 유세포 분석을 사용하여 측정되었다.
유세포 분석에 따르면 Ab4와 Ab5는 hPD-1 단백질에 대한 각각의 다른 결합을 완전하게 방해하고, Ab3의 포화 농도는 Ab4와 Ab5 결합에 부분적으로 차단 효과가 있었, Ab1 및 Ab2는 hPD-1에 대한 Ab4 및 Ab5의 결합에 차단 효과를 나타내지 않았다(도 5). 따라서, Ab4 및 Ab5에 대한 PD-1상의 결합 부위는 중첩될 수 있다. Ab1 또는 Ab2 및 Ab4 또는 Ab5는 상이한 인터페이스를 통해 PD-1에 결합하며, 이는 또한 리간드 차단 시험에 의해 입증된다.
실시예 3 : 항-PD-1 항체 생산 하이브리도마 및 항체 인간화의 시퀀싱
항-PD-1 항체 생산 하이브리도마의 서열 분석 : 1 × 107 하이브리도마 세포를 수확하고 PBS로 세척하였다. 메신저 RNA는 RAeasy 미니 키트(Qiagen)를 사용하여 하이브리도마에서 추출하였다. RACE-Ready 제1가닥 cDNA는 SMARTer RACE cDNA 증폭 키트(Clontech)를 사용하여 합성하였다. 역전사 후, 5 'RACE PCR 반응은 레디(ready) cDNA를 주형으로 하여 키트에 의해 제공되는 5' 유니버셜 프라이머(UPM) 및 마우스 IgG1 중쇄 가변 영역 및 κ 경쇄 유전자 서열에 의해 설계된 3' 유전자 특이적 프라이머(GSP1)로 수행하였다. RACE 생성물은 겔 전기영동 분석에 의해 결정되었다(도 6). PCR 생성물을 Zero Blunt TOPO PCR 클로닝 키트(Invitrogen)를 사용하여 T 벡터에 클로닝하였다. 형질전환 후, 플라스미드는 서열 분석에 의해 확인되었다. 항체 유전자 단편은 VBASE2(http://www.vbase2.org)를 사용하여 분석하였다. 서열은 표 2에 개시되어있다.
설치류 항체의 서열
이름 (서열번호 ) 서열 (밑줄이 그어진 굵은 글씨는 CDR)
Murine Ab2 VH (19) SQVQLQQSGAELARPGASVKMSCKAS GYTFTSYT MHWVKQRPGQGLEWIGY INPTTGYT N
YNQKFKDKANPTTGYTNYNQKFKDKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYC ARDDAY
YSGY WGQGTTLTVSS
Murine Ab2 VH (20) TCCCAGGTCCAGCTGCAGCAGTCTGGGGCTGAACTGGCAAGACCTGGGGCCTCAGTGAAG
ATGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTTACTAGTTACACGATGCACTGGGTAAAACAG
AGGCCTGGACAGGGTCTGGAATGGATTGGATACATTAATCCTACTACTGGTTATACTAAT
TACAATCAGAAGTTCAAGGACAAGGCCACATTGACTGCAGACAAATCCTCCAGCACAGCC
TACATGCAATTGAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTACTGTGCAAGAGAT
GATGCTTACTACTCGGGCTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA
Murine Ab2 VK (21) DIQMTQSPASLSVSVGETVTITCRAS ENIYSNL AWYRQKQGKSPQLLVY AAK NLADGVPS
RFSGSGSGTQYSLKINSLQSEDFGSYYC QHFWGTPWT FGGGTKLEIKR
Murine Ab2 VK (22) GACATCCAGATGACTCAGTCTCCAGCCTCCCTATCTGTATCTGTGGGAGAAACTGTCACC
ATCACATGTCGAGCAAGTGAGAATATTTACAGTAATTTAGCATGGTATCGGCAGAAACAG
GGAAAATCTCCTCAGCTCCTGGTCTATGCTGCAAAAAACTTAGCAGATGGTGTGCCATCA
AGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGCACACAGTATTCCCTCAAGATCAACAGCCTGCAGTCT
GAAGATTTTGGGAGTTATTACTGTCAACATTTTTGGGGTACTCCGTGGACGTTCGGTGGA
GGCACCAAGCTGGAAATCAAACGG
Murine Ab3 VH (23) VQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAAS GFAFSSYD MSWVRQTPEKRLVWVAY ITIGGGTT YYS
DTVKRLVWVAYITIGGGTTYYSDTVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTAMYYC ARH
RYDYFAMDN WGHGTSVTVSS
Murine Ab3 VH (24) GAAGTGCAGCTGGTGGAGTCGGGGGGAGGCTTAGTGAAGCCTGGAGGGTCCCTGAAACTC
TCCTGTGCAGCCTCTGGATTCGCTTTCAGTAGCTATGACATGTCTTGGGTTCGCCAGACT
CCGGAGAAGAGGCTGGTGTGGGTCGCATACATTACTATTGGTGGTGGCACCACCTACTAT
TCAGACACTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAACACCCTGTAC
CTGCAAATGAGCAGTCTGAAGTCTGAGGACACAGCCATGTATTACTGTGCAAGACATAGG
TACGATTACTTCGCTATGGACAACTGGGGTCATGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA
Murine Ab3 VK (25) DIVLTQSPASLAVSLEHRATISCQAS ENVDNYGINF MNWFQHKPAQPPQLLIY VSS NLGS
GVPAKFSGSGSGTDFSLNIHPMEEDDTAMYFC QQSKDVPW TFSGGTKLEIKR
Murine Ab3 VK (26) GACATTGTGCTGACCCAATCTCCAGCTTCTTTGGCTGTGTCTCTAGAGCACAGGGCCACC
ATCTCCTGCCAAGCCAGCGAAAATGTTGATAATTATGGCATTAATTTTATGAACTGGTTC
CAACACAAACCAGCACAGCCACCCCAACTCCTCATCTATGTTTCATCCAACCTAGGATCC
GGGGTCCCTGCCAAGTTTAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGACTTCAGCCTCAACATCCAT
CCTATGGAAGAAGATGATACTGCAATGTATTTCTGTCAGCAAAGTAAGGACGTTCCGTGG
ACGTTCAGTGGAGGCACCAAACTGGAAATCAAACGG
Murine Ab4 VH (27) EVKLVESGGGLVQPGGSLKLSCAAS GFTFSSYT MSWIRQTPEKRLEWVAY ISHGGGDT YY
PDTVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTAMYYC ARHSGYERGYYYVMDY WGQGTSVT
VSS
Murine Ab4 VH (28) GAAGTGAAGTTGGTGGAGTCTGGGGGAGGTTTAGTGCAGCCTGGAGGGTCCCTGAAACTC
TCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTAGCTATACCATGTCTTGGATTCGCCAGACT
CCAGAGAAGAGGCTGGAGTGGGTCGCATACATTAGTCATGGTGGTGGTGACACCTACTAT
CCAGACACTGTAAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGGGACAATGCCAAGAACACCCTGTAC
CTGCAAATGAGCAGTCTGAAGTCTGAGGACACGGCCATGTATTACTGTGCAAGACATAGT
GGTTACGAGAGGGGATATTACTATGTTATGGATTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACC
GTCTCCTCA
Murine Ab4 VK (29) DIVLTQFPTSLAVSLGQRATISCRAS ESVDYYGFSF INWFQQKPGQPPKLLIY AAS NQGS
GVPARFGGSGSGTDFSLNIHPMEEDDTAMYFC QQSKEVPW TFGGGTKLEIK
Murine Ab4 VK (30) GACATTGTGCTGACCCAATTTCCAACTTCTTTGGCTGTGTCTCTAGGGCAGAGGGCCACC
ATCTCCTGCAGAGCCAGCGAAAGTGTTGATTACTATGGCTTTAGTTTTATAAACTGGTTC
CAACAGAAACCAGGACAGCCACCCAAACTCCTCATCTATGCTGCATCCAACCAGGGATCC
GGGGTCCCTGCCAGGTTTGGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCAGCCTCAACATCCAT
CCTATGGAGGAGGATGATACTGCAATGTATTTCTGTCAGCAAAGTAAGGAGGTTCCGTGG
ACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAACGG
삭제
삭제
재조합 항체의 단백질 발현 및 기능 결정 : 재조합 항체 서열의 정확성을 보장하기 위해, 재조합 항체 중쇄 및 경쇄의 전장 서열을 각각 pcDNA3.1 벡터에 클로닝하고 일시적으로 HEK 293T 세포에 형질감염시켰다. 세포 배양 상등액의 단백질은 기능 평가를 위해, 단백질 G 세파로스 컬럼(GE healthcare)으로 정제하였다.
세포측정(cytometry) 분석 데이터는 재조합 항체가 hPD-1 단백질에 결합할 수 있고 hPD-1 융합 단백질이 PD-L1 단백질에 결합하는 것을 차단할 수 있음을 보여준다(도 7, 패널 A, B).
항 인간 PD-1 항체 인간화 : 인간화는 항-hPD-1 하이브리도마의 가변 중쇄(VH) 및 가변 경쇄(VL) 서열에 기초하여 수행되었다. 일반적으로, 부모 마우스 VH 및 VL 서열 및 인간 IgG4-S228P 불변 영역 및 인간 κ 사슬로 구성된 마우스-인간 키메릭 mAb가 먼저 구성된다. 키메라 항체의 특성을 확인한 후, 3 개의 VL 및 3 개의 VL 인간화 서열을 설계하여 9 개의 인간화 항체를 제조하였다. 서열 목록은 표 3A 및 3B에 있다.
[표 3A] 키메라 항체(인간 IgG4-S228P 백본)
이름(서열번호 ) 서열 (밑줄이 그어진 굵은 글씨는 CDR)
Chimeric heavy chain (31) EVKLVESGGGLVQPGGSLKLSCAAS GFTFSSYT MSWIRQTPEKRLEWVAY ISHGGGDT YY
PDTVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTAMYYC ARHSGYERGYYYVMDY WGQGTSVT
VSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVL
QSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGG
PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFN
STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEE
MTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRW
QEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
Chimeric heavy chain (32) CGAAGTGAAGTTGGTGGAGTCTGGGGGAGGTTTAGTGCAGCCTGGAGGGTCCCTGAAACT
CTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTAGCTATACCATGTCTTGGATTCGCCAGAC
TCCAGAGAAGAGGCTGGAGTGGGTCGCATACATTAGTCATGGTGGTGGTGACACCTACTA
TCCAGACACTGTAAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGGGACAATGCCAAGAACACCCTGTA
CCTGCAAATGAGCAGTCTGAAGTCTGAGGACACGGCCATGTATTACTGTGCAAGACATAG
TGGTTACGAGAGGGGATATTACTATGTTATGGATTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCAC
CGTCTCCTCAGCTAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTTCCTCTCGCTCCCTGCAGCCGGAG
CACATCCGAGAGCACCGCTGCTCTGGGCTGTCTCGTGAAGGACTACTTCCCTGAACCCGT
CACCGTCAGCTGGAATAGCGGCGCCCTGACATCCGGCGTCCACACATTCCCCGCTGTCCT
GCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCTCCGTGGTCACCGTGCCTAGCAGCAGCCTGGG
AACAAAGACCTACACCTGCAACGTGGACCATAAGCCCTCCAACACCAAGGTGGACAAGCG
GGTGGAATCCAAGTATGGACCCCCCTGTCCTCCTTGCCCTGCTCCTGAATTTCTCGGAGG
CCCCTCCGTCTTCCTGTTTCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCTCCCGGACACC
CGAAGTCACCTGCGTCGTGGTGGATGTCAGCCAGGAAGATCCCGAGGTGCAGTTCAACTG
GTACGTGGACGGAGTGGAGGTGCATAACGCCAAAACCAAGCCCAGGGAAGAGCAGTTCAA
CAGCACCTATCGGGTCGTGTCCGTGCTCACCGTCCTGCATCAGGATTGGCTCAACGGCAA
GGAGTACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGGCCTGCCCTCCTCCATCGAGAAGACCATCTC
CAAGGCTAAGGGCCAACCTCGGGAGCCCCAAGTGTATACCCTCCCTCCCAGCCAGGAGGA
GATGACCAAGAATCAAGTGAGCCTGACCTGCCTCGTGAAGGGATTTTACCCCTCCGACAT
CGCTGTGGAATGGGAAAGCAATGGCCAACCTGAGAACAACTACAAGACCACACCCCCCGT
GCTGGACTCCGATGGCTCCTTCTTCCTGTACAGCAGGCTGACCGTGGACAAATCCCGGTG
GCAAGAGGGAAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCTCTCCACAACCACTACAC
CCAGAAGAGCCTCTCCCTGAGCCTCGGCAAGTAGTAA
Chimeric light chain (33) DIVLTQFPTSLAVSLGQRATISCRAS ESVDYYGFSF INWFQQKPGQPPKLLIY AAS NQGS
GVPARFGGSGSGTDFSLNIHPMEEDDTAMYFC QQSKEVPW TFGGGTKLEIKRTVAAPSVF
IFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQQDSKDSTYSL
TSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
Chimeric light chain (34) AGACATTGTGCTGACCCAATTTCCAACTTCTTTGGCTGTGTCTCTAGGGCAGAGGGCCAC
CATCTCCTGCAGAGCCAGCGAAAGTGTTGATTACTATGGCTTTAGTTTTATAAACTGGTT
CCAACAGAAACCAGGACAGCCACCCAAACTCCTCATCTATGCTGCATCCAACCAGGGATC
CGGGGTCCCTGCCAGGTTTGGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCAGCCTCAACATCCA
TCCTATGGAGGAGGATGATACTGCAATGTATTTCTGTCAGCAAAGTAAGGAGGTTCCGTG
GACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAGCGGACCGTGGCCGCCCCCAGCGTGTT
CATCTTCCCTCCCAGCGACGAGCAGCTGAAGTCTGGCACCGCCAGCGTGGTGTGCCTGCT
GAACAACTTCTACCCCCGCGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAACGCCCTGCAGAG
CGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCGAGCAACAGGACTCCAAGGACAGCACCTACAGCCT
GACCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGCGA
GGTGACCCACCAGGGACTGTCTAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGAGTGCTA
A
[표 3B] 인간화된 중쇄 및 경쇄 가변 영역
이름(서열번호 ) 서열 (밑줄이 그어진 굵은 글씨는 CDR)
VH 변이체 a (35) EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS GFTFSSYT MSWVRQAPGKGLEWVSY ISHGGGDT YY
ADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYC ARHSGYERGYYYVMDY WGQGTLVT
VSSA
VH 변이체 a (36) CGAAGTGCAGCTGGTGGAATCTGGCGGCGGACTGGTGCAGCCTGGCGGATCTCTGAGACT
GTCTTGTGCCGCCTCCGGCTTCACCTTCTCCAGCTACACCATGTCCTGGGTGCGACAGGC
TCCTGGCAAGGGCCTGGAATGGGTGTCCTACATCTCTCACGGCGGAGGCGACACCTACTA
CGCCGACTCTGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGGGACAACTCCAAGAACACCCTGTA
CCTGCAGATGAACTCCCTGCGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGTGCTCGGCACTC
TGGCTACGAGCGGGGCTACTACTACGTGATGGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTCGTGAC
CGTGTCATCTGCT
VH 변이체 b (37) EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS GFTFSSYT MSWVRQAPGKGLEWVSY ISHGGGDT YY
PDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYC ARHSGYERGYYYVMDY WGQGTLVT
VSS
VH 변이체 b (38) CGAAGTGCAGCTGGTGGAATCTGGCGGCGGACTGGTGCAGCCTGGCGGATCTCTGAGACT
GTCTTGTGCCGCCTCCGGCTTCACCTTCTCCAGCTACACCATGTCCTGGGTGCGACAGGC
TCCTGGCAAGGGCCTGGAATGGGTGTCCTACATCTCTCACGGCGGAGGCGACACCTACTA
CCCCGACTCTGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGGGACAACTCCAAGAACACCCTGTA
CCTGCAGATGAACTCCCTGCGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGTGCTCGGCACTC
TGGCTACGAGCGGGGCTACTACTACGTGATGGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTCGTGAC
CGTGTCATCTGCT
VH 변이체 c (39) EVKLLESGGGLVQPGGSLRLSCAAS GFTFSSYT MSWVRQAPGKGLEWVSY ISHGGGDT YY
PDSVKGRFTISRDNSKGGDTYYPDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYC AR
HSGYERGYYYVMDY WGKGTTVTVSSA
VH 변이체 c (40) GAAGTGAAGCTGCTGGAATCTGGCGGCGGACTGGTGCAGCCTGGCGGATCTCTGAGACTG
TCTTGTGCCGCCTCCGGCTTCACCTTCTCCAGCTACACCATGTCCTGGGTGCGACAGGCT
CCTGGCAAGGGCCTGGAATGGGTGTCCTACATCTCTCACGGCGGAGGCGACACCTACTAC
CCCGACTCTGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGGGACAACTCCAAGAACACCCTGTAC
CTGCAGATGAACTCCCTGCGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGTGCTCGGCACTCT
GGCTACGAGCGGGGCTACTACTACGTGATGGACTACTGGGGCAAGGGCACCACCGTGACC
GTGTCATCTGCT
VK 변이체 a (41) DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSS ESVDYYGFSF LNWFQQKPGQPPKLLIY AAS NRES
GVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYC QQSKEVPW TFGQGTKLEIKR
VK 변이체 a (42) AGACATCGTGATGACCCAGTCCCCCGACTCCCTGGCTGTGTCTCTGGGCGAGAGAGCCAC
CATCAACTGCAAGTCCTCCGAGTCCGTGGACTACTACGGCTTCTCCTTCCTGAACTGGTT
CCAGCAGAAGCCCGGCCAGCCCCCTAAGCTGCTGATCTACGCCGCCTCCAACCGCGAGTC
TGGCGTGCCCGATAGATTCTCCGGCTCTGGCTCTGGCACCGACTTTACCCTGACCATCAG
CTCCCTGCAGGCCGAGGATGTGGCCGTGTACTACTGCCAGCAGTCCAAAGAGGTGCCCTG
GACCTTCGGCCAGGGCACAAAGCTGGAAATCAAGCGG
VK 변이체 b (43) DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKAS ESVDYYGFSF LNWFQQKPGQPPKLLIY AAS NRES
GVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYC QQSKEVPW TFGQGTKLEIKR
VK 변이체 b (44) AGACATCGTGATGACCCAGTCCCCCGACTCCCTGGCTGTGTCTCTGGGCGAGAGAGCCAC
CATCAACTGCAAGGCCTCCGAGTCCGTGGACTACTACGGCTTCTCCTTCCTGAACTGGTT
CCAGCAGAAGCCCGGCCAGCCCCCTAAGCTGCTGATCTACGCCGCCTCCAACCGCGAGTC
TGGCGTGCCCGATAGATTCTCCGGCTCTGGCTCTGGCACCGACTTTACCCTGACCATCAG
CTCCCTGCAGGCCGAGGATGTGGCCGTGTACTACTGCCAGCAGTCCAAAGAGGTGCCCTG
GACCTTCGGCCAGGGCACAAAGCTGGAAATCAAGCGG
VK 변이체 c (45) DIQLTQSPDSLSVSLGERATINCKAS ESVDYYGFSF LNWFQQKPGQPPKLLIY AAS NRQS
GVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYFC QQSKEVPW TFGQGTKLEIKR
VK 변이체 c (46) GACATCCAGCTGACCCAGTCCCCCGACTCCCTGTCTGTGTCTCTGGGCGAGAGAGCCACC
ATCAACTGCAAGGCCTCCGAGTCCGTGGACTACTACGGCTTCTCCTTCCTGAACTGGTTC
CAGCAGAAGCCCGGCCAGCCCCCTAAGCTGCTGATCTACGCCGCCTCCAACCGCCAGTCT
GGCGTGCCCGATAGATTCTCCGGCTCTGGCTCTGGCACCGACTTTACCCTGACCATCAGC
TCCCTGCAGGCCGAGGATGTGGCCGTGTACTTCTGCCAGCAGTCCAAAGAGGTGCCCTGG
ACCTTCGGCCAGGGCACAAAGCTGGAAATCAAGCGG
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실시예 4 : 인간화 항체의 특징 및 기능
인간화 항체의 결합능 : CHO/hPD-1 세포를 연속 희석된 단일클론항체와 함께 배양하였다. PD-1 단백질에 대한 9 개의 인간화 항체의 결합 효과를 유세포 분석을 사용하여 평가하고, 키메라 모항체와 비교하였다.
유세포 분석 결과는 일부 돌연변이 조합의 결합 활성은 모항체보다 높다는 것을 보여준다; 일부는 모항체와 동일하거나 약간 낮다(도 8). 돌연변이 조합은 하기 표 4에 열거되어있다.
Figure 112022017788717-pat00008
인간화 항체의 차단능 : hPD-L1에 대한 hPD-1의 결합을 차단하는 인간화 항체의 능력을 측정하였다. 100 ng의 hPD1mIg를 4 ℃에서 30 분 동안 10 μl의 PBS 내의에서 인간화된 항체의 다른 농도와 함께 미리 배양한 다음 CHO/hB7-H1 세포를 염색하는데 사용하였다. 세포를 세척하고 염소 항 mIgG-APC로 더 염색 하였다. 차단 효과는 유세포 분석으로 평가하였다. 유사한 방법을 사용하여, 인간화 항체가 hPD-L2에 대한 hPD-1의 결합을 차단하는 능력을 측정하였다.
상기 결과는 CHO/hPD-L1 세포에 대한 hPD-1mIg의 결합은 모든 인간화 항체에 의해 농도 의존적으로 억제됨을 보여준다. 일부 돌연변이 조합은 키메라 모항체보다 높은 차단 능력을 가졌다(도 9). 또한 결과는 CHO/hPD-L2 세포에 대한 hPD-1mIg의 결합도 차단되었음을 보여준다(도 10).
인간화 항체의 결합 친화도 및 반응속도 결정 : hPD-1 단백질과 상호작용하는 인간화 PD-1 mAb의 결합 친화도 및 반응속도는 Biacore T100으로 평가하였다. hPD-1mIg 단백질은 아민 커플링에 의해 센서칩 CM5 상에 고정화되었다. 여과된 인간화 항체를 HBS-EP 완충액 pH7.4(GE Healthcare Life Sciences)로 희석하고, 그 후 hPD-1mIg-고정화된 표면에 주입하였다. 9 개의 다른 농도는 각 샘플에 대해 시험되어졌다. 구체적인 결합 반응속도 파라미터(결합속도, Ka, 해리속도, Kd 및 친화성 상수, KD)는 완전 반응속도 분석에 의해 결정될 수 있다.
분석 데이터는 돌연변이 조합과 키메릭 모항체 사이의 결합 속도(Ka)에는 현저한 차이가 없음을 보여준다. 세 개의 돌연변이 조합(3, 6, 9)은 해리 속도(Kd)에서 키메라 모항체와 유사했다. 모든 인간화 항체는 낮은 나노몰 범위(10-10M)의 KD 값과 강한 친화성을 가지고 있다. 두 돌연변이 조합(3, 6) KD 값은 키메라 모항체에 가깝다(9.89 × 10-11M)(표 4).
[표 4]
인간화 항체의 결합 친화력 및 반응속도 결정
Figure 112022017788717-pat00009
시험관 내에서 PD-L1 양성 종양 세포를 죽이는 allo CD8 + CTL에 대한 항 PD-1의 증강 효과 : 항-PD-1 항체의 항암 기전에 기초하여, 이 실시예는 인간 동종 CD8+ 세포독성 림프구(allo CD8+CTL)에 의한 종양 세포 사멸에 대한 항-PD-1 항체의 증강 효과를 결정하기 위해 시험관 내 모델을 설계하였다. 먼저, CD8+ 림프구는 인간 PBMC로부터 분리되었고, allo CD8+ 세포 CTL을 생산하기 위해 방사선 조사된 인간 흑색종으로 형질감염된 hB7-1 세포(624 Mel/B7-1)를 함께 배양하였다. 그 후 allo CD8+CTL 세포를 96-웰 플레이트에서 밤새 배양된 624 Mel/hPD-L1 종양 세포와 함께 인간화 항체 또는 대조군 Ig의 존재 하에 5 일 동안 공동 배양하였다. 플레이트 웰 내의 세포를 0.5 % 크리스탈 바이올렛으로 염색하고 플레이트를 540nm에서 ELISA 판독기로 판독하였다. 사멸 활성은 종양 세포의 생존율에 기초하여 계산하였다.
Figure 112022017788717-pat00010
결과는 몇몇 돌연변이 조합이 시험관 내에서 종양 세포를 죽이는 allo CTL 세포의 능력을 향상시킬 수 있음을 보여준다(도 11).
최적의 돌연변이 조합 세트(변이체 3)를 선택하고 단백질 코딩 서열을 적절한 발현 벡터에 클로닝하였으며, TY101로 또한 언급된 항-hPD-1 항체를 생산하기 위해 CHO 세포로 옮겨졌다.
실시예 5 : 암 면역치료에서 TY101의 특징
PBMC에서 사이토카인-증강된 혼합 림프구 반응(MRL). 건강한 개인의 인간 말초 혈액 단핵세포(PBMCs)는 Ficoll-Hypaque를 사용하여 밀도 구배 원심 분리로 분리되었다. 건강한 공여자 1의 PBMC 자극 세포로서 40Gy의 선량의 X-선이 조사되었다. T 림프구는 반응 세포로서 건강한 공여자 2에서 인간의 Pan T 세포 분리 키트(MiltenylBiotec)로 분리되었다. 반응 세포 및 자극 세포는 10 % FCS를 함유하는 완전한 RPMI 배지에 재현탁되었고, TY101 또는 hIgG 대조군의 연속 희석 하에서 96 웰 플레이트에 웰 당 2.5 x 105 개의 반응 세포 및 1.25 x 105 자극 세포(R/S=2)를 시딩하였다. 세포는 5 % CO2의 가습된 배양기에서 37 ℃에서 5 일 동안 배양하였다. T 세포의 증식 활성은 5 일째에 세포 계수 키트-8(Dojindo Molecular Technologies, Inc)에 의해 평가되었다. 사이토카인을 검출하기 위해, 배양 상등액을 3 일 및 5 일에 수집하였다. 사이토카인 분석은 인간 Th1/Th2/Th17 세포측정(cytometry) 비드 어레이 키트(CBA, BD Biosciences)를 사용하여 수행되었다.
결과는 TY101에 대한 T 세포 증식 반응이 hIgG와 유사함을 입증하였다(도 12). 흥미롭게도, 사이토카인 IL-2 및 IFN 생산은 TY101과 함께 투여된 MLR의 배양 상등액에서 hIgG와 비교하여 유의하게 증가하였다(도 13).
T 림프구에서 PD-1의 발현 차단. 종양 세포에서 PD-L1의 발현은 종양 미세 환경 및 PD-1 의존성 면역 억제에서 종양 침윤성 림프구(TIL)에 대한 PD-1 발현을 유도할 수 있다. 이 실시예는 TY101이 hPD-L1 형질감염된 종양 세포와 함께 배양 시 인간 림프구에서 hPD-1 발현을 억제할 수 있는지 결정하기 위한 시험관 내 모델을 설계하였다. 인간 PBMC로부터 분리된 인간 T 림프구를 10μg/ml TY101 또는 대조군 IgG의 존재 하에서 4 일 동안 인간 흑색종 형질감염된 hPD-L1(624/hPD-L1) 세포와 배양하였다. 림프구에 대한 hPD-1의 발현은 유세포 분석에 의해 검출되었다.
결과는 림프구에 대한 PD-1의 발현은 배지 단독 및 hIgG 대조군에 비해 TY101의 첨가에 의해 완전히 억제되었음을 입증하였다(도 14).
인간화된 PD-1 항체의 생체 내 항종양 활성 : TY101의 생체 내 항종양 효과가 조사되었다. 8 주 령의 암컷 PD-1 넉-인 마우스(Shanghai Model Organisms Centre, Inc.에서 구입)는 0 일 째 우측 측면에 MC38 형질주입된 hPD-L1(MC38/hPD-L1) 종양 세포(1×106/마우스)가 피하 주입되었다. TY101 또는 대조군 Ig는 6 일, 9 일 및 13 일에 i.p. 주사를 통해 투여되었다(10mg/kg). 종양의 크기와 생존율을 관찰하였다.
모든 동물들은 처음에 검출 가능한 종양(6 일에 4-5mm)을 가지고 있었다. 그러나 TY101로 MC38/hPD-L1 종양을 갖는 마우스를 처리한 후, 100 %의 마우스에서 완전한 반응이 나타났다. TY101로 치료한 5 마리 쥐의 종양은 모두 25 일째 완전히 퇴화되었다. 이와 대조적으로, 대조군 IgG를 처리한 5 마리의 마우스 중 2 마리는 계속해서 성장하는 종양이 발달되었다. 대조군 IgG를 처리한 또 다른 3 마리의 마우스에서, 32 일째에 종양이 퇴화되었지만, 2 마리의 마우스의 종양은 곧 재발되었다(도 15). 이 결과는 TY101이 생체 내에서 항종양 효능을 향상시킬 수 있음을 나타낸다.
실시예 6 : 상업적 PD-1 항체에 대한 TY101의 기능 비교
이 실시예는 TY101과 비교하기 위해 암 환자의 임상 치료를 위해 현재 승인된 두 개의 항 hPD-1 항체를 선택하였다: Merck의 Keytruda(pembrolizumab)와 Bristol-Myers Squibb의 Opdivo(nivolumab).
항체 결합 친화도 및 반응속도 : TY101의 친화도 및 반응속도는 Biacore T200 기기(GE Healthcare Life Sciences)를 사용하여 분석되었고, 2 개의 상업용 항체와 비교되었다. hPD-1mIg 단백질은 센서칩 CM5에 저농도(33RU)로 고정화되었으며, 항체는 분석물(이동상)로서 상호작용을 검출한다. 데이터는 3 가지 항체의 결합 속도 Ka가 현저하게 상이하지 않음을 보여준다. TY101은 시판중인 항체보다 약간 낮다. TY101의 해리 속도 Kd는 2 개의 상업용 항체보다 10 배 느리고, TY101의 친화도 KD는 상업용 항체보다 4-7 배 더 강하다. 이 결과는 TY101이 강한 결합을 나타내는 것을 나타낸다(도 16).
PD-1/PD-L1 차단에서 PD-1 항체의 비교 : PD-1/PD-L1 차단 분석은 PD-1/PD-L1 Blockade Bioassays Kit(Promega)를 사용하여 분석하였다. 1×105 세포/웰의 Jurkat-PD1 세포는 TY101, Pembrolizumab, Nivolumab 또는 음성 대조군 Ctrl hIgG4의 연속희석(0-30 μg/ml)의 존재 하에서 5 시간 동안 불투명 96 웰 TC 플레이트에서 밤새도록-배양된 CHO-PD-L1 세포(배양은 5×104 세포/웰로 시작)로 자극되었다. 배양 5 시간 후, Jurkat-PD-1 세포 활성은 SpectraMAX L 루미노미터에서 상대 광 단위(RLU)에 대해 ONE-Glo 기질(Promega)로 루시퍼라제 활성을 측정하여 검출되었다.
분석 데이터는 TY101 및 2 개의 상업용 항체가 PD-1/PD-L1 경로를 차단할 수 있음을 보여준다. TY101의 차단 효과는 Pembrolizumab의 차단 효과와 비슷하며 Nivolumab의 차단 효과보다 우수하다(도 17).
시험관 내에서 종양 세포 성장의 억제 효과 비교 : 전술한 바와 같이, allo CD8+CTL 세포는 다른 단일클론항체 및 대조군 IgG의 존재 하에서 96 웰 플레이트에서 밤새도록 배양된 624 Mel/PD-L1 종양 세포와 함께 5 일 동안 공동 배양되었다. 세포는 0.5 % 크리스탈 바이올렛으로 염색되었고, 플레이트는 540nm에서 ELISA 판독기로 판독되었다. 사멸 활성은 종양 세포의 생존율에 기초하여 계산하였다.
이 결과는 세 가지 항-PD-1 mAbs 모두 allo CD8+CTL의 종양 사멸 능력을 향상시킬 수 있음을 보여준다. TY101의 증강 효과는 두 가지 상업용 항체의 사멸 능력보다 높았다(도 18).
실시예 7 : TY101을 위한 클론 개발 및 그 활성
TY101의 서열은 독점적 발현 벡터에 클로닝되었고, CHO 세포를 형질감염시켰다. 단일클론 세포주는 ClonePix 및/또는 한계 희석법을 사용하여 확립되었다. 다중 클론은 확립되었고, 3 개의 클론(TY101-01-09, TY101-04-T3-05 및 TY101-4G1)에 의해 생성된 항체가 특징지어졌다.
hPD-1 또는 mPD-1 단백질에 대한 항체 결합 시험(ELISA)
hPD-1에 대한 항체의 결합 및 mPD-1 단백질에 대한 교차 반응을 ELISA로 시험하였다. 시험 항체의 연속 희석을 1 μg/ml hPD-1 또는 mPD-1로 미리-코팅된 ELISA 플레이트에 첨가하였다. 이어서, HRP 접합된 염소 항-인간 IgG 또는 염소 항-마우스 IgG 항체를 첨가하였으며, 뒤이어 기질 테트라메틸벤지딘(TZB)을 첨가하여, SpectraMax Plus 384 마이크로 플레이트 판독기(Molecular Device, LLC., Sunnyvale, CA)로 450nm 파장에서 정량하였다. 시험된 TY101 클론인 TY101-01-09, TY101-04-T3-05 및 TY101-4G1은 0.01-0.15nM 범위에서 EC50을 가지며 hPD-1 단백질에 대한 우수한 결합을 나타냈다. 항체는 mPD-1 단백질에 대한 결합을 나타내지 않았다(도 19).
hPD-1 및 cPD-1 발현 CHOK1 세포에 결합하는 항체 결합 시험(유세포 분석)
hPD-1에 대한 항체의 결합 및 게잡이 원숭이 PD-1(cPD-1)에 대한 교차 반응성을 hPD-1 또는 cPD-1 발현 CHOK1 세포를 사용하여 유세포 분석을 통해 시험하였다. CHOK1-hPD-1, CHOK1-cPD-1 및 CHOK1 블랭크 세포를 시험 물질의 연속 희석액과 함께 배양한 후 Alexa Fluor® 488 접합 염소 항 인간 IgG(H+L) 항체와 함께 배양하고 FACSCanto II를 사용하여 분석하였다(BD Biosciences, San Jose, CA). 시험된 TY101 클론 TY101-01-09, TY101-04-T3-05 및 TY101-4G1은 나노몰농도보다 적은 EC50을 가진 CHOK1-hPD-1 및 한자릿 수 나노몰농도 EC50을 가진 CHOK1-cPD-1 세포에 좋은 결합을 보였다(도 20).
hPD-1/hPD-L1 또는 hPD-1/hPD-L2 결합에서 항체 차단 활성 시험(유세포 분석)
이 항체들은 hPD-1/hPD-L1 뿐만 아니라 hPD-1/hPD-L2 결합을 차단하는 능력에 대해 추가적으로 시험되었는데, 이는 암 환자 치료에서 잠재적인 효과를 위한 열쇠가 될 것이다. CHOK1-hPD-1 세포를 Biotin-hPD-L1 또는 Biotin-hPD-L2와 혼합된 시험 물질의 연속 희석액과 함께 배양하였다. 이어서, 세포를 Alexa 488로 표지된 스트렙타비딘과 함께 배양하고 FACSCanto II를 사용하여 분석하였다. 항-hPD-1 항체 TY101-01-09, TY101-04-T3-05 및 TY101-4G1은 1.15-1.47nM IC50으로 hPD-L1-발현 CHOK1 세포에 대한 hPD-L1의 결합을 차단하였다. 그것들은 또한 1.52-2.33nM IC50으로 hPD-1-발현 CHOK1 세포에 hPD-L2 결합을 차단했다(도 21).
T 세포에 대한 항체의 효과를 시험하기 위한 인간 백혈구혼합배양반응(MLR) 분석
T 세포 기능에 대한 상기 항체의 효과를 2 명의 공여자로부터 분리된 T 세포와 함께 인간 MLR 분석에서 시험하였다. 부착성 PBMC(주로 단핵구; 공여자 1로부터 분리하고 세포 배양용 접시에 부착되도록 함)를 100 ng/mL의 재조합 인간(rh) GM-CSF 및 50 ng/mL의 rhIL-4의 존재 하에서 5 일 동안 배양하고, 절반 부피의 배지를 3 일 후에 교체하였고, 6 일째에 1 μg/ml의 LPS를 첨가하였다. 7 일째에, 결과 세포(주로 성숙한 DC)를 수확하고 마이토마이신 C로 처리하였다. CD3+ T 세포는 EasySep™ 인간 T 세포 분리 키트(negative selection, STEMCELL Technologies)에 의해 기증자 2 및 3으로부터 분리되었다. DC 및 T 세포를 3 가지 농도(5, 0.5, 0.05㎍ / ml)의 시험 항체 존재 하에서 5 일 동안 공동배양하였다. 상등액은 IL-2 농도를 결정하기 위해 3 일 후, IFN-γ 농도를 결정하기 위해 5 일 후 수확(100 μL)하였다. 항-hPD-1 항체 TY101-01-09, TY101-04-T3-05 및 TY101-4G1은 이소타입 대조군 hIgG4와 비교했을 때 두 기증자 모두로부터의 세포에 의한 IL-2 및 IFN-γ의 분비를 농도 의존적인 방식으로 촉진시켰다(도 22).
T 세포에 대한 항체의 효과를 시험하기 위한 조작된 종양 세포-인간 T 세포 공동배양 분석
T 세포 기능에 대한 상기 항체의 효과가 또한 4 명의 상이한 공여자로부터 분리된 T 세포를 사용하여 조작된 종양 세포-인간 T 세포 공동-배양 분석에서 시험되었다. CD3+ T 세포는 EasySep ™ 인간 T 세포 분리 키트에 의해 4 명의 공여자의 PBMC로부터 분리되었다. hPD-L1뿐만 아니라 OS8(anti-CD3 single chain variable fragment(scFv))을 안정적으로 발현하도록 조작된 Hep3B 세포(KCLB, catalog #:88064)인 조작된 종양 세포 Hep3B-OS8-hPDL1은 마이토마이신 C로 처리되었고, CD3+ T 세포와 함께 3 가지 농도(5, 0.5, 0.05 μg/ml)의 시험 항체 존재 하에서 3일 간 배양되었으며, 배양 상등액을 IFN-γ 농도를 결정하기 위해 수확했다. 항-hPD-1 항체 TY101-01-09, TY101-04-T3-05 및 TY101-4G1은 이소타입 대조군 hIgG4와 비교하여 용량 의존적 방식으로 4 명의 모든 공여자로부터의 세포에 의한 IFN-γ 분비를 촉진시켰다(도 23).
실시예 8. TY101 클론은 FDA 승인된 항-hPD-1 항체와 비교하여 더 우수한 결합 친화력을 나타냈다.
항체 에피토프 겹침을 시험하기 위한 경쟁적 ELISA
상기 항체가 FDA 승인된 항-hPD-1 항체인 Nivolumab 또는 Pembrolizumab과 동일한 에피토프에 결합하는지 여부는 경쟁적 ELISA 분석으로 시험되었다. 경쟁 항체 및 Biotin-hPD-1의 연속 희석액을 시험 항체 1 μg/ml로 미리 코팅된 ELISA 플레이트에 첨가하였다. HRP 접합된 스트렙타비딘을 첨가한 후, 기질 TMB를 첨가하고, 파장 450 nm에서 SpectraMax Plus 384 마이크로 플레이트 판독기로 정량하였다. 항-hPD-1 항체 TY101-01-09, TY101-04-T3-05 및 TY101-4G1은 hPD-1에 대한 서로의 결합을 거의 완벽하게 차단하였으며, 상기 항체들이 유사한 에피토프를 공유한다는 것을 시사한다. 3 가지 항체는 또한 Nivolumab과 Pembrolizumab의 hPD-1에 대한 결합을 거의 완전히 차단(93 % ~ 94 %)한 반면, Nivolumab과 Pembrolizumab은 hPD-1에 대한 항체의 결합을 부분적으로 차단(Nivolumab의 경우 77 % ~ 78 %, Pembrolizumab의 경우 46 % ~ 49 %)하였다. 상기 데이터는 TY101-01-09, TY101-04-T3-05 및 TY101-4G1 항체는 Nivolumab 및 Pembrolizumab과는 다른 에피토프에 결합하며, 그들은 Nivolumab과 Pembrolizumab보다 hPD-1에 더 높은 친화성을 가질 수 있음을 시사한다(도 24).
SPR에 의해 결정된 hPD-1에 대한 시험 항체의 결합 친화도
hPD-1에 대한 결합 친화도의 정확한 측정을 위해, 항체 TY101-01-09, TY101-04-T3-05 및 TY101-4G1 뿐만 아니라 Nivolumab 및 Pembrolizumab이 SPR로 분석되었다. 인간 PD-1 ECD 단백질은 플로우 셀 3에서의 낮은 고정화 수준(60 RU에서) 및 플로우 셀 4에서의 높은 고정화 수준(960 RU)을 달성하기 위하여 상이한 길이의 시간 동안 CM5 센서칩에 고정화되었다. 연속 희석된(0, 1.5625, 3.125, 6.25, 12.5, 25 및 50 nM) 항체를 플로우 셀에 주입하였다. 결합 시간은 180 초였고, 해리 시간은 600 초(Nivolumab 및 Pembrolizumab의 경우) 또는 1500 초(TY101-01-09, TY101-04-T3-05 및 TY101-4G1의 경우)였다. 샘플의 신호에서 기준(플로우 셀 1)과 농도 0의 신호를 모두 뺀 후, 결합 반응속도는 Biacore T200 평가 소프트웨어 버전 1.0 및 곡선 맞춤을 위한 1:1 결합 모델을 사용하여 계산되었다. hPD-1에 대한 대조군 인간 IgG4의 결합은 없었다. hPD-1의 낮은 고정화 농도(~ 60 RU; 표 3, 도 23)로부터의 데이터에 기초하여, 항 -hPD-1 항체 TY101-01-09, TY101-04-T3-05 및 TY101-4G1에 의한 인간 PD-1에 대한 결합 속도는 Nivolumab 및 Pembrolizumab보다 낮았다(2 ~ 4배). 상기 3 가지 항체의 인간 PD-1으로부터의 해리 속도는 Nivolumab 및 Pembrolizumab의 것보다 12 내지 30 배 더 느렸고, 결과적으로 그것들의 친화도는 Nivolumab과 Pembrolizumab보다 4-8 배 더 나았다(KD가 낮으면 친화성이 좋으며, 그 반대의 경우도 마찬가지임; 표 3). 또한 항-hPD-1 항체 TY101-01-09, TY101-04-T3-05 및 TY101-4G1 대 hPD-1의 결합 친화도는 hPD-1의 높은 고정화 수준에서 시험되었다. 항체 TY101-01-09, TY101-04-T3-05 및 TY101-4G1은 1500s의 해리시간 후에도 관찰된 최소 해리와 함께 매우 느린 해리율을 보였다(도 23). 이 데이터는 TY101-01-09, TY101-04-T3-05 및 TY101-4G1의 결합 친화도가 주로 느린 해리 속도 때문에 Nivolumab과 Pembrolizumab보다 좋았다는 것을 제안한다(도 25).
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본 발명은 설명된 특정 실시예에 의해 그 범위가 제한되지 않으며, 이는 발명의 개별적인 측면의 단일예로서 의도되고, 기능적으로 동등한 임의의 구성 또는 방법은 본 발명의 범위 내에 있다. 본 발명의 사상 또는 범위를 벗어나지 않고 본 발명의 방법 및 조성물에서 다양한 변형 및 변화가 이루어질 수 있음은 당업자에게 명백할 것이다. 따라서, 본 발명은 첨부된 청구항 및 그 등가물의 범위 내에 있는 경우 본 발명의 변경 및 변형을 포함하는 것으로 의도된다.
본 발명에서 언급된 모든 간행물 및 특허 출원은 본 발명에 각각의 간행물 또는 특허 출원이 구체적으로 및 개별적으로 참조로 포함되는 것으로 표시되더라도, 동일한 범위로 참고로 인용된다.
<110> TAYU HUAXIA Biotech Medical Group Co., Ltd. <120> ANTI-PD-1 ANTIBODIES AND USES THEREOF <130> ESP1V190787XN-JW/CNTYHX/GG-KR <140> PCT/CN2018/073383 <141> 2018-01-19 <150> 2017100461482 <151> 2017-01-20 <160> 48 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 1 Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Thr 1 5 <210> 2 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 2 Ile Ser His Gly Gly Gly Asp Thr 1 5 <210> 3 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 3 Ala Arg His Ser Gly Tyr Glu Arg Gly Tyr Tyr Tyr Val Met Asp Tyr 1 5 10 15 <210> 4 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 4 Glu Ser Val Asp Tyr Tyr Gly Phe Ser Phe 1 5 10 <210> 5 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4) <223> X is a space filler, not requiring an amino acid <400> 5 Ala Ala Ser Xaa 1 <210> 6 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial 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accgcgagtc 180 tggcgtgccc gatagattct ccggctctgg ctctggcacc gactttaccc tgaccatcag 240 ctccctgcag gccgaggatg tggccgtgta ctactgccag cagtccaaag aggtgccctg 300 gaccttcggc cagggcacaa agctggaaat caagcgg 337 <210> 43 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 43 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ala Ser Glu Ser Val Asp Tyr Tyr 20 25 30 Gly Phe Ser Phe Leu Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 65 70 75 80 Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Lys 85 90 95 Glu Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 110 <210> 44 <211> 337 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 44 agacatcgtg atgacccagt cccccgactc cctggctgtg tctctgggcg agagagccac 60 catcaactgc aaggcctccg agtccgtgga ctactacggc ttctccttcc tgaactggtt 120 ccagcagaag cccggccagc cccctaagct gctgatctac gccgcctcca accgcgagtc 180 tggcgtgccc gatagattct ccggctctgg ctctggcacc gactttaccc tgaccatcag 240 ctccctgcag gccgaggatg tggccgtgta ctactgccag cagtccaaag aggtgccctg 300 gaccttcggc cagggcacaa agctggaaat caagcgg 337 <210> 45 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 45 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ser Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ala Ser Glu Ser Val Asp Tyr Tyr 20 25 30 Gly Phe Ser Phe Leu Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Arg Gln Ser Gly Val Pro Asp 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 65 70 75 80 Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Lys 85 90 95 Glu Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 110 <210> 46 <211> 336 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 46 gacatccagc tgacccagtc ccccgactcc ctgtctgtgt ctctgggcga gagagccacc 60 atcaactgca aggcctccga gtccgtggac tactacggct tctccttcct gaactggttc 120 cagcagaagc ccggccagcc ccctaagctg ctgatctacg ccgcctccaa ccgccagtct 180 ggcgtgcccg atagattctc cggctctggc tctggcaccg actttaccct gaccatcagc 240 tccctgcagg ccgaggatgt ggccgtgtac ttctgccagc agtccaaaga ggtgccctgg 300 accttcggcc agggcacaaa gctggaaatc aagcgg 336 <210> 47 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 47 ctgtctagaa tgcagatccc acaggcgcc 29 <210> 48 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 48 ggatcctcag aggggccaag agcagt 26

Claims (24)

  1. 중쇄 상보성 결정 영역 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 상보성 결정 영역 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하며, 상기 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3은 다음으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 인간 세포예정사 단백질 1(PD-L1)에 특이성을 갖는 분리된 항체 또는 그 단편:
    (a) HCDR1: GFTFSSYT(서열번호 1), HCDR2: ISHGGGDT(서열번호 2), HCDR3: ARHSGYERGYYYVMDY(서열번호 3), LCDR1: ESVDYYGFSF(서열번호 4), LCDR2: AAS(서열번호 5), LCDR3: QQSKEVPW(서열번호 6);
    (b) HCDR1: GYTFTSYT(서열번호 7), HCDR2: INPTTGYT(서열번호 8), HCDR3: ARDDAYYSGY(서열번호 9), LCDR1: ENIYSNL(서열번호 10), LCDR2: AAK(서열번호 11), LCDR3: QHFWGTPWT(서열번호 12); 및
    (c) HCDR1: GFAFSSYD(서열번호 13), HCDR2: ITIGGGTT(서열번호 14), HCDR3: ARHRYDYFAMDN(서열번호 15), LCDR1: ENVDNYGINF(서열번호 16), LCDR2: VSS(서열번호 17), LCDR3: QQSKDVPW(서열번호 18);이고,
    여기서 중쇄 가변 영역은 서열번호 35, 37 또는 39에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고,
    상기 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열은 서열번호 35, 37 또는 39의 활성 또는 구조를 보유함.
  2. 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 그의 단편은 서열번호 41, 43 또는 45에 대해 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고, 상기 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열은 서열번호 41, 43 또는 45의 활성 또는 구조를 보유하는 것인, 항체 또는 그 단편.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 중쇄 불변 영역, 경쇄 불변 영역, Fc 영역, 또는 이들의 조합을 추가로 포함하는 항체 또는 그 단편.
  4. 제3항에 있어서, 상기 경쇄 불변 영역은 카파 또는 람다 사슬 불변 영역인 항체 또는 그 단편.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 항체 또는 그 단편은 IgG, IgM, IgA, IgE 또는 IgD의 이소타입인 것인 항체 또는 그 단편.
  6. 제5항에 있어서, 상기 이소타입은 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4인 항체 또는 그 단편.
  7. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 항체 또는 그 단편은 키메라 항체, 인간화 항체 또는 완전 인간 항체인 항체 또는 그 단편.
  8. 제7항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 단편은 인간화 항체인 항체 또는 그 단편.
  9. 제1항의 항체 또는 그 단편을 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  10. 제1항의 항체 또는 그 단편을 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 분리된 세포.
  11. 제9항에 있어서, 상기 암은 방광암, 간암, 결장암, 직장암, 자궁내막암, 백혈병, 림프종, 췌장암, 소세포 폐암, 비소세포 폐암, 유방암, 요도암, 두경부암, 위장암, 위암, 식도암, 난소암, 신장암, 흑색종, 전립선암 및 갑상선암으로 구성되는 군으로부터 선택되는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  12. 제9항에 있어서, 상기 암 치료는 제1항의 항체 또는 그 단편을 환자에 투여하는 단계를 포함하는 것인, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  13. 제9항에 있어서, 상기 암 치료는
    (a) 시험관 내에서, 제1항의 항체 또는 그 단편으로 세포를 처리하는 단계; 및
    (b) 처리된 세포를 환자에 투여하는 단계;
    를 포함하는 것인, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  14. 제13항에 있어서, 상기 세포는 T 세포인 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  15. 제1항의 항체 또는 그 단편을 포함하는 감염 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  16. 제15항에 있어서, 상기 감염은 바이러스 감염, 세균 감염, 진균 감염 또는 기생충에 의한 감염인 감염 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  17. 제15항에 있어서, 상기 감염 치료는
    (a) 시험관 내에서, 제1항의 항체 또는 그 단편으로 세포를 처리하는 단계; 및
    (b) 처리된 세포를 환자에 투여하는 단계;
    를 포함하는 것인 감염 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  18. 제17항에 있어서, 상기 세포는 T 세포인 감염 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  19. 제1항의 항체 또는 그 단편을 포함하는 면역질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  20. 제19항에 있어서, 상기 면역질환은 감염, 감염과 관련된 내독소 쇼크, 관절염, 류마티스성 관절염, 천식, COPD, 골반 염증성 질환, 알츠하이머병, 염증성 장질환, 크론병, 궤양성 대장염, 페이로니병(Peyronie's Disease), 만성 소화장애증, 담석증, 모소의 질병, 복막염, 건선, 혈관염, 수술 유착, 뇌졸중, I 형 당뇨병, 라임병, 관절염, 뇌수막염, 자가 면역 포도막염, 중추 및 말초 신경계의 면역 매개 염증 장애, 다발성 경화증, 루푸스 및 길랑-바르 증후군, 아토피성 피부염, 자가 면역 간염, 섬유성 폐렴, 그레이브병, IgA 신장병증, 특발성 혈소판 감소 자반증, 메니에르병, 천포창, 원발성 담즙성 경변증, 사르코이드종, 피부경화증, 베게너 육아종증, 췌장염, 정신적 외상, 이식 편대 숙주 질환, 이식 거부반응, 허혈성 질환, 심근경색, 죽상동맥경화증, 혈관 내 응고, 골 흡수, 골다공증, 골관절염, 치주염, 위산저하증 및 태아-모성 내성 결여와 관련된 불임으로 구성되는 군으로부터 선택되는 면역질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
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