CN1202128C

CN1202128C - 修饰蛋白的免疫原性

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Publication number: CN1202128C
Application number: CNB998044016A
Authority: CN
Inventors: F·J·卡尔; F·S·爱迪艾尔; A·A·哈姆利顿; G·卡特尔
Original assignee: Biovation Ltd
Current assignee: Merck Patent GmbH
Priority date: 1998-12-08
Filing date: 1999-12-08
Publication date: 2005-05-18
Anticipated expiration: 2019-12-08
Also published as: AU1667600A; AU776910B2; DE69934967D1; WO2000034317A3; ATE352559T1; EP1051432B1; ES2278463T3; JP2002534959A; CA2342967A1; DE69934967T2; EP1051432A2; WO2000034317A2; CN1294596A

Abstract

已知通过鉴定出一个或多个潜在的T细胞表位并通过氨基酸修饰来消除这些表位，可以使蛋白或其部分对人或其它物种具有非免疫原性或者更少的免疫原性。按照常规，如果构成这类表位的肽是以内源的人的蛋白存在的话，那么某些表位可以保留在蛋白序列中，这是因为它们被识别为是“自身的”。但是，现已发现即使是自身表位也会引起免疫反应。本发明例如通过重组DNA技术提供了消除这些表位的方法，以便使它们对于向人体给药而言(例如出于治疗或诊断的目的)更为有用。

Description

修饰蛋白的免疫原性

本发明涉及特别是出于治疗用途以及诊断测试用途的尤其用于向人体给药的蛋白。本发明特别提供了经过修饰以便当在体内使用时比未修饰的相应物具有更少免疫原性的蛋白。

本发明特别针对这样的一种方法的临床需求，通过该方法宿主对所给药的蛋白产生免疫应答的自然趋势基本上下降或者消除。现有几个将蛋白分子给药提供了治疗收益的实例。但是，特别是当需要多剂量的治疗蛋白时，这种收益大大降低，这是因为受体的免疫系统识别了新到的治疗蛋白并且加速了它们的消除。

现有许多的治疗蛋白，由于其在人体内的免疫原性而剥夺了它们的治疗用途。例如，当把鼠的抗体向没有进行免疫抑制的病人给药时，大多数病人通过产生人抗鼠抗体(HAMA)而对外源物质产生免疫反应。于是产生了两个严重的后果。首先，在治疗抗体或免疫缀合物有机会与肿瘤结合并发挥其功能之前，病人的抗鼠抗体会结合并清除这些物质。其次，病人会对鼠抗体产生过敏敏感性，并且当将来的任何时候暴露给鼠免疫球蛋白时会产生过敏性休克的危险。

已经采用了若干种技术来解决HAMA问题，并从而可以使治疗单克隆抗体在人体中使用(参见例如WO-A-8909622，EP-A-0239400，EP-A-0438310，WO-A-9109967)。现已将这些方法的共同方面引入治疗抗体中，一般说来这些抗体都是来源于啮齿类动物的，其序列的显著片段与在人抗体蛋白中存在的是相同的。这种改变通常还与在被认为是对维持抗体一抗原结合反应至关重要的位置处特殊的单个氨基酸残基的改变相结合。对抗体而言，该方法可能是由于在不同种的抗体分子之间非常高度的结构(和功能)的保守性所致。但是对潜在的治疗蛋白而言，当在宿主物种(例如人)中不可能存在着所述治疗蛋白的结构同系物时，该方法就不可以采用。而且，这些方法已经假定通常的人序列的引入将会使重新构造的抗体具有非免疫原性。但是已知为了触发T细胞的活化，在细胞内部蛋白降解的过程中可以释放出某些短肽序列(“T细胞表位”)，随后可以由主要组织相容性复合体(MHC)分子呈递这些序列。对于由MHC-II类呈递的肽来说，这种T细胞的活化然后可以通过直接刺激B细胞产生这类抗体而产生抗体的应答。以前的方法中没有一种方法提出在最终的治疗分子中消除或避免这类表位来作为降低或消除所述抗体对蛋白产生应答的方式。以前的方法中也没有一种方法考虑到消除由MHC-I类呈递的肽，它可以触发导致杀死细胞的细胞毒性T细胞的应答。这样杀死细胞导致包括蛋白在内的细胞成分的释放，其本身又可以激活在蛋白加工和MHC呈递中具有高度活性的特有细胞，并且由于这种激活还会导致炎症细胞因子的释放。结果，可以产生这样的一种炎症环境，它促进了更为活跃地吸收和加工用于治疗用途的蛋白，从而有助于对所述蛋白产生抗体应答的诱导。

以前已经公开了从蛋白中除去T细胞表位(参见WO-A-9852976)，其中将这类潜在的T细胞表位定义为在蛋白序列中具有与MHC-II类分子结合能力的任何的肽。通过任何计算的或物理的方法来测量这类潜在的表位以确定MHC的结合。术语“T细胞表位”的含义为一种被T细胞受体所识别并且至少可以原则上导致这些T细胞活化的表位。但是通常了解到的是发现与MHC-II类分子结合的某些肽可以保留在蛋白序列中，这是因为这类肽在生物体中被识别为是“自身的”，其中是将最终的蛋白向所述生物体内给药的。

实际上，引入到自身生物体中的可溶蛋白有时的确触发免疫应答，这导致形成了与所述可溶蛋白结合的宿主的抗体。一个例子为α2干扰素，尽管事实上该蛋白是内源产生的，但仍有一定比例的病人对α2干扰素产生抗体。

本发明基于发明人发现了在自身蛋白中的MHC-结合肽可以在活的生物体内触发对那些所述蛋白的免疫应答，即使当特异性蛋白是内源产生的也是如此。针对这一发现的可能的解释为这类给药蛋白的剂量比正常提供的可以活化T细胞的MHC-肽的生成要高出许多。另一方面，这类给药蛋白所送入的生理环境为一种有利于以比通常遇到的(例如在炎症状况下)水平要高的水平有效地进行抗原加工和肽-MHC生成的环境。

根据本发明的第一方面，本发明提供了一种使蛋白或蛋白的一部分对给定的物种具有非免疫原性或更少的免疫原性的方法，该方法包括：

(a)测定所述蛋白的至少部分氨基酸序列；

(b)在所述氨基酸序列中鉴定出一个或多个潜在的针对T细胞的表位(“T细胞表位”)，其见于给定物种的内源蛋白中；以及

(c)修饰所述的氨基酸序列以便去除在步骤(b)中鉴定出的T细胞表位中的至少一个，从而当暴露给给定物种的免疫系统时降低所述蛋白或其部分的免疫原性。

给定的物种通常为人类。在步骤(c)中，可以消除掉一个或多个实际的表位或潜在的表位。

因此，本发明提供了一种用于创制蛋白的改进的方法，该蛋白触发减少的或者不触发免疫应答，从而修饰了也在自身生物体的内源蛋白中发现的一个或多个MHC结合肽以便减少或消除与MHC分子的结合。于是实际上，没有作出有关生物体可以耐受肽的假设(除非可以得到表明耐受是原位存在的数据)。总之，本发明涉及创制在活的生物体内具有减少的或不具有免疫原性的蛋白分子，其中从所述的蛋白分子中去除了一个或多个与MHC分子结合的肽。因此，本发明是对现有技术作出的改进，现有技术是在假定生物体对自身蛋白或肽序列耐受的情况下，仅仅集中在从蛋白中去除潜在的T细胞表位。具体地讲，本发明包括一系列人和非人的蛋白，其中所述的蛋白通过修饰序列中的一个或多个MHC结合肽而得以修饰。这类MHC结合肽可以包括与MHC-II类分子结合的肽和/或与MHC-I类分子结合的肽。

本发明如上所述的这一方面优选为用这类肽对生物体独立地免疫接种以诱导耐受性的另一种策略或者为将抵制结合或吸收的所述蛋白的类似物或片段向细胞(尤其是抗原呈递细胞)给药的另一种方法(例如通过消除所述蛋白中的细胞结合位点)。以这种方式使生物体对肽产生耐受性(例如在将整个蛋白给药之前使用从同源蛋白中鉴定出的MHC结合肽，它可以用来诱导宿主中的耐受性)将需要两种治疗分子，一种用于发挥主要的蛋白功能，而另一种则用于诱导耐受性，从调节的观点来看它将得不到支持。

在本发明中可以使用鉴定(其中还包括术语预测”)一个或多个潜在的T细胞表位的任何方法。可接受的方法可以是计算的或物理的方法，并且包括测量MHC-肽复合体与T细胞受体的结合、测试在表达人MHC分子的转基因小鼠中潜在的T细胞表位、测试在用人的抗原呈递细胞和T细胞代替其内源细胞而重组的小鼠中潜在的T细胞表位、以及测试通过采用同源的抗原呈递细胞在MHC分子上呈递肽在体外对T细胞的刺激的潜在的T细胞表位。

除了鉴定氨基酸序列中在给定物种的内源蛋白中发现的一个或多个潜在的T细胞表位外，本发明的方法另外可以涉及并且通常会涉及鉴定并消除在给定物种的内源蛋白中未被发现的一个或多个潜在的T细胞表位，这是因为这类表位甚至更可能具有免疫原性。

本发明基于开发治疗蛋白的一种新的观念。事先已经认识到与外源T细胞依赖型蛋白一起，辅助T细胞表位对于对自身蛋白产生明显的免疫应答来说是重要的。这类T细胞表位通过释放出肽的蛋白的内部加工起作用，其中所述的肽与MHC-II类分子复合、然后在合适细胞的表面上呈递，从而可能与位于T细胞上的受体结合。但是，非常难于预测蛋白中的肽将被适当地加工从而可以发生MHC的结合，并且这也是许多加工过的肽不与MHC-II类分子的所有同种异型变体结合的一个原因(MHC限制)。此外，在任何给定的活的生物体中，难于预测在MHC-II类上呈递的给定肽是否实际上触发T细胞的应答，这是因为T细胞可能已经对这类表位产生了耐受性或者可能不具有T细胞受体的所有组成成分从而不与MHC-II类-肽的复合体结合。由于这些复杂的因素，以前开发具有减少的或者缺乏免疫原性的蛋白是不现实的，这是因为在预测实际的T细胞表位方面存在一定的难度。本发明主要采取了通过去除潜在的而非实际的T细胞表位(通常通过与MHC分子的结合来限定)来创制改进的治疗蛋白的新途径，从而除了那些具有免疫原性的肽之外，还可以改变实际上没有免疫原性的所述分子中的某些肽。对治疗分子来说，在保留所述蛋白活性的同时，优选除去所有潜在的T细胞表位。优选地，这涉及明智地选择能够除去T细胞表位的氨基酸的取代，并且通常涉及测试一系列具有不同氨基酸取代的变体分子。

并非必须消除在内源蛋白中发现的所有鉴定出的潜在T细胞表位。例如，一般说来对自身循环蛋白(如免疫球蛋白和其它的血清蛋白、如血清白蛋白)并不产生免疫应答。因此有时可以忽略例如在给定物种(所述的物种通常为人)的种系免疫球蛋白可变区蛋白序列中发现的潜在T细胞表位。但是，可以将被认为通常不能为免疫系统利用以获得耐受性的表位鉴定为根据本发明的方法用于消除的潜在表位。这类例子包括含有胞内蛋白(如核内蛋白和整合膜蛋白)的那些表位的表位。

因此，本发明提供了已经加以改变以降低其免疫原性的蛋白以及一种改变这类蛋白以降低其免疫原性的通用方法。本发明主要的原理为通过鉴定出潜在的T细胞表位并且为了消除这类潜在的表位在所述蛋白中其随后的改变来改变蛋白。任选地，如果例如借助病人的抗血清可以鉴定出被宿主抗体识别的表位(“B细胞表位”)的话或者如果可以在不丧失非自身分子所有的所需活性的情况下将非自身蛋白中的表面残基改变成对宿主生物体而言是内源的相关自身蛋白的那些表面残基的话，那么也可以除去这些表位。

在消除了一个或多个T细胞表位后，可以测试蛋白的所需活性。它可能保留了其全部的活性，或者它可能保留了一定比例的最初活性以便使之足以有用。在一些情况下，或者可以有利地或者至少以一种可以接受的方式来改变其活性。可以丢弃掉在修饰后完全缺乏有用功能的蛋白。

本发明的蛋白包括那些在人类中具有潜在的临床用途或者在动物中具有兽医用途的蛋白，尤其是当所述的用途涉及将蛋白多次给药的情况。它们可以是非自身的或是自身的。本发明的蛋白包括具有有益的治疗效果的酶活性的蛋白、用于在活的生物体内将非活性药物转化为活性药物的蛋白、用于接种疫苗从而某些免疫原性表位是不想要的蛋白、在活的生物体内起到其它分子的载体作用的蛋白以及为了改变其它分子的生物分布与活的生物体内的或者在活的生物体内引入的其它分子结合的蛋白。其中，对在人体内使用具有潜在益处的非自身蛋白的例子如下：溶栓蛋白链激酶和葡萄球菌激酶；前体药物激活酶，如天冬酰胺酶和羧肽酶G2；植物、真菌和细菌来源的毒素，如蓖麻毒蛋白、皂角苷、美洲商陆抗病毒蛋白、槲寄生凝集素、霍乱毒素、百日咳毒素、白喉毒素；细菌磷脂酶C(例如PE33，PE35，PE37，PE38，PE40)；核糖毒素，如α-八叠球菌(sarcin)、clavin、丝林霉素、局限曲菌素以及bryodin-1和bryodin-2。具有经证实的和潜在的治疗益处的其它突出的非自身分子包括链霉抗生物素蛋白、眼镜蛇毒因子、胰岛素、胶原、非自身抗体、非自身MHC分子和非自身T细胞受体分子。具有证实的和潜在的治疗价值的自身蛋白包括IL-2、α和β干扰素、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GMCSF)、粒细胞集落刺激因子(GCSF)、组织纤溶酶原激活物(t-PA)、胰岛素、因子VIII、因子IX、促红细胞生成素(EPO)、垂体生长激素和巨核细胞生长发育因子(MGDF)以及通过重组方法生产的这些蛋白的衍生物。这类蛋白的其它例子包括来源于自身或非自身蛋白的重组分子或者由所述蛋白的单结构域或多结构域组成的重组分子、以及进行了人工改造以改变或改进功能或来源于上述任一分子之蛋白序列的重组蛋白。

在本发明的通用方法中，一种典型的方案包括下列步骤：

I.测定蛋白或其部分(如果仅仅需要修饰一部分的话)的氨基酸序列；

II.通过任何方法鉴定所述蛋白氨基酸序列中潜在的T细胞表位，所述方法包括测定肽与MHC分子的结合、测定肽：MHC复合体与来自接受所述治疗蛋白的物种的T细胞受体的结合、采用带有接受所述治疗蛋白的物种之MHC分子的转基因动物测试所述的蛋白或其肽部分、或者采用以来自接受所述治疗蛋白的物种之免疫系统细胞重建的转基因动物进行测试；

III.通过遗传工程或其它用于产生修饰的蛋白的方法，改变所述的蛋白以去除一个或多个潜在的T细胞表位并产生用于测试的这样一种改变的蛋白；

IV.(任选)在步骤III中，改变所述的蛋白以去除一个或多个潜在的B细胞表位；

V.为了鉴定已保留了其所有或部分的所需活性、但却已丧失了一个或多个T细胞表位的修饰的蛋白，测试除去了一个或多个潜在的T细胞表位(和任选的B细胞表位)的改变的蛋白。

将本文中潜在的T细胞表位定义为特异性的肽序列，该序列或者以适当的效率与MHC-II类分子(或其在非人的物种中的等同物)结合，或者以肽：MHC复合体的形式与来自接受所述治疗蛋白的物种的T细胞受体强烈地结合，或者从以前或其它的研究显示出通过在MHC-II类上的呈递来刺激T细胞的能力。本发明的方法认识到对外源蛋白产生有效的T细胞依赖型免疫应答需要激活免疫系统的细胞臂。这样的一种应答需要通过抗原呈递细胞(APC)摄入治疗(外源)蛋白。一旦在这类细胞内部时，所述的蛋白便被加工，而且所述蛋白的片段与MHC-II类分子形成复合体并且在细胞表面上呈递出来。如果通过来自T细胞的T细胞受体的结合识别这样的一种复合体，在某些情况下这类细胞可以被激活以产生刺激细胞因子。细胞因子将会引起B细胞分化成完全抗体产生细胞。另外，这样的T细胞应答还会介导对病人的其它有害的作用，比如发炎和可能的过敏反应。

应理解并非所有的肽序列都被送递至正确的MHC-II类细胞区室内进行MHC-II类的结合或者从较大的细胞蛋白中适当地释放出来进行随后的MHC-II类的结合。另外应理解甚至由位于APC表面上的MHC-II类呈递的这类肽都可能不会引起T细胞的应答，理由包括缺乏合适的T细胞的特异性、免疫系统对特殊肽序列的耐受性或者MHC-肽复合体对T细胞受体低的亲和力。

本发明提供了从治疗蛋白中除去人(或其它给定物种)的潜在的T细胞表位，从而可以通过任何适当的方式分析治疗蛋白的一级序列中MHC-II类结合基元的存在。例如，可以与MHC-结合基元数据库进行比较，比如通过检索万维网中网址为http：//wehih.wehi.edu.au/mhcpep(以前为 wehil.wehi.edu.au或wehi.wehi.edu.au)的“基元”数据库。另一方面，采用计算穿线法，比如那些由Altuvia等人设计的方法(《分子生物学杂志》249 244-250(1995))，可以鉴定出MHC-II类结合的肽。可以采用类似的方法来鉴定和除去与MHC-I类结合的表位。

现已鉴定了潜在的给定物种(例如人)的T细胞表位，然后当需要消除T细胞表位时，通过改变一个或多个氨基酸来消除这些表位，这通常涉及改变T细胞表位自身当中的一个或多个氨基酸。这可以涉及改变在所述蛋白一级结构上与所述表位相邻的氨基酸或者改变在一级结构上并不相邻而在所述分子的二级结构上相邻的氨基酸。通常设计的改变是氨基酸的取代，但在某些情况下氨基酸的缺失或添加也是合适的。在一些情况下，参照同源蛋白的一级结构，可以在治疗蛋白一级结构中的任何特殊的位置上选择适当的氨基酸的取代。特殊的情况为同源基因的所有组成成分都存在(这例如与免疫球蛋白一样)，或者治疗蛋白的单一同源基因存在(这与实施例1中详细描述的眼镜蛇毒因子蛋白和人补体因子C3的情况相同)。但在其它的情况下，可能没有治疗蛋白的同源蛋白，这与一些潜在的治疗剂的情况一样(比如溶栓剂葡萄球菌激酶)。在这种情况下，可以在类似的大小和/或电荷的基础上选择氨基酸，或者更优选地并且与计算机(in silico)制作蛋白质模型技术结合或者参照所述的技术根据已有的蛋白结构数据来选择氨基酸。在一些情况下，可以进行氨基酸的取代以防止蛋白的水解切割并从而抑制肽与MHC-II类的结合。蛋白酶切割位点的例子包括那些由van Noort & van der Drift报道的位点(《生物化学杂志》26414159-14164(1989))以及由van Noort等人报道的位点(《欧洲免疫学杂志》21 1989-1996(1991))。已经公开了防止蛋白酶消化的氨基酸的例子，例如Kropshofer等人在《免疫学杂志》151 4732-4742(1993)中鉴定出来的氨基酸。

在本发明的方法中，通常生产出许多改变的蛋白的变体并且测试保留的所需活性。若理想的情况是最大程度地从蛋白中除去潜在的T细胞表位，通常创制出一系列的变体，其中包括一些在分子中残留着潜在的T细胞表位的变体。据认为在某些蛋白分子中难于从根本上改变分子和保留全部的活性，因此明智地使用给变体制作分子模型并测试最大数量的变体是人们所希望的。对于制作分子模型而言，以晶体结构或者由同源性或蛋白折叠预测建立的模型为起点，可以使用标准的可商购的软件包来制作蛋白结构的模型。有关所述蛋白的某些部分的信息(与赋予所述分子活性有关)将会协助制作变体的模型，以便能够最好地选出改变的氨基酸，其中在保留活性的同时除去了潜在的T细胞表位(或任选的B细胞表位)。

在本发明的方法中(其中生产出许多改变的蛋白的变体并且测试了保留的所需活性)，理想的是拥有一种用于筛选大量变体的高效的方法。这样的方法包括在诸如细菌这样的细胞中表达基因变体并伴随着迅速分离所述蛋白(例如采用抗所述蛋白保守区的抗体或者通过包含在蛋白序列中的蛋白纯化标记物)的体内法。作为一种可供选择的方法，在一些情况下可以使用诸如体外转录和翻译这样的体外法。当蛋白与另一种分子结合时，为了挑选出保留了结合活性的变体，可以使用诸如噬菌体展示和核糖体展示这样的展示法。

在实施本发明的过程中，通过重组DNA技术可以进行具体的氨基酸的改变，从而采用已确定的方法通过重组宿主的表达可以制备出最终的分子。但是，在实施本发明时并不排除采用蛋白质化学或任何其它分子改变的方法。虽然本发明提供了一种用于从蛋白分子中除去潜在的T细胞表位(和任选的B细胞表位)的方法，但该方法并不排除测试本发明中产生的变体分子实际的T细胞表位的活性，其中包括采用带有接受所述治疗蛋白的物种之MHC分子的转基因动物测试所述的蛋白或其肽部分，或者采用以来自接受了所述治疗蛋白的物种之免疫系统细胞重建的转基因动物进行测试。

当这样的方法仍不是常规的方法时，可以进行体外T细胞测定，从而所述的蛋白可以被加工并且通过针对同源T细胞的合适的抗原呈递细胞(APC)在MHC-II类上呈递出来。通过简单的增殖测量(尤其是如果已经辐射了APCs或者已经以其它方式进行了处理以防止增殖的话)或者通过测量特异性细胞因子的释放可以测出T细胞的应答。为了解释不同的MHC-II类的同种异型，通常需要进行一系列的体内测定以便在很宽的范围内测试T细胞表位。另一方面，可以使用以人(或所需物种)的MHC-II类分子装配的转基因动物来测试T细胞表位，尤其是其中已经除去了宿主MHC-II类的所有组成成分的情况下以及尤其是在APC/T细胞的相互作用中一种或多种其它宿主的辅助分子也已被诸如T细胞上的CD4这样的人(或所需的物种)的分子置换的情况下。

再一方面，本发明提供了由如上所述的方法得到的分子。这类分子对于治疗或预防疾病或病症来说可能是有用的。本发明还延伸到这类分子在体内和体外诊断中的用途以及用于人或兽医的用途。本发明各方面的优选特征是对彼此方面而言在细节上作必要的修改。

通过下面的实施例来说明、但并不限制本发明。实施例参照了下列附图：

图1显示出成熟的眼镜蛇毒因子的蛋白序列；

图2显示出改变的眼镜蛇毒因子链的蛋白序列；

图3显示出改变的眼镜蛇毒因子链的蛋白序列；

图4显示出改变的眼镜蛇毒因子链的蛋白序列；

图5显示出来自似马链球菌的链激酶的蛋白序列；

图6显示出改变的链激酶分子的蛋白序列；

图7显示出成熟的葡萄球菌激酶的蛋白序列；

图8显示出改变的葡萄球菌激酶分子的蛋白序列；

图9显示出野生型bryodin 1的蛋白序列；

图10显示出改变的bryodin 1分子的蛋白序列；

图11显示出成熟的人干扰素2的蛋白序列；并且

图12显示出改变的人干扰素2分子的蛋白序列。

实施例1

在本实施例中，分析了眼镜蛇毒因子(CVF)蛋白中潜在的MHC结合基元的存在并且公开了一种用于从所述分子中除去许多所述基元的方法。

CVF是眼镜蛇毒中无毒性的补体-激活糖蛋白。成熟的CVF蛋白由α，β和γ这三个多肽链组成，它是由分子量约为150kDa的前原蛋白经翻译后加工产生的(Fritzinger D.C.等人《美国国家科学院学报》9112775-12779(1994))。α和β链都通过单一的二硫键与γ链相连。另外，α链和γ链两者都具有单一的链内二硫键，而β链具有复杂排布的六个进一步的内部二硫键。成熟蛋白具有四个潜在的N-糖基化位点，其中仅仅使用了三个这样的位点(Vogel，C.W & Muller-Eberhard《免疫学杂志》18 125-133(1984))。

在本发明的优选实施方案中，减少了免疫原性或改变了形式的治疗蛋白是通过重组DNA技术生产的。对本实施例来说，理解到单是重组生产成熟的CVF蛋白的权宜之计就可能导致所述蛋白免疫原性极大的减少。这一断言起源于这样的知识，即由将从眼镜蛇的毒液纯化的CVF给药而产生的免疫原性的程度是由抗体对在哺乳动物蛋白中未遇到的特殊模式的糖基化作用的应答产生的(Gowda，D.C等人《免疫学杂志》152 2977-2986(1994))。另外理解到由CVF的重组生产产生的(例如在哺乳动物的生产细胞系统中)去糖基化的并且还有唾液酸化的(sialylated)CVF与天然的成熟CVF具有相等功能的活性(Gowda，D.C等人(1994)出处同上)。

在人体内，CVF触发补体激活的替代(备解素)途径。CVF与因子B形成双分子复合体，其中因子B被因子D切割成Bb，而Bb仍然与CVF结合以生成C3/C5转化酶CVF，Bb。该复合体在功能上和结构上都与在激活替代途径的过程中生成的人C3/C5转化酶类似。CVF的临床重要性在于与天然的C3/C5转化酶相比CVF，Bb复合体的稳定性相对要高(与90秒的t_1/2相比，其t_1/2为7小时)，特别是CVF，Bb不能被破坏的能力并因而由因子H和I进行减量调节(Gowda，D.C等人(1994)出处同上)。因此，CVF给药最终的结果是通过连续有效的和不加以控制的补体激活导致人血清中补体的减少。

已经把这种特性加以利用作为体内和体外去补体作用的研究工具(Cochrane C.G等人《免疫学杂志》105 55(1970))，并且也已经利用这种特性以与肿瘤靶向单克隆抗体形成缀合物的方式来选择性地清除肿瘤细胞(Vogel，C.-W. & Muller-Eberhard H.J.《美国国家科学院学报》78 7707(1981))。作为一种潜在的治疗剂，为了减少经历了器官异体移植的病人血浆中的补体或者减少针对癌症病人体内补体的定向激活在第二代抗体缀合物构建中的补体，可以得到非免疫原性的CVF将具有非常重要的意义。

用于鉴定眼镜蛇毒因子中潜在的MHC-II类结合基元的方法：

从GenBank数据库中鉴定出CVF的序列。自始至终使用登记号为U09969的序列。独立地鉴定和分析成熟的α，β和γ链的蛋白序列(图1)中潜在的MHC-II类结合基元的存在。通过与位于万维网中网址为http：//wehih.wehi.edu.au/mhcpep/的MHC结合基元数据库进行计算机辅助的比较进行分析。

对α链的“检索”结果表明存在着638个潜在的MHC-II类结合基元。其中，在人种系免疫球蛋白可变区蛋白序列的数据库中鉴定出525个配对序列。在对自身循环蛋白(如免疫球蛋白)通常并不产生免疫应答的基础上，不再考虑这些表位。这意味着在免疫球蛋白(以及的确是大多数的人的蛋白)的结构中存在着对潜在T细胞表位的免疫耐受性。由非自身蛋白(如CVF)呈递的与免疫球蛋白中存在的基元相同或类似的表位也可能被耐受并且实际上可以在去免疫的过程中保留下来。

在减去人免疫球蛋白的种系基元后，独立地分析α链中剩余的113个潜在表位与非免疫球蛋白序列的相似性。实际上，在人的表达蛋白的共有序列检索中采用每个潜在表位的预测的锚定残基。使用可商购的软件(DNAstar Madison，WI，美国)查询SwissProt和GenBank翻译序列数据库。不再考虑在已知的人循环蛋白中鉴定出的表位，从而使其在CVF的α链中保持不变。由CVFα链中第332-338位上(从成熟α链的第一个氨基酸开始编号)的序列FKPGMPY给出了这样一个排除的潜在表位的例子。该序列代表针对HLA-DRQBl*0301的预测的共有结合基元，其中锚定残基下加有下划线。采用共有序列FxxxMxY进行的数据库检索在对应于人血清生物素酶(SwissProt的登记号为#A54362)的SwissProt数据库的人蛋白亚型中仅仅鉴定出单一的记录。由CVFα链中第501-509位上的序列YYQVGNNEI提供了这样一种表位的例子，其中发现该表位与被认为是在普通循环之中的人的蛋白不匹配。该序列代表针对HLA-DRBl*0101呈递的潜在表位。共有序列的检索仅仅鉴定出含有该基元的四种人的蛋白，其中有三种是分化组织(如大脑)的核内蛋白，而第四种为整合膜蛋白。可以将这些蛋白视为通常不能为免疫系统利用以获得耐受性，因而根据本发明的方法鉴定其为用于消除的潜在表位。类似地，在α链中鉴定出其它潜在的HLA-DR1结合基元。其中使用了第81-89位上的肽序列YVVVOVTGP。该基元在相同的数据库组中鉴定出单一的人核内蛋白DNA聚合酶α(GenBank的登记号为# M64481)，因而也通过本发明的方法进行鉴定以用于修饰。在这些过程之后，认为α链中共有15个潜在的表位要通过氨基酸的取代除去。

对β链的“检索”结果表明存在着366个潜在的MHC-II类结合基元。其中，在人种系免疫球蛋白可变区蛋白序列的数据库中鉴定出281个配对序列并且不再予以考虑。在采用人血清蛋白序列数据库进行第二轮的减除后(如上所述)，认为有18个潜在的表位要除去。

对γ链的“检索”结果表明存在着267个潜在的MHC-II类结合基元。其中，在人种系免疫球蛋白可变区蛋白序列的数据库中鉴定出219个配对序列并且不再予以考虑。在采用人血清蛋白序列数据库进行第二轮的减除后(如上所述)，认为有9个潜在的表位要除去。

这些过程最终的结果是在CVF分子中鉴定出了那些应当进行改变以消除潜在的MHC-II类结合基元的残基。挑选出预测的结合基元中单个的氨基酸以便改变。为了最大可能地保持蛋白的功能活性，在所有的情况下在任何给定的位点处都选择保守的氨基酸取代。在许多情况下，参照已出版的人补体因子3(C3)的序列(GenBank的登记号为#K02765)取代单个的氨基酸、甚至短的肽链(＜5个连续的残基)，其中所述出版的序列呈现出与CVF之间具有高度同源性的区域，其中包括同一性的区域。在两个实例中，通过插入其它的氨基酸从β链中消除了潜在的表位。参照人C3蛋白选出氨基酸。

汇集了改变的CVF的α链、β链和γ链的序列(图2-4)，并且如前所述通过数据库比较进一步进行分析以验证成功地消除了潜在的MHC-II类结合基元。

用于构建改变的CVF分子的方法：

使用PCR引物CVFlfor；5’ATAAGAATGCGGCCGCATGGAGAGGATGGCTCTCT和CVFlrev；5’ATAAGAATGCGGCCGCTATCATTGATTCTTCTGAAC，由λgtll眼镜蛇毒腺cDNA文库(Fritzinger DC等人，出处同上)扩增出4985bp的片段。使用对长距离PCR优化的高度保真的聚合酶混合物(高级PCR试剂盒，Clontech，Basingstoke，英国)以及由供应商建议的条件，在总文库DNA制剂上进行PCR。采用标准的技术(Sambrook J.，Fritsch E.F.& Maniatis T.编辑的《分子克隆：实验指南》冷泉港实验室出版社，纽约州，美国(1989))，将PCR产物以NotI限制片段的形式克隆到pcDNA3.1(Invitrogen，Leek，荷兰)中。使用可商购的试剂系统以及由供应商提供的说明(Amersham，Little Chalfont，英国)证实该基因序列与数据库的记录是相同的。使用合成的寡核苷酸和“快速-改变”方法以及来自Stratagene(剑桥，英国)的试剂进行定点诱变。通过测序验证突变(去免疫)型式的基因。通过电穿孔将突变的CVF基因转染到CHO细胞中。采用G418选出稳定的转染体，并采用C消耗测定(Gowda D.C等人(1994)出处同上；Cochrane C.G.等人(1970)出处同上)选出分泌活性CVF的克隆。扩张表达克隆，并采用连续的柱层析和如上所述的方法(Vogel C-W等人《免疫学方法杂志》73203-220(1984))从培养上清液中纯化重组蛋白。

实施例2

本发明详细地描述了一种方法，通过该方法可以鉴定出非自身蛋白中潜在的具有免疫原性的表位，而且本发明提供了一种方法，通过该方法可以消除这类表位。据理解现有许多经证实的治疗蛋白，由于它们在人当中的免疫原性，因而剥夺了它们的治疗用途。在本实施例中，分析了治疗蛋白链激酶中潜在的MHC结合基元的存在并且公开了一种用于从该分子中除去许多所述基元的方法。

链激酶(SK)是一种分子量约为47kDa的单链蛋白，它是由β-溶血链球菌的某些菌株产生的(Huang T.T.等人《分子生物学》2 197-205(1989))。该蛋白本身不具有酶活性，但是由于它能够有效地结合人的纤溶酶原、增强对纤溶酶的活化并从而促进血块中血纤蛋白丝的溶解，因此具有相当的临床重要性。几项研究已经表明SK在治疗冠状动脉血栓形成、改善存活能力(ISIS-2合作小组《柳叶刀杂志》2 349-360(1988))以及在心肌梗死后保持左心室功能(ISAM研究小组《英国国家医学杂志》314 1465-1471(1986)；Kernedy J.W.等人《循环》77345-352(1988))方面是一种有效的溶栓剂。尽管SK具有毫无疑问的治疗价值，但是由于它在人当中具有免疫原性，因此该蛋白的非自身来源是不利的。在病人中产生中和抗体通常将该蛋白限制到单一的用途。

用于鉴定链激酶中潜在的MHC-II类结合基元的方法：

从GenBank数据库中鉴定出链激酶的序列。自始至终使用登记号为S46536的序列(图5)。通过与位于万维网中网址为http：//wehih.wehi.edu.au/mhcpep/的MHC结合基元数据库进行计算机辅助的比较，分析所述序列中潜在的MHC-II类结合基元的存在。

“检索”过程的结果表明存在着395个潜在的MHC-II类结合基元。其中，在人种系免疫球蛋白可变区蛋白序列的数据库中鉴定出283个配对序列。在对自身循环蛋白(如免疫球蛋白)通常并不产生免疫应答的基础上，不再考虑这些表位。这意味着在免疫球蛋白(以及的确是大多数的人的蛋白)的结构中存在着对潜在T细胞表位的免疫耐受性。由非自身蛋白(如SK)呈递的与免疫球蛋白中存在的基元相同或类似的表位也可能被耐受并且实际上可以在去免疫的过程中保留下来。

在减去人免疫球蛋白的种系基元后，独立地分析剩余的112个潜在表位与非免疫球蛋白序列的相似性。实际上，在人的表达蛋白的共有序列检索中采用每个潜在表位的预测的锚定残基。使用可商购的软件(DNAstar Madison，WI，美国)查询SwissProt和GenBank翻译序列数据库。不再考虑在已知的人循环蛋白中鉴定出的表位，从而使其在SK分子中保持不变。由SK蛋白中第79-87位上的序列 LLK AIQEQ L给出了这样一个排除的潜在表位的例子。该序列代表针对HLA-DR1*0101的预测的共有结合基元，其中锚定残基下加有下划线。采用共有序列LxxAxxxxL进行的数据库检索在包括血清白蛋白(SwissProt的登记号为P02768)的SwissProt数据库的人蛋白亚型中鉴定出大于4000条的记录。由SK蛋白中第299-305位上的序列YVD VN TN提供了这样一种表位的例子，其中发现该表位与被认为是在普通循环之中的人的蛋白不匹配。该序列代表针对HLA-DR4*0401呈递的潜在表位。共有序列的检索鉴定出含有该基元的少于50种人的蛋白，其中许多是分化组织(如大脑)的胞内蛋白。可以将这些蛋白视为通常不能为免疫系统利用以获得耐受性，因而根据本发明的方法鉴定其为用于消除的潜在表位。类似地，在SK蛋白第76-83位上的SK肽序列KADLLKAI中鉴定出其它潜在的HLA-DRl*0101结合基元。该基元在相同的数据库组中鉴定出少于150种的人的蛋白，并且也通过本发明的方法进行鉴定以用于修饰。

这些过程最终的结果是在SK分子中鉴定出了那些应当进行改变以消除潜在的MHC-II类结合基元的残基。挑选出预测的结合基元中单个的氨基酸以便改变。为了最大可能地保持蛋白的功能活性，在所有的情况下在任何给定的位点处都选择保守的氨基酸取代。汇集了一种新的(去免疫的)SK序列(图6)，并且如前所述通过数据库比较进一步进行分析以验证成功地消除了潜在的MHC-II类结合基元。

用于构建去免疫的SK分子的方法：

使用PCR引物SK1(5’-ggaattcatgattgctggacctgagtggctg)和SK2(5’-tggatccttatttgtcgttagggtatc)扩增来自似马链球菌C组菌株(ATCC的登记入册号为9542)的野生型SK基因。采用标准的技术(Sambrook J.，Fritsch E.F. & Maniatis T.编辑的《分子克隆：实验指南》冷泉港实验室出版社，纽约州，美国(1989))，将得到的1233bp片段以BamHI-EcoRI限制片段的形式克隆到pUC19中。使用可商购的试剂系统以及由供应商提供的说明(Amersham，LittleChalfont，英国)证实该基因序列与数据库的记录是相同的。使用合成的寡核苷酸和“快速-改变”方法以及来自英国Stratagene有限公司的试剂进行定点诱变。通过测序验证突变(去免疫)型式的基因。将突变的SK基因以EcoRI-BamHI片段的形式亚克隆到细菌表达载体pEKG-3(Estrada M.P.等人《生物/技术》10 1138-1142(1992))中，从而表达去免疫的SK。根据Rodriguez等人的方法(Rodriguez P.等人《生物技术》7 638-641(1992))，采用纤溶酶原亲和柱纯化重组蛋白。采用酪蛋白/纤溶酶原平板技术以及如Estrada等人(Estrada等人，出处同上)所述的体外血块溶解测定来评价纤维蛋白溶解的活性。

实施例3

在本实施例中，分析了葡萄球菌激酶中潜在的MHC结合基元的存在并且公开了一种用于从该分子中除去许多所述基元的方法。

来自金黄色葡萄球菌的葡萄球菌激酶已经被认可并且其特征在于纤维蛋白原溶解的特性。事先已经生产出重组形式的蛋白，并且体外和体内研究已经表明该蛋白对于溶解血栓的治疗具有良好的前景(Sako，T.《欧洲生物化学杂志》149 557-563(1985)；Schlott，B.等人《生物技术》12 185-189(1994)；Collen，D.等人《循环》94197-462(1996))。但是，由于该蛋白在人当中表现出的免疫原性，因此已经限制了临床上在人中的使用(Collen，D.等人《循环》95 463-472(1997))。作为一种用于溶解血栓治疗的潜在药剂，可以得到非免疫原性的葡萄球菌激酶将具有非常重要的意义。

成熟的葡萄球菌激酶由137个氨基酸的单一多肽链组成，其分子量约为15.4kDa(Silence K.等人《生物化学杂志》270 27192-27198(1995))。

用于鉴定葡萄球菌激酶中潜在的MHC-II类结合基元的方法：

自始至终使用如Collen等人(Collen，D等人(1996)出处同上)在表1中给出的葡萄球菌激酶的序列(sakSTAR)。分析成熟的葡萄球菌激酶的蛋白序列(图7)中潜在的MHC-II类结合基元的存在。通过与位于万维网中网址为 http：//wehih.wehi.edu.au/mhcpep/的MHC结合基元数据库进行计算机辅助的比较进行分析。

“检索”过程的结果表明存在着128个潜在的MHC-II类结合基元。其中，在人种系免疫球蛋白可变区蛋白序列的数据库中鉴定出91个配对序列。这些表位不再予以考虑。由非自身蛋白(如葡萄球菌激酶)呈递的与免疫球蛋白中存在的基元相同或类似的表位有可能被耐受并且实际上可以在去免疫的过程中保留下来。

在减去人免疫球蛋白的种系基元后，独立地分析剩余的37个潜在表位与非免疫球蛋白序列的相似性。实际上，在人的表达蛋白的共有序列检索中采用每个潜在表位的预测的锚定残基。使用可商购的软件(DNAstar Madison，WI，美国)查询SwissProt和GenBank翻译序列数据库。不再考虑在已知的人循环蛋白中鉴定出的表位，从而使其在所述蛋白中保持不变。

这些过程最终的结果是在葡萄球菌激酶分子中鉴定出了那些应当进行改变以消除潜在的MHC-II类结合基元的残基。挑选出预测的结合基元中单个的氨基酸以便改变。为了最大可能地保持蛋白的功能活性，在所有的情况下在任何给定的位点处都选择保守的氨基酸取代。

汇集了一种改变了的葡萄球菌激酶的序列(图8)，并且如前所述通过数据库比较进一步进行分析以验证成功地消除了潜在的MHC-II类结合基元。

用于构建改变的葡萄球菌激酶分子的方法：

根据Genosys生物技术有限公司(剑桥，英国)的合约合成出野生型葡萄球菌激酶的基因。采用长的(80个基体)重叠的合成引物以及由Collen，D等人(Collen，D.等人(1996)出处同上)给出的序列通过PCR构建基因。将合成的基因以453bp的EcoRI-HindIII限制片段的形式克隆到细菌表达载体pMEX(MoBiTec，Gottingen，德国)中。使用可商购的试剂系统以及由供应商提供的说明(Amersham，Little Chalfont，英国)证实该基因序列与数据库的记录是相同的。采用定点诱变pMEX中的野生型基因来改造改变了(减少了免疫原性的)型式的基因。使用短的(18个基体)合成寡核苷酸和“快速-改变”方法以及来自Stratagene(剑桥，英国)的试剂来创制变体基因。所有变体基因序列都通过DNA测序来验证。

通过标准的技术将突变的葡萄球菌激酶基因转化到大肠杆菌菌株TGl中。选出单个转化的克隆，并采用血纤蛋白平板测定(Astrup，T.等人《Arch.Biochem.Biophys.》40：346-351(1952)；Collen，D.等人《纤维蛋白溶解作用》 6：203-213(1992))选出分泌活性葡萄球菌激酶的克隆。培养最佳的表达克隆，并采用连续的柱层析和如前所述的方法(Collen，D.等人(1992)出处同上；Schlott等人，出处同上)从培养上清液中纯化重组蛋白。

实施例4

在本实施例中，分析了bryodin 1中潜在的MHC结合基元的存在并且公开了一种用于从该分子中除去许多所述基元的方法。

近来已经从葫芦科植物的一个成员Bryonia dionia中克隆出bryodin 1蛋白的基因(Gawlak，S.等人《生物化学》36 3095-3103(1997))。Bryodin 1是一种1型核糖体失活蛋白。采用重组形式的蛋白进行的研究已经表明bryodin 1对于癌症和其它疾病的免疫毒素治疗具有良好的前景(Gawlak，S.等人(1997)出处同上)。但是，由于该蛋白在人当中具有免疫原性，因此与其它免疫毒素一样，有可能剥夺该蛋白在临床上在人当中的使用。作为一种基于免疫毒素治疗中潜在的成分，可以得到非免疫原性的bryodin将具有非常重要的意义。

成熟的bryodin蛋白由267个氨基酸的单一多肽链组成，其分子量约为29kDa。在图9中显示出野生型序列。

用于鉴定bryodin 1中潜在的MHC-II类结合基元的方法：

自始至终使用如Gawlak等人(Gawlak，S.等人(1997)出处同上)给出的bryodin 1蛋白的序列。分析成熟的bryodin 1的蛋白序列(图9)中潜在的MHC-II类结合基元的存在。通过与位于万维网中网址为http：//wehih.wehi.edu.au/mhcpep/的MHC结合基元数据库进行计算机辅助的比较进行分析。

“检索”过程的结果表明存在着315个潜在的MHC-II类结合基元。其中，在人种系免疫球蛋白可变区蛋白序列的数据库中鉴定出259个配对序列。这些表位不再予以考虑。

在减去人免疫球蛋白的种系基元后，独立地分析剩余的56个潜在表位与非免疫球蛋白序列的相似性。在人的表达蛋白的共有序列检索中采用每个潜在表位的预测的锚定残基。使用可商购的软件(DNAstarMadison，WI，美国)查询SwissProt和GenBank翻译序列数据库。不再考虑在已知的人循环蛋白中鉴定出的表位，从而使其在所述蛋白中保持不变。

这些过程最终的结果是在bryodin 1分子中鉴定出了那些应当进行改变以消除潜在的MHC-II类结合基元的残基。对bryodin 1蛋白来说，鉴定出13个潜在的表位要从该分子中除去。挑选出预测的结合基元中单个的氨基酸以便改变。为了最大可能地保持蛋白的功能活性，在所有的情况下在任何给定的位点处都选择保守的氨基酸取代。

汇集了一种改变的bryodin 1的序列(图10)，并且如前所述通过数据库比较进一步进行分析以验证成功地消除了潜在的MHC-II类结合基元。

用于构建改变的bryodin 1分子的方法：

根据Genosys生物技术有限公司(剑桥，英国)的合约合成出野生型bryodin 1的基因。采用长的(80个基体)重叠的合成引物以及由Gawlak等人(Gawlak，S.等人(1997)出处同上)给出的序列通过PCR构建基因。将合成的基因以843bp的NcoI-EcoRI限制片段的形式克隆到修饰型的细菌表达载体pET22b+(Novagen，Madison，美国)中。修饰该载体以除去pelB前导序列，其中事先已表明该前导序列阻碍了bryodin 1蛋白的有效表达(Gawlak，S.等人(1997)出处同上)。通过用XbaI和NcoI消化进行修饰，以除去包括pelB前导序列在内的107bp的DNA。通过使接头分子与载体中的XbaI/NcoI游离端相连，在该载体中重建包括核糖体结合位点序列和NcoI位点在内的非pelB序列的元件。接头是通过使下列互补寡核苷酸退火形成的：

Llf(5’-ctagaaataattttgtttaactttaagaaggagatatacatatgcc)和

Llr(5’-ccatggatatgtatatctccttcttaaagttaaacaaaattattt)。

寡核苷酸具有Genosys生物技术有限公司(剑桥，英国)提供的磷酸化末端。限制酶切消化、DNA纯化和连接反应等都是采用标准的方法以及由试剂供应商建议的条件进行的。采用定点诱变修饰的pET22b载体中的野生型基因来改造改变了(减少了免疫原性的)型式的基因。使用短的(18个基体)合成寡核苷酸和“快速-改变”方法以及来自Stratagene(剑桥，英国)的试剂来创制变体基因。所有变体基因序列都通过DNA测序来验证。

通过标准的技术将野生型和突变的bryodin 1基因变体转化到大肠杆菌菌株TG1中。针对每种基因选出单个转化的克隆，并且将该克隆用于序列分析。对表达来说，将bryodin 1的基因转化到从ATCC获得的大肠杆菌菌株BL21(λDE3)中。采用如前所述的方法(Gawlak，S.等人(1997)出处同上)纯化重组的bryodin 1和变体bryodin 1蛋白。在从内含体中重折叠粗蛋白后，采用如前所述的CM-Sepharose层析(Gawlak，S.等人(1997)出处同上)获得了纯度大于95％的纯化的bryodin 1和变体。采用无细胞的蛋白合成抑制测定并根据Siegall等人的方法(Siegall，C.B.等人《生物缀合物化学》5 423-429(1994))评价重组蛋白的活性。

实施例5

在本实施例中，分析了人干扰素α2蛋白中潜在的MHC结合基元的存在并且公开了一种用于从该分子中除去许多所述基元的方法。

干扰素α2(INA2)是一种由活化巨噬细胞表达的重要的糖蛋白细胞因子。该蛋白具有抗病毒活性并在与表达细胞中的干扰素α受体结合时刺激产生至少两种酶：一种蛋白激酶和一种寡腺苷酸合成酶。成熟的INA2蛋白是由165个氨基酸组成的单链多肽，它是通过从氨基末端切下23个氨基酸的信号序列在翻译后加工188个氨基酸的前体蛋白而产生的。

所述蛋白作为广谱的抗病毒剂、抗增殖剂和免疫调制剂具有非常重要的临床意义。在人的多种癌症和病毒适应征的治疗中已经使用了重组的INA2及其它制剂(参阅Sen，G.G.与Lengyel P.《生物化学杂志》267 5017-5020(1992))。尽管对许多病人来说它具有非常显著的治疗益处，但是已经证明在某些病人中对该疗法产生了抵抗力，并且已经表明这种抵抗力的一种重要的机理为在接受治疗的病人血清中生成了可检测到的中和抗体(Quesada，J.R.等人《临床肿瘤学杂志》31522-1528(1985)；Stein R.G.等人《英国新医学杂志》3181409-1413(1988)；Russo，D.等人《Br.J.Haem.》94 300-305(1996)；Brooks M.G.等人《Gut》30 1116-1122(1989))。在这些病人中对治疗用干扰素产生了免疫应答，尽管事实是在人体内内源产生了至少在一级结构上相同的分子。在本实施例中，提供了在人体内具有降低了潜在免疫原性的干扰素α2分子。

用于鉴定人干扰素α2中潜在的MHC-II类结合基元的方法：

从GenBank数据库中鉴定出INF2的序列。自始至终使用登记号为P01563的序列。鉴定成熟的INF2蛋白的蛋白序列，并且分析不包括头23个氨基酸信号肽的序列中潜在的MHC-II类结合基元的存在(图11)。使用MPT 1.0版软件(Biovation，Aberdeen，英国)通过计算机进行分析。该软件包根据WO-A-9859244中公开的方法进行“肽穿线(peptide threading)”。该软件能够提供潜在的肽与18种不同的MHC-II类DR等位基因结合的指数，其中所述的DR等位基因包括在人群中现存的96％以上的HLA-DR的同种异型。

针对INF2进行的“肽穿线”过程的结果表明总共存在着18个独立的潜在的表位。将这些表位定位到重叠表位的5个特有的簇，其中包含残基7-40(簇1)、残基45-70(簇2)、残基79-103(簇3)、残基108-132(簇4)和残基140-163(簇5)。5个簇中的每一个分别含有5，3，4，3和3个潜在的表位。

为了按优先顺序排列用于除去的表位，然后根据所述分子中公知的结构-功能特征给表位簇定位。由制作同源性模型(Murgolo N.J.等人《蛋白：结构、功能与遗传学》17 62-74(1993))、定点诱变(Tymms，M.J.等人《抗病毒研究》12 37-48(1989)；McInnes B.等人《干扰素研究杂志》9 305-314(1989))、杂种嵌合分子(Ra，N.B.K.等人《生物化学杂志》263 8943-8952(1988)；Shafferman，A.等人《生物化学杂志》262 6227-6237(1987))、缺失突变体(Wetzel，R.等人《干扰素》纽约学术出版社，第819-823页(1982))以及血清学定位研究(Lydon N.B.等人《生物化学》24 4131-4141(1985)；Trotta P.P.等人《干扰素系统》Dianzani F & Rossi G.B编辑，纽约，Raven出版社，1985，第231-235页)得到的INF2的证据表明簇1和簇2中的表位是最优先要除去的目标。参照Murgolo等人(Murgolo N.J.等人(1993)出处同上)的结构模型，以5个潜在的表位为特征的簇1包括INF2分子的在功能上重要的螺旋A和AB表面环区域。该区域对于抗病毒活性来说是重要的并且参与了与人INF2受体结构的结合。最为突出的是已经将针对中和抗体的表位定位到该区域，具体地讲为螺旋A结构元件的残基10-11(Lydon N.B.等人(1985)出处同上)。

在该基础上，通过用苏氨酸取代第15位上的亮氨酸(L₁₅t，其中使用了单字母密码)消除在第7-19和第13-25位上的簇1表位。采用MPT 1.0版程序包在计算机中(in silico)交互地进行这一步骤。类似地，通过F₂₇Y取代消除第28-41位上的簇1表位。这一在后的取代伴随着具有将针对第22-34位上的重叠表位的潜在结合等位基因的数量由13减小到11的作用。

簇2表位从AB环穿过螺旋B区延伸至BC环状域。已经表明中和抗体在BC环上结合(Lydon N.B.等人(1985)出处同上；Trotta P.P.等人(1985)出处同上)，因而第58-70位上的簇2表位也是要除去的目标。取代N₆₅L通过消除包含第61-77位的3个重叠表位而降低了该区域中潜在的免疫原性，其中一致预测所述的表位结合5个不同的MHCDR等位基因。另外，这一取代也将位于表位58-70的不同的结合等位基因的数量由5减小到3。

将其它表位簇(例如3-5)或者定位到所述分子的隐蔽区或者定位到不参与受体结合的表面区，从而提供抗体应答大量是非中和的所对应的抗原部位。

采用上述方法，汇集了含有从起始序列进行了3处取代的改变的INF2蛋白序列并且将该序列描绘于图12中。就人的MHC-II类呈递而言，预测该序列显然具有更低的免疫原性。免疫原性减少的区域集中在所述分子中这样的区域，在该区域中已经表明发生了所述蛋白的抗体介导的中和作用，而它具有限制作为一种治疗实体的该分子的临床功效的潜力。

用于构建改变的干扰素α2分子的方法：

根据Genosys生物技术有限公司(剑桥，英国)的合约合成出野生型INA2的基因。采用长的(80个基体)重叠的合成DNA引物以及由GenBank中登记号为M29883给出的序列通过PCR构建基因。将合成的基因以520bp的EcoRI-HindIII限制片段的形式克隆到细菌表达载体pMEX8(MoBiTec，Gottingen，德国)中。使用可商购的试剂系统以及由供应商提供的说明(Ametsham，Little Chalfont，英国)证实该基因序列与想要的基因是相同的。

通过定点诱变pMEX8中的野生型基因来构建改变了(减少了免疫原性的)型式的蛋白。使用商购得到的短的(18个基体)合成寡核苷酸(Genosys，剑桥，英国)和“快速-改变(quick-change)”方法以及来自Stratagene(剑桥，英国)的试剂进行诱变。在定点诱变后，如前所述验证所选出的克隆的DNA序列。

对于重组的野生型和重组的变体INA2蛋白的表达来说，采用标准的步骤(Sambrook J.，Fritisch E.F. & Maniatis T.(1989)出处同上)将pMEX8-INA2表达质粒转化到大肠杆菌菌株JA221中。基本上如前所述(Grosfeld，H.等人《生物技术方法中的进步4》Mizrahi A.& Van Wezel A.L.编辑，第59-78页，Alan R.Liss Inc，纽约(1985))但要作一些较小的改进来制备重组INA2。简单地说，在高速离心后，通过饱和度为60％的硫酸铵浓缩上清液，然后将其在用PBS外加0.5M NaCl平衡的2.7×68cm Sephadex G-75柱中层析。以1min/ml的流速收集级分(8ml)。使用如前所述的免疫亲和柱进一步纯化收集的级分(Grosfeld，H.等人(1985)出处同上)。采用SDS-PAGE分析测定纯化的蛋白，并且采用如前所述的生物测定(Shafferman，A.等人《生物化学杂志》262 6227-6237(1987))来测定其功能活性(抗病毒活性)。

序列表

<110>Biovation有限公司

<120>改变蛋白的免疫原性

<130>P22184WO

<140>PCT/GB99/04119

<141>1999-12-08

<150>GB9826925.1

<151>1998-12-08

<150>GB9902139.6

<151>1999-02-02

<160>26

<170>PatentIn 2.1版

<210>1

<211>627

<212>PRT

<213>眼镜蛇(naja naja)

<400>1

Ala Leu Tyr Thr Leu Ile Thr Pro Ala Val Leu Arg Thr Asp Thr Glu

1 5 10 15

Glu Gln Ile Leu Val Glu Ala His Gly Asp Ser Thr Pro Lys Gln Leu

20 25 30

Asp Ile Phe Val His Asp Phe Pro Arg Lys Gln Lys Thr Leu Phe Gln

35 40 45

Thr Arg Val Asp Met Asn Pro Ala Gly Gly Met Leu Val Thr Pro Thr

50 55 60

Ile Glu Ile Pro Ala Lys Glu Val Ser Thr Asp Ser Arg Gln Asn Gln

65 70 75 80

Tyr Val Val Val Gln Val Thr Gly Pro Gln Val Arg Leu Glu Lys Val

85 90 95

Val Leu Leu Ser Tyr Gln Ser Ser Phe Leu Phe Ile Gln Thr Asp Lys

100 105 110

Gly Ile Tyr Thr Pro Gly Ser Pro Val Leu Tyr Arg Val Phe Ser Met

115 120 125

Asp His Asn Thr Ser Lys Met Asn Lys Thr Val Ile Val Glu Phe Gln

130 135 140

Thr Pro Glu Gly Ile Leu Val Ser Set Asn Ser Val Asp Leu Asn Phe

145 150 155 160

Phe Trp Pro Tyr Asn Leu Pro Asp Leu Val Ser Leu Gly Thr Trp Arg

165 170 175

Ile Val Ala Lys Tyr Glu His Ser Pro Glu Asn Tyr Thr Ala Tyr Phe

180 185 190

Asp Val Arg Lys Tyr Val Leu Pro Ser Phe Glu Val Arg Leu Gln Pro

195 200 205

Ser Glu Lys Phe Phe Tyr Ile Asp Gly Asn Glu Asn Phe His Val Ser

210 215 220

Ile Thr Ala Arg Tyr Leu Tyr Gly Glu Glu Val Glu Gly Val Ala Phe

225 230 235 240

Val Leu Phe Gly Val Lys Ile Asp Asp Ala Lys Lys Ser Ile Pro Asp

245 250 255

Ser Leu Thr Arg Ile Pro Ile Ile Asp Gly Asp Gly Lys Ala Thr Leu

260 265 270

Lys Arg Asp Thr Phe Arg Ser Arg Phe Pro Asn Leu Asn Glu Leu Val

275 280 285

Gly His Thr Leu Tyr Ala Ser Val Thr Val Met Thr Glu Ser Gly Ser

290 295 300

Asp Met Val Val Thr Glu Gln Ser Gly Ile His Ile Val Ala Ser Pro

305 310 315 320

Tyr Gln Ile His Phe Thr Lys Thr Pro Lys Tyr Phe Lys Pro Gly Met

325 330 335

Pro Tyr Glu Leu Thr Val Tyr Val Thr Asn Pro Asp Gly Ser Pro Ala

340 345 350

Ala His Val Pro Val Val Ser Glu Ala Phe His Ser Met Gly Thr Thr

355 360 365

Leu Ser Asp Gly Thr Ala Lys Leu Ile Leu Asn Ile Pro Leu Asn Ala

370 375 380

Gln Ser Leu Pro Ile Thr Val Arg Thr Asn His Gly Asp Leu Pro Arg

385 390 395 400

Glu Arg Gln Ala Thr Lys Ser Met Thr Ala Ile Ala Tyr Gln Thr Gln

405 410 415

Gly Gly Ser Gly Asn Tyr Leu His Val Ala Ile Thr Ser Thr Glu Ile

420 425 430

Lys Pro Gly Asp Asn Leu Pro Val Asn Phe Asn Val Lys Gly Asn Ala

435 440 445

Asn Ser Leu Lys Gln Ile Lys Tyr Phe Thr Tyr Leu Ile Leu Asn Lys

450 455 460

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Lys Gly Asp Asn Leu Ile Gln Met Pro Gly Ala Ala Met Lys Ile Lys

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<213>眼镜蛇

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<212>PRT

<213>似马链球菌

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Ser Ser Ser Phe Asp Lys Gly Lys Tyr Lys Glu Gly Asp Asp Ala Ser

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<211>267

<212>PRT

<213>Bryonia dionia

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Ser Ala Leu Ser Lys Gln Ile Gln Ile Ala Ser Thr Asn Asn Gly Gln

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Leu Asn Arg Asn Asn Ile Ala Ala Val Gly Glu Asp Ile Ser Met Thr

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<212>PRT

<213>人

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100 105 110

Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu

115 120 125

Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg

130 135 140

Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu Ser

145 150 155 160

Leu Arg Ser Lys Glu

165

<210>14

<211>165

<212>pRT

<213>人

<400>14

Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Thr Met

1 5 10 15

Leu Leu Ala Gln Met Arg Lys Ile Ser Leu Phe Tyr Cys Leu Lys Asp

20 25 30

Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln

35 40 45

Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Ile Phe

50 55 60

Leu Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu

65 70 75 80

Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu

85 90 95

Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val Thr Glu Thr Pro Leu Met Lys

100 105 110

Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu

115 120 125

Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg

130 135 140

Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu Ser

145 150 155 160

Leu Arg Ser Lys Glu

165

<210>15

<211>7

<212>PRT

<213>眼镜蛇

<400>15

Phe Lys Pro Gly Met Pro Tyr

1 5

<210>16

<211>9

<212>PRT

<213>眼镜蛇

<400>16

Tyr Tyr Gln Val Gly Asn Asn Glu Tle

1 5

<210>17

<211>9

<212>PRT

<213>人

<400>17

Tyr Val Val Val Gln Val Thr Gly Pro

1 5

<210>18

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：PCR引物CVF1

<400>18

ataagaatgc ggccgcatgg agaggatggc tctct 35

<210>19

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：PCR引物CVF1reV

<400>19

ataagaatgc ggccgctatc attgattctt ctgaac 36

<210>20

<211>9

<212>PRT

<213>似马链球菌

<400>20

Leu Leu Lys Ala Ile Gln Glu Gln Leu

1 5

<210>21

<211>7

<212>PRT

<213>似马链球菌

<400>21

Tyr Val Asp Val Asn Thr Asn

1 5

<210>22

<211>8

<212>PRT

<213>似马链球菌

<400>22

Lys Ala Asp Leu Leu Lys Ala Ile

1 5

<210>23

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：PCR引物SK1

<400>23

ggaattcatg attgctggac ctgagtggct g 31

<210>24

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：PCR引物 SK2

<400>24

tggatcctta tttgtcgtta gggtatc 27

<210>25

<211>46

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：寡核苷酸

Llf

<400>25

ctagaaataa ttttgtttaa ctttaagaag gagatataca tatgcc 46

<210>26

<211>45

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：寡核苷酸

Llr

<400>26

ccatggatat gtatatctcc ttcttaaagt taaacaaaat tattt 45

Claims

1.通过去除蛋白质的一个或多个潜在T细胞表位而使所述蛋白或其一部分对给定的人类物种具有非免疫原性或者较少免疫原性的方法，其中所述蛋白质相对于所述人类物种是自身蛋白质，并且所述蛋白质中的所述T细胞表位结合MHC-II类分子，但不能为所述人类物种的免疫系统利用以获得耐受性。

2.权利要求1的方法，其中所述T细胞表位在所述给定人类物种中不引发T细胞反应，其前提是该人类物种不识别被所述人类物种所耐受的作为自身蛋白或自身肽的所述蛋白质或肽序列。

3.权利要求1或2的方法，其中去除一个或多个T细胞表位包括下述步骤：

a)确定所述蛋白质的至少部分氨基酸序列；

b)在所述氨基酸序列内分析肽序列以确定MHC-II类结合基元，并将所述序列与MHC数据库中的人类MHC-II类结合基元进行比较，从而鉴定所述蛋白质氨基酸序列中含有一个或多个潜在T细胞表位的第一套潜在T细胞表位；

c)从所述第一套潜在T细胞表位中减去也存在于人类免疫球蛋白可变区种系序列中的潜在T细胞表位，其中所述种系序列得自人类种系数据库，从而得到含有一个或多个潜在T细胞表位的第二套潜在T细胞表位，该第二套潜在T细胞表位与第一套相比其T细胞基元的数目减少了；以及

d)从所述蛋白质氨基酸序列中消除至少一个步骤c)所鉴定的所述T细胞表位，其方法是改变所述鉴定的T细胞表位内或邻近的一个或多个氨基酸残基。

4.权利要求1-2中任何一项的方法，其中另外还去除了B细胞表位。

5.权利要求3的方法，其中鉴定步骤是通过计算手段完成的。

6.权利要求5的方法，其中所述计算手段鉴定了重叠T细胞表位的不同簇。

7.权利要求5的方法，其中根据所述蛋白质已知的结构—功能特征对鉴定的T细胞表位定位，从而按优先顺序对其进行区分。

8.权利要求3的方法，其中通过氨基酸取代对鉴定的T细胞表位进行了改变。

9.权利要求8的方法，其中所述氨基酸取代是参照同源蛋白的一级结构进行的，或在相似的大小和/或电荷的基础上进行的，或是参照计算机制作蛋白质模型技术进行的。

10.根据权利要求1-2中任一项的方法，其中所述蛋白质是胞内蛋白质。