TW201632542A

TW201632542A - 包含缺乏醣基化信號之修飾噬菌體ｇ３ｐ胺基酸序列的多肽

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Publication number: TW201632542A
Application number: TW104140347A
Authority: TW
Inventors: 拉賈拉曼克里斯南; 伊娃艾斯普; 明波斯奇茲基; 理察費雪; 法蘭西斯Ｊ卡爾; 羅伯特ＧＥ霍爾蓋特; 提摩西Ｄ瓊斯
Original assignee: 神經噬菌體製藥股份有限公司
Priority date: 2014-12-03
Filing date: 2015-12-02
Publication date: 2016-09-16
Also published as: EA201791212A1; WO2016090022A9; EP3227313A1; PH12017501004A1; ES2910017T3; CN107250154A; CA2969128A1; JP2020073610A; MX2017007059A; US11723951B2; JP2017538407A; DK3227313T3; KR20170085132A; IL252426A0; PL3227313T3; BR112017011530A2; AU2015358504A1; AR102890A1; JP6730988B2; WO2016090022A8

Abstract

本發明係關於多肽，該等多肽包含足以結合至澱粉樣蛋白及/或使澱粉樣蛋白解聚之絲狀噬菌體基因3蛋白質(g3p)之一部分，例如，g3p之N1-N2部分及其突變體及片段，其中該g3p胺基酸序列經由胺基酸缺失、插入或取代來修飾以移除推定醣基化信號。本發明進一步係關於如下多肽，該等多肽亦經由額外胺基酸取代來修飾以在體內使用時，與對應野生型g3p胺基酸序列相比，免疫原性大致上更小。本發明之多肽保持其結合澱粉樣蛋白及/或使澱粉樣蛋白解聚之能力。本發明進一步係關於此等g3p修飾多肽在治療及/或預防與澱粉樣蛋白之錯誤摺疊或聚集相關聯之疾病中之用途。

Description

包含缺乏醣基化信號之修飾噬菌體G3P胺基酸序列的多肽

本申請案主張2014年12月3日申請之美國臨時申請案第62/087,052號的權益，該申請案以全文引用方式併入本文以提供揭示內容之連續性。

本發明係關於多肽，該等多肽包含足以結合至及/或使澱粉樣蛋白解聚之絲狀噬菌體基因3蛋白質(g3p)之一部分，亦即，g3p之N1-N2部分及其突變體及片段，其中該g3p胺基酸序列經由胺基酸缺失、插入或取代來修飾以移除推定醣基化信號。本發明進一步係關於如下多肽，該等多肽亦經由額外胺基酸取代來修飾以在體內使用時，與對應野生型g3p胺基酸序列相比，免疫原性大致上更少。本發明之多肽保持其結合及/或使澱粉樣蛋白解聚之能力。本發明進一步係關於此等g3p修飾多肽在治療及/或預防與澱粉樣蛋白之錯誤摺疊或聚集相關聯之疾病中之用途。

絲狀噬菌體g3p蛋白質，及尤其包含g3p之N1-N2區域之其多肽部分已經展示可結合至及使各種澱粉樣蛋白，如β-澱粉樣蛋白、tau蛋白質及普里昂蛋白質解聚。參見共同申請中之PCT申請案PCT/US2012/066793，及美國臨時申請案US 61/801,349，及US 61/801,849，其中之每一者之揭示內容以引用方式併入本文。亦參見R.Krishnan等人，J. Mol.Biol.(2014)。儘管存在此功效，但預期此等多肽在重組哺乳動物細胞系統中之產生可受到g3p序列中推定天冬醯胺酸連接的醣基化信號處之醣基化有害影響。另外，將包含g3p或其N1-N2區域之多肽全身性投與人可導致有害免疫響應。此等先前技術教示中沒有一個識別與推定醣基化有關之任何潛在問題。

許多重組或另外非原生治療性蛋白質或多肽之功效可受到患者對於治療性蛋白質或多肽之不需要免疫反應限制。在藉由蛋白質來誘導免疫響應中之主要因素係在蛋白質內存在T-細胞抗原決定基，即，可經由在主要組織相容性複合物(MHC)種類II分子上呈遞來刺激T-細胞之活性之胺基酸序列。T-細胞抗原決定基通常定義為具有結合至MHC種類II分子之能力之任何胺基酸序列。當結合至MHC分子時，T-細胞抗原決定基可藉由T-細胞受體(TCR)來識別，並且可藉由嚙合T-細胞受體來導致T-細胞之活化以促進T-細胞響應。然而，通常理解結合至MHC種類II分子之某些T-細胞抗原決定基不刺激T-細胞響應，因為此等肽在投與蛋白質之生物體內被識別為「自身」肽。

在治療性蛋白質或多肽在細胞內降解期間，一些T-細胞抗原決定基可作為肽來釋放，然後藉由MHC之分子來呈遞以觸發T-細胞之活化。對於藉由MHC種類II分子呈遞之肽而言，然後，T-細胞之此活化可例如藉由直接刺激B-細胞來產生此等抗體而引起抗體響應。

MHC種類II分子係在輔助T-細胞選擇及活化中發揮核心作用的一組高度多形性蛋白質。人白細胞抗原組DR(HLA-DR)係此組蛋白質之主要同種型。然而，同種型HLA-DQ及HLA-DP執行類似功能。在人中，已知DR同種型之大約70個不同同種異型，對於DQ而言，存在30個不同同種異型並且，對於DP而言，已知47個不同同種異型。每個個體攜帶兩個至四個DR等位基因，兩個DQ及兩個DP等位基因。

個體中之對於蛋白質或多肽之免疫響應受到T-細胞抗原決定基識別顯著地影響，該抗原決定基識別隨著此個體之HLA-DR同種異型之肽結合特異性而變化。為了在全球人口之情形下，識別蛋白質或多肽內之T-細胞抗原決定基，需要考慮一組儘可能多種多樣的HLA-DR同種異型之結合性質，由此涵蓋儘可能較高百分比之世界人口。

T-細胞抗原決定基識別係抗原決定基消除之第一步驟。實現T-細胞抗原決定基之偵測之方法在此項技術中為已知的並且揭示於WO 98/52976、WO 00/34317、US2007/0269435；US 7,208,147、Kern等人，Nature Medicine 4：975-978(1998)；及Kwok等人，Trends in Immunology 22：583-588(2001)中。在此等方法中，所預測或識別之T-細胞抗原決定基藉由使用治療性蛋白質或多肽之原始序列內之合理胺基酸取代來移除。雖然此等參考實現T-細胞抗原決定基之推定識別，但是選擇避免對於生物活性之負面影響之胺基酸取代不能得到合理地預測。此情形僅可藉由對於此活性來測試修飾多肽中之每一者來確定。

因此，需要檢查並減少醣基化，此過程係單獨進行的或在不破壞其澱粉樣蛋白結合/解聚性質的情況下減少與g3p之N1-N2部分之免疫原性一起來進行。此允許在哺乳動物細胞中產生包含g3p之N1-N2部分之多肽而不產生與醣基化相關之難題。另外，減少免疫原性允許包含N1-N2部分之多肽出於治療及/或診斷目的來長期全身投與。本發明滿足此需要，藉由識別g3p之N1-N2部分中之推定醣基化信號並且在保持g3p多肽之活性的同時提供其防止醣基化之修飾，如PCT/US13/62862(WO 2014/055515)中所描述，或將g3p多肽修飾以減少或消除免疫原性，如PCT/US2014/039760中所描述，兩者以引用方式併入本文。因此，g3p本發明之某些多肽不僅經過修飾以防止醣基化，而且包含此等潛在T-細胞抗原決定基內之特定胺基酸取代以產生變異體N1-N2序列，該序列減少或消除此T-細胞抗原決定基之免疫原性而不破壞變異體N1-N2結合至澱粉樣蛋白、防止澱粉樣蛋白聚集，及/或實現澱粉樣蛋白斑之解聚的能力。

在本發明之某些實施例中，多肽包含經過修飾以移除醣基化信號的g3p或其澱粉樣蛋白結合片段。在一實施例中，本發明亦提供包含N1-N2胺基酸序列之變異體，或其突變體或片段的多肽，其由於所識別的T-細胞抗原決定基中之一或多者內的一或多個胺基酸取代及缺乏醣基化信號而具有減少之免疫原性。在一態樣中，本發明提供包含融合至人免疫球蛋白Fc區域之變異體N1-N2序列的融合蛋白質。

在另一實施例中，本發明提供包含本發明之多肽的醫藥組成物及藉由將此等醫藥組成物投與患有或易患此疾病之受試者來治療或預防與錯誤摺疊及/或聚集澱粉樣蛋白相關聯之疾病的方法。

在另一個實施例中，本發明提供編碼本發明之多肽的核酸分子，以及包含彼等核酸分子之載體及容納此等載體之細胞。

在另一實施例中，本發明提供產生本發明之多肽的方法。具體而言，此等方法使用核酸分子及/或容納包含此等核酸分子之載體的細胞。

圖1呈現具有藉由粗體及底線識別之五個T-細胞抗原決定基及斜體、粗體及加底線之推定醣基化信號的N1-N2-hIgG1-Fc融合蛋白質(SEQ ID NO：1)之胺基酸序列。胺基酸1-217構成野生型g3p序列之N1-N2部分。胺基酸218-256表示由存在於M13噬菌體中之野生型g3p富含甘胺酸N2-C末端連接子組成之連接子區域。此區域藉由陰影識別。胺基酸 257-261表示藉由用於構建編碼融合蛋白質之核酸分子的多個選殖部位來編碼之胺基酸。蛋白質之IgG-Fc部分開始於胺基酸262。

圖2呈現具有藉由粗體及底線識別之三個T-細胞抗原決定基及斜體、粗體及加底線之推定醣基化信號的另一個g3p-hIgG1-Fc融合蛋白質(SEQ ID NO：2)之胺基酸序列。第四個T-細胞抗原決定基藉由如與SEQ ID NO：1相比之V215A及G220E之取代來消除並且第五個T-細胞抗原決定基藉由對應於SEQ ID NO：1之胺基酸258及259之胺基酸之缺失來消除。

圖3呈現編碼具有N末端哺乳動物信號序列之SEQ ID NO：1之g3p-hIgG1-Fc融合蛋白質之DNA序列(SEQ ID NO：3)。

圖4呈現編碼具有N末端哺乳動物信號序列之SEQ ID NO：2之g3p-hIgG1-Fc融合蛋白質之DNA序列(SEQ ID NO：4)。

圖5提供實例1所描述之研究中表現之供體同種異型之頻率之比較。

圖6呈現本發明之多肽的胺基酸序列(SEQ ID NO：5)，其為與SEQ ID NO：2相比在推定醣基化信號(T41G)、抗原決定基1(T56H)及抗原決定基3(K174R)中具有胺基酸變化之g3p-hIgG1-Fc融合蛋白質。將取代胺基酸加粗體、斜體、加底線並且藉由灰色高亮度顯示。

圖7呈現編碼具有N末端哺乳動物信號序列之多肽86之質粒的DNA序列(SEQ ID NO：6)。編碼序列，包括信號序列藉由粗體來指示。如與編碼SEQ ID NO：1之DNA相比的密碼子變化藉由底線來指示。

圖8呈現編碼具有N末端哺乳動物信號序列之多肽86 T41G之質粒的DNA序列(SEQ ID NO：7)。編碼序列，包括信號序列藉由粗體來指示。如與編碼SEQ ID NO：1之DNA相比的密碼子變化藉由底線來指示。

圖9描繪將SEQ ID NO：1之多肽與多肽86及多肽86 T41G 比較的SDS-PAGE分析。

圖10描繪將SEQ ID NO：1之多肽與多肽86及多肽86 T41G比較的過濾阻滯檢定之結果。

圖11描繪SEQ ID NO：1之多肽與多肽86 T41G對於三種不同類型之纖維的比較性結合，如藉由ELISA量測。

在本申請案中，相對於參考(未修飾)胺基酸或核酸序列之「變異體」(及其同源物)一詞係指含有一或多個胺基酸取代、缺失或插入，或密碼子之對應取代、缺失或插入的序列。參考序列亦稱為「起始胺基酸序列」或「起始序列」。變異體不一定需要參考序列之實體調處。只要序列含有如與參考序列相比之不同胺基酸，其被視為「變異體」，不論其如何合成。

如本文使用，「突變體」(及其同源物)一詞係指如與申請案闡明之特定序列(例如，SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2等)相比已經修飾之起始序列。

如本文使用，用語「修飾」(及其同源詞)係指參考胺基酸序列或核酸序列中之變化。當起始序列被修飾時，所得序列為變異體。修飾包括一或多個胺基酸取代、缺失或插入，或密碼子之對應取代、缺失或插入。

如本文使用，「對應取代」一詞意謂SEQ ID NO：1之胺基酸1-217之突變體或片段中之取代，其對應於在此突變體或片段與SEQ ID NO：1之胺基酸1-217比對時的表1、表2、表6或表7中之等效胺基酸取代。

結合至及/或使澱粉樣蛋白解聚之SEQ ID NO：1之胺基酸1-217之片段之實例包括但不限於包含SEQ ID NO：1之胺基酸1-67之任何片段。結合至及/或使澱粉樣蛋白解聚之SEQ ID NO：1之胺基酸1-217之突變體之實例包括但不限於：(1)SEQ ID NO：2之胺基酸1-217；(2)SEQ ID NO：1之胺基酸1-217、SEQ ID NO：2之胺基酸1-217，或SEQ ID NO：5之胺基酸1-217，其攜帶胺基酸43-45處之VVV藉由AAA之取代；(3)SEQ ID NO：1之胺基酸1-217、SEQ ID NO：2之胺基酸1-217，或SEQ ID NO：5之胺基酸1-217，其具有取代C53W；(4)SEQ ID NO：1之胺基酸1-217、SEQ ID NO：2之胺基酸1-217，或SEQ ID NO：5之胺基酸1-217，其具有胺基酸96-103之缺失；(5)SEQ ID NO：1之胺基酸1-217、SEQ ID NO：2之胺基酸1-217，或SEQ ID NO：5之胺基酸1-217，其攜帶胺基酸212-214處之QPP藉由AGA之取代；(6)SEQ ID NO：1之胺基酸1-217、SEQ ID NO：2之胺基酸1-217，或SEQ ID NO：5之胺基酸1-217，其具有取代W181A、F190A及F194A；(7)PCT/US2012/066793揭示之其他活性突變體及片段；(8)SEQ ID NO：5之胺基酸1-217；(9)SEQ ID NO：1之胺基酸2-217、SEQ ID NO：2之胺基酸2-217，或SEQ ID NO：5之胺基酸2-217；(10)SEQ ID NO：1之胺基酸3-217、SEQ ID NO：2之胺基酸3-217，或SEQ ID NO：5之胺基酸3-217；(11)含有額外N末端甲硫胺酸殘基之SEQ ID NO：1之胺基酸1-217、SEQ ID NO：2之胺基酸1-217，或SEQ ID NO：5之胺基酸1-217中之任一者。

絲狀噬菌體g3p蛋白質之N1-N2部分先前展示為具有澱粉樣蛋白結合及解聚性質(參見PCT/US2012/066793)。原生M13噬菌體之N1-N2部分藉由SEQ ID NO：1之胺基酸1-217來表示。相同N1-N2胺基酸序列亦存在於fd及f1絲狀噬菌體中。應瞭解SEQ ID NO：1之胺基酸218-256亦為原生g3p序列之部分並且通常被稱為將g3p之N2區域連接至g3p之C末端域(CT)的富含甘胺酸連接子，該C末端域亦稱為N3域。SEQ ID NO：1之胺基酸257-261表示藉由用於構建編碼SEQ ID NO：1之融合蛋白質之核酸分子的多個選殖部位來編碼的胺基酸。

多肽

因此，在一實施例中，本發明提供包含起始胺基酸序列之變異體的多肽，其中起始胺基酸序列選自：SEQ ID NO：1之胺基酸1-217或SEQ ID NO：2之胺基酸1-217及前述多肽中之任一者的具有以下修飾中之一或多者的突變體：胺基酸43-45處之VVV藉由AAA之取代；取代C53W；胺基酸96-103之缺失；胺基酸212-214處之QPP藉由AGA之取代；取代W181A、F190A及F194A；胺基酸1之缺失；胺基酸1及2之缺失；及N末端甲硫胺酸殘基之添加，其中：(a)起始胺基酸序列經過修飾以移除胺基酸39-41處之推定醣基化信號；及(b)多肽結合至及/或使澱粉樣蛋白解聚。

在此實施例之一態樣中，起始胺基酸序列選自：SEQ ID NO：1之胺基酸1-217，及SEQ ID NO：2之胺基酸1-217。

推定醣基化信號之消除藉由N39、A40及/或T41中之一或多者之胺基酸取代來達成；N39、A40及/或T41中之一或多者之缺失；N39與A40之間之一或多個胺基酸之插入；及A40與T41之間之一或多個胺基酸之插入，只要此類取代、缺失或插入不使醣基化信號再生。推定醣基化序列為Asn-X-Thr/Ser，其中X為除了Pro或Cys以外的任何胺基酸。因此，僅A40之某些取代消除醣基化序列。在此等實施例之一態樣中，推定醣基化信號之消除藉由N39、A40及/或T41中之一或多者之胺基酸取代來達成。在此等實施例之更具體態樣中，推定醣基化信號之消除藉由T41之胺基酸取代來達成。在此等實施例之甚至更具體態樣中，推定醣基化信號之消除藉由以下取代中之任一者來達成：T41G、T41W、T41H、T41V、T41I、T41L、 T41R、T41K、T41Y、T41F、T41D、T41E、T41Q、T41N或T41A。在此等實施例之最具體態樣中，推定醣基化信號之消除藉由T41G取代來達成。

在本發明之另一實施例中，如與包含起始胺基酸序列之對應多肽相比，經過修飾以移除胺基酸39-41處之推定醣基化信號的多肽另外具有減少免疫原性；並且如與起始胺基酸序列相比，變異體具有1至9個胺基酸取代(除了消除醣基化信號之任何取代以外)，其中每一胺基酸取代選自表1及表2闡明之胺基酸取代之群。如本文使用，用語「包含起始胺基酸序列之對應多肽」意謂除了醣基化信號之修飾及額外取代以外，具有與包含起始胺基酸序列之多肽相同胺基酸序列的多肽。

表1及2闡明之胺基酸取代藉由識別完全存在於N1-N2胺基酸序列中之T-細胞抗原決定基來衍生。此舉藉由相對於來自最佳表示HLA-DR同種異型之世界人口之社區血液供體之群組的外周血單核細胞(PBMC)孵育N1-N2序列之不同重疊肽部分來進行以識別潛在T-細胞抗原決定基。然後，此資訊相對於已知T-細胞抗原決定基之資料庫來經受軟體分析以識別彼等潛在抗原決定基內之最佳胺基酸取代。此等程序在實例中詳細描述。

在此等實施例之一態樣中，1-9個額外胺基酸取代(除了消除醣基化信號之任何取代以外)選自表1中闡明之彼等。在以上闡明之實施例之更具體態樣中，多肽包含SEQ ID NO：1之胺基酸1-217之變異體或SEQ ID NO：2之胺基酸1-217之變異體，其僅具有單一具體胺基酸取代，其中取代選自表3闡明之取代之一者：

在此等實施例之甚至更具體態樣中，具體單一胺基酸取代不在抗原決定基2(SEQ ID NO：1之胺基酸135-143)中。

在一些實施例中，多肽包含SEQ ID NO：1之胺基酸1-217之變異體或SEQ ID NO：2之胺基酸1-217之變異體，其具有2-9個胺基酸取代(除了消除醣基化信號之任何取代以外)，其中取代在抗原決定基1、2及3之至少兩者中，並且其中取代選自表1及2中闡明之彼等。在更具體態樣中，SEQ ID NO：1之胺基酸1-217之變異體或SEQ ID NO：2之胺基酸1-217之變異體中之至少兩個取代選自表1中闡明之彼等。在甚至更具體態樣中，多肽包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2之變異體，其僅具有兩個胺基酸取代，其中取代選自表4闡明之具體兩個胺基酸取代中之任何者：

在此等實施例之更具體態樣中，兩個胺基酸取代都不在抗原決定基2(SEQ ID NO：1之胺基酸135-143)中。在此等實施例之甚至更具體態樣中，兩個胺基酸取代在T56H及K174R中。

在另一實施例中，多肽包含SEQ ID NO：1之胺基酸1-217之變異體或SEQ ID NO：2之胺基酸1-217之變異體，其具有3-9個胺基酸取代(除了消除醣基化信號之任何取代以外)，其中至少一個胺基酸取代在抗原決定基1、2及3之每一者中，並且其中取代選自表1及表2闡明之取代。在更具體態樣中，SEQ ID NO：1之胺基酸1-217之變異體或SEQ ID NO：2之胺基酸1-217之變異體中之至少三個胺基酸取代選自表2闡明之取代。在甚至更具體態樣中，包含SEQ ID NO：1之胺基酸1-217之變異體或SEQ ID NO：2之胺基酸1-217之變異體的多肽僅具有三個胺基酸取代，其中取代選自表5闡明之具體三個胺基酸取代之任何者。

在另一實施例中，本發明提供包含g3p變異體之多肽，其中1至9個取代之一者為選自V215A、V215S、V215G或V215T、V215C、V215D、V215E、V215F、V215H、V215K、V215N、V215P、V215Q或V215R之抗原決定基4中之取代。在仍然另一實施例中，本發明提供包含SEQ ID NO：1之胺基酸1-217之變異體的多肽，其中1至9個取代之一者為選自V215A、V215S、V215G、V215T、V215C、V215D、V215E、V215F、V215H、V215K、V215N、V215P、V215Q或V215R之抗原決定基4中之取代。經由測試N1-N2序列之重疊潛在T-細胞抗原決定基肽部分，申請人確定SEQ ID NO：1中之V215為跨越SEQ ID之胺基酸215-223(N2之末端至富含甘胺酸連接子之部分)之潛在T-細胞抗原決定基(圖1中之抗原決定基4)之一部分。在此實施例之更具體態樣中，抗原決定基4具有V215A及G220E取代(如在SEQ ID NO：2中)。另外，如與SEQ ID NO：1相比之抗原決定基4中之單一V215G取代不影響多肽結合至或使澱粉樣蛋白解聚的能力。以上闡明之V215之其他取代中之每一者類似地藉由軟體及資料庫分析來預測以消除T-細胞抗原決定基，同時對於澱粉樣蛋白結合幾乎沒有影響。

在更具體態樣中，包含SEQ ID NO：1之胺基酸1-217之變異體的多肽具有移除胺基酸39-41處之推定醣基化部位之修飾；以上闡明之V215取代中之任一者；以及表1或表2闡明之胺基酸取代中之1-8。在甚至更具體實施例中，1-8個胺基酸取代選自表1中闡明之彼等。在甚至更具體態樣中，多肽具有選自T41G、T41W、T41H、T41V、T41I、T41L、T41R、T41K、T41Y、T41F、T41D、T41E、T41Q、T41N及T41A之T41取代；選自V215A、V215S、V215G或V215T、V215C、V215D、V215E、V215F、V215H、V215K、V215N、V215P、V215Q及V215R之V215取代；及選自表3中闡明之彼等的一個額外單一胺基酸取代，其中單一胺基酸取代不在抗原決定基2中。在更具體態樣中，包含SEQ ID NO：1之胺基酸1-217之變異體的多肽具有移除胺基酸39-41處之推定醣基化部位之修飾；以上闡明之V215取代中之任一者；及2-8個額外胺基酸取代，其中額外取代在抗原決定基1、2及3之至少兩者中，並且其中取代選自表1或表2中闡明之彼等。在甚至更具體實施例中，抗原決定基1、2及3之至少兩者中之至少一個取代選自表1闡明之取代。在仍然更具體實施例中，多肽具有選自T41G、T41W、T41H、T41V、T41I、T41L、T41R、T41K、T41Y、T41F、 T41D、T41E、T41Q、T41N及T41A之T41取代；選自V215A、V215S、V215G或V215T、V215C、V215D、V215E、V215F、V215H、V215K、V215N、V215P、V215Q及V215R之V215取代；及表4闡明之具體兩個胺基酸取代之一者，其中兩個胺基酸取代都不在抗原決定基2中。

在更具體態樣中，包含SEQ ID NO：1之胺基酸1-217之變異體的多肽具有移除胺基酸39-41處之推定醣基化部位之修飾；以上闡明之V215取代中之任一者；及選自表1或表2中闡明之彼等的3-8個額外胺基酸取代，其中抗原決定基1、2及3中之每一者包含額外取代之一者。在甚至更具體實施例中，抗原決定基1、2及3之每一者中之取代選自表1中闡明之彼等。在仍然更具體實施例中，多肽具有選自T41G、T41W、T41H、T41V、T41I、T41L、T41R、T41K、T41Y、T41F、T41D、T41E、T41Q、T41N及T41A之T41取代；選自V215A、V215S、V215G或V215T、V215C、V215D、V215E、V215F、V215H、V215K、V215N、V215P、V215Q及V215R之V215取代；任擇G220E取代；及表5闡明之具體三個胺基酸取代之一者。

在甚至更具體實施例中，多肽包含SEQ ID NO：2之胺基酸1-217之變異體，其具有選自T41G、T41W、T41H、T41V、T41I、T41L、T41R、T41K、T41Y、T41F、T41D、T41E、T41Q、T41N及T41A之T41取代；及選自表4中闡明之彼等的一對取代，其中取代之一者在抗原決定基1中並且另一者在抗原決定基3中。在此實施例之一態樣中，T41取代為T41G。在此實施例之替代態樣中，其中取代之一者在抗原決定基1中並且另一者在抗原決定基3中的一對取代為T56H及K174R。在此實施例之甚至更具體態樣中，多肽包含SEQ ID NO：5之胺基酸1-215。在另一實施例中，本發明之多肽為融合蛋白質，其基本上由經由肽連接子或直接融合至變異體g3p胺基酸序列之C末端的人或人類化免疫球蛋白Fc多肽序列組成。如本文使用，用語「肽連接子」係指不干擾多肽之功能的一系列連續胺基酸。如以上闡明，在SEQ ID NO：1及3中，胺基酸218-256表示通常存在於M13 g3p蛋白質中之富含甘胺酸連接子。在本發明之多肽中，可使用該連接子或不同連接子可將其取代。或者，Fc多肽序列可直接連接至編碼N2之最後一個胺基酸(例如，SEQ ID NO1及3之胺基酸217)。連接子序列之選擇及/或其不存在可藉由熟習此項技術者考慮到可用於本發明之多肽之重組表現之載體，及此連接子可賦予多肽的任何二級或三級結構來作出。在此實施例之一態樣中，Fc多肽為人IgG之Fc部分。在更具體態樣中，多肽為SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3之變異體，其具有移除胺基酸39-41處之推定醣基化部位之修飾。在甚至更具體態樣中，多肽為SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2之變異體，其具有移除胺基酸39-41處之推定醣基化部位之修飾；及其中之1至9個額外胺基酸殘基取代，該等取代選自以下表1、表2或表6或表7中闡明之胺基酸取代之群：

在一實施例中，多肽為SEQ ID NO：1之變異體，其具有移除胺基酸39-41處之推定醣基化部位之修飾；及2-9個額外胺基酸取代，其中額外取代之一者為表6及表7闡明之取代；並且取代中之至少一個其他取代為表1及表2闡明之取代。在此實施例之更具體態樣中，額外取代之一者為表6闡明之取代；並且取代中之至少一個其他取代為表1闡明之取代。在此實施例之甚至更具體態樣中，多肽在抗原決定基2中不具有取代。在此實施例之另一個甚至更具體態樣中，多肽具有選自T41G、T41W、T41H、T41V、T41I、T41L、T41R、T41K、T41Y、T41F、T41D、T41E、T41Q、T41N及T41A之T41取代。在此實施例之仍然更具體態樣中，多肽具有T41G取代。

在另一實施例中，多肽為SEQ ID NO：1之變異體，其具有移除胺基酸39-41處之推定醣基化部位之修飾；並且具有3-9個額外胺基酸取代，其中額外取代中之至少一者選自表6及表7闡明之取代，並且其中抗原決定基1、2及3之至少兩者含有選自表1及表2闡明之取代之至少一個取代。在更具體態樣中，多肽具有表6闡明之取代中之至少一者及抗原決定基1、2及3之至少兩者中的選自表1闡明之取代的至少一個取代。在此實施例之甚至更具體態樣中，多肽在抗原決定基2中不具有取代。在此實施例之另一個甚至更具體態樣中，多肽具有選自T41G、T41W、T41H、T41V、T41I、T41L、T41R、T41K、T41Y、T41F、T41D、T41E、T41Q、T41N及T41A之T41取代。在此實施例之仍然更具體態樣中，多肽具有T41G取代。在此實施例之替代態樣中，多肽具有僅兩個額外取代，其中一者在抗原決定基1中並且另一者在抗原決定基3中。在此實施例之甚至更具體態樣中，多肽具有僅兩個額外取代，其中一者在T56H中並且另一者在K174R中。

在另一實施例中，多肽為SEQ ID NO：1之變異體，其具有移除胺基酸39-41處之推定醣基化部位之修飾；並且具有4-9個胺基酸取代；表6及表7闡明之取代中之至少一者；及抗原決定基1、2及3之每一者中的選自表1及表2闡明之取代的至少一個取代。在此實施例之具體態樣中，多肽具有表6闡明之取代中之至少一者及抗原決定基1、2及3之每一者中的選自表1中闡明之彼等的至少一個取代。在另一個更具體態樣中，多肽具有表6闡明之取代中之至少一者；及分別在表3、表4或表5闡明之具體取代一個、兩個或三個胺基酸取代中之至少一者。在此實施例之仍然另一個更具體態樣中，多肽為SEQ ID NO：1之變異體並且具有表6闡明之胺基酸取代中之僅一者及分別選自表3、表4或表5闡明之具體一個、兩個或三個胺基酸取代之一者的僅一個、兩個或三個額外胺基酸取代。在此實施例之另一個甚至更具體態樣中，多肽具有選自T41G、T41W、T41H、T41V、T41I、T41L、T41R、T41K、T41Y、T41F、T41D、T41E、T41Q、 T41N及T41A之T41取代。在此實施例之仍然更具體態樣中，多肽具有T41G取代。

在替代實施例中，多肽為SEQ ID NO：2之變異體，其具有移除胺基酸39-41處之推定醣基化部位之修飾；及選自表1及表2闡明之胺基酸取代之群的1至9個額外胺基酸殘基取代。在更具體態樣中，至少一個額外取代在表1闡明。在此實施例之甚至更具體態樣中，多肽在抗原決定基2中不具有取代。在此實施例之另一個甚至更具體態樣中，多肽具有選自T41G、T41W、T41H、T41V、T41I、T41L、T41R、T41K、T41Y、T41F、T41D、T41E、T41Q、T41N及T41A之T41取代。在此實施例之仍然更具體態樣中，多肽具有T41G取代。

在另一實施例中，多肽為SEQ ID NO：2之變異體，其具有移除胺基酸39-41處之推定醣基化部位之修飾；及2-9個額外胺基酸取代及抗原決定基1、2及3之至少兩者中的選自表1及2闡明之取代之任何者的至少一個取代。在更具體態樣中，抗原決定基1、2及3之至少兩者中之至少一個取代選自表1闡明之彼等。在此實施例之甚至更具體態樣中，多肽在抗原決定基2中不具有取代。在此實施例之另一個甚至更具體態樣中，多肽具有選自T41G、T41W、T41H、T41V、T41I、T41L、T41R、T41K、T41Y、T41F、T41D、T41E、T41Q、T41N及T41A之T41取代。在此實施例之仍然更具體態樣中，多肽具有T41G取代。在此實施例之替代態樣中，多肽包含抗原決定基1中之至少一個胺基酸取代及抗原決定基3中之至少一個胺基酸取代。在此實施例之甚至更具體態樣中，多肽包含T56H及K174R取代。

在另一個更具體態樣中，多肽為SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：5之變異體並且具有3-9個胺基酸取代，其中至少一個取代在抗原決定基1、2及3之每一者中並且選自表1及2闡明之取代之任何者。在更具體態樣中，抗原決定基1、2及3之每一者中之至少一個取代選自表1闡明之彼等。在甚至更具體實施例中，多肽為SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：5之變異體並且具有分別選自表3、表4或表5闡明之具體一個、兩個或三個胺基酸取代之一者的僅一個、兩個或三個胺基酸取代。在此實施例之另一個甚至更具體態樣中，多肽具有選自T41G、T41W、T41H、T41V、T41I、T41L、T41R、T41K、T41Y、T41F、T41D、T41E、T41Q、T41N及T41A之T41取代。在此實施例之仍然更具體態樣中，多肽具有T41G取代。

在另一實施例中，本發明之多肽為SEQ ID NO：2之變異體，其具有選自T41G、T41W、T41H、T41V、T41I、T41L、T41R、T41K、T41Y、T41F、T41D、T41E、T41Q、T41N及T41A之T41取代；及選自表4闡明之具體兩個胺基酸取代之任何者的僅2個額外胺基酸取代。在此實施例之具體態樣中，多肽具有T41G取代。在此實施例之更具體態樣中，多肽具有T41G取代。在此實施例之另一個更具體態樣中，一個額外胺基酸取代在抗原決定基1中並且另一個額外胺基酸取代在抗原決定基3中。在此實施例之仍然更具體態樣中，一個額外胺基酸取代為T56H並且另一個額外胺基酸取代為K174R。在此實施例之甚至更具體態樣中，多肽具有在SEQ ID NO：5中闡明的胺基酸序列。

在另一實施例中，本發明之多肽為SEQ ID NO：2之變異體，其具有選自T41G、T41W、T41H、T41V、T41I、T41L、T41R、T41K、T41Y、T41F、T41D、T41E、T41Q、T41N及T41A之T41取代；及選自表5闡明之具體三個胺基酸取代之任何者的僅3個額外胺基酸取代。在此實施例之具體態樣中，多肽具有T41G取代。

核酸分子、序列、載體及宿主細胞

在其他實施例中，本發明提供分離核酸分子，其包含編碼包含上述g3p變異體之多肽或融合蛋白質之任何者的核酸序列。在此實施例之一態樣中，分離核酸分子包含SEQ ID NO：3之核苷酸64-714或SEQ ID NO：5之核苷酸64-708之變異體，其藉由密碼子取代、同框密碼子插入或同框密碼子缺失來修飾，該取代、插入或缺失破壞藉由SEQ ID NO：3或4之核苷酸181-189編碼之推定醣基化部位(對應於SEQ ID NO：1或3之胺基酸39-41處之胺基酸NAT)。在此等實施例之更具體態樣中，SEQ ID NO：3或4之核苷酸64-714之變異體藉由破壞藉由SEQ ID NO：3或4之核苷酸181-189編碼之推定醣基化部位之密碼子取代來修飾。在此等實施例之甚至更具體態樣中，SEQ ID NO：3或4之核苷酸64-714之變異體藉由核苷酸187-189(編碼SEQ ID NO：1及2之T41)處的編碼選自T41G、T41W、T41H、T41V、T41I、T41L、T41R、T41K、T41Y、T41F、T41D、T41E、T41Q、T41N及T41A之胺基酸取代的密碼子取代來修飾。在此等實施例之甚至更具體態樣中，取代密碼子取代選自gga、tgg、cat、gtt、att、ctt、agg、aaa、tat、ttc、gac、gag、cag、aat及gct。在此等實施例之甚至更具體態樣中，SEQ ID NO：3或4之核苷酸64-714之變異體藉由核苷酸187-189處的編碼胺基酸取代T41G之密碼子取代來修飾。在此等實施例之甚至更具體態樣中，取代密碼子取代為gga。

在另一實施例中，除了破壞藉由SEQ ID NO：3或4之核苷酸181-189編碼之推定醣基化部位的修飾以外，SEQ ID NO：3或4之核苷酸64-714之變異體進一步由1-9個密碼子取代組成，其中每一個密碼子取代對應於選自表1及表2闡明之取代的胺基酸取代，及以下V215胺基酸取代中之任一者：V215A、V215S、V215G或V215T、V215C、V215D、V215E、V215F、V215H、V215K、V215N、V215P、V215Q及V215R。在此等實施例之甚至更具體態樣中，變異體核酸序列藉由以下來修飾：被選擇來編碼以上闡明之V215胺基酸取代之任一者的一個密碼子取代；及1-8個額外密碼子取代，其中額外密碼子取代中之每一者被選擇來編碼表1闡明之胺基酸取代。在此等實施例之仍然更具體態樣中，變異體核酸序列藉由以下來修飾：被選擇來編碼以上闡明之V215胺基酸取代之任一者的一個密碼子取代；及2-8個額外密碼子取代，其中每一個額外密碼子取代編碼表1闡明之胺基酸取代，並且密碼子取代存在於抗原決定基1、2及3之至少兩者中之每一者中。在仍然更具體態樣中，變異體核酸序列藉由以下來修飾：被選擇來編碼以上闡明之V215胺基酸取代之任一者的一個密碼子取代；及3-8個額外密碼子取代，其中每一個額外密碼子取代編碼表1闡明之胺基酸取代，並且密碼子取代存在於抗原決定基1、2及3之每一者中。在仍然更具體實施例中，變異體核酸序列藉由以下來修飾：被選擇來編碼V215A胺基酸取代的一個密碼子取代；及被選擇來編碼表3闡明之單一胺基酸取代之一者的一個額外密碼子取代。在此實施例之更具體態樣中，被選擇來編碼表3闡明之單一胺基酸取代之一者的一個額外密碼子取代不編碼抗原決定基2中之胺基酸取代。在另一個具體實施例中，變異體核酸序列藉由以下來修飾：被選擇來編碼以上闡明之V215A胺基酸取代的一個密碼子取代；及被選擇來編碼表4闡明之具體兩個胺基酸取代之一者的兩個額外密碼子取代。在此實施例之更具體態樣中，被選擇來編碼表4闡明之具體兩個胺基酸取代之一者的兩個額外密碼子取代不編碼抗原決定基2中之胺基酸取代。在仍然更具體實施例中，變異體核酸序列藉由以下來修飾：被選擇來編碼以上闡明之V215胺基酸取代的一個密碼子取代；及被選擇來編碼表5闡明之具體三個胺基酸取代之一者的三個額外密碼子取代。

在仍然其他實施例中，分離核酸分子包含SEQ ID NO：3之核苷酸64-1530或SEQ ID NO：6之核苷酸64-1524之變異體，其中該序列藉由密碼子取代、同框密碼子插入或同框密碼子缺失來修飾，該取代、插入或缺失破壞藉由SEQ ID NO：3或4之核苷酸181-189編碼之推定醣基化部位(對應於SEQ ID NO：1或3之胺基酸39-41處之胺基酸NAT)。在此等實施例之更具體態樣中，SEQ ID NO：3之核苷酸64-1530或SEQ ID NO：4之核苷酸64-1524之變異體藉由破壞藉由SEQ ID NO：3或4之核苷酸181-189編碼之推定醣基化部位之密碼子取代來修飾。在此等實施例之甚至更具體態樣中，SEQ ID NO：3之核苷酸64-1530或SEQ ID NO：4之核苷酸64-1524之變異體藉由核苷酸187-189(編碼SEQ ID NO：1及2之T41)處的編碼選自T41G、T41W、T41H、T41V、T41I、T41L、T41R、T41K、T41Y、T41F、T41D、T41E、T41Q、T41N及T41A之胺基酸取代的密碼子取代來修飾。在此等實施例之甚至更具體態樣中，取代密碼子取代選自gga、tgg、cat、gtt、att、ctt、agg、aaa、tat、ttc、gac、gag、cag、aat及gct。在此等實施例之甚至更具體態樣中，SEQ ID NO：3或4之核苷酸64-714之變異體藉由核苷酸187-189處的編碼胺基酸取代T41G之密碼子取代來修飾。在此等實施例之甚至更具體態樣中，取代密碼子取代為gga。

在另一實施例中，除了破壞藉由SEQ ID NO：3或4之核苷酸181-189編碼之推定醣基化部位的修飾以外，SEQ ID NO：3之核苷酸64-1530或SEQ ID NO：4之核苷酸64-1524之變異體進一步由1-9個密碼子取代組成，其中每一個密碼子取代對應於選自表1、表2闡明之取代的胺基酸取代，及以下V215胺基酸取代中之任一者：V215S、V215G或V215T、V215C、V215D、V215E、V215F、V215H、V215K、V215N、V215P、V215Q及V215R。在此實施例之更具體態樣中，每一個密碼子取代對應於選自表1闡明之取代的胺基酸取代，及以上闡明之V215取代之任一者。在甚至更具體實施例中，變異體核酸序列藉由以下來修飾：被選擇來編碼以上闡明之V215胺基酸取代之任一者的一個密碼子取代；及1-8個額外密碼子取代，其中額外密碼子取代中之每一者對應於選自表1闡明之取代的胺基酸取代。在更具體態樣中，變異體具有對應於表3闡明之具體一個胺基酸取代之一者的一個額外密碼子取代。在此實施例之更具體態樣中，被選擇來編碼表3闡明之單一胺基酸取代之一者的一個額外密碼子取代不編碼抗原決定基2中之胺基酸取代。

在另一實施例中，除了破壞藉由SEQ ID NO：3或4之核苷酸181-189編碼之推定醣基化部位之修飾以外，SEQ ID NO：3之核苷酸64-1530，或SEQ ID NO：6之核苷酸64-1524之變異體具有由以下組成之修飾：被選擇來編碼以上闡明之V215胺基酸取代之任一者的一個密碼子取代；及2-8額外密碼子取代，其中每一個額外密碼子取代對應於表1闡明之胺基酸取代，並且密碼子取代存在於抗原決定基1、2及3之至少兩者中之每一者。在更具體態樣中，變異體具有對應於表4闡明之具體兩個胺基酸取代之一者的兩個額外密碼子取代。在此實施例之更具體態樣中，被選擇來編碼表4闡明之具體兩個胺基酸取代之一者的兩個額外密碼子取代不編碼抗原決定基2中之胺基酸取代。在此實施例之甚至更具體態樣中，來自表4的具體兩個胺基酸取代為T56H及K174R。在此實施例之甚至更具體態樣中，變異體核苷酸序列為SEQ ID NO：8。

在另一實施例中，除了破壞藉由SEQ ID NO：3或4之核苷酸181-189編碼之推定醣基化部位之修飾以外，SEQ ID NO：3之核苷酸64-1530，或SEQ ID NO：6之核苷酸64-1524之任一者之變異體具有由以下組成之修飾：被選擇來編碼以上闡明之V215胺基酸取代之任一者的一個密碼子取代；及3-8額外密碼子取代，其中每一個額外密碼子取代對應於表1 闡明之胺基酸取代，並且密碼子取代存在於抗原決定基1、2及3之每一者中。在更具體態樣中，變異體具有對應於表5闡明之具體三個胺基酸取代之一者的三個額外密碼子取代。

在本發明之核酸分子之其他實施例中，核酸分子進一步包含編碼信號序列之核酸序列，其同相位及直接融合至編碼變異體g3p之核酸序列之5’末端。在此等實施例之一態樣中，編碼信號序列之核酸序列為SEQ ID NO：3之核苷酸1-63。

本發明之核酸分子包涵退行性的，但是編碼與如上所述之核酸核酸分子中之任一者所編碼的胺基酸序列相同胺基酸序列的核酸序列。

對於重組產生，本發明之核酸分子中之任一者可插入合適表現載體中，該載體含有轉錄及轉譯所插入編碼序列的所需元件，或在RNA病毒載體的情況下，複製及轉譯的所需元件。所編碼核酸插入適當閱讀框中之載體中。因此，本發明提供包含本發明之核酸分子及序列的載體。此等載體包括但不限於DNA載體、噬菌體載體、病毒載體、逆轉錄病毒載體等。用於選殖本發明之核酸分子及序列的合適載體之選擇可藉由熟習此項技術者使用載體與執行表現之選定宿主細胞之相容性之熟知知識來進行。此可在哺乳動物細胞、植物細胞、昆蟲細胞、細菌細胞、酵母細胞等中之任一者中進行。此等細胞類型中之每一者的適當載體在此項技術中為熟知的並且總體上可購得。

在另一實施例中，本發明提供容納含有本發明之核酸分子或核酸序列的載體的宿主細胞。轉染或轉化或另外使本發明之載體進入宿主細胞的方法在此項技術中為已知的。容納載體之細胞，在合適條件下培養時，產生本發明之多肽。用於本發明之多肽之重組產生的載體及細胞的具體實例在以下實例部分中闡明。

醫藥組成物

在一些實施例中，本發明提供醫藥組成物，其包含含有變異體g3p之任何多肽或融合蛋白質，視情況連同醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑。「醫藥組成物」係指治療有效量的如本文描述之組成物與生理合適載劑及/或賦形劑。醫藥組成物不導致對於生物體之顯著刺激。可互換使用之片語「生理合適載劑」及「醫藥學上可接受之載劑」係指不導致對於生物體之顯著刺激並且不消除所投與組成物之生物活性及性質的載劑或稀釋劑。「賦形劑」一詞係指添加至醫藥組成物以進一步促進投與活性成分之惰性物質。實例無限制地包括例如鹽水、碳酸鈣、磷酸鈣、各種糖及多種類型之澱粉、纖維素衍生物、明膠、植物油、聚乙二醇，及界面活性劑，包括例如聚山梨醇酯20。

根據本發明使用之醫藥組成物可以習知方式使用一或多種生理上可接受之載劑包含賦形劑及助劑來配製，該等載劑促進將活性成分加工成可藥用之組成物。適當調配物取決於所選擇的投與途徑及所遞送組成物之性質(例如，多肽之大小及溶解性)。在此等實施例之一態樣中，將醫藥組成物配製以便注射或輸注至患者之血流中。在此等實施例之另一態樣中，將醫藥組成物配製以便例如藉由直接髓內、鞘內或心室內注射來直接投與患者之大腦或中樞神經系統。

本文所述之組成物可配製以便例如藉由快速濃注或連續輸注來非經腸投與。非經腸投與之醫藥組成物包括水溶性形式之組成物之水溶液。另外，活性成分之懸浮液可製備為油性或水基注射懸浮液。合適親脂性溶劑或媒介物包括脂肪油諸如芝麻油，或合成脂肪酸酯諸如油酸乙酯、甘油三酯或脂質體。水性注射懸浮液可含有增加懸浮液黏度的物質，諸如羧甲基纖維素鈉、山梨糖醇或右旋糖酐。視情況地，懸浮液亦可含有合適穩定劑或試劑(例如，界面活性劑如聚山梨醇酯(吐溫20))，其增加活性成分之溶解性以允許製備高濃度溶液。基於蛋白質之試劑例如像白蛋白可用於防止本發明之多肽吸附至遞送表面(即，IV袋、導管、針等)。

對於經口投與，組成物可藉由將活性化合物與在此項技術中熟知之醫藥學上可接受之載劑組合來容易地配製。

調配物可以單位劑型來呈現，例如，呈小瓶、安瓿或視情況添加有防腐劑之多劑量容器形式。組成物可為油性或水性媒介物中之懸浮液、溶液或乳液，並且可含有調配劑如懸浮、穩定及/或分散劑。單一劑型可呈液體或固體形式。單一劑型可在不改性的情況下直接投與患者或可在投與之前加以稀釋或重構。在某些實施例中，單一劑型可以濃注形式，例如，單一注射、單一經口劑量，包括包含多個錠劑、膠囊、丸劑等之經口劑量來投與。在替代實施例中，單一劑型可諸如藉由輸注，或經由植入泵如ICV泵在一段時間內投與。在後一實施例中，單一劑型可為用合適量的包含變異體g3p的多肽或融合蛋白質來預填充之輸注袋或泵儲槽。或者，輸注袋或泵儲槽可恰好在投與患者之前藉由將合適劑量之變異體g3p與輸注袋或泵儲槽溶液混合來製備。

本發明之另一態樣包括製備本發明之醫藥組成物的方法。調配藥物之技術可發現於例如最新版本之「Remington's Pharmaceutical Sciences」,Mack Publishing Co.,Easton,Pa.中，其全部以引用方式併入本文。

適用於本發明情況之醫藥組成物包括其中活性成分以有效達成預定目的之量包含在內之組成物。

治療或診斷有效量之確定完全在熟習此項技術者之能力範圍內，尤其鑒於本文提供之詳細揭示內容。

給藥量及間隔可個別地調整以向大腦提供足以治療或診斷具體大腦疾病、病症或病狀的噬菌體展示媒介物之含量(最小有效濃度，MEC)。MEC對於每一個製備物可變化，但是可自體外資料來估計。達成MEC之所需劑量取決於個體特徵。

給藥間隔亦可使用MEC值來確定。製劑應使用保持大腦含量高於MEC歷時10-90%之時間，較佳30-90%之間及最佳50-90%之方案來投與。

取決於將要治療之病狀之嚴重程度及響應性，給藥可為單次或多次投與，並且治療過程持續幾天至幾週或直至實現治癒或達成疾病狀態之減少為止。

當然，將要投與之組成物之量取決於所治療或診斷之受試者、病痛之嚴重程度、處方醫師之判斷等。在某些實施例中，將要投與之多肽之量係選自0.1-100mg/kg受試者體重；0.5-50mg/kg；1-30mg/kg；1-10mg/kg；3-30mg/kg；1-3mkg/kg；3-10mg/kg；以及10-30mg/kg。在一些實施例中，將肽每週一次、每兩週一次、每三週一次、每四週一次或每月一次投與受試者。

若需要，本發明之組成物可以包裝或施配器裝置，諸如FDA批准之套組形式來呈現，該裝置可含有一或多個包含活性成分之單位劑型。包裝可，例如，包含金屬或塑膠箔，如泡罩包裝。包裝或施配器裝置可伴有投與說明書。包裝或施配器亦可具備與容器相關聯之通知，該通知呈藉由管理藥物之製造、使用或銷售之政府機構所規定之形式，該通知反映該機構批准該形式之組成物用於人或獸醫學投與。此通知，例如，可為藉由美國食品藥物管理局批准處方藥物之標籤或為所批准之產品插入物。包含在相容醫藥載劑中配製之本發明之製劑的組成物亦可製備，安置於合適容器中，並且貼有治療指示病狀之標籤，如以上進一步詳述。

應瞭解前述及以下描述僅為示例性及解釋性的並且不限制所要求保護之本發明。

治療性用途

本發明之另一態樣係關於本發明之多肽、核酸分子或組成物中之任一者在治療蛋白質錯誤摺疊疾病，包括但不限於涉及以下任一者之彼等疾病中的用途：fAβ42、fαsyn或ftau。

在治療情況下，用語「患者」、「受試者」及「接受者」可互換使用並且包括人以及其他哺乳動物。在一些實施例中，患者為關於與蛋白質錯誤摺疊疾病相關之生物標記物呈陽性之人。在一實施例中，患者展現β-澱粉樣蛋白沈積，如藉由使用氟比他匹(florbetapir)來PET成像所偵測。

用語「治療」及其同源詞旨在意謂在展現疾病之一或多個臨床症狀之患者中，減少、減緩或逆轉疾病之進展。「治療」亦旨在意謂在展現疾病之一個或多個臨床症狀之患者中，減少、減緩或逆轉疾病之症狀。在一實施例中，患者展現β-澱粉樣蛋白沈積，如藉由使用氟比他匹來PET成像所偵測並且β-澱粉樣蛋白沈積之數目藉由治療來減少。在一實施例中，患者展現β-澱粉樣蛋白沈積，如本發明之多肽或多肽組成物所偵測，並且β-澱粉樣蛋白沈積之數目藉由治療來減少或保持。在另一實施例中，患者展現任何類型之澱粉樣蛋白沈積，如藉由PET成像來偵測，並且患者之認知功能藉由治療來改良。認知功能之改良可藉由McKhann等人，Alzheimer’s & Dementia7(3)：263-9(2011)之方法及測試來分析。

「預防」不同於治療並且係指在任何臨床症狀發作之前，將組成物投與個體。包括使用本發明之多肽或其組成物中之任一者的預防。預防可涉及已知處於增加之疾病風險之中，或，僅基於一或多個基因標記物而確定將要患上疾病的個體。對於各種蛋白質錯誤摺疊疾病，已經識別許多基因標記物。例如，在人澱粉樣前驅蛋白(hAPP)中具有瑞典型突變、印地安那型突變或倫敦型突變中之一或多者的個體患上早發阿茲海默病之增加之風險中並且因此為預防之候選者。同樣地，在亨丁頓蛋白基因中具有三核苷酸CAG重複序列之個體，尤其具有36或更多個重複序列之彼等最終患上亨丁頓病並且因此為預防候選者。

用語「蛋白質錯誤摺疊」係指以藉由聚集蛋白質(澱粉樣蛋白形成肽)來形成澱粉樣蛋白質為特徵之疾病，該聚集蛋白質諸如但不限於β-澱粉樣蛋白、血清澱粉樣蛋白A、半胱胺酸蛋白酶抑制劑C、IgGκ輕鏈或普里昂蛋白質。已知與錯誤摺疊及/或聚集澱粉樣蛋白質相關聯之疾病包括阿茲海默病，包括早發阿茲海默病，晚發阿茲海默病，及症狀前阿茲海默病，帕金森病，SAA澱粉樣變性，半胱胺酸蛋白酶抑制劑C，遺傳性冰島症候群，早衰，多發性骨髓瘤，普里昂疾病包括但不限於庫魯病，庫賈氏病(CJD)，傑茨曼-斯脫司勒-史茵克病(GSS)，致死家族性失眠症(FFI)，癢病，及牛海綿形腦炎(BSE)；肌萎縮性側索硬化(ALS)，脊髓小腦共濟失調(SCA1)，(SCA3)，(SCA6)，(SCA7)，亨丁頓病，齒狀紅核蒼白球肌萎縮症，脊髓延髓肌肉萎縮症，遺傳性大腦澱粉樣血管病，家族性澱粉樣變性，額顳葉型癡呆症，英格蘭/丹麥型癡呆，進行性核上性麻痹(PSP)，及家族性腦病。本發明之多肽及組成物可用於治療「蛋白質錯誤摺疊」疾病。

許多此等錯誤摺疊及/或聚集澱粉樣蛋白質疾病發生於中樞神經系統(CNS)中。發生於CNS中之疾病之一些實例為帕金森病；阿茲海默病；額顳癡呆(FTD)包括具有以下臨床症候群之彼等患者：行為變異性FTD(bvFTD)，進行性非流暢型失語症(PNFA)及詞義性癡呆(SD)；額顳葉型變性(FTLD)；及亨丁頓病。本發明之多肽及組成物可用於治療發生於中樞神經系統(CNS)中之以錯誤摺疊及/或聚集澱粉樣蛋白質為特徵之疾病。

錯誤摺疊及/或聚集蛋白質亦可發生於CNS外部。澱粉樣變性A(AA)(其前驅蛋白為血清急性期載脂蛋白，SAA)及多發性骨髓瘤(前驅蛋白免疫球蛋白輕及/或重鏈)為發生於CNS外部之兩種廣泛已知蛋白質錯誤摺疊及/或聚集蛋白質疾病。其他實例包括涉及藉由以下物質形成之澱粉樣蛋白的疾病：α2-微球蛋白，甲狀腺素轉運蛋白(家族性澱粉樣多神經病[FAP]，家族性澱粉樣心肌病[FAC]，及老年全身性澱粉樣變性[SSA])，(apo)血清AA，載脂蛋白AI、AII及AIV，凝溶膠蛋白(芬蘭型家族性澱粉樣多神經病)，溶菌酶，纖維蛋白原，半胱胺酸蛋白酶抑制劑C(大腦澱粉樣血管病，具有澱粉樣變性之遺傳性腦出血，冰島型)，(原)降鈣素，胰島澱粉樣多肽(IAPP澱粉樣變性)，心房利尿鈉因子，催乳激素，胰島素，乳凝集素，角膜上皮素，乳鐵蛋白，牙源性成釉細胞相關蛋白質，及精液凝固蛋白I。本發明之多肽及組成物可用於治療涉及發生於CNS外部的蛋白質之錯誤摺疊及/或聚集之疾病。

神經變性疾病亦可涉及tau病變。綜述於Lee等人，Annu.Rev.Neurosci.24：1121-159(2001)中。tau蛋白質係在中樞及外周神經系統神經元之軸突中表現的微管相關蛋白質。包括神經變性tau蛋白病(有時被稱為tau蛋白病)。tau蛋白病之實例包括阿茲海默病，肌萎縮性側索硬化/帕金森病-癡呆複合症，嗜銀顆粒性癡呆，皮質基底節變性，庫賈氏病，拳擊員癡呆，伴發鈣化的瀰漫性神經原纖維纏結，唐氏症候群，額顳癡呆包括連鎖於17號染色體的伴帕金森病的額顳葉癡呆，傑茨曼-斯脫司勒-史茵克病(Gerstmann-Sträussler-Scheinker disease)，哈勒沃登-施帕茨病，肌強直營養不良，C型尼曼-匹克病，非關島伴發神經原纖維纏結的運動神經元病，匹克病，腦炎後帕金森病，普里昂蛋白大腦澱粉樣血管病，進行性皮層下神經膠質瘤病，進行性核上麻痹，亞急性硬化全腦炎，及僅纏結性癡呆。一些此等疾病亦可包括纖絲狀澱粉樣蛋白β肽之沈積。舉例而言，阿茲海默病展現澱粉樣蛋白β沈積及tau病變。同樣地，普里昂蛋白介導之疾病如庫賈氏病、普里昂蛋白質大腦澱粉樣血管病，及傑茨曼-斯脫司勒-史茵克症候群亦可具有tau病變。因此，疾病係「tau蛋白病」之指示不應解釋為將該疾病排除於其他神經變性疾病分類或分組之外，該等表述僅僅為了方便來提供。本發明之多肽及組成物可用於治療神經變性疾病以及涉及tau病變之疾病。

在一實施例中，醫藥組成物或調配物在展現與存在澱粉樣蛋白相關之症狀或關於與蛋白質錯誤摺疊疾病相關聯之生物標記物，如氟比他匹(AV-45,Eli Lilly)呈陽性的患者中減少澱粉樣蛋白之方法中使用，包含向患者投與有效量的如本文描述之醫藥組成物或調配物。在一實施例中，投與途徑選自鞘內注射或輸注、直接心室內注射或輸注、腦實質內注射或輸注或靜脈內注射或輸注。

在一實施例中，醫藥組成物或調配物在展現與存在澱粉樣蛋白相關之症狀或關於與蛋白質錯誤摺疊疾病相關聯之生物標記物，如氟比他匹(AV-45,Eli Lilly)呈陽性的患者中保持澱粉樣蛋白之含量之方法中使用，包含向患者投與有效量的如本文描述之醫藥組成物或調配物。在一實施例中，投與途徑選自鞘內注射或輸注、直接心室內注射或輸注、腦實質內注射或輸注或靜脈內注射或輸注。

在一實施例中，醫藥組成物或調配物在使患者中之澱粉樣蛋白解聚的方法中使用，包含向具有澱粉樣蛋白之患者投與有效量的如本文描述之醫藥組成物或調配物。在一實施例中，投與途徑選自鞘內注射或輸注、直接心室內注射或輸注、腦實質內注射或輸注或靜脈內注射或輸注。

在一實施例中，本發明之醫藥組成物或調配物在導致大腦中之β-澱粉樣蛋白沈積物解聚的方法中使用，包含向有需要的患者之大腦直接注射有效量的如本文描述之醫藥組成物，從而導致大腦中之β-澱粉樣蛋白沈積物減少。在替代實施例中，本發明之醫藥組成物或調配物在導致大腦中之β-澱粉樣蛋白沈積物解聚的方法中使用，包含向有需要的患者之大腦靜脈內注射遞送有效量的如本文描述之醫藥組成物，從而導致大腦中之β-澱粉樣蛋白沈積物減少。

在一實施例中，醫藥組成物或調配物在減少大腦中之澱粉樣蛋白形成的方法中使用。減少大腦中之澱粉樣蛋白形成可預防、治療或減少蛋白質錯誤摺疊或神經變性疾病之症狀或嚴重程度。在一實施例中，投與途徑選自鞘內注射或輸注、直接心室內注射或輸注、腦實質內注射或輸注或靜脈內注射或輸注。

在一實施例中，本發明之醫藥組成物或調配物在促進大腦中之澱粉樣蛋白清除的方法中使用。促進澱粉樣蛋白清除可預防、治療或減少蛋白質錯誤摺疊或神經變性疾病之症狀或嚴重程度。在一實施例中，投與途徑選自鞘內注射或輸注、直接心室內注射或輸注、腦實質內注射或輸注或靜脈內注射或輸注。

在一實施例中，本發明之醫藥組成物或調配物在抑制大腦中之澱粉樣蛋白聚集的方法中使用。抑制大腦中之澱粉樣蛋白聚集可預防、治療或減少蛋白質錯誤摺疊或神經變性疾病之症狀或嚴重程度。在一實施例中，投與途徑選自鞘內注射或輸注、直接心室內注射或輸注、腦實質內注射或輸注或靜脈內注射或輸注。

在一實施例中，本發明之醫藥組成物或調配物在清除大腦中之毒性澱粉樣蛋白寡聚物的方法中使用。清除大腦中之毒性澱粉樣蛋白寡聚物可預防、治療或減少蛋白質錯誤摺疊或神經變性疾病之症狀或嚴重程度。在一實施例中，投與途徑選自鞘內注射或輸注、直接心室內注射或輸注、腦實質內注射或輸注或靜脈內注射或輸注。

在一實施例中，本發明之醫藥組成物或調配物在預防在大腦中形成毒性澱粉樣蛋白寡聚物的方法中使用。防止在大腦中形成毒性寡聚物可預防、治療或減少蛋白質錯誤摺疊或神經變性疾病之症狀或嚴重程度。在一實施例中，投與途徑選自鞘內注射或輸注、直接心室內注射或輸注、腦實質內注射或輸注或靜脈內注射或輸注。

在一實施例中，本發明之醫藥組成物或調配物在保護神經元免於澱粉樣蛋白損傷的方法中使用。保護神經元免於澱粉樣蛋白損傷可預防、治療或減少蛋白質錯誤摺疊或神經變性疾病之症狀或嚴重程度。在一實施例中，投與途徑選自鞘內注射或輸注、直接心室內注射或輸注、腦實質內注射或輸注或靜脈內注射或輸注。在一實施例中，用於保護神經元免於澱粉樣蛋白損傷的本發明之醫藥組成物或調配物係預防性地給予。

在一些實施例中，患者關於與蛋白質錯誤摺疊及/或聚集疾病相關聯之生物標記物係陽性的。在一實施例中，生物標記物為氟比他匹(AV45,Eli Lilly)。

在一些實施例中，患者展現與存在澱粉樣蛋白相關聯的神經變性疾病之症狀。在各種實施例中，澱粉樣蛋白為fAβ42、fαsyn或ftau中之任一者。

在某些實施例中，神經變性疾病為帕金森病、阿茲海默病或亨丁頓病。在一實施例中，神經變性疾病為阿茲海默病。在一實施例中，神經變性疾病為阿茲海默病並且患者展現β-澱粉樣蛋白，如藉由成像劑氟比他匹(AV-45,Eli Lilly)所偵測。

在一些實施例中，患者展現普里昂蛋白介導疾病之症狀。

在某些實施例中，普里昂蛋白介導疾病選自庫賈氏病、庫魯病、致死家族性失眠，或傑茨曼-斯脫司勒-史茵克症候群。

在一些實施例中，患者展現除了阿茲海默病以外之神經變性tau蛋白病之症狀。在某些實施例中，將要治療之疾病選自嗜銀顆粒性癡呆，皮質基底節變性，拳擊員癡呆，伴發鈣化的瀰漫性神經原纖維纏結，唐氏症候群，額顳癡呆包括連鎖於17號染色體的伴帕金森病的額顳葉癡呆，哈勒沃登-施帕茨病，肌強直營養不良，C型尼曼-匹克病，非關島伴發神經原纖維纏結的運動神經元病，匹克病，腦炎後帕金森病，進行性皮層下神經膠質瘤病，進行性核上麻痹，亞急性硬化全腦炎，及僅纏結性癡呆。

在另一實施例中，如上所述之疾病病狀中之任一者可藉由將本發明之核酸分子(即，編碼變異體g3p之核酸分子，該變異體g3p展現減少之免疫原性並且具有結合至澱粉樣蛋白、使澱粉樣蛋白斑解聚，及/或防止澱粉樣蛋白聚集的能力)單獨或以與合適載劑，如例如脂質奈米顆粒，聚合物載劑，或載體如病毒載體締合的形式藉由任何合適途徑，如例如吸入及靜脈內輸注來直接投與患者來治療。編碼適合於此治療之本發明之變異體g3p的核酸分子可為DNA或RNA。

診斷

在本發明之另一態樣中，本文所述之多肽及組成物用於與本文所述之各種疾病相關之診斷應用中。舉例而言，在體內或體外用作成像劑的本發明之組成物的結合可為所描述蛋白質錯誤摺疊疾病之一者之診斷的一部分。當用作診斷劑時，本發明之多肽可進一步包含可偵測標記，或可另外在體內偵測。各種標記可使用用於標記蛋白質之標準技術來連接至診斷組成物之澱粉樣蛋白結合部分。標記之實例包括螢光標記及放射性標記。存在可使用的多種放射性標記，但是通常標記經常選自放射性標記，包括但不限於¹⁸F、¹¹C及¹²³I。此等及其他放射性同位素可使用熟知化學來連接至蛋白質。在一實施例中，標記使用正電子發射斷層攝影術(PET)來偵測。然而，偵測放射性同位素之任何其他合適技術亦可用於偵測放射性示蹤劑。

本發明之多肽及組成物可與對於β-澱粉樣蛋白具有特異性之成像劑例如像F18-AV-45,Eli Lilly組合來用作診斷成像劑。由於當前沒有針對非β-澱粉樣蛋白聚集物之已知成像劑，與β-澱粉樣蛋白特異性成像劑一起來使用本發明之診斷組成物將導致基於差異偵測來偵測非β-澱粉樣蛋白聚集物。因此，在一實施例中，本發明之診斷組成物與β-澱粉樣蛋白成像劑組合來用作成像劑以偵測非β-澱粉樣蛋白聚集物。

在另一實施例中，本發明之多肽或組成物用作診斷成像劑以偵測CNS，包括大腦中之β-澱粉樣蛋白。

本發明之診斷組成物可對於治療性組成物所描述之使用相同途徑來投與。在一實施例中，投與途徑選自鞘內注射或輸注、直接心室內注射或輸注、腦實質內注射或輸注或靜脈內注射或輸注。

實例 實例1：g3p中之CD4+ T細胞抗原決定基之對映

將跨越序列SEQ ID NO：1之胺基酸1-240之87個重疊肽(15胺基酸長度，具有12個胺基酸重疊)合成並且在T細胞抗原決定基對映檢定中針對來自人CD4+T細胞之響應來加以測試。個別肽在六份PBMC培養物中測試並且評估T細胞響應以便識別抗原決定基之位置以及其相對效能。

使用自英國國家輸血機構(Addenbrooke’s Hospital,Cambridge,UK)獲得之健康社區供體膚色血球層(在24小時內抽取之血液)並且根據藉由Addenbrooke醫院本地研究道德委員會授予之批准、藉由 Lymphoprep(Axis-shield,Dundee,UK)密度離心來分離PBMC(外周血單核細胞)。將CD8⁺T細胞使用CD8⁺RosetteSep^TM(StemCell Technologies Inc,London,UK)來消耗。供體藉由使用基於HLA SSP-PCR之組織定型套組(Biotest,Solihull,UK)來識別HLA-DR單倍體型來加以表徵。亦確定對於對照新抗原蛋白質(KLH蛋白質(Pierce(Perbio),Cramlington,UK)及自IFV及EBV衍生之肽)之T細胞響應。然後將PBMC冷凍並且儲存於液體氮中直至需要為止。

選擇55個供體之群組用於檢定以最佳表示在世界人口中表現之HLA-DR同種異型之數目及頻率。在群組中表現之同種異型相對於在世界人口中表現之彼等同種異型之分析顯示達成>80%之覆蓋並且良好地表示所有主要HLA-DR等位基因(在世界人口中表現的具有>5%之頻率的個別同種異型)。個別供體單倍體型之詳細資料及在世界人口及抽樣人口中表現之MHC種類II單倍體型之頻率之比較分別在表8及圖3中示出。

將來自每一個供體之PBMC解凍、計數並且評估生存力。細胞在室溫AIM-V®培養基(Invitrogen,Paisley,UK)中復活，然後將細胞密度調整至2-3x10⁶PBMC/ml(增殖細胞儲備物)。15胺基酸長肽在1-3mg規模下與自由N末端胺及C末端羧酸一起合成。將肽在DMSO中溶解至10mM之濃度並且肽培養儲備物藉由在AIM-V®培養基中稀釋至孔中5μM之最終濃度來製備。對於每一個肽及每一個供體，在平底96孔板中建立六份培養物。陽性及陰性對照培養物亦重複測試六次。對於每一個供體，亦包括三個對照(KLH蛋白質及自IFV及EBV衍生之肽)。對於陽性對照，PHA(Sigma,Dorset,UK)以2.5μg/ml之最終濃度使用。

培養物孵育總共6天，然後將0.75μCi³[H]-胸苷(Perkin Elmer®,Beaconsfield,UK)添加至每一個孔。將培養物再孵育18小時，然後使用TomTec Mach III細胞收穫機將其收穫至濾墊上。每一個孔之Cpm藉由在paralux、低背景計數模式中之Microplate β射線計數器(Perkin Elmer®,Beaconsfield,UK)上進行Meltilex^TM(Perkin Elmer®,Beaconsfield,UK)閃爍計數來確定。

為了分析資料，使用等於或大於SI2.00之刺激指數(SI)之臨界值(並且考慮到邊界SI1.90-1.99響應)。陽性響應藉由以下統計及經驗臨界值來定義：

1.藉由使用未配對兩樣品Student檢驗將測試孔之cpm相對於培養基對照孔進行比較所獲得的響應之顯著性(p<0.05)。

2.大於2.00之刺激指數(SI2.00)，SI=測試孔之平均cpm/平均cpm培養基對照孔。以此方式呈現之資料指示為SI2.00，p<0.05。

另外，檢定內變化藉由計算來自重複培養物之原始資料之CV及SD來評估。在六份培養物(「非調整資料」)中建立增殖檢定。為了確保檢定內變化性較低，亦在移除最大及最小cpm值(「調整資料」)之後分析資料，並且供體響應之SI使用兩個資料集來比較。T細胞抗原決定基藉由計算對於研究中之所有肽的陽性響應(以上定義)之平均頻率加上SD以給出背景響應速率來識別。在調整及非調整資料中誘導高於背景響應速率之增殖響應的任何肽被視為含有T細胞抗原決定基。當兩個重疊肽誘導增殖響應速率時，T-細胞抗原決定基被視為在重疊區域中。基於此情況，在測試多肽中識別以下T-細胞抗原決定基：

抗原決定基1：C T G D E T Q C Y G T W(SEQ ID NO：1之胺基酸46-57)

抗原決定基2：T F M F Q N N R F R N R(SEQ ID NO：1之胺基酸133-144)

抗原決定基3：S S K A M Y D A Y W N G(SEQ ID NO：1之胺基酸172-183)

抗原決定基4：P V N A G G G S G G G S(SEQ ID NO：1之胺基酸214-225)

抗原決定基5：S G S G A M V R S D K T H T C(SEQ ID NO：1之胺基酸253-267)

實例2：藉由電腦(In Silico)分析來設計T細胞抗原決定基4及5中之取代

在T細胞檢定中呈陽性之肽之序列使用來自抗原決定基區域之重疊9-基體使用iTope^TM及TCED^TM 電腦技術來分析。[Perry等人，Drugs R D 9(6)：385-96(2008).]每個9-基體相對於MHC種類II等位基因(總計34個)之資料庫來測試並且基於與MHC種類II分子之擬合及相互作用來評分。另外，每一個9-基體相對於已知CD4+T細胞抗原決定基之資料庫來進行BLAST搜索以便識別9-基體與資料庫肽之間的任何較高序列同源性，該等資料庫肽來自在先前T細胞檢定中刺激T細胞響應之無關蛋白質。基於來自電腦分析之資訊，識別有利於自所識別的抗原決定基中潛在地移除CD4+T細胞抗原決定基活性的取代。

抗原決定基5橫跨原生N2-CT富含Gly連接子之C末端、用於產生SEQ ID NO：1之N1-N2-人Ig Fc融合蛋白質之pFUSE載體之多個選殖部位(「MCS」)所編碼的胺基酸，及人Ig Fc區域之N末端。電腦分析暗示SEQ ID NO：1之M258及V259為負責T-細胞活性之P1錨定物。基於其在N1-N2編碼區域外部之位置，預期移除此等兩個胺基酸不導致功能損失。此等兩個胺基酸藉由MCS編碼。因此，修飾MCS並且消除編碼SEQ ID NO：1之M258及V259之核苷酸的雙鏈DNA分子藉由定點誘變使用合適寡核苷酸引子來產生。此後使用MCS中之EcoRI及BglII限制部位將所得誘變DNA序列再選殖回到pFUSE載體中。所得成熟(缺乏信號序列)融合蛋白質省去M258及V259。該融合蛋白質在以下描述之檢定中保持與SEQ ID NO：1融合蛋白質相同的結合Aβ之能力。

抗原決定基4重疊N2域及原生富含Gly連接子。g3p蛋白質之晶體結構(未展示)暗示抗原決定基4遠離澱粉樣蛋白結合區域定位並且因此將容許胺基酸取代而不影響活性。識別為P1錨定物之V215(SEQ ID NO：1)在側鏈稍微朝向蛋白質核心定向的情況下表面暴露。對於結構分析，表6及7闡明之V215之任何取代應移除抗原決定基。另外，亦應考慮如表6及7闡明之此抗原決定基內之其他胺基酸之任何取代。編碼包含V215A 取代(SEQ ID NO：4)並且省去M258及V259之N1-N2-Ig Fc之核酸序列自上述核苷酸序列藉由使用合適寡核苷酸引子之定點誘變來衍生。如與具有SEQ ID NO：1之胺基酸序列之融合蛋白質或如上所述缺乏M258及V239之成熟融合蛋白質相比，所得成熟融合蛋白質(SEQ ID NO：2)在結合檢定中展示增加的與Aβ之結合。SEQ ID NO：4之核酸序列用作親本序列以產生併入抗原決定基1、2及3中之所有修飾的基因。

實例3：藉由電腦分析來設計T細胞抗原決定基1、2及3中之取代

抗原決定基1恰好位於N1-N2之推定Aβ結合部分之C末端。電腦分析抗原決定基1表明SEQ ID NO：1之胺基酸48-56如有利於胺基酸取代及移除T-細胞抗原決定基之區域。如藉由g3p之X射線晶體結構所解釋，基於現有胺基酸之性質、表面暴露，及與g3p之澱粉樣蛋白結合區域之相互作用，此9-基體內之胺基酸為取代之目標。具體而言，藉由表1指示之變化，G48、T51、Y54及T56為取代之目標。此區域中之其他潛在胺基酸取代在表2中闡明。

抗原決定基2之iTope^TM分析指明SEQ ID NO：1之胺基酸135-143為減少或消除該抗原決定基之目標。基於X射線晶體結構，SEQ ID NO：1之胺基酸136-139形成環區域，其與N1-N2之鉸鏈區域形成鍵合，因此對於澱粉樣蛋白結合活性可為重要的。此等胺基酸之變化不太佳並且僅呈現於表2中。更佳變化係針對M135、R140、F141及N143並且在表1中闡明。此九胺基酸區域之其他潛在變化在表2中闡明。

抗原決定基3內之SEQ ID NO：1之胺基酸173-182藉由電腦分析識別為取代之目標。抗原決定基3定位於N2域之α螺旋狀部分中，因而策略為避免引入疏水性殘基及較小極性不帶電荷的殘基。另外，需要避免朝向此抗原決定基之C末端引入極性殘基酸性殘基。基於X射線晶體學資料，藉由表1指示之變化，將S173、D174、M176、D178及W182作為取代之目標。此區域中之其他潛在胺基酸取代在表2中闡明。

實例4：產生具有減小T-細胞抗原決定基之N1-N2-人IgG Fc多肽

製備五十八個不同核酸分子，該等分子分別編碼含有表3闡明之不同單一胺基酸取代的N1-N2-人IgG Fc融合蛋白質。此舉藉由使用合適寡核苷酸引子來將SEQ ID NO：4定點誘變以引入所需取代，隨後將PCR擴增之誘變序列再選殖至pFUSE-hIgG1-Fc2載體(Invivogen®,Toulouse,France，目錄號pfuse-hg1fc2)中來達成。

將編碼此等「去免疫化」Fc融合多肽之基因瞬時表現於FreeStyle 293-F細胞(Invitrogen,Paisley,Scotland，目錄# R790-07)中之個別pFUSE-hIgG1-Fc2載體中。在轉染日，細胞在FreeStyle 293培養基(Invitrogen，目錄# 12338)中稀釋至1×10⁶/mL以確保>90%之生存力。質粒DNA及聚乙烯亞胺(PEI)在Optimem(Invitrogen，目錄#31985)中個別地稀釋並且孵育5分鐘，然後將PEI緩慢添加至DNA，並且DNA/PEI混合物在室溫下孵育5分鐘。在孵育之後，在使燒瓶渦動的同時，將DNA/PEI混合物逐滴添加至293-F細胞。轉染培養物在37℃，8% CO₂下在以135rpm旋轉之回轉式振盪器平台上孵育6-7天，然後將其收穫。

含有多肽之培養基藉由離心收穫並且使用10x PBS來進行pH調整。藉由在4℃下旋轉隔夜，蛋白質結合至蛋白質A Sepharose珠粒(Sigma,Dorset,UK)。珠粒以1x PBS洗滌兩次並且轉移至SigmaPrep旋轉管柱(Sigma)。樣品藉由使用0.1M甘胺酸pH3.0離心來溶離並且在收集管中使用1/10體積1M Tris-HCl pH8.0來中和。使用2ml ZebaSpin管柱(Pierce,Cramlington,UK，目錄#89890)將溶離液緩衝交換至1x PBS中。將樣品過濾滅菌並且對於每一個樣品量測280nm下之吸收率。

實例5：去免疫化多肽之Aβ結合分析

A. Aβ纖維製備。將Aβ42(1mg,rPeptideA-1002-2)溶解於六氟異丙醇(HFIP,1mL)中，充分地渦旋並且在室溫下孵育2-18小時直至透明溶液出現為止。將等分試樣(100μl,100μg)安置於1.5mL Eppendorf管中並且在真空(speed Vac，Eppendorf，濃縮器5301)下乾燥2-3h。所得單體重新懸浮於20μL DMSO中，吸移並且充分地渦旋直至完全溶解為止。溶液用260μL之10mM HCl溶液(最終Aβ42濃度為80μM)稀釋並且渦旋20秒。將透明溶液在37℃下孵育(沒有振盪)3天以允許聚集。

為了在檢定中使用，來自所得儲備溶液之Aβ42纖維稀釋50倍至PBS中之1.6μM最終濃度。

B. ELISA板製備。向96孔板(F96 MAXISORP NUNC-IMMUNO PLATE；目錄號：442404，批次125436及128158；Denmark)之每一個孔添加200μL之1%BSA溶液。將板密封並且在7℃下孵育3h。然後，板用PBS(250μL/孔)洗滌x3。將50μL之稀釋Aβ42纖維溶液(1.6μM)添加至每一個孔並且在37℃下未遮蔽地孵育隔夜至完全乾燥。將PBS(50μl/孔)添加至對照孔(沒有Aβ42纖維)。然後，板用水洗滌2X並且用PBS洗滌1X(對於每次洗滌，250μL/孔)。

C. ELISA檢定。將50μL之不同濃度之每一種多肽(以及SEQ ID NO：2之多肽)添加至每一個孔，以及非Aβ42纖維塗佈孔並且在37℃下孵育1h。然後，板用PBS-T(PBS中之0.05%吐溫20)洗滌3X並且用PBS洗滌3X(對於每次洗滌，250μL/孔)。然後將在PBS-T+1%乳(Difco^TMSkim Milk,Becton,Dickinson and Company.USA，目錄號：232100，批號：7320448)中1：2500稀釋(最終為0.32μg/mL)的50μl之HRP偶聯山羊抗人抗Fcγ(Jackson Labs，目錄號109-035-008，批號：106617)添加至每一個孔並且在37℃下孵育40min。然後，將板用PBS-T洗滌6X並且用PBS洗滌2X(對於每次洗滌，250μL/孔)。然後添加50μl/孔OPD溶液(15mg/7.5ml 0.05M檸檬酸緩衝液pH-5.5/3μl H₂O₂)並且使顏色顯現3-6min。隨後添加25μl/孔之4N HCl溶液來停止反應。對於492nm及405nm下之吸收率，將板讀出。將405nm吸收率自492nm吸收率減去並且將隨著多肽濃度而變化之結果作圖。然後計算每一種去免疫化多肽之結合IC₅₀並且與對於SEQ ID NO：2之多肽所計算之IC₅₀比較。結果在以下表9中示出。

實例6：分析完整蛋白質CD4+T細胞響應

為了與SEQ ID NO：1相比，分析來自本發明之多肽中之任一者之CD4+T細胞響應，執行完整蛋白質T細胞檢定。將PBMC自如實例1製備之20個健康人供體膚色血球層分離。將PBMC自AIM-V®培養基中之冷凍復活並且CD14⁺細胞使用Miltenyi CD14微珠及LS管柱(Miltenyi Biotech,Oxford,UK)來分離。將單核細胞重新懸浮於補充有1000U/ml IL-4及1000U/ml GM-CSF之AIM-V®(「DC培養基」)中直至4-6x10⁶PBMC/ml，然後分佈於24孔板(2ml最終培養物體積)中。細胞在第2天藉由置換一半體積DC培養基來饋給。第3天，單核細胞分化至半成熟樹突狀細胞(DC)，其與包含40ug/ml之測試多肽或40ug/ml之SEQ ID NO：1之多肽及100μg/ml之KLH或僅培養基之抗原一起預孵育。半成熟DC與抗原一起孵育24小時，然後過量抗原藉由洗滌細胞兩次並且重新懸浮於補充有50ng/ml TNF-α(Peprotech,London,UK)之DC培養基中來移除。DC在第7天藉由置換補充有50ng/ml TNFα之一半體積DC培養基來饋給並且成熟DC在第8天收穫。將收穫的成熟DC計數並且生存力使用錐蟲藍染料排阻來評估。然後將DC經受γ-照射(4000拉德)並且以2x10⁵細胞/ml重新懸浮於AIM-V培養基，然後在T細胞增殖及如下ELISpot檢定中使用分析。另外，在第8天，亦製備新鮮CD4+T細胞。為了純化CD4+T細胞，將PBMC在AIM-V®培養基中復活並且CD4⁺細胞使用Miltenyi CD4微珠及LS管柱(Miltenyi Biotech,Oxford,UK)分離並且以2x10⁶細胞/ml重新懸浮於AIM-V®培養基中。

第8天，建立T細胞增殖檢定，其中將1x10⁵自體CD4⁺T細胞添加至96孔U形底板中之1x10⁴抗原負載DC(10：1之比率)，並且AIM-V®培養基添加至200ul/孔之最終體積。第14天，檢定板之每個孔之 25ul AIM-V®用1uCi[³H](Perkin Elmer,Beaconsfield,UK)脈衝處理6小時，然後使用TomTec Mach III(Hamden CT,USA)細胞收穫機來收穫至濾墊(PerkinElmer)上。所有多肽在六份培養物中測試。每一個孔之每分鐘計數(cpm)藉由paralux、低背景計算下之1450 Microbeta Wallac Trilux液體閃爍計數器(Perkin Elmer)上之Meltilex^TM(Perkin Elmer)閃爍計數來確定。每一個抗原之每分鐘計數相對於僅AIM-V®培養基之對照來標準化。

對於ELISpot檢定，ELISpot板(Millipore,Watford,UK)用PBS中之100ul/孔IL-2捕獲抗體(R&D Systems,Abingdon,UK)塗佈。然後，板在PBS中洗滌兩次，在阻斷緩衝液(PBS中之1%BSA(Sigma))孵育隔夜並且在AIM-V®培養基中洗滌。第8天，將1x10⁵自體CD4⁺T細胞添加至96孔ELISpot板中之1x10⁴抗原負載DC(比率10：1)。所有多肽製劑在六份培養物中測試。對於每一個供體PBMC，亦包括陰性對照(單獨AIM-V®培養基)、無細胞對照及PHA(10ug/ml)陽性對照。

在進一步7天孵育期之後，ELISpot板藉由在dH₂O及PBS中連續洗滌三次來顯影，然後添加PBS/1%BSA中之100ul過濾生物素化偵測抗體(R&D Systems,Abingdon,UK)。在37℃下孵育1.5小時之後，板進一步在PBS中洗滌三次並且添加PBS/1%BSA中之100ul過濾鏈黴抗生物素蛋白-AP(R&D Systems)1小時(在室溫下孵育)。將鏈黴抗生物素蛋白-AP丟棄並且板在PBS中洗滌四次。將BCIP/NBT(R&D Systems)添加至每一個孔並且在室溫下孵育30分鐘。斑點顯影藉由使用dH₂O洗滌孔及孔之後部三次來停止。乾燥板在Immunoscan^TM分析器上掃描並且每孔之斑點數(spw)使用Immunoscan^TM版本4軟體來確定。

對於增殖及IL-2ELISpot檢定，結果表現為刺激指數(SI)，其定義為測試多肽之cpm(增殖檢定)或斑點(ELISpot檢定)相對於僅培養基對照之比率，該比率使用陽性T細胞響應之等於或大於2之SI臨界值(SI2.0)。

實例7：設計T細胞抗原決定基1、2及3兩者或兩者以上中之雙重及三重取代。

基於結合檢定之結果，在存在於多肽中之抗原決定基1、2及3處選擇以下取代，該等多肽含有如與SEQ ID NO：2相比之兩個胺基酸取代，每一個取代在不同抗原決定基處。

編碼具有表10闡明之胺基酸取代中之兩者的N1-N2-人IG Fc融合蛋白質的DNA，每一個取代在不同抗原決定基處，使用合適起始DNA之定點誘變來製備(通常如實例3闡明來製備之編碼兩個取代之一者的DNA。編碼此等融合蛋白質之所得DNA用於轉化細胞並且如實例4闡明來表現並純化，並且如實例5闡明來測試結合。然後，具有抗原決定基1、2 及3之每一者中之一個取代的多肽基於對於兩個胺基酸取代多肽之結合檢定之結果來設計。具有抗原決定基1、2及3之每一者中之一個取代的多肽針對Aβ結合，以及如實例6闡明之T-細胞響應來加以分析。具體而言，以下雙重及三重抗原決定基變異體藉由取代SEQ ID NO：2中之某些胺基酸來產生，如下表11指示。

以上指示之多肽使用實例5闡明之ELISA檢定針對結合至β-澱粉樣蛋白來分析。結果闡明於表12及13中。相對結合值反映IC₅₀(多肽SEQ ID NO：2)/IC₅₀(測試多肽)(例如，值越低，如與多肽SEQ ID NO：2相比之多肽之結合越大)。多個值反映結合檢定中之重複測試。

實例8：乙酸纖維素過濾阻滯檢定。

此檢定用於監測將澱粉樣蛋白纖維去穩定(解聚)或重塑成非澱粉樣蛋白或可溶性聚集物。該檢定主要根據Chang,E.及Kuret,J.,Anal Biochem 373,330-6,(2008)及Wanker,E.E.等人，Methods Enzymol 309,375-86,(1999)來調適。具體而言，fAβ澱粉樣蛋白纖維之2.5μM製劑與不同濃度之本發明之變異體融合多肽(1nM至2μM)在37℃下一起預孵育3天。孵育之後，將具有以及沒有融合多肽之纖維稀釋並且在真空墨點之乙酸纖維素膜上形成斑點。將膜用PBS廣泛洗滌並且使用對於Aβ之N末端具有特異性之抗體來探測1小時。HRP偶聯二級Ab用於將保持在膜上之纖絲狀聚集物量化。斑點顏色使用密度掃描器來分析並數位化。EC₅₀(一半最大有效濃度)基於每一個斑點之信號之強度相比於添加至每一個斑點之融合多肽之濃度來計算。

如可以自以上實例看出，本發明之變異體多肽都展示與Aβ之結合，如藉由ELISA檢定確定。所測試的大多數變異體多肽亦展示Aβ之解聚，如藉由斑點墨點檢定確定。

實例9：構建及分析具有修飾醣基化信號之多肽

使用編碼作為定點誘變之起始材料之多肽編號86的SEQ ID NO：3之核苷酸序列或修飾型式之核苷酸序列SEQ ID NO：4，構建在SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2之胺基酸39-41處缺乏醣基化信號的多肽。

自pFUSE-hIgG1-Fc2載體(InVivogen)衍生並且編碼融合至哺乳動物信號序列的多肽86的質粒載體係使用QuickChange定點誘變套組(Agilent)及以下引子來誘變：

前向引子：GCTGTCTGTGGAATGCTGGAGGCGTTGTAGTTTG(SEQ ID NO：8)

反向引子：CAAACTACAACGCCTCCAGCATTCCACAGACAGC(SEQ ID NO：9)

遵循製造商之指示來產生T41G取代。所得載體(SEQ ID NO：7)用於轉化NEB5-α感受態大腸桿菌細胞以便將所需質粒分離並且使用標準技術來測序。

然後，純化載體用於使用商購Expi293^TM表現系統(Life Tehcnologies)來轉化Expi293細胞。轉染之前一天，Expi293細胞以2x10⁶活細胞/ml之密度來接種。轉染當天，將500μg過濾滅菌質粒在Opti-MEM I中稀釋至25ml之總體積。在單獨試管中，將1.333ml ExpiFectamine^TM293試劑在25ml Opti-MEM I中稀釋並且藉由倒轉來混合。在室溫下五分鐘孵育之後，將稀釋DNA添加至稀釋ExpiFectamine^TM293試劑並且再孵育20-30分鐘。將DNA-ExpiFectamine^TM293試劑複合物緩慢添加至500ml細胞(>3 x 10⁶細胞/ml)，同時輕輕地使燒瓶渦動。大約18小時之後，將分別2.5ml及25ml之ExpiFectamine^TM293轉染增強子I及II添加至轉染細胞並且細胞在37℃，8% CO₂下，在回轉式振盪器上以135rpm再孵育5天。將含有所表現融合蛋白質(被稱為「多肽86-T41G」)的培養基藉由在4℃下以10,000rpm離心20分鐘來收穫。上清液在5ml HiTrap rProtein A FF管柱(GE Healthcare)上純化，其中所有步驟在4℃下執行。管柱用5體積溶離緩衝液(0.1M甘胺酸，pH 3)再生，並且在5-10體積20mM磷酸鈉緩衝液中洗滌，然後使用5ml/min之流動速率來施加細胞培養基。管柱用5-10體積20mM磷酸鈉緩衝液洗滌，然後用0.1M甘胺酸pH 3溶離掉所結合的多肽86-T41G。一至三ml溶離份收集於試管中，用1M Tris-HCl pH 9來調整pH。在Nanodrop 2000C上，藉由280nm下之吸收率來確定產率。將五μl之每一個含有蛋白質之溶離份在SDS-PAGE TGX凝膠(BioRad)上分離並且考馬斯染色2小時。將含有多肽86-T41G之溶離份彙集並且在D-PBS中在4℃下滲析隔夜。將最終多肽86-T41G樣品在Ultrafree旋轉過濾器上滅菌並且在Nanodrop 2000C上量測濃度。

將純化多肽86-T41G(SEQ ID NO：6)藉由SDS-PAGE分析並且作為單一泳帶遷移，與多肽86相比，具有稍微較低之分子量(明顯少~500道爾頓)(圖9)。相信此較低分子量歸因於胺基酸41處之T至G變化，以及N39上之醣基化損失。

純化多肽86-T41G亦藉由在Superdex200增加10/300管柱上之粒徑排阻層析來分析。將管柱洗滌並且用100ml磷酸鹽緩衝鹽水(「PBS」)來平衡。將一百微克(100μg)之多肽86-T41G在PBS中稀釋至200μL之最終體積並且負載至管柱上。然後，管柱以0.75mL/分鐘之速率用1.5管柱體積之PBS溶離。溶離份中之蛋白質藉由分光光度計在214nm及280nm下監測並且展示指示均勻性之尖峰(資料未展示)。

純化多肽86-T41G使用實例5描述之ELISA針對Aβ結合來分析。此檢定中之關於Aβ結合之EC₅₀被計算為13.15nM，與SEQ ID NO：1之多肽之20.6-27.01nM及多肽86之34.5nM形成相比。

純化多肽86-T41G亦使用實例8描述之乙酸纖維素過濾阻滯檢定針對Aβ結合與SEQ ID NO：1之多肽及多肽86進行比較。此檢定之結果在圖10中示出。

然後，在使用表示95%人HLA單倍體型之50個不同PBMC供體的完整蛋白質CD4+T細胞響應檢定中；並且在實例6描述之ELISpot細胞因子(IL-2)檢定中，純化多肽86-T41G與多肽86及SEQ ID NO：1之多肽進行比較(以及人類化A33抗體及匙孔血藍蛋白作為陽性對照)。結果在以下表13及14示出。

如可以自上表看出，對於12%之供體(6/50)，SEQ ID NO：1之多肽(在胺基酸39-41處之推定醣基化部位或任何推定T-細胞抗原決定基中沒有胺基酸變化)引起>2倍背景之增殖響應(「SI」)。多肽86及多肽86 T41G自顯著較少供體PBMC(4%；2/50)中引起增殖響應，其中響應者具有亦稍微高於2倍背景之增殖響應。此指示多肽86 T41G對於人受試者之較低預計免疫原性。IL-2檢定確認T-細胞響應檢定結果。

多肽86 T41G亦對於結合至Aβ42纖維、NAC纖維及tau-mtbr纖維與SEQ ID NO：1之多肽比較。

纖維及ELISA板製備。Aβ42肽(rPeptide A-1002-2)藉由渦動並且在室溫下孵育18小時來溶解於六氟異丙醇中。等分試樣在真空下乾燥並且儲存於-20℃下。將100ug之Aβ42單體溶解於20μl DMSO中，藉由渦動來溶解並且在10mM HCl溶液中稀釋至80μM。Aβ42肽溶液在37℃下孵育3天並且纖維形成藉由ThT螢光檢定來驗證。

老人斑之非澱粉樣蛋白β組分(NAC)為α-突觸核蛋白之聚集片段，該聚集物為帕金森病之標誌。NAC肽((Bachem H2598)在600uM下溶解於20mM NaHCO₃中並且在4℃下以100,000xg離心1小時。上清液藉由2N HCl來中和並且與10mM HCl進行1：1混合。肽在37℃下孵育4天並且纖維形成藉由ThT螢光檢定來確認。

包含Tau之微管結合部分之纖維(Tau-mtbr纖維)根據Frost等人J Biol Chem.2009年5月8日；284(19)：12845-52來製成。簡言之，在37℃下，將40uM之tau-mtbr蛋白質與40uM低分子量肝素(Fisher Scientific,BP2524)及2mM DTT一起孵育3天。原纖維形成藉由ThT螢光檢定來確認。

纖維在PBSA-0.02%中稀釋至1μM並且藉由在37℃下孵育隔夜來乾燥塗佈於Maxisorp Nunc Immunoplate ELISA板(ThermoFisher目錄號442404)上。在室溫下，將孔在Superblock(ThermoFisher目錄號37515)中以200μl/孔阻斷1小時並且在PBST-0.05%中洗滌。

結合檢定及結果。將SEQ ID NO：1之多肽及多肽86 T41G在50及200nM下個別地添加至纖維ELISA並且在37℃下孵育1小時。將孔在PBST-0.05% 6x200μl中洗滌，然後在室溫下，在TBST-0.05%；1%奶塊(LabScientific目錄號732-291-1940)中，與山羊抗人IgG Fc片段特異性-HRP(Jackson labs目錄號109-035-008)1：2500一起孵育45分鐘。將板在4x200ul TBST-0.05%，2x200ul PBS中洗滌，然後每孔添加50ul TMB溶液(Sigma T0440)。反應保持發展8分鐘並且藉由每孔添加50μl 2N HCl來停止。將450nm下之吸收率記錄於Tecan板閱讀器(Infinite M1000Pro)中。

資料點自三重測定孔之平均數獲取，並且標準偏差藉由GraphPad Prism來計算。對於每一種基質，藉由減去在沒有任一種多肽的情況下孵育之孔中之平均吸收率來將值針對背景來進行校正。

如圖11示出，與SEQ ID NO：1之多肽相比，多肽86 T41G以相同或較高親和力結合Aβ42m NAC及tau-mtbr纖維。

亦藉由類似協定來構建SEQ ID NO：1之以下變異體，該等變異體被修飾成僅消除推定醣基化部位(圓括號中指示之取代)：

實例10：多肽217及SEQ ID NO：1之藥物動力學(PK)研究。

動物治療及樣品收集。向C57Bl6小鼠(8-12週；Hilltop Lab Animals)投與單一20mg/kg腹膜內劑量之SEQ ID NO：1多肽(n=22)或所使用之多肽217(n=22)。將SEQ ID NO：1之多肽一次(20mg/kg,i.p.)投與22只小鼠。將多肽217一次(20mg/kg,i.p.)投與單獨一組22只小鼠。將每一隻動物在不同時間收集血液一次(給藥後0h、6h、9h、12h、1d、3d、7d及14d)。血漿自血液樣品分離，儲存於100μL等分試樣中，並且用於所有後續分析。收集血液之後，將小鼠安樂死，用PBS穿心灌注並且收穫其大腦。將大腦對半切並且每一個半球進一步切割成吻部、尾部、海馬及小腦部分。將血漿裝運至Intertek(San Diego,CA)進行藥物動力學分析，而左額皮質裝運至Cambridge Biomedical(Boston,MA)進行PK分析。

血漿ELISA分析。在室溫下(「RT」)，將分析的所有標準及樣品暴露於217mM乙酸歷時30min，然後在(1：1.5 v/v 1M Tris pH 9.5：樣品)中進行中和。酸解離步驟使存在於不溶性部分中之多肽溶解。

夾心ELISA檢定用於量測血漿中之多肽含量。在4℃下，在碳酸酯緩衝液(pH 9.6)中，MaxiSorp^TM板用來自儲備物(3.7μg/mL，0.37μg/孔)之1：1,000稀釋度之兔抗-M13(Abcam：ab6188)塗佈隔夜。板用含有0.1%吐溫-20(「PBST」)之PBS洗滌三次並且在37℃下用PBS中之1%乳阻斷2h隨後在RT下阻斷1h。板再次用PBST洗滌三次，然後將樣品或標準添加至孔並且在37℃下孵育1h。然後，孔用PBST洗滌3X，並且在RT下，與HRP-標記山羊抗人IgG(重鏈&輕鏈，Bethel：A80-219P；1：10,000)一起孵育30min。孔用PBST洗滌3x，並且然後板在RT下與TMB基質一起顯影。在最高標準之A₄₅₀在0.6-0.8之間之後，將反應停止。多肽之含量藉由在450nm下讀取之吸收率，減去650nm下之參考吸收率來定量。血漿在1：20、1：300及1：3,000之稀釋度下分析；在此等稀釋度下未觀察到基質干擾。結果在下表15中示出。

大腦ELISA分析。大腦組織(左額皮質)使用三重Pure M-Bio Grade珠狀管及Precellys024溶胞均化器在冷PBS中均化(5,000RPM兩次歷時20秒，在均化週期之間有5秒間隔)。在4℃下，均漿在14,000rpm下離心5min。將上清液移除至新試管並且用於所有後續分析。大腦溶解產物之蛋白質含量使用Pierce BCA蛋白質檢定套組來確定。溶解產物以1：2稀釋度使用。

夾心ELISA檢定用於量測大腦中之多肽含量。在4℃下，在碳酸酯緩衝液中，MaxiSorp^TM板用兔抗-M13(Abcam：ab6188)1：1,000(3.7μg/mL，0.37μg/孔)塗佈隔夜。板用PBST洗滌3x並且在37℃下用PBS中之1%乳阻斷2h，隨後在RT下阻斷1h。然後，板用PBST洗滌3x，並且將樣品或標準添加至孔並且在37℃下孵育1h。板再次用PBST洗滌3x，然後在RT下，將孔與HRP-標記驢抗人IgG(重鏈&輕鏈，Jackson ImmunoResearch：709-035-149；1：10,000)一起孵育30min。用PBST洗滌3x之後，在RT下，將板與TMB基質一起顯影15min。將反應停止並且讀取450nm下之吸收率。將大腦中之多肽含量相對於裂解物之蛋白質含量來表示。結果在下表16中示出。

<110> 神經噬菌體製藥股份有限公司

<120> 包含缺乏醣基化信號之修飾噬菌體G3P胺基酸序列的多肽

<130> 12236.0007-00270

<140>

<141>

<150> 62/087,052

<151> 2014-12-03

<160> 9

<170> PatentIn版本3.5

<210> 1

<211> 488

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成多肽

<400> 1

<210> 2

<211> 486

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成多肽

<400> 2

<210> 3

<211> 1530

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成多核苷酸

<400> 3

<210> 4

<211> 1524

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成多核苷酸

<400> 4

<210> 5

<211> 486

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成多肽

<400> 5

<210> 6

<211> 4953

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成多核苷酸

<400> 6

<210> 7

<211> 4953

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成多核苷酸

<400> 7

<210> 8

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成引子

<400> 8

<210> 9

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成引子

<400> 9

Claims

一種多肽，其包含起始胺基酸序列之變異體，其中該起始胺基酸序列選自：SEQ ID NO：1之胺基酸1-217或SEQ ID NO：2之胺基酸1-217及前述多肽中之任一者的具有以下修飾中之一或多者的突變體：胺基酸43-45處之VVV藉由AAA之取代；取代C53W；胺基酸96-103之缺失；胺基酸212-214處之QPP藉由AGA之取代；取代W181A、F190A及F194A；胺基酸1之缺失；胺基酸1及2之缺失；及N末端甲硫胺酸殘基之添加，其中：(a)該起始胺基酸序列經過修飾以移除胺基酸39-41處之推定醣基化信號；及(b)該多肽結合至澱粉樣蛋白及/或使該澱粉樣蛋白解聚。
如請求項1之多肽，其中胺基酸39-41處之該修飾選自N39、A40及/或T41中之一或多者之取代；N39、A40及/或T41中之一或多者之缺失；N39與A40之間之一或多個胺基酸之插入；及A40與T41之間之一或多個胺基酸之插入。
如請求項1或2之多肽，其中該起始胺基酸序列選自：SEQ ID NO：1之胺基酸1-217，及SEQ ID NO：2之胺基酸1-217。
如請求項1至3中任一項之多肽，其中SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2之胺基酸39-41處之該修飾選自N39及/或T41中之一或多者之胺基酸取代。
如請求項4之多肽，其中移除SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2之胺基酸39-41處之該推定醣基化信號之該修飾為選自T41G、T41W、T41H、T41V、T41I、T41L、T41R、T41K、T41Y、T41F、T41D、T41E、T41Q、T41N及T41A之胺基酸取代。
如請求項5之多肽，其中移除SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2之胺基酸39-41處之該推定醣基化信號之該修飾為T41G取代。
如請求項3至6中任一項之多肽，其中：(c)如與包含該起始胺基酸序列之對應多肽相比，該多肽具有減少之免疫原性；及(d)除了SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2之胺基酸39-41或其突變體處之任何胺基酸取代以外，該變異體具有1至9個胺基酸取代，其中每一個胺基酸取代選自以下闡明之胺基酸取代之群：及(e)當該起始胺基酸序列為SEQ ID NO：1之胺基酸1-217時，該等1至9個胺基酸取代中之任一者視情況另外選自以下闡明之胺基酸取代之群：
如請求項7之多肽，其中該等1至9個胺基酸取代中之每一者選自以下闡明之胺基酸取代之群：
如請求項3至8中任一項之多肽，其中該起始胺基酸序列選自SEQ ID NO：1之胺基酸1-217，及SEQ ID NO：2之胺基酸1-217。
如請求項3至9中任一項之多肽，其中除了SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2之胺基酸39-41或其突變體處之任何胺基酸取代以外，該變異體胺基酸序列具有2至9個胺基酸取代，其中至少一個取代存在於抗原決定基1中，包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2之胺基酸48-56；並且其中至少一個取代存在於抗原決定基3中，包含SEQ ID NO：1，或SEQ ID NO：2之胺基酸173-181。
如請求項10之多肽，其中除了SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2之胺基酸39-41或其突變體處之任何胺基酸取代以外，該變異體胺基酸序列僅具有兩個胺基酸取代；且其中該等取代選自以下闡明之兩個胺基酸取代之群：
如請求項1至11中任一項之多肽，其基本上由經由肽連接子或直接融合至該變異體胺基酸序列之C末端的人或人類化免疫球蛋白Fc多肽序列組成。
如請求項12之多肽，其中該免疫球蛋白Fc多肽序列為人IgG之Fc部分。
如請求項13之多肽，其中該肽連接子及人IgG之Fc部分之胺基酸序列選自SEQ ID NO：1之胺基酸218-488，及SEQ ID NO：2之胺基酸218-486。
一種由變異體起始胺基酸序列組成之多肽，其中該起始胺基酸序列選自SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2並且該起始胺基酸序列經過修飾以移除SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2之胺基酸39-41處之推定醣基化信號，其中該修飾選自N39、A40及/或T41中之一或多者之胺基酸取代； N39、A40及/或T41中之一或多者之缺失；N39與A40之間之一或多個胺基酸之插入；及A40與T41之間之一或多個胺基酸之插入。
如請求項15之多肽，其中移除SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2之胺基酸39-41處之該推定醣基化信號之該修飾選自N39及/或T41中之一或多者之胺基酸取代。
如請求項16之多肽，其中移除SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2之胺基酸39-41處之該推定醣基化信號之該修飾為選自T41G、T41W、T41H、T41V、T41I、T41L、T41R、T41K、T41Y、T41F、T41D、T41E、T41Q、T41N及T41A之胺基酸取代。
如請求項17之多肽，其中移除SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2之胺基酸39-41處之該推定醣基化信號之該修飾為T41G取代。
如請求項15至18中任一項之多肽，其中該起始胺基酸序列為SEQ ID NO：2，並且除了SEQ ID NO：2之胺基酸39-41處之任何胺基酸取代以外，該多肽具有選自以下任何者的兩個胺基酸取代：
如請求項19之多肽，其中該多肽具有SEQ ID NO：5之胺基酸序列。
一種醫藥組成物，其包含如請求項1至20中任一項之多肽及醫藥學上可接受之載劑。
如請求項21之醫藥組成物，其中該組成物被配製成用於注射或輸注至患者之血流中。
如請求項21之醫藥組成物，其中該組成物被配製成直接投與大腦或CNS。
一種減少有需要的患者之澱粉樣蛋白或tau蛋白質聚集物的方法，其包含向該患者投與有效量的如請求項1至18中任一項之多肽或如請求項21至24中任一項之醫藥組成物。
如請求項24之方法，其中該患者展現與存在澱粉樣蛋白或tau蛋白質聚集物相關聯之神經變性疾病之症狀。
如請求項24或25之方法，其中該患者關於生物標記物氟比他匹(florbetapir)呈陽性，其中該生物標記物在正電子發射斷層攝影術中用作成像劑。
如請求項24-26之方法，其中該患者患有選自以下之神經變性疾病：阿茲海默病，包括早發阿茲海默病，晚發阿茲海默病，及症狀前阿茲海默病，帕金森病，SAA澱粉樣變性，半胱胺酸蛋白酶抑制劑C，遺傳性冰島症候群，早衰，多發性骨髓瘤，普里昂疾病包括但不限於庫魯病，庫賈氏病(CJD)，傑茨曼-斯脫司勒-史茵克病(GSS)，致死家族性失眠症(FFI)，癢病，及牛海綿形腦炎(BSE)；肌萎縮性側索硬化(ALS)，脊髓小腦共濟失調(SCA1、SCA3、SCA6或SCA7)，亨丁頓病，齒狀紅核蒼白球肌萎縮症，脊髓延髓肌肉萎縮症，遺傳性大腦澱粉樣血管病，家族性澱粉樣變性，英格蘭/丹麥型癡呆，家族性腦病，肌萎縮性側索硬化/帕金森病-癡呆複合症，嗜銀顆粒性癡呆，皮質基底節變性，拳擊員癡呆，伴發鈣化的瀰漫性神經原纖維纏結，唐氏症候群，傑茨曼-斯脫司勒-史茵克病(Gerstmann-Sträussler-Scheinker disease)，哈勒沃登-施帕茨病，肌強直營養不良，C型尼曼-匹克病，非關島伴發神經原纖維纏結的運動神經元病，匹克病，腦炎後帕金森病，普里昂蛋白大腦澱粉樣血管病，進行性皮層下神經膠質瘤病，進行性核上麻痹，亞急性硬化全腦炎，僅纏結性癡呆，額顳葉型變性(FTLD)及額顳葉型癡呆(FTD)，包括具有以下臨床症候群中一或多者之患者：行為變異性FTD(bvFTD)，進行性非流暢型失語症(PNFA)、連鎖於17號染色體的伴帕金森病的額顳葉型癡呆、進行性核上性麻痹(PSP)及詞義性癡呆(SD)。
如請求項27之方法，其中該神經變性疾病為帕金森病、阿茲海默病或亨丁頓病。
如請求項28之方法，其中該神經變性疾病為阿茲海默病。
如請求項27之方法，其中該患者患有普里昂蛋白介導之疾病，其選自庫賈氏病、庫魯病、致死家族性失眠或傑茨曼-斯脫司勒-史茵克症候群。
一種核酸序列，其編碼如請求項1至20之多肽中之任一者。
如請求項31之核酸序列，其進一步編碼融合至該多肽編碼序列並且與該序列同框之哺乳動物信號序列。
如請求項32之核酸序列，其中該核酸序列為SEQ ID NO：6。
一種載體，其包含如請求項31至33中任一項之核酸序列，其中該核酸序列可操作地連接至該載體中之表現控制序列。
一種宿主細胞，其含有如請求項34之載體。
一種產生如請求項1至20中任一項之多肽之方法，其包含以下步驟：表現由如請求項31至33中任一項之核酸序列所編碼之該蛋白質；並且分離所表現多肽。
一種產生如請求項1至20中任一項之多肽之方法，其包含以下步驟：將如請求項35之宿主細胞在足以允許表現該多肽之條件下培養；並且分離所表現多肽。