JP2020073610A - グリコシル化シグナルを欠く改変バクテリオファージg3pアミノ酸配列を含むポリペプチド - Google Patents
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Abstract
Description
T細胞エピトープ同定は、エピトープ排除の第1のステップである。T細胞エピトープの検出を可能にする方法は、当該分野で公知であり、WO98/52976、WO00/34317、米国特許出願公開第2007/0269435号;米国特許第7,208,147号、Kernら、Nature Medicine 4巻:975〜978頁(1998年);およびKwokら、Trends in Immunology 22巻:583〜588頁(2001年)に開示されている。これらのアプローチでは、予測または同定されたT細胞エピトープは、治療的タンパク質またはポリペプチドの一次配列内での賢明なアミノ酸置換の使用によって除去される。これらの参考文献は、T細胞エピトープの推定的同定を可能にするが、生物学的活性に対する負の影響を回避するアミノ酸置換の選択は、合理的に予測することができない。それは、改変されたポリペプチドの各々をかかる活性について試験することによってのみ決定され得る。
本発明の実施形態の一部の例として、以下の項目が挙げられる。
(項目1)
出発アミノ酸配列のバリアントを含むポリペプチドであって、前記出発アミノ酸配列は、配列番号1のアミノ酸1〜217または配列番号2のアミノ酸1〜217、ならびに以下の改変:
アミノ酸43〜45におけるVVVのAAAによる置換;置換C53W;アミノ酸96〜103の欠失;アミノ酸212〜214におけるQPPのAGAによる置換;置換W181A、F190AおよびF194A;アミノ酸1の欠失;アミノ酸1および2の欠失;ならびにN末端メチオニン残基の付加
のうちの1つまたは複数を有する、上記のもののいずれかの変異体から選択され、ここで、
(a)前記出発アミノ酸配列は、アミノ酸39〜41における推定グリコシル化シグナルを除去するように改変されている;および
(b)前記ポリペプチドは、アミロイドに結合するおよび/またはアミロイドを脱凝集させる、
ポリペプチド。
(項目2)
アミノ酸39〜41における前記改変が、N39、A40および/またはT41のうちの1つまたは複数の置換;N39、A40および/またはT41のうちの1つまたは複数の欠失;N39とA40との間での1つまたは複数のアミノ酸の挿入;ならびにA40とT41との間での1つまたは複数のアミノ酸の挿入から選択される、項目1に記載のポリペプチド。
(項目3)
前記出発アミノ酸配列が、配列番号1のアミノ酸1〜217および配列番号2のアミノ酸1〜217から選択される、項目1または2に記載のポリペプチド。
(項目4)
配列番号1または配列番号2のアミノ酸39〜41における前記改変が、N39および/またはT41のうちの1つまたは複数のアミノ酸置換から選択される、項目1から3のいずれか一項に記載のポリペプチド。
(項目5)
配列番号1または配列番号2のアミノ酸39〜41における前記推定グリコシル化シグナルを除去する前記改変が、T41G、T41W、T41H、T41V、T41I、T41L、T41R、T41K、T41Y、T41F、T41D、T41E、T41Q、T41NおよびT41Aから選択されるアミノ酸置換である、項目4に記載のポリペプチド。(項目6)
配列番号1または配列番号2のアミノ酸39〜41における前記推定グリコシル化シグナルを除去する前記改変が、T41G置換である、項目5に記載のポリペプチド。
(項目7)
(c)前記ポリペプチドが、前記出発アミノ酸配列を含む対応するポリペプチドと比較して、低減された免疫原性を有し;かつ
(d)前記バリアントが、配列番号1もしくは配列番号2のアミノ酸39〜41またはそれらの変異体における任意のアミノ酸置換に加えて、1〜9個のアミノ酸置換を有し、各アミノ酸置換は、以下:
(e)前記出発アミノ酸配列が配列番号1のアミノ酸1〜217である場合、前記1〜9個のアミノ酸置換のいずれかが、以下:
項目3から6のいずれか一項に記載のポリペプチド。
(項目8)
前記1〜9個のアミノ酸置換の各々が、以下:
(項目9)
前記出発アミノ酸配列が、配列番号1のアミノ酸1〜217および配列番号2のアミノ酸1〜217から選択される、項目3から8のいずれか一項に記載のポリペプチド。
(項目10)
前記バリアントのアミノ酸配列が、配列番号1もしくは配列番号2のアミノ酸39〜41またはそれらの変異体における任意のアミノ酸置換に加えて、2〜9個のアミノ酸置換を有し、少なくとも1つの置換は、配列番号1または配列番号2のアミノ酸48〜56を含むエピトープ1中に存在し;少なくとも1つの置換は、配列番号1または配列番号2のアミノ酸173〜181を含むエピトープ3中に存在する、項目3から9のいずれか一項に記載のポリペプチド。
(項目11)
前記バリアントのアミノ酸配列が、配列番号1もしくは配列番号2のアミノ酸39〜41またはそれらの変異体における任意のアミノ酸置換に加えて、2つのみのアミノ酸置換を有し、前記置換は、以下:
(項目12)
前記バリアントのアミノ酸配列のC末端に、ペプチドリンカーを介してまたは直接的に融合した、ヒトまたはヒト化免疫グロブリンFcポリペプチド配列から本質的になる、項目1から11のいずれか一項に記載のポリペプチド。
(項目13)
前記免疫グロブリンFcポリペプチド配列が、ヒトIgGのFc部分である、項目12に記載のポリペプチド。
(項目14)
前記ペプチドリンカーおよび前記ヒトIgGのFc部分のアミノ酸配列が、配列番号1のアミノ酸218〜488および配列番号2のアミノ酸218〜486から選択される、項目13に記載のポリペプチド。
(項目15)
出発アミノ酸配列のバリアントからなるポリペプチドであって、前記出発アミノ酸配列は、配列番号1または配列番号2から選択され、前記出発アミノ酸配列は、配列番号1または配列番号2のアミノ酸39〜41における推定グリコシル化シグナルを除去するように改変されており、前記改変は、N39、A40および/またはT41のうちの1つまたは複数のアミノ酸置換;N39、A40および/またはT41のうちの1つまたは複数の欠失;N39とA40との間での1つまたは複数のアミノ酸の挿入;ならびにA40とT41との間での1つまたは複数のアミノ酸の挿入から選択される、ポリペプチド。
(項目16)
配列番号1または配列番号2のアミノ酸39〜41における前記推定グリコシル化シグナルを除去する前記改変が、N39および/またはT41のうちの1つまたは複数のアミノ酸置換から選択される、項目15に記載のポリペプチド。
(項目17)
配列番号1または配列番号2のアミノ酸39〜41における前記推定グリコシル化シグナルを除去する前記改変が、T41G、T41W、T41H、T41V、T41I、T41L、T41R、T41K、T41Y、T41F、T41D、T41E、T41Q、T41NおよびT41Aから選択されるアミノ酸置換である、項目16に記載のポリペプチド。
(項目18)
配列番号1または配列番号2のアミノ酸39〜41における前記推定グリコシル化シグナルを除去する前記改変が、T41G置換である、項目17に記載のポリペプチド。
(項目19)
前記出発アミノ酸配列が、配列番号2であり、前記ポリペプチドが、配列番号2のアミノ酸39〜41における任意のアミノ酸置換に加えて、以下:
(項目20)
配列番号5のアミノ酸配列を有する、項目19に記載のポリペプチド。
(項目21)
項目1から20のいずれか一項に記載のポリペプチドおよび薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
(項目22)
患者の血流中への注射もしくは注入のために製剤化された、項目21に記載の医薬組成物。
(項目23)
脳またはCNSへの直接投与のために製剤化された、項目21に記載の医薬組成物。
(項目24)
アミロイドまたはタウタンパク質凝集体の低減を必要とする患者においてアミロイドまたはタウタンパク質凝集体を低減させる方法であって、有効量の、項目1から18のいずれか一項に記載のポリペプチドまたは項目21から24のいずれか一項に記載の医薬組成物を前記患者に投与するステップを含む、方法。
(項目25)
前記患者が、アミロイドまたはタウタンパク質凝集体の存在と関連する神経変性疾患の症状を示している、項目24に記載の方法。
(項目26)
バイオマーカーであるフロルベタピルがポジトロン放出断層撮影における画像化剤として使用される場合、前記患者が、前記バイオマーカーについて陽性である、項目24または項目25に記載の方法。
(項目27)
前記患者が、早期発症型アルツハイマー病、遅発型アルツハイマー病および発症前アルツハイマー病が含まれるアルツハイマー病、パーキンソン病、SAAアミロイドーシス、シスタチンC、遺伝性アイスランド型症候群、老化、多発性骨髄腫、クールー、クロイツフェルト・ヤコブ病(CJD)、ゲルストマン・シュトロイスラー・シャインカー病(GSS)、致死性家族性不眠症(FFI)、スクレイピーおよびウシ海綿状脳症(BSE)が含まれるがこれらに限定されないプリオン病;筋萎縮性側索硬化症(ALS)、脊髄小脳失調症(SCA1、SCA3、SCA6またはSCA7)、ハンチントン病、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症、球脊髄性筋萎縮症、遺伝性脳アミロイド血管症、家族性アミロイドーシス、イギリス型/デンマーク型認知症、家族性脳症、筋萎縮性側索硬化症/パーキンソン認知症複合、嗜銀顆粒性認知症、皮質基底核変性症、ボクシング認知症、石灰化を伴うびまん性神経原線維変化病、ダウン症候群、ゲルストマン・シュトロイスラー・シャインカー病、ハラーホルデン・シュパッツ病、筋緊張性ジストロフィー、ニーマン・ピック病C型、神経原線維変化を伴う非グアム型運動ニューロン疾患、ピック病、脳炎後パーキンソニズム、プリオンタンパク質脳アミロイド血管症、進行性皮質下グリオーシス、進行性核上性麻痺、亜急性硬化性全脳炎、神経原線維変化型認知症、前頭側頭葉変性症(FTLD)、ならびに以下の臨床症候群:行動異常型FTD(bvFTD)、進行性非流暢性失語(PNFA)、第17染色体に連鎖しパーキンソニズムを伴う前頭側頭型認知症、進行性核上性麻痺(PSP)および意味性認知症(SD)のうちの1つまたは複数を有する患者を含めた前頭側頭葉認知症(FTD)から選択される神経変性疾患に罹患している、項目24から26のいずれか一項に記載の方法。
(項目28)
前記神経変性疾患が、パーキンソン病、アルツハイマー病またはハンチントン病である、項目27に記載の方法。
(項目29)
前記神経変性疾患がアルツハイマー病である、項目28に記載の方法。
(項目30)
前記患者が、クロイツフェルト・ヤコブ病、クールー、致死性家族性不眠症またはゲルストマン・シュトロイスラー・シャインカー症候群から選択されるプリオン媒介性疾患に罹患している、項目27に記載の方法。
(項目31)
項目1から20に記載のポリペプチドのいずれか1つをコードする、核酸配列。
(項目32)
前記ポリペプチドをコードする配列とインフレームで融合した哺乳動物シグナル配列をさらにコードする、項目31に記載の核酸配列。
(項目33)
配列番号6である、項目32に記載の核酸配列。
(項目34)
項目31から33のいずれか一項に記載の核酸配列を含むベクターであって、前記核酸配列は、前記ベクター中の発現制御配列に作動可能に連結されている、ベクター。
(項目35)
項目34に記載のベクターを含む、宿主細胞。
(項目36)
項目1から20のいずれか一項に記載のポリペプチドを作製する方法であって、項目31から33のいずれか一項に記載の核酸配列によってコードされるタンパク質を発現させるステップ;および発現されたポリペプチドを単離するステップ、を含む、方法。
(項目37)
項目1から20のいずれか一項に記載のポリペプチドを作製する方法であって、項目35に記載の宿主細胞を、前記ポリペプチドの発現を可能にするのに十分な条件下で培養するステップ;および発現された前記ポリペプチドを単離するステップ、を含む、方法。
したがって、一実施形態では、本発明は、出発アミノ酸配列のバリアントを含むポリペプチドを提供し、出発アミノ酸配列は、配列番号1のアミノ酸1〜217または配列番号2のアミノ酸1〜217、および以下の改変のうちの1つまたは複数を有する、上記のもののいずれかの変異体から選択される:アミノ酸43〜45におけるVVVのAAAによる置換;置換C53W;アミノ酸96〜103の欠失;アミノ酸212〜214におけるQPPのAGAによる置換;置換W181A、F190AおよびF194A;アミノ酸1の欠失;アミノ酸1および2の欠失;ならびにN末端メチオニン残基の付加、ここで、
(a)出発アミノ酸配列は、アミノ酸39〜41における推定グリコシル化シグナルを除去するように改変されている;および
(b)ポリペプチドは、アミロイドに結合するおよび/またはアミロイドを脱凝集させる。
他の実施形態では、本発明は、上記g3pバリアントを含むポリペプチドまたは融合タンパク質のいずれかをコードする核酸配列を含む単離された核酸分子を提供する。この実施形態の一態様では、単離された核酸分子は、配列番号3または4のヌクレオチド181〜189によってコードされる推定グリコシル化部位(配列番号1または3のアミノ酸39〜41におけるアミノ酸NATに対応する)を破壊するコドン置換、インフレームコドン挿入またはインフレームコドン欠失によって改変された、配列番号3のヌクレオチド64〜714または配列番号5のヌクレオチド64〜708のバリアントを含む。これらの実施形態のより具体的な一態様では、配列番号3または4のヌクレオチド64〜714のバリアントは、配列番号3または4のヌクレオチド181〜189によってコードされる推定グリコシル化部位を破壊するコドン置換によって改変されている。これらの実施形態のさらにより具体的な一態様では、配列番号3または4のヌクレオチド64〜714のバリアントは、T41G、T41W、T41H、T41V、T41I、T41L、T41R、T41K、T41Y、T41F、T41D、T41E、T41Q、T41NおよびT41Aから選択されるアミノ酸置換をコードする、ヌクレオチド187〜189(配列番号1および2のT41をコードする)におけるコドン置換によって改変されている。これらの実施形態のさらにより具体的な一態様では、置換されたコドン置換は、gga、tgg、cat、gtt、att、ctt、agg、aaa、tat、ttc、gac、gag、cag、aatおよびgctから選択される。これらの実施形態のさらにより具体的な一態様では、配列番号3または4のヌクレオチド64〜714のバリアントは、アミノ酸置換T41Gをコードするヌクレオチド187〜189におけるコドン置換によって改変されている。これらの実施形態のさらにより具体的な一態様では、置換されたコドン置換は、ggaである。
一部の実施形態では、本発明は、任意選択で薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤と一緒に、バリアントg3pを含む任意のポリペプチドまたは融合タンパク質を含む医薬組成物を提供する。「医薬組成物」とは、生理学的に適切な担体および/または賦形剤を伴う、治療有効量の本明細書に記載される組成物を指す。医薬組成物は、生物への顕著な刺激を引き起こさない。相互交換可能に使用され得る語句「生理学的に適切な担体」および「薬学的に許容される担体」とは、生物への顕著な刺激を引き起こさず、投与された組成物の生物学的活性および特性を無効にしない、担体または希釈剤を指す。用語「賦形剤」とは、活性成分の投与をさらに促進するために医薬組成物に添加される不活性物質を指す。例には、限定なしに、例えば、生理食塩水、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、種々の糖および種々の型のデンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油、ポリエチレングリコール、および例えばポリソルベート20が含まれる界面活性剤が含まれる。
本発明の別の一態様は、fAβ42、fαsynまたはftauのいずれかが関与する疾患が含まれるがこれに限定されないタンパク質ミスフォールディング疾患の処置における、本発明のポリペプチド、核酸分子または組成物のいずれかの使用に関する。
診断薬
配列番号1のアミノ酸1〜240の配列にわたる87個の重複するペプチド(12アミノ酸の重複を伴う15アミノ酸長)を合成し、ヒトCD4+T細胞からの応答について、T細胞エピトープマッピングアッセイで試験した。個々のペプチドを、6連PBMC培養物中で試験し、T細胞応答を、エピトープの位置およびそれらの相対的効力を同定するために評価した。
1.独立2試料スチューデントt検定を使用して試験ウェルのcpmを培地対照ウェルに対して比較することによる、応答の有意性(p<0.05);
2.2.00よりも大きい刺激指数(SI≧2.00)、ここで、SI=試験ウェルの平均cpm/平均cpm培地対照ウェルである。この方法で提示されるデータは、SI≧2.00、p<0.05として示される。
エピトープ1:CTGDETQCYGTW(配列番号1のアミノ酸46〜57)
エピトープ2:TFMFQNNRFRNR(配列番号1のアミノ酸133〜144)
エピトープ3:SSKAMYDAYWNG(配列番号1の172〜183のアミノ酸)
エピトープ4:PVNAGGGSGGGS(配列番号1のアミノ酸214〜225)
エピトープ5:SGSGAMVRSDKTHTC(配列番号1のアミノ酸253〜267)
T細胞アッセイにおいて陽性であったペプチドの配列を、iTope(商標)およびTCED(商標)in silicoテクノロジーを使用して、エピトープ領域由来の重複する9マーを使用して分析した[Perryら、Drugs R D 9巻(6号):385〜96頁(2008年)]。各9マーを、MHCクラスII対立遺伝子(合計で34)のデータベースに対して試験し、MHCクラスII分子とのフィットおよび相互作用に基づいてスコア付けした。さらに、各9マーを、この9マーの配列と、以前のT細胞アッセイにおいてT細胞応答を刺激した無関係のタンパク質由来のデータベースペプチドの配列との間のあらゆる高い配列相同性を同定するために、公知のCD4+T細胞エピトープのデータベースに対してBLAST検索した。in silico分析からの情報に基づいて、同定されたエピトープからのCD4+T細胞エピトープ活性の潜在的除去のための置換を同定した。
エピトープ1は、N1−N2の推定Aベータ結合部分に対してすぐC末端側に存在する。エピトープ1のin silico分析は、T細胞エピトープのアミノ酸置換および除去のためのエリアとして、配列番号1のアミノ酸48〜56を強調した。この9マー内のアミノ酸を、既存のアミノ酸の性質、表面曝露、およびg3pのX線結晶構造から解釈されるようなg3pのアミロイド結合領域との相互作用に基づいて、置換のために標的化した。特に、G48、T51、Y54およびT56を、表1に示される変化による置換のために標的化した。この領域中の他の潜在的アミノ酸置換は、表2に示される。
表3に示される異なる単一アミノ酸置換を含有するN1−N2−ヒトIgG Fc融合タンパク質を各々がコードする58の異なる核酸分子を調製した。これを、所望の置換を導入するための適切なオリゴヌクレオチドプライマーを使用した配列番号4の部位特異的変異誘発と、その後の、pFUSE−hIgG1−Fc2ベクター(Invivogen(登録商標)、Toulouse、France、カタログ番号pfuse−hg1fc2)中へのPCR増幅した変異誘発配列の再クローニングとによって達成した。
A.Aベータ(Aβ)線維調製。Aβ42(1mg、rPeptide A−1002−2)を、ヘキサフルオロイソプロパノール(HFIP、1mL)中に溶解させ、徹底的にボルテックスし、透明な溶液が現れるまで2〜18時間室温でインキュベートした。アリコート(100μl、100μg)を、1.5mL Eppendorfチューブ中に配置し、減圧下で2〜3時間乾燥させた(speed Vac、Eppendorf、Concentrator 5301)。得られたモノマーを、20μLのDMSO中に再懸濁し、ピペッティングし、完全に溶解するまで徹底的にボルテックスした。この溶液を、260μLの10mM HCl溶液で希釈し(最終Aβ42濃度は80μMである)、20秒間ボルテックスした。透明な溶液を37℃で3日間インキュベートして(振盪なし)凝集させる。
配列番号1と比較して、本発明のポリペプチドのいずれかからのCD4+T細胞応答を分析するために、全タンパク質T細胞アッセイを実施した。PBMCを、実施例1と同様に調製した20個の健康なヒトドナーバフィーコートから単離した。PBMCを、AIM−V(登録商標)培養培地中で凍結から生き返らせ、CD14+細胞を、Miltenyi CD14マイクロビーズおよびLSカラム(Miltenyi Biotech、Oxford、UK)を使用して単離した。単球を、1000U/mlのIL−4および1000U/mlのGM−CSFを補充したAIM−V(登録商標)(「DC培養培地」)中に4〜6×106のPBMC/mlになるように再懸濁し、次いで、24ウェルプレート中に分配した(2mlの最終培養容積)。2日目に、半容積のDC培養培地の置き換えによって細胞に培地供給した。3日目までに、40ug/mlの試験ポリペプチドまたは40ug/mlの配列番号1のポリペプチドのいずれかを含む抗原および100μg/mlのKLHまたは培地のみと共に事前インキュベートした単球は、半成熟樹状細胞(DC)へと分化した。半成熟DCを、抗原と共に24時間インキュベートし、その後、細胞を2回洗浄し、50ng/mlのTNF−α(Peprotech、London、UK)を補充したDC培養培地中に再懸濁することによって、過剰な抗原を除去した。DCに、50ng/mlのTNFαを補充した半容積のDC培養培地の置き換えによって7日目に培地供給し、成熟DCを8日目に回収した。回収された成熟DCを計数し、生存度を、トリパンブルー色素排除を使用して評価した。次いで、DCにγ照射(4000ラド)し、AIM−V培地中に2×105細胞/mlに再懸濁し、使用前に、T細胞増殖アッセイおよびELISpotアッセイにおいて以下のように分析した。さらに、8日目に、新鮮なCD4+T細胞もまた調製した。CD4+T細胞を精製するために、PBMCを、AIM−V(登録商標)培養培地中で生き返らせ、CD4+細胞を、Miltenyi CD4マイクロビーズおよびLSカラム(Miltenyi Biotech、Oxford、UK)を使用して単離し、AIM−V(登録商標)培地中に2×106細胞/mlで再懸濁した。
結合アッセイの結果に基づいて、配列番号2と比較して2つのアミノ酸置換を含有するポリペプチド中に存在するように、以下の置換をエピトープ1、2および3において選択した。各置換は、異なるエピトープ中にある。
このアッセイを使用して、非アミロイド形成的凝集体または可溶性凝集体へのアミロイド線維の不安定化(脱凝集)またはリモデリングをモニタリングした。このアッセイは、Chang, E.およびKuret, J.、Anal Biochem 373巻、330〜6頁(2008年)ならびにWanker, E. E.ら、Methods Enzymol 309巻、375〜86頁(1999年)から主に適応させた。具体的には、fAβアミロイド線維の2.5μM調製物を、異なる濃度の本発明のバリアント融合ポリペプチド(1nM〜2μM)と共に、37℃で3日間事前インキュベートした。インキュベーション後、融合ポリペプチドありおよびなしの線維を希釈し、減圧ブロットで酢酸セルロースメンブレン上にスポットした。これらのメンブレンを、PBSで広範に洗浄し、AβのN末端に特異的な抗体を用いて1時間プローブした。HRPコンジュゲート化二次Abを使用して、メンブレン上に保持された原線維凝集体を定量した。スポットの色を分析し、濃度測定スキャナーを使用してデジタル化した。EC50(最大半量有効濃度)を、各スポットのシグナルの強度対各スポットに添加した融合ペプチドの濃度に基づいて計算した。
本発明者らは、部位特異的変異誘発のための出発材料として、配列番号3、またはポリペプチド番号86をコードする改変バージョンのヌクレオチド配列配列番号4のいずれかのヌクレオチド配列を使用して、配列番号1または配列番号2のアミノ酸39〜41におけるグリコシル化シグナルを欠くポリペプチドを構築した。
フォワードプライマー:GCTGTCTGTGGAATGCTGGAGGCGTTGTAGTTTG(配列番号8)
リバースプライマー:CAAACTACAACGCCTCCAGCATTCCACAGACAGC(配列番号9)
を使用して、製造業者の指示に従って変異誘発させて、T41G置換を創出した。得られたベクター(配列番号7)を使用して、標準的な技術を使用して所望のプラスミドを単離および配列決定するために、NEB 5−アルファコンピテントE.coli細胞を形質転換した。
T0440)を添加した。反応を、8分間発色させ、50μl/ウェルの2N HClを添加することによって停止させた。450nmでの吸光度を、Tecanプレートリーダー(Infinite M1000Pro)で記録した。
ポリペプチド200(N39A) ポリペプチド202(T41M) ポリペプチド204(T41H)
ポリペプチド201(N39Q) ポリペプチド203(T41W) ポリペプチド205(T41V)
ポリペプチド206(T41I) ポリペプチド211(T41F) ポリペプチド216(T41A)
ポリペプチド207(T41L) ポリペプチド212(T41D) ポリペプチド217(T41G)
ポリペプチド208(T41R) ポリペプチド213(T41E)
ポリペプチド209(T41K) ポリペプチド214(T41Q)
ポリペプチド210(T41Y) ポリペプチド215(T41N)
動物処置および試料収集。C57Bl6マウス(8〜12週齢;Hilltop Lab Animals)に、使用した配列番号1のポリペプチド(n=22)またはポリペプチド217(n=22)の単一20mg/kg腹腔内用量を投与した。配列番号1のポリペプチドは、22匹のマウスに1回投与した(20mg/kg、i.p.)。ポリペプチド217は、別個のセットの22匹のマウスに1回投与した(20mg/kg、i.p.)。血液を、異なる時点(投薬後0時間、6時間、9時間、12時間、1日、3日、7日および14日)において、各動物から1回収集した。血漿を、血液試料から単離し、100μLアリコートで貯蔵し、全ての引き続く分析に使用した。血液の収集後、マウスを安楽死させ、PBSで経心的に灌流し、それらの脳を回収した。脳を半切除し、各半球を、吻側、尾側、海馬および小脳部分へとさらに切片にした。血漿を、薬物動態分析のためにIntertek(San Diego、CA)に発送し、左前頭皮質を、PK分析のためにCambridge Biomedical(Boston、MA)に発送した。
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