MX2011005430A - Metodo para el tratamiento de la enfermedad de parkinson usando bacetriofago filamentoso. - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere al uso de un bacteriófago filamentoso, que muestra un anticuerpo que se une especifícame a una citoquina pro-inflamatoria, ya sea de manera individual o en combinación con un bacteriófago filamentoso que no muestra una señal de incorporación de célula de mamífero, para tratar la enfermedad de Parkinson.

Description

METODO PARA EL TRATAMIENTO DE LA ENFERMEDAD DE PARKINSON USANDO BACETRIOFAGO FILAMENTOSO CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención describe terapéuticos y métodos para tratar la enfermedad de Parkinson.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Enfermedad de Parkinson (PD) es una enfermedad neurodegenerativa progresiva cuyas características clínicas primarias incluyen anormalidades motoras, tal como temblor estático, bradiquinesia y rigidez (Fahn and Sulzer, 2004). PD se caracteriza por la pérdida de neuronas dopaminérgicas en la sustancia negra pars compacta y la presencia de cuerpos de inclusión, llamados cuerpos de Lewy y neuritas de Lewy, en la supervivencia de neuronas de alguna región (Forno, 1996). Aunque es generalmente aceptado que la pérdida de neuronas dopaminérgicas del cerebro medio es ampliamente responsable para los síntomas motores principales, esta no es solamente la región que muestra cambios patológicos en pacientes con PD. Patología de Lewy y pérdida celular primero aparecen en el núcleo del tronco cerebral inferior, progresivamente ascienden al cerebro medio y finalmente a áreas corticales en una manera altamente predecible (Break et al., 2004). Progresión de la patología de Lewy a las varias regiones externas del cerebro medio puede contar para la abundancia de los síntomas secundarios comúnmente observados en pacientes con PD, tal como depresión, demencia, y varias disfunciones autonómicas y sensoriales.

Aunque la causa de PD permanece difícil de alcanzar, existe un cuerpo grande de evidencia que sugiere que el desdoblamiento y agregación anormal de a-sinucleina es un componente importante de la patogénesis de enfermedad. Análisis de enlace genético han identificado tres mutaciones sin sentido en las formas heredadas de parkinsonismo (Kruger et al. 1998; Polymeropoulos et al,, 1997; Zarranz et al., 2004), y todas las variantes mutantes se ha mostrado que aceleran la oligomerización o fibrilación (Conway et al., 2000; Greenbaum et al., 2005). La acumulación de a-sinucleina tipo silvestre es suficiente para causar la enfermedad.

Agregados fibrilares de a-sinucleina parecen ser el componente principal de cuerpos de Lewy y neuritas de Lewy, y estos son considerados ahora el marcador de PD más confiable para diagnosis post-mortem (Spillantini et al., 1998). Debido a que a-sinucleina es una proteína citosólica se ha asumido que cambios y efectos patogénicos inducidos por la proteina ocurren en el citoplasma y se limitan a la célula sencilla. Sin embargo, estudios recientes de a-sinucleina extracelular sugieren que el alcance de acción patogénica va más allá del citoplasma de su origen (Lee, 2008).

La presencia de a-sinucleina y sus formas agregadas en fluido extracelular recientemente se demuestra ¡n vivo e ¡n vitro. a-sinucleina extracelular parece ser suministrada por exocitosis no convencional de a-sinucleina intravesicular, aunque el mecanismo exacto no se ha caracterizado. a-sinucleina intravesicular es propensa a agregación y es la fuente potencial de agregados extracelulares.

La función de a-sinucleina secretada en el espacio extracelular se puede interferir de estudios que usan sistemas de cultivo de tejido. Varios estudios reportan efectos citotóxicos de a-sinucleina extracelular y su fragmento hidrófobo interno (componente nomamiloide o NAC) cuando las proteínas se añaden al medio de cultivo (Albani et al., 2004; Bodles et al., 2000; Du et al., 2003; El-Agnaf et al., 1998; Forloni et al., 2000; Lee et al., 2004; Seo et al., 2002; Sung et al., 2001). Algunos estudios han demostrado el efecto tóxico de agregados fibrilares (Bodles et al., 2000; El-Agnaf et al., 1998), mientras otros estudios identifican agregados oligoméricos o protofibrilares como la causa tóxica (Du et al., 2003).

Alfa sinucleina se puede incorporar fácilmente en las membranas y se puede encontrar en vesículas sinápticas y en la membrana celular. No existen muchos modelos bien estructurados para los mecanismos de toxicidad. Estudios recientes ilustran una función posible para unos protofibrilos tipo poro de a-sinucleina en la patogénesis de enfermedad de Parkinson (Tsigelny et al., 2007; Lee et al., 2002; Volles and Lansbury, 2002). Un modelo propone que a-sinucleina oligomérica puede formar estructuras anulares con un poro central (Volles and Lansbury 2003). Estos agregados pueden unir a membranas (Volles et al., 2001 ) y su acción permeabilizante de membrana se ha demostrado en membranas de modelo sintético, tal como liposomas de fosfolípido (Volles et al., 2001) y membranas bicapa planas (Kayed et al., 2004). La inserción de estos agregados en la membrana celular puede tener un efecto catastrófico en la viabilidad celular debido al intercambio libre de iones y metabolitos pequeños entre el citoplasma y el espacio extracelular. Aunque este modelo de poro tóxico explica la citotoxicidad de al menos algunos agregados oligoméricos, los poros y la actividad de poro aún se han demostrado en sistemas biológicos. Otro mecanismo potencial de neurotoxicidad de a-sinucleina extracelular, y especialmente sus formas agregadas, puede involucrar respuestas neuro-inflamatorias (Zhang et al., 2005; Klegeris et al., 2006).

A pesar de los avances hechos a la fecha en desarrollar terapias para tratar PD, aún existe una necesidad grande para terapias adicionales.

La citación de cualquier documento aquí no se destina como una admisión tal que dicho documento es técnica previa pertinente, o material considerado para la patentabilidad de cualquier reivindicación de la presente solicitud. Cualquier establecimiento como el contenido o una fecha de cualquier documento se basa en la información disponible para el solicitante en el tiempo de presentación y no constituye una admisión como para corrección de dicho establecimiento.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención provee un bacteriófago filamentoso para el uso en el tratamiento de enfermedad de Parkinson o susceptibilidad a enfermedad de Parkinson, y un método para tratar a un paciente que padece o es susceptible enfermedad de Parkinson (PD). El método involucra la administración al paciente de un bacteriófago filamentoso que no despliega una señal de incorporación de célula de mamífero.

La presente invención también provee una composición farmacéutica que contiene un bacteriófago filamentoso que despliega un anticuerpo específico a una citoquina pro-inflamatoria y un segundo bacteriófago filamentoso que no despliega (i) una señal de incorporación de célula de mamífero; (ii) un antígeno de a-sinucleina o anticuerpo de a-sinucleina; (iii) un antígeno de ß-amiloide o anticuerpo de ß-amiloide; o (iv) un anticuerpo específico para una citoquina pro-inflamatoria.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Las figuras 1A y 1 B muestran un modelo de computadora de un agregado de a-sinucleina de membrana (AS) con una vista en perspectiva de la frente de un agregado de a-sinucleina incrustado en la membrana celular en una estructura tipo poro (figura 1A) y una vista en sección trasversal de la membrana, que muestra la profundidad de la inserción de proteína en la membrana (figura 1 B) (Tsigelny et al., 2007).

Las figuras 2A y 2B muestran la actividad de disgregación del fago en agregados del fragmento de AS in vitro como se mide por Tht (figura 2A) y se visualiza por TEM (figura 2B).

La figura 3 es una gráfica que representa los efectos del fago en la viabilidad de células SH-SY5Y.

Las figuras 4A y 4B muestran la reducción de agregados AS por fago (auxiliar) como se visualiza (figura 4 A) y se mide en un ELISA (figura 4B) usando un anticuerpo policlonal de a-sinucleina en un ensayo de retardación de filtro de a-sinucleina.

La figura 5A muestra análisis Western blot de la fracción de membrana de células SH-SY5Y, que demuestran la presencia de varios oiigómeros de a-sinucleina (AS), y la figura 5B muestra ensayo ELISA para medición de oiigómeros después del tratamiento M13. En la figura 5A, AS se detecta con un anticuerpo policlonal contra AS (Sigma). En la figura 5B, ,la cantidad de oiigómeros AS de la fracción de membrana se cuantifica en un ELISA específico para oiigómeros AS que se detectan con un anticuerpo monoclonal contra AS (Sigma, clon Syn 211). Una reducción significante en la cantidad de oiigómeros AS se mide en la fracción de membrana de células SH-SY5Y tratadas con fagos filamentosos tipo silvestre. *= diferencia de significancia comparada con células no tratadas (p<0.05).

La figura 6 es una gráfica que muestra la reducción en reactividad AS después de la interacción con fagos M13 comparados con el vehículo. Los datos se expresan como una relación del número promedio de agregados neuronales de AS observados en un hemisferio del cerebro inyectado con M13 comparado con los otros hemisferio inyectados con vehículo PBS (+M 3). En el control -M13, ambos hemisferios se inyectan con vehículo PBS.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Definiciones Para propósitos de esta especificación y las reivindicaciones acompañantes, las siguientes definiciones aplican.

Los términos "paciente", "sujeto" y "recipiente" se usan de manera intercambiable. Estos incluyen humanos y otros mamíferos que son el objeto de tratamiento terapéutico.

El término "que trata" con respecto a enfermedad de Parkinson se destina a significar sustancialmente inhibir, disminuir o revertir la progresión de enfermedad de Parkinson, tal como reducir o inhibir la formación de agregados de a-sinucleina, o disgregación de agregados pre-formados de a-sinucleina; mejoramiento sustancialmente de uno o más síntomas clínicos de enfermedad de Parkinson, tal como reducir la inflamación asociada con enfermedad de Parkinson; o sustancialmente prevenir la aparición de síntomas clínicos de enfermedad de Parkinson.

El término "co-administrador" se destina a significar la administración por medios de una forma de dosificación sencilla o por medios de formas de dosificación múltiples administradas de manera simultánea, secuencial o separada. Preferiblemente, la co-administración causa los efectos de cada administración que se ejercen en las células a ser tratadas en un periodo de traslape de tiempo, más preferiblemente de manera simultánea.

El término "anticuerpo" como se usa aquí incluye anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales, composiciones de anticuerpo con especificidades de poliepítope, anticuerpos biespecíficos, diacuerpos, u otras preparaciones purificadas de anticuerpos y anticuerpos recombinantes. Los anticuerpos pueden ser anticuerpos completos, por ejemplo, de cualquier isotipo (IgG, IgA, IgE, IgM, etc.) o fragmentos de anticuerpo que unen el antigeño de interés. En un ejemplo específico de un anticuerpo usado en la presente invención, el anticuerpo a ser formulado es un anticuerpo que tiene el isotipo IgG. Anticuerpos se pueden fragmentar usando técnicas convencionales u otras y los fragmentos clasificados para unión a un antigeño de interés. Generalmente, un fragmento de anticuerpo comprende la unión a antigeño y/o la región variable de un anticuerpo intacto.

El término "fragmento de anticuerpo" incluye segmentos de escisión proteolíticamente o porciones preparadas de manera recombinante de una molécula de anticuerpo que puede unir selectivamente a una proteína seleccionada. Ejemplos no limitantes de dichos fragmentos proteolíticos y/o recombinantes incluyen Fab, F(ab')2, Fab', Fv, y anticuerpos de cadena sencilla (scFv) que contienen un dominio VL y/o VH unidos por un enlazador de péptido, anticuerpos de dominio (dAbs), Nanobodies® (agentes terapéuticos biológicos derivados de anticuerpo que contienen la estructura única y propiedades funcionales de anticuerpos de cadena pesada de origen natural), y UniBodies (anticuerpos que carecen de la región articulada). El scFvs se puede enlazar covalentemente o no covalentemente para formar anticuerpos que tienen dos o más sitios de unión.

En algunas modalidades, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo es un anticuerpo monoclonal humanizado o anticuerpo monoclonal completamente humanizado. El término "anticuerpo monoclonal humanizado" como se usa aquí es un anticuerpo monoclonal de una fuente no humana (recipiente) que se ha alterado para contener al menos uno o más de los residuos de aminoácido encontrados en el anticuerpo monoclonal humano equivalente (donador). Un "anticuerpo monoclonal completamente humanizado" es un anticuerpo monoclonal de una fuente no humana que se ha alterado para contener todos los residuos de aminoácido encontrados en' la región de unión a antígeno del anticuerpo monoclonal humano equivalente. Anticuerpos humanizados también pueden comprender residuos que no se encuentran en el anticuerpo del recipiente o el anticuerpo donador. Estas modificaciones se pueden hacer para refinar adicionalmente y optimizar la funcionalidad de anticuerpo. Un anticuerpo humanizado también puede comprender opcionalmente al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina humana (Fe).

El término "citoquina pro-inflamatoria" se refiere a cualquier citoquina pro-inflamatoria involucrada en la inflamación cerebral asociada con enfermedad de Parkinson, que preferiblemente incluye IL-6, IL-1 , IL-17 y TNFa, y es más preferiblemente IL-6.

El término "señal de incorporación de célula de mamífero" se refiere a cualquier secuencia de adhesión celular que facilita la incorporación como un resultado de adhesión celular/unión a la célula. Numerosas secuencias de adhesión celular de mamífero son conocidas e incluyen la secuencia de adhesión celular Arg-Gly-Asp (RGD), el péptido Tat de VIH y péptidos que comprenden la secuencia de Arg-Glu-Asp (RED), Arg-Lys-Lys (RKK), Leu-Asp-Val (LDV; Humphries, 1992), Leu-Leu-Gly (LLG; Koivunen et al., 2001), Asp-Gly-Glu-Ala (DGEA; SEQ ID NO:2), lle-Arg-Val-Val-Met (IRWM; SEQ ID NO:3; Kosfeld et al., 1993), Pro-His-Ser-Arg-Asp (PHSRN; SEQ ID NO:4) y RFYWMWK (SEQ ID NO:5; Kosfeld et al., 1993). Muchas secuencias de adhesión celular (también conocidas como motivos de unión celular) son conocidas en moléculas adhesivas celulares tal como lamininá, fibronectina, vitronectina, fibrinogeno, trombospondina, etc.

El término "antígeno de a-sinucleina" se refiere a un antigeno de a-sinucleina humana, donde la a-sinucleina humana preferiblemente tiene la secuencia de aminoácido de SEQ ID NO: 6 (gen NCBI ID; 6622, No. de acceso NP000336; UniprotKB/Swiss-Prot No. de acceso P37840). Un "anticuerpo de a-sinucleina" es uno que reconoce y une a la a-sinucleina SEQ ID NO: 6 o su variante o mutante.

El término "antígeno de ß-amiloide" se refiere a un antígeno de una placa que forma "péptido de ß-amiloide", también conocido como "ß??", "ß?", "?ß" o "?ß?", derivado de proteína precursora amiloide humana. Un "anticuerpo ß-amiloide" es uno que reconoce y une al péptido ß-amiloide de péptido ?ß 1-42 humano de origen natural y sus variantes y mutantes.

Como se usa aquí, una "composición farmacéutica" se refiere a una preparación de uno o más ingredientes activos descritos aquí con otros componentes químicos tal como portadores y excipientes fisiológicamente adecuados. El propósito de una composición farmacéutica es facilitar la administración de un compuesto a un paciente.

Las frases "portador fisiológicamente aceptable" y "portador farmacéuticamente aceptable" que se pueden usar de manera intercambiable, se refieren a un portador o un diluyente que no causa irritación significante a un organismo y no deroga la actividad biológica y propiedades del compuesto administrado.

El término "excipiente" se refiere a una sustancia inerte añadida a una composición farmacéutica para facilitar adicionalmente la administración de un ingrediente activo. Ejemplos no limitantes de excipientes incluyen carbonato de calcio, fosfato de calcio, varios azúcares y tipos de almidón, derivados de celulosa, gelatina, aceites vegetales y polietilenglicoles.

El término "bacteriófago filamentoso tipo silvestre" como se usa aquí significa un bacteriófago filamentoso de origen natural que se aisla lejos de otros componentes con los cuales es usualmente asociado en naturaleza. El término también incluye fago filamentoso disponible comercialmente que se caracteriza como "tipo silvestre".

El término "bacteriófago filamentoso tipo silvestre inactivado" como se usa aquí significa un bacteriófago filamentoso tipo silvestre que no es genéticamente alterado por medios de ADN recombinantes, pero se ha rendido incapaz de replicación, tal como por irradiación con UV. Cualquier mecanismo que rinde el fago incapaz de replicación, pero no perturba la estructura filamentosa de bacteriófago (retiene su capacidad de penetrar en el cerebro a través de la trayectoria olfatoria) se contempla por esta invención.

El término "fago WT" se refiere a bacteriófago filamentoso tipo silvestre y bacteriófago filamentoso tipo silvestre inactivado.

Bacteriófago filamentoso para uso en tratamiento y métodos de tratamiento En una modalidad, la invención provee un bacteriófago filamentoso para uso en el tratamiento de enfermedad de Parkinson o susceptibilidad a enfermedad de Parkinson y un método para tratar un paciente que padece o es susceptible a enfermedad de Parkinson al administrar al paciente un bacteriófago filamentoso, en donde el bacteriófago no despliega (i) una señal de incorporación de célula de mamífero, (ii) un antigeno de a-sinucleina o anticuerpo de a-sinucleina, o (iií) un antigeno de ß-amiloide o anticuerpo de ß-amiloide.

En un aspecto de esta modalidad, el bacteriófago se administra al paciente como parte de una composición farmacéuticamente aceptable que comprende adicionalmente un portador farmacéuticamente aceptable.

En otro aspecto de esta modalidad, el bacteriófago es un fago WT. o Sin ser unido a una teoría, se propone que el fago utilizado en esta invención une a a-sinucleina extracelular o agregados de a-sinucleina en la membrana y reduce la agregación de a-sinucleina en la membrana celular. Los presentes inventores proponen que esta reducción de agregados de a-sinucleina en la membrana también conduce a una reducción de agregados intracelulares de a-sinucleina, posiblemente al fijar el equilibrio de a-sinucleina de intracelular a extracelular. Sin embargo, sin ser unido a cualquier mecanismo particular, el presente bacteriófago filamentoso y método son útiles para tratar un paciente que padece o es susceptible a enfermedad de Parkinson.

En una modalidad, el bacteriófago filamentoso es útil para administración intranasal. La administración intranasal permite a estos bacteriófagos cruzar la barrera de sangre-cerebro. El fago después se elimina del cerebro y cuerpo vía orina y heces sin efectos adversos en órganos periféricos.

Citoquinas pro-inflamatorias contribuyen a los síntomas neuroinflamatorios de enfermedad de Parkinson. La remoción de dichas citoquinas pro-inflamatorias puede mejorar dichos síntomas. De esta manera en una modalidad, la invención provee un bacteriófago filamentoso que despliega un anticuerpo específico a una citoquina pro-inflamatoria para uso en el tratamiento de enfermedad de Parkinson o susceptibilidad a enfermedad de Parkinson y un método para tratar un paciente que padece o es susceptible a enfermedad de Parkinson al administrar al paciente un bacteriófago filamentoso que despliega un anticuerpo especifico a una citoquina pro-inflamatoria. En un aspecto de esta modalidad, el bacteriófago se administra intranasalmente. En otro aspecto, el bacteriófago se administra como parte de una composición farmacéuticamente aceptable que comprende adicionalmente un portador farmacéuticamente aceptable. En otro aspecto, el anticuerpo específico a una citoquina pro-inflamatoria es de la clase IgG y porta una porción Fe. En aún otro aspecto el anticuerpo es un anticuerpo específico para IL-6. En aún otro aspecto el bacteriófago que porta la citoquina pro-inflamatoria no comprende una señal de incorporación de célula de mamífero.

Cuando se administra intranasalmente, el fago que porta el anticuerpo será suministrado al cerebro donde será dirigido a las citoquinas pro-inflamatorias por los anticuerpos desplegados en este, con lo cual inactivan dichas citoquinas. La porción de fago de estos anticuerpos desplegados de fago tendrá la acción doble de permitir a los anticuerpos pasar la barrera sangre-cerebro e inhibir directamente la agregación de a-sinucleina.

En consecuencia a una modalidad relacionada, la invención provee un primero y segundo bacteriófago filamentoso para el uso en tratamiento y un método para tratar un paciente que padece o es susceptible a enfermedad de Parkinson al co-administrar al paciente (a) un primer bacteriófago filamentoso que despliega un anticuerpo específico a una citoquina pro-inflamatoria; y (b) un segundo bacteriófago filamentoso, en donde el segundo bacteriófago no despliega un anticuerpo específico a una citoquina pro-inflamatoria. En un aspecto, el segundo fago filamentoso adicionalmente no despliega una señal de incorporación de célula de mamífero. En otro aspecto, el segundo fago filamentoso adicionalmente no despliega (i) un antígeno de a-sinucleina o anticuerpo de a-sinucleina; o (ii) un antígeno de ß-amiloide o anticuerpo de ß-amiloide. En aún otro aspecto, el segundo fago filamentoso adicionalmente no despliega (i) una señal de incorporación de célula de mamífero; (¡i) un antígeno de a-sinucleina o anticuerpo de a-sinucleína; o (iií) un antígeno de ß-amiloide o anticuerpo de ß-amiloide.

En otro aspecto, cada bacteriófago filamentoso se administra como parte de una composición farmacéuticamente aceptable que comprende adicionalmente un portador farmacéuticamente aceptable. En otro aspecto de cualquiera de las combinaciones expuestas anteriormente, el segundo bacteriófago filamentoso es un fago WT. En aún otro aspecto, el segundo bacteriófago filamentoso es un bacteriófago irradiado con UV.

En aún otro aspecto, el primero y segundo bacteriófago son cada uno administrado al paciente intranasalmente. En otro aspecto, el anticuerpo especifico para una citoquina pro-inflamatoria es de la clase IgG y porta una porción Fe. En aún otro aspecto, el anticuerpo es un anticuerpo específico para IL-6. En otro aspecto, el primer bacteriófago no comprende una señal de incorporación de célula de mamífero.

Se pueden producir fagos para desplegar los anticuerpos para citoquinas pro-inflamatorias por cualquier técnica conocida en la técnica. Por ejemplo, el anticuerpo se puede diseñar como un anticuerpo de cadena sencilla por técnicas bien conocidas y el vector de fago se puede modificar de modo que despliega dichos anticuerpos de cadena sencilla (scFv) en la superficie de bacteriófago.

Otra manera de causar cualquier anticuerpo dado, preferiblemente un anticuerpo monoclonal, que se despliega en un fago es para producir un fago que despliega un polipéptido que une la porción Fe de inmunoglobulinas. Dicho fago es conocido en la técnica y se describe en la publicación de PCT WO 2007/095616. Usando un fago modificado, cualquier anticuerpo que contiene una porción Fe se puede causar para ser desplegado en este al poner en contacto simplemente los anticuerpos con el fago. La porción Fe del anticuerpo será unida por el polipéptido de unión a Fe desplegado por el fago. De esta manera, la unión de un anticuerpo, o su fragmento, se facilita.

En una modalidad, un polipéptido que une la porción Fe de inmunoglobulinas es proteína A, proteína G, su fragmento que contiene la porción de unión a anticuerpo de proteína A (es decir, dominio de unión B) o proteína G, o una variante de proteína A o proteína G. En otra modalidad, el variante de proteína A es la variante que tiene la secuencia de aminoácido de SEQ ID NO: 1. Cuando un anticuerpo que carece de región Fe se usa, se debe desplegar directamente por el fago.

Bacteriófagos filamentosos son un grupo de virus relacionados estructuralmente que contienen un genoma de ADN de cadena sencilla circular. No eliminan su huésped durante la infección productiva. Los fagos que infectan Escherichia coli que contienen los plásmidos F son colectivamente referidos como bacteriófagos Ff. Estos no infectan células de mamífero. En una modalidad, cada bacteriófago filamentoso usado en los métodos expuestos anteriormente se selecciona independientemente de fagos filamentosos M13, f1 y fd. En un aspecto, cuando un primer y segundo fago filamentoso se usa, cada fago es del mismo subtipo y se selecciona de fagos filamentosos M 3, f1 , y fd.

Fago que lleva un anticuerpo específico para una citoquina pro-inflamatoria o un polipéptido que une la porción Fe de inmunoglobulinas están diseñados para mostrar la proteína en su superficie. Esto normalmente involucra la expresión de un clon de ADNc del polipéptido para mostrarse, como una proteína de fusión con una proteína de capa de fago. Bacteriófagos filamentosos que muestran proteínas o péptidos externos como una fusión con una proteína de capa de fago se conocen bien por aquellos con experiencia en la técnica. Se puede usar una variedad de fagos y proteínas de capa, incluyendo, pero no limitado a: proteína III M 3, proteína VIII M 3, proteína VI M13, proteína IX M13 y proteina plll de capa menor fd (Saggio et al., 1995; Uppala y Koivunen, 2000). Un gran arreglo de vectores está disponible para producir tales proteínas de fusión (ver Kay et al., 1996; Berdichevsky et al, 1999; y Benhar, 2001 ). Métodos para insertar secuencias de codificación externas en un gen de fago se conocen bien (véase por ejemplo, Sambrook et al., 1989; y Brent et al, 2003).

En una modalidad, un polipéptido que une la porción Fe de inmunoglobulinas se muestra por su fusión a la proteína de capa menor (proteína III) de un fago filamentoso.

Métodos delineados aquí también incluyen aquellos donde el paciente se identifica en necesidad de un tratamiento indicado particular. La identificación de un paciente en necesidad de dicho tratamiento puede estar en el juicio de un paciente o un profesional de la salud y puede ser subjetivo (por ejemplo, opinión) u objetivo (por ejemplo, medible por una prueba o un método de diagnóstico).

Composiciones farmacéuticas En una modalidad relacionada, la invención proporciona una composición farmacéutica (por ejemplo, libre de pirógenos) integrada por: (a) un primer bacteriófago filamentoso que muestra un anticuerpo específico para una citoquina pro-inflamatoria; y (b) un segundo bacteriófago filamentoso, donde el segundo bacteriófago no muestra un anticuerpo especifico para una citoquina pro-inflamatoria. En un aspecto, el segundo fago filamentoso además no muestra una señal de internalización de células de mamífero. En otro aspecto, el segundo fago filamentoso además no muestra (i) un antígeno de a-sinucleina o anticuerpo de a-sinucleina; o (ii) un antígeno de ß-amiloide o anticuerpo de ß-amiloide. En otro aspecto todavía, el segundo fago filamentoso además no muestra (i) una señal de internalización de células de mamífero; (ii) un antígeno de a-sínucleina o anticuerpo de a-sinucleina; o (iii) un antígeno de ß-amíloide o anticuerpo de ß-amiloide.

En un aspecto de esta modalidad, el segundo bacteriófago es un fago WT. En un aspecto más concreto, el segundo bacteriófago es un bacteriófago irradiado con UV.

En otro aspecto, el anticuerpo específico para una citoquina pro-inflamatoria es de la clase IgG y lleva una porción Fe. En otro aspecto aún, el primer bacteriófago en la composición muestra un anticuerpo específico para IL-6. En otro aspecto incluso, el primer bacteriófago no constituye una señal de incorporación de células de mamífero.

En otro aspecto, la composición se formula para administración intranasal.

Técnicas para la formulación y administración de fármacos se pueden encontrar en "Remington's Pharmaceutical Sciences," Mack Publishíng Co., Easton, PA, última edición, que se incorpora aquí por referencia y se conoce bien en la técnica.

Las composiciones farmacéuticas para uso de acuerdo con la presente invención de este modo se pueden formular de forma convencional con uno o más portadores fisiológicamente aceptables que comprenden excipientes y auxiliares, que facilitan el procesamiento de los ingredientes activos en preparaciones que se pueden utilizar farmacéuticamente.

Para una administración por inhalación nasal, los ingredientes activos para uso de acuerdo con la presente invención convenientemente se suministran en forma de una presentación de aerosol desde un envase a presión o un nebulizador con el uso de un propelente adecuado, por ejemplo, diclorodifluorometano, triclorofluorometano, dicloro-tetrafluoroetano o dióxido de carbono. Un aerosol nasal, que no requiere un envase a presión o nebulizador como en un aerosol de inhalación, se puede utilizar alternativamente para la administración intranasal. En el caso de un aerosol presurizado, la unidad de dosificación se puede determinar al proporcionar una válvula para suministrar una cantidad medida. Se pueden formular cápsulas y cartuchos de, por ejemplo, gelatina para uso en un dispensador que contiene una mezcla en polvo del compuesto y una base adecuada en polvo como lactosa o almidón.

Composiciones farmacéuticas adecuadas para su uso en el contexto del método de la presente invención incluyen composiciones donde el ingrediente o ingredientes activos están contenidos en una cantidad efectiva para conseguir el objetivo pretendido. Más específicamente, una cantidad efectiva significa una cantidad del ingrediente o ingredientes activos eficaces para tratar la enfermedad de Parkinson.

La determinación de una cantidad terapéuticamente eficaz se encuentra dentro de la capacidad de aquellos expertos en la técnica, especialmente en vista de la descripción detallada proporcionada aquí.

La cantidad de dosis y el intervalo se pueden ajustar individualmente para proporcionar niveles de cerebro del vehículo de despliegue de virus filamentoso que son suficientes para tratar (concentración mínima efectiva, MEC). La MEC variará para cada preparación, pero se puede estimar de datos in vitro. Dosis necesarias para lograr la MEC dependerán de las características individuales.

Intervalos de dosis también se pueden determinar utilizando el valor de MEC. Preparaciones deben administrarse mediante un régimen, que mantiene los niveles de cerebro por encima de MEC para 10-90% del tiempo, preferentemente entre 30-90% del tiempo y más preferentemente entre 50-90% del tiempo durante el curso del tratamiento.

Dependiendo de la gravedad y la capacidad de respuesta de la enfermedad de Parkinson a tratarse en el paciente, la dosis puede ser de una única administración o una pluralidad de administraciones, con el curso del tratamiento de una duración de varios días a varias semanas o hasta que se logre la disminución del estado de la enfermedad de Parkinson.

La cantidad de una composición que se va a administrar, por supuesto, dependerá del sujeto que se trata, la gravedad de la aflicción, la sentencia del médico que prescribe, etc.

Composiciones usadas en el método de la presente invención pueden, si se desea, presentarse en un envase o dispositivo dosificador, tales como un kit aprobado por la FDA, que puede contener una o más formas de dosificación unitaria que contiene el ingrediente activo. El envase puede, por ejemplo, comprender lámina de plástico o metal, como un envase tipo burbuja. El envase o dispositivo dispensador puede ir acompañado de instrucciones para la administración. El envase o dispensador también puede acomodarse por un aviso asociado al contenedor en una forma prescrita por una agencia gubernamental que regula la fabricación, uso o venta de productos farmacéuticos, aviso el cual es reflejo de la aprobación por la agencia de la forma de las composiciones o administración humana o veterinaria. Dicho aviso, por ejemplo, puede ser de etiquetado aprobado por la Administración de Alimentos y Fármacos de Estados Unidos para la prescripción de fármacos o de un prospecto de producto aprobado. Composiciones que comprenden una preparación de la invención formulada en un portador farmacéutico compatible también se puede preparar, colocado en un contenedor adecuado y etiquetado para tratamiento de un padecimiento indicado, como se detalla además anteriormente.

En una modalidad particular, la invención proporciona un kit para tratar la enfermedad de Parkinson que comprende, en contenedores separados, (a) un primer bacteriófago filamentoso que muestra un anticuerpo especifico para una citoquina pro-inflamatoria; y (b) un segundo bacteriófago filamentoso, en el que el segundo bacteriófago no muestra (i) una señal de incorporación de células de mamífero; (¡i) un antígeno de a-sinucleina o anticuerpo de a-sinucleina; (iii) un antígeno de ß-amiloide o anticuerpo de ß-amiloide; o (iv) un anticuerpo específico para una citoquina pro-inflamatoria; y (c) instrucciones que describen un método de uso del kit para tratar la enfermedad de Parkinson.

Habiendo descrito ahora generalmente la invención, la misma será más fácilmente entendida por referencia al siguiente ejemplo que se proporciona a titulo de ilustración y no pretende limitar la presente invención.

EJEMPLO Los resultados experimentales en este ejemplo demuestran el efecto de fago filamentoso en la disgregación de agregados de a-sinucleina involucrados en la patogénesis de PD.

Preparación de fagos filamentosos Fagos filamentosos M 3 se preparan de cultivos de TG1 Escherichia coli infectados con fago auxiliar de M13K07 (New England Biolabs, Beverly, MA) en caldo 2YT que contiene 50 g/ml de kanamicina (Sigma-Aldrich, St. Louis, O). Las células bacterianas se centrifugan (8300xg, 15 minutos), y fagos se precipitan desde el sobrenadante por adición de 1/5 (p/v) de 16.7% de polietilenglicol (PEG) y se centrifuga (14,000xg, 1 hora a 4°C). La pella se resuspende en solución salina estéril amortiguada con fosfato (PBS) (3% del volumen de sobrenadante). Bacterias residuales se eliminan por centrifugación en 6,000xg durante 15 minutos y los fagos entonces se someten a precipitación de PEG-NaCI. La pella finalmente se resuspende en PBS (2% del volumen de sobrenadante) y solución de fago se filtran a través de un filtro libre pirógenos de 0.45 pm para eliminar cualquier bacteria residual. Fagos esféricos se generan por incubación de fagos filamentosos en PBS con un volumen igual de cloroformo. La solución se agita con vórtice seis veces cada una durante 10 segundos, alrededor de 3 minutos a temperatura ambiente (RT) y se centrifuga a 18,5000xg durante 1 minuto. Ambas soluciones acuosa y cloroformo quedan al descubierto en la capucha hasta que todos los residuos de cloroformo se hayan evaporado y, a continuación, se resuspenden en PBS al volumen original. La integridad del fago se interrumpe por sonicación de 500 µ? de 1 x 1013 fagos en PBS en hielo durante 15 x 5 segundos utilizando un disgregador de células ultrasónico (Microson Heat Systems, Farmingdale, NY, Estados Unidos).

Investigación de agregación de a-sinucleina in vitro El nivel de agregación de un fragmento de 12 aminoácido correspondiente a los aminoácidos 71 -82 de la a-sinucleina humana (SEQ ID NO: 7), el núcleo de cuerpos de Lewy, y la proteína alfa-sinucleina recombinante completa se prueban y analizan.

Se examina la capacidad de fago filamentoso para prevenir y disgregar el péptido y alfa-sinucleina recombinante. El nivel de agregación de a-sinucleina se determina en la tioflavina T (Tht) y ensayos de filtración de proteína como se describe a continuación.

Fibrilos alfa-sinucleina y fagos filamentosos se visualizan por microscopía electrónica A fin de evaluar el efecto anti-agregación del fago filamentoso, muestras de 900 µ? de fragmento de a-sinucleina que extienden residuos de aminoácidos 71-82 de a-sinucleina se incuban durante seis semanas a 37°C. En esta etapa, fagos filamentosos se incuban con el péptido agregado por un periodo de una semana. Se examinan dos concentraciones de fagos: 1012/ml y 1011/ml. Las muestras de péptido se diluyen en una solución acuosa 0.3 µ? Tht a una concentración final de 225 µ?. Muestras de emisión de fluorescencia a 480 nm se cuantifican. Se detecta una reducción significativa del 43% en la muestra que contiene la cantidad de 1012/ml de fagos vistos por una reducción en la emisión a 480 nm (figura 2A).

Muestras también se observan por microscopía electrónica de transmisión (TEM). Las muestras se cargan en rejillas de carbono y se recubren con acetato de uranilo. En la muestra que contiene sólo el péptido a-sinucleina, cantidades significativas de fibrilos complejos en una forma densa se detectan (figura 2B, panel izquierdo). Una reducción sustancial en la cantidad y complejidad de fibrilos se observa en la muestra incubada con 1011 fagos, mientras que en la muestra incubada con 1012 fagos, no se detectan fibrilos y sólo agregados amorfos son visibles (figura 2B, paneles central y derecho).

Cultivos de células SH-SY5Y como modelo celular La línea de células de neuroblastoma SH-SY5Y es un buen candidato para usar como modelo de PD ya que es una célula dopaminérgica. Las células se transfectan de forma estable con el gen humano a-sinucleina 'tipo silvestre y el gen mutante a-sinucleina A53T. • la expresión de alfa-sinucleina se determina por Western blot. • las células se tiñen con anticuerpo de alfá-sinucleina para visualizar los cuerpos de Lewy.

Células SH-SY5Y transfectadas de manera estable para sobre- expresar a-sinucleina A53T se cultivan en platos de 10 cm y mantienen en medio modificado DMEM: F12 de Ham (1 :1 ) que contiene 1 % de aminoácidos no esenciales (NEAA) y complementado con FCS (10%), glutamina (2 mM), solución de penicilina-estreptomicina (1 %) (Biological Industries), en incubadora humidificada a 37°C con 5% C02.

Lisis celular Para la separación de a-sinucleina, el procedimiento de lisis se realiza mediante la extracción de células descrita por Lee et al (2004), modificada por el laboratorio de los presentes inventores. Brevemente, las células se enjuagan con PBS, se tripsinizan con tripsina 1.5 mi por plato recolectado a un tubo de 15 mi, se centrifugan y lavan nuevamente con PBS seguido de colección a un tubo de Eppendorf. Las células se lisan con 100 µ? de regulador de pH T (que contiene 20 mM Tris pH 7.4, 25 mM KCI, 5 mM MgC , 0.25 M sacarosa, 1 % Tritón X-100 y mezcla de inhibidor de proteasa), se pipetean hasta que no queden grumos celulares, se incuban a temperatura ambiente durante 10 minutos y centrifugan a 13,000 kg durante 10 minutos. El sobrenadante se recolecta y coloca en un tubo separador Eppendorf marcado como "rejilla" (notar que no se debe dejar sobrenadante con la fracción de pellas). La pella se cubre suavemente con regulador de pH N (que contiene 0.1 M Na2C03, pH 11.5 y una mezcla de inhibidor de proteína) sin mezclado y se incuba durante la noche a 4°C. Esto permite que las proteínas se resuspenden suavemente en el regulador de pH. Tras la incubación, se remueve el regulador de pH ahora turbio con una punta de pipeta pequeña y se descarta. El material restante en el tubo se marca como "pella". Los extractos de sobrenadante y pella se mantienen a -20"C y se analizan por Western blot para cuantificar la cantidad de a-sinucleina soluble e insoluble.

Toxicidad de fago Viabilidad de las células diferenciadas SH-SY5Y después de la incubación con fago se prueba con el reactivo MTT. Las células se incuban durante la noche con 1 x 109 y 1 x 1011 fagos/pozo en una placa de 96 pozos. No se observa muerte celular tras la incubación (figura 3).

Ensayo de retardo de filtro Para la filtración de agregado de proteina, se utiliza un dispositivo de transferencia por ranuras disponible comercialmente (Bio-Rad Laboratories, Munich, Alemania). Muestras se filtran a través de una membrana de nitrocelulosa bloqueada (0-0.2 µ?t? de tamaño de poro, Schieicher & ScheulI, Dassel, Alemania). Después de filtración, cada ranura se lava con 0.1 % SDS. Agregados de alfa-sinucleina se detectan con el anticuerpo monoclonal LB509 (1 :10,000) con un anticuerpo secundario de cabra-anti-ratón acoplado a HRP y finalmente visualizado por quimioluminiscencia. Cuantificación densitométrica de transferencia PAF se realiza con SigmaGel v1.0.

Igual número de células por plato de 10 cm se agregan y se deja llegar a la confluencia del 80%. En ese momento, las células se tratan con diferentes cantidades de fago durante 24 y 72 horas. Las células luego se recogen de cada placa y lisan y analizan, como se describe a continuación. Células diferenciadas de SH-SY5Y que sobre-expresan a-sinucleina de tipo silvestre se incuban con un total de 1 x 1012 fagos durante un período de 3 horas o durante la noche a 37°C. Se extraen las fracciones solubles e insolubles y la fracción insoluble se filtran a través de una membrana de nitrocelulosa 0.2 pm. La cantidad de agregados de a-sinucleina retenidos en el filtro es mayor en las células sin tratar (figura 4A).

ELISA de oligómeros a-sinucleina Un ELISA para detectar especies oligoméricas de a-sinucleina (El-Agnaf et al., 2000) se modifica a fin de medir la cantidad de oligómeros de a-sinucleina en la fracción insoluble de células SH-SY5Y. A fín de detectar sólo oligómeros de AS, se utiliza el mismo anticuerpo monoclonal empleado para revestimiento (conjugado para biotina).

Una reducción de 40%-50% en oligómeros AS se detecta en la fracción insoluble de células tratadas con fago durante incubación durante 3 horas y durante la noche (figura 4B).

Interacción de fago M13 con a-sinucleina en modelos celulares Alfa-sinucleina (AS) es una proteína nativamente desdoblada localizada en terminales presinápticas. AS se incorpora fácilmente en membranas a través de la N-terminal y, por tanto, existe en la célula en dos formas: una membrana unida y una forma desordenada citosólica. Los datos acumulados indican que la forma de membrana de AS desempeña un papel en la toxicidad celular. Los protofibrilos pueden formar estructuras anulares incrustadas en la membrana de la célula y causar permeabilidad de la membrana. Recientemente se ha demostrado que AS tiene una propensión a una agregación mucho mayor en presencia de lípidos y que los agregados de membrana pueden inducir agregación de la forma citosólica de AS.

Aquí, la modulación de oligómeros AS tras el tratamiento con fagos filamentosos tipo silvestre (M13) en células SH-SY5Y que sobre-expresan AS tipo silvestre se presenta. La fracción de membrana de las células se extraen mediante un kit de extracción de membrana (MBL) para detección de AS por análisis Western blot. No sólo se detectan monómeros AS, pero dímeros AS y trímeros también se detectan en la fracción de membrana (figura 5A), demostrando la existencia de oligómeros AS en compartimentos de membrana en nuestro modelo celular. El efecto de fago filamentoso en la oligomerización de la membrana AS después de incubación con fagos filamentosos se muestra en la figura 5A y 5B. Células SH-SY5Y se diferencian con ácido retinoico y se incuban durante la noche con fagos tipo silvestre en 1011 fagos/ml. Las fracciones de membrana se extraen al día siguiente y muestras de cada extracción se miden para la cantidad de oligómeros AS en un ELISA diseñado para reconocer solo especies oligoméricas de AS (figura 5B). Una reducción significativa en oligómeros AS de la fracción de membrana se mide en células SH-SY5Y después de la incubación con fagos filamentosos. El efecto de fagos tipo silvestre sobre agregación de AS extraída de la fracción de membrana sugiere que los fagos tipo silvestre afectan AS en la membrana plasmática, posiblemente a través de la interacción directa con AS a través de una región previamente demostrada de interacción ubicada en aminoácidos 73-85 de la región NAC de AS. También es posible que debido a la larga incubación de las células con fagos, un pequeño porcentaje de los fagos se incorpore en las células que afectan otros compartimentos membranosos en la célula diferente de la membrana plasmática. La unión de los fagos a las células con posible incorporación puede promover la remoción de alfa-sinucleina de la membrana de plasma a través de la activación de degradación lisosmal.

Estudios de interacción M 3 con g-sinucleina utilizando el modelo de ratones transgénicos de la enfermedad de Parkinson Ratones transgénicos PDGF a-sinucleina (línea D) y ratones no transgénicos de 7 meses reciben inyecciones ¡ntra-hipocampo con fago M13 a 1 x 1014 y los cerebros se analizan 7 días más tarde por IHC con anticuerpos contra alfa-sinucleina, M13 y Iba1 (para la activación de la microglia). Inmuno-reactividad M13 abundante se observa en ratones Tg alfa-sinucleina inyectados con M13. Inmuno-tinción M13 se observa en cuerpos de células neuronales en la neocorteza y el hipocampo. En el hipocampo la inmuno-tinción 13 también es abundante en el neuropilo. El número promedio de agregados neuronales de a-sinucleina se mide en ambos hemisferios del cerebro después de inyección de M13 en un hemisferio y vehículo de solución salina amortiguada con fosfato (PBS) en el otro hemisferio, y la relación entre las mediciones en los hemisferios independientes se muestra en la figura 6.

Habiendo ahora descrito completamente esta invención, se apreciará por los expertos en la técnica que lo mismo se puede realizar dentro de una amplia gama de parámetros equivalentes, concentraciones y condiciones sin apartarse del espíritu y el alcance de la invención y sin experimentación indebida.

Mientras este invención se ha descrita en relación con modalidades específicas de la misma, se entenderá que es capaz de nuevas modificaciones. Esta aplicación se destina a cubrir cualquier variación, usos o adaptaciones de las invenciones, en general, siguiendo los principios de la invención e incluyendo dichas desviaciones de la presente descripción como vienen dentro de la práctica conocida o habitual en la técnica a la que pertenece la invención y como se puede aplicar a las características esenciales precedentemente enunciadas como sigue en el alcance de las reivindicaciones anexadas.

Referencia a las etapas del método conocido, etapas de los métodos convencionales, métodos conocidos o métodos convencionales no es en absoluto una admisión que cualquier aspecto, descripción o modalidad de la presente invención se describe, enseña o sugiere en la técnica pertinente.

La descripción anterior de las modalidades específicas completamente revelarán la naturaleza general de la invención que otros pueden, mediante la aplicación de los conocimientos dentro de la habilidad de la técnica (incluyendo el contenido de las referencias citadas en el presente documento), fácilmente modificar y/o adaptar diversas aplicaciones de tales modalidades específicas, sin experimentación indebida, sin apartarse del concepto general de la presente invención. Por lo tanto, dichas modificaciones y adaptaciones pretenden estar dentro del significado y gama de equivalentes de las modalidades descritas, basadas en la enseñanza y orientación presentadas en este documento. Se debe entender que la fraseología o terminología en el presente documento tiene como fin describir y no limitar, de tal modo que la terminología o fraseología de la presente especificación se debe interpretar por el experto en la técnica en vista de las enseñanzas y pautas presentadas en este documento, en combinación con el conocimiento del experto en la técnica.

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Claims (37)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Un bacteriófago filamentoso para el uso en el tratamiento de enfermedad de Parkinson o susceptibilidad a la enfermedad de Parkinson, en donde el bacteriófago filamentoso despliega un anticuerpo para una citoquina pro-inflamatoria.

2 - Un bacteriófago filamentoso para el uso en el tratamiento de enfermedad de Parkinson o susceptibilidad a enfermedad de Parkinson, en donde el bacteriófago filamentoso que no despliega (i) una señal de incorporación de célula de mamífero; (ii) un antígeno de a-sinucleina o un anticuerpo de a-sinucleina; o (iii) un antígeno de ß-amiloide o un anticuerpo de ß-am'iloide.

3.- El bacteriófago filamentoso de conformidad con la reivindicación 1 o 2, caracterizado además porque el bacteriófago no muestra una señal de incorporación de célula de mamífero.

4. - El bacteriófago filamentoso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado además porque el bacteriófago es un fago WT.

5. - El bacteriófago filamentoso de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado además porque el bacteriófago es un fago irradiado con UV.

6 - Un primer y segundo bacteriófago filamentoso para el uso en el tratamiento de enfermedad de Parkinson, en donde: a) el primer bacteriófago filamentoso despliega un anticuerpo para una citoquina pro-inflamatoria; y b) el segundo bacteriófago filamentoso no despliega (i) una señal de incorporación de célula de mamífero; (ii) un antígeno de a-sinucleina o un anticuerpo de a-sinucleina; (iii) un antígeno de ß-amiloide o un anticuerpo de ß-amiloide; o (iv) un anticuerpo para una citoquina pro-inflamatoria.

7 - Los bacteriófagos filamentosos de conformidad con la reivindicación 6, caracterizados además porque el primer bacteriófago no muestra una señal de incorporación de célula de mamífero.

8 - Los bacteriófagos filamentosos de conformidad con la reivindicación 6 o 7, caracterizados además porque el segundo bacteriófago es un fago WT.

9 - Los bacteriófagos filamentosos de conformidad con la reivindicación 8, caracterizados además porque el segundo bacteriófago es ün fago irradiado con UV.

10.- El bacteriófago filamentoso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 , 3, 4 y 5, caracterizado además porque el bacteriófago filamentoso que muestra un anticuerpo que se une a una citoquina pro-inflamatoria además muestra una porción de unión de anticuerpo de la proteina A o proteina G, y en donde el anticuerpo que se une a una citoquina pro-inflamatoria se une a la porción de unión de anticuerpo de la proteína A o proteína G.

11 - El bacteriófago filamentoso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 3-10, caracterizado además porque el anticuerpo que se une a una citoquina pro-inflamatoria es un anticuerpo que se une a IL-6.

12. - El bacteriófago filamentoso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-11 , caracterizado además porque cada bacteriófago está adaptado para ser administrable intranasalmente.

13. - El bacteriófago filamentoso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 y 3-12, caracterizado además porque cada bacteriófago filamentoso se selecciona independientemente de bacteriófago M13, f 1 y fd, y sus mezclas.

14. - El bacteriófago filamentoso de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado además porque cada bacteriófago filamentoso es M13.

15. - Una composición farmacéutica que comprende: (a) un primer bacteriófago filamentoso que despliega un anticuerpo especifico para una citoquina pro-inflamatoria; (b) un segundo bacteriófago filamentoso, en el que el segundo bacteriófago no despliega (i) una señal de incorporación de células de mamífero; (ii) un antígeno de a-sinucleina o un anticuerpo de a-sinucleina; (iii) un antígeno de ß-amiloide o un anticuerpo de ß-amiloide; o (iv) un anticuerpo especifico para una citoquina pro-inflamatoria; y (c) un portador farmacéuticamente aceptable.

16. - La composición de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada además porque la composición está formulada para ser administrable intranasalmente.

17 - La composición de conformidad con la reivindicación 15 o 16, caracterizada además porque el primer bacteriófago no muestra una señal de incorporación de células de mamífero.

18 - La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 15 a 17, caracterizada además porque el segundo bacteriófago es un fago WT.

19 - La composición de conformidad con la reivindicación 18, caracterizada además porque el segundo bacteriófago es un bacteriófago irradiado con UV.

20. - La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 15 a 19, caracterizada además porque el primer bacteriófago filamentoso muestra además una porción de unión de anticuerpo de la proteína A o proteína G, y en donde el anticuerpo que se une a una citoquina pro-inflamatoria se une a la porción de unión de anticuerpo de la proteína A o proteína G.

21. - La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 15 a 20, caracterizada además porque el anticuerpo que se une a una citoquina pro-inflamatoria es un anticuerpo que se une a IL-6.

22.- La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 15 a 21 , caracterizada además porque cada uno del primer y segundo bacteriófago filamentoso se selecciona independientemente de bacteriófago M 3, f1 y fd, y sus mezclas.

23 - La composición de conformidad con la reivindicación 22, caracterizada además porque el primero y segundo bacteriófago filamentoso es M13.

24.- El uso de un bacteriófago filamentoso, en donde el bacteriófago no despliega (i) una señal de incorporación de células de mamífero; (ii) un antígeno de a-sinucleina o un anticuerpo de a-sinucleina; o (iii) un antígeno de ß-amiloide o un anticuerpo de ß-amiloide, en la preparación de un medicamento para tratar un paciente que padece o que es susceptible a la enfermedad de Parkinson.

25.- El uso de un bacteriófago filamentoso que despliega un anticuerpo a una citoquina pro-inflamatoria, en la preparación de un medicamento para tratar un paciente que padece o que es susceptible a la enfermedad de Parkinson.

26. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 25, en donde el bacteriófago no muestra una señal de incorporación de células de mamífero.

27. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 24 o 25, en donde el bacteriófago es un fago WT.

28. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 27, en donde el bacteriófago es un fago irradiado con UV.

29. - El uso de: (a) un primer bacteriófago filamentoso que despliega un anticuerpo para una citoquina pro-inflamatoria; y (b) un segundo bacteriófago filamentoso, en el que el segundo bacteriófago no despliega (i) una señal de incorporación de células de mamífero; (ii) un antígeno de a-sinucleina o un anticuerpo de a-sinucleina; (iii) un antigeno de ß-amiloide o un anticuerpo de ß-amiloide; o (iv) un anticuerpo para una citoquina pro-inflamatoria, en la preparación de un medicamento para tratar un paciente que padece o que es susceptible a la enfermedad de Parkinson.

30. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 29, en donde el primer bacteriófago no muestra una señal de incorporación de célula de mamífero.

31. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 29 o 30, en donde el segundo bacteriófago es un gafo WT.

32. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 31 , en donde el segundo bacteriófago es un fago irradiado con UV.

33. - El uso como el que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 25 a 32, en donde el bacteriófago filamentoso que muestra un anticuerpo que se une a una citoquina pro-inflamatoria muestra además una porción de unión de anticuerpo de la proteína A o proteína G, y en donde el anticuerpo que se une a una citoquina pro-inflamatoria se une a la porción de unión de anticuerpo de la proteína A o proteína G.

34. - El uso como el que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 25 a 33, en donde el anticuerpo que se une a una citoquina pro-inflamatoria es un anticuerpo que se une a IL-6.

35. - El uso como el que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 24 a 34, en donde cada bacteriófago está adaptado para ser administrable intranasalmente.

36 - El uso como el que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 24 a 35, en donde cada bacteriófago filamentoso se selecciona independientemente del bacteriófago M13, f1 , y fd, y sus mezclas.

37 - El uso como el que se reclama en la reivindicación 36, en donde cada bacteriófago filamentoso es M13.