KR20110091778A

KR20110091778A - 사상 박테리오파지를 이용하는 파킨슨병의 치료방법

Info

Publication number: KR20110091778A
Application number: KR1020117014511A
Authority: KR
Inventors: 베카 솔로몬; 하임 엠. 디맨트
Original assignee: 라모트 앳 텔-아비브 유니버시티 리미티드
Priority date: 2008-11-24
Filing date: 2009-11-24
Publication date: 2011-08-12
Also published as: IL213120A0; EP2478911A1; HK1162964A1; NZ592928A; SG171791A1; CA2744339A1; CO6390112A2; CN102223887A; US20110286970A1; EP2358377A2; BRPI0921557A2; JP2012509672A; ZA201104701B; AU2009316326A1; CN102223887B; MX2011005430A; WO2010060073A2; WO2010060073A3; RU2011125971A

Abstract

본 발명은 사이토카인에 특이적으로 결합하는 항체를 디스플레이하는 사상 박테리오파지의, 단독적으로 또는 포유동물 세포 내재화 신호를 디스플레이하지 않는 사상 박테리오파지와 함께, 파킨슨병을 치료하기 위한 용도에 관한 것이다.

Description

사상 박테리오파지를 이용하는 파킨슨병의 치료방법{METHOD FOR TREATING PARKINSON'S DISEASE USING FILAMENTOUS BACTERIOPHAGE}

본 발명은 파킨슨병의 치료제 및 치료방법에 관한 것이다.

파킨슨병(PD)은 안정시 진전, 운동 완서, 경직과 같은 운동 이상을 주요 임상증상으로 하는 진행성 퇴행성 신경질환이다(Fahn and Sulzer, 2004). PD는 흑질 치밀부 내 도파민성 뉴런의 상실과, 동일한 부위의 생존 신경세포 내에 존재하는, 루이체와 루이 신경돌기라고 불리는 내포체를 특징으로 한다(Forno, 1996). 일반적으로 중뇌의 도파민성 뉴런의 상실이 주요 운동증상의 원인으로 알려져 있지만, PD 환자에게서 병리학적 변화가 나타나는 것은 이 부위에 국한되지 않는다. 루이체 이상과 세포상실은 하부 뇌간핵에서 처음으로 나타나 중뇌 쪽으로 상승하여 피질 영역까지 진행되는, 예측 가능한 양상을 보인다(Braak et al., 2004). PD 환자에게서 흔히 나타나는 2차 증상, 예컨대 우울증, 치매, 기타 다양한 자율신경 기능장애 및 감각장애는 중뇌 외 여러 부위에서의 루이체 이상의 진전과 관련이 있는 것으로 생각된다.

PD의 원인은 아직 밝혀지지 않았지만, α-시뉴클린의 구조변성과 비정상적인 응집이 이 질환의 주요 요인임을 암시하는 증거들이 많이 있다. 유전적 연관성 분석을 통해 유전에 의한 파킨슨병에서 3 가지 미스센스 돌연변이가 확인되었으며(Kruger et al. 1998; Polymeropoulos et al. 1997; Zarranz et al. 2004), 이들 세 돌연변이는 모두 올리고머화 또는 섬유화를 촉진하는 것으로 밝혀졌다(Conway et al. 2000; Greenbaum et al. 2005). 야생형 α-시뉴클린의 축적은 PD 발생의 충분조건이다.

α-시뉴클린의 섬유성 응집체는 루이체와 루이 신경돌기의 주요 구성성분으로 생각되며, 이들은 현재 부검에 있어 가장 확실한 PD의 마커로 취급된다(Spillantini et al. 1998). α-시뉴클린은 세포질 단백질이므로 이 단백질에 의한 병리학적 변화와 영향은 세포질 내에서 발생하며 단일 세포 내에 국한되는 것으로 추정되어 왔다. 그러나, 세포외 α-시뉴클린에 관한 최근 연구에 의하면, 병리학적 작용의 범위는 그 기원이 된 세포질의 외부로 확장되는 듯하다(Lee, 2008).

최근, α-시뉴클린과 그 응집체가 세포외액 내에 존재한다는 사실이 생체 내 및 생체 외 실험을 통해 확인되었다. 세포외 α-시뉴클린은 막 내부의 α-시뉴클린이 엑소시토시스에 의해 외부로 이동한 것으로 생각되나, 정확한 메커니즘은 밝혀지지 않았다. 막 내부의 α-시뉴클린은 쉽게 응집하여 세포외 응집체를 형성할 수 있다.

분비된 α-시뉴클린의 세포외 공간에서의 역할은 세포배양 시스템을 이용한 연구의 결과로부터 추론해 볼 수 있다. α-시뉴클린을 배지에 가한 실험에서, 세포외 α-시뉴클린과 그 내부의 소수성 부분(비아밀로이드 성분(NAC))의 세포독성 효과가 확인되었다(Albani et al. 2004; Bodles et al. 2000; Du et al. 2003; El-Agnaf et al. 1998; Forloni et al. 2000; Lee et al. 2004; Seo et al. 2002; Sung et al. 2001). 또한, 섬유성 응집체의 독성 효과도 확인되었으며(Bodles et al. 2000; El-Agnaf et al. 1998), 원섬유성 또는 올리고머성 응집체의 독성도 확인되었다(Du et al. 2003).

알파 시뉴클린은 막 내로 쉽게 함입되므로 시냅스 소낭 내부와 세포막 상에서 발견될 수 있다. α-시뉴클린의 독성의 메커니즘 연구를 위한, 잘 정립된 모델은 많지 않다. 최근 보고된 연구에서 α-시뉴클린의 세공 유사 원섬유가 파킨슨병의 발병과 관련한 역할에 대한 한 가지 가능성이 제기되었다(Tsigelny et al., 2007; Lee et al., 2002; Volles and Lansbury, 2002). 제시된 모델에 의하면, 올리고머성 α-시뉴클린이 중심부의 세공과 함께 고리 모양의 구조를 형성한다(Volles and Lansbury 2003). 형성된 응집체는 막과 결합할 수 있는데(Volles et al. 2001), 인지질 리포좀(Volles et al. 2001) 및 평면형 이중층막(Kayed et al. 2004)과 같은 합성막 모델에서 이들의 막 투과 활성화 작용이 확인되었다. 이들 응집체가 세포막 내로 삽입되면, 세포질과 세포외 공간 사이에서 이온과 작은 대사산물이 자유롭게 교환되어 세포 생존에 큰 악영향을 주게 된다. 적어도 일부 올리고머성 응집체의 세포독성은 이러한 독성 세공 모델로 설명이 가능하지만, 이들 세공 및 그 활성은 아직 생체 내에서 확인되지 않았다. 세포외 α-시뉴클린, 특히 그 응집체의 신경독성에 대한 또 다른 유력한 메커니즘은 신경염증반응과 관련이 있다(Zhang et al., 2005; Klegeris et al., 2006).

본 명세서에서 인용된 문헌이 반드시 선행기술을 구성하는 것은 아니며, 또한 본 출원의 특허요건에 있어 요부가 되는 것도 아니다. 인용된 문헌의 내용 또는 날짜에 관한 기재사항은 출원인이 출원일 당시에 가진 지식에 근거한 것으로서 정확하지 않을 수도 있다.

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지금까지 PD의 치료를 위한 방법들이 많이 개발되었으나, 다른 치료법들이 절실하게 요구되는 상황이다.

본 발명은 파킨슨병(PD) 또는 파킨슨병에 대한 감수성의 치료를 위한 사상 박테리오파지와, 파킨슨병 또는 파킨슨병에 대한 감수성을 가지는 환자를 치료하기 위한 방법을 제공한다. 상기 방법은 환자에게 포유동물 세포 내재화 신호를 디스플레이하지 않는 사상 박테리오파지를 투여하는 것을 포함한다.

본 발명은 또한 전염증성 사이토카인에 특이적인 항체를 디스플레이하는 사상 박테리오파지와, (i) 포유동물 세포 내재화 신호; (ii) α-시뉴클린 항원 또는 α-시뉴클린 항체; (iii) β-아밀로이드 항원 또는 β-아밀로이드 항체; 또는 (iv) 전염증성 사이토카인에 특이적인 항체를 디스플레이하지 않는 제2 사상 박테리오파지를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.

도 1A와 1B는 막 α-시뉴클린(AS) 응집체의 컴퓨터 모델로서, 세공 유사 구조의 세포막 내에 파묻힌 α-시뉴클린 응집체의 정면에서 바라본 사시도(도 1A)와, 막 내에 삽입된 단백질의 깊이를 보여주는 단면도(도 1B)이다(Tsigelny et al., FEBS Journal 274 1862-1677 (2007).)
도 2A와 2B는 티오플라빈 T(Tht)에 의해 측정한 AS 단편 응집체에 대한 파지의 생체 외 분해활성(도 2A)과, TEM 이미지(도 2B)이다.
도 3은 파지가 SH-SY5Y 세포의 생존에 미치는 영향을 도시한 그래프이다.
도 4A와 4B는 파지(보조파지)에 의한 AS 응집체의 감소를 보여주는 사진(도 4A)과, α-시뉴클린 다클론 항체를 이용한 α-시뉴클린 필터 지연분석에서 측정한 ELISA 분석결과(도 4B)이다.
도 5A는 SH-SY5Y 세포의 막 분획에 대한 웨스턴블롯 분석결과로서 다양한 α-시뉴클린(AS) 올리고머가 존재함을 보여주며, 도 5B는 M13 처리 후 올리고머에 대한 ELISA 분석결과이다. 도 5A에서, AS는 AS에 대한 다클론 항체(Sigma)를 사용하여 검출하였다. 도 5B에서, 막 분획에서 얻은 AS 올리고머의 양은 AS에 대한 단일클론 항체(Sigma, clone Syn 211)를 사용하여 검출되는 AS 올리고머들에 대해 특이적인 ELISA를 이용하여 정량하였다. 야생형 사상 파지로 처리한 SH-SY5Y 세포의 막 분획에 포함된 AS 올리고머의 양이 크게 감소한 것으로 나타났다. *는 처리하지 않은 세포에 비해 유의한 차이(p < 0.05)가 있음을 나타낸다.
도 6은 M13 파지와의 상호작용에 의한 AS의 반응성의 감소를 비히클로 처리한 경우와 비교한 그래프이다. 뇌의 한 쪽 반구에 M13을, 다른 반구에 PBS 비히클을 주사한 후, 관찰되는 AS 응집체의 평균 개수의 비를 데이터로 표시하였다(+M13). 대조군(-M13)의 경우, 두 반구 모두에 PBS 비히클을 주사하였다.

정의

본 명세서와 첨부된 청구범위에 사용된 용어의 정의는 다음과 같다.

용어 "환자", "대상" 및 "수령자"는 같은 의미로 사용된다. 이들 용어는 치료의 대상이 되는 사람과 기타 포유동물을 포함한다.

파킨슨병과 관련하여 용어 "치료"는 파킨슨병의 진행을 실질적으로 억제하거나, 늦추거나 되돌리는 것, 예컨대 α-시뉴클린의 응집체 형성을 감소 또는 억제시키거나 이미 형성된 α-시뉴클린 응집체를 분해하는 것; 파킨슨병의 임상적 증상을 하나 이상 실질적으로 완화하는 것, 예컨대 파킨슨병과 관련된 염증을 감소시키는 것; 또는 파킨슨병의 임상적 증상의 출현을 실질적으로 예방하는 것을 의미한다.

용어 "병용투여"는 단회투여 제형 또는 반복투여 제형을 이용하여 동시에, 연속적으로 또는 개별적으로 투여하는 것을 의미한다. 구체적으로, 병용투여는 각 투여의 효과가 치료 대상인 세포에 시간적으로 중복되게, 보다 구체적으로는 동시에 미치도록 한다.

본 명세서에서, 용어 "항체"는 다클론 항체, 단일클론 항체, 폴리에피토프 특이성을 갖는 항체 조성물, 이중특이성 항체, 이중항체, 또는 기타 정제된 항체 및 재조합 항체를 포함한다. 이들 항체는 항체 전체, 예컨대 임의의 항체 이소타입(IgG, IgA, IgE, IgM 등), 또는 대상 항원과 결합하는 항체 단편일 수 있다. 본 발명에서 사용되는 항체의 일 구체예로서, 항체는 IgG 이소타입을 가지는 항체일 수 있다. 항체는 통상의 또는 다른 방법에 의해 단편화될 수 있으며, 항체 단편들은 대상 항원에 결합하는 것을 선별할 수 있다. 일반적으로, 항체 단편은 항원 결합부위 및/또는 항체의 가변부위를 포함한다.

용어 "항체 단편"은 단백질 가수분해 또는 항체 분자의 재조합에 의해 얻어진 단편으로서 선택된 단백질에 선택적으로 결합할 수 있는 것을 포함한다. 그러한 단백질 가수분해 및/또는 재조합 단편의 비제한적인 예로서, Fab, F(ab')2, Fab', Fv, 펩티드 링커에 의해 연결된 V_L 및/또는 V_H 도메인을 포함하는 단일사슬 항체(scFv), 도메인 항체(dAb), Nanobody®(자연발생적인 중쇄 항체의 독특한 구조적, 기능적 특성을 가지는, 항체로부터 유래된 생물학적 치료제제) 및 UniBody(경첩부위가 없는 항체)가 포함된다. scFv는 공유적으로 또는 비공유적으로 연결되어 둘 이상의 결합부위를 갖는 항체를 형성할 수 있다.

일부 구현예에서, 상기 항체 또는 항체 단편은 인간화된 단일클론 항체 또는 완전 인간화된 단일클론 항체이다. 여기에서, 용어 "인간화된 단일클론 항체"는 인간 외의 동물(수령자)로부터 유래한 단일클론 항체로서, 그에 상응하는 인간(공여자)의 단일클론 항체에서 발견되는 아미노산 잔기를 적어도 하나 이상 포함하도록 변형된 것을 의미한다. "완전 인간화된 단일클론 항체"는 인간 외의 동물로부터 유래한 단일클론 항체로서, 그에 상응하는 인간 단일클론 항체의 항원 결합부위에서 발견되는 아미노산 잔기를 모두 포함하도록 변형된 것을 의미한다. 또한 인간화된 항체는 수령자 항체 또는 공여자 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이러한 변형을 통해 항체의 기능을 개선하거나 최적화할 수 있다. 또한, 인간화 항체는 인간 면역글로불린 불변부위(Fc)의 적어도 일부분을 더 포함할 수 있다.

용어 "전염증성 사이토카인"은 파킨슨병과 관련된 뇌 염증에 관여하는 임의의 전염증성 사이토카인을 의미하며, 구체적으로 IL-6, IL-1, IL-17 및 TNFα, 가장 구체적으로 IL-6를 포함한다.

용어 "포유동물 세포 내재화 신호"는 세포와 부착/접착하여 내재화를 촉진하는 임의의 세포부착 서열을 의미한다. 다수의 포유동물 세포부착 서열이 알려져 있으며, 여기에는 Arg-Gly-Asp(RGD) 세포부착 서열, HIV의 Tat 펩티드, 그리고 Arg-Glu-Asp(RED), Arg-Lys-Lys(RKK), Leu-Asp-Val(LDV; Humphries, 1992), Leu-Leu-Gly(LLG; Koivunen et al., 2001), Asp-Gly-Glu-Ala(DGEA; 서열번호 2), Ile-Arg-Val-Val-Met(IRVVM; 서열번호 3; Kosfeld et al., 1993), Pro-His-Ser-Arg-Asp(PHSRN; 서열번호 4) 및 RFYVVMWK(서열번호 5; Kosfeld et al., 1993) 서열을 포함하는 펩티드가 포함된다. 세포부착 분자에 포함되는 다수의 세포부착 서열(세포부착 모티프라고도 함)이 알려져 있는데, 라미닌, 피브로넥틴, 비트로넥틴, 피브리노겐, 트롬보스폰딘 등이 그 예이다.

용어 "α-시뉴클린 항원"은 인간 α-시뉴클린으로부터 유래한 항원을 의미하며, 이때 인간 α-시뉴클린은 구체적으로 서열번호 6(NCBI gene ID: 6622, 기탁번호 NP000336; UniProtKB/Swiss-Prot 기탁번호 P37840)의 아미노산 서열을 가진다. "α-시뉴클린 항체"는 서열번호 6의 α-시뉴클린 또는 변형체 또는 그의 돌연변이체를 인식하여 결합하는 항체를 의미한다.

용어 "β-아밀로이드 항원"은 인간 아밀로이드 전구체 단백질로부터 유래된, "β-아밀로이드 펩티드"("βAP", "βA", "Aβ" 또는 "AβP"라고도 함)를 형성하는 플라크로부터 유래된 항원을 의미한다. "β-아밀로이드 항체"는 자연발생적인 인간 Aβ1-42 펩티드의 β-아밀로이드 펩티드 및 변형체 및 그의 돌연변이체를 인식하여 결합하는 항체를 의미한다.

본 명세서에서, "약학적 조성물"은 본 발명에 따른 하나 이상의 유효성분과 함께 생리학적으로 적합한 담체 및 부형제와 같은 기타 화학성분을 포함하는 제제를 의미한다. 약학적 조성물의 목적은 환자에 대한 화합물의 투여를 용이하게 하기 위함이다.

어구 "생리학적으로 허용되는 담체"와 "약학적으로 허용되는 담체"는 같은 의미로 사용될 수 있으며, 생체에 나쁜 영향을 주지 않으면서 투여된 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 의미한다.

용어 "부형제"는 유효성분의 투여를 촉진하기 위하여 약학적 조성물에 첨가되는 비활성 물질을 의미한다. 부형제의 비제한적인 예로서, 탄산칼슘, 인산칼슘, 여러 당류 및 전분류, 셀룰로스 유도체, 젤라틴, 식물유 및 폴리에틸렌 글리콜이 포함된다.

본 명세서에서, 용어 "야생형 섬유형 박테리오파지"는 일반적으로 자연상태에서 함께 존재하는 다른 성분으로부터 분리한, 자연발생적인 섬유형 박테리오파지를 의미한다. 이 용어는 또한 "야생형"의 특징을 갖는, 상용화된 섬유형 파지를 포함한다.

본 명세서에서, 용어 "불활성화된 야생형 섬유형 박테리오파지"는 재조합 DNA 기술에 의해 유전적으로 변형되지는 않았으나, UV 조사 등에 의해 복제가 불가능하게 된 야생형 섬유형 박테리오파지를 의미한다. 박테리오파지의 섬유형 구조에 대한 변경 없이(후각경로를 통해 뇌에 침입할 수 있는 능력을 유지한 채), 파지가 복제를 할 수 없도록 하는 임의의 방법이 본 발명에 적용될 수 있다.

용어 "WT 파지"는 야생형 섬유형 박테리오파지와 불활성화된 야생형 섬유형 박테리오파지 모두를 의미한다.

치료용 섬유형 박테리오파지와 치료방법

일 구현예에 있어서, 본 발명은 파킨슨병 또는 파킨슨병에 대한 감수성의 치료를 위한 섬유형 박테리오파지와, 섬유형 박테리오파지를 파킨슨병 또는 파킨슨병에 대한 감수성을 가지는 환자에게 투여하여 치료하는 방법을 제공한다. 이때, 상기 박테리오파지는 (i) 포유동물 세포 내재화 신호, (ii) α-시뉴클린 항원 또는 α-시뉴클린 항체, 또는 (iii) β-아밀로이드 항원 또는 β-아밀로이드 항체를 디스플레이하지 않는다.

본 발명의 한 태양에 있어서, 상기 박테리오파지는 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학적으로 허용되는 조성물의 한 성분으로서 환자에게 투여된다.

본 발명의 다른 태양에 있어서, 상기 박테리오파지는 WT 파지이다.

이론적으로 이에 국한되는 것은 아니나, 본 발명에서 사용되는 파지는 세포외 α-시뉴클린 또는 막 내부의 α-시뉴클린 응집체와 결합하여 세포막 내에서의 α-시뉴클린의 응집을 감소시키는 것으로 생각된다. 본 발명의 발명자들은 막 내부에서의 이러한 α-시뉴클린 응집체의 감소가 α-시뉴클린의 평형을 세포 사이에서 세포 외로 이동시킴으로써 α-시뉴클린의 세포간 응집을 감소시킬 수 있는 가능성을 제시한다. 그러나, 특정한 메커니즘에 구애됨이 없이, 본 발명에 따른 섬유형 박테리오파지와 방법은 파킨슨병 또는 파킨슨병에 대한 감수성을 가지는 환자의 치료에 유용하다.

일 구현예에 있어서, 상기 섬유형 박테리오파지는 비강내 투여에 적합하다. 비강내 투여는 이들 박테리오파지가 혈액뇌장벽을 통과할 수 있게 해 준다. 이후, 이들 파지는 말초기관에 대하여 부작용을 일으키지 않고 소변 및 대변을 통해 뇌와 신체에서 제거된다.

전염증성 사이토카인은 파킨슨병의 신경염증 증상을 일으킨다. 따라서, 전염증성 사이토카인을 제거함으로써 이러한 증상을 완화할 수 있다. 따라서, 일 구현예에 있어서, 본 발명은 파킨슨병 또는 파킨슨병에 대한 감수성의 치료에 사용되는, 전염증성 사이토카인에 특이적인 항체를 디스플레이하는 사상 박테리오파지와, 환자에게 전염증성 사이토카인에 특이적인 항체를 디스플레이하는 사상 박테리오파지를 투여하여 파킨슨병 또는 파킨슨병에 대한 감수성을 가지는 환자를 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명의 한 태양에 있어서, 상기 박테리오파지는 비강 내로 투여된다. 다른 태양에 있어서, 상기 박테리오파지는 약학적으로 허용되는 담체를 추가적으로 포함하는 약학적으로 허용되는 조성물의 한 성분으로서 투여된다. 다른 태양에 있어서, 상기 전염증성 사이토카인에 특이적인 항체는 IgG로서 Fc 부위를 포함한다. 또다른 태양에 있어서, 상기 항체는 IL-6에 특이적인 항체이다. 또다른 태양에 있어서, 상기 전염증성 사이토카인을 포함하는 박테리오파지는 포유동물 세포 내재화 신호를 포함하지 않는다.

상기 항체를 포함하는 파지는 비강 내로 투여된 후 뇌로 전달되어 상기 파지에서 디스플레이되는 항체에 의해 전염증성 사이토카인으로 이동하게 되며, 그 사이토카인을 불활성화시킨다. 이들 파지에 디스플레이되는 항체의 파지 부위는 상기 항체가 혈액뇌장벽을 통과할 수 있게 하고 α-시뉴클린의 응집을 직접 억제하는 두 가지 역할을 수행한다.

따라서, 이와 관련된 태양에 있어서, 본 발명은 치료를 위한 제1 및 제2 사상 박테리오파지와, (a) 전염증성 사이토카인에 특이적인 항체를 디스플레이하는 제1 사상 박테리오파지; 및 (b) 전염증성 사이토카인에 특이적인 항체를 디스플레이하지 않는 제2 사상 박테리오파지를 파킨슨병 또는 파킨슨병에 대한 감수성을 가지는 환자에게 병용투여하여 치료하는 방법을 제공한다. 한 태양에 있어서, 제2 사상 파지는 포유동물세포 내재화 신호를 디스플레이하지 않는다. 다른 태양에 있어서, 상기 제2 사상 파지는 추가적으로 (i) α-시뉴클린 항원 또는 α-시뉴클린 항체; 또는 (ii) β-아밀로이드 항원 또는 β-아밀로이드 항체를 디스플레이하지 않는다. 또다른 태양에 있어서, 상기 제2 사상 파지는 추가적으로 (i) 포유동물 세포 내재화 신호; (ii) α-시뉴클린 항원 또는 α-시뉴클린 항체; 또는 (iii) β-아밀로이드 항원 또는 β-아밀로이드 항체를 디스플레이하지 않는다.

다른 태양에 있어서, 각 사상 박테리오파지는 약학적으로 허용되는 담체를 추가적으로 포함하는 약학적으로 허용되는 조성물의 한 성분으로서 투여된다. 다른 태양에 있어서, 상기 조성물의 제2 사상 박테리오파지는 WT 파지이다. 또다른 태양에 있어서, 상기 제2 사상 박테리오파지는 UV가 조사된 박테리오파지이다.

또다른 태양에 있어서, 상기 제1 및 제2 박테리오파지는 각각 환자에게 비강 내로 투여된다. 다른 태양에 있어서, 상기 전염증성 사이토카인에 특이적인 항체는 IgG로서 Fc 부위를 포함한다. 또다른 태양에 있어서, 상기 항체는 IL-6에 특이적인 항체이다. 또다른 태양에 있어서, 상기 제1 박테리오파지는 포유동물 세포 내재화 신호를 포함하지 않는다.

파지는 임의의 공지된 기술을 사용하여 전염증성 사이토카인에 대한 항체를 디스플레이하도록 할 수 있다. 예를 들면, 잘 알려진 기술을 이용하여 단일사슬 항체를 제조할 수 있으며, 박테리오파지의 표면 상에 이러한 단일사슬 항체(scFv)가 디스플레이되도록 파지 벡터를 변형할 수 있다.

주어진 항체, 구체적으로 단일클론 항체가 파지 상에 디스플레이되도록 하기 위한 다른 방법은 면역글로불린의 Fc 부위에 결합하는 폴리펩티드를 디스플레이하는 파지를 생산하는 것이다. 이러한 파지는 공지되어 있으며 PCT 공개번호 WO2007/095616에 기재되어 있다. 이렇게 변형된 파지를 사용함으로써, 단지 항체를 파지와 접촉시킴으로써 Fc 부위를 포함하는 임의의 항체가 그 표면 상에 디스플레이되도록 할 수 있다. 항체의 Fc 부위는 상기 파지에 의해 디스플레이된, Fc 바인딩 폴리펩티드와 결합하게 된다. 따라서, 항체 또는 그 단편의 결합이 용이해진다.

일 구현예에 있어서, 면역글로불린의 Fc 부위에 결합하는 폴리펩티드는 단백질 A, 단백질 G, 단백질 A 또는 단백질 G의 항체 결합부위(예컨대, 결합부위 B)를 포함하는 그 단편, 또는 단백질 A 또는 단백질 G의 변형체이다. 다른 구현예에 있어서, 상기 단백질 A의 변형체는 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 변형체이다. Fc 부위가 없는 항체를 사용하는 경우, 상기 항체는 파지에 의해 직접 디스플레이되어야 한다.

사상 박테리오파지는 원형의 단일가닥 DNA 게놈을 포함하는, 구조적으로 유사한 바이러스 그룹이다. 이들은 증식성 감염 과정에서 숙주를 죽게 하지 않는다. F 플라스미드를 포함하는, 대장균을 감염시키는 파지들을 통칭하여 Ff 박테리오파지라고 한다. 이들은 포유동물 세포는 감염시키지 않는다. 일 구현예에 있어서, 상기 방법에 사용되는 사상 박테리오파지는 각각 독립적으로 사상 파지 M13, f1 및 fd로부터 선택된다. 일 구현예에 있어서, 제1 및 제2 사상 파지를 사용하는 경우, 각 파지는 동일한 서브타입이며 사상 파지 M13, f1 및 fd로부터 선택된다.

전염증성 사이토카인에 특이적인 항체 또는 면역글로불린의 Fc 부위에 결합하는 폴리펩티드를 포함하는 파지를 그 표면 상에 단백질이 디스플레이되도록 조작한다. 이러한 과정은 일반적으로 디스플레이하고자 하는 폴리펩티드의 cDNA 클론을, 파지의 외피 단백질과의 융합단백질로서 디스플레이시키는 과정을 포함한다. 외래 단백질 또는 펩티드를 파지의 외피 단백질과의 융합단백질로서 디스플레이하는 사상 박테리오파지는 당 기술분야에서 잘 알려져 있다. 다양한 파지 및 외피 단백질을 사용할 수 있으며, 그 비제한적인 예는 다음과 같다: M13 단백질 III, M13 단백질 VIII, M13 단백질 VI, M13 단백질 IX 및 fd 소수 외피 단백질 pIII(Saggio et al., 1995; Uppala and Koivunen, 2000). 다수의 벡터를 사용하여 이러한 융합단백질을 생산할 수 있다(Kay et al., 1996; Berdichevsky et al., 1999; 및 Benhar, 2001 참고). 외래 암호화 서열을 파지 유전자에 삽입하기 위한 방법은 잘 알려져 있다(예컨대, Sambrook et al., 1989; 및 Brent et al., 2003 참고).

일 구현예에 있어서, 면역글로불린의 Fc 부위에 결합하는 폴리펩티드는 사상 파지의 소수 외피 단백질(단백질 III)과의 융합에 의해 디스플레이된다.

본 명세서에서 기술된 방법은 또한 환자가 위에 언급한 특정한 치료를 요하는 것으로 확인되는 경우를 포함한다. 그러한 치료를 요하는 환자의 확인은 환자 또는 의료 전문가의 판단에 의한 것으로서 주관적(예컨대, 견해) 또는 객관적(예컨대, 시험 또는 진단방법에 의한 측정)일 수 있다.

약학적 조성물

한 태양에 있어서, 본 발명은 (a) 전염증성 사이토카인에 특이적인 항체를 디스플레이하는 제1 사상 박테리오파지; 및 (b) 전염증성 사이토카인에 특이적인 항체를 디스플레이하지 않는 제2 사상 박테리오파지를 포함하는 (예컨대, 발열성 물질이 없는) 약학적 조성물을 제공한다. 일 구현예에 있어서, 상기 제2 사상 파지는 또한 포유동물 세포 내재화 신호를 디스플레이하지 않는다. 다른 태양에 있어서, 상기 제2 사상 파지는 또한 (i) α-시뉴클린 항원 또는 α-시뉴클린 항체; 또는 (ii) β-아밀로이드 항원 또는 β-아밀로이드 항체를 디스플레이하지 않는다. 또다른 태양에 있어서, 상기 제2 사상 파지는 또한 (i) 포유동물 세포 내재화 신호; (ii) α-시뉴클린 항원 또는 α-시뉴클린 항체; 또는 (iii) β-아밀로이드 항원 또는 β-아밀로이드 항체를 디스플레이하지 않는다.

본 발명의 한 태양에 있어서, 상기 제2 박테리오파지는 WT 파지이다. 보다 구체적인 태양에 있어서, 상기 제2 박테리오파지는 UV가 조사된 박테리오파지이다.

다른 태양에 있어서, 상기 전염증성 사이토카인에 특이적인 항체는 IgG로서 Fc 부위를 포함한다. 또다른 태양에 있어서, 상기 조성물 내의 제1 박테리오파지는 IL-6에 특이적인 항체를 디스플레이한다. 또다른 태양에 있어서, 상기 제1 박테리오파지는 포유동물 세포 내재화 신호를 포함하지 않는다.

또다른 태양에 있어서, 상기 조성물은 비강내 투여용으로 제제화된다.

약물의 제제화 및 투여를 위한 기술은 "Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Co., Easton, PA)" 최신판을 참고할 수 있다. 이 문헌은 당 기술분야에서 잘 알려져 있으며 본 발명의 참고로서 인용된다.

따라서, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 유효성분을 약학적으로 사용될 수 있는 제제로 제조하는 공정을 용이하게 하는, 부형제 및 보조제를 포함하는 하나 이상의 약학적 및 생리학적으로 허용되는 담체를 사용하여 통상적인 방법에 따라 제제화할 수 있다.

비내 흡입에 의한 투여를 위하여, 본 발명에 따른 유효성분은 통상적으로 적절한 추진제, 예컨대 디클로로디플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄 또는 이산화탄소와 함께 압축 팩 또는 연무기 내에 에어로졸 스프레이 제형의 형태로 제공된다. 또한, 비강내 투여를 위하여 압축 팩 또는 연무기를 필요로 하지 않는 비강 분무제를 사용할 수도 있다. 가압 에어로졸의 경우, 계량을 위한 밸브를 제공하여 투여용량을 결정할 수 있다. 디스펜서 내에 사용하기 위한, 예컨대 젤라틴으로 된 캡슐 및 카트리지는 해당 화합물의 분말 혼합물과 함께 락토스 또는 전분과 같은 적절한 분말을 포함하도록 제조될 수 있다.

본 발명의 방법에 사용하기에 적합한 약학적 조성물은 유효성분(들)이 원하는 목적을 달성하기에 효과적인 양으로 포함된 조성물을 포함한다. 보다 구체적으로, 효과적인 양이란 파킨슨병을 치료하기에 효과적인 유효성분(들)의 양을 의미한다.

당업자는, 특히 본 명세서의 기재내용을 바탕으로 하여, 치료학적으로 효과적인 양을 쉽게 결정할 수 있을 것이다.

투여량과 투여간격은 사상 바이러스가 치료에 충분한 수준의 뇌내 농도(최소유효농도(MEC))를 제공할 수 있도록 개별적으로 조절할 수 있다. MEC는 각 제형에 따라 달라지나, 생체 외 데이터로부터 추정할 수 있다. MEC를 달성하기 위해 필요한 투여량은 개별적인 특성에 따라 달라진다.

투여간격 역시 MEC 값을 이용하여 결정할 수 있다. 제제는 뇌내 농도가 치료기간 동안 시간 기준으로 10~90% 이상, 바람직하게는 시간 기준으로 30~90%, 가장 바람직하게는 시간 기준으로 50~90% 동안 MEC보다 높게 유지되도록 하는 투여계획에 따라 투여되어야 한다.

치료 대상 환자의 파킨슨병의 정도와 반응성에 따라, 단회투여 또는 반복투여를 적용할 수 있으며, 치료기간은 수일 내지 수주 또는 파킨슨병의 상태가 완화될 때까지 지속될 수 있다.

조성물의 투여량은 물론 치료하고자 하는 대상과, 질병의 정도, 의료 제공자의 판단 등에 따라 달라지게 된다.

필요에 따라, 본 발명의 방법에 사용되는 조성물은 팩 또는 미국 식품의약품안전청(FDA)의 승인을 받은 키트와 같은 디스펜서 장치 내에 제공될 수 있으며, 여기에는 상기 유효성분을 포함하는 하나 이상의 단회투여 제형이 포함될 수 있다. 상기 팩은 예컨대 블리스터 팩과 같이 금속 또는 플라스틱 포일을 포함할 수 있다. 상기 팩 또는 디스펜서 장치는 투여 설명서와 함께 제공될 수 있다. 상기 팩 또는 디스펜서에는 또한 약품의 제조, 사용 또는 판매를 규제하는 정부기관에 의해 작성된, 해당 조성물의 인체 또는 동물에 대한 투여를 승인하는 통지내용이 동봉될 수 있다. 그러한 통지는 예컨대 처방약에 대한 미국 FDA의 승인 라벨 또는 제품허가 통지문일 수 있다. 본 발명의 제제를 포함하는, 약학적 담체 내에 제제화된 조성물은 또한 적절한 용기에 담겨 제공될 수 있으며, 취급방법 및 적용증상이 표시될 수 있다.

구체적인 한 태양에 있어서, 본 발명은 파킨슨병의 치료를 위한 키트로서, 분리된 용기 내에 (a) 전염증성 사이토카인에 특이적인 항체를 디스플레이하는 제1 사상 박테리오파지; (b) 제2 사상 박테리오파지로서, (i) 포유동물 세포 내재화 신호; (ii) α-시뉴클린 항원 또는 α-시뉴클린 항체; (iii) β-아밀로이드 항원 또는 β-아밀로이드 항체; 또는 (iv) 전염증성 사이토카인에 특이적인 항체를 디스플레이하지 않는 제2 박테리오파지; 및 (c) 파킨슨병의 치료 목적으로 상기 키트를 사용하는 방법에 대한 설명서를 포함하는 키트를 제공한다.

이상에서 본 발명을 개괄적으로 설명하였다. 이하에서 제공되는 실시예를 통해 본 발명을 더 쉽게 이해할 수 있을 것이다. 그러나, 하기 실시예는 설명의 목적으로만 제공되며 본 발명의 범위를 제한하지 않는다.

실시예

본 실시예의 실험결과는 파킨슨병(PD)의 병인과 관련된 α-시뉴클린 응집체의 분해에 있어 사상 파지가 미치는 영향을 입증해 준다.

사상 파지의 제조

50 ㎍/mL 카나마이신(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)을 포함하는 2YT 배지 내에서 M13K07 보조파지(New England Biolabs, Beverly, MA)로 감염된 TG1 대장균 배양물로부터 M13 사상 파지를 제조하였다. 박테리아 세포를 원심분리(8300kg, 15 분)한 뒤, 1/5(wt/vol)의 16.7% 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 가하여 상청액으로부터 파지를 침전시키고 다시 원심분리하였다(14,000kg, 1 시간, 4 ℃). 얻어진 펠릿을 멸균된 인산완충 식염수(PBS)(상청액 부피의 3%)에서 재현탁시켰다. 잔류 박테리아를 6,000kg에서 15 분 동안 원심분리하여 제거한 다음, 파지를 PEG-NaCl 침전시켰다. 마지막으로, 펠릿을 PBS(상청액 부피의 2%)에서 재현탁하고 파지 용액을 발열성 물질을 포함하지 않는 0.45 ㎛ 필터로 여과하여 잔류 박테리아를 모두 제거하였다. 사상 파지를 PBS와 같은 부피의 클로로포름 내에서 배양하여 구형 파지를 얻었다. 용액을 실온(RT)에서 3 분에 걸쳐 각각 10 초 동안 6 차례 볼텍싱한 다음, 18,5000kg에서 1 분 동안 원심분리하였다. 수용액과 클로로포름 용액을 커버를 덮지 않은 채 후드에 두어 잔류 클로로포름이 모두 증발하도록 한 다음, PBS에서 원래 부피로 재현탁하였다. 초음파 세포파쇄기(Microson Heat Systems, Farmingdale, NY, USA)를 사용하여, 1×10¹³ 개의 파지(500 μL)를 얼음 위, PBS에서 5 초 동안 15 회 초음파 처리하여 파쇄하였다.

생체 외 α- 시뉴클린 응집 조사

루이체의 핵심부위인 인간 α-시뉴클린(서열번호 7)의 아미노산 71~82와 전체 재조합 알파-시뉴클린 단백질에 해당하는 두 개의 12 아미노산 단편에 대하여 응집정도를 시험, 분석하였다.

사상 파지가 상기 펩티드 및 재조합 알파-시뉴클린을 억제, 분해하는 능력을 조사하였다. α-시뉴클린의 응집정도는 다음과 같이 티오플라빈 T(Tht)를 사용하여 단백질 여과분석을 통해 측정하였다.

알파- 시뉴클린 섬유 및 사상 파지의 전자현미경 분석

사상 파지의 응집억제 효과를 측정하기 위하여, α-시뉴클린의 아미노산 잔기 71~82에 해당하는 900 μL의 α-시뉴클린 단편 샘플을 6 주 동안 37℃에서 배양하였다. 이 단계에서, 사상 파지를 응집된 펩티드와 함께 1 주 동안 배양하였다. 파지의 농도를 10¹²/mL와 10¹¹/mL의 둘로 하여 측정하였다. 펩티드 샘플을 0.3 μM Tht 수용액으로 최종농도 225 μM로 희석하였다. 샘플의 형광방출을 480 nm에서 측정하였다. 10¹²/mL의 파지를 포함하는 샘플에서 43%의 형광방출 감소가 측정되었다(도 2A).

또한 샘플을 전자투과 현미경법(TEM)으로 관찰하였다. 샘플을 탄소 그리드에 장착하고 우라닐 아세테이트로 코팅하였다. α-시뉴클린 펩티드만을 포함하는 샘플에서 상당량의 복합섬유가 치밀한 상태로 관찰되었다(도 2B, 좌측 사진). 10¹¹ 개의 파지와 함께 배양한 샘플에서는 섬유의 양과 복잡성이 상당히 감소하였다. 10¹² 개의 파지와 함께 배양한 샘플에서는 섬유가 관찰되지 않았으며 비정형의 응집체만이 관찰되었다(도 2B, 중앙 및 우측 사진).

세포 모델로서 SH - SY5Y 세포의 배양

신경아세포종 세포주 SH-SY5Y는 도파민성 세포이므로 PD 모델로서 사용하기에 적합하다. SH-SY5Y 세포를 야생형 인간 α-시뉴클린 유전자와 돌변변이 α-시뉴클린 A53T 유전자로 안정적으로 감염시켰다.

알파-시뉴클린의 발현을 웨스턴블롯으로 측정하였다.

세포를 알파-시뉴클린 항체로 염색하여 루이체가 보이도록 하였다.

A53T α-시뉴클린을 과발현시키기 위하여 안정적으로 감염시킨 SH-SY5Y 세포를 10 cm 배양접시에서 배양한 후, 37℃, 5% CO₂ 조건의 가습 세포배양기 내에서 1% 비필수 아미노산(NEAA)과 FCS(10%), 글루타민(2　mM), 페니실린-스트렙토마이신 용액(1%)(Biological Industries)을 포함하는 DMEM:Ham's F12(1:1)배지 내에 유지하였다.

세포용해

α-시뉴클린을 분리하기 위하여, Lee et al. (2004)에 의해 기재된 세포추출 방법을 변형하여 세포용해를 실시하였다. 간단히 설명하면, 세포를 PBS로 헹구고, 배양접시 당 1.5 mL의 트립신으로 처리하였다. 세포를 15 mL 튜브에 모은 다음, 원심분리 후 다시 PBS로 세척하고 에펜도르프 튜브에 모았다. 세포를 100 μL의 완충액 T(20 mM Tris pH 7.4, 25 mM KCl, 5 mM MgCl₂, 0.25 M 수크로스, 1% Triton X-100 및 단백질분해효소 억제제 혼합물 함유)로 용해하고, 세포 덩어리가 남지 않을 때까지 피펫팅한 후, 실온에서 10 분간 유지하고 13,000Kg에서 10 분 동안 원심분리하였다. 상청액을 모아 다른 에펜도르프 튜브에 넣고 "sup"이라고 표시하였다(펠릿 분획에는 상청액이 남아 있지 않아야 함). 펠릿 위에 완충액 N(0.1 M Na₂CO₃ pH 11.5 및 단백질 억제제 혼합물 함유)을 믹싱하지 않고 부드럽게 가한 다음, 혼합하지 않고 하룻밤 동안 4℃에서 인큐베이션하여 단백질이 완충액 내에서 서서히 재현탁되도록 하였다. 인큐베이션 후, 작은 피펫 팁을 사용하여 흐려진 완충액을 제거하였다. 튜브에 남은 물질을 "pellet"이라고 표시하였다. 상청액과 펠릿 추출물을 -20℃에서 보관한 후 웨스턴블롯 분석을 통해 가용성 및 불용성 α-시뉴클린의 양을 정량하였다.

파지 독성

SH-SY5Y 세포를 파지와 함께 인큐베이션한 후, 분화된 SH-SY5Y 세포의 생존을 MTT 시약을 사용하여 측정하였다. 96웰 플레이트에 웰 당 1×10⁹ 및 1×10¹¹ 개의 파지를 가한 후 세포를 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후 사멸한 세포는 관찰되지 않았다(도 3).

필터 지연분석

단백질 응집체를 여과하기 위하여 상용화된 슬롯블롯 장치(Bio-Rad Laboratories, Munich, Germany)를 사용하였다. 샘플을 블로킹된 니트로셀룰로스 막(세공 크기 0~0.2 ㎛, Schleicher & Scheull, Dassel, Germany)을 통해 여과하였다. 여과 후, 각 슬롯을 0.1% SDS로 세척하였다. 알파-시뉴클린 응집체는 단일클론 항체 LB509(1:10,000)와 HRP가 결합된 염소 항-마우스 2차항체를 사용하여 검출하였으며, 화학발광에 의해 가시화하였다. SigmaGel v1.0을 사용하여 PAF 블롯의 밀도를 정량하였다.

10　cm 배양접시에 동일한 수의 세포를 가하고 합류도가 80%에 이를 때까지 배양하였다. 이때, 세포를 다른 양의 파지로 24 시간 및 72 시간 동안 처리하였다. 이어, 각 플레이트에서 세포를 모으고 용해한 다음, 아래에 설명한 바와 같이 분석하였다. 야생형 α-시뉴클린을 과발현하는 분화된 SH-SY5Y 세포를 37℃에서 총 1×10¹² 개의 파지와 함께 3 시간 동안 또는 밤새 배양하였다. 가용성 및 불용성 분획을 추출한 다음, 불용성 분획을 0.2 ㎛ 니트로셀룰로스 막을 통해 여과하였다. 필터에 잔류한 α-시뉴클린 응집체의 양은 처리하지 않은 세포에서 더 많았다(도 4A).

α- 시뉴클린 올리고머의 ELISA 분석

올리고머성 α-시뉴클린의 검출을 위한 ELISA 분석법(El-Agnaf et al., 2000)을 변형하여 SH-SY5Y 세포의 불용성 분획 내의 α-시뉴클린 올리고머의 양을 측정하였다. AS의 올리고머만을 검출하기 위하여, 코팅에 사용한 (비오틴과 결합된) 단일클론 항체와 동일한 단일클론 항체를 사용하였다.

파지 배양액으로 3 시간 및 밤새 처리한 세포의 불용성 분획 내의 AS 올리고머 양은 40%~50% 감소하였다(도 4B).

세포 모델에서 M13 파지와 α- 시뉴클린의 상호작용

알파-시뉴클린(AS)은 시냅스전 말단에 위치하는 접히지 않은 단백질이다. AS는 N-말단을 통해 막 내부로 쉽게 진입하므로 세포 내에서 두 가지 형태, 즉 막에 결합된 형태와 세포질 내에서의 무질서한 형태로 존재한다. 데이터에 의하면, 막에 결합된 형태의 AS가 세포독성 작용을 하는 것으로 보인다. 원섬유는 세포막에 파묻히는 고리형 구조를 형성함으로써 막 투과성을 제공할 수 있다. 최근, AS가 지질 존재 하에 더 높은 응집 경향을 보이며 막에 결합된 AS 응집체가 세포질 형태의 AS의 응집을 유도할 수 있음이 밝혀졌다.

본 발명에서는, 야생형 AS를 과발현하는 SH-SY5Y 세포 내에서 AS 올리고머를 야생형(M13) 사상 파지로 처리하여 모듈화하는 방법을 제시한다. 웨스턴블롯 분석에 의한 AS 검출용 막추출 키트(MBL)를 사용하여 세포의 막 분획을 추출하였다. AS 단량체뿐 아니라 이량체와 삼량체도 막 분획에서 검출되었는데(도 5A), 이것은 세포의 막 내부에 AS 올리고머가 존재한다는 증거이다. 도 5A와 도 5B는 사상 파지가 AS 막의 올리고머화에 미치는 영향을 보여준다. 레티노산을 사용하여 SH-SY5Y 세포를 발현시키고 1 mL 당 10¹¹ 개의 야생형 파지를 가한 후 밤새 인큐베이션하였다. 다음 날 막 분획을 추출하고, AS의 올리고머만을 인식하도록 고안된 ELISA 분석을 통해 각 추출 샘플의 AS 올리고머의 양을 측정하였다(도 5B). 사상 파지와 함께 인큐베이션한 SH-SY5Y 세포에서 막 분획의 AS 올리고머 양이 상당히 감소한 것으로 확인되었다. 이러한 결과는 야생형 파지가 세포막 상의 AS에 영향을 미친다는 것을 의미하는데, 이것은 AS의 73~85 아미노산에 해당하는 NAC 부위에 위치하는 상호작용 부위를 통한 AS와의 상호작용에 의한 것일 수 있다. 또한, 오랜 시간 동안 파지와 함께 인큐베이션한 결과로 소량의 파지가 세포막이 아닌 다른 막 성분에 영향을 미치는 세포 내로 내재화되었기 때문일 수도 있다. 파지가 내재화된 세포에 결합되면 리소좀 분해의 활성화를 통해 원형질막으로부터 알파-시뉴클린의 제거를 촉진할 수 있다.

파킨슨병의 형질전환 마우스 모델을 이용한 M13 과 α- 시뉴클린의 상호작용 조사

7 월령의 PDGF α-시뉴클린 형질전환 마우스(D line)와 비형질전환 마우스에게 1×10¹⁴ 개의 M13 파지를 해마 내 주사한 후, 7 일 후에 알파-시뉴클린에 대한 항체 M13 및 lba1(미세아교세포 활성화를 위해)을 사용한 IHC에 의해 뇌를 분석하였다. M13를 주사한 알파-시뉴클린 Tg 마우스에서 상당한 M13 면역반응성이 관찰되었다. 신피질과 해마의 신경세포체에서 M13 면역염색이 확인되었다. 해마의 M13 면역염색은 신경섬유망에서도 상당량 확인되었다. 뇌의 한 쪽 반구에 M13를, 다른 쪽 반구에 인산완충 식염수(PBS) 비히클을 주사한 후, 양쪽 반구의 α-시뉴클린의 평균적인 뉴런 응집체 수를 측정하고 그 비를 도 6에 도시하였다.

이상에서 실시예를 통해 본 발명을 자세히 설명하였으나, 본 발명은 본 발명의 사상과 범위 내에서 여러 변수와 농도 및 조건을 달리하여, 과도하게 많은 실험을 요하지 않고 실시될 수 있음을 당업자들은 이해할 수 있을 것이다.

이상에서 본 발명을 구체적인 태양들과 관련하여 설명하였으나, 본 발명은 더 변형될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 본 출원은 일반적으로 본 발명의 원리에 따르며 본 발명과 관련된 기술분야에서 공지된 또는 관용화된 기술을 전술한 명세서 및 첨부된 청구범위에 기재된 본 발명의 주요특징에 적용하여 얻어지는 임의의 변형, 이용 또는 변경을 포함한다.

공지된 방법의 단계, 관용화된 방법의 단계, 공지된 방법 또는 관용화된 방법에 대한 인용은 본 발명의 기재 또는 구현예가 관련 기술분야에서 공개, 개시 또는 암시되었음을 인정하는 것이 결코 아니다.

전술한 구체적인 구현예에 대한 설명으로부터 본 발명의 일반적인 특성이 충분히 드러나며, 당업자는 당해 기술분야의 지식(본 명세서에 인용된 내용을 포함)을 적용함으로써, 본 발명의 일반적인 사상에서 벗어남이 없이, 과도한 실험을 요하지 않고 상기 구체적인 구현예를 다양한 용도에 맞도록 쉽게 변형 및/또는 변경할 수 있을 것이다. 따라서, 그러한 변형 및 변경은 본 발명의 개시와 지침에 따라, 개시된 구현예의 등가물의 의미와 범위 내에 포함되는 것이다. 본 명세서에서 사용된 표현 또는 용어는 설명을 위한 것으로서 제한적인 의미를 갖는 것이 아니며, 본 명세서의 표현 또는 용어는 당해 기술분야에서 통상적인 기술을 가지는 자의 지식과 본 발명의 개시와 지침을 고려하여 해석해야 할 것이다.

<110> LAMOT AT TEL AVIV UNIVERSITY LTD. <120> METHOD FOR TREATING PARKINSON'S DISEASE USING FILAMENTOUS BACTERIOPHAGE <130> IF11P047US <150> US 61/117,446 <151> 2008-11-24 <160> 7 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 235 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 1 Met Gln Gln Ser Ala Phe Tyr Glu Ile Leu Asn Met Pro Asn Leu Asn 1 5 10 15 Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser 20 25 30 Gln Ser Thr Asn Val Leu Gly Glu Ala Lys Lys Leu Asn Glu Ser Gln 35 40 45 Ala Pro Lys Ala Asp Asn Asn Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe 50 55 60 Tyr Glu Ile Leu Asn Met Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Gly 65 70 75 80 Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu 85 90 95 Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Glu Ser Gln Ala Pro Lys Ala Asp Asn 100 105 110 Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu 115 120 125 Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys 130 135 140 Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu 145 150 155 160 Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Ala Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln 165 170 175 Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu 180 185 190 Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser 195 200 205 Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro 210 215 220 Lys Glu Glu Asp Asn Asn Lys Pro Ala Ala Ala 225 230 235 <210> 2 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 2 Asp Gly Glu Ala 1 <210> 3 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 3 Ile Arg Val Val Met 1 5 <210> 4 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 4 Pro His Ser Arg Asn 1 5 <210> 5 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 5 Arg Phe Tyr Val Val Met Trp Lys 1 5 <210> 6 <211> 140 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 6 Met Asp Val Phe Met Lys Gly Leu Ser Lys Ala Lys Glu Gly Val Val 1 5 10 15 Ala Ala Ala Glu Lys Thr Lys Gln Gly Val Ala Glu Ala Ala Gly Lys 20 25 30 Thr Lys Glu Gly Val Leu Tyr Val Gly Ser Lys Thr Lys Glu Gly Val 35 40 45 Val His Gly Val Ala Thr Val Ala Glu Lys Thr Lys Glu Gln Val Thr 50 55 60 Asn Val Gly Gly Ala Val Val Thr Gly Val Thr Ala Val Ala Gln Lys 65 70 75 80 Thr Val Glu Gly Ala Gly Ser Ile Ala Ala Ala Thr Gly Phe Val Lys 85 90 95 Lys Asp Gln Leu Gly Lys Asn Glu Glu Gly Ala Pro Gln Glu Gly Ile 100 105 110 Leu Glu Asp Met Pro Val Asp Pro Asp Asn Glu Ala Tyr Glu Met Pro 115 120 125 Ser Glu Glu Gly Tyr Gln Asp Tyr Glu Pro Glu Ala 130 135 140 <210> 7 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 7 Val Thr Gly Val Thr Ala Val Ala Gln Lys Thr Val 1 5 10

Claims

파킨슨병 또는 파킨슨병에 대한 감수성의 치료용 사상 박테리오파지로서,
상기 사상 박테리오파지는 전염증성 사이토카인에 대한 항체를 디스플레이하는 것을 특징으로 하는 사상 박테리오파지.
파킨슨병 또는 파킨슨병에 대한 감수성의 치료용 사상 박테리오파지로서,
상기 사상 박테리오파지는 포유동물 세포 내재화 신호; (ii) α-시뉴클린 항원 또는 α-시뉴클린 항체; 또는 (iii) β-아밀로이드 항원 또는 β-아밀로이드 항체를 디스플레이하지 않는 것을 특징으로 하는 사상 박테리오파지.
제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 박테리오파지는 포유동물 세포 내재화 신호를 디스플레이하지 않는 것을 특징으로 하는 사상 박테리오파지.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 박테리오파지는 WT 파지인 것을 특징으로 하는 사상 박테리오파지.
제4항에 있어서,
상기 박테리오파지는 UV가 조사된 파지인 것을 특징으로 하는 사상 박테리오파지.
파킨슨병의 치료용 제1 및 제2 사상 박테리오파지로서,
a) 제1 사상 박테리오파지는 전염증성 사이토카인에 대한 항체를 디스플레이하고;
b) 제2 사상 박테리오파지는 (i) 포유동물 세포 내재화 신호; (ii) α-시뉴클린 항원 또는 α-시뉴클린 항체; (iii) β-아밀로이드 항원 또는 β-아밀로이드 항체; 또는 (iv) 전염증성 사이토카인에 대한 항체를 디스플레이하지 않는 것을 특징으로 하는 사상 박테리오파지.
제6항에 있어서,
상기 제1 박테리오파지는 포유동물 세포 내재화 신호를 디스플레이하지 않는 것을 특징으로 하는 사상 박테리오파지.
제6항 또는 제7항에 있어서,
상기 제2 박테리오파지는 WT 파지인 것을 특징으로 하는 사상 박테리오파지.
제8항에 있어서,
상기 제2 박테리오파지가 UV가 조사된 파지인 것을 특징으로 하는 사상 박테리오파지.
제1항, 제3항, 제4항 및 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
전염증성 사이토카인에 결합하는 항체를 디스플레이하는 상기 사상 박테리오파지는 단백질 A 또는 단백질 G의 항체 결합부위를 더 디스플레이하고, 전염증성 사이토카인에 결합하는 상기 항체는 상기 단백질 A 또는 단백질 G의 항체 결합부위에 결합하는 것을 특징으로 하는 사상 박테리오파지.
제3항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
전염증성 사이토카인에 결합하는 상기 항체는 IL-6에 결합하는 항체인 것을 특징으로 하는 사상 박테리오파지.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 각 박테리오파지는 비강내 투여용으로 사용되는 것을 특징으로 하는 사상 박테리오파지.
제1항 및 제3항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 각 사상 박테리오파지는 독립적으로 M13, f1, 및 fd 박테리오파지, 및 그 혼합물로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 사상 박테리오파지.
제13항에 있어서,
상기 각 사상 박테리오파지는 M13인 것을 특징으로 하는 사상 박테리오파지.
약학적 조성물로서,
a) 전염증성 사이토카인에 특이적인 항체를 디스플레이하는 제1 사상 박테리오파지;
b) 제2 사상 박테리오파지로서, (i) 포유동물 세포 내재화 신호; (ii) α-시뉴클린 항원 또는 α-시뉴클린 항체; (ⅲ) β-아밀로이드 항원 또는 β-아밀로이드 항체; 또는 (iv) 전염증성 사이토카인에 특이적인 항체를 디스플레이하지 않는 제2 박테리오파지; 및
c) 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제15항에 있어서,
상기 조성물은 비강내 투여용으로 제형화된 것을 특징으로 하는 조성물.
제15항 또는 제16항에 있어서,
상기 제1 박테리오파지는 포유동물 세포 내재화 신호를 디스플레이하지 않는 것을 특징으로 하는 조성물.
제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 제2 박테리오파지는 WT 파지인 것을 특징으로 하는 조성물.
제18항에 있어서,
상기 제2 박테리오파지는 UV가 조사된 박테리오파지인 것을 특징으로 하는 조성물.
제15항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 제1 사상 박테리오파지는 단백질 A 또는 단백질 G의 항체 결합부위를 더 디스플레이하고, 전염증성 사이토카인에 결합하는 상기 항체는 단백질 A 또는 단백질 G의 항체 결합부위에 결합하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제15항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
전염증성 사이토카인에 결합하는 상기 항체는 IL-6에 결합하는 항체인 것을 특징으로 하는 조성물.
제15항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 제1 및 제2 사상 박테리오파지는 각각 독립적으로 M13, f1 및 fd 박테리오파지와 그 혼합물로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
제22항에 있어서,
상기 제1 및 제2 사상 박테리오파지는 M13인 것을 특징으로 하는 조성물.
파킨슨병 또는 파킨슨병에 대한 감수성을 가지는 환자에게 사상 박테리오파지를 투여하여 환자를 치료하는 방법으로서,
상기 박테리오파지는 (i) 포유동물 세포 내재화 신호; (ii) α-시뉴클린 항원 또는 α-시뉴클린 항체; 또는 (iii) β-아밀로이드 항원 또는 β-아밀로이드 항체를 디스플레이하지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
파킨슨병 또는 파킨슨병에 대한 감수성을 가지는 환자에게 전염증성 사이토카인에 대한 항체를 디스플레이하는 사상 박테리오파지를 투여하여 환자를 치료하는 것을 특징으로 하는 방법.
제25항에 있어서,
상기 박테리오파지는 포유동물 세포 내재화 신호를 디스플레이하지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
제24항 또는 제25항에 있어서,
상기 박테리오파지는 WT 파지인 방법.
제27항에 있어서,
상기 박테리오파지는 UV가 조사된 파지인 방법.
파킨슨병 또는 파킨슨병에 대한 감수성을 가지는 환자를 치료하는 방법으로서,
a) 전염증성 사이토카인에 대한 항체를 디스플레이하는 제1 사상 박테리오파지; 및
b) 제2 사상 박테리오파지로서, (i) 포유동물 세포 내재화 신호; (ii) α-시뉴클린 항원 또는 α-시뉴클린 항체; (ⅲ) β-아밀로이드 항원 또는 β-아밀로이드 항체; 또는 (iv) 전염증성 사이토카인에 특이적인 항체를 디스플레이하지 않는 제2 박테리오파지를 환자에게 병용투여하여 치료하는 것을 특징으로 하는 방법.
제29항에 있어서,
상기 제1 박테리오파지는 포유동물 세포 내재화 신호를 디스플레이하지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
제29항 또는 제30항에 있어서,
상기 제2 박테리오파지는 WT 파지인 것을 특징으로 하는 방법.
제31항에 있어서,
상기 제2 박테리오파지는 UV가 조사된 파지인 것을 특징으로 하는 방법.
제25항 내지 32항 중 어느 한 항에 있어서,
전염증성 사이토카인에 결합하는 항체를 디스플레이하는 상기 사상 박테리오파지는 단백질 A 또는 단백질 G의 항체 결합부위를 더 디스플레이하고, 전염증성 사이토카인에 결합하는 상기 항체는 단백질 A 또는 단백질 G의 항체 결합부위에 결합하는 것을 특징으로 하는 방법.
제25항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서,
전염증성 사이토카인에 결합하는 상기 항체는 IL-6에 결합하는 항체인 것을 특징으로 하는 방법.
제24항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 각 박테리오파지는 비강 내 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
제24항 내지 35항 중 어느 한 항에 있어,
상기 각 사상 박테리오파지는 독립적으로 M13, f1, 및 fd 박테리오파지, 및 그 혼합물로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제36항에 있어서,
상기 각 사상 박테리오파지는 M13인 것을 특징으로 하는 방법.