EA030389B1 - ПОЛИПЕПТИДЫ, СОДЕРЖАЩИЕ ИЗМЕНЕННУЮ АМИНОКИСЛОТНУЮ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ g3p БАКТЕРИОФАГА С ПОНИЖЕННОЙ ИММУНОГЕННОСТЬЮ - Google Patents

ПОЛИПЕПТИДЫ, СОДЕРЖАЩИЕ ИЗМЕНЕННУЮ АМИНОКИСЛОТНУЮ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ g3p БАКТЕРИОФАГА С ПОНИЖЕННОЙ ИММУНОГЕННОСТЬЮ Download PDF

Info

Publication number
EA030389B1
EA030389B1 EA201592272A EA201592272A EA030389B1 EA 030389 B1 EA030389 B1 EA 030389B1 EA 201592272 A EA201592272 A EA 201592272A EA 201592272 A EA201592272 A EA 201592272A EA 030389 B1 EA030389 B1 EA 030389B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
text
amino acid
zeo
absent
polypeptide
Prior art date
Application number
EA201592272A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201592272A1 (ru
Inventor
Фрэнсис Джозеф Карр
Тимоти Дэвид Джоунз
Ричард А. Фишер
Роберт Джордж Эдвард Холгейт
Original Assignee
Проклара Байосайенсиз, Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Проклара Байосайенсиз, Инк. filed Critical Проклара Байосайенсиз, Инк.
Publication of EA201592272A1 publication Critical patent/EA201592272A1/ru
Publication of EA030389B1 publication Critical patent/EA030389B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C07K14/01—DNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0085—Brain, e.g. brain implants; Spinal cord
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/04—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system for myasthenia gravis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A61P25/16—Anti-Parkinson drugs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4711—Alzheimer's disease; Amyloid plaque core protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70514—CD4
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2795/00—Bacteriophages
    • C12N2795/00011—Details
    • C12N2795/14011—Details ssDNA Bacteriophages
    • C12N2795/14111—Inoviridae
    • C12N2795/14122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2795/00—Bacteriophages
    • C12N2795/00011—Details
    • C12N2795/14011—Details ssDNA Bacteriophages
    • C12N2795/14111—Inoviridae
    • C12N2795/14133—Use of viral protein as therapeutic agent other than vaccine, e.g. apoptosis inducing or anti-inflammatory

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Psychology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)

Abstract

Изобретение относится к полипептидам, которые содержат часть белка гена 3 (g3p) нитевидного бактериофага, достаточную для связывания и/или дезагрегации амилоида, например N1-N2 часть g3p и мутанты и их фрагменты, причем эта аминокислотная последовательность g3p была изменена путем замены аминокислот, чтобы быть в значительной степени менее иммуногенной, чем соответствующая последовательность аминокислот g3p дикого типа при использовании in vivo. Полипептиды изобретения сохраняют свою способность к связыванию и/или дезагрегации амилоида. Изобретение относится к использованию этих вариантов g3p-полипептидов в лечении и/или профилактике заболеваний, связанных с неправильной укладкой или агрегацией амилоида.

Description

Изобретение относится к полипептидам, которые содержат часть белка гена 3 (дЗр) нитевидного бактериофага, достаточную для связывания и/или дезагрегации амилоида, например Ν1-Ν2 часть §3р и мутанты и их фрагменты, причем эта аминокислотная последовательность §3р была изменена путем замены аминокислот, чтобы быть в значительной степени менее иммуногенной, чем соответствующая последовательность аминокислот §3р дикого типа при использовании ίη νίνο. Полипептиды изобретения сохраняют свою способность к связыванию и/или дезагрегации амилоида. Изобретение относится к использованию этих вариантов §3р-полипептидов в лечении и/или профилактике заболеваний, связанных с неправильной укладкой или агрегацией амилоида.
030389
Изобретение относится к полипептидам, которые содержат часть белка гена 3 (дЗр) нитевидного бактериофага, достаточную для связывания и/или дезагрегации амилоида, например Ν1-Ν2 часть §3р и мутанты и их фрагменты, причем эта аминокислотная последовательность §3р была изменена путем замены аминокислот, чтобы быть в значительной степени менее иммуногенной, чем соответствующая последовательность аминокислот §3р дикого типа при использовании в естественных условиях. Полипептиды изобретения сохраняют свою способность к связыванию и/или дезагрегации амилоида. Изобретение также относится к использованию этих §3р-измененных полипептидов в лечении и/или профилактике заболеваний, связанных с неправильной укладкой или агрегацией амилоида.
Белок §3р нитевидного бактериофага и, в частности, его полипептидная часть, содержащая регион Ν1-Ν2 из д3р, демонстрирует связывание и дезагрегацию различных амилоидов, таких как бета-амилоид, тау-белок и белков прионов. См. совместно рассматриваемую РСТ заявку РСТ/США 2012/066793 и предварительные заявки США 61/801349 и 61/801849, раскрытие каждой из которых включено в данном документе в качестве ссылки. См. также К. КгЫшап е! а1., 1. Μοί. ΒίοΙ. (2014). Несмотря на указанную эффективность, ожидается, что системное введение полипептидов, содержащих §3р или его регион N1Ν2, человеку может вызвать вредоносный иммунный ответ. Тем не менее, ни одна из этих идей не определяет конкретные Т-клеточные эпитопы, которые приводят к иммуногенным свойствам §3р или предлагают конкретные модификации, представленные здесь, чтобы уменьшить или устранить эти иммуногенные свойства.
Эффективность многих рекомбинантных или других искусственных терапевтических белков или полипептидов может быть ограничена нежелательными иммунными реакциями пациентов на этот терапевтический белок или полипептид. Основным фактором в индукции иммунной реакции с помощью белка является наличие Т-клеточных эпитопов в данном белке, т.е. аминокислотных последовательностей, которые могут стимулировать активность Т-клеток с помощью презентации на молекулах главного комплекса гистосовместимости (МНС) класса II. Т-клеточные эпитопы, как правило, определяются как любая аминокислотная последовательность со способностью связываться с молекулами МНС класса II. При связывании с молекулами МНС Т-клеточные эпитопы могут быть распознаны Т-клеточным рецептором (ТСК) и могут вызвать активацию Т-клеток путем привлечения Т-клеточного рецептора с целью активизации Т-клеточного ответа. Однако в общем понятно, что некоторые Т-клеточные эпитопы, связывающиеся с молекулами МНС класса II, не стимулируют Т -клеточный ответ, потому что эти пептиды распознаются как "свои" внутри организма, в которой вводят белок.
Некоторые Т-клеточные эпитопы могут быть выпущены как пептиды во время деградации терапевтического белка или полипептида в клетках, а затем представлены молекулами МНС для запуска активации Т-клеток. Для пептидов, представленных молекулами МНС класса II, такие активации Т-клеток могут затем приводить, например, к образованию антител путем прямой стимуляции В-клеток для получения таких антител.
Молекулы МНС класса II представляют собой группу высокополиморфных белков, которые играют центральную роль в отборе и активации хелперных Т-клеток. Антиген лейкоцитов группы БК (НЬА-БК) человека является преобладающими изотипом этой группы белков. Однако изотипы НЬА-БО и НЬА-БР выполняют аналогичные функции. В организме человека известно около 70 различных аллотипов изотипа БК, БО имеет 30 различных аллотипов и БР имеет, как известно, 47 различных аллотипов. Каждый человек несет от двух до четырех аллелей БК, два аллеля БО и два аллеля БР.
Иммунный ответ на белок или полипептид у индивидуума во многом зависит от распознавания Тклеточного эпитопа, которое является функцией пептидсвязывающей специфичности аллотипа НЬА-БК данного индивидуума. С целью выявления Т-клеточных эпитопов в белке или полипептиде в контексте глобальной популяции желательно рассмотреть свойства связывания как можно более разнообразного множества НЬА-БК аллотипов, таким образом, чтобы охватить как можно более высокий процент из мировой популяции.
Идентификация Т-клеточного эпитопа является первым шагом на пути к элиминации эпитопа. Способы, позволяющие устанавливать Т-клеточные эпитопы известны в области техники и описаны в АО 98/52976, АО 00/34317, И8 2007/0269435; США 7208147, Кет е! а1., ХаПае Мебкте 4:975-978 (1998) и К\уок е! а1., Тгепбк ίη ОпишпоКду 22:583-588 (2001). В этих подходах прогнозируемые или указанные Тклеточные эпитопы удаляются с использованием продуманных аминокислотных замен в первичной последовательности терапевтического белка или полипептида. Несмотря на то, что эти ссылки позволяют предположительно идентифицировать Т-клеточные эпитопы, отбор аминокислотных замен, с помощью которых избегается негативное воздействия на биологическую активность, не может быть в достаточной мере обоснован. Это может быть определено только путем тестирования каждого измененного полипептида на предмет такой активности.
Таким образом, было бы желательно исследовать и уменьшить иммуногенность части Ν1-Ν2 в §3р, не разрушая его свойства амилоидного связывания/дезагрегации, для того, чтобы полипептид, содержащий данную часть Ν1-Ν2, мог хронически системно вводится для терапевтической и/или диагностической целей. Настоящее изобретение удовлетворяет эту потребность путем идентификации потенциальных Т-клеточных эпитопов в пределах последовательности Ν1-Ν2. Изобретение также идентифицирует
- 1 030389
специфические аминокислотные замены в пределах этих потенциальных Т-клеточных эпитопов для создания варианта последовательности Ν1-Ν2, которая будет сокращать или устранять иммуногенность данного Т-клеточного эпитопа, при этом не разрушая способность варианта Ν1-Ν2 связываться с амилоидом, предотвращать агрегацию амилоида и/или осуществлять разбивку амилоидных бляшек.
В одном варианте реализации изобретение также обеспечивает полипептиды, содержащие вариант аминокислотной последовательности Ν1-Ν2, или мутантную последовательность, или ее фрагмент, имеющие пониженную иммуногенность за счет одной или более аминокислотной замены в одном или более идентифицированном Т-клеточном эпитопе. В одном аспекте изобретение обеспечивает слитый белок, содержащий вариант последовательности Ν1-Ν2, слитый с регионом Рс иммуноглобулина человека.
В другом варианте реализации изобретение обеспечивает фармацевтические композиции, содержащие полипептиды изобретения и способы лечения или профилактики связанных с неправильно свернутыми и/или агрегированными амилоидными белками заболеваний, путем введения таких фармацевтических композиций восприимчивому или страдающему от такого заболевания субъекту.
В дополнительных вариантах реализации изобретение обеспечивает молекулы нуклеиновых кислот, которые кодируют полипептиды изобретения, а также векторы, содержащие такие молекулы нуклеиновой кислоты, и клетки, несущие такие векторы.
В другом варианте реализации изобретение обеспечивает способы получения полипептидов изобретения. В частности, такие способы используют молекулы нуклеиновых кислот и/или клетки, несущие вектор, который содержит такие молекулы нуклеиновых кислот.
Краткое описание фигур
Фиг. 1 представляет аминокислотную последовательность слитого белка Ν1-Ν2-Μ§01-Ρο (8ЕЦ ГО № 1) с пятью Т-клеточными эпитопами, определенными жирным шрифтом и подчеркиванием. Аминокислоты 1-217 составляют часть Ν1-Ν2 из последовательности §3р дикого типа. Аминокислоты 218-256 представляют линкерный регион, состоящий из глицин-богатого Ш-С-концевого линкера дикого типа д3р, представленного в бактериофаге М13. Этот регион определяется затенением текста. Аминокислоты 257-261 представляют аминокислоты, кодирующие сайт множественного клонирования, который используется для создания молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей слитый белок. Часть 1§0-Рс белка начинается с аминокислоты 262.
Фиг. 2 представляет аминокислотную последовательность альтернативного варианта реализации изобретения слитого белка д3р-Ы§О1-Рс (8ЕЦ ГО № 2) с четырьмя Т-клеточными эпитопами, определенными подчеркиванием. Пятый Т-клеточный эпитоп был устранен путем делеции аминокислот, соответствующих аминокислотам 258 и 259 из 8ЕЦ ГО № 1.
Фиг. 3 представляет аминокислотную последовательность другого альтернативного варианта реализации изобретения слитого белка д3р-Ы§О1-Рс (8ЕЦ ГО № 3) с тремя Т-клеточными эпитопами, определенными жирным шрифтом и подчеркиванием. Четвертый Т-клеточный эпитоп был устранен путем замены У215А и О220Е по сравнению с 8ЕЦ ГО № 1 и пятый Т-клеточный эпитоп был устранен путем делеции аминокислот, соответствующих аминокислотам 258 и 259 из 8ЕЦ ГО № 1.
Фиг. 4А представляет последовательность ДНК (8ЕЦ ГО № 4), кодирующую слитый белок §3рЫдО1-Рс из 8ЕО ГО № 1 с Ν-концевой сигнальной последовательности млекопитающих. Фиг. 4Б представляет последовательность ДНК (8ЕЦ ГО № 5), кодирующую слитый белок §3р-Ы§О1-Рс из 8ЕЦ ГО № 2 с Ν-концевой сигнальной последовательности млекопитающих.
Фиг. 5 представляет последовательность ДНК (8ЕЦ ГО № 6), кодирующую слитый белок §3рЫдО1-Рс из 8ЕО ГО № 3 с Ν-концевой сигнальной последовательности млекопитающих.
Фиг. 6 иллюстрирует сравнение частоты донорных аллотипов, экспрессированных в исследовании, описанном в примере 1.
Фиг. 7 представляет аминокислотную последовательность другого альтернативного варианта реализации изобретения слитого белка д3р-Ы§О1-Рс (8ЕЦ ГО № 7) с тремя Т-клеточными эпитопами, определенными жирным шрифтом и подчеркиванием. Четвертый Т-клеточный эпитоп был устранен путем замены У215О по сравнению с 8ЕЦ ГО № 1.
Фиг. 8 представляет последовательность ДНК (8ЕЦ ГО № 8), кодирующую слитый белок §3рЫдО1-Рс из 8ЕЦ ГО № 7 с Ν-концевой сигнальной последовательности млекопитающих.
Подробное описание сущности изобретения
В настоящей заявке термин "измененный" (и его однокоренные слова) по отношению к контрольной (неизмененной) аминокислоте или последовательности нуклеиновой кислоты относится к последовательности, содержащей одну или более аминокислотную замену или соответствующую замену кодонов. Модификация не обязательно требует физического манипулирования стандартной последовательностью. До тех пор пока последовательность содержит такие замены в сравнении с стандартной последовательностью, она будет считаться "измененной" независимо от того, как она была синтезирована. Термин "вариант" относится к аминокислоте или последовательности нуклеиновой кислоты, которая была изменена для того, чтобы уменьшить иммуногенность по сравнению со стандартной последовательностью. Используемый в данном документе "вариант §3р" или "вариант Ν1-Ν2" относится к аминокислотной последовательности (или последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей ее), включающей: (а)
- 2 030389
часть Ν1-Ν2 белка д3р нитевидного бактериофага (например, аминокислоты 1-217 из 8ЕР ГО № 1) или (б) мутантную аминокислотную последовательность или фрагмент этой аминокислотной последовательности (например, аминокислоты 1-217 из 8ЕР ГО № 3), которая связывается и/или дезагрегирует амилоид, причем аминокислотная последовательность (или последовательность нуклеиновой кислоты кодирующая ее) была изменена для того, чтобы снизить иммуногенность по сравнению с стандартной (неизмененной) последовательностью аминокислоты; и отличающихся тем, что модификации содержат 1-9 аминокислотных замен, выбранных из группы аминокислотных замен, изложенных в любой из табл. 1, 2, 6 или 7, или соответствующей замены. Термин "соответствующая замена" в данном описании обозначает замену в мутантной последовательности или в фрагменте аминокислот 1-217 из 8ЕР ГО № 1, которая соответствует эквивалентной замене аминокислот в табл. 1, 2, 6 или 7, если такая мутантная последовательность или фрагмент выровнены с аминокислотами 1-217 из 8ЕР ГО № 1.
Пример фрагмента аминокислот 1-217 из 8ЕР ГО № 1, которые связываются с и/или дезагрегируют амилоид, включает, но не ограничивается, любой фрагмент, содержащий аминокислоты 1-67 из 8ЕР ГО № 1. Пример мутантов по аминокислотам 1-217 из 8ЕР ГО № 1, которые связываются с и/или дезагрегируют амилоид, включает, но не ограничивается: (1) аминокислоты 1-217 из 8ЕР ГО № 3; (2) аминокислоты 1-217 из 5>ЕР ГО № 1, аминокислоты 1-217 из 5>ЕР ГО № 3 или аминокислоты 1-217 из 5>ЕР ГО № 7, несущие замену УУУ на ААА в аминокислотах 43-45; (3) аминокислоты 1-217 из 5>ЕР ГО № 1, аминокислоты 1-217 из 5>ЕР ГО № 3 или аминокислоты 1-217 из 5>ЕР ГО № 7, имеющие замену С53\У; (4) аминокислоты 1-217 из 5>ЕР ГО № 1, аминокислоты 1-217 из 5>ЕР ГО № 3 или аминокислоты 1-217 из 5>ЕР ГО № 7, имеющие делецию аминокислот 96-103; (5) аминокислоты 1-217 из 8ЕР ГО № 1, аминокислоты 1217 из 5>ЕР ГО № 3 или аминокислоты 1-217 из 5>ЕР ГО № 7, несущие замену ЦРР на ЛОЛ в аминокислотах 212-214; (6) аминокислоты 1-217 из 5>ЕР ГО № 1, аминокислоты 1-217 из 5>ЕР ГО № 3, или аминокислоты 1-217 из 5>ЕР ГО № 7, имеющие замены У181А, Р190Л и Р194Л; (7) другие активные мутанты и фрагменты, описанные в РСТ/США 2012/066793; (8) аминокислоты 1-217 из 5>ЕР ГО № 7; (9) аминокислоты 2-217 из 5>ЕР ГО № 1, аминокислоты 2-217 из 5>ЕР ГО № 3 или аминокислоты 2-217 из 5>ЕР ГО № 7; (10) аминокислоты 3-217 из 8ЕР ГО № 1, аминокислоты 3-217 из 8ЕР ГО № 3 или аминокислоты 3-217 из 5ЕЕ) ГО № 7.
Ранее показывалось, что часть Ν1-Ν2 белка д3р нитевидного бактериофага обладает способностями связывать и дезагрегировать амилоид (см. РСТ/США 2012/066793). Часть Ν1-Ν2 дикого фага М13 представлена аминокислотами 1-217 из 8ЕР ГО № 1. Та же аминокислотная последовательность Ν1-Ν2 присутствует также в нитевидных бактериофагах й и И. Следует понимать, что аминокислоты 218-256 из 5>Ер ГО № 1 также являются частью нативной последовательности д3р и обычно упоминаются как глицин-богатый линкер, соединяющей регион Ν2 д3р с С-концевым доменом д3р (СК), также известным как домен Ν3. Аминокислоты 257-261 из 8ЕР ГО №1 представляют аминокислоты, кодирующие сайт множественного клонирования, который используется для создания молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей слитый белок из 8ЕЦ ГО №1.
Полипептиды
Таким образом, в одном варианте реализации изобретение обеспечивает полипептид, содержащий вариант д3р или вариант Ν1-Ν2. Более конкретный вариант реализации изобретения обеспечивает полипептид, содержащий вариант исходной аминокислотной последовательности, выбранный из аминокислот 1-217 из 5>ЕР ГО № 1, аминокислот 1-217 из 8ЕЦ ГО № 3 и аминокислот 1-217 из 8ЕЦ ГО № 7, причем (а) полипептид связывается и/или дезагрегирует амилоид; (б) полипептид имеет пониженную иммуногенность по сравнению с соответствующим полипептидом, содержащим исходную аминокислотную последовательность; и (в) вариант имеет 1-9 аминокислотных замен в сравнении с исходной аминокислотной последовательностью, причем каждая аминокислотная замена выбрана из группы аминокислотных замен, указанных в табл. 1 и 2. Термин "соответствующий полипептид, содержащий исходную аминокислотную последовательность" в данном описании, обозначает полипептид, который, за исключением замен(ы), имеет ту же аминокислотную последовательность, что и полипептид, содержащий исходную аминокислотную последовательность.
- 3 030389
Таблица 1
Деиммунизированные аминокислотные замены аминокислотами 1-217 из ЗЕЕ) ГО № 1, ЗЕр ГО № 2, ЗЕр ГО № 3 или ЗЕр ГО № 7
Таблица 2
Альтернативные или дополнительные деиммунизированные аминокислотные замены аминокислотами 1-217 из ЗЕр ГО № 1, ЗЕр ГО № 2, ЗЕр ГО № 3 или ЗЕр ГО № 7
В табл. 1 и 2 каждая из указанных аминокислот такая же, как и в ЗЕО ГО № 1, 3 и 7.
*
Аминокислотные замены, изложенные в табл. 1 и 2, были получены путем определения Тклеточных эпитопов, полностью представленных в аминокислотной последовательности Ν1-Ν2. Это было сделано путем инкубации различных перекрывающихся пептидных фрагментов последовательности Ν1-Ν2 против мононуклеарных клеток периферической крови (МКПК) из когорты сообщества доноров крови, лучше представляющих НЕА-ЭИ аллотипы мировой популяции для идентификации потенциальных Т-клеточных эпитопов. Эта информация затем подвергалась программному анализу с базой данных известных Т-клеточных эпитопов для выявления оптимальных аминокислотных замен в этих потенциальных эпитопах. Данные процедуры подробно описаны в примерах.
В одном аспекте данных вариантов реализации изобретения замены аминокислот 1-9 выбраны из тех, которые изложены в табл. 1. В более конкретном изложенном выше аспекте варианта реализации изобретения полипептид содержит вариант аминокислот 1-217 из ЗЕО ГО № 1, или вариант аминокислот 1-217 ЗЕР из ГО № 3, или вариант аминокислот 1-217 из ЗЕР ГО № 7, имеющий только одну специфиче- 4 030389
скую замену аминокислоты, причем замена выбрана из замен, изложенных в табл. 3.
Таблица 3
Специфические деиммунизированные одиночные аминокислотные замены аминокислотами 1-217 из ЗНС) ΙΌ № 1, аминокислотами 1-217 из ЗЕР ΙΌ № 3 или аминокислотами 1-217 из ЗЕО ГО № 7
О48Н О48К О48К 0488
О48Т Т51О Т51Н Т51К
Т51Р Т51К Т510 Τ51Ν
Υ54Ο Υ54Η Υ54Κ Υ54Ρ
Υ54Κ Т56О Т56Н Т56К
Т56Р Т56К М135А Μ135Ώ
М135С М135Н М135К Μ135Ν
М135К М135Т К140 А Κ140ϋ
К140Е К1400 К140Н Κ140ζ)
Р14Ю Р141Е Ν143Α N1430
81730 8173Р М176О М176Н
М176К Μ176Ν Ό178Ο Ό178Ν
Ц178О Ώ1783 А181О А181Н
А181К А181К 8173К К174К
М176К Ώ178Τ
В некоторых вариантах реализации изобретения полипептид содержит вариант аминокислот 1-217 из ЗЕР ГО № 1, или вариант аминокислот 1-217 ЗЕР из ГО № 3, или вариант аминокислот 1-217 из ЗЕР ГО № 7, имеющий замены аминокислоты 2-9, причем замены находятся по меньшей мере в двух эпитопах из эпитопов 1, 2 и 3, причем замены выбраны из тех, которые изложены в табл. 1 и 2. В более конкретном аспекте варианта реализации изобретения по крайней мере две замены в варианте аминокислот 1-217 из ЗЕО ГО № 1, или варианте аминокислот 1-217 из ЗЕО ГО № 3, или варианте аминокислот 1-217 из ЗЕР ГО № 7, выбраны из тех, которые изложены в табл. 1. В еще более конкретном аспекте полипептид содержит вариант из ЗЕР ГО № 1, или ЗЕО ГО № 3, или ЗЕО ГО № 7, который имеет только две аминокислотные замены, причем замены выбраны из любых двух специфических аминокислотных замен, изложенных в табл. 4.
Таблица 4
Две специфические деиммунизированные аминокислотные замены аминокислотами 1-217 из ЗЕО ГО № 1, аминокислотами 1-217 из ЗЕО ГО № 3 или аминокислотами 1-217 из ЗЕО ГО № 7
Υ54Κ и М135К У54КиМ135Т Υ54Κ и Κ1400 У54КиМ135К
У54КиМ135Т Υ54Κ и ΚΙ 40(2 Т56НиМ135К Т56НиМ135Т
Т56НиК140(2 Т56КиМ135К Т56КиМ135Т Т56К и К140(2
Υ54Κ и ϋ178Ν Υ54Κ иА181Н Υ54Κ иА181К У54КиК174К
Υ54Κπϋ178Ν У54КиА181Н У54КиА181К У54КиК174К
Τ56Ηπϋ178Ν Τ56Η иА181Н Т56Ни\У181К Т56НиК174К
Τ56Κπϋ178Ν Τ56Κ иА181Н Т56К и\У181К Т56КиК174К
Μ135ΚΗϋ178Ν М135Ки\\'181Н М135К и А181К М135К и К174К
Μ135ΤΗϋ178Ν М135Ти ΥΥΊ81Η М135ТиА181К М135ТиК174К
Κ140(2πΟ178Ν Κ140(2 ИА181Н К14ОС2 иА181К К140(2иК174К
В другом варианте реализации изобретения, полипептид содержит вариант аминокислот 1-217 из ЗЕО ГО № 1, или вариант аминокислот 1-217 ЗЕО из ГО № 3, или вариант аминокислот 1-217 из ЗЕР ГО № 7, имеющий замены аминокислоты 3-9, причем по меньшей мере одна аминокислотная замена находится в каждом эпитопе из 1, 2 и 3, и причем замены выбраны из замен, изложенных в табл. 1 и 2. В более конкретном аспекте варианта реализации изобретения по крайней мере три аминокислотные замены в варианте аминокислот 1-217 из ЗЕО ГО № 1, или варианте аминокислот 1-217 из ЗЕР ГО № 3, или варианте аминокислот 1-217 из ЗЕО ГО № 7 выбраны из замен, изложенных в табл. 2. В еще более конкретном аспекте полипептид содержит вариант аминокислот 1-217 из ЗЕО ГО № 1, или вариант аминокислот 1-217 ЗЕО из ГО № 3, или вариант аминокислот 1-217 из ЗЕО ГО № 7, имеющий только три аминокислотные замены, причем замены выбраны из любых трех специфических аминокислотных замен, изложенных в табл. 5.
Таблица 5
Три специфические деиммунизированные аминокислотные замены аминокислотами 1-217 из ЗЕР ГО № 1, аминокислотами 1-217 из ЗЕО ГО № 3, или аминокислотами 1-217 из ЗЕО ГО № 7
Υ54Κ, М135Ки Ό178Ν Υ54Κ, М135Т и Ό178Ν Υ54Κ, К 140(2 и Ό178Ν Υ54Κ, М135Ки Ό178Ν
Υ54Κ, М135Т и Υ54Κ, К 140(2 и Т56Н, М135Ки Т56Н, М135Т и
- 5 030389
Ό178Ν ϋ178Ν Ό178Ν Ό178Ν
Т56Н, К1400 и Ό178Ν Τ56Κ, М135Ки ϋ178Ν Τ56Κ, М135Т и Ό178Ν Τ56Κ, КТ400 и Ό178Ν
Υ54Κ, М135Ки Ж81Н Υ54Κ, М135Т и 3Υ181Η Υ54Κ, К1400 и Ж81Н Υ54Κ, М135Ки Ж81Н
Υ54Κ, М135Т и Ж81Н Υ54Κ, К1400 и 3Υ181Η Τ56Η, М135Ки Ж81Н Т56Н, М135Т и Ж81Н
Τ56Η, К1400 и Ж81Н Τ56Κ, М135Ки 3Υ181Η Τ56Κ, М135Т и Ж81Н Т56К, К1400 и Ж81Н
Υ54Κ, М135Ки Ж81К Υ54Κ, М135Т и Ж81К Υ54Κ, К1400 и ΑΥ181Κ Υ54Κ, М135Ки Ж81К
Υ54Κ, М135Т и Ж81К Υ54Κ, К140Ц и Ж81К Τ56Η, М135Ки ΑΥ181Κ Т56Н, М135Т и Ж81К
Τ56Η, К1400 и Ж81К Τ56Κ, М135Ки Ж81К Τ56Κ, М135Т и λ¥181Κ Т56К, К1400 и Ж81К
Υ54Κ, М135Ки К174К Υ54Κ, М135Т и К174К Υ54Κ, К1400 и К174К Υ54Κ, М135Ки К174К
Υ54Κ, М135Т и К174К Υ54Κ, К1400 и К174К Τ56Η, М135Ки К174К Т56Н, М135Т и К174К
Τ56Η, К1400 и К174К Τ56Κ, М135Ки К174К Τ56Κ, М135Т и К174К Т56К, К1400 и К174К
В другом варианте реализации, изобретение обеспечивает полипептид, содержащий вариант д3р, причем одна из 1-9 замен является заменой в эпитопе 4 и выбрана из У215А, У2155, У215О или У215Т, У215С, У215Э, У215Е, У215Е, У215Н, У215К, У215Ы, У215Р, ν215ς или У215К. В еще одном варианте реализации изобретение обеспечивает полипептид, содержащий вариант аминокислот 1-217 из δΙΤ) ГО № 1, причем одна из 1-9 замен является заменой в эпитопе 4 и выбрана из У215А, У2155, У215О, У215Т, У215С, У215Э, У215Е, У215Е, У215Н, У215К, У215Ы, У215Р, У215р или У215К. Посредством тестирования перекрывающихся потенциальных пептидных фрагментов Т-клеточного эпитопа последовательности Ν1-Ν2 заявители определили, что У215 в δΕ^ ГО № 1 является частью потенциального Т-клеточного эпитопа (эпитоп 4 на фиг. 1), охватывающей аминокислоты 215-223 из δΙΤ) ГО (конец N2 через фрагмент глицин-богатого линкера). Замены У215А и Θ220Ε в эпитопе 4 (см. δΕ^ ГО № 3) не влияют на способность полипептида к связыванию с амилоидом, однако последующий анализ предположил, что одна или обе из этих замен в сочетании с некоторыми изменениями, указанными в табл. 1 и 2 в каждом из эпитопов 1, 2 и 3, снижает способность полученного полипептида дезагрегировать амилоид. Единственная замена У215О в эпитопе 4 по сравнению с δΕ^ ГО № 1 (см. δΕ^ ГО № 7) не влияет на способность полипептида связывать или дезагрегировать амилоид. Каждая из этих замен эпитопа 4 была спрогнозирована программным обеспечением и анализом базы данных для исключения Т-клеточного эпитопа. Каждая из других замен для У215, изложенных выше, так же прогнозируется с целью исключить Т-клеточный эпитоп, имея небольшой эффект или вообще не влияя на связывание амилоида.
В более конкретном аспекте полипептид, содержащий вариант аминокислот 1-217 из δΕ^ ГО № 1, имеет любую из замен У215, изложенных выше, а также 1-8 аминокислотных замен, изложенных в табл. 1 или 2. В еще более конкретном варианте реализации изобретения замены аминокислот 1-8 выбраны из тех, которые изложены в табл. 1. В еще более конкретном аспекте полипептид имеет любую из замен У215, изложенных выше, и одну дополнительную замену одной аминокислоты, выбранную из тех, которые изложены в табл. 3. В более конкретном аспекте полипептид, содержащий вариант аминокислот 1217 из δΕ^ ГО № 1, имеет любую из замен У215, изложенных выше, а также 2-8 дополнительных аминокислотных замен, причем дополнительные замены находятся по меньшей мере в двух эпитопах 1, 2 и 3, в отличие от замен, выбранных из тех, которые изложены в табл. 1 или 2. В еще более конкретном варианте реализации изобретения по меньшей мере одна замена по меньшей мере в двух эпитопах 1, 2 и 3 выбрана из замен, изложенных в табл. 1. В еще более конкретном варианте реализации изобретения полипептид имеет одну замену из замен У215, изложенных выше, и одну из конкретных двух замен аминокислот, изложенных в табл. 4.
В более конкретном аспекте полипептид, содержащий вариант аминокислот 1-217 из δΕ^ ГО № 1, имеет любую из замен У215, изложенных выше, и 3-8 дополнительных аминокислотных замен, изложенных в табл. 1 или 2, причем каждый из эпитопов 1, 2 и 3 содержит одну из дополнительных замен. В еще более конкретном варианте реализации изобретения замена в каждом из эпитопов 1, 2 и 3 выбрана из тех, которые изложены в табл. 1. В еще более конкретном варианте реализации изобретения полипептид имеет одну замену из замен У215, изложенных выше, и одну из конкретных трех замен аминокислот, изложенных в табл. 5. В еще более конкретном варианте реализации изобретения полипептид имеет замену У215О и три аминокислотные замены, выбранные из Т56Н, М135К и Ώ178Ν; Т56К, М135К и Ώ178Ν; Т56К, М135Т и Ώ178Ν; Т56Н, М135К и №181К; Т56Н, М135Т и №181К; У54К, М135Т и К174К; У54К, М135К и К174К; У54К, М135Т и К174К; Т56Н, М135К и К174К; Т56Н, М135Т и К174К.
В другом варианте реализации изобретения полипептид изобретения является слитым белком, состоящим, по существу, из человеческой или гуманизированной иммуноглобулиновой полипептидной последовательности Ее, слитой с помощью пептидного линкера или непосредственно с С-концом варианта аминокислотной последовательности д3р. Термин "пептидный линкер" в данном описании обозначает серии последовательных аминокислот, которые не будут мешать функции полипептида. Как изло- 6 030389
жено выше в 8КЕ) ГО № 1-3 и 7, аминокислоты 218-256 представляют глицин-богатый линкер, который обычно присутствует в белке д3р М13. В полипептидах данного изобретения может быть использован этот линкер или другой линкер может быть использован вместо этого. Как альтернативный вариант, последовательность полипептида Ре может быть связана непосредственно с последней аминокислотой, кодирующей N2 (например, аминокислотой 217 из 8ЕР ГО № 1-3). Выбор линкерной последовательности и/или ее отсутствие могут быть сделаны специалистом в данной области техники, принимая во внимание векторы, доступные для рекомбинантной экспрессии полипептида данного изобретения, и любые вторичные или третичные структуры, которые линкер может придать полипептиду. В одном аспекте данного варианта реализации изобретения полипептид Рс является частью Рс человеческого 1дО. В более конкретном аспекте полипептид является вариантом 8ЕР ГО № 1, 8ЕР ГО № 2, 8ЕР ГО № 3 или 8ЕР ГО № 7, имеющим там 1-9 замен аминокислотных остатков, выбранных из группы аминокислотных замен, изложенных в табл. 1, 2, или 6, или 7 ниже.
Таблица 6
Деиммунизированные аминокислотные замены аминокислотами 215-223 из 8ЕО ГО № 1
Эпитоп Аминокислота №: Аминокислота присутствующая в аминокислотах 1-215 из 8ЕО ГО №: 1 Замены
4 215 у* А*, 5, О**,Т
4 218 с С, Ε, Ν, Р, 8, Τ
4 220 с* Ε*,ϋ, Е, А
4 221 8 ϋ, Е, С
4 223 С ϋ, Р
Таблица 7
Альтернативные или дополнительные деиммунизированные аминокислотные замены аминокислотами 215-223 из 8ЕР ГО № 1 или 8ЕР ГО № 2
Эпитоп Аминокислота №: Аминокислота присутствующая в аминокислотах 1-215 из 8ЕО ГО N0 1-3 Замены
4 215 С, ϋ, Ε, Ρ, Η, К, Ν, Р, 0, К
4 218 с А, Н.А
4 220 о* Μ, Υ
4 223 с Е, К, Ν, К, Т
* У215Л и О220Е уже замещены в 8ЕР ГО № 3, так что вариант 8ЕР ГО № 3 не будет содержать дополнительной замены в этих аминокислотных остатках;
** замена У215О уже присутствует в 8ЕР ГО № 7, так что вариант 8ЕР ГО № 7 не будет содержать дополнительной замены в этих аминокислотных остатках.
В еще более конкретном аспекте полипептид является вариантом из 8ЕР ГО № 1 или 8ЕР ГО № 2, имеющим 2-9 аминокислотных замен, причем одна из замен является заменой, изложенной в табл. 6 и 7; и по меньшей мере одна из замен является заменой, изложенной в табл. 1 и 2. В более конкретном аспекте полипептид является вариантом из 8ЕР ГО № 1 или 8ЕР ГО № 2 и имеет 2-9 аминокислотных замен; по меньшей мере одна из замен изложена в табл. 6; и по меньшей мере одна из замен изложена в табл. 1. В другом более конкретном аспекте полипептид является вариантом из 8ЕР ГО № 1 или 8ЕР ГО № 2 и имеет 3-9 аминокислотных замен, причем по меньшей мере одна из замен выбрана из замен, изложенных в табл. 6 и 7, и причем по меньшей мере два из эпитопов 1, 2 и 3 содержат по меньшей мере одну замену, выбранную из замен, изложенных в табл. 1 и 2. В более конкретном аспекте полипептид является вариантом из 8ЕР ГО № 1 или 8ЕР ГО № 2 и имеет по меньшей мере одну из замен, изложенных в табл. 6, и по меньшей мере одну замену по меньшей мере в двух из эпитопов 1, 2 и 3, выбранную из замен, изложенных в табл. 1. В другом более конкретном аспекте полипептид является вариантом из 8КЕ) ГО № 1 или 8ЕР ГО № 2 и имеет 4-9 аминокислотных замен; по меньшей мере одна из замен изложена в табл. 6 и 7; и по меньшей мере одна замена в каждом из эпитопов 1, 2 и 3 выбрана из замен, изложенных в табл. 1 и 2. В более конкретном аспекте полипептид является вариантом из 8ЕР ГО № 1 или 8ЕР ГО № 2 и имеет по меньшей мере одну из замен, изложенных в табл. 6, и по меньшей мере одну замену в каждом из эпитопов 1, 2 и 3, выбранную из тех, которые изложены в табл. 1. В другом более конкретном аспекте полипептид является вариантом из 8ЕР ГО № 1 или 8ЕР ГО № 2 и имеет по меньшей мере одну замену, изложенную в табл. 6; и по крайней мере одну из конкретных замен одной, двух или трех аминокислотных замен, изложенных в табл. 3, 4 или 5 соответственно. В еще одном более конкретном аспекте данного варианта реализации изобретения полипептид является вариантом из 8ЕР ГО № 1 или 8ЕР ГО № 2 и имеет только одну замену, изложенную в табл. 6, и только одну, две или три дополнительные аминокислотные замены, выбранные из конкретно одной, двух или трех аминокислотных замен, изложенных в табл.
- 7 030389
3, 4 или 5 соответственно.
В альтернативном варианте реализации изобретения полипептид является вариантом δΕρ ГО № 3 или δΕρ ГО № 7 и имеет 1-9 замен аминокислотных остатков, выбранных из группы аминокислотных замен, изложенных в табл. 1 и 2. В более конкретном аспекте по меньшей мере одна замена изложена в табл. 1. В другом более конкретном аспекте полипептид является вариантом из δΕρ ГО № 3 или δΕρ ГО № 7 и имеет 2-9 аминокислотных замен и по меньшей мере одну замену по меньшей мере в двух из эпитопов 1, 2 и 3, выбранную из любых замен, изложенных в табл. 1 и 2. В более конкретном аспекте по меньшей мере одна замена по меньшей мере в двух из эпитопов 1, 2 и 3 выбрана из тех, которые изложены в табл. 1. В другом более конкретном аспекте полипептид является вариантом из δΕρ ГО № 3 или δΕρ ГО № 7 и имеет 3-9 аминокислотных замен, причем по меньшей мере одна замена в каждом из эпитопов 1, 2 и 3 и является выбранной из любых замен, изложенных в табл. 1 и 2. В более конкретном аспекте по меньшей мере одна замена в каждом из эпитопов 1, 2 и 3 выбрана из тех, которые изложены в табл. 1. В еще более конкретном варианте реализации изобретения полипептид является вариантом из δΕρ ГО № 3 или δΕρ ГО № 7 и имеет только одну, две или три аминокислотные замены, выбранные из конкретно одной, двух или трех аминокислотных замен, изложенных в табл. 3, 4 или 5 соответственно.
В другом варианте реализации изобретения полипептид изобретения является вариантом из δΕρ ГО № 3 или δΕρ ГО № 7, имеющим только две аминокислотные замены, выбранные из любой конкретной замены двух аминокислот, изложенной в табл. 1 и 2. В другом варианте реализации изобретения полипептид изобретения является вариантом из δΕρ ГО № 3 или δΕρ ГО № 7, имеющим только 3 аминокислотные замены, выбранные из любой конкретной замены трех аминокислот, изложенной в табл. 5. В более конкретном варианте реализации изобретения полипептид изобретения является вариантом из δΕρ ГО № 7, имеющим только 3 аминокислотные замены, выбранные из любой конкретной замены трех аминокислот, изложенной в табл. 5. В другом более конкретном варианте реализации изобретения полипептид изобретения является вариантом из δΕρ ГО № 7, имеющим только 3 аминокислотные замены, выбранные из любого из следующих наборов конкретных трех аминокислотных замен: Т56Н, М135К и Ό178Ν; Т56К, М135К и Ό178Ν; Т56К, М135Т и Ό178Ν; Т56Н, М135К и №181К; Т56Н, М135Т и №181К; Υ54Κ, М135Т и К174К; Υ54Κ, М135К и К174К; Υ54Κ, М135Т и К174К; Т56Н, М135К и К174К; Т56Н, М135Т и К174К.
Молекулы нуклеиновых кислот, последовательности, векторы и клетки-хозяева
В других вариантах реализации изобретение обеспечивает выделенную молекулу нуклеиновой кислоты, которая содержит последовательность нуклеиновых кислот, кодирующую любой из полипептидов или слитых белков, содержащих описанный выше вариант д3р. В одном аспекте данного варианта реализации изобретения выделенная молекула нуклеиновой кислоты содержит вариант нуклеотидов 64714 из δΕρ ГО № 4, который изменен 1-9 заменами кодона, причем каждая замена кодона соответствует аминокислотной замене, выбранной из замен, изложенных в табл. 1 и 2, и любой из следующих замен аминокислоты У215: У215Л, ν215δ, У215С или У215Т, У215С, У215Б, ν215Ε, У215Р, У215Н, У215К, ν215Ν, ν215Ρ, ν215ρ и ν215Κ. В еще более конкретном аспекте данных вариантов реализации изобретения вариант последовательности нуклеиновой кислоты является измененным одной заменой кодона, выбранной для кодирования любой из аминокислотных замен ν215, изложенных выше; и из 1-8 дополнительных замен кодона, причем каждая из дополнительных замен кодона выбрана для кодирования аминокислотной замены, изложенной в табл. 1. В еще более конкретном аспекте данных вариантов реализации изобретения вариант последовательности нуклеиновой кислоты является измененным одной заменой кодона, выбранной для кодирования любой из аминокислотных замен ν215, изложенных выше; и из 2-8 дополнительных замен кодона, причем каждая дополнительная замена кодона кодирует аминокислотную замену, изложенную в табл. 1, и замена кодона представлена в каждом по меньшей мере из двух эпитопов 1, 2 и 3. В еще более конкретном варианте реализации изобретения вариант последовательности нуклеиновой кислоты является измененным одной заменой кодона, выбранной для кодирования любой из аминокислотных замен ν215, изложенных выше; и из 3-8 дополнительных замен кодона, причем каждая дополнительная замена кодона кодирует аминокислотную замену, изложенную в табл. 1, и замена кодона представлена в каждом из эпитопов 1, 2 и 3. В еще более конкретном варианте реализации изобретения вариант последовательности нуклеиновой кислоты является измененным одной заменой кодона, выбранной для кодирования аминокислотной замены ν215Α; и одна дополнительная замена кодона, выбранная для кодирования одной из одиночных аминокислотных замен, изложенных в табл. 3. В еще более конкретном варианте реализации изобретения вариант последовательности нуклеиновой кислоты является измененным одной заменой кодона, выбранной для кодирования аминокислотной замены ν215Ο; и одной дополнительной замены кодона, выбранной для кодирования одной из одиночных аминокислотных замен, изложенных в табл. 3. В другом конкретном варианте реализации изобретения вариант последовательности нуклеиновой кислоты является измененным одной заменой кодона, выбранной для кодирования аминокислотной замены ν215Α, изложенной выше; и двух дополнительных замен кодона, выбранных для кодирования одной из двух конкретных аминокислотных замен, изложенных в табл. 4. В другом конкретном варианте реализации изобретения вариант последовательности нуклеиновой кислоты является измененным одной заменой кодона, выбранной для кодирования аминокис- 8 030389
лотной замены У215О, изложенной выше; и двух дополнительных замен кодона, выбранных для кодирования одной из двух конкретных аминокислотных замен, изложенных в табл. 4. В еще более конкретном варианте реализации изобретения вариант последовательности нуклеиновой кислоты является измененным одной заменой кодона, выбранной для кодирования аминокислотной замены У215, изложенной выше; и трех дополнительных замен кодона, выбранных для кодирования одной из трех конкретных аминокислотных замен, изложенных в табл. 5. В еще более конкретном варианте реализации изобретения вариант последовательности нуклеиновой кислоты является измененным одной заменой кодона, выбранной для кодирования аминокислотной замены У215О, изложенной выше; и трех дополнительных замен кодона, выбранных для кодирования одной из трех конкретных аминокислотных замен, изложенных в табл. 5.
В еще одних вариантах реализации изобретения выделенная молекула нуклеиновой кислоты содержит вариант нуклеотидов 64-1530 из 8ЕО ГО № 4 или нуклеотидов 64-1524 из 8ЕО ГО № 5, причем последовательность изменена 1-9 заменами кодона, причем каждая замена кодона соответствует аминокислотной замене, выбранной из замен, изложенных в табл. 1 и 2, и любой из следующих замен аминокислоты У215: У2158, У215О или У215Т, У215С, У215П, У215Е, У215Р, У215Н, У215К, У215Ы, У215Р, У215Ц и У215К. В более конкретном варианте реализации изобретения, каждая замена кодона соответствует аминокислотной замене, выбранной из замен, изложенных в табл. 1, и любой из замен У215, изложенных выше. В еще более конкретном варианте реализации изобретения вариант последовательности нуклеиновой кислоты является измененным одной заменой кодона, выбранной для кодирования любой из аминокислотных замен У215, изложенных выше, и из 1-8 дополнительных замен кодона, причем каждая из дополнительных замен кодона соответствует аминокислотной замене, выбранной из замен, изложенных в табл. 1. В более конкретном аспекте вариант имеет одну дополнительную замену кодона, соответствующую одной из конкретных замен одной аминокислоты, изложенных в табл. 3. В еще более конкретном варианте реализации изобретения вариант нуклеотидов 64-1530 из 8ЕЦ ГО № 4 или нуклеотидов 64-1524 из 8ЕЦ ГО № 5 имеет изменение, которое состоит из одной замены кодона, выбранной для кодирования любой аминокислотной замены У215, изложенной выше; и из 2-8 дополнительных замен кодона, причем каждая дополнительная замена кодона соответствует аминокислотной замене, изложенной в табл. 1, и замены кодона, представленной в каждом по меньшей мере из двух эпитопов 1, 2 и 3. В более конкретном аспекте вариант имеет две дополнительные замены кодона, соответствующие одной из конкретных замен двух аминокислот, изложенных в табл. 4. В еще более конкретном варианте реализации изобретения вариант нуклеотидов 64-1530 из 8ЕЦ ГО № 4 или нуклеотидов 64-1524 из 8ЕЦ ГО № 5 имеет изменение, которое состоит из одной замены кодона, выбранной для кодирования любой аминокислотной замены У215, изложенной выше; и из 3-8 дополнительных замен кодона, причем каждая дополнительная замена кодона соответствует аминокислотной замене, изложенной в табл. 1, и замены кодона, представленной в каждом эпитопе 1, 2 и 3. В более конкретном аспекте вариант имеет три дополнительные замены кодона, соответствующие одной из конкретных замен трех аминокислот, изложенных в табл. 5.
В еще одних вариантах реализации изобретения выделенная молекула нуклеиновой кислоты содержит вариант нуклеотидов 64-1524 из 8ЕЦ ГО № 6 или нуклеотидов 64-1524 из 8ЕЦ ГО № 8, причем последовательность изменена 1-9 заменами кодона, причем каждая замена кодона соответствует аминокислотной замене, выбранной из замен, изложенных в табл. 1 и 2. В более конкретном варианте реализации изобретения каждая замена кодона соответствует аминокислотной замене, выбранной из замен, изложенных в табл. 1. В более конкретном варианте реализации изобретения вариант имеет одну дополнительную замену кодона, соответствующую одной из конкретных замен одной аминокислоты, изложенных в табл. 3. В еще более конкретном варианте реализации изобретения вариант нуклеотидов 64-1524 из 8ЕЦ ГО № 6 или нуклеотидов 64-1524 из 8ЕЦ ГО № 8 имеет модификацию из 2-8 замен кодона, причем каждая замена кодона соответствует аминокислотной замене, изложенной в табл. 1, и замене кодона, представленной в каждом по меньшей мере из двух эпитопов 1, 2 и 3. В более конкретном аспекте вариант имеет две дополнительные замены кодона, соответствующие одной из конкретных замен двух аминокислот, изложенных в табл. 4. В еще более конкретном варианте реализации изобретения вариант нуклеотидов 64-1524 из 8ЕЦ ГО № 6, или нуклеотидов 64-1524 из 8ЕЦ ГО № 8 имеет модификацию из 3-8 замен кодона, причем каждая замена кодона соответствует аминокислотной замене, изложенной в табл. 1, и замене кодона, представленной в каждом из эпитопов 1, 2 и 3. В более конкретном аспекте вариант имеет три дополнительные замены кодона, соответствующие одной из конкретных замен трех аминокислот, изложенных в табл. 5. В еще более конкретном аспекте вариант имеет три дополнительные замены кодона, соответствующие одному из следующих конкретных наборов замен трех аминокислот: Т56Н, М135К и Ό178Ν; Т56К, М135К и Ό178Ν; Т56К, М135Т и Ό178Ν; Т56Н, М135К и №181К; Т56Н, М135Т и №181К; У54К, М135Т и К174К; Υ54Κ, М135К и К174К; Υ54Κ, М135Т и К174К; Т56Н, М135К и К174К; Т56Н, М135Т и К174К
В еще одних вариантах реализации молекул нуклеиновой кислоты изобретения молекула нуклеиновой кислоты также содержит последовательности молекул нуклеиновой кислоты, кодирующие сигнальную последовательность, слитую в комплексе, и непосредственно к 5'-концу последовательности нук- 9 030389
леиновой кислоты, кодирующей вариант §3р. В одном аспекте данных вариантов реализации изобретений последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая сигнальную последовательность, является нуклеотидами 1-63 из δΕφ ΙΌ № 4.
Молекулы нуклеиновой кислоты изобретения содержат последовательности нуклеиновых кислот, которые являются вырожденными, но кодируют ту же последовательность аминокислот, кодируемую любой из описанных выше молекул нуклеиновых кислот.
Для рекомбинантного производства любая из молекул нуклеиновых кислот данного изобретения может быть введена в соответствующий вектор экспрессии, содержащий необходимые элементы для транскрипции и трансляции введенной кодирующей последовательности, или в случае с вирусным РНК вектором, необходимые элементы для репликации и трансляции. Кодирующая нуклеиновая кислота вводится в вектор под соответствующую рамку считывания. Соответственно, изобретение обеспечивает векторы, содержащие молекулы нуклеиновой кислоты и последовательности изобретения. Такие векторы включают, но не ограничиваются, ДНК векторы, фаговые векторы, вирусные векторы, ретровирусные векторы и пр. С целью осуществления экспрессии специалистами в данной области техники с использованием хорошо известных знаний о совместимости вектора с выбранной клеткой-хозяином осуществляется выбор соответствующего вектора, в котором происходит клонирование молекул нуклеиновых кислот и последовательностей изобретения. Это может быть сделано в любой из клеток млекопитающих, клеток растений, клеток насекомых, бактериальных клеток, дрожжевых клеток и пр. Соответствующие векторы для каждого из этих типов клеток хорошо известны специалистам в данной области техники и, как правило, имеются в продаже.
В другом варианте реализации изобретение обеспечивает клетку-хозяина, содержащую вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты или последовательности нуклеиновой кислоты изобретения. Способы трансфекции или трансформации или другого способа получения вектора изобретения в клеткехозяине являются известными в данной области техники. Содержащая вектор клетка при культивировании в подходящих условиях будет производить полипептиды изобретения. Конкретные примеры векторов и клеток, используемых для рекомбинантной продукции полипептидов изобретения, изложены в разделе примеров ниже.
Фармацевтические композиции
В некоторых вариантах реализации изобретения изобретение обеспечивает фармацевтическую композицию, содержащую любой полипептид или слитый белок, содержащий вариант §3р, в некоторых случаях вместе с фармацевтически приемлемым носителем, растворителем или вспомогательным веществом. "Фармацевтическая композиция" относится к терапевтически эффективному количеству композиции, как описано в данном документе, с физиологически пригодным носителем и/или вспомогательным веществом. Фармацевтическая композиция не вызывает значительного раздражения организма. Фразы "физиологически подходящий носитель" и "фармацевтически приемлемый носитель", которые могут быть использованы взаимозаменяемо, относятся к носителю или растворителю, который не вызывает значительного раздражения организма и не отменяет биологическую активность и свойства вводимого состава. Термин "вспомогательное вещество" означает инертное вещество, добавленное к фармацевтической композиции для дальнейшего облегчения введения действующего вещества. Примеры, без ограничений, включают в себя, например, физиологический раствор, карбонат кальция, фосфат кальция, различные сахара и типы крахмала, производные целлюлозы, желатин, растительные масла, полиэтиленгликоли и поверхностно-активные вещества, в том числе, например, полисорбат 20.
Фармацевтические композиции для использования в соответствии с настоящим изобретением могут быть приготовлены стандартным способом с использованием одного или нескольких физиологически приемлемых носителей, включая наполнители и вспомогательные вещества, облегчающие переработку действующих веществ в композициях, которые могут быть использованы фармацевтически. Надлежащая лекарственная форма зависит от выбранного пути введения и от природы поставляемой композиции (например, размер и растворимость полипептида). В одном аспекте данных вариантов реализации изобретения фармацевтическая композиция изготовлена для инъекции или инфузии в кровоток пациента. В другом аспекте данных вариантов реализации изобретения фармацевтическая композиция изготовлена для прямого введения в мозг или центральную нервную систему пациента, например, путем прямого интрамедуллярного, интратекального или интравентрикулярного введения.
Композиции, описанные в данном документе, могут быть приготовлены для парентерального введения, например, путем болюсной инъекции или непрерывной инфузии. Фармацевтические композиции для парентерального введения включают водные растворы композиции в водорастворимой форме. Кроме того, суспензии действующих веществ могут быть приготовлены как инъекционные суспензии на масляной или водной основе. Подходящие липофильные растворители или носители включают жирные масла, такие как кунжутное масло, или синтетические эфиры жирных кислот, такие как этилолеат, триглицериды или липосомы. Водные инъекционные суспензии могут содержать вещества, которые увеличивают вязкость суспензии, такие как натрий-карбоксиметилцеллюлоза, сорбит или декстран. В некоторых случаях суспензия может также содержать подходящие стабилизаторы или агенты (например, поверхностно-активные вещества, такие как полисорбат (Т\уссп 20), которые увеличивают растворимость дейст- 10 030389
вующих веществ для обеспечения приготовления высококонцентрированных растворов. Агент на основе белка, такой как, например, альбумин, может быть использован для предотвращения адсорбции полипептида данного изобретения на поверхности доставки (т.е. пакете для внутривенного вливания, катетере, игле и т.д.).
Для перорального введения композиции могут быть приготовлены быстро путем объединения активных соединений с фармацевтически приемлемыми носителями, хорошо известными в данной области.
Лекарственные формы могут быть представлены в разовой дозированной лекарственной форме, например в ампулах, или в многодозовых контейнерах, в некоторых случаях с добавленным консервантом. Композиции могут быть суспензиями, растворами или эмульсиями в масляных или водных носителях и могут содержать вспомогательные агенты, такие как суспендирующие, стабилизирующие и/или диспергирующие агенты. Однократные дозированные лекарственные формы могут быть в жидком или твердом виде. Однократные дозированные лекарственные формы могут быть введены непосредственно пациенту без изменений или могут быть разбавлены или восстановлены до введения. В определенных вариантах реализации изобретения однократная дозированная лекарственная форма может быть введена в виде болюса, например, разовой инъекции, однократной пероральной дозы, в том числе пероральной дозы, содержащей множество таблеток, капсул, пилюль и др. В альтернативных вариантах реализации изобретения однократная дозированная лекарственная форма может быть введена в течение некоторого периода времени, например, путем инфузии или с помощью имплантированного насоса, такого как инфузионный насос. В последнем варианте реализации изобретения однократная дозированная лекарственная форма может быть инфузионным мешком или резервуаром насоса, предварительно заполненным соответствующим количеством полипептида или слитого белка, содержащего вариант §3р. В качестве альтернативы инфузионный мешок или резервуар насоса может быть приготовлен непосредственно перед введением пациенту путем смешивания соответствующей дозы варианта д3р с раствором инфузионного мешка или резервуара насоса.
Другой аспект настоящего изобретения включает способы изготовления фармацевтической композиции настоящего изобретения. Способы разработки лекарственных средств можно найти, например, в "ВспипдЮп'к РЬаттасеийса1 Зшепсек," Маек РиЪйкЫпд Со., ЕаЫоп. Ра., последнее издание, которое включено в данном документе в качестве полной ссылки.
Фармацевтические композиции, пригодные для использования в контексте настоящего изобретения, включают композиции, в которых действующие вещества содержатся в количестве, эффективном для достижения намеченной цели.
Определение терапевтически или диагностически эффективного количества находится в пределах компетенции специалистов данной области, а именно в свете подробного описания, представленного в данном документе.
Дозировку и интервал можно регулировать индивидуально для обеспечения уровней концентрации конструкции фагового дисплея в головном мозге, которые достаточны для лечения или диагностики конкретного заболевания головного мозга, расстройства или состояния (минимальная эффективная концентрация, МЭК). Значение МЭК будет отличаться для каждого препарата, но может быть установлено из данных ίη νίίτο. Дозы, необходимые для достижения МЭК, будут зависеть от индивидуальных характеристик.
Интервалы доз также могут быть определены с использованием значения МЭК. Препараты должны вводиться по схеме, обеспечивающей поддержание концентрации препаратов в головном мозге на уровне выше МЭК в течение 10-90% времени, желательно в течение 30-90% и оптимально в течение 50-90% времени.
В зависимости от серьезности и способности к реагированию состояния, подлежащего лечению, доза может составлять единственное или множественное введение, и продолжительность курса лечения может составлять от нескольких дней до нескольких недель или до тех пор, пока лечение достигнет своей цели или произойдет уменьшение болезненного состояния.
Количество композиции для введения будет, конечно, зависеть от субъекта, которого лечат или который проходит диагностику, от тяжести заболевания, решение лечащего врача и т.д.
Композиции по настоящему изобретению могут, при желании, быть представлены в упаковке или в дозирующем устройстве, таком как набор, утвержденный ΡΌΑ, который может содержать одну или более стандартных лекарственных форм, содержащих активный ингредиент. Упаковка, например, может включать металлическую или пластиковую фольгу, представляя собой, например, блистерную упаковку. Упаковка или диспенсерное устройство может сопровождаться инструкцией по введению. Упаковка или диспенсерное устройство также может сопровождаться уведомлением, связанным с контейнером, в форме, установленной правительственным агентством, регулирующим производство, применение или продажу фармацевтических препаратов, указанное предупреждение отражает одобрение агентством формы композиции или введения людям или животным. Такое уведомление, например, может быть с пометкой одобрения США. Управлением по контролю за продуктами и лекарствами США для лекарств, отпускаемых по рецепту, или в виде вкладыша одобренного продукта. Композиции, включающие препараты изо- 11 030389
бретения, содержащиеся в совместимом фармацевтическом носителе, также могут быть получены, помещены в подходящий контейнер и помечены как предназначенные для лечения указанного состояния.
Это следует понимать, что как предшествующее, так и последующее описание являются только иллюстративными и пояснительными и не ограничивают изобретение, как заявлено.
Терапевтическое применение
Другой аспект настоящего изобретения относится к применению любых полипептидов, молекул нуклеиновых кислот или композиций изобретения в лечении заболеваний, вызванных неправильной укладкой белка, включая, но не ограничиваясь, заболевания с участием любого из £Άβ42, Гакуи, ίΝΜ или йаи.
В контексте способов лечения термины "пациент", "субъект" и "реципиент" используются взаимозаменяемо и включают людей, а также других млекопитающих. В некоторых вариантах реализации изобретения пациент является человеком, который является положительным по биомаркеру, связанному с заболеванием, вызванным неправильной укладкой белка. В одном варианте реализации изобретения пациент демонстрирует бета-амилоидные отложения, как обнаружено с помощью ПЭТ-визуализации с флорбетапиром.
Термин "лечение" и его однокоренные слова предназначены означать снижение, замедление или обратное прогрессирование заболевания у пациента, демонстрирующего один или более клинических симптомов болезни. "Лечение" также означает снижение, замедление или обращение вспять симптомов болезни у пациента, проявляющего еще одни клинические симптомы заболевания. В одном варианте реализации изобретения пациент демонстрирует бета-амилоидные отложения, как обнаружено с помощью ПЭТ-визуализации с флорбетапиром, и уменьшение количества бета-амилоидных отложений за счет лечения. В одном варианте реализации изобретения пациент демонстрирует бета-амилоидные отложения, как обнаружено полипептидами или композициями полипептидов данного изобретения, и уменьшение или сохранение количества бета-амилоидных отложений за счет лечения. В другом варианте реализации изобретения пациент демонстрирует любой тип амилоидных отложений, как обнаружено с помощью ПЭТ-визуализации, и улучшение когнитивной функции пациента за счет лечения. Улучшение когнитивной функции может быть проанализировано с помощью способов и тестов по МеКЬаии с1 а1., АкЬешег'к & Иетеийа 7(3):263-9 (2011).
"Профилактика" отличается от лечения и относится к введению композиции индивидууму перед началом каких-либо клинических симптомов. Охватывается профилактика с использованием любого из полипептидов настоящего изобретения и их композиций. Исключительно на основе одного или более генетических маркеров профилактика может быть применена к людям, подверженным повышенному риску болезни или у которых наверняка развивается болезнь. Многие генетические маркеры были определены для различных заболеваний, вызванных неправильной укладкой белка. Для примеров, люди с одной или более "шведской" мутацией, "индианской" мутацией или "лондонской" мутацией в белкепредшественнике бета-амилоида человека (ПБА) подвергаются повышенному риску развития болезни Альцгеймера с ранним началом и таким образом являются кандидатами для профилактики. Кроме того, у индивидуумов, обладающих тринуклеотидными САО повторами в гене хантингтина, особенно у тех, кто имеет 36 или более повторов, в конечном итоге развивается болезнь Хантингтона, и такие индивидуумы являются кандидатами для профилактики.
Термин "неправильная укладка белка" относится к заболеваниям, характеризующимся образованием амилоидных белков с помощью агрегирующего белка (образующего амилоид пептида), такого как, но не ограничиваясь, бета-амилоид, сывороточный амилоид А, цистатин С, каппа легкая цепь 1§О или прионовый белок. Как известно, болезни, связанные с неправильно упакованным и/или агрегированным белком амилоида, включают болезнь Альцгеймера, которая включает в себя болезнь Альцгеймера с ранним началом, болезнь Альцгеймера с поздним началом и предсимптоматическую болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, амилоидоз сывороточного амилоида А (8АА), цистатина С, наследственный Исландский синдром, старческое слабоумие, множественную миелому, прионные заболевания, включая, но не ограничиваясь, куру, болезнь Крейтцфельдта-Якоба (СГО), болезнь Герстманна-Штраусслера-Шейнкера (О88), фатальную семейную бессонницу (ΡΡΙ), скрейпи и губкообразную энцефалопатию крупного рогатого скота (ГЭКРС); боковой амиотрофический склероз (БАС), спинально-церебеллярную атаксию (СЦА1), (СЦА3), (СЦА6), (СЦА7), болезнь Хантингтона, дентато-рубро-паллидо-льюисову атрофию, спинальную и бульбарную мышечную атрофию, наследственную церебральную амилоидную ангиопатию, семейный амилоидоз, деменцию лобно-височной доли, Британскую/Датскую деменцию, прогрессирующий надъядерный паралич (ПНП) и семейную энцефалопатию. Полипептиды и композиции изобретения могут быть использованы для лечения болезней, вызванных "неправильной укладкой белка".
Многие из этих болезней, вызванных неправильной укладкой и/или агрегацией амилоидного белка, возникают в центральной нервной системе (ЦНС). Некоторыми примерами заболеваний, возникающих в ЦНС, являются болезнь Паркинсона; болезнь Альцгеймера; лобно-височная деменция (ЛВД), включая тех пациентов, имеющих следующие клинические синдромы: поведенческий вариант ЛВД (пвЛВД), прогрессирующую афазию со снижением беглости речи (ΡΝΡΆ) и семантическую деменцию (СД); дегенерации лобно-височной доли (ДЛВД); болезнь Хантингтона. Полипептиды и композиции изобретения
- 12 030389
могут быть использованы для лечения болезней, вызванных неправильной укладкой и/или агрегацией амилоидного белка, которые возникают в центральной нервной системе (ЦНС).
Неправильная укладка и/или агрегация белков может также возникать вне ЦНС. Амилоидоз А (АА) (для которого белком-предшественником является сывороточный аполипопротеин острой фазы, 8АА) и множественная миелома (белки-предшественники легкой и/или тяжелой цепи иммуноглобулина) являются двумя широко известными заболеваниями, вызванными неправильной укладкой и/или агрегацией белка, возникающей вне ЦНС. Другие примеры включают болезнь с участием амилоида, образованного с помощью а2-микроглобулина, транстиретина (семейная амилоидотическая полиневропатия [САП], семейная амилоидотическая кардиомиопатия [САК] и старческий системный амилоидоз [ССА]), (апо)сывороточного амилоида А, аполипопротеинов А1, ΑΙΙ и Αίν, гельсолина (финская форма семейной амилоидотической полиневропатии), лизоцима, фибриногена, цистатина С (церебральная ангиопатия амилоида, исландский тип наследственного мозгового кровотечения с амилоидозом), (про)кальцитонина, островкового амилоидного полипептида (ΙΑΡΡ амилоидоз), предсердного натрийуретического фактора, пролактина, инсулина, лактадрегина, кератоэпителина, лактоферрина, одонтогенного амелобластассоциированного белка и семеногелина Ι. Полипептиды и композиции изобретения могут быть использованы для лечения заболеваний, связанных с неправильной укладкой и/или агрегацией белков, которые происходят вне ЦНС.
Нейродегенеративные заболевания могут также включать очаги повреждения, вызванные белком тау. Рассмотрено в Ьее с1 а1., Аппи. Кеу. №иго8сг 24:1121-159 (2001). Тау-белки являются ассоциированными с микротрубочками белками, которые экспрессируются в аксонах нейронов как центральной нервной системы, так и периферической. Охвачены нейродегенеративные таупатии (иногда упоминаются как таупатии). Примеры таупатий включают болезнь Альцгеймера, комплекс боковой амиотрофический склероз/паркинсонизм-деменция, деменцию, вызванную аргирофильной зернистостью, кортикобазальную дегенерацию, болезнь Крейтцфельдта-Якоба (СГО), деменцию боксеров, диффузные нейрофибриллярные клубки с кальцификацией, синдром Дауна, лобно-височные деменции, включая лобно-височную деменцию с паркинсонизмом, сцепленную с хромосомой 17, болезнь Герстманна-ШтраусслераШейнкера (088), болезнь Галлервордена-Шпатца, миотоническую дистрофию, болезнь Ниманна-Пика типа С, болезнь двигательного нейрона с нейрофибриллярными клубками не Гуам-типа, болезнь Пика, постэнцефалитический паркинсонизм, церебральную амилоидную ангиопатию, вызванную прионным белком, прогрессивный субкортикальный глиоз, прогрессирующий надъядерный паралич, подострый склерозирующий панэнцефалит и деменцию нейрофибриллярных клубков. Некоторые из этих заболеваний могут также включать в себя отложения фибриллярных пептидов бета-амилоида. Например, болезнь Альцгеймера демонстрирует как отложения бета-амилоида, так и очаги повреждения, вызванные белком тау. Аналогичным образом, заболевания, опосредованные прионами, такие как болезнь КрейтцфельдтаЯкоба, церебральная амилоидная ангиопатия, вызванная прионным белком, и синдром ГерстманнаШтраусслера-Шейнкера, могут также иметь очаги повреждения, вызванные белком тау. Таким образом, указание того, что болезнь является "таупатией", не должно быть истолковано как исключающее заболевание из других классификаций нейродегенеративных заболеваний или групп, которые предусмотрены более для удобства. Полипептиды и композиции изобретения могут быть использованы для лечения нейродегенеративных заболеваний, а также заболеваний, связанных с очагами повреждений, вызванными белком тау.
В одном варианте реализации изобретения фармацевтическая композиция или препарат предназначены для использования как способ уменьшения амилоида у пациента, демонстрирующего симптомы, связанные с наличием амилоида или положительным по ассоциированному с заболеванием биомаркеру, такому как флорбетапир γν-45, Ε1ί ЬШу), включая введение пациенту эффективного количества фармацевтической композиции или препарата, как описано в данном документе. В одном варианте реализации изобретения способы введения могут быть следующими: субарахноидальная инъекция или инфузия, прямая внутрижелудочковая инъекция или инфузия, интрапаренхиматозная инъекция или инфузия или внутривенная инъекция или инфузия.
В одном варианте реализации изобретения фармацевтическая композиция или препарат предназначены для использования как способ сохранения уровня амилоида у пациента, демонстрирующего симптомы, связанные с наличием амилоида или положительным по ассоциированному с заболеванием биомаркеру, такому как флорбетапир γν-45, Ε1ί ЬШу), включая введение пациенту эффективного количества фармацевтической композиции или препарата, как описано в данном документе. В одном варианте реализации изобретения способы введения могут быть следующими: субарахноидальная инъекция или инфузия, прямая внутрижелудочковая инъекция или инфузия, интрапаренхиматозная инъекция или инфузия или внутривенная инъекция или инфузия.
В одном варианте реализации изобретения фармацевтическая композиция или препарат предназначены для использования как способ дезагрегации амилоида у пациента, включающий введение пациенту, имеющему амилоид, эффективного количества фармацевтической композиции или препарата, как описано в данном документе. В одном варианте реализации изобретения способы введения могут быть следующими: субарахноидальная инъекция или инфузия, прямая внутрижелудочковая инъекция или инфу- 13 030389
зия, интрапаренхиматозная инъекция или инфузия или внутривенная инъекция или инфузия.
В одном варианте реализации изобретения фармацевтическая композиция или препарат изобретения предназначены для использования как способ, вызывающий дезагрегацию бета-амилоидных отложений в головном мозге, включающий инъекцию непосредственно в мозг пациента, нуждающегося в этом, эффективного количества фармацевтической композиции, как описано в данном документе, таким образом, вызывая уменьшение бета-амилоидных отложений в головном мозге. В альтернативном варианте реализации изобретения фармацевтическая композиция или препарат изобретения предназначены для использования как способ, вызывающий дезагрегацию бета-амилоидных отложений в головном мозге, включающий инъекцию для внутривенной доставки непосредственно в мозг пациента, нуждающегося в этом, эффективного количества фармацевтической композиции, как описано в данном документе, таким образом, вызывая уменьшение бета-амилоидных отложений в головном мозге.
В одном варианте реализации изобретения фармацевтическая композиция или препарат предназначен для использования как способ уменьшения амилоидного образования в головном мозге. Уменьшение амилоидного образования в головном мозге может предотвратить, вылечить или уменьшить симптомы или тяжесть болезней, вызванных неправильной укладкой белка, или нейродегенеративных заболеваний. В одном варианте реализации изобретения способы введения могут быть следующими: субарахноидальная инъекция или инфузия, прямая внутрижелудочковая инъекция или инфузия, интрапаренхиматозная инъекция или инфузия или внутривенная инъекция или инфузия.
В одном варианте реализации изобретения фармацевтическая композиция или препарат изобретения предназначены для использования как способ, способствующий очистке головного мозга от амилоида. Способствование очистки от амилоида может предотвратить, вылечить или уменьшить симптомы или тяжесть болезней, вызванных неправильной укладкой белка, или нейродегенеративных заболеваний. В одном варианте реализации изобретения способ введения может быть следующими: субарахноидальная инъекция или инфузия, прямая внутрижелудочковая инъекция или инфузия, интрапаренхиматозная инъекция или инфузия или внутривенная инъекция или инфузия.
В одном варианте реализации изобретения фармацевтическая композиция или препарат изобретения предназначены для использования как способ, препятствующий агрегации амилоида в головном мозге. Препятствование агрегации амилоида в головном мозге может предотвратить, вылечить или уменьшить симптомы или тяжесть болезней, вызванных неправильной укладкой белка, или нейродегенеративных заболеваний. В одном варианте реализации изобретения способы введения могут быть следующими: субарахноидальная инъекция или инфузия, прямая внутрижелудочковая инъекция или инфузия, интрапаренхиматозная инъекция или инфузия или внутривенная инъекция или инфузия.
В одном варианте реализации изобретения фармацевтическая композиция или препарат изобретения предназначен для использования как способ очистки головного мозга от токсичных амилоидных олигомеров. Очистка токсичных амилоидных олигомеров в мозге может предотвратить, вылечить или уменьшить симптомы или тяжесть болезней, вызванных неправильной укладкой белка, или нейродегенеративных заболеваний. В одном варианте реализации изобретения способы введения могут быть следующими: субарахноидальная инъекция или инфузия, прямая внутрижелудочковая инъекция или инфузия, интрапаренхиматозная инъекция или инфузия или внутривенная инъекция или инфузия.
В одном варианте реализации изобретения фармацевтическая композиция или препарат изобретения предназначен для использования как способ предотвращения образования токсичных амилоидных олигомеров в головном мозге. Предотвращение образования токсичных амилоидных олигомеров в мозге может предотвратить, вылечить или уменьшить симптомы или тяжесть болезней, вызванных неправильной укладкой белка, или нейродегенеративных заболеваний. В одном варианте реализации изобретения способы введения могут быть следующими: субарахноидальная инъекция или инфузия, прямая внутрижелудочковая инъекция или инфузия, интрапаренхиматозная инъекция или инфузия или внутривенная инъекция или инфузия.
В одном варианте реализации изобретения фармацевтическая композиция или препарат изобретения предназначен для использования как способ защиты нейронов от амилоидного повреждения. Защита нейронов от амилоидного повреждения может предотвратить, вылечить или уменьшить симптомы или тяжесть процессов неправильной укладки белка или нейродегенеративных заболеваний. В одном варианте реализации изобретения способы введения могут быть следующими: субарахноидальная инъекция или инфузия, прямая внутрижелудочковая инъекция или инфузия, интрапаренхиматозная инъекция или инфузия или внутривенная инъекция или инфузия. В одном варианте реализации изобретения фармацевтическая композиция или препарат изобретения предназначен для защиты нейронов от амилоидного повреждения и применяется с профилактической целью.
В некоторых вариантах реализации изобретения у пациента присутствует биомаркер, который ассоциируется с нарушениями укладки белка и/или агрегации белка. В одном варианте реализации изобретения биомаркером является флорбетапир (ЛУ45, Εΐί ЬШу).
В некоторых вариантах реализации изобретения пациент проявляет симптомы нейродегенеративного заболевания, связанного с наличием амилоида. В различных вариантах реализации изобретения амилоидом является один из ΓΑβ42, Газуп, ΓΝΜ или Гаи.
- 14 030389
В определенных вариантах реализации изобретения нейродегенеративным заболеванием является болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера или болезнь Хантингтона. В одном варианте реализации изобретения нейродегенеративным заболеванием является болезнь Альцгеймера. В одном варианте реализации изобретения нейродегенеративным заболеванием является болезнь Альцгеймера, и у пациента проявляется наличие бета-амилоида благодаря использованию визуализирующего агента флорбетапира (АУ45, Ей ЬШу).
В некоторых вариантах реализации изобретения у пациента проявляются симптомы заболевания, вызванного прионами.
В определенных вариантах реализации изобретения заболеванием, вызванным прионами, может быть болезнью Крейтцфельдта-Якоба, куру, фатальной семейной бессонницей или синдром Г ерстманнаШтраусслера-Шейнкера.
В некоторых вариантах реализации изобретения помимо болезни Альцгеймера пациент проявляет симптомы нейродегенеративной таутопатии. В определенных вариантах реализации изобретения заболевания, подлежащие лечению, выбирали из группы, которая включала деменцию, вызванную аргирофильной зернистостью, кортикобазальную дегенерацию, деменцию боксеров, диффузные нейрофибриллярные клубки с кальцификацией, синдром Дауна, лобно-височные деменции, включая лобно-височную деменцию с паркинсонизмом, сцепленную с хромосомой 17, болезнь Галлервордена-Шпатца, миотоническую дистрофию, болезнь Ниманна-Пика типа С, болезнь двигательного нейрона с нейрофибриллярными клубками не Гуам-типа, болезнь Пика, постэнцефалитический паркинсонизм, прогрессивный субкортикальный глиоз, прогрессирующий надъядерный паралич, подострый склерозирующий панэнцефалит и деменцию нейрофибриллярных клубков.
В другом варианте реализации изобретения любое из болезненных состояний, описанных выше, может лечиться посредством введения молекулы нуклеиновой кислоты изобретения (т.е. той молекулы, которая кодирует вариант §3р, проявляющий уменьшенную иммуногенность и обладающий способностью связываться с амилоидом, дезагрегировать амилоидные бляшки и/или предотвращать агрегацию амилоида) самостоятельно или будучи связанным с подходящим носителем, таким как, например, липидная наночастица. Полимерный носитель или вектор, такой как вирусный вектор, который передается непосредственно пациенту любым подходящим способом, таким как, например, ингаляция и внутривенное вливание. Молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей вариант §3р изобретения, подходящий для такого применения, может быть ДНК или РНК.
Диагностика
В другом аспекте реализации изобретения полипептиды и композиции, описанные в данном документе, используют при диагностике различных заболеваний, описанных в данном документе. Например, способность композиции изобретения к связыванию при использовании в качестве визуализирующего агента ίη νίνο или ίη νίίτο, может быть частью диагноза одного из заболеваний, связанного с неправильной укладкой белка, и описанного в данном документе. При использовании в качестве диагностических агентов полипептиды изобретения могут дополнительно содержать детектируемые метки или в других случаях могут быть обнаруженными ίη νίνο. Различные метки могут быть прикреплены к компоненту связывания амилоида, входящему в состав диагностической композиции, используя стандартные методики метки пептидов. Примеры меток включают флуоресцентные метки и радиоактивные метки. Существует большое разнообразие радиоактивных меток, которые могут быть использованы, но в целом их
18 11 123
часто выбирают из таких, как Р, С, I, но не ограничиваясь этим выбором. Эти и другие радиоизотопы могут быть присоединены к белку с помощью хорошо известных химических соединений. В одном варианте реализации изобретения метка определяется с помощью позитронно-эмиссионной томографии (ПЭТ). Вместе с тем, любая другая подходящая методика для обнаружения радиоизотопов также может использоваться для обнаружения радиотрейсера.
Полипептиды и композиции изобретения могут быть использованы в качестве диагностических визуализирующих средств в сочетании с визуализирующим средством, специфическим к бета-амилоиду, таким как, например, Р18-АУ-45, Ей Ы11у. Поскольку в настоящее время нет визуализирующих средств для не бета-амилоидных агрегатов, использование диагностической композиции изобретения вместе с визуализирующим средством, специфическим к бета-амилоиду, приведет к обнаружению не бетаамилоидных агрегатов на основе дифференциального обнаружения. Таким образом, в одном варианте реализации изобретения диагностическая композиция изобретения используется в качестве визуализирующего средства в сочетании с бета-амилоидным визуализирующим средством для обнаружения не бета-амилоидных агрегатов.
В другом варианте реализации изобретения полипептиды или композиции изобретения используют в качестве диагностического визуализирующего средства для обнаружения бета-амилоида в ЦНС, в том числе в головном мозге.
Диагностические композиции изобретения могут быть введены с использованием тех же способов, которые описаны для терапевтических композиций. В одном варианте реализации изобретения способы введения могут быть следующими: субарахноидальная инъекция или инфузия, прямая внутрижелудочковая инъекция или инфузия, интрапаренхиматозная инъекция или инфузия или внутривенная инъекция
- 15 030389
или инфузия.
Примеры
Пример 1. Картирование СЭ4+ Т-клеточных эпитопов в §3р.
87 перекрывающихся пептидов, охватывающих последовательность аминокислот 1-240 из ЗЕр ГО № 1 (15 аминокислот длиной с 12-ю перекрывающимися аминокислотами), были синтезированы и протестированы посредством Т-клеточного эпитопного картирования на ответ СО4+ Т-клеток человека. Отдельные пептиды были протестированы в шестикратных МКПК культурах, и Т-клеточный иммунный ответ оценивался с целью определения местоположения эпитопов, а также их относительной активности.
МКПК (мононуклеарные клетки периферической крови) выделяли из лейкоцитарной пленки здоровых доноров (полученной из крови в течение 24 ч), полученной из Национальной службы переливания крови (Аббенбрукский госпиталь, Кембридж, Великобритания), и согласно разрешению, предоставленного Комитетом по научным исследованиям и этике Аденбуркского госпиталя, выделяли посредством центрифугирования в градиенте плотности Ьутрйоргер (Ах18-8Ые1б, Данди, Великобритания). СО8+ Тклетки удаляли с помощью СО8+ Ко8е11еЗер™ (З1етСе11 Т есИпо1од1еУ Ιηο., Лондон, Великобритания). Доноры были охарактеризированы посредством определения НБАГОК гаплотипов с помощью набора для гистотипирования НЕА ЗЗР на основе ПЦР (В1оЕезЕ, Солихалл, Великобритания). Также была определена Т-клеточная иммунная реакция на контрольный белок неоантиген (КЕН белок (Р1егсе (РегЫо), Крамлингтон, Великобритания), а также на пептиды, производные ΙΡν и ЕВУ). До момента использования МКПК замораживали и хранили в жидком азоте. Для проведения анализа была отобрана когорта из 55 доноров с лучшим представлением количества и частоты НЕАГОК аллотипов, экспрессированных в мировой популяции. Анализ аллотипов, экспрессированных в когорте доноров, против тех, которые экспрессированы в мировом населении, показал, что был достигнут охват более 80% и что все основные аллели НБАГОК (индивидуальные аллотипы с частотой >5%, присутствующие у мирового населения) были хорошо представлены. Подробная информация об отдельных донорских гаплотипах, а также сравнение частоты гаплотипов МНС класса ΙΙ, присутствующих у мирового населения и отобранной группы, представлена в табл. 8 и на фиг. 3 соответственно.
Таблица 8
Данные о донорах и гаплотипах
Номер Донора Гаплотип
1 ΌΚΒ1 *04:01 ,ΌΚΒ 1 * 16:01 ДЖВ4*01:03 ЦЦВ1 *03:02;ϋ()Β 1 *05:02
2 ОКВ1*01:01,ОКВ1*13:02;ОКВЗ*03:01;ОЦВ1*05:01;ОЦВ1*06:04
3 ОКВ1*03:01,ОКВ1*07:01;ОКВЗ*01:01;ОКВ4*01:03;ОЦВ1*02:01;ОЦВ1*03:03
4 ΟΚΒ1*09:01,ΟΚΒ1*13:01;ΟΚΒ3*02:02;ΟΚΒ4*01:03;ϋς)Β1*03:03;θς)Β1*06:03
5 ОКВ1*13:01,ОКВ1*13:02;ОКВЗ*01:01;ОКВЗ*03:01;ОЦВ1*06:03;ОЦВ1*06:04
6 ОКВ1*04:01,ОКВ1*04:07;ОКВ4*01:03;ОЦВ1*03:01
7 ОКВ1*13:01;ОКВЗ*01:01;ОЦВ1*06:03
8 ОКВ1*13:01,ОКВ1*15:01;ОКВЗ*02:02;ОКВ5*01:01;ОЦВ1*06:02;ОЦВ1*06:03
9 ΟΚΒ1Ή)4:01,ΟΚΒ1*11:01;ΟΚΒ3*02:02;ΟΚΒ4*01:03;ϋς)Β1*03:01;θς)Β1*03:02
10 ОКВ1*04:04,ОКВ1*12:01;ОКВЗ*02:02;ОКВ4*01:03;ОЦВ1*03:01;ОЦВ1*03:02
11 ΟΚΒ1*13:02,ΟΚΒ1*15:01;ΟΚΒ3*01:01;ΟΚΒ5*01:01;ϋς)Β1*06:02;θς)Β1*06:04
12 ΟΚΒ1*04:01,ΟΚΒ1*15:01;ΟΚΒ4*01:03;ΟΚΒ5*01:01;ϋς)Β1*03:02;θς)Β1*06:02
13 ΌΚΒ1 *04:02,ϋΚΒ 1 *07:01 ;ΌΚΒ4*01:01 ;ΌΚΒ4*01:03 ;ϋ()Β 1 *02:01
14 ΟΚΒ1*03:01,ΟΚΒ1*16:01;ΟΚΒ3*01:01;ΟΚΒ5*02:02;ϋς)Β1*02:01;θς)Β1*05:02
15 ОКВ1*03:01,ОКВ1*13:01;ОКВЗ*02:02;ОЦВ1*02:01;ОЦВ1*06:03
16 ОКВ1*01:01,ОКВ1*15:01;ОКВ5*01:01;ОЦВ1*05:01;ОЦВ1*06:02
17 ОКВ1*01:01,ОКВ1*07:01;ОКВ4*01:03;ОЦВ1*03:03;ОЦВ1*05:01
18 ОКВ1*01:01,ОКВ1*09:01;ОКВ4*01:03;ОЦВ1*03:03;ОЦВ1*05:01
19 ОКВ1*03:01,ОКВ1*11:02;ОКВЗ*01:01;ОКВЗ*02:02;ОЦВ1*02:01;ОПВ1*03:01
20 ΟΚΒ1*13:01;ΟΚΒ3*01:01;ΟΚΒ3*02:02;ϋς)Β1*06:03
21 ΟΚΒ1*01:01,ΟΚΒ1*13:02;ΟΚΒ3*03:01;ϋς)Β1*05:01;θς)Β1*06:04
22 ΌΚΒ1 *04:01 ,ΌΚΒ 1 *04:03 ;ΌΚΒ4*01:03 ;ϋ()Β 1 *03:02
23 ОКВ1*08:01,ОКВ1*13:01;ОКВЗ*01:01;ОЦВ1*04:02;ОЦВ1*06:03
- 16 030389
24 ΟΚΒ1*03:01,ΟΚΒ1*15:01;ΟΚΒ3*01:01;ΟΚΒ5*01:01;ϋς)Β1*02:01;θς)Β1*06:02
25 ΟΚΒ1*03:01,ΟΚΒ4*01:01;ΟΚΒ3*01:01;ϋΚΒ4*01:03^Β1*02:01^Β1*03:01
26 ΟΚΒ1*01:01,ΟΚΒ1*15:01;ϋΚΒ5*01:01^Β1*05:01^Β1*06:02
27 ΌΚΒ1 *04:04,ΌΚΒ 1 *07:01 ;ΌΚΒ4*01:01 ;ΌΚΒ4*01:03 ДОВ1 *02:02;ϋ(2Β 1 *03:02
28 ΟΚΒ1*11:01,ΟΚΒ1*15:01;ΟΚΒ3*02:01;ϋΚΒ5*01:01^Β1*03:01^Β1*06:01
29 ΟΚΒ1*08:01,ΟΚΒ1*15:01;ΟΚΒ5*01:01;ϋς)Β1*04:02;θς)Β1*06:02
30 ΟΚΒ1*13:02,ΟΚΒ1*15:01;ΟΚΒ3*03:01;ϋΚΒ5*01:01^Β1*06:02^Β1*06:09
31 ΌΚΒ1 *04:01 ,ΌΚΒ 1 * 16:01 ;ΌΚΒ4*01:03 ;ϋΚΒ5*02:02;ϋ(2Β 1 *03:02;О(Щ 1 *06:03
32 ΟΚΒ1*13:02,ΟΚΒ1*15:01;ΟΚΒ3*03:01;ϋΚΒ5*01:01^Β1*06:02^Β1*06:04
33 ΟΚΒ1*07:01,ϋΚΒ 1*11:04;ΟΚΒ3*02:02;ϋΚΒ4*01:01^Β1*02:02^Β 1*03:01
34 ΟΚΒ1*01:03,ΟΚΒ1*15:01;ϋΚΒ5*01:01^Β1*03:01^Β1*06:02
35 ΟΚΒ1*03:01,ΟΚΒ1*14:01;ΟΚΒ3*01:01;ϋΚΒ3*02:02^Β1*02:01^Β1*05:03
36 ΟΚΒ1*03:01,ΟΚΒ1*08:01;ϋΚΒ3*01:01^Β1*02:01^Β1*04:02
37 ΟΚΒ1*03:01,ΟΚΒ1*11:01;ΟΚΒ3*01:01;ϋΚΒ3*02:02^Β1*02:01^Β1*03:01
38 ΟΚΒ1*07:01,ΟΚΒ1*15:01;ΟΚΒ4*01:03;ϋΚΒ5*01:01^Β1*02:02^Β1*06:02
39 ΌΚΒ1 *03:01 ,ΌΚΒ 1 * 13:02;ϋΚΒ3*02:02;ϋΚΒ3*03:01 ДОВ1 *02:01 ДОВ1 *06:09
40 ΟΚΒ1*01:01,ΌΚΒ1*13:02;ΟΚΒ3*01:01^Β1*05:01^Β1*06:04
41 ΟΚΒ1*04:07,ΟΚΒ1*15:01;ΟΚΒ4*01:03;ΟΚΒ5*01:01;ϋς)Β1*03:01;θς)Β1*06:02
42 ΌΚΒ1 *07:01 ;ΌΚΒ4*01:03 ДОВ1 *02:02;ϋ(2Β 1 *03:03
43 ΟΚΒ1*03:01,ΟΚΒ1*15:01;ΟΚΒ3*01:05;ϋΚΒ5*01:01^Β1*02:01^Β1*06:02
44 ϋΚΒ1*07:01,ϋΚΒ 1*11:04;ϋΚΒ3*02:02;ϋΚΒ4*01:01^Β1*02:02^Β 1*03:01
45 ΟΚΒ1*03:01,ΌΚΒ1*04:04;ΟΚΒ3*01:01;ΟΚΒ4*01:03^Β1*02:01^Β1*03:02
46 ΟΚΒ1*04:04,ΟΚΒ1*13:01;ΟΚΒ3*02:02;ΟΚΒ4*01:03;ϋς)Β1*03:02;θς)Β1*06:03
47 ΟΚΒ1*04:01,ΟΚΒ1*11:01;ΟΚΒ3*02:02;ΟΚΒ4*01:03;ϋς)Β1*03:01
48 ΟΚΒ1*03:01,ΟΚΒ1*04:01;ΌΚΒ3*01:06;ΟΚΒ4*01:03^Β1*02:01^Β1*03:02
49 ΟΚΒ1*01:02,ΟΚΒ1*13:03;ΟΚΒ3*01:01;ϋς)Β1*03:01;θς)Β1*05:01
50 ΟΚΒ1*04:07,ΟΚΒ1*15:01;ΟΚΒ4*01:03;ΟΚΒ5*01:01;ϋζ)Β1*03:01;Οζ)Β1*06:02
51 ΌΚΒ1 *04:07,ϋΚΒ 1 * 13:02;ΌΚΒ3*03:01 ;ΌΚΒ4*01:03 ДОВ1 *03:01 ДОВ1 *06:04
52 ΟΚΒ1*03:01;ϋΚΒ3*01:05;0(2Β1*02:01
53 ΟΚΒ1*03:01,ΟΚΒ1*07:01;ΟΚΒ3*01:01;ΟΚΒ4*01:01;ϋς)Β1*02:01;θς)Β1*02:02
54 ΟΚΒ1*04:04,ΟΚΒ1*15:01;ΟΚΒ4*01:03;ϋζ)Β1*03:02;θς)Β1*06:02
55 ΟΚΒ1*03:01,ΟΚΒ1*04:01;ΟΚΒ3*01:01;ϋΚΒ4*01:03^Β1*02:01^Β1*03:01
МКПК от каждого донора размораживали, подсчитывали и оценивали жизнеспособность. Клетки восстанавливали при комнатной температуре с использованием культуральной среды ЛШ-У® (Ιηνίΐτοдеп, Пейсли, Великобритания) и ресуспендировали с плотностью на уровне 2-3 х106 МКПК/мл (исходный раствор пролиферирующих клеток). Пептиды, состоящие из 15 аминокислот, синтезировались на 1-3 мг подложке со свободным Ν-концевым амином и свободной С-концевой карбоновой кислотой. Пептиды были растворены в ДМСО до концентрации 10 мМ, и исходные культуральные растворы пептидов были приготовлены путем разведения в среде для культивирования ΑΙΜ-У® до конечной концентрации 5 мкМ в лунке. Для каждого пептида и каждого донора были созданы шестиповторные культуры в плоскодонной 96-луночной плашке. Положительные и отрицательные контрольные культуры также были протестированы в шести повторностях. Кроме того, для каждого донора были проведены по три контроля (КБН белок и пептиды, производные 1РУ и ЕВУ). Для проведения положительного контроля использовался РНА (8щта, Дорсет, Великобритания) в конечной концентрации 2,5 мкг/мл.
Культуры инкубировали в общей сложности 6 дней перед добавлением по 0,75 мкКи 3[Н]-тимидина (Регкш Е1тег®, Биконсфилд, Великобритания) в каждую лунку. Культуры инкубировали в течение 18 ч перед сбором на плоские фильтры с использованием сборщика клеток Тот1ес Масй III. Количество импульсов в минуту (срт) для каждой лунки определяли путем сцинтилляционного подсчета Меййех ™ (Регкш Е1тег®, Биконсфилд, Великобритания) на счетчике М1сгор1а1е Ве1а Соип1ег (Регкш Е1тег®, Биконсфилд, Великобритания) в режиме Рага1их для подсчета при низком фоне.
Для анализа данных был использован порог индекса стимуляции (8Ι) равный или больше 8Ι>2,00 (с учетом пограничных 8Ι>1,90-1,99 ответов). Положительные ответы определяли по статистическим и эмпирическим пороговым значениям.
1. Значение (р<0,05) ответа путем сравнения срт анализируемых лунок с контрольными лунками со средой с использованием непарного ΐ-критерий Стьюдента двух образцов.
2. Индекс стимуляции больше 2. 00 (8Ι>2.00), где 8!=среднее (срт) анализируемых лунок/среднее (срт) контрольных лунок. Данные, представленные подобным образом, обозначаются как 8Ι>2.00, р<0,05.
Кроме того, вариации внутри анализа оценивали путем расчета коэффициента дисперсии (СУ) и стандартного отклонения (8Ώ) исходных данных от повторных культур. Анализ пролиферации проводили на культурах в шести повторах ("нескорректированные данные"). Чтобы убедиться в том, что вариативность результатов одного анализа была низкой, данные были также проанализированы после удаления максимальных и минимальных значений количества импульсов в минуту (срт) ("скорректированные данные"), и индекс стимуляции (8Ι) ответов доноров сравнивали с использованием обоих наборов данных. Т-клеточные эпитопы были определены путем подсчета средней частоты положительных ответов (определено выше) ко всем пептидам в исследовании, плюс стандартное отклонение (8Ώ), чтобы определить уровень фонового ответа. Любой пептид, индуцирующий пролиферативные ответы выше уровня фонового ответа, как в случае со скорректированными данными, так и в случае с нескорректированными данными, рассматривался как тот, который содержит Т-клеточный эпитоп. Когда два перекрывающихся
- 17 030389
пептида индуцируют пролиферативный ответ, Т-клеточный эпитоп рассматривается как находящийся в области перекрытия. На основании этого такие Т-клеточные эпитопы были идентифицированы в тестируемом полипептиде:
Эпитоп 1: СТСОЕТОСУСТХУ (аминокислоты 46-57 из последовательности §ЕЦ ГО № 1).
Эпитоп 2: ΤΕΜΕΟΝΝΚ.ΕΚ.ΝΚ. (аминокислоты 133-144 из последовательности §ЕЦ ГО № 1).
Эпитоп 3: δδΚΆΜΥΏΆΥνΝΟ (аминокислоты 194-205 из последовательности §ЕЦ ГО № 1).
Эпитоп 4: ΡΎΝΆΟΟΟδΟΟΟδ (аминокислоты 214-225 из последовательности §ЕЦ ГО № 1).
Эпитоп 5:§О8ОАМУК§ОКТНТС (аминокислоты 253-267 из последовательности §ЕЦ ГО № 1).
Пример 2: Моделирование мутаций в Т-клеточных эпитопах 4 и 5 с помощью ίη δίΐίοο анализа.
Последовательности пептидов, показавшие положительный результат при Т-клеточном анализе, были проанализированы с использованием перекрывающихся 9-меров из эпитопного домена с помощью Поре™ и ТСЕЭ ™ технологий ίη άΐίοο. [Репу с1 а1., Эгидх КТО. 9(6):385-96 (2008).] Каждый 9-мер был протестирован в базе данных МНС аллелей класса II (34 в общей сложности) и оценивался в соответствии с совместимостью и взаимодействиям с МНС класса II. Кроме того, по каждому 9-меру производился поиск с помощью ВЬА§Т в базе данных известных СГО4+ Т-клеточных эпитопов с целью выявления какой-либо значительной гомологии между последовательностью 9-мера и пептидов из неродственных белков, находящихся в базе данных, которые стимулировали Т-клеточные иммунные ответы в предыдущих исследованиях Т-клеток. На основе информации, полученной от ίη δίΐίοο анализа, были идентифицированы мутации для потенциального устранения СГО4+ Т-клеточной эпитоной активности из выявленных эпитопов.
Эпитоп 5 включает в себя С-конец нативного ΝΣ-СТ богатого на глицин линкера, аминокислоты, кодируемые множественным сайтом клонирования ("МС8") вектора рЕИ8Е, используемого для создания слитого белка Ес-фрагмента человеческого Щ и последовательности Ν1-Ν2 из последовательности §ЕЦ ГО № 1, и Ν-конец домена человеческого Щ Ес. В анализ ίη 8Йюо включены М258 и У259 из последовательности §ЕЦ ГО № 1 в роле якорных последовательностей Р1, ответственных за активность Т-клеток. Исходя из того, что их местоположение находится за пределами Ν1-Ν2 кодирующей области, предполагается, что удаление этих двух аминокислот не приведет к потере функции. Эти две аминокислоты были кодированы сайтом множественного клонирования (МС8). Следовательно, двухцепочная молекула ДНК с модифицированной МС8 и удаленными нуклеотидами, кодирующими М258 и У259 из 8ЕЦ ГО № 1, была создана посредством сайт-специфического мутагенеза с использованием соответствующих олигонуклеотидных праймеров. Затем последовало реклонирование полученной путем мутагенеза последовательности ДНК обратно в вектор рЕИ8Е с использованием сайтов рестрикции ЕсоЫ и В§1П в МС8. В результате был получен зрелый (с недостающей сигнальной последовательностью) слитый белок без М258 и У259. Его аминокислотная последовательность приведена в §ЕЦ ГО № 2 и кодируется §ЕЦ ГО № 5. В нижеприведенном анализе данный слитый белок сохранил такую же способность к связыванию бета-амилоида, как и слитый белок §ЕЦ ГО № 1.
Эпитоп 4 перекрывает Ν2 домен и нативный богатый на глицин линкер. Кристаллическая структура белка д3р (не показано) дает основание предполагать, что эпитоп 4 расположен вдали от области связывания амилоида и, следовательно, может быть устойчивым к аминокислотным заменам без утраты активности. У215 (8ЕЦ ГО № 2), которая была идентифицирована как Р1 якорь, поверхностно воздействует со слабой ориентацией боковой цепи по направлению к белковой сердцевине. Структурный анализ показывает, что любая замена У215, описанная в табл. 6 и 7, приводит к удалению эпитопа. Кроме того, любая другая замена аминокислоты из состава этого эпитопа, описанная в табл. 6 и 7, также должна быть согласована. Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая Ν1-Ν2-ί§ Ес, содержащая замену У215А (8ЕЦ ГО № 6) была получена из 8ЕЦ ГО № 5 посредством сайт-специфического мутагенеза с использованием соответствующих олигонуклеотидных праймеров. Анализ связывания показал, что полученный зрелый слитый белок (8ЕЦ ГО № 3) демонстрирует увеличенную способность к связыванию с бета-амилоидом по сравнению со слитым белком, имеющим аминокислотную последовательность §ЕЦ ГО № 1 или §ЕЦ ГО № 2. Последовательность нуклеиновой кислоты §ЕЦ ГО № 6 использовали в качестве исходной последовательности для создания генов, включающих все модификации в эпитопах 1, 2 и 3.
Пример 3. Моделирование мутаций в Т-клеточных эпитопах 1, 2 и 3 в анализе ίη 8Йюо.
Эпитоп 1 находится рядом с С-концом предполагаемой части Ν1-Ν2, связывающей бета-амилоид. Ш 81Йсо анализ эпитопа 1 выделил аминокислоты 48-56 из 8ЕЦ ГО № 1 как область замены аминокислот и удаления Т-клеточного эпитопа. Аминокислоты, входящие в этой 9-мер, были выбраны для замены на основе свойств существующей аминокислоты, выдержки поверхности и взаимодействия с амилоидсвязывающей области д3р, как видно из кристаллической структуры д3р, полученной с помощью рентгеновского излучения. В частности, 048, Т51, Т56 и Υ54 были выбраны для замены с изменениями, указанными в табл. 1. Другие потенциальные аминокислотные замены в этой области изложены в табл. 2.
ГТоре анализ эпитопа 2 показал, что аминокислоты 135-143 из 8ЕЦ ГО № 1, могут быть выбраны в качестве цели для уменьшения или удаления этого эпитопа. На основе кристаллической структуры, полученной с помощью рентгеновского излучения, аминокислоты 136-139 из 8ЕЦ ГО № 1, формируют петлевой регион, который образует связи с шарнирным участком Ν1-Ν2 и, следовательно, может быть важ- 18 030389
ным для процесса амилоидного связывания.
Изменения этих аминокислот являются менее предпочтительными, и они представлены только в табл. 2. Более предпочтительными являются изменения, касающиеся М135, К140, Р141 и N143, и изложены в табл. 1. Другие потенциальные изменения в области этих девяти аминокислот приведены в табл. 2.
С помощью ίη δΐίΐοο анализа аминокислоты 173-182 из 8ЕО ГО № 1 были идентифицированы в эпитопе 3 в качестве мишеней для замены. Поскольку эпитоп 3 находится в альфа-спиральной части домена Ν2, стратегия заключалась в том, чтобы избежать введения гидрофобных остатков и небольших полярных незаряженных остатков. Кроме того, мы хотели избежать введения полярных и кислотных остатков вблизи С-конца этого эпитопа. На основе результатов рентгеновской кристаллографии мы ориентировались на 8173, Ό174, Ό178, М176 и А182 для осуществления замены с изменениями, которые указаны в табл. 1. Другие потенциальные аминокислотные замены в этой области изложены в табл. 2.
Пример 4. Получение последовательностей полипептидов, состоящих из Ν1-Ν2последовательностей и Рс-фрагмента человеческого ЦС. имеющих Т-клеточные эпитопы со сниженной иммуногенностью.
Было получено пятьдесят восемь различных молекул нуклеиновых кислот, каждая из которых кодирует слитый белок Рс-фрагмента человеческого ЦС и последовательности Ν1-Ν2, содержащие различные одиночные аминокислотные замены, приведенные в табл. 3. Это было достигнуто путем сайтспецифического мутагенеза 8Е0 ГО № 6 с использованием соответствующих олигонуклеотидных праймеров для внедрения желаемой замены с последующим реклонированием ПЦР-амплифицированой измененной в результате мутагенеза последовательности в вектор рРи§Е-Ы§С1-РС2 Отауодеп®, Тои1ои5е, Ргапсе, Каталог № рГи5е-Нд1Гс2).
Гены, кодирующие данные "деиммунизированные" Рс-слитые полипептиды, были временно экспрессированы в отдельных рРи§Е-Ы§С1-РС2 векторах в Ргее81у1е 293-Р клетках ЦпуЬгодеп, Пейсли, Шотландия, каталог № К790-07). В день трансфекции клетки разводили до 1х106/мл в Ргее81у1е 293клеточной питательной среде ЦпуЬгодеп, каталог № 12338), обеспечивая жизнеспособность более 90%. Плазмидную ДНК и полиэтиленимин (РЕ0 разводили отдельно в ОрЬтет ЦпуЬгодеп, каталог № 31985) и инкубировали в течение 5 мин, после чего к ДНК медленно добавляли РЕЕ и смесь ДНККЫ инкубировали в течение 5 мин при комнатной температуре. После инкубации смесь ДНК/ΡЕI по каплям, вращая при этом колбу, добавляли к 293-Р клеткам. Трансфицированные культуры инкубировали при 37°С, 8% СО2 на платформе орбитального шейкера, вращающегося со скоростью 135 об/мин в течение 6-7 дней, после чего они были собраны.
Среду для культивирования, содержащую полипептид, собирали посредством центрифугирования и доводили рН с помощью 10х ΡΒ8. Белки связывали с гранулами протеин А-сефарозы (Рго1еш А 8ерНаго5е) (8щта, Дорсет, Великобритания) путем перемешивания вращательными движениями в течение ночи при 4°С. Гранулы дважды промывали 1х РВ8 и переносили на центрифужную колонку §1§таРгер (8щта). Образцы элюировали с помощью центрифугирования с использованием 0,1М глицинового буфера, рН 3,0 и нейтрализовали в пробирке для сбора образцов с использованием 1/10 объема 1М Тп5-НС1 буфера, рН 8,0. Элюаты помещали в однократный РВ8 буфер, используя 2 мл 2еЪа8рш колонки (Пирс, Крамлингтон, Великобритания, каталог № 89890). Образцы стерилизовали посредством фильтрации и для каждого образца измеряли показатель поглощения при 280 нм.
Пример 5. Анализ связывание бета-амилоида деиммунизироваными полипептидами.
A. Приготовление бета-амилоидных (Ав) фибрилл.
Ав42 (1 мг, гРерЬбе А-1002-2) растворяли в гексафторизопропаноле (НЕГО 1 мл), тщательно перемешивали и инкубировали при комнатной температуре в течение 2-18 ч до появления прозрачного раствора. Аликвоты (100 мкл, 100 мкг) помещали в 1,5 мл пробирки типа Эппендорф и сушили под вакуумом (8рееб Уас, ЕррепбогГ, С’опсеШгаЮг 5301) в течение 2-3 ч. Полученные мономеры ресуспендировали в 20 мкл ДМСО, пипетировали и тщательно перемешивали до полного растворения. Раствор разбавляли с помощью 260 мкл раствора 10 мМ НС1 (конечная концентрация Ав42 составляет 80 мкМ) и перемешивали в течение 20 с. Прозрачный раствор инкубировали (без встряхивания) в течение 3 дней при 37°С для обеспечения агрегации.
Для использования в анализе, Ав42 из полученного стокового раствора разбавляли в 50 раз с помощью фосфатно-солевого буферного раствора (РВ8) до конечной концентрации 1,6 мкМ.
B. Приготовление планшета для ЕЫ8А.
В каждую лунку 96-луночного планшета (Р96 МАХЕОКР NυNС-IΜΜυNО РЬАТЕ; Са!а1од питЪег: 442404, Ьо1 125436 и 128158; Дания) добавляли 200 мкл 1%-го раствора бычьего сывороточного альбумина (В8А). Планшеты герметизировали и инкубировали при 7°С в течение 3 ч. После этого планшеты промывали с помощью РВ8 (250 мкл/лунку)х3. Мы добавили 50 мкл разбавленного раствора Ав42 фибрилл (1,6 мкМ) в каждую лунку, не накрывали планшет и инкубировали при 37°С в течение ночи для завершения сушки. РВ8 (50 мкл/лунку) добавляли в контрольные лунки (без Ав42 фибрилл). После этого планшеты промывали два раза водой и один раз РВ8 (250 мкл/лунку для каждой промывки).
- 19 030389
С. ЕЫ8А анализ.
Различные концентрации каждого полипептида (а также полипептида ВЕР ΙΌ № 3) в объеме 50 мкл добавляли в каждую лунку, а также в лунки, не содержащие Αβ42 фибрилл, и инкубировали в течение 1 ч при 37°С. Затем планшеты промывали 3 раза с помощью РВЗ-Т (0,05% Т^ееп 20 в РВЗ) и 3 раза с помощью РВЗ (250 мкл/лунку для каждой промывки). Затем мы добавили 50 мкл НКР-конъюгированного козьего античеловеческого анти-Рс (1аск§оп БаЬ§, номер по каталогу 109-035-008, номер партии 106617), разведенного 1:2500 (0,32 г/мл конечная концентрация) в РВВ-Т + 1% молоко (Όΐί<20™ ΒΕίηι МПк, Бектон, Эшктзоп апб Сотрапу. США, номер каталога 232100, номер партии 7320448) в каждую лунку и инкубировали 40 мин при 37°С. Затем планшеты промывали 6 раз с помощью РВЗ-Т и 2 раза с помощью РВЗ (250 мкл/лунку для каждой промывки). Затем мы добавили 50 мкл/лунку раствора ОЕ1) (15 мг/7,5 мл 0,05М цитратного буфера рН 5,5 на 3 мкл Н2О2) и ожидали 3-6 мин до развития цветной реакции. Затем для остановки данной реакции мы добавили 25 мкл/лунку 4Н раствора НС1. При 492 и 405 нм измеряли показатель поглощения образцов, находящихся в планшетах. Значение показателя поглощения при 405 нм вычиталось из значения при 492 нм, результаты графически представлялись в виде функции концентрации полипептида. Затем для каждого деиммунизированого полипептида вычисляли концентрацию полумаксимального ингибирования (1С50) и сравнивали с 1С50, рассчитанной для полипептида ВЕС) ΙΌ №
3. Результаты представлены ниже в табл. 9.
Таблица 9
Относительное изменение показателя бета-амилоидного связывания 1С501 для полипептидов с одним дополнительным замещением аминокислоты в эпитопе 1, 2 или 3 по сравнению с полипептидом ВЕС) ΙΌ № 3
Эпитоп 1 О48Н 1,8
Эпитоп 1 О48К 1Д
Эпитоп 1 О48К 1,9
Эпитоп 1 0488 1,2
Эпитоп 1 О48Т 1,0
Эпитоп 1 Т51О 0,8
Эпитоп 1 Т51Н 1,5
Эпитоп 1 Т51К 2,5
Эпитоп 1 Т51Р 0,2
Эпитоп 1 Т51К 2,0
Эпитоп 1 Τ51ζ) 0,8
Эпитоп 1 Τ51Ν 0,5
Эпитоп 1 Υ54Ο 0,02 / 0,2
Эпитоп 1 Υ54Η 0,3
Эпитоп 1 Υ54Κ 0,13/0,32
Эпитоп 1 Υ54Ρ 0,07
Эпитоп 1 Υ54Κ 0,15/0,25
Эпитоп 1 Т56О 0,1
Эпитоп 1 Т56Н 0,47 / 0,77
Эпитоп 1 Т56К 0,5 / 0,66
Эпитоп 1 Т56Р 0,1/0,09
Эпитоп 1 Т56К 0,8
Эпитоп 2 М135А 0,4
Эпитоп 2 М135Б 0,5
Эпитоп 2 М135О 0,2
Эпитоп 2 М135Н 0,1
Эпитоп 2 М135К 0,4 / 0,2
Эпитоп 2 Μ135Ν 0,3
Эпитоп 2 М135К 0,1
Эпитоп 2 М135Т 0,14/0,3
Эпитоп 2 К140А 0,2
Эпитоп 2 К140Б 0,3
Эпитоп 2 К140Е 0,3
Эпитоп 2 К1400 0,2
Эпитоп 2 К140Н 0,2
Эпитоп 2 К 140ф 0,28 / 0,22
Эпитоп 2 Р141Б 0,2
Эпитоп 2 Р141Е 0,2
Эпитоп 2 N143 А 1,9/1,1
Эпитоп 2 N1430 0,19/0,08
Эпитоп 3 81730 0,2
- 20 030389
Эпитоп 3 5173Р 0,4
Эпитоп 3 М176О 0,3
Эпитоп 3 М176Н 0,4
Эпитоп 3 М176К 0,2
Эпитоп 3 Μ176Ν 0,5
Эпитоп 3 В178О 0,2
Эпитоп 3 Β178Ν 0,5 / 0,4
Эпитоп 3 В1780 0,6
Эпитоп 3 В1785 0,3
Эпитоп 3 5У181О 0,5
Эпитоп 3 5У181Н 0,47 / 0,87
Эпитоп 3 5У181К 0,3
Эпитоп 3 5У181К 0,5/0,8
Эпитоп 3 δ173К 0,17/0,07
Эпитоп 3 К174К 1,2 /1,0
Эпитоп 3 М176К 0,2
Эпитоп 3 В178Т 0,4
* Цифры отражают 1С50 (замененного полипептида)/1С50 (полипептида ВЕО ГО № 3).
Множественные значения отражают результаты повторных исследований в анализе связывания.
Пример 6. Анализ СЭ4+ Т-клеточных иммунных ответов цельного белка.
Для того чтобы проанализировать СС)4· Т-клеточные иммунные ответы любого полипептида изобретения по сравнению с ВЕР ГО № 1, был выполнен Т-клеточный анализ цельного белка. МКПК выделяли из лейкоцитарных пленок, взятых у 20 здоровых людей доноров и обработанных, как описано на примере 1. МКПК восстанавливали после замораживания в культуральной среде ΑΙΜ-У® и СП14- клетки выделяли с помощью МШепу1 СГО14 МюгоЪеабз и СВ колонок (Μίΐΐοηχ'ί ВкЯесЕ, Оксфорд, Великобритания). Моноциты ресуспендировали в ΑΙΜ-У® с добавлением 1000Ю/мл ГО-4 и 1000Ю/мл ОМ-СВР ("культуральная среда ЭС"), до показателя 4-6х106 МКПК/мл, а затем распределяли по 24-луночных планшетам (конечный объем культуры 2 мл). На 2-й день клетки подпитывали путем замены половины объема культуральной среды. К 3-му дню моноциты дифференцировались в незрелые дендритные клетки (ДК), которые предварительно инкубировали с антигенами, содержащими или 40 мкг/мл тестируемого полипептида, или 40 мкг/мл полипептида ВЕР ГО № 1 и 100 мкг/мл КБН, или только культуральную среду. Незрелые ДК инкубировали с антигеном в течение 24 ч, после чего избыток антигена удаляли путем двухкратного промывания клеток и ресуспендирования в культуральной среде для ДК, содержащей 50 нг/мл ΤΝΡ-α (Рерго1есЬ, Лондон, Великобритания). На 7 день дендритные клетки подпитывали путем замены половины объема культуральной среды для ДК, содержащей 50 нг/мл ΤΝΡα, и на 8 день собирали зрелые ДК. Собранные зрелые ДК подсчитывали и оценивали их жизнеспособность путем измерения вытеснения красителя трипанового синего. Затем ДК подвергали γ-облучению (4000 рад) и ресуспендировали в ΑΙΜ-У культуральной среде до концентрации 2х105 клеток на 1 мл перед проведением Тклеточных пролиферативных тестов и ЕС1Вро1 анализа, как изложено ниже. Кроме того, на 8-й день также были подготовлены свежие СО4+ Т-клетки. Для очистки СО4+ Т-клеток МНПК восстанавливали в ΑΙΜ-У® культуральной среде и СС)4· клетки выделяли с использованием СГО4 Μΐΐ^^ΐ Μ^с^оЪеаά8 и ЕВ колонок (Μΐ1ΐΌ^ΐ Вю1есЬ, Оксфорд, Великобритания) и ресуспендировали в ΑΙΜ-У® культуральной среде до концентрации 2х10 клеток/мл.
На 8-й день был проведены Т-клеточные пролиферативные тести в которых в 96-луночном планшете с ϋ-подобным дном 1х105 аутологичных СЛ)4- Т-клеток добавляли к 1х 10 загруженным антигеном ДК (в соотношении 10:1) и доводили конечный объем в каждой лунке до 200 мкг/мл с помощью культуральной среды ΑΙΜ-У®. На 14-й день аналитические планшеты импульсно метили с использованием 1иС1 [3Н] (Регкт Е1тег, Беконсфилд, Великобритания) на каждую лунку в 25 мкл ΑΙΜ-У® в течение 6 ч перед сбором клеток на плоские фильтры (Регкт Е1тег) с использованием сборщика клеток Тот1ес ΜαΗι ΙΙΙ (Натбеп СТ, США). Все полипептиды были протестированы в культурах в шести повторах. Количество импульсов в минуту (срт) для каждой лунки определяли путем сцинтилляционного подсчета ΜχΊΐίΕχ131 (Регкт Е1тег) на счетчике 1450 \ЛсгоЪе1а \С'а11ас Тп1их Εκμικί ВстШ1а1юп Соип1ег (Регкт Е1тег) в режиме Рага1их для подсчета при низком фоне. Количество импульсов в минуту для каждого антигена приводили к контролю, который представлял собой только культуральную среду ΑΙΜ-У®.
Для анализов ЕЫВРОТ планшеты ЕЫВРОТ (Μ^11^ро^е, Уотфорд, Великобритания) покрывали иммобилизованным антителом ГО-2 (Κ&Ό Ву§1ет§, Абингдон, Великобритания) в расчете по 100 мкл/лунку в РВВ буфере. Затем планшеты дважды промывали РВВ буфером, инкубировали в течение ночи в блок- 21 030389
буфере (1% В8А (81дта) в РВ8) и промывали в культуральной среде А1М-У®. На 8-й день в 96луночные планшеты ЕЫ8РОТ добавляли 1x10 аутологичных ΟΌ4+ Т-клеток и 1х104 ДК, загруженных антигеном (в соотношении 10:1). Все полипептидные композиции были протестированы в культурах в шести повторах. Для каждого донора МКПК также проводили негативный контроль (только культуральна среда ΑΙΜ-У®), контроль без клеток и РНА (10 мкг/мл) положительный контроль.
После еще одного 7-дневного инкубационного периода планшеты ЕЫ8РОТ были подданы трем последовательным промывкам в РВ8 и 6Н2О перед добавлением 100 мкл отфильтрованных биотинилированных детекторных антител (Κ&Ό 8уз1ет8, АЪтдбоп, ЦК) в РВ8/1% В8А. После инкубации при 37°С в течение 1,5 ч планшеты дополнительно промывали три раза в РВ8 и добавляли 100 мкл отфильтрованного стрептавидин-АР (Κ&Ό 8у81етз) в РВ8/1% В8А для инкубации в течение 1 ч (при комнатной температуре). Стрептавидин-АР удаляли и планшеты четыре раза промывали РВ8-буфером. ВСГРМВТ (Κ&Ό 8у81етз) добавляли в каждую лунку и инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре. Развитие пятен останавливали путем трехкратного промывания 6Н2О лунок и задних стенок лунок. Сухие планшеты сканировались с помощью 1ттипо5сап ™ Апа1узег, и определяли пятна в лунке (8Р^), используя программное обеспечения 1ттипозсап ™ версия 4.
И для анализа пролиферации, и для II .-2 ЕЫ8ро1 анализа результаты выражали в виде индекса стимуляции (8Ι), который определялся как отношение количества импульсов в минуту (анализ пролиферации) или пятен (ЕЫ8ро1 анализ) тестируемого полипептида только к контрольной среде культивирования, используя порог индекса стимуляции (8Ι), равный или больше 2 (8Ι>2.0) для положительных Тклеточных ответов.
Пример 7. Моделирование двойных или тройных мутаций в двух или более Т-клеточных эпитопах 1, 2 и 3.
На основании результатов анализа связывания в эпитопах 1, 2 и 3 были выбраны такие замены, которые должны присутствовать в полипептидах, которые содержат две аминокислотные замены по сравнению с 81:0 ΙΌ № 3, каждая замена в другом эпитопе.
Таблица 10
Аминокислотные замены для вариантов, содержащих две или три эпитопные модификации
Эпитоп Аминокислота Оригинальная аминокислота в 8ЕО Ш N0:3 Замененные аминокислоты
1 54 Υ К, К
1 56 Т Н, К
2 135 м к,т
2 140 к Ω
3 174 к к
3 178 ϋ N
3 181 λν н,к
Молекулы ДНК, кодирующие слитые белки Рс-фрагмента человеческого Ιμίΐ и последовательности Ν1-Ν2, имеющие по две аминокислотные замены в различных эпитопах (описаны в табл. 10), были получены посредством сайт-специфического мутагенеза соответствующих исходных ДНК (как правило, ДНК для одой или двух мутаций подготавливали, как изложено в примере 3). Полученные молекулы ДНК, кодирующие данные слитые белки, были использованы для трансформации клеток, экспрессированы и очищены, как описано в примере 4, а также тестировались на связывание, как описано в примере 5. Полипептиды, имеющие одну замену в каждом из эпитопов 1, 2 и 3, были затем разработаны на основе результатов анализа связывания полипептидов, имеющих две аминокислотные замены. Полипептиды, имеющие одну замену в каждом из эпитопов 1, 2 и 3, анализировали как на связывание с бетаамилоидом, так и на наличие Т-клеточного иммунного ответа, как изложено в примере 6. В частности, нижеописанные двойные и тройные варианты эпитопов были получены путем замены определенных аминокислот в 8Ι:Ο ΙΌ № 3 или 8Ι:Ο ΙΌ № 7, как показано в табл. 11.
- 22 030389
Таблица 11
Полипептиды изобретения с двойными или тройными эпитопными вариантами
Номер полипептида. Стартовая последовательность Замена в эпитопе 1 Замена в эпитопе 2 Замена в эпитопе 3
63 8 Ер ГО №: 3 Υ54Κ М135К
64 8 Ер ГО №; 3 Υ54Κ М135Т
65 8Ер ГО №: 3 Υ54Κ К440Р
66 8Ер ГО №: 3 Υ54Κ М135К
67 8Ер ГО №: 3 Υ54Κ М135Т
68 8Ер ГО №: 3 Υ54Κ К440Р
69 8Ер ГО №: 3 Т56Н М135К
70 8Ер ГО №: 3 Т56Н М135Т
71 8Ер ГО №: 3 Т56Н К440Р
72 8Ер ГО №: 3 Т56К М135К
73 8Ер ГО №: 3 Т56К М135Т
74 ЗЕр ГО №; 3 Т56К К140р
75 ЗЕр ГО №: 3 Υ54Κ Ό178Ν
76 ЗЕр ГО №: 3 Υ54Κ А181Н
77 8Ер ГО №: 3 Υ54Κ А181К
78 8Ер ГО №: 3 Υ54Κ К174К
79 ЗЕр ГО №; 3 Υ54Κ ϋ178Ν
80 8Ер ГО №: 3 Υ54Κ А181Н
81 8Ер ГО №: 3 Υ54Κ А181К
82 8Ер ГО №: 3 Υ54Κ К174К
83 8Ер ГО №: 3 Т56Н Ό178Ν
84 8Ер ГО №: 3 Т56Н А181Н
85 8Ер ГО №: 3 Т56Н А181К
86 8Ер ГО №: 3 Т56Н К174К
87 8Ер ГО №: 3 Т56К Ό178Ν
88 8Ер ГО №: 3 Т56К А181Н
89 8Ер ГО №: 3 Т56К А181К
90 8Ер ГО №: 3 Т56К К174К
91 8Ер ГО №: 3 М135К Ό178Ν
92 8Ер ГО №: 3 М135К А181Н
93 8Ер ГО №: 3 М135К А181К
94 8Ер ГО №: 3 М135К К174К
95 8Ер ГО №: 3 М135Т Ό178Ν
96 8Ер ГО №: 3 М135Т А181Н
97 8Ер ГО №: 3 М135Т А181К
98 8Ер ГО №: 3 М135Т К174К
99 8Ер ГО №: 3 К440Р Ό178Ν
- 23 030389
100 δΕΟ ГО № 3 К140Ц 5Υ181Η
101 ЗЕр ГО № 3 К140Ц 5У181К.
102 δΕΟ ГО № 3 К140Ц К174К
по δΕΟ ГО № 7 Т56Н М135К Ό178Ν
111 δΕΟ ГО № 7 Т56Н М135К 5Υ181Η
112 δΕΟ ГО № 7 Т56Н М135К 3Υ181Κ
113 δΕΟ ГО № 7 Т56Н М135К К174К
114 δΕΟ ГО № 7 Т56Н М135Т Ό178Ν
115 δΕΟ ГО № 7 Т56Н М135Т 5Υ181Η
116 δΕΟ ГО № 7 Т56Н М135Т 3Υ181Κ
117 δΕΡ ГО № 7 Т56Н М135Т Κ174Κ
118 δΕρ ГО № 7 Т56К М135К Ό178Ν
119 δΕρ ГО № 7 Т56К М135К 5Υ181Η
120 δΕρ ГО № 7 Т56К М135К 5Υ181Κ
121 δΕρ ГО № 7 Т56К М135К Κ174Κ
122 δΕρ ГО № 7 Т56К М135Т Ό178Ν
123 δΕρ ГО № 7 Т56К М135Т 5Υ181Η
124 δΕρ ГО № 7 Т56К М135Т 3Υ181Κ
125 δΕρ ГО № 7 Т56К М135Т Κ174Κ
126 δΕρ ГО № 7 Υ54Κ М135К Κ174Κ
127 δΕρ ГО № 7 Υ54Κ М135Т Κ174Κ
128 δΕρ ГО № 7 Υ54Κ М135К Κ174Κ
129 δΕρ ГО № 7 Υ54Κ М135Т Κ174Κ
130 δΕρ ГО № 7 Т56Н Ό178Ν
131 δΕρ ГО № 7 Т56Н 5Υ181Η
132 δΕρ ГО № 7 Т56Н 3Υ181Κ
133 δΕρ ГО № 7 Т56Н Κ174Κ
134 δΕρ ГО № 7 Т56К Ό178Ν
135 δΕρ ГО № 7 Т56К 5Υ181Η
136 δΕρ ГО № 7 Т56К 5Υ181Κ
137 δΕρ ГО № 7 Т56К Κ174Κ
Указанные выше полипептиды анализировали на связывание с бета-амилоидом посредством ΕΗδΑ анализа, как изложено в примере 5. Результаты изложены в табл. 12 и 13. Относительные значения связывания отражают показатель 1С50 (полипептид δΕΟ ΙΌ № 3)/1С50 (тестируемого полипептида) (например, чем ниже значение данного показателя, тем большим связыванием характеризуется полипептиды по сравнению с полипептидом δΕΟ ΙΌ № 3). Множественные значения отражают результаты повторных исследований в анализе связывания.
Таблица 12
Относительные значения связывания полипептида δΕΟ ΙΌ № 3 в сравнении с типовыми полипептидами изобретения
Номер полипепти да. Относитель ное значение связывания
63 0,12
64 0,14
65 0,18
66 0,08
67 0,1
68 0,19
69 0,29, 0,37
70 0,43, 0,45
71 0,42
72 0,40, 0,27
73 0,25, 0,39
74 0,26
75 0,11
76 0,13
77 0,18,0,16
78 0,24, 0,20
79 0,08
80 0,16
- 24 030389
81 0,14
82 0,2
83 0,18,0,36
84 0,26, 0,48
85 0,24, 0,79
86 0,51, 1,08
87 0,51,0,83
88 0,65, 1,30
89 0,71, 1,05
90 1,43, 1,64
91 0,14
92 0,24
93 0,34
94 0,53, 0,48
95 0,07
96 0,15
97 0,14
98 0,21,0,61
99 0,11
100 0,36
101 0,2
102 0,23
Таблица 13
Относительные значения связывания полипептида ВЕС) 10 № 7 в сравнении с типовыми полипептидами изобретения
Номер полипепти да. Относитель ное значение связывания
110 0,671
111 0,348
112 0,564
113 0,407
114 0,447
115 0,871
116 0,7
117 0,913
118 0,35
119 0,63
120 0,755
121 0,488
122 0,493
123 0,88
124 0,538
125 0,575
126 0,391
127 0,44
128 0,72
129 0,648
Пример 8. Анализ на замедление на ацетатцеллюлозном фильтре.
Данный анализ был проведен для контроля над процессом дестабилизации (дезагрегации) или перестройки амилоидных волокон в неамилоидогенные или растворимые агрегаты. Метод данного анализа главным образом был взят из Сйапд, Е. апб Киге!, I., Апа1 Вюсйет 373, 330-6, (2008) и \Уапкег, Е.Е. е! а1., МеЙюсЕ Еп/уто1 309, 375-86, (1999). В частности, 2,5 мкМ препараты ίΑβ амилоидных волокон предварительно инкубировали с различными концентрациями слитых полипептидов из изобретения (от 1 нМ до 2 мкМ) при 37°С в течение 3 дней. После инкубации волокна с и без слитого полипептида разводили и наносили на ацетатцеллюлозные мембраны и помещали на вакуумные блоты. Мембраны интенсивно промывали РВ8-буфером и зондировали специфичным к Ν-концу Ав антителом в течение 1 ч. НКРконъюгированные вторичные антитела были использованы для подсчета фибриллярных агрегатов, оставшихся на мембране. Цвет пятен был проанализирован и оцифрован с помощью денситометрического
- 25 030389
сканера. Показатель ЕС50 (полумаксимальная эффективная концентрация вещества) вычислялся на основе интенсивности сигнала каждого пятна относительно концентрации слитого полипептида, добавленного в каждую пробу.
Когда полипептид из ЗЕР ГО № 3 тестировали вышеописанным способом, показатель ЕС50 составлял выше 2 мкМ, что указывает на низкую дезагрегационную активность данного полипептида. Полипептиды из ЗЕО ГО № 1 и ЗЕС) ГО № 7 также были испытаны в этом анализе, и каждый продемонстрировал ЕС50, равный 100 нМ, что указывает на значительную дезагрегационную активность. Исходя из данного результата, все последующие пронумерованные полипептиды после полипептида 102, в том числе все варианты полипептидов, имеющие деиммунизированные замены в каждом из эпитопов 1, 2 и 3, были созданы с использованием полипептида ЗЕР ГО № 7 как исходной аминокислотной последовательности для последующего процесса модификации. Значения ЕС50 для исследованных полипептидов приведены ниже в табл. 14.
Таблица 14
Дезагрегационное действие типовых вариантов полипептидов, являющихся предметом изобретения, в отношении амилоидных фибрилл ίΛβ
*нд = интервал концентраций полипептида, который не анализировался для определения ЕС50.
При тестировании самые высокие концентрации данных пептидов не демонстрируют достоверные значения ЕС50.
Как видно из приведенных выше примеров, все варианты полипептидов изобретения демонстрируют связывание с Ав, как и было установлено с помощью анализа ЕЫЗА. Большинство протестированных вариантов полипептидов также демонстрировали дезагрегацию Ав, что и было установлено дотблот-анализом.

Claims (3)

  1. <claim-text>ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ</claim-text> <claim-text>1. Полипептид, содержащий вариант исходной аминокислотной последовательности, причем исходная аминокислотная последовательность выбрана из аминокислот 1-217 из ЗЕЕ) ГО № 1, аминокислот</claim-text> <claim-text>- 26 030389</claim-text> <claim-text>1-217 из 8РС) ΙΌ № 3 и аминокислот 1-217 из 8РС) ΙΌ № 7, причем</claim-text> <claim-text>(а) вариант имеет 1-9 аминокислотных замен по сравнению с исходной аминокислотной последовательностью, причем каждая аминокислотная замена выбрана из группы аминокислотных замен, изложенных ниже</claim-text> <table border="1"> <tr><td> Аминокислота №:</td><td> Аминокислота присутствующая в исходной аминокислотной последовательности</td><td colspan="7"> Аминокислотные замены</td></tr> <tr><td> 48</td><td> С</td><td> н,</td><td> к,</td><td> к,</td><td> з,</td><td> Т,</td><td> О,</td><td> Р</td></tr> <tr><td> 50</td><td> Е</td><td> с,</td><td> Н,</td><td> К,</td><td> р,</td><td> к</td><td> </td><td> </td></tr> <tr><td> 51</td><td> Т</td><td> с, И</td><td> Н,</td><td> К,</td><td> Н,</td><td> р,</td><td> &lt;2,</td><td> Ν,</td></tr> <tr><td> 53</td><td> С</td><td> Е, Υ</td><td> Н,</td><td> К,</td><td> Ν,</td><td> 0,</td><td> Н,</td><td> И,</td></tr> <tr><td> 54</td><td> Υ</td><td> с,</td><td> н,</td><td> к,</td><td> К,</td><td> Р</td><td> </td><td> </td></tr> <tr><td> 56</td><td> Т</td><td> с,</td><td> н,</td><td> к,</td><td> К,</td><td> Р</td><td> </td><td> </td></tr> <tr><td> 135</td><td> М</td><td> А, к,</td><td> О, С,</td><td> С, Е,</td><td> К, р,</td><td> Ν, 0&gt;,</td><td> Т, 3</td><td> н,</td></tr> <tr><td> 137</td><td> &lt;2</td><td> о,</td><td> Е</td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td></tr> <tr><td> 138</td><td> N</td><td> о, Т</td><td> Е,</td><td> с,</td><td> н,</td><td> р,</td><td> &lt;2,</td><td> з,</td></tr> <tr><td> 140</td><td> К</td><td> О, Ν,</td><td> Е, Р,</td><td> Н, 3,</td><td> &lt;2, Υ</td><td> А,</td><td> с,</td><td> м,</td></tr> <tr><td> 141</td><td> Е</td><td> о,</td><td> Е</td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td></tr> <tr><td> 143</td><td> N</td><td> А,</td><td> С</td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td></tr> <tr><td> 173</td><td> 3</td><td> с,</td><td> Р,</td><td> К,</td><td> О,</td><td> Н,</td><td> Н,</td><td> т</td></tr> <tr><td> 174</td><td> К</td><td colspan="7"> К</td></tr> <tr><td> 175</td><td> А</td><td> с,</td><td> н,</td><td> к,</td><td> Р,</td><td> к</td><td> </td><td> </td></tr> <tr><td> 176</td><td> М</td><td> с, и</td><td> н,</td><td> К,</td><td> Ν,</td><td> Н,</td><td> Р,</td><td> а,</td></tr> <tr><td> 178</td><td> Б</td><td> с,</td><td> Ν,</td><td> 0,</td><td> з,</td><td> Т,</td><td> Е,</td><td> Н,</td></tr> <tr><td> </td><td> </td><td> К,</td><td> н,</td><td> и,</td><td> Υ</td><td> </td><td> </td><td> </td></tr> <tr><td> 179</td><td> А</td><td> Н,</td><td> к,</td><td> р,</td><td> к</td><td> </td><td> </td><td> </td></tr> <tr><td> 181</td><td> И</td><td> с,</td><td> н,</td><td> К,</td><td> Н,</td><td> Р</td><td> </td><td> </td></tr> </table> <claim-text>причем когда исходная аминокислотная последовательность представляет собой аминокислоты 1217 из 8РС) ΙΌ № 1, любая из 1-9 аминокислотных замен дополнительно выбрана из группы, состоящей из ν215δ, ν215Τ, У215С, ν215Ό, ν215Ε, ν215Ρ, ν215Η, ν215Κ, ν215Ν, ν215Ρ, ν215Θ и ν215Κ; и</claim-text> <claim-text>(Ь) вариант в случае необходимости дополнительно включает одно или более из следующих изменений по сравнению с исходной аминокислотной последовательностью:</claim-text> <claim-text>(ΐ) замена ννν в аминокислотах 43-45 на ААА;</claim-text> <claim-text>(ίί) замена С53№;</claim-text> <claim-text>(ίίί) удаление аминокислот 96-103;</claim-text> <claim-text>(ίν) замена ΟΡΡ в аминокислотах 212-214 на АОА;</claim-text> <claim-text>(ν) замены Ш181А. Р190А и Р194А;</claim-text> <claim-text>(νί) удаление аминокислоты 1 и</claim-text> <claim-text>(νΐΐ) удаление аминокислот 1 и 2;</claim-text> <claim-text>и причем полипептид связывается и/или дезагрегирует амилоид,</claim-text> <claim-text>полипептид имеет пониженную иммуногенность по сравнению с полипептидом, содержащим исходную аминокислотную последовательность.</claim-text> <claim-text>2. Полипептид по п.1, отличающийся тем, что каждая из 1-9 аминокислотных замен с исходной аминокислотной последовательностью выбрана из группы аминокислотных замен, изложенных ниже</claim-text> <claim-text>- 27 030389</claim-text> <table border="1"> <tr><td> Аминокислота №:</td><td> Аминокислота присутствующая в исходной аминокислотной последовательности</td><td> Аминокислотные замены</td></tr> <tr><td> 48</td><td> С</td><td> Н, К, К, 3, Т</td></tr> <tr><td> 51</td><td> Т</td><td> 6, Н, К, К, Р,
  2. (2, N</td></tr> <tr><td> 54</td><td> Υ</td><td> 6, Н, К, К, Р</td></tr> <tr><td> 56</td><td> Т</td><td> 6, Н, К, К, Р</td></tr> <tr><td> 135</td><td> М</td><td> Α, ϋ, С, К, Ν, Т, Н, К</td></tr> <tr><td> 140</td><td> К</td><td> ϋ, Ε, Н, &lt;2, А, С</td></tr> <tr><td> 141</td><td> Г</td><td> ϋ, Е</td></tr> <tr><td> 143</td><td> N</td><td> А, С</td></tr> <tr><td> 173</td><td> 3</td><td> С, Р, К</td></tr> <tr><td> 174</td><td> К</td><td> К</td></tr> <tr><td> 176</td><td> М</td><td> 6, Η, К, Ν, К</td></tr> <tr><td> 178</td><td> Ό</td><td> С, Ν,
  3. 3, Т</td></tr> <tr><td> 181</td><td> И</td><td> 6, н, к, к</td></tr> </table> <claim-text>3. Полипептид по п.1 или 2, отличающийся тем, что вариант аминокислотной последовательности имеет 2-9 аминокислотных замен по сравнению с исходной аминокислотной последовательностью, и в котором по меньшей мере одна замена присутствует по меньшей мере в двух из эпитопа 1, содержащего аминокислоты 48-56 из ЗРС) ΙΌ № 1, ЗЕР ΙΌ № 3 или ЗЕР ΙΌ № 7; эпитопа 2, содержащего аминокислоты 135-143 из ЗРС) ΙΌ № 1, ЗРС) ΙΌ № 3 или ЗРС) ΙΌ № 7; и эпитопа 3, содержащего аминокислоты 173181 из ЗРП ΙΌ № 1, ЗРП ΙΌ № 3 или ЗРП ΙΌ № 7.</claim-text> <claim-text>4. Полипептид по п.3, отличающийся тем, что измененная аминокислотная последовательность имеет только две аминокислотные замены, и в которой замены выбраны из группы двух аминокислотных замен, изложенных ниже</claim-text> <table border="1"> <tr><td> Υ54Κ и М135К</td><td> Υ54Κ и М135Т</td><td> Υ54Κ и Н1400</td><td> Υ54Η и М135К</td></tr> <tr><td> Υ54Η и М135Т</td><td> Υ54Η и Н1400</td><td> Т56Н и М135К</td><td> Т56Н и М135Т</td></tr> <tr><td> Т56Н и Н1400</td><td> Т56К и М135К</td><td> Т56К и М135Т</td><td> Т56К и Р.1400</td></tr> <tr><td> Υ54Κ и Ώ178Ν</td><td> Υ54Κ и И181Н</td><td> Υ54Κ и И181Н</td><td> Υ54Κ и К174Н</td></tr> <tr><td> Υ54Η и Ώ178Ν</td><td> Υ54Η и И181Н</td><td> Υ54Κ и И181Н</td><td> Υ54Η и К174Н</td></tr> <tr><td> Т56Н и Ώ178Ν</td><td> Т56Н и И181Н</td><td> Т56Н и И181Н</td><td> Т56Н и К174Н</td></tr> <tr><td> Т56К и Ώ178Ν</td><td> Т56К и И181Н</td><td> Т56К и И181Н</td><td> Т56К и К174Н</td></tr> <tr><td> М135К и Ώ178Ν</td><td> М135К и И181Н</td><td> М135К и И181К</td><td> М135К и К174Н</td></tr> <tr><td> М135Т и Ό178Ν</td><td> М135Т и И181Н</td><td> М135Т и И181Р.</td><td> М135Т и К174Р</td></tr> <tr><td> Н1400 и Ρ178Ν</td><td> Н1400 и И181Н</td><td> Н1400 и И181К</td><td> Н1400 и К174Н</td></tr> </table> <claim-text>5. Полипептид по п.1 или 2, отличающийся тем, что вариант аминокислотной последовательности имеет 3-9 аминокислотных замен по сравнению с исходной аминокислотной последовательностью, и в котором по меньшей мере одна замена присутствует, по меньшей мере, в каждом из эпитопа 1, содержащего аминокислоты 48-56 из ЗРП ΙΌ № 1, ЗРП ΙΌ № 3 или ЗРП ΙΌ № 7; эпитопа 2, содержащего аминокислоты 135-143 из ЗРП ΙΌ № 1, ЗРП ΙΌ № 3 или ЗРП ΙΌ № 7; и эпитопа 3, содержащего аминокислоты 173-181 из ЗРП ΙΌ № 1, ЗРП ΙΌ № 3 или ЗРП ΙΌ № 7.</claim-text> <claim-text>6. Полипептид по п.4, отличающийся тем, что вариант аминокислотной последовательности имеет только три аминокислотные замены по сравнению с исходной аминокислотной последовательностью, и в котором замены выбраны из любого из следующих наборов аминокислотных замен: Т56Н, М135К и Ό178Ν; Т56К, М135К и Ό178Ν; Т56К, М135Т и Ό178Ν; Т56Н, М135К и Ж81К; Т56Н, М135Т и Ж81К; Υ54Κ, М135Т и К174К; У54К, М135К и К174К; У54К, М135Т и К174К; Т56Н, М135К и К174К; Т56Н, М135Т и К174К.</claim-text> <claim-text>7. Полипептид по любому из пп.1-6, отличающийся тем, что состоит, по существу, из человеческой или гуманизированной иммуноглобулиновой полипептидной последовательности Ре, слитой или с помощью пептидного линкера, или непосредственно с С-концом варианта аминокислотной последовательности, причем</claim-text> <claim-text>а) человеческая или гуманизированная иммуноглобулиновая полипептидная последовательность Р с</claim-text> <claim-text>- 28 030389</claim-text> <claim-text>представляет собой Ре часть человеческого 1дО;</claim-text> <claim-text>b) аминокислотная последовательность пептидного линкера и человеческая или гуманизированная иммуноглобулиновая полипептидная последовательность Рс выбрана из аминокислот 218-488 из ЗЕС) ГО № 1, аминокислот 218-486 из ЗЕЕ) ГО № 3 и аминокислот 218-488 из ЗЕС) ГО № 7;</claim-text> <claim-text>c) аминокислотная последовательность пептидного линкера и человеческая или гуманизированная иммуноглобулиновая полипептидная последовательность Рс является вариантом последовательности аминокислот 218-488 из ЗЕС) ГО № 1 или аминокислот 218-488 из ЗЕС) ГО № 7;</claim-text> <claim-text>причем вариант последовательности имеет одну или более аминокислотных замен, выбранных из</claim-text> <claim-text>или</claim-text> <claim-text>ά) аминокислотная последовательность пептидного линкера и человеческая или гуманизированная иммуноглобулиновая полипептидная последовательность Рс является вариантом последовательности аминокислот 218-488 из ЗЕС) ГО № 3;</claim-text> <claim-text>причем вариант последовательности имеет одну или более аминокислотных замен, выбранных из</claim-text> <table border="1"> <tr><td> Аминокис лота #</td><td> Аминокислота, присутствующая в исходной аминокислотной последовательности</td><td> Аминокислотные замены</td></tr> <tr><td> 220</td><td> С</td><td> Ε, Ό, Е, И, Μ, Υ</td></tr> <tr><td> 221</td><td> 3</td><td> Ρ, Е, С</td></tr> <tr><td> 223</td><td> С</td><td> Ρ, Ρ, Е, К, Ν, Ρ, Т</td></tr> </table> <claim-text>8. Полипептид по п.7, отличающийся тем, что иммуноглобулиновая полипептидная Рс последовательность является Рс частью человеческого 1дО.</claim-text> <claim-text>9. Полипептид по п.7, отличающийся тем, что аминокислотная последовательность пептидного линкера и человеческая или гуманизированная иммуноглобулиновая полипептидная последовательность Рс выбрана из аминокислот 218-488 из ЗЕС) ГО № 1, аминокислот 218-486 из ЗЕС) ГО № 3 и аминокислот 218-488 и ЗЕ(? ГО № 7.</claim-text> <claim-text>10. Полипептид по п.7, в котором аминокислотная последовательность пептидного линкера и человеческая или гуманизированная иммуноглобулиновая полипептидная последовательность Рс выбрана из</claim-text> <claim-text>а) варианта последовательности аминокислот 218-488 из ЗЕС) ГО № 1 или аминокислот 218-488 из ЗЕН ГО № 7;</claim-text> <claim-text>причем вариант последовательности имеет одну или более аминокислотных замен, выбранных из</claim-text> <table border="1"> <tr><td> Аминокис лота #</td><td> Аминокислота, присутствующая в исходной аминокислотной последовательности</td><td> Аминокислотные замены</td></tr> <tr><td> 218</td><td> С</td><td> С, Ε, Ν, Р, 0, 3, Т, А, Н, И</td></tr> <tr><td> 220</td><td> С</td><td> Ε, ϋ, Е, И, Μ, Υ</td></tr> <tr><td> 221</td><td> 3</td><td> В, Е, С</td></tr> <tr><td> 223</td><td> С</td><td> Ρ, Ρ, Е, К, Ν, Р, Т</td></tr> </table> <claim-text>или</claim-text> <claim-text>Ь) варианта последовательности аминокислот 218-486 из ЗЕС) ГО № 3;</claim-text> <claim-text>причем вариант последовательности имеет одну или более аминокислотных замен, выбранных из</claim-text> <table border="1"> <tr><td> Аминокис лота #</td><td> Аминокислота, присутствующая в исходной аминокислотной последовательности</td><td> Аминокислотные</td><td> замены</td></tr> <tr><td> 220</td><td> С</td><td> Е, В, Е, И, М,</td><td> Υ</td></tr> <tr><td> 221</td><td> 3</td><td colspan="2"> Ό, Е, С</td></tr> <tr><td> 223</td><td> С</td><td> Ό, Ρ, Е, К, Ν,</td><td> Р, Т</td></tr> </table> <claim-text>- 29 030389</claim-text> <claim-text>11. Полипептид по п.8, в котором аминокислотная последовательность пептидного линкера и Рс части 1дС человека представляет собой аминокислоты 218-488 из 8ЕР ГО № 3.</claim-text> <claim-text>12. Вариант полипептида, включающий измененную исходную последовательность, отличающийся тем, что исходная последовательность выбрана из 8КС) 10 № 3 или 8КС) 10 № 7, и изменением является две или три аминокислотные замены, полипептид выбирается из любого из полипептидов, изложенных ниже</claim-text> <table border="1"> <tr><td> Номер полипептид а</td><td colspan="4"> Стартовая последовательное ть</td><td> Замена в эпитопе 1</td><td> Замена в эпитопе 2</td><td> Замена в эпитопе 3</td></tr> <tr><td> 63</td><td> 5Е&lt;2</td><td> Ю</td><td> №:</td><td> 3</td><td> Υ54Κ</td><td> М135К</td><td> Отсутству ет</td></tr> <tr><td> 64</td><td> 5Е&lt;2</td><td> Ю</td><td> №:</td><td> 3</td><td> Υ54Κ</td><td> М135Т</td><td> Отсутству ет</td></tr> <tr><td> 65</td><td> 5Е&lt;2</td><td> Ю</td><td> №:</td><td> 3</td><td> Υ54Κ</td><td> Н1400</td><td> Отсутству ет</td></tr> <tr><td> бб</td><td> 5Е&lt;2</td><td> Ю</td><td> №:</td><td> 3</td><td> Υ54Η</td><td> М135К</td><td> Отсутству ет</td></tr> <tr><td> 67</td><td> 3ΕΩ</td><td> Ю</td><td> №:</td><td> 3</td><td> Υ54Η</td><td> М135Т</td><td> Отсутству ет</td></tr> <tr><td> 68</td><td> 5Е&lt;2</td><td> ю</td><td> №:</td><td> 3</td><td> Υ54Η</td><td> Н1400</td><td> Отсутству ет</td></tr> <tr><td> 69</td><td> 5Е&lt;2</td><td> ю</td><td> №:</td><td> 3</td><td> Т56Н</td><td> М135К</td><td> Отсутству ет</td></tr> <tr><td> 70</td><td> 5Е&lt;2</td><td> ю</td><td> №:</td><td> 3</td><td> Т56Н</td><td> М135Т</td><td> Отсутству ет</td></tr> <tr><td> 71</td><td> 5Е&lt;2</td><td> ю</td><td> №:</td><td> 3</td><td> Т56Н</td><td> Н1400</td><td> Отсутству ет</td></tr> <tr><td> 72</td><td> 5Е&lt;2</td><td> ю</td><td> №:</td><td> 3</td><td> Т56К</td><td> М135К</td><td> Отсутству ет</td></tr> <tr><td> 73</td><td> 5Е&lt;2</td><td> ю</td><td> №:</td><td> 3</td><td> Т56К</td><td> М135Т</td><td> Отсутству ет</td></tr> <tr><td> 74</td><td> 5Е&lt;2</td><td> ю</td><td> №:</td><td> 3</td><td> Т56К</td><td> Н1400</td><td> Отсутству ет</td></tr> <tr><td> 75</td><td> 5Е&lt;2</td><td> ю</td><td> №:</td><td> 3</td><td> Υ54Κ</td><td> Отсутству ет</td><td> Ώ178Ν</td></tr> <tr><td> 76</td><td> 5Е&lt;2</td><td> ю</td><td> №:</td><td> 3</td><td> Υ54Κ</td><td> Отсутству ет</td><td> И181Н</td></tr> <tr><td> 77</td><td> 5Е&lt;2</td><td> ю</td><td> №:</td><td> 3</td><td> Υ54Κ</td><td> Отсутству ет</td><td> И181Н</td></tr> </table> <claim-text>- 30 030389</claim-text> <table border="1"> <tr><td> 78</td><td> ЗЕО</td><td> Ю</td><td> №:</td><td> 3</td><td> Υ54Κ</td><td> Отсутству ет</td><td> К174К</td></tr> <tr><td> 79</td><td> ЗЕО</td><td> Ю</td><td> №:</td><td> 3</td><td> Υ54Κ</td><td> Отсутству ет</td><td> Ώ178Ν</td></tr> <tr><td> 80</td><td> ЗЕО</td><td> Ю</td><td> №:</td><td> 3</td><td> Υ54Κ</td><td> Отсутству ет</td><td> И181Н</td></tr> <tr><td> 81</td><td> ЗЕО</td><td> Ю</td><td> №:</td><td> 3</td><td> Υ54Κ</td><td> Отсутству ет</td><td> И181К</td></tr> <tr><td> 82</td><td> ЗЕО</td><td> Ю</td><td> №:</td><td> 3</td><td> Υ54Κ</td><td> Отсутству ет</td><td> К174К</td></tr> <tr><td> 83</td><td> ЗЕО</td><td> Ю</td><td> №:</td><td> 3</td><td> Т56Н</td><td> Отсутству ет</td><td> Ό178Ν</td></tr> <tr><td> 84</td><td> ЗЕО</td><td> Ю</td><td> №:</td><td> 3</td><td> Т56Н</td><td> Отсутству ет</td><td> М181Н</td></tr> <tr><td> 85</td><td> ЗЕО</td><td> Ю</td><td> №:</td><td> 3</td><td> Т56Н</td><td> Отсутству ет</td><td> М181К</td></tr> <tr><td> 86</td><td> ЗЕО</td><td> Ю</td><td> №:</td><td> 3</td><td> Т56Н</td><td> Отсутству ет</td><td> К174К</td></tr> <tr><td> 87</td><td> ЗЕО</td><td> Ю</td><td> №:</td><td> 3</td><td> Т56К</td><td> Отсутству ет</td><td> Ό178Ν</td></tr> <tr><td> 88</td><td> ЗЕО</td><td> Ю</td><td> №:</td><td> 3</td><td> Т56К</td><td> Отсутству ет</td><td> М181Н</td></tr> <tr><td> 89</td><td> ЗЕО</td><td> Ю</td><td> №:</td><td> 3</td><td> Т56К</td><td> Отсутству ет</td><td> М181К</td></tr> <tr><td> 90</td><td> ЗЕО</td><td> Ю</td><td> №:</td><td> 3</td><td> Т56К</td><td> Отсутству ет</td><td> К174К</td></tr> <tr><td> 91</td><td> ЗЕО</td><td> Ю</td><td> №:</td><td> 3</td><td> Отсутству ет</td><td> М135К</td><td> Ώ178Ν</td></tr> <tr><td> 92</td><td> ЗЕО</td><td> Ю</td><td> №:</td><td> 3</td><td> Отсутству ет</td><td> М135К</td><td> И181Н</td></tr> <tr><td> 93</td><td> ЗЕО</td><td> Ю</td><td> №:</td><td> 3</td><td> Отсутству ет</td><td> М135К</td><td> И181К</td></tr> <tr><td> 94</td><td> ЗЕО</td><td> Ю</td><td> №:</td><td> 3</td><td> Отсутству ет</td><td> М135К</td><td> К174К</td></tr> <tr><td> 95</td><td> ЗЕО</td><td> Ю</td><td> №:</td><td> 3</td><td> Отсутству ет</td><td> М135Т</td><td> Ώ178Ν</td></tr> <tr><td> 96</td><td> ЗЕО</td><td> Ю</td><td> №:</td><td> 3</td><td> Отсутству ет</td><td> М135Т</td><td> И181Н</td></tr> <tr><td> 97</td><td> ЗЕО</td><td> Ю</td><td> №:</td><td> 3</td><td> Отсутству ет</td><td> М135Т</td><td> И181К</td></tr> <tr><td> 98</td><td> ЗЕО</td><td> Ю</td><td> №:</td><td> 3</td><td> Отсутству ет</td><td> М135Т</td><td> К174К</td></tr> <tr><td> 99</td><td> ЗЕО</td><td> ю</td><td> №:</td><td> 3</td><td> Отсутству ет</td><td> К.140О</td><td> Ό178Ν</td></tr> <tr><td> 100</td><td> ЗЕО</td><td> ю</td><td> №:</td><td> 3</td><td> Отсутству ет</td><td> К140О</td><td> М181Н</td></tr> <tr><td> 101</td><td> ЗЕО</td><td> Ιϋ</td><td> №:</td><td> 3</td><td> Отсутству ет</td><td> К140О</td><td> М181К</td></tr> <tr><td> 102</td><td> ЗЕО</td><td> ю</td><td> №:</td><td> 3</td><td> Отсутству</td><td> К140О</td><td> К174К</td></tr> </table> <claim-text>- 31 030389</claim-text> <table border="1"> <tr><td> </td><td colspan="2"> </td><td> ет</td><td> </td><td> </td></tr> <tr><td> 110</td><td> ЗЕО Ю №</td><td> 7</td><td> Т56Н</td><td> М135К</td><td> Ώ178Ν</td></tr> <tr><td> 111</td><td> ЗЕО Ю №</td><td> 7</td><td> Т56Н</td><td> М135К</td><td> И181Н</td></tr> <tr><td> 112</td><td> ЗЕО Ю №</td><td> 7</td><td> Т56Н</td><td> М135К</td><td> И181Н</td></tr> <tr><td> 113</td><td> ЗЕО Ю №</td><td> 7</td><td> Т56Н</td><td> М135К</td><td> К174Н</td></tr> <tr><td> 114</td><td> ЗЕО Ю №</td><td> 7</td><td> Т56Н</td><td> М135Т</td><td> Ώ178Ν</td></tr> <tr><td> 115</td><td> ЗЕО Ю №</td><td> 7</td><td> Т56Н</td><td> М135Т</td><td> И181Н</td></tr> <tr><td> 116</td><td> ЗЕО Ю №</td><td> 7</td><td> Т56Н</td><td> М135Т</td><td> И181Н</td></tr> <tr><td> 117</td><td> ЗЕО Ю №</td><td> 7</td><td> Т56Н</td><td> М135Т</td><td> К174Н</td></tr> <tr><td> 118</td><td> ЗЕО Ю №</td><td> 7</td><td> Т56К</td><td> М135К</td><td> Ώ178Ν</td></tr> <tr><td> 119</td><td> ЗЕО Ю №</td><td> 7</td><td> Т56К</td><td> М135К</td><td> И181Н</td></tr> <tr><td> 120</td><td> ЗЕО Ю №</td><td> 7</td><td> Т56К</td><td> М135К</td><td> И181Н</td></tr> <tr><td> 121</td><td> ЗЕО Ю №</td><td> 7</td><td> Т56К</td><td> М135К</td><td> К174Н</td></tr> <tr><td> 122</td><td> ЗЕО Ю №</td><td> 7</td><td> Т56К</td><td> М135Т</td><td> Ώ178Ν</td></tr> <tr><td> 123</td><td> ЗЕО Ю №</td><td> 7</td><td> Т56К</td><td> М135Т</td><td> И181Н</td></tr> <tr><td> 124</td><td> ЗЕО Ю №</td><td> 7</td><td> Т56К</td><td> М135Т</td><td> И181Н</td></tr> <tr><td> 125</td><td> ЗЕО Ю №</td><td> 7</td><td> Т56К</td><td> М135Т</td><td> К174К</td></tr> <tr><td> 126</td><td> ЗЕО Ю №</td><td> 7</td><td> Υ54Κ</td><td> М135К</td><td> К174Н</td></tr> <tr><td> 127</td><td> ЗЕО Ю №</td><td> 7</td><td> Υ54Κ</td><td> М135Т</td><td> К174Н</td></tr> <tr><td> 128</td><td> ЗЕО Ю №</td><td> 7</td><td> Υ54Η</td><td> М135К</td><td> К174Н</td></tr> <tr><td> 129</td><td> ЗЕО Ю №</td><td> 7</td><td> Υ54Η</td><td> М135Т</td><td> К174Н</td></tr> <tr><td> 130</td><td> ЗЕО Ю №</td><td> 7</td><td> Т56Н</td><td> Отсутству ет</td><td> Ώ178Ν</td></tr> <tr><td> 131</td><td colspan="2"> ЗЕО Ю №: 7</td><td> Т56Н</td><td> Отсутству ет</td><td> И181Н</td></tr> <tr><td> 132</td><td colspan="2"> ЗЕО Ю №: 7</td><td> Т56Н</td><td> Отсутству ет</td><td> И181Н</td></tr> <tr><td> 133</td><td colspan="2"> ЗЕО Ю №: 7</td><td> Т56Н</td><td> Отсутству ет</td><td> К174Н</td></tr> <tr><td> 134</td><td colspan="2"> ЗЕО Ю №: 7</td><td> Т56К</td><td> Отсутству ет</td><td> Ώ178Ν</td></tr> <tr><td> 135</td><td colspan="2"> ЗЕО Ю №: 7</td><td> Т56К</td><td> Отсутству ет</td><td> И181Н</td></tr> <tr><td> 136</td><td colspan="2"> ЗЕО Ю №: 7</td><td> Т56К</td><td> Отсутству ет</td><td> И181Н</td></tr> <tr><td> 137</td><td colspan="2"> ЗЕО Ю №: 7</td><td> Т56К</td><td> Отсутству ет</td><td> К174Н</td></tr> </table> <claim-text>13. Полипептид по п.12, выбранный из любого полипептида №№ 110, 112, 113, 116, 117, 118, 122, 127, 128 или 129.</claim-text> <claim-text>14. Фармацевтическая композиция для лечения заболевания, характеризующегося присутствием агрегатов амилоида или тау-белка, содержащая полипептид по любому из пп.1-13 и фармацевтически приемлемый носитель.</claim-text> <claim-text>15. Фармацевтическая композиция по п.14, отличающаяся тем, что композиция составлена для инъекции или инфузии в кровеносную систему пациента.</claim-text> <claim-text>16. Фармацевтическая композиция по п.14, отличающаяся тем, что композиция составлена для прямого введения в мозг или ЦНС.</claim-text> <claim-text>17. Способ уменьшения агрегатов амилоида или тау-белка у пациента, включающий введение пациенту эффективного количества полипептида по любому из пп.1-13 или фармацевтической композиции по любому из пп.14-16.</claim-text> <claim-text>18. Способ по п.17, отличающийся тем, что пациент демонстрирует признаки нейродегенеративного заболевания, связанного с наличием агрегатов амилоида или тау-белка.</claim-text> <claim-text>19. Способ по п.17 или 18, отличающийся тем, что пациент является положительным по биомаркеру флорбетапира, если этот биомаркер используется в качестве визуализирующего средства в позитронноэмиссионной томографии.</claim-text> <claim-text>20. Способ по любому из пп.17-19, отличающийся тем, что пациент страдает от нейродегенеративных заболеваний, выбранных из следующего: болезни Альцгеймера, которые включают в себя болезнь Альцгеймера с ранним началом, болезнь Альцгеймера с поздним началом и предсимптоматическую болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, амилоидоз сывороточного амилоида А (ЗАЛ), цистатина С, наследственный Исландский синдром, слабоумие, множественная миелома, прионные заболевания, включая, но не ограничиваясь, куру, болезнь Крейтцфельдта-Якоба (СГО), болезнь ГерстманнаШтраусслера-Шейнкера (ОЗЗ), фатальную семейную бессонницу (ЕИ), скрейпи, губкообразную энцефалопатию крупного рогатого скота (ГЭКРС); боковой амиотрофический склероз (БАС), спинальноцеребеллярную атаксию (СЦА1), (СЦА3), (СЦА6), (СЦА7), болезнь Хантингтона, дентато-рубро- 32 030389</claim-text> <claim-text>паллидо-льюисову атрофию, спинальную и бульбарную мышечную атрофию, наследственную церебральную амилоидную ангиопатию, семейный амилоидоз, Британскую/Датскую деменцию, семейную энцефалопатию, комплекс боковой амиотрофический склероз/паркинсонизм-деменция, деменцию, вызванную аргирофильной зернистостью, кортикобазальную дегенерацию, деменцию боксеров, диффузные нейрофибриллярные клубки с кальцификацией, синдром Дауна, болезнь Герстманна-ШтраусслераШейнкера, болезнь Галлервордена-Шпатца, миотоническую дистрофию, болезнь Ниманна-Пика типа С, болезнь двигательного нейрона с нейрофибриллярными клубками не Гуам-типа, болезнь Пика, постэнцефалитический паркинсонизм, церебральную амилоидную ангиопатию, вызванную прионным белком, прогрессивный субкортикальный глиоз, прогрессирующий надъядерный паралич, подострый склерозирующий панэнцефалит, деменцию нейрофибриллярных клубков, лобно-височные лобарные дегенерации (ЛВЛД), деменцию лобно-височной доли (ЛВД), включая пациента, имеющего один или более из следующих клинических синдромов: поведенческий вариант ЛВД (пвЛВД), прогрессирующая афазия со снижением беглости речи (РОТА), лобно-височная деменция с паркинсонизмом, сцепленная с хромосомой 17, прогрессирующий надъядерный паралич (ПНП) и семантическую деменцию (СД).</claim-text> <claim-text>21. Способ по п.20, отличающийся тем, что нейродегенеративным заболеванием является болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера или болезнь Хантингтона.</claim-text> <claim-text>22. Способ по п.21, отличающийся тем, что нейродегенеративным заболеванием является болезнь Альцгеймера.</claim-text> <claim-text>23. Способ по п.20, отличающийся тем, что пациент страдает от прион-опосредованного заболевания, выбранного из болезни Крейтцфельдта-Якоба, куру, фатальной семейной бессонницы и синдрома Герстманна-Штраусслера-Шейнкера.</claim-text> <claim-text>24. Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая любой из полипептидов по пп.1-13.</claim-text> <claim-text>25. Последовательность нуклеиновой кислоты по п.24, дополнительно кодирующая сигнальную последовательность млекопитающего, слитую и находящуюся в рамке считывания с кодирующей последовательностью полипептида.</claim-text> <claim-text>26. Вектор, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты по п.24 или 25, отличающийся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты функционально связана в векторе с последовательностью, контролирующей экспрессию.</claim-text> <claim-text>27. Клетка-хозяин, содержащая вектор по п.26.</claim-text> <claim-text>28. Способ получения полипептида по любому из пп.1-13, включающий стадии экспрессии белка, кодируемого последовательностью нуклеиновой кислоты по п.24 или 25; и выделения экспрессированного полипептида.</claim-text> <claim-text>29. Способ получения полипептида по любому из пп.1-13, включающий стадии культивирования клетки-хозяина по п.27 в условиях, достаточных для обеспечения экспрессии полипептида; и выделения экспрессированного полипептида.</claim-text> <claim-text>- 33 030389</claim-text> <claim-text>1 22</claim-text> <table border="1"> <tr><td> <claim-text>А Е</claim-text></td><td> <claim-text>Т</claim-text></td><td> <claim-text>V</claim-text></td><td> <claim-text>Е</claim-text></td><td> <claim-text>3</claim-text></td><td> <claim-text>С</claim-text></td><td> <claim-text>Ь</claim-text></td><td> <claim-text>А</claim-text></td><td> <claim-text>К</claim-text></td><td> <claim-text>Р</claim-text></td><td> <claim-text>Н</claim-text></td><td> <claim-text>Т</claim-text></td><td> <claim-text>Е</claim-text></td><td> <claim-text>N</claim-text></td><td> <claim-text>3</claim-text></td><td> <claim-text>Е</claim-text></td><td> <claim-text>т</claim-text></td><td> <claim-text>N</claim-text></td><td> <claim-text>V</claim-text></td><td> <claim-text>№</claim-text></td><td> <claim-text>К</claim-text></td></tr> <tr><td> <claim-text>23</claim-text> <claim-text>Б Б</claim-text></td><td> <claim-text>К</claim-text></td><td> <claim-text>Т</claim-text></td><td> <claim-text>Ь</claim-text></td><td> <claim-text>Б</claim-text></td><td> <claim-text>К</claim-text></td><td> <claim-text>Υ</claim-text></td><td> <claim-text>А</claim-text></td><td> <claim-text>N</claim-text></td><td> <claim-text>Υ</claim-text></td><td> <claim-text>Е</claim-text></td><td> <claim-text>С</claim-text></td><td> <claim-text>С</claim-text></td><td> <claim-text>Ь</claim-text></td><td> <claim-text>и</claim-text></td><td> <claim-text>N</claim-text></td><td> <claim-text>А</claim-text></td><td> <claim-text>Т</claim-text></td><td> <claim-text>С</claim-text></td><td> <claim-text>V</claim-text></td><td> <claim-text>44</claim-text> <claim-text>V</claim-text></td></tr> <tr><td> <claim-text>45</claim-text> <claim-text>V С</claim-text></td><td> <claim-text>Т</claim-text></td><td> <claim-text>Θ</claim-text></td><td> <claim-text>ϋ</claim-text></td><td> <claim-text>Е</claim-text></td><td> <claim-text>т</claim-text></td><td> <claim-text>2</claim-text></td><td> <claim-text>С</claim-text></td><td> <claim-text>Υ</claim-text></td><td> <claim-text>Θ</claim-text></td><td> <claim-text>т</claim-text></td><td> <claim-text>№</claim-text></td><td> <claim-text>V</claim-text></td><td> <claim-text>Р</claim-text></td><td> <claim-text>I</claim-text></td><td> <claim-text>С</claim-text></td><td> <claim-text>Ь</claim-text></td><td> <claim-text>А</claim-text></td><td> <claim-text>I</claim-text></td><td> <claim-text>Р</claim-text></td><td> <claim-text>66</claim-text> <claim-text>Е</claim-text></td></tr> <tr><td> <claim-text>67</claim-text> <claim-text>N Е</claim-text></td><td> <claim-text>С</claim-text></td><td> <claim-text>С</claim-text></td><td> <claim-text>С</claim-text></td><td> <claim-text>3</claim-text></td><td> <claim-text>Е</claim-text></td><td> <claim-text>с</claim-text></td><td> <claim-text>с</claim-text></td><td> <claim-text>С</claim-text></td><td> <claim-text>3</claim-text></td><td> <claim-text>Е</claim-text></td><td> <claim-text>С</claim-text></td><td> <claim-text>С</claim-text></td><td> <claim-text>С</claim-text></td><td> <claim-text>3</claim-text></td><td> <claim-text>Е</claim-text></td><td> <claim-text>С</claim-text></td><td> <claim-text>С</claim-text></td><td> <claim-text>с</claim-text></td><td> <claim-text>Т</claim-text></td><td> <claim-text>88</claim-text> <claim-text>К</claim-text></td></tr> <tr><td> <claim-text>89</claim-text> <claim-text>Р Р</claim-text></td><td> <claim-text>Е</claim-text></td><td> <claim-text>Υ</claim-text></td><td> <claim-text>с</claim-text></td><td> <claim-text>Б</claim-text></td><td> <claim-text>Т</claim-text></td><td> <claim-text>Р</claim-text></td><td> <claim-text>I</claim-text></td><td> <claim-text>Р</claim-text></td><td> <claim-text>с</claim-text></td><td> <claim-text>Υ</claim-text></td><td> <claim-text>Т</claim-text></td><td> <claim-text>Υ</claim-text></td><td> <claim-text>I</claim-text></td><td> <claim-text>N</claim-text></td><td> <claim-text>Р</claim-text></td><td> <claim-text>Ь</claim-text></td><td> <claim-text>Б</claim-text></td><td> <claim-text>с</claim-text></td><td> <claim-text>Т</claim-text></td><td> <claim-text>110</claim-text> <claim-text>Υ</claim-text></td></tr> <tr><td> <claim-text>111</claim-text> <claim-text>Р Р</claim-text></td><td> <claim-text>С</claim-text></td><td> <claim-text>т</claim-text></td><td> <claim-text>Е</claim-text></td><td> <claim-text>&lt;2</claim-text></td><td> <claim-text>N</claim-text></td><td> <claim-text>Р</claim-text></td><td> <claim-text>А</claim-text></td><td> <claim-text>N</claim-text></td><td> <claim-text>Р</claim-text></td><td> <claim-text>N</claim-text></td><td> <claim-text>Р</claim-text></td><td> <claim-text>3</claim-text></td><td> <claim-text>Ь</claim-text></td><td> <claim-text>Е</claim-text></td><td> <claim-text>Е</claim-text></td><td> <claim-text>3</claim-text></td><td> <claim-text>2</claim-text></td><td> <claim-text>Р</claim-text></td><td> <claim-text>Ь</claim-text></td><td> <claim-text>132</claim-text> <claim-text>N</claim-text></td></tr> <tr><td> <claim-text>133</claim-text> <claim-text>Τ Е</claim-text></td><td> <claim-text>М</claim-text></td><td> <claim-text>г</claim-text></td><td> <claim-text>2</claim-text></td><td> <claim-text>N</claim-text></td><td> <claim-text>N</claim-text></td><td> <claim-text>к</claim-text></td><td> <claim-text>Е</claim-text></td><td> <claim-text>К</claim-text></td><td> <claim-text>N</claim-text></td><td> <claim-text>К</claim-text></td><td> <claim-text>2</claim-text></td><td> <claim-text>С</claim-text></td><td> <claim-text>А</claim-text></td><td> <claim-text>Б</claim-text></td><td> <claim-text>Т</claim-text></td><td> <claim-text>V</claim-text></td><td> <claim-text>Υ</claim-text></td><td> <claim-text>т</claim-text></td><td> <claim-text>С</claim-text></td><td> <claim-text>154</claim-text> <claim-text>Т</claim-text></td></tr> <tr><td> <claim-text>155</claim-text> <claim-text>Е Т</claim-text></td><td> <claim-text>&lt;2</claim-text></td><td> <claim-text>с</claim-text></td><td> <claim-text>т</claim-text></td><td> <claim-text>Б</claim-text></td><td> <claim-text>Р</claim-text></td><td> <claim-text>V</claim-text></td><td> <claim-text>К</claim-text></td><td> <claim-text>т</claim-text></td><td> <claim-text>Υ</claim-text></td><td> <claim-text>Υ</claim-text></td><td> <claim-text>2</claim-text></td><td> <claim-text>Υ</claim-text></td><td> <claim-text>Т</claim-text></td><td> <claim-text>Р</claim-text></td><td> <claim-text>V</claim-text></td><td> <claim-text>3</claim-text></td><td> <claim-text>3</claim-text></td><td> <claim-text>к</claim-text></td><td> <claim-text>А</claim-text></td><td> <claim-text>176</claim-text> <claim-text>М</claim-text></td></tr> <tr><td> <claim-text>177</claim-text> <claim-text>Υ ϋ</claim-text></td><td> <claim-text>А</claim-text></td><td> <claim-text>Υ</claim-text></td><td> <claim-text>и</claim-text></td><td> <claim-text>N</claim-text></td><td> <claim-text>С</claim-text></td><td> <claim-text>к</claim-text></td><td> <claim-text>Е</claim-text></td><td> <claim-text>к</claim-text></td><td> <claim-text>Б</claim-text></td><td> <claim-text>С</claim-text></td><td> <claim-text>А</claim-text></td><td> <claim-text>Е</claim-text></td><td> <claim-text>Н</claim-text></td><td> <claim-text>3</claim-text></td><td> <claim-text>С</claim-text></td><td> <claim-text>Е</claim-text></td><td> <claim-text>N</claim-text></td><td> <claim-text>Е</claim-text></td><td> <claim-text>Б</claim-text></td><td> <claim-text>198</claim-text> <claim-text>Р</claim-text></td></tr> <tr><td> <claim-text>199</claim-text> <claim-text>Е V</claim-text></td><td> <claim-text>С</claim-text></td><td> <claim-text>Е</claim-text></td><td> <claim-text>Υ</claim-text></td><td> <claim-text>2</claim-text></td><td> <claim-text>С</claim-text></td><td> <claim-text>2</claim-text></td><td> <claim-text>3</claim-text></td><td> <claim-text>3</claim-text></td><td> <claim-text>Б</claim-text></td><td> <claim-text>Ь</claim-text></td><td> <claim-text>Р</claim-text></td><td> <claim-text>2</claim-text></td><td> <claim-text>Р</claim-text></td><td> <claim-text>Р</claim-text></td><td> <claim-text>V</claim-text></td><td> <claim-text>N</claim-text></td><td> <claim-text>А</claim-text></td><td> <claim-text>Θ</claim-text></td><td> <claim-text>Θ</claim-text></td><td> <claim-text>220</claim-text> <claim-text>Θ</claim-text></td></tr> <tr><td> <claim-text>221</claim-text> <claim-text>5 Θ</claim-text></td><td> <claim-text>Θ</claim-text></td><td> <claim-text>С</claim-text></td><td> <claim-text>3</claim-text></td><td> <claim-text>С</claim-text></td><td> <claim-text>с</claim-text></td><td> <claim-text>с</claim-text></td><td> <claim-text>3</claim-text></td><td> <claim-text>Е</claim-text></td><td> <claim-text>С</claim-text></td><td> <claim-text>С</claim-text></td><td> <claim-text>С</claim-text></td><td> <claim-text>3</claim-text></td><td> <claim-text>Е</claim-text></td><td> <claim-text>с</claim-text></td><td> <claim-text>С</claim-text></td><td> <claim-text>С</claim-text></td><td> <claim-text>3</claim-text></td><td> <claim-text>Е</claim-text></td><td> <claim-text>С</claim-text></td><td> <claim-text>242</claim-text> <claim-text>С</claim-text></td></tr> <tr><td> <claim-text>243</claim-text> <claim-text>С 3</claim-text></td><td> <claim-text>Е</claim-text></td><td> <claim-text>С</claim-text></td><td> <claim-text>с</claim-text></td><td> <claim-text>С</claim-text></td><td> <claim-text>3</claim-text></td><td> <claim-text>с</claim-text></td><td> <claim-text>С</claim-text></td><td> <claim-text>С</claim-text></td><td> <claim-text>3</claim-text></td><td> <claim-text>С</claim-text></td><td> <claim-text>3</claim-text></td><td> <claim-text>С</claim-text></td><td> <claim-text>А</claim-text></td><td> <claim-text>м</claim-text></td><td> <claim-text>V</claim-text></td><td> <claim-text>К</claim-text></td><td> <claim-text>3</claim-text></td><td> <claim-text>ϋ</claim-text></td><td> <claim-text>К</claim-text></td><td> <claim-text>264</claim-text> <claim-text>Т</claim-text></td></tr> <tr><td> <claim-text>265</claim-text> <claim-text>н т</claim-text></td><td> <claim-text>С</claim-text></td><td> <claim-text>Р</claim-text></td><td> <claim-text>Р</claim-text></td><td> <claim-text>С</claim-text></td><td> <claim-text>Р</claim-text></td><td> <claim-text>А</claim-text></td><td> <claim-text>Р</claim-text></td><td> <claim-text>Е</claim-text></td><td> <claim-text>Ь</claim-text></td><td> <claim-text>Ь</claim-text></td><td> <claim-text>С</claim-text></td><td> <claim-text>С</claim-text></td><td> <claim-text>Р</claim-text></td><td> <claim-text>3</claim-text></td><td> <claim-text>V</claim-text></td><td> <claim-text>Е</claim-text></td><td> <claim-text>ь</claim-text></td><td> <claim-text>Е</claim-text></td><td> <claim-text>Р</claim-text></td><td> <claim-text>286</claim-text> <claim-text>Р</claim-text></td></tr> <tr><td> <claim-text>287</claim-text> <claim-text>К Р</claim-text></td><td> <claim-text>К</claim-text></td><td> <claim-text>Б</claim-text></td><td> <claim-text>т</claim-text></td><td> <claim-text>ь</claim-text></td><td> <claim-text>м</claim-text></td><td> <claim-text>I</claim-text></td><td> <claim-text>3</claim-text></td><td> <claim-text>К</claim-text></td><td> <claim-text>Т</claim-text></td><td> <claim-text>Р</claim-text></td><td> <claim-text>Е</claim-text></td><td> <claim-text>V</claim-text></td><td> <claim-text>Т</claim-text></td><td> <claim-text>с</claim-text></td><td> <claim-text>V</claim-text></td><td> <claim-text>V</claim-text></td><td> <claim-text>V</claim-text></td><td> <claim-text>Б</claim-text></td><td> <claim-text>V</claim-text></td><td> <claim-text>308</claim-text> <claim-text>3</claim-text></td></tr> <tr><td> <claim-text>309</claim-text> <claim-text>Η Е</claim-text></td><td> <claim-text>Б</claim-text></td><td> <claim-text>Р</claim-text></td><td> <claim-text>Е</claim-text></td><td> <claim-text>V</claim-text></td><td> <claim-text>к</claim-text></td><td> <claim-text>Е</claim-text></td><td> <claim-text>N</claim-text></td><td> <claim-text>№</claim-text></td><td> <claim-text>Υ</claim-text></td><td> <claim-text>V</claim-text></td><td> <claim-text>Б</claim-text></td><td> <claim-text>С</claim-text></td><td> <claim-text>V</claim-text></td><td> <claim-text>Е</claim-text></td><td> <claim-text>V</claim-text></td><td> <claim-text>Н</claim-text></td><td> <claim-text>N</claim-text></td><td> <claim-text>А</claim-text></td><td> <claim-text>к</claim-text></td><td> <claim-text>330</claim-text> <claim-text>Т</claim-text></td></tr> <tr><td> <claim-text>331</claim-text> <claim-text>К Р</claim-text></td><td> <claim-text>К</claim-text></td><td> <claim-text>Е</claim-text></td><td> <claim-text>Е</claim-text></td><td> <claim-text>2</claim-text></td><td> <claim-text>Υ</claim-text></td><td> <claim-text>N</claim-text></td><td> <claim-text>3</claim-text></td><td> <claim-text>Т</claim-text></td><td> <claim-text>Υ</claim-text></td><td> <claim-text>к</claim-text></td><td> <claim-text>V</claim-text></td><td> <claim-text>V</claim-text></td><td> <claim-text>3</claim-text></td><td> <claim-text>V</claim-text></td><td> <claim-text>ь</claim-text></td><td> <claim-text>Т</claim-text></td><td> <claim-text>V</claim-text></td><td> <claim-text>Ь</claim-text></td><td> <claim-text>н</claim-text></td><td> <claim-text>352</claim-text> <claim-text>2</claim-text></td></tr> <tr><td> <claim-text>353</claim-text> <claim-text>Б №</claim-text></td><td> <claim-text>Ь</claim-text></td><td> <claim-text>N</claim-text></td><td> <claim-text>С</claim-text></td><td> <claim-text>к</claim-text></td><td> <claim-text>Е</claim-text></td><td> <claim-text>Υ</claim-text></td><td> <claim-text>К</claim-text></td><td> <claim-text>С</claim-text></td><td> <claim-text>К</claim-text></td><td> <claim-text>V</claim-text></td><td> <claim-text>3</claim-text></td><td> <claim-text>N</claim-text></td><td> <claim-text>К</claim-text></td><td> <claim-text>А</claim-text></td><td> <claim-text>ь</claim-text></td><td> <claim-text>Р</claim-text></td><td> <claim-text>А</claim-text></td><td> <claim-text>Р</claim-text></td><td> <claim-text>I</claim-text></td><td> <claim-text>374</claim-text> <claim-text>Е</claim-text></td></tr> <tr><td> <claim-text>375</claim-text> <claim-text>К Т</claim-text></td><td> <claim-text>I</claim-text></td><td> <claim-text>3</claim-text></td><td> <claim-text>К</claim-text></td><td> <claim-text>А</claim-text></td><td> <claim-text>К</claim-text></td><td> <claim-text>С</claim-text></td><td> <claim-text>2</claim-text></td><td> <claim-text>Р</claim-text></td><td> <claim-text>К</claim-text></td><td> <claim-text>Е</claim-text></td><td> <claim-text>Р</claim-text></td><td> <claim-text>2</claim-text></td><td> <claim-text>V</claim-text></td><td> <claim-text>Υ</claim-text></td><td> <claim-text>т</claim-text></td><td> <claim-text>Ь</claim-text></td><td> <claim-text>Р</claim-text></td><td> <claim-text>Р</claim-text></td><td> <claim-text>3</claim-text></td><td> <claim-text>396</claim-text> <claim-text>К</claim-text></td></tr> <tr><td> <claim-text>397</claim-text> <claim-text>Е Е</claim-text></td><td> <claim-text>М</claim-text></td><td> <claim-text>Т</claim-text></td><td> <claim-text>К</claim-text></td><td> <claim-text>N</claim-text></td><td> <claim-text>2</claim-text></td><td> <claim-text>V</claim-text></td><td> <claim-text>3</claim-text></td><td> <claim-text>Ь</claim-text></td><td> <claim-text>Т</claim-text></td><td> <claim-text>С</claim-text></td><td> <claim-text>Ь</claim-text></td><td> <claim-text>V</claim-text></td><td> <claim-text>К</claim-text></td><td> <claim-text>С</claim-text></td><td> <claim-text>Е</claim-text></td><td> <claim-text>Υ</claim-text></td><td> <claim-text>Р</claim-text></td><td> <claim-text>3</claim-text></td><td> <claim-text>Б</claim-text></td><td> <claim-text>418</claim-text> <claim-text>I</claim-text></td></tr> <tr><td> <claim-text>419</claim-text> <claim-text>А V</claim-text></td><td> <claim-text>Е</claim-text></td><td> <claim-text>№</claim-text></td><td> <claim-text>Е</claim-text></td><td> <claim-text>3</claim-text></td><td> <claim-text>N</claim-text></td><td> <claim-text>С</claim-text></td><td> <claim-text>2</claim-text></td><td> <claim-text>Р</claim-text></td><td> <claim-text>Е</claim-text></td><td> <claim-text>N</claim-text></td><td> <claim-text>N</claim-text></td><td> <claim-text>Υ</claim-text></td><td> <claim-text>К</claim-text></td><td> <claim-text>Т</claim-text></td><td> <claim-text>Т</claim-text></td><td> <claim-text>Р</claim-text></td><td> <claim-text>Р</claim-text></td><td> <claim-text>V</claim-text></td><td> <claim-text>Ь</claim-text></td><td> <claim-text>440</claim-text> <claim-text>Б</claim-text></td></tr> <tr><td> <claim-text>441</claim-text> <claim-text>3 Б</claim-text></td><td> <claim-text>С</claim-text></td><td> <claim-text>3</claim-text></td><td> <claim-text>Е</claim-text></td><td> <claim-text>Е</claim-text></td><td> <claim-text>Ь</claim-text></td><td> <claim-text>Υ</claim-text></td><td> <claim-text>3</claim-text></td><td> <claim-text>К</claim-text></td><td> <claim-text>Ь</claim-text></td><td> <claim-text>Т</claim-text></td><td> <claim-text>V</claim-text></td><td> <claim-text>Б</claim-text></td><td> <claim-text>К</claim-text></td><td> <claim-text>3</claim-text></td><td> <claim-text>К</claim-text></td><td> <claim-text>№</claim-text></td><td> <claim-text>2</claim-text></td><td> <claim-text>2</claim-text></td><td> <claim-text>С</claim-text></td><td> <claim-text>462</claim-text> <claim-text>N</claim-text></td></tr> <tr><td> <claim-text>463</claim-text> <claim-text>V Е</claim-text></td><td> <claim-text>3</claim-text></td><td> <claim-text>С</claim-text></td><td> <claim-text>3</claim-text></td><td> <claim-text>V</claim-text></td><td> <claim-text>М</claim-text></td><td> <claim-text>Н</claim-text></td><td> <claim-text>Е</claim-text></td><td> <claim-text>А</claim-text></td><td> <claim-text>Ь</claim-text></td><td> <claim-text>Н</claim-text></td><td> <claim-text>N</claim-text></td><td> <claim-text>Н</claim-text></td><td> <claim-text>Υ</claim-text></td><td> <claim-text>т</claim-text></td><td> <claim-text>2</claim-text></td><td> <claim-text>К</claim-text></td><td> <claim-text>3</claim-text></td><td> <claim-text>Ь</claim-text></td><td> <claim-text>3</claim-text></td><td> <claim-text>484</claim-text> <claim-text>Ь</claim-text></td></tr> <tr><td> <claim-text>485</claim-text> <claim-text>3 Р</claim-text></td><td> <claim-text>С</claim-text></td><td> <claim-text>К</claim-text></td><td> <claim-text></claim-text></td><td> <claim-text></claim-text></td><td> <claim-text></claim-text></td><td> <claim-text></claim-text></td><td> <claim-text></claim-text></td><td colspan="5">
EA201592272A 2013-05-28 2014-05-28 ПОЛИПЕПТИДЫ, СОДЕРЖАЩИЕ ИЗМЕНЕННУЮ АМИНОКИСЛОТНУЮ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ g3p БАКТЕРИОФАГА С ПОНИЖЕННОЙ ИММУНОГЕННОСТЬЮ EA030389B1 (ru)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201361828004P 2013-05-28 2013-05-28
US201361828497P 2013-05-29 2013-05-29
PCT/US2014/039760 WO2014193935A1 (en) 2013-05-28 2014-05-28 Polypeptides comprising a modified bacteriophage g3p amino acid sequence with reduced immunogenicity

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201592272A1 EA201592272A1 (ru) 2016-04-29
EA030389B1 true EA030389B1 (ru) 2018-07-31

Family

ID=51168338

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201592272A EA030389B1 (ru) 2013-05-28 2014-05-28 ПОЛИПЕПТИДЫ, СОДЕРЖАЩИЕ ИЗМЕНЕННУЮ АМИНОКИСЛОТНУЮ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ g3p БАКТЕРИОФАГА С ПОНИЖЕННОЙ ИММУНОГЕННОСТЬЮ

Country Status (13)

Country Link
US (2) US9988444B2 (ru)
EP (1) EP3003349B1 (ru)
JP (1) JP2016526044A (ru)
KR (1) KR20160010618A (ru)
CN (1) CN105473153A (ru)
AU (1) AU2014274253B2 (ru)
CA (1) CA2913414A1 (ru)
EA (1) EA030389B1 (ru)
HK (1) HK1223285A1 (ru)
MX (1) MX2015016263A (ru)
PH (1) PH12015502585A1 (ru)
SG (1) SG11201509647WA (ru)
WO (1) WO2014193935A1 (ru)

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2012346056B2 (en) 2011-11-29 2018-02-22 Proclara Biosciences, Inc. Use of P3 of bacteriophage as amyloid binding agents
WO2014055515A1 (en) 2012-10-02 2014-04-10 Neurophage Pharmaceuticals, Inc. Use of p3 of bacteriophage fusion proteins as amyloid binding agents
TW201632542A (zh) * 2014-12-03 2016-09-16 神經噬菌體製藥股份有限公司 包含缺乏醣基化信號之修飾噬菌體ｇ３ｐ胺基酸序列的多肽
CN107384960B (zh) * 2017-07-25 2020-06-12 吉优诺（上海）基因科技有限公司 基于复制缺陷性重组腺病毒携带il-17结合分子转基因载体及其构建方法和应用
CN112672755A (zh) * 2018-06-15 2021-04-16 普罗克拉拉生物科学股份有限公司 通用淀粉样蛋白相互作用基序(gaim)
WO2020227515A1 (en) 2019-05-07 2020-11-12 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the vectored augmentation of protein destruction, expression and/or regulation
CN114057858B (zh) 2020-08-10 2023-03-21 上海瑞吉康生物医药有限公司 对引起神经变性和神经退行性疾病的蛋白聚集具有解聚作用的多肽
WO2024119183A1 (en) 2022-12-02 2024-06-06 Alzheon, Inc. Methods for treating neurodegenerative disorders with tramiprosate

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006083795A1 (en) * 2005-02-01 2006-08-10 Ramot At Tel-Aviv University Ltd. Method for treating inflammation associated with amyloid deposits and brain inflammation involving activated microglia
WO2011084714A2 (en) * 2009-12-17 2011-07-14 Biogen Idec Ma Inc. STABILIZED ANTI-TNF-ALPHA scFv MOLECULES OR ANTI-TWEAK scFv MOLECULES AND USES THEREOF

Family Cites Families (30)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3941763A (en) 1975-03-28 1976-03-02 American Home Products Corporation PGlu-D-Met-Trp-Ser-Tyr-D-Ala-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 and intermediates
US4215051A (en) 1979-08-29 1980-07-29 Standard Oil Company (Indiana) Formation, purification and recovery of phthalic anhydride
EP0154316B1 (en) 1984-03-06 1989-09-13 Takeda Chemical Industries, Ltd. Chemically modified lymphokine and production thereof
ATE135370T1 (de) 1988-12-22 1996-03-15 Kirin Amgen Inc Chemisch modifizierte granulocytenkolonie erregender faktor
EP0417563B1 (de) 1989-09-12 2000-07-05 F. Hoffmann-La Roche Ag TNF-bindende Proteine
US6552170B1 (en) 1990-04-06 2003-04-22 Amgen Inc. PEGylation reagents and compounds formed therewith
US5252714A (en) 1990-11-28 1993-10-12 The University Of Alabama In Huntsville Preparation and use of polyethylene glycol propionaldehyde
WO1992016221A1 (en) 1991-03-15 1992-10-01 Synergen, Inc. Pegylation of polypeptides
JP3068301B2 (ja) * 1992-01-08 2000-07-24 三菱電機株式会社 Ｉｃカード内のコネクタ支持固定機構
FR2686899B1 (fr) 1992-01-31 1995-09-01 Rhone Poulenc Rorer Sa Nouveaux polypeptides biologiquement actifs, leur preparation et compositions pharmaceutiques les contenant.
WO1993024135A1 (en) 1992-05-26 1993-12-09 Immunex Corporation Novel cytokine that binds cd30
ES2258817T3 (es) 1997-05-21 2006-09-01 Biovation Limited Metodo para la produccion de proteinas no inmunogenas.
EP1051432B1 (en) 1998-12-08 2007-01-24 Biovation Limited Method for reducing immunogenicity of proteins
US20020052311A1 (en) 1999-09-03 2002-05-02 Beka Solomon Methods and compostions for the treatment and/or diagnosis of neurological diseases and disorders
US8022270B2 (en) 2000-07-31 2011-09-20 Biolex Therapeutics, Inc. Expression of biologically active polypeptides in duckweed
RU2363707C2 (ru) 2001-02-19 2009-08-10 Мерк Патент Гмбх Искусственные белки с пониженной иммуногенностью
CA2439926A1 (en) 2001-03-08 2002-09-12 Merck Patent Gesellschaft Mit Beschraenkter Haftung Modified human granulocyte macrophage colony stimulating factor (gm-csf) with reduced immunogenicity
DE10238846A1 (de) 2002-08-20 2004-03-04 Nemod Immuntherapie Ag Aktive Fusionsproteine und Verfahren zu ihrer Herstellung
WO2007095616A2 (en) 2006-02-15 2007-08-23 Ramot At Tel Aviv University Filamentous bacteriophage displaying protein as a binder of antibodies and immunocomplexes for delivery to the brain
EP1991259B1 (en) 2006-02-15 2012-10-10 Ramot at Tel-Aviv University Ltd. Viral display vehicles for treating multiple sclerosis
WO2007109733A2 (en) 2006-03-21 2007-09-27 The Johns Hopkins University Diagnostic and prognostic markers and treatment strategies for multiple sclerosis
US20090105090A1 (en) 2006-04-06 2009-04-23 Fumiaki Uchiyama Phage Display By Novel Filamentous Bacteriophage
CA2659032A1 (en) 2006-07-21 2008-01-24 Ramot At Tel Aviv University Ltd. Method for inhibiting or treating a disease associated with intracellular formation of protein fibrillar inclusions or aggregates
SG10201502661SA (en) 2006-10-11 2015-05-28 Antitope Ltd T cell epitope databases
US20110182948A1 (en) 2008-05-22 2011-07-28 Beka Solomon Method for treating disease characterized by plaque
CN102223887B (zh) 2008-11-24 2013-11-06 台拉维夫大学拉莫特 使用丝状噬菌体治疗帕金森病的方法
CA2829223A1 (en) 2011-03-11 2012-09-20 Beka Solomon Method for treating neurodegenerative tauopathy
AU2012346056B2 (en) * 2011-11-29 2018-02-22 Proclara Biosciences, Inc. Use of P3 of bacteriophage as amyloid binding agents
WO2014055515A1 (en) 2012-10-02 2014-04-10 Neurophage Pharmaceuticals, Inc. Use of p3 of bacteriophage fusion proteins as amyloid binding agents
TW201632542A (zh) 2014-12-03 2016-09-16 神經噬菌體製藥股份有限公司 包含缺乏醣基化信號之修飾噬菌體ｇ３ｐ胺基酸序列的多肽

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006083795A1 (en) * 2005-02-01 2006-08-10 Ramot At Tel-Aviv University Ltd. Method for treating inflammation associated with amyloid deposits and brain inflammation involving activated microglia
WO2011084714A2 (en) * 2009-12-17 2011-07-14 Biogen Idec Ma Inc. STABILIZED ANTI-TNF-ALPHA scFv MOLECULES OR ANTI-TWEAK scFv MOLECULES AND USES THEREOF

Also Published As

Publication number Publication date
KR20160010618A (ko) 2016-01-27
PH12015502585A1 (en) 2016-02-29
US20160115223A1 (en) 2016-04-28
EP3003349A1 (en) 2016-04-13
HK1223285A1 (zh) 2017-07-28
WO2014193935A1 (en) 2014-12-04
SG11201509647WA (en) 2015-12-30
CN105473153A (zh) 2016-04-06
MX2015016263A (es) 2016-04-18
US20180251534A1 (en) 2018-09-06
AU2014274253B2 (en) 2018-06-14
US9988444B2 (en) 2018-06-05
EP3003349B1 (en) 2018-12-12
US20170129945A9 (en) 2017-05-11
AU2014274253A1 (en) 2016-01-21
CA2913414A1 (en) 2014-12-04
JP2016526044A (ja) 2016-09-01
EA201592272A1 (ru) 2016-04-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA030389B1 (ru) ПОЛИПЕПТИДЫ, СОДЕРЖАЩИЕ ИЗМЕНЕННУЮ АМИНОКИСЛОТНУЮ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ g3p БАКТЕРИОФАГА С ПОНИЖЕННОЙ ИММУНОГЕННОСТЬЮ
US11013814B2 (en) Cartilage-homing peptide conjugates and methods of use thereof
US11723951B2 (en) Polypeptides comprising a modified bacteriophage G3P amino acid sequence lacking a glycosylation signal
EA028356B1 (ru) Лечение и профилактика амилоидоза
US8999921B2 (en) Process for diagnosing rheumatic diseases
EA013752B1 (ru) Предупреждение и лечение синуклеинопатических и амилоидогенных заболеваний
EA017611B1 (ru) Способ получения связывающей молекулы, специфичной к белку, ассоциированному с расстройством, или антитела или его связывающего фрагмента или по меньшей мере одной цепи иммуноглобулина, связывающих вышеуказанный белок (варианты), связывающая молекула, антитело, цепь иммуноглобулина или их связывающий фрагмент (варианты), антиген, полинуклеотид, вектор и клетка-хозяин, их включающие композиция и набор и способ диагностики или лечения неврологических расстройств посредством
WO1996018900A1 (en) Prevention of protein aggregation
EA023477B1 (ru) МОНОКЛОНАЛЬНОЕ АНТИТЕЛО, СВЯЗЫВАЮЩЕЕ ДОМЕН γ-С ФИБРИНА ИЛИ ФИБРИНОГЕНА
US20220339270A1 (en) Compositions and methods for the treatment of tauopathy
Southwell et al. Antibody therapy in neurodegenerative disease
BR112020025111A2 (pt) Motivo de interação amiloide geral (gaim)
KR101205655B1 (ko) 시냅토피신에 대한 특이적 결합 멤버
US20200385461A1 (en) Fusion constructs and uses thereof
EP3459970A1 (en) Norovirus nanobodies
US20210171589A1 (en) Truncated cartilage-homing peptides and peptide complexes and methods of use thereof
IL299503A (en) Preparations and methods for the treatment of allograft vasculopathy, Moyamoya disease, Moyamoya syndrome and proliferation of the inner mantle
CN115397865A (zh) 多种抗胰岛素降解酶抗体及其多种用途

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG TJ TM RU