EA023477B1 - МОНОКЛОНАЛЬНОЕ АНТИТЕЛО, СВЯЗЫВАЮЩЕЕ ДОМЕН γ-С ФИБРИНА ИЛИ ФИБРИНОГЕНА - Google Patents

Abstract

Изобретение предлагает выделенное антитело, связывающее домен γ-С фибрина или фибриногена. В различных вариантах осуществления этого изобретения такое антитело ингибирует адгезию микроглий к домену γ-С фибрина или фибриногена, ингибирует связывание рецептора Мас-1 с доменом γ-С фибрина или фибриногена и/или ингибирует клинические симптомы экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита (ЭАЭ). Предлагаются также различные способы использования антител, фармацевтических композиций, наборов, векторов, клеток, содержащих векторы, и способы получения антител.

Description

Перекрестная ссылка на родственные заявки

Описание изобретения заявляет преимущество приоритета патентной заявки США №61/248014, поданной 2 октября 2009 года, которая полностью включена в это описание изобретения посредством ссылки.

Заявление о научно-исследовательских и опытно-конструкторских работах по федеральному заказу

Изобретение частично финансировалось государством с помощью гранта № N8052189 Национального Института Здоровья. Г осударство имеет определенные права на это изобретение.

Включение материала, представленного в электронном виде, посредством ссылки

Список последовательностей, являющийся неотъемлемой частью этого описания изобретения, включает последовательности, представленные в документе под названием РиС110\У0_8Т25. созданном программным обеспечением Ра!еийи Уеткюи 3.5 Управления США по патентам и торговым маркам, и содержит нуклеотидные и/или аминокислотные последовательности, описанные в этом изобретении. Содержание списка последовательностей полностью включено в это описание изобретения посредством ссылки.

Область техники

Это изобретение относится, в целом, к созданию моноклональных антител и, в частности, к моноклональным антителам, распознающим домен уС фибрина, и к способам использования моноклональных антител как терапевтических средств.

Введение

Рассеянный склероз развивается в случаях, когда иммунная система атакует головной и спинной мозг, поражая миелин, изолирующий и защищающий нервные волокна. В такой атаке участвуют клетки головного мозга под названием микроглии, и такие клетки активируются, когда разрушается гематоэнцефалический барьер - слой выстилающих клеток, который должен защищать головной мозг от вторжения нежелательных элементов. Кроме своей известной роли в образовании сгустков крови, фибриноген активирует клетки микроглии и, таким образом, усиливает воспалительную реакцию в животных моделях рассеянного склероза. Кроме того, было установлено, что фибриноген участвует в патогенезе определенных видов рака, ревматоидного артрита и других заболеваний и патологий, в которых происходит повреждение ткани, через которое утекает фибриноген. См., например, Ака88од1ои е! а1., 2002, №итои, 33:861-875; Ака88од1ои е! а1., 2004, Ргос. Иа!1. Асай. 8с1. И8А, 101:6698-6703; Айашз е! а1., 2007, 1. Ехр. Мей., 35:2428-34. Было также установлено, что специфический рецептор, Мас-1, используемый фибриногеном в указанных эффектах, не принимает участие в полезных свойствах фибриногена, способствующих образованию сгустков крови. Однако к настоящему времени не был разработан ни один специфический ингибитор связывания фибриногена с рецептором Мас-1. Поэтому необходимы специфические ингибиторы связывания фибриногена с рецептором Мас-1, которые снижают способствующее воспалительному процессу влияние фибриногена на головной мозг и другие соответствующие области, сохраняя при этом полезное влияние фибриногена на образование сгустков крови.

Сущность изобретения

Изобретение предлагает выделенное антитело, связывающее домен уС фибрина или фибриногена. В определенных вариантах осуществления этого изобретения антитело демонстрирует подавление адгезии микроглий к домену уС фибрина или фибриногена более чем на 20%. В другом варианте осуществления этого изобретения антитело демонстрирует подавление адгезии Мас-1 к домену уС фибрина или фибриногена более чем на 50%. Еще в одном варианте осуществления этого изобретения антитело ингибирует клинические симптомы экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита (ЭАЭ) во время рецидива заболевания.

В различных вариантах осуществления этого изобретения антитело связывается с эпитопом у³ домена уС фибрина или фибриногена. Антитело, являющееся предметом этого изобретения, может, в качестве альтернативы, связываться с эпитопом у^190-202 домена уС фибрина или фибриногена. Такие антитела являются моноклональными антителами, и в различных вариантах осуществления этого изобретения - гуманизированными антителами или антителами человека.

В различных вариантах реализации этого изобретения антитело содержит легкую цепь с тремя гипервариабельными участками, определяющими комплементарность, содержащими аминокислотную последовательность, включая К88К8ЕЕН88С1ТУЪ8 (8ЕО ГО N0: 2), ОМ8Ж-А8 (8ЕО ГО N0: 3), и АОЖЕБРБТ (8ЕО ГО N0: 4). В различных вариантах реализации этого изобретения антитело содержит тяжелую цепь с тремя гипервариабельными участками, определяющими комплементарность, содержащими аминокислотную последовательность, включая ΟΥΤΡΤδΥ^ΙΗ (8Е0 ΙΌ N0:6), ΕΙΌΡ8Ό8ΥΤNΥN^I<ΡΒС (8Е0 ΙΌ N0: 7) и 8ИРТСС (8Е0 ΙΌ N0: 8). В определенных вариантах осуществления этого изобретения антитело содержит легкую цепь с тремя гипервариабельными участками, определяющими комплементарность, содержащими аминокислотную последовательность, включая Κ.88Κ8ΕΕΗ88ΟΓΓΥΕ8 (81 У) ГО N0: 2), ОМ8М.А8 (81 У) ГО N0: 3) и АОМ УУР1.Т (81 У) ГО N0: 4), и тяжелую цепь с тремя гипервариабельными участками, определяющими комплементарность, содержащи- 1 023477 ми аминокислотную последовательность, включая ΟΥΤΡΤδΥνίΗ (ЗЕО ГО N0:6), ЬГОРЗОЗУТХУХОКРИС (ЗЕО ГО N0: 7) и 3ΌΡΤΟΟ (ЗЕО ГО N0: 8).

В различных объектах этого изобретения указанные выше антитела содержат вариабельную легкую цепь с аминокислотной последовательностью ЗЕО ГО N0: 1. В различных объектах этого изобретения указанные выше антитела содержат вариабельную тяжелую цепь с аминокислотной последовательностью ЗЕО ГО N0: 5. В другом объекте этого изобретения указанные выше антитела содержат как вариабельную легкую цепь с аминокислотной последовательностью ЗЕО ГО N0: 1, так и вариабельную тяжелую цепь с аминокислотной последовательностью ЗЕО ГО N0: 5.

Еще в другом объекте этого изобретения указанные выше антитела содержат, каждое в отдельности, легкую цепь с тремя гипервариабельными участками, определяющими комплементарность, содержащими аминокислотную последовательность, на 80% отвечающую таким последовательностям, как ΚЗЗΚЗ^^ΗЗЗΟIΤΥ^З (ЗЕО ГО N0: 2), ОМЗХРАЗ (ЗЕО ГО N0: 3), и Лр^ЕЬРЬТ (ЗЕО ГО N0: 4), и тяжелую цепь с тремя гипервариабельными участками, определяющими комплементарность, содержащими аминокислотную последовательность, на 80% отвечающую таким последовательностям, как С.¥ТРТЗ¥\\'П I (ЗЕО ГО N0:6), РГОРЗОЗУТХУХОКРИС, (ЗЕО ГО N0: 7) и З1)РТС.С (ЗЕО ГО N0: 8); причем участки комплементарности легкой цепи и участки комплементарности тяжелой цепи сохраняют способность связывать рецептор Мас-1.

В другом варианте реализации этого изобретения указанные выше антитела содержат, каждое в отдельности, легкую цепь с тремя гипервариабельными участками, определяющими комплементарность, содержащими аминокислотную последовательность, на 90% отвечающую таким последовательностям, как ΚЗЗΚЗ^^ΗЗЗΟIΤΥ^З (ЗЕО ГО N0: 2), ОМЗХРАЗ (ЗЕО ГО N0: 3), и ЛОХЕКЕРРТ (ЗЕО ГО N0: 4), и тяжелую цепь с тремя гипервариабельными участками, определяющими комплементарность, содержащими аминокислотную последовательность, на 90% отвечающую таким последовательностям, как С.УТРТЗУ\\'П I (ЗЕО ГО N0:6), РГОРЗОЗУТХУХОКРНС, (ЗЕО ГО N0: 7) и З1)РТС,С (ЗЕО ГО N0: 8); причем участки комплементарности легкой цепи и участки комплементарности тяжелой цепи сохраняют способность связывать рецептор Мас-1.

Еще в другом варианте реализации этого изобретения указанные выше антитела содержат, каждое в отдельности, легкую цепь с тремя гипервариабельными участками, определяющими комплементарность, содержащими аминокислотную последовательность, на 95% отвечающую таким последовательностям, как ΚЗЗΚЗ^^ΗЗЗΟIΤΥ^З (ЗЕО ГО N0: 2), ОМЗХРАЗ (ЗЕО ГО N0: 3), и ЛОХЕКЕРРТ (З1Т) ГО N0: 4), и тяжелую цепь с тремя гипервариабельными участками, определяющими комплементарность, содержащими аминокислотную последовательность, на 95% отвечающую таким последовательностям, как С.УТРТЗУ\\'П I (ЗЕО ГО N0:6), РГОРЗОЗУТХУХОКРНС, (ЗЕО ГО N0: 7) и З1)РТС,С (ЗЕО ГО N0: 8); причем участки комплементарности легкой цепи и участки комплементарности тяжелой цепи сохраняют способность связывать рецептор Мас-1.

Еще в другом варианте реализации этого изобретения указанные выше антитела содержат, каждое в отдельности, легкую цепь с тремя гипервариабельными участками, определяющими комплементарность, содержащими аминокислотную последовательность, на 99% отвечающую таким последовательностям, как ΚЗЗΚЗ^^ΗЗЗΟIΤΥ^З (З1Т) ГО N0: 2), ОМЗХРЛЗ (ЗЕО ГО N0: 3), и ЛОХЕКЕРРТ (З1Т) ГО N0: 4), и тяжелую цепь с тремя гипервариабельными участками, определяющими комплементарность, содержащими аминокислотную последовательность, на 99% отвечающую таким последовательностям, как С.УТРТЗУ\\'П I (ЗЕО ГО N0:6), РГОРЗОЗУТХУХОКРНС, (ЗЕО ГО N0: 7) и З1)РТС,С (ЗЕО ГО N0: 8); причем участки комплементарности легкой цепи и участки комплементарности тяжелой цепи сохраняют способность связывать рецептор Мас-1.

Предлагается также способ снижения выраженности симптомов патологии, зависящей от связывания Мас-1 с фибрином или связывания Мас-1 с фибриногеном, заключающийся во введении антитела по п.1 (формулы изобретения) пациенту, для которого следует добиться снижения выраженности симптомов такой патологии, в количестве, достаточном для снижения выраженности симптомов патологии у такого пациента. В различных вариантах реализации этого способа пациентом является человек. В различных вариантах реализации этого способа патология включает рассеянный склероз, повреждение спинного мозга, болезнь Альцгеймера, инсульт, ревматоидный артрит и рак.

Предлагается также фармацевтическая композиция, содержащая указанные выше антитела и фармацевтически приемлемый носитель. Другим предметом этого изобретения является набор, содержащий указанные выше антитела. Еще другим предметом этого изобретения является вектор, содержащий последовательность нуклеиновых кислот, кодирующую эпитоп γ ^- фибрина, СΚΚΤΤΜΚIIΡРNΚ^ΤIΟ (ЗЕО ГО N0: 18), или его биологически активное производное.

Другим предметом этого изобретения является способ создания антитела, которое иммуноспецифи377 395 чески связывается с эпитопом γ ^- фибрина или его биологически активным производным, заключающийся во введении пациенту первой дозы клеток по п.23 (формулы изобретения), причем такая первая доза является достаточной для развития иммунной реакции у такого пациента. В различных вариантах осуществления этого изобретения указанный способ может также включать этап введения пациенту вто- 2 023477 рой дозы указанных клеток, причем такая вторая доза является достаточной для развития иммунной реакции у такого пациента. В различных вариантах осуществления этого изобретения полученное антитело ингибирует связывание фибрина с рецептором Мас-1 в организме пациента.

Другим предметом этого изобретения является способ отбора лиганда, связывающегося с рецептором Мас-1 и модулирующего активность рецептора Мас-1, заключающийся в (а) получении антитела по

377 395

п.1 (формулы изобретения); (б) приведении такого антитела в контакт с эпитопом γ ^- фибрина, СККТТМКПРРИВЬТЮ (5>ЕО ГО N0: 18), или его биологически активным производным, с образованием комплекса антитело-полипептид; (в) приведении комплекса антитело-полипептид в контакт с композицией, содержащей соединение, являющееся предметом отбора; и (г) определении того, связывается ли соединение, являющееся предметом отбора, с моноклональным антителом; причем связывание соединения, являющегося предметом отбора, указывает на то, что такое соединение является лигандом, модулирующим активность рецептора Мас-1.

Эти и другие особенности, характерные черты и преимущества настоящего изобретения можно лучше понять, обратившись к следующему полному описанию, примерам и прилагающейся формуле изобретения.

Краткое описание фигур

Специалисты в данной области понимают, что представленные ниже рисунки служат лишь иллюстрациями. Эти рисунки никоим образом не ограничивают объем данного изобретения.

Фиг. 1 - связывание моноклонального антитела, оцениваемое измерением поглощения на длине волны 595 нм в сравнении с коммерчески доступным блокирующим антителом к Мас-1 (М1/70);

фиг. 2 - результаты твердофазного иммуноферментного анализа связывания антитела с фибриногеном;

377-395 фиг. 3 - моноклональное антитело 5В8 к модифицированному эпитопу γ^{3 -} фибрина демонстрирует повышенную эффективность подавления фагоцитоза;

фиг. 4 - эксперименты ίη νίνο введения антифибриновых антител в случае вызванного протеолипидным белком экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита после первого появления клинических симптомов, связанных с антителами (А) 4Е11 и (В) 5В8. Моноклональное антитело 5В8 вызывает подавление симптомов во время рецидива.

Подробное описание изобретения Сокращения и определения

Если иное не определено, научные и технические термины, используемые в этом описании изобретения, должны иметь значения, являющиеся общепринятыми среди специалистов. Кроме того, если контекст не требует иного, термины, приведенные в единственном числе, должны включать также и множественное число, и наоборот, термины, приведенные во множественном числе, должны включать также и единственное число. Как правило, в описании методик, клеток и культур клеток, микробиологических характеристик и химических характеристик белков, олиго- и полинуклеотидов и гибридизации в этом описании изобретения используются виды номенклатуры, хорошо известные и широко используемые специалистами. В работе с рекомбинантной ДНК, синтезе олигонуклеотидов, при работе с культурами клеток и для трансформации клеток используются стандартные методики. Ферментативные реакции и методики очистки осуществлялись с использованием доступных в торговле наборов в соответствии с техническими условиями изготовителя или в соответствии с общепринятыми среди специалистов методиками или методиками, представленными в этом описании изобретения.

Если иное не указано, в практической реализации этого изобретения используются традиционные методы молекулярной биологии (включая методы рекомбинантных ДНК), микробиологии, клеточной биологии, биохимии и иммунологии, знакомые специалистам. Такие методы полностью описаны в литературе, такой как: Мо1еси1аг С1ошпд: А ЬаЪотаЮгу Мапиа1 (Молекулярное клонирование: лабораторное руководство), кесопй еййоп (§атЪтоок е( а1., 1989) Со1й 8ртшд НагЪог Ргекк; Ойдопис1еоййе 8уп1Ьек1к (синтез олигонуклеотидов) (М.Т СаЪ, ей., 1984); Мейюйк ш Мо1еси1аг Вю1оду (Методы молекулярной биологии), Нитапа Ргекк; Се11 Вю1оду: А ЬаЪотаЮгу №1еЪоок (Клеточная биология: лабораторный журнал) (ТЕ. СеШк, ей., 1998) Асайетю Ргекк; Ашта1 Се11 СиЬиге (Культуры животных клеток) (КТ РтекЬпеу, ей., 1987); Штойисйоп 1о Се11 апй Тюкие СиЬиге (Введение в клетки и культуры тканей) (Й.Р. МаШет апй Р.Е. КоЪейк, 1998) Р1епит Ргекк; Се11 апй Т1ккие СиЬиге: ЬаЪотаЮгу Ртосейитек (Клетки и культуры тканей: лабораторные процедуры) (А. Ооу1е. ТВ. Сг|ГП1кк. апй Э.С. №\уе1к ейк., 30 1993-1998) ί. АЬеу апй 8опк; Мейюйк ш Еп/уто1оду (Методы энзимологии) (Асайетю Ргекк, 1пс.); НапйЪоок оГ Е\рептеп1а1 1ттипо1оду (Руководство по экспериментальной иммунологии) (ГОМ. АеЬ апй С.С. В1аск\уе1к ейк.); Сепе ТгапкГег УесЮгк Гог Маттайап Се11к (Векторы передачи генов в клетках млекопитающих) (ТМ. МШет апй М.Р. Са1ок, ейк., 1987); СиггеШ Рго1осо1к ш Мо1еси1аг Вю1оду (Действующие протоколы в молекулярной биологии) (Р.М. АикиЪе1 е( а1., ейк., 1987); РСК: ТЬе Ро1утегаке СЬат Кеасйоп (ПЦР - полимеразная цепная реакция) (МиШк е( а1., ейк., 1994); СиггеШ Рго1осо1к ш 1ттипо1оду (Действующие протоколы в иммунологии) (ТЕ. Сойдап 35 е( а1., ейк., 1991); §ЬоЬ РгоЮсо1к ш Мо1еси1аг Вю1оду (Краткие протоколы в молекулярной биологии) (АЬеу апй 8опк, 1999); 1ттипоЪю1оду (Им- 3 023477 мунобиология) (С.А. 1апе\уау апб Р. Тгаусге. 1997); ЛпНЬоб1е8 (Антитела) (Р. Ршсй, 1997); ЛпНЬоб1е8: аргасНса1 арргоасй (Антитела: непрактичный подход) (Ό. Сабу., еб., 1РЬ Рге88, 1988-1989); Мопос1опа1 апИЬоб1е8: а ргасбса1 арргоасй (Моноклональные антитела: непрактичный подход) (Р. 8йерйегб апб С. Эеап. еб8., ОхГогб Итуегейу Рге88, 2000); Иктд апбЬоб1е8: а 1аЬога1огу тапиа1 (Использование антител: лабораторное руководство) (Е. Наг1о\у апб Ό. Ьапе (Со1б 8ргшд НагЬог ЬаЬога1огу Рге88, 1999); Тйе АпбЬоб1е8 (Антитела) (М. 2апеШ апб ΕΌ. Сарга, еб8., Нагоооб Асабепис РиЬЙ8Йег8, 1995); и Сапсег: РгшсЕ р1е8 апб РгасНсе оГ Опсо1оду (Рак: практическая онкология) (У.Т. ЭеУНа е! а1., еб8., ЕВ. ЫрршсоИ Сотрапу, 1993).

В связи с лабораторными процедурами и методиками получения антитител, получением гибридом, методами аналитической химии, синтетической органической химии и медицинской и фармацевтической химии, представленными в этом описании изобретения, используется хорошо известная и широко используемая специалистами номенклатура. Для химического синтеза, химического анализа, фармацевтических препаратов, составов и их доставки и лечения пациентов используются стандартные методики.

Используемые в этом описании изобретения термины, если иное не указано, должны иметь следующие значения.

Антитело. В этом описании изобретения термин антитело означает молекулы иммуноглобулина и иммунологически активные части молекул иммуноглобулина (1д), т.е. молекулы, содержащие связывающие антиген участки, которые иммунологически связывают антиген. Антитела включают, среди прочего, поликлональные, моноклональные, химерные, доменные, одноцепочечные фрагменты Р_аЬ, Р_аЬ и Р(_аЬ')₂, одноцепочечные фрагменты Ρν (8сРх8) и экспрессионную библиотеку Р_аЬ (фрагментов антител). Основная структурная единица антитела представляет собой тетрамер. Каждый тетрамер состоит из двух идентичных пар полипептидных цепей, и каждая пара имеет одну легкую цепь (примерно 25 кДа) и одну тяжелую цепь (примерно 50-70 кДа). Аминотерминальная часть каждой цепи включает вариабельный участок (У-домен) примерно из 100-110 или большего количества аминокислотных остатков, ответственный, в первую очередь, за распознавание антигенов. Карбокситерминальная часть каждой цепи определяет постоянный участок, в первую очередь, ответственный за эффекторную функцию. В общем случае молекулы антител, полученных от человека, относятся к любому из классов иммуноглобулинов О, М, А, Е и Ό (1дО, 1дМ, 1дЛ, 1дЕ и Ι§Ό), которые отличаются друг от друга природой тяжелой цепи молекулы. Некоторые классы содержат также подклассы, такие как иммуноглобулины 1дО_ь 1дО₂ и другие. Кроме того, легкими цепями антител человека могут быть каппа-цепь или лямбда-цепь.

Моноклональное антитело. Термин моноклональное антитело (МЛЬ) или композиция моноклональных антител, используемый в этом описании изобретения, означает популяцию антител, содержащую только один вид, состоящий из уникального легкоцепочечного генного продукта и уникального тяжелоцепочечного генного продукта. В частности, гипервариабельные участки, определяющие комплементарность (СОР) моноклонального антитела, во всех молекулах такой популяции являются идентичными. Моноклональные антитела содержат связывающий антиген участок, способный иммунологически связывать определенный эпитоп антигена и характеризующийся уникальной связывающей способностью в отношении такого антигена.

Участок, связывающий антиген/связывающий участок. Термин связывающий антиген участок или связывающий участок означает часть молекулы антитела, которая участвует в связывании антитела. Связывающий антиген участок образуется аминокислотными остатками Ν-терминальнальных вариабельных (У) участков тяжелых (Н) и легких (Ь) цепей. Три весьма дивергирующих участка в пределах Vучастков тяжелых и легких цепей, называемые гипервариабельные участки, располагаются между менее изменчивыми участками под названием каркасные участки (РР). Таким образом, термин каркасный участок означает аминокислотную последовательность, которая в естественных условиях находится между гипервариабельными участками иммуноглобулинов и примыкает к ним. В молекуле антитела три гипервариабельные участка легкой цепи и три гипервариабельных участка тяжелой цепи так располагаются в пространстве относительно друг друга, чтобы образовать связывающую антиген поверхность. Связывающая антиген поверхность комплементарна трехмерной поверхности связываемого антигена и три гипервариабельных участка каждой из тяжелых и легких цепей называются также участками, определяющими комплементарность или СОР. Отнесение аминокислот к каждому домену осуществляется в соответствии с определениями Последовательностей Кэбэта белков, представляющих интерес для иммунологии (КаЬа! 8ецнепсе8 оГ Рго1еш8 оГ 1ттипо1одюа1 1п1еге81 (№Чюпа1 1ик1Ни1е8 оГ НеаНй, Ве1йе8ба, Мб. (1987 апб 1991)), или Сйобиа & Ье8к 1. Мо1. Вю1. 196:901-917 (1987), Сйобиа е! а1. Мпиге 342:878-883 (1989). Инструкции по идентификации гипервариабельных участков, определяющих комплементарность, приведены на сайте: йбр: //\\у\уу.ЬютГ.ог8.ик/аЬ8/#сбпб.).

Эпитоп. Использующийся в этом описании изобретения термин эпитоп включает любую белковую детерминанту антигена, способную специфично связываться с антителом или рецептором Т-клетки. Детерминанты эпитопа обычно состоят из химически активных поверхностных групп молекул, таких как аминокислоты или боковые цепи сахаров, и обычно обладают специфическими объемными структурными характеристиками и специфическими характеристиками заряда. Например, антитела могут быть приподнятыми относительно Ν-терминальных и С-терминальных пептидов полипептида. Антитело называ- 4 023477 ют специфически связывающим определенный антиген, если константа диссоциации составляет величину <1 мкМ, предпочтительно < 100 нМ и более предпочтительно < 10 нМ. Биологически активные производные эпитопа γ^377-395 ΟΚΚΤΤΜΚΙΙΡΡΝΚΣΤΙΟ (δΕΟ ΙΌ N0: 18) можно определить как полученные специалистами в данной области. Например, см. Идагоуа е! а!. Исиййсайои οί а ηονβΐ гссодшйои 5сс.|испсс ίοτ ш1сдгш α_Μβ₂ χνίΐΐύη !Ьс у-сЬаш οί йЪйподсп. 1. ΒίοΙ СЬет. 1998; 273:22519-22527; υда^ονа с! а1. Кссодηίϋοη οί йЪйподсп Ъу 1сикосу!с пИсдгпъ. Апп Ν Υ Асай. 8ст. 2001; 936:368-385.

Иммунологическое связывание. Используемый в этом описании изобретения термин иммунологическое связывание и свойства иммунологического связывания означает нековалентное взаимодействие такого типа как взаимодействие между молекулой иммуноглобулина и антигена, по отношению к которому такой иммуноглобулин является специфичным. Сила или сродство взаимодействий иммунологического связывания может выражаться в виде константы диссоциации (К_д) продукта взаимодействия, причем меньшие значения К_д соответствуют большему сродству. Свойства иммунологического связывания отдельных полипептидов можно определить количественно с помощью методов, хорошо известных специалистам. Один из таких методов включает измерение скорости комплексообразования связывающего антиген сайта с антигеном и скорости диссоциации такого комплекса, причем такие скорости зависят от концентрации частиц, образующих комплекс, сродства взаимодействующих частиц и их геометрических параметров, которые в равной степени влияют на скорость как прямой, так и обратной реакции комплексообразования. Таким образом, константа скорости прямой реакции (ассоциации) (Κ_οη) и константа скорости обратной реакции (диссоциации) (Κ_οίί) могут определяться расчетом концентраций и фактических скоростей комплексообразования и диссоциации (см. №Цигс 361:186-87 (1993)). Отношение констант скоростей прямой и обратной реакции позволяет исключить все параметры, не связанные со сродством молекул, и равно константе диссоциации (К_д) (см., в общем, ^аν^С8 с! а1. (1990) Аиииа1 Кс\'

ВюсЬст 59:439-473). Антитело, являющееся предметом этого изобретения, специфически связывается с

377-395 эпитопом γ^377-395 фибриногена, если равновесная константа связывания (Кд) <1 мкм, предпочтительно <100 нМ, еще более предпочтительно <10 нМ и наиболее предпочтительно от <100 пМ до примерно 1 пМ при измерении такими методами как испытание связывания с радиоактивно-меченым лигандом, или иными аналогичными методами, известными специалистам.

Фибрин и фибриноген. Используемые в этом описании изобретения термины фибрин и фибриноген используются на взаимозаменяемой основе и означают полипептид, его фрагмент или аналог, обладающий способностью связываться с рецептором Мас-1. Фибриноген является растворимым прекурсором фибрина, и оба вещества содержат домен γС и, таким образом, эпитопы, являющиеся предметом этого изобретения.

Изолированный полинуклеотид. Термин изолированный полинуклеотид, используемый в этом описании изобретения, означает полинуклеотид геномного (кДНК) или синтетического происхождения, или смешанного (из этих двух типов) происхождения, который, в силу своего происхождения как изолированный нуклеотид, (1) не связан ни с полным полинуклеотидом, ни с частью полинуклеотида, в котором такой изолированный полинуклеотид находят в природе, (2) функционально связан с полинуклеотидом, с которым он не связан в природе, или (3) не встречается в природе в виде части более крупной последовательности.

Изолированный белок. Термин изолированный белок, используемый в этом описании изобретения, означает белок, происходящий от кДНК или рекомбинантной РНК, или синтетического происхождения, или смешанного происхождения, который, в силу своего происхождения, источника или получения как изолированного белка: (1) не связан с природными белками, (2) не содержит других белков из такого же источника, (3) вырабатывается клетками другого вида или (4) не встречается в природе.

Полипептид. Термин полипептид, используемый в этом описании изобретения, означает природные белки, фрагменты белков и фрагменты или аналоги полипептидной последовательности. Фрагменты природных белков и аналоги считаются видами определенного полипептидного рода. Примеры полипептидов, представленных в этом описании изобретения, включают легкую цепь молекулы иммуноглобулина, представленную как последовательность δΕΟ ΙΌ N0: 1, и тяжелую цепь молекулы иммуноглобулина, представленную как последовательностью δΕΟ ΙΌ N0: 5, а также гипервариабельные участки, представленные последовательностями δΕΟ ΙΌ №№ 2, 3, 4, 6, 7 и 8; молекулы антител, образованных комбинациями, содержащими тяжелую цепь молекул иммуноглобулина, с легкой цепью молекул иммуноглобулина, такой как каппа-цепь молекул иммуноглобулина, и наоборот, а также фрагменты и аналоги таких молекул.

Встречающийся в природе. Термин встречающийся в природе, используемый в этом описании изобретения в связи с различными объектами, означает тот факт, что определенный объект можно найти в природе. Например, полипептидная или полинуклеотидная последовательность, присутствующая в организме (включая вирус), которую можно выделить из природного источника, и которая не была специально модифицирована человеком в лаборатории или иным образом, является встречающейся в природе последовательностью.

Функционально связанный. Термин функционально связанный, используемый в этом описании изобретения, означает такое взаимное расположение компонентов, которое позволяет им функциониро- 5 023477 вать заданным способом. Управляющая последовательность, функционально связанная с кодирующей последовательностью, связана таким образом, что экспрессия кодирующей последовательности достигается в условиях, сопоставимых с условиями для управляющей последовательности.

Управляющая последовательность. Термин управляющая последовательность, используемый в этом описании изобретения, означает полинуклеотидную последовательность, необходимую для осуществления экспрессии и процессинга кодирующей последовательности, с которой она связана. Такие управляющие последовательности имеют разную природу в зависимости от организма хозяина. У прокариотов такие управляющие последовательности, как правило, включают промотор, рибосомный связывающий сайт и кодон, терминирующий транскрипцию. Термин управляющая последовательность должен включать, как минимум, все компоненты, чье присутствие необходимо для экспрессии и процессинга, и может также включать дополнительные компоненты, присутствие которых является полезным, например, лидерную последовательность и последовательности участников слияния.

Полинуклеотид. Термин полинуклеотид, используемый в этом описании изобретения, означает полимерное соединение нуклеотидов длиной не менее 10 оснований, причем либо рибонуклеотидов, либо дезоксирибонуклеотидов, либо модифицированной формы каждого из этих двух типов нуклеотидов. Этот термин включает также одноцепочечную и двухцепочечную форму ДНК.

Олигонуклеотид. Термин олигонуклеотид, используемый в этом описании изобретения, означает встречающиеся в природе и модифицированные нуклеотиды, связанные друг с другом встречающимися в природе и не встречающимися в природе олигонуклеотидными связями. Олигонуклеотиды - это подмножество полинуклеотидов, как правило, содержащих в длину 200 или менее оснований. Предпочтительно, олигонуклеотиды содержат от 10 до 60 оснований в длину и наиболее предпочтительно от 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 до 40 оснований в длину. Олигонуклеотиды, как правило, являются одноцепочечными, например олигонуклеотиды, используемые в качестве зондов; впрочем, олигонуклеотиды могут быть и двухцепочечными, например используемые для создания мутантов генов.

Встречающиеся в природе нуклеотиды. Термин встречающиеся в природе (природные) нуклеотиды, используемый в этом описании изобретения, включает дезоксирибонуклеотиды и рибонуклеотиды. Термин модифицированные нуклеотиды, упомянутый в этом описании изобретения, включает нуклеотиды с модифицированными или замещенными группами сахара и тому подобное. Термин олигонуклеотидные связи, упомянутый в этом описании изобретения, включает такие олигонуклеотидные связи как фосфотиоат, фосфоселеноат, фосфоанилотиоат, фосфоаниладат и др. См., например, ЬаР1апсЬе е! а1. Ыис1. Ас1йк Кек. 14:9081 (1986); §!ес е! а1. 1. Ат. СЬет. §ос. 106:6077 (1984), §!еш е! а1. Ыис1. Ас1йк Кек. 16:3209 (1988), Ζοη е! а1. Апй Сапсег Эгид Оеыдп 6:539 (1991); Ζοη е! а1. ОЬдопис1еоййек апй Апа1одиек: А Ртасйса1 АрргоасЬ, рр. 87-108 (Р. Ескк!ет, Ей., ОхГогй ИшуеткИу Ргекк, ОхГогй Епд1апй (1991)); §!ес е! а1. патент США № 5151510; иЬ1тапп апй Реутап СЬетюа1 Ке\1е\ук 90:543 (1990). Нуклеотид может включать также метку для его обнаружения, если потребуется.

Селективно гибридизировать. Термин селективно гибридизировать, используемый в этом описании изобретения, означает детектируемым образом и специфично связывать. Полинуклеотиды, олигонуклеотиды и их фрагменты, представленные в этом описании изобретения, селективно гибридизируются к нитям нуклеиновых кислот в условиях гибридизации и отмывки, которые минимизируют ожидаемые количества детектируемого связывания с неспецифическими нуклеиновыми кислотами. Для достижения условий селективной гибридизации могут использоваться весьма жесткие условия, известные специалистам и представленные в этом описании изобретения. Как правило, гомология последовательностей нуклеиновых кислот в полинуклеотидах, олигонуклеотидах и их фрагментах, представленных в этом описании изобретения, с целевой последовательностью нуклеиновых кислот составляет не менее 80%, более типичной и предпочтительно возрастающей гомологией является не менее чем 85, 90, 95, 99 и 100%-ная гомология. Две аминокислотные последовательности являются гомологичными, если существует частичная или полная идентичность их последовательностей. Например, 85%-ная гомология означает, что 85% аминокислот являются идентичными при сопоставлении двух последовательностей с максимальным соответствием. Допускаются пробелы (в каждой из двух сопоставляемых последовательностей) для обеспечения максимального соответствия длиной 5 или менее остатков, более предпочтительно длиной 2 или менее остатков. В качестве альтернативы и более предпочтительно - две белковые последовательности (или полипептидные последовательности, производные от них, длиной не менее 30 аминокислотных остатков) являются гомологичными, в значении, используемом в этом описании изобретения, если их оценка выравнивания превышает 5 (стандартных единиц расхождения) по программе АЫСЫ с использованием матрицы данных мутаций и штрафа за пропуск в последовательности, равного 6 или выше. См. §ее ОауЬоГГ. М.О., в Атласе белковых последовательностей и структур (А!1ак оГ Рто!еш §ециепсе апй 8!гис!иге), стр. 101-110 (Том 5, Национальный фонд биомедицинских исследований (Ыайопа1 Вютейюа1 КекеагсЬ Роипйайоп) (1972)) и Дополнение 2 к этому тому, стр. 1-10. Более предпочтительно, две последовательности или их части являются гомологичными, если их аминокислоты на 50% или более идентичны при оптимальном сопоставлении с использованием программы АЫСЫ. Термин соответствует используется в этом описании изобретения для обозначения того, что полинуклеотидная последовательность является гомологичной (т.е. идентичной, не обязательно эволюционно родственной)

- 6 023477 всей или части полинуклеотидной последовательности сравнения, или того, что полипептидная последовательность является идентичной полипептидной последовательности сравнения. В отличие от этого, термин комплементарный используется в этом описании изобретения для обозначения того, что комплементарная последовательность является гомологичной по отношению ко всей или части полинуклеотидной последовательности сравнения. Для примера, нуклеотидная последовательность ТАТАС соответствует последовательности сравнения ТАТАС и является комплементарной последовательности сравнения ОТАТА.

Приведенные ниже термины - последовательность сравнения, интервал сравнения, идентичность последовательностей, процент идентичности последовательностей и существенная идентичность - используются для описания соотношения последовательностей двух или более полинуклеотидных или аминокислотных последовательностей.

Последовательность сравнения. Последовательность сравнения - это определенная последовательность, используемая как основание для сравнения последовательностей. Последовательность сравнения может быть частью более крупной последовательности, например сегментом полномерной кДНК или генной последовательности, приведенной в списке последовательностей, либо может содержать полную кДНК или генную последовательность. Как правило, последовательность сравнения содержит не менее 18 нуклеотидов или 6 аминокислотных остатков, нередко не менее 24 нуклеотидов или 8 аминокислотных остатков, и часто не менее 48 нуклеотидов или 16 аминокислотных остатков. Так как две полинуклеотидные или аминокислотные последовательности могут (каждая) (1) содержать последовательность (т.е. часть полной полинуклеотидной или аминокислотной последовательности), аналогичную в обеих молекулах, и (2) могут также содержать последовательность, отличающуюся для двух полинуклеотидных или аминокислотных последовательностей, сравнение последовательностей двух (или более) молекул, как правило, осуществляется путем сравнения последовательностей двух молекул в определенном интервале сравнения для определения и сравнения отдельных участков сходства последовательностей.

Интервал сравнения. Используемый в этом описании изобретения термин интервал сравнения означает схематический участок из не менее чем 18 смежных положений нуклеотидов или 6 аминокислот, на котором полинуклеотидную последовательность или аминокислотную последовательность можно сравнивать с последовательностью сравнения, содержащей не менее 18 смежных нуклеотида или 6 аминокислотных остатков, и в котором часть полинуклеотидной последовательности в интервале сравнения может содержать добавления, делеции, замещения и тому подобное (т.е. пропуски), не превышающие 20% в сравнении с последовательностью сравнения (которая не содержит добавлений или делеций) при оптимальном сопоставлении обеих последовательностей. Оптимальное сопоставление последовательностей для выставления интервала сравнения можно осуществлять с помощью алгоритма локальной гомологии, представленного в 8тИй апб \Уа1сгтап Αάν. Арр1. Ма1й. 2:482 (1981), алгоритма выверки гомологии №еб1етап апб ХУипзсН 1. Мо1. Βίο1. 48:443 (1970), метода поиска сходства Реагзоп апб Ыртап Ргос. №и1. Асаб. 8ск (И.8.А.) 85:2444 (1988), компьютеризованной реализации этих алгоритмов (программы ОАР, ВЕ8ТРГГ, РА8ТА и ТРА8ТА в пакете программ ХУРсопмп ОепеИсз 8оП\уаге Раскаде, выпуск 7.0, (ОепеИсз Сотрйег Огоир, 575 8с1епсе Иг., Маб1зоп, ^18.), Оепе\\огкз. или в пакете программного обеспечения МасУес1ог), или с помощью проверки и лучшего сопоставления (т.е. приводящего к наибольшему проценту гомологии в интервале сравнения) различными выбранными методами.

Родство последовательностей. Термин идентичность последовательностей означает, что две полинуклеотидные или аминокислотные последовательности являются идентичными (т.е. на основании сравнения нуклеотида с нуклеотидом и остатка с остатком) в пределах интервала сравнения. Термин процент идентичности последовательностей определяется сравнением двух оптимально выровненных последовательностей в интервале сравнения с подсчетом количества положений, в которых находятся идентичные основания нуклеиновых кислот (например, А, Т, С, О, и или Г) или идентичные аминокислотные остатки в обеих последовательностях для определения количества совпадающих положений; затем количество совпадающих положений делится на общее количество положений в интервале сравнения (т.е. на размер интервала сравнения) и результат умножается на 100 для получения процента идентичности последовательностей. Термин существенная идентичность, используемый в этом описании изобретения, служит характеристикой полинуклеотидной или аминокислотной последовательности, согласно которой полинуклеотидная или аминокислотная последовательность демонстрирует не менее 85%-ную идентичность, предпочтительно - не менее 90-95%-ную идентичность, как правило, не менее 99%-ную идентичность последовательности сравнения в интервале сравнения длиной не менее 18 положений нуклеотидов (6 положений аминокислот), часто - в интервале сравнения длиной не менее 24-48 положений нуклеотидов (8-16 положений аминокислот), причем процент идентичности последовательностей рассчитывается путем сравнения последовательности сравнения с последовательностью, которая может включать не более 20% делеций или добавлений относительно последовательности сравнения в интервале сравнения. Последовательность сравнения может быть частью более крупной последовательности.

Аминокислоты. В этом описании изобретения используются двадцать традиционных аминокислот и их сокращенных общепринятых названий. См. Иммунология - А Синтез (Гттипо1оду-А 8уп1йез1з (2пб ЕбШоп, Е.8. Оо1иЬ апб Ό.Κ. Огеп, Ебз., 8шаиег Аззос1а1ез, 8ипбег1апб Мазз. (1991)). Стереоизомеры

- 7 023477 (например, Ό-аминокислоты) двадцати традиционных аминокислот, не встречающиеся в природе аминокислоты, такие как α-,α-дизамещенные аминокислоты, Ν-алкиламинокислоты, молочная кислота и другие нетрадиционные аминокислоты также могут быть подходящими компонентами полипептидов, являющихся предметом этого изобретения. Примеры нетрадиционных аминокислот включают 4гидроксипролин, γ-карбоксиглутамат, ε-Ν,Ν,Ν-триметиллизин, ε-Ν-ацетиллизин, О-фосфосерин, Νацетилсерин, Ν-формилметионин, 3-метилгистидин, 5-гидроксилизин, α-Ν-метиларгинин и другие подобные аминокислоты и иминокислоты (например, 4-гидроксипролин). В записи полипептидных последовательностей в этом описании изобретения направление влево означает аминотерминальное направление, а направление вправо - карбокситерминальное направление в соответствии со стандартным (традиционным) написанием. Аналогичным образом, если иное не определено, левый конец одноцепочечных полинуклеотидных последовательностей является 5'-концом, а направление двухцепочечных нуклеотидных последовательностей влево - 5'-направлением. Направление 5'-3' добавления образующихся транскриптов РНК называется участком последовательности в (прямом) направлении транскрипции на нити ДНК, обладающим такой же последовательностью, что и РНК, а направление 5'-5' транскрипции РНК называется последовательностью транскрипции в обратном направлении или последовательностью против хода транскрипции (левым элементом оперона) на нити ДНК, обладающей такой же последовательностью, что и РНК, и З'-положения относительно З'-конца транскрипта РНК называются положениями по ходу транскрипции (или правым элементом оперона).

Существенная идентичность. В применении к полипептидам термин существенная идентичность означает, что две пептидные последовательности при оптимальном сопоставлении, например, с помощью программ САР или ΒΕδΤΡΙΤ, используя стандартные (по умолчанию) взвешенные количества пробелов, дают не менее чем 80%-ную идентичность последовательностей, предпочтительно не менее чем 90%-ную идентичность последовательностей, более предпочтительно не менее чем 95%-ную идентичность последовательностей и наиболее предпочтительно не менее чем 99%-ную идентичность последовательностей. Предпочтительно, неидентичные положения остатков различаются консервативными заменами аминокислот. Консервативной заменой аминокислот называется взаимозаменяемость остатков, обладающих аналогичными боковыми цепями. Например, группа аминокислот, обладающих алифатическими боковыми цепями, включает глицин, аланин, валин, лейцин и изолейцин; группа аминокислот, обладающих алифатическими-гидроксильными боковыми цепями, включает серин и треонин; группа аминокислот, обладающих амидсодержащими боковыми цепями, включает аспарагин и глутамин; группа аминокислот, обладающих амидароматическими боковыми цепями, включает фенилаланин, тирозин и триптофан; группа аминокислот, обладающих основными боковыми цепями, включает лизин, аргинин и гистидин; группа аминокислот, обладающих серосодержащими боковыми цепями, включает цистеин и метионин.

Предпочтительными группами консервативного аминокислотного замещения являются: валинлейцин-изолейцин, фенилаланин-тирозин, лизин-аргинин, аланин-валин, глутаминовая-аспарагиновая кислота и аспарагин-глутамин.

Как представлено в этом описании изобретения, изменения в аминокислотных последовательностях антител или молекул иммуноглобулинов предполагаются охваченными этим изобретением при условии, что изменения в аминокислотной последовательности сохраняют идентичность на уровне не менее 75%, более предпочтительно - не менее 80, 90, 95 и наиболее предпочтительно 99%. Включены также определенные проценты идентичности последовательностей, попадающие в указанный диапазон, такие как 75, 76, 77, 78, 79 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 и 99%. В частности, предусмотрены консервативные аминокислотные замены. Консервативные замены - это замены в пределах семейства аминокислот, имеющих родственные боковые цепи. Г енетически кодируемые аминокислоты, как правило, делятся на следующие семейства: (1) кислые аминокислоты - аспартат, глутамат; (2) основные аминокислоты - лизин, аргинин, гистидин; (3) неполярные аминокислоты - аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан; и (4) незаряженные полярные аминокислоты глицин, аспарагин, глутамин, цистеин, серин, треонин, тирозин. К гидрофильным аминокислотам относятся аргинин, аспарагин, аспартат, глутамин, глутамат, гистидин, лизин, серин и треонин. К гидрофобным аминокислотам относятся аланин, цистеин, изолейцин, лейцин, метионин, фенилаланин, пролин, триптофан, тирозин и валин. Другие семейства аминокислот включают (ί) серин и треонин, образующие алифатически-гидроксильное семейство; (и) аспарагин и глутамин, образующие семейство амидсодержащих аминокислот; (ίίί) аланин, валин, лейцин и изолейцин, образующие семейство алифатических аминокислот; и (ίν) фенилаланин, триптофан и тирозин, образующие семейство ароматических аминокислот. Например, можно обоснованно ожидать, что отдельное замещение лейцина изолейцином или валином, аспартата глутаматом, треонина серином или аналогичное замещение аминокислоты структурно родственной аминокислотой не повлияет существенным образом на связывание или другие свойства полученной молекулы, особенно, если замещение не касается аминокислоты в каркасном участке. Приводит ли замена аминокислоты к образованию функционального пептида, можно сразу же определить, количественно анализируя удельную активность полипептидного производного. Такие пробы

- 8 023477 подробно представлены в этом описании изобретения. Фрагменты или аналоги антител или молекул иммуноглобулинов могут легко приготовить специалисты в данной области. Предпочтительные амино- или карбокситерминальные фрагменты или аналоги находятся вблизи границ функциональных доменов. Структурные и функциональные домены могут быть идентифицированы сравнением данных о нуклеотидных и/или аминокислотных последовательностях с открытыми или патентованными базами данных о последовательностях. Предпочтительно, для идентификации мотивов последовательностей или предсказанных доменов определенных белковых конформаций, встречающихся в других белках известной структуры и/или функции, используются компьютеризованные методы сравнения. Известны методы идентификации белковых последовательностей, сворачивающихся в известные объемные структуры. Во\\те с1 а1. 8с1епсе 253:164 (1991). Таким образом, представленные выше примеры показывают, что специалисты в данной области могут распознать мотивы последовательностей и структурные конформации, которые могут использоваться для определения структурных и функциональных доменов в соответствии с этим описанием изобретения.

Предпочтительными аминокислотными заменами являются замены, которые: (1) снижают восприимчивость к протеолизу; (2) снижают восприимчивость к окислению; (3) изменяют способность к связыванию для образования комплексов белков; (4) изменяют связывающую способность и (4) придают или изменяют другие физико-химические или функциональные свойства таких аналогов. Аналоги могут включать различные мутеины, обладающие последовательностями, отличными от встречающихся в природе пептидных последовательностей. Например, единичное или множественное замещение аминокислот (предпочтительно, консервативное аминокислотное замещение) можно осуществить во встречающейся в природе последовательности (предпочтительно, в части полипептида за пределами домена (доменов), образующих межмолекулярные контакты). Консервативное аминокислотное замещение не должно существенно изменять структурные характеристики исходной последовательности (например, замещающая аминокислота не должна способствовать разрушению спирали, присутствующей в исходной последовательности, или разрушению других типов вторичной структуры, характерных для исходной последовательности). Примеры признанных в данной области вторичных и третичных структур полипептидов описаны в: Рго1е1из, 31гис1игез апб Мо1еси1аг Ргтс1р1ез (Белки, структуры и молекулярные принципы) (СгещЫоп. Еб., А.Н. Ргеешап апб Сотрапу, Иете Уогк (1984)); 1п1гобисИоп 1о Рго1еш 31гис1иге (Введение в структуру белков) (С. Вгапбеп апб 1. Тоо/е, ебз., Саг1апб РиЬЬзЫпд, Иете Уогк, Ν.Υ. (1991)); и ТЬогйоп е1 ак №Пиге 354:105 (1991).

Полипептидный фрагмент. Используемый в этом описании изобретения термин полипептидный фрагмент означает полипептид, обладающий аминотерминальной и/или карбокситерминальной делецией, но при этом остающаяся аминокислотная последовательность идентична соответствующим положениям во встречающейся в природе последовательности, полученной, например, от полномерной последовательности кДНК. Фрагменты, как правило, содержат в длину не менее 5, 6, 8 или 10 аминокислотных остатков, предпочтительно не менее 14 аминокислотных остатков, более предпочтительно не менее 20 аминокислотных остатков, как правило, не менее 50 аминокислотных остатков, и еще более предпочтительно не менее 70 аминокислотных остатков. Используемый в этом описании изобретения термин аналог означает полипептиды, содержащие сегмент из не менее 5 аминокислот, существенно идентичный части полученной аминокислотной поверхности, который демонстрирует специфическое связывание с эпитопом γ^377-395 фибрина, СККТТМКПРЖВкТГС (8ЕЦ ГО N0: 18), или его биологически активным производным в подходящих для связывания условиях. Как правило, полипептидные аналоги содержат консервативное аминокислотное замещение (или добавление, или делецию) по сравнению со встречающейся в природе последовательностью. Аналоги, как правило, имеют в длину не менее 5 аминокислот, предпочтительно не менее 10 аминокислот или более и часто могут по длине соответствовать полномерному полипептиду, встречающемуся в природе.

Пептидные аналоги, как правило, используются в фармацевтической отрасли как непептидные лекарства, обладающие свойствами, аналогичными свойствам соответствующего пептида. Такие типы непептидных соединений называются пептидные миметики или пептидомиметики. РаисЬеге, 1. Абу. Игид Кез. 15:29 (1986), УеЬег апб Рге1бшдег ΉΝ3 р. 392 (1985); и Еуапз е1 а1. 1. Меб. СЬет. 30:1229 (1987). Такие соединения часто разрабатывают с помощью компьютеризованного молекулярного моделирования. Пептидомиметики, структурно аналогичные терапевтически полезным пептидам, могут использоваться для достижения эквивалентных терапевтических и профилактических эффектов. Как правило, пептидомиметики структурно аналогичны эталонному полипептиду (т.е. полипептиду, обладающему определенным биохимическим свойством или фармакологической активностью), такому как антитело человека, но при этом в нем одно или несколько пептидных звеньев замещены звеном, выбранным из группы, включающей: -ΕΉ₂ΝΗ- , -СН₂3-, -СН₂-СН₂-, -СН=СН- (цис- и транс-), -СОСН₂-, СН(ОН)СН₂и -СН₂30-, методами, хорошо известными специалистам. Для создания более стабильных пептидов может использоваться систематическое замещение одной или нескольких аминокислот консенсусной последовательности Ό-аминокислотой того же типа (например, введением И-лизина вместо Ь-лизина). Кроме того, связанные пептиды, содержащие консенсусную последовательность или вариацию последовательности, существенно идентичную консенсусной последовательности, могут создаваться методами,

- 9 023477 известными специалистам (Κίζο апб Скга^сН Апп. Кеу. ВюсЬет. 61:387 (1992)); например, добавлением внутренних остатков цистеина, способных образовывать дисульфидные мостики, делающие пептид циклическим.

Средство. Используемый в этом описании изобретения термин средство означает химическое соединение, смесь химических соединений, биологическую макромолекулу или экстракт из биологических материалов.

Метка. Используемый в этом описании изобретения термин метка означает введение обнаруживаемого маркера, например, путем введения радиоактивно меченой аминокислоты или добавлением к полипептиду биотинильных групп, которые могут обнаруживаться маркированным авидином (например, стрептавидином, содержащим флуоресцентный маркер, или обладающим ферментативной активностью, которую можно обнаружить оптическими или калориметрическими методами). В определенных случаях метка или маркер могут быть также терапевтическими. Известны специалистам и могут использоваться различные методы мечения полипептидов и гликопротеинов. Примеры меток для полипептидов включают, среди прочего, такие метки: радиоизотопы или радионуклиды (например, ³Н, ¹⁴С, ¹⁵Ν, ³⁵δ, ⁹⁰Υ, ⁹⁹Тс, ¹¹¹1п, ¹²⁵1, ¹³¹1), флуоресцентные метки (например, флуоресцеина изотиоцианат, родамин, люминофор на основе комплексов лантанидов), ферментные метки (например, пероксидаза хрена, п-галактозидаза, люцифераза, щелочная фосфатаза), хемилюминесцентные метки, биотинильные группы, заданные полипептидные эпитопы, распознаваемые вторичным репортером (например, парные последовательности лейциновой молнии, сайты связывания со вторичными антителами, домены связывания с металлом, эпитопные метки). В некоторых вариантах осуществления этого изобретения метки присоединяют через мостики различной длины для преодоления возможных стерических препятствий.

Фармацевтическое средство или лекарство. Используемый в этом описании изобретения термин фармацевтическое средство или лекарство означает химическое соединение или композицию, способную вызывать желаемый терапевтический эффект при надлежащем введении пациенту.

Другие химические термины, используемые в этом описании изобретения, являются традиционными в данной области и приведены, например, в Словаре химических терминов (ТЬе МсСга\\-НП1 ИюЬопату о£ СЬетюа1 Теттз (Рагкег 8., Еб., МсСга\\-НП1. 8ап Ргапс18со (1985)).

В основном чистый. Используемый в этом описании изобретения термин в основном чистый означает целевой продукт, являющийся предпочтительно присутствующим (т.е. представленный наибольшим количеством молей по сравнению с любым другим компонентом композиции), и предпочтительно, в основном очищенная фракция означает композицию, в которой целевой продукт составляет не менее примерно 50% (моль) от всех присутствующих в композиции макромолекулярных продуктов. Как правило, в основном чистая композиция содержит более чем примерно 80% целевого продукта от всех макромолекулярных продуктов, присутствующих в композиции, более предпочтительно более чем примерно 85, 90, 95 и 99%. Наиболее предпочтительно целевой продукт очищается до достижения существенной однородности (загрязняющие продукты при этом уже не могут обнаруживаться в композиции традиционными методами детектирования), при которой композиция состоит, в основном, из одного макромолекулярного продукта.

Пациент. Используемый в этом описании изобретения термин пациент означает человека или животное (ветеринарный пациент/объект).

Моноклональные антитела.

Изобретение представляет моноклональные антитела, ингибирующие связывание фибриногена с рецептором Мас-1. В частности, это изобретение представляет моноклональные антитела, которые специфически связывают эпитоп γ ^- домена уС фибрина или фибриногена. Это изобретение также представляет антитела, связывающие эпитоп γ^190-202 домена уС фибрина или фибриногена. Такие антитела блокируют разрушающий эффект фибрина на нервную систему, не влияя на его полезные эффекты в отношении свертывания крови. Такие антитела могут блокировать образование бляшек рассеянного склероза и развитие определенных видов рака. Примеры антител, являющихся предметом этого изобретения,

377-395 включают, например, антитело 5В8 (связывающееся с эпитопом γ ^- ). Кроме того, антитела, являющиеся предметом этого изобретения, включают, например, антитело 1Е3 (связывающееся с эпитопом γ^190-202), в этом описании изобретения представлены различные полинуклеотидные и полипептидные последовательности, родственные антителу 5В8, и способы использования таких последовательностей. Такие последовательности включают последовательность легкой цепи антитела 5В8 (8ЕС ГО N0: 1), три гипервариабельных участка (определяющих комплементарность) последовательности легкой цепи (СЭКЬ1, 8ЕС ГО N0: 2; СпК-Ь2, 8ЕС ГО N0: 3 и СЭК-Ы, 8ЕС ГО N0: 4), аминокислотную последовательность тяжелой цепи (8ЕС ГО N0: 5), три гипервариабельных участка (определяющих комплементарность) аминокислотной последовательности тяжелой цепи (СЭК-Н1, 8ЕС ГО N0: 6; СЭК-Н2, 8ЕС ГО N0: 7 и СЭК-Н3, 8ЕС ГО N0: 8), легкоцепочечную нуклеотидную последовательность (8ЕС ГО N0: 9), тяжелоцепочечную нуклеотидную последовательность (8ЕС ГО N0:10), нуклеотидные последовательности трех гипервариабельных участков легкой цепи (СЭК-Ы, 8ЕС ГО N0: 11; СПК-Ь2, 8ЕС ГО N0: 12 и СЭК-Ы, 8ЕС ГО N0: 13) и нуклеотидные последовательности трех гипервариабельных участков тяже- 10 023477 лой цепи (СИК-Н1, δΙΕ) ΙΌ N0: 14; (Ί)Η-112. δΙΕ) ΙΌ N0: 15 и СИК-Н3, δΙΕ) ΙΌ N0: 16).

Моноклональные антитела, являющиеся предметом этого изобретения, обладают способностью ингибировать фагоцитоз ίη νίΐτο и ίη νίνο, блокировать выделение цитокинов и активацию макрофагов ίη νίίτο и ίη νίνο, активацию микроглий ίη νίΐτο и ίη νίνο, воспалительное разрушение миелинового слоя ίη νίΐτο и ίη νίνο и ослаблять клинические симптомы экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита (ЭАЭ) у животных моделей рассеянного склероза. См., например, Международную патентную заявку (поданную по процедуре РСТ) \У0 2007/038407, полностью включенную в это описание изобретения посредством ссылки. Специалисты в данной области также поймут, что моноклональные антитела, являющиеся предметом этого изобретения, могут также влиять на рак. См., например Международную патентную заявку (поданную по процедуре РСТ) \У0 2007/024817, полностью включенную в это описание изобретения посредством ссылки. Кроме того, такие моноклональные антитела могли бы использоваться в лечении заболеваний, связанных с утечкой фибриногена из поврежденных тканей, включая ревматоидный артрит, повреждение спинного мозга, болезнь Альцгеймера и инсульт. См., например, РНск οί а1., ί. СНп. Ιη\Ό5ΐί8;·ι0οη. 2007, 117, 11:3224-3235; Αка55οд1οи οί а1., 2002, №игоп, 33:861-875; Αка55οд1οи οί а1., 2004, Ртос. Ναίΐ. Асаб. δ^. υδΑ, 101:6698-6703; Абат5 οί а1., 2007, ί. Ехр. Меб., 35:2428-34. Следует отметить, что моноклональные антитела, являющиеся предметом этого изобретения, снижают способствующие воспалению эффекты фибриногена в головном мозгу и в других органах пациента, сохраняя при этом полезное влияние фибриногена на свертывание крови, в отличие от соединений, которые влияют на образование сгустков крови.

Предметом этого изобретения являются также антитела, связывающиеся с теми же эпитопами, что и антитела, представленные в этом описании изобретения. Специалисты в данной области знают, что без излишнего экспериментирования можно определить, обладает ли моноклональное антитела такой же специфичностью, что и моноклональное антитело, являющееся предметом этого изобретения, выяснив,

377 395 190 202 предотвращает ли первой от связывания последнего с эпитопом у ^- или эпитопом γ ^- домена уС фибрина. Если испытуемое моноклональное антитело конкурирует с моноклональным антителом, являющимся предметом этого изобретения, о чем свидетельствует снижение связывания моноклонального антитела, являющегося предметом этого изобретения, то, скорее всего, оба моноклональных антитела связываются с одним и тем же или близко похожим эпитопом. Отбор моноклональных антител, являющихся предметом этого изобретения, можно осуществить, измеряя их способность блокировать адгезию микроглий с помощью рецептора Мас-1 на полномерном полипептиде фибриногена. Примеры такого отбора представлены в этом описании изобретения.

Для производства поликлональных или моноклональных антител против связывания фибриногена с рецептором Мас-1, или против производных, фрагментов, аналогов, гомологов или ортологов такого комплекса могут использоваться различные процедуры, известные специалистам. (См., например, ΑηίίЬοб^е5: А ΕπΟοπιΙογυ Маηиа1 (Антитела: лабораторное руководство) см. выше).

Антитела очищают хорошо известными методами, такими как аффинная хроматография, используя белок А или белок С, что обеспечивает, в первую очередь, фракцию иммуноглобулина 1§С иммунной сыворотки. Затем, или в качестве альтернативы, специфический антиген, являющийся мишенью для добываемого иммуноглобулина или его эпитоп могут закрепляться на колонке для очистки иммуноспецифического антитела методом иммуноаффинной хроматографии.

Антитела, являющиеся предметом этого изобретения (например, антитела 5В8 и 1Е3), представляют собой моноклональные антитела. Моноклональные антитела, ингибирующие связывание фибриногена с рецептором Мас-1, создаются, например, клонами, полученными от животных, которые были иммунизированы пептидным антигеном. Линии клеток получаются слиянием В-клеток иммунизированных животных с клетками миеломы. Антитела очищают либо ίη νίίτο от среды, либо от асцита мышей. Способы производства антител также приведены в разделе Примеры этого описания изобретения.

Моноклональные антитела готовят, например, с использованием способов с применением гибридомы, таких как описанные в: ΚοΙιΚγ анб ΜίΚΦίη. №11иге, 256:495 (1975). В типичном способе с использованием гибридомы, мышь, хомяк или иное подходящее животное-хозяин, как правило, иммунизируется иммунизирующим средством для получения лимфоцитов, производящих или способных производить антитела, которые бы специфически связывались с иммунизирующим средством. В качестве альтернативы, лимфоциты можно иммунизировать ίη νίίτο.

Иммунизирующее средство, как правило, включает белковый антиген, его фрагмент или его белок слияния. Как правило, используются либо лимфоциты периферической крови, если нужны клетки, происходящие от человека, либо клетки селезенки или лимфатических узлов, если нужны лимфоциты от других млекопитающих. Затем лимфоциты сливаются с иммортализованной линией клеток с помощью подходящего средства для слияния клеток, такого как полиэтиленгликоль, с образованием клеток лимфомы ^ο6ίη§, Μοηοθοη;·ι1 Αηί^Ьοб^е5: Ргтс1р1е5 анб РгасОсе (Моноклональные антитела: принципы и практика), Асабешю Рге55, (1986) рр. 59-103). Иммортализованными линиями клеток, как правило, являются трансформированные клетки млекопитающих, в частности, клетки миеломы грызунов, крупного рогатого скота, и происходящие от человека. Как правило, используются линии клеток миеломы крысы или мыши. Клетки гибридомы могут выращиваться в подходящей питательной среде, содержащей,

- 11 023477 предпочтительно, одно или несколько веществ, которые ингибируют рост или выживаемость неслившихся, иммортализованных клеток. Например, если в родительских клетках нет или недостаточно фермента гипоксантин-гуанин-фосфорибозилтрансферазы (НСРКТ или НРКТ), питательная среда для гибридом, как правило, содержит гипоксантин, аминоптерин и тимидин (среда ГАТ) - вещества, предотвращающие рост клеток с дефицитом гипоксантин-гуанин-фосфорибозилтрансферазы.

Предпочтительными иммортализованными линиями клеток являются линии клеток, которые эффективно сливаются, поддерживают стабильно высокий уровень экспрессии антитела отобранными клетками, производящими антитела, и являются чувствительными к таким питательным средам как среда ГАТ. Более предпочтительными иммортализованными линиями клеток являются линии мышиной миеломы, которые можно получить, например, в Центре распределения клеток Института Солка, Сан-Диего, Калифорния (8а1к 1пк1ПШе Се11 ЭМпЬиОоп СсШсг. 8ап Όίοβο. С’аПГ) и в Американской коллекции типовых культур, Манасса, Виргиния (Атепсап Туре СиИиге СоИесйои, Мапаккак, Уа). Были описаны также клетки миеломы человека и гетеромиеломы мыши и человека как линии клеток для получения моноклональных антител. (См. Ко/Ьог, ί. 1ттипо1., 133:3001 (1984); Вгобеиг е( а1., Мопос1опа1 АпйЬобу Ргобисйоп ТесЬтдиек апб АррЬсаЬопк (Методы получения моноклональных антител и их использование), Магсе1 Иеккег, 1пс., Ыете Уогк, (1987) рр. 51-63)).

Питательная среда, в которой культивируются клетки гибридомы, может затем быть испытана на наличие моноклональных антител против определенного антигена. Предпочтительно, определяется специфичность связывания моноклональных антител, произведенных клетками гибридомы, с помощью иммунопреципитации или определением связывания ίη уйго, например, радиоиммунологическим анализом (РИА) или твердофазным иммуноферментным анализом (ЕЫ8А). Такие методики и вида анализа известны специалистам. Связывающую способность моноклонального антитела можно, например, определить методом Скэтчарда, описанным в Мипкоп апб Ро11агб, Апа1. ВюсЬет., 107:220 (1980); РаЦопо С. апб Реккаг В.А. (ебк.) Кабю1ттипоаккау т Вакю апб СЬтса1 РЬагтасо1о§у (Радиоиммуноанализ в фундаментальной и клинической фармакологии). Не1бе1Ьег§, Зргт§ег-Уег1ад, 1987; Итепдег А. Кабю1ттипоаккау: Ап ОуегСе\у. (Радиоиммуноанализ: обзор) 1. СЬп. ВюсЬет. 22:883, 1984. Кроме того, при терапевтическом использовании моноклональных антител важно определить антитела, обладающие высокой степенью специфичности и высоким сродством связывания с антигеном-мишенью.

После идентификации требуемых клеток гибридомы клоны можно субклонировать методом серийных разведений и выращивать стандартными методами. (См. Ообшд, Мопос1опа1 АпЬЬоб1ек: Ргтщр1ек апб РгасЬсе (Моноклональные антитела: принципы и практика), Асабетю Ргекк, (1986) рр. 59-103)). Подходящие для этих целей питательные среды включают, например, модицифированную по способу Дульбекко среду Игла и среду КРМ1-1640. В качестве альтернативы, клетки гибридомы можно выращивать ш У1уо в асцитах млекопитающих.

Моноклональные антитела, выделяемые субклонами, можно отделить или очистить от питательной среды или жидкости асцита традиционными методами очистки иммуноглобулина, такими как, например, метод с использованием белка А - сефарозы, хроматография на гидроксилапатите, электрофорез в геле, диализ или аффинная хроматография.

Моноклональные антитела можно также получать методами рекомбинантной ДНК, такими как описанные в патенте США №4816567. ДНК, кодирующую моноклональные антитела, являющиеся предметом этого изобретения, можно легко выделить и определить ее последовательность традиционными методами (например, используя олигонуклеотиды, способные специфически связываться с геном, кодирующим тяжелые и легкие цепи мышиных антител). Например, последовательности ЗЕЦ ГО N0: 9 и №10 представляют нуклеотидные последовательности для моноклонального антитела 5В8, являющегося предметом этого изобретения. Клетки гибридомы по этому изобретению служат предпочтительным источником такой ДНК. После выделения ДНК ее можно поместить в экспрессионные векторы, которыми затем трансфектируют клетки хозяина, такие как клетки СОЗ обезьяны, клетки яичника китайского хомяка или клетки миеломы, которые в ином случае не производят белок иммуноглобулин, для достижения синтеза моноклональных антител в рекомбинантных клетках хозяина. ДНК можно также модифицировать, например, замещая кодирующую последовательность тяжелой и легкой цепью константного домена человека вместо гомологической мышиной последовательности (см. патент США №4816567; Моткоп, Ыа1нге 368, 812-13 (1994)), и ковалентно присоединяя к последовательности, кодирующей иммуноглобулин, или к части кодирующей последовательности для неиммуноглобулинового полипептида. Такой неиммуноглобулиновый полипептид можно заменить на константные домены антитела, являющегося предметом этого изобретения, или на вариабельные домены одного антигенсвязывающего центра антитела, являющегося предметом этого изобретения, для создания химерного бивалентного антитела.

Полностью человеческими антителами являются молекулы антител, в которых все последовательности как легкой цепи, так и тяжелой цепи, включая гипервариабельные участки, определяющие комплементарность, получены от генов человека. Такие антитела называются в этом описании изобретения человеческими антителами или полностью человеческими антителами. Моноклональные антитела можно получить, используя методику триомы; методику гибридомы В-клеток человека (см. Ко/Ьог е( а1., 1983 1ттипо1 Тобау 4: 72); и методику гибридомы вируса Эпштейна-Барр для получения моноклональ- 12 023477 ных антител (см. Со1е ек а1., 1985 Ιη: Мопос1опа1 АпйЪобкез апб Сапсег ТЬегару (Моноклональные антитела и терапия рака), А1ап К. Ызз, 1пс., стр. 77-96). Моноклональные антитела могут использоваться и могут получаться с использованием гибридом человека (см. Соке ек а1., 1983. Ргос №к1 Асаб 8с1 И8А 80: 2026-2030) или трансформацией В-клеток человека вирусом Эпштейна-Барр ш улкго (см. Со1е, ек а1., 1985 1п: Мопос1опа1 АпбЪоб1ез апб Сапсег ТЬегару (Моноклональные антитела и терапия рака), А1ап К. Ызз, 1пс., стр. 77-96).

Кроме того, человеческие антитела можно также получить, используя дополнительные методики, включая библиотеки фагового отображения (см. НоодепЪоот апб ХУткег I. Мо1. Вю1., 227:381 (1991); Магкз ек а1., I. Мо1. Вю1., 222:581 (1991)). Аналогичным образом, антитела человека можно получить, вводя локусы иммуноглобулина человека трансгенным животным, например мышам, у которых гены эндогенного иммуноглобулина были частично или полностью дезактивированы. После пробного введения антигена наблюдается образование антител человека, которое во всех отношениях, включая генную перегруппировку, сборку и спектр антител, сильно напоминает образование таких антител у человека. Этот подход описан, например, в патентах США №№5545807; 5545806; 5569825; 5625126; 5633425; 5661016, и в: Магкз ек а1., Вю/ТесЬпо1оду, 779-783 (1992); ЬопЪегд ек а1., Ыакиге 368 856-859 (1994); Мотзоп, Ыакиге 368, 812-13 (1994); ИзЬетбб ек а1, Ыакиге ВюкесЬпо1оду 14, 845-51 (1996); ЫеиЪегдег, Ыакиге ВюкесЬпо1оду 14, 826 (1996); и ЬопЪегд апб Ннз/аг, 1пкегп. Кеу. 1ттипо1. 13 65-93 (1995).

Антитела человека можно также получать, используя трансгенных животных (не человека), модифицированных таким образом, чтобы они вырабатывали полностью человеческие антитела, а не эндогенные антитела животных, в ответ на пробное введение антигена. У таких животных дезактивируют эндогенные гены, кодирующие тяжелые и легкие цепи иммуноглобулинов в организме хозяина, и в геном хозяина вводят активные локусы, кодирующие тяжелые и легкие цепи иммуноглобулинов человека. Например, 8ЕО ГО №№11-16 обеспечивают последовательность нуклеотидов, кодирующую все три легкие цепи и три тяжелые цепи гипервариабельных участков моноклонального антитела 5В8. Гены человека вводят, например, с помощью искусственных хромосом дрожжей, содержащих необходимые сегменты ДНК человека. Животное, обеспечивающее все искомые модификации, затем получают в виде потомства от кроссбридинга промежуточных трансгенных животных, содержащих неполный набор модификаций. Примером таких животных служит мышь под названием Ксеномышь (Хепотоизе®), предоставленная компанией Атдеп (ТЬоизапб Оакз, Калифорния). Это животное вырабатывает В-клетки, которые выделяют полностью человеческие иммуноглобулины. Антитела можно получать непосредственно из животного после его иммунизации целевым иммуногеном, таким как, например, препарат поликлонального антитела, или, в качестве альтернативы, от иммортализованных В-клеток, полученных от животного, таких как гибридомы, вырабатывающие моноклональные антитела. Кроме того, гены, кодирующие иммуноглобулины с вариабельными участками человека, можно выделить и можно обеспечить их экспрессию для непосредственного получения антител, либо можно модифицировать такие гены дополнительно для получения аналогов антител, таких как, например, одноцепочечные молекулы Ρν (зсРу).

Пример способа получения животного хозяина, например, мыши, в котором происходит недостаточная экспрессия эндогенной тяжелой цепи иммуноглобулина, представлен в патенте США №5939598. Такое животное-хозяин может быть получено удалением I сегмента генов по крайней мере из одного локуса эндогенной тяжелой цепи в стволовой клетке эмбриона для предотвращения перегруппировки локуса и предотвращения образования транскрипта перегруппированного локуса тяжелой цепи иммуноглобулина, причем такое удаление осуществляется с помощью направленного вектора, содержащего ген, кодирующий селектируемый маркер; и получением из стволовой клетки эмбриона трансгенной мыши, соматические и половые клетки которой содержат ген, кодирующий селектируемый маркер.

Один способ получения целевого антитела, такого как человеческое антитело, описан в патенте США №5916771. Этот метод включает введение экспрессионного вектора, содержащего нуклеотидную последовательность, кодирующую тяжелую цепь (например, 8ЕО ГО N0: 10), в клетку млекопитающего хозяина, находящуюся в культуре клеток, введение экспрессионного вектора, содержащего нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь (например, 8ЕО ГО N0: 9), в другую клетку млекопитающего хозяина, и слияние таких двух клеток с образованием гибридной клетки. Гибридная клетка может вырабатывать антитело, содержащее тяжелую цепь и легкую цепь.

Антитело может вырабатываться вектором, содержащим сегмент ДНК, кодирующий одноцепочечное антитело, описанное выше.

Они могут включать векторы, липосомы, депротеинизированную ДНК, ДНК с адьювантом, генную пушку и катетеры. Предпочтительные векторы включают вирусные векторы, белки слияния и химические конъюгаты. Ретровирусные векторы включают вирус мышиного лейкоза Молони. Предпочтительными являются вирусные ДНК-векторы. Такие векторы включают векторы оспы, такие как векторы вируса ортопокс или авипокс, векторы вируса герпеса, такие как вектор простого вируса герпеса I (см. Се11ег, А.1. ек а1., I. №игосЬет, 64:487 (1995); Вт Ρ. ек а1., ш ΟΝΛ С1ошпд: МаттаЬап 8у5кет5, Ό. С1о\'ег Еб. (Ох&гб ипщ. Ргезз, Ох&гб Епд1апб) (1995); Се11ег А.1. ек а1., Ргос №к1. Асаб. 8сЕ: И.8.А. 90:7603 (1993); Се11ег А.1. ек а1., Ргос №ιΐ1. Асаб. 8с И8А 87:1149 (1990), векторы аденовирусов (см. ЬеСа1 Ьа8а11е ек а1., 8сгепсе, 259:988 (1993); Эа\абзоп ек а1., №Н. Сепек 3:219 (1993); Уапд ек а1., I. Уно1. 69:2004 (1995) и

- 13 023477 векторы аденоассоциированных вирусов (см. Карйй М.С. е! а1, ΝπΙ. 25 Сспс1. 8:148 (1994).

Векторы вируса оспы вводят ген в цитоплазму клетки. Вирус птичьей оспы (авипокс) приводит лишь к краткосрочной экспрессии нуклеиновой кислоты. Аденовирусные векторы, аденоассоциированные вирусные векторы и векторы вируса простого герпеса являются предпочтительными для введения нуклеиновой кислоты в нервные клетки. Аденовирусный вектор приводит к менее продолжительной экспрессии (примерно, в течение 2 месяцев), чем вектор аденоассоциированного вируса (экспрессия нуклеиновой кислоты примерно в течение 4 месяцев), который, в свою очередь, приводит к менее продолжительной экспрессии, чем вектор простого герпеса. Конкретный выбранный вектор зависит от клеткимишени и состояния, подлежащего лечению. Введение нуклеиновой кислоты может осуществляться стандартными методами, например путем инфекции, трансфекции, трансдукции или трансформации. Примеры режимов передачи гена включают, например, использование депротеинизированной ДНК, СаРО₄, преципитации, ДЭАЭ-декстрана, электропорации, слияния протопластов, липофекции, клеточной микроинъекции и вирусных векторов.

Вектор может использоваться для воздействия практически на любую целевую клетку. Например, стереотаксическая инъекция может использоваться для направления векторов (например, аденовирусов или вируса простого герпеса) в желаемое положение. Кроме того, частицы могут доставляться с помощью интрацеребровентрикулярной инфузии с использованием инфузионной системы с микронасосом, такой как инфузионная система 8уисйтоМей 1иГи8Юи 8ук!ет (МеШтотс, Миннеаполис, ΜΝ). Другие способы, которые могут использоваться, включают использование катетеров, внутривенной, парентеральной, внутрибрюшинной или подкожной инъекции, орального или иного известного способа введения.

Эти векторы могут использоваться для экспрессии больших количеств антител, которые могут использоваться разными способами. Например, антитела могут использоваться для обнаружения наличия фибриногена и связывания фибриногена с рецептором Мас-1.

Методики могут адаптироваться для получения одноцепочечных антител, специфичных к антигенному белку по этому изобретению (см., например,п США №4946778). Кроме того, методики могут адаптироваться для конструкции экспрессионных библиотек фрагментов Р_аЬ (см, например, Нике е! а1., 1989 8с1еисе 246: 1275-1281) для обеспечения быстрой и эффективной идентификации фрагментов Р_аЬ моноклональных антител с заданной специфичностью по отношению к белку или его производных, фрагментов, аналогов или гомологов. Фрагменты антител, содержащие идиотипы белка антигена, могут быть получены способами, известными специалистам, включая, среди прочего такие способы: (ί) фрагмент Р(_аь')₂ получают ферментацией молекулы антитела пепсином; (ίί) фрагмент Р_аЬ получают восстановлением дисульфидных мостиков фрагмента Р(_аь')₂; (ϊϊϊ) фрагмент Р_аЬ получают обработкой молекулы антитела папаином и восстановителем; и (ίν) получения вариабельных фрагментов Ρ_ν. Это изобретения также включает фрагменты Ρ_ν, Р_аЬ, Р_аЬ, и Р(_аЬ,)₂,

ОС 7 ПО 877 808 антифибриновые фрагменты γ ^- и γ ^- одноцепочечные биспецифические антифибриновые антитела к

190 202 377 395 антифибриновые антитела к эпитопам γ ^- и γ ^- ,

190-202 377-395 190-202 377-395 эпитопам γ ^- и γ ^- , и гетероконъюгаты антифибриновых антител к эпитопам γ ^- и γ ^- .

Биспецифические антитела - это антитела, обладающие специфичностью связывания по крайней мере двух различных антигенов. В представленном случае одним объектом специфического связывания служат

190-202 377-395 эпитопы γ ^- и γ ^- фибрина. Вторым объектом специфического связывания служит любой другой антиген, преимущественно, белок на поверхности клетки или рецептор, или субъединица рецептора.

Способы получения биспецифических антител известны специалистам в данной области. Традиционно, рекомбинантное получение биспецифических антител основывается на совместной экспрессии двух пар тяжелая цепь/легкая цепь иммуноглобулина, причем две тяжелые цепи обладают разной специфичностью (МЛкет апШ Сие11о, №Яиге. 305:537-539 (1983)). Из-за случайного расхождения тяжелых и легких цепей иммуноглобулина такие гибридомы (квадромы) вырабатывают возможную смесь десяти различных молекул антител, из которых только одна обладает надлежащей биспецифической структурой. Очистка подходящей молекулы, как правило, осуществляется методом аффинной хроматографии.

Вариабельные домены антител с целевой специфичностью связывания (сайты связывания антитело - антиген) могут сливаться с последовательностями константных доменов иммуноглобулинов. Слияние, предпочтительно, осуществляется с тяжелоцепочечным константным доменом иммуноглобулина, содержащим по крайней мере часть шарнирной области, и тяжелоцепочечные константные участки СН2 и СН3. Предпочтительно также иметь первый тяжелоцепочечный константный участок (СН1), содержащий сайт, необходимый для связывания легкой цепи, хотя бы в одном из продуктов слияния. Молекулы ДНК, кодирующие слияние тяжелых цепей иммуноглобулина, и, при желании, легкой цепи иммуноглобулина, вводят в отдельные экспрессионные векторы и параллельно трансфектируют в подходящий организм хозяина. Более подробно получение биспецифических антител описано, например, в 8иге8Й е! а1., МеШоШ ίη Еи/уто1оду (Методы энзимологии), 121:210 (1986).

Биспецифические антитела можно получать как полномерные антитела или фрагменты антител (например, фрагменты Р(_аь’)2 биспецифических антител). Методики получения биспецифических антител из фрагментов антител описаны в литературе. Например, биспецифические антитела можно получить, используя химическое связывание. В статье Вгеииаи е! а1., 8с1еисе 229:81 (1985) описана процедура, с

- 14 023477 помощью которой интактные антитела протеолитически расщепляют с образованием фрагментов Р(_аь')2Такие фрагменты восстанавливают в присутствии арсенида натрия, образующего комплекс с дитиолом, для стабилизации вицинальных дитиолов и предотвращения образования межмолекулярных дисульфидных мостиков. Образованные фрагменты Р_аЬ затем преобразуются в производные тионитробензоата (ТНБ). Одно из производных Р_аЬ<-ТНБ затем опять преобразуется в Р_аЬ<-тиол восстановлением меркаптоэтиламином и смешивается с эквимолярным количеством другого производного Р_аЬ'-ТНБ с образованием биспецифического антитела. Полученные биспецифические антитела могут использоваться как средства для селективной иммобилизации ферментов.

Кроме того, фрагменты Р_аЬ могут непосредственно выделяться из Е.сой и химически сопрягаться с образованием биспецифических антител. В статье 8Ьа1аЬу е! а1., 1. Ехр. Мей. 175:217- 225 (1992) описывается получение полностью гуманизированного биспецифического антитела Р(_аЬ')₂.

Были также описаны различные методики получения и выделения фрагментов биспецифических антител непосредственно из культуры рекомбинантных клеток. Например, биспецифические антитела получают с использованием лейциновой молнии. Кок!е1пу е! а1., 1. Iттиηо1. 148(5): 1547-1553 (1992). Этот способ также можно использовать для получения гомодимеров антител. Технология диател, описанная НоШидег е! а1., Ргос. №!1. Асай. 8с1. И8А 90:6444-6448 (1993), представляет альтернативный механизм получения фрагментов биспецифических антител. Такие фрагменты содержат тяжелоцепочечный вариабельный домен (У_Н), соединенный с легкоцепочечным вариабельным доменом (У_ъ) слишком коротким звеном, которое не позволяет образовываться парам обоих доменов на одной и той же цепи. Соответственно, домены ν_Η и У[, одного фрагмента вынуждены образовывать пары с комплементарными доменами У_ь и У_Н другого фрагмента, таким образом, образуя два антигенсвязывающих сайта. Была представлена также другая стратегия получения фрагментов биспецифических антител с использованием одноцепочечных димеров (δΡν): см. ОгиЬег е! а1., 1. Стилок 152:5368 (1994).

Предусмотрены также антитела с более чем двумя антигенными детерминантами. Например, можно получить триспецифические антитела: Тнй е! а1., 1. ^типок 147:60 (1991).

Это изобретение также имеет отношение к иммуноконъюгатам, содержащим антитело, сопряженное с цитотоксическим средством, таким как токсин (например, химиотерапевтическое средство, воздействующее на раковые клетки, обладающий ферментной активностью токсин бактериального, грибного, растительного или животного происхождения, или их фрагменты), или радиоактивный изотоп (например, радиоконъюгат). Примеры химиотерапевтических средств включают алкилирующие средства, нитрозомочевину, антиметаболиты, антрациклины и родственные лекарства, ингибиторы топоизомеразы, ингибиторы митоза, кортикостероидные гормоны и другие химиотерапевтические лекарства.

Обладающие ферментной активностью токсины и их фрагменты, которые можно использовать для реализации этого изобретения, включают цепь А дифтерии, несвязывающие активные фрагменты дифтерийного токсина, цепь А эндотоксина (из Ркеийотопак аегидшока), цепь А рицина, цепь А абрина, цепь А модеццина, альфа-сарцин, белки А1ешт!ек Гогйн, белки диантины, белки лаконоса американского (ТАРЕ РАРП, и РАР-8), ингибитор китайской горькой тыквы (Мотогйюа сйагапйа), курцин, кротин, ингибитор мыльнянки лекарственной (8аропапа оГйсшаПк), гелонин, митогеллин, рестриктион, феномицин, еномицин и трихотецин. Для получения радиосопряженных антител могут использоваться различные радионуклиды. Примеры таких радионуклидов включают: ²¹²Βί, ¹³¹Ι, ¹³¹Ιη, ⁹⁰Υ и ¹⁸⁶Ке.

Конъюгаты антитела и цитотоксического средства получают, используя различные бифункциональные средства белкового сопряжения, такие как ^сукцинимидил-3-(2-пиридилдитиол)пропионат (8РЭР), иминотиолан ^Т), бифункциональные производные имидоэфиров (таких как диметиладипимидат НСЬ), активные сложные эфиры (такие как дисукцинимидил суберат), альдегиды (такие как глутаральдегид), бис-азидосоединения (такие как (п-азидобензол)гександиамин), производные бис-диазония (такие как бис-(п-диазонийбензоил)этилендиамин), диизоцианаты (такие как толуол-2,6-диизоцианат), и бис-активные фторсодержащие соединения (такие как 1,5-дифтор-2,4-динитробензол). Например, рициновый иммунотоксин можно получить так, как описано в: УйеНа е! а1., 8аепсе 238: 1098 (1987). Примером хелатирующего средства для конъюгации радионуклидов с антителом служит меченая изотопом С I-изотиоцианатобензил-3-метилдиэтилентриамин пентауксусная кислота (МХ-ЭТРА).

Специалисты в данной области обнаружат, что в сопряжении с антителами, являющимися предметом этого изобретения, может участвовать большое разнообразие частиц (см., например, Соп)ида!е Уассшек (Конъюгированные вакцины), СопйтЬийопк !о МюгоЬю1о§у апй Iттиηо1о§у, !М. Сгике апй К.Е. ЬеМк, К (ейк), Сагдег Ргекк, №ν Уогк, (1989), полностью включенную в это описание изобретения посредством ссылки).

Сопряжение можно осуществить с помощью любой химической реакции, приводящей к связыванию двух молекул, при котором антитело и другая частица сохраняют свою активность. Такая связь может включать много химических механизмов, например, ковалентное связывание, аффинное связывание, интеркаляцию, координационную связь и комплексообразование. Предпочтительным видом связи, однако, является ковалентная связь. Ковалентное связывание достигается либо прямой конденсацией существующих боковых цепей, либо включением внешних мостиковых молекул. Многие бивалентные или поливалентные связывающие средства могут использоваться для сопряжения белковых молекул, таких как

- 15 0234ΊΊ антитела, являющиеся предметом этого изобретения, с другими молекулами. Например, характерные средства сопряжения могут включать органические соединения, такие как тиоэфиры, карбодиимиды, сукцинимидные эфиры, диизоцианаты, глутаральдегид, диазобензолы и гексаметилендиамины. Этот список не является исчерпывающим списком различных классов средств сопряжения, известных специалистам, а представляет собой пример наиболее распространенных средств сопряжения. (См. КШеи апй ЫпйбФгош, йоит. 1ттип. 133:1335-2549 (1984); йапзеп е! а1., 1ттипо1одюа1 КеОе\У5 62:185-216 (1982); апй УНе!1а е! а1., 8шепсе 238:1098 (1987)).

Линкеры описаны в литературе (см., например, КатакйкНиап 8. е! а1., Сапсег Кек. 44:201-208 (1984), в которой описывается использование МВ8 (М-малеимидобензоил-Л-гидроксисукцинимидный эфир). См. также патент США №5030719, в котором описывается использование производных галогенированого ацетилгидразида, сопряженного с антителом с помощью олигопептидного линкера. Примеры линкеров включают: (ί) БОС (1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида гидрохлорид; (ίί) 8МРТ (4сукцинимидилоксикарбонил-альфа-метил-альфа-(2-пиридилдитио)толуол (Р1егсе СНет. Со., номер по каталогу: 215580); (ίίί) 8РИР (сукцинимидил-6[3-(2-пиридилдитио)пропионамидо]гексаноат (Р1егсе СНет. Со., номер по каталогу: 216510); (ΐν) 8иНо-ЬС-8РПР (сульфосукцинимидил 6[3-(2пиридилдитио)пропианамид]гексаноат (Р1егсе СНет. Со. номер по каталогу: 2165-0); и (ν) сульфо-ΝΗδ (Ν-гидроксисульфосукцинимид: Р1егсе СНет. Со., номер по каталогу: 24510), сопряженный с ЕЭС

Описанные выше линкеры содержат компоненты, обладающие разными свойствами, таким образом, приводя к образованию конъюгатов с отличающимися физико-химическими свойствами. Например, сложные эфиры Ν-гидроксисульфосукцинимида и алкилкарбоксилатов являются более устойчивыми, чем сложные эфиры Ν-гидроксисульфосукцинимида и ароматических карбоксилатов. Эфиры Νгидроксисукцинимида, содержащие линкеры, менее растворимы, чем эфиры Ν-гидроксисульфосукцинимида. Кроме того, линкер 8МРТ содержит стерически затрудненную дисульфидную связь и может образовывать конъюгаты с повышением стабильности. Дисульфидные мостиковые связи, как правило, являются менее устойчивыми, чем другие мостиковые связи, так как дисульфидная связь расщепляется ш νίϋΌ, уменьшая количество имеющегося конъюгата. В частности, Ν-гидроксисульфосукцинимид может увеличить устойчивость карбодиимидного соединения. Вещества с карбодиимидными связями (такие как ЕЭС). используемые вместе с Ν-гидроксисульфосукцинимидом, образуют сложные эфиры, более устойчивые к гидролизу, чем вещества лишь с карбодиимидными связями.

Представленные в этом описании изобретения антитела могут также входить в состав иммунолипосом. Липосомы, содержащие антитело, получают способами, известными специалистам, такими как описанные в: Ерк!еш е! а1., Ргос. №!1. Асай. 8сй И8А, 82: 3688 (1985); Н\уапд е! а1., Ргос. Ν;·ιΐ1. Асай. 8сй И8А, 77: 4030 (1980); и патенты США №№4485045 и 4544545. Липосомы с увеличенным временем пребывания в кровотоке, описаны в патенте США №5013556.

Особенно полезные липосомы можно получить методом обращено-фазового выпаривания липидной композиции, содержащей фосфатидилхолин, холестерин и образующий производное ПЭГ фосфатидилэтаноламин (ПЭГ-ПЭ). Липосомы продавливают сквозь фильтры с известным диаметром пор для получения липосом заданного диаметра. Фрагменты Р_аЬ, антитела, являющегося предметом этого изобретения, можно конъюгировать с липосомами так, как описано в МатНп е! а1., й. Вю1. СНет., 257: 286-288 (1982), с помощью реакции дисульфидной перестановки.

190 202 377 395

Использование антител против эпитопов γ ^- и γ ^- фибрина.

Терапевтически препараты, являющиеся предметом этого изобретения, которые содержат моноклональное антитело, являющееся предметом этого изобретения, используются для лечения или ослабления симптомов заболеваний, связанных с фибрином (например, рассеянного склероза, заживления ран, легочной ишемии, повреждения спинного мозга, болезни Альцгеймера, инсульта, ревматоидного артрита и рака), предпочтительно, не влияя при этом на свертываемость крови. Настоящее изобретение также предлагает способы лечения или ослабления симптомов заболеваний, связанных с фибрином (например, рассеянного склероза, заживления ран, легочной ишемии, повреждения спинного мозга, болезни Альцгеймера, инсульта, ревматоидного артрита и рака), предпочтительно, не влияя при этом на свертываемость крови. Терапевтический режим осуществляется после определения субъекта, например, пациента (человека), страдающего (или имеющего риск развития) заболевания, связанного с фибрином (например, рассеянного склероза, заживления ран, легочной ишемии, повреждения спинного мозга, болезни Альцгеймера, инсульта, ревматоидного артрита и рака), используя стандартные способы. Симптомы таких связанных с фибрином заболеваний включают, например, воспаление, боль и потерю чувственного восприятия. Эффективность лечения определяется в связи с любыми известными способами диагностики или лечения конкретных заболеваний, связанных с фибрином. Ослабление одного или нескольких симптомов заболеваний, связанных с фибрином, указывает на то, что антитело имеет полезный клинический эффект. Препарат антитела, предпочтительно антитела, обладающего высокой специфичностью и высоким сродством к антигену-мишени, вводится пациенту и, как правило, проявляет эффект благодаря своему связыванию с мишенью. Введение антитела может уничтожить, или подавить, или помешать сиг190-202 377-395 нальной функции антигена-мишени (например, эпитопов γ ^- и γ ^- фибрина). Введение антитела

- 16 023477 может уничтожить, или подавить, или помешать связыванию антигена-мишени (например, фибрина) с эндогенным лигандом (например, рецептором Мас-1), с которым такой антиген связывается в естественных условиях. Например, антитело связывается с мишенью и ингибирует связывание фибрина с рецептором Мас-1.

Следует понимать, что введение терапевтических средств в соответствии с этим изобретением осуществляется вместе с подходящими носителями, вспомогательными веществами и другими средствами, входящими в состав препаратов для обеспечения улучшенного переноса, доставки, переносимости и т.п. Множество подходящих лекарственных форм можно найти в формуляре КсттдЮп'к РЬагтассийса1 δαспсск (19!Ь сй., Маск РиЪЬкЫпд Сотрапу, Εаδ!οη, Ра. (1995)), особенно в его главе 87, составленной В1аид, δсутοи^. Такие лекарственные формы включают, например, порошки, пасты, мази, желе, воски, масла, липиды, среды, содержащие липиды (катионные или анионные) (такие как липофектин™), ДНКконъюгаты, безводные поглощающие пасты, эмульсии типа масло в воде и вода в масле, эмульсии карбовакса (полиэтиленгликолей различного молекулярного веса), полужидкие гели и полужидкие смеси, содержащие карбовакс. Любые из указанных выше смесей могут подходить для использования в способах лечения и терапии в соответствии с этим изобретением при условии, что активный ингредиент состава не дезактивируется другими ингредиентами и такой состав физиологически совместим и переносится при использовании определенного способа введения. Дополнительную информацию о лекарственных формах, вспомогательных веществах и носителях, хорошо известных специалистам в фармацевтической химии, можно найти также в: Ва1йпск Р. РЬагтассийса1 схщрюп! йс\'с1ортсп1: (Нс пссй йог ргссЬшса1 дшйапсс. (Разработка фармацевтических вспомогательных веществ: необходимость в доклиническом руководстве) Ксди1. Тохюо1 РЬагтасо1. 32(2):210-8 (2000), \Уапд XV. ЕуорЫЬ/аНоп апй йс\'с1ортсп1 ой коЬй рго!сш РЬагтассийсак. (лиофилизация и разработка твердых белковых фармацевтических препаратов) Ιώ. 1. РЬагт. 203(1-2): 1-60 (2000), СЬагтап ν.Ν. ЫрМк, ЬрорЬШс йгидк, апй ога1 йгид йс1щсгукотс стсгдшд сопссрК (Липиды, липофильные лекарства и оральная доставка лекарств - некоторые новые идеи) 1. РЬагт. δс^.89(8):967-78 (2000), Ро\ус11 с! а1. Сотрспйшт ой схшрюйк йог рагсп!сга1 йогти1айопк (Каталог вспомогательных веществ для парентеральных препаратов) РЭА 1. РЬагт. δα. ТссЬпо1. 52:238-311 (1998) и в приведенных в них ссылках на специальную литературу.

Антитела, являющиеся предметом этого изобретения (также называемые в этом описании изобретения активные вещества), и их производные, фрагменты, аналоги и гомологи могут входить в состав фармацевтических композиций, которые могут содержать фармацевтически приемлемый носитель. Используемый в этом описании изобретения термин фармацевтически приемлемый носитель включает любые и все растворители, среды для диспергирования, покрытия, антибактериальные и противогрибковые средства, изотонические средства и средства, замедляющие всасывание, и т.п., совместимые с фармацевтическим введением. Подходящие носители описаны в последнем издании КспЬпдЮп'к РЬагтассийса1 δαατ^κ, стандартном справочнике, используемом в данной области, который включен в это описание изобретения посредством ссылки. Предпочтительные примеры таких носителей или разбавителей включают, среди прочего, воду, раствор соли, раствор Рингера, раствор декстрозы и 5%-ный раствор сывороточного альбумина человека, могут также использоваться липосомы и неводные среды, такие как жирное масло. Использование таких сред и средств с фармацевтическими активными веществами хорошо известно в данной области. За исключением случаев, когда традиционные среды или средства несовместимы с активным соединением, предусмотрено использование таких сред и средств в фармацевтических композициях. В композиции также можно включать дополнительные активные соединения.

Состав фармацевтической композиции по этому изобретению подобран так, чтобы соответствовать предполагаемому пути введения композиции. Примеры путей введения включают парентеральное введение, например внутривенное, внутрикожное, подкожное, оральное (например, ингаляция), чрезкожное (например, наружное), через слизистую оболочку и ректальное введение. Растворы или суспензии, используемые для парентерального, внутрикожного или подкожного введения, могут содержать такие компоненты: стерильный разбавитель, такой как вода для инъекций, изотонический раствор соли, жирные масла, полиэтиленгликоли, глицерин, пропиленгликоль или иные синтетические растворители; антибактериальные средства, такие как бензиловый спирт или метилпарабены; антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота или натрия бисульфит; хелатирующие агенты, такие как этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА); буферные растворы, такие как ацетаты, цитраты или фосфаты, и средства регулировки тоничности, такие как соляная кислота или натрия гидроксид. Парентеральные препараты могут помещаться в ампулы, одноразовые шприцы или флаконы с несколькими дозами, изготовленные из стекла или пластмассы.

Фармацевтические композиции, подходящие для инъекций, включают стерильные водные растворы (если композиция растворима в воде) или дисперсии и стерильные порошки для приготовления стерильных инъекционных растворов или дисперсий непосредственно перед введением. Для внутривенного введения подходящими носителями являются физиологический раствор соли, бактериостатическая вода, кремофор ΕΕ™ (ΒΑδΡ, Рагаррапу N.1.) или физиологический раствор с фосфатным буфером. Во всех случаях композиция может быть стерильной и должна быть жидкой, чтобы ее можно было вводить с по- 17 023477 мощью шприца. Она может быть устойчивой в условиях изготовления и хранения и должна быть защищена от загрязнения микроорганизмами, такими как бактерии и грибы. Носителем может быть растворитель или среда для диспергирования, содержащая, например, воду, этанол, полиол (например, глицерин, пропиленгликоль и жидкий полиэтиленгликоль и т.п.) и подходящую смесь указанных веществ. Подходящую текучесть/сыпучесть можно обеспечить, например, используя покрытия, такие как лецитин, обеспечивая необходимый размер частиц в случае дисперсий, и используя поверхностно активные вещества. Действие микроорганизмов можно предотвратить с помощью различных антибактериальных и противогрибковых средств, например парабенов, хлорбутанола, фенола, аскорбиновой кислоты, тимеросала и т.п. Во многих случаях желательно включать в состав композиции изотонические средства, например, сахара, многоатомные спирты, такие как маннит, сорбит, натрия хлорид. Продолжительное всасывание инъекционных композиций можно обеспечить, включив в состав композиции средство, замедляющее всасывание, например, алюминия моностеарат и желатин.

Стерильные инъекционные растворы можно приготовить введением активного соединения в необходимом количестве в подходящий растворитель вместе с одним или несколькими ингредиентами, перечисленными выше, при необходимости, с последующей стерилизацией. Как правило, дисперсии готовят введением активного соединения в стерильный раствор, содержащий основную среду для диспергирования и другие необходимые ингредиенты из перечисленных выше. В случае стерильных порошков для приготовления стерильных инъекционных растворов, используются такие способы приготовления как вакуумная сушка и лиофилизация для получения порошка активного ингредиента, плюс любые дополнительные необходимые ингредиенты в виде их предварительно стерильно отфильтрованных растворов.

Оральные композиции, как правило, включают инертный разбавитель или съедобный носитель. Они могут помещаться в желатиновые капсулы или прессоваться в таблетки. Для орального терапевтического введения активное соединение может включаться во вспомогательные вещества и использоваться в форме таблеток, пастилок или капсул. Оральные композиции также можно приготовить с использованием жидкого носителя для использования в виде средства для полоскания рта, в котором соединение в жидком носителе вводится в ротовую полость для ее полоскания и выплевывается либо проглатывается. Фармацевтически совместимые связующие средства и/или адъюванты также могут входить в состав фармацевтической композиции. Таблетки, пилюли, капсулы, пастилки и т.п. могут содержать любой из следующих ингредиентов или соединений аналогичной природы: связующее вещество, такое как микрокристаллическая целлюлоза, трагакантовая камедь или желатин; вспомогательное вещество, такое как крахмал или лактоза, средство, способствующее разрушению, такое как альгиновая кислота, примогель или кукурузный крахмал; смазывающее вещество, такое как магния стеарат или стерот; глидант, такой как коллоидный диоксид кремния; подсластитель, такой как сахароза или сахарин; или вкусовая добавка, такая как перечная мята, метилсалицилат или апельсиновый ароматизатор.

Для введения путем ингаляции соединения подаются в виде аэрозольного спрея из флакона под давлением или дозатора, содержащего подходящий газ-вытеснитель, например диоксид углерода, или распылитель.

Системное введение также может осуществляться через слизистую оболочку или кожу. Для введения через слизистую оболочку или для чрезкожного введения в составе композиции используются вещества, повышающие проницаемость, соответствующие барьеру, через который они должны проникнуть. Такие проникающие вещества известны специалистам и включают, например, для введения через слизистую оболочку, поверхностно-активные вещества, соли желчных кислот и производные фузидовой кислоты. Введение через слизистую оболочку можно осуществить с помощью распылителей в нос или суппозиториев. Для чрезкожного введения активное вещество вводят в состав мази, бальзама, геля или крема, как хорошо известно специалистам.

Соединения также можно подготовить в форме суппозиториев (например, с использованием традиционных основ для суппозиториев, таких как масло какао и другие глицериды) или микроклизм с удержанием для ректального введения.

В одном из вариантов осуществления этого изобретения активные соединения готовят с носителями, которые защищают соединение от быстрого выведения из организма, такими как носители для составов контролированного выделения, включая имплантаты и микрокапсульные системы. Могут использоваться биоразлагаемые и биосовместимые полимеры, такие как этилен-винилацетат, полиангидриды, полигликолевая кислота, коллаген, полиортоэфиры и полиуксусная кислота. Способы приготовления таких препаратов очевидны для специалистов в этой области. Такие материалы можно также приобрести, например, в компаниях А1/а СогрогаИоп и Nονа РЬагтасеиИса1з, Гпс. В качестве фармацевтически приемлемых носителей могут использоваться также липосомные суспензии (включая липосомы, нацеленные на инфицированные клетки, с моноклональными антителам или вирусными антигенами). Такие суспензии можно приготовить способами, известными специалистам, например, такими, как описанные в патенте США №4522811.

Особенными преимуществами обладает создание оральных или парентеральных лекарственных форм благодаря простоте их введения и однородности дозировки. Используемое в этом описании изобретения понятие единицы дозировки означает физически дискретные единицы, предлагаемые как от- 18 023477 дельные дозы введения препарата пациенту; каждая единица дозировки содержит заданное количество активного соединения, рассчитанное так, чтобы давать желаемый терапевтический эффект, и необходимый фармацевтический носитель. Технические условия на определенные единицы дозировки определяются уникальными характеристиками активного вещества и конкретным терапевтическим эффектом, которого следует достигнуть, а также, ограничениями, присущими способу приготовления такого активного вещества для лечения пациентов.

Фармацевтические композиции могут помещаться в контейнеры, пачки или дозаторы вместе с инструкциями для применения.

Если используются фрагменты антител, предпочтительно использовать наименьший ингибирующий фрагмент, который специфически связывается с доменом связывания целевого белка. Например, основываясь на последовательностях вариабельного участка антитела, могут разрабатываться пептидные молекулы, сохраняющие способность связывать последовательность целевого белка. Такие пептиды могут синтезироваться химически и/или получаться с использованием методики рекомбинантной ДНК. (См., например, Магаксо е1 а1., Ргос. Ν;·ιΐ1. Асай. 8сг И8А, 90: 7889-7893 (1993)). В состав препарата может также входить несколько активных соединений, необходимых для лечения по определенным показаниям; предпочтительно, такие активные соединения дополняют активность друг друга и не влияют друг на друга нежелательным образом. В качестве альтернативы или дополнения композиция может также содержать средство, усиливающие функцию такой композиции, например цитотоксическое средство, цитокин, химиотерапевтическое средство или средство подавления роста. Такие молекулы могут присутствовать в комбинации в количествах, эффективных для достижения заданной цели.

Активные ингредиенты могут также помещаться в микрокапсулы, приготовленные, например, с использованием методик коацервации или межфазной полимеризации, например гидроксиметилцеллюлозные или желатиновые микрокапсулы и полиметилметакрилатные микрокапсулы соответственно, в коллоидных системах доставки лекарств (например, в липосомах, альбуминовых микросферах, микроэмульсиях, наночастицах и нанокапсулах) или в макроэмульсиях.

Препараты, предназначенные для введения ш νί\Ό, могут быть стерильными. Это легко обеспечивается фильтрованием сквозь стерильные мембранные фильтры.

Можно приготовить препараты непрерывного высвобождения. Подходящие примеры препаратов непрерывного высвобождения включают полупроницаемые матрицы твердых гидрофобных полимеров, содержащие антитело, причем такие матрицы имеют определенную форму, например, форму пленок или микрокапсул. Примеры матриц для препаратов непрерывного высвобождения включают полиэфиры, гидрогели (например, поли-2-гидроксиэтилметакрилат или поливиниловый спирт), полилактиды (патент США №3773919), сополимеры Ь-глутаминовой кислоты и этил-Ь-глутамата, неразлагаемый этиленвинилацетат, разлагаемые сополимеры молочной кислоты и гликолевой кислоты, такие как ΕυΈΚΟΝ ΌΕРОТ™ (инъекционные микросферы, состоящие из сополимера молочной и гликолевой кислоты и лейпролид ацетата), и поли-Э-(-)-3-гидроксимасляную кислоту. В то время как полимеры, такие как этиленвинилацетат и сополимер молочной и гликолевой кислоты, обеспечивают выделение молекул в течение более 100 дней, определенные гидрогели высвобождают белки в течение более коротких периодов времени.

Терапевтически эффективное количество антитела, являющегося предметом этого изобретения, в общем случае, означает количество, необходимое для достижения терапевтической цели. Как отмечалось выше, такая цель может заключаться в связывании антитела с антигеном-мишенью, которое, в определенных случаях, нарушает функции мишени. Количество препарата, которое необходимо ввести пациенту, также зависит от связывающей способности антитела с его специфичным антигеном, и от скорости, с которой истощаются запасы введенного антитела в свободном объеме в организме пациента, которому такое антитело было введено. Как правило, диапазон терапевтически эффективных доз антитела или фрагмента антитела, являющегося предметом этого изобретения, может составлять, например, среди прочего, от примерно 0,1 мг/кг веса тела до примерно 50 мг/кг веса тела. Обычная частота введения доз препарата может изменяться, например, от два раза в день до раза в неделю.

Способы отбора антител.

Способы отбора антител, обладающих определенной специфичностью, включают, среди прочего, твердофазный иммуноферментный анализ (ЕЬ1§А) и другие иммунологические методики, известные специалистам.

190 202 377 395

Антитела против эпитопов γ ^- и γ ^- фибрина могут использоваться в способах, известных специалистам, касающихся локализации и/или количественного определения фибрина. В одном из вари190-202 377-395 антов осуществления этого изобретения антитела, специфичные к эпитопам γ^190-202 и γ^377-395 фибрина, или их производные, фрагменты, аналоги или гомологи, содержащие антиген-связывающий домен антитела, используются как фармакологические активные вещества (далее называемые в этом описании изобретения - терапевтические средства).

190-202 377-395

Антитела, специфичные к эпитопам γ ^- и γ ^- фибрина, могут использоваться для выделения фибринового полипептида стандартными методами, такими как иммоноаффинная хроматография или

- 19 023477 иммунопреципитация. Обнаружение можно облегчить, сопрягая (например, с помощью физического связывания) антитело с детектируемым веществом. Примеры детектируемых веществ включают разные ферменты, простетические группы, флуоресцентные материалы, люминесцентные материалы, биолюминесцентные материалы и радиоактивные материалы. Примеры подходящих ферментов включают пероксидазу хрена, щелочную фосфатазу, бета-галактозидазу или ацетилхолинэтеразу; примеры подходящих комплексов с простетическими группами включают стрептавидин/биотин и авидин/биотин; примеры подходящих флуоресцентных материалов включают умбеллиферон, флуоресцеин, флуоресцеина изотиоцианат, родамин, дихлортриазиниламин флуоресцеин, дансил хлорид или фикоэритрин; примером люминесцентного материала служит люминол; примеры биолюминесцентных материалов включают люциферазу, люциферин и экворин, и примеры подходящих радиоактивных материалов включают I, I, δ или ³Н.

Антитело, являющееся предметом этого изобретения, можно использовать как средство обнаруже190 202 377 395 ния наличия в образце эпитопов γ ^- и γ ^- фибрина. В некоторых вариантах осуществления этого изобретения антитело содержит детектируемую метку. Антитела являются поликлональными или, более предпочтительно - моноклональными. Используется интактное антитело или его фрагмент (например, фрагмент Р_аЬ, ксРу или Р(_аЬ)₂). Термин меченый в применении к зонду или антителу охватывает непосредственное введение метки путем связывания (например, физического связывания) детектируемого вещества с зондом или антителом, а также опосредованное введение метки зонда или антитела за счет реакции с другим реактивом, в который непосредственно была введена метка. Примеры опосредованного введения метки включают детектирование первичного антитела с использованием вторичного антитела с флуоресцентной меткой и конечное введение метки биотина в зонд ДНК так, что его можно обнаружить с помощью стрептавидина с флуоресцентной меткой. Термин биологический образец включает ткани, клетки и биологические жидкости, выделенные из пациента, а также ткани клетки и жидкости в организме пациента. Таким образом, в термин биологический образец включена кровь и фракции или компоненты крови, включая сыворотку крови, плазму или лимфу. Таким образом, метод детектирования, являющийся предметом этого изобретения, может использоваться для обнаружения анализируемой иРНК, белка или геномной ДНК в биологическом образце ш νίΙΐΌ и ш У1уо. Например, методики обнаружения анализируемой иРНК ш νίΙΐΌ включают нозерн гибридизацию и гибридизацию ш кйи. Методики обнаружения анализируемого белка ш уйго включают твердофазный иммуноферментный анализ (ЕЫ8А), вестерн-блоттинг, иммунопреципитацию и иммунофлуоресценцию. Методики ш уйго обнаружения анализируемой геномной ДНК включают саузерн-гибридизацию. Порядок проведения иммуноферментного анализа описан, например в: ЕЫ8А: ТЬеогу апй Ртасйсе: Ме!Ьойк ш Мо1еси1аг Вю1оду (Твердофазный иммуноферментный анализ: теория и практика: Методы молекулярной биологии), уо1. 42, ЕК. СгохуТНег (ей.) Нитап Ргекк, То1о\\а N.1., 1995; 1ттипоаккау (иммунологический анализ), Е. Ихатапйщ апй Т. СЬпк!орои1ик, Асайетю Ргекк, 1пс., 5ап 01едо, СаИГ., 1996; апй Ргасйсе апй ТЬеогу оГ Еп/уте 1ттипоаккаук (Теория и практика иммуноферментного анализа), Р. Туккеп, Е1кеу1ет 35 8аепсе РиЬЬкЬетк, Атк!егйат, 1985. Кроме того, методики обнаружения анализируемого белка ш У1уо включают введение в организм пациента меченого антитела к анализируемому белку. Например, антитело можно маркировать радиоактивным маркером, присутствие и локализацию которого в организме пациента можно определить стандартными методиками визуализации.

Методы отбора ингибиторов.

В этом изобретении предлагаются способы (называемые в этом описании изобретения также анализом для отбора) идентификации модуляторов, например, потенциальных или испытуемых смесей или средств (например, пептидов, пептидомиметиков, небольших молекул или других лекарств), которые модулируют или иным образом влияют на связывание фибрина с рецептором Мас-1, или потенциальных или испытуемых смесей или средств, которые иным образом влияют на сигнальную функцию фибрина, рецептора Мас-1 или комплекса фибрин/Мас-1. Это изобретение также включает соединения, идентифицированные в ходе отбора, представленного в этом описании изобретения.

В одном из вариантов осуществления этого изобретения, предлагается способ отбора потенциальных веществ или испытуемых смесей, которые модулируют сигнальную функцию комплекса фибрин/Мас-1 и/или взаимодействие между фибрином и рецептором Мас-1. Испытуемые смеси, являющиеся предметом этого изобретения, можно получить, используя различные подходы методов комбинаторного синтеза библиотек, известные специалистам, включая: биологические библиотеки; пространственнодоступные параллельные твердофазные библиотеки или библиотеки растворов; методы синтетических библиотек, требующие проведения деконволюционного анализа; библиотеки, полученные методом комбинаторного синтеза одна гранула - одно соединение; методы синтетических библиотек, использующие отбор с помощью аффинной хроматографии. Подход с использованием биологических библиотек ограничивается библиотеками пептидов, а остальные четыре подхода можно применить к библиотекам пептидов, непептидных олигомеров или малых молекул или к отдельным соединениям (см., например, Ьат, 1997. Апйсапсет Эгид Иеыдп 12: 145).

Используемый в этом описании изобретения термин малая молекула означает композицию, обладающую молекулярным весом менее примерно 5 кДа, наиболее предпочтительно менее чем примерно 4

- 20 023477 кДа. Малыми молекулами могут быть, например, нуклеиновые кислоты, пептиды, полипептиды, пептидомиметики, углеводы, жиры или другие органические или неорганические молекулы. Библиотеки химических и/или биологических смесей, таких как смеси грибов, бактерий или экстрактов водорослей, известны специалистам и могут анализироваться с помощью любого из способов отбора, представленных в этом изобретении.

Примеры способов, используемых для синтеза молекулярных библиотек, известны в данной области, и включают, например: Ое\УП1 е! а1., 1993. Ргос. Ναίί. Асаб. 8ск И.8.А. 90: 6909; ЕгЬ е! а1., 1994. Ргос. №ί1. Асаб. 8с1. И.8.А. 91: 11422; 2искегтапи е! а1., 30 1994. ί. Мей. СЬет. 37: 2678; СЬо е! а1., 1993. 8с1епсе 261: 1303; Саггеи е! а1., 1994. Апдеу. СЬет. 1п!. Еб. Епд1. 33: 2059; СагеП е! а1., 1994. Апдеу. СЬет. 1п!. Еб. Епд1. 33: 2061; апб Са11ор е! а1., 1994. ί. Меб. СЬет. 37:1233.

Библиотеки соединений могут быть представлены в растворе (см., например, НоидЬ!еп, 1992. Вю(есПпкщеБ 13: 412-421), или в гранулах (см. Ьат, 1991. №йиге 354: 35 82-84), на пластинках (см. Робот, 1993. №11иге 364: 555-556), бактериях (см. патент США №5223409), спорах (см. патент США №5233409), плазмидах (см. СиП е! а1., 1992. Ргос. №П. Асаб. 8ск И8А 89: 1865-1869) или на фагах (см. 8со!! апб 8тЛЬ, 1990. 8аепсе 249: 386-390; Ое\'Пп. 1990. 8аепсе 249: 404-406; Суи1а е! а1., 1990. Ргос. №!1. Асаб. δοΐ. И.8.А. 87: 6378-6382; РеИсу 1991. ί. Мо1. Вю1. 222: 301-310; и патент США №5233409).

В одном из вариантов осуществления этого изобретения потенциальное соединение вводится в комплекс антиген-антитело и определяется, разрушает ли потенциальное соединение такой комплекс, причем разрушение комплекса указывает на то, что потенциальное соединение модулирует сигнальную функцию комплекса фибрин/Мас-1 и/или взаимодействие между фибрином и рецептором Мас-1. Например, комплекс моноклонального антитела 5В8 с антигеном фибриногеном. В качестве альтернативы моноклональным антителом является антитело 1Е3, а антигеном - фибриноген.

В другом варианте осуществления этого изобретения получают комплекс фибрин/Мас-1 и вводят его в контакт с не менее чем одним нейтрализующим моноклоналычым антителом. Детектируется образование комплекса антитело-антиген, и в этот комплекс вводится одно или несколько потенциальных (испытуемых) соединений. Если комплекс антитело/антиген разрушается после введение одного или нескольких испытуемых соединений, такое испытуемое соединение пригодно для лечения заболеваний, зависящих от связывания фибрина с рецептором Мас-1.

В другом варианте осуществления этого изобретения предлагается растворимый химерный белок, который вводится в контакт с не менее чем одним нейтрализующим моноклональным антителом. Детектируется образование комплекса антитело-антиген, и в этот комплекс вводится одно или несколько потенциальных (испытуемых) соединений. Если комплекс антитело/антиген разрушается после введения одного или нескольких испытуемых соединений, такое испытуемое соединение пригодно для лечения заболеваний, зависящих от связывания фибрина с рецептором Мас-1.

Способность испытуемого соединения влиять или разрушать комплекс антитело/антиген можно определить, например, присоединяя к испытуемому соединению радиоизотопную или ферментативную метку, так чтобы связывание испытуемого соединения с антигеном или его биологически активной частью можно было определить путем обнаружения меченого соединения в комплексе. Например, испытуемые соединения можно маркировать изотопами ¹²⁵Ι, ³⁵δ, ¹⁴С или ³Н либо непосредственно, либо опосредованно, и детектировать радиоизотоп прямым подсчетом радиоактивности или с помощью сцинтилляционного счетчика. В качестве альтернативы, испытуемые вещества можно маркировать ферментами, например пероксидазой хрена, щелочной фосфатазой или люциферазой, и детектировать ферментную метку определением степени превращения соответствующего субстрата в продукт реакции.

В одном из вариантов осуществления этого изобретения анализ для отбора заключается в контакте комплекса антитело-антиген с испытуемым соединением и определении способности испытуемого соединения взаимодействовать с антигеном или иным образом разрушать существующий комплекс антитело-антиген. В таком варианте осуществления этого изобретения определение способности испытуемого соединения взаимодействовать с антигеном и/или разрушать комплекс антитело-антиген заключается в определении способности испытуемого соединения конкурентно связываться с антигеном или его биологически активной частью в сравнении с антителом.

В другом варианте осуществления этого изобретения анализ для отбора заключается в контакте комплекса антитело-антиген с испытуемым соединением и определении способности испытуемого соединения модулировать комплекс антитело-антиген. Способность испытуемого соединения модулировать комплекс антитело-антиген можно определить, например, определяя способность антигена связываться или взаимодействовать с антителом в присутствии испытуемого соединения.

Специалисты в данной области понимают, что в любом из методов отбора, представленных в этом описании изобретения, антитело может быть нейтрализующим антителом, таким как моноклональное антитело 5В8 и/или 1Е3, каждое из которых модулирует или иным образом влияет на связывание фибрина с рецептором Мас-1.

В одном из вариантов осуществления этого изобретения может оказаться желательным иммобилизовать либо антитело, либо антиген для облегчения отделения связанных в комплекс форм от не связанных в комплекс форм антитела, антигена или обоих после введения испытуемого соединения, а также

- 21 023477 для обеспечения возможности проведения автоматического анализа. Наличие комплекса антителоантиген в присутствии или в отсутствие испытуемого соединения можно наблюдать в любом сосуде, пригодном для содержания реагентов. Примерами таких сосудов служат панели микротитратора, пробирки и микроцентрифужные пробирки. В одном из вариантов осуществления этого изобретения используется белок слияния, добавляющий домен, который позволяет одному или обоим белкам связываться с матрицей. Например, белки слияния глутатион-З-трансферазы (ОЗТ)-антитело или белки слияния ОЗТ-антиген могут поглощаться на поверхности глутатион-сефарозных гранул (Зщта СНеписак З1. Ьои18, Мо.) или на панели микротитратора, покрытой производным глутатиона, и затем объединяться с испытуемым соединением, после чего смесь инкубируется в условиях, подходящих для комплексообразования (например, в условиях физиологического раствора соли и при физиологических значениях рН). После инкубации гранулы или стенки планшета микротитратора промываются для удаления несвязанных компонентов и матрицы, в случае гранул, и комплекс определяется либо непосредственно, либо косвенным методом. В качестве альтернативы, комплексы могут отделять от матрицы и уровень комплексообразования антитело/антиген может определяться стандартными методами.

В анализе для отбора по этому изобретению могут применяться и другие методики иммобилизации белков на матрицах. Например, либо антитело (например, антитело 5В8 и/или 1Е3), либо антиген (например, фибрин) можно иммобилизовать, используя сопряжение с биотином или стрептавидином. Сопряженные с биотином молекулы антитела или антигена можно получить, используя биотин-ИНЗ (NΗЗ: ^гидроксисукцинимид) и хорошо известную специалистам методику (например, используя набор для сопряжения с биотином, Р1етсе СНеписак, КоскГогб, III), и иммобилизовать их на стенках планшета с 96 лунками, покрытого стрептавидином (Р1егсе СНетюа1). В качестве альтернативы, на стенки лунок планшета можно нанести другие антитела, реагирующие с данным антителом или антигеном, но не мешающие образованию данного комплекса антитело/антиген, и несвязанное антитело или антиген будут закрепляться на стенках планшета за счет конъюгации с антителом. Методы обнаружения таких комплексов, кроме описанных выше для комплексов, иммобилизованных СЗТ, включают иммунодетектирование комплексов с помощью других антител, реагирующих с антителом или антигеном.

Это изобретение также относится к новым средствам, идентифицированным с помощью любого из указанных выше способов отбора, и к способам использования таких средств в лечении пациентов, представленным в этом описании изобретения.

Диагностический анализ.

Антитела, являющиеся предметом этого изобретения, могут детектироваться с помощью подходящих методов анализа, например, с помощью традиционных типов иммунологического анализа. Например, можно провести сэндвич-анализ, для реализации которого полномерный фибриноген, фибрин или их фрагмент крепится на твердой фазе. Затем проводят инкубацию в течение времени, достаточного, чтобы антитело в образце связалось с иммобилизованным на твердой фазе полипептидом. После первой инкубации твердую фазу отделяют от образца. Твердую фазу промывают для удаления несвязанных материалов и мешающих веществ, такие как неспецифические белки, которые также могут присутствовать в образце. Твердая фаза, содержащая целевое антитело (т.е., моноклональное антитело 5В8 и/или 1Е3), связанное с иммобилизованным полипептидом, затем инкубируют со вторым, маркированным антителом или антителом, связанным с таким средством сопряжения как биотин или авидин. Такое второе антитело может быть другим антифибриновым антителом. Метки для антител хорошо известны специалистам и включают радионуклиды, ферменты (например, малеатдегидрогеназу, пероксидазу хрена, глюкозооксидазу, каталазу), флуоресцентные метки (флуоресцеин изоцианат, родамин, фикоцианин, фторескармин), биотин и т.п. Маркированные антитела инкубируют с антителом на твердой фазе и измеряют количество метки, связанной с твердой фазой. Эти и другие способы иммунологического анализа легко реализуются специалистами.

Примером способа определения наличия или отсутствия белка фибрина в биологическом образце служит способ с использованием биологического образца, полученного от испытуемого пациента, приведением такого образца в контакт с меченым моноклональным антителом, являющимся предметом этого изобретения, и определением наличия фибрина в биологическом образце.

Используемый в этом описании изобретения термин меченый в связи с зондом или антителом охватывает прямое мечение зонда или антитела путем присоединения (например, физического связывания) детектируемого вещества к зонду или антителу, а также опосредованное введение метки зонда или антитела за счет реакции с другим реактивом, в который непосредственно была введена метка. Примеры опосредованного введения метки включают детектирование первичного антитела с использованием вторичного антитела с флуоресцентной меткой и конечное введение метки биотина в зонд ДНК так, что его можно обнаружить с помощью стрептавидина с флуоресцентной меткой. Термин биологический образец включает ткани, клетки и биологические жидкости, выделенные из пациента, а также ткани, клетки и жидкости в организме пациента. Таким образом, метод детектирования, являющийся предметом этого изобретения, может использоваться для обнаружения анализируемой иРНК, белка или геномной ДНК в биологическом образце ίη уйго и ίη У1уо. Например, методики обнаружения фибрина включают твердофазный иммуноферментный анализ (ЕЫЗА), вестерн-блоттинг, иммунопреципитацию и иммунофлуо- 22 023477 ресценцию. Кроме того, методики обнаружения фибрина ш νί\Ό включают введение в организм пациента меченого антитела к фибрину. Например, антитело можно маркировать радиоактивным маркером, присутствие и локализацию которого в организме пациента можно определить стандартными методиками визуализации.

В одном из вариантов осуществления этого изобретения биологический образец содержит молекулы белков из организма пациента. Одним предпочтительным биологическим образцом служит образец лейкоцитов периферической крови, взятый у пациента традиционным способом.

Наборы.

Это изобретение также касается наборов для обнаружения наличия фибрина в биологическом образце. Например, набор может включать: меченое соединение или средство, позволяющее обнаруживать фибрин в биологических образцах; средства определения количества фибрина в образце; средства сравнения количества фибрина в образце со стандартом. Соединение или средство может быть упаковано в подходящий контейнер. Набор может также содержать инструкции для использования набора для обнаружения фибрина в образце.

Это изобретение будет далее описано в следующих примерах, которые не ограничивают объема изобретения, описанного в формуле изобретения.

Примеры

Различные аспекты этого изобретения можно лучше понять в свете следующих примеров, которые не следует рассматривать как каким-то образом ограничивающие объем этого изобретения.

Пример 1. Получение моноклональных антител.

Были синтезированы пептидные последовательности, точно соответствующие аминокислотам в гамма-цепи фибриногена, которая, как было показано, имеют решающее значение для взаимодействия фибриногена с рецептором Мас-1 (пептид № 1: СО^ТУБ-ОККГООЗБ (ЗЕО ГО N0: 17) и пептид №2: СККТТМКIIРΡNР^ТIО (ЗЕО ГО N0: 18)). Эти два пептида были синтезированы с соответствующими Νтерминальными остатками цистеина, позволяющими выполнять конъюгацию с носителем белка - гемоцианином лимфы улитки, что способствует устойчивому антителообразованию ш νί\Ό. Оба пептида использовались для иммунизации трех мышей, вызывая у них антителообразование. Предварительный анализ сыворотки обнаружил значительный титр антител к этим пептидам и привел к последующему получению гибридом, вырабатывающих клональные антитела к этим двум пептидным последовательностям. Исходный скрининг 480 клонов гибридомы проводился методом твердофазного иммуноферментного анализа (ЕШЗЛ) для обоих пептидов, а также для белка - носителя. Положительные клоны накапливались и повторно анализировались для подтверждения реакции с эпитопами пептидов методом твердофазного иммуноферментного анализа (ЕЫЗЛ). Окончательные результаты такого исходного анализа показали, что 46 клонов были специфичными к одному из пептидов №1 или 2. Подробный анализ таких результатов твердофазного иммуноферментного анализа (ЕЫЗЛ) позволил идентифицировать 16 целевых кандидатов на дальнейшее исследование. Эти 16 клонов были испытаны на их способность блокировать адгезию микроглий с помощью рецептора Мас-1 на полномерном фибриногене. Культуры клеток покрывали раствором 50 мкг/мл фибриногена, на который затем наносили клетки микроглии (200000 клеток/мл) в присутствии таких клонов антител. Через 30 мин лунки промывали и оставшиеся приклеившиеся клетки окрашивали 0,1%-ным раствором кристаллического фиолетового. Окрашенные клетки фиксировали с помощью 1%-ного раствора параформальдегида и солюбилизировали 0,5% раствора Тритон Х-100. Пять из этих клонов продемонстрировали значительную, аналогичную коммерчески доступному блокирующему антителу к Мас-1 (М1/70), способность предотвращать адгезию микроглий к фибриногену, оцениваемую измерениями поглощения на 595 нм (фиг. 1; по сдвигу поглощения, степень подавления превысила 20%). Предусмотрено, что антитела, являющиеся предметом этого изобретения, могут ингибировать адгезий микроглий к фибриногену более чем на 30, 40 или 50%. Клоны 1А5, 1Ό6 и 1Е3 распознают эпитоп пептида № 1, а клоны 4Е11 и 5В8 распознают эпитоп пептида № 2. Эти пять клонов затем были проанализированы на их способность распознавать фибриноген методом вестерн-блоттинга. Все пять антител в одинаковой степени распознавали γ-цепь фибриногена. Для изучения того, распознают ли эти антитела фибриноген в зависимости от дозы, был проведен твердофазный иммуноферментный анализ (ЕЫЗЛ) полномерного фибриногена (фиг. 2). Было обнаружено, что вся пять антител специфически связывают полномерный фибриноген в большей степени с ростом концентрации фибриногена. Из этих пяти антител были выбраны три антитела (1Е3, 4Е11 и 5В8, обеспечивающие более чем 50% подавление связывание рецептора Мас-1 с доменом γС фибрина или фибриногена, измеренное по сдвигу поглощения) для выделения и полной очистки. В этом изобретении предусмотрено, что антитела, являющиеся предметом этого изобретения, могут ингибировать связывание Мас-1 с фибрином более чем на 50, 60 или 70%. Исходно, по 20 мг каждого из трех антител были очищены для использования в анализе фагоцитоза ш уйго и в экспериментах с ЭАЭ.

Пример 2. Моноклональные антитела к γ-цепи фибриногена ингибируют фагоцитоз микроглиями.

Фагоцитоз является важной функцией активированных микроглий и макрофагов, в которой участвует рецептор Мас-1. Анализ фагоцитоза был проведен с микроглиями так, как описывалось ранее. См. Лбат8 е!

- 23 023477 а1., 2007, 1. Ехр. Меб. 204:571-582, полностью включенную в это описание изобретения посредством ссыл377-395 ки. Производный от фибрина пептид γ^377-395 ингибирует активацию микроглий и ингибирует рецидив паралича при аутоиммунном заболевании центральной нервной системы. Моноклональное антитело 5В8 к мо377-395 дифицированному эпитопу γ^377-395 фибрина обнаружило лучшую эффективность в подавлении фагоцитоза ш νίΙΐΌ. Это антитело в исследованиях ш νί\Ό продемонстрировало эффекты профилактики и лечения на

377-395 животных моделях рассеянного склероза, как ранее было показано для пептида γ^377-395.

Пример 3. Моноклональное антитело 5В8 снижает частоту рецидивов на животных моделях рецидивирующего экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита.

Для оценки влияния антифибриновых антител на регуляцию активации микроглий и разрушение миелинового слоя ш νί\Ό, два из клонов, идентифицированных в анализе фагоцитоза, были введены мышам после развития вызванного пиридоксальфосфатом (РЬР) ЭАЭ. Антитела 5В8 и 4Е11 вводили три раза в неделю в дозах по 250 мкг на мышь. Как показано на фиг. 4, антитело 4Е11 не оказывало существенного влияния на развитие ЭАЭ. В отличие от этого, антитело 5В8 продемонстрировало подавление клинических симптомов во время рецидива.

Другие варианты осуществления этого изобретения.

Подробное описание, приведенное выше, предназначается для того, чтобы помочь специалистам с практической реализацией этого изобретения. Однако описанное в этом документе изобретение и его формула не должны ограничивать объем изобретения конкретными вариантами его осуществления, представленными в этом описании изобретения, так как такие варианты предназначены лишь для иллюстрации некоторых аспектов этого изобретения. Любые эквивалентные варианты осуществления этого изобретения входят в его объем. Действительно, различные модификации этого изобретения, кроме представленных в этом описании, станут очевидными для специалистов в данной области, исходя из приведенного выше описания, не отклоняясь от сущности и объема этого изобретения. Такие модификации также попадают в объем прилагающейся формулы изобретения.

Цитированная литература.

Цитирование литературы в этом описании изобретение не должно толковаться как описание прототипа этого изобретения.

- 24 023477

Перечень последовательностей

<11С	)>	ТЬе НедепЬз о£ ЬЬе ипд.уегз1Ьу о£ Аказзод1ои, КаЬеггпа	СаН£огп1а
<120>	Моноклональные антитела
< 13 0>	КОС-11 ΟΝΟ
<150>	из 61/248,014
<151>	2009-10-02
<160>	18
<170>	Патентная версия 3.5
<210>	1
<211 >	158
<212>	БЕЛОК
<213>	Миз 1Ьизси1из
<400>	1
ТЬг	РЬе	Азр Зег Рго Туг С1п Уа1 Агд Агд	МеЬ Агд РЬе Зег А1а С1п
1		5 10	15
Ьеи	Ьеи	С1у Ьеи Ьеи Уа1 Ьеи Тгр 11е Рго	С1у Зег ТЬг А1а Азр 11е
		20 25	30
Уа1	МеЬ	ТЬг С1п А1а А1а РЬе Зег Азп Рго	11е ТЬг Ьеи О1у ТЬг Зег
		35 40	45
А1а	Зег	МеЬ Зег Суз Агд Зег Зег Ьуз Зег	Ьеи Ьеи Нгз Зег Зег С1у
	50	55	60
Не	ТЬг	Туг Ьеи Зег Тгр Туг Ьеи С1п Ьуз	Рго 61у С1п Зег Рго С1п
65		70	75 80
Ьеи	Ьеи	11е Туг 61п МеЬ Зег Азп Ьеи А1а	Зег С1у Уа1 Рго Азр Агд
		85 90	95
РЬе	Зег	Зег Зег С1у Зег С1у ТЬг Азр РЬе	ТЬг Ьеи Агд 11е Зег Агд
		100 105	110
Уа1	61и	А1а 61и Азр Уа1 С1у Уа1 Туг Туг	Суз А1а С1п Азп Ьеи С1и
		115 120	125
Ьеи	Рго	Ьеи ТЬг РЬе С1у А1а С1у ТЬг Ьуз	Ьеи С1и Ьеи Ьуз Агд А1а
	130	135	140
Азр	А1а	А1а Рго ТЬг Уа1 Зег А1а Суз ТЬг	Ьуз С1у С1и РЬе
145		150	155

- 25 023477 <210> 2 <211> 16 <212> БЕЛОК <213> Миз тизси1из <400> 2

Агд Зег	Зег Ьуз Зег Ьеи Ьеи Низ Зег	Зег 61у	Не ТЬг Туг Ьеи Зег
1	5	10	15

<210 <211> <212> <213>	3 7 БЕЛОК Миз тизси1из
<400>	3
С1п МеЬ	Зег Азп Ьеи А1а Зег
1	5

<210> 4 <211> 9 <212> БЕЛОК <213> Миз тизси1из <400> 4

А1а 01п Азп Ьеи 61и Ьеи Рго Ьеи ТЬг 1 5 <210> 5 <211> 166 <212> БЕЛОК <213> Миз тизси1из <400> 5

Азп 1

ТЬг

А1а

РЬе

А1а 5

61у

РЬе

01у

Агд

Азп 10

МеЬ

Агд

Зег

Ьеи

РЬе 15

Зег

Ьеи

С1п

Ьеи

Ьеи 20

Зег

ТЬг

61п

Азр

Ьеи 25

А1а

МеЬ

61у

Тгр

Зег 30

Суз

11е

11е

Уа1

Ьеи 35

Ьеи

Уа1

Зег

ТЬг

А1а 40

ТЬг

С1у

Уа1

Ηί3

Зег 45

61п

Уа1

61п

Ьеи

С1п

61п

Рго

С1у

А1а

С1и

Ьеи

Уа1

Агд

Рго

С1у

ТЬг

Зег

Уа1

Ьуз

55 60

- 26 023477

Ьеи Зег Суз Ьуз АЬа Зег СЬу Туг ТЬг РЬе ТЬг Зег Туг Тгр Не Шз 65 70 75 80

Тгр УаЬ Ьуз СЬп Агд Рго СЬу СЬп СЬу Ьеи СЬи Тгр 11е СЬу Ьеи 11е 85 90 95

Азр Рго Зег Азр Зег Туг ТЬг Азп Туг Азп СЬп Ьуз РЬе Агд СЬу Ьуз 100 105 110

АЬа ТЬг Ьеи ТЬг УаЬ Азр ТЬг Зег Зег Зег ТЬг АЬа Туг МеЬ СЬп Ьеи 115 120 125

Зег Зег Ьеи ТЬг Зег СЬи Азр Зег АЬа УаЬ Туг Туг Суз АЬа Зег Зег 130 135 140

Азр Рго ТЬг СЬу Суз Тгр СЬу СЬп СЬу ТЬг ТЬг Ьеи ТЬг УаЬ Зег Рго 145 150 155 160

АЬа Зег ТЬг ТЬг Рго Рго 165 <210> 6 <211> 10 <212> БЕЛОК <213> Миз тизсиЬиз <400> 6

СЬу Туг ТЬг РЬе ТЬг Зег Туг Тгр 11е НЬз 15 10 <210> 7 <211> 17 <212> БЕЛОК <213> Миз тизсиЬиз <400> 7

Ьеи ТЬе Азр Рго Зег Азр Зег Туг ТЬг Азп Туг Азп СЬп Ьуз РЬе Агд

СЬу <210> 8 <211> 6 <212> БЕЛОК <213> Миз тизсиЬиз

- 27 023477 <400> δ

Зег Азр Рго ТЬг С1у Суз 1 5 <210> 9 <211> 474 <212> ДНК <213> Миз тизси1из <400> 9

асССССдасС 60	сассаСаСса	адНсдсада	аСдаддПс!	ИдсНадс!	!с!ддддс!д
сП дЕдс-ЬсС 120	ддаСсссЕдд	а!ссас!дса	да!а!!д!да	Ъдасдсаддс	1дса!1с!сс
аа!ссааЕса 180	с! сПддаас	а!садс!ίсс	а!д!сс!дса	дд!с!ад!аа	дад!с!сс!а
са!ад!ад!д 240	дсаЕсасНа	ИЪдЬсИдд	Ь.аЬсЪдсада	адссаддсса	д!с!сс!сад
с!сс! дат 300	а! сада!д!с	саассН дсс	ίсаддад!сс	садасаддИ	сад!адсад!
ддд!саддаа 360	с!да1Исас	асъдадаап	адссдадЬдд	аддс!дадда	!д!ддд!д!!
1аПас!д!д 420	с!саааа!с!	адаасПссд	сНасдИсд	д!дс!дддас	саадс!ддад
сЕдааасддд 474	с!да!дс!дс	ассаас!д!а	!ссдса!дса	ссаадддсда	а!! с
<210> 10 <211> 499 <212> ДНК <213> Миз	тизси1из
<400> 10 даасасЪдсд 60	!Ндс!ддс!	Пддаадааа	са!дада!са	с!д!!с!с!с	!асад!!ас!
дадсасасад 120	дассссдсса	сддда!ддад	с! д!а!саН	д!сс!с!! дд	!а!саасадс
ЬасаддЪдЕс 180	сасСсссадд	ЬссаасЬдса	дсадсс!ддд	дс!дадс!дд	!даддсс!дд
дас!!сад!д 240	аад!!д!сс!	дсааддсПс	!ддс!асасс	!!сассадс!	ас!дда!аса
с!ддд!ааад 300	сададдсс!д	дасааддсс!	!дад!дда!с	ддас!да! !д	а! сс!!с!да

- 28 023477 ^адЕЕаЕасЕ аасЬасааЬс аааадГДсад дддсааддсс асаЪДдасКд ГадасасаДс 360 сбссадсаса дссбасаЕдс адсУсадсад ссЕдасаЕсЬ даддасЬсКд сддЪсКаКЬа 420 сЬд^дсаадс ЪссдаЪссЬа саддсСдсЪд дддссааддс ассасЕсЕса садЕсЪсссс 480 адс^адсаса асассссса

499 <210> 11 <211 > 48 <212> ДНК <213> Миз тизси1из <400> 11 адд'ЬсЬадЬа адад'Ьс'ЬссК аса^адбадД ддса^сасКК аДУ^дЪсК 48 <210> 12 <211> 21 <212> ДНК <213> Миз тизси1из <400> 12 сада^д^сса ассЬ'ЬдссКс а 21 <210> 13 <211> 27 <212> ДНК <213> Миз ипизси1из <400> 13 дсКсааааДс КадаасДЪсс дс±сасд 27 <210> 14 <211> 30 <212> ДНК <213> Миз тизси1из <400> 14 ддсДасасс! КсассадсКа сДддаКасас 30

<210>	15
<211>	51
<212>	ДНК
<213>	Миз тизси1из

- 29 023477 <400> 15 скдаЬЬдаЬс сЬЬсЬдаЬад ЬЪаЬасЬаас ЬасааЪсааа адЬЬсадддд с <210> 16 <211> 18 <212> ДНК <213> Миз тизсиЬиз <400> 16

ЬссдакссЬа саддскдс 18 <210> 17 <211> 14 <212> БЕЛОК <213> Миз тизси1из <400> 17

Суз С1у Тгр ТЬг Уа1 Ьеи С1п Ьуз Агд Не Азр 61у 8ег Ьеи 15 10 <210> 18 <211> 17 <212> БЕЛОК <213> Миз тизси1из <400> 18

Суз Ьуз Ьуз ТЬг ТЬг МеЬ Ьуз 11е 11е Рго РЬе Азп Агд Ьеи ТЬг Не 15 10 15

Claims (20)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Выделенное антитело, связывающее домен γ-С фибрина или фибриногена, ингибирующее клинические симптомы экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита, содержащее СИК-Н3, с последовательностью 8ИРТОС (8ЕЦ ГО N0: 8).
2. 2. Антитело по п.1, отличающееся тем, что оно ингибирует адгезию микроглий к домену γ-С фибрина или фибриногена более чем на 20%.
3. 3. Антитело по п.1, отличающееся тем, что оно ингибирует связывание Мас-1 с доменом γ-С фибрина или фибриногена более чем на 50%.

   377-395
4. 4. Антитело по п.1, отличающееся тем, что оно связывает эпитоп γ ^- домена γ-С фибрина или фибриногена.
5. 5. Антитело по п.1, отличающееся тем, что оно связывает эпитоп γ^190-202 домена γ-С фибрина или фибриногена.
6. 6. Антитело по п.1, отличающееся тем, что оно является моноклональным антителом.
7. 7. Антитело по п.1, отличающееся тем, что оно является гуманизированным антителом.
8. 8. Антитело по п.1, отличающееся тем, что оно содержит вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность из следующей группы последовательностей: К88К8^^Н88СIТΥ^8 (СИК-Ь1, 8ЕЦ ГО N0: 2), ЦМ8ЖА8 (СИК-Ь2, 8ЕЦ ГО N0: 3) и АОМ.Н.РЬТ (СИК-Ь3, 8ЕЦ ГО N0: 4).
9. 9. Антитело по п.1, отличающееся тем, что оно содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую также аминокислотную последовательность из следующей группы последовательностей: СΥТРТ8ΥΑIН (СИК-Н1, 8ЕЦ ГО N0: 6), ^I^Р8^8ΥТNΥN^КРКС (СИК-Н2, 8ЕЦ ГО N0: 7).
10. 10. Антитело по п.1, отличающееся тем, что оно содержит вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из следующей группы последовательностей: К.88К8ЬЬН88ОГТУЬ8 (СИК-Ь1, 8ЕЦ ГО N0: 2), ЦМЗЖАЗ (СИК-Ь2, 8ЕЦ ГО N0: 3) и АЦЖЕЬРЬТ (СИК-Ь3, 8ЕЦ ГО N0: 4), и вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность 8ЕЦ ГО N0: 8 (СИК-Н3) и последовательность, выбранную из следующей

    - 30 0234ΊΊ группы последовательностей: ΟΥΤΡΤ8ΥΥΙΗ (СЭК-Н1, 8Е() ΙΌ ΝΟ: 6), ^ГОΡ8^8ΥΤNΥN^ΚΡКΟ (ССКΗ2, 8Е() ГО ΝΟ: 7).
11. 11. Антитело по п.1, отличающееся тем, что оно содержит вариабельную область легкой цепи с аминокислотной последовательностью 8Е0 ГО ΝΟ: 1.
12. 12. Антитело по п.1, отличающееся тем, что оно содержит вариабельную область тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью 8Е0 ГО ΝΟ: 5.
13. 13. Антитело по п.1, отличающееся тем, что оно содержит вариабельную область легкой цепи с аминокислотной последовательностью 8Е0 ГО ΝΟ: 1 и вариабельную область тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью 8Е0 ГО ΝΟ: 5.
14. 14. Антитело по п.1, отличающееся тем, что оно содержит вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, на 80% идентичную последовательностям, выбранным из группы Κ88Κ8ΕΕΗ88ΟΙΤΥΟ8 (С1Ж-ЕЕ 8Е() ГО ΝΟ: 2), ()М18ЖЛ8 (С1Ж-Е2. 8Е() ГО ΝΟ: 3) и А^N^Ε^Ρ^Τ (СОК-Ь3, 8Е() ГО ΝΟ: 4), и вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность 8Е0 ГО ΝΟ: 8 (СЭК-Н3), и последовательность, на 80% идентичную последовательностям, выбранным из группы ΟΥΤΡΤ8ΥΥΙΗ (СЭК-Н1, 8Е() ГО ΝΟ: 6), ^ГОΡ8^8ΥΤΥΥΥΟΚΡΕΟ (СЭК-Ж, 8Е() ГО ΝΟ: 7); причем антитело обладает способностью ингибировать связывание Мас-1 с фибрином или фибриногеном.
15. 15. Антитело по п.1, отличающееся тем, что оно содержит вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, на 90% идентичную последовательностям, выбранным из группы К88К8ЕЕ11880ΙΤΥΕ8 (СЭК-Ы, 8Е() ГО ΝΟ: 2), ()М18ЖЛ8 (С1Ж-Е2. 8Е() ГО ΝΟ: 3) и А^N^Ε^Ρ^Τ (СОК-Ь3, 8Е() ГО ΝΟ: 4), и вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность 8Е0 ГО ΝΟ: 8 (СЭК-Н3), и последовательность, на 90% идентичную последовательностям, выбранным из группы ΟΥΤΡΤ8ΥΥΙΗ (СЭК-Ш, 8Е() ГО ΝΟ: 6), ^ГОΡ8^8ΥΤΥΥΥΟΚΡΕΟ (СЭК-Ж, 8Е() ГО ΝΟ: 7); причем антитело обладает способностью ингибировать связывание Мас-1 с фибрином или фибриногеном.
16. 16. Антитело по п.1, отличающееся тем, что оно содержит вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, на 95% идентичную последовательностям, выбранным из группы К88К8ЕЕ11880ΙΤΥΕ8 (СЭК-Ы, 8Е() ГО ΝΟ: 2), ()М18ЖЛ8 (С1Ж-Е2. 8Е() ГО ΝΟ: 3) и А^N^Ε^Ρ^Τ (СОК-Ь3, 8Е() ГО ΝΟ: 4), и вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность 8Е0 ГО ΝΟ: 8 (СЭК-Н3), и последовательность, на 95% идентичную последовательностям, выбранным из группы 0ΥΤΡΤ8ΥΥΊΙΙ (СЭК-Ш, 8Е() ГО ΝΟ: 6), ^ГОΡ8^8ΥΤΥΥΥΟΚΡΡΟ (СЭК-Ж, 8Е() ГО ΝΟ: 7); причем антитело обладает способностью ингибировать связывание Мас-1 с фибрином или фибриногеном.
17. 17. Антитело по п.1, отличающееся тем, что оно содержит вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, на 99% идентичную последовательностям, выбранным из группы К88К8РР11880ΙΤΥΡ8 (СЭК-Ы, 8Е() ГО ΝΟ: 2), ()М18ЖЛ8 (С1Ж-Р2. 8Е() ГО ΝΟ: 3) и А^N^Ε^Ρ^Τ (СОК-Ь3, 8Е() ГО ΝΟ: 4), и вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность 8Е0 ГО ΝΟ: 8 (СЭК-Н3), и последовательность, на 99% идентичную последовательностям, выбранным из группы ΟΥΤΡΤ8ΥΥΙΗ (СЭК-Ш, 81:0 ГО ΝΟ:6), ^ГОΡ8^8ΥΤΥΥΥΟΚΡΡΟ (СЭК-Ж, 81:0 ГО ΝΟ: 7); причем антитело обладает способностью ингибировать связывание Мас-1 с фибрином или фибриногеном.
18. 18. Способ снижения выраженности симптомов патологии, обусловленной связыванием Мас-1 с фибрином или с фибриногеном, заключающийся во введении пациенту антитела по п.1 в количестве, достаточном для снижения у него выраженности симптомов указанной патологии.
19. 19. Способ по п.18, отличающийся тем, что указанная патология выбрана из группы, состоящей из: рассеянный склероз, повреждение спинного мозга, болезнь Альцгеймера, инсульт, ревматоидный артрит и рак.
20. 20. Фармацевтическая композиция для связывания домена γ-С фибрина или фибриногена, содержащая эффективное количество антитела по п.1 и фармацевтически приемлемый носитель.