TWI511741B

TWI511741B - 單株抗體

Info

Publication number: TWI511741B
Application number: TW099133559A
Authority: TW
Inventors: Katerina Akassoglou
Original assignee: Univ California
Priority date: 2009-10-02
Filing date: 2010-10-01
Publication date: 2015-12-11
Also published as: AR078490A1; EP2483416B1; IN2012DN03154A; CN102575277B; KR101793221B1; BR112012008370B1; IL218621B; CY1118540T1; IL218621A0; CL2012000788A1; EP2483416A4; CN102575277A; EA201270416A1; JP5883389B2; DK2483416T3; PT2483416T; MA33704B1; ES2614939T3; SI2483416T1; DOP2012000089A

Description

單株抗體

【相關申請的交叉參考】

本申請案主張2009年10月2日提出申請的美國臨時申請案第61/248,014號之優先權，其全部併入本案供參考。

關於聯邦資助研究或開發的聲明

本發明一部分是在國家衛生研究院研究基金(National Institutes of Health Grant)NS052189的政府支持下進行。政府對本發明享有一定權利。

電子提交材料的參考併入

作為本發明一部分的序列表包含由美國專利商標局(U.S. Patent & Trademark Office)帕坦汀3.5版軟體(PatentIn Version 3.5 software)產生的名稱為「RUC110WO_ST25」之文件，包括本發明之核苷酸及/或胺基酸序列。序列表的標的物全部併入本案供參考。

本發明大體而言關於單株抗體的產生，且尤其關於識別血纖維蛋白γC域之單株抗體，以及使用所述單株抗體作為治療劑的方法。

當免疫系統攻擊腦與脊髓，從而損害隔離並保護神經纖維的髓鞘時，會發生多發性硬化症。當血腦障壁(BBB)，亦即應保護腦免遭侵入物侵害之細胞內襯層受到破壞時，稱為微神經膠質細胞之腦細胞參與此攻擊且得到活化。由於BBB受到破壞，故稱為血纖維蛋白原之血蛋白滲入腦中。除了在血液凝結方面的已知作用以外，血纖維蛋白原亦活化微神經膠質細胞且由此加強多發性硬化症動物模型體內的發炎反應。另外，已確定血纖維蛋白原與某些癌症、類風濕性關節炎以及組織受損藉此血纖維蛋白原「滲漏」之其他疾病與病態的發病機制有關。參見例如阿克索洛(Akassoglou)等人,2002,神經元(Neuron),33:861-875；阿克索洛(Akassoglou)等人,2004,美國國家科學院學報(Proc. Natl. Acad. Sci. USA),101:6698-6703；亞當斯(Adams)等人,2007,實驗醫學雜誌(J. Exp. Med.),35:2428-34。亦已確定血纖維蛋白原介導(mediate)此等作用所利用之特定受體Mac-1與血纖維蛋白原的有益凝結特性無關。然而，迄今為止，尚未開發出血纖維蛋白原/Mac-1結合之特定抑制劑。

因此，需要血纖維蛋白原/Mac-1結合之特定抑制劑，其降低血纖維蛋白原在個體之腦中以及其他地方的促炎性作用，同時保持血纖維蛋白原在血液凝結方面的有益作用。

本發明提供一種結合血纖維蛋白或血纖維蛋白原γC域的分離抗體。在本發明之某些態樣中，抗體使得微神經膠質細胞黏著於血纖維蛋白或血纖維蛋白原γC域受到20%以上抑制。在另一態樣中，抗體使得Mac-1結合於血纖維蛋白或血纖維蛋白原γC域受到50%以上抑制。在另一態樣中，抗體遏制實驗性自體免疫腦脊髓炎(EAE)復發時的臨床症狀。

在多個實施例中，抗體結合血纖維蛋白或血纖維蛋白原γC域之γ^377-395 抗原決定基。或者，本發明之抗體可結合血纖維蛋白或血纖維蛋白原γC域之γ^190-202 抗原決定基。所述抗體為單株抗體，且在多個態樣中為人類化抗體或人類抗體。

在本發明之多個態樣中，抗體包括具有三個包括以下胺基酸序列之互補決定區的輕鏈，所述胺基酸序列包含RSSKSLLHSSGITYLS(SEQ ID NO:2)、QMSNLAS(SEQ ID NO:3)以及AQNLELPLT(SEQ ID NO:4)。在多個態樣中，抗體包括具有三個包括以下胺基酸序列之互補決定區的重鏈，所述胺基酸序列包含GYTFTSYWIH(SEQ ID NO:6)、LIDPSDSYTNYNQKFRG(SEQ ID NO:7)以及SDPTGC(SEQ ID NO:8)。在某些情況下，抗體包括具有三個包括以下胺基酸序列之互補決定區的輕鏈，所述胺基酸序列包含RSSKSLLHSSGITYLS(SEQ ID NO:2)、QMSNLAS(SEQ ID NO:3)以及AQNLELPLT(SEQ ID NO:4)；與具有三個包括以下胺基酸序列之互補決定區的重鏈，所述胺基酸序列包含GYTFTSYWIH(SEQ ID NO:6)、LIDPSDSYTNYNQKFRG(SEQ ID NO:7)以及SDPTGC(SEQ ID NO:8)。

在多個態樣中，上述抗體包括SEQ ID NO:1之輕鏈可變胺基酸序列。在多個態樣中，上述抗體包括SEQ ID NO:5之重鏈可變胺基酸序列。在另一態樣中，上述抗體包括SEQ ID NO:1之輕鏈可變胺基酸序列與SEQ ID NO:5之重鏈可變胺基酸序列。

在本發明之另一態樣中，上述抗體個別包括具有三個包括以下胺基酸序列之互補決定區的輕鏈，所述胺基酸序列與包含RSSKSLLHSSGITYLS(SEQ ID NO：2)、QMSNLAS(SEQ ID NO：3)以及AQNLELPLT(SEQ ID NO：4)之序列具有至少80%序列一致性；與具有三個包括以下胺基酸序列之互補決定區的重鏈，所述胺基酸序列與包含GYTFTSYWIH(SEQ ID NO：6)、LIDPSDSYTNYNQKFRG(SEQ ID NO：7)以及SDPTGC(SEQ ID NO：8)之序列具有至少80%序列一致性；且其中輕鏈互補域及重鏈互補域保持Mac-1結合能力。

在本發明之另一態樣中，上述抗體個別包括具有三個包括以下胺基酸序列之互補決定區的輕鏈，所述胺基酸序列與包含RSSKSLLHSSGITYLS(SEQ ID NO：2)、QMSNLAS(SEQ ID NO：3)以及AQNLELPLT(SEQ ID NO：4)之序列具有至少90%序列一致性；與具有三個包括以下胺基酸序列之互補決定區的重鏈，所述胺基酸序列與包含GYTFTSYWIH(SEQ ID NO：6)、LIDPSDSYTNYNQKFRG(SEQ ID NO：7)以及SDPTGC(SEQ ID NO：8)之序列具有至少90%序列一致性；且其中輕鏈互補域及重鏈互補域保持Mac-1結合能力。

在本發明之另一態樣中，上述抗體個別包括具有三個包括以下胺基酸序列之互補決定區的輕鏈，所述胺基酸序列與包含RSSKSLLHSSGITYLS(SEQ ID NO：2)、 QMSNLAS(SEQ ID NO：3)以及AQNLELPLT(SEQ ID NO：4)之序列具有至少95%序列一致性；與具有三個包括以下胺基酸序列之互補決定區的重鏈，所述胺基酸序列與包含GYTFTSYWIH(SEQ ID NO：6)、LIDPSDSYTNYNQKFRG(SEQ ID NO：7)以及SDPTGC(SEQ ID NO：8)之序列具有至少95%序列一致性；且其中輕鏈互補域及重鏈互補域保持Mac-1結合能力。

在本發明之另一態樣中，上述抗體個別包括具有三個包括以下胺基酸序列之互補決定區的輕鏈，所述胺基酸序列與包含RSSKSLLHSSGITYLS(SEQ ID NO：2)、QMSNLAS(SEQ ID NO：3)以及AQNLELPLT(SEQ ID NO：4)之序列具有至少99%序列一致性；與具有三個包括以下胺基酸序列之互補決定區的重鏈，所述胺基酸序列與包含GYTFTSYWIH(SEQ ID NO：6)、LIDPSDSYTNYNQKFRG(SEQ ID NO：7)以及SDPTGC(SEQ ID NO：8)之序列具有至少99%序列一致性；且其中輕鏈互補域及重鏈互補域保持Mac-1結合能力。

亦提供一種緩解與Mac-1結合於血纖維蛋白或Mac-1與血纖維蛋白原結合相關之病態症狀的方法，所述方法包括將前述之抗體以足以緩解個體之病態症狀的量投與需要此類緩解之個體。在此方法之多個態樣中，個體為人類。在多個態樣中，病態包含多發性硬化症、脊髓損傷、阿茲海默氏病(Alzheimer's Disease)、中風、類風濕性關節炎以及癌症。

亦提供一種醫藥組合物，其包括上述抗體以及醫藥學上可接受之載劑。在另一態樣中，提供一種套組，其包括上述抗體。在另一態樣中，提供一種載體，其包括編碼血纖維蛋白γ^377-395 抗原決定基CKKTTMKIIPFNRLTIG(SEQ ID NO：18)或其生物學上具活性之衍生物的核酸序列。在另一態樣中，提供一種細胞，其包括所述載體。

在本發明之另一態樣中，提供一種產生免疫特異性結合於血纖維蛋白γ^377-395 抗原決定基或其生物學上具活性之衍生物的抗體的方法，所述方法包括：投與個體第一劑量的前述之細胞，其中第一劑量足以在所述個體體內產生免疫反應。在多個態樣中，所述方法可更包括以下步驟：投與所述個體第二劑量的所述細胞，其中所述第二劑量足以在所述個體體內產生免疫反應。在多個態樣中，所產生之抗體在所述個體體內抑制血纖維蛋白/Mac-1結合。

在另一態樣中，提供一種篩選結合Mac-1受體且調節Mac-1受體活性之配位體的方法，所述方法包括：(a)提供前述之抗體；(b)接觸血纖維蛋白γ^377-395 抗原決定基CKKTTMKIIPFNRLTIG(SEQ ID NO：18)或其生物學上具活性之衍生物，且形成抗體/多肽複合物；(c)使抗體/多肽複合物與包括候選化合物之組合物接觸；以及(d)判定候選化合物是否結合單株抗體；藉此，候選化合物的結合指示所述候選化合物為調節Mac-1受體活性之配位體。

藉由參考以下描述、實例以及隨附申請專利範圍，本發明教示內容的此等及其他特徵、態樣以及優點將變得更好理解。

縮寫與定義

除非另有規定，否則與本發明結合使用之科學與技術術語應具有通常為一般熟習此項技術者所理解的含義。另外，除非本文另有需要，否則單數術語應包含複數且複數術語應包含單數。一般而言，與本文所述之細胞與組織培養、分子生物學以及蛋白質與寡核苷酸或聚核苷酸化學以及雜交結合利用的命名法以及其技術為此項技術中熟知且通常使用者。標準技術用於重組DNA、寡核苷酸合成、組織培養以及細胞轉型。酶促反應及純化技術是根據製造商之說明書使用市售套組來進行，或如此項技術中通常所達成或如本文所述來進行。

除非另有指示，否則本發明的實施將採用習知分子生物學技術(包含重組技術)、微生物學技術、細胞生物學技術、生物化學技術以及免疫學技術，所述技術皆在此項技術範圍內。所述技術於文獻中充分說明，諸如分子選殖：實驗室指南(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)，第二版(薩姆布魯克(Sambrook)等人，1989)冷泉港出版社(Cold Spring Harbor Press)；寡核苷酸合成(Oligonucleotide Synthesis)(MJ.蓋特(MJ.Gait)編，1984)；分子生物學方法(Methods in Molecular Biology)，休曼出版社(Humana Press)；細胞生物學：實驗室筆記(Cell Biology：A Laboratory Notebook)(J.E.賽利斯(J.E.Cellis)編，1998)學術出版社(Academic Press)；動物細胞培養(Animal Cell Culture)(R.I.弗雷謝尼(R.I. Freshney)編,1987)；細胞與組織培養導論(Introduction to Cell and Tissue Culture)(J.P. 馬瑟(J.P. Mather)及P.E.羅伯茨(P.E. Roberts),1998)普萊南出版社(Plenum Press)；細胞與組織培養：實驗室程序(Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures)(A.道爾(A. Doyle),J.B.格里菲斯(J.B. Griffiths)以及D.G.紐厄爾(D.G. Newell)編，1993-1998)J.威利父子出版(J. Wiley and Sons)；酶學方法(Methods in Enzymology)(學術出版公司(Academic Press,Inc.))；實驗免疫手冊(Handbook of Experimental Immunology)(D.M.韋爾(D.M. Weir)及CC.布萊克威爾(CC. Blackwell)編)；哺乳動物細胞的基因轉移載體(Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells)(J.M.米勒(J.M. Miller)及M.P.卡洛斯(M.P. Calos)編,1987)；最新分子生物學方案(Current Protocols in Molecular Biology)(F. M.奧蘇貝爾(F. M. Ausubel)等人編，1987)；PCR：聚合酶鏈反應(PCR: The Polymerase Chain Reaction)(穆里斯(Mullis)等人編,1994)；最新免疫學方案(Current Protocols in Immunology)(J.E.科林根(J.E. Coligan)等人編,1991)；精編分子生物學方案(Short Protocols in Molecular Biology)(威利父子出版(Wiley and Sons),1999)；免疫生物學(Immunobiology)(CA.簡威(CA. Janeway)及P.特拉維斯(P. Travers),1997)；抗體(Antibodies)(P.芬奇(P. Finch),1997)；抗體：一種實用方法(Antibodies: apractical approach)(D.凱蒂(D. Catty.)編,IRL出版社(IRL Press),1988-1989)；單株抗體：一種實用方法(Monoclonal antibodies: apractical approach)(P.謝菲爾德(P. Shepherd)及C.迪安(C. Dean)編，牛津大學出版社(Oxford University Press),2000)；使用抗體：實驗室指南(Using antibodies: a laboratory manual)(E.哈洛(E. Harlow)及D.萊恩(D. Lane)(冷泉港實驗室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press),1999)；抗體(The Antibodies)(M.薩內蒂(M. Zanetti)及J.D.卡普拉(J.D. Capra)編，哈伍德學術出版社(Harwood Academic Publishers),1995)；以及癌症：腫瘤學原理與實踐(Cancer: Principles and Practice of Oncology)(V.T.德韋塔(V. T. DeVita)等人編,J.B.利平科蒂公司(J.B. Lippincott Company),1993)。

與本文所述之抗體產生、融合瘤產生、分析化學、合成有機化學以及醫藥化學結合利用的命名法以及其實驗室程序與技術為此項技術中熟知且通常使用者。標準技術用於化學合成、化學分析、醫藥製備、調配與傳遞以及患者治療。

除非另有指示，否則根據本發明所利用之以下術語應理解為具有以下含義：抗體：本文中所用之術語「抗體」是指免疫球蛋白分子以及免疫球蛋白(Ig)分子的免疫學上具活性之部分，亦即，含有免疫結合抗原之抗原結合位點的分子。抗體包含(但不限於)多株抗體、單株抗體、嵌合抗體、dAb(域抗體)、單鏈抗體、F_ab 、F_ab' 以及F_(ab')2 片段、單鏈Fv片段(scFv)以及F_ab 表現文庫。已知基本抗體結構單元包括四聚體。各四聚體由兩對相同的多肽鏈構成，各對具有一條「輕」鏈(約25千道爾頓)與一條「重」鏈(約50-70千道爾頓)。各鏈之胺基端部分包含具有約100至110個或110個以上之胺基酸的主要負責抗原識別的可變區。各鏈之羧基端部分界定主要負責效應功能的恆定區。一般而言，獲自人類的抗體分子涉及以下任一類別：IgG、IgM、IgA、IgE以及IgD，彼此不同之處為分子中存在之重鏈的性質。某些類別亦具有子類，諸如IgG₁ 、IgG₂ 以及其他。此外，在人類中，輕鏈可為κ鏈或λ鏈。

單株抗體：本文中所用之術語「單株抗體」(MAb)或「單株抗體組合物」是指僅含有一種由獨特輕鏈基因產物與獨特重鏈基因產物組成之物質的抗體群體。詳言之，單株抗體之互補決定區(CDR)在群體的所有分子中皆相同。MAb含有能夠免疫結合抗原的特定抗原決定基的抗原結合位點，其特徵為對所述抗原決定基之獨特結合親和力。

抗原結合位點/結合部分：術語「抗原結合位點」或「結合部分」是指抗體分子參與抗原結合的部分。抗原結合位點由重(「H」)鏈及輕(「L」)鏈之N端可變(「V」)區的胺基酸殘基形成。重鏈及輕鏈之V區內的三個高度相異段(稱作「高變區」)插入多個稱為「構架區」或「FR」的保守側接段(conserved flanking stretch)之間。因此，術語「FR」是指天然存在於免疫球蛋白中之高變區之間且與之鄰接的胺基酸序列。在抗體分子中，輕鏈之三個高變區與重鏈之三個高變區相對於彼此安置於三維空間中以形成抗原結合表面。抗原結合表面與結合抗原的三維表面互補，且各重鏈及輕鏈之三個高變區稱作「互補決定區」或「CDR」。根據具有免疫學重要性之蛋白質的卡巴特序列(Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest)(國家衛生研究院(National Institutes of Health),貝塞斯達(Bethesda),馬里蘭州(Md.)(1987及1991))或霍塞納(Chothia)與萊斯克(Lesk),分子生物學雜誌(J. Mol. Biol.)196:901-917(1987)，霍塞納(Chothia)等人，自然(Nature)342:878-883(1989)的定義將胺基酸指派給各域。鑑別CDR的指南可在http://www.bioinf.org.uk/abs/#cdrid得到。

抗原決定基：本文中所用之術語「抗原決定基」包含抗原中能夠特異性結合抗體或T細胞受體的任何蛋白質決定子。抗原決定基決定子通常由化學上具活性的表面分子群(諸如胺基酸或糖側鏈)組成，且通常具有特定三維結構特徵以及特定電荷特徵。舉例而言，可產生針對多肽之N端或C端肽的抗體。當解離常數1微莫耳濃度，較佳100奈莫耳濃度且最佳10奈莫耳濃度時，則認為抗體特異性結合抗原。可如熟習此項技術者所提供來確定γ^377-395 抗原決定基CKKTTMKIIPFNRLTIG(SEQ ID NO:18)的生物學上具活性之衍生物。參見例如亞洛瓦(Ugarova)等人，血纖維蛋白原γ鏈內整合素α_M β₂ 之新穎識別序列的鑑別(Identification of a novel recognition sequence for integrin α_M β₂ within the γ-chain of fibrinogen),生物化學雜誌(J Biol Chem.)1998;273:22519-22527；亞洛瓦(Ugarova)等人，白血球整合素識別血纖維蛋白原(Recognition of fibrinogen by leukocyte integrins),紐約科學院年度期刊(Ann N Y Acad Sci.)2001;936:368-385。

免疫結合：本文中所用之術語「免疫結合」及「免疫結合特性」是指在免疫球蛋白分子與免疫球蛋白特定針對的抗原之間存在的非共價相互作用。免疫結合相互作用之強度或親和力可以相互作用的解離常數(K_d )表示，其中較小K_d 表示較大親和力。所選多肽的免疫結合特性可使用此項技術中熟知之方法來定量。一種此類方法需要量測抗原結合位點/抗原複合物形成與解離的速率，其中彼等速率取決於複合物搭配物之濃度、相互作用之親和力以及同等影響兩個方向之速率的幾何參數。因此，「締合速率常數(on rate constant)」(K_on )與「解離速率常數(off rate constant)」(K_off )均可藉由計算濃度以及實際締合與解離速率來確定(參見自然(Nature)361:186-87(1993))。K_off /K_on 之比率能夠消去與親和力無關的所有參數，且等於解離常數K_d (一般參見戴維斯(Davies)等人(1990)生物化學年鑒(Annual Rev Biochem)59:439-473)。如由諸如放射性配位體結合檢定或熟習此項技術者已知之類似檢定的檢定所量測，當平衡結合常數(K_d )1微莫耳濃度，較佳100奈莫耳濃度，更佳10奈莫耳濃度，且最佳100皮莫耳濃度至約1皮莫耳濃度時，則認為本發明之抗體特異性結合血纖維蛋白原γ^377-395 抗原決定基。

血纖維蛋白與血纖維蛋白原：本文中所用之術語「血纖維蛋白」與「血纖維蛋白原」可互換使用，且是指保持Mac-1結合能力的多肽、片段或類似物。血纖維蛋白原為血纖維蛋白的可溶性前驅體，且兩者均保留γC域且由此保留本發明之抗原決定基。

分離聚核苷酸：本文中所用之術語「分離聚核苷酸」應意謂源於基因組、cDNA或合成來源或其某種組合的聚核苷酸，根據其來源，「分離聚核苷酸」(1)與自然界中發現「分離聚核苷酸」的聚核苷酸之全部或一部分不相關聯，(2)可操作地連接於自然界中不會連接之聚核苷酸，或(3)不會作為較大序列之一部分存在於自然界中。

分離蛋白：本文中提及之術語「分離蛋白」意謂源於cDNA、重組RNA或合成來源或其某種組合的蛋白質，根據其來源或衍生來源，「分離蛋白」(1)與自然界中所見之蛋白質無關聯，(2)不含來自相同來源的其他蛋白質，(3)由來自不同物種之細胞表現，或(4)不會存在於自然界中。

多肽：術語「多肽」在本文中用於指代天然蛋白質、蛋白質片段，以及多肽序列的片段或類似物。天然蛋白質片段與類似物被視為多肽種類的物質。本發明多肽的實例包含SEQ ID NO:1所表示的輕鏈免疫球蛋白分子與SEQ ID NO:5所表示的重鏈免疫球蛋白分子，以及SEQ ID NO:2、3、4、6、7以及8所表示的CDR，由包括重鏈免疫球蛋白分子與輕鏈免疫球蛋白分子(諸如κ輕鏈免疫球蛋白分子)之組合形成的抗體分子(反之亦然)，以及其片段與類似物。

天然存在：本文中應用於標的所用之術語「天然存在」是指標的可於自然界中發現。舉例而言，存在於生物體(包含病毒)中且可自自然界中之來源分離且尚未由人類在實驗室中或以其他方式進行意向性修飾的多肽或聚核苷酸序列為天然存在的。

可操作地連接：本文中所用之術語「可操作地連接」是指所述組分的位置處於允許其以預期方式發揮功能的關係。控制序列「可操作地連接」於編碼序列是以如下方式接合：編碼序列的表現在與控制序列相容之條件下達成。

控制序列：本文中所用之術語「控制序列」是指實現其所接合之編碼序列的表現與加工所必需的聚核苷酸序列。所述控制序列的性質視宿主生物體而有所不同。在原核生物中，所述控制序列一般包含啟動子、核糖體結合位點以及轉錄終止序列。在真核生物中，所述控制序列一般包含啟動子及轉錄終止序列。術語「控制序列」欲至少包含對於表現與加工所必需存在的所有組分，且亦可包含存在起有利作用的其他組分，例如前導序列及融合搭配物序列。

聚核苷酸：本文中所用之術語「聚核苷酸」意謂長度為至少10個鹼基之核苷酸的聚合化合物，所述核苷酸為核糖核苷酸或去氧核糖核苷酸或任一核苷酸類型的經修飾形式。所述術語包含單股及雙股形式之DNA。

寡核苷酸：本文中所用之術語寡核苷酸包含經由天然存在及非天然存在之寡核苷酸鍵而連接在一起的天然存在及經修飾之核苷酸。寡核苷酸為一般包括長度為200個或200個以下之鹼基的聚核苷酸子組。寡核苷酸的長度較佳為10至60個鹼基，且長度最佳為12、13、14、15、16、17、18、19個或20至40個鹼基。寡核苷酸通常為單股，例如用於探針；寡核苷酸亦可為雙股，例如用於構築基因突變體。本發明之寡核苷酸為有義或反義寡核苷酸。

天然存在之核苷酸：本文中所用的術語「天然存在之核苷酸」包含去氧核糖核苷酸及核糖核苷酸。本文中提及的術語「經修飾之核苷酸」包含具有經修飾或經取代之糖基以及其類似物的核苷酸。本文中提及之術語「寡核苷酸鍵」包含諸如硫代磷酸酯基(phosphorothioate)、硒代磷酸酯基(phosphoroselerloate)、苯胺硫代磷酸酯基(phosphoroanilothioate)、苯胺磷酸酯基(phoshoraniladate)以及其類似物之寡核苷酸鍵。參見例如拉普朗契(LaPlanche)等人，核酸研究(Nucl. Acids Res.)14:9081(1986)；斯特克(Stec)等人，美國化學會志(J. Am. Chem. Soc.)106:6077(1984)；斯坦因(Stein)等人，核酸研究(Nucl. Acids Res.)16:3209(1988)；榮(Zon)等人，抗癌藥物設計(Anti Cancer Drug Design)6:539(1991)；榮(Zon)等人，寡核苷酸及類似物：一種實用方法(Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach),第87-108頁(F.埃克斯坦(F. Eckstein)編，牛津大學出版社(Oxford University Press)，英國牛津大學(Oxford England)(1991))；斯特克(Stec)等人，美國專利第5,151,510號；烏爾曼(Uhlmann)及佩曼(Peyman),化學評論(Chemical Reviews)90:543(1990)。必要時，寡核苷酸可包含偵測用標記。

選擇性雜交：本文中所用之術語「選擇性雜交」意謂可偵測地且特異性地結合。本發明之聚核苷酸、寡核苷酸以及其片段在使得以可偵測方式結合於非特異性核酸之可觀量降至最低的雜交與洗滌條件下與核酸股選擇性雜交。高度嚴苛條件可用於達成如此項技術中已知且在本文中論述的選擇性雜交條件。一般而言，本發明之聚核苷酸、寡核苷酸以及片段與相關核酸序列之間的核酸序列同源性將為至少80%，且更為通常的是較佳同源性漸增為至少85%、90%、95%、99%以及100%。若兩個胺基酸序列之間存在部分或完全一致性，則其序列是同源的。舉例而言，85%同源性意謂當比對兩個序列之最大匹配時，85%的胺基酸相同。允許存在間隙(在進行匹配之兩個序列的任一者中)以使匹配達到最大，5個或5個以下的間隙長度較佳，2個或2個以下更佳。或者且較佳地，若使用具有突變數據矩陣及6或6以上之間隙處罰(gap penalty)的程式ALIGN得出兩個蛋白質序列(或源自其的長度為至少30個胺基酸之多肽序列)的比對得分為5以上(標準差單位)，則其是同源的(此術語用於本文中)。參見戴霍夫M. O.(Dayhoff,M. O.),蛋白質序列與結構地圖集(Atlas of Protein Sequence and Structure),第101-110頁(第5卷，國家生物醫學研究基金會(National Biomedical Research Foundation)(1972))，以及此卷的增刊2,第1-10頁。更佳地，若使用ALIGN程式進行最佳比對得出兩個序列或其部分之胺基酸大於或等於50%相同，則此兩個序列或其部分同源。術語「對應於」在本文中用於意謂聚核苷酸序列與參考聚核苷酸序列的全部或一部分同源(亦即，一致，而在進化上並不嚴格相關)，或多肽序列與參考多肽序列一致。相比之下，術語「與……互補」在本文中用於意謂互補序列與參考聚核苷酸序列的全部或一部分同源。為作說明，核苷酸序列「TATAC」對應於參考序列「TATAC」且與參考序列「GTATA」互補。

以下術語用於描述兩個或兩個以上聚核苷酸或胺基酸序列之間的序列關係：「參考序列」、「比較窗口」、「序列一致性」、「序列一致性百分比(%age of sequence identity)」以及「實質一致性」。

參考序列：「參考序列」為用作序列比較之基礎的規定序列，參考序列可為較大序列之子組(subset)，例如作為序列表中提供之全長cDNA或基因序列的區段，或可包括完整cDNA或基因序列。參考序列的長度一般為至少18個核苷酸或6個胺基酸，長度常常為至少24個核苷酸或8個胺基酸，且長度通常為至少48個核苷酸或16個胺基酸。由於兩個聚核苷酸或胺基酸序列可能各自(1)包括兩個分子之間相似的序列(亦即，完整聚核苷酸或胺基酸序列之一部分)，以及(2)可能更包括兩個聚核苷酸或胺基酸序列之間相異的序列，故兩個(或兩個以上)分子之間的序列比較通常藉由在「比較窗口」上比較兩個分子之序列以鑑別並比較局部序列相似性區域來進行。

比較窗口：本文中所用之「比較窗口」是指至少18個相連核苷酸位置或6個胺基酸的概念性區段，其中聚核苷酸序列或胺基酸序列可與具有至少18個相連核苷酸或6個胺基酸之參考序列相比較，且其中比較窗口中聚核苷酸序列部分與參考序列(不包括添加或缺失)相比可包括20%或20%以下的添加、缺失、取代以及其類似情況(亦即間隙)以進行兩個序列的最佳比對。用於比對比較窗口的最佳序列比對可由以下方法進行：史密斯(Smith)及沃特曼(Waterman),應用數學進展(Adv. Appl. Math.),2:482(1981)之局部同源性演算法；尼德爾曼(Needleman)及溫斯切(Wunsch),分子生物學雜誌(J. Mol. Biol.)48:443(1970)之同源性比對演算法；皮爾森(Pearson)及李普曼(Lipman),美國國家科學院學報(Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.))85:2444(1988)之相似性搜尋法；此等演算法的電腦化實施(威斯康星遺傳學(Wisconsin Genetics)套裝軟體7.0版(遺傳電腦組(Genetics Computer Group),575科學(Science),麥迪森博士(Dr.,Madison),威斯康辛州(Wis.))、基因沃克斯(Geneworks)或馬克載體(MacVector)套裝軟體中的GAP、BESTFIT、FASTA以及TFASTA)；或檢查；並選擇由多種方法產生的最佳比對(亦即，在比較窗口上得到最高同源性百分比)。

序列一致性：術語「序列一致性」意謂兩個聚核苷酸或胺基酸序列在比較窗口上一致(亦即，以核苷酸-核苷酸或殘基-殘基為基礎)。術語「序列一致性百分比」由以下步驟計算：在比較窗口上比較兩個最佳比對之序列，確定兩個序列中相同核酸鹼基(例如A、T、C、G、U或I)或殘基出現的位置數以得到匹配位置數，用匹配位置數除以比較窗口中的總位置數(亦即窗口尺寸)，且用結果乘以100得到序列一致性百分比。本文中所用之術語「實質一致性」表示聚核苷酸或胺基酸序列的特徵，其中聚核苷酸或胺基酸包括在具有至少18個核苷酸(6個胺基酸)位置的比較窗口上、常常在具有至少2448個核苷酸(8-16個胺基酸)位置的窗口上，與參考序列相比具有至少85%之序列一致性、較佳至少90%至95%之序列一致性、更為通常至少99%之序列一致性的序列，其中序列一致性百分比是藉由在比較窗口上比較參考序列與可包含總共為參考序列之20%或20%以下之缺失或添加的序列來計算。參考序列可為較大序列之子組。

胺基酸：本文中所用之20個習知胺基酸以及其縮寫遵循習知用法。參見免疫學-合成(Immunology-A Synthesis)(第2版,E.S.葛洛布(E. S. Golub)及D.R.葛瑞恩(D. R. Gren)編，斯納爾聯合出版社(Sinauer Associates)，桑德蘭(Sunderland)，麻省(M ass.)(1991))。20個習知胺基酸之立體異構體(例如D-胺基酸)、非天然胺基酸(諸如α,α-二取代胺基酸)、N-烷基胺基酸、乳酸以及其他非習知胺基酸亦可為本發明多肽的適合組分。非習知胺基酸的實例包含：4-羥基脯胺酸、γ-羧基麩胺酸、ε-N,N,N-三甲基離胺酸、ε-N-乙醯基離胺酸、O-磷酸絲胺酸、N-乙醯基絲胺酸、N-甲醯基甲硫胺酸、3-甲基組胺酸、5-羥基離胺酸、α-N-甲基精胺酸以及其他類似胺基酸與亞胺基酸(例如4-羥基脯胺酸)。在本文中所用之多肽標識中，根據標準用法與慣例，左側方向為胺基端方向且右側方向為羧基端方向。類似地，除非另有規定，否則單股聚核苷酸序列的左側端為5'端，雙股聚核苷酸序列的左側方向稱作5'方向。初生RNA轉錄物的5'至3'添加方向稱作轉錄方向，DNA股上具有與RNA相同之序列且為RNA轉錄物之5'至5'端的序列區稱作「上游序列」，DNA股上具有與RNA相同之序列且為RNA轉錄物之3'至3'端的序列區稱作「下游序列」。

實質一致性：應用於多肽的術語「實質一致性」意謂兩個肽序列，當諸如藉由使用預設間隙權數之程式GAP或BESTFIT進行最佳比對時，共有至少80%之序列一致性、較佳至少90%之序列一致性、更佳至少95%之序列一致性以及最佳至少99%之序列一致性。不一致的殘基位置較佳不同之處為保守胺基酸取代。保守胺基酸取代是指具有類似側鏈的殘基可互換。舉例而言，一組具有脂族側鏈的胺基酸為甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸以及異白胺酸；一組具有脂族羥基側鏈的胺基酸為絲胺酸及蘇胺酸；一組具有含醯胺側鏈的胺基酸為天冬醯胺及麩醯胺酸；一組具有芳族側鏈的胺基酸為苯丙胺酸、酪胺酸以及色胺酸；一組具有鹼性側鏈的胺基酸為離胺酸、精胺酸以及組胺酸；以及一組具有含硫側鏈的胺基酸為半胱胺酸及甲硫胺酸。較佳保守胺基酸取代組為：纈胺酸-白胺酸-異白胺酸、苯丙胺酸-酪胺酸、離胺酸-精胺酸、丙胺酸-纈胺酸、麩胺酸-天冬胺酸以及天冬醯胺-麩醯胺酸。

如本文中所論述，預期本發明涵蓋抗體或免疫球蛋白分子之胺基酸序列的變化，其限制條件為胺基酸序列的變化維持至少75%，更佳至少80%、90%、95%且最佳99%不變。包含其間的某些百分比，諸如75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%以及99%序列一致性。詳言之，涵蓋保守胺基酸置換。保守置換為在胺基酸家族內發生的涉及其側鏈之置換。經遺傳編碼之胺基酸一般分成以下家族：(1)酸性胺基酸為天冬胺酸、麩胺酸；(2)鹼性胺基酸為離胺酸、精胺酸、組胺酸；(3)非極性胺基酸為丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸、色胺酸；以及(4)不帶電極性胺基酸為甘胺酸、天冬醯胺、麩醯胺酸、半胱胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸。親水性胺基酸包含精胺酸、天冬醯胺、天冬胺酸、麩醯胺酸、麩胺酸、組胺酸、離胺酸、絲胺酸以及蘇胺酸。疏水性胺基酸包含丙胺酸、半胱胺酸、異白胺酸、白胺酸、甲硫胺酸、苯丙胺酸、脯胺酸、色胺酸、酪胺酸以及纈胺酸。其他胺基酸家族包含(i)絲胺酸及蘇胺酸，其為脂族羥基家族；(ii)天冬醯胺及麩醯胺酸，其為含醯胺家族；(iii)丙胺酸、纈胺酸、白胺酸以及異白胺酸，其為脂族家族；以及(iv)苯丙胺酸、色胺酸以及酪胺酸，其為芳族家族。舉例而言，可合理預期白胺酸單獨置換為異白胺酸或纈胺酸、天冬胺酸單獨置換為麩胺酸、蘇胺酸單獨置換為絲胺酸、或胺基酸類似置換為結構上相關之胺基酸將對所得分子的結合或特性不會具有重大影響，尤其當置換不涉及構架位點內的胺基酸時。胺基酸變化是否產生功能性肽可藉由檢定多肽衍生物之比活性(specific activity)來容易地判定。檢定於本文中詳細描述。抗體或免疫球蛋白分子之片段或類似物可由一般熟習此項技術者容易地製備。片段或類似物的較佳胺基端及羧基端存在於功能域之邊界附近。結構域及功能域可藉由將核苷酸及/或胺基酸序列資料與公共或專屬序列資料庫相比較來鑑別。較佳使用電腦化比較法鑑別存在於具有已知結構及/或功能之其他蛋白質中的序列基元或預測蛋白質構形域。鑑別摺疊成已知三維結構之蛋白質序列的方法為已知的。鮑威(Bowie)等人，科學(Science)253:164(1991)。因此，前述實例證實，熟習此項技術者可識別可用於界定本發明之結構域及功能域的序列基元及結構構形。

較佳胺基酸取代為如下取代：(1)降低對蛋白質水解的敏感性，(2)降低對氧化的敏感性，(3)改變形成蛋白質複合物的結合親和力，(4)改變結合親和力，以及(4)賦予或改進所述類似物的其他物理化學特性或功能特性。類似物可包含具有除天然存在之肽序列以外之序列的各種突變蛋白(mutein)。舉例而言，可在天然存在之序列(較佳在形成分子間接觸之結構域外部的多肽部分中)進行單個或多個胺基酸取代(較佳為保守胺基酸取代)。保守胺基酸取代不應實質上改變親本序列的結構特徵(例如，胺基酸置換不應傾向於使存在於親本序列中的螺旋斷裂，或破壞表徵親本序列之其他類型二級結構)。技術上公認之多肽二級結構及三級結構的實例描述於蛋白質、結構以及分子原理(Proteins,Structures and Molecular Principles)(克瑞頓(Creighton)編,W.H.弗里曼公司(W.H. Freeman and Company),紐約(New York)(1984))；蛋白質結構導論(Introduction to Protein Structure)(C.布蘭登(C. Branden)及J.圖澤(J. Tooze)編，加蘭德出版社(Garland Publishing),紐約(New York,N.Y.)(1991))；以及索頓(Thornton)等人，自然(Nature) 354:105(1991)中。

多肽片段：本文中所用之術語「多肽片段」是指具有胺基端及/或羧基端缺失，但其餘胺基酸序列與例如自全長cDNA序列推導的天然存在之序列中的相應位置一致的多肽。片段長度通常為至少5、6、8或10個胺基酸，長度較佳為至少14個胺基酸，長度更佳為至少20個胺基酸，長度常常為至少50個胺基酸，且長度甚至更佳為至少70個胺基酸。本文中所用之術語「類似物」是指包括至少5個胺基酸之區段的多肽，所述區段與一部分推導之胺基酸序列具有實質一致性且在適合之結合條件下特異性結合於血纖維蛋白γ^377-395 抗原決定基CKKTTMKIIPFNRLTIG(SEQ ID NO:18)或其生物學上具活性的衍生物。多肽類似物通常包括對天然存在之序列的保守胺基酸取代(或添加或缺失)。類似物長度通常為至少5個胺基酸，長度較佳為至少10個或10個以上胺基酸，且常常可與天然存在之全長多肽一般長。

肽類似物通常在醫藥行業中用作非肽藥物，其特性類似於模板肽。此等類型之非肽化合物稱為「肽模擬物」或「擬肽(peptidomimetics)」。費切爾(Fauchere),藥物研究進展雜誌(J. Adv. Drug Res.),15:29(1986),維布(Veber)及弗雷迪戈爾(Freidinger),TINS,第392頁(1985)；以及埃文斯(Evans)等人，藥物化學雜誌(J. Med. Chem.),30:1229(1987)。常常藉助於電腦化分子建模來開發此類化合物。結構上類似於治療學上適用之肽的肽模擬物可用於產生等效治療或預防作用。一般而言，擬肽結構上類似於範本多肽(亦即具有生物化學特性或藥理活性的多肽)，諸如人類抗體；但其一或多個肽鍵視需要藉由此項技術中熟知的方法，經由以下所構成的族群中選出之鍵置換：-CH₂ NH-、-CH₂ S-、-CH₂ -CH₂ -、-CH=CH-(順式與反式)、-COCH₂ -、CH(OH)CH₂ -以及-CH₂ SO-。共同序列之一或多個胺基酸經相同類型之D-胺基酸的系統性取代(例如D-離胺酸替代L-離胺酸)可用於產生更穩定之肽。另外，包括共同序列或實質上一致之共同序列變化的限制性肽(constrained peptide)可由此項技術中已知的方法產生(瑞佐(Rizo)及吉爾拉什(Gierasch),生物化學年鑒(Ann. Rev. Biochem.),61:387(1992))；例如，藉由添加能夠形成使肽環化之分子內二硫橋鍵的內部半胱胺酸殘基。

藥劑：本文中所用之術語「藥劑」表示化合物、化合物之混合物、生物巨分子，或由生物物質製成的提取物。

標記：本文中所用之術語「標記」或「經標記」是指併入可偵測標記物，例如藉由併入經放射性標記之胺基酸或連接於具有生物素基部分的多肽，所述部分可由經標示的抗生蛋白(例如含有可由光學或量熱方法偵測之螢光標記物或酶活性的抗生蛋白鏈菌素)偵測。在某些情況下，標記或標記物亦可具治療性。對多肽及醣蛋白作標記的多種方法在此項技術中為已知的且可加以使用。多肽之標記的實例包含(但不限於)以下：放射性同位素或放射性核種(例如³ H、¹⁴ C、¹⁵ N、³⁵ S、⁹⁰ Y、⁹⁹ Tc、¹¹¹ In、¹²⁵ I、¹³¹ I)、螢光標記(例如FITC、若丹明(rhodamine)、鑭系元素、磷光體)、酶標記(例如辣根過氧化酶、p-半乳糖苷酶(p-galactosidase)、螢光素酶、鹼性磷酸酶)、化學發光劑、生物素基、由二次報導體識別的預定多肽抗原決定基(例如白胺酸拉鏈對序列、二次抗體之結合位點、金屬結合域、抗原決定基標籤)。在一些實施例中，標記由各種長度的間隔臂連接以減少潛在位阻。

醫藥劑或藥物：本文中所用之術語「醫藥劑」或「藥物」是指當適當投與患者時能夠誘導所要治療作用的化合物或組合物。

本文中之其他化學術語根據此項技術中的習知用法使用，如麥格勞-希爾化學術語辭典(The McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms)(帕克S.(Parker,S.)編，麥格勞-希爾(McGraw-Hill)，舊金山(San Francisco)(1985))所例示。

實質上純：本文中所用之術語「實質上純」意謂標的物質為存在的主要物質(亦即，以莫耳濃度計，其量比組合物中之任何其他個別物質都要高)，且實質上經純化部分較佳為標的物質構成所存在的所有巨分子物質之至少約50%(以莫耳濃度計)的組合物。一般而言，實質上純的組合物將包括組合物中所存在之所有巨分子物質的大於約80%，更佳大於約85%、90%、95%以及99%。標的物質最佳經純化至基本上均質(在組合物中由習知偵測方法不可偵測到污染物質)，其中組合物基本上由單一巨分子物質組成。

患者：本文中所用之術語患者包含人類及獸類個體。

單株抗體

本發明提供抑制血纖維蛋白原-Mac-1結合的單株抗體。詳言之，本發明提供特異性結合血纖維蛋白及血纖維蛋白原γC域之γ^377-395 抗原決定基的單株抗體。本發明亦提供結合血纖維蛋白及血纖維蛋白原γC域之γ^190-202 抗原決定基的抗體。所述抗體阻斷血纖維蛋白在神經系統中的損害作用，而不會影響其在血液凝固方面的有益作用。此等單株抗體可阻斷MS斑塊以及某些癌症形成。本發明之例示性抗體包含例如5B8抗體(靶向γ^377-395 抗原決定基)。另外，本發明之抗體包含例如1E3抗體(靶向γ^190-202 抗原決定基)。本文中提供與5B8抗體相關之各種聚核苷酸及多肽序列，以及所述序列的用途。此等序列包含5B8輕鏈胺基酸序列(SEQ ID NO:1)、三個輕鏈CDR胺基酸序列(CDR-L1，SEQ ID NO:2；CDR-L2，SEQ ID NO:3；以及CDR-L3，SEQ ID NO:4)、重鏈胺基酸序列(SEQ ID NO:5)、三個重鏈CDR胺基酸序列(CDR-H1，SEQ ID NO:6；CDR-H2，SEQ ID NO:7；以及CDR-H3，SEQ ID NO:8)、輕鏈核苷酸序列(SEQ ID NO:9)、重鏈核苷酸序列(SEQ ID NO:10)、三個輕鏈CDR之核苷酸序列(CDR-L1，SEQ ID NO:11；CDR-L2，SEQ ID NO:12；以及CDR-L3，SEQ ID NO:13)，以及三個重鏈CDR之核苷酸序列(CDR-H1，SEQ ID NO:14；CDR-H2，SEQ ID NO:15；以及CDR-H3，SEQ ID NO:16)。

本發明之單株抗體具有以下能力：抑制活體外及活體內吞噬作用，阻斷活體外及活體內細胞激素釋放及巨噬細胞活化、活體外及活體內微神經膠質細胞活化、活體外及活體內發炎性脫髓鞘以及實驗性自體免疫腦脊髓炎(EAE，一種多發性硬化症動物模型)的臨床症狀。參見例如PCT公開案WO 2007/038407，其全部併入本案供參考。熟習此項技術者亦應瞭解，本發明之單株抗體亦可影響癌症。參見例如PCT公開案WO 2007/024817，其全部併入本案供參考。另外，所述單株抗體可用於治療涉及血纖維蛋白原自受損組織滲漏的疾病，包含類風濕性關節炎、脊髓損傷、阿茲海默氏病以及中風。參見例如弗里克(Flick)等人，臨床研究雜誌(J. Clin. Investigation),2007,117,11:3224-3235；阿克索洛(Akassoglou)等人,2002,神經元(Neuron),33:861-875；阿克索洛(Akassoglou)等人,2004,美國國家科學院學報(Proc. Natl. Acad. Sci. USA),101:6698-6703；亞當斯(Adams)等人,2007,實驗醫學雜誌(J. Exp. Med.),35:2428-34。應注意，本發明之單株抗體降低血纖維蛋白原在個體之腦中以及其他地方的促炎性作用，同時保持血纖維蛋白原在血液凝結方面的有益作用，此與影響血液凝結之化合物不同。

本發明亦包含如本文所述抗體一般結合相同抗原決定基的抗體。熟習此項技術者應瞭解，有可能在不進行過度實驗下判定單株抗體是否具有與本發明之單株抗體相同的特異性，此由以下方式達成：確認前者是否阻止後者結合於血纖維蛋白γC域的γ^377-395 抗原決定基或γ^190-202 抗原決定基。若所測試之單株抗體與本發明之單株抗體競爭，如由本發明之單株抗體的結合下降所示，則可能兩種單株抗體結合於相同或密切相關的抗原決定基。可藉由量測阻斷微神經膠質細胞經由Mac-1受體黏著於全長血纖維蛋白原多肽上的能力來篩選本發明之單株抗體。此類篩選的實例於本文中提供。

此項技術中已知的多種程序可用於產生針對血纖維蛋白原-Mac-1結合，或針對其衍生物、片段、類似物、同源物或直系同源物的多株抗體或單株抗體(參見例如抗體：實驗室指南(Antibodies: A Laboratory Manual),同上)。

抗體由熟知技術純化，諸如使用蛋白質A或蛋白質G進行親和層析，其主要提供免疫血清的IgG溶離份(fraction)。隨後或替代地，可將作為探尋之免疫球蛋白之標靶的特異性抗原或其抗原決定基固定於管柱上以藉由免疫親和層析來純化免疫特異性抗體。

本發明之抗體(例如5B8及1E3)為單株抗體。抑制血纖維蛋白原/Mac-1結合的單株抗體例如由獲自已用肽抗原免疫之動物的純系產生。藉由使免疫動物之B細胞與骨髓瘤細胞融合來產生細胞株。在活體外自培養基中純化抗體，或自小鼠腹水中產生抗體。產生抗體的方法亦於下文實例部分中提供。

單株抗體例如使用融合瘤方法製備，諸如柯勒(Kohler)及米爾斯坦(Milstein),自然(Nature),256:495(1975)所述之方法。在融合瘤方法中，通常用免疫劑使小鼠、倉鼠或其他適當宿主動物免疫以誘發(elicit)淋巴細胞，其產生或能夠產生將特異性結合於免疫劑的抗體。或者，可在活體外使淋巴細胞免疫。

免疫劑通常將包含蛋白質抗原、其片段或其融合蛋白。一般而言，若需要源於人類的細胞，則使用周邊血液淋巴細胞；或若需要非人類哺乳動物來源，則使用脾細胞或淋巴結細胞。接著使用適合之融合劑(諸如聚乙二醇(polyethylene glycol))使淋巴細胞與永生化細胞株融合，以形成融合瘤細胞(古汀(Goding),單株抗體：原理與實踐(Monoclonal Antibodies: Principles and Practice),學術出版社(Academic Press),(1986)第59-103頁)。永生化細胞株通常為經轉型之哺乳動物細胞，尤其為源於齧齒動物、牛以及人類的骨髓瘤細胞。通常採用大鼠或小鼠骨髓瘤細胞株。可在適合之培養基中培養融合瘤細胞，所述培養基較佳含有一或多種抑制未融合、永生化細胞生長或存活的物質。舉例而言，若親本細胞缺乏次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶(HGPRT或HPRT)，則融合瘤的培養基通常將包含次黃嘌呤、胺基蝶呤以及胸苷(「HAT培養基」)，此等物質阻止HGPRT缺乏型細胞生長。

較佳的永生化細胞株為有效融合，支持所選抗體產生細胞穩定地高度表現抗體，且對培養基(諸如HAT培養基)敏感的細胞株。更佳的永生化細胞株為鼠類骨髓瘤株，其可例如自薩克研究所細胞分佈中心(Salk Institute Cell Distribution Center)，聖地牙哥(San Diego),加利福尼亞州(Calif.)以及美國菌種保存中心(American Type Culture Collection),馬納薩斯(Manassas),維吉尼亞州(Va)獲得。亦已描述人類骨髓瘤以及小鼠-人類雜合骨髓瘤細胞株用於產生單株抗體(參見科伯爾(Kozbor),免疫學雜誌(J. Immunol.),133:3001(1984)；布羅德(Brodeur)等人，單株抗體產生技術與應用(Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications),馬塞爾-德克爾公司(Marcel Dekker,Inc.),紐約(New York),(1987)第51-63頁)。

接著可檢定培養融合瘤細胞的培養基中針對抗原之單株抗體的存在。融合瘤細胞所產生之單株抗體的結合特異性較佳由免疫沈澱或由活體外結合檢定來測定，諸如放射性免疫檢定(RIA)或酶聯結免疫吸附劑檢定(ELISA)。所述技術與檢定在此項技術中為已知的。單株抗體的結合親和力可例如由莫森(Munson)及波拉德(Pollard),分析生物化學(Anal. Biochem.),107:220(1980)；派特羅諾C.(Patrono,C.)及佩斯卡爾B.A.(Peskar,B.A.)(編)基礎與臨床藥理學中的放射性免疫檢定(Radioimmunoassay in Basic and Clinical Pharmacology.),海德爾堡(Heidelberg),施普林格(Springer-Verlag),1987；德溫格(Dwenger),放射性免疫檢定：綜述(A. Radioimmunoassay: An Overview.),臨床生物化學雜誌(J Clin Biochem) 22:883,1984之斯卡查德分析(Scatchard analysis)來測定。此外，在單株抗體的治療應用中，重要的是鑑別對標靶抗原具有高度特異性以及高結合親和力的抗體。

鑑別所要融合瘤細胞之後，可由限制性稀釋程序對純系進行次選殖且由標準方法使之生長(參見古汀(Goding),單株抗體：原理與實踐(Monoclonal Antibodies: Principles and Practice),學術出版社(Academic Press),(1986)第59-103頁)。適於達成此目的之培養基包含例如達爾伯克改良伊格爾培養基(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)以及RPMI-1640培養基。或者，可使融合瘤細胞於哺乳動物活體內(如腹水中)生長。

可由習知免疫球蛋白純化程序，諸如蛋白質A-瓊脂糖、羥磷灰石層析、凝膠電泳、透析或親和層析，自培養基或腹水液中分離或純化由次純系分泌的單株抗體。

亦可由重組DNA方法(諸如美國專利第4,816,567號中所述之方法)製備單株抗體。可使用習知程序(例如藉由使用能夠特異性結合於編碼鼠類抗體重鏈及輕鏈之基因的寡核苷酸探針)來容易地分離編碼本發明單株抗體之DNA且對其定序。舉例而言，SEQ ID NO:9及10提供本發明之5B8單株抗體的核苷酸序列。本發明之融合瘤細胞充當所述DNA的較佳來源。一旦分離，即可將DNA置於表現載體中，接著將所述表現載體轉染至不會以其他方式產生免疫球蛋白的宿主細胞(諸如猿COS細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或骨髓瘤細胞)中，以在重組宿主細胞中合成單株抗體。亦可例如藉由用人類重鏈及輕鏈恆定域的編碼序列替代同源鼠類序列(參見美國專利第4,816,567號；莫里森(Morrison),自然(Nature)368,812-13(1994))或藉由共價連接於免疫球蛋白編碼序列或非免疫球蛋白多肽之一部分編碼序列來對DNA進行修飾。此類非免疫球蛋白多肽可取代本發明抗體之恆定域，或可取代本發明抗體之一個抗原組合位點的可變域以產生嵌合二價抗體。

完全人類抗體為輕鏈與重鏈(包含CDR)之整個序列均由人類基因產生的抗體分子。所述抗體在本文中稱為「人類抗體」或「完全人類抗體」。單株抗體可藉由使用以下技術來製備：三源雜交瘤技術(trioma technique)；人類B細胞融合瘤技術(參見科伯爾(Kozbor)等人,1983,今日免疫學(Immunol Today) 4:72)；以及EBV融合瘤技術(參見科爾(Cole)等人,1985,單株抗體與癌症療法(Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy),艾倫R.李斯公司(Alan R. Liss,Inc.),第77-96頁)，以產生單株抗體。可利用單株抗體，且可藉由使用人類融合瘤(參見科特(Cote)等人,1983,美國國家科學院學報(Proc Natl Acad Sci USA) 80: 2026-2030)或藉由在活體外用艾伯斯坦-巴爾病毒(Epstein Barr Virus)轉型人類B細胞(參見科爾(Cole)等人,1985,單株抗體與癌症療法(Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy),艾倫R.李斯公司(Alan R. Liss,Inc.),第77-96頁)來產生。

另外，亦可使用其他技術(包含噬菌體呈現文庫)來產生人類抗體(參見霍根布姆(Hoogenboom)及文特爾(Winter),分子生物學雜誌(J. Mol. Biol.),227:381(1991)；馬克斯(Marks)等人，分子生物學雜誌(J. Mol. Biol.),222:581(1991))。類似地，可藉由將人類免疫球蛋白基因座引入轉殖基因動物(例如小鼠)中來製備人類抗體，在所述動物中內源性免疫球蛋白基因已部分或完全失活。攻毒後，觀測到人類抗體產生，其在所有方面皆與人類中所見之情況密切類似，包含基因重排、組裝以及抗體庫(antibody repertoire)。此方法描述於例如以下文獻中：美國專利第5,545,807號、第5,545,806號、第5,569,825號、第5,625,126號、第5,633,425號、第5,661,016號；以及馬克斯(Marks)等人，生物/技術(Bio/Technology)10,779-783(1992)；朗伯格(Lonberg)等人，自然(Nature)368 856-859(1994)；莫里森(Morrison),自然(Nature)368,812-13(1994)；費什韋爾德(Fishwild)等人，自然生物技術(Nature Biotechnology) 14,845-51(1996)；紐伯格(Neuberger),自然生物技術(Nature Biotechnology) 14,826(1996)；以及朗伯格(Lonberg)與休斯紮爾(Huszar),國際免疫學評論(Intern. Rev. Immunol.) 1365-93(1995)。

另外，可使用轉殖基因非人類動物產生人類抗體，所述動物經修飾以對抗原攻毒作出反應而產生完全人類抗體，而非動物內源性抗體。在所述動物中，已使非人類宿主中編碼免疫球蛋白重鏈及輕鏈的內源性基因失能，且將編碼人類重鏈及輕鏈免疫球蛋白的活性基因座插入宿主之基因組中。舉例而言，SEQ ID NO:11至16提供編碼單株抗體5B8之三個輕鏈CDR以及三個重鏈CDR的核苷酸序列。舉例而言，使用含有必需人類DNA區段的酵母人工染色體來併入人類基因。接著藉由對含有少於完整補體之修飾的中間轉殖基因動物進行雜交育種來獲得提供所有所要修飾之動物作為後代。此類非人類動物的一個實例為稱作之小鼠，由安進(Amgen)(橡木城(Thousand Oaks)，加利福尼亞州(CA))提供。此動物產生分泌完全人類免疫球蛋白的B細胞。可直接自經相關免疫原免疫後的動物獲得抗體，作為例如多株抗體製劑；或者，自來源於動物之永生化B細胞(諸如產生單株抗體的融合瘤)獲得抗體。另外，可回收編碼具有人類可變區之免疫球蛋白的基因且使之表現以直接獲得抗體，或可對所述抗體進行進一步修飾以獲得抗體類似物，諸如單鏈Fv(scFv)分子。

產生缺乏內源性免疫球蛋白重鏈之表現的非人類宿主(例如小鼠)之方法的一個實例揭露於美國專利第5,939,598號中。所述非人類宿主可由如下方法獲得，其包含使J區段基因自胚胎幹細胞中之至少一個內源性重鏈基因座缺失以阻止基因座重排且阻止重排之免疫球蛋白重鏈基因座的轉錄物形成，所述缺失是藉由靶向含有編碼可選擇標記物之基因的載體而實現；且自胚胎幹細胞長成體細胞及生殖細胞含有編碼可選擇標記物之基因的轉殖基因小鼠。

一種產生相關抗體(諸如人類抗體)的方法揭露於美國專利第5,916,771號中。此方法包含將含有編碼重鏈之核苷酸序列(例如SEQ ID NO: 10)的表現載體引入培養中之一個哺乳動物宿主細胞中，將含有編碼輕鏈之核苷酸序列(例如SEQ ID NO: 9)的表現載體引入另一個哺乳動物宿主細胞中，且使兩個細胞融合以形成雜交細胞。雜交細胞表現含有重鏈及輕鏈之抗體。

可由含有編碼上述單鏈抗體之DNA區段的載體來表現抗體。

此等載體可包含載體、脂質體、裸DNA、佐劑輔助型DNA、基因槍以及導管。較佳載體包含病毒載體、融合蛋白以及化學結合物。反轉錄病毒載體包含莫洛尼鼠類白血病病毒(moloney murine leukemia virus)。DNA病毒載體較佳。此等載體包含痘載體，諸如正痘(orthopox)或鳥痘(avipox)載體；疱疹病毒載體，諸如I型單純疱疹病毒(HSV)載體(參見金勒A. I.(Geller,A. I.)等人，神經化學雜誌(J. Neurochem),64:487(1995)；萊姆F.(Lim,F.)等人,DNA選殖：哺乳動物系統(DNA Cloning: Mammalian Systems),D.格洛夫(D. Glover)編(牛津大學出版社(Oxford Univ. Press),英國牛津大學(Oxford England))(1995)；金勒A. I.(Geller,A. I.)等人，美國國家科學院學報(Proc Natl. Acad. Sci.): U.S.A. 90:7603(1993)；金勒A. I.(Geller,A.I.)等人，美國國家科學院學報(Proc Natl. Acad. Sci USA) 87:1149(1990))；腺病毒載體(參見雷格爾-拉賽勒(LeGal LaSalle)等人，科學(Science),259:988(1993)；戴維森(Davidson)等人，自然遺傳學(Nat. Genet) 3:219(1993)；楊(Yang)等人，病毒學雜誌(J. Virol.) 69:2004(1995))；以及腺相關病毒載體(參見卡普立特M. G.(Kaplitt,M. G.)等人，自然遺傳學(Nat. Genet.) 8:148(1994))。

痘病毒載體將基因引入細胞的細胞質中。鳥痘病毒載體僅使核酸短期表現。較佳使用腺病毒載體、腺相關病毒載體以及單純疱疹病毒(HSV)載體將核酸引入神經細胞中。腺病毒載體產生之表現期(約2個月)短於腺相關病毒載體(約4個月)，而腺相關病毒載體又短於HSV載體。所選特定載體將取決於標靶細胞以及所治療的病狀。引入可由標準技術達成，例如感染、轉染、轉導或轉型。基因轉移模式的實例包含例如裸DNA、CaPO₄ 沈澱、DEAE聚葡萄糖、電穿孔、原生質體融合、脂質體轉染(lipofection)、細胞顯微注射以及病毒載體。

載體可用於靶向基本上任何所要標靶細胞。舉例而言，立體定位注射(stereotaxic injection)可用於將載體(例如腺病毒、HSV)引導至所要位置。另外，可藉由使用微量泵輸注系統，諸如新科麥德(SynchroMed)輸注系統(美敦力(Medtronic),明尼阿波利斯(Minneapolis),明尼蘇達(MN))進行腦室內(icv)輸注來傳遞粒子。可使用的其他方法包含導管，靜脈內、非經腸、腹膜內以及皮下注射，以及口服或其他已知投藥途徑。

此等載體可用於表現大量可以多種方式使用的抗體。舉例而言，抗體可用於偵測血纖維蛋白原以及血纖維蛋白原/Mac-1結合的存在。

技術可用以產生對本發明之抗原性蛋白具特異性的單鏈抗體(參見例如美國專利第4,946,778號)。另外，方法可用以構築F_ab 表現文庫(參見例如休斯(Huse)等人,1989科學(Science) 246: 1275-1281)以允許快速並有效地鑑別對蛋白質或其衍生物、片段、類似物或同源物具有所要特異性的單株F_ab 片段。含有針對蛋白質抗原之個體基因型的抗體片段可由此項技術中已知的技術產生，所述技術包含(但不限於)：(i)藉由對抗體分子進行胃蛋白酶消化而產生的F_(ab')2 片段；(ii)藉由還原F_(ab')2 片段之二硫橋鍵而產生的F_ab 片段；(iii)藉由用木瓜蛋白酶及還原劑處理抗體分子而產生的F_ab 片段；以及(iv)F_v 片段。本發明亦包含F_v 、F_ab 、F_ab '以及F_(ab')2 抗血纖維蛋白γ^190-202 與γ^377-395 片段，單鏈抗γ^190-202 與γ^377-395 血纖維蛋白抗體，雙特異性抗γ^190-202 與γ^377-395 血纖維蛋白抗體，以及異結合物(heteroconjugate)抗γ^190-202 與γ^377-395 血纖維蛋白抗體。

雙特異性抗體為對至少兩種不同抗原具有結合特異性的抗體。在本發明狀況下，結合特異性之一是針對γ^190-202 與γ^377-395 血纖維蛋白抗原決定基。第二結合標靶為任何其他抗原，且宜為細胞表面蛋白或受體或受體次單位。

製備雙特異性抗體之方法在此項技術中為已知的。傳統上，重組產生雙特異性抗體是基於兩對免疫球蛋白重鏈/輕鏈的共同表現，其中兩條重鏈具有不同特異性(米爾斯坦(Milstein)及奎洛(Cuello),自然(Nature),305:537-539(1983))。由於免疫球蛋白重鏈及輕鏈的隨機分配，此等融合瘤(四源雜交瘤(quadroma))產生十種不同抗體分子之潛在混合物，其中僅一種具有正確的雙特異性結構。正確分子的純化通常由親和層析步驟完成。

具有所要結合特異性(抗體-抗原組合位點)之抗體可變域可與免疫球蛋白恆定域序列融合。融合較佳是與包括至少一部分鉸鏈區、CH2區以及CH3區的免疫球蛋白重鏈恆定域發生。較佳具有含有至少一種融合體中存在之輕鏈結合所必需之位點的第一重鏈恆定區(CH1)。將編碼免疫球蛋白重鏈融合體且必要時編碼免疫球蛋白輕鏈的DNA插入獨立表現載體中，且共同轉染至適合之宿主生物體中。關於產生雙特異性抗體之更多細節，參見例如蘇拉斯(Suresh)等人，酶學方法(Methods in Enzymology),121:210(1986)。

可將雙特異性抗體製備成全長抗體或抗體片段(例如F_(ab')2 雙特異性抗體)。自抗體片段產生雙特異性抗體之技術已描述於文獻中。舉例而言，可使用化學鍵聯製備雙特異性抗體。布雷南(Brennan)等人，科學(Science)229:81(1985)描述一種使完整抗體經蛋白質裂解以產生F_(ab')2 片段的程序。在二硫醇錯合劑砷化鈉(sodium arsenide)存在下還原此等片段以穩定鄰二硫醇且阻止分子間二硫鍵形成。接著使所產生之F_ab' 片段轉化成硫代硝基苯甲酸酯(thionitrobenzoate，TNB)衍生物。接著藉由用巰基乙胺(mercaptoethylamine)還原F_ab' -TNB衍生物之一而使之再轉化成F_ab' -硫醇，且將其與等莫耳量的另一F_ab' -TNB衍生物混合以形成雙特異性抗體。所產生之雙特異性抗體可用作選擇性固定酶的試劑。

另外，可自大腸桿菌(E. coli )中直接回收F_ab' 片段且進行化學偶合以形成雙特異性抗體。沙拉比(Shalaby)等人，實驗醫學雜誌(J. Exp. Med.)175:217-225(1992)描述完全人類化雙特異性抗體F_(ab')2 分子的產生。

亦已描述直接自重組細胞培養物製備並分離雙特異性抗體片段的多種技術。舉例而言，已使用白胺酸拉鏈產生雙特異性抗體。庫斯特賴(Kostelny)等人，免疫學雜誌(J. Immunol.)148(5):1547-1553(1992)。此方法亦可用於產生抗體均二聚體。霍靈格(Hollinger)等人，美國國家科學院學報(Proc. Natl. Acad. Sci. USA)90:6444-6448(1993)所述之「微型雙功能抗體(diabody)」技術已提供一種製備雙特異性抗體片段的替代機制。片段包括經由連接子連接於輕鏈可變域(V_L )的重鏈可變域(V_H )，所述連接子過短而無法允許在同一鏈上之兩個域之間配對。因此，迫使一個片段之V_H 及V_L 域與另一片段之互補V_L 及V_H 域配對，藉此形成兩個抗原結合位點。亦已報導藉由使用單鏈Fv(sFv)二聚體製備雙特異性抗體片段的另一策略。參見格魯貝爾(Gruber)等人，免疫學雜誌(J. Immunol.)152:5368(1994)。

涵蓋具有兩個價數以上之抗體。舉例而言，可製備三特異性抗體。圖特(Tutt)等人，免疫學雜誌(J. Immunol.)147:60(1991)。

本發明亦關於包括結合於細胞毒性劑(諸如毒素(例如靶向癌細胞之化學治療劑；源於細菌、真菌、植物或動物的酶活性毒素，或其片段))或放射性同位素(亦即放射性結合物)之抗體的免疫結合物。化學治療劑的實例包含烷基化劑、亞硝基脲、抗代謝物、蒽環黴素(Anthracycline)及相關藥物、拓撲異構酶抑制劑、有絲分裂抑制劑、皮質類固醇激素以及其他化學治療藥物。

可使用的酶活性毒素以及其片段包含白喉毒素A鏈(diphtheria A chain)、白喉毒素之非結合活性片段、外毒素A鏈(exotoxin A chain)(來自綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa))、篦麻毒素A鏈(ricin A chain)、相思豆毒素A鏈(abrin A chain)、莫迪素A鏈(modeccin A chain)、α-帚麴菌素(alpha-sarcin)、油桐蛋白(Aleurites fordii protein)、康乃馨蛋白(dianthin protein)、美洲商陸蛋白(Phytolaca americana protein)(PAPI、PAPII以及PAP-S)、苦瓜抑制劑(momordica charantia inhibitor)、麻瘋樹毒蛋白(curcin)、巴豆毒素(crotin)、石鹼草抑制劑(sapaonaria officials inhibitor)、白樹素(gelonin)、有絲分裂素(mitogellin)、限制性毒素(restriction)、酚黴素(phenomycin)、伊諾黴素(enomycin)以及黴菌毒素(tricothecene)。多種放射性核種可用於產生放射性結合之抗體。實例包含²¹² Bi、¹³¹ I、¹³¹ In、⁹⁰ Y以及¹⁸⁶ Re。

抗體與細胞毒性劑的結合物是使用以下多種雙功能蛋白質偶合劑來製備：諸如N-丁二醯亞胺基-3-(2-吡啶基二硫醇)丙酸酯(N-succinimidyl-3-(2-pyridyldithiol)propionate，SPDP)、亞胺基硫雜環戊烷(iminothiolane，IT)、醯亞胺酯(imidoester)的雙功能衍生物(諸如二亞胺代己二酸二甲酯鹽酸鹽(dimethyl adipimidate HCL))、活性酯(active ester)(諸如辛二酸二丁二醯亞胺酯(disuccinimidyl suberate))、醛(aldehyde)(諸如戊二醛(glutareldehyde))、雙疊氮基(bis-azido)化合物(諸如雙(對疊氮基苯甲醯基)己二胺(bis(p-azidobenzoyl)hexanediamine))、雙-重氮鹽(bis-diazonium)衍生物(諸如雙(對重氮基苯甲醯基)-乙二胺(bis-(p-diazoniumbenzoyl)-ethylenediamine))、二異氰酸酯(diisocyanate)(諸如甲苯2,6-二異氰酸酯(tolyene 2,6-diisocyanate)))，以及雙活性氟(bis-active fluorine)化合物(諸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯(1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzene))。舉例而言，可如維特塔(Vitetta)等人，科學(Science)238: 1098(1987)中所述來製備免疫毒素篦麻毒素。碳-14標記之1-異硫氰氧基苯甲基-3-甲基二伸乙三胺五乙酸(1-isothiocyanatobenzyl-3-methyldiethylene triaminepentaacetic acid，MX-DTPA)為使放射性核苷酸結合於抗體的例示性螯合劑。

一般熟習此項技術者應瞭解，多種可能部分可偶合於本發明之所得抗體(參見例如「結合疫苗(Conjugate Vaccines)」,微生物學與免疫學文稿(Contributions to Microbiology and Immunology),J. M.克魯索(J. M. Cruse及R. E.小路易斯(R. E. Lewis,Jr)(編),卡基爾出版社(Carger Press),紐約(New York),(1989)，其全部併入本案供參考)。

偶合可藉由結合兩個分子的任何化學反應來實現，只要抗體及另一部分保持其個別活性即可。此鍵聯可包含許多化學機制，例如共價結合、親和力結合、嵌入、配位結合以及複合。然而，較佳結合為共價結合。共價結合可藉由現有側鏈直接縮合或藉由併入外部橋聯分子來達成。許多二價或多價鍵聯劑適用於使蛋白質分子(諸如本發明之抗體)偶合於其他分子。舉例而言，代表性偶合劑可包含有機化合物，諸如硫酯(thioester)、碳化二亞胺(carbodiimide)、丁二醯亞胺酯(succinimide ester)、二異氰酸酯、戊二醛、重氮苯(diazobenzene)以及己二胺(hexamethylene diamine)。此清單不欲為此項技術中已知之偶合劑的各種詳盡類別，而是例示較常用之偶合劑(參見基倫(Killen)及林斯特羅姆(Lindstrom),免疫學雜誌(Jour. Immun.)133:1335-2549(1984)；詹森(Jansen)等人，免疫學評論(Immunological Reviews)62:185-216(1982)；以及維特塔(Vitetta)等人，科學(Science)238:1098(1987))。

鍵聯劑描述於文獻中(參見例如拉馬克里希南S.(Ramakrishnan,S.)等人，癌症研究(Cancer Res.)44:201-208(1984)，其描述使用M-順丁烯二醯亞胺基苯甲醯基-N-羥基丁二醯亞胺酯(M-maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester，MBS))。亦參見美國專利第5,030,719號，其描述使用經由寡肽鍵聯劑偶合於抗體之鹵化乙醯肼(halogenated acetyl hydrazide)衍生物。例示性鍵聯劑包含：(i)1-乙基-3-(3-二甲基胺基-丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽(1-ethyl-3-(3-dimethylamino-propyl) carbodiimide hydrochloride，EDC)；(ii)4-丁二醯亞胺氧基羰基-α-甲基-α-(2-吡啶基-二硫)-甲苯(4-succinimidyloxycarbonyl-alpha-methyl-alpha-(2-pridyl-di thio)-toluene，SMPT)(皮爾斯化學公司(Pierce Chem. Co.)，目錄號21558G)；(iii)6-[3-(2-吡啶基二硫)丙醯胺基]己酸丁二醯亞胺酯(succinimidyl-6[3-(2-pyridyldithio)propionamido]hexanoate，SPDP)(皮爾斯化學公司(Pierce Chem. Co.)，目錄號21651G)；(iv)6-[3-(2-吡啶基二硫)-丙醯胺]己酸磺酸基丁二醯亞胺酯(sulfosuccinimidyl 6[3-(2-pyridyldithio)-propianamide]hexanoate，Sulfo-LC-SPDP)(皮爾斯化學公司(Pierce Chem. Co.)，目錄號2165-G)；以及(v)結合於EDC之N-羥基磺酸基-丁二醯亞胺(N-hydroxysulfo-succinimide，sulfo-NHS)(皮爾斯化學公司(Pierce Chem. Co.)，目錄號24510)。

上述鍵聯劑含有具有不同屬性之組分，由此得到具有不同物理化學特性的結合物。舉例而言，羧酸烷酯(alkyl carboxylate)之sulfo-NHS酯比芳族羧酸酯(aromatic carboxylate)之sulfo-NHS酯穩定。含NHS酯之鍵聯劑比sulfo-NHS酯的溶解度小。另外，鍵聯劑SMPT含有位阻二硫鍵，且可形成穩定性較高之結合物。二硫鍵一般比其他鍵的穩定性差，因為二硫鍵在活體外裂解，使得較少結合物可用。詳言之，Sulfo-NHS可增強碳化二亞胺偶合的穩定性。碳化二亞胺偶合(諸如EDC)當在與sulfo-NHS結合中使用時，形成與單獨碳化二亞胺偶合反應相比抗水解性較高的酯。

亦可將本文所揭露之抗體調配成免疫脂質體。含抗體之脂質體是由此項技術中已知的方法製備，諸如愛波斯坦(Epstein)等人，美國國家科學院學報(Proc. Natl. Acad. Sci. USA),82: 3688(1985)；黃(Hwang)等人，美國國家科學院學報(Proc. Natl. Acad. Sci. USA),77: 4030(1980)；以及美國專利第4,485,045號及第4,544,545號中所述。循環時間增長之脂質體揭露於美國專利第5,013,556號中。

尤其適用之脂質體可藉由使用脂質組合物之逆相蒸發法來產生，所述脂質組合物包括磷脂醯膽鹼(phosphatidylcholine)、膽固醇以及PEG衍生處理之磷脂醯乙醇胺(PEG-derivatized phosphatidylethanolamine，PEG-PE)。經由具有規定孔徑之過濾器濾出脂質體以得到具有所要直徑的脂質體。可經由二硫鍵互換反應使本發明抗體之F_ab' 片段結合於脂質體，如馬丁(Martin)等人，生物化學雜誌(J. Biol. Chem.),257: 286-288(1982)中所述。

針對血纖維蛋白抗原決定基γ ^190-202 與γ ^377-395 之抗體的用途

包含本發明單株抗體的本發明治療性調配物用於治療或緩解與血纖維蛋白相關病症(例如多發性硬化症、創傷癒合、肺缺血、脊髓損傷、阿茲海默氏病、中風、類風濕性關節炎以及癌症)有關之症狀，較佳不會影響血液凝固。本發明亦提供治療或緩解與血纖維蛋白相關病症(例如多發性硬化症、創傷癒合、肺缺血、脊髓損傷、阿茲海默氏病、中風、類風濕性關節炎以及癌症)有關之症狀，較佳不會影響血液凝固。治療方案是藉由使用標準方法鑑別罹患(或有可能顯現)血纖維蛋白相關病症(例如多發性硬化症、創傷癒合、肺缺血、脊髓損傷、阿茲海默氏病、中風、類風濕性關節炎以及癌症)的個體(例如人類患者)來進行。與此等血纖維蛋白相關病症有關的症狀包含例如炎症、疼痛以及感官知覺喪失。治療有效性是與用於診斷或治療特定血纖維蛋白相關病症之任何已知方法聯合確定。血纖維蛋白相關病症之一或多種症狀的緩解指示抗體賦予臨床效益。將抗體製劑、較佳對其標靶抗原具有高特異性及高親和力的抗體製劑投與個體，且一般因其與標靶結合而將具有作用。投與抗體可消除或抑制或干擾標靶(例如γ^190-202 與γ^377-395 血纖維蛋白抗原決定基)的信號傳導功能。投與抗體可消除或抑制或干擾標靶(例如血纖維蛋白)與其天然結合之內源性配位體(例如Mac-1)的結合。舉例而言，抗體結合於標靶且抑制血纖維蛋白/Mac-1結合。

應瞭解，本發明之治療性實體的投藥將與適合之載劑、賦形劑以及其他試劑一起投與，所述載劑、賦形劑以及其他試劑併入調配物中以提供改良之轉移、傳遞、耐受性以及其類似性質。眾多適當調配物可見於藥典雷氏藥學大全(Remington's Pharmaceutical Sciences)(第19版，馬克出版公司(Mack Publishing Company),伊斯頓(Easton),賓夕法尼亞州(Pa.)(1995))中，尤其其中布勞格(Blaug),森莫(Seymour)之第87章。此等調配物包含例如粉末、糊劑、軟膏、膠凍、蠟、油、脂質、含脂質(陽離子或陰離子)之囊泡(諸如Lipofectin^TM )、DNA結合物、無水吸收糊劑、水包油及油包水乳液、乳液卡波蠟(carbowax)(具有多種分子量的聚乙二醇)、半固體凝膠，以及含卡波蠟之半固體混合物。任何前述混合物可能適合用於本發明之治療與療法，其限制條件為調配物中之活性成分不會因調配而失活，且調配物與投藥途徑生理學上相容且對投藥途徑具耐受性。亦參見鮑德里克P.(Baldrick P.)「醫藥賦形劑發展：臨床前指導之必需品(Pharmaceutical excipient development: the need for preclinical guidance.)」毒理藥理學規範(Regul. Toxicol Pharmacol.)32(2):210-8(2000)；王W.(Wang W.)「固體蛋白質藥品之凍乾與發展(Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals.)」國際製藥學雜誌(Int. J. Pharm.)203(1-2):1-60(2000)；查曼W N(Charman W N)「脂質、親脂性藥物及經口藥物傳遞-一些新興概念(Lipids,lipophilic drugs,and oral drug delivery-some emerging concepts.)」醫藥科學雜誌(J Pharm Sci.)89(8):967-78(2000)；鮑威爾(Powell)等人「非經腸調配物的賦形劑概要(Compendium of excipients for parenteral formulations)」PDA醫藥科學技術雜誌(J Pharm Sci Technol.)52:238-311(1998)；以及其中關於與醫藥化學工作者熟知的調配物、賦形劑以及載劑相關之其他資訊的引用。

本發明之抗體(本文中亦稱作「活性化合物」)以及其衍生物、片段、類似物以及同源物可併入可包括醫藥學上可接受之載劑的醫藥組合物中。本文中所用之術語「醫藥學上可接受之載劑」欲包含與醫藥投藥相容的任何及所有溶劑、分散介質、包衣、抗細菌劑及抗真菌劑、等張劑及吸收延遲劑以及其類似試劑。適合的載劑描述於此領域中之標準參考文本雷氏藥學大全(Remington's Pharmaceutical Sciences)的最新版本中，其併入本案供參考。所述載劑或稀釋劑的較佳實例包含(但不限於)水、鹽水、林格氏溶液(ringer's solutions)、右旋糖溶液以及5%人類血清白蛋白。亦可使用脂質體以及非水性媒劑，諸如非揮發性油。用於醫藥學上具活性之物質的所述介質及試劑的用途在此項技術中為熟知的。除非任何習知介質或試劑與活性化合物不相容，否則其在組合物中的使用涵蓋在內。補充性活性化合物亦可併入組合物中。

本發明之醫藥組合物經調配與其預期投藥途徑相容。投藥途徑的實例包含非經腸，例如靜脈內、皮內、皮下、經口(例如吸入)、經皮(亦即表面(topical))、經黏膜以及直腸投藥。用於非經腸、皮內或皮下施用的溶液或懸浮液可包含以下組分：無菌稀釋劑，諸如注射用水、鹽水溶液、非揮發性油、聚乙二醇、甘油(glycerine)、丙二醇(propylene glycol)或其他合成溶劑；抗細菌劑，諸如苯甲醇(benzyl alcohol)或對羥基苯甲酸甲酯(methyl paraben)；抗氧化劑，諸如抗壞血酸(ascorbic acid)或亞硫酸氫鈉(sodium bisulfite)；螯合劑，諸如乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA)；緩衝劑，諸如乙酸鹽(acetate)、檸檬酸鹽(citrate)或磷酸鹽(phosphate)；以及張力調節劑，諸如氯化鈉(sodium chloride)或右旋糖。pH值可用酸或鹼調節，諸如鹽酸或氫氧化鈉。非經腸製劑可封入由玻璃或塑膠製成的安瓿、拋棄式注射器或多劑量小瓶中。

適於注射使用的醫藥組合物包含無菌水溶液(水溶性的)或分散液以及即時製備無菌可注射溶液或分散液的無菌粉末。對於靜脈內投藥，適合之載劑包含生理鹽水、抑菌水、十六醇聚氧乙烯醚EL^TM (Cremophor EL^TM )(BASF,帕瑟伯尼(Parsippany),新澤西州(N.J.))或磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)。在所有狀況下，組合物可為無菌的且就注射容易性而言應為流體。組合物可在製造及儲存條件下穩定且必須針對微生物(諸如細菌及真菌)的污染作用進行防腐處理。載劑可為溶劑或分散介質，其含有例如水、乙醇(ethanol)、多元醇(例如甘油、丙二醇以及液體聚乙二醇，以及其類似物)，以及其適合之混合物。可例如藉由使用諸如卵磷脂之包衣，在分散液的狀況下藉由維持所需粒度，及藉由使用界面活性劑來維持適當流動性。阻止微生物作用可由多種抗細菌劑及抗真菌劑達成，例如對羥基苯甲酸酯(paraben)、氯丁醇(chlorobutanol)、苯酚(phenol)、抗壞血酸、硫柳汞(thimerosal)以及其類似物。在許多狀況下，組合物中較佳包含等張劑，例如糖、多元醇(諸如甘露糖醇(manitol)、山梨糖醇(sorbitol))、氯化鈉。可藉由在組合物中納入延遲吸收的試劑(例如單硬脂酸鋁(aluminum monostearate)及明膠)來延長可注射組合物的吸收。

可藉由將所需量之活性化合物併入適當溶劑與上文所列成分之一或其組合中，需要時接著以過濾滅菌來製備無菌可注射溶液。一般而言，藉由將活性化合物併入含有基礎分散介質以及上文所列之所需其他成分的無菌媒劑中來製備分散液。在用於製備無菌可注射溶液之無菌粉末的狀況下，製備方法為真空乾燥及冷凍乾燥，其自先前經無菌過濾之溶液得到活性成分與任何其他所要成分的粉末。

口服組合物一般包含惰性稀釋劑或可食用載劑。所述口服組合物可封入明膠膠囊中或壓成錠劑。為達成經口治療性投藥之目的，可將活性化合物與賦形劑合併且以錠劑、糖衣錠或膠囊的形式使用。亦可使用流體載劑製備口服組合物以用作漱劑(mouthwash)，其中流體載劑中之化合物經口施用並來回漱動(swish)且吐出或咽下。醫藥學上相容之黏合劑及/或佐劑物質可作為組合物的一部分包含在內。錠劑、丸劑、膠囊、糖衣錠以及其類似物可含有以下任何成分，或具有類似性質的化合物：黏合劑，諸如微晶纖維素、黃蓍膠(gum tragacanth)或明膠；賦形劑，諸如澱粉或乳糖；崩解劑，諸如褐藻酸(alginic acid)、澱粉羥基乙酸鈉(Primogel)或玉米澱粉；潤滑劑，諸如硬脂酸鎂(magnesium stearate)或斯托特斯(Sterotes)；滑動劑，諸如膠狀二氧化矽(colloidal silicon dioxide)；甜味劑，諸如蔗糖或糖精；或調味劑，諸如胡椒薄荷(peppermint)、水楊酸甲酯(methyl salicylate)或橙香精(orange flavoring)。

對於藉由吸入投藥，化合物可以氣霧劑噴霧的形式自含有適合之推進劑(例如氣體，諸如二氧化碳(carbon dioxide))的加壓容器或分配器，或噴霧器中傳遞。

亦可藉由經黏膜或經皮方式進行全身投藥。對於經黏膜或經皮投藥，在調配物中使用適於待滲透之障壁的穿透劑。所述穿透劑在此項技術中一般為已知的，且包含例如清潔劑、膽汁鹽以及梭鏈孢酸(fusidic acid)衍生物以供經黏膜投藥。經黏膜投藥可經由使用鼻用噴霧或栓劑來實現。對於經皮投藥，將活性化合物調配成此項技術中一般已知的軟膏、油膏、凝膠或乳膏。

化合物亦可以栓劑(例如使用習知栓劑基質，諸如可可脂及其他甘油酯)或保留灌腸劑的形式製備以供直腸傳遞。

在一個實施例中，將活性化合物與保護化合物防止其體內快速消除的載劑一起製備，諸如控制釋放調配物，包含植入物以及微膠囊化傳遞系統。可使用生物可降解且生物相容之聚合物，諸如乙烯乙酸乙烯酯(ethylene vinyl acetate)、聚酸酐(polyanhydride)、聚乙醇酸(polyglycolic acid)、膠原蛋白、聚原酸酯(polyorthoester)以及聚乳酸(polylactic acid)。製備所述調配物的方法將為熟習此項技術者顯而易知。物質亦可自阿爾紮公司(Alza Corporation)以及諾瓦醫藥公司(Nova Pharmaceuticals,Inc.)購得。脂質體懸浮液(包含靶向受感染細胞的脂質體，其具有針對病毒抗原之單株抗體)亦可用作醫藥學上可接受之載劑。此等脂質體懸浮液可根據熟習此項技術者已知的方法製備，例如美國專利第4,522,811號中所述。

尤其有利的是，將口服或非經腸組合物調配成單位劑型以使投藥容易及劑量均勻。本文中所用之單位劑型是指適於作為單位劑量用於待治療個體的物理個別單元；各單元含有預定量之活性化合物，所述預定量經計算以與所需醫藥載劑聯合產生所要治療作用。本發明之單位劑型的規格由以下因素規定且直接取決於以下因素：活性化合物之獨特特徵以及有待達成的特定治療作用，以及在此項技術中混配此類活性化合物以供治療個體所固有的限制。

醫藥組合物可與關於投藥之說明書一起容納於容器、包裝或分配器中。

當使用抗體片段時，特異性結合於標靶蛋白之結合域的最小抑制性片段較佳。舉例而言，基於抗體之可變區序列，可設計保持結合標靶蛋白序列之能力的肽分子。所述肽可以化學方式合成及/或由重組DNA技術產生(參見例如馬拉斯科(Marasco)等人，美國國家科學院學報(Proc. Natl. Acad. Sci. USA),90: 7889-7893(1993))。調配物亦可含有所治療之特定適應症所必需的一種以上活性化合物，較佳為具有彼此不會產生不良影響之互補活性的活性化合物。或者或另外，組合物可包括增強其功能的試劑，諸如細胞毒性劑、細胞激素、化學治療劑或生長抑制劑。所述分子適合以有效達成預期目的的量組合存在。

活性成分亦可封存於以下各物中：例如藉由團聚技術(coacervation technique)或藉由界面聚合(interfacial polymerization)而製備的微膠囊，分別例如羥甲基纖維素或明膠微膠囊以及聚(甲基丙烯酸甲酯)(poly-(methylmethacrylate))微膠囊；膠狀藥物傳遞系統(例如脂質體、白蛋白微球體、微乳液、奈米粒子以及奈米膠囊)；或巨乳液(macroemulsion)。

欲用於活體內投與之調配物可為無菌的。此易於藉由經無菌濾膜過濾而實現。

可製備持續釋放製劑。持續釋放製劑的適合實例包含含抗體之固體疏水性聚合物的半透性基質，所述基質呈成型物品的形式，例如膜或微膠囊。持續釋放基質的實例包含聚酯(polyester)、水凝膠(hydrogel)(例如聚(甲基丙烯酸2-羥乙酯)(poly(2-hydroxyethyl-methacrylate))或聚(乙烯醇)(poly(vinylalcohol)))、聚乳酸交酯(polylactide)(美國專利第3,773,919號)、L-麩胺酸(L-glutamic acid)與γ-乙基-L-麩胺酸酯(γethyl-L-glutamate)的共聚物、不可降解的乙烯乙酸乙烯酯、可降解的乳酸-乙醇酸(lactic acid-glycolic acid)共聚物(諸如LUPRON DEPOT^TM ，由乳酸-乙醇酸共聚物與柳菩林(leuprolide acetate)構成的可注射微球體)，以及聚-D-(-)-3-羥基丁酸(poly-D-(-)-3-hydroxybutyric acid)。諸如乙烯乙酸乙烯酯及乳酸-乙醇酸之聚合物能夠歷經100天以上釋放分子，而某些水凝膠歷經較短時段釋放蛋白質。

本發明抗體之治療有效量一般是指達成治療目的所需的量。如上所述，此可為抗體與其標靶抗原之間的結合相互作用，所述相互作用在某些狀況下干擾標靶發揮功能。此外，投藥所需之量將取決於抗體對其特異性抗原的結合親和力，且亦將取決於所投與之抗體自其投與之其他個體的自由體積中耗盡的速率。作為非限制性實例，本發明抗體或抗體片段之治療有效劑量的常用範圍可為每公斤體重約0.1毫克至每公斤體重約50毫克。常用給藥頻率可例如在每天兩次至每週一次的範圍內。

抗體篩選方法

篩選具有所要特異性之抗體的方法包含(但不限於)酶聯結免疫吸附劑檢定(ELISA)以及此項技術中已知的其他免疫介導技術。

針對γ^190-202 與γ^377-395 血纖維蛋白抗原決定基之抗體可在此項技術中已知的關於血纖維蛋白定位及/或定量的方法中使用。在特定實施例中，對γ^190-202 與γ^377-395 血纖維蛋白抗原決定基具特異性的抗體或其含有源自所述抗體之抗原結合域的衍生物、片段、類似物或同源物用作藥理學上具活性之化合物(下文稱作「治療劑」)。

對γ^190-202 與γ^377-395 血纖維蛋白抗原決定基具特異性的抗體可用於藉由諸如免疫親和層析或免疫沈澱的標準技術分離血纖維蛋白多肽。可藉由使抗體偶合(亦即物理連接)於可偵測物質而使偵測容易。可偵測物質的實例包含多種酶、輔基(prosthetic group)、螢光物質、發光物質、生物發光物質以及放射性物質。適合酶的實例包含辣根過氧化酶、鹼性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙醯膽鹼酯酶；適合輔基複合物的實例包含抗生蛋白鏈菌素/生物素及抗生蛋白/生物素；適合螢光物質的實例包含繖酮(umbelliferone)、螢光素(fluorescein)、螢光素異硫氰酸酯(fluorescein isothiocyanate)、若丹明、二氯三嗪基胺螢光素(dichlorotriazinylamine fluorescein)、丹醯氯(dansyl chloride)或藻紅素(phycoerythrin)；發光物質的實例包含魯米諾(luminol)；生物發光物質的實例包含螢光素酶、蟲螢光素(luciferin)以及水母素(aequorin)；且適合放射性物質的實例包含¹²⁵ I、¹³¹ I、³⁵ S或³ H。

本發明之抗體可用作偵測樣本中γ^190-202 及/或γ^377-395 血纖維蛋白抗原決定基之存在的試劑。在一些實施例中，抗體含有可偵測標記。抗體為多株抗體，或更佳為單株抗體。使用完整抗體或其片段(例如F_ab 、scFv或F_(ab)2 )。關於探針或抗體之術語「經標記」欲涵蓋藉由使可偵測物質偶合(亦即物理連接)於探針或抗體而對探針或抗體直接作標記，以及藉由與經直接標記的另一試劑反應而對探針或抗體間接作標記。間接作標記的實例包含使用經螢光標記之二次抗體偵測一次抗體以及用生物素對DNA探針作末端標記以使之可用經螢光標記之抗生蛋白鏈菌素偵測。術語「生物樣本」欲包含自個體分離之組織、細胞以及生物流體，以及個體體內存在的組織、細胞以及流體。因此，在術語「生物樣本」的使用中包含血液以及血液之一部分或組分，包含血清、血漿或淋巴。亦即，本發明之偵測方法可用於在活體外以及活體內偵測生物樣本中的分析物mRNA、蛋白質或基因組DNA。舉例而言，在活體外偵測分析物mRNA的技術包含北方墨點雜交(Northern hybridization)以及原位雜交(in situ hybridization)。在活體外偵測分析物蛋白質的技術包含酶聯結免疫吸附劑檢定(ELISA)、西方墨點法、免疫沈澱以及免疫螢光法。在活體外偵測分析物基因組DNA的技術包含南方墨點雜交(Southern hybridization)。進行免疫檢定的程序描述於例如「ELISA：理論與實踐：分子生物學方法(ELISA: Theory and Practice: Methods in Molecular Biology)」,第42卷,J. R.克勞瑟(J. R. Crowther)(編)休曼出版社(Human Press),托托瓦(Totowa),新澤西州(N.J.),1995；「免疫檢定(Immunoassay)」,E.迪曼蒂斯(E. Diamandis)及T.克里斯托普斯(T. Christopoulus),學術出版公司(Academic Press,Inc.),聖地牙哥(San Diego),加利福尼亞州(Calif.),1996；以及「酶免疫檢定的實踐與理論(Practice and Theory of Enzyme Immunoassays)」,P.蒂森(P. Tijssen),埃塞維爾科學出版社(Elsevier Science Publishers),阿姆斯特丹(Amsterdam),1985中。此外，在活體內偵測分析物蛋白質的技術包含將經標記之抗分析物蛋白質抗體引入個體中。舉例而言，可用放射性標記物對抗體作標記，所述放射性標記物在個體體內的存在及位置可由標準成像技術偵測。

抑制劑篩選方法

本發明提供鑑別調節劑之方法(本文中亦稱作「篩選檢定」)，所述調節劑亦即調節或以其他方式干擾血纖維蛋白及Mac-1之結合的候選或測試化合物或藥劑(例如肽、擬肽、小分子或其他藥物)，或調節或以其他方式干擾血纖維蛋白、Mac-1及/或血纖維蛋白/Mac-1複合物之信號傳導功能的候選或測試化合物或藥劑。本發明亦包含在本文所述之篩選檢定中鑑別的化合物。

在一個實施例中，本發明提供篩選候選或測試化合物之檢定，所述候選或測試化合物調節血纖維蛋白/Mac-1複合物之信號傳導功能及/或血纖維蛋白與Mac-1之間的相互作用。本發明之測試化合物可使用此項技術中已知之組合文庫法中的眾多方法中的任一種來獲得，包含：生物文庫；空間可定址平行固相或溶液相文庫(spatially addressable parallel solid phase or solution phase libraries)；需要解迴旋(deconvolution)的合成文庫法；「一珠粒一化合物(one-bead one-compound)」文庫法；以及使用親和層析選擇的合成文庫法。生物文庫法限於肽文庫，而其他四種方法適用於化合物的肽、非肽寡聚物或小分子文庫(參見例如拉姆(Lam),1997.抗癌藥物設計(Anticancer Drug Design)12: 145)。

本文中所用之「小分子」欲指分子量小於約5千道爾頓且最佳小於約4千道爾頓的組合物。小分子可為例如核酸、肽、多肽、擬肽、碳水化合物、脂質或其他有機或無機分子。化學及/或生物混合物(諸如真菌、細菌或藻類提取物)之文庫在此項技術中為已知的，且可用本發明之任何檢定進行篩選。

合成分子文庫之方法的實例可獲知於此項技術中，例如：迪威特(DeWitt)等人,1993.美國國家科學院學報(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.)90: 6909；厄本(Erb)等人,1994.美國國家科學院學報(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.)91: 11422；祖克曼(Zuckermann)等人,1994.藥物化學雜誌(J. Med. Chem.)37: 2678；曹(Cho)等人,1993.科學(Science)261: 1303；卡雷爾(Carrell)等人,1994.德國應用化學雜誌(Angew. Chem. Int. Ed. Engl.)33: 2059；卡瑞爾(Carell)等人,1994.德國應用化學雜誌(Angew. Chem. Int. Ed. Engl.)33: 2061；以及加洛普(Gallop)等人,1994.藥物化學雜誌(J. Med. Chem.)37:1233。

化合物之文庫可呈現於溶液中(參見例如霍頓(Houghten),1992.生物技術(Biotechniques)13: 412-421)，或呈現於珠粒上(參見拉姆(Lam),1991.自然(Nature)354: 82-84)、晶片上(參見福多(Fodor),1993.自然(Nature)364: 555-556)、細菌上(參見美國專利第5,223,409號)、孢子上(參見美國專利第5,233,409號)、質體上(參見庫爾(Cull)等人,1992.美國國家科學院學報(Proc. Natl. Acad. Sci. USA)89: 1865-1869)或噬菌體上(參見斯科特(Scott)及史密斯(Smith),1990.科學(Science)249: 386-390；代弗林(Devlin),1990.科學(Science)249: 404-406；西瓦拉(Cwirla)等人,1990.美國國家科學院學報(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.)87: 6378-6382；費利西(Felici),1991.分子生物學雜誌(J. Mol. Biol.)222: 301-310；以及美國專利第5,233,409號)。

在一個實施例中，將候選化合物引入抗體-抗原複合物中且判定候選化合物是否破壞抗體-抗原複合物，其中此複合物受到破壞指示候選化合物調節血纖維蛋白/Mac-1複合物之信號傳導功能及/或血纖維蛋白與Mac-1之間的相互作用。舉例而言，單株抗體為5B8且抗原為血纖維蛋白原複合物。或者，單株抗體為1E3且抗原為血纖維蛋白原。

在另一實施例中，提供血纖維蛋白/Mac-1複合物且使之與至少一種中和單株抗體接觸。偵測到抗體-抗原複合物形成，且將一或多種候選化合物引入複合物中。若在引入一或多種候選化合物之後抗體-抗原複合物受到破壞，則候選化合物適用於治療與血纖維蛋白/Mac-1結合相關之病症。

在另一實施例中，提供本發明之可溶性嵌合蛋白且使之與至少一種中和單株抗體接觸。偵測到抗體-抗原複合物形成，且將一或多種候選化合物引入複合物中。若在引入一或多種候選化合物之後抗體-抗原複合物受到破壞，則候選化合物適用於治療與血纖維蛋白/Mac-1結合相關之病症。

測定測試化合物干擾或破壞抗體-抗原複合物的能力可由以下方式實現：例如使測試化合物與放射性同位素或酶標記偶合，使得可藉由偵測複合物中的經標記化合物來測定測試化合物與抗原或其生物學上具活性之部分的結合。舉例而言，可用¹²⁵ I、³⁵ S、¹⁴ C或³ H對測試化合物直接或間接作標記，且藉由電波發射直接計數(direct counting of radioemission)或藉由閃爍計數(scintillation counting)來偵測放射性同位素。或者，可用例如辣根過氧化酶、鹼性磷酸酶或螢光素酶對測試化合物作酶標記，且藉由測定適當受質轉化成產物的情況來偵測酶標記。

在一個實施例中，檢定包括使抗體-抗原複合物與測試化合物接觸，且測定測試化合物與抗原相互作用或以其他方式破壞現有抗體-抗原複合物的能力。在此實施例中，測定測試化合物與抗原相互作用及/或破壞抗體-抗原複合物的能力包括測定測試化合物與抗體相比優先結合於抗原或其生物學上具活性之部分的能力。

在另一實施例中，檢定包括使抗體-抗原複合物與測試化合物接觸，且測定測試化合物調節抗體-抗原複合物的能力。測定測試化合物調節抗體-抗原複合物的能力可例如藉由測定在測試化合物存在下抗原結合於抗體或與抗體相互作用的能力來實現。

熟習此項技術者應瞭解，在本文所揭露的任何篩選方法中，抗體可為中和抗體，諸如單株抗體5B8及/或1E3，其各自調節或以其他方式干擾血纖維蛋白/Mac-1結合。

在一個實施例中，可能需要固定抗體或抗原以有助於在引入候選化合物之後使複合形式與未複合形式分離，以及適應檢定自動化。在存在及不存在候選化合物的情況下觀測抗體-抗原複合物可在適於容納反應物的任何容器中完成。所述容器的實例包含微量滴定盤、試管以及微量離心管。在一個實施例中，可提供融合蛋白，其添加可使一或兩種蛋白質結合於基質的結構域。舉例而言，可使GST-抗體融合蛋白或GST-抗原融合蛋白吸附於麩胱甘肽瓊脂糖珠粒(西格馬化學(Sigma Chemical),聖路易斯(St. Louis),密蘇里州(Mo.))或麩胱甘肽衍生處理之微量滴定盤上，接著將其與測試化合物組合，且在有助於複合物形成的條件(例如在鹽及pH值之生理條件)下培育混合物。培育後，洗滌珠粒或微量滴定盤孔以移除任何未結合組分，在珠粒的狀況下固定基質，直接或間接測定複合物。或者，可使複合物自基質中解離，且使用標準技術測定抗體-抗原複合物形成的程度。

將蛋白質固定於基質上的其他技術亦可用於本發明之篩選檢定。舉例而言，可利用生物素與抗生蛋白鏈菌素結合來固定抗體(例如5B8及/或1E3)或抗原(例如血纖維蛋白)。可使用此項技術中熟知之技術(例如生物素標記套組；皮爾斯化學(Pierce Chemicals),羅克福德(Rockford),I11.)自生物素-NHS(N-羥基-丁二醯亞胺，N-hydroxy-succinimide)製備生物素標記抗體或抗原分子，且將其固定於塗佈有抗生蛋白鏈菌素之96孔盤(皮爾斯化學(Pierce Chemical))的孔中。或者，可將與相關抗體或抗原反應，但不會干擾相關抗體-抗原複合物形成的其他抗體引入盤孔中，且未結合抗體或抗原經由抗體結合而截留於孔中。除了上文關於GST固定之複合物所述的方法以外，偵測所述複合物之方法亦包含使用與抗體或抗原反應的此類其他抗體對複合物進行免疫偵測。

本發明進一步關於由前述任何篩選檢定鑑別之新穎藥劑以及其用於本文所述之治療的用途。

診斷檢定

本發明之抗體可由適當檢定偵測，例如習知類型的免疫檢定。舉例而言，可進行夾心檢定(sandwich assay)，其中全長血纖維蛋白原、血纖維蛋白或其片段附著於固相。維持培育足夠長的時段以允許樣本中之抗體結合於固相上的固定多肽。此第一培育期之後，使固相與樣本分離。洗滌固相以移除未結合物質以及干擾物質，諸如亦可存在於樣本中的非特異性蛋白質。隨後將含有結合於固定多肽之相關抗體(例如單株抗體5B8及/或1E3)的固相與結合於偶合劑(諸如生物素或抗生蛋白)之第二經標記抗體或第二抗體一起培育。此第二抗體可為另一抗血纖維蛋白抗體。抗體之標記在此項技術中為熟知的，且包含放射性核種、酶(例如順丁烯二酸去氫酶、辣根過氧化酶、葡萄糖氧化酶、過氧化氫酶(catalase))、螢石(螢光素異硫氰酸酯、若丹明、藻青素(phycocyanin)、螢光胺(fluorescarmine))、生物素以及其類似物。將經標記抗體與固體一起培育，且量測結合於固相之標記。此等及其他免疫檢定可由一般熟習此項技術者容易地進行。

偵測生物樣本中血纖維蛋白存在與否的例示性方法包括自測試個體獲得生物樣本，且使生物樣本與本發明之經標記單株抗體接觸以偵測生物樣本中血纖維蛋白的存在。

本文中關於探針或抗體所用之術語「經標記」欲涵蓋藉由使可偵測物質偶合(亦即物理連接)於探針或抗體而對探針或抗體直接作標記，以及藉由與經直接標記的另一試劑反應而對探針或抗體間接作標記。間接作標記的實例包含使用經螢光標記之二次抗體偵測一次抗體且用生物素對DNA探針作末端標記以使之可用經螢光標記之抗生蛋白鏈菌素偵測。術語「生物樣本」欲包含自個體分離之組織、細胞以及生物流體，以及個體體內存在的組織、細胞以及流體。亦即，本發明之偵測方法可用於在活體外以及活體內偵測生物樣本中的血纖維蛋白。舉例而言，在活體外偵測血纖維蛋白的技術包含酶聯結免疫吸附劑檢定(ELISA)、西方墨點法、免疫沈澱以及免疫螢光法。此外，在活體內偵測血纖維蛋白的技術包含將經標記之抗血纖維蛋白抗體引入個體中。舉例而言，可用放射性標記物對抗體作標記，所述放射性標記物在個體體內的存在及位置可由標準成像技術偵測。

在一個實施例中，生物樣本含有來自測試個體的蛋白質分子。一個較佳生物樣本為由習知方式自個體分離的周邊血液白血球樣本。

套組

本發明亦涵蓋偵測生物樣本中血纖維蛋白之存在的套組。舉例而言，套組可包括：能夠偵測生物樣本中之血纖維蛋白的經標記化合物或試劑；測定樣本中血纖維蛋白之量的構件；以及比較樣本中血纖維蛋白之量與標準品的構件。化合物或試劑可封裝於適合容器中。套組可更包括關於使用套組偵測樣本中之血纖維蛋白的說明書。

本發明將由以下實例進一步描述，所述實例並不限制申請專利範圍中所述之本發明的範疇。

實例

可根據以下實例進一步理解本發明教示內容之態樣，所述實例不應視為以任何方式限制本發明教示內容的範疇。

實例1-產生單株抗體

合成對應於血纖維蛋白原之γ鏈上已顯示對血纖維蛋白原與Mac-1相互作用至關重要之確切胺基酸的肽序列(1號肽：CGWTVLQKRIDGSL(SEQ ID NO:17)與2號肽：CKKTTMKIIPFNRLTIG(SEQ ID NO:18))。所合成之此兩種肽具有相應N端半胱胺酸殘基以允許結合於載體蛋白匙孔螺血氰蛋白(keyhole limpet hemocyanin，KLH)，其促進活體內穩固的抗體反應。兩種肽均用於使三隻小鼠免疫，從而在此等小鼠體內產生抗體反應。初步血清篩選揭示針對此等肽之抗體力價較強，且隨後會產生融合瘤，其產生針對此兩種肽序列的純系抗體(clonal antibody)。480種融合瘤純系的初始篩選是藉由針對兩種肽以及載體蛋白的ELISA來進行。擴增陽性純系且再進行測試以由ELISA確認肽抗原決定基的反應性。此初始篩選的最終結果產生46種對1號肽或2號肽具特異性之純系。對此等ELISA結果的深入分析鑑別16種標靶候選物供進一步檢查。根據此16種純系阻斷微神經膠質細胞經由Mac-1受體黏著於全長血纖維蛋白原上的能力對此等純系進行篩選。將組織培養孔用50微克/毫升血纖維蛋白原塗佈，在此等抗體純系存在下於所述血纖維蛋白原上塗佈微神經膠質細胞(200,000個細胞/毫升)。30分鐘後洗滌孔，且用0.1%結晶紫(crystal violet)對殘留黏著細胞進行染色。用1% PFA固定經染色之細胞，且用0.5%曲通(Triton)X-100將其溶解。此等純系中之五種純系顯示阻止微神經膠質細胞黏著於血纖維蛋白原的顯著能力，類似於針對Mac-1之市售阻斷抗體(M1/70)，如在595奈米下的吸光度量測所評估(圖1；抑制20%以上，如吸光度變化所量測)。預期本發明之抗體可使微神經膠質細胞黏著於血纖維蛋白原受阻30%以上、40%以上或50%以上。純系1A5、1D6以及1E3識別1號肽抗原決定基，而純系4E11與5B8識別2號肽抗原決定基。由西方墨點法進一步分析此五種純系識別血纖維蛋白原的能力。所有五種抗體皆以類似程度識別血纖維蛋白原的γ鏈。為檢查此等抗體是否以劑量依賴性方式識別血纖維蛋白原，對經塗佈之全長血纖維蛋白原進行ELISA(圖2)。發現所有五種抗體皆特異性結合漸增濃度的全長血纖維蛋白原。自此五種抗體中選擇三種(1E3、4E11以及5B8，其使Mac-1結合於血纖維蛋白或血纖維蛋白原γC域受到50%以上抑制，如吸光度變化所量測)以供分離與大規模純化。預期本發明之抗體可使Mac-1結合於血纖維蛋白受到50%以上、60%以上或70%以上抑制。最初，純化20毫克所有三種抗體以供活體外吞噬檢定以及EAE實驗所用。

實例2-針對血纖維蛋白原γ鏈之單株抗體抑制微神經膠質細胞的吞噬作用

吞噬作用為經活化之微神經膠質細胞與巨噬細胞經由Mac-1介導的主要功能。如先前所述，對微神經膠質細胞進行吞噬檢定。參見亞當斯(Adams)等人,2007,實驗醫學雜誌(J. Exp. Med.)204:571-582，其全部併入本案供參考。源自血纖維蛋白之γ^377-395 肽抑制微神經膠質細胞活化，且遏制中樞神經系統自體免疫疾病中的癱瘓復發。針對經修飾之血纖維蛋白γ^377-395 抗原決定基的單株抗體5B8在活體外抑制吞噬作用方面顯示優良功效。此抗體在活體內研究中顯示投藥在動物MS模型中具有預防性與治療性作用，如先前關於γ^377-395 肽所述。

實例3-單株抗體5B8遏制實驗性自體免疫腦脊髓炎之緩解-復發型動物模型中的復發發生

為評估血纖維蛋白抗體在活體內調控微神經膠質細胞活化及脫髓鞘方面的作用，將吞噬檢定中鑑別之純系中的兩種投與顯現PLP EAE之後的小鼠。每週投與抗體5B8與4E11三次，每隻小鼠250微克。如圖4A與圖4B所示，抗體4E11對EAE顯現並無實質性影響。相比之下，抗體5B8顯示復發時的臨床症狀受到遏制。

其他實施例

上文的詳細描述是用於幫助熟習此項技術者實施本發明。然而，本文描述並主張之發明內容的範疇並不受本文所揭露之特定實施例所限制，因為此等實施例欲作為本發明之若干態樣的說明。任何等效實施例皆欲處於本發明之範疇內。當然，除本文展示並描述的內容以外的本發明之各種修改根據前述描述將為熟習此項技術者顯而易知，所述修改不會脫離本發明的精神或範疇。所述修改亦欲處於隨附申請專利範圍的範疇內。

所引用的參考文獻

本文中對參考文獻的引用不應視為承認其為本發明之先前技術。

圖1為與針對Mac-1之市售阻斷抗體(M1/70)相比，在595奈米下的吸光度量測所評估的單株抗體結合。

圖2為量測單株抗體結合於血纖維蛋白原之ELISA的結果。

圖3為針對經修飾之血纖維蛋白γ^377-395 抗原決定基的單株抗體5B8在抑制吞噬作用方面顯示較高功效。

圖4A與圖4B為在首次發生與抗體4E11及5B8相關之臨床症狀之後在PLP EAE中投與抗血纖維蛋白抗體的活體內實驗，單株抗體5B8在復發時顯示遏制作用。

<110> 加州大學董事

<120> 單株抗體

<150> US 61/248,014

<151> 2009-10-02

<160> 18

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 158

<212> PRT

<213> 小家鼠(Mus musculus)

<400> 1

<210> 2

<211> 16

<212> PRT

<213> 小家鼠(Mus musculus)

<400> 2

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<212> PRT

<213> 小家鼠(Mus musculus)

<400> 3

<210> 4

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<212> PRT

<213> 小家鼠(Mus musculus)

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<212> PRT

<213> 小家鼠(Mus musculus)

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<212> DNA

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<212> PRT

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Claims

一種分離抗體，其結合血纖維蛋白或血纖維蛋白原γC域，其中所述抗體包括輕鏈與重鏈，所述輕鏈包括具以下胺基酸序列之三個互補決定區：RSSKSLLHSSGITYLS(SEQ ID NO：2(CDR-L1))、QMSNLAS(SEQ ID NO：3(CDR-L2))以及AQNLELPLT(SEQ ID NO：4(CDR-L3))；所述重鏈包括具以下胺基酸序列之三個互補決定區：GYTFTSYWIH(SEQ ID NO：6(CDR-H1))、LIDPSDSYTNYNQKFRG(SEQ ID NO：7(CDR-H2))以及SDPTGC(SEQ ID NO：8(CDR-H3))；其中所述抗體使得微神經膠質細胞黏著於所述血纖維蛋白或血纖維蛋白原γC域受到20%以上抑制。
如申請專利範圍第1項所述之分離抗體，其中所述抗體使得Mac-1結合於所述血纖維蛋白或血纖維蛋白原γC域受到50%以上抑制。
如申請專利範圍第1項所述之分離抗體，其中所述抗體遏制實驗性自體免疫腦脊髓炎(EAE)復發時的臨床症狀。
如申請專利範圍第1至3項中任一項所述之分離抗體，其中所述抗體結合所述血纖維蛋白或血纖維蛋白原γC域的γ^377-395 抗原決定基。
如申請專利範圍第1至3項中任一項所述之分離抗體，其中所述抗體為單株抗體。
如申請專利範圍第1至3項中任一項所述之分離抗體，其中所述抗體為人類化抗體。
如申請專利範圍第1至3項中任一項所述之分離抗體，其中所述抗體為人類抗體。
如申請專利範圍第1至3項中任一項所述之分離抗體，其中所述抗體包括SEQ ID NO：1之輕鏈可變區胺基酸序列。
如申請專利範圍第1至3項中任一項所述之分離抗體，其中所述抗體包括SEQ ID NO：5之重鏈可變區胺基酸序列。
如申請專利範圍第1至3項中任一項所述之分離抗體，其中所述抗體包括SEQ ID NO：1之輕鏈可變區胺基酸序列與SEQ ID NO：5之重鏈可變區胺基酸序列。
一種抗體用於製造用以治療與Mac-1結合於血纖維蛋白或Mac-1與血纖維蛋白原結合相關的由多發性硬化症、脊髓損傷、阿茲海默氏病(Alzheimer's Disease)、中風、類風濕性關節炎以及癌症所構成的族群中選出的疾病的藥物的用途，所述抗體如申請專利範圍第1至7項中任一項所述，其中所述抗體調配成投與個體的型式。
如申請專利範圍第11項所述之用途，其中所述個體為人類。
一種醫藥組合物，其包括如申請專利範圍第1至7項中任一項所述之分離抗體以及醫藥學上可接受之載劑。
一種套組，其包括如申請專利範圍第1至7項中任一項所述之分離抗體。
一種抗體用於製造用以治療與Mac-1結合於血纖維蛋白或Mac-1與血纖維蛋白原結合相關的炎症、疼痛或感官知覺喪失的藥物的用途，所述抗體如申請專利範圍第1至7項中任一項所述，其中所述抗體調配成投與個體的型式。
如申請專利範圍第15項所述之用途，其中所述個體為人類。
如申請專利範圍第15項所述之用途，其中所述炎症、疼痛或感官知覺喪失是由多發性硬化症、脊髓損傷、阿茲海默氏病(Alzheimer's Disease)、中風、類風濕性關節炎以及癌症所構成的族群中選出的疾病所引起的。