MXPA06013482A

MXPA06013482A - Moleculas de enlace capaces de neutralizar el virus de la rabia y sus usos.

Info

Publication number: MXPA06013482A
Application number: MXPA06013482A
Authority: MX
Inventors: Alexander Berthold Hend Bakker; Willem Egbert Marissen; Robert Arjen Kramer; Cornelis Adriaan De Kruif
Original assignee: Crucell Holland Bv
Priority date: 2004-05-27
Filing date: 2005-05-26
Publication date: 2007-03-01
Also published as: CA2568162A1; PT2314621E; AU2005250163B2; ATE501171T1; IL201970A; CN102212132A; KR20070044807A; IL179586A0; HRP20110320T1; NZ550366A; RS51847B; PT1749029E; EP2314620B1; HK1094705A1; EP2314620A1; DK1749029T3; EA200602210A1; CA2568162C; JP2008508859A; PL2314621T3

Abstract

La presente invencion proporciona molecula de enlace que se enlazan especificamente al virus de la rabia y son capaces de neutralizar el virus. La invencion ademas proporciona moleculas de acido nucleico que codifican las moleculas de enlace, composiciones que comprenden las moleculas de enlace y metodo para identificar o producir las moleculas de enlace. Las moleculas de enlace pueden usarse en el diagnostico, profilaxis y/o tratamiento de una condicion que resulta del virus de la rabia. Preferiblemente, estos pueden usarse en profilaxis de exposicion posterior de la rabia.

Description

MOLÉCULAS DE ENLACE CAPACES DE NEUTRALIZAR EL VIRUS DE LA RABIA Y SUS USOS Campo de la Invención La invención se relaciona a la medicina. En particular la invención se relaciona a moléculas de enlace que neutralizan el virus de la rabia. Las moléculas de enlace son útiles en la profilaxis posterior a la exposición de rabia. Antecedentes de la Invención La rabia es una infección viral con distribución casi de cobertura mundial que afecta principalmente animales salvajes y domésticos pero también involucra humanos, resultando en una encefalitis devastadora, casi fetal invariable. Anualmente, se estiman más de 70,000 víctimas fatales humanas, y millones de otras víctimas requieren tratamiento posterior a la exposición. El virus de la rabia es un virus de ARN de hebra sencilla envuelto en forma de bala clasificado en la familia de los rhabdovirus y género Lisavirus . El genoma del virus de la rabia codifica para cinco proteínas virales: polimerasa de ARN dependiente de ARN (L) ; una nucleoproteína (N) ; una proteína fosforilada (P) ; una proteína de matriz (M) localizada en el lado interior de la envoltura de la proteína viral; y una glicoproteína de superficie externa (G) . La proteína G (62-67 KDa) es una glicoproteína de tipo I REF:176129 compuesta de 505 aminoácidos que tiene de dos a cuatro sitios de N-glicosilación potenciales, de los cuales solamente uno o dos son glicosilados dependiendo de las cepas del virus. La proteína G forma las protuberancias que cubre la superficie exterior de la cubierta de virión y se sabe que inducen anticuerpos que neutralizan virus. La rabia se puede tratar o prevenir mediante ambas inmunizaciones pasiva y activa. La profilaxis de posterior a la exposición a la rabia incluye el provocar cuidado de la herida local y administración de ambas inmunizaciones pasiva (inmunoglobulinas antirrábica) y activa (vacunas) . Actualmente, las inmunoglobulinas antirrábicas (RIG) se preparan de las muestras de suero ya sea de humanos inmunes al virus de la rabia (HRIG) o caballos inmunes al virus de la rabia (ERIG) . Una desventaja del ERIG tanto como el HRIG es que no están disponibles en cantidades suficientes y, en el caso del HRIG, es muy caro. Además, el uso del ERIG puede llevar a reacciones adversas tales como choque anafiláctico. La posibilidad de contaminación mediante patógenos conocidos o no conocidos es un problema adicional asociado con el HRIG. Para superar estas desventajas se ha sugerido usar anticuerpos monoclonales capaces de neutralizar el virus de la rabia en profilaxis de posterior a la exposición. Los anticuerpos monoclonales de murino de neutralización de virus de la rabia son bien conocidos en la técnica (ver Schumacher y colaboradores, 1989) . Sin embargo, el uso de anticuerpos de murino in vivo está limitado debido a problemas asociados con administración de anticuerpos de murino a humanos, tales como vida media del suero corta, una incapacidad para provocar ciertas funciones de efector humanos y provocación de una respuesta inmune dramática no deseada contra el anticuerpo de murino en un humano (la reacción de "anticuerpo de ratón anti humano" (HAMA) ) . Recientemente, los anticuerpos monoclonales de neutralización de virus de la rabia humanos se han descrito (ver Dietzschold y colaboradores, 1990, Champion y colaboradores, 2000, y Hanlon y colaboradores, 2001) . Para anticuerpos monoclonales antirrábicos humanos para ser tan efectivos como el HRIG en profilaxis de posterior a la exposición se debe usar una mezcla de anticuerpos monoclonales. En una mezcla tal cada anticuerpo debe enlazar a un epítopo diferente o sitio en el virus para prevenir la fuga de variantes resistentes del virus . Actualmente, existe todavía una necesidad significante para nuevos anticuerpos monoclonales de neutralización de virus de la rabia humanos que tienen potencial profiláctico posterior a la exposición mejorado, particularmente anticuerpos que tienen diferentes especificidades de reconocimientos del epítopo. La presente invención proporciona tales anticuerpos monoclonales humanos que ofrecen el potencial para ser usados en mezclas útiles en la profilaxis de posterior a la exposición de un amplio rango de virus de la rabia y variantes resistentes de neutralización de estos. Breve Descripción de las Figuras Las Figuras 1A-1B muestran la comparación de las secuencias de aminoácidos de los virus de escape CVS-11 y E57 de la cepa del virus de la rabia. Las células infectadas con el virus fueron cosechadas 2 días después de infección y el ARN total se aisló. El cADN se generó y usó para formación de secuencias de ADN. Las regiones que contienen mutaciones se muestran y las mutaciones están indicadas en negritas. La Figura lA muestra la comparación de las secuencias de nucleótido. Los números arriba de los aminoácidos indican los números de aminoácidos de la glicoproteína del virus de la rabia que incluyen el péptido de señal. La Figura IB muestra la comparación de las secuencias de aminoácidos . El esguema de la glicoproteína del virus de la rabia se muestra en la parte superior. La caja obscura indica el péptido de señal, mientras que la caja gris indica el dominio de transmembrana. Las secuencias en la Figura 1 también están representadas por la SEQ ID NOS: 130-141. Las Figuras 2A-2B muestran la comparación de las secuencias de aminoácidos de los virus de escape CVS-11 y EJB de cepa de virus de la rabia. Las células infectadas con el virus fueron cosechadas 2 días después de infección y el ARN total se aisló. El cADN se generó y usó para formación de secuencias de ADN. Las regiones que contienen mutaciones se muestran y las mutaciones están indicadas en negritas. La Figura 2A muestra la comparación de las secuencias de nucleótido. Los números arriba de los aminoácidos indican los números de aminoácidos de la glicoproteína del virus de la rabia que incluyen el péptido de señal. La Figura 2B muestra la comparación de las secuencias de aminoácidos . El esquema de la glicoproteína del virus de la rabia se muestra en la parte superior. La caja obscura indica el péptido de señal, mientras que la caja gris indica el dominio de transmembrana. Las secuencias en la Figura 2 también están representadas por la SEQ ID Nos: 142-151. La Figura 3 muestra el vector PDV-C06. La Figura 4 muestra un ELISA de competición de virus antirrábico scFvs y el anticuerpo de virus antirrábico biotinilado llamado CR-57. Las placas de ELISA recubiertas con proteína de virus G de la rabia purificada se incubaron con el scFvs respectivo antes de la adición de CR-57bio (0.5 µg/ml). Subsiguientemente, el CR-57bio que enlaza fue monitoreado en ausencia y presencia de scFvs . La Figura 5 muestra un ELISA de competición de virus antirrábico scFvs y el anticuerpo de virus antirrábico llamado CR-57. Las placas de ELISA recubiertas con proteína de virus G de la rabia purificadas se incubaron con CR-57 (1 µg/ml) antes de la adición de scFvs en exceso. Subsecuentemente, el scFvs que enlaza se monitorea en ausencia y presencia de CR-57. La Figura 6 muestra un ensayo de ELISA de competencia de proteína de virus G antirrábico IgGs y el anticuerpo de virus anti rabia llamado CR-57. La proteína G (cepa ERA) se incubó con IgGs no etiquetado (mostrado en el eje X) . El CR57 biotinilado (CR57bio) se agregó y se dejó para enlazar a la proteína G antes de visualización por medio del estreptavidina-HRP. Las señales de ELISA se muestran como porcentaje del CR57bio que enlaza solo. La Figura 7 muestra un ensayo FACS de competencia de proteína de virus G anti rabia IgGs y el anticuerpo de virus anti rabia llamado CR-57. La proteína G (cepa ERA) que expresa PER.C6 se incubó con IgGs no etiquetado (mostrado en el eje X) . El CR57 biotinilado (CR57bio) se agregó y se dejó para enlazar a la proteína G que expresa células antes de visualización por medio del estreptavidina-PE. Las señales de FACS se muestran como porcentaje del CR57bio que enlaza solo.

Las Figuras 8A-8B muestra la comparación de las secuencias de aminoácidos de los virus de escape CVS-11 y E98. Las células infectadas con el virus fueron cosechadas 2 días después de infección y el ARN total se aisló. El cADN se generó y usó para formación de secuencias de ADN. La región que contiene una mutación de punto se muestra y la mutación se indica en negritas. La Figura 8A muestra la comparación de las secuencias de nucleótido. Los números arriba del nucleótido indican el nucleótido mutado (indicado con remarcado) de la estructura de lectura abierta de glicoproteína del virus de la rabia sin secuencia de péptido de señal . La Figura 8B muestra la comparación de las secuencias de aminoácidos . El número arriba del aminoácidos indica el aminoácidos mutado (indicado con remarcado) de la glicoproteína del virus de la rabia sin secuencia de péptido de señal. La Figura 9 muestra un árbol filogenético de 123 virus de calle de la rabia (secuencias de glicoproteína de virus G de la rabia 123, unión cercana, método de parámetro de 2 Kimura, 500 cebadores) . El remarcado indica virus que albergan la mutación N>D como se observa en el virus de escape E98. La Figura 10 muestra epítopos de neutralización en glicoproteína de la rabia. Un dibujo esquemático de la glicoproteína del virus de la rabia se muestra representando los sitos antigénicos que incluyen el epítopo CR57 novedoso. El péptido de señal (19 aminoácidos ) y dominio de transmembrana se indican por cajas obscuras. Los puentes de bisulfuro se indican. La numeración del aminoácidos es desde la proteína madura menos la secuencia del péptido de señal . Descripción Detallada de la Invención De aquí en adelante las siguientes definiciones de términos se usan en la invención.

DEFINICIONES Molécula de enlace Como se usa en la presente el término "molécula de enlace" se refiere a una inmunoglobulina intacta que incluye anticuerpos monoclonales, tales como anticuerpos monoclonales humanizados o humanos quiméricos, o a un dominio que enlaza antígeno y/o variable que comprende fragmento de una inmunoglobulina que compite con la inmunoglobulina intacta para enlace específico a la pareja de enlace de la inmunoglobulina, por ejemplo, el virus de la rabia o un fragmento de este tal como por ejemplo la proteína G. A pesar de la estructura, el fragmento de enlace de antígeno enlaza con el mismo antígeno que se considera por la inmunoglobulina intacta. Un fragmento de enlace de antígeno puede comprender un péptido o polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de por lo menos 2 residuos contiguos de aminoácidos , por lo menos 5 residuos contiguos de aminoácidos , por lo menos 10 residuos contiguos de aminoácidos , por lo menos 15 residuos contiguos de aminoácidos , por lo menos 20 residuos contiguos de aminoácidos , por lo menos 25 residuos contiguos de aminoácidos , por lo menos 30 residuos contiguos de aminoácidos , por lo menos 35 residuos contiguos de aminoácidos , por lo menos 40 residuos contiguos de aminoácidos , por lo menos 50 residuos contiguos de aminoácidos , por lo menos 60 residuos contiguos de aminoácidos por lo menos 70 residuos contiguos de aminoácidos por lo menos 80 residuos contiguos de aminoácidos por lo menos 90 residuos contiguos de aminoácidos por lo menos 100 residuos contiguos de aminoácidos por lo menos 125 residuos contiguos de aminoácidos por lo menos 150 residuos contiguos de aminoácidos por lo menos 175 residuos contiguos de aminoácidos por lo menos 200 residuos contiguos de aminoácidos por lo menos 250 residuos contiguos de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos de la molécula de enlace. El término "molécula de enlace" , como se usa en la presente incluye todos los tipos de inmunoglobulina y subclases conocidas en la técnica. Dependiendo de la secuencia de aminoácidos del dominio constante de sus cadenas pesada, las moléculas de enlace se pueden dividir en las cinco clases principales de anticuerpos intactos: IgA, IgD, IgE, IgG, y IgM, y varios de estos pueden estar además divididos en subclases (isotipos), por ejemplo, IgAl, lgA2, igGl, lgG2 , IgG3 y IgG4. Los fragmentos de enlace de antígeno incluyen, inter alia, Fab, F(ab'), F(ab')2, Fv, dAb, Fd, los fragmentos de región de determinación de complementariedad (CDR) , anticuerpos de cadena sencilla (scFv) , anticuerpos de cadena sencilla bivalente, anticuerpos de fago de cadena sencilla, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos, (poli) péptidos que contienen por lo menos un fragmento de una inmunoglobulina que es suficiente para conferir antígeno específico que enlaza al (poli) péptido, etc. Los fragmentos anteriores se pueden producir sintéticamente o mediante división enzimática o química de inmunoglobulinas intactas o pueden ser diseñadas genéticamente por técnicas de ADN recombinantes. Los métodos de producción son bien conocidos en la técnica y se describen, por ejemplo, en Antibodies: A Laboratory Manual, Editado por: E. Harlow y D, Lañe (1988), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, el cual está incorporado en la presente por referencia. Una molécula de enlace o fragmento de enlace de antígeno de esta puede tener uno o más sitios de enlace. Si existe más de un sitio de enlace, los sitos de enlace pueden ser idénticos uno al otro o pueden ser diferentes . La molécula de enlace puede ser una molécula de enlace pura o no conjugada pero también puede ser parte de un inmunoconjugado. Una molécula de enlace pura o no conjugada se proyecta para referirse a una molécula de enlace que no está conjugada, ligada operativamente o de otra manera físicamente o funcionalmente asociada con una porción efectora o etiqueta, tal como inter alia una sustancia tóxica, una sustancia radioactiva, un liposoma, una enzima. Se debe entender que las moléculas de enlace puras o no conjugadas no excluyen moléculas de enlace que han sido estabilizadas, muítimerizadas, humanizadas o en cualquier otra forma manipulada, diferente del acoplamiento de una porción efectora o etiqueta. En consecuencia, todas las moléculas de enlace puras y no conjugadas modificadas post traducción se incluyen en la presente, que incluyen cuando las modificaciones se hacen en el ambiente de célula de producción de molécula de enlace natural, mediante una célula de producción de molécula de enlace recombinante, y se introducen mediante la mano del hombre después de la preparación de la molécula de enlace inicial. Por su puesto, el término molécula de enlace pura o no conjugada no excluye la capacidad de la molécula de enlace para formar asociaciones funcionales con células efectoras y/o moléculas después de administración al cuerpo, como algunas de las interacciones son necesariamente con el propósito de ejercer un efecto biológico. La carencia del grupo efector asociado o la etiqueta se aplica por lo tanto en definición a la molécula de enlace pura o no conjugada in vitro, no in vivo. Regiones de Determinación de Complementariedad (CDR) El término "regiones de determinación de complementariedad" como se usa en la presente significa secuencias dentro de las regiones variables de moléculas de enlace, tales como inmunoglobulinas, que usualmente contribuyen a una extensión larga para el sitio de enlace del antígeno el cual es complementario en forma y distribución de carga al epítopo reconocido en el antígeno. Las regiones CDR pueden ser específicas para epítopos lineales, epítopos discontinuos, o epítopos conformacionales de proteínas o fragmentos de proteína, ya sea como presentes en la proteína en su conformación nativa o, en algunos casos, como presentes en las proteínas como desnaturalizados, por ejemplo, por solubilización en SDS. Los epítopos también pueden consistir de modificaciones post-traducción de proteínas. Variante Funcional El término "variante funcional", como se usa en la presente, se refiere a una molécula de enlace que comprende un nucleótido y/o secuencia de aminoácidos que se altera por uno o más nucleótidos y/o aminoácidos comparados con el nucleótido y/o secuencias de aminoácidos de la molécula de enlace madre y que además es capaz de competir para enlace con la pareja de enlace, por ejemplo, el virus de la rabia o un fragmento de este, con la molécula de enlace madre. En otras palabras, las modificaciones en el aminoácidos y/o secuencia de nucleótido de la molécula de enlace madre no afecta significativamente o altera las características de enlace de la molécula de enlace codificada por la secuencia de nucleótido o que contiene la secuencia de aminoácidos , esto es, la molécula de enlace también es capaz de reconocer y enlazar su objetivo. La variante funcional pueden tener modificaciones de secuencia conservadoras que incluyen sustituciones, adiciones y eliminaciones de nucleótido y aminoácidos . Estas modificaciones se pueden introducir por técnicas estándar conocidas en la técnica, tales como mutagénesis dirigidas a sitio y mutagénesis mediadas por PCR aleatoria, y puede comprender nucleótidos y aminoácidos naturales así como no naturales. Las sustituciones de aminoácidos conservadoras incluyen aquellas en las cuales el residuo de aminoácidos se remplaza con un residuo de aminoácidos que tiene propiedades estructurales o químicas similares. Las familias de residuos de aminoácidos que tienen cadenas laterales similares se han definido en la técnica. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina) , cadenas laterales acidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico) , cadenas laterales polares no cargadas (por ejemplo, aspargina, glutamina, serina, treonina, tripsina, cisteína, triptofano) , cadenas laterales no polares (por ejemplo, glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina) , cadenas laterales de ramificación beta (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano) . Quedará claro para el técnico experto que otras clasificaciones de familias de residuo de aminoácidos que se usaron anteriormente también se pueden emplear. Además, una variante puede tener sustituciones de aminoácidos no conservadoras, por ejemplo, reemplazo de un aminoácidos con un residuo de aminoácidos que tiene propiedades estructurales o químicas diferentes. Las variaciones menores similares también pueden incluir eliminaciones o inserciones de aminoácidos , o ambas . La orientación en la determinación de cuáles residuos de aminoácidos pueden ser sustituidos, insertados, o eliminados sin eliminar la actividad inmunológica se puede encontrar usando programas de cómputo bien conocidos en la técnica. Una mutación en una secuencia de nucleótido puede ser una alteración única hecha en una ubicación del cromosoma (un punto de mutación) , tal como mutaciones de transición o transversión, o alternativamente, nucleótidos múltiples pueden ser insertados, eliminados o cambiados en una ubicación de cromosoma única. Además, una o más alteraciones se pueden hacer en cualquier número de ubicaciones de cromosoma dentro de una secuencia de nucleótido. Las mutaciones se pueden realizar mediante cualquier método apropiado conocido en la técnica. Hospedero El término "hospedero", como se usa en la presente, se pretende que se refiera a un organismo o una célula dentro de la cual se ha introducido un vector tal como un vector de clonación o un vector de expresión. El organismo o célula puede ser procariótico o eucariótico. Se debe entender que este término se pretende que se refiera no solamente al organismo o célula del sujeto particular, sino además a la progenie de tal organismo o célula. Debido a que ciertas modificaciones pueden ocurrir en generaciones que suceden ya sea por mutación o influencias ambientales, tal progenie puede, de hecho, no ser idéntica al organismo o célula madre, pero también están incluidas dentro del alcance del término "hospedero" como se usa en la presente. Humano El término "humano", cuando se aplica a moléculas de enlace como se definen en la presente, se refiere a moléculas que son ya sea directamente derivadas de un humano o basadas en una secuencia humana. Cuando una molécula de enlace se deriva o está basada en una secuencia humana y subsiguientemente modificada, todavía se considera humana como se usa en toda la especificación. En otras palabras, el término humano, cuando se aplica a moléculas de enlace se pretende que incluya moléculas de enlace que tienen regiones variables y constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulina de línea de germen humana basadas en regiones variables o constantes ya sea o no que ocurren en un humano o linfocito humano o en forma modificada. Así, las moléculas de enlace humanas pueden incluir residuos de aminoácidos no codificados por secuencias de inmunoglobulina de línea de germen humanas, comprende sustituciones y/o eliminaciones (por ejemplo, mutaciones introducidas mediante por ejemplo, mutagénesis específica de sitio o aleatoria in vitro o por mutación somática in vivo) . "Basado en" como se usa en la presente se refiere a la situación que una secuencia de ácido nucleico puede ser copiada exactamente de una plantilla, o con mutaciones menores, tal como por métodos PCR propensos a error, o hecha sintéticamente coincidiendo la plantilla exactamente o con modificaciones menores. Las moléculas semisintéticas basadas en secuencias humanas también se consideran humanas como se usa en la presente. Anticuerpo Monoclonal . El término "anticuerpo monoclonal" como se usa en la presente se refiere a una preparación de moléculas de anticuerpo de composición molecular única, esto es, estructura primaria, es decir, que tienen una secuencia de aminoácidos única. Un anticuerpo monoclonal exhibe una especificidad y afinidad de enlace única para un epítopo particular. En consecuencia, el término "anticuerpo monoclonal humano" se refiere a un anticuerpo que exhibe una especificidad de enlace única la cual tiene regiones variables y constantes derivadas o basadas en secuencias de inmunoglobulina de líneas germinales humanas o derivadas de secuencias completamente sintéticas . El método de preparación del anticuerpo monoclonal no es relevante.

Molécula de Acido Nucleico El término "molécula de ácido nucleico" como se usa en la presente invención se refiere a una forma polimérica de nucleótidos e incluye ambas hebras sentido y antisentido de ARN, cADN, ADN genómico, y formas sintéticas y polímeros mezclados de lo anterior. Un nucleótido se refiere a un ribonucleótido, desoxinucleótido o una forma modificada de cualquier tipo de nucleótido. El término también incluye formas de hebra sencilla y doble de ADN. Además, un polinucleótido puede incluir ya sea nucleótidos que ocurren naturalmente y modificados o ambos ligados juntos por ligaduras de nucleótido que ocurren naturalmente y/o que ocurren no naturalmente. Las moléculas, de ácido nucleico se pueden modificar químicamente o bioquímicamente o pueden contener bases de nucleótido no naturales o derivadas, como se apreciará fácilmente por aquellos expertos en la técnica. Tales modificaciones incluyen, por ejemplo, etiquetas, metilación, sustitución de uno o más de los nucleótidos que ocurren naturalmente con un análogo, modificaciones internucleótido tal como ligaduras no cargadas (por ejemplo, fosfonatos de metilo, fosfotriésteres, fosforamidatos, carbamatos, etc.), ligaduras cargadas (por ejemplo, fosforotioatos, fosforoditioatos, etc.), porciones colgantes (por ejemplo, polipéptidos) , intercaladores (por ejemplo, acridina, soralen, etc.), quemadores, alquiladores, y ligaduras modificadas (por ejemplo, ácidos nucleicos anoméricos alfa, etc.). El término anterior también se pretende que incluya cualquier conformación topológica, que incluye conformaciones de hebra sencilla, concatenadas, parcialmente duplicadas, triplos, de horquilla, circulares y de candado. También se incluyen las moléculas sintéticas que imitan polinucleótidos en su capacidad de enlazar a una secuencia designada vía enlazamiento de hidrógeno y otras interacciones químicas. Tales moléculas son conocidas en la técnica e incluyen, por ejemplo, aquellas en las cuales las ligaduras de péptido sustituyen ligaduras de fosfato en el soporte de la molécula. Una referencia a una secuencia de ácido nucleico abarca su complemento a menos que se especifique de otra manera. Así, una referencia a una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia particular se debe entender que abarca su hebra complementaria, con su secuencia complementaria. La hebra complementaria también es útil, por ejemplo, para terapia antisentido, sondas de hibridización y cebadores de PCR. Excipiente Farmacéuticamente Aceptable Por "excipiente farmacéuticamente aceptable" significa cualquier sustancia inerte que se combina con una molécula activa tal como un fármaco, agente, o molécula de enlace para la preparación de una forma de dosificación agradable o conveniente. El "excipiente farmacéuticamente aceptable" es un excipiente que es no tóxico, o por lo menos del cual la toxicidad es aceptable para su uso proyectado, a receptores en las dosis y concentraciones empleadas y es compatible con otros ingredientes de la formulación que comprende el fármaco, agente o molécula de enlace. Profilaxis Post Exposición La "profilaxis de post exposición" (PEP) se indica para personas posiblemente expuestas a un animal rabioso. Las exposiciones posibles incluyen exposición a mordedura (esto es, cualquier penetración de la piel por dientes) que incluye mordeduras de animales, y exposición sin mordedura. Las exposiciones sin mordedura incluyen exposición a cantidades grandes de virus de la rabia aerosolizados en laboratorios o cuevas y recipientes quirúrgicos de corneas transplantadas de pacientes que murieron de rabia. La contaminación de heridas abiertas, abrasiones, membranas mucosas, o teóricamente, rasguños, con saliva u otro material potencialmente infeccioso (tal como tejido neural) de un animal rabioso también constituye una exposición sin mordedura. Otro contacto por sí mismo, tal como acariciar un animal con rabia y contacto con la sangre, orina, o heces de un animal rabioso, no constituye una exposición y no es una indicación para profilaxis. La PEP debe iniciar tan pronto como sea posible después de una exposición. Si no ha ocurrido exposición la profilaxis post exposición no es necesaria. En todos los regímenes de profilaxis post exposición, excepto para personas previamente inmunizadas, las inmunizaciones activas y pasivas se deben usar concurrentemente. Enlazar Específicamente El término "enlazar específicamente", como se usa en la presente, en referencia a la interacción de una molécula de enlace, por ejemplo, un anticuerpo, y su pareja de enlace, por ejemplo, un antígeno, significa que la interacción es dependiente de la presencia de una estructura particular, por ejemplo, un determinante antigénico o epítopo, en la pareja de enlace. En otras palabras, el anticuerpo preferentemente enlaza o reconoce la pareja de enlace aún cuando la molécula de enlace está presente en una mezcla de otras moléculas u organismos. El enlace se puede mediar por interacciones covalente o no covalentes o una combinación de ambas. En todavía otras palabras, el término "enlazar específicamente" significa enlazar inmunoespecíficamente a un antígeno o un fragmento de este y no enlazar inmunoespecíficamente a otros antígenos. Una molécula de enlace que enlaza inmunoespecíficamente a un antígeno puede enlazar a otros péptidos o polipéptidos con afinidad menor como se determina, por ejemplo, por radioinmunoensayos (RÍA) , ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzima (ELISA) , BIACORE, u otros ensayos conocidos en la técnica. Las moléculas de enlace o fragmentos de estas que enlazan inmunoespecíficamente a un antígeno se pueden hacer reaccionar en forma cruzada con antígenos relacionados. Preferiblemente, las moléculas de enlace o fragmentos de éstas que enlazan inmunoespecíficamente a un antígeno no reaccionan cruzadamente con otros antígenos . Cantidad Terapéuticamente Efectiva El término "cantidad terapéuticamente efectiva" se "refiere a una cantidad de la molécula de enlace como se define en la presente que es efectiva para profilaxis de post exposición de rabia. Vector El término "vector" denota una molécula de ácido nucleico en la cual una segunda molécula de ácido nucleico se puede insertar para introducción dentro de un hospedero donde esta será replicada, y en algunos casos expresada. En otras palabras, un vector es capaz de transportar una molécula de ácido nucleico a la cual se ha ligado. Los vectores de clonación además de los de expresión se contemplan por el término "vector", como se usa en la presente. Los vectores incluyen, pero no se limitan a, plásmidos, cósmicos, cromosomas artificiales bacteriales (BAC) y cromosomas artificiales de levadura (YAC) y vectores derivados de virus de bacteriófagos o plantas o animales (incluyendo humanos) . Los vectores comprenden un origen de replicación reconocido por el hospedero propuesto y en caso de vectores de expresión, promotor y otras regiones reguladoras reconocidas por el hospedero. Un vector que contiene una segunda molécula de ácido nucleico se introduce dentro de una célula por ejemplo por transformación, transfección, o por hacer uso de mecanismos de entrada bacterial o viral . Se conocen otras formas de introducción de ácido nucleico dentro de células, tales como electroporación, bombardeo de partícula a menudo usados con células de plantas, y similares. El método de introducción de ácido nucleico dentro de células depende entre otras cosas del tipo de células, etcétera. Esto no es crítico para la invención. Ciertos vectores son capaces de replicación autónoma en un hospedero dentro de la cual se pueden introducir (por ejemplo, vectores que tienen un origen bacterial de replicación pueden replicar en bacteria) . Otros vectores se pueden integrar dentro del genoma de un hospedero en introducción dentro del hospedero, y de esa manera se replica posteriormente con el genoma hospedero. La invención proporciona moléculas de enlace capaces de enlazar y neutralizar el virus de la rabia. Además, la invención pertenece a moléculas de ácido nucleico que codifican por lo menos la región de enlace de estas moléculas de enlace . La invención además proporciona el uso de las moléculas de enlace de la invención en la profilaxis de post exposición de un sujeto en riesgo de desarrollar una condición que resulta del virus de la rabia.

En un primer aspecto la presente invención abarca moléculas de enlace capaces de enlazar específicamente al virus de la rabia. Preferiblemente, las moléculas de enlace de la invención también tienen actividad de neutralización del virus de la rabia. Preferiblemente, las moléculas de enlace de la invención son moléculas de enlace humanas . Alternativamente, también pueden ser moléculas de enlace de otros animales. El virus de la rabia es parte del género Lisavirus. En total, el género Lisavirus incluye once genotipos: virus de la rabia (genotipo 1), virus Lagos bat (genotipo 2), virus Mokola (genotipo 3), virus Duvenhage (genotipo 4) , lisavirus 1 del murciélago europeo (genotipo 5) , lisavirus 2 del murciélago europeo (genotipo 6) , lisavirus del murciélago australiano (genotipo 7), virus Aravan (genotipo 8), virus Khujand (genotipo 9) , virus Irkut (genotipo 10) y virus Caucásico Occidental (genotipo 11) . Junto con el enlazamiento del virus de la rabia, las moléculas de enlace de la invención también pueden ser capaces de enlazar a otros genotipos del género Lisavirus. Preferiblemente, las moléculas de enlace también pueden ser capaces de neutralizar otros genotipos del género Lisavirus. Además, las moléculas de enlace de la invención aún pueden ser capaces de enlazar y/o neutralizar virus, diferentes de Lisavirus, de la familia de rhabdovirus. Esta familia incluye el género cytorhabdovirus, ephemerovirus , lisavirus, nucleorhabdovirus, rhabdovirus y vesiculovirus . Las moléculas de enlace pueden ser capaces de enlazar específicamente al virus de la rabia en su forma natural o en su forma inactiva/atenuada. La inactivación del virus de la rabia se puede realizar por tratamiento con inter alia beta propiolactona (BPL) (White and Chappel, 1982), calentando a 562C por más de 30 minutos, irradiación gama, tratamiento con acetiletilenimina o etilenimina o tratamiento con ácido ascórbico y sulfato de cobre por 72 horas (Madhusudana y colaboradores, 2004) . Los métodos de inactivación viral generales bien conocidos por aquellos técnicos expertos también se pueden usar tales como pasteurización inter alia (calor húmedo) , tratamiento de calor seco, tratamiento de calentamiento de vapor, tratamiento con pH bajo, tratamiento con solvente orgánico/detergente, nanofiltración; irradiación de luz UV. Preferiblemente, la inactivación se realiza por tratamiento con beta propiolactona (BPL) . Los métodos a evaluar si el virus de la rabia es todavía inefectivo o se inactiva parcial o completamente son bien conocidos por la persona experta en la técnica y entre otros se puede encontrar en Laboratory techniques in rabies, Editado por: F.-X Meslin, M.M. Kaplan y H. Koprowski (1996) , 4a edición, Capítulo 36, Organización Mundial de la Salud, Ginebra. Las moléculas de enlace también pueden ser capaces de enlazar específicamente a uno o más fragmentos del virus de la rabia tal como inter alia una preparación de una o más proteínas y/o (poli) péptidos derivados del virus de la rabia o una célula transfectada con una proteína y/o (poli) péptido del virus de la rabia. Para métodos de tratamiento y/o prevención tales como métodos para profilaxis de post exposición del virus de la rabia las moléculas de enlace preferiblemente son capaces de enlazar específicamente a proteínas accesibles de superficie del virus de la rabia tales como la proteína M (ver Ameyama y colaboradores, 2003) o G. Para propósitos de diagnóstico las moléculas de enlace humanas también pueden ser capaces de enlazar específicamente a proteínas no presentes en la superficie del virus de la rabia. La secuencia de aminoácidos de proteínas internas y accesibles de superficie de varias cepas conocidas del virus de la rabia se puede encontrar en la base de datos EMBL y/u otras bases de datos. Preferiblemente, el fragmento por lo menos comprende un determinante antigénico reconocido por las moléculas de enlace humanas de la invención. Un "determinante antigénico" como se usa en la presente es una porción, tal como un (poli) péptido del virus de la rabia, (glico) roteína, o análogo o fragmento de este, que es capaz de enlazar a una molécula de enlace humana de la invención con afinidad suficientemente alta para formar un complejo de molécula de enlace de antígeno detectable. Las moléculas de enlace de acuerdo con la invención pueden ser moléculas de inmunoglobulina intacta tal como anticuerpos policlonales o monoclonales, en particular anticuerpos monoclonales humanos particulares, o las moléculas de enlace pueden ser fragmentos de enlace de antígeno, pero no limitadas a, Fab, F(ab')# F(ab')2< Fv, dAb, Fd, fragmentos de región de determinación de complementariedad (CDR) , anticuerpos de cadena sencilla (scFv) , anticuerpos de cadena sencilla bivalentes, anticuerpos de fago de cadena sencilla, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos, y (poli) péptidos que contienen por lo menos un fragmento de una inmunoglobulina que es suficiente para conferir antígeno específico que enlaza al virus de la rabia o fragmento de este. Las moléculas de enlace de la invención se pueden usar en forma aislada o no aislada. Además, las moléculas de enlace de la invención se pueden usar solas o en una mezcla que comprende por lo menos una molécula de enlace humana (o variante o fragmento de esta) . En otras palabras, las moléculas de enlace se pueden usar en combinación, por ejemplo, como una composición farmacéutica que comprende dos o más moléculas de enlace, variantes o fragmentos de esta. Por ejemplo, las moléculas de enlace que tiene actividad de neutralización del virus de la rabia se pueden combinar en una terapia sencilla para lograr un efecto profiláctico, terapéutico o de diagnóstico deseado. Los virus de ARN tales como el virus de la rabia hacen uso de su propia polimerasa de ARN durante la replicación del virus. Estas polimerasas de ARN tienden a ser propensas a error. Esto lleva a la formación de las así llamadas cuasiespecies durante una infección viral. Cada cuasiespecie tiene un genoma de ARN único, el cual puede resultar en diferencias en composición de aminoácidos de proteínas virales . Si ocurren tales mutaciones en proteínas virales estructurales, el virus podría potencialmente escapar del sistema inmune del hospedero debido a cambio en los epítopos de células T o B. La probabilidad de que esto ocurra es mayor cuando los individuos se tratan con una mezcla de dos moléculas de enlace, tales como anticuerpos monoclonales humanos, que con una mezcla de anticuerpo policlonal (HRIG) . Por lo tanto, un prerrequisito para una mezcla de dos anticuerpos monoclonales humanos para tratamiento de la rabia es que los dos anticuerpos reconozcan epítopos sin competencia y sin traslape en su antígeno objetivo, esto es, glicoproteína del virus de la rabia. El cambio de la ocurrencia de virus de escape de rabia se minimiza de esa manera. Como una consecuencia de esto, las moléculas de enlace de la invención preferiblemente son capaces de reaccionar con epítopos sin competencia, sin traslape diferentes del virus de la rabia, tales como epítopos en la proteína del virus G de la rabia. La mezcla de moléculas de enlace además pueden comprender por lo menos un agente terapéutico diferente tal como un medicamento apropiado para la profilaxis de post exposición de la rabia.

Comúnmente, las moléculas de enlace de acuerdo con la invención pueden enlazarse a sus parejas de enlace, eso es al virus de la rabia o fragmentos de este tal como proteínas del virus de la rabia, con una constante de afinidad (valor de Kd) que es menor que 0.2*10"4 M, 1.0*10"5 M, 1.0*10"6 M, 1.0*10"7 M, preferiblemente menor que 1.0*10"8 M, más preferiblemente menor que 1.0*10"9 M, más preferiblemente menor que 1.0*10"10 M, aún más preferiblemente menor que 1.0*10-11 M, y en particular menor que 1.0*10"12 M. Las constantes de afinidad pueden variar para isotipos de anticuerpo. Por ejemplo, el enlazamiento de afinidad para un isotipo IgM se refiere a una afinidad de enlaza de por lo menos alrededor de 1.0*10"7 M. Las constantes de afinidad por ejemplo se pueden medir usando resonancia de superficie de plasma, esto es, un fenómeno óptico que permite el análisis de interacciones bioespecíficas en tiempo real por detección de alteraciones en las concentraciones de la proteína dentro de una matriz biosensora, por ejemplo, usando el sistema de BIACORE ( (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Suecia) . Las moléculas de enlace de acuerdo con la invención pueden enlazarse al virus de la rabia en forma purificada/aislada o no purificada/no aislada. Las moléculas de enlace pueden enlazarse al virus de la rabia en forma soluble tal como por ejemplo en una muestra o pueden enlazar el virus de la rabia enlazado o acoplado a un portador o sustrato, por ejemplo, placas de microtitulador, membranas y perlas, etc. Los portadores o sustratos se pueden hacer de cristal, plástico (por ejemplo, poliestireno), polisacáridos, nailon, nitrocelulosa, o teflón, etc. La superficie de tales soportes pueden ser sólidas o porosas y de cualquier forma conveniente. Alternativamente, las moléculas de enlace también pueden enlazarse a fragmentos de virus de la rabia tal como proteínas o (poli) péptidos del virus de la rabia. En una modalidad las moléculas de enlace son capaces de enlazar específicamente a la proteína G del virus de la rabia o fragmento de esta. Las proteínas o (poli) péptidos del virus de la rabia pueden estar ya sea en forma soluble o pueden enlazar al virus de la rabia enlazado o acoplado a un portador o sustrato como se describió anteriormente. En otra modalidad las células transfectadas con la proteína G se pueden usar como pareja de enlace para las moléculas de enlace. En una modalidad preferida de la invención, las moléculas de enlace de la invención neutralizan la infectividad del virus de la rabia. Esto se puede lograr por prevención del acoplamiento del virus de la rabia a sus receptores en las células hospederas, tales como inter alia el receptor de neurotrofina P75 de murino, la molécula de adhesión de la célula neural (CD56) y el receptor de acetilcolina, o inhibición de la liberación de ARN en el citoplasma de la célula o prevención de transcripción de ARN o traducción.

Enana modalidad específica, las moléculas de enlace de la invención previenen el virus de la rabia de células hospederas de infección mediante por lo menos 99%, por lo menos 95%, por lo menos 90%, por lo menos 85%, por lo menos 80%, por lo menos 75%, por lo menos 70%, por lo menos 60%, por lo menos 50%, por lo menos 45%, por lo menos 40%, por lo menos 35%, por lo menos 30%, por lo menos 25%, por lo menos 20%, por lo menos 10% relativo a infección de las células hospederas por el virus de la rabia en la ausencia de las moléculas de enlace. La neutralización por ejemplo se puede medir como se describe en Laboratory techniques in rabies, Edited by: F.-X Meslin, M.M. Kaplan and H. Koprowski (1996), 4th edition, Chapter 15-17, Organización Mundial de la Salud, Ginebra. Además, las moléculas de enlace humanas de la invención pueden ser moléculas de enlace que fijan complementos capaces de asistir en la lysis del virus de la rabia cubierto. Las moléculas de enlace humano de la invención también pueden actuar como opsoninas y fagocitosis de aumento del virus de la rabia ya sea por promoción de su absorción vía receptores Fc o C3b o por aglutinación del virus de la rabia para hacer más fácilmente fagocitoso. En una modalidad preferida, las moléculas de enlace de acuerdo con la invención comprenden por lo menos una región CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO:l, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO : 4 , SEQ ID NO : 5 , SEQ ID NO : 6 , SEQ ID NO : 7 , SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO : 9 , SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23 y SEQ ID NO: 24. En una modalidad la región CDR3 es una región CDR3 de cadena pesada.

En todavía otra modalidad, las moléculas de enlace de acuerdo con la invención comprenden una cadena pesada variable que comprende esencialmente una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48 y SEQ ID NO: 49. En una modalidad preferida las moléculas de enlace de acuerdo con la invención comprenden una cadena pesada variable que comprende esencialmente una secuencia de aminoácidos que comprende de 1-119 aminoácidos de SEQ ID NO: 335. En una modalidad más, las moléculas de enlace de acuerdo con la invención comprenden una cadena pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 26 y una cadena ligera variable que comprende- la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 50, una cadena pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 27 y una cadena ligera variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 51, una cadena pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 28 y una cadena ligera variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 52, una cadena pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 29 y una cadena ligera variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 53, una cadena pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 30 y una cadena ligera variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 54, una cadena pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 31 y una cadena ligera variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 55, una cadena pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 32 y una cadena ligera variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 56, una cadena pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 33 y una cadena ligera variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 57, una cadena pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 34 y una cadena ligera variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 58, una cadena pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 35 y una cadena ligera variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 59, una cadena pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 36 y una cadena ligera variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 60, una cadena pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 37 y una cadena ligera variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 61, una cadena pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 38 y una cadena ligera variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 62, una cadena pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 39 y una cadena ligera variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 63, una cadena pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 40 y una cadena ligera variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 64, una cadena pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 41 y una cadena ligera variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 65, una cadena pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 42 y una cadena ligera variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 66, una cadena pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 43 y una cadena ligera variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 67, una cadena pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 44 y una cadena ligera variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 68, una cadena pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 45 y una cadena ligera variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 69, una cadena pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 46 y una cadena ligera variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 70, una cadena pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 47 y una cadena ligera variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 71, una cadena pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 48 y una cadena ligera variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 72, una cadena pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 49 y una cadena ligera variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 73. En una modalidad preferida las moléculas de enlace humanas de acuerdo con la invención comprenden una cadena pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos que comprende de 1-119 aminoácidos de SEQ ID NO: 335 y una cadena ligera variable que comprende la secuencia de aminoácidos que comprende de 1-107 aminoácidos de SEQ ID NO: 337. En una modalidad preferida las moléculas de enlace que tienen la actividad de neutralización del virus de la rabia de la invención se administran en formato IgG, preferiblemente en formato IgGl . Otro aspecto de la invención incluye variantes funcionales de moléculas de enlace como se definen en la presente. Las moléculas se considera que son variantes funcionales de una molécula de enlace de acuerdo con la invención, si las variantes son capaces de competir específicamente para enlazar el virus de la rabia o un fragmento de este con las moléculas de enlace madres. En otras palabras, cuando las variantes funcionales aún son capaces de enlazar al virus de la rabia o un fragmento de éste. Las variantes funcionales también deben tener actividad de neutralización del virus de la rabia. Las variantes funcionales incluyen, pero no se limitan a, derivados que sustancialmente son similares en secuencia estructural primaria, pero las cuales contienen por ejemplo, modificaciones in vitro o in vivo, químicas y/o bioquímicas, que no se encuentran en la molécula de enlace madre. Las modificaciones incluyen inter alia acetilación, acilación, ADP-ribosilación, amidación, enlace covalente de flavina, enlace covalente de una porción de hemo, enlace covalente de un nucleótido o derivado de nucleótido, enlace covalente de un lípido o derivado de lípido, enlace covalente de fosfotidilinositol, reticulación, ciclización, formación de enlace de bisulfuro, desmetilación, formación reticulación covalente, formación de cistina, formación de piroglutamato, formilación, gamma carboxilación, glicosilación, formación de ancla GPl, hidroxilación, iodinación, metilación, miristoilación, oxidación, pegilación, procesamiento proteolítico, fosforilación, prenilación, racemización, selenoilación, sulfación, adición mediada de ARN de transferencia de aminoácidos a proteínas tal como arginilación, ubiquitinación, y similares. Alternativamente, las variantes funcionales pueden ser moléculas de enlace como se definen en la presente invención que comprenden una secuencia de aminoácidos que contienen sustituciones, inserciones, eliminaciones o combinaciones de estas de uno o más aminoácidos comparados con las secuencias de aminoácidos de las moléculas de enlace madres. Además, las variantes funcionales pueden comprender truncamientos de la secuencia de aminoácidos en cualquiera de las terminaciones amino o carboxi o en ambas . Las variantes funcionales de acuerdo con la invención pueden tener la misma o diferentes afinidades de enlace ya sea mayor o menor comparada con la molécula de enlace madre pero también son capaces de enlazar el virus de la rabia o un fragmento de este y además son capaces de neutralizar el virus de la rabia. Por ejemplo, las variantes funcionales de acuerdo con la invención pueden haber aumentado o disminuido las afinidades de enlace para el virus de la rabia o un fragmento de este comparadas con las moléculas de enlace madres o pueden tener una actividad de neutralización del virus de la rabia mayor o menor. Preferiblemente las secuencias de aminoácidos de las regiones variables, que incluyen, pero no se limitan a, regiones de estructura, regiones hipervariables, en particular las regiones CDR3, se modifican. Generalmente, las regiones variables de cadena ligera y de cadena pesada comprenden tres regiones hipervariables, que comprenden tres CDR, y más regiones conservadas, las regiones de estructura así llamadas (FR) . Las regiones hipervariables comprenden residuos de aminoácidos de CDR y residuos de aminoácidos de circuitos hipervariables . Las variantes funcionales proyectadas para que caigan dentro del alcance de la presente invención tienen por lo menos alrededor de 50% hasta alrededor de 99%, preferiblemente por lo menos alrededor de 60% hasta alrededor de 99%, más preferiblemente por lo menos alrededor de 70% hasta alrededor de 99%, aún más preferiblemente por lo menos alrededor de 80% hasta alrededor de 99%, más preferiblemente por lo menos alrededor de 90% hasta alrededor de 99%, en particular por lo menos alrededor de 95% hasta alrededor de 99%, y en particular por lo menos alrededor de 97% hasta alrededor de 99% de homología de secuencia de aminoácidos con las moléculas de enlace madres como se definen en la presente. Los algoritmos de cómputo tales como inter alia Gap o Bestfit conocidos para una persona experta en la técnica se pueden usar para alinear óptimamente las secuencias de aminoácidos a ser comparadas y para definir residuos de aminoácidos similares o idénticas. En otra modalidad, las variantes funcionales se pueden producir cuando la molécula de enlace precursora comprende un sitio de glicosilación en su secuencia que resulta en glicosilación de la molécula de enlace sobre expresión en células eucarióticas y de ahí puede anular el enlace con el antígeno. La variante funcional producida no más grande contiene el sitio de glicosilación, pero será capaz de enlazar al virus de la rabia y además tiene actividad de neutralizació . Las variantes funcionales se pueden obtener por alteración de las moléculas de enlace precursoras o partes de estas por métodos de biología molecular general conocidos en la técnica que incluyen, pero no se limitan a, PCR propensa a error, mutagénesis dirigida a oligonucleótido y mutagénesis dirigida a sitio. Además, las variantes funcionales pueden tener actividad de fijación de complemento, pueden ser capaces de asistir en la lisis del virus de la rabia cubierto y/o actuar como opsoninas y aumentar la fagocitosis del virus de la rabia ya sea por promoción de su absorción vía receptores Fc o C3b o por el virus de la rabia de aglutinación para hacerlo más fácilmente fagocitoso.

En todavía un aspecto más, la invención incluye inmunoconjugados, esto es, moléculas que comprenden por lo menos una molécula de enlace o variante funcional de esta como se define en la presente y además comprende por lo menos una etiqueta, al como inter alia una porción/agente detectable. También están contempladas en la presente invención las mezclas de inmunoconjugados de acuerdo con la invención o mezclas de por lo menos un conjugado de acuerdo con la invención y otra molécula, tal como un agente terapéutico u otra molécula de enlace o inmunoconjugado. En una modalidad más, los inmunoconjugados de la invención pueden comprender una o más etiquetas. Estas etiquetas pueden ser las mismas o distintas una de la otra y pueden estar unidas/conjugadas no covalentemente a las moléculas de enlace. La o las etiquetas también pueden estar unidas/conjugadas directamente a las moléculas de enlace a través de enlace covalente, que incluye, pero no se limitan a, enlace de bisulfuro, enlace de hidrógeno, enlace electrostático, fusión recombinante y enlace conformacional. Alternativamente, la o las etiquetas pueden estar unidas/conjugadas a las moléculas de enlace por medios de uno o más compuestos de enlace. Las técnicas para etiquetas de conjugación para moléculas de enlace son bien conocidas por los técnicos expertos . Las etiquetas de inmunoconjugados de la presente invención pueden ser agentes terapéuticos, pero preferiblemente son porciones/agentes detectables. Los inmunocon ugados que comprenden un agente detectable se pueden usar diagnósticamente, por ejemplo, para evaluar si un sujeto ha sido infectado con el virus de la rabia o monitorear el desarrollo o progreso de una infección del virus de la rabia como parte de un procedimiento de evaluación clínica, por ejemplo, para determinar la eficacia de un régimen de tratamiento dado. Sin embargo, también se pueden usar para otros propósitos de detección y/o analíticos y/o de diagnóstico. Las porciones/agentes detectables incluyen, pero no se limitan a, enzimas, grupos prostéticos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes, materiales bioluminiscentes, materiales radioactivos, metales de emisión de positrón, e iones de metal paramagnético no radioactivo. Las etiquetas usadas para marcar las moléculas de enlace para propósitos de detección y/o analíticos y/o de diagnóstico dependen de las técnicas y/o métodos de detección/análisis/diagnóstico específicos usados tales como inter alia tinción inmunohistoquímica de muestras (tejido), detección citométrica, detección citométrica de escaneo con láser, inmunoensayos fluorescentes, ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzima (ELISA), radioinmunoensayos (RIA's), bioensayos (por ejemplo, ensayos de neutralización) , aplicaciones Western Blotting, etc. Para tinción inmunohistoquímica de muestras de tejido las etiquetas preferidas son enzimas que catalizar la producción y deposición local de un producto detectable. Comúnmente las enzimas conjugadas con moléculas de enlace para permitir su visualización inmunohistoquímica son bien conocidas e incluyen, pero no se limitan a, acetilcolinesterasa, fosfatasa alcalina, beta galactosidasa, oxidasa de glucosa, peroxidasa de raíz de rábano, y ureasa. Los sustratos comunes para producción y deposición de productos detectables visualmente también son bien conocidos por aquellos expertos en la técnica. Después de esto, los imunoconjugados de la invención pueden ser etiquetados usando oro coloidal o pueden ser etiquetados con radioisótopos, tales como 33P, 32P, 35S, 3H, y 1251 . Las moléculas de enlace de la invención se pueden acoplar a radionúclidos directa o indirectamente vía un agente de quelación por métodos bien conocidos en la técnica. Cuando las moléculas de enlace de la presente invención se usan para detecciones citométricas de flujo, detecciones citométricas de escaneo con láser, o inmunoensayos fluorescentes, de manera práctica, pueden ser etiquetadas con fluoróforos. Una amplia variedad de fluoróforos útiles para etiquetar fluorescentemente las moléculas de enlace de la presente invención son conocidas por los técnicos expertos. Cuando las moléculas de enlace de la presente invención se usan para detección secundaria usando avidina etiquetada, estreptavidina, captavidina o neutravidina, las moléculas de enlace se pueden etiquetar con biotina para formar complejos de grupo prostético apropiados. Cuando los inmunoconjugados de la invención se usan para uso diagnóstico in vivo, las moléculas de enlace también se pueden hacer detectables por conjugación, por ejemplo, con agentes de contraste de imagen de resonancia magnética (MRl) , tal como ácido dietilenetriaminopentaacético de gadolinio, con agentes de contraste de ultrasónico o con agentes de contraste de rayos X, o por etiquetado radioisotópico. Además, las moléculas de enlace, variantes funcionales de estas o inmunoconjugados de la invención también se pueden acoplar a soportes sólidos, los cuales son particularmente útiles para inmunoensayos in vitro o purificación del virus de la rabia o un fragmento de este. Los soportes sólidos pueden ser porosos o no porosos, planos o no planos e incluyen, pero no se limitan a, cristal, celulosa, poliacrilamida, nailon, poliestireno, cloruro de polivinilo o soportes de polipropileno. Las moléculas de enlace humanas también pueden, por ejemplo, de forma útil, ser conjugadas con medio de filtración, tal como Sefarosa activada con NHS o Sefarosa activada con CNBr para propósitos de cromatografía de inmunoafinidad. También puede ser útil que se acople a microesferas paramagnéticas, comúnmente por interacción de estreptavidina de biotina. Las microesferas se pueden usar para aislamiento del virus de la rabia o un fragmento de este de una muestra que contiene el virus de la rabia o un fragmento de este. Como otro ejemplo, las moléculas de enlace humanas de la presente invención pueden ser acopladas de forma útil a la superficie de una placa de microtitulador para ELISA. Las moléculas de enlace de la presente invención o variantes funcionales de estas se pueden fusionar a secuencias marcadoras, tales como un péptido para facilitar la purificación. Ejemplos incluyen, pero no se limitan a, la etiqueta de hexa-histidina, la etiqueta de hemaglutinina (HA) , la etiqueta de myc o la etiqueta de bandera. Alternativamente, un anticuerpo puede ser conjugado a un segundo anticuerpo para formar un anticuerpo heteroconjugado. En otro aspecto las moléculas de enlace humanas de la invención pueden estar conjugadas/acopladas a uno o más antígenos. Preferiblemente, estos antígenos son antígenos que se reconocen por el sistema inmune de un sujeto al cual la molécula de enlace-conjugado de antígeno se administra. Los antígenos pueden ser idénticos pero también pueden ser diferentes uno del otro. Los métodos de conjugación para acoplamiento de los antígenos y moléculas de enlace son bien conocidos en la técnica e incluyen, pero no se limitan a, el uso de agentes de reticulación. Las moléculas de enlace humanas enlazarán al virus de la rabia y los antígenos acoplados a las moléculas de enlace humanas iniciarán un ataque de célula T poderoso sobre el conjugado el cual eventualmente llevará a la destrucción del virus de la rabia.

Después de producir inmunoconjugados químicamente por conjugación, directa o indirectamente vía por ejemplo una ligadura, los inmunoconjugados se pueden producir como proteínas de fusión que comprenden las moléculas de enlace humanas de la invención y una etiqueta apropiada. Las proteínas de fusión se pueden producir por métodos conocidos en la técnica tales como, por ejemplo, recombinantemente por construcción de moléculas de ácido nucleico que comprenden secuencias de nucleótido que codifican las moléculas de enlace humanas en estructura con secuencias de nucleótido que codifica la o las etiquetas apropiadas y luego expresan las moléculas de ácido nucleico. Es otro aspecto de la presente invención proporcionar una molécula de ácido nucleico que codifica por lo menos una molécula de enlace o variante funcional de ésta de acuerdo con la invención. Tales moléculas de ácido nucleico se pueden usar como intermediarias para propósitos de clonación, por ejemplo, en el proceso de maduración de afinidad descrito anteriormente. En una modalidad preferida, las moléculas de ácido nucleico se aislan o purifican. La persona experta apreciará que las variantes funcionales de estas moléculas de ácido nucleico también se pretende que sean una parte de la presente invención. Las variantes funcionales son secuencias de ácido nucleico que pueden ser traducidas directamente, usando el código genético estándar, para proporcionar una secuencia de aminoácidos idéntica a aquella traducida de las moléculas de ácido nucleico madres . Preferiblemente, las moléculas de ácido nucleico codificada que enlazan moléculas comprenden una región CDR3 , preferiblemente una región CDR3 de cadena pesada, que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO:l, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO : 6 , SEQ ID NO : 7 , SEQ ID NO : 8 , SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO : 19 , SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23 y SEQ ID NO: 24. Aún más preferiblemente, las moléculas de ácido nucleico codifican moléculas de enlace que comprenden una cadena pesada variable que comprende esencialmente una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48 y SEQ ID NO:49. En una modalidad preferida particular las moléculas de ácido nucleico codifican moléculas de enlace que comprenden una cadena pesada variable que comprende esencialmente una secuencia de aminoácidos que comprende de 1-119 aminoácidos de SEQ ID NO: 335. En todavía otra modalidad, las moléculas de ácido nucleico codifican moléculas de enlace que comprenden una cadena pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 26 y una cadena ligera variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 50, o codifican una cadena pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 27 y una cadena ligera variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 51, o codifican una cadena pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 28 y una cadena ligera variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 52, o codifican una cadena pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos • de SEQ ID NO: 29 y una cadena ligera variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 53, o codifican una cadena pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 30 y una cadena ligera variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 54, o codifican una cadena pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 31 y una cadena ligera variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 55, o codifican una cadena pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 32 y una cadena ligera variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 56, o codifican una cadena pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 33 y una cadena ligera variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 57, o codifican una cadena pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 34 y una cadena ligera variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 58, o codifican una cadena pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 35 y una cadena ligera variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 59, o codifican una cadena pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 36 y una cadena ligera variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 60, o codifican una cadena pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 37 y una cadena ligera variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 61, o codifican una cadena pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 38 y una cadena ligera variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 62, o codifican una cadena pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 39 y una cadena ligera variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 63, o codifican una cadena pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 40 y una cadena ligera variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 64, o codifican una cadena pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 41 y una cadena ligera variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 65, o codifican una cadena pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 42 y una cadena ligera variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 66, o codifican una cadena pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 43 y una cadena ligera variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 67, o codifican una cadena pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 44 y una cadena ligera variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 68, o codifican una cadena pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 45 y una cadena ligera variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 69, o codifican una cadena pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 46 y una cadena ligera variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 70, o codifican una cadena pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 47 y una cadena ligera variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 71, o codifican una cadena pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 48 y una cadena ligera variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 72, o codifican una cadena pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 49 y una cadena ligera variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 73. En una modalidad preferida las moléculas de ácido nucleico codifican moléculas de enlace humanas que comprenden una cadena pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos que comprende de 1-119 aminoácidos de SEQ ID NO: 335 y una cadena ligera variable que comprende la secuencia de aminoácidos que comprende de 1-107 aminoácidos de SEQ ID NO:337. En una modalidad específica de la invención las moléculas de ácido nucleico que codifican la cadena pesada variable de las moléculas de enlace de la invención comprenden esencialmente una secuencia de nucleótido seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83, SEQ1-ID NO: 84, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 86, SEQ ID- NO: 87, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 96 y SEQ ID NO: 97. Preferiblemente, las moléculas de ácido nucleico que codifican la cadena pesada variable de las moléculas de enlace de la invención comprenden esencialmente una secuencia de nucleótido que comprende de 1-357 nucleótidos de SEQ ID NO:334.

En todavía otra modalidad específica de la presente invención, las moléculas de ácido nucleico que codifican la cadena ligera variable de las moléculas de enlace de la invención comprenden esencialmente una secuencia de nucleótido seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 120 y SEQ ID NO: 121. Preferiblemente, las moléculas de ácido nucleico que codifican la cadena ligera variable de las moléculas de enlace humanas de la invención comprenden esencialmente una secuencia de nucleótido que comprende de 1-321 nucleótidos de SEQ ID NO: 336. Es otro aspecto de la invención el proporcionar vectores, esto es, constructos de ácido nucleico, que comprenden una o más moléculas de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención. Los vectores se pueden derivar de plásmidos tales como inter alia F, Rl, RPl, Col, pBR322, TOL, Ti, etc.; cósmidos; fagos tales como lambda, lambdoide, M13, Mu, Pl, P22, Qp, T-even, T-odd, T2, T4, T7, etc.; virus de plantas tales como inter alia virus mosaico de alfalfa, bromovirus, capillovirus, carlavirus, carmovirus, caulivirus, clostervirus, comovirus, cryptovirus, cucumovirus, dianthovirus, fabavirus, fijivirus, furovirus, geminivirus, hordeivirus, ilarvirus, luteovirus, machlovirus, marafivirus, necrovirus, nepovirus, phytorepvirus, rhabdovirus de planta, potexvirus, potyvirus, sobemovirus, tenuivirus, tobamovirus, tobravirus, virus de tomate manchado marchito, tombusvirus, tymovirus, etc.; o virus de animal tales como inter alia adenovirus, arenaviridae, baculoviridae, birnaviridae, bunyaviridae, calciviridae, cardioviruses, coronaviridae, corticoviridae, cystoviridae, virus Epstein-Barr, enterovirus, filoviridae, flaviviridae, virus de enfermedad de Pie y Boca, hepadnaviridae, virus de hepatitis, herpesviridae, virus de inmunodeficiencia, virus de influenza, inoviridae, iridoviridae, orthomyxoviridae, papovavirus, paramyxoviridae, parvoviridae, picornaviridae, poliovirus, polydnaviridae, poxviridae, reoviridae, retrovirus, rhabdoviridae, rhinoviruses, virus de Semliki Forest, tetraviridae, togaviridae, toroviridae, virus de vacuna, virus de estomatitis vesicular, etc. Los vectores se pueden usar para clonación y/o para expresión de las moléculas de enlace humanas de la invención y pueden aún ser usadas para propósitos de terapia de gen. Los vectores que comprenden una o más moléculas de ácido nucleico de acuerdo con la invención operablemente ligados a una o más moléculas de ácido nucleico que regulan la expresión también están cubiertos por la presente invención. La selección del vector es dependiente de los procedimientos recombinantes seguidos y el hospedero usado. La introducción de vectores en las células hospederas se puede efectuar por inter alia transfección de fosfato de calcio, infección de virus, transfección mediada de DEAE-dextrano, transfección de lipofectamina o electroporación. Los vectores pueden ser de replicación autónoma o pueden replicar junto con el cromosoma dentro del cual se han integrado. Preferiblemente, los vectores contienen uno o más marcadores de selección. La elección de los marcadores puede depender de las células hospederas de selección, aunque esto no es crítico para la invención como es bien sabido para aquellas personas expertas en la técnica. Estos incluyen, pero no se limitan a, canamicina, neomicina, puromicina, higromicina, zeocina, gen de cinasa de timidita del virus simple del Herpes (HSV-TK) , gen de reductasa de dihidrofolato de ratón (dhfr) . Los vectores que comprenden una o más moléculas de ácido nucleico que codifican las moléculas de enlace humanas como se describen anteriormente operablemente ligadas a una o más moléculas de ácido nucleico codifican proteínas o péptidos que se pueden usar para aislar las moléculas de enlace también están cubiertas por la invención. Estas proteínas o péptidos incluyen, pero no se limitan a, glutationa-S-transferasa, proteína de enlace de maltosa, polihistidina de enlace de metal, proteína fluorescente verde, luciferasa y beta galactosidasa.

Los hospederos que contienen una o más copias de los vectores mencionados anteriormente son un tema adicional de la presente invención. Preferiblemente, los hospederos son células hospedadoras . Las células hospedadoras incluyen, pero no se limitan a, células de origen mamífero, de planta, insecto, micótico o bacterial. Las células bacteriales incluyen, pero no se limitan a, células de bacteria positiva Gram tales como varias especies de los géneros Bacillus, Streptomyces y Staphylococcus o células de bacteria negativa Gram tales como varias especies del género Escherichia, tales como E. coli , y Pseudomonas. En el grupo de células micóticas preferiblemente se usan células de levadura. La expresión en levadura se puede lograr por el uso de cepas de levadura tales como inter alia Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae y Hansenula polymorpha . Además, las células de insectos tales como células de Drosophila y Sf9, se pueden usar como células hospederas. Además de esto, las células hospederas pueden ser células de planta. Las células de planta o de plantas transformadas (transgénicas) se producen por métodos conocidos, por ejemplo, transferencia de genes mediada por agrobacteria, transformación de discos de hoja, transformación de protoplasto por transferencia de ADN inducido por polietilen glicol, electroporación, sonicación, microinyección o transferencia de gen boxístico. Adicionalmente, un sistema de expresión apropiado puede ser un sistema de baculovirus.

Los sistemas de expresión que usan células mamíferas tales como células de Ovario de Hámster Chino (CHO) , células de COS, células de BHK o células de melanoma Bowes se prefieren en la presente invención. Las células mamíferas proporcionan proteínas expresadas con modificaciones después de traducción que son lo más similares a las moléculas naturales de origen mamífero. Puesto que la presente invención se reparte con moléculas que podrían tener que ser administradas a humanos, se podría preferir particularmente un sistema de expresión completamente humano. Por lo tanto, aún más preferiblemente, las células hospederas son células humanas. Ejemplos de células humanas son inter alia las células HeLa, 911, AT1080, A549, 293 y HEK293T. Las células de mamíferos preferidas son células de retina humana tales como las células 911 o la línea de célula depositada en la European Collection of Cell Cultures (ECACC) , CAMR, Salisbury, Wiltshire SP4 OJG, Great Britain el 29 de febrero de 1996 bajo el número 96022940 y comercializado bajo la marca comercial PER.C6® (PER.C6 es una marca comercial registrada por Crucell Holland B. V.). Para los propósitos de esta solicitud "PER.C6" se refiere a células depositadas bajo el número 96022940 o antecesores, pasos en la dirección 5' o en la dirección 3' además de descendentes de antecesores de células depositadas, además de derivados de cualquiera de las anteriores . En modalidades preferidas, las células productoras humanas comprenden por lo menos una parte funcional de una secuencia de ácido nucleico que codifica una región El de adenovirus en formato de expresión. En modalidades aún más preferidas, las células hospederas se derivan de una retina humana y se inmortalizan con ácidos nucleicos que comprenden secuencias El adenovirales, tales como la línea de célula depositada en la European Collection of Cell Cultures (ECACC) , CAMR, Salisbury, Wiltshire SP4 OJG, Gran Bretaña el 29 de febrero de 1996 bajo el número 96022940 y comercializado bajo la marca comercial PER.C6®. La producción de proteínas recombinantes en las células hospederas se puede realizar de acuerdo con métodos bien conocidos en la técnica. El uso de las células comercializadas bajo la marca comercial PER.C6® como una plataforma de producción para proteínas de interés se ha descrito en WO 00/63403, la descripción de la cual está incorporada en la presente por referencia en su totalidad. Un método para la producción de una molécula de enlace o una variante funcional de acuerdo con la invención es una parte adicional de la invención. El método comprende los pasos de a) cultivo de un hospedero de acuerdo con la invención bajo condiciones favorables para la expresión de la molécula de enlace o variante funcional de ésta, y b) opcionalmente, la recuperación de la molécula de enlace expresada o variante funcional de ésta. Las moléculas de enlace expresadas o variantes funcionales de éstas se pueden recuperar del extracto libre de célula, pero preferiblemente se recuperan del medio de cultivo. Los métodos para recuperar proteínas, tales como moléculas de enlace, de extractos libres de célula o medio de cultivo son bien conocidos por la persona experta en la técnica. Las moléculas de enlace o variantes funcionales de éstas como son obtenibles por el método descrito anteriormente también son una parte de la presente invención.

Alternativamente, después de la expresión en hospedadores, tales como células hospedadoras, las moléculas de enlace o variantes funcionales de éstas de la invención se pueden producir sintéticamente por sintetizadores de péptido convencionales o en sistemas de traducción libre de célula que usan ácido nucleico ARN derivado de moléculas de ADN de acuerdo con la invención. La molécula de enlace o variantes funcionales de éstas obtenibles por los métodos de producción sintéticos descritos anteriormente o sistemas de traducción libre de célula también son una parte de la presente invención. En otra modalidad las moléculas de enlace o variantes funcionales de éstas de acuerdo con la presente invención se pueden generar por mamíferos no humanos transgénicos, tales como por ejemplo ratones o conejos transgénicos, que expresan genes de inmunoglobulina humanos. Preferiblemente, los mamíferos no humanos transgénicos tienen un genoma que comprende un transgen de cadena pesada humano y un transgen de cadena ligera humano que codifica todas o una porción de las moléculas de enlace humanas como se describió anteriormente. Los mamíferos no humanos transgénicos se pueden inmunizar con una preparación purificada o enriquecida del virus de la rabia o un fragmento de éste. Los protocolos para inmunización de mamíferos no humanos están bien establecidos en la técnica. Ver Using Antibodies: A Laboratory Manual, Editado por: E. Harlow, D. Lañe (1998) , Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York y Current Protocols in Immunology, Editado por: J.E. Coligan, A.M. Kruisbeek, D.H. Margulies, E.M. Shevach, W. Strober (2001), John Wiley & Sons Inc., New York, las descripciones de los cuales están incorporadas en la presente por referencia. En un aspecto más, la invención proporciona un método de identificación de moléculas de enlace tales como anticuerpos monoclonales humanos o fragmentos de éstos de acuerdo con la invención o moléculas de ácido nucleico de acuerdo con la invención capaces de enlazar específicamente al virus de la rabia y comprende los pasos de a) contactar una colección de moléculas de enlace en la superficie de los paquetes genéticos reproducibles con el virus de la rabia o un fragmento de éste bajo condiciones favorables para enlace, b) seleccionar por lo menos una vez para paquetes genéticos reproducibles que enlazan al virus de la rabia o el fragmento de éste, y c) separación y recuperación de los paquetes genéticos reproducibles que enlazan al virus de la rabia o fragmento de éste. El paso de selección se puede realizar en la presencia del virus de la rabia. El virus de la rabia se puede aislar o no aislar, por ejemplo, presente en suero y/o sangre de un individuo infectado. En otra modalidad el virus de la rabia está inactivo. Alternativamente, el paso de selección se puede realizar en la presencia de un fragmento del virus de la rabia tal como una parte extracelular del virus de la rabia, uno o más (poli) péptidos derivados del virus de la rabia tal como la proteína G, proteínas de fusión que comprenden estas proteínas o (poli) péptidos, y similares. En otra modalidad las células transfectadas con la proteína G del virus de la rabia se usan para procedimientos de selección. En todavía otro aspecto, la invención proporciona un método de obtención de una molécula de enlace o una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención, en donde el método comprende los pasos de a) realizar el método descrito anteriormente de identificación de moléculas de enlace, así como anticuerpos monoclonales humanos o fragmentos de éstos de acuerdo con la invención, o moléculas de ácido nucleico de acuerdo con la invención, y b) aislamiento de los paquetes genéticos reproducibles recuperados, la molécula de enlace y/o el ácido nucleico que codifica la molécula de enlace. Una vez que se ha establecido o identificado un nuevo anticuerpo monoclonal con el método mencionado anteriormente de identificación de moléculas de enlace o moléculas de ácido nucleico que codifican las moléculas de enlace, el ADN que codifica scFc o Fab se puede aislar de la bacteria o los paquetes genéticos reproducibles y se combina con técnicas biológicas moleculares estándar para producir constructos que codifican scFvs bivalente o inmunoglobulinas humanas completas de una especificidad deseada (por ejemplo, IgG, IgA o IgM) . Estos constructos se pueden transfectar dentro de líneas de célula apropiadas y se pueden producir anticuerpos monoclonales humanos completos (ver Huís y colaboradores, 1999; Boel y colaboradores, 2000) . Un paquete genético reproducible como se usa en la presente puede ser procariótico o eucariótico e incluye células, esporas, bacterias, virus, (bacteria) fago y polisomas. Un paquete genético reproducible preferido es un fago. Las moléculas de enlace humanas, tales como por ejemplo, Fv's de cadena sencilla, se exhiben en el paquete genético reproducible, esto es, están acoplados a un grupo o molécula localizada en una superficie exterior del paquete genético reproducible . El paquete genético reproducible es una unidad separable por exclusión que comprende una molécula de enlace humana para ser ligada por separación por exclusión a una molécula de ácido nucleico que codifica la molécula de enlace. La molécula de ácido nucleico debe ser reproducible ya sea in vivo (por ejemplo, como un vector) o in vitro (por ejemplo, por PCR, transcripción y traducción) . La reproducción in vivo puede ser autónoma (como para una célula) , con la asistencia de factores hospederos (como para u virus) o con la asistencia de ambos virus hospederos y auxiliares (como para un fagémido) . Los paquetes genéticos reproducibles que despliegan una colección de moléculas de enlace humanas se forman por introducción de las moléculas de ácido nucleico que codifican moléculas de enlace exógenas para ser exhibidas en los genomas de los paquetes genéticos reproducibles para formar proteínas de fusión con proteínas endógenas que normalmente se expresan de la superficie exterior de los paquetes genéticos reproducibles. La expresión de las proteínas de fusión, transporte de la superficie exterior y resultados de ensamble en la exhibición de moléculas de enlace exógenas de la superficie exterior de los paquetes genéticos reproducibles . En un aspecto más la invención está relacionada con una molécula de enlace humana capaz de enlazar el virus de la rabia o un fragmento de éste y que se obtiene por el método de identificación como se describe anteriormente. En todavía un aspecto más la invención se relaciona a un método de identificación una molécula de enlace que tiene potencialmente actividad de neutralización contra el virus de la rabia, en donde el método comprende los pasos de (a) contactar una colección de moléculas de enlace en la superficie de los paquetes genéticos reproducibles con el virus de la rabia bajo condiciones favorables para enlace, b) separación y recuperación de las moléculas de enlace que enlazan al virus de la rabia de moléculas de enlace que no lo enlazan, (c) aislamiento de por lo menos una molécula de enlace recuperada, (d) verificar si la molécula de enlace aislada tiene actividad de neutralización contra el virus de la rabia, caracterizado porque el virus de la rabia en el paso (a) se inactiva. El virus de la rabia inactivado se puede purificar antes de ser inactivado. La purificación se puede realizar por medio de métodos de purificación bien conocidos apropiados para los virus tales como por ejemplo centrifugación a través de un cojín de glicerol. El virus de la rabia inactivado en el paso (a) puede ser inmovilizado a un material apropiado antes de uso. Alternativamente, el virus de la rabia en el paso (a) todavía puede estar activo. En otra modalidad alternativa un fragmento de un virus de la rabia, tal como un polipéptido de un virus de la rabia tal como la proteína G, se usa en el paso (a) . En todavía otra modalidad las células transfectadas con la proteína G del virus de la rabia se usan para seleccionar la molécula de enlace que potencialmente tiene actividad de neutralización contra el virus de la rabia. Como se indica en la presente, cuando las células que expresan la proteína G del virus de la rabia estuvieron incluidas en el método de selección el número de anticuerpos de neutralización seleccionados fue mayor comparado con los métodos de selección en donde solamente la proteína G del virus de la rabia purificada y/o el virus de la rabia inactivo se usa. En una modalidad más el método de identificación de una molécula de enlace que potencialmente tiene actividad de neutralización contra el virus de la rabia como se describe anteriormente además comprende el paso de separación y recuperación, y opcionalmente aislamiento, de moléculas de enlace humanas que contienen un gen de líneas germinales de 3-30 pesada variable. Una persona experta en la técnica puede identificar el gen de líneas germinales específica por métodos conocidos en la técnica tales como por ejemplo formación de secuencias de nucleótido. El paso de separación y recuperación de moléculas de enlace que contienen un gen de líneas germinales de 3-30 pesada variable se puede realizar antes o después del paso (c) . Como se indica posteriormente la mayoría de los anticuerpos monoclonales humanos que neutralizan el virus de la rabia encontrados en la presente invención comprenden este gen de líneas germinales VH específico. Los métodos de despliegue de fagos para identificación y obtención (neutralización) de moléculas de enlace, por ejemplo, anticuerpos, son por ahora métodos bien establecidos conocidos por la persona experta en la técnica. Están, por ejemplo, descritos la Patente de EUA No. 5,696,108; Burton and Barbas, 1994; de Kruif y colaboradores, 1995b; y Phage Display: A Laboratory Manual. Editado por: CF Barbas, DR Burton, JK Scott and GJ Silverman (2001) , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York. Todas estas referencias están aquí dentro incorporadas en la presente en su totalidad. Para la construcción de bibliotecas de despliegue de fagos, las colecciones de genes de región variable de cadena pesada y ligera de anticuerpo monoclonal humano se expresan en la superficie del bacteriófago, preferiblemente en el bacteriófago del filamento, partículas, en por ejemplo Fv de cadena sencilla (scFv) o en formato Fab (ver de Kruif y colaboradores, 1995b). Grandes bibliotecas de fagos que expresan fragmentos de anticuerpo comúnmente contienen más de 1.0*109 especificidades de anticuerpo y pueden ser ensamblados de las regiones V de inmunoglobulina expresadas en los linfocitos B de individuos inmunizados o no inmunizados. En una modalidad específica de la invención la biblioteca de fagos de moléculas de enlace humanas, preferiblemente la biblioteca de fagos scFv, se prepara de ARN aislado de células obtenidas de un sujeto que ha sido vacunado contra la rabia o expuesto a un virus de la rabia. El ARN se puede aislar de inter alia médula ósea o sangre periférica, preferiblemente de linfocitos de sangre periférica. El sujeto puede ser un animal vacunado o expuesto al virus de la rabia, pero es preferiblemente un sujeto humano el cual ha sido vacunado o ha sido expuesto al virus de la rabia. Preferiblemente el sujeto humano ha sido vacunado. Una colección de moléculas de enlace humanas en la superficie de paquetes genéticos reproducibles, tales como una biblioteca de fago scFv, como se describen anteriormente es otro aspecto de la presente invención. Alternativamente, las bibliotecas que despliegan fagos pueden estar construidas de regiones variables de inmunoglobulina que han sido parcialmente ensambladas in vitro para introducir una diversidad de anticuerpo adicional en la biblioteca (bibliotecas semi sintéticas). Por ejemplo, las regiones variables ensambladas in vitro contienen extensiones de ADN aleatorias o parcialmente aleatorias producidas sintéticamente en aquellas regiones de moléculas que son importantes para la especificidad del anticuerpo, por ejemplo, las regiones CDR. Los anticuerpos de fago específicos del virus de la rabia se pueden seleccionar de las bibliotecas por antígenos objetivo de inmovilización tales como antígenos del virus de la rabia en una fase sólida y subsiguientemente exposición de los antígenos objetivo a una biblioteca de fago para permitir el enlace de fagos que expresan fragmentos de anticuerpo específicos para el o los antígenos de enlace de fase sólida. Los fagos no enlazados se remueven por lavado y los fagos enlazados se eluyen de la fase sólida para infección de bacteria Escherichia coli (E. coli ) y propagación subsiguiente. Usualmente se requieren múltiples sucesiones de selección y propagación para enriquecer suficientemente para fagos que enlazan específicamente al o los antígenos objetivo. Si se desea, antes de la exposición de la biblioteca de fagos para antígenos objetivo la biblioteca de fago puede primero ser sustraída por exposición de la biblioteca de fago a antígenos no objetivo enlazados a una fase sólida. Los fagos también se pueden seleccionar por enlace a antígenos de complejo tales como mezclas de complejo de proteínas del virus de la rabia o (poli) éptidos, células hospederas que expresan una o más proteínas del virus de la rabia o (poli) péptidos del virus de la rabia, o el mismo virus de la rabia (inactivado) . Los anticuerpos de fago específicos de antígeno se pueden seleccionar de la biblioteca por incubación de una fase sólida con enlazamiento ahí encima de una preparación de virus de la rabia inactivados con la biblioteca de anticuerpo de fago para permitir por ejemplo la parte scFv o Fab del fago enlazar a las proteínas/polipéptidos de la preparación del virus de la rabia. Después de incubación y varios lavados para remover los fagos anexados no enlazados y perdidos, los fagos que tienen enlace con su parte scFv o Fab para la preparación son eluídos y usados para infección de Escherichia coli para permitir amplificación de la nueva especificidad. Generalmente, se requieren una o más sucesiones de selección para separar los fagos de interés del gran exceso de fagos no enlazados.

Alternativamente, las proteínas conocidas o (poli) éptidos del virus de la rabia se pueden expresar en células hospederas y estas células se pueden usar para selección de anticuerpos de fago específicos para las proteínas o (poli ) éptidos . Un método de despliegue de fago que usa estas células hospederas se puede extender y mejorar por sustracción enlazadores no relevantes durante la separación por exclusión por adición de un exceso de células hospederas que comprende moléculas no objetivo o moléculas sin objetivo que son similares, pero no idénticas, para el objetivo, y de esa manera aumenta fuertemente la oportunidad de encontrar moléculas de enlace relevantes (Este proceso se refiere como el proceso MAbstract®. Mabstract® es una marca registrada de Crucell Holland B.V., ver también la Patente de EUA No. 6,265,150 la cual está incorporada en la presente por referencia) . En todavía otro aspecto, la invención proporciona composiciones que comprenden por lo menos una molécula de enlace, por lo menos una variante funcional o fragmento de esta, por lo menos un inmunoconjugado de acuerdo con la invención o una combinación de estos. Las composiciones además pueden comprender inter alia moléculas de estabilización, tales como albúmina o polietilén glicol, o sales. Preferiblemente, las sales usadas son sales que retiene la actividad biológica deseada de las moléculas de enlace humanas y no imparten ningún efecto toxicológico indeseado. Si es necesario, las moléculas de enlace humanas de la invención puede ser recubiertas dentro o fuera por un material para protegerlas de la acción de ácidos u otras condiciones naturales o no naturales que pueden inactivar las moléculas de enlace. En todavía un aspecto más, la invención proporciona composiciones que comprenden por lo menos una molécula de ácido nucleico como se define en la presente invención. Las composiciones pueden comprender soluciones acuosas tales como soluciones acuosas que contienen sales (por ejemplo, NaCl o sales como se describen anteriormente) , detergentes (por ejemplo, SDS) y/u otros componentes apropiados. Además, la presente invención se refiere a composiciones farmacéuticas que comprenden por lo menos una molécula de enlace de acuerdo con la invención, por lo menos una variante funcional o fragmento de esta, por lo menos un inmunoconjugado de acuerdo con la invención, por lo menos una composición de acuerdo con la invención, o combinaciones de estos. La composición farmacéutica de la invención además comprende por lo menos un excipiente farmacéuticamente aceptable. En una modalidad preferida la composición farmacéutica de acuerdo con la invención comprende por lo menos una molécula de enlace adicional, esto es, la composición farmacéutica puede ser un cóctel/mezcla de moléculas de enlace. La composición farmacéutica puede comprender por lo menos dos moléculas de enlace de acuerdo con la invención o por lo menos una molécula de enlace de acuerdo con la invención y por lo menos una molécula de enlace anti virus de la rabia más. La molécula de enlace además preferiblemente comprende una región CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 25. La molécula de enlace que comprende la región CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 25 puede ser un anticuerpo monoclonal quimérico o humanizado o fragmento funcional de este, pero preferiblemente es un anticuerpo monoclonal humano o fragmento funcional de este. En una modalidad, la molécula de enlace comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 273. En otra modalidad, la molécula de enlace comprende una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 275. En todavía otra modalidad la molécula de enlace comprende una cadena pesada y ligera que comprende las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO: 123 y SEQ ID NO: 125, respectivamente. Las moléculas de enlace en la composición farmacéutica deben ser capaces de reaccionar con epítopos diferentes sin competencia del virus de la rabia. Los epítopos pueden estar presentes en la proteína Ga del virus de la rabia y pueden ser diferentes, epítopos sin traslape. Las moléculas de enlace deben ser de alta afinidad y deben tener una especificidad amplia. Preferiblemente, neutralizan tantas cepas fijas y de vía del virus de la rabia como sean posibles . Aún más preferiblemente, también exhiben actividad de neutralización hacia otros genotipos del género Lisavirus o aún con otros virus de la familia rhabdovirus, mientras que no exhiben reactividad cruzada con otros virus o proteínas celulares normales. Preferiblemente, la molécula de enlace es capaz de neutralizar variantes de escape de la otra molécula de enlace en el cóctel . Otro aspecto de la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende por lo menos dos virus de la rabia que neutralizan moléculas de enlace, preferiblemente moléculas de enlace (humanas) de acuerdo con la invención, caracterizadas en que las moléculas de enlace son capaces de reaccionar con diferentes epítopos sin competencia del virus de la rabia. En una modalidad la composición farmacéutica comprende una primer molécula de enlace que neutraliza el virus de la rabia la cual es capaz de reaccionar con un epítopo localizado en el sitio I antigénico de la proteína G del virus de la rabia y una segunda molécula de enlace que neutraliza el virus de la rabia la cual es capaz de reaccionar con un epítopo localizado en el sitio III antigénico de la proteína G del virus de la rabia. La estructura antigénica de la glicoproteína de la rabia inicialmente se definió por Lafon y colaboradores, (1983). Los sitios antigénicos fueron identificados usando un panel de mAbs de ratón y sus variantes de virus resistente de mAb respectivas. A partir de ahí, los sitios antigénicos han sido mapeados por identificación de las mutaciones de aminoácidos en la glicoproteína de variantes resistentes de mAb (ver Seif y colaboradores, 1985; Prehaud y colaboradores, 1988; y Benmansour y colaboradores, 1991) . La mayoría de los mAbs que neutralizan la rabia están dirigidos contra el sitio II antigénico (ver Benmansour y colaboradores, 1991), el cual es un epítopo conformacional discontinuo que comprende de 34-42 aminoácidos y de 198-200 aminoácidos (ver Prehaud y colaboradores, 1988). El sitio III antigénico es un epítopo conformacional continuo en 330-338 aminoácidos y alberga dos residuos cargados, K330 y R333, que afectan la fatogenicidad viral (ver Seif y colaboradores, 1985; Coulon y colaboradores, 1998; y Dietzschold y colaboradores, 1983) . El sitio I antigénico conformacional se definió por solamente un mAb, 509-6, y se localiza en el aminoácidos 231 (ver Benmansour y colaboradores, 1991; y Lafon y colaboradores, 1983). El sitio IV antigénico se sabe que alberga epítopos lineales de traslape (ver, Tordo, 1996; Bunschoten y colaboradores, 1989; Luo y colaboradores, 1997; y Ni y colaboradores, 1995). Benmansour y colaboradores, (1991) también describe la presencia del sitio menor localizado en la posición 342-343, la cual es distinta del sitio III antigénico a pesar de su proximidad. La alineación del epítopo CR-57 con los epítopos de neutralización lineales y conformacionales conocidos actualmente en la glicoproteína de la rabia (Figura 10) revelan que el epítopo CR-57 se localiza en la misma región como el sitio I antigénico conformacional, definido por el mAb sencillo 509-6. Basados en el nucleótido y en las secuencias de aminoácidos de la glicoproteína de los virus de escape de CR04-098, el epítopo reconocido por este anticuerpo aparenta estar localizado en la misma región como el sitio III antigénico conformacional continuo. En una modalidad preferida la composición farmacéutica comprende una primera molécula de enlace de neutralización del virus de la rabia que comprende por lo menos una región CDR3 , preferiblemente región CDR3 de cadena pesada, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 24 y una segunda molécula de enlace de neutralización del virus de la rabia que comprende por lo menos una región CDR3, preferiblemente región CDR3 de cadena pesada, que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 y SEQ ID NO:22. Más preferiblemente, la segunda molécula de enlace de neutralización del virus de la rabia que comprende por lo menos una región CDR3 , preferiblemente región CDR3 de cadena pesada, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14. Preferiblemente, la primera molécula de enlace de neutralización del virus de la rabia comprende una cadena pesada y ligera que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 123 y SEQ ID NO: 125, respectivamente, y la segunda molécula de enlace de neutralización del virus de la rabia comprende una cadena pesada y ligera que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 335 y SEQ ID NO: 337, respectivamente. Preferiblemente, las cadenas pesada y ligera de la primera molécula de enlace de neutralización del virus de la rabia están codificadas por SEQ ID NO: 122 y SEQ ID NO: 124, y las cadenas pesada y ligera de la primera molécula de enlace de neutralización del virus de la rabia están codificadas por SEQ ID NO: 334 y SEQ ID NO: 336, respectivamente . Una composición farmacéutica que comprende dos moléculas de enlace, en donde el pl de las moléculas de enlace es divergente puede tener un problema cuando se selecciona una solución amortiguadora apropiada la cual estabiliza óptimamente ambas moléculas de enlace. Cuando se ajusta el pH de la solución amortiguadora de la composición de manera que esta aumente la estabilidad de una molécula de enlace, esto puede disminuir la estabilidad de la otra molécula de enlace. La disminución de la estabilidad o aún la inestabilidad de una molécula de enlace puede llevar a su precipitación o agregación o a su degradación espontánea que resulta en pérdida de la funcionalidad de la molécula de enlace. Por lo tanto, en otro aspecto la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende por lo menos dos moléculas de enlace, preferiblemente moléculas de enlace humanas, caracterizadas porque las moléculas de enlace tienen puntos isoeléctrios (pl) que difieren menos que alrededor de 1.5, 1.4, 1.3, 1.2, 1.1, 1.0, 0.9, 0.8, 0.7, 0.6, 0.5, 0.4, 0.3, preferiblemente menos que (y que incluye) 0.25 unidades pl uno del otro. El pl se puede medir experimentalmente, por ejemplo, por medio de enfoque isoeléctrico, o ser calculado con base en la secuencia de aminoácidos de las moléculas de enlace. En una modalidad las moléculas de enlace son moléculas de enlace de acuerdo con la presente invención y la composición farmacéutica es una composición farmacéutica de acuerdo con la invención. Preferiblemente, las moléculas de enlace son anticuerpos monoclonales, por ejemplo, anticuerpos monoclonales humanos tales como anticuerpos IgGl . Preferiblemente, las moléculas de enlace son capaces de enlazar y/o neutralizar un agente infeccioso, por ejemplo, un virus, una bacteria, una levadura, un mitógeno o un parásito. En una modalidad las moléculas de enlace son capaces de enlazar y/o neutralizar a lisavirus, por ejemplo, el virus de la rabia. En una modalidad específica ambas moléculas de enlace tienen un pl calculado que está en el rango entre 8.0-9.5, preferiblemente 8.1-9.2, más preferiblemente 8.2-8.5. Preferiblemente, las moléculas de enlace tienen la región CDR3 de cadena pesada de SEQ ID NO: 14 y SEQ ID NO: 25, respectivamente. En otra modalidad la invención proporciona un cóctel de dos o más moléculas de enlace humanas o de otro animal, que incluyen pero no se limitan a anticuerpos, en donde por lo menos una molécula de enlace se deriva de un fago de anticuerpo u otra técnica de exhibición del paquete reproducible y por lo menos una molécula de enlace se obtiene por una técnica de hibridoma. Cuando las técnicas divergentes se usan, la selección de las moléculas de enlace que tienen un pl compatible también es muy útil con el propósito de obtener una composición en donde cada molécula de enlace es suficientemente estable para almacenamiento, manipulación y uso subsiguiente. En otra modalidad las moléculas de enlace presentes en la composición farmacéutica de la invención aumentan cada una actividades de neutralización diferentes, esto es, actúan sinérgicamente cuando se combinan. En otras palabras, las composiciones farmacéuticas pueden exhibir actividad de neutralización del virus de la rabia sinérgico, y aún lisavirus. Como se usa en la presente, el término "sinérgico" significa que el efecto combinado de las moléculas de enlace cuando se usan en combinación es mayor que sus efectos aditivos cuando se usan individualmente. Los rangos y relaciones de los componentes de las composiciones farmacéuticas de la invención se deben determinar con base en sus potencias individuales y ser evaluados en ensayos de neutralización in vitro o modelos de animales tales como hámster. Además, la composición farmacéutica de acuerdo con la invención puede comprender por lo menos un agente terapéutico, profiláctico y/o diagnóstico diferente. Los demás agentes terapéuticos y/o profilácticos pueden ser agentes antivirales tales como ribavirina o interferón alfa. Las moléculas de enlace o composiciones farmacéuticas de la invención se pueden evaluar en sistemas de modelos de animales apropiados antes del uso en humanos. Los sistemas de modelos animales incluyen, pero no se limitan a, ratones, ratas, hámster, monos, etc. Comúnmente, las composiciones farmacéuticas deben ser estériles y estables bajo las condiciones de fabricación y almacenamiento. Las moléculas de enlace humanas, variantes o fragmentos de estas, inmunoconjugados, moléculas de pacido nucleico o composiciones de la presente invención pueden estar en forma de polvo para reconstitución en el excipiente farmacéuticamente aceptable apropiado antes o durante el suministro. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos preferidos de preparación son secado al vacío y secado por congelamiento (liofilización) que producen un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente deseado adicional de una solución filtrada estéril previamente de este. Alternativamente, las moléculas de enlace, variantes o fragmentos de estas, inmunoconjugados, moléculas de ácido nucleico o composiciones de la presente invención pueden estar en solución y el excipiente farmacéuticamente aceptable apropiado puede ser agregado y/o mezclado antes o durante el suministro para proporcionar una forma inyectable de dosis de unidad. Preferiblemente, el excipiente farmacéuticamente aceptable usado en la presente invención es apropiado para concentración de fármaco alta, puede mantener fluidez apropiada y, si es necesario, puede retardar la absorción. La selección de la ruta óptima de administración de la composición farmacéutica estará influenciada por varios factores que incluyen las propiedades fisicoquímicas de las moléculas activas dentro de las composiciones, la urgencia de la situación clínica y la relación de las concentraciones de plasma de las moléculas activas para el efecto terapéutico deseado. Por ejemplo, si es necesario, las moléculas de enlace humanas de la invención se pueden preparar con portadores que las protegerán contra liberación rápida, tal como una formulación de liberación controlada, que incluye implantes, parches transdermales, y sistemas de suministro microencapsulado . Los polímeros biocompatibles biodegradables se pueden usar inter alia, tales como acetato de vinil etileno, poli-anhídridos , ácido poliglicólico, poliortoésteres, y ácido poliláctico. Además, puede ser necesario recubrir las moléculas de enlace humanas, o coadministrar las moléculas de enlace, con un material o compuesto que previene la inactivación de las moléculas de enlace. Por ejemplo, las moléculas de enlace humanas se pueden administrar a un sujeto en un portador apropiado, por ejemplo, liposomas, o un diluente. Las vías de administración generalmente pueden estar divididas en dos categorías principales, administración oral y parenteral. La administración preferida de las moléculas de enlace humanas y las composiciones farmacéuticas de la invención es dentro y alrededor de la herida e intramuscularmente en la región glútea. Las formulaciones de las moléculas de enlace humanas y composiciones farmacéuticas son dependientes de las vías de administración. En un aspecto más, las moléculas de enlace, variantes funcionales, inmunoconjugados, composiciones, o composiciones farmacéuticas de la invención, se pueden usar como medicamento. Así, un método de tratamiento y/o prevención de una infección de lisavirus que usa las moléculas de enlace humanas, variantes funcionales, inmunoconjugados, composiciones, o composiciones farmacéuticas de la invención es otra parte de la presente invención. El Lisavirus puede ser un virus de cualquiera de los genotipos conocidos, pero preferiblemente es el virus de la rabia. Las moléculas o composiciones antes mencionadas se pueden usar en la profilaxis de posterior a la exposición de la rabia. Las moléculas o composiciones antes mencionadas se pueden emplear en conjunto con otras moléculas útiles en el diagnóstico, profilaxis y/o tratamiento del virus de la rabia. Se pueden usar in vi tro, ex vivo o in vivo . Por ejemplo, las moléculas de enlace humanas, variantes funcionales, inmunoconjugados o composiciones farmacéuticas de la invención se pueden coadministrar con una vacuna contra la rabia. Alternativamente, la vacuna también se puede administrar antes o después de administración de las moléculas o composiciones de la invención. La administración de las moléculas o composiciones de la invención con una vacuna es apropiada para profilaxis de posterior a la exposición. Las vacunas contra la rabia incluyen, pero no se limitan a, vacuna de célula de embrión de pollo purificada (PCEC) (RabAvert) , vacuna de célula diploide humana (HDCV; vacuna Imovax) o vacuna contra la rabia absorbida (RVA) . Las moléculas se formulan comúnmente en las composiciones y composiciones farmacéuticas de la invención en una cantidad efectiva terapéutica o diagnósticamente. Los regímenes de dosificación se pueden ajustar para proporcionar la respuesta deseada óptima (por ejemplo, una respuesta terapéutica) . Un rango de dosificación apropiado por ejemplo puede ser 0.1-100 IU/kg de peso corpóreo, preferiblemente 1.0-50 IU/kg de peso corpóreo y más preferiblemente 10-30 IU/kg de peso corpóreo, tal como 20 IU/kg de peso corpóreo. Preferiblemente, se administra un bolo único de las moléculas de enlace o composiciones farmacéuticas de la invención. Las moléculas y composiciones farmacéuticas de acuerdo con la presente invención preferiblemente son estériles. Los métodos para producir estas moléculas y composiciones estériles son bien conocidos en la técnica. El régimen de dosificación de profilaxis posterior a la exposición es la administración de cinco dosis de vacuna contra la rabia intramuscularmente en el músculo deltoideo en los días 0, 3, 7, 14 y 28 después de exposición en individuos no inmunizados previamente contra el virus de la rabia. Las moléculas de enlace humanas o composiciones farmacéuticas de acuerdo con la invención se deben administrar dentro y alrededor de las heridas en el día 0 o de otra manera tan pronto como sea posible después de exposición, con el volumen remanente dado intramuscularmente en un sitio distante de la vacuna. Los individuos no vacunados se les recomienda administrarse las moléculas de enlace humanas del virus antirabia, pero está claro que el técnico experto que vacuna individuos en necesidad del tratamiento también puede ser administrado con moléculas de enlace humanas del virus antirrábico. En otro aspecto, la invención se refiere al uso de moléculas de enlace o variantes funcionales de éstas, inmunoconjugados de acuerdo con la invención, moléculas de ácido nucleico de acuerdo con la invención, composiciones o composiciones farmacéuticas de acuerdo con la invención en la preparación de un medicamento para el diagnóstico, profilaxis, tratamiento, o combinación de estos, de una condición que resulta de una infección por un lisavirus. El lisavirus puede ser un virus de cualquiera de los genotipos conocidos pero preferiblemente es el virus de la rabia.' Preferiblemente las moléculas mencionadas anteriormente se usan en la preparación de un medicamento para la profilaxis de post exposición de la rabia. Después de esto, los kits que comprenden por lo menos una molécula de enlace de acuerdo con la invención, por lo menos una variante funcional de ésta de acuerdo con la invención, por lo menos un inmunoconjugado de acuerdo con la invención, por lo menos una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención, por lo menos una composición de acuerdo con la invención, por lo menos una composición farmacéutica de acuerdo con la invención, por lo menos un vector de acuerdo con la invención, por lo menos un hospedero de acuerdo con la invención o una combinación de estos también son una parte de la presente invención. Opcionalmente, los componentes descritos anteriormente de los kits de la invención están empacados en contenedores apropiados y etiquetados para diagnóstico, profilaxis y/o tratamiento de las condiciones indicadas . Los componentes antes mencionados se pueden almacenar en recipientes de unidad o de dosis múltiple, por ejemplo, ampolletas selladas, frascos, botellas, jeringas, y tubos de ensayo, como una solución preferiblemente estéril, acuosa o como una formulación preferiblemente estéril lifolizada para reconstitución. Los recipientes se pueden formar de una variedad de materiales tales como cristal o plástico y pueden tener un puerto de acceso estéril (por ejemplo, el recipiente puede ser una bolsa de solución intravenosa o un frasco que tiene un tapón traspasable por una aguja de inyección hipodérmica) . El kit además puede comprender más recipientes que comprenden una solución amortiguadora farmacéuticamente aceptable, tal como solución salina amortiguada de fosfato, solución de Ringer y solución de dextrosa. Además puede incluir otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y de usuario, que incluyen otras soluciones amortiguadoras, diluentes, filtros, agujas, jeringas, medio de cultivo para uno o más de los hospederos apropiados. Asociadas con los kits pueden estar las instrucciones habitualmente incluidas en los empaques comerciales de productos terapéuticos, profilácticos o de diagnóstico, que contienen información alrededor de por ejemplo, las indicaciones, usos, dosis, fabricación, administración, contraindicaciones y/o precauciones concernientes al uso de los productos terapéuticos, profilácticos o de diagnóstico. Comúnmente, los productos HRIG se usan para profilaxis de posterior a la exposición de la rabia. Una dosis de adulto de HRIG de 1500 IU (individuo de 75 Kg, 20 IU/Kg) solamente está disponible en un volumen de 10 ml . Los productos de HRIG más concentrados no son posibles conforme la dosis de 10 ml obtenible comúnmente contiene 1-1.5 gramos de IgG total. En vista de esto los productos de HRIG actuales tienen dos inconvenientes. Primeramente, a menudo no es anatómicamente factible administrar la dosis completa recomendada dentro y alrededor de las heridas de mordida y secundariamente la administración de la dosis en volumen en el momento de HRIG está asociada con dolor significante. La presente invención da una solución a estos inconvenientes cuando proporciona una composición farmacéutica que comprende una dosis de adulto completa en un volumen de aproximadamente 2 ml o menor, si es deseable. Una composición farmacéutica tal puede comprender por ejemplo, dos moléculas de enlace capaces de neutralizar el virus de la rabia, preferiblemente CR57 y CR04-098. La composición farmacéutica además comprende un excipiente farmacéuticamente aceptable y tiene un volumen de alrededor de 2 ml . También es posible más, pero menos deseable en el punto de vista del dolor asociado con volúmenes de inyección grandes. También es posible menos de 2 ml . La composición farmacéutica comprende la dosis de adulto completa (en IU) necesaria para profilaxis de post exposición exitosa. En una modalidad la composición farmacéutica se almacena en fras?os de 10 ml tal como por ejemplo un frasco listo para usar de 10 ml (cristal tipo I) con un tapón. En un frasco de 10 ml se diluye la composición farmacéutica a un volumen mayor en caso de que in individuo presente un área de superficie de herida grande. La invención también proporciona un kit que comprende por lo menos un recipiente (tal como un frasco) que comprende la composición farmacéutica. El kit además puede comprender un segundo recipiente el cual mantiene un diluente apropiado para dilución de la composición farmacéutica a un volumen mayor. Los diluentes apropiados incluyen, pero no se limitan al excipiente farmacéuticamente aceptable de la composición farmacéutica y una solución salina. Además, el kit puede comprender las instrucciones para diluir la composición farmacéutica y/o instrucciones para administrar la composición farmacéutica, ya sea diluida o no. La invención concierne además a un método para detectar un virus de la rabia en una muestra, en donde el método comprende las etapas de a) poner en contacto a una muestra con una cantidad diagnósticamente eficaz de una molécula de enlace, una variante funcional o un inmunoconjugado según la invención, y b) determinando si la molécula de enlace, variante funcional, o inmunoconjugado que se enlaza específicamente a una molécula de la muestra. La muestra puede ser un muestra que incluye, pero no se limita a sangre, suero, tejido u otro material biológico de sujetos (potencialmente) infectados. Los sujetos (potencialmente) infectados pueden ser sujetos humanos, pero también animales que son sospechosos como portadores del virus de la rabia podrían ser probados para la presencia del virus de la rabia usando las moléculas de enlace humanas, variantes funcionales o inmunoconjugados de la invención. La muestra puede manipularse primero para hacerla más conveniente para el método de detección. Los medios de la manipulación inter alia que tratan la muestra sospechosa de contener y/o que contiene el virus de la rabia de tal manera que el virus de la rabia se desintegrará en componentes antigénicos tal como las proteínas, (poli) péptidos u otros fragmentos antigénicos. Preferentemente, las moléculas de enlace, variantes funcionales o inmunoconjugados de la invención se ponen en contacto con la muestra bajo condiciones que permiten la formación de un complejo inmunológico entre las moléculas de enlace humanas y el virus de la rabia o componentes antigénicos de los mismos que pueden estar presentes en la muestra. La formación de un complejo inmunológico, si es cualquiera, que indica la presencia del virus de la rabia en la muestra, se detecta entonces y se mide mediante medios convenientes . Tales métodos incluyen, inter alia , inmunoensayos de enlaces homogéneos y heterogéneos, tales como radioinmunoensayos (RÍA) , ELISA, inmunofluorescencia, inmunohistoquímica, FACS, análisis BIACORE y análisis de inmunomanchado Western. Además, pueden usarse las moléculas de enlace de la invención para identificar epítopos de proteínas del virus de la rabia tal como la proteína G. Los epítopos pueden ser lineales, pero también estructurales y/o conformacionales . En una modalidad, el enlace de moléculas de enlace de la invención a una serie péptidos de traslape, tal como los péptidos 15-mero, de una proteína del virus de la rabia tal como la proteína G del virus de la rabia puede analizarse por medio del análisis PEPSCAN (ver inter alia WO 84/03564, WO 93/09872, Slootstra et al. 1996). El enlace de las moléculas de enlace humanas en cada péptido puede probarse en un inmunoensayo enlazado con enzimas basado en PEPSCAN (ELISA) . En otra modalidad, una colección del péptido aleatoria que comprende los péptidos de las proteínas del virus de la rabia puede separarse por exclusión para los péptidos capaces de enlazar a las moléculas de enlace humano de la invención. En los ensayos anteriores, el uso del virus de la rabia que neutraliza a las moléculas de enlace humanas puede identificar uno o más epítopos neutralizados. Pueden usarse los péptidos/epítopos encontrados como vacunas y para el diagnóstico de la rabia.

En un aspecto adicional, la invención proporciona un método para separar por exclusión a una molécula de enlace o una variante funcional de una molécula de enlace para enlazar específicamente a un epítopo no traslapado preferiblemente diferente del virus de la rabia como el epítopo enlazado mediante una molécula de enlace o variante funcional de la invención, en donde el método comprende las etapas de a) contactar una molécula de enlace o una variante funcional a ser separada por exclusión, una molécula de enlace o variante funcional de la invención y virus de la rabia o un fragmento del mismo (tal como por ejemplo, la proteína G del virus de la rabia) , b) medir si la molécula de enlace o la variante funcional a ser separada por exclusión son capaces de competir para enlazar específicamente al virus de la rabia o fragmentos de los mismos con la molécula de enlace o la variante funcional de la invención. Si ninguna competición se mide, las moléculas de enlace o las variantes funcionales a ser separadas por exclusión se enlazan a un epítopo diferente. En una modalidad específica del método de separación por exclusión anterior, las moléculas de enlace humanas o variantes funcionales de las mismas pueden ser separadas por exclusión para identificar moléculas de enlace humanas o las variantes funcionales capaces de ligar un epítopo diferente al epítopo reconocido por la molécula de enlace que comprende la región CDR3 , que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 25. Preferentemente, los epítopos son los no traslapables o no competitivos. Está claro por un experto en el arte que el método de separación por exclusión anterior puede también usarse para identificar las moléculas de enlace o las variantes funcionales de las mismas capaces de enlazar al mismo epítopo. En una etapa adicional, esta puede determinarse si las moléculas de enlace separadas por exclusión que no son capaces de competir para enlazar específicamente al virus de la rabia o fragmento de los mismos tienen actividad de neutralización. También puede determinarse si las moléculas de enlace separadas por exclusión, que son capaces de competir para enlazar específicamente al virus de la rabia o fragmento del mismo tienen actividad de neutralización. Las moléculas de enlace del virus antirrábico de neutralización o variantes funcionales de las mismas encontradas en el método de la separación por exclusión son otra parte de la presente invención. En el método de separación por exclusión "que enlaza específicamente al mismo epítopo" contempla también un enlace específico a substancialmente o esencialmente el mismo epítopo como el epítopo enlazado por las moléculas de enlace humanas de la invención. La capacidad para bloquear, o competir con, el enlace de las moléculas de enlace humanas de la invención para el virus de la rabia indica típicamente que una molécula de enlace a ser separada por exclusión enlaza a un epítopo o sitio de enlace en el virus de la rabia que se traslapa estructuralmente con el sitio de enlace en el virus de la rabia que se reconoce inmunoespecíficamente mediante las moléculas de enlace de la invención. Alternativamente, esto puede indicar que una molécula de enlace a ser separada por exclusión enlaza a un epítopo o sitio de enlace que son suficientemente próximos al sitio de enlace reconocido inmunoespecíficamente por las moléculas de enlace de la invención al estéricamente o por otra parte inhibiendo el enlace de las moléculas de enlace de la invención al virus de la rabia o un fragmento del mismo. En general, la inhibición competitiva se mide por medio de un ensayo, en donde una composición del antígeno, es decir una composición que compren el virus de la rabia o fragmentos (tales como las proteínas G) de las mismas, se mezclan con respecto a las moléculas de enlace y las moléculas de enlace a ser separadas por exclusión. En una modalidad la referencia de la molécula de enlace puede ser una de las moléculas de enlace humanas de la invención y la molécula de enlace a ser separada por exclusión puede ser otra molécula de enlace humana de la invención. En otra modalidad, la molécula de enlace de referencia puede ser la molécula de enlace que comprende la región CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 25 y la molécula de enlace a ser separada por exclusión puede ser una de las moléculas de enlace humanas de la invención. En otra modalidad, la molécula de enlace de referencia puede ser una de la molécula de enlace humana de la invención y la molécula de enlace a ser separada por exclusión puede ser la molécula de enlace que comprende la región CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 25. Normalmente, las moléculas de enlace a ser separadas por exclusión están presentes en exceso. Los protocolos basados en ELISAs son convenientes para uso en tales estudios de competición simple. En ciertas modalidades, uno puede pre-mezclar las moléculas de enlace de referencia con las cantidades variantes de las moléculas de enlace a ser separada por exclusión (por ejemplo, 1:10, 1:20, 1:30, 1:40, 1:50, 1:60, 1:70, 1:80, 1:90 o 1:100) para un período de tiempo previo a la aplicación de una composición del antígeno. En otras modalidades, las moléculas de enlace de referencia y las cantidades variantes que enlazan a las moléculas de enlace a ser separada por exclusión pueden simplemente ser mezcladas durante la exposición a la composición del antígeno. En cualquier caso, usando especies o isotipos de anticuerpos secundarios uno podrá detectar sólo las moléculas de enlace de referencia, el enlace que se reducirá mediante la presencia de una molécula de enlace a ser separada por exclusión que reconoce substancialmente el mismo epítopo. Al dirigir un estudio de competición de la molécula de enlace entre una molécula de enlace de referencia y cualquier molécula de enlace a ser separada por exclusión (independiente de especies o isotipos) , uno puede etiquetar la molécula de enlace de referencia con una etiqueta perceptible, tal como por ejemplo, biotina, enzimática, una etiqueta radiactiva u otra etiqueta para habilitar la identificación subsecuente. En estos casos, uno pre-mezclaría o incubaría las moléculas de enlace de referencia etiquetadas con las moléculas de enlace a ser separadas por exclusión en varias proporciones (por ejemplo, 1:10, 1:20, 1:30, 1:40, 1:50, 1:60, 1:70, 1:80, 1:90 o 1:100) y (opcionalmente después de un período conveniente de tiempo) después del ensayo de la reactividad de las moléculas de enlace de referencia etiquetadas y comparar esto con un valor del control en el cual no existe potencialmente una competencia con la molécula de enlace que se incluyó en la incubación. El ensayo puede ser de nuevo cualquiera de un rango de ensayos inmunológicos basados en la hibridización del anticuerpo, y las moléculas de enlace de referencia se detectarían por medios que detecten su etiqueta, por ejemplo, usando eestreptavidina en el caso de las moléculas de enlace de referencia biotiniladas o usando un substrato cromogénico en relación con una etiqueta enzimática (tal como el substrato 3 , 3 ' 5, 5 ' -tetrametilbencidina (TMB) con la enzima de peroxidasa) o detectando simplemente una etiqueta radioactiva. Una molécula de enlace a ser separada por exclusión que enlaza al mismo epítopo como la molécula de enlace de referencia podrá competir eficazmente para enlazar y reducirá significativamente por lo tanto, el enlace de la molécula de enlace de referencia, evidenciado por una reducción en la etiqueta enlazada. Las moléculas de enlace que enlazan a los diferentes epítopos no competitivos no mostrarán ninguna reducción. La reactividad de la molécula de enlace de referencia (etiquetada) en ausencia de una molécula de enlace completamente irrelevante sería el control de valor alto. El control de valor bajo se obtendría incubando la molécula de enlace de referencia etiquetada con las moléculas de enlace de referencia de exactamente el mismo tipo, cuando la competición ocurriría y reduciría el enlace de la molécula de enlace de referencia etiquetada. En un ensayo de prueba, una reducción significativa en la en la reactividad de la molécula de enlace de referencia etiquetada en presencia de una molécula de enlace a ser separada por exclusión es indicativa de una molécula de enlace que reconoce al mismo epítopo, es decir, uno que "reacciona de forma cruzada" con la molécula de enlace de referencia etiquetada. Si ninguna reducción se muestra, la molécula de enlace puede enlazar a un epítopo no competitivo diferente. Las moléculas de enlace identificadas mediante estos ensayos de competición ("moléculas de enlace competitivas") incluyen pero no se limitan a, anticuerpos, fragmentos del anticuerpo y otros agentes de enlace que se enlazan a un epítopo o sitio de enlace que se enlaza mediante la molécula de enlace de referencia así como los anticuerpos, fragmentos del anticuerpo y otros agentes de enlace que se enlazan a un epítopo o sitio de enlace suficientemente próximo a un epítopo enlazado mediante la molécula de enlace de referencia para el enlace competitivo entre las moléculas de enlace a ser separadas por exclusión y la molécula de enlace de referencia a ocurrir. Preferentemente, las moléculas de enlace competitivas de la invención, cuando están presentes en exceso, inhibirán el enlace específico de una molécula de enlace de referencia para especies objetivo seleccionadas mediante por lo menos 10%, preferentemente por lo menos 25%, más preferentemente por lo menos 50%, y más preferentemente por lo menos 75%-90% o aun mayor. La identificación de una o más moléculas de enlace competitivas aproximadamente a, substancialmente, esencialmente o al mismo epítopo como los de las moléculas de enlace de la invención es una materia técnica veraz. Como la identificación de las moléculas de enlace competitivas se determina en comparación a una molécula de enlace de referencia, se entenderá que determinar actualmente el epítopo al cual la molécula de enlace de referencia y el enlace de la molécula que se enlaza competitivamente no es cualquier forma alguna para identificar una molécula de enlace competitiva que se enlaza a la misma o substancialmente al mismo epítopo, como la molécula de enlace de referencia.

Alternativamente, las moléculas de enlace que se enlazan a diferentes epítopos no competitivos identificados por estos ensayos de competición también pueden incluir, pero no se limitan a, anticuerpos, fragmentos de anticuerpos y otros agentes de enlace. En otro aspecto, la invención proporciona un método para identificar una molécula de enlace que tiene potencialmente actividad de neutralización contra un agente infeccioso que causa la enfermedad en un ser viviente o una molécula de ácidos nucleicos que codifica a una molécula de enlace que tiene potencialmente actividad de neutralización contra un agente infeccioso que causa la enfermedad en un ser viviente, en donde el método comprende las etapas de a) poner en contacto una colección de moléculas de enlace en la superficie de los paquetes genéticos replicables con por lo menos, una célula que expresa una proteína del agente infeccioso que causa la enfermedad en un ser viviente en su superficie bajo las condiciones conducentes a enlazar, b) separar y recuperar las moléculas de enlace que se enlazan a la célula que expresa una proteína del agente infeccioso que causa la enfermedad en un ser viviente en su superficie de las moléculas de enlace que no enlazan a dicha célula, c) aislar al menos una molécula de enlace recuperada d) verificar si la molécula de enlace aislada tiene actividad de neutralización contra el agente infeccioso que causa la enfermedad en un ser viviente. La célula que expresa una proteína del agente infeccioso que causa la enfermedad en un ser viviente en su superficie puede ser una célula transfectada con la proteína. Una persona experta en el arte está consciente que los antígenos del agente infeccioso distinto a las proteínas pueden usarse con éxito en el método. En una modalidad específica, la célula es una célula PER.C6®. Sin embargo, otras líneas celulares (El-inmortalizada) también podrían usarse para expresar las proteínas tales como BHK, CHO, NSO, HEK293, o células 911. En una modalidad, la molécula de enlace es humana. El agente infeccioso puede ser un virus, una bacteria, una levadura, un hongo o un parásito. En una modalidad, la proteína es normalmente una proteína expresada en la superficie del agente infeccioso o que comprende al menos una parte de una proteína que es la superficie accesible. En una modalidad específica, la colección de enlazar moléculas en la superficie de paquetes genéticos replicables son substraídos/contraseleccionados con las células usadas para expresar la proteína del agente infeccioso, es decir, las células son idénticas a las células usadas en la etapa en la que no expresa a la proteína del agente infeccioso en su superficie. Las células usadas para la substracción/contra selección pueden ser células no transfectadas. Alternativamente, las células pueden ser transfectadas con una proteína o parte (extracelular) de las mismas, que es similar y/o altamente homologa en la secuencia o estructura con la proteína respectiva del agente infeccioso y/o que se deriva de un agente infeccioso de la misma familia o igual género . Otro aspecto de la invención se refiere a una molécula de enlace como se define en la presente, que tiene actividad que neutraliza al virus de la rabia, caracterizada en que la molécula de enlace humana comprende al menos una región CDR3 de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 25 y además caracterizada en que la molécula de enlace humana tiene una actividad que neutraliza al virus de la rabia de por lo menos 2500 IU/mg de proteína. Más preferentemente, dicha molécula de enlace humana tiene una actividad que neutraliza al virus de la rabia de por lo menos 2800 IU/mg de proteína, por lo menos 3000 IU/mg de proteína, por lo menos 3200 IU/mg de proteína, por lo menos 3400 IU/mg de proteína, por lo menos 3600 iu/mg de proteína, por lo menos 3800 IU/ g de proteína, por lo menos 4000 IU/mg de proteína, por lo menos 4200 IU/mg de proteína, por lo menos 4400 iu/ g de proteína, por lo menos 4600 iu/mg de proteína, por lo menos 4800 IU/mg de proteína, por lo menos 5000 IU/mg de proteína, por lo menos 5200 IU/mg de proteína, por lo menos 5400 IU/mg de proteína. La actividad de neutralización de la molécula de enlace se midió mediante un ensayo de neutralización in vitro (RFFIT modificado (prueba de inhibición de enfoque fluorescente rápida) . El ensayo se describe en detalle en la sección infra del ejemplo.

En una modalidad, la molécula de enlace comprende una cadena pesada inconstante que comprende la secuencia del aminoácidos que comprende la SEQ ID NO: 273. En otra modalidad, la molécula de enlace comprende una cadena pesada que comprende la secuencia del aminoácidos que incluye la SEQ ID NO: 123. La cadena ligera variable de la molécula de enlace puede comprender la secuencia del aminoácidos que comprende la SEQ ID NO: 275. La cadena ligera de la molécula de enlace puede comprender la secuencia del aminoácidos que comprende la SEQ ID NO: 125. Una molécula del ácido nucleico que codifica a las moléculas de enlace como se describe anteriormente también es una parte de la presente invención. Preferentemente, la molécula del ácido nucleico comprende la secuencia del nucleótido que comprende la SEQ ID NO: 122. Además, la molécula del ácido nucleico también puede comprender la secuencia del nucleótido que comprende la SEQ ID NO: 124. Un vector que comprende las moléculas del ácido nucleico y una célula hospedadora que comprenden tal un vector también se proporcionan en la presente. Preferentemente, la célula hospedadora es una célula mamífero tal como una célula humana. Ejemplos de células adecuadas para la producción de moléculas de enlace humanas son inter alia HeLa, 911, AT1080, A549, 293 y células HEK293T. Las células de mamífero preferidas son las células de la retina humanas tales como las células 911 o la línea celular depositadas en la Colección Europea de Cultivos Celulares (ECACC) , CAMR, Salisbury, Wiltshire SP4 OJG, Gran Bretaña el 29 de Febrero de 1996 bajo el número 96022940 y comercializada bajo la marca PER.C6® (PER.C6 es una marca registrada de Crucell Holanda B.V.) - Para los propósitos de esta solicitud "PER.C6" se refiere a células depositadas bajo el número 96022940 o antecesoras, que pasan en dirección ascendente o dirección descendente así como descendentes de antecesores de células depositadas, como también sus derivados de cualquiera de las anteriores. Ejemplos Para ilustrar la invención, se proporcionan los siguientes ejemplos. Los ejemplos no pretenden limitar el alcance de la invención de forma alguna. Ejemplo 1 Reconocimiento del epítopo de anticuerpos antirrábicos humanos CR-57 y CR-JB Para atender si los anticuerpos monoclonales humanos llamados CR-57 y CR-JB reconocen epítopos no traslapados, no competitivos, se generaron los virus de escape a partir de los anticuerpos monoclonales humanos llamados CR-57 y CR-JB. Los CR-57 y CR-JB se generaron esencialmente como se describe (ver Jones et al., 2003), vía la introducción de las regiones de codificación de cadena ligera y pesada variables de los genes del anticuerpo correspondiente en un solo vector de expresión IgGl humano llamado pcDNA3002 (Neo) . Se usaron los vectores resultantes pgS057Cll y pgSOJBCll para la expresión transitoria en células de la línea celular depositada en la Colección Europea de Cultivos Celulares (ECACC) , CAMR, Salisbury, Wiltshire SP4 OJG, Gran Bretaña el 29 de Febrero de 1996 bajo el número 96022940 y comercializado bajo la marca PER.C6®. Se muestran los nucleótidos y secuencias de los aminoácidos de las cadenas pesadas y ligeras de estos anticuerpos en la SEQ ID NO: 122-129, respectivamente. Las diluciones en serie (0.5 ml) de cepas del virus de la rabia CVS-Il (diluciones que van de 10"1 - 10"8) se incubaron con una cantidad constante (~4 IU/ml) del anticuerpo CR-57 o CR-JB (0.5 ml) durante 1 hora a 37°C/5% de C02 antes de la adición de pozos que contienen las células del neuroblastoma de ratón (células MNA) o células BSR (línea celular tipo riñon de hámster recién nacido) . Después de 3 días de selección en presencia de cualquier anticuerpo monoclonal humano CR-57 o CR-JB, el medio (1 ml) que contiene virus de escape potencial se cosechó y se almacenó a 4°C hasta un uso adicional. Posteriormente, las células se fijaron con acetona durante 20 minutos a 4°C, y se tiñeron toda la noche a 37°C/5% C02 con un conjugado del anticuerpo N-FITC antirrábico (Centocor) . El número de focos por pozo registrados mediante inmunofluorescencia y el medio de pozos que contenían de uno a seis focos se eligieron para la amplificación del virus. Todos los virus de escape E57 se generaron de un enfoque simple con la excepción de E57B1 (3 focos) . Los virus de escape EJB se aislaron de 1 foco (EJB3F) , 3 focos (EJB2B, 4 focos (EJB2C) , 5 focos (EJB2E, 2F) , o 6 focos (EJB2D) , respectivamente. Cada virus de escape se amplificó primero en una escala pequeña en células BSR o células MNA dependiendo de sus características de crecimiento. Estos lotes de virus pequeños se usaron entonces para amplificar además al virus en una escala grande en células MNA o BSR. El virus amplificado ese tituló entonces en células MNA para determinar la titulación de cada lote de virus de escape así como la dilución óptima del virus de escape (dando 80-100% de infección después de 24 horas) para el uso en un ensayo de neutralización del virus. Los ensayos RFFIT modificada (prueba de inhibición de enfoque fluorescente rápida) se realizó para examinar la protección cruzada de E57 (virus de escape CR-57) y EJB (virus de escape CR-JB) con CR-JB y CR-57, respectivamente. Por consiguiente, CR-57 o CR-JB se diluyeron mediante diluciones en serie tres veces que inician con una dilución 1:5. El virus de la rabia (cepa CVS-Il) se agregó a cada dilución en una concentración que da 80-100% de infección. La mezcla del Virus/IgG se incubó durante 1 hora a 37°C/5% C02 antes de la adición de células MNA. 24 horas después de la infección (a 34°C/5% de C02) las células se fijaron con acetona durante 20 minutos a 4°C, y se tiñeron durante mínimamente 3 horas con un conjugado del anticuerpo N-FITC del virus antirrábico (Centocor) . Los pozos se analizaron entonces para la infección del virus de la rabia bajo un microscopio de fluorescencia para determinar el 50% de la dilución en el punto final. Esta es la dilución a la que la infección del virus se bloquea en un 50% en este ensayo. Para calcular la potencia, una Norma Internacional (Lote R3 de Globulina Inmune a la Rabia, material de Referencia del Laboratorio de Normas y Pruebas DMPQ/CBER/FDA) se incluyó en cada RFFIT modificado. El 50% de la dilución en su punto final de esta norma corresponde a una potencia de 2 IU/ml . La potencia de neutralización de los anticuerpos monoclonales humanos CR-57 y CR-JB así como la combinación de estos anticuerpos fue probada. Los virus EJB ya no se neutralizaron por CR-JB o CR-57 (ver la Tabla 1) , sugiriendo que ambos anticuerpos se enlazaron y se indujeron cambios en los aminoácidos en las regiones similares de la glicoproteína del virus de la rabia. Los virus E57 ya no fueron neutralizados por CR-57, considerando que 4 fuera de los virus E57 fueron neutralizados aún por CR-JB, aunque con una potencia más baja (ver Tabla 1) . Una mezcla de los anticuerpos CR-57 y CR-JB (en una proporción 1:1 de IU/ g) dio resultados similares como se observa con solo los anticuerpos (no se muestran datos) . Para identificar las posibles mutaciones en la glioproteína del virus de la rabia se determinó la secuencia del nucleótido de la estructura de lectura abierta de la glicoproteína (ORF) de cada uno de los virus de escape EJB y E57. El ARN viral de cada uno de los virus de escape y CVS-Il se aisló de las células MNA infectadas con el virus y se convirtió en el ADNc mediante RT-PCR estándar. Posteriormente, el ADNc se usó para la secuenciación del nucleótido de la glicoproteína del virus de la rabia ORFs para identificar las mutaciones . Ambos virus de escape E57 y EJB mostraron las mutaciones en la misma región de la glicoproteína (ver la figura 1 y 2, respectivamente; ver para todas las secuencias descritas en las Figuras 1 y 2 de la SEQ ID NO:130 - 151). Esto indica que ambos anticuerpos reconocen los epítopos de traslape. De lo anterior puede concluirse que la combinación de CR-57 y CR-JB en un cóctel no previene la salida de las variantes resistentes a la neutralización y no es por consiguiente una preparación de la inmunoglobulina ideal para la profilaxis de exposición después de la rabia. Ejemplo 2 Construcción de una colección que despliega fagos ScFv usando los linfocitos sanguíneos periféricos de donadores vacunados de la rabia. De cuatro sujetos humanos vacunados contra la rabia, 50 ml de sangre se sacaron de una vena una semana después del último estímulo. Los linfocitos de sangres periféricas (PBL) se aislaron de las muestras de estas sangres usando un fraccionamiento de densidad celular Ficoll. El suero sanguíneo se conservó y se congeló a -20°C. La presencia de anticuerpos antirrábicos en el suero se probó positivo usando un inmunotinción FACS en la glicoproteína del virus de la rabia de la células 293T transfectadas. El ARN total se preparó del PBL usando una separación de la fase orgánica (TRIZOL™) y la precipitación del etanol subsiguiente. El ARN obtenido se disolvió en agua ultrapura tratada con DEPC y la concentración se determinó mediante una medición de 260 nm. Después de esto, el ARN se diluyó a una concentración de 100 ng/µl. Luego, 1 µg de ARN se convirtió en ADNc como sigue: A 10 µl de ARN total, 13 µl de agua ultrapura tratada con DEPC y 1 µl de hexámeros aleatorios (500 ng/µl) se agregaron y la mezcla obtenida se calentó a 65°C durante 5 minutos y rápidamente se enfrió en hielo. Entonces, 8 µl de una solución amortiguadora Firts-Strand, 2 µl de dNTP (10 mm cada uno), 2 µl de DTT (0.1 M), 2 µl de inhibidor de Rnasa (40 U/µl) y 2 µl de transcriptasa inversa de Superscript™III MMLV (200 U/µl) se agregó a la mezcla, se incubó a la temperatura ambiente durante 5 minutos y se incubó durante 1 hora a 50°C. La reacción se terminó por inactivación de calor, es decir incubando la mezcla durante 15 minutos a 75°C. Los productos del ADNc obtenidos se diluyeron a un volumen final de 200 µl con el agua ultrapura tratada con DEPC. El OD 260 nm de una solución diluida 50 veces (en 10 mm de una solución amortiguadora Tris) de la dilución de los productos del ADNc obtenidos dieron un valor de 0.1. Para cada donador se usaron 5 a 10 µl de los productos del ADNc diluidos como una plantilla para la amplificación de las secuencias de la cadena ligera lambda o kappa y la familia de la cadena pesada gama de la inmunoglobulina usando cebadores del oligonucleótido específico (ver Tabla 2-7) . Las mezclas de reacción PCR contenidas, además de los productos ADNc diluidos, 25 pmol del cebador sentido y 25 pmol del cebador sentido en un último volumen de 50 µl de 20 mm Tris-HCl (pH 8.4), 50 mm KCl, 2.5 mm MgCl2, 250 dNTPs de µM y 1.25 unidades de la polimerasa Taq. En un ciclizador térmico con tapa para calentar que trabaja a una temperatura de 96°C, las mezclas obtenidas se fundieron rápidamente durante 2 minutos, seguido por 30 ciclos de: 30 segundos a 96°C, 30 segundos a 60e C y 60 segundos a 72°C. En una primera ronda de amplificación, cada uno de los diecisiete cebadores sentido de región variable de cadena ligera (once para la cadena ligera lambda (ver Tabla 2) y seis para la cadena ligera kappa (ver Tabla 3) se combinaron con un cebador anti-sentido que reconoce la kappa C llamada HuCk 5'-ACACTCTCCCCTGTTGAAGCTCTT-3 (vea la SEQ ID NO: 152) o región constante C-lambda HuC?2 5 ' -TGAACATTCTGTAGGGGCCACTG-3 ' (ver la SEQ ID NO: 153) y HuC?7 5 ' -AGAGCATTCTGCAGGGGCCACTG-5 ' (ver la SEQ ID NO: 154) (los cebadores HuC?2 y HuC?7 antisentido se mezclaron para antes del uso equimolarmente) , produciendo 4 veces 17 productos de aproximadamente 600 pares base. Estos productos se purificaron en gel de agarosa al 2% y se aislaron del gel usando columnas de extracción de gel Qiagen. Se usaron 1/10 de cada uno de los productos aislados en una reacción de PCR idéntica como se describe arriba usando los mismos diecisiete cebadores sentido, en donde cada cebador sentido de cadena ligera lambda se combinó con uno de los tres cebadores antisentido específicos de región Jlambda y cada cebador sentido de cadena ligera kappa se combinaron con uno de los cinco cebadores antisentido específicos de región Jkappa. Los cebadores usados en la segunda amplificación se extendieron en los sitios de restricción (ver Tabla 4) para permitir la clonación dirigida en el vector que despliega el fago PDV-C06 (ver la Figura 3 y la SEQ ID NO: 155). Esto resulta en 4 veces 63 productos de aproximadamente 350 pares de base que se agruparon a un total de 10 fragmentos. Este número de fragmentos se eligió para mantener la distribución natural de las diferentes familias de cadena ligera dentro de la colección y no sobre o bajo la representación de ciertas familias. El número de alelos dentro de una familia se usó para determinar el porcentaje de representación dentro de una colección (ver Tabla 5). En el próximo paso, 2.5 µg de fragmentos agrupados y 100 µg del vector PDV-C06 se digirió con Salí y Notl y se purificó con gel. Después de esto, una ligación se realizó toda la noche a 16°C como sigue. A 500 ng del vector PDV-C06 de 70 ng se agregó una fracción agrupada en un volumen total de una mezcla de ligación de 50 µl conteniendo 50 mm Tris-HCl (pH 7.5), 10 mm MgC12, 10 mm DTT, 1 mm ATP, 25 µg/ml BSA y 2.5 µl T4 ADN Ligasa (400 U/µl). Este procedimiento se siguió para cada fracción agrupada. Las mezclas de ligación se purificaron por fenol/cloroformo, seguido por una extracción de cloroformo y precipitación de etanol, métodos bien conocidos por un experto en el arte. El ADN obtenido se disolvió en 50 µl de agua ultrapura y per mezcla de ligación dos veces 2.5 µl de alícuotas se electroporaron en 40 µl de la bacteria E. coli competente TGl de acuerdo al protocolo del fabricante (Stratagene) . Los transformantes se hicieron crecer durante toda 1 anoche a 37° C en un total de 30 placas (tres placas por fragmento agrupado; dimensión de la placa: 240 mm x 240 mm) conteniendo 2TY agar suplementada con 50 ug/ml de ampicilina y 4.5% de glucosa. Una sub colección de regiones de cadena ligera variables se obtuvo raspando los transformantes de las placas de agar. Esta (sub) colección se usó directamente para la preparación del plasmido del ADN usando un kit de preparación Qiagen™ QIAFilter MAXIa. Para cada donador, las secuencias de inmunoglobulina de cadena pesada se amplificaron de las mismas preparaciones de ADNc en un procedimiento de dos rondas de PCR y se usaron parámetros de la reacción idénticos como se describió anteriormente para las regiones de la cadena ligeras con la condición que los cebadores descritos en las tablas 6 y 7. La primera amplificación se realizó usando un conjunto de nueve cebadores dirigidos sentido (ver Tabla 6; cubriendo a todas las familias de las regiones variables de cadena pesada) cada una combinada con un cebador antisentido de región constante específico llamado HuCIgG 5 ' -GTC CAC CTT GGT GTT GCT GGG CTT-3 (SEQ ID NO: 156) produciendo cuatro veces nueve productos de aproximadamente 650 pares de base. Estos productos se purificaron en un 2% de gel de agarosa y se aisló del gel usando columnas de extracción de gel Qiagen. Se usaron 1/10 de cada uno de los productos aislados en una reacción de PCR idéntica como se describe arriba usando los mismos nueve cebadores sentido, en donde cada cebador sentido de cadena pesado se combinó con uno de los cuatro cebadores antisentido específicos de región JH. Los cebadores usados en la segunda ronda se extendieron con los sitios de restricción (ver Tabla 7) para permitir la clonación dirigida en el vector de la subcolección de cadena ligera. Esto produjo por donador 36 productos de aproximadamente 350 pares de base. Estos productos se agruparon para cada donador por cebador sentido usado (VH) en nueve fracciones. Los productos obtenidos se purificaron usando columnas de purificación Qiagen PCR. Luego, los fragmentos se digirieron con Sfil y Xhol y se enlazaron en el vector del sub colección de cadena ligera, que se cortó con las mismas enzimas de restricción, usando el mismo procedimiento de ligación y volúmenes como se describe arriba para la subcolección de cadena ligera. Alternativamente, las fracciones se digirieron con Ncol y Xhol y se ligaron en el vector de cadena ligera que se cortó con las mismas enzimas de restricción, usando el mismo procedimiento de ligación y volúmenes como se describió anteriormente para la subcolección de cadena ligera. La purificación de ligación y la transformación subsecuente de la colección definitiva resultante también se realizaron como se describe anteriormente para la subcolección de la cadena ligera y en este punto la mezcla de ligación de cada donador se combinó por depósito de VH. Los transformantes se hicieron crecer en 27 platos (tres platos por fracción agrupada; dimensión del plato: 240 mm x 240 mm) conteniendo 2TY agar suplementado con 50 ampicilina de µg/ml y 4.5% glucosa. Todas las bacterias se cosecharon en un medio de cultivo 2TY que contiene 50 ampicilina de µg/ml y 4.5% glucosa, mezclado con el glicerol a 15% (v/v) y congelado en alícuota de 1.5 ml a -8O0C. El rescate y selección de cada colección se realizó como se describe abajo. Ejemplo 3 Selección de fagos que llevan glicoproteína del virus de la rabia que reconocen específicamente fragmentos Fv de cadena sencilla. Los fragmentos del anticuerpo se seleccionaron usando colecciones de despliegue de fagos del anticuerpo, tecnología que despliega fagos general y tecnología MAbstrac ®, esencialmente como se describe en la Patente americana Número 6,265,150 y en la WO 98/15833 (ambas están incorporadas en la presente mediante la referencia) . Las colecciones del fago del anticuerpo usadas fueron dos colecciones del fago scFv semi-sintéticas diferentes (JK1994 y WT2000) y las colecciones del fago scFv inmunes (RAB-03-G01 y RAB-04-G01) preparadas como se describió anteriormente en el Ejemplo 2. La primera colección del fago scFv semi-sintética (JK1994) se ha descrito en Kruif et al. (1995b), el segundo uno (WT2000) se construyó esencialmente como se describe en de Kruif et al. (1995b). Brevemente, la colección tiene un semi formato sintético en el cual la variación está incorporada en los genes de cadena pesada y ligera que usan los oligonucleótidos degenerado que incorporan la variación incorporada dentro de las regiones CDR. Sólo se usaron los genes VH3 de cadena pesada en combinación con los genes de cadena ligera kappa y lambda. Se recrearon los CDRl y CDR3 de la cadena pesada y CDR3 de la cadena ligera sintéticamente en una metodología basada en PCR similar a la descrita por Kruif et al. (1995b). La región V así creada se clonó posteriormente en el formato scFv en un vector fagémido y amplificado para generar una colección del fago como se describió anteriormente. Además, los métodos y fagos auxiliadores como se describe en la WO 02/103012 (incorporados aquí dentro mediante la referencia) se usaron en la presente invención. Para identificar la selección del fago de glicoproteína del virus de la rabia que reconoce a los anticuerpos del fago se realizaron experimentos usando el virus de la rabia completo (cepa del virus de la rabia Minero-Moore) inactivado mediante el tratamiento con la beta propiolactona, glicoproteína del virus de la rabia purificado (cepas del virus de la rabia ERA) , y/o células transfectadas que expresan la proteína G del virus de la rabia (cepa del virus de la rabia ERA) . La proteína G se purificó de la cepa ERA del virus de la rabia como sigue. A una solución del virus, 1/10 volumen de 10% de octil-beta-glucopiranosida se agregó y mezcló suavemente. Luego de una incubación de 30 minutos a 4°C la muestra del virus se centrifugó (36,000 rpm, 4°C) en un rotor de SW51. El sobrenadante se recogió y se dializó a 4°C contra 0.1 M de Tris/EDTa. Posteriormente, la glicoproteína se recogió de la cámara de diálisis, se llenó en alícuotas y se almacenó a -80°C hasta un uso adicional. La concentración de la proteína se determinó mediante OD 280 nm y la integridad de la proteína G se analizó por SDS-PAGE. La proteína G del virus de la rabia o el virus de la rabia inactivo completo se diluyó en una solución salina amortiguada con fosfato (PBS) , 2-3 ml se agregaron a tubos MaxiSorp Nunc-Immuno (Nunc) y se incubaron toda la noche a 4°C en una rueda que gira. Una alícuota de una colección del fago (500 µl, aproximadamente 1013 cfu, se amplificó usando el fago auxiliador CT (ver la WO 02/103012)) se bloqueó en la solución amortiguadora que se bloquea (2% Protifar en PBS) durante 1-2 horas a la temperatura ambiente. La colección del fago bloqueada se agregó al inmunotubo (ya sea preincubado con o sin el scFv de CR-57 para bloquear el epítopo reconocido por CR-57), incubado durante 2 horas a la temperatura ambiente, y se lavó con una solución amortiguadora de lavado (0.1% Tween-20 (Serva) en PBS) para quitar los fagos no enlazados. Los fagos enlazados se eluyeron entonces del antígeno mediante la incubación durante 10 minutos a la temperatura ambiente con 1 ml de 50 mm Glicina-HCl pH 2.2. Como consecuencia, los fagos eluidos se mezclaron con 0.5 ml de 1 M Tris-HCl pH 7.5 para neutralizar el pH. Esta mezcla se usó para infectar 5 ml de un cultivo de E. coli XLl-azul que había crecido a 37°C a un OD 600 nm de aproximadamente 0.3. Los fagos se dejaron infectar a la bacteria XLl-azul durante 30 minutos a 37°C. Entonces, la mezcla se centrifugó durante 10 minutos, a 3200*g a la temperatura ambiente y las pelotillas bacterianas se resuspendieron en 0.5 ml de un medio del extracto de levadura 2-tripton (2TY) . La suspensión bacteriana obtenida se dividió sobre dos placas de agar 2TY suplementadas con tetraciclina, ampicilina y glucosa. Después de la incubación durante la noche de las placas a 37°C, las colonias se rasparon de las placas y se usaron para preparar una colección del fago enriquecida, esencialmente como se describe en Kruif et al. (1995a) y la WO 02/103012. Brevemente, se usaron las bacterias raspadas para inocular la ampicilina que contiene el medio 2TY medio, tetraciclina y glucosa y se hizo crecer a una temperatura de 37° C a un OD 600 nm de -0.3. Se agregaron los fagos auxiliadores CT y se dejaron infectar las bacterias después de que el medio se cambió para contener ampicilina 2TY, tetraciclina y kanamicina. La incubación se continuó durante toda la noche a 30°C. El próximo día, las bacterias se removieron del medio 2TY mediante centrifugación después de que se precipitaron los fagos en el medio usando polietilen glicol (PEG) 6000/NaCl. Finalmente, los fagos se disolvieron en 2 ml de PBS con 1% albúmina de suero bovino (BSA) , esterilizado por filtro y se usaron para la próxima ronda de selección. Las selecciones del fago también se realizaron con las células transfectadas de la glicoproteína del virus de la rabia. Las células usadas fueron células de la línea celular depositada en la Colección Europea de Cultivos Celulares (ECACC) , CAMR, Salisbury, Wiltshire SP4 OJG, Gran Bretaña 29 de Febrero de 1996 bajo el número 96022940 y comercializado bajo la marca PER.C6®. Estos son denominados de aquí en adelante como células PER.C6®. Aquí, la colección del fago bloqueada (2 ml) se agregó primero a las células de substractor de 1*107 (en DMEM/10% FBS) y se incubaron durante 1 hora a 4°C en una rueda giratoria. Las células del substractor fueron células PER.C6® que expresaron el dominio ecto de la glicoproteína del virus de la estomatitis vesicular (VSV) en su superficie fusionada a la transmembrana del virus de la rabia y dominio citoplásmico. Con esta etapa de substracción, los fagos que reconocen tanto a los antígenos como las glicoproteínas VSV específicos, para las células PER.C6® se removieron de la colección del fago. La mezcla del fago/célula se centrifugó (5 minutos a 4°C a 500xg) para remover los fagos que enlaza a la célula, y el sobrenadante se agregó a un nuevo tubo que contiene 3 ml de células de substractor de 1*107. La etapa de substracción se repitió dos veces con el sobrenadante respectivo. Posteriormente, los fagos substraídos se incubaron durante 1.5 horas a 4°C en una rueda que gira con la glicoproteína del virus de la rabia que expresa a las células transfectadas (células de PER.C6® (3*106 células) ) . Antes de esto, las células transfectadas se preincubaron ya sea con o sin scFv de CR-57 para bloquear el epítopo reconocido por CR-57. Después de la incubación, las células se lavaron cinco veces con 1 ml de DMEM/10%FBS (para cada lavado, las células se resuspendieron y transfirieron al nuevo tubo) , los fagos se eluyeron y procesaron como se describió anteriormente. Típicamente, se realizaron dos rondas de selecciones antes del aislamiento de los anticuerpos del fago individual. Después de la segunda ronda de selección, las colonias de E. coli se usaron para preparar los anticuerpos del fago monoclonal. Esencialmente, se hicieron crecer colonias individuales a una fase larga en un formato de 96 placas de pozo y se infectaron con fagos auxiliadores VCSM13 después de que la producción de anticuerpo del fago se permitió proceder durante toda la noche. Los anticuerpos del fago producidos fueron precipitados en PEG/NaCl y se esterilizaron por filtración y se probaron en ELISA para enlazar a ambos virus de la rabia inactivados completos y la proteína G del virus de la rabia purificado. Se obtuvo de la selección un panel grande de anticuerpos del fago que demostró enlazar a ambos virus de la rabia inactivado completo y la proteína G del virus de la rabia (ver el ejemplo debajo) . Dos estrategias de la selección se siguieron con las colecciones inmunes descritas anteriormente. En la primera estrategia, los 736 anticuerpos del fago se seleccionaron después de que dos rondas de selección se usaron en la primera y segunda ronda de la selección del virus inactivado o la proteína G purificada. En la segunda estrategia, 736 anticuerpos del fago se seleccionaron después de las dos rondas de selección usando en la primera ronda de selección la superficie celular expresada en la proteína G recombinante y en la segunda ronda de selección del virus inactivado o proteína G purificada. El número de únicos anticuerpos del fago único obtenido mediante la primera estrategia fue 97, mientras la segunda estrategia produjo 70 únicos uno. Los 97 anticuerpos de fago únicos encontrados por medio de la primera estrategia dieron lugar a 18 anticuerpos que se neutralizaron y los 70 únicos clones identificados por medio de la segunda estrategia produjeron 33 anticuerpos de neutralización. Esto demuestra claramente que las selecciones incluyen células transfectadas con la glicoproteína del virus de la rabia, es decir la superficie celular expresada en la proteína G recombinante, cuando el antígeno parecía producir anticuerpos más neutralizados en comparación con las selecciones que usan sólo la proteína G purificada y/o el virus inactivado. Ejemplo 4 Validación de los anticuerpos del fago de cadena sencilla específicos de la glicoproteína del virus de la rabia. Los anticuerpos del fago de cadena sencilla seleccionados que se obtuvieron en las selecciones descritas arriba, se validaron en ELISA para su especificidad, es decir enlazar la proteína G del virus de la rabia, purificada como se describe en supra. Adicionalmente, los anticuerpos del fago de cadena sencilla también se probaron para enlazar 5% de FBS. Para este propósito, la proteína G del virus de la rabia o la preparación del 5% de FBS se cubrieron con placas Maxisorp™ ELISA. Después del revestimiento, las placas se bloquearon en PBS/1% Protifar durante 1 hora a la temperatura ambiente. Los anticuerpos del fago de cadena sencilla seleccionados se incubaron durante 15 minutos en un volumen igual de PBS/1% Protifar para obtener los anticuerpos del fago bloqueados. Las placas fueron vaciadas, y los anticuerpos del fago bloqueados se agregaron a los pozos. La incubación se dejó proceder durante una hora, las placas se lavaron en PBS que contenía 0.1% Tween-20 y los anticuerpos del fago de enlace se detectaron (usando una medida OD de 492 nm) usando un anticuerpo anti-Ml3 conjugado a la peroxidasa. Como un control, el procedimiento se realizó usando simultáneamente un anticuerpo del fago de cadena sencilla usando ningún anticuerpo de fago de cadena sencilla, un control negativo del anticuerpo del fago de cadena sencilla dirigida contra CD8 (SC02-007) o un anticuerpo del fago de cadena sencilla control positivo contra la glicoproteína del virus de la rabia (scFv S057) . Como se muestra en la tabla 8, los anticuerpos del fago seleccionados llamados SC04-001, SC04-004, SC04-008, SC04-010, SC04-018, SC04-021, SC04-026, SC04-031, SC04-038, SC04-040, SC04-060, SC04-073, SC04-097, SC04-098, SC04-103, SC04-104, SC04-108, SC04-120, SC04-125, SC04-126, SC04-140, SC04-144, SC04-146, y SC04-164 desplegaron un enlace importante a la proteína G del virus de la rabia purificado inmovilizado, mientras no se observe un enlace al FBS. Se obtuvieron los resultados idénticos en ELISA usando el virus de la rabia inactivado preparado como supra descrito {no se muestran datos) . Ejemplo 5 Caracterización del virus de la rabia scFvs específico. A partir de los clones del anticuerpo del fago de cadena sencilla específico seleccionado (scFv) se obtuvo el ADN del plásmido y las secuencias del nucleótido se determinaron de acuerdo a las técnicas estándar. Las secuencias del nucleótido scFvs (que incluyen los sitios de restricción para clonar) llamadas SC04-001, SC04-004, SC04-008, SC04 - 010, SC04-018, SC04-021, SC04-026, SC04-031, SC04-038, SC04 - 040, SC04-060, SC04-073, SC04-097, SC04-098, SC04-103, SC04 - 104, SC04-108, SC04-120, SC04-125, SC04-126, SC04-140, SC04-144, SC04-146, y SC04-164 se muestran en las SEQ ID NO: 157, SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO: 161, SEQ ID NO: 163, SEQ ID NO: 165, SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO.171, SEQ ID NO: 173, SEQ ID NO: 175, SEQ ID NO: 177, SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 181, SEQ ID NO: 183, SEQ ID NO: 185, SEQ ID NO: 187, SEQ ID NO: 189, SEQ ID NO: 191, SEQ- ID NO: 193, SEQ ID NO: 195, SEQ ID NO: 197, SEQ ID NO: 199, SEQ ID NO: 201 e SEQ ID NO: 203, respectivamente. Se muestran las secuencias de aminoácidos scFvs llamadas SC04-001, SC04-004, SC04-008, SC04-010, SC04-018, SC04-021, SC04-026, SC04-031, SC04-038, SC04-040, SC04-060, SC04-073, SC04-097, SC04-098, SC04-103, SC04-104, SC04-108, SC04-120, SC04-125, SC04-126, SC04-140, SC04-144, SC04-146, y SC04-164 en la SEQ ID NO: 158, SEQ ID NO: 160, SEQ ID NO: 162, SEQ ID NO: 164, SEQ ID NO:16d, SEQ ID NO: 168, SEQ ID NO: 170, SEQ ID NO: 172, SEQ ID NO: 174, SEQ ID NO: 176, SEQ ID NO: 178, SEQ ID NO: 180, SEQ ID NO: 182, SEQ ID NO: 184, SEQ ID NO: 186, SEQ ID NO: 188, SEQ ID NO: 190, SEQ ID NO:192, SEQ ID NO:194, SEQ ID NO:196, SEQ ID NO:198, IDENTIFICACIÓN de SEQ NO: 200, SEQ ID NO: 202 e SEQ ID NO: 204, respectivamente. La identidad del gen VH y VL (ver Tomlinson IM, Williams SC, Ignatovitch O, Corbett SJ, G. Winter, Directorio de Secuencia de BASE V. Reino Unido Cambridge: MRC Centre for Protein Engineering (1997)) y composiciones CDR3 de cadena pesada de scFvs que enlazan específicamente la proteína G del virus de la rabia se describen en la tabla 9. Ejemplo 6 Neutralización in vitro del virus de la rabia mediante scFvs específicos del virus de la rabia (RFFIT modificado) . Para determinar si los scFvs seleccionados eran capaces de bloquear la infección del virus de la rabia, se realizaron ensayos de neutralización in vitro (RFFIT modificado) . Las preparaciones scFv se diluyeron mediante tres veces diluciones en serie que empiezan con una dilución 1:5. El virus de la rabia (cepas CVS-Il) se agregó a cada dilución a una concentración que da 80-100% de infección. La mezcla de Virus/scFv se incubó durante 1 hora a 37°C/5% C02 antes de la adición a las células de MNA. 24 horas después de la infección (a 34°C/5% C02) las células se fijaron con acetona durante 20 minutos a 4°C, y se tiñeron mínimamente en 3 horas con un conjugado del anticuerpo N-FITC antirrábico (Centocor) . Las células se analizaron entonces para la infección del virus de la rabia bajo un microscopio de fluorescencia para determinar la dilución al 50% del punto final. Esta es la dilución a que la infección del virus se bloquea en un 50% en este ensayo (ver el Ejemplo 1) . Se identificaron varios scFvs que mostraron una actividad de neutralización contra el virus de la rabia (ver la Tabla 10) . Adicionalmente, se investigó por medio del ensayo de neutralización in vitro (RFFIT modificado) como se describe anteriormente, si los scFvs seleccionados fueran capaces de neutralizar los virus de escape E57 como se prepararon en el Ejemplo 1 (E57A2, E57A3 , E57B1, E57B2, E57B3 y E57C3 ) . Se identificaron varios scFvs que mostraron una actividad de neutralización contra los virus de escape E57 (ver las Tablas HA y 11B) . Ejemplo 7 Competición ELISA de la proteína G del virus de la rabia con scFvs . Para identificar anticuerpos que enlazan epítopos no competitivos, no traslapados, se realizó una ELISA de competición de la glicoproteína de la rabia. Las placas Immuno™ Maxisorp F96 (Nunc) se revistieron durante toda la noche a 4°C con una dilución 1:1000 dilución de glicoproteína del virus de la rabia (1 mg/ml; cepa ERA del virus de la rabia) en PBS (50 µl) . La proteína no revestida se lavó fuera antes de los pozos, se bloqueó con 100 µl PBS/1% Protifar durante 1 hora a la temperatura ambiente. Consecuentemente, la solución de bloqueo se descartó y se añadió 50 µl del scFvs del virus antirrábico no purificado en PBS/1% Protifar (2x diluido) . Se lavaron los pozos cinco veces con 100 µl de PBS/0.05% Tween-20. Después, 50 µl del virus antirrábico biotinilado competidor IgG, CR-57bio, se agregó bien a cada uno, se incubó durante 5 minutos a la temperatura ambiente, y los pozos se lavaron cinco veces con 100 µl de PBS/0.05% Tween-20. Para detectar el enlace de CR-57bio, 50 µl de una dilución 1:2000 del anticuerpo de estreptavidina-HRP (Becton Dickinson) se agregó a los pozos y se incubó durante 1 hora a la temperatura ambiente. Los pozos se lavaron de nuevo como arriba y la ELISA se desarrolló además por la adición de 100 µl de reactivos OPD (la Sigma) . La reacción se detuvo agregando 50 µl 1 M H2S04 antes de medir el OD a 492 nm. La señal obtenida con sólo CR-57bio podría reducirse a los niveles últimos cuando se co-incubaron con scFv S057, es decir, la forma scFv de CR-57 (para el nucleótido y la secuencia del aminoácidos S057 ver la SEQ ID NO: 205 y 206, respectivamente) o scFv SOJB, es decir, la forma scFv de CR-JB (para el nucleótido y la secuencia del aminoácidos SOJB ver la SEQ ID NO:312 y 313, respectivamente). Esto indica que el scFvs S057 y SOJB compiten con la interacción de CR-57bio a la glicoproteína del virus de la rabia enlazando al mismo epítopo o a un epítopo de traslape como CR-57bio, respectivamente. En contraste, un scFv no relevante llamado SC02-007, es decir un scFv que enlaza a CD8, no compite por el enlace. Los scFvs del virus antirrábicos llamados SC04-004, SC04-010, SC04-024, SC04-060, SC04-073, SC04-097, SC04-098, SC04-103, SC04-104, SC04-120, SC04-125, SC04-127, SC04-140, SC04-144 y SC04-146 tampoco compitieron con CR-57bio, indicando que estos scFvs enlazan a un epítopo diferente al epítopo reconocido por CR-57 (vea la Figura 4) . Se obtuvieron resultados similares con el siguiente experimento. Primero, el anticuerpo del virus de la rabia CR-57 se agregó a pozos cubiertos con la proteína G del virus de la rabia. Luego, fueron agregados los scFvs de competición. En esta estructuración, los scFvs del virus antirrábico se detectaron con el anti-VSV-HRP en virtud de la presencia de una etiqueta VSV en las secuencias del aminoácidos scFv (ver la Figura 5) . Ejemplo 8 Construcción de moléculas de inmunoglobulina totalmente humanas (anticuerpos del virus antirrábico monoclonal humano) de los Fv's de cadena sencilla del virus antirrábico seleccionado. Las regiones variables de cadena ligera y pesada de los scFvs llamados SC04-001, SC04-008, SC04-018, SC04-040 y SC04-126 se amplificaron por PCR usando oligonucleótidos para añadir sitios de restricción y/o secuencias para la expresión en los vectores de expresión IgG pSyn-C03-HC?l (ver la SEQ ID NO:277) y pSyn-C04-C? (ver la SEQ ID NO:278), respectivamente. Se amplificaron los VH y genes V usando los oligonucleótidos como se muestra en la tabla 12 y 13, respectivamente, y los productos de PCR se clonaron en los vectores pSyn-C03-HC?l y pSyn-C04-C?, respectivamente. Las regiones variables de cadena ligera y pesada de los scFvs llamadas SC04-004, SC04-010, SC04-021, SC04-026, SC04-031, SC04-038, SC04-060, SC04-073, SC04-097, SC04-098, SC04-103, SC04-104, SC04-108, SC04-120, SC04-125, SC04-140, SC04-144, SC04-146 y SC04-164 se amplificaron también usando los oligonucleótidos para añadir sitios de restricción y/o secuencias para la expresión en los vectores de expresión igG pSyn-C03-HC?l y pSyn-C05-Ck (ver la SEQ ID NO:279), respectivamente. Se amplificaron los genes VH y VL usando los oligonucleótidos como se da en la tabla 12 y 13, respectivamente, y los productos de PCR se clonaron en los vectores pSyn-C03-HC?l y pSyn-C05-Ck, respectivamente. Los oligonucleótidos se diseñan tal que corrijan cualquier desviación de la secuencia de línea germinal que se ha introducido durante la construcción de la colección, debido al conjunto limitado de oligonucleótidos que se ha usado para amplificar el repertorio grande de genes del anticuerpo. Se verificaron todas las secuencias del nucleótido para todos los constructos de acuerdo a las técnicas normales conocidas por un experto en el arte. Los constructos de expresión resultantes pgG104-00lC03 , pgGl04-008C03, pgG104-018C03 , pgGl04-040C03 , y pgGl04-126C03 que codifican las cadenas pesadas IgGl humanas del virus antirrábico IgGl en combinación con el constructo pSyn-C04-V relevante que codifica a la cadena ligera correspondiente que se expresó transitoriamente en células 293T y sobrenadantes que contienen los anticuerpos IgGl obtenidos. Los constructos de expresión pgG104-004C03 , pgGl04-010C03 , pgG104-02lC03 , el pgGl04-026C03, pgGl04-03lC03 , pgGl04-038C03 , pgG104-060C03 , pgGl04-073C03, pgGl04-097C03 , pgGl04-098C03 , pgG104-103C03 , pgG104-104C03, pgG104-108C03 , pgG104-120C03 , pgG104-125C03 , pgGl04-140C03, pgGl04-144C03 , pgGl04-146C03 y pgGl04-164C03 que codifican a alas cadenas pesadas IgGl del virus humano antirrábico en combinación con el constructo pSyn-C05-Vk relevante que codifica la cadena ligera correspondiente se expresó transitoriamente en células 293T y se obtuvieron sobrenadantes que contienen los anticuerpos IgGl .

Los nucleótidos y secuencias de los aminoácidos de las cadenas pesadas y ligeras de los anticuerpos llamados CR04-001, CR04-004, CR04-008, CR04-010, CR04-018, CR04-021, CR04-026, CR04-031, CR04-038, CR04-040, CR04-060, CR04-073, CR04-097, CR04-098, CR04-103, CR04-104, CR04-108, CR04-120, CR04-125, CR04-126, CR04-140, CR04-144, CR04-146 y CR04-164 se determinaron de acuerdo a las técnicas estándar. Posteriormente, los anticuerpos monoclonales humanos recombinantes se purificaron sobre una columna de proteína A seguido por un intercambio de una solución amortiguadora en una columna de desalación usando métodos de purificación normales generalmente usados para las inmunoglobulinas (ver la WO 00/63403 que está en la presente incorporada mediante la referencia) . Adicionalmente, para CR04-098, un solo vector IgGl de expresión humano nombrado pgG104-098ClO se generó como se describió anteriormente para los vectores pgS057Cll y pgSOJBCll que codifican a CR-57 y CR-JB, respectivamente (ver el Ejemplo 1). Los nucleótidos y secuencias del aminoácidos de la cadena pesada y ligera del anticuerpo CR04-098 codificado por el vector pgGl04-098ClO se muestra en la SEQ ID NO : 334-337, respectivamente. Los vectores pgS057Cll (ver el Ejemplo 1) y pgG104-098ClO se usaron para la expresión estable de CR-57 y CR04-098, respectivamente, en las células de la línea celular depositada en la Colección Europea de Cultivo Celular (ECACC) , CAMR, Salisbury, Wiltshire SP4 OJG, Gran Bretaña 29 de Febrero de 199.6 bajo el número 96022940 y comercializado bajo la marca PER.C6®. El CR-57 y CR04-098 producidos establemente tienen un punto isoeléctrico calculado de 8.22 y 8.46, respectivamente. Los puntos isoeléctricos experimentalmente observados se encuentran entre 8.1-8.3 para CR-57 y 9.0-9.2 para CR04-098. Los anticuerpos monoclonales humanos recombinantes se purificaron como se describe anteriormente. A menos que se establezca lo contrario, para CR04-001, CR04-004, CR04-008, CR04-010, CR04-018, CR04-021, CR04-026, CR04-031, CR04-038, CR04-040, CR04-060, CR04-073, CR04-097, CR04-098, CR04-103, CR04-104, CR04-108, CR04-120, CR04-125, CR04-126, CR04-140, CR04-144, CR04-146 y uso de CR04-164 se elaboraron a partir de anticuerpos monoclonales humanos recombinantes expresados transitoriamente mediante los dos sistemas de vectores, como se describió anteriormente y para el uso de CR57 se elaboró a partir de un anticuerpo monoclonal humano recombinante expresado transitoriamente mediante un sistema del vector como se describe en el Ejemplo 1. Ejemplo 9 ELISA de Competición de la proteína G del virus de la rabia con IgGs Para saber si el IgGs de la proteína G del virus antirrábico monoclonal humano enlaza a un epítopo no competitivo, no traslapado, se realizaron experimentos de competición. Los pozos revestidos con la proteína G del virus de la rabia se incubaron con las concentraciones incrementadas (0-50 µg/ml) de IgG de la proteína G del virus antirrábico no etiquetado durante 1 hora a la temperatura ambiente. Entonces, 50 µl de un IgG del virus antirrábico biotinilado diferente (1 µg/ml) se agregó bien a cada pozo, se incubó durante 5 minutos a la temperatura ambiente, e inmediatamente se lavó cinco veces con 100 µl de PBS/0.05% Tween-20. Posteriormente, se incubaron los pozos durante 1 hora a la temperatura ambiente con 50 µl de una dilución 1:2000 de estreptavidina-HRP (Becton Dickinson) , se lavó y desarrolló como se describió anteriormente . Una disminución en señal con una concentración incrementada de IgG no etiquetada indica que los dos anticuerpos están compitiendo entre sí y reconocen el mismo epítopo o epítopos traslapados. Alternativamente, los pozos revestidos con la proteína G del virus de la rabia (cepas ERA) se incubaron con 50 µg/ml de IgG de la proteína G del virus antirrábico no etiquetado durante 1 hora a la temperatura ambiente. Entonces, 50 µl de CR57 biotinilado (0.5-5 µg/ml; a niveles subsaturados) se agregaron bien a cada pozo. Las etapas adicionales se realizaron como se describe supra. Se compararon las señales obtenidas a las señales obtenidas con sólo el CR57 biotinilado (ver la Figura 6; ningún competidor) . De la figura 6 puede deducirse que la señal no podría reducirse con el anticuerpo llamado CR02-428 que sirvió como un control negativo. En contraste, la competición con el CR57 no etiquetado (control positivo) o CR-JB redujo la señal a niveles últimos. De la figura 6 puede deducirse además que ninguno de los IgGs de la proteína G del virus antirrábico compitió significativamente con CR-57, que está conforme con los datos de competición de scFv como se describe en el Ejemplo 7. Además, se realizaron los experimentos de competición en la proteína G del virus de la rabia (cepas ERA) transfectada en las células PER.C6 por medio de citometría de flujo. Se incubaron las células transfectadas con 20 µl de IgG de la proteína G del virus antirrábico no etiquetado (50 µg/ml) durante 20 minutos a 4 °C . Después de lavar las células con PBS que contiene 1% BSA, 20 µl de CR57 biotinilado (0.5-5 µg/ml; a niveles subsaturados) se agregó bien a cada pozo, incubado durante 5 minutos a 4°C, e inmediatamente se lavó dos veces con 100 µl de PBS que contenía 1% de BSA. Posteriormente, se incubaron los pozos durante 15 minutos a 4°C con 20 µl de una dilución 1:200 de estreptavidina-PE (Caltag) , se lavó y desarrolló como se describe anteriormente. La señal obtenida con el CR57 biotinilado no podría reducirse significativamente con el anticuerpo de control negativo CR02-428 (ver la Figura 7) . En contraste, la competición con el CR57 no etiquetado (control positivo) o CR-JB redujo la señal a niveles últimos. Ninguno de los IgGs de la proteína G del virus antirrábico compitió significativamente con CR-57, con la excepción de CR04-126 que redujo la señal de aproximadamente 30% (ver la figura 7) . El último no compite en la ELISA (ver la Figura 6) . Esto puede ser causado mediante la diferencia en la forma en que la glicoproteína se presenta en el anticuerpo en experimentos FACS comparados a los experimentos en la ELISA. El enlace de CR04-126 podría ser más dependiente en la conformación de la glicoproteína, resultando en un efecto competitivo observado con CR04-126 en el ensayo de la competición basado en FACS y no en el ensayo de competición basado en ELISA. Adicionalmente, los CR04-008 y CR04-010 redujeron la señal en aproximadamente 50% (ver la figura 7) en el ensayo de competición basado en FACS que indica que podrían competir con CR57. Sin embargo, para CR04-010 esto no se confirmó mediante los datos de competición scFv o el ensayo de competición basado en ELISA. Para otros IgGs, los datos de FACS estaban acordes con los datos respectivos de la ELISA de ambos scFvs y IgGs . Ejemplo 10 Efectos aditivos/sinérgicos de los IgGs anti-rabia en la neutralización in vitro del virus de la rabia (RFFIT modificada) . Con objeto de determinar si los IgGs de la proteína G del virus antirrábico tienen efectos aditivos o sinérgicos en la neutralización del virus de la rabia, se prueban diferentes combinaciones de los IgGs . Primero, la potencia (en IU/mg) de cada anticuerpo individual se determina en un RFFIT modificado (ver Ejemplo 1) . Luego, las combinaciones de anticuerpos se preparan con base en cantidades iguales de IU/mg y se prueben en el RFFIT modificado. Las potencias de cada combinación de anticuerpos se pueden determinar y comparar con las potencias esperadas . Si la potencia de la combinación de anticuerpos es igual a la suma de las potencias de cada anticuerpo individual presente en la combinación, los anticuerpos tienen un efecto aditivo. Si la potencia de la combinación de anticuerpos es superior, los anticuerpos tienen un efecto sinérgico en la neutralización del virus de la rabia. Alternativamente, se pueden determinar efectos aditivos o sinérgicos por el siguiente experimento. Primero, la potencia de los anticuerpos a probarse, por ejemplo CR-57 y CR04-098, se determina en un RFFIT estándar (ver Laboratory techniques in rabies, Editado por: F.-X Meslin, M.M. Kaplan and H. Koprowski (1996), cuarta edición, capítulo 15, Organización Mundial de la Salud, Ginebra) . Luego, los anticuerpos se mezclan en una relación 1:1 con base en IU/ml. Esta mezcla de anticuerpos junto con los anticuerpos individuales a la misma concentración, se prueban en 6 experimentos independientes de RFFIT para determinar el punto final de neutralización al 50%. Posteriormente, el índice de combinación (Cl) se determinan para la mezcla de anticuerpos usando la fórmula CI= (Cl/Cxl) + (C2/Cx2) + (ClC2/CxlCx2) como se describe por Chou et al. (1984) . Cl y C2 son la cantidad (en µg) de anticuerpo monoclonal 1 y anticuerpo monoclonal 2 que conducen a una neutralización del 50% cuando se usan en combinación y Cxi y Cx2 son la cantidad (en µg) del anticuerpo monoclonal 1 y el anticuerpo monoclonal 2 que conduce a un neutralización del 50% cuando se usan solos. Cl = 1, indica un efecto aditivo, Cl < 1 indica un efecto sinérgico y Cl > 1 indica un efecto antagonista de los anticuerpos monoclonales. Ejemplo 11 Identificación de los epítopos reconocidos por anticuerpos del virus atni-rabia recombinante humano por PEPSCAN-ELISA Los péptidos cíclicos/en rizo y lineales de 15-mero se sintetizaron del dominio extracelular de la proteína de la cepa del virus de la rabia ERA (ver SEQ ID NO: 207 para la secuencia completa de aminoácidos de la glicoproteína de la cepa del virus de la rabia ERA, el dominio extracelular consiste de los aminoácidos 20-458; la identificación de proteínas de la glicoproteína de la cepa del virus de la rabia ERA en la base de datos EMBL es J02293) y se selecciona usando tarjetas mini-PEPSCAN con un formato de tarjeta de crédito (formatos de 455 péptidos/tarjeta) como se describe previamente (Slootstra et al., 1996; WO 93/09872). Todos los péptidos se acetilaron en la terminación amino. En todos los péptidos rizados en la posición 2 y posición 14 se reemplazaron por una cisteína (acetil-XCXXXXXXXXXXXCX-mini tarjeta) . Si otras cisteínas además de las cisteínas en la posición 2 y la posición 14 estuvieran presentes en un péptido preparado, las otras cisteínas se reemplazaron por una alanina. Los péptidos rizados se sintetizaron al usar una química estándar Fmoc y se desprotegieron al usar el ácido trifluórico con agentes secuestrantes. Posteriormente, se hicieron reaccionar los péptidos desprotegidos en las tarjetas con una solución 0.5 M de 1, 3-bis (bromoetil) benceno en bicarbonato de amonio (20 mM, pH 7.9/acetonitrilo (1:1 (v/v)). Las tarjetas se agitaron suavemente en la solución por 30-60 minutos, mientras se cubrían completamente en la solución. Finalmente, las tarjetas se lavaron ampliamente con un exceso de H20 y se sonicaron en una solución amortiguadora de fragmentación que contiene 1% SDS/0.1% beta-mercaptoetano en PBS (pH 7.2) a 70°C durante 30 minutos, seguido por sonicación en H20 por otros 45 minutos. Se prepararon los anticuerpos monoclonales humanos como se describen arriba. El enlace de estos anticuerpos a cada péptido lineal y rizado se probó en un inmunoensayo ligado a enzimas con base en PEPSCAN (ELISA) . Las tarjetas de polipropileno en un formato de tarjeta de crédito de 455 pozos, que contienen los péptidos ligados covalentemente se incubaron con los anticuerpos (10 µg/ml; se diluyeron en solución de bloqueo la cual contenía suero de caballo al 5% (v/v) y ovalbúmina al 5% (p/v) (4°C durante la noche) . Después de lavar, se incubaron los péptidos con peroxidasa antihumana de anticuerpos (dilución 1/1000) (1 hora, 25°C) y posteriormente, después de lavar el substrato de peroxidasa 2, 2 '-azino-di-3-etilbenztiazolina sulfonato (ABTS) y 2 µl/ml 3% de H202 se agregaron. Los controles (para el lineal y el rizado) se incubaron solamente con peroxidasa de anticuerpos antihumano. Después de una hora el desarrollo de color se midió. El desarrollo de color de la ELISA se cuantifico con una cámara CCD y un sistema de procesamiento de imagen. El arranque consistió de una cámara CCD y un lente de 55 mm (Sony CCD Video Camera XC-77RR, Nikon micro-nikkor 55 mm f/2.8 lens), un adaptador de cámara (Sony Camera adaptor DC-77RR) y un paquete de software para procesamiento de imágenes óptimas, versión 6.5 (Media Cybernetics, Silver Spring, MD 20910, U.S.A.). El Óptimas corre en una sistema de computadoras pentium II. Los anticuerpos monoclonales de la. proteína G del virus antirrábico humano se probaron para su enlace a los péptidos cíclicos/rizados y lineales de 15 meros sintetizados como se describe en supra. Se consideró un péptido como que se enlaza de forma relevante a un anticuerpo cuando los valores OD son iguales a o son mayores a 2 veces el valor promedio de OD de todos los péptidos (por anticuerpo) . Ver la Tabla 14 para resultados del enlace de los anticuerpos monoclonales humanos denominados CR57, CDJB y CD04-010 a los péptidos lineales del dominio extracelular de la glicoproteína G de la cepa del virus de la rabia ERA. Las regiones que muestran un enlace importante a los anticuerpos respectivos se resaltan en color gris (ver tabla 14) . El anticuerpo CR57 enlazado a los péptidos lineales que tienen una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SLKGACKLKLCGVLG (SEQ ID NO: 314), LKGACKLKLCGVLGL (SEQ ID NO: 315), KGACKLKLCGVLGLR (SEQ ID NO: 316), GACKLKLCGVLGLRL (SEQ ID NO: 317), ACKLKLCGVLGLRLM (SEQ ID NO: 318), CKLKLCGVLGLRIMD (SEQ ID NO: 319), KLKLCGVLGLRLMDG (SEQ ID NO: 320), LKLCGVLGLRLMDGT (SEQ ID NO : 321) y KLCGVLGLRLMDGTW (SEQ ID NO: 322) (ver tabla 14) . Los péptidos que tienen las secuencias de aminoácidos GACKLKLCGVLGLRL (SEQ ID NO: 317), ACKLKLCGVLGLRLM (SEQ ID NO: 318) tienen un valor OD que es menor que el doble del valor promedio. Sin embargo, se reclamaron estos péptidos, debido a que están en proximidad cercana de una región de péptidos antigénicos reconocidos por el anticuerpo CR57. El enlace fue más prominente al péptido con la secuencia de aminoácidos KLCGVLGLRLMDGTW (SEQ ID NO: 322). El anticuerpo CR04-010 enlazado a los péptidos lineales que tienen una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de GFGKAYTIFNKTLME (SEQ ID NO: 323), FGKAYTIFNKTLMEA (SEQ ID NO : 324), GKAYTIFNKTLMEAD (SEQ ID NO: 325), KAYTIFNKTLMEADA (SEQ ID NO: 326), AYTIFNKTLMEADAH (SEQ ID NO: 327), YTIFNKTLMEADAHY (SEQ ID NO: 328), TIFNKTLMEDAHYK (SEQ ID NO: 329), IFNKTLMEADAHYKS (SEQ ID NO: 330) y FNKTLMEADAHYKSV (SEQ ID NO: 331) . Los péptidos tienen las secuencias de aminoácidos AYTIFNKTLMEADAH (SEQ ID NO: 327), YTIFNKTLMEADAHY (SEQ ID NO: 328) tienen un valor OD que es inferior al doble del valor promedio. Sin embargo, estos péptidos se reivindicaron debido a que están en proximidad cercana de una región de péptidos antigénicos reconocidos por el anticuerpo CR04-010. El enlace fue más prominente a los péptidos con la secuencia de aminoácidos TIFNKTLMEADAHYK (SEQ ID NO: 329), IFNKTLMEADAHYKS (SEQ ID NO : 330) y FNKTLMEADAHYKSV (SEQ ID NO: 331) . CRJB y los anticuerpos denominados CR04-040, CR04-098 y CR04-103 (no se muestran los datos) no reconocieron una región de péptidos antigénicos lineales. Cualquiera de los péptidos anteriores o partes de los mismos representan buenos candidatos de un epítopo de neutralización del virus de la rabia y pueden formar la base para una vacuna o para formular anticuerpos de neutralización para tratar y/o evitar una infección por el virus de la rabia. SLKGACKLKLCGVLGLRLMDGTW (SEQ ID NO: 332) y GFGKAYTIFNKTLMEDAHYKSV (SEQ ID NO: 333) son regiones particularmente interesantes de la glicoproteína con base en su alta reactividad en PEPSCAN. A partir de los datos anteriores de PEPSCAN, se puede deducir además que los anticuerpos monoclonales humanos denominados CR57 y CR04-010 se enlazan a regiones diferentes de la proteína G del virus de la rabia lo que indica que reconocen a epítopos que no compiten. Ejemplo 12 Determinación de la potencia de neutralización de los IgGs de la proteína G anti-rabia usando un ensayo de neutralización in vitro (RFFIT modificado) . La potencia de neutralización de los anticuerpos monoclonales humanos producidos se determinó en un RFFIT modificado como se describe en el ejemplo 1. Dieciséis IgGs neutralizaron la cepa de la rabia CVS-11 con una potencia mayor que 100 IU/mg, mientras que solamente 2 IgGs tuvieron una potencia menor que 2 IU/mg (ver tabla 15) . Ocho de los dieciséis anticuerpos estuvieron por arriba del CR-57 producido transitoriamente con respecto a la potencia, lo que sugiere a una mayor eficiencia en la profilaxis posterior a la exposición del virus de la rabia que CR-57. La potencia del CR-57 producido transitoriamente fue de aproximadamente 3800 IU/mg de proteína (ver tablas 1 y 15) , mientras que el CR-57 producido establemente desplegó una potencia de 5400 iu/mg proteína (no se muestran los datos) . De manera interesante, la mayoría de los anticuerpos monoclonales humanos neutralizantes identificados contienen un gen de una línea germinal 3-30 pesada variable (ver tabla 9) . Con base en la afinidad de los anticuerpos para el virus de la rabia (no se muestran los datos) y una dilución de punto final al 100% de los anticuerpos en un ensayo modificado RFFIT (no se muestran los datos) , se escogieron un panel de seis IgGs únicos, esto es, CR04-010, CR04-040, CR04-098, CR04-103, CR04-104, y CR04-144, para un desarrollo adicional. Dentro de este panel, el anticuerpo CR04-098 fue particularmente interesante ya que desplegó la potencia más elevada esto es, aproximadamente 7300 IU/mg de proteína (ver tabla 15) . También se encontró una potencia similar para el CR04-098 producido de manera estable (los datos no se muestran) . Ejemplo 13 Neutralización in vitro de los virus de escape E57 por los IgGs del virus antirrábico . Para caracterizar además los anticuerpos antirrábicos monoclonales humanos novedosos, la actividad neutralizante de los IgGs contra los virus de escape E57 se probó en un RFFIT modificado como se describe arriba. La mayoría de los IgGs del virus antirrábico tuvo una buena actividad neutralizante contra todos los seis virus de escape E57 (ver tabla 16) . En contraste, CR04-008, CR04-018 y CR04-126 no neutralizó los virus de escape 6/6, 2/6 y 3/6 E57, respectivamente. Ninguna neutralización significa que no se alcanzó ningún punto final al 50% a una dilución de anticuerpos de 1:100. CR04-021, CR04-108, CR04-120, CR04-125 y CR04-164 mostraron una disminución importante en la actividad neutralizadora contra diversos virus de escape. Esto sugiere que el epítopo de estos anticuerpos se ha afectado ya sea directa o indirectamente en la glicoproteína del virus de escape E57. Sobre la base sobre los diversos IgGs del virus antirrábico anterior pueden ser compatibles con CR-57 en un cóctel antirrábico para un tratamiento de profilaxis posterior a la exposición. En particular, el panel de seis IgGs únicos como se identifican arriba, esto es, los anticuerpos CR04-010, CR04-040, CR04-098, CR04-130, CR04-104, y CR04-144, desplegaron una buena potencia de neutralización hacia los virus de escape E57 lo que sugiere que el o los epítopos reconocidos por estos anticuerpos no se afectaron por las mutaciones de aminoácidos inducidas por CR-57. El anticuerpo CR04-098 apareció más prometedor ya que tuvo una potencia mayor que 3000 IU/mg para cada uno de los virus de escape. Ejemplo 14 Reconocimiento de epítopo de los anticuerpos antirrábicos CR-57 y CR04-098 Para confirmar que los anticuerpos monoclonales humanos denominados CR-57 y CR04-098 reconocen epítopos que no se traslapan y que no compiten, los virus de escape del anticuerpo I monoclonal humano denominado CR04-098 se generaron esencialmente como se describen para los virus de escape de CR57 (ver ejemplo 1) . En resumen, se registró el número de focos por pozo por inmunofluorescencia y el medio de los pozos que contiene preferiblemente un foco se escogió par amplificación del virus. Todos los virus de escape E98 se generaron a partir de un foco sencillo con la excepción de E98-2 (2 focos) y E98-4 (4 focos) . Se definió un virus como una variante de escape si el índice de neutralización fue de <2.5 logs. El índice de neutralización se determinó al restar el número de partículas del virus infeccioso/ml producido en cultivos de células BSR infectada con el virus más el anticuerpo monoclonal (~ 4 IU/ml) a partir del número de partículas del virus infeccioso/ml producido en cultivos de células BSR o MNA infectadas solo con el virus ( [unidades formadoras de foco logarítmicas/ml de virus en ausencia de anticuerpo monoclonal menos el ffu logarítmico/virus ml en presencia de anticuerpo monoclonal]). Un índice inferior a 2.5 logs se consideró como evidencia del escape. Para investigar además si CR04-098 se enlaza a un epítopo que no compite, no se traslapa diferente comparado a CR-57, CR-57 se probó contra los virus de escape E98 en un ensayo modificado como se describe arriba. Como se muestra en la Tabla 17, CR-57 tuvo una buena actividad neutralizadora contra todos los cinco virus de escape E98. Adicionalmente, se probaron los anticuerpos CR04-010 y CR04-114 para la actividad neutralizante contra los virus de escape E98. Ambos anticuerpos no neutralizaron los virus de escape E98 (no se muestran los datos) lo que sugiere que el epítopo reconocido por ambos anticuerpos se afecta ya sea directa o indirectamente por la mutación de aminoácidos inducida por el anticuerpo CR04-098. Los anticuerpos CR04-018 y CR04-126 se probaron por su actividad neutralizante contra solamente uno de los virus de escape E98, esto es E98-4. CR04-018 pudo neutralizar el virus de escape, mientras que CR04-126 solamente tuvo una potencia neutralizadora débil hacia el virus de escape. Esto sugiere que el epítopo reconocido por CR04-018 no se afecta por la mutación inducida por el anticuerpo CR04-098. adicionalmente, los anticuerpo CR04-010, CR04-038, CR04-040, CRT04-073, CR04-103, CR04-104, CR04-108, CR04-120, CR04-125, CR04-164 no neutralizaron E98-4 lo que sugiere que reconocen al mismo epítopo como CR04-098 (no se muestran los datos) . Para identificar las mutaciones posibles en la glicoproteína de la rabia de cada uno de los virus de escape E98, la secuencia de nucleótidos de la estructura de lectura abierta de la glicoproteína (ORF) se determinó como se describe anteriormente para los virus de escape E57 y EJB. Todos los virus de escape E98 mostraron la mutación N a D en la posición de aminoácidos 336 de la glicoproteína de la rabia (ver figura 8) . Esta región de la glicoproteína se ha definido como el sitio antigénico III que comprende lo aminoácidos 330-338 (numeración sin el péptido de señal) . En contraste, CR-57 reconoció un epítopo localizado en los aminoácidos 226-231 (numeración sin el péptido de señal) , el cual se traslapa con el sitio antigénico I. Además de la mutación de N336D, el virus de escape E98 denominado E98-5 mostró la mutación H a Q en la posición de aminoácidos 354 (cambio del codón CAT hasta CAG) de la glicoproteína de la rabia (no se muestran los datos) . Adicionalmente, el análisis pepscan de enlace de CR57 a los péptidos que aloja un epítopo mutado CR57 (cuando se observa en los virus de escape E57) mostró que la interacción de CR57 se eliminó (no se muestran los datos) . Sorprendentemente, CR04-098 todavía pudieron enlazarse a la glicoproteína mutada (que comprende la mutación N336D) expresada en las células PER.C6®, cuando se mide por citometría de flujo (no se muestran los datos) , aunque los virus que contienen esta mutación ya no se neutralizaron. Adicionalmente, los estudios de mapeo de epítopos y los estudios de calificación de afinidad se efectuaron en un análisis de resonancia de plasmón de superficie usando un sistema analítico BIAcore3000™. La glicoproteína de la rabia purificada (cepa ERA) se inmovilizó como un ligando en un canal de 4 flujos CM5 grado de investigación (Fc) en un chip sensor (Biacore AB, Suecia) usando un acoplamiento de amina. La clasificación se efectúo a 25°C con HBS-EP (Biacore AB, Suecia) como solución amortiguadora para la corrida. 50 µl de cada anticuerpo se inyectaron a una relación de flujo constante de 20 µl/min. Luego, se aplicó una solución amortiguadora de corrida durante 750 segundos seguido por la regeneración del chip CM5 con 5 µl NaOH 2M, 5 µl HCl 45 mM y 5 µl NaOH 2 mM. Las señales de resonancia expresadas como unidades de resonancia (RU) se graficaron como una función del tiempo y el incremento y disminución en RU como una medida de la asociación y disociación respectivamente, se determinaron y usaron para clasificar los anticuerpos. Los valores actuales de KD para CR57 y CR04-098 cuando se determinan por un análisis de resonancia de plasmón de superficie fueron 2.4 nM y 4.5 nM, respectivamente. Los estudios de mapeo de epítopos confirmaron además de CR57 y CR04-098 se enlazan a epítopos diferentes en la glicoproteína de la rabia. La inyección de CR57 resultó en una respuesta de 58 RU (no se muestran los datos) . Después de la inyección de CR04-098 se obtuvo un incremento adicional en el nivel de respuesta (24 RU) , lo que sugiere que los sitios de enlace para CR04-098 no se ocuparon (no se muestran los datos) . Se observaron resultados similares cuando se aplicó el orden inverso que muestra que cada anticuerpo alcanzó niveles similares de RU independientemente del orden de inyección (los datos no se muestran) . Estos resultados demuestran además que CR57 y CR04-098 se pueden enlazar simultáneamente y reconocer a epítopos diferentes en la glicoproteína del virus de la rabia.

En general, los datos anteriores confirman además que los anticuerpos CR-57 y CR04-098 reconocen diferentes epítopos que no se traslapan, esto es, epítopos en el sitio antigénico I y III, respectivamente. Los datos están en buen acuerdo con los datos de competición ELISA/FACS lo que indica que CR-57 y CR04-098 no compiten para el enlace para ERA G y la buena actividad de neutralización del anticuerpo CR04-098 contra todos los virus de escape E57. Sobre la base de estos resultados y el hecho de que la exposición in vitro del virus de la rabia a la combinación de CR57 y CR04-098 (selección en presencia de 4 IU/ml de cualquier anticuerpo) no produjo virus de escape (no se muestran los datos) , se concluyó que los anticuerpos CR-57 y CR04-098 reconocen epítopos que no se traslapan y que no compiten y que pueden usarse ventajosamente en un cóctel de anticuerpos del virus antirrábico para un tratamiento de profilaxis posterior a la exposición. Ejemplo 15 Evaluación de la conservación del epítopo reconocido por CR57 y CR04-098. La región de enlace mínimo de CR-57 (aminoácidos KLCGVL dentro de SEQ ID NO: 332, la región de la glicoproteína del virus de la rabia reconocida por CR57 cuando se determina por medio de PEPSCAN y tecnología de barrido de alanina) se alineó con secuencias de nucleótidos de los aislados del virus de la rabia del genotipo 1 229 para evaluar la conservación del epítopo (ver tabla 18) . El conjunto de muestras contenía aislados humanos, aislados de murciélago y aislados de caninos o de animales domésticos que más probablemente fueron mordidos por caninos con rabia. El análisis de frecuencia de los aminoácidos en cada posición dentro de la región mínima de enlace reveló que los residuos críticos que constituyen el epítopo estuvieron altamente conservados. La lisina en la posición uno se conservó en 99.6% de los aislados, mientras que en solamente 1/229 aislados se observó una mutación conservadora K > R. Las posiciones dos y tres (L y C) se conservaron por completo. Se cree que el residuo central de cisteína está involucrado estructuralmente en el pliegue de glicoproteína y se conserva entro todos los lisavirus (ver Badrane and Tordo, 2001) . La glicina en la posición cuatro se conservó en 98.7% de los aislados, mientras que en los aislados 3/229 las mutaciones hacia los aminoácidos cargados (G > R en 1/229; G > E en 2/229) se observaron. La quinta posición también se conservó con la excepción de un aislado en donde una mutación V > I conservadora se observó. En la sexta posición, la cual no es un residuo crítico cuando se determina por un barrido de reemplazo de alanina, se observó una heterogeneidad importante en los aislados de la calle: L en 70.07%, P en 26.7% y S en 2.6% de las cepas, respectivamente. Al tomarse en conjunto, aproximadamente 99% de los virus de la rabia que se pueden encontrar se predice que se reconozcan por el anticuerpo CR-57. 123 de estos 229 aislados de virus se analizaron por la presencia de mutaciones tanto en el epítopo CR-57 como CR04-098. Ninguno de estos 123 virus de la calle contenían mutaciones en ambos epítopos. La mutación N>D cuando se observa en los virus de escape E98 estuvo presente solamente en cinco aislados de virus. Estos virus fueron geográficamente diferentes y aislados de animales en África (ver la figura 9 para el árbol filogenético; los cinco aislados de virus, esto es AF325483, AF325482, AF325481, AF325480 y AF325485 se indican en negritas) . El análisis filogenético de las secuencias de glicoproteína revelaron que los virus de la rabia con los epítopos mutados CR57 se relacionan solamente de manera lejana por los virus de la rabia que transportan un epítopo mutado CR04-098. Por lo tanto, la probabilidad de encontrar un virus de la rabia resistente a la neutralización por un cóctel de CR-57 y CR04-098 está virtualmente ausente. Tabla 1: Potencia neutralizada de CR-57 y CR-JB contra virus de tipo silvestre y escape.

Tabla 2 : Cebadores de región variables de cadena lambda humana (sentido) . Tabla 3 : Cebadores de región variable de cadena kappa humana (sentido) .

Tabla 4: Los cebadores de región variable de cadena kappa humana se extienden con sitios de restricción Salí (sentido) , los cebadores de región J de cadena kappa humana (anti-sentido) , los cebadores de región variable de cadena lambda humana con sitios de restricción Salí (sentido) y los cebadores de región J de cadena lambda humana se extienden con sitio de restricción Notl (anti-sentido) .

Tabla 5: Distribución de los productos de cadena ligera diferentes durante las 10 fracciones.

Tabla 6 : Cebadores de región variable de cadena pesada IgG humana (sentido) .

Tabla 7 : Los cebadores de región variable de cadena pesada IgG humana se extienden con sitios de restricción Sfil/Ncol (sentido) y los cebadores de región J de cadena pesada IgG se extienden con sitios de restricción XhoI/BstEII (antisentido) .

Tabla 8: Enlace de la cadena sencilla (scFv) anticuerpos fago a la proteína de virus G de rabia (cepa ERA) y a FBS cuando se mide por ELISA.

Tabla 9: Datos de la cadena sencilla Fv capaces de enlazar la proteína de virus G de rabia.

Tabla 10: Datos de los ensayos para la actividad que neutraliza el virus de la rabia de scFvs. Tabla HA: Datos del ensayo para medir la actividad neutralizada de scFvs para el escape E57 de los virus E57A2, E57A3 y E57B1. 1* es 50% de dilución de punto final * es 50% de dilución de punto final WHO estándar (2 IU/mi; * es Potencia (IU/ml) Tabla 11B: Datos del ensayo para medir la actividad neutralizada de scFvs para el escape E57 de los virus E57B2, E57B3 y E57C3. 1* es 50% de dilución de punto final 2* es 50% de dilución de punto final WHO estándar (2 IU/ml) 3* es Potencia (IU/ml) Tabla 12: Oligonucleótidos usados para la amplificación PCR de los genes VH.

Tabla 13 : Oligonucleótidos usados para la amplificación PCR de los genes VL.

Tabla 14: Enlace de los anticuerpos monoclonales humanos CR57, CRJB y CR04-010 (10 µg/ml) a los péptidos lineales del dominio extracelular de la glicoproteína G de la cepa del virus de la rabia ERA.

Tabla 15: Potencias neutralizadas de la proteína IgGs del virus G anti-rabia. ND no se determinó Tabla 16: Potencia neutralizadas de proteína IgGs de virus S anti-rabia contra virus del escape E57. *0 indica ningún punto final al 50% a una dilución de 1:100 del anticuerpo. Tabla 17. Potencia neutralizada de CR-57 contra el virus de escape E98. *cero indica ningún punto final al 50% a una dilución de 1:1000 del anticuerpo.

Tabla 18: Presencia de los residuos de aminoácidos en la región de enlace mínima de Cr57 dentro del virus de la rabia del genotipo 1.

*Porcentaje de presencia de cada aminoácidos se muestra dentro de 229 virus de la rabia aislados. REFERENCIAS Ameyama S, Toriumi H, Takahashi T, Shimura Y, Nakahara T, Honda Y, Mifune K, Uchiyama T and Kawai A (2003), Monoclonal antibody #3-9-16 recognizes one of the two isoforms of rabies virus matrix protein that exposes its N-terminus on the virion surface. Microbiol. Immunol . 47:639-651. Badrane H and Tordo N (2001) , Host switching in Lisavirus history from the Chiroptera to the Carnívora orders . J. Virol. 75:8096-8104. Benmansour A, Leblois H, Coulon P, Tuffereau C, Gaudin Y, Flamand A, and Lafay F (1991) , Antigenicity of rabies virus glycoprotein. J. Virol. 65:4198-4203. Boel E, Verlaan S, Poppelier MJ, Westerdaal NA, Van Strijp JA and Logtenberg T (2000) , Functional human monoclonal antibodies of all isotypes constructed from phage display library-derived single-chain Fv antibody fragments . J. Immunol. Methods 239:153-166. Bunschoten H, Gore M, Claassen IJ, Uytdehaag FG, Dietzschold B, Wunner WH, and Osterhaus AD (1989), Characterization of a new virus-neutralizing epitope that denotes a sequential determinant on the rabies virus glycoprotein. J. Gen. Virol. 70 (Pt 2) : 291-8. Burton DR and Barbas CF (1994) , Human antibodies from combinatorial libraries. Adv. Immunol . 57:191-280. Champion JM, Kean RB, Rupprecht CE, Notkins AL, Koprowski H, Dietzschold B, and Hooper DC (2000), The development of monoclonal human rabies virus-neutralizing antibodies as a substitute for pooled human immune globulin in the prophylactic treatment of rabies virus exposure. J. Immunol . Methods 235:81-90. Chou TC and Talalay P (1984) , Quantitative analysis of dose-effect relationships : the combined effects of múltiple drugs or enzyme inhibitors. Adv. Enzyme Regul. 22:27-55. Coulon P, Ternaux JP, Flamand A, and Tuffereau C (1998) , An avirulent mutant of rabies virus is unable to infect motoneurons in vivo and in vitro. J. Virol. 72:273-278. De Kruif J, Terstappen L, Boel E and Logtenberg T (1995a) , Rapid selection of cell subpopulation-specific human monoclonal antibodies from a synthetic phage antibody library.

Proc. Nati. Acad. Sci. USA 92:3938. De Kruif J, Boel E and Logtenberg T (1995b) , Selection and application of human single-chain Fv antibody fragments from a semi-synthetic phage antibody display library with designed CDR3 regions. J. Mol. Biol. 248:97-105. Dietzschold B, Wunner WH, Wiktor TJ, Lopes AD, Lafon M, Smith CL, and Koprowski H (1983), Characterization of an antigenic determinant of the glycoprotein that correlates with pathogenicity of rabies virus. Proc. Nati. Acad. Sci. USA 80:70-74. Dietzschold B, Gore M, Casali P, Ueki Y, Rupprecht CE, Notkins AL, and Koprowski H (1990) , Biological characterization of human monoclonal antibodies to rabies virus. J. Virol. 64:3087-3090. Hanlon CA, DeMattos CA, DeMattos CC, Niezgoda M, Hooper DC, Koprowski H, Notkins A, and Rupprecht CE (2001) , Experimental utility of rabies virus neutralizing human monoclonal antibodies in post-exposure prophylaxis. Vaccine 19:3834-3842. Huís G, Heijnen IJ, Cuomo E, van der Linden J, Boel E, van de Winkel J and Logtenberg T (1999), Antitumor immune effector mechanisms recruited by phage display-derived fully human IgGl and igAl monoclonal antibodies. Cáncer Res. 59:5778-5784. Jones D, Kroos N, Anema R, van Montfort B, Vooys A, van der Kraats S, van der Helm E, Smits S, Schouten J, Brouwer K, Lagerwerf F, van Berkel P, Opstelten DJ, Logtenberg T and Bout A (2003), High-level expression of recombinant IgG in the human cell line PER.C6. Biotechnol. Prog. 19:163-168. Lafon M, Wiktor TJ, and Macfarlan Rl (1983), Antigenic sites on the CVS rabies virus glycoprotein: analysis with monoclonal antibodies. J. Gen. Virol. 64 (Pt 4). 843-851. Luo TR, Minamoto N, Ito H, Goto H, Hiraga S, Ito N, Sugiyama M, and Kinjo T (1997) , A virus-neutralizing epitope on the glycoprotein of rabies virus that contains Trp251 is a linear epítopo. Virus Res. 51:35-41. Madhusudana SN, Shamsundar R and Seetharaman S (2004) , In vitro inactivation of the rabies virus by ascorbic acid. Int. J. Infect. Dis. 8:21-25. Ni Y, Tominaga Y, Honda Y, Morimoto K, Sakamoto S, and Kawai A (1995) , Mapping and characterization of a sequential epitope on the rabies virus glycoprotein which is recognized by a neutralizing monoclonal antibody, RG719. Microbiol. Immunol. 39:693-702. Prehaud C, Coulon P, LaFay F, Thiers C, and Flamand A (1988) , Antigenic site II of the rabies virus glycoprotein: structure and role in viral virulence. J. Virol. 62:1-7. Schumacher CL, Dietzschold B, Ertl HC, Niu HS, Rupprecht CE, and Koprowski H (1989), Use of mouse anti-rabies monoclonal antibodies in postexposure treatment of rabies. J.

Clin. Invest. 84:971-975. Seif I, Coulon P, Rollin E, and Flamand A (1985) Rabies virulence: effect on pathogenicicty and sequence characterization of rabies virus mutations affecting antigenic site III of the glycoprotein. J. Virol. 53:926-934. Slootstra JW, Puijk WC, Ligtvoet GJ, Langeveld JP, Meloen RH 1996. Structural aspects of antibody-antigen interaction revealed through small random peptide libraries. Mol. Divers . 1:87-96. Tordo N (1996), Characteristics and molecular biology of rabies virus. In Meslin F-X, Kaplan MM, Koprowski H, editors. Laboratory Techniques in rabies, 4th edition Geneva, Switzerland: World Health Organization. White LA and Chappell WA (1982), Inactivation of rabies virus in reagents used for the fluorescent rabies antibody test. J. Clin. Microbiol. 16:253-256. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a cabo la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES
Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones. 1. Un método para identificar una molécula de enlace específicamente enlazada a un virus de la rabia o una molécula de ácido nucleico que codifica una molécula de enlace específicamente enlazada a un virus de la rabia, caracterizado porque el método comprende las etapas de: a) poner en contacto una colección de moléculas de enlace en la superficie de paquetes genéticos replicables con un virus de la rabia bajo condiciones oportunas para enlace, en donde la colección de moléculas de enlace se prepara a partir del ARN aislado de células obtenidas de un sujeto que es vacunado contra la rabia o que se expone al virus de la rabia. b) seleccionar al menos una vez las moléculas de enlace enlazadas al virus de la rabia, y c) separar y recuperar las moléculas de enlace enlazadas al virus de la rabia. 2. Un método para identificar una molécula de enlace que tiene potencialmente actividad neutralizada contra un virus de la rabia o una molécula de ácido nucleico que codifica una molécula de enlace que tiene potencialmente actividad neutralizada contra un virus de la rabia, caracterizado porque el método comprende las etapas de: a) poner en contacto una colección de moléculas de enlace en la superficie de paquetes genéticos replicables con un virus de la rabia bajo condiciones oportunas para enlazar, en donde la colección de molécula de enlace se prepara a partir de ARN aislado de células obtenidas de un sujeto que es vacunado contra la rabia o que se expone al virus de la rabia. b) separar y recuperar las moléculas de enlace que se enlazan al virus de la rabia de las moléculas de enlace que no están enlazadas, c) aislar al menos una molécula de enlace recuperada, d) verificar si la molécula de enlace aislada tiene actividad neutralizada contra el virus de la rabia.
3. El método de conformidad con la reivindicación 2 , caracterizado además porque comprende la etapa de separar y recuperar las moléculas de enlace que contienen un gen de la línea germinal 3-30 variable pesado.
4. El método de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1-3, caracterizado porque el virus de la rabia está inactivo.
5. El método de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1-4, caracterizado porque la colección de moléculas de enlace en la superficie de los paquetes genéticos replicables es una biblioteca de cadena sencilla de Fv.
6. El método de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1-5, caracterizado porque el sujeto es un individuo humano el cual se vacuna contra la rabia.
7. El método de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1-6, caracterizado porque el paquete genético replicable se selecciona del grupo que consiste de una partícula de fago, una bacteria, una levadura, un hongo, una espora de un microorganismo y una ribosoma.
8. Una colección de moléculas de enlace humanas en la superficie de paquetes genéticos replicables, caracterizada porque la colección se prepara de ARN aislado de células obtenidas de un sujeto que es vacunado contra la rabia o que está expuesto al virus de la rabia.
9. La colección de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque la colección es una biblioteca de cadena sencilla Fv.
10. La colección de conformidad con la reivindicación 8 ó 9, caracterizada porque el sujeto es un individuo humano el cual está vacunado contra la rabia.
11. Una molécula de enlace que tiene actividad neutralizada del virus de la rabia, caracterizada porque la molécula de enlace comprende al menos una región CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14
12. La molécula de enlace de conformidad con la reivindicación 11, caracterizada porque la molécula de enlace comprende una cadena pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 39 o aminoácidos 1-119 de la SEQ ID NO: 335.
13. La molécula de enlace de conformidad con las reivindicaciones 11 ó 12, caracterizada porque la molécula de enlace es humana.
14. La variante funcional de una molécula de enlace de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 11-13, caracterizada porque la variante funcional tiene actividad neutralizada del virus de la rabia.
15. Un inmunoconjugado caracterizado porque comprende una molécula de enlace de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 11-13 o una variante funcional de conformidad con la reivindicación 14, el inmunoconjugado además comprende al menos una etiqueta.
16. Una molécula de ácido nucleico caracterizada porque codifica una molécula de enlace de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 11-13 o una variante funcional de conformidad con las reivindicación 14.
17. Un vector caracterizado porque comprende al menos una molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 16.
18. Una célula hospedadora caracterizada porque comprende al menos un vector de conformidad con la reivindicación 17.
19. Una célula hospedadora de conformidad con la reivindicación 18, caracterizada porque es una célula humana.
20. Un método para producir una molécula de enlace de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 11-13 o una variante funcional de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque el método comprende las etapas de: a) cultivar una célula hospedadora de conformidad con la reivindicación 18 ó 19 bajo las condiciones oportunas para la expresión de la molécula de enlace o variante funcional, y opcionalmente, b) recuperar la molécula de enlace expresada o variante funcional.
21. Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende una molécula de enlace de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 11-13, la composición farmacéutica además comprende al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable.
22. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 21, caracterizada porque comprende al menos una molécula de enlace adicional, la molécula de enlace adicional comprende al menos una región CRD3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 25, en donde las molécula de enlace son capaces de hacerse reaccionar con diferentes epítopos del virus de la rabia que no compiten.
23. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 22, caracterizada porque la molécula de enlace adicional comprende una cadena pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 273.
24. Una composición farmacéutica que comprende al menos dos moléculas de enlace neutralizadas del virus de la rabia que son capaces de hacerse reaccionar con diferentes epítopos del virus de la rabia que no compiten, caracterizada porque una primera molécula de enlace neutralizada del virus de la rabia es capaz de hacerse reaccionar con un epítopo localizado en un sitio I antigénico de la proteína G del virus de la rabia y una segunda molécula de enlace de neutralización del virus de la rabia es capaz de hacerse reaccionar con un epítopo localizado en un sitio III antigénico de la proteína G del virus de la rabia.
25. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 24, caracterizada porque en la primera molécula de enlace de neutralización de virus de la rabia comprende al menos una región CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 25 y la segunda molécula de enlace de neutralización de virus de la rabia comprende al menos una región CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de la SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 y SEQ ID NO: 22.
26. La molécula de enlace de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 11-13, una variante funcional de conformidad con la reivindicación 14, un inmunoconjugado de conformidad con la reivindicación 15, o una composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 21-25 para uso como un medicamento .
27. La molécula de enlace de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 11-13, una variante funcional de conformidad con la reivindicación 14, un inmunoconjugado de conformidad con la reivindicación 15, o una composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 21-25, caracterizada porque es para el uso en el diagnóstico, profilaxis, tratamiento o combinación de los mismos, de una condición resultante de virus de la rabia.
28. El uso de una molécula de enlace de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 11-13, una variante funcional de conformidad con la reivindicación 14, un inmunoconjugado de conformidad con la reivindicación 15, o una composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 21-25 en la preparación de un medicamento para el diagnóstico, profilaxis, tratamiento o combinación de los mismos, de una condición que resulta del virus de la rabia.
29. Un kit caracterizado porque comprende al menos una molécula de enlace de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 11-13, al menos una variante funcional de conformidad con la reivindicación 14, al menos un inmunoconjugado de conformidad con la reivindicación 15, o al menos una composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 21-25 o una combinación de los mismos.
30. Una composición farmacéutica que comprende al menos dos anticuerpos monoclonales humanos, caracterizada porque los anticuerpos monoclonales humanos tienen puntos isoeléctricos como se mide por focalización isoeléctrica que difieren menos 1.5 unidades pl .
31. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 30, caracterizada porque los puntos isoeléctricos difieren menos de 1.2 unidades pl .
32. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 30 ó 31, caracterizada porque ambos anticuerpos monoclonales humanos pueden neutralizar un agente infeccioso.
33. La composición farmacéutica de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 30-32, caracterizada porque ambos anticuerpos monoclonales humanos son capaces de neutralizar el virus de la rabia.
34. Una molécula de enlace que tiene actividad neutralizadora del virus de la rabia, caracterizada porque la molécula de enlace comprende al menos una región CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos que comprende la SEQ ID NO: 25, la molécula de enlace tiene una actividad neutralizadora de al menos 2500 IU/mg proteínas.
35. La molécula de enlace de conformidad con la reivindicación 34, caracterizada porque la molécula de enlace comprende una cadena pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos que comprende la SEQ ID NO: 273.
36. La molécula de enlace de conformidad con la reivindicación 34 ó 35, caracterizada porque la molécula de enlace comprende una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos que comprende la SEQ ID NO: 123.
37. La molécula de enlace de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 34-36, caracterizada porque la molécula de enlace es humana.
38. Una molécula de ácido nucleico caracterizada porque codifica una molécula de enlace de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 34-37.
39. Una molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 38, caracterizada porque la molécula de ácido nucleico comprende la secuencia nucleótido que comprende la SEQ ID NO: 122.
40. Un método para producir una molécula de enlace neutralizada del virus de la rabia la cual comprende al menos una región CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos que comprende la SEQ ID NO: 25 en una célula, caracterizado porque comprende las etapas de: proporcionar la célula con una molécula de ácido nucleico que codifica la molécula de enlace, cultivar la célula bajo condiciones oportunas para la expresión de la molécula de enlace y recuperar la molécula de enlace del medio, en donde la célula es una célula PER.C6 como se deposita bajo ECACC no. 96022940 o un derivado del mismo y la molécula de enlace tiene una actividad neutralizada del virus de la rabia de al menos 2500 IU/mg proteínas .
41. El método de conformidad con la reivindicación 40, caracterizado porque la molécula de ácido nucleico comprende la secuencia de nucleótido que comprende la SEQ ID NO: 122.