CN109069627A - 对foxp3衍生肽特异性的t细胞受体样抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明公开的主题提供与Foxp3肽/MHC分子复合物结合的抗原结合蛋白(例如嵌合抗原受体)和抗体或其抗原结合部分。这些抗体、融合蛋白及其缀合物可用于抑制调节性T细胞和治疗癌症。

Description

对FOXP3衍生肽特异性的T细胞受体样抗体
相关申请的交叉引用
本申请要求2016年1月14日提交的美国临时专利申请系列号62/278,815的优先权，要求其优先权并且将其全部内容并入本文。
资助信息
本发明是在来自美国国立卫生研究院(National Institutes of Health)的基金号为NIH NCI p30 ca 008748的政府资助下进行的。政府对本发明公开的主题享有一定的权利。
技术领域
本发明公开的主题总体涉及针对叉头盒P3(“Foxp3”)的抗体，具体是识别与主要组织相容性复合物(“MHC”)分子结合的Foxp3肽的抗体。
背景技术
为了诱导细胞毒性T细胞(“CTL”)应答，细胞内蛋白质通常由蛋白酶体或内吞溶酶体/溶酶体降解，并且所得肽片段与MHC I类或II类分子结合。这些肽-MHC复合物展示在细胞表面，在那里它们通过肽-MHC(pMHC)-T细胞受体(“TCR”)相互作用提供T细胞识别的靶标(Oka等,The Scientific World Journal 2007；7:649-665；Kobayashi等,CancerImmunol.Immunother.2006；55(7):850-860)。
为了提高功效，能够通过单克隆抗体(“mAb”)疗法靶向细胞标志物抗原。Mab疗法已经显示通过多种机制发挥有力的抗肿瘤作用，包括补体依赖性细胞毒作用(“CDC”)、抗体依赖性细胞毒作用(“ADCC”)、和对表达靶分子并具有抑制抗肿瘤免疫应答和有利于肿瘤进展的功能的细胞的直接细胞抑制或诱导细胞凋亡的作用。此外，能够使用mAb作为载体，以特异性地将细胞毒性部分例如放射性核素、细胞毒性药物或毒素递送至靶细胞(Miederer等,Adv Drug Deliv Rev 2008；60(12):1371-1382)。
如果除细胞免疫治疗方法以外，体液免疫治疗方法也可用于靶向非细胞表面抗原，将会存在巨大的受益。因此，在对于包含与MHC分子结合的细胞内蛋白质片段的靶标例如Foxp3肽/HLA-A2复合物具有特异性这方面模拟T细胞受体的mAb，单独或者是作为能够递送强效的抗癌试剂例如药物、毒素和放射性元素的载体，将会是新的、有效的治疗剂。这些mAb也可以用作诊断或预后工具。
表达Foxp3的调节性T(Treg)细胞在维持自身耐受性和免疫稳态中起重要作用。Treg细胞能够抑制体外和体内多种免疫细胞包括CD4+、CD8+ T细胞、自然杀伤(“NK”)细胞、NK-T细胞、B细胞和抗原递呈细胞(APC)的活化、增殖和功能。Treg细胞的功能障碍导致自身免疫性疾病、过敏症和同种异体移植物的耐受性维持。另一方面，Treg细胞还能够抑制抗肿瘤免疫应答并有利于肿瘤进展，因此肿瘤-诱导的调节性T(Treg)细胞的免疫抑制带来成功免疫治疗的主要障碍。认为Treg细胞是抗肿瘤免疫力的最强大抑制剂和成功免疫治疗的最大障碍。Treg扩增及其对肿瘤生长的负面预后意义是在许多类型的癌症中观察到的普遍现象。因此，开发耗尽Treg的策略能帮助重新激活或刺激针对癌细胞的免疫应答。已经尝试了许多用于耗尽或干扰Treg功能的策略，例如，通过CD25、糖皮质激素-诱导的TNF相关蛋白(GITR)特异性的单克隆抗体(mAb)和靶向细胞表面受体CD25的配体-定向毒素(如地尼白介素(Dennileukin diftitox))耗尽Treg。然而，CD25和GITR两者不仅在Treg细胞中表达，而且在活化的CD4和CD8效应T细胞中表达。这些策略的问题是当前可用试剂缺乏特异性，导致有益的抗肿瘤效应T细胞的耗尽。转录因子叉头盒P3(Foxp3)对于Treg的建立和抑制功能是必需的，因此将是消除Treg细胞的高度特异性和理想的靶标。然而，Foxp3是一种成药性差(undruggable)的细胞内蛋白质。因此，对选择性抑制Treg细胞的药物存在大量未满足的需求。
发明内容
本发明公开的主题鉴定且表征能够靶向Foxp3转录因子的抗原结合蛋白，如抗体和嵌合抗原受体。本发明公开的抗体靶向肽/MHC复合物，因为其通常将在Foxp3蛋白的抗原加工和由细胞递呈之后出现在细胞的表面上。在某些实施方式中，本发明公开的抗体是T细胞受体模拟物(TCRm)抗体。在某些实施方式中，TCRm抗体模拟T细胞受体在于，当肽结合于MHC抗原(例如，人MHC分子)时，抗体具有特异性识别并结合MHC-限制性形式的肽的能力。肽/MHC复合物重演抗原，因为其通常将在Foxp3蛋白的抗原加工和递呈至T-细胞之后出现在细胞表面上。在某些实施方式中，TCRm抗体是可溶性抗体，其功能类似于T细胞受体之处在于它们识别HLA沟(相比于肽来源的完整蛋白质的3D拓扑结构)中递呈的肽并且能够引发下游T-细胞免疫效应物。
在某些非限制性实施方式中，抗体或其抗原结合部分在Foxp3的配偶体MHC分子不存在的情况下不与其靶标Foxp3肽结合。在某些非限制性实施方式中，抗体或其抗原结合部分在Foxp3的配偶体MHC分子不存在的情况下与其靶Foxp3肽结合，其结合亲和力比抗体或其抗原结合部分与肽/MHC复合物的结合亲和力低至少10倍、或至少100倍、或至少1000倍。
本文公开的抗体特异性地识别并结合肽/MHC复合物(例如，Foxp3/HLA复合物，更具体地，Foxp3/HLA I类复合物，更具体地，Foxp3/HLA-A复合物，以及更具体地，Foxp3/HLA-A2复合物，甚至更具体地，Foxp3/HLA-A*02:01复合物)的表位。作为人MHC-肽复合物一部分的由本发明公开主题的抗原结合蛋白识别的Foxp3肽的实例包括但不限于，具有SEQ IDNO:2所示氨基酸序列的Foxp3-1或其一部分、具有SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的Foxp3-2或其一部分、具有SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的Foxp3-3或其一部分、具有SEQ ID NO:5所示氨基酸序列的Foxp3-4或其一部分、具有SEQ ID NO:6所示氨基酸序列的Foxp3-5或其一部分、具有SEQ ID NO:7所示氨基酸序列的Foxp3-6或其一部分、和具有SEQ ID NO:8所示氨基酸序列的Foxp3-7或其一部分。
因此，在某些实施方式中，本发明公开的主题提供一种分离的抗体或其抗原结合部分，该抗体或其抗原结合部分与结合于人MHC分子的Foxp3肽结合。Foxp3肽与MHC分子结合以形成Foxp3/MHC复合物。在某些实施方式中，MHC分子是HLA I类分子。在某些实施方式中，HLA I类分子是HLA-A。在某些实施方式中，HLA-A是HLA-A2。在某些实施方式中，HLA-A2是HLA-A*02:01。
在某些实施方式中，Foxp3肽是包含SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的人Foxp3多肽的一部分。在某些实施方式中，Foxp3肽具有8-12个氨基酸的长度。在某些实施方式中，Foxp3肽具有9个氨基酸的长度。在某些实施方式中，Foxp3肽具有10个氨基酸的长度。
在某些实施方式中，抗体或抗原结合部分与具有SEQ ID NO:8所示氨基酸序列的Foxp3-7结合。在某些实施方式中，抗体或抗原结合部分与Foxp3-7的一部分结合。在某些实施方式中，与Foxp3-7或其一部分结合的抗体或其抗原结合部分包含选自以下的重链可变区CDR3序列和轻链可变区CDR3序列：(a)包含SEQ ID NO:11所示氨基酸序列或其修饰的重链可变区CDR3序列、和包含SEQ ID NO:14所示氨基酸序列或其修饰的轻链可变区CDR3序列；(b)包含SEQ ID NO:17所示氨基酸序列或其修饰的重链可变区CDR3序列、和包含SEQ IDNO:20所示氨基酸序列或其修饰的轻链可变区CDR3序列；(c)包含SEQ ID NO:23所示氨基酸序列或其修饰的重链可变区CDR3序列、和包含SEQ ID NO:26所示氨基酸序列或其修饰的轻链可变区CDR3序列；(d)包含SEQ ID NO:29所示氨基酸序列或其修饰的重链可变区CDR3序列、和包含SEQ ID NO:32所示氨基酸序列或其修饰的轻链可变区CDR3序列；(e)包含SEQ IDNO:35所示氨基酸序列或其修饰的重链可变区CDR3序列、和包含SEQ ID NO:38所示氨基酸序列或其修饰的轻链可变区CDR3序列；(f)包含SEQ ID NO:41所示氨基酸序列或其修饰的重链可变区CDR3序列、和包含SEQ ID NO:44所示氨基酸序列或其修饰的轻链可变区CDR3序列；(g)包含SEQ ID NO:47所示氨基酸序列或其修饰的重链可变区CDR3序列、和包含SEQ IDNO:50所示氨基酸序列或其修饰的轻链可变区CDR3序列；和(h)包含SEQ ID NO:53所示氨基酸序列或其修饰的重链可变区CDR3序列、和包含SEQ ID NO:56所示氨基酸序列或其修饰的轻链可变区CDR3序列。在某些实施方式中，与Foxp3-7或其一部分结合的抗体或其抗原结合部分还包含选自以下的重链可变区CDR2序列和轻链可变区CDR2序列：(a)包含SEQ ID NO:10所示氨基酸序列或其修饰的重链可变区CDR2序列、和包含SEQ ID NO:13所示氨基酸序列或其修饰的轻链可变区CDR2序列；(b)包含SEQ ID NO:16所示氨基酸序列或其修饰的重链可变区CDR2序列、和包含SEQ ID NO:19所示氨基酸序列或其修饰的轻链可变区CDR2序列；(c)包含SEQ ID NO:22所示氨基酸序列或其修饰的重链可变区CDR2序列、和包含SEQ IDNO:25所示氨基酸序列或其修饰的轻链可变区CDR2序列；(d)包含SEQ ID NO:28所示氨基酸序列或其修饰的重链可变区CDR2序列、和包含SEQ ID NO:31所示氨基酸序列或其修饰的轻链可变区CDR2序列；(e)包含SEQ ID NO:34所示氨基酸序列或其修饰的重链可变区CDR2序列、和包含SEQ ID NO:37所示氨基酸序列或其修饰的轻链可变区CDR2序列；(f)包含SEQ IDNO:40所示氨基酸序列或其修饰的重链可变区CDR2序列、和包含SEQ ID NO:43所示氨基酸序列或其修饰的轻链可变区CDR2序列；(g)包含SEQ ID NO:46所示氨基酸序列或其修饰的重链可变区CDR2序列、和包含SEQ ID NO:49所示氨基酸序列或其修饰的轻链可变区CDR2序列；和(h)包含SEQ ID NO:52所示氨基酸序列或其修饰的重链可变区CDR2序列、和包含SEQID NO:55所示氨基酸序列或其修饰的轻链可变区CDR2序列。在某些实施方式中，与Foxp3-7或其一部分结合的抗体或其抗原结合部分还包含选自以下的重链可变区CDR1序列和轻链可变区CDR1序列：(a)包含SEQ ID NO:9所示氨基酸序列或其修饰的重链可变区CDR1序列、和包含SEQ ID NO:12所示氨基酸序列或其修饰的轻链可变区CDR1序列；(b)包含SEQ IDNO:15所示氨基酸序列或其修饰的重链可变区CDR1序列、和包含SEQ ID NO:18所示氨基酸序列或其修饰的轻链可变区CDR1序列；(c)包含SEQ ID NO:21所示氨基酸序列或其修饰的重链可变区CDR1序列、和包含SEQ ID NO:24所示氨基酸序列或其修饰的轻链可变区CDR1序列；(d)包含SEQ ID NO:27所示氨基酸序列或其修饰的重链可变区CDR1序列、和包含SEQ IDNO:30所示氨基酸序列或其修饰的轻链可变区CDR1序列；(e)包含SEQ ID NO:33所示氨基酸序列或其修饰的重链可变区CDR1序列、和包含SEQ ID NO:36所示氨基酸序列或其修饰的轻链可变区CDR1序列；(f)包含SEQ ID NO:39所示氨基酸序列或其修饰的重链可变区CDR1序列、和包含SEQ ID NO:42所示氨基酸序列或其修饰的轻链可变区CDR1序列；(g)包含SEQ IDNO:45所示氨基酸序列或其修饰的重链可变区CDR1序列、和包含SEQ ID NO:48所示氨基酸序列或其修饰的轻链可变区CDR1序列；和(h)包含SEQ ID NO:51所示氨基酸序列或其修饰的重链可变区CDR1序列、和包含SEQ ID NO:54所示氨基酸序列或其修饰的轻链可变区CDR1序列。
在某些实施方式中，与Foxp3-7或其一部分结合的抗体或其抗原结合部分包含：(a)包含SEQ ID NO:9所示氨基酸序列的重链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:10所示氨基酸序列的重链可变区CDR2；包含SEQ ID NO:11所示氨基酸序列的重链可变区CDR3；包含SEQ IDNO:12所示氨基酸序列的轻链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:13所示氨基酸序列的轻链可变区CDR2；和包含SEQ ID NO:14所示氨基酸序列的轻链可变区CDR3；(b)包含SEQ ID NO:15所示氨基酸序列的重链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:16所示氨基酸序列的重链可变区CDR2；包含SEQ ID NO:17所示氨基酸序列的重链可变区CDR3；包含SEQ ID NO:18所示氨基酸序列的轻链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:19所示氨基酸序列的轻链可变区CDR2；和包含SEQ IDNO:20所示氨基酸序列的轻链可变区CDR3；(c)包含SEQ ID NO:21所示氨基酸序列的重链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:22所示氨基酸序列的重链可变区CDR2；包含SEQ ID NO:23所示氨基酸序列的重链可变区CDR3；包含SEQ ID NO:24所示氨基酸序列的轻链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:25所示氨基酸序列的轻链可变区CDR2；和包含SEQ ID NO:26所示氨基酸序列的轻链可变区CDR3；(d)包含SEQ ID NO:27所示氨基酸序列的重链可变区CDR1；包含SEQ IDNO:28所示氨基酸序列的重链可变区CDR2；包含SEQ ID NO:29所示氨基酸序列的重链可变区CDR3；包含SEQ ID NO:30所示氨基酸序列的轻链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:31所示氨基酸序列的轻链可变区CDR2；和包含SEQ ID NO:32所示氨基酸序列的轻链可变区CDR3；(e)包含SEQ ID NO:33所示氨基酸序列的重链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:34所示氨基酸序列的重链可变区CDR2；包含SEQ ID NO:35所示氨基酸序列的重链可变区CDR3；包含SEQ IDNO:36所示氨基酸序列的轻链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:37所示氨基酸序列的轻链可变区CDR2；和包含SEQ ID NO:38所示氨基酸序列的轻链可变区CDR3；(f)包含SEQ ID NO:39所示氨基酸序列的重链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:40所示氨基酸序列的重链可变区CDR2；包含SEQ ID NO:41所示氨基酸序列的重链可变区CDR3；包含SEQ ID NO:42所示氨基酸序列的轻链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:43所示氨基酸序列的轻链可变区CDR2；和包含SEQ IDNO:44所示氨基酸序列的轻链可变区CDR3；(g)包含SEQ ID NO:45所示氨基酸序列的重链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:46所示氨基酸序列的重链可变区CDR2；包含SEQ ID NO:47所示氨基酸序列的重链可变区CDR3；包含SEQ ID NO:48所示氨基酸序列的轻链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:49所示氨基酸序列的轻链可变区CDR2；和包含SEQ ID NO:50所示氨基酸序列的轻链可变区CDR3；或(h)包含SEQ ID NO:51所示氨基酸序列的重链可变区CDR1；包含SEQID NO:52所示氨基酸序列的重链可变区CDR2；包含SEQ ID NO:53所示氨基酸序列的重链可变区CDR3；包含SEQ ID NO:54所示氨基酸序列的轻链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:55所示氨基酸序列的轻链可变区CDR2；和包含SEQ ID NO:56所示氨基酸序列的轻链可变区CDR3。在某些实施方式中，与Foxp3-7或其一部分结合的抗体或其抗原结合部分包含：包含SEQ IDNO:39所示氨基酸序列的重链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:40所示氨基酸序列的重链可变区CDR2；包含SEQ ID NO:41所示氨基酸序列的重链可变区CDR3；包含SEQ ID NO:42所示氨基酸序列的轻链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:43所示氨基酸序列的轻链可变区CDR2；和包含SEQ ID NO:44所示氨基酸序列的轻链可变区CDR3。
在某些实施方式中，与Foxp3-7或其一部分结合的抗体或其抗原结合部分包含：包含与选自SEQ ID NO:93、95、97、99、101、103、105和107的序列至少约80％同源、或至少约90％同源、或至少约95％同源、或至少约98％同源的氨基酸序列的重链可变区，和/或包含与选自SEQ ID NO:94、96、98、100、102、104、106和108的序列至少约80％同源、或至少约90％同源、或至少约95％同源、或至少约98％同源的氨基酸序列的轻链可变区。这些抗体或其抗原结合部分包含：(a)包含SEQ ID NO:93所示氨基酸序列的重链可变区、和包含SEQ IDNO:94所示氨基酸序列的轻链可变区；(b)包含SEQ ID NO:95所示氨基酸序列的重链可变区、和包含SEQ ID NO:96所示氨基酸序列的轻链可变区；(c)包含SEQ ID NO:97所示氨基酸序列的重链可变区、和包含SEQ ID NO:98所示氨基酸序列的轻链可变区；(d)包含SEQ IDNO:99所示氨基酸序列的重链可变区、和包含SEQ ID NO:100所示氨基酸序列的轻链可变区；(e)包含SEQ ID NO:101所示氨基酸序列的重链可变区、和包含SEQ ID NO:102所示氨基酸序列的轻链可变区；(f)包含SEQ ID NO:103所示氨基酸序列的重链可变区、和包含SEQID NO:104所示氨基酸序列的轻链可变区；(g)包含SEQ ID NO:105所示氨基酸序列的重链可变区、和包含SEQ ID NO:106所示氨基酸序列的轻链可变区；或(h)包含SEQ ID NO:107所示氨基酸序列的重链可变区、和包含SEQ ID NO:108所示氨基酸序列的轻链可变区。在某些实施方式中，与Foxp3-7或其一部分结合的抗体或其抗原结合部分包含：包含SEQ ID NO:103所示氨基酸序列的重链可变区、和包含SEQ ID NO:104所示氨基酸序列的轻链可变区。
在某些实施方式中，抗体或抗原结合部分与具有SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的Foxp3-2或其一部分结合。在某些实施方式中，与Foxp3-2或其一部分结合的抗体或其抗原结合部分包含选自以下的重链可变区CDR3序列和轻链可变区CDR3序列：(a)包含SEQ IDNO:59所示氨基酸序列或其修饰的重链可变区CDR3序列、和包含SEQ ID NO:62所示氨基酸序列或其修饰的轻链可变区CDR3序列；(b)包含SEQ ID NO:65所示氨基酸序列或其修饰的重链可变区CDR3序列、和包含SEQ ID NO:68所示氨基酸序列或其修饰的轻链可变区CDR3序列；(c)包含SEQ ID NO:71所示氨基酸序列或其修饰的重链可变区CDR3序列、和包含SEQ IDNO:74所示氨基酸序列或其修饰的轻链可变区CDR3序列；(d)包含SEQ ID NO:77所示氨基酸序列或其修饰的重链可变区CDR3序列、和包含SEQ ID NO:80所示氨基酸序列或其修饰的轻链可变区CDR3序列；和(e)包含SEQ ID NO:83所示氨基酸序列或其修饰的重链可变区CDR3序列、和包含SEQ ID NO:86所示氨基酸序列或其修饰的轻链可变区CDR3序列。在某些实施方式中，与Foxp3-2或其一部分结合的抗体或其抗原结合部分还包含选自以下的重链可变区CDR2序列和轻链可变区CDR2序列：(a)包含SEQ ID NO:58所示氨基酸序列或其修饰的重链可变区CDR2序列、和包含SEQ ID NO:61所示氨基酸序列或其修饰的轻链可变区CDR2序列；(b)包含SEQ ID NO:64所示氨基酸序列或其修饰的重链可变区CDR2序列、和包含SEQ IDNO:67所示氨基酸序列或其修饰的轻链可变区CDR2序列；(c)包含SEQ ID NO:70所示氨基酸序列或其修饰的重链可变区CDR2序列、和包含SEQ ID NO:73所示氨基酸序列或其修饰的轻链可变区CDR2序列；(d)包含SEQ ID NO:76所示氨基酸序列或其修饰的重链可变区CDR2序列、和包含SEQ ID NO:79所示氨基酸序列或其修饰的轻链可变区CDR2序列；和(e)包含SEQID NO:82所示氨基酸序列或其修饰的重链可变区CDR2序列、和包含SEQ ID NO:85所示氨基酸序列或其修饰的轻链可变区CDR2序列。在某些实施方式中，与Foxp3-2或其一部分结合的抗体或其抗原结合部分还包含选自以下的重链可变区CDR1序列和轻链可变区CDR1序列：(a)包含SEQ ID NO:57所示氨基酸序列或其修饰的重链可变区CDR1序列、和包含SEQ IDNO:60所示氨基酸序列或其修饰的轻链可变区CDR1序列；(b)包含SEQ ID NO:63所示氨基酸序列或其修饰的重链可变区CDR1序列、和包含SEQ ID NO:66所示氨基酸序列或其修饰的轻链可变区CDR1序列；(c)包含SEQ ID NO:69所示氨基酸序列或其修饰的重链可变区CDR1序列、和包含SEQ ID NO:71所示氨基酸序列或其修饰的轻链可变区CDR1序列；(d)包含SEQ IDNO:75所示氨基酸序列或其修饰的重链可变区CDR1序列、和包含SEQ ID NO:78所示氨基酸序列或其修饰的轻链可变区CDR1序列；和(e)包含SEQ ID NO:81所示氨基酸序列或其修饰的重链可变区CDR1序列、和包含SEQ ID NO:84所示氨基酸序列或其修饰的轻链可变区CDR1序列。
在某些实施方式中，与Foxp3-2或其一部分结合的抗体或其抗原结合部分包含：(a)包含SEQ ID NO:57所示氨基酸序列的重链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:58所示氨基酸序列的重链可变区CDR2；包含SEQ ID NO:59所示氨基酸序列的重链可变区CDR3；包含SEQID NO:60所示氨基酸序列的轻链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:61所示氨基酸序列的轻链可变区CDR2；和包含SEQ ID NO:62所示氨基酸序列的轻链可变区CDR3；(b)包含SEQ ID NO:63所示氨基酸序列的重链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:64所示氨基酸序列的重链可变区CDR2；包含SEQ ID NO:65所示氨基酸序列的重链可变区CDR3；包含SEQ ID NO:66所示氨基酸序列的轻链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:67所示氨基酸序列的轻链可变区CDR2；和包含SEQ ID NO:68所示氨基酸序列的轻链可变区CDR3；(c)包含SEQ ID NO:69所示氨基酸序列的重链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:70所示氨基酸序列的重链可变区CDR2；包含SEQ IDNO:71所示氨基酸序列的重链可变区CDR3；包含SEQ ID NO:72所示氨基酸序列的轻链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:73所示氨基酸序列的轻链可变区CDR2；和包含SEQ ID NO:74所示氨基酸序列的轻链可变区CDR3；(d)包含SEQ ID NO:75所示氨基酸序列的重链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:76所示氨基酸序列的重链可变区CDR2；包含SEQ ID NO:77所示氨基酸序列的重链可变区CDR3；包含SEQ ID NO:78所示氨基酸序列的轻链可变区CDR1；包含SEQ IDNO:79所示氨基酸序列的轻链可变区CDR2；和包含SEQ ID NO:80所示氨基酸序列的轻链可变区CDR3；或(e)包含SEQ ID NO:81所示氨基酸序列的重链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:82所示氨基酸序列的重链可变区CDR2；包含SEQ ID NO:83所示氨基酸序列的重链可变区CDR3；包含SEQ ID NO:84所示氨基酸序列的轻链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:85所示氨基酸序列的轻链可变区CDR2；和包含SEQ ID NO:86所示氨基酸序列的轻链可变区CDR3。
在某些实施方式中，与Foxp3-2或其一部分结合的抗体或其抗原结合部分包含：包含与选自SEQ ID NO:109、111、113、115和117的序列至少约80％同源的氨基酸序列的重链可变区，和/或包含与选自SEQ ID NO:110、112、114、116和118的序列至少约80％同源、或至少约90％同源、或至少约95％同源、或至少约98％同源的氨基酸序列的轻链可变区。这些抗体或其抗原结合部分包含：(a)包含SEQ ID NO:109所示氨基酸序列的重链可变区、和包含SEQ ID NO:110所示氨基酸序列的轻链可变区；(b)包含SEQ ID NO:111所示氨基酸序列的重链可变区、和包含SEQ ID NO:112所示氨基酸序列的轻链可变区；(c)包含SEQ ID NO:113所示氨基酸序列的重链可变区、和包含SEQ ID NO:114所示氨基酸序列的轻链可变区；(d)包含SEQ ID NO:115所示氨基酸序列的重链可变区、和包含SEQ ID NO:116所示氨基酸序列的轻链可变区；或(e)包含SEQ ID NO:117所示氨基酸序列的重链可变区、和包含SEQ IDNO:118所示氨基酸序列的轻链可变区。
在某些实施方式中，抗体或抗原结合部分与具有SEQ ID NO:5所示氨基酸序列的Foxp3-4或其一部分结合。在某些实施方式中，与Foxp3-2或其一部分结合的抗体或其抗原结合部分包含：包含SEQ ID NO:87所示氨基酸序列或其修饰的重链可变区CDR1；包含SEQID NO:88所示氨基酸序列或其修饰的重链可变区CDR2；包含SEQ ID NO:89所示氨基酸序列或其修饰的重链可变区CDR3；包含SEQ ID NO:90所示氨基酸序列或其修饰的轻链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:91所示氨基酸序列或其修饰的轻链可变区CDR2；和包含SEQ ID NO:92所示氨基酸序列或其修饰的轻链可变区CDR3。
在某些实施方式中，与Foxp3-4或其一部分结合的抗体或其抗原结合部分包含：包含与SEQ ID NO:119的序列至少约80％同源、或至少约90％同源、或至少约95％同源、或至少约98％同源的氨基酸序列的重链可变区，和/或包含与SEQ ID NO:120的序列至少约80％同源的氨基酸序列的轻链可变区。在某些实施方式中，与Foxp3-4或其一部分结合的抗体或其抗原结合部分包含：包含SEQ ID NO:119所示氨基酸序列的重链可变区、和/或包含SEQID NO:120所示氨基酸序列的轻链可变区。
修饰可以是一个或多个缺失、插入、和/或取代。其修饰可以包含不超过2、不超过3、不超过4、或不超过5个修饰。该修饰可以是保守性修饰或非保守性修饰。
在某些实施方式中，抗体或其抗原结合部分与Foxp3肽的N-末端结合。在某些实施方式中，抗体或其抗原结合部分与Foxp3肽的C-末端结合。抗体或其抗原结合部分与Foxp3肽特异性地结合，例如，以1×10-7M或更小的结合亲和力(KD)与Foxp3肽结合。
本发明公开的主题还提供分离的抗体或其抗原结合部分，该抗体或其抗原结合部分(i)与本文公开的任何抗体或其抗原结合部分交叉竞争与结合于人MHC分子的Foxp3肽的结合，并且(ii)以约5×10-7M或更小的结合亲和力(KD)与Foxp3肽特异性地结合。
在某些非限制性实施方式中，抗体或其抗原结合部分在Foxp3的配偶体MHC分子不存在的情况下不与其靶标Foxp3肽结合，或以低至少10倍、或至少100倍、或至少1000倍的亲和力与之结合。
本发明公开的主题还提供分离的抗体或其抗原结合部分，该抗体或其抗原结合部分与本文公开的任何抗体或其抗原结合部分与结合于人MHC分子的Foxp3肽上的相同的或基本上重叠的等效表位结合。
在某些实施方式中，抗体或其抗原结合部分是全人抗体或其抗原结合部分。某些实施方式中，抗体或其抗原结合部分是嵌合抗体或其抗原结合部分。在某些实施方式中，抗体或其抗原结合部分是人源化抗体或其抗原结合部分。在某些实施方式中，抗体的抗原结合部分是Fab、Fab'、F(ab')2、Fv或单链Fv(scFv)。在某些实施方式中，抗体或其抗原结合部分是IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4同种型。在某些实施方式中，抗体或其抗原结合部分是IgG1同种型。在某些实施方式中，抗原结合部分与一个或多个非免疫球蛋白成分包含在融合蛋白中。
在某些实施方式中，上述抗体包含一个或多个翻译后修饰。在某些非限制性实施方式中，一个或多个翻译后修饰包括无岩藻糖基化(afucosylation)。例如，抗体包含无岩藻糖基化(afucosylated)的Fc区。
另一方面，本发明公开的主题提供一种免疫缀合物，其包含第一组分，该第一组分为本文公开的抗原结合蛋白、抗体或其抗原结合部分。免疫缀合物包含第二组分，该第二组分为细胞毒素、可检测标记、放射性同位素、治疗剂、具有第二氨基酸序列的结合蛋白或分子。在第二组分为结合蛋白或第二抗体时，结合蛋白或第二抗体对与第一抗体特异性的HLA-肽复合物不同的靶标具有结合特异性。
因此，在相关方面，本发明公开的主题提供一种包含本文所述的抗原结合蛋白或其功能性片段的双特异性抗体。在某些实施方式中，该双特异性抗体识别结合于MHC分子的Foxp3肽(Foxp3/MHC复合物)和细胞表面蛋白。在某些实施方式中，细胞表面蛋白是CD3或CD16。
在又一方面，本发明公开的主题提供对Foxp3肽/HLA复合物(例如，Foxp3/HLA I类复合物，更具体地，Foxp3/HLA-A复合物，以及更具体地，Foxp3/HLA-A2复合物，甚至更具体地，Foxp3/HLA-A*02:01复合物)特异性的抗原结合蛋白，包括抗体和嵌合抗原受体(CAR)。本发明公开的主题还提供编码本发明公开的CAR的核酸、包含这些核酸的载体，包括促进根据本发明公开的主题的抗原结合蛋白(例如抗体或CAR)的表达和/或分泌的载体。
在另一相关的方面，本发明公开的主题提供包含本文所公开的核酸或抗原结合蛋白的宿主细胞，包括重组免疫效应细胞，比如，基因修饰成表达包含根据本发明公开主题的抗原结合区的CAR的T-细胞。在某些实施方式中，该宿主细胞是T细胞。在某些实施方式中，该宿主细胞是Treg细胞。本发明公开的主题还包括改造成产生根据本公开内容的抗体的细胞。
在相关的方面，本发明公开的主题提供包含本文公开的抗原结合蛋白、抗体、核酸、包含该核酸或抗原结合蛋白的载体或细胞，连同药学上可接受的载体的药物组合物。
在另一方面，本发明公开的主题提供一种使用本发明公开主题的Foxp3抗体检测细胞或组织表面上的Foxp3/MHC的方法。
在另一方面，本发明公开的主题提供杀伤受试者中表达Foxp3的细胞的方法。在某些实施方式中，该方法包括向受试者施用本文公开的抗体或其抗原结合部分(包括双特异性抗体)、抗原结合蛋白(包括CAR)、免疫缀合物、编码抗原结合蛋白或抗体的核酸、或包含该核酸或蛋白质的细胞。
在另一方面，本发明公开的主题提供诱导受试者的免疫应答的方法。在某些实施方式中，该方法包括向受试者施用本文公开的抗体或其抗原结合部分(包括双特异性抗体)、抗原结合蛋白(包括CAR)、免疫缀合物、编码抗原结合蛋白或抗体的核酸、或包含该核酸或蛋白质的细胞。
在另一方面，本发明公开的主题提供选择性抑制(例如失活、抑制增殖或杀伤)受试者的调节性T细胞的方法。在某些实施方式中，该方法包括向受试者施用本文公开的抗体或其抗原结合部分(包括双特异性抗体)、抗原结合蛋白(包括CAR)、免疫缀合物、编码抗原结合蛋白或抗体的核酸、或包含该核酸或蛋白质的细胞。在某些实施方式中，该方法减少调节性T细胞的数量，耗尽调节性T细胞，抑制调节性T细胞的免疫抑制活性，和/或阻断调节性T细胞运输到淋巴结或肿瘤中。
在又一方面，本发明公开的主题提供用于治疗癌症的方法，其包括向患有癌症的受试者施用治疗有效量的本文公开的抗体或其抗原结合部分(包括双特异性抗体)、抗原结合蛋白(例如CAR)、免疫缀合物、编码抗原结合蛋白或抗体的核酸、或包含该核酸或蛋白质的细胞，从而诱导受试者中癌细胞的死亡。在某些实施方式中，该癌症选自乳腺癌、卵巢癌、黑色素瘤、肺癌、胰腺癌、胃癌、结肠癌、成胶质细胞瘤、肾癌、肝癌、淋巴瘤、白血病、骨髓瘤、肉瘤、及其组合。在某些实施方式中，该受试者是人。在某些实施方式中，该受试者是非人动物比如但不限于非人灵长类动物、狗、猫、马、牛、猪、小鼠、大鼠、仓鼠、兔等。在某些实施方式中，该癌细胞表达Foxp3。
此外，本发明公开的主题提供用于治疗癌症的试剂盒，其包含本文公开的抗体或其抗原结合部分(包括双特异性抗体)、抗原结合蛋白(包括CAR)、免疫缀合物、编码抗原结合蛋白或抗体的核酸、或包含该核酸或蛋白质的细胞。
附图说明
图1A-1D表示Foxp3肽的肽特异性T-细胞应答。(A)来自HLA-A*02:01(也称为“HLA-A0201”或“HLA-A*0201”)供体的CD3 T细胞用Foxp3-4或Foxp3-6肽刺激3轮，并且通过IFN-g酶联免疫斑点测定法(elispot assay)测试针对Foxp3-1、-2、-3、-4、-5或-6肽的T细胞应答。(B)来自相同供体的T细胞用Foxp3-4或-6肽进一步刺激另外2轮，并针对Foxp3-4或Foxp3-6肽进行测试。(C和D)来自不同HLA-A2+供体的T细胞用Foxp3-1或-3(3轮)或Foxp3-2或-5肽(5轮)刺激，并测试针对刺激肽的肽特异性T细胞应答。对照：CD14+ APC和CD14+细胞用无关肽EW进行脉冲。数据代表来自一式三份微孔培养物的平均值+/-SD。
图2A-2D表示Foxp3肽的肽特异性T-细胞应答。(A和B)来自第三个HLA-A*02:01+供体的CD3 T细胞用所示的Foxp3肽刺激5轮，并针对刺激肽进行测试。在不同的实验中，针对脉冲到自体CD14+ APC的刺激肽测试经Foxp3-4、6或-7肽刺激的T细胞(C)，体外产生的未脉冲的Foxp3+ HLA-A2+细胞系MAC-1、MAC2A、Foxp3+ HLA-A2-细胞系Jurkat或CD4+CD25+/HLA-A2+ Treg细胞用作靶细胞(D)。
图3表示Foxp3肽的表位特异性T细胞应答。来自HLA-A*02:01+供体的CD3 T细胞用Foxp3-肽1、2、4、5、6或7刺激4轮，并且通过IFN-γELISPOT测定法，针对Foxp3+/HLA-A2+细胞系MAC-1、MAC-2A或Foxp3+/HLA-A2-细胞系Jurkat测试Foxp3的识别。
图4A-4F表示Foxp3肽的肽特异性T细胞细胞毒性。来自HLA-A*02:01+供体的CD3 T细胞用Foxp3-衍生的肽Foxp3-1、-2、-4、(A、C和E)-5、-6或-7(B、D和F)刺激5轮，并且通过51Cr-释放测定法测量针对T2细胞上刺激肽的细胞毒性。单独的T2细胞或用EW脉冲的T2细胞用作阴性对照。每个数据点代表来自一式三份培养物的平均值+/-SD。
图5A-5D表示在HLA-A0201分子的背景下Foxp3-TLI对肽特异性T细胞应答的诱导。(A)来自HLA-A0*201+Foxp3供体的CD3 T细胞用Foxp3-TLI肽刺激四轮，并通过IFN-γ酶联免疫斑点测定法测试针对TLI肽或无关肽EW的T细胞应答。CD14+ APC用作阴性对照。(B)TLI-刺激的T细胞还识别HLA-A0201+ Treg-样细胞系MAC-1和MAC-2A细胞，但不识别HLA-A0*201-Jurkat细胞。(C和D)将来自相同供体的T细胞刺激五轮，并通过51Cr-释放测定法测量针对脉冲到T2细胞上的刺激肽的细胞毒性(C)，或通过51Cr-释放测定法测量针对未脉冲的靶细胞的细胞毒性(D)。HLA-A0*201阴性AML细胞系HL-60用作阴性对照。(C)T细胞能够杀伤用Foxp3肽脉冲的T2细胞和(D)MAC-1和MAC-2A细胞，但不能杀伤HLA-A0201-HL-60细胞。每个数据点代表来自一式三份培养物的平均值+/-SD。
图6A-6J表示噬菌体scFv克隆与用Foxp3-7肽、Foxp3-2肽和Foxp3-4肽脉冲的T2细胞的结合。(A)来自用于Foxp3-7肽特异性噬菌体克隆的T2细胞流式细胞术分析的代表性数据。阴性对照是无第二抗体、无抗体和无关抗体Pr435。单独的T2细胞(B、D、F)，用对照肽R3脉冲的T2细胞(C、G)，或用EW肽脉冲的T2细胞(E、H)。(I)来自用于Foxp3-2肽特异性噬菌体克隆的T2细胞流式细胞术分析的代表性数据。(J)来自用于Foxp3-4肽特异性噬菌体克隆的T2细胞流式细胞术分析的代表性数据。噬菌体克隆#9、11、17、18、21、26、27、28、32未显示出与单独的T2细胞或用R3肽脉冲的T2细胞的任何显著结合，但与用Foxp3-7肽脉冲的T2细胞结合，克隆#32的结合最强。数据代表来自五个类似实验的数据。染色对照包括未染色的细胞，第二mAb(GAM)或无关噬菌体Pr435-#20。
图7A-7C表示指定双特异性抗体(BsAb)(也称为“BiTE”)构建体与Foxp3+/HLA-A2+T淋巴瘤细胞系MAC-1、MAC-2A和CD3+ T细胞系Jurkat的结合。(A)指定BsAb构建体与Foxp3+/HLA-A2+ T淋巴瘤细胞系MAC-1的结合。由于BsAb构建体是myc-标记的，因此该结合通过用BsAb、然后用与FITC缀合的第二mAb小鼠抗-myc对细胞染色来测试。对照包括未染色的细胞、对照BsAb NC-16或第二mAbGA6xHis。如所示，HLA-A2表达通过用抗-A2 mAb BB7及其同种型对照小鼠IgG2b对细胞染色来测量。结合强度通过中值荧光强度示出。(B)指定BsAb构建体与Foxp3+/HLA-A2+ T淋巴瘤细胞系MAC-2A的结合。对照包括未染色的细胞、对照BsAbNC-16或第二mAb GA6xHis。如所示，HLA-A2表达通过用抗-A2 mAb BB7及其同种型对照小鼠IgG2b对细胞染色来测量。结合强度通过中值荧光强度示出。(C)类似地，如(A)中所述，#32BiTE与CD3臂的结合在CD3+ T细胞系Jurkat上测量。对照包括未染色的细胞、对照BsAb NC-16或第二mAb GA6xHis。如所示，HLA-A2表达通过用抗-A2 mAb BB7及其同种型对照小鼠IgG2b对细胞染色来测量。结合强度通过中值荧光强度示出。
图8A-8B表示表位特异性。(A)Foxp3-TLI肽序列在位置1、2、3、4、5、7、8、9处用丙氨酸取代或在位置十处用甘氨酸(G10)取代(图8A-8B中的序列)。用指定肽以50μg/ml对T2细胞进行脉冲，并且通过流式细胞术测量#32-BiTE的结合。(B)用抗-HLA-A2 mAb、克隆BB7.2同时对细胞染色，以测量肽与HLA-A2分子的相对结合。
图9A-9E表示健康供体中#32 mAb与PBMC中天然Treg细胞的特异性结合。用对CD4、CD25、CD127特异性的mAb和mAb#32小鼠IgG1对PBMC染色。数据显示mAb#32与CD4+CD25高CD127低Treg(A)、CD4+25高CD127高群体(B)、来自HLA-A0*201+供体的CD8+CD25高CD127高(C)、或来自HLA-A-0*201阴性供体的CD4+CD25高CD127低Teg(D、E)的结合。数据显示来自3组不同个体的代表性结果。#32 mAb识别来自HLA-A0201+供体的CD4+CD25高CD127低Treg(A)，但不识别HLA-A-0*201阴性供体的CD4+CD25高CD127低Treg(D、E)。
图10A-10B表示#32 mAb与从HLA-A*02:01+供体体外产生的Treg细胞的特异性结合。由(A)同种异体(allo)-PBMC或(B)MAC-2A细胞刺激产生的Treg之间的结果相似。将CD4+T细胞进行FACS分选，并在IL-2(100单位)和TGF-β(10ng/ml)存在下用同种异体-PBMC或同种异体肿瘤(MAC-2A)刺激一周。用对CD4、CD25、foxp3的mAb和mAb#32/APC对细胞染色。Mab#32结合通过对DAPI-、CD4和CD25双阳性细胞进行门控来测定。数据显示小鼠mAb#32(红色)及其同种型对照小鼠IgG1(绿色)和针对foxp3的mAb的大鼠同种型对照(橙色)的重叠。#32mAb仅结合CD4+CD25+Foxp3+ Treg。
图11A-11E表示BiTE#32介导的针对Foxp3+ T淋巴瘤细胞的T细胞杀伤。在有或没有浓度范围为1μg/ml至0.0003μg/ml BiTE的情况下，将PBMC与TLI-脉冲的T2细胞(A：蓝线：#32 BiTE针对单独的T2；红色：对照BiTE针对单独的T2；绿色：#32 BiTE针对用TLI肽脉冲的T2；紫色：对照BiTE针对用TLI肽脉冲的T2；浅蓝色：#32BITE针对用EW肽脉冲的T2；橙色：对照BiTE针对用对照肽脉冲的T2)、HL-60(B)、MAC-1(C)、MAC-2A(D)、或Jurkat(E)靶细胞以50:1的E:T比一起孵育。通过5小时51C释放测定法测量细胞毒性。数据代表一式三份微孔培养物的平均值。
图12A-12D表示#32 BsAb-介导的针对来自HLA-A*02:01+供体的Treg的T细胞杀伤。(A和B)在存在或不存在BsAb#32或对照BsAb(1μg/ml)的情况下，将非HLA-A2 T细胞与从HLA-A*02:01+供体产生的T reg克隆(T reg克隆1(A)和T reg克隆3(B))以5:1的E:T比一起孵育过夜。通过流式细胞术测定A2+T细胞中Foxp3+细胞的百分比。Foxp3+细胞在HLA-A2+(BB7.2)上进行门控。HLA-A2+Foxp3+细胞的减少表明#32 BsAb-介导的T细胞杀伤。数据显示来自重复培养物的代表性数据。(C)将图12A和12B中所示的流式细胞术数据总结为柱状图，以示出Treg细胞百分比的减少。每个数据点示出重复培养物的平均值。(D)#32 BsAb、对照-BsAb和无BsAb的T reg细胞裂解数据。
图13A-13H表示8个EXT017-噬菌体与负载有丙氨酸突变体组的T2细胞结合的柱状图。(A)EXT017-17噬菌体与负载有丙氨酸突变体组的T2细胞结合的柱状图。(B)EXT017-18噬菌体与负载有丙氨酸突变体组的T2细胞结合的柱状图。(C)EXT017-20噬菌体与负载有丙氨酸突变体组的T2细胞结合的柱状图。(D)EXT017-27噬菌体与负载有丙氨酸突变体组的T2细胞结合的柱状图。(E)EXT017-28噬菌体与负载有丙氨酸突变体组的T2细胞结合的柱状图。(F)EXT017-32噬菌体与负载有丙氨酸突变体组的T2细胞结合的柱状图。(G)EXT017-53噬菌体与负载有丙氨酸突变体组的T2细胞结合的柱状图。(H)EXT017-53噬菌体与负载有丙氨酸突变体组的T2细胞结合的柱状图。
具体实施方式
一.定义
除非另外定义，本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域的技术人员所通常理解的含义。以下参考文献为本领域普通技术人员提供本发明公开主题中所用多个术语的通常定义：Singleton等人,Dictionary of Microbiology and Molecular Biology(2nd ed.1994)；The Cambridge Dictionary of Science and Technology(Walker ed.,1988)；The Glossary of Genetics,5th Ed.,R.Rieger等人(eds.),Springer Verlag(1991)；和Hale&Marham,The Harper Collins Dictionary of Biology(1991)；MolecularCloning:a Laboratory Manual 3rd edition,J.F.Sambrook和D.W.Russell,ed.ColdSpring Harbor Laboratory Press 2001；Recombinant Antibodies for Immunotherapy,Melvyn Little,ed.Cambridge University Press 2009；“Oligonucleotide Synthesis”(M.J.Gait,ed.,1984)；“Animal Cell Culture”(R.I.Freshney,ed.,1987)；“Methods inEnzymology”(Academic Press,Inc.)；“Current Protocols in Molecular Biology”(F.M.Ausubel等人,eds.,1987,以及定期更新)；“PCR:The Polymerase Chain Reaction”,(Mullis等人,ed.,1994)；“A Practical Guide to Molecular Cloning”(Perbal BernardV.,1988)；“Phage Display:A Laboratory Manual”(Barbas等人,2001)。在此将这些参考文献和含有本领域技术人员公知且依赖的标准方案的其它参考文献包括制造商说明书均并入作为本发明公开主题的一部分以供参考。如本文所用，除非另外指出，以下术语具有以下对其所述的含义。
以下缩写在本申请中通篇使用：
Ab：抗体
ADCC：抗体依赖性细胞毒作用
ALL：急性淋巴细胞性白血病
AML：急性髓细胞样白血病
APC：抗原递呈细胞
β2M：β-2-微球蛋白
BiTE：双特异性T细胞接合抗体(engaging antibody)
CAR：嵌合抗原受体
CDC：补体依赖性细胞毒作用
CMC：补体介导的细胞毒作用
CDR：互补决定区
CL：轻链的恒定域
CH1：重链的第一恒定域
CH1,2,3：重链的第一、第二和第三恒定域
CH2,3：重链的第二和第三恒定域
CHO：中国仓鼠卵巢
CTL：细胞毒性T细胞
E:T比：效应子：靶标比例
Fab：抗体结合片段
FACS：流式细胞仪辅助细胞分选
FBS：胎牛血清
FR：框架区
HC：重链
HLA：人白细胞抗原
Ig：免疫球蛋白
IRES：内部核糖体进入位点
KD：解离常数
koff：解离速率
kon：结合速率
MHC：主要组织相容性复合物
MM：多发性骨髓瘤
scFv：单链可变片段
TCR：T细胞受体
TIL：肿瘤浸润淋巴细胞
TLI：Foxp3-7肽(序列TLIRWAILEA(SEQ ID NO:8))
VH：可变重链包含重链高变区和重链可变框架区
VL：可变轻链包含轻链高变区和轻链可变框架区
Foxp3：叉头盒P3
本文使用的术语“大约(about)”或“大约(approximately)”是指在由本领域普通技术人员确定的特定值的可接受误差范围内，这将部分地取决于如何测量或测定该值，即测量系统的局限性。例如，按照本领域的惯例，“大约”可以表示在3个或多于3个标准偏差内。或者，“大约”可以表示给定值的至多20％，例如至多10％、至多5％、或至多1％的范围。或者，特别是关于生物系统或过程，该术语可以表示在数值的数量级内，例如在5倍以内、或在2倍以内。
本文使用的术语“细胞群体”是指一组至少两种表达相似或不同表型的细胞。在非限制性实例中，细胞群体能够包括至少大约10种、至少大约100种、至少大约200种、至少大约300种、至少大约400种、至少大约500种、至少大约600种、至少大约700种、至少大约800种、至少大约900种、至少大约1000种表达相似或不同表型的细胞。
本文使用的术语“抗原结合蛋白”是指包含抗原结合区或抗原结合部分的蛋白质或多肽，即，对于与其结合的另一分子具有很强的亲和力的蛋白质或多肽。抗原结合蛋白包括抗体、嵌合抗原受体(CAR)和融合蛋白。
术语“抗体”和“多种抗体”是指免疫系统的抗原结合蛋白。本文使用的术语“抗体”包括具有抗原结合区的完整全长抗体、以及其保留“抗原结合部分”或“抗原结合区”的任意片段，或者其单链、例如单链可变片段(scFv)。术语“抗体”不仅指完整的抗体分子，也指保留免疫原结合能力的抗体分子片段。这些片段是本领域公知的，并且常规在体外和体外使用。因此，本文使用的术语“抗体”不仅指完整的免疫球蛋白分子，也指公知的活性片段F(ab’)2和Fab。缺少完整抗体Fc片段的F(ab’)2和Fab片段更迅速地从循环中清除，并且可以具有比完整抗体更少的非特异性组织结合(Wahl等人,J.Nucl.Med.24:316-325(1983))。在某些实施方式中，抗体是包含通过二硫键互连的至少两个重(H)链和两个(L)轻链的糖蛋白。每个重链包含重链可变区(在本文中缩写为VH)和重链恒定(CH)区。重链恒定区包含三个结构域——CH1、CH2和CH3。每个轻链包含轻链可变区(在本文中缩写为VL)和轻链恒定CL区。轻链恒定区包含一个结构域CL。VH和VL区能够进一步细分成超变区，其称作互补决定区(CDR)，与更加保守的称作框架区(FR)的区域间隔。每个VH和VL均由以如下顺序从氨基端到羧基端排列的三个CDR和四个FR组成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子(包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(C1q))的结合。
本文使用的术语抗体的“抗原结合部分”、“抗原结合片段”或“抗原结合区”是指结合抗原并且赋予抗体以抗原特异性的抗体区域或部分；抗原结合蛋白例如抗体的片段包含保留特异性地结合抗原(例如肽/HLA复合物)的能力的抗体的一个或多个片段。已经显示抗体的抗原结合功能可以通过全长抗体的片段实施。术语抗体的“抗体片段”内包括的抗原结合部分的实例包括由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段Fab片段；包含通过铰链区的二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段F(ab)2片段；由VH和CH1结构域组成的Fd片段；由抗体的单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；由VH结构域组成的dAb片段(Ward等人，1989Nature341:544-546)；以及分离的互补决定区(CDR)。
此外，尽管Fv片段的两个结构域VL和VH由分开的基因编码，但可使用重组方法，通过合成接头将它们联接，该接头使得它们能够作为其中VL和VH区配对以形成单价分子的单一蛋白质链制备。这些称为单链Fv(scFv)；参见例如，Bird等人，1988Science 242:423-426；和Huston等人，1988Proc.Natl.Acad.Sci.85:5879-5883。这些抗体片段使用本领域普通技术人员已知的常规技术来获得，并且以与针对完整抗体所使用的方式相同的方式就功用进行片段筛选。
“分离的抗体”或“分离的抗原结合蛋白”是已经被鉴定并且从其天然环境的组分中分离和/或回收的那些。“合成抗体”或“重组抗体”通常使用本领域技术人员已知的重组技术或者使用肽合成技术产生。
本文使用的术语“单链可变片段”或“scFv”是免疫球蛋白(例如小鼠或人)的重链(VH)和轻链(VL)的可变区共价连接形成VH::VL异二聚体的融合蛋白。重链(VH)和轻链(VL)直接联接或者通过编码肽的接头(例如10、15、20、25个氨基酸)联接，该接头将VH的N-末端与VL的C-末端连接，或者将VH的C-末端与VL的N-末端连接。接头通常出于柔性而富含甘氨酸，以及出于溶解性而富含丝氨酸或苏氨酸。尽管去除了恒定区并引入了接头，scFv蛋白保留了原始免疫球蛋白的特异性。单链Fv多肽抗体可以由包含VH和VL编码序列的核酸表达，如Huston等人所述(Proc.Nat.Acad.Sci.USA,85:5879-5883,1988)。另外参见，美国专利第5,091,513、5,132,405和4,956,778号；和美国专利公开第20050196754和20050196754号。已经描述了具有抑制活性的拮抗性scFv(参见，例如，Zhao等人,Hyrbidoma(Larchmt)2008 27(6):455-51；Peter等人,J Cachexia Sarcopenia Muscle 2012年8月12日；Shieh等人,JImunol 2009 183(4):2277-85；Giomarelli等人,Thromb Haemost 2007 97(6):955-63；Fife等人,J Clin Invst 2006116(8):2252-61；Brocks等人,Immunotechnology 1997 3(3):173-84；Moosmayer等人,Ther Immunol 1995 2(10:31-40))。已经描述了具有刺激活性的激动性scFv(参见，例如，Peter等人,J Bioi Chern 2003 25278(38):36740-7；Xie等人,Nat Biotech 1997 15(8):768-71；Ledbetter等人,Crit Rev Immunol 1997 17(5-6):427-55；Ho等人,BioChim Biophys Acta 2003 1638(3):257-66))。
本文使用的“F(ab)”是指结合抗原但是是单价的并且不具有Fc部分的抗体结构的片段，例如，由木瓜蛋白酶消化的抗体产生两个F(ab)片段和一个Fc片段(例如，重(H)链恒定区；不结合抗原的Fc区)。
本文使用的“F(ab’)2”是指由胃蛋白酶消化完整IgG抗体产生的抗体片段，其中该片段具有两个抗原结合(ab’)(二价)区，其中每个(ab’)区包含两条分开的氨基酸链，H链的一部分通过S-S键与轻(L)链连接用于结合抗原，其中H链的剩余部分连接在一起。“F(ab’)2”片段可以分裂成两个单独的Fab’片段。
本文使用的术语“载体”是指任何遗传元件，比如质粒、噬菌体、转座子、粘粒、染色体、病毒、病毒粒子等，其当关联有适当的控制元件时能够复制，并且其可以将基因序列转移到细胞中。因此，该术语包括克隆和表达载体，以及病毒载体和质粒载体。
本文使用的“表达载体”是指重组核酸序列，例如，重组DNA分子，其包含所需的编码序列和在特定宿主有机体中表达可操作连接的编码序列所必需的适当核酸序列。在原核生物中表达必需的核酸序列通常包含启动子、操作子(任选)和核糖体连接位点，常常与其它序列一起。真核细胞已知利用启动子、增强子和终止及多腺苷酸化信号。
本文使用的“CDR”定义为抗体的互补决定区氨基酸序列，其是免疫球蛋白重链和轻链的超变区。参见，例如Kabat等人,Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,4th U.S.Department of Health and Human Services,National Institutesof Health(1987)。通常，抗体在可变区中包含三个重链CDR或CDR区和三个轻链CDR或CDR区。CDR提供抗体与抗原或表位结合的大多数接触残基。在某些实施方式中，CDR区使用Kabat系统以下划线示出(Kabat,E.A.等人(1991)Sequences of Proteins ofImmunological Interest,Fifth Edition,U.S.Department of Health and HumanServices,NIH Publication No.91-3242)。
本文使用的术语“亲和力”(affinity)是指结合强度的量度。不受理论的束缚，亲和力取决于抗体结合位点和抗原决定簇之间的立体化学配合的紧密程度、它们之间接触区域的大小以及带电和疏水基团的分布。亲和力还包括术语“亲合力”(avidity)，其是指形成可逆复合物后抗原-抗体键的强度。用于计算抗体对抗原的亲和力的方法在本领域是已知的，包括使用结合实验来计算亲和力。功能试验(例如，流式细胞术试验)中的抗体活性也反映抗体亲和力。可以使用功能试验(例如，流式细胞术试验)对抗体进行表型鉴定并比较亲和力。
可用于本发明公开主题的核酸分子包括编码抗体或其抗原结合部分的任意核酸分子。这些核酸分子不需要与内源性核酸序列100％相同。与内源性序列具有“基本的同源性”或“基本的同一性”的多核苷酸通常能够与双链核酸分子中的至少一条链杂交。同源性和同源性百分比可通过标准软件程序如BLAST或FASTA测定。“杂交”是指在各种严格性条件下在互补的多核苷酸序列(例如，本文所述基因)或其部分之间配对以形成双链分子。(参见，例如，Wahl,G.M.和S.L.Berger(1987)Methods Enzymol.152:399；Kimmel,A.R.(1987)Methods Enzymol.152:507)。
例如，严格的盐浓度通常为小于约750mM NaCl和75mM柠檬酸三钠、优选小于约500mM NaCl和50mM柠檬酸三钠、更优选小于约250mM NaCl和25mM柠檬酸三钠。低严格杂交可以在不存在有机溶剂例如甲酰胺的情况下获得，而高严格杂交可以在至少约35％甲酰胺、更优选至少约50％甲酰胺的存在下获得。严格温度条件通常包括至少约30℃、更优选至少约37℃、最优选至少约42℃的温度。改变其它参数，例如杂交时间、洗涤剂例如十二烷基硫酸钠(SDS)的浓度、以及载体DNA的包含或排除，对本领域技术人员来说是熟知的。通过根据需要组合这些不同条件来实现各种严格的水平。在优选的实施方式中，杂交将在30℃下在750mM NaCl、75mM柠檬酸三钠和1％SDS中发生。在更优选的实施方式中，杂交将在37℃下在500mM NaCl、50mM柠檬酸三钠、1％SDS、35％甲酰胺和100μg/ml变性鲑鱼精DNA(ssDNA)中发生。在最优选的实施方式中，杂交将在42℃下在250mM NaCl、25mM柠檬酸三钠、1％SDS、50％甲酰胺和200μg/ml ssDNA中发生。可用的这些条件的变化对于本领域技术人员将是显而易见的。
对于大多数应用，杂交后的洗涤步骤也将在严格性上变化。洗涤严格性条件可以通过盐浓度和温度来定义。如上文，可以通过降低盐浓度或通过升高温度来提高洗涤严格性。例如，洗涤步骤的严格的盐浓度优选为小于约30mM NaCl和3mM柠檬酸三钠、最优选小于约15mM NaCl和1.5mM柠檬酸三钠。洗涤步骤的严格温度条件通常包括至少约25℃、更优选至少约42℃、甚至更优选至少约68℃的温度。在优选的实施方式中，洗涤步骤将在25℃下在30mM NaCl、3mM柠檬酸三钠和0.1％SDS中发生。在更优选的实施方式中，洗涤步骤将在42℃下在15mM NaCl、1.5mM柠檬酸三钠和0.1％SDS中发生。在更优选的实施方式中，洗涤步骤将在68℃下在15mM NaCl、1.5mM柠檬酸三钠和0.1％SDS中发生。这些条件的另外的变化对于本领域技术人员将是显而易见的。杂交技术是本领域技术人员熟知的，并且描述于例如Benton和Davis(Science 196:180,1977)；Grunstein和Rogness(Proc.Natl.Acad.Sci.,USA 72:3961,1975)；Ausubel等人(Current Protocols in Molecular Biology,WileyInterscience,New York,2001)；Berger和Kimmel(Guide to Molecular CloningTechniques,1987,Academic Press,New York)；以及Sambrook等人,Molecular Cloning:ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York。
本文使用的术语“交叉竞争”或“竞争”是指以下情形：其中本发明公开的抗体或其抗原结合部分与指定抗原例如Foxp3肽或Foxp3/HLA I类复合物(例如，Foxp3/HLA-A复合物，例如，Foxp3/HLA-A2复合物，例如，Foxp3/HLA-A*02::01复合物)的结合降低或减少参考抗体或其抗原结合部分(例如其包含任何本发明公开的抗体或其抗原结合部分的VH和VLCDR1、CDR2和CDR3序列或VH和VL序列)与相同抗原的结合。术语“交叉竞争”或“竞争”也指以下情形：其中参考抗体或其抗原结合部分与指定抗原例如Foxp3肽或Foxp3/HLA I类复合物(例如，Foxp3/HLA-A复合物，例如，Foxp3/HLA-A2复合物，例如，Foxp3/HLA-A*02::01复合物)的结合降低或减少本发明公开的抗体或其抗原结合部分与相同抗原的结合。“交叉竞争”或“竞争”的抗体或其抗原结合部分与参考抗体或其抗原结合部分结合相同或基本上相同的表位、重叠或基本上重叠的表位、或抗原(例如，Foxp3肽或Foxp3/HLA I类复合物(例如，Foxp3/HLA-A复合物，例如，Foxp3/HLA-A2复合物，例如，Foxp3/HLA-A*02::01复合物))上的相邻表位。
本文使用的“有效量”或“治疗有效量”是足以在治疗后影响有益或期望的临床结果的量。能够以一个或多个剂量将有效量施用于受试者。在治疗方面，有效量是足以减轻、改善、稳定、逆转或减缓疾病的进展或以其它方式减少疾病的病理学后果的量。有效量通常由医生根据具体情况确定，并且在本领域技术人员的技能范围内。当确定合适剂量以达到有效量时，通常考虑几个因素。这些因素包括受试者的年龄、性别和体重、所治疗的病症、病症的严重程度以及施用的免疫应答细胞的形式和有效浓度。
本文使用的术语“异源核酸分子或多肽”是指通常不存在于细胞中或由细胞获得的样品中的核酸分子(例如，cDNA、DNA或RNA分子)或多肽。该核酸可以来自另一生物体，或者其可以是例如细胞或样品中通常不表达的mRNA分子。
本文使用的术语“增加”是指正向变化至少大约5％，其包括，但不限于，正向变化大约5％、大约10％、大约25％、大约30％、大约50％、大约75％或大约100％。
本文使用的术语“减少”是指负向变化至少大约5％，其包括，但不限于，负向变化大约5％、大约10％、大约25％、大约30％、大约50％、大约75％或大约100％。
本文使用的术语“分离的”、“纯化的”或“生物纯的”是指不同程度地不含有其天然状态中发现的通常伴随的组分的材料。“分离”表示与原始来源或环境分开的程度。“纯化”表示比分离更高的分开程度。“纯化的”或“生物纯的”蛋白质与其它材料充分分离，使得任何杂质不会实质上影响蛋白质的生物学性质或引起其它不良后果。即，如果本发明公开主题的核酸或多肽在通过重组DNA技术产生时基本上不含细胞材料、病毒材料或培养基，或化学合成时基本上不含化学前体或其它化学品，则本发明公开主题的核酸或多肽是纯化的。纯度和均一性通常使用分析化学技术、例如聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相色谱法测定。术语“纯化的”可以表示核酸或蛋白质在电泳凝胶中基本上产生一条带。对于可以进行修饰(例如磷酸化或糖基化)的蛋白质，不同的修饰可以产生不同的分离的蛋白质，其可以分别纯化。
本文使用的术语“特异性结合”或“与…特异性结合”或“特异性靶向”是指多肽或其片段(包括抗体或其抗原结合部分)识别并结合目标生物分子(例如，Foxp3/MHC复合物(例如，Foxp3/HLA复合物，更具体地，Foxp3/HLA I类复合物，更具体地，Foxp3/HLA-A复合物，更具体地，Foxp3/HLA-A2复合物，或更具体地，Foxp3/HLA-A*02:01复合物))，但基本上不识别和结合样品例如生物样品中的其它分子。在某些实施方式中，抗体或其抗原结合部分“与Foxp3/MHC复合物特异性结合”是指抗体或其抗原结合部分以5x 10-7M或更低、1x 10-7M或更低、5x 10-8M或更低、1x 10-8M或更低、5x 10-9M或更低、1x10-9M或更低、5x 10-10M或更低、1x 10-10M或更低、5x 10-11M或更低、或者1x 10-11M或更低的KD与Foxp3/MHC复合物结合。
本文使用的术语“治疗(treating、treatment)”是指试图改变所治疗的个体或细胞的疾病过程的临床干预，并且可以用于预防、或在临床病理过程期间进行。治疗的治疗性效果包括但不限于预防疾病的发生或复发、症状的缓解、疾病的任何直接或间接病理学后果的减少、预防转移、降低疾病进展的速度、减轻或缓和疾病状态、以及缓解或改善的预后。通过预防疾病或病症的进展，治疗可以防止受侵袭或诊断的受试者或疑似患有病症的受试者中的病症引起的恶化，而且治疗可以预防具有病症风险或疑似患有病症的受试者中病症或病症症状的发作。
本文使用的术语“受试者”是指任何动物(例如哺乳动物)，包括但不限于人和非人动物(包括但不限于非人灵长类动物、狗、猫、啮齿动物、马、牛、猪、小鼠、大鼠、仓鼠、兔等(例如，其将是特定治疗的受者、或从其中收获细胞)。在某些实施方式中，受试者是人。
二.Foxp3和Treg细胞
Foxp3已鉴定为Treg功能的关键参与者，并且是CD4+CD25+Treg细胞的最确定标志物。Foxp3是Treg细胞谱系分化、维持和抑制性的功能所必需的。除了在胸腺中产生的天然存在的Treg细胞外，已经鉴定出诱导型Treg细胞，其在感染和癌症中占优势。Treg细胞的胸腺外生成需要通过在转化生长因子(TGF)-β存在下对CD4+ T细胞的次优抗原刺激而进行的Foxp3诱导。对肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)中Foxp3表达的分析表明，Treg细胞的积累与许多癌症类型(包括乳腺癌、肺癌、黑色素瘤、卵巢癌和胰腺癌)的预后不良相关(1-4)。治疗地靶向Treg群体在各种类型癌症的小鼠模型中促进抗肿瘤免疫和肿瘤排斥(5、6)。在患者中还显示，Treg细胞的耗尽增强胰腺癌中疫苗介导的抗肿瘤免疫并诱导黑色素瘤转移的消退(7-9)。这些研究证明Treg细胞在癌症中通过抑制免疫应答的突出的肿瘤促进作用。
除了Foxp3+ Treg细胞在癌症患者的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、局部淋巴结和血液中的积累，其通过抑制抗肿瘤免疫而赋予癌细胞的生长和转移的优势，Foxp3的表达也已显示在一些癌细胞中。表达Foxp3的胰腺癌细胞和皮肤T细胞淋巴瘤细胞已显示抑制T细胞增殖(2、11)。因此，癌细胞可能与调节性T(Treg)细胞共享抑制性作用，并且模拟Treg功能可能代表癌症中免疫逃避的新机制。
总体而言，认为Treg细胞是最有效的抗肿瘤免疫的抑制剂，并且是成功免疫治疗的最大障碍。已经尝试了许多耗尽或干扰Treg功能的策略。这些包括：由CD25特异性的、糖皮质激素诱导的TNF-相关蛋白(GITR)特异性的单克隆抗体(mAb)和靶向细胞表面受体CD25的配体定向毒素(如地尼白介素(Dennileukin diftitox))引起的Treg耗尽。然而，CD25和GITR两者不仅在Treg细胞中表达，而且在活化的CD4和CD8效应T细胞中表达。此外，已经尝试了通过Treg扰乱肿瘤归巢(homing)和调节T细胞可塑性。这些策略的问题是缺乏特异性，导致有益的抗肿瘤效应T细胞的消耗。
因此，需要能够选择性地抑制Treg细胞的药物。据本发明人所知，没有药物可以选择性地抑制Treg细胞，细胞表面上没有Treg细胞的有效靶点能够用于或正在用于抑制Treg细胞或杀伤Treg细胞，并且没有选择性药物可以耗尽Treg细胞。
Foxp3除了其不能通过小分子成药，且其处于细胞内因此抗体治疗不可行之外是一个理想的靶标。然而，来自Foxp3蛋白的经降解和加工用于细胞表面递呈的肽能够作为TCR模拟抗体的靶标。对Foxp3衍生表位特异性的TCR-模拟抗体特异性地并直接地消耗Foxp3+ Treg细胞和肿瘤细胞。通过去除由Treg细胞和肿瘤细胞两者引起的免疫抑制，Treg细胞的消耗可以极大地释放抗肿瘤免疫。
可以使用各种表面细胞标志物鉴定Treg，如CD4(分化簇4)和CD25(IL-2受体的α链)。另外，已知活化的常规T细胞可瞬时表达Foxp3。CD127的表达可用作细胞标志物以区分活化的常规T细胞和Treg。CD127也称为IL-7受体的α链。已经发现Treg表达低CD127，而活化的T细胞表达高CD127。
在某些实施方式中，Treg通过CD4的存在(CD4+)、CD127的低表达水平(CD127低)、CD25的高表达水平(CD25高)、和Foxp3的高表达水平(Foxp3高)中的一种或多种来鉴定。在某些实施方式中，Treg通过CD4的存在和CD25的高表达水平(例如CD4+CD25高T细胞)来鉴定。在某些实施方式中，Treg通过CD4的存在和CD127的低表达水平(例如CD4+CD127低T细胞)来鉴定。在某些实施方式中，Treg通过CD4的存在、CD25的高表达水平和CD127的低表达水平(例如CD4+CD25高CD127低T细胞)来鉴定。
在某些实施方式中，本发明公开的抗体或其抗原结合部分与一种或多种Treg细胞结合。在某些实施方式中，本发明公开的抗体或其抗原结合部分与选自以下的一种或多种T细胞结合：CD4+ T细胞、CD127低T细胞、CD25高T细胞、Foxp3高T细胞、及其组合。该组合包括所有包括CD4+ T细胞、CD127低T细胞、CD25高T细胞、和Foxp3高T细胞的可能组合，例如CD4+ T细胞、CD127低T细胞、CD25高T细胞、和Foxp3高T细胞中的任意两种(例如CD4+CD127低T细胞、CD4+CD25高T细胞、CD4+Foxp3高T细胞、CD127低CD25高T细胞、D127低Foxp3高T细胞、或CD25高Foxp3高T细胞)，CD4+ T细胞、CD127低T细胞、CD25高T细胞、和Foxp3高T细胞中的任意三种(例如CD4+CD127低CD25高T细胞、CD4+CD127低Foxp3高T细胞、CD4+CD25高Foxp3高T细胞、或CD127低CD25高Foxp3高T细胞)，以及CD4+ T细胞、CD127低T细胞、CD25高T细胞、和Foxp3高T细胞中的所有四种(例如CD4+CD127低CD25高Foxp3高T细胞)。
在某些实施方式中，本发明公开的抗体或其抗原结合部分与一种或多种CD127低T细胞结合。在某些实施方式中，本发明公开的抗体或其抗原结合部分与一种或多种Foxp3高T细胞结合。在某些实施方式中，本发明公开的抗体或其抗原结合部分与一种或多种CD25高T细胞结合。在某些实施方式中，本发明公开的抗体或其抗原结合部分与一种或多种CD4+T细胞结合。在某些实施方式中，本发明公开的抗体或其抗原结合部分与一种或多种CD4+CD25高T细胞结合。在某些实施方式中，本发明公开的抗体或其抗原结合部分与一种或多种CD4+CD127低T细胞结合。在某些实施方式中，本发明公开的抗体或其抗原结合部分与一种或多种CD4+CD25高CD127低T细胞结合。
三.靶向Foxp3/MHC肽复合物的抗-Foxp3抗体
本发明公开的主题使用得到任意蛋白质的治疗性抗体的方法，上述蛋白质包括由于不在细胞表面上表达而难以接近的蛋白质，例如Foxp3。
为了靶向源自细胞内或核内蛋白质的抗原，要求以不寻常的方法开发治疗性抗体。该方法是产生与T-细胞受体(TCR)具有相同的特异性、识别细胞表面上表达的肽/MHC复合物的重组抗体(Ab，例如单克隆Ab(mAb))。这些Ab在靶标识别方面与TCR共享功能上的同一性，但具有更高的亲和力、以及装配以抗体特征的细胞毒性药剂的能力。技术上，可以通过常规的杂交瘤技术或者通过本领域技术人员已知的体外抗体文库技术产生TCR样mAb，以产生人、人源化或嵌合抗体。
仅有10％的细胞蛋白质预定在细胞表面上表达。因此，对于绝大多数蛋白质不存在单克隆抗体。相反地，细胞内几乎所有蛋白质均在细胞表面上作为MHC分子背景中的肽经加工和递呈用于T细胞受体识别。常规地，MHC-肽复合物仅能由T-细胞受体(TCR)识别，限制了使用基于T细胞的读出试验检测目标表位的能力。现在噬菌体展示方法学已使得能够可靠地产生这些独特表位的单克隆抗体，从而打开了之前难以接近的抗原新世界的大门。噬菌体展示文库的使用已使得可以为了针对非常确定表位的独特稀有的抗体来筛选大量的抗体库(antibody repertoiry)(对于噬菌体展示方面的更多详情，参见McCafferty等人,Nature,348:552-554)。迅速鉴定出对于源自肿瘤抗原的肽-MHC复合物分子具有高度特异性的人Fab或scFv片段因此已变得可能(Noy,Expert Rev Anticancer Ther 2005:5(3):523-536；Chames等人,Proc Nalt Acad Sci USA 2000；97:7969-7974；Held等人,EurJ.Immunol.2004:34:2919-2929；Lev等人,Cancer Res 2002；62:3184-3194)。通过将对于黑色素瘤Ag MART-1 26-35/A2或gp100280-288/A2特异性的TCR样Fab与截短形式的假单胞菌(Pseudomonas)内毒素融合产生的免疫毒素，已经显示在体外和体内均抑制人黑色素瘤的生长(Klechevsky等人,Cancer Res 2008；68(15):6360-6367)。本发明公开的主题涉及开发用于癌症治疗的识别例如Foxp3肽/HLA-A2复合物的TCR样全人Ab(例如mAb)。因此，本发明公开的主题提供构建将会识别细胞表面上特异性MHC/肽复合物的噬菌体-抗体药剂的方法和组合物，以极大地扩大Treg特异性靶标。本发明公开的主题提供针对源自典型的细胞内Treg标志物Foxp3的肽/MHC复合物的新表位的抗体(例如单克隆抗体)。
在某些实施方式中，本发明公开的抗体或其抗原结合部分以高亲和力例如以约5x10-7M或更低，例如约1x 10-7M或更低、约5x 10-8M或更低、约1x 10-8M或更低、约5x 10-9M或更低、约1x 10-9M或更低、约5x 10-10M或更低、约1x 10-10M或更低、约5x 10-11M或更低、或约1x 10-11M或更低的KD与Foxp3肽/MHC复合物结合。在某些实施方式中，本发明公开的抗体或其抗原结合部分以约1x 10-11M至约5x 10-7M，例如约1x 10-11M至约1x 10-10M、约1x 10-11M至约5x 10-11M、约5x 10-11M至约1x 10-10M、约1x 10-10M至约1x 10-9M、约1x 10-10M至约5x 10- 10M、约5x 10-10M至约1x 10-9M、1x 10-9M至约1x 10-8M、1x 10-9M至约5x 10-9M、5x 10-9M至约1x 10-8M、约1x 10-8M至约1x 10-7M、约1x 10-8M至约5x 10-8M、或约5x 10-8M至约1x 10-7M的KD与Foxp3肽/MHC复合物结合。在某些实施方式中，本发明公开的抗体或其抗原结合部分以约1x 10-7M至约2.5x 10-7M，例如约1x 10-7M至约1.5x 10-7M、约1.5x 10-7M至约2x 10-7M、或约2x 10-7M至约2.5x 10-7M的KD与Foxp3肽/MHC复合物结合。在某些实施方式中，本发明公开的抗体或其抗原结合部分以约1.4x 10-7M的KD与Foxp3肽/MHC复合物结合。在某些实施方式中，本发明公开的抗体或其抗原结合部分以约1.9x 10-7M的KD与Foxp3肽/MHC复合物结合。在某些实施方式中，本发明公开的抗体或其抗原结合部分以约2.2x 10-7M的KD与Foxp3肽/MHC复合物结合。在某些实施方式中，本发明公开的抗体或其抗原结合部分以约3x 10-8M至约7x 10-8M，例如约3x 10-8M至约4x 10-8M、约4x 10-8M至约5x 10-8M、约5x 10-8M至约6x 10- 8M、或约6x 10-8M至约7x 10-8M的KD与Foxp3肽/MHC复合物结合。在某些实施方式中，本发明公开的抗体或其抗原结合部分以约3.3x 10-8M的KD与Foxp3肽/MHC复合物结合。在某些实施方式中，本发明公开的抗体或其抗原结合部分以约3.5x 10-8M的KD与Foxp3肽/MHC复合物结合。在某些实施方式中，本发明公开的抗体或其抗原结合部分以约4.8x 10-8M的KD与Foxp3肽/MHC复合物结合。在某些实施方式中，本发明公开的抗体或其抗原结合部分以约4.9x10-8M的KD与Foxp3肽/MHC复合物结合。在某些实施方式中，本发明公开的抗体或其抗原结合部分以约5x 10-8M的KD与Foxp3肽/MHC复合物结合。在某些实施方式中，本发明公开的抗体或其抗原结合部分以约7x 10-8M的KD与Foxp3肽/MHC复合物结合。在某些实施方式中，本发明公开的抗体或其抗原结合部分以约7.2x 10-8M的KD与Foxp3肽/MHC复合物结合。在某些实施方式中，本发明公开的抗体或其抗原结合部分以约1x 10-10M至约5x 10-10M，例如约1x10-10M至约2x 10-10M、约2x 10-10M至约3x 10-10M、约3x 10-10M至约4x 10-10M、或4x 10-10M至约5x 10-10M的KD与Foxp3肽/MHC复合物结合。在某些实施方式中，本发明公开的抗体或其抗原结合部分以约2x 10-10M的KD与Foxp3肽/MHC复合物结合。在某些实施方式中，本发明公开的抗体或其抗原结合部分以约5x 10-10M的KD与Foxp3肽/MHC复合物结合。在某些实施方式中，本发明公开的抗体或其抗原结合部分以约4.6x 10-10M的KD与Foxp3肽/MHC复合物结合。
在本发明公开的主题中，描述了具有基于使用重组HLA-肽复合物选自人scFv噬菌体展示文库的scFv的抗原结合区的抗原结合蛋白，其包括抗体。这些分子表现出精细的特异性，例如，如仅识别Foxp3/MHC复合物(例如，Foxp3/HLA复合物，更具体地，Foxp3/HLA I类复合物，更具体地，Foxp3/HLA-A复合物，更具体地，Foxp3/HLA-A2复合物，以及更具体地，Foxp3/HLA-A*02:01复合物)的抗-Foxp3抗体所示。此外，随同其不能与含有其它肽的MHC-复合物结合，上述分子也不能结合肽自身，进一步说明了其TCR样特异性。
具有TCR样特异性的重组抗体代表了用于肿瘤免疫学和免疫治疗中研究和治疗应用的有价值的新工具。Foxp3是成熟的并经验证的Treg标志物。
本发明公开的抗原结合部分能够是Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv或单链可变片段(scFv)。在某些非限制性实施方式中，本发明公开的其抗原结合部分是scFv。在某些实施方式中，scFv是人scFv。最初对通过噬菌体展示选择的本发明公开主题的scFv测试其与HLA-阳性细胞表面上存在的肽结合的能力。将T2细胞在肽的存在下孵育之后，使用流式细胞术，可使用荧光标记的抗体用于选择性地识别抗原脉冲的细胞。
在某些实施方式中，本发明公开的主题提供具有与抗体重链或轻链可变区的一个或多个恒定结构域融合的scFv序列的抗体，以形成具有人免疫球蛋白Fc区的抗体，产生二价蛋白质，增加抗体的总体抗体亲合力和稳定性。此外，Fc部分使得可以将其它分子与抗体直接缀合，上述其它分子包括但不限于荧光染料、细胞毒素、放射性同位素等，例如，用于抗原定量研究，使抗体固定化用于亲和力测量，用于治疗药剂的靶向递送，和/或使用免疫效应细胞测试Fc介导的细胞毒性以及许多其它应用。
本发明公开主题的分子基于使用噬菌体展示进行的scFv鉴定和选择，其氨基酸序列使分子具有对目标MHC限制性肽的特异性，并形成本公开内容所有抗原结合蛋白的基础。因此，scFv可以用于设计“抗体”分子的多样化阵列，其包括，例如，全长抗体、其片段例如Fab和F(ab’)2、微型抗体(minibody)、包括scFv-Fc融合物的融合蛋白、多价抗体(即具有针对相同抗原或不同抗原的一种以上特异性的抗体)例如双特异性T-细胞接合抗体(BiTe)、三价抗体等(参见，Cuesta等人,Multivalent antibodies:when design surpassesevolution.Trends in Biotechnology 28:355-362 2010)。
在重组免疫球蛋白的构建中，用于各种免疫球蛋白同种型恒定区的适当氨基酸序列以及产生广泛的一系列抗体的方法是本领域普通技术人员已知的。
噬菌体展示技术使得可以迅速选择并产生抗原特异性scFv和Fab片段，这些scFv和Fab片段自身有用或者可以对它们进一步开发以提供完整的抗体、抗原结合蛋白或其抗原结合片段。相对于scFv和Fab抗体，具有Fc结构域的完整Ab具有许多优势。首先，只有全长Ab发挥例如经由Fc结构域介导的CDC和ADCC的免疫功能。第二，二价mAb比单体Fab Ab提供更强的抗原结合亲和力。第三，血浆半衰期和肾清除率将与Fab和二价mAb不同。各自的特定特征和优势可以与计划的效应子策略匹配。第四，二价mAb可以以与scFv和Fab不同的速率内化，改变免疫功能或载体功能。例如，α发射体不需要内化来杀伤靶标，但许多药物和毒素将会受益于免疫复合物的内化。因此，在某些实施方式中，一旦由噬菌体展示文库得到对于Foxp3肽-HLA复合物具有特异性的scFv克隆，则产生使用scFv片段的全长IgG Ab(例如mAb)。
为了在HEK293或中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系细胞中产生重组人单克隆IgG，可以基于本领域技术人员已知的方法对全长IgG mAb 进行改造(Tomomatsu等人,Production ofhuman monoclonal antibodies against FceRIa by a method combining in vitroimmunization with phage display.Biosci Biotechnol Biochem 73(7):1465-14692009)。简言之，可以将抗体可变区亚克隆到哺乳动物表达载体中，将λ或κ轻链恒定序列与IgG1亚类Fc匹配(例如)(Lidija P等人,An integrated vector system for theeukaryotic expression of antibodies or their fragments after selection fromphage display libraries.Gene 1997；187(1):9-18；Lisa JH等人,Crystallographicstructure of an intact lgG1 monoclonal antibody.Journal of Molecular Biology1998；275(5):861-872)。可以使用动力学结合分析(Yasmina NA等人,Probing thebinding mechanism and affinity of tanezumab,a recombinant humanized anti-NGFmonoclonal antibody,using a repertoire of biosensors.Protein Science 2008；17(8):1326-1335)，以确认全长IgG与Foxp3/HLA I类复合物以纳摩尔范围内的KD特异性结合。
在某些实施方式中，本发明公开的主题提供作为全长抗体(抗-Foxp3抗体)的抗原结合蛋白，本发明公开主题的抗体的重链和轻链可以是全长的(例如，包括至少一个、并且优选两个完整重链和至少一个、并且优选两个完整轻链的抗体)。抗体可以是IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgD或IgE同种型的抗体。在某些实施方式中，抗原结合部分包含在具有一种或多种非免疫球蛋白组分的融合蛋白中。在某些实施方式中，抗体是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同种型的抗体。在一个非限制性实施方式中，抗体是IgG1同种型的抗体(例如，人IgG1抗体)。抗体类型的选择可以取决于设计抗体要引发的免疫效应子功能。轻链恒定区能够是κ或λ恒定区，优选为κ恒定区。
在某些实施方式中，本发明公开的抗体或其它抗原结合蛋白与结合于MHC分子(例如HLA分子，更具体地，HLA I类分子，更具体地，HLA-A分子，更具体地，HLA-A2，甚至更具体地，HLA-A*02:01)的Foxp3肽特异性地结合。Foxp3肽可包含6-20个氨基酸，例如8-12个氨基酸，例如8、9、10、11、或12个氨基酸。在某些实施方式中，Foxp3肽是9-聚肽。在某些实施方式中，Foxp3肽是10-聚肽。Foxp3肽可以是本领域已知的一种。
在某些实施方式中，Foxp3肽是Foxp3蛋白的一部分。在某些实施方式中，Foxp3肽是人Foxp3蛋白的一部分。在某些实施方式中，人Foxp3蛋白具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列(Genbank登录No.ABQ15210.1)，其提供如下。
在某些实施方式中，Foxp3肽选自具有SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的Foxp3-1(其是SEQ ID NO：1的氨基酸序列252-260)或其一部分、具有SEQ ID NO：3所示氨基酸序列的Foxp3-2(其是SEQ ID NO：1的氨基酸序列390-398)或其一部分、具有SEQ ID NO：4所示氨基酸序列的Foxp3-3(其是SEQ ID NO：1的氨基酸序列304-312)或其一部分、具有SEQ ID NO：5所示氨基酸序列的Foxp3-4(其是SEQ ID NO：1的氨基酸序列388-396)或其一部分、具有SEQID NO：6所示氨基酸序列的Foxp3-5(其是SEQ ID NO：1的氨基酸序列95-103)或其一部分、具有SEQ ID NO：7所示氨基酸序列的Foxp3-6(其是SEQ ID NO：1的氨基酸序列69-77)或其一部分、和具有SEQ ID NO：8所示氨基酸序列的Foxp3-7(其是SEQ ID NO：1的氨基酸序列344-353)或其一部分。SEQ ID NO：2-8的序列提供如下。
KLSAMQAHL(SEQ ID NO：2)
SLHKCFVRV(SEQ ID NO：3)，
SLFAVRRHL(SEQ ID NO：4)
NLSLHKCFV(SEQ ID NO：5)
LLQDRPHFM(SEQ ID NO：6)
LQLPTLPLV(SEQ ID NO：7)
TLIRWAILEA(SEQ ID NO：8)
在某些实施方式中，Foxp3肽是Foxp3-7。在某些实施方式中，Foxp3肽是Foxp3-2。在某些实施方式中，Foxp3肽是Foxp3-4。在某些实施方式中，抗体或其它抗原结合蛋白与Foxp3/MHC复合物中Foxp3肽的C-末端结合。在某些实施方式中，抗体或其它抗原结合蛋白与Foxp3/MHC复合物中Foxp3肽的N-末端结合。在下文实施例2中示出的表位作图数据证明某些抗体与MHC分子中氨基酸序列的C末端结合。
在某些实施方式中，抗体或其它抗原结合蛋白与结合于HLA-A*02：01的Foxp3-7结合。与Foxp3-7结合的scFv的非限制性实例包括EXT017-5、EXT017-9、EXT017-10、EXT017-11、EXT017-17、EXT017-18、EXT017-20、EXT017-21、EXT017-23、EXT017-24、EXT017-25、EXT017-26、EXT017-27、EXT017-28、EXT017-29、EXT017-30、EXT017-32、EXT017-34、EXT017-53、EXT017-54、和EXT017-55。
在某些实施方式中，本发明公开的抗体或其抗原结合部分与Foxp3-1、Foxp3-2、Foxp3-3、Foxp3-4、Foxp3-5、Foxp3-6、或Foxp3-7的至少一部分结合。更具体地，在某些实施方式中，本发明公开的抗体或其抗原结合部分与Foxp3-7(SEQ ID NO:8)的至少一部分结合。
EXT017-17、EXT017-18、EXT017-20、EXT017-27、EXT017-28、EXT017-32、EXT017-53、和EXT017-54的重链和轻链可变区CDR1、CDR2、和CDR3序列在下表1中示出。CDR区使用Kabat系统带下划线(Kabat,E.A.等人,(1991)Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,Fifth Edition,U.S.Department of Health and Human Services,NIHPublication No.91-3242)。EXT017-17、EXT017-18、EXT017-20、EXT017-27、EXT017-28、EXT017-32、EXT017-53、和EXT017-54的全长氨基酸序列及编码其的核苷酸、重链可变区序列及编码其的核苷酸、以及轻链可变区序列及编码其的核苷酸显示于附录A中。
表1
EXT017-5、EXT017-9、EXT017-10、EXT017-11、EXT017-21、EXT017-23、EXT017-24、EXT017-25、EXT017-26、EXT017-29、EXT017-30、EXT017-34、和EXT017-55的重链和轻链可变区CDR1、CDR2、和CDR3序列在附录B中示出。EXT017-5、EXT017-9、EXT017-10、EXT017-11、EXT017-21、EXT017-23、EXT017-24、EXT017-25、EXT017-26、EXT017-29、EXT017-30、EXT017-34、和EXT017-55的全长氨基酸序列及编码其的核苷酸、重链可变区序列及编码其的核苷酸、以及轻链可变区序列及编码其的核苷酸在附录C中示出。
在某些实施方式中，抗体或其它抗原结合蛋白与结合于HLA-A*02:01的Foxp3-2结合。与Foxp3-2结合的scFv的非限制性实例包括EXT019-6、EXT019-12、EXT019-9、EXT019-15、EXT019-20、EXT019-4、EXT019-13、和EXT019-8。EXT019-6、EXT019-9、EXT019-12、EXT019-15、和EXT019-20的重链和轻链可变区CDR1、CDR2、和CDR3序列在下表2中示出。EXT019-6、EXT019-9、EXT019-12、EXT019-15、和EXT019-20的全长氨基酸序列及编码其的核苷酸、重链可变区序列及编码其的核苷酸、和轻链可变区序列及编码其的核苷酸在附录D中示出。
表2
EXT019-4、EXT019-13、和EXT019-8的重链和轻链可变区CDR1、CDR2、和CDR3序列在附录E中示出。EXT019-4、EXT019-13、和EXT019-8的全长氨基酸序列及编码其的核苷酸、重链可变区序列及编码其的核苷酸、和轻链可变区序列及编码其的核苷酸在附录D中示出。
在某些实施方式中，抗体或其它抗原结合蛋白与结合于HLA-A*02:01的Foxp3-4结合。与Foxp3-4结合的scFv的非限制性实例包括EXT018-5、EXT018-2、和EXT018-4。EXT018-5的重链和轻链可变区CDR1、CDR2、和CDR3序列在下表3中示出。EXT018-5的全长氨基酸序列及编码其的核苷酸、重链可变区序列及编码其的核苷酸、和轻链可变区序列及编码其的核苷酸在附录F中示出。
表3
EXT018-2和EXT018-4的重链和轻链可变区CDR1、CDR2、和CDR3序列在附录G中示出。EXT018-2和EXT018-4的全长氨基酸序列及编码其的核苷酸、重链可变区序列及编码其的核苷酸、和轻链可变区序列及编码其的核苷酸在附录F中示出。
鉴于EXT017-5、EXT017-9、EXT017-10、EXT017-11、EXT017-17、EXT017-18、EXT017-20、EXT017-21、EXT017-23、EXT017-24、EXT017-25、EXT017-26、EXT017-27、EXT017-28、EXT017-29、EXT017-30、EXT017-32、EXT017-34、EXT017-53、EXT017-54、和EXT017-55中的每一个均可以与结合于HLA-A*02:01的Foxp3-7结合，EXT017-5、EXT017-9、EXT017-10、EXT017-11、EXT017-17、EXT017-18、EXT017-20、EXT017-21、EXT017-23、EXT017-24、EXT017-25、EXT017-26、EXT017-27、EXT017-28、EXT017-29、EXT017-30、EXT017-32、EXT017-34、EXT017-53、EXT017-54、和EXT017-55的VH和VL序列可以“混合并匹配”，以产生与结合于HLA-A*02:01的Foxp3-7结合的其它抗体或抗原结合蛋白。
类似地，鉴于EXT019-6、EXT019-12、EXT019-9、EXT019-15、EXT019-20、EXT019-4、EXT019-13、和EXT019-8中的每一个均可以与结合于HLA-A*02:01的Foxp3-2结合，EXT019-6、EXT019-12、EXT019-9、EXT019-15、EXT019-20、EXT019-4、EXT019-13、和EXT019-8的VH和VL序列可以“混合并匹配”，以产生与结合于HLA-A*02:01的Foxp3-2结合的其它抗体或抗原结合蛋白。
类似地，鉴于EXT018-5、EXT018-2、和EXT018-4中的每一个均可以与结合于HLA-A*02:01的Foxp3-4结合，EXT018-5、EXT018-2、和EXT018-4的VH和VL序列可以“混合并匹配”，以产生与结合于HLA-A*02:01的Foxp3-4结合的其它抗体或抗原结合蛋白。
这些“混合并匹配”的抗体可以使用本领域已知的结合试验进行测试，包括，例如，ELISA、蛋白质印迹、RIA、Biacore分析。优选地，当VH和VL链混合并匹配时，来自特定VH/VL对的VH序列用结构上类似的VH序列代替。类似地，来自特定VH/VL对的VL序列用结构上类似的VL序列代替。
在某些实施方式中，本发明公开的抗体或其它抗原结合蛋白包含包含：(a)EXT017-5、EXT017-9、EXT017-10、EXT017-11、EXT017-17、EXT017-18、EXT017-20、EXT017-21、EXT017-23、EXT017-24、EXT017-25、EXT017-26、EXT017-27、EXT017-28、EXT017-29、EXT017-30、EXT017-32、EXT017-34、EXT017-53、EXT017-54、或EXT017-55的VH，如附录A和C所示，和/或(b)EXT017-5、EXT017-9、EXT017-10、EXT017-11、EXT017-17、EXT017-18、EXT017-20、EXT017-21、EXT017-23、EXT017-24、EXT017-25、EXT017-26、EXT017-27、EXT017-28、EXT017-29、EXT017-30、EXT017-32、EXT017-34、EXT017-53、EXT017-54、或EXT017-55的VL，如附录A和C所示。
在某些实施方式中，抗体或其它抗原结合蛋白包含：(a)包含选自SEQ ID NO:93、95、97、99、101、103、105和107的氨基酸序列的VH；和/或(b)包含选自SEQ ID NO:94、96、98、100、102、104、106和108的氨基酸序列的VL。
优选的重链和轻链组合包括：
(a)包含SEQ ID NO:93所示氨基酸序列的重链可变区、和包含SEQ ID NO:94所示氨基酸序列的轻链可变区；
(b)包含SEQ ID NO:95所示氨基酸序列的重链可变区、和包含SEQ ID NO:96所示氨基酸序列的轻链可变区；
(c)包含SEQ ID NO:97所示氨基酸序列的重链可变区、和包含SEQ ID NO:98所示氨基酸序列的轻链可变区；
(d)包含SEQ ID NO:99所示氨基酸序列的重链可变区、和包含SEQ ID NO:100所示氨基酸序列的轻链可变区；
(e)包含SEQ ID NO:101所示氨基酸序列的重链可变区、和包含SEQ ID NO:102所示氨基酸序列的轻链可变区；
(f)包含SEQ ID NO:103所示氨基酸序列的重链可变区、和包含SEQ ID NO:104所示氨基酸序列的轻链可变区；
(g)包含SEQ ID NO:105所示氨基酸序列的重链可变区、和包含SEQ ID NO:106所示氨基酸序列的轻链可变区；或
(h)包含SEQ ID NO:107所示氨基酸序列的重链可变区、和包含SEQ ID NO:108所示氨基酸序列的轻链可变区。
在某些实施方式中，本发明公开的抗体或其它抗原结合蛋白包含：
(a)EXT019-6、EXT019-12、EXT019-9、EXT019-15、EXT019-20、EXT019-4、EXT019-13、和EXT019-8的VH，如附录D所示，和/或(b)EXT019-6、EXT019-12、EXT019-9、EXT019-15、EXT019-20、EXT019-4、EXT019-13、和EXT019-8的VL，如附录D所示。
例如，抗体或其它抗原结合蛋白包含(a)包含选自SEQ ID NO:109、111、113、115和117的氨基酸序列的VH；和/或(b)包含选自SEQ ID NO:110、112、114、116和118的氨基酸序列的VL。
优选的重链和轻链组合包括：
(a)包含SEQ ID NO:109所示氨基酸序列的重链可变区、和包含SEQ ID NO:110所示氨基酸序列的轻链可变区；
(b)包含SEQ ID NO:111所示氨基酸序列的重链可变区、和包含SEQ ID NO:112所示氨基酸序列的轻链可变区；
(c)包含SEQ ID NO:113所示氨基酸序列的重链可变区、和包含SEQ ID NO:114所示氨基酸序列的轻链可变区；
(d)包含SEQ ID NO:115所示氨基酸序列的重链可变区、和包含SEQ ID NO:116所示氨基酸序列的轻链可变区；或
(e)包含SEQ ID NO:117所示氨基酸序列的重链可变区、和包含SEQ ID NO:118所示氨基酸序列的轻链可变区。
在某些实施方式中，本发明公开的抗体或其它抗原结合蛋白包含：(a)EXT018-5、EXT018-2、和EXT018-4的VH，如附录F所示，和/或(b)EXT018-5、EXT018-2、和EXT018-4的VL，如附录F所示。
例如，抗体或其它抗原结合蛋白包含(a)包含SEQ ID NO:119所示氨基酸序列的VH；和/或(b)包含SEQ ID NO:120所示氨基酸序列的VL。
在某些实施方式中，本发明公开的抗体或其它抗原结合蛋白包含EXT017-5、EXT017-9、EXT017-10、EXT017-11、EXT017-17、EXT017-18、EXT017-20、EXT017-21、EXT017-23、EXT017-24、EXT017-25、EXT017-26、EXT017-27、EXT017-28、EXT017-29、EXT017-30、EXT017-32、EXT017-34、EXT017-53、EXT017-54、或EXT017-55的重链和轻链CDR1、CDR2和CDR3，如表1和附录B所示。
鉴于EXT017-5、EXT017-9、EXT017-10、EXT017-11、EXT017-17、EXT017-18、EXT017-20、EXT017-21、EXT017-23、EXT017-24、EXT017-25、EXT017-26、EXT017-27、EXT017-28、EXT017-29、EXT017-30、EXT017-32、EXT017-34、EXT017-53、EXT017-54、或EXT017-55中的每一个均可以与结合于HLA-A*02:01的Foxp3-7结合并且其抗原结合特异性主要由CDR1、CDR2、和CDR3区提供，EXT017-5、EXT017-9、EXT017-10、EXT017-11、EXT017-17、EXT017-18、EXT017-20、EXT017-21、EXT017-23、EXT017-24、EXT017-25、EXT017-26、EXT017-27、EXT017-28、EXT017-29、EXT017-30、EXT017-32、EXT017-34、EXT017-53、EXT017-54、或EXT017-55中每一个的VH CDR1、CDR2、和CDR3序列以及VL CDR1、CDR2、和CDR3序列可以“混合并匹配”(即，来自不同抗体的CDR可以混合并匹配，尽管各个抗体必须包含VH CDR1、CDR2和CDR3以及VLCDR1、CDR2和CDR3)，以产生与结合于HLA-A*02:01的Foxp3-7结合的其它抗体或其它抗原结合蛋白。
类似地，鉴于EXT019-6、EXT019-12、EXT019-9、EXT019-15、EXT019-20、EXT019-4、EXT019-13、和EXT019-8中的每一个均可以与结合于HLA-A*02:01的Foxp3-2结合并且其抗原结合特异性主要由CDR1、CDR2、和CDR3区提供，EXT019-6、EXT019-12、EXT019-9、EXT019-15、EXT019-20、EXT019-4、EXT019-13、和EXT019-8中每一个的VH CDR1、CDR2、和CDR3序列以及VL CDR1、CDR2、和CDR3序列可以“混合并匹配”，以产生与结合于HLA-A*02:01的Foxp3-2结合的其它抗体或抗原结合蛋白。这些“混合并匹配”的抗体可以使用上述的结合试验进行测试。
类似地，鉴于EXT018-5、EXT018-2、和EXT018-4中的每一个均可以与结合于HLA-A*02:01的Foxp3-4结合并且其抗原结合特异性主要由CDR1、CDR2、和CDR3区提供，EXT018-5、EXT018-2、和EXT018-4中每一个的VH CDR1、CDR2、和CDR3序列以及VL CDR1、CDR2、和CDR3序列可以“混合并匹配”，以产生与结合于HLA-A*02:01的Foxp3-4结合的其它抗体或抗原结合蛋白。这些“混合并匹配”的抗体可以使用上述的结合试验进行测试。
当VH CDR序列混合并匹配时，来自特定VH序列的CDR1、CDR2和/或CDR3序列用结构上类似的CDR序列代替。同样地，当VL CDR序列混合并匹配时，来自特定VL序列的CDR1、CDR2和/或CDR3序列优选地用结构上类似的CDR序列代替。对于本领域普通技术人员显然易见的是，新的VH和VL序列可以通过将一个或多个VH和/或VLCDR区序列用结构上类似的来自本文公开的抗体或其抗原结合部分的CDR序列代替而产生。
在某些实施方式中，本发明公开的抗体、或其抗原结合部分包含：
(a)EXT017-5、EXT017-9、EXT017-10、EXT017-11、EXT017-17、EXT017-18、EXT017-20、EXT017-21、EXT017-23、EXT017-24、EXT017-25、EXT017-26、EXT017-27、EXT017-28、EXT017-29、EXT017-30、EXT017-32、EXT017-34、EXT017-53、EXT017-54、或EXT017-55的VHCDR1，如表1和附录B所示；
(b)EXT017-5、EXT017-9、EXT017-10、EXT017-11、EXT017-17、EXT017-18、EXT017-20、EXT017-21、EXT017-23、EXT017-24、EXT017-25、EXT017-26、EXT017-27、EXT017-28、EXT017-29、EXT017-30、EXT017-32、EXT017-34、EXT017-53、EXT017-54、或EXT017-55的VHCDR2，如表1和附录B所示；
(c)EXT017-5、EXT017-9、EXT017-10、EXT017-11、EXT017-17、EXT017-18、EXT017-20、EXT017-21、EXT017-23、EXT017-24、EXT017-25、EXT017-26、EXT017-27、EXT017-28、EXT017-29、EXT017-30、EXT017-32、EXT017-34、EXT017-53、EXT017-54、或EXT017-55的VHCDR3，如表1和附录B所示；
(d)EXT017-5、EXT017-9、EXT017-10、EXT017-11、EXT017-17、EXT017-18、EXT017-20、EXT017-21、EXT017-23、EXT017-24、EXT017-25、EXT017-26、EXT017-27、EXT017-28、EXT017-29、EXT017-30、EXT017-32、EXT017-34、EXT017-53、EXT017-54、或EXT017-55的VLCDR1，如表1和附录B所示；
(e)EXT017-5、EXT017-9、EXT017-10、EXT017-11、EXT017-17、EXT017-18、EXT017-20、EXT017-21、EXT017-23、EXT017-24、EXT017-25、EXT017-26、EXT017-27、EXT017-28、EXT017-29、EXT017-30、EXT017-32、EXT017-34、EXT017-53、EXT017-54、或EXT017-55的VLCDR2，如表1和附录B所示；和
(f)EXT017-5、EXT017-9、EXT017-10、EXT017-11、EXT017-17、EXT017-18、EXT017-20、EXT017-21、EXT017-23、EXT017-24、EXT017-25、EXT017-26、EXT017-27、EXT017-28、EXT017-29、EXT017-30、EXT017-32、EXT017-34、EXT017-53、EXT017-54、或EXT017-55的VLCDR3，如表1和附录B所示。
例如，本发明公开的抗体、或其抗原结合部分包含：
(a)包含选自SEQ ID NO:9、15、21、27、33、39、45、和51的氨基酸序列的重链可变区CDR1；
(b)包含选自SEQ ID NO:10、16、22、28、34、40、46、52的氨基酸序列的重链可变区CDR2；
(c)包含选自SEQ ID NO:11、17、23、29、35、41、47、和53的氨基酸序列的重链可变区CDR3；
(d)包含选自SEQ ID NO:12、18、24、30、36、40、42、48、和54的氨基酸序列的轻链可变区CDR1；
(e)包含选自SEQ ID NO:13、19、25、31、37、43、49、和55的氨基酸序列的轻链可变区CDR2；和
(f)包含选自SEQ ID NO:14、20、26、32、38、44、50、和56的氨基酸序列的轻链可变区CDR3。
在某些实施方式中，本发明公开的抗体、或其抗原结合部分包含：包含SEQ ID NO:9所示氨基酸序列的重链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:10所示氨基酸序列的重链可变区CDR2；包含SEQ ID NO:11所示氨基酸序列的重链可变区CDR3；包含SEQ ID NO:12所示氨基酸序列的轻链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:13所示氨基酸序列的轻链可变区CDR2；和包含SEQ ID NO:14所示氨基酸序列的轻链可变区CDR3。包含该CDR1、CDR2、和CDR3的组合的抗体称为“EXT017-17”。
在某些实施方式中，本发明公开的抗体、或其抗原结合部分包含：包含SEQ ID NO:15所示氨基酸序列的重链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:16所示氨基酸序列的重链可变区CDR2；包含SEQ ID NO:17所示氨基酸序列的重链可变区CDR3；包含SEQ ID NO:18所示氨基酸序列的轻链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:19所示氨基酸序列的轻链可变区CDR2；和包含SEQ ID NO:20所示氨基酸序列的轻链可变区CDR3。包含该CDR1、CDR2、和CDR3的组合的抗体称为“EXT017-18”。
在某些实施方式中，本发明公开的抗体、或其抗原结合部分包含：包含SEQ ID NO:21所示氨基酸序列的重链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:22所示氨基酸序列的重链可变区CDR2；包含SEQ ID NO:23所示氨基酸序列的重链可变区CDR3；包含SEQ ID NO:24所示氨基酸序列的轻链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:25所示氨基酸序列的轻链可变区CDR2；和包含SEQ ID NO:26所示氨基酸序列的轻链可变区CDR3。包含该CDR1、CDR2、和CDR3的组合的抗体称为“EXT017-20”。
在某些实施方式中，本发明公开的抗体、或其抗原结合部分包含：包含SEQ ID NO:27所示氨基酸序列的重链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:28所示氨基酸序列的重链可变区CDR2；包含SEQ ID NO:29所示氨基酸序列的重链可变区CDR3；包含SEQ ID NO:30所示氨基酸序列的轻链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:31所示氨基酸序列的轻链可变区CDR2；和包含SEQ ID NO:32所示氨基酸序列的轻链可变区CDR3。包含该CDR1、CDR2、和CDR3的组合的抗体称为“EXT017-27”。
在某些实施方式中，本发明公开的抗体、或其抗原结合部分包含：包含SEQ ID NO:33所示氨基酸序列的重链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:34所示氨基酸序列的重链可变区CDR2；包含SEQ ID NO:35所示氨基酸序列的重链可变区CDR3；包含SEQ ID NO:36所示氨基酸序列的轻链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:37所示氨基酸序列的轻链可变区CDR2；和包含SEQ ID NO:38所示氨基酸序列的轻链可变区CDR3。包含该CDR1、CDR2、和CDR3的组合的抗体称为“EXT017-28”。
在某些实施方式中，本发明公开的抗体、或其抗原结合部分包含：包含SEQ ID NO:39所示氨基酸序列的重链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:40所示氨基酸序列的重链可变区CDR2；包含SEQ ID NO:41所示氨基酸序列的重链可变区CDR3；包含SEQ ID NO:42所示氨基酸序列的轻链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:43所示氨基酸序列的轻链可变区CDR2；和包含SEQ ID NO:44所示氨基酸序列的轻链可变区CDR3。包含该CDR1、CDR2、和CDR3的组合的抗体称为“EXT017-32”。
在某些实施方式中，本发明公开的抗体、或其抗原结合部分包含：包含SEQ ID NO:45所示氨基酸序列的重链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:46所示氨基酸序列的重链可变区CDR2；包含SEQ ID NO:47所示氨基酸序列的重链可变区CDR3；包含SEQ ID NO:48所示氨基酸序列的轻链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:49所示氨基酸序列的轻链可变区CDR2；和包含SEQ ID NO:50所示氨基酸序列的轻链可变区CDR3。包含该CDR1、CDR2、和CDR3的组合的抗体称为“EXT017-53”。
在某些实施方式中，本发明公开的抗体、或其抗原结合部分包含：包含SEQ ID NO:51所示氨基酸序列的重链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:52所示氨基酸序列的重链可变区CDR2；包含SEQ ID NO:53所示氨基酸序列的重链可变区CDR3；包含SEQ ID NO:54所示氨基酸序列的轻链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:55所示氨基酸序列的轻链可变区CDR2；和包含SEQ ID NO:56所示氨基酸序列的轻链可变区CDR3。包含该CDR1、CDR2、和CDR3的组合的抗体称为“EXT017-54”。
在某些实施方式中，本发明公开的抗体、或其抗原结合部分包含：
(a)EXT019-6、EXT019-12、EXT019-9、EXT019-15、EXT019-20、EXT019-4、EXT019-13、和EXT019-8的VH CDR1，如表2和附录E所示；
(b)EXT019-6、EXT019-12、EXT019-9、EXT019-15、EXT019-20、EXT019-4、EXT019-13、和EXT019-8的VH CDR2，如表2和附录E所示；
(c)EXT019-6、EXT019-12、EXT019-9、EXT019-15、EXT019-20、EXT019-4、EXT019-13、和EXT019-8的VH CDR3，如表2和附录E所示；
(d)EXT019-6、EXT019-12、EXT019-9、EXT019-15、EXT019-20、EXT019-4、EXT019-13、和EXT019-8的VL CDR1，如表2和附录E所示；
(e)EXT019-6、EXT019-12、EXT019-9、EXT019-15、EXT019-20、EXT019-4、EXT019-13、和EXT019-8的VL CDR2，如表2和附录E所示；和
(f)EXT019-6、EXT019-12、EXT019-9、EXT019-15、EXT019-20、EXT019-4、EXT019-13、和EXT019-8的VL CDR3，如表2和附录E所示。
例如，本发明公开的抗体、或其抗原结合部分包含：
(a)包含选自SEQ ID NO:57、63、69、75、和81的氨基酸序列的重链可变区CDR1；
(b)包含选自SEQ ID NO:58、64、70、76、和82的氨基酸序列的重链可变区CDR2；
(c)包含选自SEQ ID NO:59、65、71、77、和83的氨基酸序列的重链可变区CDR3；
(d)包含选自SEQ ID NO:60、66、72、78、和84的氨基酸序列的轻链可变区CDR1；
(e)包含选自SEQ ID NO:61、67、73、79、和85的氨基酸序列的轻链可变区CDR2；和
(f)包含选自SEQ ID NO:62、68、74、80、和86的氨基酸序列的轻链可变区CDR3。
在某些实施方式中，本发明公开的抗体、或其抗原结合部分包含：包含SEQ ID NO:57所示氨基酸序列的重链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:58所示氨基酸序列的重链可变区CDR2；包含SEQ ID NO:59所示氨基酸序列的重链可变区CDR3；包含SEQ ID NO:60所示氨基酸序列的轻链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:61所示氨基酸序列的轻链可变区CDR2；和包含SEQ ID NO:62所示氨基酸序列的轻链可变区CDR3。包含该CDR1、CDR2、和CDR3的组合的抗体称为“EXT019-6”。
在某些实施方式中，本发明公开的抗体、或其抗原结合部分包含：包含SEQ ID NO:63所示氨基酸序列的重链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:64所示氨基酸序列的重链可变区CDR2；包含SEQ ID NO:65所示氨基酸序列的重链可变区CDR3；包含SEQ ID NO:66所示氨基酸序列的轻链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:67所示氨基酸序列的轻链可变区CDR2；和包含SEQ ID NO:68所示氨基酸序列的轻链可变区CDR3。包含该CDR1、CDR2、和CDR3的组合的抗体称为“EXT019-9”。
在某些实施方式中，本发明公开的抗体、或其抗原结合部分包含：包含SEQ ID NO:69所示氨基酸序列的重链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:70所示氨基酸序列的重链可变区CDR2；包含SEQ ID NO:71所示氨基酸序列的重链可变区CDR3；包含SEQ ID NO:72所示氨基酸序列的轻链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:73所示氨基酸序列的轻链可变区CDR2；和包含SEQ ID NO:74所示氨基酸序列的轻链可变区CDR3。包含该CDR1、CDR2、和CDR3的组合的抗体称为“EXT019-12”。
在某些实施方式中，本发明公开的抗体、或其抗原结合部分包含：包含SEQ ID NO:75所示氨基酸序列的重链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:76所示氨基酸序列的重链可变区CDR2；包含SEQ ID NO:77所示氨基酸序列的重链可变区CDR3；包含SEQ ID NO:78所示氨基酸序列的轻链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:79所示氨基酸序列的轻链可变区CDR2；和包含SEQ ID NO:80所示氨基酸序列的轻链可变区CDR3。包含该CDR1、CDR2、和CDR3的组合的抗体称为“EXT019-15”。
在某些实施方式中，本发明公开的抗体、或其抗原结合部分包含：包含SEQ ID NO:81所示氨基酸序列的重链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:82所示氨基酸序列的重链可变区CDR2；包含SEQ ID NO:83所示氨基酸序列的重链可变区CDR3；包含SEQ ID NO:84所示氨基酸序列的轻链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:85所示氨基酸序列的轻链可变区CDR2；和包含SEQ ID NO:86所示氨基酸序列的轻链可变区CDR3。包含该CDR1、CDR2、和CDR3的组合的抗体称为“EXT019-20”。
在某些实施方式中，本发明公开的抗体、或其抗原结合部分包含：
(a)EXT018-5、EXT018-2、和EXT018-4的VH CDR1，如表3和附录G所示；
(b)EXT018-5、EXT018-2、和EXT018-4的VH CDR2，如表3和附录G所示；
(c)EXT018-5、EXT018-2、和EXT018-4的VH CDR3，如表3和附录G所示；
(d)EXT018-5、EXT018-2、和EXT018-4的VL CDR1，如表3和附录G所示；
(e)EXT018-5、EXT018-2、和EXT018-4的VL CDR2，如表3和附录G所示；和
(f)EXT018-5、EXT018-2、和EXT018-4的VL CDR3，如表3和附录G所示。
在某些实施方式中，本发明公开的抗体、或其抗原结合部分包含：包含SEQ ID NO:87所示氨基酸序列的重链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:88所示氨基酸序列的重链可变区CDR2；包含SEQ ID NO:89所示氨基酸序列的重链可变区CDR3；包含SEQ ID NO:90所示氨基酸序列的轻链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:91所示氨基酸序列的轻链可变区CDR2；和包含SEQ ID NO:92所示氨基酸序列的轻链可变区CDR3。包含该CDR1、CDR2、和CDR3的组合的抗体称为“EXT018-5”。
本发明公开的抗体的恒定区/框架区可以进行变化，例如，通过氨基酸替换，以修饰抗体的特性(例如，增加或降低以下的一种或多种：抗体结合亲和力，Fc受体结合，抗体碳水化合物例如糖基化、岩藻糖基化等，半胱氨酸残基的数量，效应细胞功能，效应细胞功能，补体功能或缀合位点的引入)。
在某些实施方式中，本发明公开的抗体是全人抗体。在某些实施方式中，本发明公开的抗体是全人单克隆抗体(mAb)。全人mAb优选用于人的治疗用途，因为鼠类抗体在施用于人时导致称作HAMA(人抗-鼠抗体)应答的免疫原性反应(Azinovic I等,Survivalbenefit associated with human anti-mouse antibody(HAMA)in patients with B-cell malignancies.Cancer Immunol Immunother 2006；55(12):1451-8；Tjandra JJ等,Development of human anti-murine antibody(HAMA)response in patients.ImmunolCell Biol 1990；68(6):367-76)，导致严重的副作用，包括过敏反应和超敏反应。因鼠类抗体与天然人抗体的氨基酸序列略微不同，人免疫系统将其识别为外来物，进而触发免疫原性反应。可以使用本领域已知的人源化方法(Riechmann L等,Reshaping humanantibodies for therapy.Nature 1988；332(6162):332:323；Queen C等,A humanizedantibody that binds to the interleukin 2 receptor.Proc Natl Acad Sci USA1989；86(24):10029-33)，以降低来自鼠类抗体的免疫原性(Gerd R等,SerologicalAnalysis of Human Anti-Human Antibody Responses in Colon Cancer PatientsTreated with Repeated Doses of Humanized Monoclonal Antibody A33.Cancer Res2001；61,6851–6859)。
噬菌体展示文库的使用已使得可以为了针对非常确定表位的独特稀有的抗体来筛选大量的抗体库(对于噬菌体展示更详细的描述参见McCafferty等,Phage antibodies:filamentous phage displaying antibody variable domains.Nature,348:552-554)。因此，迅速鉴定出对于源自肿瘤抗原的肽-MHC复合物分子具有高度特异性的人Fab或scFv变得可能。通过将对于黑色素瘤Ag MART-1 26-35/A2或gp100 280-288/A2特异性的TCR样Fab与截短形式的假单胞菌内毒素融合产生的免疫毒素已经显示在体外和体内均抑制人黑色素瘤的生长(Klechevsky E等,Antitumor activity of immunotoxins with T-cellreceptor-like specificity against human melanoma xenografts.Cancer Res 2008；68(15):6360-6367)。此外，通过使用Fab片段对全长单克隆抗体(mAb)进行改造，可以略过为开发例如用于治疗癌症或免疫性疾病的治疗性mAb通常需要的耗时数月之久的工作，直接产生治疗性人mAb。
同源性抗体
在某些实施方式中，本发明公开的抗体或其抗原结合部分包含：包含与本文所述的抗体或其抗原结合部分(例如scFv)(例如EXT017-5、EXT017-9、EXT017-10、EXT017-11、EXT017-17、EXT017-18、EXT017-20、EXT017-21、EXT017-23、EXT017-24、EXT017-25、EXT017-26、EXT017-27、EXT017-28、EXT017-29、EXT017-30、EXT017-32、EXT017-34、EXT017-53、EXT017-54、EXT017-55、EXT019-6、EXT019-12、EXT019-9、EXT019-15、EXT019-20、EXT019-4、EXT019-13、EXT019-8、EXT018-5、EXT018-2、或EXT018-4)的氨基酸序列同源的氨基酸序列的重链和轻链可变区，并且其中抗体或其抗原结合部分保持本发明公开主题的抗-Foxp3抗体或其抗原结合部分所需的功能特性。
例如，本发明公开的抗体或其抗原结合部分包含：包含与EXT017-5、EXT017-9、EXT017-10、EXT017-11、EXT017-17、EXT017-18、EXT017-20、EXT017-21、EXT017-23、EXT017-24、EXT017-25、EXT017-26、EXT017-27、EXT017-28、EXT017-29、EXT017-30、EXT017-32、EXT017-34、EXT017-53、EXT017-54、EXT017-55、EXT019-6、EXT019-12、EXT019-9、EXT019-15、EXT019-20、EXT019-4、EXT019-13、EXT019-8、EXT018-5、EXT018-2、或EXT018-4的VH序列(如附录A、C、D、和F所示)至少约80％同源(例如至少约81％同源、至少约82％同源、至少约83％同源、至少约84％同源、至少约85％同源、至少约86％同源、至少约87％同源、至少约88％同源、至少约89％同源、至少约90％同源、至少约91％同源、至少约92％同源、至少约93％同源、至少约94％同源、至少约95％同源、至少约96％同源、至少约97％同源、至少约98％同源、至少约99％同源、或约100％同源)的氨基酸序列的重链可变区，和包含与EXT017-5、EXT017-9、EXT017-10、EXT017-11、EXT017-17、EXT017-18、EXT017-20、EXT017-21、EXT017-23、EXT017-24、EXT017-25、EXT017-26、EXT017-27、EXT017-28、EXT017-29、EXT017-30、EXT017-32、EXT017-34、EXT017-53、EXT017-54、EXT017-55、EXT019-6、EXT019-12、EXT019-9、EXT019-15、EXT019-20、EXT019-4、EXT019-13、EXT019-8、EXT018-5、EXT018-2、或EXT018-4的VL序列(如附录A、C、D、和F所示)至少80％同源(例如至少约81％同源、至少约82％同源、至少约83％同源、至少约84％同源、至少约85％同源、至少约86％同源、至少约87％同源、至少约88％同源、至少约89％同源、至少约90％同源、至少约91％同源、至少约92％同源、至少约93％同源、至少约94％同源、至少约95％同源、至少约96％同源、至少约97％同源、至少约98％同源、至少约99％同源、或约100％同源)的氨基酸序列的轻链可变区，并且抗体或其抗原结合部分以约5x 10-7M或更低的KD与结合于HLA-A*02:01的Foxp3肽结合。
例如，本发明公开的抗体或其抗原结合部分包含：
(a)包含与选自SEQ ID NO:93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、和119的氨基酸序列至少约80％同源的氨基酸序列的重链可变区；
(b)包含与选自SEQ ID NO:94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、和120的氨基酸序列至少约80％同源的氨基酸序列的轻链可变区；并且
其中抗体或其抗原结合部分以约5x 10-7M或更低的KD与结合于HLA-A*02:01的Foxp3肽结合。
在某些实施方式中，VH和/或VL氨基酸序列可以与上述序列约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％、或约100％同源。具有与上述序列的VH和VL区高同源性(即80％或更高)的VH和VL区的抗体可以通过诱变(例如，定点诱变或PCR介导的诱变)、然后使用本文所述的结合试验测试所编码的改变的抗体保留的功能(即结合亲和力)来获得。
两个序列之间序列的比较和同源性的测定可以使用数学算法完成，并且在本领域中是标准的。
作为一个非限制性实例，两个氨基酸序列之间的百分比同源性可以使用E.Meyers和W.Miller的算法确定(Comput.Appl.Biosci.,4:11-17(1988))，其已经并入到ALIGN程序(2.0版本)中，使用PAM120权重残基表(weight residue table)，空位长度罚分为12，并且空位罚分为4。此外，两个氨基酸序列之间的百分比同源性可以使用Needleman和Wunsch的算法确定(J.Mol.Biol.48:444-453(1970))，其已经并入到GCG软件包的GAP程序中(在www.gcg.com中可得)，使用Blossum62矩阵或PAM250矩阵，并且空位权重为16、14、12、10、8、6或4，长度权重为1、2、3、4、5或6。
另外或替代地，本发明公开主题的蛋白质序列可以进一步用作“查询序列”，以对公开的数据库进行检索，例如，以识别相关的序列。这种搜索可以使用Altschul等,(1990)J.Mol.Biol.215:403-10的XBLAST程序(2.0版本)进行。BLAST蛋白质搜索可以用XBLAST程序进行，分数＝50，字长＝3，以得到与本发明的抗体分子同源的氨基酸序列。为了获得有空位的比对用于比较目的，可以使用Gapped BLAST，如Altschul等,(1997)Nucleic AcidsRes.25(17):3389-3402所述。使用BLAST和Gapped BLAST程序时，可以使用各个程序(例如XBLAST和NBLAST)的默认参数(参见www.ncbi.nlm.nih.gov)。
具有修饰的抗体
在某些实施方式中，本发明公开的抗体或其抗原结合部分包含：包含CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区以及包含CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变区，其中这些CDR序列中的一种或多种包含基于本文所述抗体或其抗原结合部分(例如scFv)(例如，EXT017-5、EXT017-9、EXT017-10、EXT017-11、EXT017-17、EXT017-18、EXT017-20、EXT017-21、EXT017-23、EXT017-24、EXT017-25、EXT017-26、EXT017-27、EXT017-28、EXT017-29、EXT017-30、EXT017-32、EXT017-34、EXT017-53、EXT017-54、EXT017-55、EXT019-6、EXT019-12、EXT019-9、EXT019-15、EXT019-20、EXT019-4、EXT019-13、EXT019-8、EXT018-5、EXT018-2、或EXT018-4，如表1-3和附录B、E和G所示)的特定氨基酸序列、或其修饰，并且其中抗体或其抗原结合部分保留本发明公开主题的抗-Foxp3抗体或其抗原结合部分的期望的功能特性。
本发明公开的主题提供一种分离的抗体或其抗原结合部分，该抗体或其抗原结合部分包含：包含CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区和包含CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变区，其中：
(a)重链可变区CDR3序列包含选自SEQ ID NO:11、17、23、29、35、41、47、53、59、65、71、77、83和89的氨基酸序列、或其保守性修饰；
(b)轻链可变区CDR3序列包含选自SEQ ID NO:14、20、26、32、38、44、50、56、62、68、74、80、86和92的氨基酸序列、或其修饰；并且抗体或其抗原结合部分与结合于MHC分子的Foxp3肽特异性地结合。
在某些实施方式中，重链可变区CDR2序列包含选自SEQ ID NO:10、16、22、28、34、40、46、52、58、64、70、76、82、和88的氨基酸序列、或其修饰；并且轻链可变区CDR2序列包含选自SEQ ID NO:13、19、25、31、37、43、49、55、61、67、73、79、85、和91的氨基酸序列、或其修饰。
在某些实施方式中，重链可变区CDR1序列包含选自SEQ ID NO:9、15、21、27、33、39、45、51、57、63、69、75、81、和87的氨基酸序列、及其修饰；并且轻链可变区CDR1序列包含选自SEQ ID NO:12、18、24、30、36、42、48、54、60、66、72、78、84、和90的氨基酸序列、或其修饰。
在某些实施方式中，修饰不会显著影响或改变含有该氨基酸序列的抗体的结合特性。这些修饰包括氨基酸替换、添加和缺失。修饰可以通过本领域已知的标准技术例如定点诱变和PCR-介导的诱变引入到本发明的抗体或其抗原结合部分中。
修饰可以是保守修饰、非保守修饰或者保守修饰与非保守修饰的混合。保守氨基酸替换是氨基酸残基由具有相似侧链的氨基酸残基取代的一种替换。具有相似侧链的氨基酸残基家族在本领域中已有定义。示例性的保守氨基酸替换显示于表4。氨基酸替换可以引入到目标抗体中，并对产物进行所需活性的筛选，例如，抗原结合的保留/改善、免疫原性降低、或者ADCC或CDC提高。
表4
原始残基 示例性保守氨基酸替换
Ala(A) Val；Leu；Ile
Arg(R) Lys；Gln；Asn
Asn(N) Gln；His；Asp,Lys；Arg
Asp(D) Glu；Asn
Cys(C) Ser；Ala
Gln(Q) Asn；Glu
Glu(E) Asp；Gln
Gly(G) Ala
His(H) Asn；Gln；Lys；Arg
Ile(I) Leu；Val；Met；Ala；Phe
Leu(L) Ile；Val；Met；Ala；Phe
Lys(K) Arg；Gln；Asn
Met(M) Leu；Phe；Ile
Phe(F) Trp；Leu；Val；Ile；Ala；Tyr
Pro(P) Ala
Ser(S) Thr
Thr(T) Val；Ser
Trp(W) Tyr；Phe
Tyr(Y) Trp；Phe；Thr；Ser
Val(V) Ile；Leu；Met；Phe；Ala
氨基酸可以根据共同的侧链特性进行分组：
·疏水性：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；
·中性亲水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；
·酸性：Asp、Glu；
·碱性：His、Lys、Arg；
·影响链取向的残基：Gly、Pro；
·芳香性：Trp、Tyr、Phe。
因此，CDR区内的一个或多个氨基酸残基可以用来自同组的其它氨基酸残基取代，并使用本文所述的功能试验来测试被改变的抗体的保留功能。
非保守替换需要将这些类别之一的成员换成另一类别。
在某些实施方式中，指定序列或CDR区内的不超过一个、不超过两个、不超过三个、不超过四个、不超过五个残基被改变。
交叉竞争抗体
本发明公开的主题提供抗体或其抗原结合部分，该抗体或其抗原结合部分与本发明公开主题的任何抗-Foxp3抗体或其抗原结合部分(例如scFv)(例如EXT017-5、EXT017-9、EXT017-10、EXT017-11、EXT017-17、EXT017-18、EXT017-20、EXT017-21、EXT017-23、EXT017-24、EXT017-25、EXT017-26、EXT017-27、EXT017-28、EXT017-29、EXT017-30、EXT017-32、EXT017-34、EXT017-53、EXT017-54、EXT017-55、EXT019-6、EXT019-12、EXT019-9、EXT019-15、EXT019-20、EXT019-4、EXT019-13、EXT019-8、EXT018-5、EXT018-2、或EXT018-4)交叉竞争结合Foxp3肽/HLA复合物(例如Foxp3肽/HLA I类复合物、Foxp3肽/HLA-A2复合物、或Foxp3肽/HLA-A*02:01复合物)，并且以约5x 10-7M或更低，例如约1x 10-7M或更低、约5x 10-8M或更低、约1x 10-8M或更低、约5x 10-9M或更低、约1x 10-9M或更低、约5x 10-10M或更低、约1x 10-10M或更低、约5x 10-11M或更低、或者约1x 10-11M或更低的结合亲和力(KD)与Foxp3肽特异性地结合。交叉竞争的抗体或其抗原结合部分与本文所述的任何抗-Foxp3抗体或其抗原结合部分结合相同的表位区例如相同表位、相邻表位或重叠。在某些实施方式中，交叉竞争的抗体或其抗原结合部分与本文所述的任何抗-Foxp3抗体或其抗原结合部分结合Foxp3肽上的相同表位。
这些交叉竞争抗体可以基于它们在标准的Foxp3结合试验中与任意一种本发明公开的抗-Foxp3抗体或其抗原结合部分交叉竞争的能力加以鉴定。例如，可以使用Biacore分析、ELISA试验或流式细胞术来证明与本发明公开主题的抗体或其抗原结合部分的交叉竞争。测试抗体抑制例如任意一种本发明公开的抗-Foxp3抗体或其抗原结合部分与Foxp3肽/MHC(例如，Foxp3/HLA复合物，更具体地，Foxp3/HLA I类复合物，更具体地，Foxp3/HLA-A2复合物，以及更具体地，Foxp3/HLA-A*02:01复合物)结合的能力，说明测试抗体能够与任意一种本发明公开的抗-Foxp3抗体或其抗原结合部分竞争结合这些Foxp3肽/MHC复合物。
结合抗原的抗体的表征
可以通过例如标准ELISA测试本发明公开主题的抗体与Foxp3肽/HLA复合物的结合。为了确定纯化抗体的同种型，可以使用对特定同种型的抗体具有特异性的试剂进行同种型ELISA。可以通过蛋白质印迹进一步就抗-Foxp3人IgG进行与Foxp3肽/MHC复合物反应性的测试。
在某些实施方式中，通过放射性标记抗原结合试验(RIA)测量KD。在某些实施方式中，用Fab形式的感兴趣抗体及其抗原进行RIA。例如，通过在存在滴定系列的未标记抗原的情况下用最小浓度的(125I)-标记的抗原平衡Fab，然后用抗-Fab抗体包被的板捕捉结合的抗原，来测量Fab对抗原的溶液结合亲和力(参见例如Chen等,J.Mol.Biol.293:865-881(1999))。
在某些实施方式中，使用表面等离子体共振试验来测量KD。例如，使用-2000或-3000(BIAcore,Inc.,Piscataway,NJ)的试验。
免疫缀合物
本发明公开的主题提供与治疗部分例如细胞毒素、药物(例如免疫抑制剂)或放射性毒素缀合的抗-Foxp3抗体或其抗原结合部分。这些缀合物在本文中称作“免疫缀合物”。包括一种或多种细胞毒素的免疫缀合物称作“免疫毒素”。细胞毒素或细胞毒性剂包括对细胞有害(例如，杀伤)的任何试剂。实例包括紫杉醇(比如蓖麻毒蛋白、白喉、白树毒素)、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、吐根碱、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷(tenoposide)、长春新碱、长春花碱、秋水仙素、阿霉素、柔红霉素、二羟基炭疽菌素二酮(dihydroxy anthracindione)、米托蒽醌、光辉霉素、放线菌素D、1-去氢睾酮、糖皮质激素类、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔和嘌呤霉素及其类似物或同系物。治疗剂还包括例如，刺孢霉素(calecheamicin)、aureastatin、抗代谢物(例如氨甲蝶呤、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶氨烯咪胺(5-fluorouracil decarbazine))、烷基化剂(例如氮芥、噻替派苯丁酸氮芥(thioepa chlorambucil)、苯丙氨酸氮芥、亚硝脲氮芥(BSNU)和环己亚硝脲(CCNU)、环磷酰胺(cyclothosphamide)、白消安、二溴甘露醇、链脲霉素、丝裂霉素C、和顺-二氯二胺铂(II)(DDP)顺铂)、蒽环类(例如，柔红霉素(以前称道诺霉素)和阿霉素)、抗生素(例如，更生霉素(以前称放线菌素)、博来霉素、光辉霉素、和氨茴霉素(AMC))、和抗有丝分裂剂(例如，长春新碱和长春花碱)。
可以与本文公开的抗-Foxp3抗体或其抗原结合部分缀合的治疗性细胞毒素的其它实例包括多卡米星(duocarmycin)类、卡奇霉素(calicheamicin)类、美登素类和auristatin类以及它们的衍生物。卡奇霉素抗体缀合物的实例是市售可得的(MylotargTM；Wyeth-Ayerst)。
可以使用本领域可获得的接头技术将细胞毒素(cytoxin)与本文公开的抗-Foxp3抗体或其抗原结合部分缀合。已经用于将细胞毒素缀合到抗体的接头类型的实例包括，但不限于，腙类、硫醚、酯类、二硫化物和含有肽的接头。可以选择例如对溶酶体隔室内的低pH切割敏感或者对蛋白酶切割敏感的接头，该蛋白酶为比如优先在肿瘤组织中表达的蛋白酶，如组织蛋白酶类(例如，组织蛋白酶B、C、D)。关于细胞毒素类型、用于将治疗剂缀合到抗体的接头和方法的进一步讨论，还参见Saito,G.等(2003)Adv.Drug Deliv.Rev.55:199-215；Trail,P.A.等(2003)Cancer Immunol.Immunother.52:328-337；Payne,G.(2003)Cancer Cell 3:207-212；Allen,T.M.(2002)Nat.Rev.Cancer 2:750-763；Pastan,I.和Kreitman,R.J.(2002)Curr.Opin.Investig.Drugs 3:1089-1091；Senter,P.D.和Springer,C.J.(2001)Adv.Drug Deliv.Rev.53:247-264。
本发明公开主题的抗-Foxp3抗体也能够与放射性同位素缀合，以产生细胞毒性放射性药物，也称作放射性免疫缀合物。可以缀合到用于诊断或治疗用途的抗体的放射性同位素的实例包括，但不限于，90Y、131I、225Ac、213Bi、223Ra、177Lu和227Th。用于制备放射免疫缀合物的方法是本领域中已建立的。放射性免疫缀合物的实例是市售可得的，包括ZevalinTM(IDEC Pharmaceuticals)和BexxarTM(Corixa Pharmaceuticals)，并且可以用类似的方法使用本发明的抗体制备放射性免疫缀合物。
本发明公开主题的抗体缀合物可以用于修饰给定生物学应答，并且药物部分不理解为局限于典型的化学治疗剂。例如，药物部分可以是具有所期望的生物学活性的蛋白质或多肽。这种蛋白质可以包括，例如，酶促活性毒素或其活性片段，如相思豆毒蛋白、蓖麻毒蛋白A、假单胞菌外毒素或白喉毒素；蛋白质，如肿瘤坏死因子(TNF)或γ干扰素；或生物应答调节剂，例如淋巴因子、白介素-1(“IL-1”)、白介素-2(“IL-2”)、白介素-6(“IL-6”)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(“GM-CSF”)、粒细胞集落刺激因子(“G-CSF”)，或其它生长因子。
将这些治疗部分与抗体缀合的技术是公知的，参见，例如，Arnon等,“MonoclonalAntibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy”,in MonoclonalAntibodies And Cancer Therapy,Reisfeld等(eds.),pp.243-56(Alan R.Liss,Inc.1985)；Hellstrom等,“Antibodies For Drug Delivery”,in Controlled DrugDelivery(2nd Ed.),Robinson等(eds.),pp.623-53(Marcel Dekker,Inc.1987)；Thorpe,“Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy:A Review”,inMonoclonal Antibodies’84:Biological And Clinical Applications,Pinchera等(eds.),pp.475-506(1985)；“Analysis,Results,And Future Prospective Of TheTherapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy”,in MonoclonalAntibodies For Cancer Detection And Therapy,Baldwin等(eds.),pp.303-16(Academic Press 1985)和Thorpe等,“The Preparation And Cytotoxic Properties OfAntibody-Toxin Conjugates”,Immunol.Rev.,62:119-58(1982)。
双特异性分子
本发明公开的主题提供包含本文公开的抗-Foxp3抗体或其抗原结合部分的双特异性分子。本发明公开主题的抗体或其抗原结合部分可以衍生化，或者与其它功能分子例如其它肽或蛋白质(例如其它抗体或受体配体)连接，以产生与至少两种不同的结合位点或靶标分子结合的双特异性分子。本发明公开主题的抗体实际上可以衍生化，或者与多于一种的其它功能分子连接，以产生与多于两种的不同结合位点和/或靶标分子结合的多特异性分子；本文使用的术语“双特异性分子”也意在包括这些多特异性分子。为了产生双特异性分子，可以将本发明公开的抗-Foxp3抗体或其抗原结合部分在功能上与一种或多种其它的结合分子例如其它抗体、抗体片段、肽或结合模拟物连接(例如通过化学联接、基因融合、非共价结合或其它方法)，使得产生双特异性分子。
本发明公开的主题提供双特异性分子，其包含至少一个对于第一靶标表位或抗原的第一结合特异性和对于第二靶标表位或抗原的第二结合特异性。第二靶标表位或抗原可以与第一表位或抗原不同。在某些实施方式中，双特异性分子具有多特异性，该分子可以进一步包含第三结合特异性。当双特异性抗体的第一部分与例如肿瘤细胞上的抗原结合，并且双特异性抗体的第二部分识别人免疫效应细胞表面上的抗原时，抗体能够通过与人免疫效应细胞上的效应抗原特异性结合来募集该效应细胞的活性。因此，在某些实施方式中，双特异性抗体能够在效应细胞例如T细胞和肿瘤细胞之间形成连接，从而提高效应子功能。
本发明公开主题的双特异性分子可以使用本领域已知的方法通过缀合组分结合特异性而制备。例如，可以单独产生双特异性分子的每种结合特异性，然后将它们相互缀合。当结合特异性是蛋白质或肽时，可使用多种偶联剂或交联剂用于共价缀合。交联剂的实例包括蛋白A、碳二亚胺、N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰基-硫代乙酸酯(SATA)、5,5’-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)、邻亚苯基二马来酰亚胺(oPDM)、N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、和硫代琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯(硫代-SMCC)(参见例如，Karpovsky等(1984)J.Exp.Med.160:1686；Liu,MA等(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:8648)。其它方法包括在Paulus(1985)BehringIns.Mitt.No.78,118-132；Brennan等(1985)Science 229:81-83)和Glennie等(1987)J.Immunol.139:2367-2375)中描述的那些。优选的缀合剂是SATA和硫代-SMCC，二者均可得自Pierce Chemical Co.(Rockford,IL)。
当结合特异性为抗体时，它们可以经由两个重链的C-末端铰链区的巯基键合来缀合。在一个非限制性实施方式中，铰链区修饰成在缀合之前含有奇数个巯基残基，优选一个巯基残基。
或者，两种结合特异性均可以在相同的载体中编码，并在相同的宿主细胞中表达和组装。当双特异性分子是mAb x mAb、mAb x Fab、Fab x F(ab’)2或配体x Fab融合蛋白时，该方法特别有用。
双特异性分子与其特异性靶标的结合可以通过以下方式确认：例如，酶联免疫吸附试验(ELISA)、放射性免疫试验(RIA)、FACS分析、生物检定(例如，生长抑制)或蛋白质印迹试验。这些试验各自通常通过使用对目标复合物有特异性的标记试剂(例如抗体)来检测具体目标蛋白质-抗体复合物的存在。另外可选地，复合物可以使用任意许多种其它的免疫试验来检测。例如，抗体可以进行放射性标记，并用于放射性免疫试验(RIA)(参见，例如，Weintraub,B.,Principles of Radioimmunoassays,Seventh Training Course onRadioligand Assay Techniques,The Endocrine Society,March,1986，将其并入本文以供参考)。可以通过如使用γ计数器或者闪烁计数器的手段或者通过放射自显影来检测放射性同位素。
在某些实施方式中，双特异性抗体既识别Foxp3/MHC复合物，也识别T细胞、NK细胞、NK T细胞、嗜中性粒细胞、单核细胞或巨噬细胞上的细胞表面蛋白。细胞表面蛋白的非限制性实例包括CD3和CD16。在某些实施方式中，双特异性抗体既识别Foxp3/MHC复合物，也识别免疫T细胞上的CD3，如(Yan等,J.Biol.Chem.2010；285:19637-19646；Rossi等,ProcNatl Aca Sci USA 2006；103:6841-6)所述，该双特异性抗体具有人IgG1 Fc。双特异性抗体招募细胞毒性T细胞并将其靶向至Foxp3/MHC阳性癌细胞，同时保持Fc效应子功能和体内的长半衰期。通过双特异性抗体特异性杀伤癌细胞涉及三种机制：i)通过激活的T细胞杀伤；ii)ADCC活性；iii)CDC活性。可以构建其它形式的双特异性抗体，例如串联scFv分子(taFv)、双抗体(Db)、或单链双抗体(scDb)、以及与人血清白蛋白的融合蛋白(Ryutaro等,JBiol Chem 2011；286:1812-1818；Anja等,Blood 2000；95(6):2098-2103；Weiner等,J.Immunology 1994；152(5):2385-2392；Dafne等,J Biol Chem 2007；282:12650-12660)，但缺少具有不同药代动力学图谱的Fc效应子功能。
改造和修饰的抗体
本发明公开主题的抗体能够进一步使用本文公开的具有一个或多个VH和/或VL序列的抗体或其抗原结合部分作为起始原料制备，以工程化设计修饰的抗体，该修饰的抗体可具有与起始抗体相比变化的特性。通过对一个或两个可变区(即，VH和/或VL)内、例如一个或多个CDR区内和/或一个或多个框架区内的一个或多个残基进行修饰，能够对抗体进行改造。另外或替代地，通过对恒定区内的残基进行修饰，可以对抗体进行改造，例如，改变抗体的效应子功能。
能够进行的一种类型的可变区改造是CDR嫁接(grafting)。抗体主要通过位于6个重链和轻链CDR中的氨基酸残基与靶标抗原相互作用。出于该原因，相比于CDR外部的序列，CDR内的氨基酸序列在单个抗体之间更为多样。由于CDR序列负责大多数抗体-抗原相互作用，通过构建包含嫁接在来自具有不同特性的不同抗体的框架序列上的来自特定天然存在抗体的CDR序列的表达载体，可以表达模拟特定天然存在抗体特性的重组抗体(参见，例如，Riechmann,L.等(1998)Nature 332:323-327；Jones,P.等(1986)Nature 321:522-525；Queen,C.等(1989)Proc.Natl.Acad.See.U.S.A.86:10029-10033；Winter的美国专利第5,225,539号；和Queen等的美国专利第5,530,101、5,585,089、5,693,762和6,180,370号)。
框架序列能够获自公开DNA数据库或包括种系抗体基因序列的出版文献。例如，人重链和轻链可变区基因的种系DNA序列可以见于IMGT人种系序列数据库(可获自互联网，http://www.imgt.org/)，以及以下文献：Kabat,E.A.,等(1991)Sequences of Proteinsof Immunological Interest,Fifth Edition,U.S.Department of Health and HumanServices,NIH Publication No.91-3242；Tomlinson,I.M.,等(1992)“The Repertoire ofHuman Germline VH Sequences Reveals about Fifty Groups of VH Segments withDifferent Hypervariable Loops”J.Mol.Biol.227:776-798；和Cox,J.P.L.等(1994)“ADirectory of Human Germ-line VH Segments Reveals a Strong Bias in theirUsage”Eur.J.Immunol.24:827-836；将其各自内容明确并入本文以供参考。作为另一实例，人重链和轻链可变区基因的种系DNA序列可以见于GenBank数据库。
能够将VH CDR1、CDR2和CDR3序列、以及VL CDR1、CDR2和CDR3序列嫁接到具有与框架序列所源自的种系免疫球蛋白基因中所见者相同的序列的框架区上，或者可以将CDR序列嫁接到与种系序列相比较含有一个或多个突变的框架区上。例如，已经发现，在某些情形中，对框架区内的残基进行突变是有益的，以维持或提高抗体的抗原结合能力(参见，例如，Queen等的美国专利第5,530,101、5,585,089、5,693,762和6,180,370号)。
另一类型的可变区修饰是对VH和/或VL CDR1、CDR2和/或CDR3区内的氨基酸残基进行突变，从而提高目标抗体的一种或多种结合特性(例如亲和力)。能够进行定点诱变或者PCR-介导的诱变以引入突变，并且对抗体结合或其它目标功能特性的影响可以在体外或体内试验中加以评价。优选地，引入保守修饰(如上文所讨论)。突变可以是氨基酸替换、添加或缺失。例如，可以对CDR区内的不超过一个、两个、三个、四个或五个残基进行变化。
因此，本发明公开的主题提供包含重链可变区的分离的抗-Foxp3单克隆抗体或其抗原结合部分，该抗体或其抗原结合部分包含：(a)本文所述抗体或其抗原结合部分(例如，scFv)(例如#9、#11、#17、#18、#20、#21、#26、#27、#28、#32、#53、#54、#6、#9、#12、#15、或#5)的VH CDR1序列，或者与本文所述的任一抗体或其抗原结合部分的VH CDR1序列相比较具有至少一个(例如，不超过一个、不超过两个、不超过三个、不超过四个或不超过五个)氨基酸修饰(例如，替换、缺失和/或添加)的氨基酸序列；(b)本文公开的任一抗体或其抗原结合部分的VH CDR2序列，或者与本文所述的任一抗体或其抗原结合部分的VH CDR2序列相比较具有至少一个(例如，不超过一个、不超过两个、不超过三个、不超过四个或不超过五个)氨基酸修饰(例如，替换、缺失和/或添加)的氨基酸序列；(c)本文公开的任一抗体或其抗原结合部分的VH CDR3序列，或者与本文所述的任一抗体或其抗原结合部分的VH CDR3序列相比较具有至少一个(例如，不超过一个、不超过两个、不超过三个、不超过四个或不超过五个)氨基酸修饰(例如，替换、缺失和/或添加)的氨基酸序列；(d)本文公开的任一抗体或其抗原结合部分的VL CDR1序列，或者与本文所述的任一抗体或其抗原结合部分的VL CDR1序列相比较具有至少一个(例如，不超过一个、不超过两个、不超过三个、不超过四个或不超过五个)氨基酸修饰(例如，替换、缺失和/或添加)的氨基酸序列；(e)本文公开的任一抗体或其抗原结合部分的VL CDR2序列，或者与本文所述的任一抗体或其抗原结合部分的VL CDR2序列相比较具有至少一个(例如，不超过一个、不超过两个、不超过三个、不超过四个或不超过五个)氨基酸修饰(例如，替换、缺失和/或添加)的氨基酸序列；和(f)本文公开的任一抗体或其抗原结合部分的VL CDR3序列，或者与本文所述的任一抗体或其抗原结合部分的VL CDR3序列相比较具有至少一个(例如，不超过一个、不超过两个、不超过三个、不超过四个或不超过五个)氨基酸修饰(例如，替换、缺失和/或添加)的氨基酸序列。
例如，本发明公开的主题提供包含重链可变区的分离的抗-Foxp3单克隆抗体或其抗原结合部分，该抗体或其抗原结合部分包含：(a)包含SEQ ID NO:9、15、21、27、33、39、45、51、57、63、69、75、81、或87所示的氨基酸序列、或者与SEQ ID NO:9、15、21、27、33、39、45、51、57、63、69、75、81、或87相比具有至少一个(例如，不超过一个、不超过两个、不超过三个、不超过四个或不超过五个)氨基酸修饰(例如取代、缺失和/或添加)的氨基酸序列的VHCDR1区；(b)包含SEQ ID NO:10、16、22、28、34、40、46、52、58、64、70、76、82、或88所示的氨基酸序列、或者与SEQ ID NO:10、16、22、28、34、40、46、52、58、64、70、76、82、或88相比具有至少一个(例如，不超过一个、不超过两个、不超过三个、不超过四个或不超过五个)氨基酸修饰(例如取代、缺失和/或添加)的氨基酸序列的VH CDR2区；(c)包含SEQ ID NO:11、17、23、29、35、41、47、53、59、65、71、77、83、或89所示的氨基酸序列、或者与SEQ ID NO:11、17、23、29、35、41、47、53、59、65、71、77、83、或89相比具有至少一个(例如，不超过一个、不超过两个、不超过三个、不超过四个或不超过五个)氨基酸修饰(例如取代、缺失和/或添加)的氨基酸序列的VH CDR3区；(d)包含SEQ ID NO:12、18、24、30、36、40、42、48、54、60、66、72、78、84、或90所示的氨基酸序列、或者与SEQ ID NO:12、18、24、30、36、40、42、48、54、60、66、72、78、84、或90相比具有至少一个(例如，不超过一个、不超过两个、不超过三个、不超过四个或不超过五个)氨基酸修饰(例如取代、缺失和/或添加)的氨基酸序列的VL CDR1区；(e)包含SEQID NO:13、19、25、31、37、43、49、55、61、67、73、79、85、或91所示的氨基酸序列、或者与SEQID NO:13、19、25、31、37、43、49、55、61、67、73、79、85、或91相比具有至少一个(例如，不超过一个、不超过两个、不超过三个、不超过四个或不超过五个)氨基酸修饰(例如取代、缺失和/或添加)的氨基酸序列的VL CDR2区，以及(f)包含SEQ ID NO:14、20、26、32、38、44、50、56、62、68、74、80、86、或92所示的氨基酸序列、或者与SEQ ID NO:14、20、26、32、38、44、50、56、62、68、74、80、86、或92相比具有至少一个(例如，不超过一个、不超过两个、不超过三个、不超过四个或不超过五个)氨基酸修饰(例如取代、缺失和/或添加)的氨基酸序列的VL CDR3区。
本发明公开主题的改造抗体包括对VH和/或VK内的框架残基进行修饰例如以改善抗体特性的抗体。通常进行这些框架修饰，以降低抗体的免疫原性。例如，一种方法是将一个或多个框架残基“返突变(backmutate)”成相应的种系序列。更具体地，已经历体细胞突变的抗体可含有与抗体源自的种系序列不同的框架残基。这些残基可以通过将抗体框架序列与该抗体源自的种系序列进行比较加以鉴别。
另一类型的框架修饰涉及对框架区内、或甚至一个或多个CDR区内的一个或多个残基进行突变，以除去T细胞表位，从而降低抗体潜在的免疫原性。该方法也称作“去免疫化(deimmunization)”，由Carr等在美国专利公开第20030153043号中进一步详述。
除了在框架或CDR区内进行修饰或替代地，本发明公开主题的抗-Foxp3抗体或其抗原结合部分可以改造成包括Fc区内的修饰，通常改变抗体的一个或多个功能特性，例如血清半衰期、补体结合、Fc受体结合、和/或抗原依赖性细胞毒作用。而且，本发明公开的抗-Foxp3抗体可在化学上进行修饰(例如，可以将一个或多个化学部分连接在抗体上)，或者进行修饰以改变其糖基化，再次改变抗体的一个或多个功能特性。CH1的铰链区可以进行修饰使得改变例如增加或减少铰链区中半胱氨酸残基的数目。该方法进一步描述于Bodmer等的美国专利第5,677,425号中。改变CH1铰链区中半胱氨酸残基的数目从而，例如，有利于轻链和重链的组装，或者增加或降低抗体的稳定性。抗体的Fc铰链区可进行突变，以降低抗体的生物学半衰期。更具体地，将一个或多个氨基酸突变引入到Fc-铰链片段的CH2-CH3结构域界面区内，使得抗体相对于天然Fc-铰链结构域SpA结合具有受损的葡萄球菌蛋白质A(SpA)结合。该方法由Ward等在美国专利第6,165,745号中进一步详述。抗体可以进行修饰以增加其生物学半衰期，例如，抗体可在CH1或CL区内进行变化，以含有取自IgG Fc区CH2结构域的两个回环的补救受体结合表位，如Presta等在美国专利第5,869,046和6,121,022号中所述。而且，可以通过将至少一个氨基酸残基用不同的氨基酸残基取代对Fc区进行变化，以改变抗体的效应子功能。可以对Fc区进行修饰，以增加抗体介导抗体依赖性细胞毒作用(ADCC)的能力和/或增加抗体对Fcγ受体的亲和力，例如，如Presta在WO 00/42072中所述。在某些实施方式中，本发明公开的抗-Foxp3抗体包含无岩藻糖基化的Fc区。从免疫球蛋白G(IgG)Fc部分的N-多糖除去岩藻糖残基可以通过对Fcγ受体IIIa(FcγRIIIa)亲和力的提高而大大提高ADCC。
另外或替代地，可以对抗体的糖基化进行修饰。例如，可以产生非糖基化(aglycoslated)抗体(即，抗体缺少糖基化)。糖基化可以加以变化，例如，以增加抗体对抗原的亲和力，参见，例如，美国专利第5,714,350和6,350,861号。这些碳水化合物修饰可以通过例如改变抗体序列内的一个或多个糖基化位点完成。例如，可以进行导致一个或多个可变区框架糖基化位点消除的一个或多个氨基酸替换，从而消除该位点处的糖基化。
另外或替代地，可以产生糖基化类型改变的抗体，例如岩藻糖基残基量降低的岩藻糖基不足(hypofucosylated)的抗体或者平分型GlcNac结构增加的抗体。这些改变的糖基化方式已经表现出增加了抗体的ADCC能力。这些碳水化合物修饰可以通过例如在糖基化机制改变的宿主细胞内表达抗体来实现。
抗体的另一修饰可以是聚乙二醇化。抗体可以进行聚乙二醇化，例如，增加抗体的生物(例如血清)半衰期。为对抗体进行聚乙二醇化，通常使抗体或其片段与聚乙二醇(PEG)例如PEG的反应性酯或醛衍生物在一个或多个PEG基团开始连接到抗体或抗体片段的条件下反应。聚乙二醇化可以经由与反应性PEG分子(或类似的反应性水溶性聚合物)的酰基化反应或烷基化反应进行。本文使用的术语“聚乙二醇”是要包括任何形式的已经用于对其它蛋白质进行衍生化的PEG，例如，单(C1-C10)烷氧基-或芳氧基-聚乙二醇或聚乙二醇马来酰亚胺。要聚乙二醇化的抗体可以是非糖基化的抗体。对蛋白质进行聚乙二醇化的方法是本领域已知的，并且可以应用于本文公开的抗体，参见，例如，EP 0 154 316和EP 0 401 384。
三.制备方法
1.鉴定与MHC分子具有高度预测结合的肽
本发明公开的主题提供一种产生与MHC-限制性肽特异性结合的抗体的方法，限制性肽在作为肽/MHC复合物的一部分递呈时，能够引起特异性细胞毒性T-细胞应答。HLA I类分子表示针对CD8+细胞毒性T淋巴细胞上的长度大约8-12个氨基酸的内源性衍生肽。本发明所公开方法中使用的肽通常长度为大约6-22个氨基酸，并且在一些实施方式中，为大约9-20个氨基酸(更具体地，8-12个氨基酸，例如9个氨基酸或10个氨基酸)，并且包含源自目标蛋白例如具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的人Foxp3蛋白(Genbank登录No.ABQ15210.1，提供如下)或其类似物的氨基酸序列。
适合用于根据本发明公开的方法产生抗体的肽可以使用本领域技术人员已知的计算机预测模型基于MHC分子(例如，HLA分子，更具体地，HLA I类分子，更具体地，HLA-A，更具体地，HLA-A2，更具体地HLA-A*02:01)结合基序以及蛋白酶体和免疫-蛋白酶体切割位点的存在而确定。对于MHC I类结合位点的预测，这些模型包括，但不限于，ProPred1(在Singh和Raghava,Bioinformatics 17(12):1236-12372001中更加详细地说明)，SYFPEITHI(参见Schuler等人Immunoinformatics Methods in Molecular Biology,vol 409(1):75-932007)，Net MHC(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHC/)，和BIMAS(http://www-bimas.cit.nih.gov/cgi-bin/molbio/ken_parker_comboform)。
HLA-A*02:01在所有高加索人的39-46％中表达，因此代表用于本方法的MHC抗原的合适选项。为了鉴定Foxp3肽抗原的一个实施方式，使用SYFPEITHI数据库的预测算法(http://www.syfpeithi.de/；参见Schuler(2007))鉴定氨基酸序列和预测的推定Foxp3表位与HLA-A*02:01分子的结合。为了鉴定Foxp3肽抗原的一个实施方式，使用BIMAS的预测算法(http://www-bimas.cit.nih.gov/cgi-bin/molbio/ken_parker_comboform)鉴定氨基酸序列和预测的推定Foxp3表位与HLA-A*02:01分子的结合。为了鉴定Foxp3肽抗原的一个实施方式，使用RANKPEP的预测算法(http://bio.dfci.harvard.edu/Tools/rankpep.html)鉴定氨基酸序列和预测的推定Foxp3表位与HLA-A*02:01分子的结合。
一旦鉴定出适当的肽，肽的合成可以根据本领域普通技术人员公知的方案进行。由于其大小相对较小，本发明公开主题的肽可以根据常规的肽合成技术直接在溶液中或者在固体载体上合成。各种自动合成仪是市售的，可以根据已知的方案使用。溶液相中的肽合成对于合成肽的大规模制造来说已经成为成熟的方法，因此是制备本发明的肽的另外可选的适当方法(参见，例如，Stewart等人,Tetrahedron Letters Vol.39,第1517-1520页1998)。
本文所述方案中使用的各个肽通过Genemed Synthesis,Inc.(San Antonio,TX)购买并合成。肽的质量通过高效液相色谱分析来评价，使用基质辅助激光解吸质谱观察到预计的分子量。肽是无菌的，并且80％至>90％纯。将肽溶解在DMSO中，并在盐水中以5mg/mL稀释，并在-80℃下保存。
继肽选择之后，使用抗原-加工-缺陷型T2细胞系测试所选择肽的结合活性，上述细胞系在通过抗原递呈沟中的肽稳定化时增加HLA-A的表达。简言之，将T2细胞用肽脉冲持续足以诱导HLA-A表达的时间。然后通过用对HLA-A具有特异性的荧光标记单克隆抗体(例如，BB7.2)免疫染色和流式细胞术对T2细胞的HLA-A表达进行测量。荧光指数(FI)计算为通过荧光-激活细胞分选分析所测定的T2细胞上HLA-A*02:01的平均荧光强度(MFI)，其使用以下公式：FI＝(MFI[具有肽的T2细胞]/MFI[没有肽的T2细胞]-1。
使用本文公开的方法产生Foxp3的全人T-细胞受体(TCR)样抗体。通过噬菌体展示技术产生的TCR样抗-Foxp3抗体对Foxp3肽/HLA复合物具有特异性，其类似于诱导HLA-限制性的细胞毒性CD8 T-细胞。
一旦已经鉴定出合适的肽，则通过在溶液中将肽与组织相容性抗原放在一起形成复合物，制备要用于噬菌体展示文库筛选的靶标抗原，即肽/MHC复合物(例如，Foxp3/HLA复合物，例如，Foxp3肽/HLA-A*02:01)。
2.选择针对Foxp3肽的高亲和力scFv
下一步是从人噬菌体展示文库中不结合或者以较低亲和力结合的噬菌体中选出以高亲和力与感兴趣的靶标抗原结合的噬菌体。通过噬菌体与结合在固体载体例如小珠或哺乳动物细胞上的抗原的反复结合，然后除去未结合的噬菌体，并进行特异性结合噬菌体的洗脱，从而实现这一点。在某些实施方式中，首先对抗原进行生物素化，用于固定化在例如链霉亲和素-缀合的Dynabeads M-280上。将噬菌体文库与细胞、小珠或其它固体载体一起孵育，通过洗涤除去未结合的噬菌体。选择结合的克隆，并进行测试。
一经选择，通过间接流式细胞术测试阳性scFv克隆与活T2细胞表面上的HLA-A2/肽复合物的结合。简言之，将噬菌体克隆与已经用Foxp3肽或者无关的肽(对照)脉冲的T2细胞一起孵育。将细胞洗涤，然后用小鼠抗-M13外壳蛋白mAb洗涤。在流式细胞术之前，将细胞再次洗涤，并用FITC-山羊(Fab)2抗-小鼠Ig标记。
在其它实施方式中，抗-Foxp3抗体可以包含一个或多个设计成提高蛋白质稳定性、抗体结合、表达水平或者引入治疗剂缀合位点的框架区氨基酸替换。然后根据本领域技术人员已知的方法将这些scFv用于产生重组人单克隆Ig。
另外包括降低白血病细胞增殖的方法，其包括使白血病细胞与本发明公开的Foxp3抗体接触。在相关方面，本发明公开的抗体可以用于预防或治疗白血病。治疗性抗体的给药是本领域已知的。
四.嵌合抗原受体
嵌合抗原受体(CAR)是改造的受体，其将所关注的特异性嫁接或赋予到免疫效应细胞上。CAR可以用于将单克隆细胞的特异性嫁接到T细胞上；通过逆转录病毒载体促进其编码序列的转移。
存在有三代CAR。“第一代”CAR通常由细胞外抗原结合结构域(例如scFv)与跨膜结构域融合，再与T细胞受体链的胞质/细胞内结构域融合而组成。“第一代”CAR通常具有来自CD3ζ链的细胞内结构域，其是来自内源性TCR信号传导的主要传递者。“第一代”CAR可以提供从头的抗原识别并且通过其在单个融合分子中的CD3ζ链信号传导结构域激活CD4+和CD8+T细胞，而不依赖HLA介导的抗原递呈。“第二代”CAR将来自各种共刺激分子(例如CD28、4-1BB、ICOS、OX40)的细胞内结构域添加到CAR的胞质尾部，以向T细胞提供额外的信号。“第二代”CAR包括既提供共刺激(例如CD28或4-1BB)又提供激活(CD3ζ)的那些CAR。临床前研究表明，“第二代”CAR可以提高T细胞的抗肿瘤活性。例如，在慢性淋巴细胞白血病(CLL)和急性淋巴细胞白血病(ALL)患者中，靶向CD19分子的临床试验证实了“第二代”CAR修饰的T细胞的强烈功效。“第三代”CAR包括提供多种共刺激(例如CD28和4-1BB)和激活(CD3ζ)的那些CAR。
根据本发明公开的主题，CAR包含细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内结构域，其中细胞外抗原结合结构域与结合于MHC分子(例如，HLA分子，更具体地，HLA I类分子)的Foxp3肽结合。在某些实施方式中，细胞外抗原结构域是scFv。在某些实施方式中，scFv是人scFv。scFv的非限制性实例包括EXT017-5、EXT017-9、EXT017-10、EXT017-11、EXT017-17、EXT017-18、EXT017-20、EXT017-21、EXT017-23、EXT017-24、EXT017-25、EXT017-26、EXT017-27、EXT017-28、EXT017-29、EXT017-30、EXT017-32、EXT017-34、EXT017-53、EXT017-54、EXT017-55EXT019-6、EXT019-12、EXT019-9、EXT019-15、EXT019-20、EXT019-4、EXT019-13、EXT019-8、EXT018-5、EXT018-2、和EXT018-4。
在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域是Fab，其任选地是交联的。在某些实施方式中，细胞外结合结构域是F(ab)2。在某些实施方式中，任意前述分子可以包括在具有异源性序列的融合蛋白中，以形成细胞外抗原结合结构域。
在某些非限制性实施方式中，本发明公开的CAR的细胞外抗原结合结构域能够包括将细胞外抗原结合结构域的重链可变区和轻链可变区连接的接头。本文使用的术语“接头(linker)”是指将两个或多个多肽或核酸共价结合使得其彼此连接的官能团(例如，化学基团或多肽)。如本文所用，“肽接头”是指用于将两个蛋白质偶联在一起(例如，将VH和VL结构域偶联)的一个或多个氨基酸。在某些实施方式中，接头包含具有下文提供的SEQ ID NO：135所示序列的氨基酸。在某些实施方式中，编码氨基酸序列SEQ ID NO：135的核苷酸序列如下文提供的SEQ ID NO：136所示。
在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域是scFv，其包含：包含SEQ ID NO：93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、或119所示的氨基酸序列、或者与SEQID NO：93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、或119至少80％同源的氨基酸序列的VH，和包含SEQ ID NO：94、96、98、100、102、104、106和108、110、112、114、116、118、或120所示的氨基酸序列、或者与SEQ ID NO：94、96、98、100、102、104、106和108、110、112、114、116、118、或120至少80％同源的氨基酸序列的VL，以及任选地包含SEQ ID NO：135所示氨基酸序列的接头。
在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域是scFv，其包含(a)包含SEQ ID NO：9、15、21、27、33、39、45、51、57、63、69、75、81、或87所示的氨基酸序列、或者与SEQ ID NO：9、15、21、27、33、39、45、51、57、63、69、75、81、或87相比具有至少一个(例如，不超过一个、不超过两个、不超过三个、不超过四个或不超过五个)氨基酸修饰(例如取代、缺失和/或添加)的氨基酸序列的VH CDR1区；(b)包含SEQ ID NO:10、16、22、28、34、40、46、52、58、64、70、76、82、或88所示的氨基酸序列、或者与SEQ ID NO:10、16、22、28、34、40、46、52、58、64、70、76、82、或88相比具有至少一个(例如，不超过一个、不超过两个、不超过三个、不超过四个或不超过五个)氨基酸修饰(例如取代、缺失和/或添加)的氨基酸序列的VH CDR2区；(c)包含SEQID NO:11、17、23、29、35、41、47、53、59、65、71、77、83、或89所示的氨基酸序列、或者与SEQID NO:11、17、23、29、35、41、47、53、59、65、71、77、83、或89相比具有至少一个(例如，不超过一个、不超过两个、不超过三个、不超过四个或不超过五个)氨基酸修饰(例如取代、缺失和/或添加)的氨基酸序列的VH CDR3区；(d)包含SEQ ID NO:12、18、24、30、36、40、42、48、54、60、66、72、78、84、或90所示的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:12、18、24、30、36、40、42、48、54、60、66、72、78、84、或90相比具有至少一个(例如，不超过一个、不超过两个、不超过三个、不超过四个或不超过五个)氨基酸修饰(例如取代、缺失和/或添加)的氨基酸序列的VL CDR1区；(e)包含SEQ ID NO:13、19、25、31、37、43、49、55、61、67、73、79、85、或91所示的氨基酸序列、或者与SEQ ID NO:13、19、25、31、37、43、49、55、61、67、73、79、85、或91相比具有至少一个(例如，不超过一个、不超过两个、不超过三个、不超过四个或不超过五个)氨基酸修饰(例如取代、缺失和/或添加)的氨基酸序列的VL CDR2区；和(f)包含SEQ ID NO:14、20、26、32、38、44、50、56、62、68、74、80、86、或92所示的氨基酸序列、或者与SEQ ID NO:14、20、26、32、38、44、50、56、62、68、74、80、86、或92相比具有至少一个(例如，不超过一个、不超过两个、不超过三个、不超过四个或不超过五个)氨基酸修饰(例如取代、缺失和/或添加)的氨基酸序列的VL CDR3区，以及任选地包含SEQ ID NO:135所示氨基酸序列的接头。在某些实施方式中，scFv还包含His-标签和HA-标签。在某些实施方式中，His-标签和HA-标签的氨基酸序列包含SEQ ID NO:141的氨基酸序列，提供如下。编码SEQ ID NO:141的核苷酸序列是SEQ IDNO:142。
在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域是包含选自SEQ ID NO:121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、和134的氨基酸序列的scFv。
在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域是scFv，其包含：包含SEQ ID NO:93所示氨基酸序列或与SEQ ID NO:93至少80％同源的氨基酸序列的VH，包含SEQ ID NO:94所示氨基酸序列或与SEQ ID NO:94至少80％同源的氨基酸序列的VL，包含SEQ ID NO:135所示氨基酸序列的接头，以及包含SEQ ID NO:141所示氨基酸序列的His-标签和HA-标签。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域是scFv，其包含：包含SEQ ID NO:9所示氨基酸序列的重链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:10所示氨基酸序列的重链可变区CDR2；包含SEQ IDNO:11所示氨基酸序列的重链可变区CDR3；包含SEQ ID NO:12所示氨基酸序列的轻链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:13所示氨基酸序列的轻链可变区CDR2；和包含SEQ ID NO:14所示氨基酸序列的轻链可变区CDR3，包含SEQ ID NO:135所示氨基酸序列的接头，以及包含SEQID NO:141所示氨基酸序列的His-标签和HA-标签。在某些实施方式中，scFv包含SEQ IDNO:121所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域是scFv，其包含：包含SEQ ID NO:95所示氨基酸序列或与SEQ ID NO:95至少80％同源的氨基酸序列的VH，包含SEQ ID NO:96所示氨基酸序列或与SEQ ID NO:96至少80％同源的氨基酸序列的VL，包含SEQ ID NO:135所示氨基酸序列的接头，以及包含SEQ ID NO:141所示氨基酸序列的His-标签和HA-标签。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域是scFv，其包含：包含SEQ ID NO:15所示氨基酸序列的重链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:16所示氨基酸序列的重链可变区CDR2；包含SEQ IDNO:17所示氨基酸序列的重链可变区CDR3；包含SEQ ID NO:18所示氨基酸序列的轻链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:19所示氨基酸序列的轻链可变区CDR2；和包含SEQ ID NO:20所示氨基酸序列的轻链可变区CDR3，包含SEQ ID NO:135所示氨基酸序列的接头，以及包含SEQID NO:141所示氨基酸序列的His-标签和HA-标签。在某些实施方式中，scFv包含SEQ IDNO:122所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域是scFv，其包含：包含SEQ ID NO:97所示氨基酸序列或与SEQ ID NO:97至少约80％同源的氨基酸序列的VH，包含SEQ ID NO:98所示氨基酸序列或与SEQ ID NO:98至少约80％同源的氨基酸序列的VL，包含SEQ ID NO:135所示氨基酸序列的接头，以及包含SEQ ID NO:141所示氨基酸序列的His-标签和HA-标签。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域是scFv，其包含：包含SEQ ID NO:21所示氨基酸序列的重链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:22所示氨基酸序列的重链可变区CDR2；包含SEQID NO:23所示氨基酸序列的重链可变区CDR3；包含SEQ ID NO:24所示氨基酸序列的轻链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:25所示氨基酸序列的轻链可变区CDR2；和包含SEQ ID NO:26所示氨基酸序列的轻链可变区CDR3，包含SEQ ID NO:135所示氨基酸序列的接头，以及包含SEQ ID NO:141所示氨基酸序列的His-标签和HA-标签。在某些实施方式中，scFv包含SEQID NO:123所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域是scFv，其包含：包含SEQ ID NO:99所示氨基酸序列、或与SEQ ID NO:99至少约80％同源的氨基酸序列的VH，包含SEQ ID NO:100所示氨基酸序列、或与SEQ ID NO:100至少约80％同源的氨基酸序列的VL，包含SEQ ID NO:135所示氨基酸序列的接头，以及包含SEQ ID NO:141所示氨基酸序列的His-标签和HA-标签。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域是scFv，其包含：包含SEQ ID NO:27所示氨基酸序列的重链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:28所示氨基酸序列的重链可变区CDR2；包含SEQ ID NO:29所示氨基酸序列的重链可变区CDR3；包含SEQ ID NO:30所示氨基酸序列的轻链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:31所示氨基酸序列的轻链可变区CDR2；和包含SEQ ID NO:32所示氨基酸序列的轻链可变区CDR3，包含SEQ ID NO:135所示氨基酸序列的接头，以及包含SEQ ID NO:141所示氨基酸序列的His-标签和HA-标签。在某些实施方式中，scFv包含SEQID NO:124所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域是scFv，其包含：包含SEQ ID NO:101所示氨基酸序列、或与SEQ ID NO:101至少约80％同源的氨基酸序列的VH，包含SEQ ID NO:102所示氨基酸序列、或与SEQ ID NO:102至少约80％同源的氨基酸序列的VL，包含SEQ IDNO:135所示氨基酸序列的接头，以及包含SEQ ID NO:141所示氨基酸序列的His-标签和HA-标签。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域是scFv，其包含：包含SEQ ID NO:33所示氨基酸序列的重链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:34所示氨基酸序列的重链可变区CDR2；包含SEQ ID NO:35所示氨基酸序列的重链可变区CDR3；包含SEQ ID NO:36所示氨基酸序列的轻链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:37所示氨基酸序列的轻链可变区CDR2；和包含SEQ IDNO:38所示氨基酸序列的轻链可变区CDR3，包含SEQ ID NO:135所示氨基酸序列的接头，以及包含SEQ ID NO:141所示氨基酸序列的His-标签和HA-标签。在某些实施方式中，scFv包含SEQ ID NO:125所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域是scFv，其包含：包含SEQ ID NO:103所示氨基酸序列、或与SEQ ID NO:103至少约80％同源的氨基酸序列的VH，包含SEQ ID NO:104所示氨基酸序列、或与SEQ ID NO:104至少约80％同源的氨基酸序列的VL，包含SEQ IDNO:135所示氨基酸序列的接头，以及包含SEQ ID NO:141所示氨基酸序列的His-标签和HA-标签。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域是scFv，其包含：包含SEQ ID NO:39所示氨基酸序列的重链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:40所示氨基酸序列的重链可变区CDR2；包含SEQ ID NO:41所示氨基酸序列的重链可变区CDR3；包含SEQ ID NO:42所示氨基酸序列的轻链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:43所示氨基酸序列的轻链可变区CDR2；和包含SEQ IDNO:44所示氨基酸序列的轻链可变区CDR3，包含SEQ ID NO:135所示氨基酸序列的接头，以及包含SEQ ID NO:141所示氨基酸序列的His-标签和HA-标签。在某些实施方式中，scFv包含SEQ ID NO:126所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域是scFv，其包含：包含SEQ ID NO:105所示氨基酸序列、或与SEQ ID NO:105至少约80％同源的氨基酸序列的VH，包含SEQ ID NO:106所示氨基酸序列、或与SEQ ID NO:106至少约80％同源的氨基酸序列的VL，包含SEQ IDNO:135所示氨基酸序列的接头，以及包含SEQ ID NO:141所示氨基酸序列的His-标签和HA-标签。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域是scFv，其包含：包含SEQ ID NO:45所示氨基酸序列的重链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:46所示氨基酸序列的重链可变区CDR2；包含SEQ ID NO:47所示氨基酸序列的重链可变区CDR3；包含SEQ ID NO:48所示氨基酸序列的轻链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:49所示氨基酸序列的轻链可变区CDR2；和包含SEQ IDNO:50所示氨基酸序列的轻链可变区CDR3，包含SEQ ID NO:135所示氨基酸序列的接头，以及包含SEQ ID NO:141所示氨基酸序列的His-标签和HA-标签。在某些实施方式中，scFv包含SEQ ID NO:127所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域是scFv，其包含：包含SEQ ID NO:107所示氨基酸序列、或与SEQ ID NO:107至少约80％同源的氨基酸序列的VH，包含SEQ ID NO:108所示氨基酸序列、或与SEQ ID NO:108至少80％同源的氨基酸序列的VL，包含SEQ IDNO:135所示氨基酸序列的接头，以及包含SEQ ID NO:141所示氨基酸序列的His-标签和HA-标签。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域是scFv，其包含：包含SEQ ID NO:51所示氨基酸序列的重链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:52所示氨基酸序列的重链可变区CDR2；包含SEQ ID NO:53所示氨基酸序列的重链可变区CDR3；包含SEQ ID NO:54所示氨基酸序列的轻链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:55所示氨基酸序列的轻链可变区CDR2；和包含SEQ IDNO:56所示氨基酸序列的轻链可变区CDR3，包含SEQ ID NO:135所示氨基酸序列的接头，以及包含SEQ ID NO:141所示氨基酸序列的His-标签和HA-标签。在某些实施方式中，scFv包含SEQ ID NO:128所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域是scFv，其包含：包含SEQ ID NO:109所示氨基酸序列、或与SEQ ID NO:109至少约80％同源的氨基酸序列的VH，包含SEQ ID NO:110所示氨基酸序列、或与SEQ ID NO:110至少约80％同源的氨基酸序列的VL，包含SEQ IDNO:135所示氨基酸序列的接头，以及包含SEQ ID NO:141所示氨基酸序列的His-标签和HA-标签。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域是scFv，其包含：包含SEQ ID NO:57所示氨基酸序列的重链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:58所示氨基酸序列的重链可变区CDR2；包含SEQ ID NO:59所示氨基酸序列的重链可变区CDR3；包含SEQ ID NO:60所示氨基酸序列的轻链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:61所示氨基酸序列的轻链可变区CDR2；和包含SEQ IDNO:62所示氨基酸序列的轻链可变区CDR3，包含SEQ ID NO:135所示氨基酸序列的接头，以及包含SEQ ID NO:141所示氨基酸序列的His-标签和HA-标签。在某些实施方式中，scFv包含SEQ ID NO:129所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域是scFv，其包含：包含SEQ ID NO:111所示氨基酸序列、或与SEQ ID NO:111至少约80％同源的氨基酸序列的VH，包含SEQ ID NO:112所示氨基酸序列、或与SEQ ID NO:112至少约80％同源的氨基酸序列的VL，包含SEQ IDNO:135所示氨基酸序列的接头，以及包含SEQ ID NO:141所示氨基酸序列的His-标签和HA-标签。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域是scFv，其包含：包含SEQ ID NO:63所示氨基酸序列的重链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:64所示氨基酸序列的重链可变区CDR2；包含SEQ ID NO:65所示氨基酸序列的重链可变区CDR3；包含SEQ ID NO:66所示氨基酸序列的轻链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:67所示氨基酸序列的轻链可变区CDR2；和包含SEQ IDNO:68所示氨基酸序列的轻链可变区CDR3，包含SEQ ID NO:135所示氨基酸序列的接头，以及包含SEQ ID NO:141所示氨基酸序列的His-标签和HA-标签。在某些实施方式中，scFv包含SEQ ID NO:130所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域是scFv，其包含：包含SEQ ID NO:113所示氨基酸序列、或与SEQ ID NO:113至少约80％同源的氨基酸序列的VH，包含SEQ ID NO:114所示氨基酸序列、或与SEQ ID NO:114至少约80％同源的氨基酸序列的VL，包含SEQ IDNO:135所示氨基酸序列的接头，以及包含SEQ ID NO:141所示氨基酸序列的His-标签和HA-标签。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域是scFv，其包含：包含SEQ ID NO:69所示氨基酸序列的重链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:70所示氨基酸序列的重链可变区CDR2；包含SEQ ID NO:71所示氨基酸序列的重链可变区CDR3；包含SEQ ID NO:72所示氨基酸序列的轻链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:73所示氨基酸序列的轻链可变区CDR2；和包含SEQ IDNO:74所示氨基酸序列的轻链可变区CDR3，包含SEQ ID NO:135所示氨基酸序列的接头，以及包含SEQ ID NO:141所示氨基酸序列的His-标签和HA-标签。在某些实施方式中，scFv包含SEQ ID NO:131所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域是scFv，其包含：包含SEQ ID NO:115所示氨基酸序列、或与SEQ ID NO:115至少约80％同源的氨基酸序列的VH，包含SEQ ID NO:116所示氨基酸序列、或与SEQ ID NO:116至少约80％同源的氨基酸序列的VL，包含SEQ IDNO:135所示氨基酸序列的接头，以及包含SEQ ID NO:141所示氨基酸序列的His-标签和HA-标签。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域是scFv，其包含：包含SEQ ID NO:75所示氨基酸序列的重链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:76所示氨基酸序列的重链可变区CDR2；包含SEQ ID NO:77所示氨基酸序列的重链可变区CDR3；包含SEQ ID NO:78所示氨基酸序列的轻链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:79所示氨基酸序列的轻链可变区CDR2；和包含SEQ IDNO:80所示氨基酸序列的轻链可变区CDR3，包含SEQ ID NO:135所示氨基酸序列的接头，以及包含SEQ ID NO:141所示氨基酸序列的His-标签和HA-标签。在某些实施方式中，scFv包含SEQ ID NO:132所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域是scFv，其包含：包含SEQ ID NO:117所示氨基酸序列、或与SEQ ID NO:117至少约80％同源的氨基酸序列的VH，包含SEQ ID NO:118所示氨基酸序列、或与SEQ ID NO:118至少约80％同源的氨基酸序列的VL，包含SEQ IDNO:135所示氨基酸序列的接头，以及包含SEQ ID NO:141所示氨基酸序列的His-标签和HA-标签。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域是scFv，其包含：包含SEQ ID NO:81所示氨基酸序列的重链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:82所示氨基酸序列的重链可变区CDR2；包含SEQ ID NO:83所示氨基酸序列的重链可变区CDR3；包含SEQ ID NO:84所示氨基酸序列的轻链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:85所示氨基酸序列的轻链可变区CDR2；和包含SEQ IDNO:86所示氨基酸序列的轻链可变区CDR3，包含SEQ ID NO:135所示氨基酸序列的接头，以及包含SEQ ID NO:141所示氨基酸序列的His-标签和HA-标签。在某些实施方式中，scFv包含SEQ ID NO:133所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域是scFv，其包含：包含SEQ ID NO:119所示氨基酸序列、或与SEQ ID NO:119至少约80％同源的氨基酸序列的VH，包含SEQ ID NO:120所示氨基酸序列、或与SEQ ID NO:120至少约80％同源的氨基酸序列的VL，包含SEQ IDNO:135所示氨基酸序列的接头，以及包含SEQ ID NO:141所示氨基酸序列的His-标签和HA-标签。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域是scFv，其包含：包含SEQ ID NO:87所示氨基酸序列的重链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:88所示氨基酸序列的重链可变区CDR2；包含SEQ ID NO:89所示氨基酸序列的重链可变区CDR3；包含SEQ ID NO:90所示氨基酸序列的轻链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:91所示氨基酸序列的轻链可变区CDR2；和包含SEQ IDNO:92所示氨基酸序列的轻链可变区CDR3，包含SEQ ID NO:135所示氨基酸序列的接头，以及包含SEQ ID NO:141所示氨基酸序列的His-标签和HA-标签。在某些实施方式中，scFv包含SEQ ID NO:134所示的氨基酸序列。
此外，细胞外抗原结合结构域能够包含将初生蛋白质引导至内质网中的先导序列或信号肽。如果CAR要糖基化并锚定在细胞膜中，信号肽或先导序列可以是必要的。信号序列或先导序列可以是新合成的蛋白质的N-末端处存在的引导其进入分泌通路的肽序列(长度大约5、大约10、大约15、大约20、大约25或大约30个氨基酸)。在非限制性实例中，信号肽与细胞外抗原结合结构域的5'末端共价连接。
在某些非限制性实施方式中，CAR的跨膜结构域包含跨越至少一部分膜的疏水性α螺旋。不同的跨膜结构域产生不同的受体稳定性。在抗原识别之后，受体聚簇，并将信号传递至细胞。根据本发明公开的主题，CAR的跨膜结构域能够包括CD8多肽、CD28多肽、CD3ζ多肽、CD4多肽、4-1BB多肽、OX40多肽、ICOS多肽、CTLA-4多肽、PD-1多肽、LAG-3多肽、2B4多肽、BTLA多肽、合成多肽(不基于与免疫应答相关的蛋白质)、或其组合。
在某些实施方式中，本发明公开的CAR的跨膜结构域包含CD28多肽。在某些实施方式中，本发明公开的CAR的跨膜结构域包含CD8多肽。
在某些非限制性实施方式中，CAR的细胞内结构域可包含能激活或刺激细胞(例如，淋巴谱系的细胞，例如T细胞)的CD3ζ多肽。CD3ζ包含3个ITAM，并且在结合抗原后将激活信号传递到细胞(例如，淋巴谱系的细胞，例如T细胞)。该CD3ζ多肽可具有与NCBI参考编号为NP_932170(SEQ ID NO:137)的序列或其片段至少约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％同源的氨基酸序列，和/或可任选地包含至多一个或至多两个或至多三个保守氨基酸取代。在非限制性实施方式中，CD3ζ多肽可具有SEQ ID NO:137的连续部分的氨基酸序列，其长度为至少20、或至少30、或至少40、或至少50，并且至多164个氨基酸。或者，或另外，在非限制性的各种实施方式中，CD3ζ多肽的氨基酸序列为SEQ IDNO:137的氨基酸1-164、1-50、50-100、100-150或150-164。在某些实施方式中，CD3ζ多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO:137的氨基酸52-121。
SEQ ID NO:137提供如下：
在某些实施方式中，CD3ζ多肽具有SEQ ID NO:138所示的氨基酸序列，其提供如下。
在某些非限制性的实施方式中，CAR的细胞内结构域还包含至少一个共刺激信号传导区，其包含至少一个可提供最佳淋巴细胞活化的共刺激分子。本文使用的“共刺激分子”是指淋巴细胞对抗原有效应答所需的除抗原受体或其配体之外的细胞表面分子。该至少一个共刺激信号传导区可包含CD28多肽、4-1BB多肽、OX40多肽、ICOS多肽、合成肽(不基于与免疫应答相关的蛋白质)，或其组合。共刺激分子可以结合共刺激配体，共刺激配体是在细胞表面上表达的蛋白质，其在结合其受体时产生共刺激应答，即当抗原结合其CAR分子时所提供的影响刺激的细胞内应答。在某些实施方式中，CAR的细胞内结构域包含有包含CD28多肽的共同刺激信号传导区。在一个非限制性实施方式中，CAR包含CD28跨膜结构域和CD28共同刺激信号传导区，其中CD28多肽包含在跨膜结构域中，并且共同刺激信号传导区具有SEQ ID NO:139所示的氨基酸序列，其提供如下。
此外，本发明公开的主题提供表达本发明公开的CAR的免疫应答细胞。免疫应答细胞可以用本发明公开的CAR转导，使得细胞表达CAR。本发明公开的主题还提供使用该细胞治疗肿瘤或Foxp3-相关病理病症的方法。本发明公开主题的免疫应答细胞可以是淋巴谱系的细胞。淋巴谱系包括B细胞、T细胞和天然杀伤(NK)细胞，其提供抗体的产生、细胞免疫系统的调节、血液中外来物质的检测、宿主外来细胞的检测等。淋巴谱系免疫应答细胞的非限制性实例包括T细胞、天然杀伤(NK)细胞、胚胎干细胞和多能干细胞(例如，可分化成淋巴样细胞的多能干细胞)。
在某些实施方式中，免疫应答细胞是T细胞。T细胞可以是在胸腺中成熟的淋巴细胞，并且主要负责细胞介导的免疫。T细胞参与获得性免疫系统。本发明公开主题的T细胞可以是任何类型的T细胞，包括但不限于T辅助细胞、细胞毒性T细胞、记忆T细胞(包括中枢记忆T细胞、干细胞样记忆T细胞(或干样记忆T细胞)和两种类型的效应记忆T细胞(例如，TEM细胞和TEMRA细胞)、调节性T细胞(也称为抑制性T细胞)、自然杀伤T细胞、粘膜相关恒定T细胞、和γδT细胞。细胞毒性T细胞(CTL或杀伤T细胞)是能够诱导感染的体细胞或肿瘤细胞死亡的T淋巴细胞的亚类。在某些实施方式中，表达CAR的T细胞表达Foxp3，以实现并维持T调节表型。
天然杀伤(NK)细胞可以是作为细胞介导的免疫的一部分并在先天性免疫应答过程中发挥作用的淋巴细胞。NK细胞不要求在先激活以对靶细胞发挥其细胞毒性作用。
免疫应答细胞(例如T细胞、NK细胞)的基因修饰可以通过将基本上同源的细胞组合物用重组DNA或RNA构建物转导进行。载体可以是逆转录病毒载体(例如，γ逆转录病毒)，其用于将DNA或RNA构建物引入到宿主细胞基因组中。例如，编码本发明公开的CAR的多核苷酸可以克隆到逆转录病毒载体中，表达可以由其内源性启动子、由逆转录病毒长端重复部分或者由另外可选的内部启动子驱动。
也可使用非病毒载体或RNA。可以使用随机染色体整合或靶向整合(例如使用核酸酶、转录激活子样效应物核酸酶(TALEN)、锌指核酸酶(ZFN)和/或规律成簇间隔短回文重复(CRISPR)或转基因表达(例如使用天然或化学修饰的RNA)。
为进行细胞的初始基因修饰以提供表达本发明公开的CAR的细胞，通常使用逆转录病毒载体进行转导，然而可以使用任何其它合适的病毒载体或非病毒递送系统。对于细胞的后续基因修饰以提供包含含有至少两种共刺激配体的抗原递呈复合物的细胞，逆转录病毒基因转移(转导)同样证明是有效的。逆转录病毒载体和合适的组装线的联合也是合适的，其中衣壳蛋白对于感染人细胞是有功能的。已知各种产生双嗜性病毒的细胞系，包括但不限于PA12(Miller等人(1985)Mol.Cell.Biol.5：431-437)；PA317(Miller等人(1986)Mol.Cell.Biol.6：2895-2902)；和CRIP(Danos等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：6460-6464)。非双嗜性颗粒也是合适的，例如，用VSVG、RD114或GALV包衣假型包装的颗粒和本领域已知的任何其它颗粒。
可能的转导方法还包括将细胞与生产细胞的直接共培养，例如通过Bregni等人(1992)Blood 80：1418～1422的方法，或者用单独的病毒上清或具有或没有合适的生长因子和聚阳离子的浓缩载体储备液培养，例如通过Xu等人(1994)Exp.Hemat.22：223-230；和Hughes等人(1992)J.Clin.Invest.89：1817的方法。
非病毒方法也可以用于在细胞中表达蛋白质。例如，可以通过在脂质转染(Feigner等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：7413，1987；Ono等人，Neuroscience Letters17：259，1990；Brigham等人，Am.J.Med.Sci.298：278，1989；Staubinger等人，Methods inEnzymology 101：512，1983)、去唾液酸血清类粘蛋白-多聚赖氨酸缀合物(Wu等人，Journalof Biological Chemistry 263：14621，1988；Wu等人，Journal of Biological Chemistry264：16985，1989)的存在下施用核酸、或通过在外科条件下的微注射(Wolff等人，Science247：1465，1990)将核酸分子引入细胞中。用于基因转移的其它非病毒方法包括体外使用磷酸钙、DEAE葡聚糖、电穿孔和原生质体融合的转染。脂质体对于将DNA递送到细胞中也可以是潜在有益的。正常基因移植到受试者的受影响组织中也可以通过将正常核酸离体转移到可培养细胞类型(例如，自体的或异源的原代细胞或其子代)中来实现，之后将细胞(或其子代)注射到靶组织中或全身注射。重组受体也可以使用转座酶或靶向核酸酶(例如锌指核酸酶、(兆碱基)大范围核酸酶或TALE核酸酶)获得或得到。瞬时表达可以通过RNA电穿孔获得。
用于多核苷酸治疗方法的cDNA表达可以由任何合适的启动子(例如，人巨细胞病毒(CMV)、猿猴病毒40(SV40)或金属硫蛋白启动子)引导，并且受任何合适的哺乳动物调节元件或内含子(例如，延伸因子1α增强子/启动子/内含子结构)调节。例如，如果需要，可以使用已知优先引导特定细胞类型中的基因表达的增强子来引导核酸的表达。所使用的增强子可以包括但不限于特征为组织或细胞特异性增强子的那些增强子。或者，如果使用基因组克隆作为治疗性构建体，则调节可以通过同源调节序列介导，或如果需要，通过来自异源来源的调节序列介导，包括上述任何启动子或调节元件。
所得细胞可以在类似于未修饰细胞的条件下生长，由此可以扩增修饰的细胞并用于多种目的。
五.药物组合物和使用方法
本发明公开主题的抗体(包括本文公开的双特异性抗体和改造抗体)和包含其的组合物、抗原结合蛋白(包括CAR)和包含其的组合物、以及免疫缀合物和包含其的组合物可用于杀伤表达Foxp3的细胞。本发明公开主题的抗体(包括本文公开的双特异性抗体和改造抗体)和包含其的组合物、抗原结合蛋白(包括CAR)和包含其的组合物、以及免疫缀合物和包含其的组合物可用于诱导受试者的免疫应答。此外，本发明公开主题的抗体(包括本文公开的双特异性抗体和改造抗体)和包含其的组合物、抗原结合蛋白(包括CAR)和包含其的组合物、以及免疫缀合物和包含其的组合物可用于选择性抑制(例如失活、抑制增殖或杀伤)某些T细胞，例如CD4+ T细胞、CD127低T细胞、CD25高T细胞、Foxp3高T细胞、及其组合，例如调节性T(Treg)细胞。Foxp3已鉴定为Treg功能的关键参与者，并且是CD4+CD25+ Treg细胞的最确定标志物。本发明公开的抗体和抗原结合蛋白特异性地靶向Treg细胞并选择性地抑制Treg细胞。在某些实施方式中，该方法包括将本发明公开的抗体或抗原结合蛋白施用于受试者。本发明公开主题的抗体和抗原结合蛋白可减少T细胞(例如，Treg)的数量，消耗T细胞(例如，Treg)，抑制T细胞(例如，Treg)的免疫抑制活性，阻断T细胞(例如，Treg)运输到淋巴结或肿瘤中，抑制(失活和/或杀伤)T细胞(例如，Treg)；和/或诱导癌细胞死亡。
另外，本发明公开的抗体(包括本文公开的双特异性抗体和改造抗体)或包含其的组合物、抗原结合蛋白(包括CAR)或包含其的组合物、或者免疫缀合物或包含其的组合物可用于治疗癌症。大多数肿瘤相关抗原是自身蛋白质，其在免疫疗法后引发弱的天然或诱导的T细胞应答。已显示Treg细胞能够识别肿瘤相关的自身抗原并控制针对各种癌抗原的T细胞应答。在某些实施方式中，该方法包括将本发明公开的抗体(包括本文公开的双特异性抗体和改造抗体)或包含其的组合物、抗原结合蛋白(包括CAR)或包含其的组合物、或者免疫缀合物或包含其的组合物施用于患有癌症的受试者，从而诱导受试者中癌细胞的死亡。在某些实施方式中，癌细胞表达Foxp3。在某些实施方式中，将本发明公开的抗体(包括本文公开的双特异性抗体和改造抗体)或包含其的组合物、抗原结合蛋白(包括CAR)或包含其的组合物、或者免疫缀合物或包含其的组合物以足以阻止、抑制或减少癌症或肿瘤的进展的量施用于受试者。进展包括例如癌症或肿瘤的生长、侵袭、转移和/或复发。对于该用途有效的量将取决于疾病的严重程度和患者自身免疫系统的一般状况。剂量方案也随着疾病状态和患者的状况而变化，通常范围从单一大剂量或连续输注到每天多次给药(例如，每4-6小时)，或者根据治疗医师和患者的状况处方。
可通过本发明公开主题的抗体(包括本文公开的双特异性抗体和改造抗体)和包含其的组合物、抗原结合蛋白(包括CAR)和包含其的组合物、以及免疫缀合物和包含其的组合物进行治疗的医学病症的鉴定在本领域技术人员的熟练能力和知识范围以内。本领域医务人员例如通过使用临床测试、身体检查和医疗/家族史可以很容易地确定是否该个体是该治疗的候选者。
癌症的非限制性实例包括各种实体瘤，包括但不限于黑色素瘤、卵巢癌、乳腺癌、肺癌、胰腺癌、胃癌、结肠癌、成胶质细胞瘤、肾癌、肝癌、淋巴瘤、白血病、骨髓瘤、和肉瘤。
抗癌免疫疗法可通过伴随的Treg阻断改善。在某些实施方式中，癌症受试者接受或已经接受一种或多种抗癌免疫疗法。抗癌免疫疗法的非限制性实例包括抗体疗法、细胞疗法(T细胞、NK细胞等)、CAR疗法、骨髓移植和供体白细胞输注、免疫T细胞调节疗法(免疫检查点疗法、例如抗-PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗-LAG3抗体、抗-CTLA-4抗体和抗-CD47抗体)、以及基于疫苗接种的药物及其变体。在某些实施方式中，该方法包括将本发明公开的Foxp3抗体(包括双特异性抗体和改造抗体)或包含其的组合物、抗原结合蛋白(包括CAR)或包含其的组合物、或免疫缀合物或包含其的组合物与一种或多种其它药剂(包括但不限于抗-PD-1抗体、抗-PD-L1抗体、抗-LAG3抗体、抗-CTLA-4抗体和抗-CD47抗体)组合施用。例如，本发明公开主题的一个实施方式提供一种通过施用本发明公开的抗体或抗原结合蛋白与抗肿瘤剂来治疗医学病症的方法。Treg阻断还可以有益于多种其它癌症疗法的治疗效果，该其它癌症疗法包括但不限于化学疗法，靶向疗法(例如酪氨酸激酶抑制剂)，激素疗法，放射疗法，外科手术，高温热疗，局部疗法，光激活疗法，以及可能需要激活免疫系统以增强杀伤、减少残留肿瘤或白血病细胞、或与这些疗法协同或相加地起作用的疗法。抗体还可以以化学或生物合成方式与一种或多种抗肿瘤剂连接，以制备抗体药物缀合物。
可以使用任何合适的方法或路径施用本发明公开的抗体或抗原结合蛋白(例如CAR)，或者任选地同时施用抗肿瘤剂和/或其它受体的拮抗剂。给药路径包括，例如，静脉内、腹膜内、动脉内、皮下、鞘内、局部或肌内给药。共同施用的药剂可以通过这些途径给药并且也可以口服给药。然而，应当强调，本发明公开的主题不限于任何具体的给药方法或路径。
注意到可以将本发明公开的抗体(包括双特异性抗体和改造抗体)或抗原结合蛋白(包括CAR)作为缀合物施用，其与受体特异性结合，并在配体-毒素内化之后递送毒性的致死负载。
应当理解到，本发明公开主题的抗体(包括双特异性抗体和改造抗体)、抗原结合蛋白(包括CAR)或免疫缀合物可以以组合物、例如包含药学上可接受的载体的药物组合物的形式施用。适当的药学上可接受的载体包括，例如，水、盐水、磷酸盐缓冲液、葡萄糖、甘油、乙醇等、及其组合中的一种或多种。药学上可接受的载体还可以包括微量的辅助性物质例如润湿剂或乳化剂、防腐剂或缓冲剂，其提高结合蛋白质的保存限期或效用。注射组合物是本领域公知的，其可以配制成在施用于哺乳动物之后提供快速、持续或延缓的活性组分释放。
本发明公开主题的其它方面包括，但不限于，抗体和编码它们的核酸作为检测细胞和组织中Foxp3的研究工具的用途。本发明公开的主题提供用于检测全细胞或组织中Foxp3的方法。在某些实施方式中，该方法包括(a)使细胞或组织与包含可检测标记的本发明公开的抗体或其抗原结合部分接触；和(b)通过测量与细胞或组织相关的可检测标记的量来测定结合于细胞或组织的带标记的抗体或其抗原结合部分的量，其中结合抗体或其抗原结合部分的量表示细胞或组织中Foxp3的量。
包含所公开抗体和核酸的药物组合物包括在本发明公开的主题中。用于通过载体免疫疗法的基于抗体的治疗的包含本发明公开主题的核酸的载体也包括在本发明公开的主题中。载体包括能够表达和分泌抗体的表达载体、以及导向抗原结合蛋白例如嵌合抗原受体至细胞表面表达的载体。
包含核酸的细胞例如已经用本发明公开主题的载体转染的细胞也包括在本公开内容中。
对于诊断和研究应用中的用途，还提供含有本发明公开的抗-Foxp3抗体或本发明公开主题的核酸、检定试剂、缓冲剂等的试剂盒。
六.试剂盒
本发明公开的主题提供用于治疗或预防癌症的试剂盒。在某些实施方式中，试剂盒包含含有单位剂型的有效量的本发明公开的抗体(包括双特异性抗体或改造抗体)、抗原结合蛋白(包括CAR)或免疫缀合物的治疗组合物。在某些实施方式中，试剂盒包含含有治疗或预防性疫苗的无菌容器；这些容器可以是盒、安瓿、瓶、小瓶、管、袋、小袋、泡罩包装或本领域已知的其它容器形式。这些容器可以由塑料、玻璃、层压纸、金属箔或其它适合于容纳药物的材料制成。
如果需要，本发明公开的抗体(包括双特异性抗体或改造抗体)、抗原结合蛋白(包括CAR)或免疫缀合物与关于将细胞施用于患有癌症或者处于发展其风险中的受试者的说明书一起提供。说明书通常包括有关用于治疗或预防癌症的组合物的使用的信息。在其它实施方式中，说明书包括以下中的至少一种：治疗剂的说明；用于治疗或预防癌症或其症状的剂量方案和施用方法；注意事项；警告；适应症；禁忌症；过量信息；不良反应；动物药理学；临床研究；和/或参考文献。说明书可以直接印在容器上(当存在时)、或作为标签贴到容器上、或作为单独的页、小册子、卡片或折叠式印刷品，在容器中或与容器一起提供。
七.方法
1.流式细胞术分析
对于细胞表面染色，将细胞与适当的mAb一起在冰上孵育30分钟，洗涤，并且当必要时与第二抗体试剂一起孵育。对于#32-BiTE染色，将人T细胞或癌细胞与不同浓度的#32-BiTE或对照BiTE在冰上孵育30分钟，洗涤，并与抗His-标签的第二mAb一起孵育。在FACSCalibur(Becton Dickinson)或LSRFortessa(BD Biosciences)上收集流式细胞术数据，并用FlowJo V8.7.1和9.4.8软件进行分析。
2.对Foxp3肽/HLA-A*02:01复合物具有特异性的scFv的选择和表征
使用建立成熟的噬菌体展示文库和本领域技术人员已知的筛选方法来选择对Foxp3肽/HLA-A2复合物具有高度特异性的scFv片段。在某些实施方式中，使用人scFv抗体噬菌体展示文库用于mAb克隆的选择。为了降低通过固定化在塑料表面上引入的MHC1复合物的构象变化，使用溶液淘选法代替常规的板淘选。简言之，首先将生物素化抗原与人scFv噬菌体文库混合，然后通过链霉亲和素-缀合的Dynabeads M-280通过磁力架使抗原-scFv抗体复合物免疫共沉淀(pull down)。
然后将结合的克隆洗脱，并用于感染大肠杆菌(E.Coli)XL1-Blue。提纯细菌中表达的scFv噬菌体克隆(Yasmina等人,Protein Science 2008；17(8):1326-1335；Roberts等人,Blood 2002:99(10):3748-3755)。淘选进行3-4轮，以富集与HLA-A*02:01/Foxp3复合物特异性结合的scFv噬菌体克隆。通过标准ELISA方法针对生物素化单链HLA-A*02:01/Foxp3肽复合物确定阳性克隆。通过流式细胞术，使用TAP-缺陷型HLA-A*02:01+细胞系T2进一步测验阳性克隆与活细胞表面上的HLA-A2/肽复合物的结合。在20μg/mlβ2M的存在下，在不含血清的RPMI1640培养基中将T2细胞用肽(50μg/ml)脉冲过夜。将细胞洗涤，并如下进行染色。
首先将细胞用提纯的scFv噬菌体克隆染色，然后用小鼠抗-M13mAb染色，最后用山羊F(ab)2抗-小鼠Ig与FITC的缀合物染色。每个染色步骤均在冰上进行30-60分钟，每个染色步骤之间将细胞洗涤两次。
3.使用选择的ScFv片段改造全长mAb
噬菌体展示技术使得可以迅速选择并产生抗原特异性scFv和Fab片段，它们可以自身用于或者可以进一步开发以提供完整的抗体、抗原结合蛋白或其抗原结合部分。具有Fc结构域的完整mAb相对于scFv和Fab抗体具有若干优势。首先，只有全长Ab经由Fc结构域发挥诸如CDC和ADCC的免疫功能。第二，相比于单体Fab Ab，二价mAb提供更强的抗原结合亲和力。第三，使用Fab和二价mAb，血浆半衰期和肾清除率将不同。每一种的具体特征和优势可以与计划的效应子策略匹配。第四，相比于scFv和Fab，二价mAb可以不同的速率内化，改变免疫功能或载体功能。例如，α发射体(emitter)不需要内化来杀伤靶标，但许多药物和毒素将受益于免疫复合物的内化。因此，在某些实施方式中，一旦从噬菌体展示文库获得对Foxp3/HLA-A2具有特异性的scFv克隆，则使用scFv片段产生全长IgG mAb。
在HEK293和中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系中产生所选择噬菌体克隆的全长人IgG1，如(Caron等人,J Exp Med 176:1191-1195.1992)所述。简言之，将抗体可变区亚克隆到哺乳动物表达载体中，与人λ或κ轻链恒定区和人IgG1 Fc亚类匹配。提纯的全长IgG抗体的分子量通过电穿孔在还原和非还原条件下测量。
4.改造嵌合抗原受体和免疫效应细胞
编码本文鉴定的抗体和抗原结合蛋白的核酸可以用于改造重组免疫效应细胞。产生基因修饰的例如T细胞的方法和载体是本领域已知的(参见Brentjens等人,Safety andpersistence of adoptively transferred autologous CD19-targeted T cells inpatients with relapsed or chemotherapy refractory B-cell leukemias in Blood118(18):4817-4828,November 2011)。
5.Foxp3/A0201复合物的全长人IgG1的表征
最初，通过使用间接或直接染色，对用或者不用Foxp3肽(例如，Foxp3-7)、或无关EW或RHAMM-R3对照肽脉冲的T2细胞进行染色，然后用与PE或FITC缀合的第二山羊F(ab)2抗-人IgG mAb染色，测定全人IgG1 mAb对Foxp3肽/A0201复合物的特异性。通过流式细胞术测量荧光强度。使用相同的方法测定mAb与新鲜肿瘤细胞和细胞系的结合。
示例性实施方式
1.一种分离的抗体或其抗原结合部分，该抗体或其抗原结合部分与结合于人主要组织相容性复合物(MHC)分子的Foxp3肽结合。
2.实施方式1的抗体或其抗原结合部分，其中该人MHC分子是人白细胞抗原(HLA)分子。
3.实施方式2的抗体或其抗原结合部分，其中该HLA分子是HLA I类分子。
4.实施方式3的抗体或其抗原结合部分，其中该HLA I类分子是HLA-A。
5.实施方式4的抗体或其抗原结合部分，其中该HLA-A是HLA-A2。
6.实施方式5的抗体或其抗原结合部分，其中该HLA-A2是HLA-A*02:01。
7.实施方式1-6中任一项的抗体或其抗原结合部分，其中该Foxp3肽是包含SEQ IDNO:1所示氨基酸序列的人Foxp3多肽的一部分。
8.实施方式1-7中任一项的抗体或其抗原结合部分，其中该Foxp3肽具有8-12个氨基酸的长度。
9.实施方式8的抗体或其抗原结合部分，其中该Foxp3肽具有9个氨基酸的长度。
10.实施方式8的抗体或其抗原结合部分，其中该Foxp3肽具有10个氨基酸的长度。
11.实施方式1-10中任一项的抗体或其抗原结合部分，其中该Foxp3肽选自具有SEQ ID NO:8所示氨基酸序列的Foxp3-7或其一部分、具有SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的Foxp3-1或其一部分、具有SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的Foxp3-2或其一部分、具有SEQ IDNO:4所示氨基酸序列的Foxp3-3或其一部分、具有SEQ ID NO:5所示氨基酸序列的Foxp3-4或其一部分、具有SEQ ID NO:6所示氨基酸序列的Foxp3-5或其一部分、和具有SEQ ID NO:7所示氨基酸序列的Foxp3-6或其一部分。
12.实施方式11的抗体或其抗原结合部分，其中该Foxp3肽是具有SEQ ID NO:8所示氨基酸序列的Foxp3-7。
13.实施方式1-8和10-12中任一项的抗体或其抗原结合部分，该抗体或其抗原结合部分包含选自以下的重链可变区CDR3序列和轻链可变区CDR3序列：
(a)包含SEQ ID NO:11所示氨基酸序列或其修饰的重链可变区CDR3序列、和包含SEQ ID NO:14所示氨基酸序列或其修饰的轻链可变区CDR3序列；
(b)包含SEQ ID NO:17所示氨基酸序列或其修饰的重链可变区CDR3序列、和包含SEQ ID NO:20所示氨基酸序列或其修饰的轻链可变区CDR3序列；
(c)包含SEQ ID NO:23所示氨基酸序列或其修饰的重链可变区CDR3序列、和包含SEQ ID NO:26所示氨基酸序列或其修饰的轻链可变区CDR3序列；
(d)包含SEQ ID NO:29所示氨基酸序列或其修饰的重链可变区CDR3序列、和包含SEQ ID NO:32所示氨基酸序列或其修饰的轻链可变区CDR3序列；
(e)包含SEQ ID NO:35所示氨基酸序列或其修饰的重链可变区CDR3序列、和包含SEQ ID NO:38所示氨基酸序列或其修饰的轻链可变区CDR3序列；
(f)包含SEQ ID NO:41所示氨基酸序列或其修饰的重链可变区CDR3序列、和包含SEQ ID NO:44所示氨基酸序列或其修饰的轻链可变区CDR3序列；
(g)包含SEQ ID NO:47所示氨基酸序列或其修饰的重链可变区CDR3序列、和包含SEQ ID NO:50所示氨基酸序列或其修饰的轻链可变区CDR3序列；和
(h)包含SEQ ID NO:53所示氨基酸序列或其修饰的重链可变区CDR3序列、和包含SEQ ID NO:56所示氨基酸序列或其修饰的轻链可变区CDR3序列。
14.实施方式1-8和10-13中任一项的抗体或其抗原结合部分，该抗体或其抗原结合部分包含选自以下的重链可变区CDR2序列和轻链可变区CDR2序列：
(a)包含SEQ ID NO:10所示氨基酸序列或其修饰的重链可变区CDR2序列、和包含SEQ ID NO:13所示氨基酸序列或其修饰的轻链可变区CDR2序列；
(b)包含SEQ ID NO:16所示氨基酸序列或其修饰的重链可变区CDR2序列、和包含SEQ ID NO:19所示氨基酸序列或其修饰的轻链可变区CDR2序列；
(c)包含SEQ ID NO:22所示氨基酸序列或其修饰的重链可变区CDR2序列、和包含SEQ ID NO:25所示氨基酸序列或其修饰的轻链可变区CDR2序列；
(d)包含SEQ ID NO:28所示氨基酸序列或其修饰的重链可变区CDR2序列、和包含SEQ ID NO:31所示氨基酸序列或其修饰的轻链可变区CDR2序列；
(e)包含SEQ ID NO:34所示氨基酸序列或其修饰的重链可变区CDR2序列、和包含SEQ ID NO:37所示氨基酸序列或其修饰的轻链可变区CDR2序列；
(f)包含SEQ ID NO:40所示氨基酸序列或其修饰的重链可变区CDR2序列、和包含SEQ ID NO:43所示氨基酸序列或其修饰的轻链可变区CDR2序列；
(g)包含SEQ ID NO:46所示氨基酸序列或其修饰的重链可变区CDR2序列、和包含SEQ ID NO:49所示氨基酸序列或其修饰的轻链可变区CDR2序列；和
(h)包含SEQ ID NO:52所示氨基酸序列或其修饰的重链可变区CDR3序列、和包含SEQ ID NO:55所示氨基酸序列或其修饰的轻链可变区CDR3序列。
15.实施方式1-8和10-14中任一项的抗体或其抗原结合部分，该抗体或其抗原结合部分包含选自以下的重链可变区CDR1序列和轻链可变区CDR1序列：
(a)包含SEQ ID NO:9所示氨基酸序列或其修饰的重链可变区CDR1序列、和包含SEQ ID NO:12所示氨基酸序列或其修饰的轻链可变区CDR1序列；
(b)包含SEQ ID NO:15所示氨基酸序列或其修饰的重链可变区CDR1序列、和包含SEQ ID NO:18所示氨基酸序列或其修饰的轻链可变区CDR1序列；
(c)包含SEQ ID NO:21所示氨基酸序列或其修饰的重链可变区CDR1序列、和包含SEQ ID NO:24所示氨基酸序列或其修饰的轻链可变区CDR1序列；和
(d)包含SEQ ID NO:27所示氨基酸序列或其修饰的重链可变区CDR1序列、和包含SEQ ID NO:30所示氨基酸序列或其修饰的轻链可变区CDR1序列；
(e)包含SEQ ID NO:33所示氨基酸序列或其修饰的重链可变区CDR1序列、和包含SEQ ID NO:36所示氨基酸序列或其修饰的轻链可变区CDR1序列；
(f)包含SEQ ID NO:39所示氨基酸序列或其修饰的重链可变区CDR1序列、和包含SEQ ID NO:42所示氨基酸序列或其修饰的轻链可变区CDR1序列；
(g)包含SEQ ID NO:45所示氨基酸序列或其修饰的重链可变区CDR1序列、和包含SEQ ID NO:48所示氨基酸序列或其修饰的轻链可变区CDR1序列；和
(h)包含SEQ ID NO:51所示氨基酸序列或其修饰的重链可变区CDR1序列、和包含SEQ ID NO:54所示氨基酸序列或其修饰的轻链可变区CDR1序列。
16.实施方式1-8和10-15中任一项的抗体或其抗原结合部分，该抗体或其抗原结合部分包含：
(a)包含SEQ ID NO:9所示氨基酸序列的重链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:10所示氨基酸序列的重链可变区CDR2；包含SEQ ID NO:11所示氨基酸序列的重链可变区CDR3；包含SEQ ID NO:12所示氨基酸序列的轻链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:13所示氨基酸序列的轻链可变区CDR2；和包含SEQ ID NO:14所示氨基酸序列的轻链可变区CDR3；
(b)包含SEQ ID NO:15所示氨基酸序列的重链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:16所示氨基酸序列的重链可变区CDR2；包含SEQ ID NO:17所示氨基酸序列的重链可变区CDR3；包含SEQ ID NO:18所示氨基酸序列的轻链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:19所示氨基酸序列的轻链可变区CDR2；和包含SEQ ID NO:20所示氨基酸序列的轻链可变区CDR3；
(c)包含SEQ ID NO:21所示氨基酸序列的重链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:22所示氨基酸序列的重链可变区CDR2；包含SEQ ID NO:23所示氨基酸序列的重链可变区CDR3；包含SEQ ID NO:24所示氨基酸序列的轻链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:25所示氨基酸序列的轻链可变区CDR2；和包含SEQ ID NO:26所示氨基酸序列的轻链可变区CDR3；
(d)包含SEQ ID NO:27所示氨基酸序列的重链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:28所示氨基酸序列的重链可变区CDR2；包含SEQ ID NO:29所示氨基酸序列的重链可变区CDR3；包含SEQ ID NO:30所示氨基酸序列的轻链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:31所示氨基酸序列的轻链可变区CDR2；和包含SEQ ID NO:32所示氨基酸序列的轻链可变区CDR3；
(e)包含SEQ ID NO:33所示氨基酸序列的重链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:34所示氨基酸序列的重链可变区CDR2；包含SEQ ID NO:35所示氨基酸序列的重链可变区CDR3；包含SEQ ID NO:36所示氨基酸序列的轻链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:37所示氨基酸序列的轻链可变区CDR2；和包含SEQ ID NO:38所示氨基酸序列的轻链可变区CDR3；
(f)包含SEQ ID NO:39所示氨基酸序列的重链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:40所示氨基酸序列的重链可变区CDR2；包含SEQ ID NO:41所示氨基酸序列的重链可变区CDR3；包含SEQ ID NO:42所示氨基酸序列的轻链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:43所示氨基酸序列的轻链可变区CDR2；和包含SEQ ID NO:44所示氨基酸序列的轻链可变区CDR3；
(g)包含SEQ ID NO:45所示氨基酸序列的重链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:46所示氨基酸序列的重链可变区CDR2；包含SEQ ID NO:47所示氨基酸序列的重链可变区CDR3；包含SEQ ID NO:48所示氨基酸序列的轻链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:49所示氨基酸序列的轻链可变区CDR2；和包含SEQ ID NO:50所示氨基酸序列的轻链可变区CDR3；或
(h)包含SEQ ID NO:51所示氨基酸序列的重链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:52所示氨基酸序列的重链可变区CDR2；包含SEQ ID NO:53所示氨基酸序列的重链可变区CDR3；包含SEQ ID NO:54所示氨基酸序列的轻链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:55所示氨基酸序列的轻链可变区CDR2；和包含SEQ ID NO:56所示氨基酸序列的轻链可变区CDR3。
17.实施方式16的抗体或其抗原结合部分，该抗体或其抗原结合部分包含：包含SEQ ID NO:39所示氨基酸序列的重链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:40所示氨基酸序列的重链可变区CDR2；包含SEQ ID NO:41所示氨基酸序列的重链可变区CDR3；包含SEQ ID NO:42所示氨基酸序列的轻链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:43所示氨基酸序列的轻链可变区CDR2；和包含SEQ ID NO:44所示氨基酸序列的轻链可变区CDR3。
18.实施方式1-8和10-16中任一项的抗体或其抗原结合部分，该抗体或其抗原结合部分包含重链可变区，该重链可变区包含与选自SEQ ID NO:93、95、97、99、101、103、105和107的序列至少约80％同源的氨基酸序列。
19.实施方式18的抗体或其抗原结合部分，该抗体或其抗原结合部分包含重链可变区，该重链可变区包含选自SEQ ID NO:93、95、97、99、101、103、105和107的氨基酸序列。
20.实施方式1-8和10-16中任一项的抗体或其抗原结合部分，该抗体或其抗原结合部分包含轻链可变区，该轻链可变区包含与选自SEQ ID NO:94、96、98、100、102、104、106和108的序列至少约80％同源的氨基酸序列。
21.实施方式20的抗体或其抗原结合部分，该抗体或其抗原结合部分包含轻链可变区，该轻链可变区包含选自SEQ ID NO:94、96、98、100、102、104、106和108的氨基酸序列。
22.实施方式18-21中任一项的抗体或其抗原结合部分，该抗体或其抗原结合部分包含：
(a)包含与SEQ ID NO:93所示氨基酸序列至少约80％同源的氨基酸序列的重链可变区、和包含与SEQ ID NO:94所示氨基酸序列至少约80％同源的氨基酸序列的轻链可变区；
(b)包含与SEQ ID NO:95所示氨基酸序列至少约80％同源的氨基酸序列的重链可变区、和包含与SEQ ID NO:96所示氨基酸序列至少约80％同源的氨基酸序列的轻链可变区；
(c)包含与SEQ ID NO:97所示氨基酸序列至少约80％同源的氨基酸序列的重链可变区、和包含与SEQ ID NO:98所示氨基酸序列至少约80％同源的氨基酸序列的轻链可变区；
(d)包含与SEQ ID NO:99所示氨基酸序列至少约80％同源的氨基酸序列的重链可变区、和包含与SEQ ID NO:100所示氨基酸序列至少约80％同源的氨基酸序列的轻链可变区；
(e)包含与SEQ ID NO:101所示氨基酸序列至少约80％同源的氨基酸序列的重链可变区、和包含与SEQ ID NO:102所示氨基酸序列至少约80％同源的氨基酸序列的轻链可变区；
(f)包含与SEQ ID NO:103所示氨基酸序列至少约80％同源的氨基酸序列的重链可变区、和包含与SEQ ID NO:104所示氨基酸序列至少约80％同源的氨基酸序列的轻链可变区；
(g)包含与SEQ ID NO:105所示氨基酸序列至少约80％同源的氨基酸序列的重链可变区、和包含与SEQ ID NO:106所示氨基酸序列至少约80％同源的氨基酸序列的轻链可变区；或
(h)包含与SEQ ID NO:107所示氨基酸序列至少约80％同源的氨基酸序列的重链可变区、和包含与SEQ ID NO:108所示氨基酸序列至少约80％同源的氨基酸序列的轻链可变区。
23.实施方式22的抗体或其抗原结合部分，该抗体或其抗原结合部分包含：
(a)包含SEQ ID NO:93所示氨基酸序列的重链可变区、和包含SEQ ID NO:94所示氨基酸序列的轻链可变区；
(b)包含SEQ ID NO:95所示氨基酸序列的重链可变区、和包含SEQ ID NO:96所示氨基酸序列的轻链可变区；
(c)包含SEQ ID NO:97所示氨基酸序列的重链可变区、和包含SEQ ID NO:98所示氨基酸序列的轻链可变区；
(d)包含SEQ ID NO:99所示氨基酸序列的重链可变区、和包含SEQ ID NO:100所示氨基酸序列的轻链可变区；
(e)包含SEQ ID NO:101所示氨基酸序列的重链可变区、和包含SEQ ID NO:102所示氨基酸序列的轻链可变区；
(f)包含SEQ ID NO:103所示氨基酸序列的重链可变区、和包含SEQ ID NO:104所示氨基酸序列的轻链可变区；
(g)包含SEQ ID NO:105所示氨基酸序列的重链可变区、和包含SEQ ID NO:106所示氨基酸序列的轻链可变区；或
(h)包含SEQ ID NO:107所示氨基酸序列的重链可变区、和包含SEQ ID NO:108所示氨基酸序列的轻链可变区。
24.实施方式23的抗体或其抗原结合部分，该抗体或其抗原结合部分包含：包含SEQ ID NO:103所示氨基酸序列的重链可变区、和包含SEQ ID NO:104所示氨基酸序列的轻链可变区。
25.实施方式11的抗体或其抗原结合部分，其中该Foxp3肽是具有SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的Foxp3-2。
26.实施方式25的抗体或其抗原结合部分，该抗体或其抗原结合部分包含选自以下的重链可变区CDR3序列和轻链可变区CDR3序列：
(a)包含SEQ ID NO:59所示氨基酸序列或其修饰的重链可变区CDR3序列、和包含SEQ ID NO:62所示氨基酸序列或其修饰的轻链可变区CDR3序列；
(b)包含SEQ ID NO:65所示氨基酸序列或其修饰的重链可变区CDR3序列、和包含SEQ ID NO:68所示氨基酸序列或其修饰的轻链可变区CDR3序列；
(c)包含SEQ ID NO:71所示氨基酸序列或其修饰的重链可变区CDR3序列、和包含SEQ ID NO:74所示氨基酸序列或其修饰的轻链可变区CDR3序列；
(d)包含SEQ ID NO:77所示氨基酸序列或其修饰的重链可变区CDR3序列、和包含SEQ ID NO:80所示氨基酸序列或其修饰的轻链可变区CDR3序列；和
(e)包含SEQ ID NO:83所示氨基酸序列或其修饰的重链可变区CDR3序列、和包含SEQ ID NO:86所示氨基酸序列或其修饰的轻链可变区CDR3序列。
27.实施方式25或26的抗体或其抗原结合部分，该抗体或其抗原结合部分包含选自以下的重链可变区CDR2序列和轻链可变区CDR2序列：
(a)包含SEQ ID NO:58所示氨基酸序列或其修饰的重链可变区CDR2序列、和包含SEQ ID NO:61所示氨基酸序列或其修饰的轻链可变区CDR2序列；
(b)包含SEQ ID NO:64所示氨基酸序列或其修饰的重链可变区CDR2序列、和包含SEQ ID NO:67所示氨基酸序列或其修饰的轻链可变区CDR2序列；
(c)包含SEQ ID NO:70所示氨基酸序列或其修饰的重链可变区CDR2序列、和包含SEQ ID NO:73所示氨基酸序列或其修饰的轻链可变区CDR2序列；
(d)包含SEQ ID NO:76所示氨基酸序列或其修饰的重链可变区CDR2序列、和包含SEQ ID NO:79所示氨基酸序列或其修饰的轻链可变区CDR2序列；和
(e)包含SEQ ID NO:82所示氨基酸序列或其修饰的重链可变区CDR2序列、和包含SEQ ID NO:85所示氨基酸序列或其修饰的轻链可变区CDR2序列。
28.实施方式25、26或27的抗体或其抗原结合部分，该抗体或其抗原结合部分包含选自以下的重链可变区CDR1序列和轻链可变区CDR1序列：
(a)包含SEQ ID NO:57所示氨基酸序列或其修饰的重链可变区CDR1序列、和包含SEQ ID NO:60所示氨基酸序列或其修饰的轻链可变区CDR1序列；
(b)包含SEQ ID NO:63所示氨基酸序列或其修饰的重链可变区CDR1序列、和包含SEQ ID NO:66所示氨基酸序列或其修饰的轻链可变区CDR1序列；
(c)包含SEQ ID NO:69所示氨基酸序列或其修饰的重链可变区CDR1序列、和包含SEQ ID NO:71所示氨基酸序列或其修饰的轻链可变区CDR1序列；
(d)包含SEQ ID NO:75所示氨基酸序列或其修饰的重链可变区CDR1序列、和包含SEQ ID NO:78所示氨基酸序列或其修饰的轻链可变区CDR1序列；和
(e)包含SEQ ID NO:81所示氨基酸序列或其修饰的重链可变区CDR1序列、和包含SEQ ID NO:84所示氨基酸序列或其修饰的轻链可变区CDR1序列。
29.实施方式25-28中任一项的抗体或其抗原结合部分，该抗体或其抗原结合部分包含：
(a)包含SEQ ID NO:57所示氨基酸序列的重链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:58所示氨基酸序列的重链可变区CDR2；包含SEQ ID NO:59所示氨基酸序列的重链可变区CDR3；包含SEQ ID NO:60所示氨基酸序列的轻链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:61所示氨基酸序列的轻链可变区CDR2；和包含SEQ ID NO:62所示氨基酸序列的轻链可变区CDR3；
(b)包含SEQ ID NO:63所示氨基酸序列的重链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:64所示氨基酸序列的重链可变区CDR2；包含SEQ ID NO:65所示氨基酸序列的重链可变区CDR3；包含SEQ ID NO:66所示氨基酸序列的轻链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:67所示氨基酸序列的轻链可变区CDR2；和包含SEQ ID NO:68所示氨基酸序列的轻链可变区CDR3；
(c)包含SEQ ID NO:69所示氨基酸序列的重链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:70所示氨基酸序列的重链可变区CDR2；包含SEQ ID NO:71所示氨基酸序列的重链可变区CDR3；包含SEQ ID NO:72所示氨基酸序列的轻链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:73所示氨基酸序列的轻链可变区CDR2；和包含SEQ ID NO:74所示氨基酸序列的轻链可变区CDR3；
(d)包含SEQ ID NO:75所示氨基酸序列的重链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:76所示氨基酸序列的重链可变区CDR2；包含SEQ ID NO:77所示氨基酸序列的重链可变区CDR3；包含SEQ ID NO:78所示氨基酸序列的轻链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:79所示氨基酸序列的轻链可变区CDR2；和包含SEQ ID NO:80所示氨基酸序列的轻链可变区CDR3；或
(e)包含SEQ ID NO:81所示氨基酸序列的重链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:82所示氨基酸序列的重链可变区CDR2；包含SEQ ID NO:83所示氨基酸序列的重链可变区CDR3；包含SEQ ID NO:84所示氨基酸序列的轻链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:85所示氨基酸序列的轻链可变区CDR2；和包含SEQ ID NO:86所示氨基酸序列的轻链可变区CDR3。
30.实施方式25-29中任一项的抗体或其抗原结合部分，该抗体或其抗原结合部分包含重链可变区，该重链可变区包含与选自SEQ ID NO:109、111、113、115和117的序列至少约80％同源的氨基酸序列。
31.实施方式30的抗体或其抗原结合部分，该抗体或其抗原结合部分包含重链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:113、SEQ ID NO:115、或SEQ ID NO:117所示的氨基酸序列。
32.实施方式25-31中任一项的抗体或其抗原结合部分，该抗体或其抗原结合部分包含轻链可变区，该轻链可变区包含与选自SEQ ID NO:110、112、114、116和118的序列至少约80％同源的氨基酸序列。
33.实施方式32的抗体或其抗原结合部分，该抗体或其抗原结合部分包含轻链可变区，该轻链可变区包含SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:112、SEQ ID NO:114、SEQ ID NO:116、或SEQ ID NO:118所示的氨基酸序列。
34.实施方式30-33中任一项的抗体或其抗原结合部分，该抗体或其抗原结合部分包含：
(a)包含与SEQ ID NO:109所示氨基酸序列至少约80％同源的氨基酸序列的重链可变区、和包含与SEQ ID NO:110所示氨基酸序列至少约80％同源的氨基酸序列的轻链可变区；
(b)包含与SEQ ID NO:111所示氨基酸序列至少约80％同源的氨基酸序列的重链可变区、和包含与SEQ ID NO:112所示氨基酸序列至少约80％同源的氨基酸序列的轻链可变区；
(c)包含与SEQ ID NO:113所示氨基酸序列至少约80％同源的氨基酸序列的重链可变区、和包含与SEQ ID NO:114所示氨基酸序列至少约80％同源的氨基酸序列的轻链可变区；
(d)包含与SEQ ID NO:115所示氨基酸序列至少约80％同源的氨基酸序列的重链可变区、和包含与SEQ ID NO:116所示氨基酸序列至少约80％同源的氨基酸序列的轻链可变区；或
(e)包含与SEQ ID NO:117所示氨基酸序列至少约80％同源的氨基酸序列的重链可变区、和包含与SEQ ID NO:118所示氨基酸序列至少约80％同源的氨基酸序列的轻链可变区。
35.实施方式34的抗体或其抗原结合部分，该抗体或其抗原结合部分包含：
(a)包含SEQ ID NO:109所示氨基酸序列的重链可变区、和包含SEQ ID NO:110所示氨基酸序列的轻链可变区；
(b)包含SEQ ID NO:111所示氨基酸序列的重链可变区、和包含SEQ ID NO:112所示氨基酸序列的轻链可变区；
(c)包含SEQ ID NO:113所示氨基酸序列的重链可变区、和包含SEQ ID NO:114所示氨基酸序列的轻链可变区；
(d)包含SEQ ID NO:115所示氨基酸序列的重链可变区、和包含SEQ ID NO:116所示氨基酸序列的轻链可变区；或
(e)包含SEQ ID NO:117所示氨基酸序列的重链可变区、和包含SEQ ID NO:118所示氨基酸序列的轻链可变区。
36.实施方式11的抗体或其抗原结合部分，其中Foxp3肽是具有SEQ ID NO:5所示氨基酸序列的Foxp3-4。
37.实施方式36的抗体或其抗原结合部分，该抗体或其抗原结合部分包含：包含SEQ ID NO:89所示氨基酸序列或其修饰的重链可变区CDR3序列、和包含SEQ ID NO:92所示氨基酸序列或其修饰的轻链可变区CDR3序列。
38.实施方式36或37的抗体或其抗原结合部分，该抗体或其抗原结合部分包含：包含SEQ ID NO:88所示氨基酸序列或其修饰的重链可变区CDR2序列、和包含SEQ ID NO:91所示氨基酸序列或其修饰的轻链可变区CDR2序列。
39.实施方式36、37或38的抗体或其抗原结合部分，该抗体或其抗原结合部分包含：包含SEQ ID NO:87所示氨基酸序列或其修饰的重链可变区CDR1序列、和包含SEQ IDNO:90所示氨基酸序列或其修饰的轻链可变区CDR2序列。
40.实施方式36-39中任一项的抗体或其抗原结合部分，该抗体或其抗原结合部分包含：包含SEQ ID NO:87所示氨基酸序列的重链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:88所示氨基酸序列的重链可变区CDR2；包含SEQ ID NO:89所示氨基酸序列的重链可变区CDR3；包含SEQID NO:90所示氨基酸序列的轻链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:91所示氨基酸序列的轻链可变区CDR2；和包含SEQ ID NO:92所示氨基酸序列的轻链可变区CDR3。
41.实施方式36-40中任一项的抗体或其抗原结合部分，该抗体或其抗原结合部分包含重链可变区，该重链可变区包含与SEQ ID NO:119所示氨基酸序列至少约80％同源的氨基酸序列。
42.实施方式41的抗体或其抗原结合部分，该抗体或其抗原结合部分包含重链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO:119所示的氨基酸序列。
43.实施方式36-42中任一项的抗体或其抗原结合部分，该抗体或其抗原结合部分包含轻链可变区，该轻链可变区包含与SEQ ID NO:120所示氨基酸序列至少约80％同源的氨基酸序列。
44.实施方式43的抗体或其抗原结合部分，该抗体或其抗原结合部分包含轻链可变区，该轻链可变区包含SEQ ID NO:120所示的氨基酸序列。
45.实施方式41-44中任一项的抗体或其抗原结合部分，该抗体或其抗原结合部分包含：包含与SEQ ID NO:119所示氨基酸序列至少约80％同源的氨基酸序列的重链可变区、和包含与SEQ ID NO:120所示氨基酸序列至少约80％同源的氨基酸序列的轻链可变区。
46.实施方式45的抗体或其抗原结合部分，该抗体或其抗原结合部分包含：包含SEQ ID NO:119所示氨基酸序列的重链可变区、和包含SEQ ID NO:120所示氨基酸序列的轻链可变区。
47.实施方式13-15、26-28和37-39中任一项的抗体或其抗原结合部分，其中修饰选自缺失、插入、取代、及其组合。
48.实施方式13-15、26-28和37-39中任一项的抗体或其抗原结合部分，其中其修饰由不超过2、不超过3、不超过4、或不超过5个修饰组成。
49.实施方式1-48中任一项的抗体或其抗原结合部分，该抗体或其抗原结合部分与结合于人MHC分子的Foxp3肽的N-末端结合。
50.实施方式1-48中任一项的抗体或其抗原结合部分，该抗体或其抗原结合部分与结合于人MHC分子的Foxp3肽的C-末端结合。
51.实施方式1-50中任一项的抗体或其抗原结合部分，该抗体或其抗原结合部分以约1x 10-7M或更低的结合亲和力(KD)与Foxp3肽/MHC复合物结合。
52.一种分离的抗体或其抗原结合部分，该抗体或其抗原结合部分与参考抗体或抗原结合部分交叉竞争对结合于人MHC分子的Foxp3肽的结合，该参考抗体或抗原结合部分包含：
(a)包含SEQ ID NO:9所示氨基酸序列的重链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:10所示氨基酸序列的重链可变区CDR2；包含SEQ ID NO:11所示氨基酸序列的重链可变区CDR3；包含SEQ ID NO:12所示氨基酸序列的轻链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:13所示氨基酸序列的轻链可变区CDR2；和包含SEQ ID NO:14所示氨基酸序列的轻链可变区CDR3；
(b)包含SEQ ID NO:15所示氨基酸序列的重链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:16所示氨基酸序列的重链可变区CDR2；包含SEQ ID NO:17所示氨基酸序列的重链可变区CDR3；包含SEQ ID NO:18所示氨基酸序列的轻链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:19所示氨基酸序列的轻链可变区CDR2；和包含SEQ ID NO:20所示氨基酸序列的轻链可变区CDR3；
(c)包含SEQ ID NO:21所示氨基酸序列的重链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:22所示氨基酸序列的重链可变区CDR2；包含SEQ ID NO:23所示氨基酸序列的重链可变区CDR3；包含SEQ ID NO:24所示氨基酸序列的轻链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:25所示氨基酸序列的轻链可变区CDR2；和包含SEQ ID NO:26所示氨基酸序列的轻链可变区CDR3；
(d)包含SEQ ID NO:27所示氨基酸序列的重链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:28所示氨基酸序列的重链可变区CDR2；包含SEQ ID NO:29所示氨基酸序列的重链可变区CDR3；包含SEQ ID NO:30所示氨基酸序列的轻链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:31所示氨基酸序列的轻链可变区CDR2；和包含SEQ ID NO:32所示氨基酸序列的轻链可变区CDR3；
(e)包含SEQ ID NO:33所示氨基酸序列的重链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:34所示氨基酸序列的重链可变区CDR2；包含SEQ ID NO:35所示氨基酸序列的重链可变区CDR3；包含SEQ ID NO:36所示氨基酸序列的轻链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:37所示氨基酸序列的轻链可变区CDR2；和包含SEQ ID NO:38所示氨基酸序列的轻链可变区CDR3；
(f)包含SEQ ID NO:39所示氨基酸序列的重链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:40所示氨基酸序列的重链可变区CDR2；包含SEQ ID NO:41所示氨基酸序列的重链可变区CDR3；包含SEQ ID NO:42所示氨基酸序列的轻链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:43所示氨基酸序列的轻链可变区CDR2；和包含SEQ ID NO:44所示氨基酸序列的轻链可变区CDR3；
(g)包含SEQ ID NO:45所示氨基酸序列的重链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:46所示氨基酸序列的重链可变区CDR2；包含SEQ ID NO:47所示氨基酸序列的重链可变区CDR3；包含SEQ ID NO:48所示氨基酸序列的轻链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:49所示氨基酸序列的轻链可变区CDR2；和包含SEQ ID NO:50所示氨基酸序列的轻链可变区CDR3；
(h)包含SEQ ID NO:51所示氨基酸序列的重链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:52所示氨基酸序列的重链可变区CDR2；包含SEQ ID NO:53所示氨基酸序列的重链可变区CDR3；包含SEQ ID NO:54所示氨基酸序列的轻链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:55所示氨基酸序列的轻链可变区CDR2；和包含SEQ ID NO:56所示氨基酸序列的轻链可变区CDR3；
(i)包含SEQ ID NO:57所示氨基酸序列的重链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:58所示氨基酸序列的重链可变区CDR2；包含SEQ ID NO:59所示氨基酸序列的重链可变区CDR3；包含SEQ ID NO:60所示氨基酸序列的轻链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:61所示氨基酸序列的轻链可变区CDR2；和包含SEQ ID NO:62所示氨基酸序列的轻链可变区CDR3；
(j)包含SEQ ID NO:63所示氨基酸序列的重链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:64所示氨基酸序列的重链可变区CDR2；包含SEQ ID NO:65所示氨基酸序列的重链可变区CDR3；包含SEQ ID NO:66所示氨基酸序列的轻链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:67所示氨基酸序列的轻链可变区CDR2；和包含SEQ ID NO:68所示氨基酸序列的轻链可变区CDR3；
(k)包含SEQ ID NO:69所示氨基酸序列的重链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:70所示氨基酸序列的重链可变区CDR2；包含SEQ ID NO:71所示氨基酸序列的重链可变区CDR3；包含SEQ ID NO:72所示氨基酸序列的轻链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:73所示氨基酸序列的轻链可变区CDR2；和包含SEQ ID NO:74所示氨基酸序列的轻链可变区CDR3；
(l)包含SEQ ID NO:75所示氨基酸序列的重链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:76所示氨基酸序列的重链可变区CDR2；包含SEQ ID NO:77所示氨基酸序列的重链可变区CDR3；包含SEQ ID NO:78所示氨基酸序列的轻链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:79所示氨基酸序列的轻链可变区CDR2；和包含SEQ ID NO:80所示氨基酸序列的轻链可变区CDR3；
(m)包含SEQ ID NO:81所示氨基酸序列的重链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:82所示氨基酸序列的重链可变区CDR2；包含SEQ ID NO:83所示氨基酸序列的重链可变区CDR3；包含SEQ ID NO:84所示氨基酸序列的轻链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:85所示氨基酸序列的轻链可变区CDR2；和包含SEQ ID NO:86所示氨基酸序列的轻链可变区CDR3；或
(n)包含SEQ ID NO:87所示氨基酸序列的重链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:88所示氨基酸序列的重链可变区CDR2；包含SEQ ID NO:89所示氨基酸序列的重链可变区CDR3；包含SEQ ID NO:90所示氨基酸序列的轻链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:91所示氨基酸序列的轻链可变区CDR2；和包含SEQ ID NO:92所示氨基酸序列的轻链可变区CDR3，并且
其中该交叉竞争抗体或其抗原结合部分以约5x 10-7M或更低的结合亲和力(KD)与Foxp3肽/MHC复合物特异性地结合。
53.一种分离的抗体或其抗原结合部分，该抗体或其抗原结合部分与参考抗体或抗原结合部分结合到与MHC分子结合的Foxp3肽上的相同表位，该参考抗体或抗原结合部分包含：
(a)包含SEQ ID NO:9所示氨基酸序列的重链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:10所示氨基酸序列的重链可变区CDR2；包含SEQ ID NO:11所示氨基酸序列的重链可变区CDR3；包含SEQ ID NO:12所示氨基酸序列的轻链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:13所示氨基酸序列的轻链可变区CDR2；和包含SEQ ID NO:14所示氨基酸序列的轻链可变区CDR3；
(b)包含SEQ ID NO:15所示氨基酸序列的重链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:16所示氨基酸序列的重链可变区CDR2；包含SEQ ID NO:17所示氨基酸序列的重链可变区CDR3；包含SEQ ID NO:18所示氨基酸序列的轻链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:19所示氨基酸序列的轻链可变区CDR2；和包含SEQ ID NO:20所示氨基酸序列的轻链可变区CDR3；
(c)包含SEQ ID NO:21所示氨基酸序列的重链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:22所示氨基酸序列的重链可变区CDR2；包含SEQ ID NO:23所示氨基酸序列的重链可变区CDR3；包含SEQ ID NO:24所示氨基酸序列的轻链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:25所示氨基酸序列的轻链可变区CDR2；和包含SEQ ID NO:26所示氨基酸序列的轻链可变区CDR3；
(d)包含SEQ ID NO:27所示氨基酸序列的重链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:28所示氨基酸序列的重链可变区CDR2；包含SEQ ID NO:29所示氨基酸序列的重链可变区CDR3；包含SEQ ID NO:30所示氨基酸序列的轻链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:31所示氨基酸序列的轻链可变区CDR2；和包含SEQ ID NO:32所示氨基酸序列的轻链可变区CDR3；
(e)包含SEQ ID NO:33所示氨基酸序列的重链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:34所示氨基酸序列的重链可变区CDR2；包含SEQ ID NO:35所示氨基酸序列的重链可变区CDR3；包含SEQ ID NO:36所示氨基酸序列的轻链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:37所示氨基酸序列的轻链可变区CDR2；和包含SEQ ID NO:38所示氨基酸序列的轻链可变区CDR3；
(f)包含SEQ ID NO:39所示氨基酸序列的重链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:40所示氨基酸序列的重链可变区CDR2；包含SEQ ID NO:41所示氨基酸序列的重链可变区CDR3；包含SEQ ID NO:42所示氨基酸序列的轻链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:43所示氨基酸序列的轻链可变区CDR2；和包含SEQ ID NO:44所示氨基酸序列的轻链可变区CDR3；
(g)包含SEQ ID NO:45所示氨基酸序列的重链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:46所示氨基酸序列的重链可变区CDR2；包含SEQ ID NO:47所示氨基酸序列的重链可变区CDR3；包含SEQ ID NO:48所示氨基酸序列的轻链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:49所示氨基酸序列的轻链可变区CDR2；和包含SEQ ID NO:50所示氨基酸序列的轻链可变区CDR3；
(h)包含SEQ ID NO:51所示氨基酸序列的重链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:52所示氨基酸序列的重链可变区CDR2；包含SEQ ID NO:53所示氨基酸序列的重链可变区CDR3；包含SEQ ID NO:54所示氨基酸序列的轻链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:55所示氨基酸序列的轻链可变区CDR2；和包含SEQ ID NO:56所示氨基酸序列的轻链可变区CDR3；
(i)包含SEQ ID NO:57所示氨基酸序列的重链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:58所示氨基酸序列的重链可变区CDR2；包含SEQ ID NO:59所示氨基酸序列的重链可变区CDR3；包含SEQ ID NO:60所示氨基酸序列的轻链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:61所示氨基酸序列的轻链可变区CDR2；和包含SEQ ID NO:62所示氨基酸序列的轻链可变区CDR3；
(j)包含SEQ ID NO:63所示氨基酸序列的重链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:64所示氨基酸序列的重链可变区CDR2；包含SEQ ID NO:65所示氨基酸序列的重链可变区CDR3；包含SEQ ID NO:66所示氨基酸序列的轻链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:67所示氨基酸序列的轻链可变区CDR2；和包含SEQ ID NO:68所示氨基酸序列的轻链可变区CDR3；
(k)包含SEQ ID NO:69所示氨基酸序列的重链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:70所示氨基酸序列的重链可变区CDR2；包含SEQ ID NO:71所示氨基酸序列的重链可变区CDR3；包含SEQ ID NO:72所示氨基酸序列的轻链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:73所示氨基酸序列的轻链可变区CDR2；和包含SEQ ID NO:74所示氨基酸序列的轻链可变区CDR3；
(l)包含SEQ ID NO:75所示氨基酸序列的重链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:76所示氨基酸序列的重链可变区CDR2；包含SEQ ID NO:77所示氨基酸序列的重链可变区CDR3；包含SEQ ID NO:78所示氨基酸序列的轻链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:79所示氨基酸序列的轻链可变区CDR2；和包含SEQ ID NO:80所示氨基酸序列的轻链可变区CDR3；
(m)包含SEQ ID NO:81所示氨基酸序列的重链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:82所示氨基酸序列的重链可变区CDR2；包含SEQ ID NO:83所示氨基酸序列的重链可变区CDR3；包含SEQ ID NO:84所示氨基酸序列的轻链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:85所示氨基酸序列的轻链可变区CDR2；和包含SEQ ID NO:86所示氨基酸序列的轻链可变区CDR3；或
(n)包含SEQ ID NO:87所示氨基酸序列的重链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:88所示氨基酸序列的重链可变区CDR2；包含SEQ ID NO:89所示氨基酸序列的重链可变区CDR3；包含SEQ ID NO:90所示氨基酸序列的轻链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:91所示氨基酸序列的轻链可变区CDR2；和包含SEQ ID NO:92所示氨基酸序列的轻链可变区CDR3。
54.一种分离的抗体或其抗原结合部分，该抗体或其抗原结合部分与参考抗体或抗原结合部分交叉竞争对结合于MHC分子的Foxp3肽的结合，该参考抗体或抗原结合部分包含：
(a)包含SEQ ID NO:93所示氨基酸序列的重链可变区、和包含SEQ ID NO:94所示氨基酸序列的轻链可变区；
(b)包含SEQ ID NO:95所示氨基酸序列的重链可变区、和包含SEQ ID NO:96所示氨基酸序列的轻链可变区；
(c)包含SEQ ID NO:97所示氨基酸序列的重链可变区、和包含SEQ ID NO:98所示氨基酸序列的轻链可变区；
(d)包含SEQ ID NO:99所示氨基酸序列的重链可变区、和包含SEQ ID NO:100所示氨基酸序列的轻链可变区；
(e)包含SEQ ID NO:101所示氨基酸序列的重链可变区、和包含SEQ ID NO:102所示氨基酸序列的轻链可变区；
(f)包含SEQ ID NO:103所示氨基酸序列的重链可变区、和包含SEQ ID NO:104所示氨基酸序列的轻链可变区；
(g)包含SEQ ID NO:105所示氨基酸序列的重链可变区、和包含SEQ ID NO:106所示氨基酸序列的轻链可变区；
(h)包含SEQ ID NO:107所示氨基酸序列的重链可变区、和包含SEQ ID NO:108所示氨基酸序列的轻链可变区；
(i)包含SEQ ID NO:109所示氨基酸序列的重链可变区、和包含SEQ ID NO:110所示氨基酸序列的轻链可变区；
(j)包含SEQ ID NO:111所示氨基酸序列的重链可变区、和包含SEQ ID NO:112所示氨基酸序列的轻链可变区；
(k)包含SEQ ID NO:113所示氨基酸序列的重链可变区、和包含SEQ ID NO:114所示氨基酸序列的轻链可变区；
(l)包含SEQ ID NO:115所示氨基酸序列的重链可变区、和包含SEQ ID NO:116所示氨基酸序列的轻链可变区；
(m)包含SEQ ID NO:117所示氨基酸序列的重链可变区、和包含SEQ ID NO:118所示氨基酸序列的轻链可变区；或
(n)包含SEQ ID NO:119所示氨基酸序列的重链可变区、和包含SEQ ID NO:120所示氨基酸序列的轻链可变区，并且
其中该交叉竞争抗体或其抗原结合部分以约5x 10-7M或更低的结合亲和力(KD)与Foxp3肽/MHC复合物特异性地结合。
55.一种分离的抗体或其抗原结合部分，该抗体或其抗原结合部分与参考抗体或抗原结合部分结合到与MHC分子结合的Foxp3肽上的相同表位，该参考抗体或抗原结合部分包含：
(a)包含SEQ ID NO:93所示氨基酸序列的重链可变区、和包含SEQ ID NO:94所示氨基酸序列的轻链可变区；
(b)包含SEQ ID NO:95所示氨基酸序列的重链可变区、和包含SEQ ID NO:96所示氨基酸序列的轻链可变区；
(c)包含SEQ ID NO:97所示氨基酸序列的重链可变区、和包含SEQ ID NO:98所示氨基酸序列的轻链可变区；
(d)包含SEQ ID NO:99所示氨基酸序列的重链可变区、和包含SEQ ID NO:100所示氨基酸序列的轻链可变区；
(e)包含SEQ ID NO:101所示氨基酸序列的重链可变区、和包含SEQ ID NO:102所示氨基酸序列的轻链可变区；
(f)包含SEQ ID NO:103所示氨基酸序列的重链可变区、和包含SEQ ID NO:104所示氨基酸序列的轻链可变区；
(g)包含SEQ ID NO:105所示氨基酸序列的重链可变区、和包含SEQ ID NO:106所示氨基酸序列的轻链可变区；
(h)包含SEQ ID NO:107所示氨基酸序列的重链可变区、和包含SEQ ID NO:108所示氨基酸序列的轻链可变区；
(i)包含SEQ ID NO:109所示氨基酸序列的重链可变区、和包含SEQ ID NO:110所示氨基酸序列的轻链可变区；
(j)包含SEQ ID NO:111所示氨基酸序列的重链可变区、和包含SEQ ID NO:112所示氨基酸序列的轻链可变区；
(k)包含SEQ ID NO:113所示氨基酸序列的重链可变区、和包含SEQ ID NO:114所示氨基酸序列的轻链可变区；
(l)包含SEQ ID NO:115所示氨基酸序列的重链可变区、和包含SEQ ID NO:116所示氨基酸序列的轻链可变区；
(m)包含SEQ ID NO:117所示氨基酸序列的重链可变区、和包含SEQ ID NO:118所示氨基酸序列的轻链可变区；或
(n)包含SEQ ID NO:119所示氨基酸序列的重链可变区、和包含SEQ ID NO:120所示氨基酸序列的轻链可变区。
56.实施方式52-55中任一项的抗体或其抗原结合部分，其中该人MHC分子是HLA分子。
57.实施方式56的抗体或其抗原结合部分，其中该HLA分子是HLA I类分子。
58.实施方式57的抗体或其抗原结合部分，其中该HLA I类分子是HLA-A。
59.实施方式58的抗体或其抗原结合部分，其中该HLA-A是HLA-A2。
60.实施方式59的抗体或其抗原结合部分，其中该HLA-A2是HLA-A*02:01。
61.实施方式52-60中任一项的抗体或其抗原结合部分，其中该Foxp3肽选自具有SEQ ID NO:8所示氨基酸序列的Foxp3-7或其一部分；具有SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的Foxp3-1或其一部分、具有SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的Foxp3-2或其一部分、具有SEQ IDNO:4所示氨基酸序列的Foxp3-3或其一部分、具有SEQ ID NO:5所示氨基酸序列的Foxp3-4或其一部分、具有SEQ ID NO:6所示氨基酸序列的Foxp3-5或其一部分、和具有SEQ ID NO:7所示氨基酸序列的Foxp3-6或其一部分。
62.实施方式61的抗体或其抗原结合部分，其中该Foxp3肽是Foxp3-7或其一部分。
63.实施方式52-62中任一项的抗体或其抗原结合部分，其中该参考抗体或其抗原结合部分包含：包含SEQ ID NO:103所示氨基酸序列的重链可变区、和包含SEQ ID NO:104所示氨基酸序列的轻链可变区。
64.实施方式61的抗体或其抗原结合部分，其中该Foxp3肽是Foxp3-2或其一部分。
65.实施方式61的抗体或其抗原结合部分，其中Foxp3肽是Foxp3-4或其一部分。
66.前述实施方式中任一项的抗体或其抗原结合部分，其中该抗体包含人可变区框架区。
67.前述实施方式中任一项的抗体或其抗原结合部分，该抗体或其抗原结合部分是全人抗体或其抗原结合部分。
68.实施方式1-66中任一项的抗体或其抗原结合部分，该抗体或其抗原结合部分是嵌合抗体或其抗原结合部分。
69.实施方式1-66中任一项的抗体或其抗原结合部分，该抗体或其抗原结合部分是人源化抗体或其抗原结合部分。
70.前述实施方式中任一项的抗体或其抗原结合部分，其中抗体的抗原结合部分是Fab、Fab'、F(ab')2、Fv或单链Fv(scFv)。
71.前述实施方式中任一项的抗体或其抗原结合部分，该抗体或其抗原结合部分是IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4同种型。
72.实施方式71的抗体或其抗原结合部分，该抗体或其抗原结合部分是IgG1同种型。
73.前述实施方式中任一项的抗原或其抗原结合部分，该抗体或其抗原结合部分包含一种或多种翻译后修饰。
74.实施方式73的抗体或其抗原结合部分，其中所述一种或多种翻译后修饰包含无岩藻糖基化。
75.实施方式74的抗体或其抗原结合部分，该抗体或其抗原结合部分包含无岩藻糖基化的Fc区。
76.一种组合物，其包含前述实施方式中任一项的抗体或其抗原结合部分，和药学上可接受的载体。
77.一种免疫缀合物，其包含连接到治疗剂的实施方式1-75中任一项的抗体或其抗原结合部分。
78.实施方式77的免疫缀合物，其中所述治疗剂是药物、细胞毒素、或放射性同位素。
79.一种组合物，其包含实施方式77或78的免疫缀合物和药学上可接受的载体。
80.一种双特异性分子，其包含连接到第二功能性部分的实施方式1-75中任一项的抗体或其抗原结合部分。
81.实施方式80的双特异性分子，其中该第二功能性部分具有与该抗体或其抗原结合部分不同的结合特异性。
82.实施方式80或81的双特异性分子，其识别结合于MHC分子的Foxp3肽和细胞表面蛋白。
83.实施方式82的双特异性分子，其中该细胞表面蛋白是CD3或CD16。
84.一种组合物，其包含实施方式80-83中任一项的双特异性分子和药学上可接受的载体。
85.一种分离的核酸，其编码实施方式1-75中任一项的抗体或其抗原结合部分。
86.一种表达载体，其包含实施方式85的核酸分子。
87.一种宿主细胞，其包含实施方式86的表达载体。
88.一种用于检测全细胞或组织中的Foxp3的方法，其包含：
(a)使细胞或组织与抗体或其抗原结合部分接触，该抗体或其抗原结合部分与结合于人MHC分子的Foxp3肽结合，其中抗体或其抗原结合部分包含可检测标记；和
(b)通过测量与该细胞或组织相关的可检测标记的量来测定结合于该细胞或组织的带标记的抗体或其抗原结合部分的量，其中结合的抗体或其抗原结合部分的量表示该细胞或组织中Foxp3的量。
89.实施方式88的方法，其中该人MHC分子是HLA分子。
90.实施方式89的方法，其中该HLA分子是HLA I类分子。
91.实施方式90的方法，其中该HLA I类分子是HLA-A。
92.实施方式91的方法，其中该HLA-A是HLA-A2。
93.实施方式92的方法，其中该HLA-A2是HLA-A*02:01。
94.实施方式88-93中任一项的方法，其中Foxp3肽选自具有SEQ ID NO:8所示氨基酸序列的Foxp3-7或其一部分；具有SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的Foxp3-1或其一部分、具有SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的Foxp3-2或其一部分、具有SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的Foxp3-3或其一部分、具有SEQ ID NO:5所示氨基酸序列的Foxp3-4或其一部分、具有SEQID NO:6所示氨基酸序列的Foxp3-5或其一部分、和具有SEQ ID NO:7所示氨基酸序列的Foxp3-6或其一部分。
95.实施方式94的方法，其中Foxp3肽是Foxp3-7或其一部分。
96.实施方式94的方法，其中Foxp3肽是Foxp3-2或其一部分。
97.实施方式94的方法，其中Foxp3肽是Foxp3-4或其一部分。
98.实施方式88-97中任一项的方法，其中抗体或其抗原结合部分是实施方式1-75中任一项的抗体或其抗原结合部分。
99.一种嵌合抗原受体(CAR)，其对结合于人MHC分子的Foxp3肽具有特异性。
100.实施方式99的CAR，其中所述人MHC分子是HLA分子。
101.实施方式100的CAR，其中所述HLA分子是HLA I类分子。
102.实施方式101的CAR，其中所述HLA I类分子是HLA-A。
103.实施方式102的CAR，其中所述HLA-A是HLA-A2。
104.实施方式103的CAR，其中所述HLA-A2是HLA-A*02:01。
105.实施方式99-104中任一项的CAR，其中Foxp3肽选自具有SEQ ID NO:8所示氨基酸序列的Foxp3-7或其一部分；具有SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的Foxp3-1或其一部分、具有SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的Foxp3-2或其一部分、具有SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的Foxp3-3或其一部分、具有SEQ ID NO:5所示氨基酸序列的Foxp3-4或其一部分、具有SEQ ID NO:6所示氨基酸序列的Foxp3-5或其一部分、和具有SEQ ID NO:7所示氨基酸序列的Foxp3-6或其一部分。
106.实施方式105的CAR，其中Foxp3肽是Foxp3-7或其一部分。
107.实施方式105的CAR，其中Foxp3肽是Foxp3-2或其一部分。
108.实施方式105的CAR，其中Foxp3肽是Foxp3-4或其一部分。
109.实施方式99-108中任一项的CAR，其中CAR包含抗原结合部分，该抗原结合部分包含重链可变区和轻链可变区。
110.实施方式109的CAR，其中CAR包含重链可变区和轻链可变区之间的接头。
111.实施方式110的CAR，其中接头包含SEQ ID NO:135所示的氨基酸序列。
112.实施方式99-111中任一项的CAR，其中CAR包含实施方式1-75中任一项的抗原结合部分。
113.实施方式109-112中任一项的CAR，其中抗原结合部分包含单链可变片段(scFv)。
114.实施方式113的CAR，其中该scFv是人scFv。
115.实施方式114的CAR，其中该人scFv包含选自SEQ ID NO:121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、和134的氨基酸序列。
116.实施方式115的CAR，其中该人scFv包含SEQ ID NO:126所示的氨基酸序列。
117.实施方式109-112中任一项的CAR，其中该抗原结合部分包含任选交联的Fab。
118.实施方式109-112中任一项的CAR，其中该抗原结合部分包含F(ab)2。
119.一种分离的核酸，其编码实施方式99-118中任一项的CAR。
120.一种载体，其包含实施方式119的分离的核酸。
121.一种宿主细胞，其包含实施方式119的核酸。
122.实施方式121的宿主细胞，其中该宿主细胞是T细胞。
123.一种杀伤表达Foxp3的细胞的方法，其包括使表达Foxp3的细胞与实施方式1-75中任一项的抗体或其抗原结合部分或者包含其的组合物接触。
124.实施方式1-75中任一项的抗体或其抗原结合部分或者包含其的组合物杀伤表达Foxp3的细胞的用途。
125.实施方式1-75中任一项的抗体或其抗原结合部分或者包含其的组合物，用于杀伤表达Foxp3的细胞。
126.一种杀伤表达Foxp3的细胞的方法，其包括使表达Foxp3的细胞与实施方式99-118中任一项的CAR或包含其的组合物接触。
127.实施方式99-118中任一项的CAR或包含其的组合物杀伤表达Foxp3的细胞的用途。
128.实施方式99-118中任一项的CAR或包含其的组合物，用于杀伤表达Foxp3的细胞。
129.一种杀伤表达Foxp3的细胞的方法，其包括使表达Foxp3的细胞与实施方式80-83中任一项的双特异性抗体或包含其的组合物接触。
130.实施方式80-83中任一项的双特异性抗体或包含其的组合物杀伤表达Foxp3的细胞的用途。
131.实施方式80-83中任一项的双特异性抗体或包含其的组合物，用于杀伤表达Foxp3的细胞。
132.一种杀伤表达Foxp3的细胞的方法，其包括使表达Foxp3的细胞与实施方式77或78的免疫缀合物或包含其的组合物接触。
133.实施方式77或78的免疫缀合物或包含其的组合物杀伤表达Foxp3的细胞的用途。
134.实施方式77或78的免疫缀合物或包含其的组合物，用于杀伤表达Foxp3的细胞。
135.实施方式123、126、129、和132中任一项的方法，其中表达Foxp3的细胞是选自以下的T细胞：CD4+ T细胞、CD25高T细胞、CD127低T细胞、Foxp3高T细胞、及其组合。
136.实施方式124、127、130、和133中任一项的用途，其中表达Foxp3的细胞是选自以下的T细胞：CD4+ T细胞、CD25高T细胞、CD127低T细胞、Foxp3高T细胞、及其组合。
137.实施方式125的抗体，其中表达Foxp3的细胞是选自以下的T细胞：CD4+ T细胞、CD25高T细胞、CD127低T细胞、Foxp3高T细胞、及其组合。
138.实施方式131的双特异性抗体，其中表达Foxp3的细胞是选自以下的T细胞：CD4+ T细胞、CD25高T细胞、CD127低T细胞、Foxp3高T细胞、及其组合。
139.实施方式134的免疫缀合物，其中表达Foxp3的细胞是选自以下的T细胞：CD4+T细胞、CD25高T细胞、CD127低T细胞、Foxp3高T细胞、及其组合。
140.一种诱导受试者的免疫应答的方法，其包括将实施方式1-75中任一项的抗体或其抗原结合部分或者包含其的组合物施用于受试者。
141.实施方式1-75中任一项的抗体或其抗原结合部分或者包含其的组合物诱导受试者的免疫应答的用途。
142.实施方式1-75中任一项的抗体或其抗原结合部分或者包含其的组合物，用于诱导免疫应答。
143.一种诱导受试者的免疫应答的方法，其包括将实施方式99-118中任一项的CAR或包含其的组合物施用于受试者。
144.实施方式99-118中任一项的CAR或包含其的组合物诱导受试者的免疫应答的用途。
145.实施方式99-118中任一项的CAR或包含其的组合物，用于诱导免疫应答。
146.一种诱导受试者的免疫应答的方法，其包括将实施方式80-83中任一项的双特异性抗体或包含其的组合物施用于受试者。
147.实施方式80-83中任一项的双特异性抗体或包含其的组合物诱导受试者的免疫应答的用途。
148.实施方式80-83中任一项的双特异性抗体或包含其的组合物，用于诱导免疫应答。
149.一种诱导受试者的免疫应答的方法，其包括将实施方式77或78的免疫缀合物或包含其的组合物施用于受试者。
150.实施方式77或78的免疫缀合物或包含其的组合物诱导受试者的免疫应答的用途。
151.实施方式77或78的免疫缀合物或包含其的组合物，用于诱导免疫应答。
152.一种选择性地抑制受试者的T细胞的方法，其包括将实施方式1-75中任一项的抗体或其抗原结合部分或者包含其的组合物施用于受试者，其中T细胞选自CD4+ T细胞、CD25高T细胞、CD127低T细胞、Foxp3高T细胞、及其组合。
153.实施方式1-75中任一项的抗体或其抗原结合部分或者包含其的组合物选择性地抑制受试者的T细胞的用途，其中T细胞选自CD4+T细胞、CD25高T细胞、CD127低T细胞、Foxp3高T细胞、及其组合。
154.实施方式1-75中任一项的抗体或其抗原结合部分或者包含其的组合物，用于选择性地抑制T细胞，其中T细胞选自CD4+ T细胞、CD25高T细胞、CD127低T细胞、Foxp3高T细胞、及其组合。
155.一种选择性地抑制受试者的T细胞的方法，其包括将实施方式99-118中任一项的CAR或包含其的组合物施用于受试者，其中T细胞选自CD4+ T细胞、CD25高T细胞、CD127低T细胞、Foxp3高T细胞、及其组合。
156.实施方式99-118中任一项的CAR或包含其的组合物选择性地抑制受试者的T细胞的用途，其中T细胞选自CD4+ T细胞、CD25高T细胞、CD127低T细胞、Foxp3高T细胞、及其组合。
157.实施方式99-118中任一项的CAR或包含其的组合物，用于选择性地抑制选自以下的T细胞：CD4+ T细胞、CD25高T细胞、CD127低T细胞、Foxp3高T细胞、及其组合。
158.一种选择性地抑制受试者的T细胞的方法，其包括将实施方式80-83中任一项的双特异性抗体或包含其的组合物施用于受试者。
159.实施方式80-83中任一项的双特异性抗体或包含其的组合物选择性地抑制受试者的T细胞的用途，其中T细胞选自CD4+ T细胞、CD25高T细胞、CD127低T细胞、Foxp3高T细胞、及其组合。
160.实施方式80-83中任一项的双特异性抗体或包含其的组合物，用于选择性地抑制选自以下的T细胞：CD4+ T细胞、CD25高T细胞、CD127低T细胞、Foxp3高T细胞、及其组合。
161.一种选择性地抑制受试者的T细胞的方法，其包括将实施方式77或78的免疫缀合物或包含其的组合物施用于受试者，其中T细胞选自CD4+ T细胞、CD25高T细胞、CD127低T细胞、Foxp3高T细胞、及其组合。
162.实施方式77或78的免疫缀合物或包含其的组合物选择性地抑制受试者的T细胞的用途，其中T细胞选自CD4+ T细胞、CD25高T细胞、CD127低T细胞、Foxp3高T细胞、及其组合。
163.实施方式77或78的免疫缀合物或包含其的组合物，用于选择性地抑制选自以下的T细胞：CD4+ T细胞、CD25高T细胞、CD127低T细胞、Foxp3高T细胞、及其组合。
164.实施方式152、155、158、和161中任一项的方法，其中受试者患有癌症。
165.实施方式153、154、159、和162中任一项的用途，其中受试者患有癌症。
166.实施方式154的抗体或其抗原结合部分，其中受试者患有癌症。
167.实施方式157的CAR，其中受试者患有癌症。
168.实施方式160的双特异性抗体，其中受试者患有癌症。
169.实施方式163的免疫缀合物，其中受试者患有癌症。
170.实施方式152、155、158、和161中任一项的方法，其包括以下一种或多种：
(i)减少T细胞的数量，
(ii)消耗T细胞，
(iii)抑制T细胞的免疫抑制活性，和
(iv)阻断T细胞运输到淋巴结中。
171.实施方式152、155、158、161和170中任一项的方法，其中T细胞是调节性T细胞。
172.实施方式153、156、159、和162中任一项的用途，其包括以下一种或多种：
(i)减少T细胞的数量，
(ii)消耗T细胞，
(iii)抑制T细胞的免疫抑制活性，和
(iv)阻断T细胞运输到淋巴结中。
173.实施方式153、156、159、162、和172中任一项的用途，其中T细胞是调节性T细胞。
174.实施方式154的抗体或其抗原结合部分，该抗体或其抗原结合部分
(i)减少T细胞的数量，
(ii)消耗T细胞，
(iii)抑制T细胞的免疫抑制活性，和/或
(iv)阻断调节性T细胞运输到淋巴结中。
175.实施方式154或173的抗体或其抗原结合部分，其中T细胞是调节性T细胞。
176.实施方式157的CAR，其
(i)减少T细胞的数量，
(ii)消耗T细胞，
(iii)抑制T细胞的免疫抑制活性，和/或
(iv)阻断T细胞运输到淋巴结中。
177.实施方式157或176的CAR，其中T细胞是调节性T细胞。
178.实施方式160的双特异性抗体，其
(i)减少T细胞的数量，
(ii)消耗T细胞，
(iii)抑制T细胞的免疫抑制活性，和/或
(iv)阻断T细胞运输到淋巴结中。
179.实施方式160或178的双特异性抗体，其中T细胞是调节性T细胞。
180.实施方式163的免疫缀合物，其
(i)减少T细胞的数量，
(ii)消耗T细胞，
(iii)抑制T细胞的免疫抑制活性，和/或
(iv)阻断T细胞运输到淋巴结中。
181.实施方式163或179的免疫缀合物，其中T细胞是调节性T细胞。
182.一种治疗癌症的方法，其包括将有效量的实施方式1-75中任一项的抗体或其抗原结合部分或者包含其的组合物施用于患有癌症的受试者，从而诱导受试者的癌细胞的死亡。
183.一种治疗癌症的方法，其包括将有效量的实施方式99-118中任一项的CAR或包含其的组合物施用于患有癌症的受试者，从而诱导受试者的癌细胞的死亡。
184.一种治疗癌症的方法，其包括将有效量的实施方式80-83中任一项的双特异性抗体或包含其的组合物施用于患有癌症的受试者，从而诱导受试者的癌细胞的死亡。
185.一种治疗癌症的方法，其包括将有效量的实施方式77或78的免疫缀合物或包含其的组合物施用于患有癌症的受试者，从而诱导受试者的癌细胞的死亡。
186.一种治疗癌症的方法，其包括将有效量的实施方式1-75中任一项的抗体或其抗原结合部分、实施方式99-118中任一项的CAR、实施方式80-83中任一项的双特异性抗体、实施方式77或78的免疫缀合物、或包含其的组合物施用于患有癌症的受试者，从而抑制受试者的T细胞。
187.实施方式186的方法，其中受抑制的T细胞是T调节性细胞。
188.实施方式186或187的方法，其中受抑制的T细胞是CD4+ T细胞、CD25高T细胞、CD127低T细胞、Foxp3高T细胞、或表现出两种或多种所述标志物的T细胞。
189.实施方式182-189中任一项的方法，其中该癌症选自乳腺癌、卵巢癌、黑色素瘤、肺癌、胰腺癌、胃癌、结肠癌、成胶质细胞瘤、肾癌、肝癌、淋巴瘤、白血病、骨髓瘤、肉瘤、及其组合。
190.实施方式182-189中任一项的方法，其中该受试者是人。
191.实施方式182-190中任一项的方法，其中该受试者接受抗癌免疫疗法。
192.实施方式182-191中任一项的方法，其中癌细胞和/或T细胞表达Foxp3。
193.实施方式1-75中任一项的抗体或其抗原结合部分或者包含其的组合物用于治疗癌症的用途。
194.实施方式99-118中任一项的CAR或包含其的组合物用于治疗癌症的用途。
195.实施方式80-83中任一项的双特异性抗体或包含其的组合物用于治疗癌症的用途。
196.实施方式77或78的免疫缀合物或包含其的组合物用于治疗癌症的用途。
197.实施方式193-195中任一项的用途，其中该癌症选自乳腺癌、卵巢癌、黑色素瘤、肺癌、胰腺癌、胃癌、结肠癌、成胶质细胞瘤、肾癌、肝癌、淋巴瘤、白血病、骨髓瘤、肉瘤、及其组合。
198.实施方式193-197中任一项的用途，其中该受试者是人。
199.实施方式193-198中任一项的用途，其中该受试者接受抗癌免疫疗法。
200.实施方式193-199中任一项的用途，其中癌细胞表达Foxp3。
201.实施方式1-75中任一项的抗体或其抗原结合部分或者包含其的组合物，用于治疗受试者的癌症。
202.实施方式188的抗体或其抗原结合部分，其中该癌症选自乳腺癌、卵巢癌、黑色素瘤、肺癌、胰腺癌、胃癌、结肠癌、成胶质细胞瘤、肾癌、肝癌、淋巴瘤、白血病、骨髓瘤、肉瘤、及其组合。
203.实施方式201或202的抗体或其抗原结合部分，其中该受试者是人。
204.实施方式201-203中任一项的抗体或其抗原结合部分，其中该受试者接受抗癌免疫疗法。
205.实施方式198-201中任一项的抗体或其抗原结合部分，其中癌细胞表达Foxp3。
206.实施方式99-118中任一项的CAR或包含其的组合物，用于治疗受试者的癌症。
207.实施方式206的CAR，其中该癌症选自乳腺癌、卵巢癌、黑色素瘤、肺癌、胰腺癌、胃癌、结肠癌、成胶质细胞瘤、肾癌、肝癌、淋巴瘤、白血病、骨髓瘤、肉瘤、及其组合。
208.实施方式206或207的CAR，其中该受试者是人。
209.实施方式206-208中任一项的CAR，其中该受试者接受抗癌免疫疗法。
210.实施方式206-209中任一项的CAR，其中癌细胞表达Foxp3。
211.实施方式80-83中任一项的双特异性抗体或包含其的组合物，用于治疗受试者的癌症。
212.实施方式211的双特异性抗体，其中该癌症选自乳腺癌、卵巢癌、黑色素瘤、肺癌、胰腺癌、胃癌、结肠癌、成胶质细胞瘤、肾癌、肝癌、淋巴瘤、白血病、骨髓瘤、肉瘤、及其组合。
213.实施方式211或212的双特异性抗体，其中该受试者是人。
214.实施方式211-213中任一项的双特异性抗体，其中该受试者接受抗癌免疫疗法。
215.实施方式211-214中任一项的双特异性抗体，其中癌细胞表达Foxp3。
216.实施方式77或78的免疫缀合物或包含其的组合物，用于治疗受试者的癌症。
217.实施方式216的免疫缀合物，其中该癌症选自乳腺癌、卵巢癌、黑色素瘤、肺癌、胰腺癌、胃癌、结肠癌、成胶质细胞瘤、肾癌、肝癌、淋巴瘤、白血病、骨髓瘤、肉瘤、及其组合。
218.实施方式216或217的免疫缀合物，其中该受试者是人。
219.实施方式216-218中任一项的免疫缀合物，其中该受试者接受抗癌免疫疗法。
220.实施方式216-219中任一项的免疫缀合物，其中癌细胞表达Foxp3。
221.一种用于治疗癌症的试剂盒，其包含实施方式1-75中任一项的抗体或其抗原结合部分。
222.一种用于治疗癌症的试剂盒，其包含实施方式99-118中任一项的CAR。
223.一种用于治疗癌症的试剂盒，其包含实施方式80-83中任一项的双特异性抗体。
224.一种用于治疗癌症的试剂盒，其包含实施方式77或78的免疫缀合物。
225.实施方式221-224中任一项的试剂盒，其中该癌症选自乳腺癌、卵巢癌、黑色素瘤、肺癌、胰腺癌、胃癌、结肠癌、成胶质细胞瘤、肾癌、肝癌、淋巴瘤、白血病、骨髓瘤、肉瘤、及其组合。
实施例
提出以下实施例，以便为本领域普通技术人员提供如何产生并利用本发明公开主题的抗体、双特异性抗体、包含其的组合物、筛选和治疗方法的完整公开和说明，并无意于限定发明人视作其本发明公开主题的范围。应当理解到，鉴于以上提供的一般性说明，可以实施各种其它的实施方式。
实施例1-对Fox3p衍生的表位特异性的TCR-模拟单克隆抗体
引言
效应T细胞检查点阻断疗法已成为几种癌症的有效疗法，通过激活休眠或消耗的T细胞来杀伤患者的癌细胞。表达CD4、CD25和Foxp3的调节性T细胞(Treg)大量发现于肿瘤组织，并且认为其是抗肿瘤免疫的有效抑制剂和成功免疫疗法的关键障碍。肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)中CD8+ T细胞与Treg的比例降低是各种人类癌症预后不良的指标。在某些情况下，在动物模型和癌症患者中已显示Treg的消耗增强自发和疫苗诱导的抗肿瘤免疫应答。这些研究表明Treg在癌症中具有突出的肿瘤促进作用，并为癌症免疫疗法提供了机会，在癌症免疫疗法中调节Treg功能可激活效应T细胞以杀伤癌细胞。
虽然癌症患者中Treg的消耗已引起强烈关注，但由于Treg不表达可由mAb靶向的特定细胞表面分子，也没有选择性地成药的胞质内通路，因此阻碍了有效应用。已经尝试各种策略用于消耗或干扰Treg功能，其通常集中于使用CD25特异性mAb(达克珠单抗(Daclizumab))和地尼白介素(IL-2和白喉毒素的融合蛋白)靶向CD25(IL-2受体)。此外，也已尝试过通过糖皮质激素诱导的TNF-相关蛋白(GITR)的mAb消除Treg和通过使用抗-CTLA4抗体抑制Treg功能，通过T-reg破坏肿瘤归巢或调节T细胞可塑性。各种癌症的临床研究(其中达克珠单抗和地尼白介素与疫苗组合)，已经证明了相矛盾的结果。这些数据的最佳解释可能是因为CD25和GITR不仅在Treg中表达，而且在活化的CD4和CD8效应T细胞中也表达。通过同时消除活化的效应淋巴细胞，可以减损通过靶向这些分子而导致的Treg消耗的潜在益处。因此，没有其它临床证据支持这些方法的更广泛适用性。最近的体外研究显示，C-C趋化因子受体-4(CCR4)特异性的mAb可选择性地消耗表达更高水平的Foxp3的效应Treg，导致对NY-ESO-1肽特异性的CD8 T细胞应答的增强。去岩藻糖基化的人源化抗-CCR4 mAb——Mogamulizumab已经处于各种癌症的临床试验中。虽然结果有待进行更多研究，但有些数据显示出复杂的结果8-10。除了Treg之外，已知CCR4在活化的T细胞、T辅助细胞2、NK细胞、巨噬细胞和树突状细胞上表达，并且mAb的作用可能是复杂的。环磷酰胺(Cyclophosamide)已证明可选择性抑制Treg，但机制尚不清楚。环磷酰胺因其对肿瘤细胞的细胞毒性而众所周知，因此，临床效果难以仅归因于Treg消耗。显然，非常需要靶向Treg并消除其抑制功能的更具体方法。
Foxp3已鉴定为Treg功能的关键参与者，并且是CD4+CD25+ Treg的最确定标志物。它是Treg细胞谱系分化、维持和重要的抑制功能所必需的。除了在胸腺中产生的天然存在的Treg之外，已经鉴定出诱导型Treg细胞，其在感染和癌症中占优势。有趣的是，除了Foxp3在Treg中的关键作用外，许多癌细胞也表达Foxp3。表达Foxp3的胰腺癌细胞和皮肤T细胞淋巴瘤细胞已显示抑制T细胞增殖。这些研究表明癌细胞可能与Treg共享抑制作用，并且模仿Treg功能可能代表癌症中免疫逃避的新机制。
就其本身而论，没有可消耗Treg的选择性药物。Foxp3将是理想的靶标，除了它不能通过小分子成药并且它是细胞内蛋白质因此抗体疗法不可行。理论上，来自Foxp3蛋白的经降解和加工用于细胞表面递呈的肽可作为TCR识别的靶标。在黑色素瘤小鼠模型中，Nair等用编码Foxp3的mRNA电穿孔的树突状细胞(DC)接种小鼠。接种引发Foxp3-特异性CTL应答，导致肿瘤中Foxp3+ Treg的优先消耗。同时用明确定义的TRP2黑色素瘤抗原(Ag)和Foxp3接种小鼠，增强了疫苗-诱导的针对高转移性B6/F10.9黑色素瘤的保护作用。尽管在该研究中未鉴定出Foxp3衍生的表位，但它证明了使用T细胞方法靶向Foxp3蛋白的可能性。令人鼓舞的是，最近的体外人体研究已显示在HLA-A0201分子的背景下通过人CD8 T细胞鉴定Foxp3-衍生的表位的结果。因此，对Foxp3-衍生的表位特异性的TCR模拟mAb应该能够特异性地和直接地消耗表达Foxp3的Treg和肿瘤细胞，具有双刃剑效应。使用TCRm mAb，证明对人Foxp3特异性的TCRm mAb#32可特异性结合并杀伤表达Foxp3的Treg和肿瘤细胞。通过去除由Treg和肿瘤细胞引起的免疫抑制，Treg的消耗应该极大地释放抗肿瘤免疫力。
方法和材料
1.肽合成
所有肽均购自Genemed Synthesis,Inc.(San Antonio，TX)并由其合成。肽是无菌的，并且80％至>90％纯。将肽溶解在DMSO中并在盐水中以5mg/mL稀释并储存在-80℃。用于HLA-A*02:01的对照肽：尤文肉瘤-衍生肽EW(QLQNPSYDK[SEQ ID NO:140])。生物素化的单链Foxp3p/HLA-A0201复合物在Eureka Therapeutics Inc.(Berkely，CA)通过重折叠肽与重组HLA-A*02和β2微球蛋白(β2M)来合成。
2.细胞因子、抗体和细胞系
人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白细胞介素(IL)-1β、IL-4、IL-6、IL-15、肿瘤坏死因子(TNF)-α和前列腺素E2(PGE2)购自R&D Systems(Minneapolis,MN)。β2-微球蛋白(β2-m)和人IFN-γ购自Sigma(St.Louis,MO)。用于CD14和CD3的细胞分离试剂盒购自Miltenyi Biotec.(Bergisch Gladbach，德国)。人IL-2和TGF-β购自R&D Systems。人Treg分离试剂盒购自Stem cell Technology(加拿大)。Foxp-3+和HLA-A*0201+皮肤T淋巴瘤细胞系MAC-1和MAC-2A由丹麦大学的Mad H.Anderson博士友情提供。TAP-缺陷型T2细胞、T白血病细胞系JURKAT和肿瘤细胞由纪念斯隆-凯特琳癌症中心(Memorial Sloan-Kettering Cancer Center)的细胞免疫学实验室进行HLA分型。将细胞系在补充有5％-10％FCS、青霉素、链霉素、2mmol/l谷氨酰胺和2-巯基乙醇的RPMI 1640中于37℃/5％CO2下培养。细胞定期检查支原体。通过表型或基因型确认细胞身份。
Foxp3-#32 Fc-增强的人IgG1、小鼠IgG1或BiTE形式及其各自(respect)对照由Eureka Therapeutics Inc.生产。与#32的小鼠IgG1形式的APC缀合及其对照通过根据制造商的说明书(Novus Biologicals)使用发光-连接(lightening-link)APC抗体标记试剂盒进行。针对人HLA A*02的mAb(克隆BB7.2)、其同种型对照小鼠IgG2b(克隆MPC-11)、人CD3mAb(克隆HIT3A和OKT3)、CD4 mAb(克隆RPA-T4)、CD8 mAb(克隆RPA-T8)、CD19 mAb(克隆HIB19)、CD25 mAb(克隆2A3)、CD33 mAb(克隆WM53)、CD45RA mAb(克隆HI100)、与FITC或PE缀合的小鼠抗-His标签mAb(克隆F24-796)购自BD Biosciences(San Diego,CA)。人Foxp3特异性mAb克隆PCH101、其同种型对照大鼠IgG2aκ、克隆236A/E7及其同种型对照小鼠IgG1κ、CD4特异性mAb(克隆OKT4)、CD14特异性mAb(克隆61D3)、CD127特异性mAb(克隆HIL-7R-M21)购自eBioscience。用于细胞内染色的固定和透化试剂盒也购自eBioscience。荧光素酶底物荧光素购自Promega(Madison,MI)。
3.体外刺激和人T细胞培养
虽然许多序列可以通过算法预测，但是在活细胞上测试时这些模型在30％的病例中不预测与MHC的结合，因此体外测试是必要的。此外，即使证明了结合，也可能不发生细胞毒性T细胞应答，需要额外的体外研究。
在获得纪念斯隆-凯特琳癌症中心机构审查委员会批准方案的知情同意后，通过Ficoll密度离心获得来自HLA-A*24:02健康供体的外周血单核细胞(PBMC)。CD14+单核细胞通过使用与磁珠偶联的人CD14的mAb阳性选择进行分离，并将其用于T细胞的第一次刺激。PBMC的CD14-级分使用全T细胞分离试剂盒通过阴性免疫磁性细胞分离而用于分离CD3。细胞纯度总是大于98％。T细胞在补充有5％自体血浆(AP)、20ug/mL合成肽、2ug/mLβ2-m和5-10ng/mL IL-15的RPMI 1640存在下刺激7天。通过在补充有1％AP、500单位/mL重组IL-4和1,000单位/mL GM-CSF的RPMI 1640培养基中培养细胞，从CD14+细胞产生单核细胞衍生的树突状细胞(DC)。在孵育的第2天和第4天，加入含有IL-4和GM-CSF的新鲜培养基或替换培养基的一半。在第5天，将20ug/mL II类肽加入未成熟的DC中。在第6天，加入成熟细胞因子混合物(IL-4、GM-CSF、500IU/mL IL-1、1000IU/mL IL-6、10ng/mL TNF-α和1ug/mL PGE-2)。在第7天或第8天，T细胞用成熟DC以30：1的T：APC比、用IL-15再刺激。使用自体DC或CD14+细胞作为抗原递呈细胞(APC)，以相同方式刺激T细胞3至5次。最终刺激后一周，通过IFN-γ酶联免疫斑点(ELISPOT)测定法检查肽-特异性T细胞应答。
4.IFN-γELISPOT测定法测量肽-特异性T细胞应答
HA-Multiscreen板(Millipore)用PBS中的100uL小鼠抗-人IFN-γ抗体(10μg/mL；克隆1-D1K；Mabtech)包被，在4℃孵育过夜，用PBS洗涤以除去未结合的抗体，并在37℃下用RPMI 1640/10％自体血浆(AP)封闭2小时。将CD3+ T细胞与自体CD14+(10:1E:APC比)或自体DC(30:1E:APC比)铺板。将各种测试肽以20μg/mL添加到孔中。阴性对照孔含有APC和T细胞，不含肽或具有无关肽。阳性对照孔含有T细胞加APC加20ug/mL植物血凝素(PHA，Sigma)。所有条件均一式三份进行。在37℃下将微量滴定板孵育20小时，然后用PBS/0.05％吐温充分洗涤，并且添加100μl/孔针对人IFN-γ的生物素化检测抗体(2μg/mL；克隆7-B6-1；Mabtech)。在37℃下将板再孵育2小时，并如(12、13)所述进行斑点显影。使用具有KSELISPOT 4.0软件(Carl Zeiss Vision)的计算机辅助视频图像分析仪自动测定斑点数。
5.51铬释放测定
如(12、13)所述，在标准铬释放测定中测量特异性CTL的存在。简言之，单独的靶细胞，或在37℃下用50μg/mL合成肽脉冲2小时(在某些情况下持续过夜)的靶细胞，用50uCi/百万细胞的Na2 51CrO4(NEN Life Science Products,Inc)标记。在充分洗涤后，将靶细胞与T细胞以各种E：T比孵育。所有条件均一式三份进行。在37℃下将板在5％CO2中孵育4-5小时。收获上清液并在γ计数器中测量放射性。特定裂解百分比由下式确定：[(实验释放-自发释放)/(最大释放-自发释放)]×100％。最大释放通过在1％SDS中裂解放射性标记的靶标12,13来测定。
6.Treg产生
通过FACS分选从PBMC中纯化CD4+ T细胞或CD4+CD25+ T细胞，并且在重组人IL-1(100单位)和TGF-β(10ng/mL)的存在下，用同种异体-PBMC作为刺激物/饲养细胞以效应物：刺激物(E:S)10-20:1的比刺激一周，并且每周重复相同的刺激以维持Treg细胞。Treg的表型通过用对CD4、CD25+的mAb对细胞进行表面染色和用foxp3进行细胞内染色来测定。在某些实施方式中，mAb#32(EXT017-32)与APC缀合，并且Treg细胞的特异性识别通过mAb与CD4+CD25+Foxp3+细胞群体的结合来确定。
7.Foxp3衍生表位特异性的scFv的噬菌体筛选、选择和表征
如前所述18，人ScFv抗体噬菌体展示文库(7×1010个克隆)用于选择mAb克隆。简言之，生物素化的无关肽/HLA-A0201复合物用于去除任何潜在与HLA-A0201结合的克隆。对剩余的克隆筛选Foxp3p/HLA-A0201复合物。所选择的克隆通过3-4轮淘选过程富集。阳性克隆通过针对生物素化的单链Foxp3/HLA-A*0201复合物的标准ELISA方法测定。
通过在以下细胞系上进行间接流式细胞术进一步测试阳性scFv克隆与活细胞表面上的HLA-A2/肽复合物的结合：(i)TAP缺陷型HLA-A*02:01+细胞系T2，它们在内源性HLA-相关肽的递呈中是有缺陷的。T2细胞用Foxp3肽或无关肽脉冲；(ii)Foxp3+ HLA-A*02:01+细胞系如MAC-1、MAC-2A和对照细胞系Jurkat(HLA-A02-)，不用肽脉冲。后者测定scFv对肿瘤细胞上天然加工的Foxp3-7p/A2复合物的识别和结合亲和力。
对总共Foxp3-7的21个噬菌体克隆、Foxp3-2的8个噬菌体克隆和Foxp3-4的3个噬菌体克隆筛选其产生对其各自的Foxp3肽/A2复合物特异性的mAb的能力。活细胞上Foxp3/A2复合物的识别通过噬菌体scFv与20μg/mlβ2M存在下在无血清RPMI 1640培养基中用Foxp3肽和其它HLA-A2结合肽(50ug/mL)脉冲过夜的T2细胞的结合来测量。这些包括：单独的T2细胞；用Foxp3-7、-2或-3肽脉冲的T2细胞；用HLA-A2-结合的无关EW或RHAMM 3(R3)肽脉冲的T2细胞。洗涤上述组中的细胞，然后用3个步骤染色：
步骤1：噬菌体染色：将T2细胞悬浮液(10μl)与纯的scFv噬菌体克隆(90μl)在冰上孵育60分钟，然后洗涤。
步骤2：针对M13外壳蛋白的小鼠mAb(1mg/mL)以1：100稀释，在冰上孵育30分钟，然后洗涤。
步骤3：与FITC或PE缀合的山羊(Fab)2抗-小鼠Ig(1：100稀释)，在冰上孵育30分钟，然后洗涤。
在每个染色步骤之间将细胞洗涤两次。流式细胞术的对照包括：未染色的细胞和仅用山羊抗-小鼠Ig(Fab)/FITC或PE染色的细胞。
8.Foxp3-BiTE的构建、表达和纯化
Foxp3-#32 BiTE如前所述进行改造19。mAb#32 scFv的N-末端端部通过柔性接头连接至小鼠单克隆抗体的抗-人CD3εscFv的C-末端端部。编码两种mAb的scFv的DNA片段由GeneArt(InVitrogen)合成，并使用标准DNA技术亚克隆到Eureka的哺乳动物表达载体pGSN-Hyg中。将六组氨酸(His)标签插入#32 BiTE下游C-末端端部处，用于检测和纯化BiTE。
中国仓鼠卵巢(CHO)细胞用Foxp3-BiTE表达载体转染，并通过用基于谷氨酰胺合成酶(GS)的方法，用甲硫氨酸亚砜亚胺(MSX)的标准药物选择实现稳定表达。收集含有分泌的Foxp3-BiTE分子的CHO细胞上清液。通过FPLC AKTA系统使用HisTrap HP柱(GEhealthcare)纯化Foxp3-#32BiTE。简言之，使CHO细胞培养物澄清并加载到具有低咪唑浓度(20mM)的柱上，然后使用等强度高咪唑浓度洗脱缓冲液(500mM)来洗脱结合的Foxp3-BiTE蛋白。阴性对照BiTE抗体由无关的人IgG1抗体(Cat#ET901，Eureka Therapeutics，)替代Fox3-#32scFv构建。
9.Treg产生、表型分析和Foxp3-#32 mAb结合
通过FACS分选从健康HLA-A*0201阳性供体的PBMC中纯化CD4+ T细胞，并在重组人IL-2(100单位)和TGF-β(10ng/mL)存在下，用同种异体-PBMC(HLA-A*0201阴性)作为刺激物/饲养细胞以效应物：刺激物(E:S)的比例1:5-10或用肿瘤细胞刺激一至两周，并重复相同的刺激以维持Treg细胞15-17。Treg的表型通过用针对CD4、CD25+、CD127的mAb、与APC缀合的Foxp3 mAb#32在冰上对细胞进行表面染色30分钟、洗涤来测定。根据制造商的说明书，通过使用对人Foxp3的mAb和Cytofix/CytoPerm试剂盒(eBiosciences)进行细胞内蛋白质染色来测量Foxp3表达。通过流式细胞术在Beckman Dickinson Fortesa上进行分析。
10.SvFv双特异性抗体(BsAb)构建体在HLA-A*0201背景下介导针对Treg细胞的T细胞毒性
两种方法用于测量通过Foxp3#32 BiTE的Treg的杀伤。由于天然Treg仅表现出少数百分比的CD4+ T细胞，因此，为了获得足够的Treg杀伤读数，将体外产生的Treg用作靶标并通过流式细胞术通过减少Treg群体来测定Treg的杀伤。简言之，在存在或不存在特异性BsAb(也称为“BiTE”)构建体(1ug/mL)(例如，BsAb-#32)或其对照BsAb的情况下，将通过来自HLA-A*02:01阴性供体(效应物)的阴性选择所纯化的CD3 T细胞与来自HLA-A*02:01+供体的Treg细胞以E:T比5:1孵育过夜。洗涤细胞并用针对CD4、CD25、foxp3和HLA-A02的mAb染色。门控HLA-A2+细胞(Treg作为靶标)，并且与用单独的效应物或效应物加上对照BiTE的对照培养物相比较，通过HLA-A*0201+细胞中CD4+CD25+Foxp3+细胞的百分比降低来确定Tregs的杀伤。另外，通过标准51Cr-释放测定法，将Treg-样T淋巴瘤细胞系MAC-1和MAC-2A(Foxp3+/HLAA*0201+)用作ADCC测定中的靶标。
11.抗体依赖性的细胞毒作用(ADCC)
用于ADCC的靶细胞是用或不用Foxp3-TLI肽或EW对照肽脉冲的T2细胞，和没有肽脉冲的Foxp3+MAC-1和MAC2A细胞系(参见上文“细胞因子、抗体和细胞系”部分中所列)。将不同浓度的Foxp3#32Fc-增强的IgG1或其同种型对照与靶细胞和新鲜PBMC以不同的效应物:靶标(E:T)比孵育4-5小时。通过标准51Cr释放测定法测量细胞毒性。
结果
本研究通过使用名为mAb#32的T细胞受体模拟(TCRm)mAb选择性地靶向Foxp3阳性细胞，该mAb#32识别细胞表面上由HLA-A*0201分子递呈的人Foxp3-衍生的CD8 T细胞表位。结果显示mAb#32特异性地结合来自HLA-A*0201阳性供体的CD4+CD25高CD127低Foxp3+ Treg细胞以及共表达Foxp3和HLA-A*0201的肿瘤细胞系。无岩藻糖基化的Fc增强的人IgG1和Foxp3mAb的双特异性T细胞接合(engager)形式都能够杀伤具有CD4、CD25和Fox3+高水平表达的来自HLA-A0201+供体和“Treg-样”皮肤淋巴瘤细胞(HLA-A*02:01+)的体外产生的Treg克隆。该TCRm mAb可允许用于人类癌症的免疫疗法的另一种方法或其它需要选择性免疫刺激的环境。此外，通过克服由表达Foxp3的T-reg和肿瘤细胞引起的免疫抑制，Fox3-靶向抗体可以是癌症免疫疗法中的新方法。
1.在HLA-A*0201的背景下选择Foxp3-衍生的表位
与衍生自肿瘤抗原如WT1的其它明确定义的表位不同，关于衍生自诱导T细胞应答的Foxp-3的表位信息很少。因此，能产生针对Foxp3的细胞毒性CD8 T细胞的免疫原性表位首次得到鉴定。使用三种基于计算机的预测算法BIMAS(http://www-bimas.cit.nih.gov/cgi-bin/molbio/ken_parker_comboform)、SYFPEITHI(http://www.syfpeithi.de/)和RANKPEP(http://bio.dfci.harvard.edu/Tools/rankpep.html)筛选整个人Foxp3蛋白质序列。在HLA-A*02:01分子的背景下选择衍生自人Foxp3的针对CD8 T细胞的潜在表位(具有SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的Foxp3-1、具有SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的Foxp3-2、具有SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的Foxp3-3、具有SEQ ID NO:5所示氨基酸序列的Foxp3-4、具有SEQ ID NO:6所示氨基酸序列的Foxp3-5、具有SEQ ID NO:7所示氨基酸序列的Foxp3-6、和具有SEQ ID NO:8所示氨基酸序列的Foxp3-7)，来测试这些肽是否能够诱导来自HLA-A*02:01+供体的特异性CD8 T细胞应答。重要的是，预测所有选择的HLA-A*0201结合肽在C-末端剪切，表明由蛋白酶体加工的概率更高。
2.在HLA-A*02:01分子背景下的肽-特异性T细胞应答
虽然许多序列可以通过算法预测，但是在某些情况下在活细胞上测试时这些模型不预测与MHC的结合，因此体外测试是必要的。此外，即使证明了结合，也可能不发生细胞毒性T细胞应答，需要额外的体外研究。选择数种Foxp-3-衍生肽以测试它们是否能够刺激来自HLA-HLA-A*0201+供体的CD8 T细胞应答。在用衍生自人Foxp3的多种肽测试来自多个供体的T细胞应答后，选择Foxp3-7(氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示)用于进一步研究。有趣的是，这种肽也显示出诱导强的肽-特异性CD8 T细胞应答，这种应答识别Foxp3+/HLA-A*0201+皮肤T淋巴瘤细胞14。
来自多个供体的CD3 T细胞用Foxp3-衍生肽刺激3-5轮，并通过IFN-γ酶联免疫斑点测定法和51Cr释放测定法测量肽-特异性T细胞应答。除Foxp3-3肽外，所有肽在多个HAL-A*02:01+供体中诱导肽-特异性T细胞应答。
用Foxp3-1至6肽刺激的T细胞仅针对刺激肽引发肽-特异性应答，但不针对其它肽，也不针对包括CD14+抗原递呈细胞(APC)或用无关肽EW脉冲没有肽的APC的对照(图1A-1D和图2A)。肽特异性T细胞应答在多个HLA-A2+供体中可再现(图2A-2C)，并且未检测到肽之间的交叉反应性，如图2B中所示的另一个实例。
为了测试肽所诱导的T细胞是否能够识别天然加工的Foxp3表位，将呈Foxp3和HLA-A*02:01+的T细胞淋巴瘤细胞系MAC-1和MAC2A(图3)(14)和Foxp3+ HLA-A*02:01-细胞系Jurkat(图7C)用作靶标。用Foxp3-4、-6或-7肽刺激的T细胞能够识别MAC-1和MAC-2A细胞系，但不能识别Jurkat。用Foxp3-6和-7肽刺激的T细胞也识别Foxp3+CD4+CD25 Treg细胞，该细胞通过用抗-CD3 mAb、IL-2和TGF-β刺激纯化的CD4+细胞由HLA-A*02:01+供体产生。
还研究了Foxp3-衍生肽Foxp3-1、-2、-4、-5、-6和-7的肽特异性T细胞细胞毒性。来自HLA-A*02:01+供体的CD3 T细胞用Foxp3-衍生肽Foxp3-1、-2、-4、-5、-6或-7刺激，并且刺激肽引起的对T2细胞的细胞毒性通过51Cr释放测定法测量。如图4A-4F以及图5C和5D所示，所有测试的Foxp3-衍生肽显示肽-特异性T细胞细胞毒性。
关于Foxp3-7(也称为TLI肽或Foxp3-TLI肽)的其它实验表明，在四轮刺激后，通过IFN-γ酶联免疫斑点测定法，T细胞仅识别用TLI肽脉冲的自体CD14+单核细胞，但不识别单独的CD14+ APC或用无关HLA-A*0201-结合肽EW脉冲的CD14+ APC(图5A)。重要的是，还观察到针对HLA-A*0201+Foxp3+皮肤T淋巴瘤细胞系MAC-1和MAC-2A的T细胞应答，但不针对Foxp3+ HLA-A*0201-T白血病细胞系Jurkat，表明TLI-刺激的T细胞可识别由HLA-A*0201分子递呈的天然加工的Foxp3 TLI表位(图5B)。与IFN-γ分泌的结果一致，TLI肽-刺激的T细胞杀伤用TLI肽脉冲的T2和未脉冲的MAC-1和MAC-2A细胞，但不杀伤HLA-A*0201-阴性、Foxp3+细胞系HL-60(图5C和5D)。上述数据证实了在HLA-A2分子的背景下Foxp3衍生的表位的鉴定，和在肽脉冲的T2细胞中以及在表达Foxp3/HLA-A2的T淋巴瘤细胞系中Foxp3引起CTL应答产生。这证明了天然肽在细胞表面上以HLA加工和递呈，用于通过T细胞TCR识别。基于这些数据，选择Foxp3-7、Fox3-4和Fox3-2表位以在HLA-A*02:01分子的背景下产生TCR-模拟单克隆抗体(mAb)。
3.使用噬菌体展示技术在HLA-A*02:01分子的背景下产生Foxp3肽的TCR模拟mAb
对总共Foxp3-7的21个噬菌体克隆、Foxp3-2的8个噬菌体克隆(图6I)和Foxp3-4的3个噬菌体克隆(图6J)筛选其产生对其各自的Foxp3肽/A2复合物特异性的mAb的能力。图6A-6H显示噬菌体scFv克隆与Fox3-7的结合数据。图6I显示噬菌体scFv克隆与Fox3-2的结合数据。图6J显示噬菌体scFv克隆与Fox3-4的结合数据。
特别地，对于Foxp3-7，通过确认Foxp3-TLI肽能够诱导识别出表达Foxp3蛋白的肿瘤细胞的表位-特异性T细胞应答，通过使用如前所述的噬菌体展示技术18产生了对TLI/HLA-A*0201复合物特异性的TCRm mAb。简言之，通过筛选噬菌体文库选择的对TLIp/A2复合物特异性的单一噬菌体克隆通过ELISA进一步验证。使用T2细胞测试所选克隆与活细胞的结合。将显示与没有TLI肽的T2细胞结合或与具有HLA-A*0201-结合无关肽的T2细胞结合的任何克隆除去。经过5轮筛选，基于对经TLI肽脉冲的T2细胞和表达foxp3和HLA-A*0201的活细胞的结合特异性，选择八个scFv克隆用于工程化为全长人IgG1或双特异性T细胞接合mAb(T-BiTE)用于进一步表征。
对于Foxp3-7：克隆#32、17、28、54、18、53、27、20
4.对Foxp3-7/HLA-A*02:01复合物特异性的BsAb的表征
可以通过多种方式增强Mab杀伤功能。作为使T细胞对靶标具有细胞毒性的策略，产生对Foxp3-7肽/HLA-A2复合物特异性的mAb的八种双特异性T细胞接合构建体。对Foxp3-7/HLA-A2复合物特异性的八种BsAb(也称为“BiTE”)构建体的结合在用或不用Foxp3-7或无关肽脉冲的T2细胞上以及在未脉冲的T淋巴瘤细胞MAC-1、MAC-2A和Jurkat细胞上测试。
如图7A-7C所示，所有BsAb构建体#17、18、20、27、28、32、53和54与用Foxp3-7肽脉冲的T2细胞非常好地结合，但不与单独的T2细胞或用对照肽的T2细胞结合。然而，BsAb#32与MAC-1和MAC-2A细胞结合，证明它具有足够的亲合力来识别天然加工的表位(图7A和7B)。#32 BiTE还与CD3+ T细胞系Jurkat结合，证明了借助BiTE的抗-CD3臂与CD3的结合(图7C)。所有BsAb构建体都与CD3+ T细胞系Jurkat结合，证明了BsAb的抗-CD3臂的结合。
Foxp3-#32mAb的特异性通过使用Foxp3-#32 BiTE与含有类似TLI肽的T2细胞的结合进一步分析。TLI肽在位置1、2、3、4、5、7和8处用丙氨酸取代，或在位置10处用甘氨酸取代。位置6已经是丙氨酸并且保持完整。将突变肽加载到T2细胞上并测试Foxp3-Bite结合。与天然TLI肽相比，位置2、8、9或10处的丙氨酸或甘氨酸取代降低了foxp3-bite的结合(图8A)。位置2和9处的结合的丧失可能是由于肽对HLA-A*02分子的结合亲和力的降低，因为两种肽在T2稳定化测定中显示降低的结合(图8B)。在HLA-A2稳定化中突变肽TLI-A8和G10没有显著减少，表明这些位置处的氨基酸可由mAb特异性地识别。这些结果进一步证明了foxp3-BiTE对TLI肽/HLA-A*0201复合物的特异性，并且与单独的HLA-A*0201分子的结合不充分。
5.Foxp3-#32 mAb识别表达Foxp3和HLA-A*0201的人Treg和肿瘤细胞。
尽管Foxp3 mAb已证明与用TLI肽脉冲的T2细胞结合的优异特异性，但测试TLI表位是否由天然存在的Treg和可诱导的Treg中的HLA-A*0201分子加工和递呈是至关重要的。将Foxp3#32 mAb与来自健康供体的HLA-A*0201阳性或阴性PBMC的Trge结合进行比较。CD4+T细胞对于CD25高且CD127低群体进行门控，这是天然Treg的特征。与HLA-A*0201+供体中的同种型对照相比，Mab-#32 mAb显示在该群体上的显著移位(图9A)。相比之下，mAb-#32不与CD4+CD25低CD127高或CD8+CD25高CD127高群体结合(分别为图9B和9C)。Mab-#32不与HLA-A*0201阴性供体中的相同CD4+CD25高CD127低Treg群体结合(图9D)。
接下来，为了测试#32 mAb是否也识别可诱导的Treg，通过在IL-2和TGF-β存在下用同种异体-PBMC(HLA-A*0201阴性)或肿瘤细胞MAC-2A刺激来自HLA-A0201+供体的纯化的CD4+ T细胞来产生Treg细胞系15-17。典型的染色图案显示在图10A-10B中。如图10A-10B所示，EXT017-32特异性结合HLA-A*02:01+ Treg细胞。通过用HLA-A*0201阴性同种异体-PBMC(图10A)或MAC-2A肿瘤细胞(图10B)刺激来自HLA-A*0201阳性供体的CD4+ T细胞产生Treg。与单一CD4+ T细胞群体(右上)相比，Foxp3#32 mAb与CD4+CD25+ T细胞强烈结合，并且mAb-#32仅与CD4+CD25+Foxp3+群体结合但不与CD4+CD25+Foxp3阴性群体结合(左下图)。由同种异体-PBMC(图10A)或MAC-2A细胞刺激(图10B)产生的Treg之间的结果相似。这些结果证明Foxp3-#32 mAb能够在HLA-A*0201分子的背景下特异性地识别表达Foxp3表位的Treg。
已经显示许多类型的人癌细胞表达Foxp3，其与不良预后和远端转移相关。因此，Foxp3 mAb也可以直接攻击表达Foxp3的肿瘤细胞。
6.在HLA-A*0201背景下，Mab-#32 BiTE介导的针对Foxp3+ Treg和肿瘤细胞的T细胞细胞毒作用
进行实验以测试mAb-#32 BiTE是否能够在HLA-A*0201分子的背景下介导针对Foxp3 TLI表位的T细胞杀伤。PBMC用作效应物，并且在存在或不存在#32 BsAb和同种型-衍生的对照BsAb的情况下通过标准51Cr-释放测定法测量细胞毒性。在存在或不存在mAb#32-BiTE或同种型-衍生的对照BiTE的情况下，T2细胞用TLI或对照HLA-A0*201-结合肽CT脉冲，并将PBMC用作效应物。Mab-#32 BiTE介导针对用TLI肽脉冲的T2细胞的特异性和强烈的杀伤活性，但不针对单独的T2细胞或用对照肽脉冲的T2细胞(图11A)。类似地，在mAb-#32-BiTE存在下的PBMC在指定浓度下显示针对Treg-样T淋巴瘤细胞系MAC-1和MAC2A细胞的剂量依赖性杀伤(图11C和11D)，但不针对Foxp3+/HLA-A*0201阴性细胞系HL-60(图11B)或Jurkat细胞(图11E)。MAC-1和MAC-2A细胞系均不表达CD3，针对这些细胞系的T细胞细胞毒性不是由抗-CD3 mAb的scFv臂介导的。这些数据证明mAb-#32 BiTE能够杀伤表达Foxp3和HLA-A0*201的肿瘤细胞，并证明杀伤表达Foxp3的细胞的特异性。
由于健康PBMC中的Treg群体可能太低而不能测量由bite介导的细胞毒性，因此通过同种异体刺激从HLA-A0201+供体产生Treg克隆，然后进行有限稀释。在存在或不存在Foxp3-BiTE或对照bite的情况下，将两种不同的T reg克隆与来自HLA-A*02-阴性供体的PBMC孵育过夜。然后通过流式细胞术测量HLA-A*0201+ T细胞群体(仅来自Treg克隆)中Foxp3+细胞的百分比。HLA-A*02+Foxp3+细胞的减少表明Foxp3-BiTE-介导的T细胞杀伤。图12A-12B分别显示来自两个Treg克隆的结果。图12A-12B中所示的流式细胞仪数据总结为图12C中的柱状图，以显示Treg细胞百分比的减少。在克隆3中，与仅效应物(PBMC：9.88％)或与对照BiTE的效应物(9.11％)的对照相比，在#32-BiTE存在下HLA-A*02+Foxp3+ T细胞的百分比降低超过约60％(3.45％)。从其它Treg克隆获得了类似的结果。
这些结果证明#32-BiTE能够在HLA-A*0201分子的背景下识别和介导针对Treg的T细胞细胞毒作用。
7.EXT017抗体与Foxp3肽/HLA-A*02：01复合物的结合亲和力
使用生物层干涉测量法(BLI)评估8种EXT017-BsAb对EXT017肽/HLA-A*02：01复合物的结合亲和力，并且结果显示在表5中。
表5
抗体 k<sub>d</sub>[1/s] k<sub>d</sub>中的误差[1/s] k<sub>a</sub>[1/Ms] K<sub>D</sub>[nM]
EXT-017-17 BsAb 2.63E-3 5.46E-5 1.84E7 144
EXT-017-18 BsAb 1.88E-3 6.79E-5 5.31E7 35.4
EXT-017-20 BsAb 1.75E-3 4.84E-5 7.90E6 221
EXT-017-27 BsAb 2.08E-3 7.06E-5 4.28E7 48.5
EXT-017-28 BsAb 1.89E-3 6.79E-5 1.00E7 188
EXT-017-32 BsAb 2.27E-3 6.26E-5 3.15E7 72.2
EXT-017-53 BsAb 2.35E-3 6.98E-5 4.84E7 48.6
EXT-017-54 BsAb 1.05E-3 9.41E-5 3.19E7 32.9
使用表面等离子共振(SPR)测量EXT017-32-hIgG1和mIgG1与EXT017肽/HLA-A*02：01复合物的结合亲和力，并且结果显示在表6中。
表6
抗体 k<sub>d</sub>[1/s] k<sub>a</sub>[1/Ms] K<sub>D</sub>[nM]
EXT017-32 mIgG 1.12E<sup>+</sup>07 0.005167 0.462
EXT017-32 hIgG 5.97E<sup>+</sup>07 0.01222 0.205
讨论
开发用于消耗或干扰Treg功能而不损害抗肿瘤免疫力的治疗策略一直具有挑战性，因为没有Treg-特异性表面标志物。特异性消耗Treg的障碍之一是Treg和效应T细胞都表现出活化的表型，尤其是细胞表面分子的表达模式；两者都高表达CD25、细胞毒性T淋巴细胞-相关抗原(CTLA)-4、OX40和糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体-相关蛋白(GITR)。单独消耗Treg或与通过抗-CD25 mAb接种相组合已显示有助于改善各种动物模型中的抗肿瘤免疫应答。然而，临床上，通过使用达克珠单抗(抗CD25 mAb)或地尼白介素(由IL-2和白喉毒素的活性结构域组成的重组蛋白)靶向CD25已显示出不太有希望的结果。尽管Treg表达CTLA-4，但临床研究结果表明，抗-CTLA-4治疗的效果是由于效应T细胞的激活增加，或者在初始给药后早期存在Treg消耗效应，这允许效应细胞应答的最佳诱导。最近，Sakaguchi小组已经显示C-C趋化因子受体4(CCR4)在黑色素瘤患者的TIL中的效应物Treg(eTreg；CD45RA-Foxp3高CD4+)中显著表达。当用NY-ESO-1肽刺激时，使用抗-CCR4 mAb体外消耗该群体增强T细胞应答。当将mAb施用于患有T细胞白血病-淋巴瘤的患者时，eTreg部分减少并且NY-ESO-1特异性CD8 T细胞应答增加。CCR-4是CC趋化因子CCL17和CCl22的同源受体，并且在功能上不同的免疫细胞亚群上表达。除了Treg，它还在活化的T细胞、Th2细胞、血小板、NK细胞、巨噬细胞和树突状细胞(DC)中表达。类似地，已显示使用同源配体或激动性mAb靶向GITR在鼠模型中的抗-肿瘤应答中有效。然而，这种策略的临床疗效仍有待在人体试验中进行研究。
Foxp3是叉头/翼状螺旋家族中的转录因子，并且主要发现于CD4+CD25+ Treg细胞中，占CD4+ T细胞群体总数的2％至5％，但显著富集于肿瘤块、外周血或癌症患者的腹水中。肿瘤细胞不仅将Treg募集到肿瘤部位，而且还通过肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)直接或间接提供抗原刺激和细胞因子，在将早幼和/或效应T细胞转化为Treg中起着至关重要的作用。在TIL中，效应T细胞与Treg的比决定疾病结果。肿瘤进展与Treg之间存在很强的关联性，Treg数量或频率增加与各种癌症(包括卵巢癌、乳腺癌、非小细胞肺癌、肝细胞癌、肾细胞癌、胰腺癌和胃癌)预后不良相关1-7。尽管尚未完全了解Treg-介导的免疫抑制的确切机制，但Treg可部分地通过分泌免疫抑制细胞因子并抑制细胞接触依赖性机制中T细胞的活化和增殖来起作用。在Treg中，Foxp3最重要的功能是其在正常T细胞中的异位表达可以在功能和表型上将它们转化为Treg-样细胞。因此，认为Foxp3是Treg的谱系定型和发育分化的主要调节基因。
有趣的是，Foxp3的免疫抑制功能不仅限于Treg。Hinz等已报道在大多数胰腺癌患者中检测到Foxp3表达。Foxp3在胰腺癌细胞中的异位表达在体外诱导T细胞增殖的完全抑制，并且通过使用siRNA沉默Foxp3基因表达部分地消除了这种效应。作者提出表达Foxp3的胰腺癌细胞模拟Treg功能，这可能代表癌症患者中免疫逃避的新机制。Foxp3的免疫抑制功能也已在成人T白血病(ATL)患者中提出，其特征在于白血病细胞中CD4和CD25的组成型表达以及显著的免疫缺陷状态。随后，有许多报道称许多类型的癌细胞表达Foxp3，进一步支持Foxp3在肿瘤抑制微环境中的重要作用。
一直认为Foxp3是Treg最明确的标志物，并且是一个有吸引力的靶标。然而，没有抑制Foxp3的药物或mAb，因为该蛋白质处于细胞内，常规抗体疗法无法接近。虽然它处于细胞内，但是当由MHC I类分子递呈时，某些蛋白酶体加工的FOXp3肽可以在细胞表面上表达，以通过CD8 T细胞识别。实际上，Anderson小组已经证明Foxp3-特异性细胞毒性CD8 T细胞存在于人PBMC中，特别是在癌症患者中。这些CTL能够以HLA-A*0201-限制性方式识别Treg并杀伤恶性Treg-样皮肤T淋巴瘤细胞。因此，该研究证明了通过使用肽-特异性CTL的方法靶向细胞内Foxp3的可能性。已经采用本申请中的新方法开发T细胞受体模拟mAb(TCRm)，其在HLA-A*02:01的背景下对Foxp3肽具有特异性。从Fopx3蛋白中鉴定出许多可以在HLA-A*0201分子的背景下诱导特异性CD8 T细胞应答的肽。因为Foxp3是大叉头蛋白家族的成员，为了避免潜在的脱靶，选择肽TLI用于mAb工程化，其与其它Foxp家族成员如Foxp1、2和4具有最小的同源性。mAb成功产生并能够特异性地结合并杀伤Foxp3阳性的癌细胞系和Treg细胞。
已知活化的常规T细胞可瞬时表达Foxp3。然而，活化的CD4+CD25+ T细胞和Treg可以通过CD127(IL-7受体的α链)的表达来区分。Treg表达低CD127但活化的T细胞表达高CD127。TCRm Foxp3-#32仅与HLA-A*0201+健康供体中的CD127低CD25高、Foxp3高的CD4+ T细胞群体结合。当测试体外诱导的Treg时，Foxp3 mAb仅与CD4+CD25高群体结合，但不与CD25低/阴性群体结合。通常，TCRm mAb识别低密度肽/HLA复合物，并且靶蛋白或HLA的低表达将难以使这种mAb具有有效识别。因此，Foxp3 TCRm mAb将仅结合高度表达Foxp3的细胞。此外，在肿瘤微环境中，T细胞极度处于灭活状态，并且CD25高Foxp3高CD4 T细胞最可能是Treg。这通过首先使用Foxp3-#32 mAb消耗Treg，然后使用比如接种或检查点阻断的方法扩增效应T细胞或增强其效应物活性的策略来打开设计有效组合疗法的治疗窗口。这种策略可以避免同时消耗Treg和活化的T细胞，从而实现选择性和更有效的治疗结果。
实施例2-Foxp3-7最佳噬菌体克隆的肽表位作图
进行针对Foxp3-7肽的8种EXT017抗体的表位作图以确定抗体结合所必需的表位。简言之，在位置1-9处用丙氨酸取代产生突变体EXT017肽，并将它们分别脉冲到T2细胞的表面上。用EXT017-噬菌体对载有肽的T2细胞染色，并通过流式细胞术测量结合。表7列出了实验中使用的突变体EXT017氨基酸序列。表8总结了对载有表7中所示的丙氨酸突变体组的T2细胞进行EXT017-噬菌体FACS染色的平均荧光强度(MFI)值。如表8所示，EXT017-mut2用于锚定位置。与载有丙氨酸突变体组的T2细胞结合的8种EXT017-噬菌体的柱状图显示在图13A-13H中。
表7
表8
影响抗体结合的位置(结合MFI&lt;野生型肽的20％)用*标记。
实施例3-靶向Foxp3的CART细胞
过继转移CAR T细胞已成为B-细胞ALL和其它造血系统癌症的有效疗法。然而，许多癌症类型仍然需要更大的效力和机制以抵抗免疫抑制性肿瘤微环境。一种方法是通过修饰CAR T细胞以组成型地表达可以杀伤Treg细胞的治疗性TCRm CAR来克服肿瘤抗性，该Treg细胞优先在抗原定向的CAR T细胞附近。产生对Foxp3的肽片段具有反应性的T-细胞受体-模拟(TCRm)CAR，其可杀伤HLA-A*02:01的背景下在Treg细胞和肿瘤细胞表面上表达的Foxp3。修饰T细胞以表达该Foxp3-靶向的CAR。
产生逆转录病毒构建体和转导
本发明公开的Foxp3scFv序列用于产生靶向Foxp3的第二代CAR。加入可变重链和可变轻链(用(Gly4Ser)3接头连接)和c-myc标签以允许通过流式细胞术检测CAR表达。如果需要，对CAR进行优化以包括CD28跨膜结构域上游的间隔区结构域。将其克隆到含有CD28和CD3ζ或4-1BB的SFG逆转录病毒载体或本领域熟知的其它类似信号传导CAR形式，例如Park(2016)。产生稳定的293病毒生产细胞系，并如前所述用于转导原代人T细胞(Rafiq(2017))。转导后，通过流式细胞术验证CAR表达，对包含在Foxp3-CAR中的c-myc标签进行染色。先前已经描述了原代人T细胞的逆转录病毒转导(Koneru(2015))。
表征Foxp3 CAR在体外和体内的特异性和活性
通过检测PR20-转导的T细胞的Foxp3-特异性细胞毒性、细胞因子分泌和增殖功能，体外分析Foxp3-CAR重定向T细胞功能的能力，如前所述(Rafiq(2017))。特异性细胞毒性使用针对来自HLA-A0201+供体或Foxp3+ HLA-A*0201阳性或阴性肿瘤细胞系的Treg的标准51铬释放测定来测量。特异性细胞因子分泌通过收集来自Foxp3T细胞与Foxp3+或Foxp3-细胞的24小时共培养物的上清液来测量。细胞因子的存在使用Luminex技术分析。foxp3CAR刺激T细胞增殖的能力通过共培养转导的T细胞与Foxp3+肿瘤细胞并使用计数珠用流式细胞术监测T细胞扩增来分析。转录以表达靶向无关抗原的CAR的T细胞将用作对照，如先前所公布(Rafiq(2017))。
表征foxp3 CAR在体内的抗肿瘤功效
使用临床前异种鼠模型评估Foxp3-CAR T细胞在体内根除Foxp3+肿瘤的能力。将SCID-Beige或NSG小鼠接种(对于血液恶性肿瘤为全身地，或对于实体瘤为腹膜内)经修饰以表达萤火虫荧光素酶(Luciferace)(FFLuc)以允许生物发光成像的肿瘤细胞(Rafiq(2017))。随后通过全身输注foxp3-或对照CAR T细胞(表达靶向无关抗原的CAR)处理小鼠。如前所述(Rafiq(2017))，在临床上和用生物发光成像监测疾病进展。CAR T细胞的持久性通过收集来自处理小鼠的外周血并用流式细胞术检测CAR+ T细胞来测定。CAR功能随时间的变化通过使用Luminex技术检测处理小鼠的血清中的细胞因子来测定。
本文引用了各种专利和出版物，将其内容整体并入本文以供参考。
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附录A
接头(带下划线)
His标签+HA标签(斜体)
#17
Lv(λ)
DNA序列
AA序列
Hv
DNA序列
AA序列
全长AA序列
全长DNA序列
#18
Lv(λ)
DNA序列
AA序列
Hv
DNA序列
AA序列
全长AA序列
全长DNA序列
#20
Lv(λ)
DNA序列
AA序列
Hv
DNA序列
AA序列
全长AA序列
全长DNA序列
#27
Lv(λ)
DNA序列
AA序列
Hv
DNA序列
AA序列
全长AA序列
全长DNA序列
#28
Lv(λ)
DNA序列
AA序列
Hv
DNA序列
AA序列
全长AA序列
全长DNA序列
#32
Lv(λ)
DNA序列
AA序列
Hv
DNA序列
AA序列
全长AA序列
全长DNA序列
#53
Lv(λ)
DNA序列
AA序列
Hv
DNA序列
AA序列
全长AA序列
全长DNA序列
#54
Lv(λ)
DNA序列
AA序列
Hv
DNA序列
AA序列
全长AA序列
全长DNA序列
附录B
附录C
接头(带下划线)
His标签+HA标签(斜体)
#5
DNA序列:
氨基酸序列:
轻链DNA序列:
轻链氨基酸序列:
重链DNA序列:
重链氨基酸序列:
#9
DNA序列:
氨基酸序列:
轻链DNA序列:
轻链氨基酸序列:
重链DNA序列:
重链氨基酸序列:
#10
DNA序列:
氨基酸序列:
轻链DNA序列:
轻链氨基酸序列:
重链DNA序列:
重链氨基酸序列:
#11
DNA序列:
氨基酸序列:
轻链DNA序列:
轻链氨基酸序列:
重链DNA序列:
重链氨基酸序列:
#21
DNA序列:
氨基酸序列:
轻链DNA序列:
轻链氨基酸序列:
重链DNA序列:
重链氨基酸序列:
#23
DNA序列:
氨基酸序列:
轻链DNA序列:
轻链氨基酸序列:
重链DNA序列:
重链氨基酸序列:
#24
DNA序列:
氨基酸序列:
轻链DNA序列:
轻链氨基酸序列:
重链DNA序列:
重链氨基酸序列:
#25
DNA序列:
氨基酸序列:
轻链DNA序列:
轻链氨基酸序列:
重链DNA序列:
重链氨基酸序列:
#26
DNA序列:
氨基酸序列:
轻链DNA序列:
轻链氨基酸序列:
重链DNA序列:
重链氨基酸序列:
#29
DNA序列:
氨基酸序列:
轻链DNA序列:
轻链氨基酸序列:
重链DNA序列:
重链氨基酸序列:
#30
DNA序列:
氨基酸序列:
轻链DNA序列:
轻链氨基酸序列:
重链DNA序列:
重链氨基酸序列:
#34
DNA序列:
氨基酸序列:
轻链DNA序列:
轻链氨基酸序列:
重链DNA序列:
重链氨基酸序列:
#55
DNA序列:
氨基酸序列:
轻链DNA序列:
轻链氨基酸序列:
重链DNA序列:
重链氨基酸序列:
附录D
EXT019-04
DNA序列
(轻链可变区scFv接头重链可变区His标签+HA标签)
氨基酸序列
(轻链可变区scFv接头重链可变区His标签+HA标签)
EXT019-06
DNA序列
(轻链可变区scFv接头重链可变区His标签+HA标签)
氨基酸序列
(轻链可变区scFv接头重链可变区His标签+HA标签)
EXT019-08
DNA序列
(轻链可变区scFv接头重链可变区His标签+HA标签)
氨基酸序列
(轻链可变区scFv接头重链可变区His标签+HA标签)
EXT019-09
DNA序列
(轻链可变区scFv接头重链可变区His标签+HA标签)
氨基酸序列
(轻链可变区scFv接头重链可变区His标签+HA标签)
EXT019-12
DNA序列
(轻链可变区scFv接头重链可变区His标签+HA标签)
氨基酸序列
(轻链可变区scFv接头重链可变区His标签+HA标签)
EXT019-13
DNA序列
(轻链可变区scFv接头重链可变区His标签+HA标签)
氨基酸序列
(轻链可变区scFv接头重链可变区His标签+HA标签)
EXT019-15
DNA序列
(轻链可变区scFv接头重链可变区His标签+HA标签)
氨基酸序列
(轻链可变区scFv接头重链可变区His标签+HA标签)
EXT019-20
DNA序列
(轻链可变区scFv接头重链可变区His标签+HA标签)
氨基酸序列
(轻链可变区scFv接头重链可变区His标签+HA标签)
附录E
附录F
EXT018-02
DNA序列
(轻链可变区scFv接头重链可变区His标签+HA标签)
氨基酸序列
(轻链可变区scFv接头重链可变区His标签+HA标签)
EXT018-04
DNA序列
(轻链可变区scFv接头重链可变区His标签+HA标签)
氨基酸序列
(轻链可变区scFv接头重链可变区His标签+HA标签)
EXT018-05
DNA序列
(轻链可变区scFv接头重链可变区His标签+HA标签)
氨基酸序列
(轻链可变区scFv接头重链可变区His标签+HA标签)
附录G

Claims (83)

1.一种分离的抗体或其抗原结合部分，所述抗体或其抗原结合部分与结合于人主要组织相容性复合物(MHC)分子的Foxp3肽结合。
2.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合部分，其中所述人MHC分子是人白细胞抗原(HLA)分子。
3.根据权利要求2所述的抗体或其抗原结合部分，其中所述HLA分子是HLA I类分子。
4.根据权利要求3所述的抗体或其抗原结合部分，其中所述HLA I类分子是HLA-A。
5.根据权利要求4所述的抗体或其抗原结合部分，其中所述HLA-A是HLA-A2。
6.根据权利要求5所述的抗体或其抗原结合部分，其中所述HLA-A2是HLA-A*02:01。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，其中所述Foxp3肽是包含SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的人Foxp3多肽的一部分。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，其中所述Foxp3肽具有8-12个氨基酸的长度。
9.根据权利要求8所述的抗体或其抗原结合部分，其中所述Foxp3肽具有9个氨基酸的长度。
10.根据权利要求8所述的抗体或其抗原结合部分，其中所述Foxp3肽具有10个氨基酸的长度。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，其中所述Foxp3肽选自具有SEQ ID NO:8所示氨基酸序列的Foxp3-7或其一部分、具有SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的Foxp3-1或其一部分、具有SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的Foxp3-2或其一部分、具有SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的Foxp3-3或其一部分、具有SEQ ID NO:5所示氨基酸序列的Foxp3-4或其一部分、具有SEQ ID NO:6所示氨基酸序列的Foxp3-5或其一部分、和具有SEQID NO:7所示氨基酸序列的Foxp3-6或其一部分。
12.根据权利要求1-8和10-11中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，所述抗体或其抗原结合部分包含选自以下的重链可变区CDR3序列和轻链可变区CDR3序列：
(a)包含SEQ ID NO:11所示氨基酸序列或其修饰的重链可变区CDR3序列、和包含SEQID NO:14所示氨基酸序列或其修饰的轻链可变区CDR3序列；
(b)包含SEQ ID NO:17所示氨基酸序列或其修饰的重链可变区CDR3序列、和包含SEQID NO:20所示氨基酸序列或其修饰的轻链可变区CDR3序列；
(c)包含SEQ ID NO:23所示氨基酸序列或其修饰的重链可变区CDR3序列、和包含SEQID NO:26所示氨基酸序列或其修饰的轻链可变区CDR3序列；
(d)包含SEQ ID NO:29所示氨基酸序列或其修饰的重链可变区CDR3序列、和包含SEQID NO:32所示氨基酸序列或其修饰的轻链可变区CDR3序列；
(e)包含SEQ ID NO:35所示氨基酸序列或其修饰的重链可变区CDR3序列、和包含SEQID NO:38所示氨基酸序列或其修饰的轻链可变区CDR3序列；
(f)包含SEQ ID NO:41所示氨基酸序列或其修饰的重链可变区CDR3序列、和包含SEQID NO:44所示氨基酸序列或其修饰的轻链可变区CDR3序列；
(g)包含SEQ ID NO:47所示氨基酸序列或其修饰的重链可变区CDR3序列、和包含SEQID NO:50所示氨基酸序列或其修饰的轻链可变区CDR3序列；和
(h)包含SEQ ID NO:53所示氨基酸序列或其修饰的重链可变区CDR3序列、和包含SEQID NO:56所示氨基酸序列或其修饰的轻链可变区CDR3序列。
13.根据权利要求1-8和10-12中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，所述抗体或其抗原结合部分还包含选自以下的重链可变区CDR2序列和轻链可变区CDR2序列：
(a)包含SEQ ID NO:10所示氨基酸序列或其修饰的重链可变区CDR2序列、和包含SEQID NO:13所示氨基酸序列或其修饰的轻链可变区CDR2序列；
(b)包含SEQ ID NO:16所示氨基酸序列或其修饰的重链可变区CDR2序列、和包含SEQID NO:19所示氨基酸序列或其修饰的轻链可变区CDR2序列；
(c)包含SEQ ID NO:22所示氨基酸序列或其修饰的重链可变区CDR2序列、和包含SEQID NO:25所示氨基酸序列或其修饰的轻链可变区CDR2序列；
(d)包含SEQ ID NO:28所示氨基酸序列或其修饰的重链可变区CDR2序列、和包含SEQID NO:31所示氨基酸序列或其修饰的轻链可变区CDR2序列；
(e)包含SEQ ID NO:34所示氨基酸序列或其修饰的重链可变区CDR2序列、和包含SEQID NO:37所示氨基酸序列或其修饰的轻链可变区CDR2序列；
(f)包含SEQ ID NO:40所示氨基酸序列或其修饰的重链可变区CDR2序列、和包含SEQID NO:43所示氨基酸序列或其修饰的轻链可变区CDR2序列；
(g)包含SEQ ID NO:46所示氨基酸序列或其修饰的重链可变区CDR2序列、和包含SEQID NO:49所示氨基酸序列或其修饰的轻链可变区CDR2序列；和
(h)包含SEQ ID NO:52所示氨基酸序列或其修饰的重链可变区CDR3序列、和包含SEQID NO:55所示氨基酸序列或其修饰的轻链可变区CDR3序列。
14.根据权利要求1-8和10-13中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，所述抗体或其抗原结合部分还包含选自以下的重链可变区CDR1序列和轻链可变区CDR1序列：
(a)包含SEQ ID NO:9所示氨基酸序列或其修饰的重链可变区CDR1序列、和包含SEQ IDNO:12所示氨基酸序列或其修饰的轻链可变区CDR1序列；
(b)包含SEQ ID NO:15所示氨基酸序列或其修饰的重链可变区CDR1序列、和包含SEQID NO:18所示氨基酸序列或其修饰的轻链可变区CDR1序列；
(c)包含SEQ ID NO:21所示氨基酸序列或其修饰的重链可变区CDR1序列、和包含SEQID NO:24所示氨基酸序列或其修饰的轻链可变区CDR1序列；和
(d)包含SEQ ID NO:27所示氨基酸序列或其修饰的重链可变区CDR1序列、和包含SEQID NO:30所示氨基酸序列或其修饰的轻链可变区CDR1序列；
(e)包含SEQ ID NO:33所示氨基酸序列或其修饰的重链可变区CDR1序列、和包含SEQID NO:36所示氨基酸序列或其修饰的轻链可变区CDR1序列；
(f)包含SEQ ID NO:39所示氨基酸序列或其修饰的重链可变区CDR1序列、和包含SEQID NO:42所示氨基酸序列或其修饰的轻链可变区CDR1序列；
(g)包含SEQ ID NO:45所示氨基酸序列或其修饰的重链可变区CDR1序列、和包含SEQID NO:48所示氨基酸序列或其修饰的轻链可变区CDR1序列；和
(h)包含SEQ ID NO:51所示氨基酸序列或其修饰的重链可变区CDR1序列、和包含SEQID NO:54所示氨基酸序列或其修饰的轻链可变区CDR1序列。
15.根据权利要求1-8和10-14中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，所述抗体或其抗原结合部分包含：
(a)包含SEQ ID NO:9所示氨基酸序列的重链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:10所示氨基酸序列的重链可变区CDR2；包含SEQ ID NO:11所示氨基酸序列的重链可变区CDR3；包含SEQID NO:12所示氨基酸序列的轻链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:13所示氨基酸序列的轻链可变区CDR2；和包含SEQ ID NO:14所示氨基酸序列的轻链可变区CDR3；
(b)包含SEQ ID NO:15所示氨基酸序列的重链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:16所示氨基酸序列的重链可变区CDR2；包含SEQ ID NO:17所示氨基酸序列的重链可变区CDR3；包含SEQ ID NO:18所示氨基酸序列的轻链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:19所示氨基酸序列的轻链可变区CDR2；和包含SEQ ID NO:20所示氨基酸序列的轻链可变区CDR3；
(c)包含SEQ ID NO:21所示氨基酸序列的重链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:22所示氨基酸序列的重链可变区CDR2；包含SEQ ID NO:23所示氨基酸序列的重链可变区CDR3；包含SEQ ID NO:24所示氨基酸序列的轻链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:25所示氨基酸序列的轻链可变区CDR2；和包含SEQ ID NO:26所示氨基酸序列的轻链可变区CDR3；
(d)包含SEQ ID NO:27所示氨基酸序列的重链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:28所示氨基酸序列的重链可变区CDR2；包含SEQ ID NO:29所示氨基酸序列的重链可变区CDR3；包含SEQ ID NO:30所示氨基酸序列的轻链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:31所示氨基酸序列的轻链可变区CDR2；和包含SEQ ID NO:32所示氨基酸序列的轻链可变区CDR3；
(e)包含SEQ ID NO:33所示氨基酸序列的重链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:34所示氨基酸序列的重链可变区CDR2；包含SEQ ID NO:35所示氨基酸序列的重链可变区CDR3；包含SEQ ID NO:36所示氨基酸序列的轻链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:37所示氨基酸序列的轻链可变区CDR2；和包含SEQ ID NO:38所示氨基酸序列的轻链可变区CDR3；
(f)包含SEQ ID NO:39所示氨基酸序列的重链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:40所示氨基酸序列的重链可变区CDR2；包含SEQ ID NO:41所示氨基酸序列的重链可变区CDR3；包含SEQ ID NO:42所示氨基酸序列的轻链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:43所示氨基酸序列的轻链可变区CDR2；和包含SEQ ID NO:44所示氨基酸序列的轻链可变区CDR3；
(g)包含SEQ ID NO:45所示氨基酸序列的重链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:46所示氨基酸序列的重链可变区CDR2；包含SEQ ID NO:47所示氨基酸序列的重链可变区CDR3；包含SEQ ID NO:48所示氨基酸序列的轻链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:49所示氨基酸序列的轻链可变区CDR2；和包含SEQ ID NO:50所示氨基酸序列的轻链可变区CDR3；或
(h)包含SEQ ID NO:51所示氨基酸序列的重链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:52所示氨基酸序列的重链可变区CDR2；包含SEQ ID NO:53所示氨基酸序列的重链可变区CDR3；包含SEQ ID NO:54所示氨基酸序列的轻链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:55所示氨基酸序列的轻链可变区CDR2；和包含SEQ ID NO:56所示氨基酸序列的轻链可变区CDR3。
16.根据权利要求15所述的抗体或其抗原结合部分，所述抗体或其抗原结合部分包含：包含SEQ ID NO:39所示氨基酸序列的重链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:40所示氨基酸序列的重链可变区CDR2；包含SEQ ID NO:41所示氨基酸序列的重链可变区CDR3；包含SEQ IDNO:42所示氨基酸序列的轻链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:43所示氨基酸序列的轻链可变区CDR2；和包含SEQ ID NO:44所示氨基酸序列的轻链可变区CDR3。
17.根据权利要求1-8和10-15中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，所述抗体或其抗原结合部分包含重链可变区，所述重链可变区包含与选自SEQ ID NO:93、95、97、99、101、103、105和107的序列至少约80％同源的氨基酸序列。
18.根据权利要求17所述的抗体或其抗原结合部分，所述抗体或其抗原结合部分包含重链可变区，所述重链可变区包含选自SEQ ID NO:93、95、97、99、101、103、105和107的氨基酸序列。
19.根据权利要求1-8和10-15中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，所述抗体或其抗原结合部分包含轻链可变区，所述轻链可变区包含与选自SEQ ID NO:94、96、98、100、102、104、106和108的序列至少约80％同源的氨基酸序列。
20.根据权利要求19所述的抗体或其抗原结合部分，所述抗体或其抗原结合部分包含轻链可变区，所述轻链可变区包含选自SEQ ID NO:94、96、98、100、102、104、106和108的氨基酸序列。
21.根据权利要求17-20中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，所述抗体或其抗原结合部分包含：
(a)包含与SEQ ID NO:93所示氨基酸序列至少约80％同源的氨基酸序列的重链可变区、和包含与SEQ ID NO:94所示氨基酸序列至少约80％同源的氨基酸序列的轻链可变区；
(b)包含与SEQ ID NO:95所示氨基酸序列至少约80％同源的氨基酸序列的重链可变区、和包含与SEQ ID NO:96所示氨基酸序列至少约80％同源的氨基酸序列的轻链可变区；
(c)包含与SEQ ID NO:97所示氨基酸序列至少约80％同源的氨基酸序列的重链可变区、和包含与SEQ ID NO:98所示氨基酸序列至少约80％同源的氨基酸序列的轻链可变区；
(d)包含与SEQ ID NO:99所示氨基酸序列至少约80％同源的氨基酸序列的重链可变区、和包含与SEQ ID NO:100所示氨基酸序列至少约80％同源的氨基酸序列的轻链可变区；
(e)包含与SEQ ID NO:101所示氨基酸序列至少约80％同源的氨基酸序列的重链可变区、和包含与SEQ ID NO:102所示氨基酸序列至少约80％同源的氨基酸序列的轻链可变区；
(f)包含与SEQ ID NO:103所示氨基酸序列至少约80％同源的氨基酸序列的重链可变区、和包含与SEQ ID NO:104所示氨基酸序列至少约80％同源的氨基酸序列的轻链可变区；
(g)包含与SEQ ID NO:105所示氨基酸序列至少约80％同源的氨基酸序列的重链可变区、和包含与SEQ ID NO:106所示氨基酸序列至少约80％同源的氨基酸序列的轻链可变区；或
(h)包含与SEQ ID NO:107所示氨基酸序列至少约80％同源的氨基酸序列的重链可变区、和包含与SEQ ID NO:108所示氨基酸序列至少约80％同源的氨基酸序列的轻链可变区。
22.根据权利要求21所述的抗体或其抗原结合部分，所述抗体或其抗原结合部分包含：
(a)包含SEQ ID NO:93所示氨基酸序列的重链可变区、和包含SEQ ID NO:94所示氨基酸序列的轻链可变区；
(b)包含SEQ ID NO:95所示氨基酸序列的重链可变区、和包含SEQ ID NO:96所示氨基酸序列的轻链可变区；
(c)包含SEQ ID NO:97所示氨基酸序列的重链可变区、和包含SEQ ID NO:98所示氨基酸序列的轻链可变区；
(d)包含SEQ ID NO:99所示氨基酸序列的重链可变区、和包含SEQ ID NO:100所示氨基酸序列的轻链可变区；
(e)包含SEQ ID NO:101所示氨基酸序列的重链可变区、和包含SEQ ID NO:102所示氨基酸序列的轻链可变区；
(f)包含SEQ ID NO:103所示氨基酸序列的重链可变区、和包含SEQ ID NO:104所示氨基酸序列的轻链可变区；
(g)包含SEQ ID NO:105所示氨基酸序列的重链可变区、和包含SEQ ID NO:106所示氨基酸序列的轻链可变区；或
(h)包含SEQ ID NO:107所示氨基酸序列的重链可变区、和包含SEQ ID NO:108所示氨基酸序列的轻链可变区。
23.根据权利要求22所述的抗体或其抗原结合部分，所述抗体或其抗原结合部分包含：包含SEQ ID NO:103所示氨基酸序列的重链可变区、和包含SEQ ID NO:104所示氨基酸序列的轻链可变区。
24.根据权利要求11所述的抗体或其抗原结合部分，其中所述Foxp3肽是具有SEQ IDNO:3所示氨基酸序列的Foxp3-2。
25.根据权利要求24所述的抗体或其抗原结合部分，所述抗体或其抗原结合部分包含选自以下的重链可变区CDR3序列和轻链可变区CDR3序列：
(a)包含SEQ ID NO:59所示氨基酸序列或其修饰的重链可变区CDR3序列、和包含SEQID NO:62所示氨基酸序列或其修饰的轻链可变区CDR3序列；
(b)包含SEQ ID NO:65所示氨基酸序列或其修饰的重链可变区CDR3序列、和包含SEQID NO:68所示氨基酸序列或其修饰的轻链可变区CDR3序列；
(c)包含SEQ ID NO:71所示氨基酸序列或其修饰的重链可变区CDR3序列、和包含SEQID NO:74所示氨基酸序列或其修饰的轻链可变区CDR3序列；
(d)包含SEQ ID NO:77所示氨基酸序列或其修饰的重链可变区CDR3序列、和包含SEQID NO:80所示氨基酸序列或其修饰的轻链可变区CDR3序列；和
(e)包含SEQ ID NO:83所示氨基酸序列或其修饰的重链可变区CDR3序列、和包含SEQID NO:86所示氨基酸序列或其修饰的轻链可变区CDR3序列。
26.根据权利要求24或25所述的抗体或其抗原结合部分，所述抗体或其抗原结合部分还包含选自以下的重链可变区CDR2序列和轻链可变区CDR2序列：
(a)包含SEQ ID NO:58所示氨基酸序列或其修饰的重链可变区CDR2序列、和包含SEQID NO:61所示氨基酸序列或其修饰的轻链可变区CDR2序列；
(b)包含SEQ ID NO:64所示氨基酸序列或其修饰的重链可变区CDR2序列、和包含SEQID NO:67所示氨基酸序列或其修饰的轻链可变区CDR2序列；
(c)包含SEQ ID NO:70所示氨基酸序列或其修饰的重链可变区CDR2序列、和包含SEQID NO:73所示氨基酸序列或其修饰的轻链可变区CDR2序列；
(d)包含SEQ ID NO:76所示氨基酸序列或其修饰的重链可变区CDR2序列、和包含SEQID NO:79所示氨基酸序列或其修饰的轻链可变区CDR2序列；和
(e)包含SEQ ID NO:82所示氨基酸序列或其修饰的重链可变区CDR2序列、和包含SEQID NO:85所示氨基酸序列或其修饰的轻链可变区CDR2序列。
27.根据权利要求24、25或26所述的抗体或其抗原结合部分，所述抗体或其抗原结合部分还包含选自以下的重链可变区CDR1序列和轻链可变区CDR1序列：
(a)包含SEQ ID NO:57所示氨基酸序列或其修饰的重链可变区CDR1序列、和包含SEQID NO:60所示氨基酸序列或其修饰的轻链可变区CDR1序列；
(b)包含SEQ ID NO:63所示氨基酸序列或其修饰的重链可变区CDR1序列、和包含SEQID NO:66所示氨基酸序列或其修饰的轻链可变区CDR1序列；
(c)包含SEQ ID NO:69所示氨基酸序列或其修饰的重链可变区CDR1序列、和包含SEQID NO:71所示氨基酸序列或其修饰的轻链可变区CDR1序列；
(d)包含SEQ ID NO:75所示氨基酸序列或其修饰的重链可变区CDR1序列、和包含SEQID NO:78所示氨基酸序列或其修饰的轻链可变区CDR1序列；和
(e)包含SEQ ID NO:81所示氨基酸序列或其修饰的重链可变区CDR1序列、和包含SEQID NO:84所示氨基酸序列或其修饰的轻链可变区CDR1序列。
28.根据权利要求24-27中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，所述抗体或其抗原结合部分包含重链可变区，所述重链可变区包含与选自SEQ ID NO:109、111、113、115和117的序列至少约80％同源的氨基酸序列。
29.根据权利要求24-28中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，所述抗体或其抗原结合部分包含轻链可变区，所述轻链可变区包含与选自SEQ ID NO:110、112、114、116和118的序列至少约80％同源的氨基酸序列。
30.根据权利要求11所述的抗体或其抗原结合部分，其中所述Foxp3肽是具有SEQ IDNO:5所示氨基酸序列的Foxp3-4。
31.根据权利要求30所述的抗体或其抗原结合部分，所述抗体或其抗原结合部分包含：包含SEQ ID NO:89所示氨基酸序列或其修饰的重链可变区CDR3序列、和包含SEQ ID NO:92所示氨基酸序列或其修饰的轻链可变区CDR3序列。
32.根据权利要求30或31所述的抗体或其抗原结合部分，所述抗体或其抗原结合部分包含：包含SEQ ID NO:88所示氨基酸序列或其修饰的重链可变区CDR2序列、和包含SEQ IDNO:91所示氨基酸序列或其修饰的轻链可变区CDR2序列。
33.根据权利要求30、31或32所述的抗体或其抗原结合部分，所述抗体或其抗原结合部分包含：包含SEQ ID NO:87所示氨基酸序列或其修饰的重链可变区CDR1序列、和包含SEQID NO:90所示氨基酸序列或其修饰的轻链可变区CDR2序列。
34.根据权利要求30-33中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，所述抗体或其抗原结合部分包含重链可变区，所述重链可变区包含与SEQ ID NO:119所示氨基酸序列至少约80％同源的氨基酸序列。
35.根据权利要求30-34中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，所述抗体或其抗原结合部分包含轻链可变区，所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:120所示氨基酸序列至少约80％同源的氨基酸序列。
36.根据权利要求1-35中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，所述抗体或其抗原结合部分与结合于所述人MHC分子的所述Foxp3肽的N-末端、或与结合于所述人MHC分子的所述Foxp3肽的C-末端结合。
37.根据权利要求1-36中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，所述抗体或其抗原结合部分以约1x 10-7M或更低的结合亲和力(KD)与Foxp3肽/MHC复合物结合。
38.一种分离的抗体或其抗原结合部分，所述抗体或其抗原结合部分与参考抗体或抗原结合部分交叉竞争对结合于人MHC分子的Foxp3肽的结合，所述参考抗体或抗原结合部分包含：
(a)包含SEQ ID NO:9所示氨基酸序列的重链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:10所示氨基酸序列的重链可变区CDR2；包含SEQ ID NO:11所示氨基酸序列的重链可变区CDR3；包含SEQID NO:12所示氨基酸序列的轻链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:13所示氨基酸序列的轻链可变区CDR2；和包含SEQ ID NO:14所示氨基酸序列的轻链可变区CDR3；
(b)包含SEQ ID NO:15所示氨基酸序列的重链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:16所示氨基酸序列的重链可变区CDR2；包含SEQ ID NO:17所示氨基酸序列的重链可变区CDR3；包含SEQ ID NO:18所示氨基酸序列的轻链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:19所示氨基酸序列的轻链可变区CDR2；和包含SEQ ID NO:20所示氨基酸序列的轻链可变区CDR3；
(c)包含SEQ ID NO:21所示氨基酸序列的重链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:22所示氨基酸序列的重链可变区CDR2；包含SEQ ID NO:23所示氨基酸序列的重链可变区CDR3；包含SEQ ID NO:24所示氨基酸序列的轻链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:25所示氨基酸序列的轻链可变区CDR2；和包含SEQ ID NO:26所示氨基酸序列的轻链可变区CDR3；
(d)包含SEQ ID NO:27所示氨基酸序列的重链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:28所示氨基酸序列的重链可变区CDR2；包含SEQ ID NO:29所示氨基酸序列的重链可变区CDR3；包含SEQ ID NO:30所示氨基酸序列的轻链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:31所示氨基酸序列的轻链可变区CDR2；和包含SEQ ID NO:32所示氨基酸序列的轻链可变区CDR3；
(e)包含SEQ ID NO:33所示氨基酸序列的重链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:34所示氨基酸序列的重链可变区CDR2；包含SEQ ID NO:35所示氨基酸序列的重链可变区CDR3；包含SEQ ID NO:36所示氨基酸序列的轻链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:37所示氨基酸序列的轻链可变区CDR2；和包含SEQ ID NO:38所示氨基酸序列的轻链可变区CDR3；
(f)包含SEQ ID NO:39所示氨基酸序列的重链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:40所示氨基酸序列的重链可变区CDR2；包含SEQ ID NO:41所示氨基酸序列的重链可变区CDR3；包含SEQ ID NO:42所示氨基酸序列的轻链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:43所示氨基酸序列的轻链可变区CDR2；和包含SEQ ID NO:44所示氨基酸序列的轻链可变区CDR3；
(g)包含SEQ ID NO:45所示氨基酸序列的重链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:46所示氨基酸序列的重链可变区CDR2；包含SEQ ID NO:47所示氨基酸序列的重链可变区CDR3；包含SEQ ID NO:48所示氨基酸序列的轻链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:49所示氨基酸序列的轻链可变区CDR2；和包含SEQ ID NO:50所示氨基酸序列的轻链可变区CDR3；
(h)包含SEQ ID NO:51所示氨基酸序列的重链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:52所示氨基酸序列的重链可变区CDR2；包含SEQ ID NO:53所示氨基酸序列的重链可变区CDR3；包含SEQ ID NO:54所示氨基酸序列的轻链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:55所示氨基酸序列的轻链可变区CDR2；和包含SEQ ID NO:56所示氨基酸序列的轻链可变区CDR3；
(i)包含SEQ ID NO:57所示氨基酸序列的重链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:58所示氨基酸序列的重链可变区CDR2；包含SEQ ID NO:59所示氨基酸序列的重链可变区CDR3；包含SEQ ID NO:60所示氨基酸序列的轻链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:61所示氨基酸序列的轻链可变区CDR2；和包含SEQ ID NO:62所示氨基酸序列的轻链可变区CDR3；
(j)包含SEQ ID NO:63所示氨基酸序列的重链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:64所示氨基酸序列的重链可变区CDR2；包含SEQ ID NO:65所示氨基酸序列的重链可变区CDR3；包含SEQ ID NO:66所示氨基酸序列的轻链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:67所示氨基酸序列的轻链可变区CDR2；和包含SEQ ID NO:68所示氨基酸序列的轻链可变区CDR3；
(k)包含SEQ ID NO:69所示氨基酸序列的重链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:70所示氨基酸序列的重链可变区CDR2；包含SEQ ID NO:71所示氨基酸序列的重链可变区CDR3；包含SEQ ID NO:72所示氨基酸序列的轻链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:73所示氨基酸序列的轻链可变区CDR2；和包含SEQ ID NO:74所示氨基酸序列的轻链可变区CDR3；
(l)包含SEQ ID NO:75所示氨基酸序列的重链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:76所示氨基酸序列的重链可变区CDR2；包含SEQ ID NO:77所示氨基酸序列的重链可变区CDR3；包含SEQ ID NO:78所示氨基酸序列的轻链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:79所示氨基酸序列的轻链可变区CDR2；和包含SEQ ID NO:80所示氨基酸序列的轻链可变区CDR3；
(m)包含SEQ ID NO:81所示氨基酸序列的重链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:82所示氨基酸序列的重链可变区CDR2；包含SEQ ID NO:83所示氨基酸序列的重链可变区CDR3；包含SEQ ID NO:84所示氨基酸序列的轻链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:85所示氨基酸序列的轻链可变区CDR2；和包含SEQ ID NO:86所示氨基酸序列的轻链可变区CDR3；或
(n)包含SEQ ID NO:87所示氨基酸序列的重链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:88所示氨基酸序列的重链可变区CDR2；包含SEQ ID NO:89所示氨基酸序列的重链可变区CDR3；包含SEQ ID NO:90所示氨基酸序列的轻链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:91所示氨基酸序列的轻链可变区CDR2；和包含SEQ ID NO:92所示氨基酸序列的轻链可变区CDR3，并且
其中所述交叉竞争抗体或其抗原结合部分以约5x 10-7M或更低的结合亲和力(KD)与Foxp3肽/MHC复合物特异性地结合。
39.一种分离的抗体或其抗原结合部分，所述抗体或其抗原结合部分与参考抗体或抗原结合部分结合到与MHC分子结合的Foxp3肽上的相同表位，所述参考抗体或抗原结合部分包含：
(a)包含SEQ ID NO:9所示氨基酸序列的重链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:10所示氨基酸序列的重链可变区CDR2；包含SEQ ID NO:11所示氨基酸序列的重链可变区CDR3；包含SEQID NO:12所示氨基酸序列的轻链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:13所示氨基酸序列的轻链可变区CDR2；和包含SEQ ID NO:14所示氨基酸序列的轻链可变区CDR3；
(b)包含SEQ ID NO:15所示氨基酸序列的重链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:16所示氨基酸序列的重链可变区CDR2；包含SEQ ID NO:17所示氨基酸序列的重链可变区CDR3；包含SEQ ID NO:18所示氨基酸序列的轻链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:19所示氨基酸序列的轻链可变区CDR2；和包含SEQ ID NO:20所示氨基酸序列的轻链可变区CDR3；
(c)包含SEQ ID NO:21所示氨基酸序列的重链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:22所示氨基酸序列的重链可变区CDR2；包含SEQ ID NO:23所示氨基酸序列的重链可变区CDR3；包含SEQ ID NO:24所示氨基酸序列的轻链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:25所示氨基酸序列的轻链可变区CDR2；和包含SEQ ID NO:26所示氨基酸序列的轻链可变区CDR3；
(d)包含SEQ ID NO:27所示氨基酸序列的重链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:28所示氨基酸序列的重链可变区CDR2；包含SEQ ID NO:29所示氨基酸序列的重链可变区CDR3；包含SEQ ID NO:30所示氨基酸序列的轻链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:31所示氨基酸序列的轻链可变区CDR2；和包含SEQ ID NO:32所示氨基酸序列的轻链可变区CDR3；
(e)包含SEQ ID NO:33所示氨基酸序列的重链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:34所示氨基酸序列的重链可变区CDR2；包含SEQ ID NO:35所示氨基酸序列的重链可变区CDR3；包含SEQ ID NO:36所示氨基酸序列的轻链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:37所示氨基酸序列的轻链可变区CDR2；和包含SEQ ID NO:38所示氨基酸序列的轻链可变区CDR3；
(f)包含SEQ ID NO:39所示氨基酸序列的重链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:40所示氨基酸序列的重链可变区CDR2；包含SEQ ID NO:41所示氨基酸序列的重链可变区CDR3；包含SEQ ID NO:42所示氨基酸序列的轻链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:43所示氨基酸序列的轻链可变区CDR2；和包含SEQ ID NO:44所示氨基酸序列的轻链可变区CDR3；
(g)包含SEQ ID NO:45所示氨基酸序列的重链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:46所示氨基酸序列的重链可变区CDR2；包含SEQ ID NO:47所示氨基酸序列的重链可变区CDR3；包含SEQ ID NO:48所示氨基酸序列的轻链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:49所示氨基酸序列的轻链可变区CDR2；和包含SEQ ID NO:50所示氨基酸序列的轻链可变区CDR3；
(h)包含SEQ ID NO:51所示氨基酸序列的重链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:52所示氨基酸序列的重链可变区CDR2；包含SEQ ID NO:53所示氨基酸序列的重链可变区CDR3；包含SEQ ID NO:54所示氨基酸序列的轻链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:55所示氨基酸序列的轻链可变区CDR2；和包含SEQ ID NO:56所示氨基酸序列的轻链可变区CDR3；
(i)包含SEQ ID NO:57所示氨基酸序列的重链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:58所示氨基酸序列的重链可变区CDR2；包含SEQ ID NO:59所示氨基酸序列的重链可变区CDR3；包含SEQ ID NO:60所示氨基酸序列的轻链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:61所示氨基酸序列的轻链可变区CDR2；和包含SEQ ID NO:62所示氨基酸序列的轻链可变区CDR3；
(j)包含SEQ ID NO:63所示氨基酸序列的重链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:64所示氨基酸序列的重链可变区CDR2；包含SEQ ID NO:65所示氨基酸序列的重链可变区CDR3；包含SEQ ID NO:66所示氨基酸序列的轻链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:67所示氨基酸序列的轻链可变区CDR2；和包含SEQ ID NO:68所示氨基酸序列的轻链可变区CDR3；
(k)包含SEQ ID NO:69所示氨基酸序列的重链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:70所示氨基酸序列的重链可变区CDR2；包含SEQ ID NO:71所示氨基酸序列的重链可变区CDR3；包含SEQ ID NO:72所示氨基酸序列的轻链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:73所示氨基酸序列的轻链可变区CDR2；和包含SEQ ID NO:74所示氨基酸序列的轻链可变区CDR3；
(l)包含SEQ ID NO:75所示氨基酸序列的重链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:76所示氨基酸序列的重链可变区CDR2；包含SEQ ID NO:77所示氨基酸序列的重链可变区CDR3；包含SEQ ID NO:78所示氨基酸序列的轻链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:79所示氨基酸序列的轻链可变区CDR2；和包含SEQ ID NO:80所示氨基酸序列的轻链可变区CDR3；
(m)包含SEQ ID NO:81所示氨基酸序列的重链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:82所示氨基酸序列的重链可变区CDR2；包含SEQ ID NO:83所示氨基酸序列的重链可变区CDR3；包含SEQ ID NO:84所示氨基酸序列的轻链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:85所示氨基酸序列的轻链可变区CDR2；和包含SEQ ID NO:86所示氨基酸序列的轻链可变区CDR3；或
(n)包含SEQ ID NO:87所示氨基酸序列的重链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:88所示氨基酸序列的重链可变区CDR2；包含SEQ ID NO:89所示氨基酸序列的重链可变区CDR3；包含SEQ ID NO:90所示氨基酸序列的轻链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:91所示氨基酸序列的轻链可变区CDR2；和包含SEQ ID NO:92所示氨基酸序列的轻链可变区CDR3。
40.一种分离的抗体或其抗原结合部分，所述抗体或其抗原结合部分与参考抗体或抗原结合部分交叉竞争对结合于MHC分子的Foxp3肽的结合，所述参考抗体或抗原结合部分包含：
(a)包含SEQ ID NO:93所示氨基酸序列的重链可变区、和包含SEQ ID NO:94所示氨基酸序列的轻链可变区；
(b)包含SEQ ID NO:95所示氨基酸序列的重链可变区、和包含SEQ ID NO:96所示氨基酸序列的轻链可变区；
(c)包含SEQ ID NO:97所示氨基酸序列的重链可变区、和包含SEQ ID NO:98所示氨基酸序列的轻链可变区；
(d)包含SEQ ID NO:99所示氨基酸序列的重链可变区、和包含SEQ ID NO:100所示氨基酸序列的轻链可变区；
(e)包含SEQ ID NO:101所示氨基酸序列的重链可变区、和包含SEQ ID NO:102所示氨基酸序列的轻链可变区；
(f)包含SEQ ID NO:103所示氨基酸序列的重链可变区、和包含SEQ ID NO:104所示氨基酸序列的轻链可变区；
(g)包含SEQ ID NO:105所示氨基酸序列的重链可变区、和包含SEQ ID NO:106所示氨基酸序列的轻链可变区；
(h)包含SEQ ID NO:107所示氨基酸序列的重链可变区、和包含SEQ ID NO:108所示氨基酸序列的轻链可变区；
(i)包含SEQ ID NO:109所示氨基酸序列的重链可变区、和包含SEQ ID NO:110所示氨基酸序列的轻链可变区；
(j)包含SEQ ID NO:111所示氨基酸序列的重链可变区、和包含SEQ ID NO:112所示氨基酸序列的轻链可变区；
(k)包含SEQ ID NO:113所示氨基酸序列的重链可变区、和包含SEQ ID NO:114所示氨基酸序列的轻链可变区；
(l)包含SEQ ID NO:115所示氨基酸序列的重链可变区、和包含SEQ ID NO:116所示氨基酸序列的轻链可变区；
(m)包含SEQ ID NO:117所示氨基酸序列的重链可变区、和包含SEQ ID NO:118所示氨基酸序列的轻链可变区；或
(n)包含SEQ ID NO:119所示氨基酸序列的重链可变区、和包含SEQ ID NO:120所示氨基酸序列的轻链可变区，并且
其中所述交叉竞争抗体或其抗原结合部分以约5x 10-7M或更低的结合亲和力(KD)与Foxp3肽/MHC复合物特异性地结合。
41.一种分离的抗体或其抗原结合部分，所述抗体或其抗原结合部分与参考抗体或抗原结合部分结合到与MHC分子结合的Foxp3肽上的相同表位，所述参考抗体或抗原结合部分包含：
(a)包含SEQ ID NO:93所示氨基酸序列的重链可变区、和包含SEQ ID NO:94所示氨基酸序列的轻链可变区；
(b)包含SEQ ID NO:95所示氨基酸序列的重链可变区、和包含SEQ ID NO:96所示氨基酸序列的轻链可变区；
(c)包含SEQ ID NO:97所示氨基酸序列的重链可变区、和包含SEQ ID NO:98所示氨基酸序列的轻链可变区；
(d)包含SEQ ID NO:99所示氨基酸序列的重链可变区、和包含SEQ ID NO:100所示氨基酸序列的轻链可变区；
(e)包含SEQ ID NO:101所示氨基酸序列的重链可变区、和包含SEQ ID NO:102所示氨基酸序列的轻链可变区；
(f)包含SEQ ID NO:103所示氨基酸序列的重链可变区、和包含SEQ ID NO:104所示氨基酸序列的轻链可变区；
(g)包含SEQ ID NO:105所示氨基酸序列的重链可变区、和包含SEQ ID NO:106所示氨基酸序列的轻链可变区；
(h)包含SEQ ID NO:107所示氨基酸序列的重链可变区、和包含SEQ ID NO:108所示氨基酸序列的轻链可变区；
(i)包含SEQ ID NO:109所示氨基酸序列的重链可变区、和包含SEQ ID NO:110所示氨基酸序列的轻链可变区；
(j)包含SEQ ID NO:111所示氨基酸序列的重链可变区、和包含SEQ ID NO:112所示氨基酸序列的轻链可变区；
(k)包含SEQ ID NO:113所示氨基酸序列的重链可变区、和包含SEQ ID NO:114所示氨基酸序列的轻链可变区；
(l)包含SEQ ID NO:115所示氨基酸序列的重链可变区、和包含SEQ ID NO:116所示氨基酸序列的轻链可变区；
(m)包含SEQ ID NO:117所示氨基酸序列的重链可变区、和包含SEQ ID NO:118所示氨基酸序列的轻链可变区；或
(n)包含SEQ ID NO:119所示氨基酸序列的重链可变区、和包含SEQ ID NO:120所示氨基酸序列的轻链可变区。
42.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体包含人可变区框架区。
43.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，所述抗体或其抗原结合部分是全人抗体或其抗原结合部分、嵌合抗体或其抗原结合部分、或人源化抗体或其抗原结合部分。
44.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体的抗原结合部分是Fab、Fab'、F(ab')2、Fv或单链Fv(scFv)。
45.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，所述抗体或其抗原结合部分是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同种型。
46.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，所述抗体或其抗原结合部分包含一种或多种翻译后修饰。
47.根据权利要求46所述的抗体或其抗原结合部分，其中所述一种或多种翻译后修饰包含无岩藻糖基化。
48.根据权利要求47所述的抗体或其抗原结合部分，所述抗体或其抗原结合部分包含无岩藻糖基化的Fc区。
49.一种免疫缀合物，其包含连接到治疗剂的权利要求1-48中任一项所述的抗体或其抗原结合部分。
50.根据权利要求49所述的免疫缀合物，其中所述治疗剂是药物、细胞毒素、或放射性同位素。
51.一种双特异性分子，其包含连接到第二功能性部分的权利要求1-48中任一项所述的抗体或其抗原结合部分。
52.根据权利要求51所述的双特异性分子，其识别结合于所述MHC分子的Foxp3肽和细胞表面蛋白。
53.根据权利要求52所述的双特异性分子，其中所述细胞表面蛋白是CD3或CD16。
54.一种组合物，其包含权利要求1-48中任一项所述的抗体或其抗原结合部分、权利要求49或50所述的免疫缀合物、或权利要求51-53中任一项所述的双特异性分子，以及药学上可接受的载体。
55.一种分离的核酸，其编码权利要求1-48中任一项所述的抗体或其抗原结合部分。
56.一种表达载体，其包含权利要求55所述的核酸分子。
57.一种宿主细胞，其包含权利要求56所述的表达载体。
58.一种用于检测全细胞或组织中的Foxp3的方法，其包括：
(a)使细胞或组织与抗体或其抗原结合部分接触，所述抗体或其抗原结合部分与结合于人MHC分子的Foxp3肽结合，其中所述抗体或其抗原结合部分包含可检测标记；和
(b)通过测量与所述细胞或组织相关的可检测标记的量来测定结合于所述细胞或组织的带标记的抗体或其抗原结合部分的量，其中结合的抗体或其抗原结合部分的量表示所述细胞或组织中Foxp3的量。
59.根据权利要求58所述的方法，其中所述抗体或其抗原结合部分是权利要求1-48中任一项所述的抗体或其抗原结合部分。
60.一种嵌合抗原受体(CAR)，其对结合于人MHC分子的Foxp3肽具有特异性。
61.根据权利要求60中任一项所述的CAR，其中所述Foxp3肽选自具有SEQ ID NO:8所示氨基酸序列的Foxp3-7或其一部分；具有SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的Foxp3-1或其一部分、具有SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的Foxp3-2或其一部分、具有SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的Foxp3-3或其一部分、具有SEQ ID NO:5所示氨基酸序列的Foxp3-4或其一部分、具有SEQ ID NO:6所示氨基酸序列的Foxp3-5或其一部分、和具有SEQ ID NO:7所示氨基酸序列的Foxp3-6或其一部分。
62.根据权利要求60-61中任一项所述的CAR，其中所述CAR包含权利要求1-48中任一项所述的抗原结合部分。
63.根据权利要求60-62中任一项所述的CAR，其中所述抗原结合部分包含单链可变片段(scFv)。
64.根据权利要求63所述的CAR，其中所述scFv是人scFv。
65.根据权利要求64所述的CAR，其中所述人scFv包含选自SEQ ID NO:121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、和134的氨基酸序列。
66.一种分离的核酸，其编码权利要求60-65中任一项所述的CAR。
67.一种载体，其包含权利要求66所述的分离的核酸。
68.一种宿主细胞，其包含权利要求67所述的核酸。
69.一种杀伤表达Foxp3的细胞、诱导免疫应答、和/或治疗癌症的方法，其包括使表达Foxp3的细胞与以下中的一种接触：
(a)权利要求1-48中任一项所述的抗体或其抗原结合部分；
(b)权利要求60-65中任一项所述的CAR；
(c)权利要求51-53中任一项所述的双特异性抗体；
(d)权利要求49或50所述的免疫缀合物；和
(d)或权利要求54所述的组合物。
70.权利要求1-48中任一项所述的抗体或其抗原结合部分、权利要求60-65中任一项所述的CAR、权利要求51-53中任一项所述的双特异性抗体、权利要求49或50所述的免疫缀合物、或权利要求54所述的组合物用于杀伤表达Foxp3的细胞、和/或用于诱导免疫应答的用途。
71.权利要求1-48中任一项所述的抗体或其抗原结合部分、权利要求60-65中任一项所述的CAR、权利要求51-53中任一项所述的双特异性抗体、权利要求49或50所述的免疫缀合物、或权利要求54所述的组合物，用于杀伤表达Foxp3的细胞、和/或用于诱导免疫应答。
72.根据权利要求69所述的方法，根据权利要求70所述的用途，或根据权利要求71所述的抗体、CAR、双特异性抗体、免疫缀合物或组合物，其中所述表达Foxp3的细胞是选自以下的T细胞：CD4+T细胞、CD25高T细胞、CD127低T细胞、Foxp3高T细胞、及其组合。
73.一种选择性地抑制受试者的T细胞的方法，其包括将以下中的一种施用于所述受试者：
(a)权利要求1-48中任一项所述的抗体或其抗原结合部分；
(b)权利要求60-65中任一项所述的CAR；
(c)权利要求51-53中任一项所述的双特异性抗体；
(d)权利要求49或50所述的免疫缀合物；和
(d)或权利要求54所述的组合物，
其中所述T细胞选自CD4+T细胞、CD25高T细胞、CD127低T细胞、Foxp3高T细胞、及其组合。
74.权利要求1-48中任一项所述的抗体或其抗原结合部分、权利要求60-65中任一项所述的CAR、权利要求51-53中任一项所述的双特异性抗体、权利要求49或50所述的免疫缀合物、或权利要求54所述的组合物用于选择性地抑制受试者的T细胞的用途，其中所述T细胞选自CD4+T细胞、CD25高T细胞、CD127低T细胞、Foxp3高T细胞、及其组合。
75.权利要求1-48中任一项所述的抗体或其抗原结合部分、权利要求60-65中任一项所述的CAR、权利要求51-53中任一项所述的双特异性抗体、权利要求49或50所述的免疫缀合物、或权利要求54所述的组合物，用于选择性地抑制T细胞，其中所述T细胞选自CD4+T细胞、CD25高T细胞、CD127低T细胞、Foxp3高T细胞、及其组合。
76.根据权利要求69、72和73中任一项所述的方法，根据权利要求70、72和74中任一项所述的用途，或根据权利要求71、72和75中任一项所述的抗体、CAR、双特异性抗体、免疫缀合物或组合物，其中所述受试者患有癌症。
77.根据权利要求69、72、73和76中任一项所述的方法，根据权利要求70、72、74和76中任一项所述的用途，或根据权利要求71、72、75和76中任一项所述的抗体、CAR、双特异性抗体、免疫缀合物或组合物，包括以下的一种或多种：
(i)减少T细胞的数量，
(ii)消耗所述T细胞，
(iii)抑制所述T细胞的免疫抑制活性，和
(iv)阻断所述T细胞运输到淋巴结中；
(v)抑制所述T细胞；和
(vi)诱导癌细胞的死亡。
78.根据权利要求72、73、76和77中任一项所述的方法，根据权利要求72、74、76和77中任一项所述的用途，或根据权利要求72、75、76和77中任一项所述的抗体、CAR、双特异性抗体、免疫缀合物或组合物，其中所述T细胞是调节性T细胞。
79.根据权利要求69、72、73和76-78中任一项所述的方法，根据权利要求70、72、74和76-78中任一项所述的用途，或根据权利要求71、72和75-78中任一项所述的抗体、CAR、双特异性抗体、免疫缀合物或组合物，其中所述癌症选自乳腺癌、卵巢癌、黑色素瘤、肺癌、胰腺癌、胃癌、结肠癌、成胶质细胞瘤、肾癌、肝癌、淋巴瘤、白血病、骨髓瘤、肉瘤、及其组合。
80.根据权利要求69、72、73和76-79中任一项所述的方法，根据权利要求70、72、74和76-79中任一项所述的用途，或根据权利要求71、72和75-79中任一项所述的抗体、CAR、双特异性抗体、免疫缀合物或组合物，其中所述受试者是人。
81.根据权利要求69、72、73和76-80中任一项所述的方法，根据权利要求70、72、74和76-80中任一项所述的用途，或根据权利要求71、72和75-80中任一项所述的抗体、CAR、双特异性抗体、免疫缀合物或组合物，其中所述受试者接受抗癌免疫疗法。
82.一种用于治疗癌症的试剂盒，其包含以下的一种或多种：
权利要求1-48中任一项所述的抗体或其抗原结合部分；
(b)权利要求60-65中任一项所述的CAR；
(c)权利要求51-53中任一项所述的双特异性抗体；
(d)权利要求49或50所述的免疫缀合物；和
(d)或权利要求54所述的组合物。
83.根据权利要求82所述的试剂盒，其中所述癌症选自乳腺癌、卵巢癌、黑色素瘤、肺癌、胰腺癌、胃癌、结肠癌、成胶质细胞瘤、肾癌、肝癌、淋巴瘤、白血病、骨髓瘤、肉瘤、及其组合。
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