CN105142668A - 治疗性肽 - Google Patents

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Abstract

本公开部分地提供了包含与限定的结合伙伴免疫特异性结合的肽的组合物，其中所述肽至少包含与表1所示的互补区相关的互补决定区。

Description

治疗性肽
相关专利申请
本申请要求获得2013年3月15日提交的美国临时专利申请系列号61/792,034和2013年12月6日提交的美国临时专利申请系列号61/913,198，的利益，本申请通过提述并入二者的全部内容。
政府资助
本发明是在美国国立卫生研究院批准基金号P01AI045757和P01CA78378的政府资助下完成的。美国政府对本发明具有某些权益。
技术领域
本发明涉及与人类受试者相关的治疗性组合物(例如，肽)。
背景
暴露于病症或疾病的人类受试者是具有治疗潜力的抗体的一个来源，获得此类抗体的一般方法是本领域已知的。然而，用于特异性获得具有治疗潜力的抗体的方法通常受表达此类抗体的B细胞的出现频率低、增殖速度缓慢，和抗体分泌水平低的限制。例如，具有限定的特异性的记忆B细胞通常在每百万个外周血单核细胞或者大约一毫升血液中仅占1个细胞(Lanzavecchia等人,Curr.Opin.Immunol.,21:298-304(2009):Yoshida等人,Immunol.Rev.,237:117-139(2010))。在癌症患者中，具有治疗潜力的抗体的频率很可能还要更低，这就使得开发能够以高灵敏度和效率分离这类细胞的新方法成为必要。
常规的方法通常依赖于通过体外培养和/或使用经免疫的动物模型(例如小鼠)将记忆B细胞转变成抗体分泌细胞(Crotty等人,J.Immunol.,171:4969-4973(2003):Fecteau等人,Immunology,128:e353-e365(2009):Buisman等人,Vaccine,28:179-186(2009):Corti等人,PLoSOne,5:e8805(2010))。例如，在体外培养长达1周之后，可以使用酶联免疫斑点(enzyme-linkedimmunosorbentspot)(ELISPOT)测定法测量培养物上清液中的抗体并对抗体分泌细胞的频率进行评估。这些方法的局限性已有报道(Henn等人,J.Immunol.,183:31777-3187(2009):Cao等人,J.Immunol.,Methods,358:56-65(2010))。例如，体外培养记忆B细胞会将记忆B细胞的表型变成类似于具有截然不同的功能性质的浆细胞(Jiang等人,Eur.J.Immunol.,37:2205-2213(2007):Huggins等人,Blood,109:1611-1619(2007):Jourdan等人,Blood,114:5173-5181(2009))。基于荧光抗原的方法的局限性也有报告(Hofer等人,Immunol.Rev.,211:295-302(2006):Odendahl等人,Blood,105:1614-1621(2005)；Kunkel等人,Nat.Rev.Immunol.,3:822-829(2003):Scheid等人,Nature,458:636-640(2009):Wu等人,Science,329:856-861(2010))。
需要改进特异性获得或靶定具有治疗潜力的抗体的方法。
MICA是NKG2D的一种配体，NKG2D是一种在大多数人NK细胞、γδT细胞和CD8+T细胞上表达的C型凝集素样II型跨膜受体。一旦偶联(ligation)后，NKG2D通过衔接子蛋白(adaptorprotein)DAP10传递信号，引发穿孔素依赖性细胞溶解，并提供共刺激。在人类中，NKG2D配体包括MHCI类链相关蛋白A(MICA)、与之密切近缘的MICB、UL-16结合蛋白(ULBP)1-4，和RAE-1G。尽管NKG2D配体通常不会在健康组织中被发现，但是各种形式的细胞胁迫，包括DNA损伤，可能上调配体表达，导致它们在多种实体瘤和血液恶性肿瘤，包括黑色素瘤中被频繁检测到。通过配体阳性转化细胞导致的NKG2D活化有助于外在肿瘤抑制，因为NKG2D缺陷小鼠和用抗-NKG2D阻断抗体处理的野生型小鼠表现出增强的肿瘤易感性。然而，在患者体内，可能由于NKG2D配体从肿瘤细胞脱落，引发表面NKG2D的内化并阻碍细胞毒淋巴细胞的功能，从而导致免疫逃逸。可溶性NKG2D配体也可能刺激调节性NKG2D+CD4+Foxp3-T细胞的扩增，该扩增可通过Fas配体、IL-10和TGF-β拮抗抗肿瘤细胞毒作用。MICA是一种从肿瘤细胞脱落，即从细胞表面释放到周围介质中的NKG2D配体，来自癌症患者的血清通常含有升高水平的可溶形式(sMICA)。MICA脱落部分地是通过与蛋白质二硫键异构酶ERp5相互作用实现的，ERp5与关键的半胱氨酸形成二硫键，导致α3结构域去折叠(unfolding)，使其容易遭受ADAM-10/17和MMP14的蛋白水解作用。
需要鉴定可特异性识别并结合癌症靶标从而作为基于免疫的癌症疗法的新作用剂。这样的作用剂将可用于对与肿瘤发展相关的疾病状态进行诊断筛查和治疗性干预。
概要
本公开提供与具有治疗潜力的抗体相关的组合物和方法。
在一些实施方案中，本公开了提供了组合物，其包含免疫特异性结合MHCI类多肽相关序列A(MICA)或其上的表位的肽。在一些方面中，该组合物的肽包含表1所示的抗体ID11的VH的互补决定区(CDR)3，其中具有5个或更少的保守氨基酸取代，和表1所示的抗体ID11的VL的CDR3，其中具有5个或更少的保守氨基酸取代。在一些方面中，这些肽包含表1所示的抗体ID11的VH的互补决定区(CDR)3和表1所示的抗体ID11的VL的CDR3。在一些方面中，肽进一步包含表1所示的抗体ID11的VH的CDR2，其中具有5个或更少的保守氨基酸取代，或表1所示的抗体ID11的VL的CDR2，其中具有5个或更少的保守氨基酸取代，或上述两者。在一些方面中，这样的肽包含表1所示的抗体ID11的VH的互补决定区CDR2，或表1所示的抗体ID11的VL的CDR2，或上述两者。在一些方面中，肽进一步包含表1所示的抗体ID11的VH的CDR1，其中具有5个或更少的保守氨基酸取代，或表1所示的抗体ID11的VL的CDR1，其中具有5个或更少的保守氨基酸取代，或上述两者。在一些方面中，这些肽包含表1所示的抗体ID11的VH的互补决定区CDR1，或表1所示的抗体ID11的VL的CDR1，或上述两者。
在一些方面中，肽是抗体或抗体片段，其包括：与SEQIDNO:150具有同一性的VH链，其中对应于CDR1,CDR2,和CDR3的区域包括表1所示的抗体ID11的VH的CDR1,CDR2,和CDR3，其在CDR1,CDR2,和CDR3区内具有5个或更少的保守氨基酸取代，并且SEQIDNO:150中对应于FR1,FR2,FR3,FR4的区域包含与表1所示的抗体ID11的VH的FR1,FR2,FR3,FR4具有至少80％,85％,90％,95％,96％,97％,98,99％,或100％同一性的氨基酸序列；和与SEQIDNO:152具有同一性的VL链，其中对应于CDR1,CDR2,和CDR3的区域包括表1所示的抗体ID11的VL的CDR1,CDR2,和CDR3，其在CDR1,CDR2,和CDR3区内具有5个或更少的保守氨基酸取代，并且SEQIDNO:152中对应于FR1,FR2,FR3,FR4的区域包含与表1所示的抗体ID11的VL的FR1,FR2,FR3,FR4具有至少80％,85％,90％,95％,96％,97％,98,99％,或100％同一性的氨基酸序列。在一些方面中，肽是抗体或抗体片段，其包含：包含SEQIDNO:150的VH链、和包含SEQIDNO:152的VL链。
在一些方面中，本公开提供的肽是结合MICA内的这样的表位的抗体或抗体片段：该表位包含被本文所述的特定抗体识别的表位的全部或一部分。在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段识别MICAα3结构域内的对应于MICA*009参考序列(SEQIDNO:167)的氨基酸181-274的区域。在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段与具有包含SEQIDNO:131的VH链和包含SEQIDNO:133的VL链的抗体结合相同的表位。在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段识别的表位包含MICA的至少一部分，该至少一部分具有至少5,6,7,8,9,10,11,12,13,14或15个氨基酸，并包含氨基酸序列GDVLPDGNGTYQTWVATRIC(SEQIDNO:168)或与之重叠。在一些实施方案中，抗体或抗体片段与具有包含SEQIDNO:113的VH链和包含SEQIDNO:115的VL链的抗体结合相同的表位。在一些实施方案中，抗体或抗体片段识别的表位包括MICA的至少一部分，该至少一部分具有至少5,6,7,8,9,10,11,12,13,14或15个氨基酸并包含氨基酸序列NVETEEWTVP(SEQIDNO:169)或与之重叠。在一些实施方案中，抗体或抗体片段与具有包含SEQIDNO:150的VH链和包含SEQIDNO:152的VL链的抗体结合相同的表位。在一些实施方案中，抗体或抗体片段识别的表位包括MICA的至少一部分，该至少一部分具有至少5,6,7,8,9,10,11,12,13,14或15个氨基酸并包含氨基酸序列TVPPMVNVTR(SEQIDNO:170)或与之重叠。在一些实施方案中，抗体或抗体片段与具有包含SEQIDNO:77的VH链和包含SEQIDNO:79的VL链的抗体结合相同的表位。在一些实施方案中，抗体或抗体片段与具有包含SEQIDNO:2的VH链和包含SEQIDNO:11的VL链的抗体结合相同的表位。在一些实施方案中，抗体或抗体片段与具有包含SEQIDNO:96的VH链和包含SEQIDNO:98的VL链的抗体结合相同的表位。
在一些方面中，除了肽之外，组合物进一步包括一种或多种(例如12,3,4,5,6,7,8,9,10种或少于20种)抗癌治疗剂。在一些方面中，组合物被配制成药物组合物(例如，用于施用给受试者)。
在一些实施方案中，本公开提供包括编码免疫特异性结合MHCI类多肽相关序列A(MICA)或其上的表位的肽的核酸的组合物。在一些方面中，该组合物的核酸编码表1所示的抗体ID1,6,7,8,9,或11的VH，其中具有5个或更少的保守氨基酸取代。在一些方面中，组合物的核酸编码表1所示的抗体ID1,6,7,8,9,或11的VL，其中具有5个或更少的保守氨基酸取代。
在一个方面中，本公开提供这样的核酸，其包含与SEQIDNO:1具有至少大约75％,80％,90％,95％,99％或更多、或者完全的(100％)序列同一性的核苷酸序列。在一些方面中，该核酸序列编码包含与SEQIDNO:2具有至少80％,85％,90％,95％,96％,97％,98,99％,或100％同一性的氨基酸序列的肽。在另一个方面中，本公开提供这样的核酸，其包含与SEQIDNO:10具有至少大约75％,80％,90％,95％,99％或更多、或者完全的(100％)序列同一性的核苷酸序列。在一些方面中，该核酸序列编码包含与SEQIDNO:11具有至少80％,85％,90％,95％,96％,97％,98,99％,或100％同一性的氨基酸序列的肽。
在一个方面中，本公开提供这样的核酸，其包含与SEQIDNO:76具有至少大约75％,80％,90％,95％,99％或更多、或者完全的(100％)序列同一性的核苷酸序列。在一些方面中，该核酸序列编码包含与SEQIDNO:77具有至少80％,85％,90％,95％,96％,97％,98,99％,或100％同一性的氨基酸序列的肽。在另一个方面中，本公开提供这样的核酸，其包含与SEQIDNO:78具有至少大约75％,80％,90％,95％,99％或更多、或者完全的(100％)序列同一性的核苷酸序列。在一些方面中，该核酸序列编码包含与SEQIDNO:79具有至少80％,85％,90％,95％,96％,97％,98,99％,或100％同一性的氨基酸序列的肽。
在一个方面中，本公开提供这样的核酸，其包含与SEQIDNO:95具有至少大约75％,80％,90％,95％,99％或更多、或者完全的(100％)序列同一性的核苷酸序列。在一些方面中，该核酸序列编码包含与SEQIDNO:96具有至少80％,85％,90％,95％,96％,97％,98,99％,或100％同一性的氨基酸序列的肽。在另一个方面中，本公开提供这样的核酸，其包含与SEQIDNO:97具有至少大约75％,80％,90％,95％,99％或更多、或者完全的(100％)序列同一性的核苷酸序列。在一些方面中，该核酸序列编码包含与SEQIDNO:98具有至少80％,85％,90％,95％,96％,97％,98,99％,或100％同一性的氨基酸序列的肽。
在一个方面中，本公开提供这样的核酸，其包含与SEQIDNO:112具有至少大约75％,80％,90％,95％,99％或更多、或者完全的(100％)序列同一性的核苷酸序列。在一些方面中，该核酸序列编码包含与SEQIDNO:113具有至少80％,85％,90％,95％,96％,97％,98,99％,或100％同一性的氨基酸序列的肽。在另一个方面中，本公开提供这样的核酸，其包含与SEQIDNO:114具有至少大约75％,80％,90％,95％,99％或更多、或者完全的(100％)序列同一性的核苷酸序列。在一些方面中，该核酸序列编码包含与SEQIDNO:115具有至少80％,85％,90％,95％,96％,97％,98,99％,或100％同一性的氨基酸序列的肽。
在一个方面中，本公开提供这样的核酸，其包含与SEQIDNO:130具有至少大约75％,80％,90％,95％,99％或更多、或者完全的(100％)序列同一性的核苷酸序列。在一些方面中，该核酸序列编码包含与SEQIDNO:131具有至少80％,85％,90％,95％,96％,97％,98,99％,或100％同一性的氨基酸序列的肽。在另一个方面中，本公开提供这样的核酸，其包含与SEQIDNO:132具有至少大约75％,80％,90％,95％,99％或更多、或者完全的(100％)序列同一性的核苷酸序列。在一些方面中，该核酸序列编码包含与SEQIDNO:133具有至少80％,85％,90％,95％,96％,97％,98,99％,或100％同一性的氨基酸序列的肽。
在一个方面中，本公开提供这样的核酸，其包含与SEQIDNO:149具有至少大约75％,80％,90％,95％,99％或更多、或者完全的(100％)序列同一性的核苷酸序列。在一些方面中，该核酸序列编码包含与SEQIDNO:150具有至少80％,85％,90％,95％,96％,97％,98,99％,或100％同一性的氨基酸序列的肽。在另一个方面中，本公开提供这样的核酸，其包含与SEQIDNO:151具有至少大约75％,80％,90％,95％,99％或更多、或者完全的(100％)序列同一性的核苷酸序列。在一些方面中，该核酸序列编码包含与SEQIDNO:152具有至少80％,85％,90％,95％,96％,97％,98,99％,或100％同一性的氨基酸序列的肽。
在一些实施方案中，本公开提供了嵌合抗原受体(CAR)，其包含与MICA免疫特异性结合的肽和细胞内T细胞结构域。在一个方面中，CAR中包含的肽是抗体或抗体片段，其包括：与SEQIDNO:2具有同一性的VH链，其中对应于CDR1,CDR2,和CDR3的区域包括表1所示的抗体ID1的VH的CDR1,CDR2,和CDR3，其中具有5个或更少的保守氨基酸取代，并且SEQIDNO:2中对应于FR1,FR2,FR3,FR4的区域所包含的氨基酸序列与表1所示的抗体ID1的VH的FR1,FR2,FR3,FR4具有至少80％,85％,90％,95％,96％,97％,98,99％,或100％同一性；或者抗体或抗体片段，其包括与SEQIDNO:11具有同一性的VL链，其中对应于CDR1,CDR2,和CDR3的区域包括表1所示的抗体ID1的VL的CDR1,CDR2,和CDR3，其中具有5个或更少的保守氨基酸取代，并且SEQIDNO:11中对应于FR1,FR2,FR3,FR4的区域所包含的氨基酸序列与表1所示的抗体ID1的VL的FR1,FR2,FR3,FR4具有至少80％,85％,90％,95％,96％,97％,98,99％,或100％同一性。在一些方面中，肽包括这样的抗体或抗体片段，所述抗体或抗体片段具有包含SEQIDNO:2的VH链和包含SEQIDNO:11的VL链。
在一个方面中，CAR中包含的肽是这样的抗体或抗体片段，其包括：与SEQIDNO:77具有同一性的VH链，其中对应于CDR1,CDR2,和CDR3的区域包含表1所示的抗体ID6的VH的CDR1,CDR2,和CDR3，其中具有5个或更少的保守氨基酸取代；并且SEQIDNO:77中对应于FR1,FR2,FR3,FR4的区域包含与表1所示的抗体ID6的VH的FR1,FR2,FR3,FR4具有至少80％,85％,90％,95％,96％,97％,98,99％,或100％同一性的氨基酸序列；或者是这样的抗体或抗体片段，其包括：与SEQIDNO:79具有同一性的VL链，其中对应于CDR1,CDR2,和CDR3的区域包括表1所示的抗体ID6的VL的CDR1,CDR2,和CDR3，其中具有5个或更少的保守氨基酸取代，并且SEQIDNO:79中对应于FR1,FR2,FR3,FR4的区域包含与表1所示的抗体ID6的VL的FR1,FR2,FR3,FR4具有至少80％,85％,90％,95％,96％,97％,98,99％,或100％同一性的氨基酸序列。在一些方面中，肽包括这样的抗体或抗体片段，其具有包含SEQIDNO:77的VH链和包含SEQIDNO:79的VL链。
在一个方面中，CAR中包含的免疫特异性结合MICA的肽是这样的抗体或抗体片段，其包括：与SEQIDNO:96具有同一性的VH链，其中对应于CDR1,CDR2,和CDR3的区域包括表1所示的抗体ID7的VH的CDR1,CDR2,和CDR3，其中具有5个或更少的保守氨基酸取代，并且SEQIDNO:96中对应于FR1,FR2,FR3,FR4的区域包含与表1所示的抗体ID7的VH的FR1,FR2,FR3,FR4具有至少80％,85％,90％,95％,96％,97％,98,99％,或100％同一性的氨基酸序列；或者这样的抗体或抗体片段，其包括与SEQIDNO:98具有同一性的VL链，其中对应于CDR1,CDR2,和CDR3的区域包括表1所示的抗体ID7的VL的CDR1,CDR2,和CDR3，其中具有5个或更少的保守氨基酸取代，并且SEQIDNO:98中对应于FR1,FR2,FR3,FR4的区域包含与表1所示的抗体ID7的VL的FR1,FR2,FR3,FR4具有至少80％,85％,90％,95％,96％,97％,98,99％,或100％同一性的氨基酸序列。在一些方面中，肽包括这样抗体或抗体片段，其具有包含SEQIDNO:96的VH链和包含SEQIDNO:98的VL链。
在一个方面中，CAR中包含的免疫特异性结合MICA的肽是这样的抗体或抗体片段，其包括：与SEQIDNO:113具有同一性的VH链，其中对应于CDR1,CDR2,和CDR3的区域包括表1所示的抗体ID8的VH的CDR1,CDR2,和CDR3，其中具有5个或更少的保守氨基酸取代，并且SEQIDNO:113中对应于FR1,FR2,FR3,FR4的区域包含与表1所示的抗体ID8的VH的FR1,FR2,FR3,FR4具有至少80％,85％,90％,95％,96％,97％,98,99％,或100％同一性的氨基酸序列；或者这样的抗体或抗体片段，其包括与SEQIDNO:115具有同一性的VL链，其中对应于CDR1,CDR2,和CDR3的区域包括表1所示的抗体ID8的VL的CDR1,CDR2,和CDR3，其中具有5个或更少的保守氨基酸取代，并且SEQIDNO:115中对应于FR1,FR2,FR3,FR4的区域包含与表1所示的抗体ID8的VL的FR1,FR2,FR3,FR4具有至少80％,85％,90％,95％,96％,97％,98,99％,或100％同一性的氨基酸序列。在一些方面中，肽包括这样抗体或抗体片段，其具有包含SEQIDNO:113的VH链和包含SEQIDNO:115的VL链。
在一个方面中，CAR中包含的免疫特异性结合MICA的肽是这样的抗体或抗体片段，其包括：与SEQIDNO:131具有同一性的VH链，其中对应于CDR1,CDR2,和CDR3的区域包括表1所示的抗体ID9的VH的CDR1,CDR2,和CDR3，其中具有5个或更少的保守氨基酸取代，并且SEQIDNO:131中对应于FR1,FR2,FR3,FR4的区域包含与表1所示的抗体ID9的VH的FR1,FR2,FR3,FR4具有至少80％,85％,90％,95％,96％,97％,98,99％,或100％同一性的氨基酸序列；或者这样的抗体或抗体片段，其包括与SEQIDNO:133具有同一性的VL链，其中对应于CDR1,CDR2,和CDR3的区域包括表1所示的抗体ID9的VL的CDR1,CDR2,和CDR3，其中具有5个或更少的保守氨基酸取代，并且SEQIDNO:133中对应于FR1,FR2,FR3,FR4的区域包含与表1所示的抗体ID9的VL的FR1,FR2,FR3,FR4具有至少80％,85％,90％,95％,96％,97％,98,99％,或100％同一性的氨基酸序列。在一些方面中，肽包括这样抗体或抗体片段，其具有包含SEQIDNO:131的VH链和包含SEQIDNO:133的VL链。
在一个方面中，CAR中包含的免疫特异性结合MICA的肽是这样的抗体或抗体片段，其包括：与SEQIDNO:150具有同一性的VH链，其中对应于CDR1,CDR2,和CDR3的区域包括表1所示的抗体ID11的VH的CDR1,CDR2,和CDR3，其中具有5个或更少的保守氨基酸取代，并且SEQIDNO:150中对应于FR1,FR2,FR3,FR4的区域包含的氨基酸序列与表1所示的抗体ID11的VH的FR1,FR2,FR3,FR4具有至少80％,85％,90％,95％,96％,97％,98,99％,或100％同一性；或者这样的抗体或抗体片段，其包括与SEQIDNO:152具有同一性的VL链，其中对应于CDR1,CDR2,和CDR3的区域包括表1所示的抗体ID11的VL的CDR1,CDR2,和CDR3，其中具有5个或更少的保守氨基酸取代，并且SEQIDNO:152中对应于FR1,FR2,FR3,FR4的区域包含与表1所示的抗体ID11的VL的FR1,FR2,FR3,FR4具有至少80％,85％,90％,95％,96％,97％,98,99％,或100％同一性的氨基酸序列。在一些方面中，肽包括这样抗体或抗体片段，其具有包含SEQIDNO:150的VH链和包含SEQIDNO:152的VL链。
在其它实施方案中，本公开提供了载体(例如，表达载体、病毒载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒(AAV)载体、疱疹病毒载体或痘病毒载体)，其包含编码与MICA免疫特异性结合的肽的核酸。在一个方面中，载体包含与SEQIDNO:10,78,97,114,132或151具有至少大约75％,80％,90％,95％,99％或更多、或者完全的(100％)序列同一性的核苷酸序列。在一些方面中，该核酸序列编码包含与SEQIDNO:11,79,98,115,133,或152具有至少80％,85％,90％,95％,96％,97％,98,99％,或100％同一性的氨基酸序列的肽。
在另一个方面中，载体包含与SEQIDNO:1,76,95,112,130,或149具有至少大约75％,80％,90％,95％,99％或更多、或者完全的(100％)序列同一性的核苷酸序列。在一些方面中，该核酸序列编码包含与SEQIDNO:2,77,96,113,131,或150具有至少80％,85％,90％,95％,96％,97％,98,99％,或100％同一性的氨基酸序列的肽。
在一个方面中，载体包含与SEQIDNO:1具有至少大约75％,80％,90％,95％,99％或更多，或者完全的(100％)序列同一性的核苷酸序列。在一些方面中，该核酸序列编码包含与SEQIDNO:2具有至少80％,85％,90％,95％,96％,97％,98,99％,或100％同一性的氨基酸序列的肽。在另一个方面中，载体包含与SEQIDNO:10具有至少大约75％,80％,90％,95％,99％或更多，或者完全的(100％)序列同一性的核苷酸序列。在一些方面中，该核酸序列编码包含与SEQIDNO:11具有至少80％,85％,90％,95％,96％,97％,98,99％,或100％同一性的氨基酸序列的肽。
在一个方面中，载体包含与SEQIDNO:76具有至少大约75％,80％,90％,95％,99％或更多，或者完全的(100％)序列同一性的核苷酸序列。在一些方面中，该核酸序列编码包含与SEQIDNO:77具有至少80％,85％,90％,95％,96％,97％,98,99％,或100％同一性的氨基酸序列的肽。在另一个方面中，载体包含与SEQIDNO:78具有至少大约75％,80％,90％,95％,99％或更多，或者完全的(100％)序列同一性的核苷酸序列。在一些方面中，该核酸序列编码包含与SEQIDNO:79具有至少80％,85％,90％,95％,96％,97％,98,99％,或100％同一性的氨基酸序列的肽。
在一个方面中，载体包含与SEQIDNO:95具有至少大约75％,80％,90％,95％,99％或更多，或者完全的(100％)序列同一性的核苷酸序列。在一些方面中，该核酸序列编码包含与SEQIDNO:96具有至少80％,85％,90％,95％,96％,97％,98,99％,或100％同一性的氨基酸序列的肽。在另一个方面中，载体包含与SEQIDNO:97具有至少大约75％,80％,90％,95％,99％或更多，或者完全的(100％)序列同一性的核苷酸序列。在一些方面中，该核酸序列编码包含与SEQIDNO:98具有至少80％,85％,90％,95％,96％,97％,98,99％,或100％同一性的氨基酸序列的肽。
在一个方面中，载体包含与SEQIDNO:112具有至少大约75％,80％,90％,95％,99％或更多，或者完全的(100％)序列同一性的核苷酸序列。在一些方面中，该核酸序列编码包含与SEQIDNO:113具有至少80％,85％,90％,95％,96％,97％,98,99％,或100％同一性的氨基酸序列的肽。在另一个方面中，载体包含与SEQIDNO:114具有至少大约75％,80％,90％,95％,99％或更多，或者完全的(100％)序列同一性的核苷酸序列。在一些方面中，该核酸序列编码包含与SEQIDNO:115具有至少80％,85％,90％,95％,96％,97％,98,99％,或100％同一性的氨基酸序列的肽。
在一个方面中，载体包含与SEQIDNO:130具有至少大约75％,80％,90％,95％,99％或更多，或者完全的(100％)序列同一性的核苷酸序列。在一些方面中，该核酸序列编码包含与SEQIDNO:131具有至少80％,85％,90％,95％,96％,97％,98,99％,或100％同一性的氨基酸序列的肽。在另一个方面中，载体包含与SEQIDNO:132具有至少大约75％,80％,90％,95％,99％或更多，或者完全的(100％)序列同一性的核苷酸序列。在一些方面中，该核酸序列编码包含与SEQIDNO:133具有至少80％,85％,90％,95％,96％,97％,98,99％,或100％同一性的氨基酸序列的肽。
在一个方面中，载体包含与SEQIDNO:149具有至少大约75％,80％,90％,95％,99％或更多，或者完全的(100％)序列同一性的核苷酸序列。在一些方面中，该核酸序列编码包含与SEQIDNO:150具有至少80％,85％,90％,95％,96％,97％,98,99％,或100％同一性的氨基酸序列的肽。在另一个方面中，载体包含与SEQIDNO:151具有至少大约75％,80％,90％,95％,99％或更多，或者完全的(100％)序列同一性的核苷酸序列。在一些方面中，该核酸序列编码包含与SEQIDNO:152具有至少80％,85％,90％,95％,96％,97％,98,99％,或100％同一性的氨基酸序列的肽。
在一些实施方案中，本公开包括治疗受试者体内癌症的方法。在一些方面中，该方法包括向受试者施用包含一种或多种本文公开的肽和/或核酸的组合物。
本公开还提供了在免疫疗法之后从癌症患者分离人抗体的方法。
在一些实施方案中，本公开包括从受试者获得针对自体抗原的免疫细胞的方法，该方法包括鉴定对自体抗原呈阳性免疫响应的受试者，提供多聚体形式的所述自体抗原，使该多聚体形式的自体抗原与来自该对自体抗原呈阳性免疫响应的受试者的样品接触，和获得结合于该多聚体形式的自体抗原的免疫细胞。
在一些实施方案中，本公开包括从癌症患者获得针对自体抗原的免疫细胞的方法，该方法包括鉴定对自体抗原呈阳性免疫响应的受试者，提供多聚体形式的所述自体抗原，使该多聚体形式的自体抗原与来自该对自体抗原呈阳性免疫响应的受试者的样品接触，和获得结合于该多聚体形式的自体抗原结合的免疫细胞。
除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语所具有的含义均与本发明所属领域普通技术人员所共同理解的相同。本文描述了用于在本发明中使用的方法和材料；其它本领域已知的合适方法和材料也可以被使用。材料、方法和实施例只是例示性的，并不意图具有限制意义。本文通过提述并入本文中援引的所有出版物、专利申请、专利、序列、数据库条目和其它参考文献的全部内容。当存在冲突时，以本专利说明书包括定义为准。
本发明的其他特征和优势从下面的详述以及权利要求中将不言自明。
附图描述
图1：抗体ID1(抗-MHCI类多肽相关序列A(MICA)抗体)的可变重(VH)链的核酸序列(SEQIDNO:1)。
图2：抗体ID1(抗-MICA抗体)的可变重(VH)链的氨基酸序列(SEQIDNO:2)。
图3：抗体ID1(抗-MICA抗体)的可变轻(VL)链的核酸序列(SEQIDNO:10)。
图4：抗体ID1(抗-MICA抗体)的可变轻(VL)链的氨基酸序列(SEQIDNO:11)。
图5A-5F图解了用于从B细胞制作抗体的示例方法。(A)表达带有BirA标签的抗原，用于位点特异性生物素化和用荧光标记的链霉亲和素进行四聚体化。(B)B细胞用四聚体和一组单克隆抗体染色。将四聚体+、类别转换的记忆B细胞单细胞分选到PCR条管中。(C)用T7RNA聚合酶实施mRNA扩增。(D)用300-400bpPCR产物实施PCR产物测序。(E)使用重叠PCR构建全长IgG1重链和κ/λ轻链序列，将二者克隆到不同的载体中。将载体瞬时转染到CHO-S细胞中以表达全人重组抗体。(F)测试抗体的抗原结合，并评估抗体的潜在治疗性质。
图6A-6B：比较单体与四聚体抗原对记忆B细胞的鉴定的线图。(A)单体生物素化的TTCF或CD80抗原用Alexa-488荧光团直接标记；用无标记的链霉亲和素产生四聚体。将从每个供体富集的B细胞分成三份，并在0.125μg/mL的相同总抗原浓度下用对照CD80四聚体、TTCF单体或TTCF四聚体进行染色。FACS作图描绘了CD19+CD27+IgM-类别转换记忆B细胞；门附近的数字表示亲门(parentalgate)的百分比。(B)在三个不同供体中检测到四聚体+记忆B细胞的频率。数字计算为每1x106个CD19+记忆B细胞的四聚体+细胞数。
图7A-7B：显示从浆母细胞和记忆B细胞产生的抗体高亲和力结合TTCF的线图。实施了饱和结合实验来确定重组抗体的亲和力。用铕标记TTCF抗原，铕在用螯合剂温育时在615nm处发射强荧光信号。将抗体固定在96孔板中并用TTCF-铕(100nM-4pM)37℃温育2小时。记录615nm处的荧光计数，并使用非线性回归分析计算KD。在所有实验中包含同样在CHO-S细胞中产生的对照抗体(克隆8.18.C5)。(A)从TTCF四聚体+浆母细胞(供体1)产生了重组TTCFAb1和2。(B)TTCF抗体3，4和5源自三个不同供体的TTCF四聚体+记忆B细胞。
图8：显示抗-MICA抗体与MICA包被的luminex珠子的结合的柱状图。
图9A-9O：显示抗-MICA抗体与MICA包被的珠子的结合的线图。
图10：抗体ID6(抗-MHCI类多肽相关序列A(MICA)抗体)的可变重(VH)链的核酸序列(SEQIDNO:76)。
图11：抗体ID6(抗-MICA抗体)的可变重(VH)链的氨基酸序列(SEQIDNO:77)。
图12：抗体ID6(抗-MICA抗体)的可变轻(VL)链的核酸序列(SEQIDNO:78)。
图13：抗体ID6(抗-MICA抗体)的可变轻(VL)链的氨基酸序列(SEQIDNO:79)。
图14：抗体ID7(抗-MHCI类多肽相关序列A(MICA)抗体)的可变重(VH)链的核酸序列(SEQIDNO:95)。
图15：抗体ID7(抗-MICA抗体)的可变重(VH)链的氨基酸序列(SEQIDNO:96)。
图16：抗体ID7(抗-MICA抗体)的可变轻(VL)链的核酸序列(SEQIDNO:97)。
图17：抗体ID7(抗-MICA抗体)的可变轻(VL)链的氨基酸序列(SEQIDNO:98)。
图18：抗体ID8(抗-MHCI类多肽相关序列A(MICA)抗体)的可变重(VH)链的核酸序列(SEQIDNO:112)。
图19：抗体ID8(抗-MICA抗体)的可变重(VH)链的氨基酸序列(SEQIDNO:113)。
图20：抗体ID8(抗-MICA抗体)的可变轻(VL)链的核酸序列(SEQIDNO:114)。
图21：抗体ID8(抗-MICA抗体)的可变轻(VL)链的氨基酸序列(SEQIDNO:115)。
图22：抗体ID9(抗-MHCI类多肽相关序列A(MICA)抗体)的可变重(VH)链的核酸序列(SEQIDNO:130)。
图23：抗体ID9(抗-MICA抗体)的可变重(VH)链的氨基酸序列(SEQIDNO:131)。
图24：抗体ID9(抗-MICA抗体)的可变轻(VL)链的核酸序列(SEQIDNO:132)。
图25：抗体ID9(抗-MICA抗体)的可变轻(VL)链的氨基酸序列(SEQIDNO:133)。
图26A-G：显示对重组抗-MICA抗体的MICA等位基因特异性结合的评估的图。
图27：显示抗-MICA抗体CM24002Ab2对自身肿瘤的标记的图。
图28：显示NKG2D被血清MICA调节的一系列FACS绘图。将人NK细胞用以1:10稀释的来自患者CM24002的对照血清温育48小时。在温育开始时以10μg/ml的浓度添加标示的抗体。通过流式细胞术对CD56+NK细胞上的NKG2D表达进行评估。
图29：显示NKG2D被重组MICA调节的一系列FACS绘图。将人NK细胞用重组MICA以2ng/ml的浓度温育48小时。在温育开始时以10μg/ml的浓度添加标示的抗体。48小时后，通过流式细胞术对CD56+NK细胞上的NKG2D表达进行评估。
图30：证明抗-MICA抗体CM24002Ab2强化细胞介导的细胞毒作用的线图。在10μg/ml的标示抗体的存在下，将人NK细胞用重组MICA(2ng/ml)温育48小时。通过测量在以标示的比例温育4小时之后的LDH释放来评估NK细胞(效应器)杀死K562靶细胞的能力。
图31：证明抗-MICA抗体CM24002Ab2和CM33322Ab29的细胞介导的细胞毒作用的柱状图。在10μg/ml标示抗体的存在下，将人NK细胞用重组MICA(2ng/ml)温育48小时。通过测量在温育4小时之后的LDH释放来评估NK细胞(效应器)杀死K562靶细胞的能力。在效应器与靶细胞温育4小时的过程中添加NKG2D阻断性抗体或Fc阻断性抗体，以评估Fc受体和NKG2D对细胞介导的细胞毒作用的贡献。
图32：显示重组抗-MICA抗体结合MICAα3结构域的一系列线图。将重组MICAα3结构域生物素化并捕获在链霉亲和素包被的珠子表面上。使10μg/ml的标示抗体与包被有各种重组蛋白的珠子温育1小时。随后清洗珠子并用FITC偶联的抗-人IgG第二抗体温育。通过流式细胞术定量FITC荧光。
图33：证明肿瘤细胞被抗-MICA抗体CM24002Ab2和CM33322Ab29标记的线图。荧光通过流式细胞术加以确定。
图34：证明通过Luminex测定法确定的抗-MICA抗体CM33322Ab29的MICA等位基因特异性的柱状图。
图35：抗体ID11(抗-MHCI类多肽相关序列A(MICA)抗体)的可变重(VH)链的核酸序列(SEQIDNO:149)。
图36：抗体ID11(抗-MICA抗体)的可变重(VH)链的氨基酸序列(SEQIDNO:150)。
图37：抗体ID11(抗-MICA抗体)的可变轻(VL)链的核酸序列(SEQIDNO:151)。
图38：抗体ID11(抗-MICA抗体)的可变轻(VL)链的氨基酸序列(SEQIDNO:152)。
图39：晚期黑色素瘤患者体内的血清MICA浓度的柱状图展示。血清MICA使用市售夹心式ELISA进行检测。血清以1:10稀释进行检测。
图40：显示抗-MICA抗体阻断用黑色素瘤患者血清温育的NK细胞上的NKG2D下调的表格。将PBMC与对照血清或者含有可溶性MICA的黑色素瘤患者样品单独地或者在100ug/ml的标示抗体的存在下温育48小时。在48小时，通过流式细胞术确定NK细胞(CD3-,CD8-,CD56+)上NKG2D的表达。数据表示为NKG2D阳性NK细胞的％。
图41-43：显示抗-MICA抗体强化NKG2D介导的用黑色素瘤患者血清温育的NK细胞对K562靶细胞的细胞毒作用的一系列图。将PBMC与对照血清或者含有可溶性MICA的黑色素瘤患者样品单独地或者在100ug/ml指示抗体的存在下温育48小时。在48小时时，清洗细胞并与51Cr标记的K562靶细胞以20:1的效应器:靶比例进行温育。4小时后，通过闪烁计数对特异性裂解进行评估。
图44：显示抗-MICA抗体CM33322Ab29与先前被转导从而表达人MICA的B16黑色素瘤细胞的结合的图。将10ug/ml的标示抗体与B16黑色素瘤细胞和被转导而表达人MICA的B16黑色素瘤细胞一起温育，通过流式细胞术对染色进行分析。
图45：证明B16-MICA肿瘤下调脾NK细胞和肿瘤浸润NK细胞上的NKG2D表达的一系列图。通过流式细胞术确定从非肿瘤小鼠的脾脏或者从荷瘤动物的脾脏和肿瘤分离的NK细胞(CD3-,CD8-,CD335+)上NKG2D的表达。
图46：证明抗-MICA抗体处理可降低B16-MICA荷瘤小鼠体内的血清MICA水平的一系列图。B16-MICA荷瘤B6小鼠用100ug或200ug/剂量的CM33322Ab29每周3次尾静脉注射进行处理。初始处理后1周时，收集血液，并通过ELISA测量血清MICA。
图47：显示施用抗-MICA抗体不会干扰通过夹心式ELISA检测MICA的图。将重组MICA与1000倍过量抗体在旋转下温育18小时。MICA浓度通过夹心式ELISA确定。
图48：证明用抗-MICA抗体CM33322Ab29处理B16-MICA荷瘤小鼠可停止肿瘤生长的图。当肿瘤直径达到5mm时，用200ug/剂量小鼠IgG2a/κ同种型对照或抗-MICA抗体CM33322Ab29静脉内处理B16-MICA荷瘤小鼠。每周施用3次剂量，每天记录肿瘤体积。箭头指示剂量施用。
图49：证明抗-MICA抗体能够减少MICA从肿瘤细胞脱落的一系列图。在10ug/ml同种型对照抗体、CM33322Ab29或CM24002Ab2存在下培养RPMI-8226细胞。48小时后，清洗细胞，并通过流式细胞术确定MICA的表面表达，通过夹心式ELISA评估条件培养基中的脱落MICA。
图50：证明抗-MICA抗体CM24002Ab2,CM33322Ab4和CM33322Ab11的细胞介导的细胞毒作用的柱状图。在标示抗体存在下温育51Cr标记的K562细胞30分钟。在30分钟，以20:1的效应器:靶比例添加全PBMC。4小时后通过闪烁计数评估特异性裂解。
图51：证明抗-MICA抗体能够减少MICA从肿瘤细胞脱落的一系列图。在同种型对照抗体、CM24002Ab2、CM33322Ab4或CM33322Ab11的存在下培养RPMI-8226细胞。48小时后，清洗细胞，并通过流式细胞术确定MICA的表面表达，通过夹心式ELISA评估条件化培养基中的脱落MICA。
图52：显示当用黑色素瘤患者血清进行温育时，抗-MICA抗体可强化NKG2D介导的NK细胞对K562靶细胞的细胞毒作用的线图。将PBMC用对照血清或者含有可溶性MICA的黑色素瘤患者样品单独地或者在指示抗体的存在下温育48小时。在48小时时，清洗细胞并用51Cr标记的K562靶细胞以20:1的效应器:靶标比例进行温育。4小时后，通过闪烁计数对特异性裂解进行评估。
图53：显示NKG2D受血清MICA调节的一系列FACS图。将全PBMC与对照血清或黑色素瘤血清单独地或者在指示抗体的存在下温育48小时。48小时后，清洗细胞并通过流式细胞术评估NKG2D的表面表达。
图54：显示抗-MICA抗体CM24002Ab2,CM33322Ab4和CM33322Ab11的细胞介导的细胞毒作用的线图。将全PBMC与重组MICA(rMICA)在标示的抗体、阴性对照抗体(TTCF特异性)、或阳性对照抗体(BioLegend)的存在下温育48小时。4小时后，通过闪烁计数对特异性裂解进行评估。
图55：显示NKG2D受重组MICA调节的一系列FACS图。将全PBMC与对照血清或掺加rMICA的血清单独地或者在指示抗体的存在下温育48小时。48小时后，清洗细胞并通过流式细胞术评估NKG2D的表面表达。
图56A-56C：A.CM33322Ab29的表位在MICA*009(SEQIDNO:167)的氨基酸序列中显示；B.CM33322Ab4的表位在MICA*009(SEQIDNO:167)的氨基酸序列中显示；C.CM33322Ab11的表位在MICA*009(SEQIDNO:167)的氨基酸序列中显示。
图57：CM33322Ab29和CM3322AbB4的表位在MICA*009参考结构上的定位(mapping)。表位定位使用重叠肽阵列来实施。每个肽是一个20个氨基酸的线性序列，每个肽有10个氨基酸的偏移量(offset)。
详细说明
本公开部分地基于如下的发现：通过用感兴趣的抗原的四聚体形式标记B细胞，可以从暴露于疾病的人类受试者中获得针对在该疾病中重要的治疗靶标的抗体。如前文背景部分所述，先前的方法的局限性至少由于它们鉴定人类受试者体内的合适B细胞的效率低下，和/或因为它们会诱导任何被捕获的B细胞经历表型改变，因此减少其价值。相反，本文描述的方法允许捕获针对特定的疾病相关抗原的稀有的记忆B细胞。如下文所述，该方法需要疾病相关抗原的四聚体化，这个过程，如后面的实施例证明的，可以更好地鉴定合适的记忆B细胞。具体地说，利用本文的方法，在受试者初始暴露于抗原之后捕获合适的记忆B细胞的效率可以更高，时间可以更长。本文的方法还包括从获自记忆B细胞的遗传材料产生的抗体(以及从这些抗体序列生成的肽)，其中该记忆B细胞是用本文公开的方法捕获的。
本文描述了针对MHCI类多肽相关序列A(MICA)的人抗体。这些针对MICA的人抗体是从先前接受了基于细胞的癌症疫苗(GM-CSF转导的自身肿瘤细胞)的患者中，通过需要使用四聚体化抗原的方法鉴定出来的。
在一些情况下，本公开提供了从选定的人类受试者特异性地获得或靶定(target)具有治疗潜力的抗体的方法，以及由此获得的治疗性组合物。这些方法可以包括：获得或靶定人类受试者体内的免疫细胞，其中这些免疫细胞包括但不仅限于，例如，B细胞和/或记忆B细胞，从所获得或靶定的免疫细胞分离或纯化遗传材料(例如，DNA和/或mRNA)，和使用该分离或纯化的遗传材料产生治疗性组合物，例如本文公开的治疗性组合物。这些方法的进一步描述在下文标题为“方法”的部分中提供。
在一些情况下，本公开提供了与受试者体内存在的抗体相关的治疗性组合物(例如，包括治疗性肽，包括抗体、抗体片段、抗体衍生物、和/或抗体缀合物)，其中所述受试者患有或者曾经患有病症或疾病，并且对该病症或疾病显示阳性免疫响应。
治疗性组合物
在一些情况下，本文的治疗性组合物能够与疾病或病症的相关结合伙伴(例如免疫原、抗原和/或表位)相互作用(例如，结合、特异性结合、和/或免疫特异性结合)，其中该治疗性组合物与结合伙伴之间的相互作用导致针对该病症或疾病的阳性免疫响应(例如，受试者体内疾病或其症状的水平下降)。
在一些情况下，治疗性组合物可包括肽，其包括(例如，包含，其组成基本上为，或者其组成为)表1所示的抗体ID1,6,7,8,9或11的可变重链(VH)和/或可变轻链(VL)的至少一个(例如1、2、3、4、5和/或6个)互补决定区(CDR)。
在一些情况下，治疗性组合物包括这样的肽，其包括(例如，包含，基本上组成为，或者组成为)表1所示的抗体ID1,6,7,8,9或11的可变重链(VH)和/或可变轻链(VL)的至少一个(例如1、2、3、4、5和/或6个)互补决定区(CDR)，并且与MHCI类多肽相关序列A(MICA(例如，UniGeneHs.130838))(例如可溶性MICA(sMICA))，包括其表位，相互作用(例如，结合、特异性结合和/或免疫特异性结合)。
在一些情况下，治疗性组合物包括这样的肽，其包括表1所示的抗体ID1,6,7,8,9或11的VH和/或VL的至少一个CDR，其中该肽结合(例如特异性结合和/或免疫特异性结合)MICA(例如，人MICA(例如可溶性MICA(sMICA)))。在一些情况下，肽可以包括至少两个CDR，其中该至少两个CDR是表1所示的不同抗体的CDR。换言之，表1所示的抗体ID1,6,7,8,9或11的CDR(和FR和/或AA序列)是可互换的，并能够组合以产生肽，只要这些肽可以结合(例如，特异性结合和/或免疫特异性结合)MICA(例如，人MICA(例如可溶性MICA(sMICA)))即可。在一些情况下，这样的肽包括表1所示的抗体ID1,6,7,8,9或11的VH和/或VL的CDR3。在一些情况下，这样的肽包括表1所示的抗体ID1,6,7,8,9或11的VH和VL的CDR3和表1所示的抗体ID1,6,7,8,9或11的VH和/或VL的CDR1和/或CDR2。在一些情况下，这样的肽包括抗体ID1,6,7,8,9或11的VH和/或VL的CDR1、CDR2和CDR3。在一些情况下，这样的肽包括抗体ID1,6,7,8,9或11的VH和/或VL的CDR1、CDR2和CDR3，和抗体ID1,6,7,8,9或11的VH和/或VL的FR1、FR2、FR3、和/或FR4中的至少一个，如表1所示。在一些情况下，这样的肽包括SEQIDNO:2,77,96,113,131或150的其中之一和/或SEQIDNO:11,79,98,115,133或152的其中之一。在每种情况下，所述肽能够结合(例如，特异性结合和/或免疫特异性结合)MICA(例如，人MICA(例如可溶性MICA(sMICA)))。在一些情况下，所述肽与MICA之间的结合亲和力为大约0.1nM-1μM，大约50nM-200nM,或1nM-20nM,例如500nM或更小,400nM或更小,300nM或更小,200nM或更小,100nM或更小,50nM或更小,10nM或更小,5nM或更小,1nM,0.5nM或更小,0.4nM或更小,0.3nM或更小,0.2nM或更小,或者0.10nM或更小。在一些情况下，治疗性组合物可以包括这样的肽，其包括表1所示的抗体ID1的VH和/或VL的至少一个CDR，其中该肽结合(例如，特异性结合和/或免疫特异性结合)MICA(例如，人MICA(例如可溶性MICA(sMICA)))。在一些情况下，这样的肽包括表1所示的抗体ID1的VH和/或VL的CDR3。在一些情况下，这样的肽包括抗体ID1的VH和VL的CDR3，以及表1所示的抗体ID1的VH和/或VL的CDR1和/或CDR2。在一些情况下，这样的肽包括抗体ID1的VH和/或VL的CDR1、CDR2和CDR3。在一些情况下，这样的肽包括抗体ID1的VH和/或VL的CDR1、CDR2和CDR3，和抗体ID1的VH和/或VL的FR1、FR2、FR3、和/或FR4中的至少一个，如表1所示。在一些情况下，这样的肽包括SEQIDNO:2和/或SEQIDNO:11。在每种情况下，所述肽能够结合(例如，特异性结合和/或免疫特异性结合)MICA(例如，人MICA(例如可溶性MICA(sMICA)))。在一些情况下，所述肽与MICA之间的结合亲和力为大约0.1nM-1μM，大约50nM-200nM,或1nM-20nM,例如500nM或更小,400nM或更小,300nM或更小,200nM或更小,100nM或更小,50nM或更小,10nM或更小,5nM或更小,1nM,0.5nM或更小,0.4nM或更小,0.3nM或更小,0.2nM或更小,或者0.10nM或更小。
在一些情况下，治疗性组合物可包括这样的肽，其包括表1所示的抗体ID6的VH和/或VL的至少一个CDR，其中该肽结合(例如，特异性结合和/或免疫特异性结合)MICA(例如，人MICA(例如可溶性MICA(sMICA)))。在一些情况下，这样的肽包括表1所示的抗体ID6的VH和/或VL的CDR3。在一些情况下，这样的肽包括抗体ID6的VH和VL的CDR3、以及表1所示的抗体ID6的VH和/或VL的CDR1和/或CDR2。在一些情况下，这样的肽包括抗体ID6的VH和/或VL的CDR1、CDR2和CDR3。在一些情况下，这样的肽包括抗体ID6的VH和/或VL的CDR1、CDR2和CDR3，和抗体ID6的VH和/或VL的FR1、FR2、FR3、和/或FR4中的至少一个，如表1所示。在一些情况下，这样的肽包括SEQIDNO:77和/或SEQIDNO:79。在每种情况下，所述肽能够结合(例如，特异性结合和/或免疫特异性结合)MICA(例如，人MICA(例如可溶性MICA(sMICA)))。在一些情况下，所述肽与MICA之间的结合亲和力为大约0.1nM-1μM，大约50nM-200nM,或1nM-20nM,例如500nM或更小,400nM或更小,300nM或更小,200nM或更小,100nM或更小,50nM或更小,10nM或更小,5nM或更小,1nM,0.5nM或更小,0.4nM或更小,0.3nM或更小,0.2nM或更小,或者0.10nM或更小。
在一些情况下，治疗性组合物可包括这样的肽，其包括表1所示的抗体ID7的VH和/或VL的至少一个CDR，其中该肽结合(例如，特异性结合和/或免疫特异性结合)MICA(例如，人MICA(例如可溶性MICA(sMICA)))。在一些情况下，这样的肽包括表1所示的抗体ID7的VH和/或VL的CDR3。在一些情况下，这样的肽包括抗体ID7的VH和VL的CDR3，以及表1所示的抗体ID7的VH和/或VL的CDR1和/或CDR2。在一些情况下，这样的肽包括抗体ID7的VH和/或VL的CDR1、CDR2和CDR3。在一些情况下，这样的肽包括抗体ID7的VH和/或VL的CDR1、CDR2和CDR3，和抗体ID7的VH和/或VL的FR1、FR2、FR3、和/或FR4中的至少一个，如表1所示。在一些情况下，这样的肽包括SEQIDNO:96和/或SEQIDNO:98。在每种情况下，所述肽能够结合(例如，特异性结合和/或免疫特异性结合)MICA(例如，人MICA(例如可溶性MICA(sMICA)))。在一些情况下，所述肽与MICA之间的结合亲和力为大约0.1nM-1μM，大约50nM-200nM,或1nM-20nM,例如500nM或更小,400nM或更小,300nM或更小,200nM或更小,100nM或更小,50nM或更小,10nM或更小,5nM或更小,1nM,0.5nM或更小,0.4nM或更小,0.3nM或更小,0.2nM或更小,或者0.10nM或更小。
在一些情况下，治疗性组合物可包括这样的肽，其包括表1所示的抗体ID8的VH和/或VL的至少一个CDR，其中该肽结合(例如，特异性结合和/或免疫特异性结合)MICA(例如，人MICA(例如可溶性MICA(sMICA)))。在一些情况下，这样的肽包括表1所示的抗体ID8的VH和/或VL的CDR3。在一些情况下，这样的肽包括抗体ID8的VH和VL的CDR3，以及表1所示的抗体ID8的VH和/或VL的CDR1和/或CDR2。在一些情况下，这样的肽包括抗体ID8的VH和/或VL的CDR1、CDR2和CDR3。在一些情况下，这样的肽包括抗体ID8的VH和/或VL的CDR1、CDR2和CDR3，和抗体ID8的VH和/或VL的FR1、FR2、FR3、和/或FR4中的至少一个，如表1所示。在一些情况下，这样的肽包括SEQIDNO:113和/或SEQIDNO:115。在每种情况下，所述肽能够结合(例如，特异性结合和/或免疫特异性结合)MICA(例如，人MICA(例如可溶性MICA(sMICA)))。在一些情况下，所述肽与MICA之间的结合亲和力为大约0.1nM-1μM，大约50nM-200nM,或1nM-20nM,例如500nM或更小,400nM或更小,300nM或更小,200nM或更小,100nM或更小,50nM或更小,10nM或更小,5nM或更小,1nM,0.5nM或更小,0.4nM或更小,0.3nM或更小,0.2nM或更小,或者0.10nM或更小。
在一些情况下，治疗性组合物可包括这样的肽，其包括表1所示的抗体ID9的VH和/或VL的至少一个CDR，其中该肽结合(例如，特异性结合和/或免疫特异性结合)MICA(例如，人MICA(例如可溶性MICA(sMICA)))。在一些情况下，这样的肽包括表1所示的抗体ID9的VH和/或VL的CDR3。在一些情况下，这样的肽包括抗体ID9的VH和VL的CDR3，以及表1所示的抗体ID9的VH和/或VL的CDR1和/或CDR2。在一些情况下，这样的肽包括抗体ID9的VH和/或VL的CDR1、CDR2和CDR3。在一些情况下，这样的肽包括抗体ID9的VH和/或VL的CDR1、CDR2和CDR3，以及抗体ID9的VH和/或VL的FR1、FR2、FR3、和/或FR4中的至少一个，如表1所示。在一些情况下，这样的肽包括SEQIDNO:131和/或SEQIDNO:133。在每种情况下，所述肽能够结合(例如，特异性结合和/或免疫特异性结合)MICA(例如，人MICA(例如可溶性MICA(sMICA)))。在一些情况下，所述肽与MICA之间的结合亲和力为大约0.1nM-1μM，大约50nM-200nM,或1nM-20nM,例如500nM或更小,400nM或更小,300nM或更小,200nM或更小,100nM或更小,50nM或更小,10nM或更小,5nM或更小,1nM,0.5nM或更小,0.4nM或更小,0.3nM或更小,0.2nM或更小,或者0.10nM或更小。
在一些情况下，治疗性组合物可包括这样的肽，其包括表1所示的抗体ID11的VH和/或VL的至少一个CDR，其中该肽结合(例如，特异性结合和/或免疫特异性结合)MICA(例如，人MICA(例如可溶性MICA(sMICA)))。在一些情况下，这样的肽包括表1所示的抗体ID11的VH和/或VL的CDR3。在一些情况下，这样的肽包括抗体ID11的VH和VL的CDR3，以及表1所示的抗体ID11的VH和/或VL的CDR1和/或CDR2。在一些情况下，这样的肽包括抗体ID11的VH和/或VL的CDR1、CDR2和CDR3。在一些情况下，这样的肽包括抗体ID11的VH和/或VL的CDR1、CDR2和CDR3，以及抗体ID11的VH和/或VL的FR1、FR2、FR3、和/或FR4中的至少一个，如表1所示。在一些情况下，这样的肽包括SEQIDNO:150和/或SEQIDNO:152。在每种情况下，所述肽能够结合(例如，特异性结合和/或免疫特异性结合)MICA(例如，人MICA(例如可溶性MICA(sMICA)))。在一些情况下，所述肽与MICA之间的结合亲和力为大约0.1nM-1μM，大约50nM-200nM,或1nM-20nM,例如500nM或更小,400nM或更小,300nM或更小,200nM或更小,100nM或更小,50nM或更小,10nM或更小,5nM或更小,1nM,0.5nM或更小,0.4nM或更小,0.3nM或更小,0.2nM或更小,或者0.10nM或更小。
在一些情况下，治疗性组合物可包括这样的肽，其包括：SEQIDNO:2和/或SEQIDNO:11；SEQIDNO:77和/或SEQIDNO:79；SEQIDNO:96和/或SEQIDNO:98；SEQIDNO:113和/或SEQIDNO:115；SEQIDNO:131和/或SEQIDNO:133；和/或SEQIDNO:150和/或SEQIDNO:152。
“肽”是指包含至少两个连续连接的氨基酸残基的链，链的长度没有上限。蛋白质中的一个或多个氨基酸残基可以含有修饰，例如但不仅限于，糖基化、磷酸化或二硫键形成。在本文中，术语“肽”可以和“多肽”和“蛋白质”互换使用。
在一些情况下，治疗性组合物可包括肽，肽包括例如抗体，抗体包括全长和/或完整抗体或抗体片段。“抗体”是能够通过位于该免疫球蛋白分子可变区内的至少一个抗原识别位点特异性结合靶标，例如碳水化合物、多聚核苷酸、脂质、多肽等的免疫球蛋白分子。如本文所使用的，术语“抗体”不仅包括完整的多克隆或单克隆抗体，还包括其任何抗原结合片段(即“抗原结合部分”)或单链，包含抗体的融合蛋白，和包含抗原识别位点的免疫球蛋白分子的任何其它经修饰构型。抗体包括任何类型的抗体，例如IgG,IgA,或IgM(或其亚型)，并且抗体不必属于任何特定类型。根据其重链恒定区的抗体氨基酸序列，免疫球蛋白可以分成不同的类型。有五种主要的免疫球蛋白类型：IgA,IgD,IgE,IgG,和IgM，其中一些可以被进一步分成亚型(同种型)，例如IgG1,IgG2,IgG3,IgG4,IgA1和IgA2。对应于不同类型免疫球蛋白的重链恒定区被分别称作α、δ、ε、γ和μ。不同类型免疫球蛋白的亚单位结构和三维构型是众所周知的。
示例性抗体和抗体片段包括，但不仅限于，单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、由至少两个不同的表位结合片段形成的多特异性抗体(例如双特异性抗体)、骆驼化(camelised)抗体、嵌合抗体、单链Fv(scFv)、单链抗体、单结构域抗体、结构域抗体、Fab片段、F(ab')2片段，显示期望生物活性的抗体片段(例如抗原结合部分)，二硫键连接的Fvs(dsFv)，和抗独特型(抗Id)抗体(包括，例如，抗本发明抗体的抗-Id抗体)，胞内抗体(intrabody)，和上述任何的表位结合片段。抗体或抗体片段可以是人源的或人源化的。
抗体通常以高亲和力与其相关抗原特异性结合，反映在解离常数(KD)上为10-5-10-11M或者更低。任何大于约10-4M的KD一般被认为指示非特异性结合。如本文所使用的，与抗原“特异性结合”的抗体是指以高亲和力与抗原及基本上相同的抗原结合的抗体，这意味着KD为10-7M或更小，优选地10-8M或更小，甚至更优选地5x10-9M或更小，最优选地10-8M-10-10M或更小，但是不会以高亲和力与无关抗原结合。如果某抗原与给定抗原具有高度的序列同一性，例如如果它与给定抗原的序列具有至少80％，至少90％，优选地至少95％，更优选地至少97％，或者甚至更优选地至少99％的序列同一性，则该抗原与给定抗原“基本上相同”。作为举例，与人MICA特异性结合的抗体也可以和来自某些灵长类物种的MICA抗原(例如，食蟹猴MICA)交叉反应，但是不会和来自其它物种的MICA抗原、或者与除MICA之外的抗原交叉反应。
抗体片段适用于本方法，只要它们含有全长抗体的抗原结合部分并保留全长抗体的期望的亲和性和特异性即可。如本文所使用的，术语抗体“抗原结合部分”(或者简称作“抗体部分”)是指保留与抗原(例如人MICA)特异性结合能力的抗体的一个或多个片段。这些“片段”的长度是，例如，大约8-大约1500个氨基酸，合适的长度是大约8-大约745个氨基酸，合适的长度是大约8-大约300，例如大约8-大约200个氨基酸，或者长度为大约10-大约50或100个氨基酸。因此，抗-MICA抗体的片段将分别在Fv部分中保留结合MICA的能力，并在Fc部分中保留结合树突细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、B细胞和NK细胞上的Fc受体的能力。这些片段的特征是其性质与相应的全长抗-MICA抗体相似，即这些片段分别特异性结合在人细胞表面上表达的人MICA抗原或脱落到培养基中的相应sMICA抗原。
已经显示，抗体的抗原结合功能可以由全长抗体的片段来执行。抗体的“抗原结合部分”这一术语所涵盖的结合片段的实例包括(i)Fab片段，由VL,VH,CL和CH1结构域构成的单价片段；(ii)F(ab')2片段，包含通过铰链区的二硫键连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)Fd片段，由VH和CH1结构域构成；(iv)Fv片段，由抗体单臂的VL和VH结构域构成，(v)dAb片段(Ward等人,(1989)Nature341:544-546)，其由VH结构域构成；和(vi)分离的互补决定区(CDR)或(vii)两个或多个分离的CDR的组合，它们可以任选由人工接头连接起来。此外，尽管Fv片段的两个结构域VL和VH由不同的基因编码，但是可以使用重组方法通过人工接头将它们连接在一起，使它们能够被制备成单个蛋白链，其中VL和VH区配对以形成单价分子(称作单链Fv(scFv)；参见例如，Bird等人(1988)Science242:423-426；andHuston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:5879-5883)。这些单链抗体也意图包含在术语抗体的“抗原结合部分”内。使用本领域技术人员已知的常规技术获得这些抗体片段，并通过与完整抗体相同的方式筛选具有可用性的片段。抗原结合部分可以通过重组DNA技术生产，或者通过完整免疫球蛋白的酶促或化学切割产生。
Fv片段是含有完整的抗原识别和结合位点的抗体片段。该区域由紧密连接的一条重链可变结构域和一条轻链可变结构域的二聚体构成，紧密连接在性质上可以是共价的，例如在scFv中。正是在这种构型中，每个可变结构域的三个CDR相互作用而限定出VH-VL二聚体表面上的抗原结合位点。六个CDR或其子集合起来赋予了抗体的抗原结合特异性。然而，即使是单个可变结构域(或者仅包括3个抗原特异性CDR的Fv的一半)也可能具有识别和结合抗原的能力，虽然其亲和力通常以比完整的结合位点更低。
单链Fv或(scFv)抗体片段包括抗体的VH和VL结构域，其中这些结构域存在于单个多肽链中。一般地，Fv多肽在VH和VL结构域之间进一步包括多肽接头，使得scFv能够形成用于抗原结合的期望结构。
Fab片段含有轻链的可变和恒定结构域，以及重链的可变结构域和第一恒定结构域(CH1)。F(ab')2抗体片段包括一对Fab片段，这两个片段一般在其羧基端附近通过它们之间的铰链半胱氨酸共价连接。抗体片段的其它化学偶联也是本领域已知的。
“双特异性”或“双功能抗体”是具有两个不同的重链/轻链对和两个不同结合位点的人工杂交抗体。双特异性抗体可以通过多种方法产生，包括杂交瘤融合或Fab'片段的连接。参见例如Songsivilai&Lachmann,Clin.Exp.Immunol.79:315-321(1990)；Kostelny等人,J.Immunol.148,1547-1553(1992)。
双抗体是具有两个抗原结合位点的小抗体片段，该片段包括在同一多肽链中连接的VL和VH(VH与VL)。通过使用太短以至于不允许相同链上的两个结构域配对的接头，迫使结构域与另一条链的互补结构域配对，并产生两个抗原结合位点。
线性抗体包括一对串联的Fd节段(VH-CH1-VH-CH1)，它们与互补的轻链多肽一起形成一对抗原结合区。线性抗体可以是双特异性的或者单特异性的。
本公开的抗体或抗体片段可以在Fc区中有修饰，从而提供期望的效应器功能或血清半衰期。在一些情况下，Fc区可以和PEG或白蛋白偶联以增加血清半衰期，或者一些其它的偶联导致期望的效果。作为备选，当期望消除或减少效应器功能以便使副作用或治疗并发症最小化时，可以使用某些其它的Fc区。
人源和人源化抗体包括具有来自人种系免疫球蛋白序列(或者具有与其相同的氨基酸序列)的可变区和恒定区的抗体。人抗体可以包括不是由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机诱变或定点诱变或者通过体内体细胞突变而引入的突变)，例如在CDR中，特别是在CDR3中。如本文所使用的，术语“重组人抗体”包括所有通过重组手段制备、表达、创建或分离的人抗体，例如(a)从具有人免疫球蛋白转基因或转染色体的动物(例如小鼠)或从此类动物制备的杂交瘤分离的抗体，(b)从被转化而表达该抗体的宿主细胞，例如从转染瘤分离的抗体，(c)从重组组合人抗体文库分离的抗体，和(d)通过任何其它涉及将人免疫球蛋白基因序列与其它DNA序列剪接的方法而制备、表达、创建或分离的抗体。这些重组人抗体包括这样的可变区和恒定区，它们利用由种系基因编码的特定人种系免疫球蛋白序列，但包括在例如抗体成熟期间发生的后续重排和突变。如本领域中已知的(参见例如Lonberg(2005)NatureBiotech.23(9):1117-1125)，可变区含有抗原结合结构域，抗原结合结构域由多种基因编码，这些基因发生重排以形成特异针对外来抗原的抗体。除了重排之外，可变区可以进一步被多个单氨基酸改变(称作体细胞突变或超突变)所修饰，以增加抗体与外来抗原的亲和性。恒定区会进一步应答于抗原而改变(即，同种型转换(switch))。因此，响应抗原于编码的轻链和重链免疫球蛋白多肽的核酸分子经过重排和体细胞突变后与原始的核酸分子可能不具有序列同一性，而是基本上相同或者相似(即，具有至少80％的同一性)。
“人(源)抗体(HuMAb)”是指具有如下可变区的抗体，其中框架和CDR区均源自(derivedfrom)人种系免疫球蛋白序列。而且，如果抗体含有恒定区，则恒定区也源自人种系免疫球蛋白序列。本发明的人(源)抗体可以包括不是由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机诱变或定点诱变或者通过体内体细胞突变引入的突变)。然而，如本文所使用的，术语“人抗体”不意图包括这样的抗体：其中来自另一个哺乳动物物种种系(例如小鼠)的CDR序列被移植到人框架序列上。术语“人(源)”抗体和“全人(源)”抗体同义使用。
“人源化”抗体是指这样的抗体，其中非人源抗体CDR结构域外部的一些、大部分或者全部氨基酸被来自人免疫球蛋白的相应氨基酸代替。在人源化形式抗体的一个实施方案中，CDR结构域外部的一些、大多数或全部氨基酸被来自人免疫球蛋白的氨基酸代替，而一个或多个CDR区域内的一些、大多数或全部氨基酸没有改变。少量氨基酸的添加、缺失、插入、取代或修饰也允许的，只要它们不会破坏抗体结合特定抗原的能力即可。“人源化”抗体保留与原始抗体相似的抗原特异性。
“嵌合抗体”是指这样的抗体：其中可变区源自一个物种而恒定区来自另一个物种，例如这样的抗体：其中可变区源自小鼠抗体而恒定区源自人抗体。
如本文所使用的，术语“表位”是指能够结合抗体的蛋白决定簇。表位通常由氨基酸或糖侧链等分子的化学活性表面基团构成，并且通常具有特定的三维结构特征，以及特定的电荷特征。表位可以由非邻接的氨基酸通过蛋白三维折叠被并置而形成(例如，构象表位)，或者可以由邻接的氨基酸形成(例如，非构象表位)。构象和非构象表位的区别在于，在变性溶剂的存在下，与前者的结合会丧失，而与后者的结合不会丧失。表位通常包括处于独特空间构象的至少3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14或15个氨基酸。用于确定什么表位被给定的抗体结合的方法(即，表位定位)是本领域众所周知的，并且包括，例如，免疫印迹测定法和免疫沉淀测定法，其中测试重叠或邻接的肽(例如来自MICA的)对给定抗体(例如抗-MICA抗体)的反应性。确定表位空间构象的方法包括现有技术中的和本文描述的那些，例如，x-射线晶体学和2维核磁共振(参见例如，EpitopeMappingProtocolsinMethodsinMolecularBiology,Vol.66,G.E.Morris,Ed.(1996))。
术语“表位定位(epitopemapping)”是指鉴定抗体-抗原识别的分子决定簇的过程。
术语“与某表位结合”或“识别某表位”对某一抗体或抗体片段而言是指抗原内部连续或不连续的氨基酸节段。本领域的技术人员会理解，该术语不一定意味着该抗体或抗体片段与表位序列内的每一个氨基酸都直接接触。
术语“结合相同的表位”对两个或更多个抗体而言意思是抗体与相同的、重叠的或包括连续或不连续氨基酸的节段结合。本领域的技术人员会理解，语句“结合相同的表位”不一定意味着各抗体结合或接触完全相同的氨基酸。各抗体接触的确切氨基酸可以有不同。例如，第一种抗体结合的氨基酸节段可完全包含于第二种抗体所结合的氨基酸节段中。在另一个实例中，第一种氨基酸结合的一个或多个氨基酸节段与第二种抗体所结合的一个或多个节段显著重叠。为本文的目的，这些抗体被认为“结合相同的表位”
因此，本发明还包括这样的抗体，其结合MICA上的表位，该表位包括被本文所述的具体抗体所识别的表位的全部或一部分(例如3,4,5,6,7,8,9或10个连续的或不连续的氨基酸)(例如，相同或重叠的区域，或者区域之间或跨区域的区域)。
用于确定与本文所述的抗体结合“MICA上相同表位”的抗体的技术包括，例如，表位定位方法，例如抗原-抗体复合物晶体的x-射线分析，其提供表位的原子级分辨率。其它方法监测抗体与抗原片段或抗原突变变异体的结合，其中由于抗原序列内氨基酸残基的修饰导致的结合丧失经常被认为是表位组分的指示。此外，还可以使用计算组合方法对表位定位。这些方法依赖于感兴趣抗体从组合噬菌体展示肽文库中亲和分离特定短肽的能力。然后，这样的肽被看作是限定表位的前导，这些表位对应于用于筛选肽文库的抗体。对于表位定位，也已经开发了已证明可以对构象不连续的表位进行作图的计算机算法。
本发明还涵盖与本文所述抗体竞争结合MICA的抗体。识别相同表位或竞争结合的抗体可以使用常规技术鉴定。这些技术包括，例如，免疫测定，其显示一种抗体阻断另一种抗体与靶抗原结合的能力，即竞争性结合测定。竞争性结合可以在这样的测定系统中确定，其中被测试的免疫球蛋白抑制参考抗体与共同抗原(例如MICA)的特异性结合。已知有许多类型的竞争性结合测定系统，例如：固相直接或间接放射免疫测定(RIA)，固相直接或间接酶免疫测定(EIA)，夹心式竞争测定(见Stahli等人,MethodsinEnzymology9:242(1983))；固相直接生物素-亲和素EIA(见Kirkland等人,J.Immunol.137:3614(1986))；固相直接标记测定，固相直接标记夹心式测定(见HarlowandLane,Antibodies:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborPress(1988))；使用I-125标记物的固相直接标记RIA(见Morel等人,Mol.Immunol.25(1):7(1988))；固相直接生物素-亲和素EIA(Cheung等人,Virology176:546(1990))；和直接标记RIA(Moldenhauer等人,Scand.J.Immunol.32:77(1990))。典型地，这种测定系统涉及使用：与固体表面结合的纯化抗原或者携带两者之一的细胞、无标记的测试免疫球蛋白、和带标记的参考免疫球蛋白。通过确定在测试免疫球蛋白的存在下与固体表面或细胞结合的标记物的量来测量竞争性抑制。通常，当竞争性抗体过量存在时，它会抑制参考抗体与共同抗原的特异性结合达至少50-55％,55-60％,60-65％,65-70％,70-75％或者更多。
如本文所使用的，术语“特异性结合”、“选择性结合”、“选择性地结合”、和“特异性地结合”是指抗体与预定抗原上的表位的结合。典型地，当在BIACORE2000仪器上使用重组MICA作为分析物、以抗体作为配体，通过表面等离子共振(SPR)技术进行测定时，抗体以大约小于10-7M，例如大约小于10-8M,10-9M或10-10M或者甚至更低的平衡解离常数(KD)结合，并且与预定抗原的结合亲和力是其与预定抗原或密切近缘的抗原之外的非特异性抗原(例如BSA、酪蛋白)的结合亲和力的至少2倍。因此，“特异性结合人MICA”的抗体是指这样的抗体，其与人MICA的结合KD为10-7M或更小，例如大约小于10-8M,10-9M或10-10M或者甚至更低。“与食蟹猴MICA交叉反应”的抗体是指这样的抗体，其与食蟹猴MICA的结合KD为10-7M或更小，例如约小于10-8M,10-9M或10-10M或者甚至更低。在某些实施方案中，这些不与来自非人物种的MICA交叉反应的抗体在标准结合测定中基本上显示不出可检测到的针对这些蛋白质的结合。
如本文所使用的，术语“kassoc”或“ka”意图指特定的抗体-抗原相互作用的缔合速率，而如本文所使用的，术语“kdis”或“kd”意图指特定的抗体-抗原相互作用的解离速率。如本文所使用的，术语“KD”意图指解离常数，其是从kd与ka的比值(即kd/ka)获得的，并且用摩尔浓度(M)表示。抗体的KD值可以使用本领域中确立的方法确定。用于确定抗体KD的优选方法是通过使用等离子体表面共振，优选地使用生物传感器系统，例如系统。
如本文所使用的，对于IgG抗体，术语“高亲和力”是指抗体对靶抗原具有为10-8M或更小，优选地10-9M或更小，甚至更优选地10-10M或更小的KD。然而，“高亲和力”结合对于其它抗体同种型可能有变化。例如，对于IgM同种型的“高亲和力”结合是指抗体的KD为10-7M或更小，更优选地10-8M或更小。
如本文所使用的，术语“EC50”是指抗体或其抗原结合部分在体外或体内测定中诱导50％最大响应，即最大响应和基线之间的半程，的浓度。
术语“与固定的MICA的结合”是指本发明抗体与MICA结合，例如与在细胞表面上表达的或者附着在固体支持物上的MICA结合的能力。
如本文所使用的，术语“交叉反应”是指本发明抗体与来自不同物种的MICA结合的能力。例如，与人MICA结合的本发明抗体也会结合另一个物种的MICA(例如食蟹猴MICA)。如本文所使用的，通过在结合测定系统(例如SPR、ELISA)中用纯化抗原检测的特异反应性，或者检测与生理性表达MICA的细胞结合或者功能性相互作用，来测量交叉反应性。用于确定交叉反应性的方法包括标准结合测定，如本文所述的，例如通过使用BiacoreTM2000SPR装置(BiacoreAB,Uppsala,Sweden)的BiacoreTM表面等离子体共振(SPR)分析，或者流式细胞技术。
可变结构域的“CDR”是超变区内的氨基酸残基，这些残基是根据Kabat、Chothi、Kabat和Chothia的累加、AbM、接触(contact)、和/或构象定义等定义方法，或者本领域众所周知的任何CDR确定方法鉴定的。抗体CDR可以作为最初由Kabat等人定义的超变区被鉴定。参见例如Kabat等人,1992,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,第五版,PublicHealthService,NIH,WashingtonD.C。CDR的位置也可以作为最初由Chothia等人描述的结构环结构鉴定。参见例如Chothia等人,1989,Nature342:877-883。鉴定CDR的其它方法包括“AbM定义”，其是Kabat和Chothia之间的折中，是使用OxfordMolecular的AbM抗体建模软件(现在是)推导的；或者还有CDR的“接触定义”，其是基于所观察的抗原接触，是在MacCallum等人,1996,J.Mol.Biol.,262:732-745中提出的。在另一种在本文中称作CDR的“构象定义”的方法中，可以鉴定对抗原结合发挥焓贡献的残基作为CDR的位置。参见例如Makabe等人,2008,JournalofBiologicalChemistry,283:1156-1166。再其它的CDR边界定义可能不严格遵循上述其中一种方法，但是仍然与KabatCDR的至少一部分重叠，尽管根据预测或者特定的残基或者残基群或者甚至整个CDR不显著影响抗原结合的实验发现，它们可能被缩短或延长。如本文所使用的，CDR是指通过本领域已知的任何方法，包括方法的组合，定义的CDR。本文所用的方法可以利用根据这些方法中的任一种定义的CDR。对于含有超过1个CDR的任何给定的实施方案，CDR可以根据Kabat,Chothia,扩展(extended),AbM,接触(contact),和/或构象定义中的任一种来定义。
在一些情况下，本文公开的肽的氨基酸序列可以被修饰和改变以产生肽变体(例如，与本文公开的肽具有限定的序列同源性的肽)，例如，只要肽变体与未经修饰的肽相比保持或者提高了抗原结合性质即可(任何经修饰肽的抗原结合性质可以使用本文所述的体外和/或体内测定和/或本领域已知的技术进行评估)。
尽管对肽变体的观察和讨论一般在氨基酸水平上进行，但是实际的修饰通常是在核酸水平上引入或实施的。例如，与表1所示肽具有80％,85％,90％,95％,96％,97％,98,或99％氨基酸序列同一性的变体可以通过使用本领域已知的技术(例如克隆技术)和/或本文公开的技术对编码SEQIDNO:1,10,76,78,95,97,112,114,130,132,149,和/或151的核酸，或其部分/片段进行修饰而产生。
氨基酸序列修饰通常属于三种类型中的一种或多种：取代性、插入性、或缺失性修饰。插入包括氨基和/或末端融合以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。插入通常是比氨基或羧基端融合更小的插入，例如，1-4个残基的数量级。缺失的特征是从蛋白质序列中除去一个或多个氨基酸残基。典型地，在蛋白分子内的任何一个部位缺失不超过大约2-6个残基。氨基酸取代一般是单个残基的取代，但也可以一次发生在多个不同的位置；插入通常是大约1-10个氨基酸残基的量级；而缺失的范围是大约1-30个残基。缺失或插入可以相邻地成对进行，即缺失2个残基或插入2个残基。取代、缺失、插入或其任何组合可以组合进行以达到最终的构建体。突变一定不能使序列阅读框变化，优选地不会产生可导致mRNA二级结构的互补区域。取代修饰是其中除去至少一个残基并插入不同的残基取而代之。在某些情况下，取代可以是保守的氨基酸取代。在一些情况下，本文的肽相对于表1所示的肽可以包括一个或多个保守氨基酸取代。例如，变体相对于表1所示的肽可以包括1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，20-30，30-40，或40-50个保守氨基酸取代。作为备选，变体相对于表1所示的肽可以包括50个或更少，40个或更少，30个或更少，20个或更少，10个或更少，9个或更少，8个或更少，7个或更少，6个或更少，5个或更少，4个或更少，3个或更少，或2或更少的保守氨基酸取代。这些取代一般是按照下面的表2实施的，并被称为保守取代。用于预测对蛋白修饰的容忍度的方法是本领域已知的(参见，例如，Guo等人,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,101(25):9205-9210(2004))。
表2:保守氨基酸取代
氨基酸取代(其它是本领域已知的)
AlaSer,Gly,Cys
ArgLys,Gln,His
AsnGln,His,Glu,Asp
AspGlu,Asn,Gln
CysSer,Met,Thr
GlnAsn,Lys,Glu,Asp,Arg
GluAsp,Asn,Gln
GlyPro,Ala,Ser
HisAsn,Gln,Lys
IleLeu,Val,Met,Ala
LeuIle,Val,Met,Ala
LysArg,Gln,His
MetLeu,Ile,Val,Ala,Phe
PheMet,Leu,Tyr,Trp,His
SerThr,Cys,Ala
ThrSer,Val,Ala
TrpTyr,Phe
TyrTrp,Phe,His
ValIle,Leu,Met,Ala,Thr
在一些情况下，取代并不保守。例如，表1所示的肽中的氨基酸可以被会改变该肽的一些性质或方面的氨基酸代替。在一些情况下，可以实施非保守的氨基酸取代，例如，改变肽的结构，改变肽的结合性质(例如，增加或降低肽与抗原的结合亲和力，和/或增加或降低肽与抗原的结合特异性)。
在一些情况下，肽和/或肽变体可以包括或者可以是表1所示的肽的片段。这样的片段包括，例如，比表1所示的CDR、FR和/或AA少1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,3637,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49,50,50-100,101-150个氨基酸，只要这些片段仍保持全长肽的至少一部分结合性质即可(例如，全长肽的结合性质的至少50％,60％,70％,80％,90％,或100％)。截短可以发生在本文肽的氨基端、羧基端和/或内部。
在一些情况下，肽变体的相互作用面(interactingface)可以和未经修饰的肽的相互作用面相同(例如，基本上相同)，以便例如改变(例如增加或降低)、保留或维持与未经修饰肽相关的肽变体的结合性质。鉴定肽的相互作用面的方法是本领域已知的(Gong等人,BMC:Bioinformatics,6:1471-2105(2007)；AndradeandWei等人,PureandAppl.Chem.,64(11):1777-1781(1992)；Choi等人,Proteins:Structure,Function,andBioinformatics,77(1):14-25(2009)；Park等人,BMC:andBioinformatics,10:1471-2105(2009))。
本领域的技术人员会容易理解如何确定两个多肽(例如未经修饰的肽和肽变体)的同一性。例如，可以在对齐两条序列使它们的同一性达到最高水平之后再计算同一性。计算同一性的另一个方法可以通过公开的算法实施。用于序列比较的最佳比对可以通过SmithandWaterman,Adv.Appl.Math,2:482(1981)的局部同一性算法，通过NeedlemanandWunsch,J.Mol.Biol.48:443(1970)的同一性比对算法，通过PearsonandLipman,Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:2444(1988)的相似性搜索方法，通过这些算法的计算机化实现(Wisconsin遗传软件包中的GAP,BESTFIT,FASTA,和TFASTA(GeneticsComputerGroup,575ScienceDr.,Madison,WI))，或通过检视来实施。
对于核酸，通过例如Zuker,Science244:48-52(1989)；Jaeger等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:7706-10(1989)；Jaeger等人,MethodsEnzymol.183:281-306(1989)中公开的算法获得相同类型的同一性，本申请至少为了该文献与核酸算法相关的材料而将其通过提述并入。应当理解，任何方法通常均可被使用，并且在某些情况下，这些不同方法的结果可能不同，但是技术人员会理解，如果使用这些方法中的至少一种发现了同一性，则可以说这些序列具有其声明的同一性并且在本申请中被公开。
两个序列之间的百分比同一性是序列所共享的相同位置的数目的函数(即，％同源性＝相同位置#/总位置#x100)，并考虑为获得两个序列的最佳比对而需要引入的缺口的数目和每个缺口的长度。序列的比较和两个序列之间百分比同一性的确定可以使用数学算法实现，如下文的非限制性实施例所述。
两个核苷酸序列之间的百分比同一性可以使用GCG软件包(可在http://www.gcg.com访问)中的GAP程序加以确定，使用NWSgapdna.CMP矩阵，缺口权重为40,50,60,70,或80，长度权重为1,2,3,4,5,或6。两个核苷酸或氨基酸序列之间的百分比同一性也可以使用E.MeyersandW.Miller(CABIOS,4:11-17(1989))的算法加以确定，该算法被整合在ALIGN程序(2.0版)中，使用PAM120权重残基表，缺口长度罚分为12，缺口罚分为4。此外，两个氨基酸序列之间的百分比同一性可以使用NeedlemanandWunsch(J.Mol.Biol.(48):444-453(1970))算法确定，该算法被整合在GCG软件包(可在http://www.gcg.com访问)中的GAP程序中，使用Blossum62矩阵或PAM250矩阵，缺口权重为16,14,12,10,8,6,或4，长度权重为1,2,3,4,5,或6。
本发明的核酸和蛋白序列可以进一步用作“查询序列”，对公共数据库进行搜索，以便例如鉴定相关序列。这些搜索可以使用Altschul,等人(1990)J.Mol.Biol.215:403-10的NBLAST和XBLAST程序(2.0版)实施。可以用NBLAST程序以得分＝100，字长＝12实施BLAST核苷酸搜索，以获得与本发明核酸分子同源的核苷酸序列。可以用XBLAST程序以得分＝50，字长＝3实施BLAST蛋白搜索，以获得与本发明蛋白分子同源的氨基酸序列。为了获得带缺口的比对用于比较的目的，可以如Altschul等人,(1997)NucleicAcidsRes.25(17):3389-3402所述地利用带缺口的BLAST(GappedBLAST)。当利用BLAST和带缺口的BLAST程序时，可以使用各自程序(例如，XBLAST和NBLAST)的缺省参数。见www.ncbi.nlm.nih.gov。
在一些情况下，如下文“方法”部分更详细描述的，本文公开的治疗性组合物可以使用从免疫细胞(例如B细胞，包括记忆B细胞)分离和/或纯化的遗传材料(例如DNA和/或mRNA)产生，其中免疫细胞使用本文公开的方法获得。一旦获得了这些遗传材料，使用它们产生本文公开的治疗性组合物的方法是本领域已知的，和/或在下文有总结。
在一些情况下，肽可以包括可检测标记物。如本文所使用的，“标记物”是指分子的部分，该部分中纳入有至少一种元素、同位素或功能基团，使得该标记物所附着于的肽能够被检测出来。标记物可以直接附着(即，通过键合)或者可以通过接头附着(例如环状或非环状、分支或无分支、取代或非取代的亚烷基；环状或非环状、分支或无分支、取代或非取代的亚烯基；环状或非环状、分支或无分支、取代或非取代的亚炔基；环状或非环状、分支或无分支、取代或非取代的杂亚烷基(heteroalkenylene)；环状或非环状、分支或无分支、取代或非取代的杂亚烯基(heteroalkenylene)；环状或非环状、分支或无分支、取代或非取代的杂亚炔基(heteroalkynylene)；取代或非取代的亚烷基(arylene)；取代或非取代的杂炔基(heteroarylene)；或者取代或非取代的炔基(acylene)，或它们的可以构成接头的任何组合。标记物可以附着在肽的任何不干扰所检测的本发明多肽的生物学活性或特征的位置。
标记物可以包括：含有同位素部分的标记物，同位素可以是放射性同位素或重同位素，包括但不仅限于，2H,3H,13C,14C,15N,31P,32P,35S,67Ga,99mTc(Tc-99m),111In,123I,125I,169Yb,和186Re；包含免疫或免疫反应性部分的标记物，免疫或免疫反应性部分可以是抗体或抗原，抗体或抗原可以和酶(例如辣根过氧化物酶)结合；有色、发光、磷光或者包含荧光部分(例如荧光标记物FITC)的标记物；具有一个或多个光亲和性部分的标记物；具有一种或多种已知结合伙伴(例如生物素-链霉亲和素、FK506-FKBP等)的配体部分的标记物。
在一些情况下，标记物可以包括一个或多个光亲和性部分，用于直接阐明生物系统中的分子间相互作用。可以采用多种已知的发光团，它们大多数依赖于重氮化合物、叠氮化物或重氮甲烷(diazirine)光转化为氮宾或卡宾(见，例如，Bayley,H.,PhotogeneratedReagentsinBiochemistryandMolecularBiology(1983),Elsevier,Amsterdam，本申请通过提述并入其全部内容)。在本发明的某些实施方案中，所用的光亲和标记物是邻-、间-和对-叠氮苯甲酰基，其被一个或多个卤素部分取代，包括但不限于，4-叠氮基-2,3,5,6-四氟苯甲酸。
标记物还可以是、或者用作成像剂。示例性成像剂包括，但不仅限于，在正电子发射断层扫描(PET)、计算机辅助断层扫描(CAT)、单光子发射计算机断层摄影术、X射线、荧光显微镜、和磁共振成像(MRI)中使用的那些；止吐药(抗-emetics)和造影剂(contrastagent)。示例性诊断试剂包括，但不仅限于，荧光部分、发光部分、磁性部分；用于CAT和X-射线成像的钆螯合物(例如，钆与DTPA,DTPA-BMA,DOTA和HP-DO3A的螯合物)、铁螯合物、镁螯合物、锰螯合物、铜螯合物、铬螯合物、碘基材料，和放射性核素。合适的放射性核素包括，但不限于，123I,125I,130I,131I,133I,135I,47Sc,72As,72Se,90Y,88Y,97Ru,100Pd,101mRh,119Sb,128Ba,197Hg,211At,212Bi,212Pb,109Pd,111In,67Ga,68Ga,67Cu,75Br,77Br,99mTc,14C,13N,150,32P,33P,和18F。
荧光和发光部分包括，但不仅限于，多种不同的有机或无机小分子，其统称为“染料”、“标记物”或“指示剂”。实例包括，但不仅限于，荧光素，若丹明，吖啶染料，Alexa染料，花青染料等。荧光和发光部分可包括各种天然存在的蛋白质及其衍生物，例如，基因工程化的变体。例如，荧光蛋白包括绿色荧光蛋白(GFP)，强化的GFP，红色、蓝色、黄色、青色、和蓝宝石荧光蛋白、礁珊瑚荧光蛋白等。发光蛋白包括荧光素酶、水母发光蛋白和它们的衍生物。众多的荧光和发光染料和蛋白是本领域已知的(见例如，美国专利公开2004/0067503；Valeur,B.,"MolecularFluorescence:PrinciplesandApplications,"JohnWileyandSons,2002；和HandbookofFluorescentProbesandResearchProducts,MolecularProbes,第9版,2002)。
如本文所使用的，属于“纯化的”或“分离的”是指从其天然环境的成分中被鉴定和分离和/或回收的其它分子，例如多肽、核酸分子。因此，在一个实施方案中，本发明的抗体是纯化的抗体，其中它们与其自然环境下的一种或多种组分分离。
核酸组合物
在一些情况下，本公开提供了对应于(例如编码)所公开的肽(例如表1中公开的那些)的核苷酸序列。这些序列包括所有与本公开肽相关的简并序列，即具有编码某一特定的肽或其变体和衍生物的序列的所有核酸。因此，尽管在本文中可以没有写出每一个具体的核酸序列，但是应当理解，通过所公开的多肽序列，本文实际上公开并记载了所有的序列。
在一些情况下，所公开的核酸可以包括表达载体。合适的载体实例包括，但不仅限于，质粒、人工染色体，例如BAC,YAC,或PAC，和病毒载体。
所提供的载体还可包括，例如，复制原点和/或标志物。标志物基因能够为细胞提供可选择的表型，例如抗生素抗性等。利用标志物产物来确定载体是否被递送到细胞内，以及一旦递送是否被表达。用于哺乳动物细胞的可选择标志物的实例有二氢叶酸还原酶(DHFR)、胸苷激酶、新霉素、新霉素类似物G418、潮霉素、嘌呤霉素、和杀稻瘟素。当此类可选择标志物被成功地转移到哺乳动物宿主细胞内时，被转化的哺乳动物宿主细胞在选择压力存在下能够生存。其他标志物的实例包括，例如，大肠杆菌lacZ基因、绿色荧光蛋白(GFP)和荧光素酶。此外，表达载体可以包括旨在方便所表达多肽的操作或检测(例如，纯化或定位)的标签序列。标签序列，例如GFP，谷胱甘肽S-转移酶(GST)，多组氨酸，c-myc，血凝素，或FLAGTM标签(Kodak；NewHaven,CT)序列通常被表达为与所编码多肽的融合物。这样的标签可以被插入在多肽内的任何位置，包括羧基端或氨基端。
在一些情况下，本公开包括含有本文公开的核酸(例如载体)和/或肽的细胞。细胞可包括，例如，真核生物和/或原核生物细胞。一般地，本文可用的细胞是可以从例如美国模式培养物保藏中心(ATCC),P.O.Box1549,Manassas,VA20108商购的。另见F.Ausubel等人,CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&Sons,NewYork,NY,(1998)。产生本文所公开细胞的转化和转染方法在例如F.Ausubel等人,CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&Sons,NewYork,NY,(1998)中有描述。
载体介导的转移已显示可以工程化抗体的靶向递送(Balazs等人,Nature.2011Nov30；481(7379):81-4)。因此，在一个方面中，本公开提供方法和组合物，其可用于利用病毒将编码与感兴趣MICA免疫特异性结合的肽的多核苷酸递送到靶细胞内。在基因治疗的背景中，可以通过载体(例如病毒载体，包括但不仅限于，腺病毒、牛痘病毒或腺相关病毒)将编码与感兴趣MICA免疫特异性结合的肽的多核苷酸递送到靶细胞内。例如，蛋白质，例如对特定细胞表面分子具有特异性的抗体或抗体片段可以被附着在病毒的表面，允许病毒靶向特定的细胞。进一步，病毒可以被工程化以含有允许病毒仅在特定的细胞内，例如癌细胞内发挥功能的核酸序列，例如启动子。
在一些情况下，本公开的治疗性组合物可以包括载体(例如，表达载体、病毒载体和腺相关病毒载体)，其包含编码与MICA免疫特异性结合的肽的核酸。在一个方面中，与MICA免疫特异性结合的肽是与MICA免疫特异性结合的抗体或抗体片段。如本文所述，抗体和抗体片段包括，但不仅限于，单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、单克隆抗体、由至少两个不同的表位结合片段形成的多特异性抗体(例如双特异性抗体)、骆驼化抗体、嵌合抗体、单链Fv(scFv)、单链抗体、单结构域抗体、结构域抗体、Fab片段、F(ab')2片段、显示期望生物学活性的抗体片段(例如抗原结合部分)，二硫键链接的Fv(dsFv)，和抗-独特型(抗-Id)抗体(包括例如，抗本发明抗体的抗-Id抗体)、胞内抗体和上述任意者的表位结合片段。
相应地，在一个方面中，本公开提供了载体和细胞，其包括与SEQIDNO:1,76,95,112,130,或149具有至少大约75％,80％,90％,95％,99％或更多,或者完全(100％)序列同一性的核苷酸序列。在一些方面中，该核酸序列编码包含与SEQIDNO:2,77,96,113,131或150具有至少80％,85％,90％,95％,96％,97％,98,99％,或100％同一性的氨基酸序列的肽。
在一个方面中，载体可以包含与SEQIDNO:10,78,97,114,132或151具有至少大约75％,80％,90％,95％,99％或更多,或者完全(100％)的序列同一性的核苷酸序列。在一些方面中，该核酸序列编码包含SEQIDNO:2,11,79,98,115,133或152具有至少80％,85％,90％,95％,96％,97％,98,99％,或100％同一性的氨基酸序列的肽。
在一些实施方案中，本公开提供包含核酸的组合物，所述核酸编码与MHCI类多肽相关序列A(MICA)或其上的表位免疫特异性结合的肽。在一些方面中，所述组合物的核酸编码表1所示的抗体ID1,6,7,8,9或11的VH，其中具有5个或更少的保守氨基酸取代。在一些方面中，所述组合物的核酸编码表1所示的抗体ID1,6,7,8,9或11的VL，其中具有5个或更少的保守氨基酸取代。
在一个方面中，本公开提供了分离核酸，其包括与SEQIDNO:1具有至少大约75％,80％,90％,95％,99％或更多,或者完全(100％)序列同一性的核苷酸序列。在一些方面中，该分离的核酸编码包含与SEQIDNO:2具有至少80％,85％,90％,95％,96％,97％,98,99％,或100％同一性的氨基酸序列的肽。在另一个方面中，本公开提供了分离核酸，其包括与SEQIDNO:2具有至少大约75％,80％,90％,95％,99％或更多,或者100％序列同一性的核苷酸序列。在一些方面中，该分离的核酸编码包含与SEQIDNO:11具有至少80％,85％,90％,95％,96％,97％,98,99％,或100％同一性的氨基酸序列的肽。
在一个方面中，本公开提供分离的核酸，其包括与SEQIDNO:76具有至少大约75％,80％,90％,95％,99％或更多,或者完全(100％)序列同一性的核苷酸序列。在一些方面中，该分离的核酸编码包含与SEQIDNO:77具有至少80％,85％,90％,95％,96％,97％,98,99％,或100％同一性的氨基酸序列的肽。在另一个方面中，本公开提供分离的核酸，其包括与SEQIDNO:78具有至少大约75％,80％,90％,95％,99％或更多,或完全(100％)序列同一性的核苷酸序列。在一些方面中，该分离的核酸编码包含与SEQIDNO:79具有至少80％,85％,90％,95％,96％,97％,98,99％,或100％同一性的氨基酸序列的肽。
在一个方面中，本公开提供分离的核酸，其包括与SEQIDNO:95具有至少大约75％,80％,90％,95％,99％或更多,或者完全(100％)序列同一性的核苷酸序列。在一些方面中，该分离的核酸编码包含与SEQIDNO:96具有至少80％,85％,90％,95％,96％,97％,98,99％,或100％同一性的氨基酸序列的肽。在另一个方面中，本公开提供分离的核酸，其包括与SEQIDNO:97具有至少大约75％,80％,90％,95％,99％或更多,或完全(100％)序列同一性的核苷酸序列。在一些方面中，该分离的核酸编码包含与SEQIDNO:98具有至少80％,85％,90％,95％,96％,97％,98,99％,或100％同一性的氨基酸序列的肽。
在一个方面中，本公开提供分离的核酸，其包括与SEQIDNO:112具有至少大约75％,80％,90％,95％,99％或更多,或者完全(100％)序列同一性的核苷酸序列。在一些方面中，该分离的核酸编码包含与SEQIDNO:113具有至少80％,85％,90％,95％,96％,97％,98,99％,或100％同一性的氨基酸序列的肽。在另一个方面中，本公开提供分离的核酸，其包括与SEQIDNO:114具有至少大约75％,80％,90％,95％,99％或更多,或完全(100％)序列同一性的核苷酸序列。在一些方面中，该分离的核酸编码包含与SEQIDNO:115具有至少80％,85％,90％,95％,96％,97％,98,99％,或100％同一性的氨基酸序列的肽。
在一个方面中，本公开提供分离的核酸，其包括与SEQIDNO:130具有至少大约75％,80％,90％,95％,99％或更多,或者完全(100％)序列同一性的核苷酸序列。在一些方面中，该分离的核酸编码包含与SEQIDNO:131具有至少80％,85％,90％,95％,96％,97％,98,99％,或100％同一性的氨基酸序列的肽。在另一个方面中，本公开提供分离的核酸，其包括与SEQIDNO:132具有至少大约75％,80％,90％,95％,99％或更多,或完全(100％)序列同一性的核苷酸序列。在一些方面中，该分离的核酸编码包含与SEQIDNO:133具有至少80％,85％,90％,95％,96％,97％,98,99％,或100％同一性的氨基酸序列的肽。
在一个方面中，本公开提供分离的核酸，其包括与SEQIDNO:149具有至少大约75％,80％,90％,95％,99％或更多,或者完全(100％)序列同一性的核苷酸序列。在一些方面中，该分离的核酸编码包含与SEQIDNO:150具有至少80％,85％,90％,95％,96％,97％,98,99％,或100％同一性的氨基酸序列的肽。在另一个方面中，本公开提供分离的核酸，其包括与SEQIDNO:151具有至少大约75％,80％,90％,95％,99％或更多,或完全(100％)序列同一性的核苷酸序列。在一些方面中，该分离的核酸编码包含与SEQIDNO:152具有至少80％,85％,90％,95％,96％,97％,98,99％,或100％同一性的氨基酸序列的肽。
如本文所使用的，属于“核酸”或“核酸分子”意图包括DNA分子和RNA分子。核酸分子可以是单链或双链，但优选地是双链DNA。
分离的核酸可以是，例如，DNA分子，条件是在天然存在的基因组中通常位于该DNA分子紧邻两侧出现的核酸序列之一被除去或缺失。因此，分离的核酸包括，但不仅限于，作为独立于其他序列的单独分子存在的DNA分子(例如化学合成的核酸、cDNA或通过PCR或限制性内切酶处理产生的基因组DNA片段)，以及整合到载体、自主复制质粒、病毒(例如逆转录病毒、慢病毒、腺病毒或疱疹病毒)的DNA，或者整合到原核生物或真核生物基因组DNA内的DNA。此外，分离的核酸可以包括作为杂交体或融合核酸的一部分的工程化的核酸，例如重组DNA分子。存在于例如cDNA文库或基因组文库内的数百到数百万个其它核酸或者含有基因组DNA限制性消化物的凝胶片(gelslice)不视为分离的核酸。
在计算百分比序列同一性时，将两个序列比对，并确定两个序列之间相同匹配的核苷酸或氨基酸残基的数目。相同匹配的数目除以所比对区域的长度(即，所比对核苷酸或氨基酸残基的数目)并乘以100，从而获得百分比序列同一性数值。应当意识到，比对区域的长度可以是一个或两个序列的一部分，上至最短序列的全长尺寸。还应当意识到，单个序列可以和多于一个其它序列比对，因此在每个比对区域可以具有不同的百分比序列同一性数值。注意，百分比同一性数值通常被四舍五入到最接近的整数。例如，78.1％,78.2％,78.3％,和78.4％被四舍到78％，而78.5％,78.6％,78.7％,78.8％,和78.9％被五入到79％。还要注意，比对区域的长度永远是整数。
如本文所使用的，属于“百分比序列同一性”是指任何给定的查询序列和主题序列之间的同一性程度。任何查询核酸或氨基酸序列(例如转录因子)相对于另一主题核酸或氨基酸序列的百分比同一性可以如下确定。
核酸可以存在于完整细胞、细胞裂解物或部分纯化或基本上纯化的形式中。当通过标准技术，包括碱性/SDS处理、CsCl成带(banding)、柱色谱、琼脂糖凝胶电泳和其它本领域众所周知的技术将核酸与其它细胞组分或其它污染物(例如其它细胞核酸或蛋白)纯化分离时，核酸是“分离的”或“呈现基本上纯的”。参见，F.Ausubel,等人编辑.CurrentProtocolsinMolecularBiology,GreenePublishingandWileyInterscience,NewYork(1987)。
本发明的核酸组合物尽管经常呈现来自cDNA、基因组或其混合物的天然序列(除了具有经过修饰的限制位点等之外)，但是可以根据提供基因序列的标准技术将其突变。对于编码序列，这些突变可能根据期望影响氨基酸序列。具体地，可以构想与天然V、D、J、恒定、开关(switches)序列，以及本文所述的其它这类序列基本上同源、或源自这些序列的DNA序列(其中“源自”是指序列是与另一个序列相同的或是从另一个序列修饰而得的)。
当核酸被置于与另一个核酸序列的功能关系中时，核酸是“可操作连接的”。例如，如果启动子或增强子会影响编码序列的转录，则启动子或增强子与该序列是可操作连接的。对于转录调节序列，可操作连接意味着被连接的各DNA序列是邻接的，而且当有必要连接两个蛋白编码区时，是邻接并且合框的。对于开关序列，可操作连接指示序列能够导致开关重组。
如本文所使用的，术语“载体”是指任何用于将核酸序列转移到宿主细胞内的分子。在一些方面中，使用表达载体。表达载体是这样的核酸分子，其适合于转化宿主细胞，并含有指导和/或控制被转移的核酸序列表达的核酸序列。表达包括例如转录、翻译和剪接(如果存在内含子)等过程。在一些方面中，使用病毒载体(例如逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒(AAV)、疱疹病毒和痘病毒及其它)。应当理解，许多这样的病毒载体在本领域中是可得的。在另一个方面中，非病毒质粒载体也可适用于实践本发明。本发明的载体可以使用对本领域技术人员而言广泛可得的标准重组技术。这些技术可以在通用的分子生物学参考书中找到，例如Sambrook等人,MolecularCloning:ALaboratoryManual(第2版,1989)。
如本文所使用的，术语“重组宿主细胞”(或简称为“宿主细胞”)意图指其中已引入了重组表达载体的细胞。应当理解，这些术语不仅意图指特定的主题细胞，还指这些细胞的后代。因为在连续传代中由于突变或环境影响可能会出现某些修饰，这样的后代可能实际上不与亲本细胞相同，但是仍然包含在本文所用的术语“宿主细胞”的范围内。
嵌合抗原受体
在一些情况下，本发明提供了嵌合抗原受体(CAR)，其包括与MICA免疫特异性结合的肽、和细胞内T细胞受体信号传导结构域。(KalosM,等人,SciTranslMed.2011Aug10；3(95))。在一些方面中，CAR包含：与MICA免疫特异性结合的肽、细胞外铰链结构域、T细胞受体跨膜结构域和细胞内T细胞受体信号传导结构域。本发明进一步的实施方案提供了相关的核酸、重组表达载体、宿主细胞、细胞群体、抗体或其抗原结合部分、和与本发明CAR相关的药物组合物。
嵌合抗原受体(CAR)是人工构建的杂交蛋白或多肽，含有与T细胞信号传导结构域连接的抗体的抗原结合结构域(scFv)(KalosM,等人,SciTranslMed.2011Aug10；3(95))。Kalos等人描述了靶向CD19的CART细胞的产生，并在慢性淋巴细胞白血病患者体内证明了CAR修饰的T细胞介导的强力抗肿瘤效果。CAR的特征性工程化T细胞包括，利用单克隆抗体的抗原结合性质，以非MHC限制性的方式将T细胞特异性和反应性重新导向到选定靶标的能力。CAR修饰的T细胞具有体内复制的潜力，并且通过长期的保持，有可能实现持久的肿瘤控制，并且免去抗体重复灌注的需要(KalosM,等人,SciTranslMed.2011Aug10；3(95))。非-MHC限制性抗原识别赋予表达CAR的T细胞不依赖抗原加工而识别抗原的能力，因此绕开了肿瘤逃逸的主要机制。而且，当在T细胞内表达时，CAR会有利地不与内源T细胞受体(TCR)α和β链二聚体化。CAR修饰的T细胞在下列文献中有详细描述：US2003/022450和US2010/0261269和Milone等人2009Mol.Ther.17:1453。
药物配制剂
在一些情况下,本文公开的治疗性组合物可包括用于治疗癌症的其它的化合物、药物和/或作用剂。这样的化合物、药物和/或作用剂可包括例如化疗药、小分子药物、或提高对给定癌症的免疫响应的抗体。在一些情况下，治疗性组合物可以包括，例如，一种或多种本文公开的肽、和一种或多种抗-CTLA-4抗体或肽，抗-PD-1抗体或肽，抗-PDL-1抗体或肽，抗-OX40(也称作CD134,TNFRSF4,ACT35和/或TXGP1L)抗体或肽，抗-GITR(也称作TNFRSF18,AITR,和/或CD357)抗体或肽，抗-LAG-3抗体或肽，和/或抗-TIM-3抗体或肽。例如，在一些情况下,本文公开的治疗性组合物可以和一种或多种(例如1、2、3、4、5、或少于10种)化合物组合。
在一些情况下,本文公开的治疗性组合物可以包括其他的化合物，包括组蛋白去乙酰化酶抑制剂(“HDAC”)抑制剂。HDAC抑制剂的实例包括，例如，异羟肟酸、伏立诺他(vorinostat)(Zolinza)、辛二酰苯胺异羟肟酸(suberoylanilidehydroxamicacid)(SAHA)(Merck)、曲古抑菌素A(TSA)、LAQ824、帕比司他(panobinostat)(LBH589)(Novartis)、belinostat(PXD101)(CuraGen)、ITF2357italfarmacoSpA(Cinisello)、环状四肽、缩酚酸肽(罗米地辛(romidepsin)，FK228)(GloucesterPharmaceuticals)、苯甲酰胺；恩替诺特(entinostat)(SNDX-275/MS-275)(SyndaxPharmaceuticals)、MGCD0103(Celgene)、短链脂族酸、丙戊酸、丁酸苯酯、AN-9、pivanex(TitanPharmaceutical)、CHR-3996(ChromaTherapeutics)，和CHR-2845(ChromaTherapeutics)。
在一些情况下,本文公开的治疗性组合物可包括其他的化合物，包括蛋白酶体抑制剂，包括例如硼替佐米(bortezomib)(MillenniumPharmaceuticals)、NPI-0052(NereusPharmaceuticals)、卡非佐米(carfilzomib)(PR-171)(OnyxPharmaceuticals)、CEP18770和MLN9708。
在一些情况下，本文公开的治疗性组合物可包括烷基化剂，例如美法仑，以及拓扑异构酶抑制剂如阿霉素(doxorubicin)已显示出可增加MICA表达，这会提高抗-MICA单克隆抗体的功效。
在一些情况下，治疗性组合物可包括，例如，一种或多种本文公开的肽和一种或多种其它试剂，例如化疗剂、放疗剂、细胞因子、趋化因子和其它生物信号分子、肿瘤特异性疫苗、细胞癌症疫苗(例如GM-CSF转导的癌细胞)、肿瘤特异性单克隆抗体、自体和同种异体干细胞挽救(例如，增大移植物对肿瘤的效应)、其它治疗性抗体、分子靶向治疗、抗-血管新生治疗剂、具有治疗意图的感染剂(例如肿瘤定位的细菌)和基因治疗。
在一些情况下，治疗性组合物可以包括如本文所述地与药物可接受的载体一起配制的一种抗-MICA抗体或其抗原结合部分或抗-MICA抗体或其抗原结合部分的组合。这些组合物可以包括一种与MICA结合的肽、抗体、抗原结合部分、免疫偶联物或双特异性分子，或与MICA结合的肽、抗体、抗原结合部分、免疫偶联物或双特异性分子组合(例如2种或更多种不同的与MICA结合的肽、抗体、抗原结合部分、免疫偶联物或双特异性分子)。
例如，药物组合物可以包括结合靶抗原上的不同表位、或具有互补活性的抗体(或免疫偶联物或双特异性分子)的组合。在一些情况下，这样的组合物可以包括一种或多种：与下述表位相互作用的抗体或抗体片段：包含MICA*009序列(SEQIDNO:167)内的氨基酸229-248、或与MICA*009序列(SEQIDNO:167)内的氨基酸229-248重叠的表位；与下述表位相互作用的抗体或抗体片段：包含MICA*009序列(SEQIDNO:167)内的氨基酸179-188、或与MICA*009序列(SEQIDNO:167)内的氨基酸229-248重叠的表位；和/或与下述表位相互作用的抗体或抗体片段：包含MICA*009序列(SEQIDNO:167)内的氨基酸119-128、或者与MICA*009序列(SEQIDNO:167)内的氨基酸119-128重叠的表位。例如，治疗性组合物可以包括：与MICA结合且包含CM33322mAb4的VH的CDR1、CDR2和CDR3和/或CM33322mAb4的VL的CDR1、CDR2和CDR3的肽、抗体或抗体片段，以及与之组合的一种或多种包含抗体ID1,6,7,8或9的VH的CDR1、CDR2和CDR3和/或抗体ID1,6,7,8或9的VL的CDR1、CDR2和CDR3的肽、抗体或抗体片段。
在一些情况下,本文公开的治疗性组合物可以配制为药物组合物，或者配制供用于药物组合物中。这些组合物可以配制为或者适配为供用于通过任何途径施用给受试者，例如任何被美国食品药品监督管理局(FDA)批准的途径。示例方法在FDA的CDERDataStandardsManual,版本号004(其可以在fda.give/cder/dsm/DRG/drg00301.htm获得)中有描述。
可以与载体材料组合而产生单剂量形式的活性成分的量会随着所治疗的受试者和特定的施用路径而改变。可以与载体材料组合而产生单剂量形式的活性成分的量一般是可产生治疗效果的组合物的量。一般地，以百分之百为基准，该量的范围可以是活性成分占大约0.01％-大约99％，优选地大约0.1％-大约70％，最优选地大约1％-大约30％，与药物可接受的载体组合。
在一些情况下，药物组合物可以包括有效量的一种或多种肽。如本文所使用的，术语“有效量”和“对治疗有效”是指本文公开的一种或多种肽(例如与MICA结合的抗体或抗体片段)在一段时期内(包括急性和长期给药和周期性或连续给药)有效(即其给药可导致预期的效果或生理结果)的量或浓度。
在一些情况下，药物组合物可包含一种或多种肽和任何药物可接受的载体、佐剂和/或溶媒。在一些情况下，药物可进一步包括一种或多种额外的治疗剂，该治疗剂的量以实现对疾病或疾病症状的调节。
术语“药物可接受的载体或佐剂”是指可以和本发明肽一起施用给患者、并且在以足够递送治疗量的化合物的剂量下施用时不会破坏本发明肽的药理活性且无毒的载体或佐剂。
可以用在本发明药物组合物中的药物可接受的载体、佐剂和溶媒包括，但不仅限于，离子交换剂、氧化铝、硬脂酸铝、卵磷脂、自乳化药物递送系统(SEDDS)如d-Ι-生育酚聚乙二醇1000琥珀酸盐，用于药物剂型的表面活性剂例如吐温或其它类似的聚合物递送基质，血清蛋白，例如人血清白蛋白，缓冲物质如磷酸盐、甘氨酸、山梨酸、山梨酸钾，饱和植物脂肪酸的偏甘油酯混合物、水、盐或电解质，诸如硫酸鱼精蛋白、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐、胶体二氧化硅、三硅酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、基于纤维素的物质，聚乙二醇、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸酯、蜡、聚乙烯-聚氧丙烯-嵌段聚合物，聚乙二醇和羊毛脂。环糊精如Ι-,θ-，和Κ-环糊精也可以有利地用于增强本文所述化合物配制物的递送。
本发明的药物组合物可以含有任何常规的无毒的药物可接受的载体、佐剂或溶媒。在一些情况下，可以用药物可接受的酸、碱或缓冲液调节配制物的pH以提高配制化合物或其递送形式的稳定性。如本文所使用的，术语“胃肠外”包括皮下、皮内、静脉内、肌内、关节内、动脉内、滑膜内、胸骨内、鞘内、病灶内和颅内注射或输注技术。
药物组合物可以是溶液或用于吸入和/或鼻给药的干粉的形式。这样的组合物可以根据本领域已知的技术使用合适的分散剂或润湿剂(例如，吐温80)和混悬剂来配制。无菌注射制备物还可以是在无毒的肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液或混悬液，例如，作为1,3-丁二醇中的溶液。可以使用的可接受的溶媒和溶剂包括甘露醇、水、林格氏溶液和等渗氯化钠溶液。此外，无菌、不挥发性油通常用作溶剂或悬浮介质。为这个目的，任何无刺激性的不易挥发的油都可以使用，包括合成的单或二甘油酯。脂肪酸，例如油酸及其甘油酯衍生物可用于注射剂的制备，因为它们是天然的药物上可接受的油，如橄榄油或蓖麻油，尤其是它们聚氧乙烯化的形式。这些油溶液或混悬液也可以含有在配制药物上可接受的剂型(例如乳剂和或混悬剂)时通常使用的长链醇稀释剂或分散剂，或羧甲基纤维素或类似的分散剂。其它在制造药物可接受的固体、液体或其它剂型中常用的通用表面活性剂，例如吐温或司盘和/或其它类似的乳化剂或生物利用度增强剂，也可以为配制的目的而使用。
药物组合物可以用任何口服可接受的剂型口服给药，口服可接受的剂型包括但不仅限于，胶囊、片剂、乳剂和水性混悬液、分散剂和溶液。在用于口服使用的片剂的情况下，普遍使用的载体包括乳糖和玉米淀粉。润滑剂，例如硬脂酸镁，也通常加入。对于以胶囊形式的口服给药，有用的稀释剂包括乳糖和干燥的玉米淀粉。当水性混悬液和/或乳状液口服给药时，活性成分可以被混悬或溶解于油相中，与乳化剂和/或悬浮剂组合。如果需要的话，可以添加某些甜味剂和/或调味和/或着色剂。
替代地或者额外地，药物组合物可以通过鼻气雾剂或吸入给药。这样的组合物可以根据药物配制领域众所周知的技术制备，并且可以制备成盐水中的溶液，其中采用苄醇或其它合适的防腐剂，吸收促进剂以提高生物利用度，碳氟化合物，和/或其他本领域已知的增溶剂或分散剂。
在一些实施方案中，本公开提供了在下面的方法中使用本文公开的任何一种或多种肽或药物组合物(下文指示为“X”)的方法：
适用于作为治疗一种或多种本文公开的疾病并病症(例如癌症，在下面的实施例中称作“Y”)的药物的物质X。物质X用于制造用于治疗Y的药物的用途；和适用于Y的治疗的物质X。
在一些情况下,本文公开的治疗性组合物可以配制用于在美国销售，或者进口到美国和/或从美国出口。
方法
在一些情况下，方法可以包括选择患有或者曾经患有某种病症或疾病并且对该病症或疾病显示或者曾经显示阳性免疫响应的人类受试者。在一些情况下，合适的受试者包括，例如，患有或者曾经患有某种病症或疾病但是已经解决了该疾病或其某个方面，疾病的症状已经减轻(例如，相对于具有相同病症或疾病的其它受试者(例如，大部分受试者))的受试者，和或带病症或疾病存活更长的时间(例如，相对于具有相同病症或疾病的其它受试者(例如，大部分受试者))的受试者，例如处于无症状的状态(例如，相对于具有相同病症或疾病的其它受试者(例如，大部分受试者))。在一些情况下，如果受试者曾经接种针对某病症或疾病的疫苗(例如，以前接种和/或疫苗接种和再接种(例如，接受增强疫苗(boostervaccine))，则可以选择他们。
如本文所使用的，术语“受试者”是指任何动物。在一些情况下，受试者是哺乳动物。在一些情况下，如本文所使用的，术语“受试者”是指人(例如，男人、女人或儿童)。用于本方法的样品可以包括血清样品，例如从被选受试者获得的。
在一些情况下，受试者选择可以包括从受试者(例如候选受试者)获得样品，并测试该样品是否具有该受试者适合入选的指征。在一些情况下，受试者可以由例如健康护理专业人员确认或鉴定为曾经患有或正患有某种病症或疾病。在一些情况下，可以根据患者记录、家族病史和/或检测阳性免疫响应的指征来证明针对病症或疾病的阳性免疫响应。在一些情况下，受试者选择中可以包括多方。例如，第一方可以从候选受试者获得样品，第二方可以对样品进行测试。在一些情况下，受试者可以由医疗从业人员(例如，全科医师)选择和/或引见。在一些情况下，受试者选择可以包括从选定的受试者获得样品，并对样品进行贮存和/或在本文公开的方法中使用样品。样品可以包括，例如细胞或细胞群体。
在一些情况下，获得或靶向免疫细胞可以包括如下的一个或多个和/或其组合，例如：获得或提供能够结合(例如特异性结合)靶免疫细胞的四聚体免疫原；使四聚体免疫原与样品接触；检测四聚体免疫原；确定四聚体免疫原是否与靶免疫细胞结合；和如果四聚体免疫原与靶免疫细胞结合，则获得该靶免疫细胞。
四聚体免疫原可以包括与病症或疾病相关的免疫原和/或与靶免疫细胞结合(例如特异性结合)的免疫原，例如其中靶免疫细胞与选定的病症或疾病相关。与病症或疾病相关的免疫原和靶免疫细胞包括，例如，在患有某种病症或疾病的受试者中存在、但在没有该病症或疾病的受试者中不存在的免疫原或免疫细胞；和/或与没有某种病症或疾病的受试者相比，在患有该病症或疾病的受试者中的水平改变(例如增加)的免疫原或免疫细胞。在一些情况下，免疫原或免疫细胞可以是癌症特异性的。免疫原可以是可溶的。多聚体形式的免疫原可以包括四聚体形式的免疫原(例如抗原和/或表位)(包括，例如四聚体单体、二聚体，和/或三聚体抗原免疫原)。在一些情况下，四聚体免疫原对细胞的结合相对于非四聚体形式的该免疫原在类似条件下对该细胞的结合水平增加。在一些情况下，四聚体形式的自身抗原包括可检测部分，例如链霉亲和素部分。四聚化的方法是本领域已知的并在本文中公开。
检测四聚体免疫原和/或确定四聚体免疫原是否与靶细胞结合可以用本领域已知的和/或本文公开的方法实施。例如，方法可以包括流式细胞术。用于流式细胞术的最佳方法，包括分选和设门方法(gatingmethod)，是本领域已知的和/或在本文中被公开。在一些情况下，方法可以包括分析四聚体免疫原与靶免疫细胞之间的结合、结合亲和力和/或结合特异性。例如，如果(例如，只有)确定了四聚体免疫原和靶免疫细胞之间预定水平的结合，就(才)可以获得靶免疫细胞。预定的结合水平可以是特定的水平和/或可以是相对的水平。获得靶免疫细胞可以包括获得、提供、鉴定、选择、纯化和/或分离靶免疫细胞。这样的方法可以包括，例如，细胞分选方法、细胞富集和/或背景削减。
在一些情况下，获得针对自身抗原的免疫细胞可以包括如下的一项或多项或其组合，例如：鉴定对自身抗原显示阳性免疫响应的受试者；获得或提供多聚体形式的自身抗原；使多聚体形式的自身抗原与来自对自身抗原显示阳性免疫响应的受试者的样品接触；获得与多聚体形式的自身抗原结合的免疫细胞。
在一些情况下，方法可以包括从癌症患者获得针对自身抗原的免疫细胞，可包含如下的一项或多项或其组合，例如：鉴定对自身抗原显示阳性免疫响应的受试者；提供多聚体形式的自身抗原；使多聚体形式的自身抗原与来自对自身抗原显示阳性免疫响应的受试者的样品接触；和获得与多聚体形式的自身抗原结合的免疫细胞。
多聚体形式的自身抗原可以包括与病症或疾病相关的自身抗原和/或与靶免疫细胞结合(例如，特异性结合)的自身抗原，例如其中靶免疫细胞与所选病症或疾病相关。与病症或疾病相关的自身抗原和靶免疫细胞包括，例如，在患有某种病症或疾病的受试者体内存在、而在不患有某种病症或疾病的受试者体内不存在的抗原或免疫细胞；和/或与不具有某种病症或疾病的受试者相比，在患有该病症或疾病的受试者体内的存在水平改变(例如增加)的免疫原或免疫细胞。在一些情况下，病症或疾病可以是癌症。在一些实施方案中，癌症是黑色素瘤、肺癌、乳腺癌、肾癌、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、胃癌、胶质母细胞瘤、肝癌、结肠癌、淋巴瘤或白血病。在一些情况下，自身抗原或免疫细胞可以是癌症特异性的。自身抗原可以是可溶的。多聚体形式的自身抗原可以包括四聚体形式的自身抗原(例如抗原和/或表位)(包括，例如四聚体单体、二聚体，和/或三聚体抗原)。在一些情况下，多聚体形式的自身抗原包括可检测部分，例如链霉亲和素部分。多聚化的方法是本领域已知的并在本文中公开。
从所获得的靶免疫细胞分离或纯化遗传材料(例如DNA和/或mRNA)的方法是本领域已知的，并且在本文中有举例。一旦获得了这些遗传材料，使用它们产生本文公开的治疗性组合物的方法是本领域已知的和/或在下文有总结。如上文所讨论的，使用本领域已知的技术创建本文公开的肽变体可以改变遗传材料。
从靶细胞内含有的或者获自靶细胞的核酸(例如cDNA)生成肽可以包括，例如，分析(例如测序)来自靶免疫细胞(例如单个或分离的鉴定的靶免疫细胞)的重链和轻链可变区。在一些情况下，方法可以包括生成完全人抗体，或其片段(例如上文所公开的)，和非人抗体的人源化。DNA可以使用常规方法容易地从所得的免疫细胞分离和/或测序(例如通过使用能够特异性结合编码鼠抗体重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)。
一旦分离DNA，可将DNA置于表达载体中，然后将表达载体转染进入本身不产生抗体蛋白的宿主细胞，例如大肠杆菌细胞、猿猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、或骨髓瘤细胞，以便在重组宿主细胞实现单克隆抗体的合成。关于在细菌中重组表达编码抗体的DNA的综述性论文包括Skerra等人,Curr.OpinioninImmunol.,5:256-262(1993)和Pluckthun,Immunol.Revs.,130:151-188(1992)。
抗体或其变体的重组表达一般需要构建含有编码抗体的多核苷酸的表达载体。因此，本发明提供了可复制的载体，其包括编码抗体分子、抗体的重链或轻链、抗体的重链或轻链可变结构域或其部分，或者重链或轻链CDR的并且与启动子操作连接的核苷酸序列。这样的载体可以包括编码抗体分子恒定区(参见，例如美国专利No.5981216；5591639；5658759和5122464)的核苷酸序列，并且可以将抗体的可变结构域克隆到这样的载体中用于表达整个重链、整个轻链，或者同时表达整个重链和轻链。一旦该表达载体通过常规技术被转移到宿主细胞中，则通过常规技术培养被转染的细胞以产生抗体。因此，本发明包括宿主细胞，其含有编码本发明抗体或其片段、或其重链或轻链、或其部分、或本发明的单链抗体，并且与异源启动子可操作连接的多核苷酸。在用于表达双链抗体的某些实施方案中，同时编码重链和轻链的载体可以在宿主细胞内共表达，以便表达完整的免疫球蛋白分子，如下文详述。
可供用作表达重组抗体的宿主的哺乳动物细胞是本领域众所周知的，并且包括可以从美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得的任何哺乳动物细胞系，包括但不仅限于，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，HeLa细胞，幼仓鼠肾(BHK)细胞，猴肾细胞(COS)，人肝细胞癌细胞(例如HepG2细胞)，人上皮肾293细胞，和许多其它细胞系。不同宿主细胞具有对蛋白质和基因产物进行翻译后加工和修饰的特征性和特定的机制。可以选择合适的细胞系或宿主系统，以确保所表达抗体或其部分的正确修饰和加工。为此目的，可以使用具有对初级转录本、基因产物的糖基化和磷酸化进行合适加工的细胞机构的真核宿主细胞。这种哺乳动物宿主细胞包括但不限于CHO，VERY，BHK，Hela细胞，COS，MDCK，293，3T3，W138，BT483，HS578T，HTB2，BT2O和T47D，NS0(一种鼠骨髓瘤细胞系，其不内源产生任何功能性免疫球蛋白链)，SP20，CRL7O3O和HsS78Bst细胞。在一个实施方案中，可使用通过永生化人淋巴细胞而开发的人细胞系来重组生产单克隆抗体。在一个实施方案中，可以使用人细胞系PER.C6.(Crucell,Netherlands)重组生产单克隆抗体。
在一些情况下，本文公开的肽可以是合成产生的。可以在本文所述的肽合成中使用的合成化学转化和保护基团方法(保护和去保护)是本领域已知的，并且包括例如在下列文献中描述的那些：R.Larock,ComprehensiveOrganicTransformations,VCHPublishers(1989)；T.W.GreeneandP.G.M.Wuts,ProtectiveGroupsinOrganicSynthesis,第3版,JohnWileyandSons(1999)；L.FieserandM.Fieser,FieserandFieser'sReagentsforOrganicSynthesis,JohnWileyandSons(1994)；和L.Paquette编辑,EncyclopediaofReagentsforOrganicSynthesis,JohnWileyandSons(1995),及其后续版本。
肽还可以通过化学合成方法制备，化学合成方法是本领域普通技术人员熟知的。参见例如Fields等人,SyntheticPeptides:AUser'sGuide,ed.Grant,W.H.Freeman&Co.,NewYork,N.Y.,1992,第3章，77页。因此，可以利用固相合成的自动Merrifield技术，用t-Boc或Fmoc化学保护α-NH2，使用侧链被保护的氨基酸来合成肽，例如在AppliedBiosystemsPeptideSynthesizerModel430A或431上合成。
制作本文所述肽的一种方式是使用固相肽合成(SPPS)。用接头分子将C端氨基酸通过酸不稳定的键附着到交联的聚苯乙烯树脂上。这种树脂不溶于合成用的溶剂，因此可以相对简单和快速地洗去多余的试剂和副产物。N端用Fmoc基团保护，Fmoc基团在酸中稳定，但可以用碱除去。用碱稳定、酸不稳定的基团保护任何侧链官能团。
更长的肽可以通过使用天然的化学连接反应连接各别合成的肽来制备。或者，更长的合成肽可以通过众所周知的重组DNA技术合成。这些技术在公知的常规手册中提供，附带详细的实验方案。为了构建编码本发明肽的基因，对氨基酸序列进行逆向翻译以获得编码该氨基酸序列的核酸序列，优选地该核酸序列的密码子针对待表达该基因的生物体是优化的。接着，通常通过合成编码该肽和(如果必需的话)任何调节元件的寡核苷酸制备合成基因。将合成基因插入到合适的克隆载体中并转移到宿主细胞中。然后在适于所选表达系统和宿主的合适条件下表达该肽。通过标准方法对肽进行纯化和表征。
肽可以高通量、组合的方式制备，例如使用可以从AdvancedChemtech获得的高通量多通道组合合成仪。
肽键可以被如下的化学键取代，以便例如增加肽的生理稳定性：逆反键(retro-inversobond)(C(O)-NH)；还原的酰胺键(NH-CH2)；硫代亚甲基键(S-CH2或CH2-S)；氧代亚甲基键(O-CH2或CH2-O)；亚乙基键(CH2-CH2)；硫代酰胺键(C(S)-NH)；反式烯烃键(CH＝CH)；氟取代的反式烯烃键(CF＝CH)；酮亚甲基键(C(O)-CHR)或CHR-C(O)，其中R是H或CH3；和氟酮亚甲基键(C(O)-CFR或CFR-C(O)，其中R是H或F或CH3。
肽可以被进一步修饰：乙酰化、酰胺化、生物素化、肉桂酰化、法尼基化、荧光素化、甲酰化、肉豆蔻酰化、棕榈酰化、磷酸化(Ser,Tyr或Thr)、硬脂酰化(stearoylation)、琥珀酰化和磺酰化。如上所述，肽可以偶联于，例如，聚乙二醇(PEG)；烷基(例如C1-C20直链或支链烷基)；脂肪酸基团；及其组合。
在一些情况下，肽可使用任何本领域已知的用于纯化免疫球蛋白分子的方法纯化，例如通过色谱(例如离子交换色谱、亲和色谱，特别是特异性抗原蛋白A或蛋白G的亲和色谱，和大小排阻柱色谱)，离心，差异溶解度，或者任何其它用于蛋白质纯化的常规技术。另外，本发明的抗体或其片段可以和异源多肽序列(在本文中称作“标签”)融合，如上文所述或和本领域已知，以方便纯化。
一种示例性、非限制性方法的概览如图5A-5F所示。未暗示步骤的顺序。
在一些情况下，本公开还提供了这样的抗体或抗体片段，其具有包含与本文所述的抗体的氨基酸序列同源的氨基酸序列的重链可变区和/或轻链区，并保留期望的功能性MICA结合性质。例如，在一些实施方案中，抗体或抗体片段可以包含与上文所述序列85％,90％,95％,96％,97％,98％或99％相同的VH和/或VL氨基酸序列。具有分别与SEQIDNOs:2,77,96,113,131或150和79,98,115,133或152的VH和VL区高度(即80％或更高)同源的VH和VL区的抗体或抗体片段可以如下获得：对编码SEQIDNOs:77,96,113,131或150和/或11,79,98,115,133或152的核酸分子进行突变(例如定点或PCR介导的诱变)，随后使用本文所述的功能测定法测试所编码的被改变抗体的保留的功能(即，一种或多种功能，例如与MICA的α3结构域结合；阻断MICA脱落；不抑制NGKD与MICA的结合；阻断可溶性MICA诱导的NGKD下调和减弱NK细胞细胞毒作用)。
还提供了与本文所述的特定抗-MICA抗体(例如抗体ID1,6,7,8,9和11)竞争(例如交叉竞争)结合MICA的抗体和抗体片段。这些竞争抗体可以根据它们在常规MICA结合测定中竞争性抑制MICA与抗体结合的能力加以鉴定。例如，可以使用常规ELISA测定，其中重组人MICA蛋白被固定在平板上，其中一个抗体被荧光标记，并对非标记抗体竞争掉标记抗体的结合的能力进行评估。在此之上或除此之外，可以使用BIAcore分析评估抗体交叉竞争的能力。若测试抗体能够抑制抗-MICA抗体结合MICA，则证明测试抗体能够与该抗体竞争结合MICA。
因此，在一个实施方案中，本公开提供了这样的抗-MICA抗体，如FACS测量的，其可将本文所述的抗-MICA抗体与活化的T细胞上MICA的结合抑制至少50％，例如至少55％,至少60％,至少65％,至少70％,至少75％,至少80％,至少85％,至少90％,至少91％,至少92％,至少93％,至少94％,至少95％,至少96％,至少97％,至少98％,至少99％,或100％。例如，抗-MICA抗体被候选竞争性抗-MICA抗体的抑制可以在实施例所述条件下进行评估。
在一些情况下，本公开提供与本文所述的抗-MICA抗体(例如抗体ID8,9和11)结合相同表位的抗-MICA抗体。如实施例14中进一步讨论的，抗体ID8(CM33322mAb11)结合MICA*009氨基酸序列(SEQIDNO:167)中包含残基119-128的表位；抗体ID9(CM33322mAb29)结合MICA*009氨基酸序列(SEQIDNO:167)中包含残基229-248的表位；抗体ID11(CM33322mAb4)结合MICA*009氨基酸序列(SEQIDNO:167)中包含残基179-188的表位。因此，在一些实施方案中，本公开提供了抗-MICA抗体或抗体片段，其结合α3区内对应于MICA*009的氨基酸181-274的氨基酸残基。
确定与本文所述抗体结合“MICA上相同表位”的抗体的技术包括，例如，表位定位方法，例如抗原:抗体复合物晶体的X-射线分析，其提供表位的原子分辨。其它方法监测抗体与抗原片段或抗原的突变版本的结合，其中由于抗原序列内氨基酸残基的修饰导致的结合丧失经常被认为是表位组分的指示。此外，也可以使用用于表位定位的计算组合方法。这些方法依赖于感兴趣抗体从组合噬菌体展示肽文库亲和性分离(affinityisolate)特定短肽的能力。然后将这样的肽视为前导物，用于定义与用于筛选肽文库的抗体对应的表位。对于表位定位，还已经开发了这样的计算机算法，已经证明它们可以定位构象上不连续的表位。
例如，小鼠可以用本文所述的人MICA进行免疫，产生杂交瘤，并从所得的单克隆抗体筛选与mAb4竞争结合MICA的能力。也可以用含有mAb4单克隆抗体所结合表位的MICA的较小片段免疫小鼠。例如，可以使用Jespers等人,Biotechnology12:899,1994的方法来指导选择与原型单克隆抗体具有相同表位、因此具有相似性质的单克隆抗体。利用噬菌体展示，首先将原型抗体的重链与(优选人源)轻链库进行配对，以选择MICA结合的单克隆抗体，然后将新的轻链与(优选人源)重链库进行配对，以选择与原型单克隆抗体具有相同表位的(优选人源)MICA结合性单克隆抗体。作为备选，通过编码抗体重链和轻链的cDNA的突变可以获得原型单克隆抗体(例如mAb4,ID11)的变体。
可以实施表位定位，例如Champe等人(1995)J.Biol.Chem.270:1388-1394所述，以确定抗体是否结合感兴趣的表位。"丙氨酸扫描诱变"，如CunninghamandWells(1989)Science244:1081-1085所述，或一些其他形式的MICA或MICB内的氨基酸点诱变，也可用于确定本发明抗-MICA或MICB抗体的功能性表位。然而，诱变研究还可能揭示对于MICA或MICB的整体三维结构至关重要、但是不直接参与抗体-抗原接触的氨基酸残基，因此可能需要其它方法以确认使用这种方法确定的功能性表位。
如本文所述，抗体竞争测定也可用于确定抗体是否与另一个抗体“结合相同的表位”。通常，在已知与某表位相互作用的第一抗体饱和全部位点、且第二抗体过量的条件下，50％或更多,60％或更多,70％或更多,例如70％,71％,72％,73％,74％,75％,80％,85％,90％,95％或更多的第一抗体被第二抗体竞争，表明两个抗体“结合相同表位”。为了评估两个抗体之间的竞争水平，可以使用例如放射性免疫测定或使用其它标记物的测定。例如，可以将MICA或MICB抗原与饱和量的偶联有标记化合物(例如3H,125I,生物素或铷)的第一抗-MICA抗体或其抗原结合片段在相同量的第二种未标记抗-MICA抗体的存在下温育。然后评估在该未标记阻断抗体的存在下与抗原结合的所述带标记抗体的量，并与不存在该未标记阻断抗体时的结合进行比较。竞争由存在未标记阻断抗体时与不存在该阻断抗体时相比结合信号的百分比变化所决定。因此，如果与不存在阻断抗体相比，存在阻断抗体导致带标记抗体的结合有50％抑制，则两个抗体之间的竞争为50％。因此，所谓第一和第二抗体之间的竞争为50％或更多,60％或更多,70％或更多,例如70％,75％,80％,85％,90％,95％或更多，意味着第一抗体抑制第二抗体与抗原的结合(或者反之)达50％,60％,70％,75％,80％,85％,90％,95％或更多(与不存在第一抗体时第二抗体结合的抗原相比)。因此，第一抗体与抗原的结合被第二抗体抑制50％,60％,70％,75％,80％,85％,90％,95％或更多表明两个抗体结合相同表位。
还提供了工程化和重组的抗体，其包括(1)包含一个或多个本文所述的VHCDR区的VH序列、和包含一个或多个本文所述的VLCDR区的VH序列，和(2)异源框架区。该异源框架区可以源自该CDR区的天然来源之外的抗体、细胞或人。例如，在一些实施方案中，抗体可以包含表1所示的抗体ID1,6,7,8,9或11的VH的CDR1、CDR2和CDR3和/或抗体ID1,6,7,8,9或11的VL的CDR1、CDR2和CDR3，和不是来自包含相同CDR的抗体ID1,6,7,8,9或11的框架区。在一些实施方案中，抗体可以包含表1所示的抗体ID1的VH的CDR1、CDR2和CDR3和/或抗体ID1的VL的CDR1、CDR2和CDR3，和不是来自抗体ID1的框架区。在一些实施方案中，抗体可以包含表1所示的抗体ID6的VH的CDR1、CDR2和CDR3和/或抗体ID6的VL的CDR1、CDR2和CDR3，和不是来自抗体ID6的框架区。在一些实施方案中，抗体可以包含表1所示的抗体ID7的VH的CDR1、CDR2和CDR3和/或抗体ID7的VL的CDR1、CDR2和CDR3，和不是来自抗体ID7的框架区。在一些实施方案中，抗体可以包含表1所示的抗体ID8的VH的CDR1、CDR2和CDR3和/或抗体ID8的VL的CDR1、CDR2和CDR3，和不是来自抗体ID8的框架区。在一些实施方案中，抗体可以包含表1所示的抗体ID9的VH的CDR1、CDR2和CDR3和/或抗体ID9的VL的CDR1、CDR2和CDR3，和不是来自抗体ID9的框架区。在一些实施方案中，抗体可以包含表1所示的抗体ID11的VH的CDR1、CDR2和CDR3和/或抗体ID11的VL的CDR1、CDR2和CDR3，和不是来自抗体ID11的框架区。
还提供了工程化和重组的抗体，其包含(1)包含一个或多个本文所述的VHCDR区的VH序列、和包含一个或多个本文所述的VLCDR区的VH序列，和(2)异源恒定区。该异源恒定区可以来自不是该CDR区的天然来源的抗体、细胞或人。例如，在一些实施方案中，抗体可以包括表1所示的抗体ID1,6,7,8,9或11的VH的CDR1、CDR2和CDR3和/或抗体ID1,6,7,8,9或11的VL的CDR1、CDR2和CDR3，和来自这些CDR所来源的人之外的人的恒定区。在一些实施方案中，抗体可以包含表1所示的抗体ID1的VH的CDR1、CDR2和CDR3和/或抗体ID1的VL的CDR1、CDR2和CDR3，和不是来自抗体ID1的恒定区。在一些实施方案中，抗体可以包含表1所示的抗体ID6的VH的CDR1、CDR2和CDR3和/或抗体ID6的VL的CDR1、CDR2和CDR3，和不是来自抗体ID6的恒定区。在一些实施方案中，抗体可以包含表1所示的抗体ID7的VH的CDR1、CDR2和CDR3和/或抗体ID7的VL的CDR1、CDR2和CDR3，和不是来自抗体ID7的恒定区。在一些实施方案中，抗体可以包含表1所示的抗体ID8的VH的CDR1、CDR2和CDR3和/或抗体ID8的VL的CDR1、CDR2和CDR3，和不是来自抗体ID8的恒定区。在一些实施方案中，抗体可以包含表1所示的抗体ID9的VH的CDR1、CDR2和CDR3和/或抗体ID9的VL的CDR1、CDR2和CDR3，和不是来自抗体ID9的恒定区。在一些实施方案中，抗体可以包含表1所示的抗体ID11的VH的CDR1、CDR2和CDR3和/或抗体ID11的VL的CDR1、CDR2和CDR3，和不是来自抗体ID11的恒定区。
还提供了工程化和重组的抗体，其包含(1)包含一个或多个的本文所述VHCDR区的VH序列和包含一个或多个本文所述的VLCDR区的VH序列，和(2)异源Fc区。该异源Fc区可以源自不是上述的CDR区的天然来源的抗体、细胞或人。
还提供了工程化和修饰抗体，它们可以使用具有一个或多个本文公开的VH和/或VL序列的抗体作为起始材料，工程化修饰抗体而制得，所述修饰抗体可以具有相比于起始抗体改变的性质。抗体可以通过修饰例如处于一个或多个CDR区和/或一个或多个框架区内的一个或两个可变区(即VH和/或VL)的一个或多个残基来工程化。并且/或者，抗体可以通过修饰恒定区内的残基来工程化，以便例如改变抗体的效应器功能。
一种可以实施的可变区工程化是CDR移植。抗体主要通过位于6个重链和轻链互补决定区(CDR)内的氨基酸残基与靶抗原相互作用。由于这个原因，CDR内的氨基酸序列比CDR外部的序列在各个抗体之间更加多样化。因为CDR序列负责大多数抗体-抗原相互作用，因此有可能通过构建如下的表达载体来表达模拟特定的天然存在抗体的重组抗体：表达载体包含：来自特定的天然存在的抗体的CDR序列，这些CDR序列被移植到来自具有不同性质的不同抗体的框架序列上(见例如，Riechmann,L.等人(1998)Nature332:323-327；Jones,P.等人(1986)Nature321:522-525；Queen,C.等人(1989)Proc.Natl.Acad.See.U.S.A.86:10029-10033；授予Winter的美国专利No.5,225,539和授予Queen等人的美国专利Nos.5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370)。
因此，本发明的另一个实施方案涉及分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含重链可变区和轻链可变区，其中所述重链可变区包含CDR1,CDR2,和CDR3序列，所述CDR1,CDR2,和CDR3序列包含分别选自下组的氨基酸序列：SEQIDNOs:4,81,100,117,135和154；SEQIDNOs:84,102,119,137和156；和SEQIDNOs:8,86,103,121,139和158；所述轻链可变区包含CDR1,CDR2,和CDR3序列，所述CDR1,CDR2,和CDR3序列包含分别选自下组的氨基酸序列：SEQIDNOs:13,88,106,124,142和161；SEQIDNOs:15,90,108,126,144和163；和SEQIDNOs:17,92,110,128,146和165。因此，这些抗体含有表1所示的单克隆抗体ID1,6,7,8,9或11的VH和VLCDR序列，但可以含有与这些抗体不同的框架序列。
这样的框架序列可以从公共DNA数据库或公开的包含种系抗体基因序列的参考文献中获得。例如，人重链和轻链可变区基因的种系DNA序列可以在"VBase"人种系序列数据库(可以在互联网www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase访问)以及下列文献中找到：Kabat,E.A.,等人(1991)SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,第5版,U.S.DepartmentofHealthandHumanServices,NIHPublicationNo.91-3242；Tomlinson,I.M.,等人(1992)"TheRepertoireofHumanGermlineVHSequencesRevealsaboutFiftyGroupsofVHSegmentswithDifferentHypervariableLoops"J.Mol.Biol.227:776-798；和Cox,J.P.L.等人(1994)"ADirectoryofHumanGerm-lineVHSegmentsRevealsaStrongBiasintheirUsage"Eur.J.Immunol.24:827-836，本申请明确通过提述并入其每一个的内容。
用于本发明抗体的示例性框架序列包括与本文所述的抗体所用的框架序列在结构上相似的那些框架序列。VHCDR1,2和3序列和VLCDR1,2和3序列可以被移植到具有与在该框架区序列所来源的种系免疫球蛋白基因中发现的相同的序列的框架区上，或者CDR序列可以被移植到与种系序列相比含有一个或多个突变的框架区上。例如，已经发现，在某些情况下，对框架区内的残基进行突变而保持或增强抗体的抗原结合能力是有利的(见例如授予Queen等人的美国专利No.5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370)。
另一种类型的可变区修饰是突变VH和/或VLCDR1,CDR2和/或CDR3区内的氨基酸残基，借此提高感兴趣抗体的一种或多种结合性质(例如，亲和力)。可以实施定点诱变或PCR介导的诱变以引入突变，并且可以在如本文所述并且在实施例中提供的体外或体内测定中评估对抗体结合或其它感兴趣的功能性质的影响。优选地，引入保守修饰(如上面讨论的)。突变可以是氨基酸取代、添加或缺失，但是优选地是取代。而且，通常改变CDR区内的不超过1、2、3、4、或5个残基。
因此，在另一个实施方案中，本发明提供了分离的抗-MICA单克隆抗体或其抗原结合部分，其包括如下的重链可变区，其包括：(a)包含选自下组的氨基酸序列的VHCDR1区：SEQIDNOs:4,81,100,117,135和154，或者与SEQIDNOs:4,81,100,117,135和154相比具有1、2、3、4、或5个氨基酸取代、缺失或添加的氨基酸序列；(b)包含选自下组的氨基酸序列的VHCDR2区：SEQIDNOs:6,84,102,119,137和156，或者与SEQIDNOs:6,84,102,119,137和156相比具有1、2、3、4、或5个氨基酸取代、缺失或添加的氨基酸序列；(c)包含选自下组的氨基酸序列的VHCDR3区：SEQIDNOs:8,86,103,121,139和158，或者与SEQIDNOs:8,86,103,121,139和158相比具有1、2、3、4、或5个氨基酸取代、缺失或添加的氨基酸序列；(d)包含选自下组的氨基酸序列的VLCDR1区：SEQIDNOs:13,88,106,124,142和161，或者与SEQIDNOs:13,88,106,124,142和161相比具有1、2、3、4、或5个氨基酸取代、缺失或添加的氨基酸序列；(e)包含选自下组的氨基酸序列的VLCDR2区：SEQIDNOs:15,90,108,126,144和163，或者与SEQIDNOs:15,90,108,126,144和163相比具有1、2、3、4、或5个氨基酸取代、缺失或添加的氨基酸序列；(f)包含选自下组的氨基酸序列的VLCDR3区：SEQIDNOs:17,92,110,128,146和165，或者与SEQIDNOs:17,92,110,128,146和165相比具有1、2、3、4、或5个氨基酸取代、缺失或添加的氨基酸序列。
抗体CDR中的甲硫氨酸残基可能被氧化，导致潜在的化学降解和随后抗体效力的降低。因此，本发明还提供了如下的抗-MICA抗体，其重链和/或轻链CDR内的一个或多个甲硫氨酸残基被不会发生氧化降解的氨基酸残基代替。在一个实施方案中，表1所示的抗体ID1,6,7,8,9或11的CDR内的甲硫氨酸残基被不会发生氧化降解的氨基酸残基代替。
本发明的工程化抗体包括其中VH和/或VL内的框架残基被修饰以便，例如改进抗体的性质的工程化抗体。典型地，为了降低抗体的免疫原性而进行这样的框架修饰。例如，一个方法是将一个或多个框架残基“回变(backmutate)”成相应的种系序列。更具体地，经过体细胞突变的抗体可能含有与该抗体来源的种系序列不同的框架残基。这样的残基可以通过比较该抗体框架序列与抗体所来源的种系序列加以鉴定。为了使该框架区序列返回到其种系构型，可以将体细胞突变“回变”成其种系序列，通过例如定点突变或者PCR介导的突变。这种“回变”抗体也意图涵盖在本发明之内。
另一个类型的框架修饰涉及在框架区内，甚至在一个或多个CDR区内突变一个或多个残基，以去除T细胞表位，借此降低抗体的潜在免疫原性。这种方法也称作“去免疫(deimmunization)”，并且在授予Carr等人的美国专利公开No.20030153043中有更详细的描述。
作为在框架或CDR区内进行修饰的附加或者替代，可以工程化本发明抗体使其在Fc区内含有修饰，这通常是为了改变抗体的一种或多种功能性质，例如血清半衰期、补体固定、Fc受体结合和/或抗原依赖的细胞细胞毒作用。而且，同样是为了改变抗体的一种或多种功能性质，可以化学修饰本发明的抗体(例如，可以将一个或多个化学基团附接于抗体上)或者修饰本发明的抗体以改变其糖基化。这样的实施方案分别在下文有更详细的描述。Fc区残基的编号是根据Kabat的EU索引。
Fc包括源自免疫球蛋白，优选人免疫球蛋白的恒定区的结构域，包括恒定区的片段、类似物、变体、突变体或衍生物。合适的免疫球蛋白包括IgG1,IgG2,IgG3,IgG4，和其它类型如IgA,IgD,IgE和IgM。免疫球蛋白的恒定区可以是天然存在的或者合成产生的多肽，并且可以分别地或者组合地包含CH1结构域、铰链区、CH2结构域、CH3结构域或CH4结构域。
免疫球蛋白的恒定区负责许多重要的抗体功能，包括Fc受体(FcR)结合和补体固定。有5种主要的重链恒定区类型，分别是IgA,IgG,IgD,IgE,IgM，每一种具有由同种型指定的特征性效应器功能。例如，IgG可以分成4个亚型，称作IgG1,IgG2,IgG3,和IgG4。本文所指的Fc可以包括重链恒定区的任何类型或亚型。
Ig分子与多种类型的细胞受体相互作用。例如，IgG分子与三种类型的Fcγ受体(FcγR)相互作用，其特异针对IgG抗体类型，即FcγRI,FcγRII,和FcγRIII。IgG用于结合FcγR受体的重要序列已经报道位于CH2和CH3结构域。抗体的血清半衰期受到抗体与Fc受体(FcR)结合的能力的影响。类似地，IgFc的血清半衰期也受到抗体与这样的受体结合的能力的影响(GilliesSD等人,(1999)CancerRes.59:2159-66)。本文所指的Fc可以结合一种或多种这样的受体。
本文所公开的抗体可以包括这样的Fc，其至少包括免疫球蛋白重链羧基端的一部分。例如，Fc可以包括：CH2结构域、CH3结构域、CH4结构域、CH2-CH3结构域、CH2-CH4结构域、CH2-CH3-CH4结构域、铰链-CH2结构域、铰链-CH2-CH3结构域、铰链-CH2-CH4结构域、或铰链-CH2-CH3-CH4结构域。Fc结构域可以源自属于任何免疫球蛋白类型，即IgA,IgD,IgE,IgG或IgM，或者任何IgG抗体亚型，即IgG1,IgG2,IgG3和IgG4，的抗体。Fc结构域可以是天然存在的Fc结构域，包括天然的等位基因或者剪接变体。Fc结构域可以是杂合结构域，包括来自两种或多种不同的Ig同种型的Fc结构域的一部分，例如IgG2/IgG4杂合Fc结构域。在示例性实施方案中，Fc结构域源自人免疫球蛋白分子。Fc结构域可以是人源化的或者来自非人动物的Fc结构域的去免疫版本，包括但不仅限于小鼠、大鼠、家兔、骆驼、美洲驼、单峰驼和猴。
在某些实施方案中，Fc结构域是Fc序列的变体，例如Fc序列相对于亲本Fc序列(例如未经修饰的Fc多肽，其随后被修饰产生变体)已被修饰(例如通过氨基酸取代、缺失和/或插入)，以提供期望的结构特征和/或生物学活性。
例如，可以在Fc区中进行修饰以产生具有(a)增加或减少的抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC),(b)增加或减少的补体介导的细胞毒作用(CDC),(c)增加或减少的对C1q的亲和力，和/或(d)增加或减少的亲和力对与亲本Fc相关的Fc受体的亲和力的Fc变体。这样的Fc区变体一般包括Fc区内的至少一个氨基酸修饰。结合氨基酸修饰被认为是特别理想的。例如，变体Fc区可以包含2、3、4、5个等取代，例如在本申请(包括附图)中鉴定的特定Fc区位置中包含取代。
变体Fc区可以包括序列改变，其中参与二硫键形成的位点被除去。这样的除去可以避免与用于产生本发明分子的宿主细胞内存在的其它含半胱氨酸蛋白反应。为这个目的，可以截去N端含有半胱氨酸的节段，或者将半胱氨酸残基删除或用其他氨基酸(例如丙氨酰基、丝氨酰基)取代。即使当半胱氨酸被除去后，单链Fc结构域仍能够形成非共价地保持在一起的二聚体Fc结构域。在其他实施方案中，可以修饰天然的Fc结构域，使其与所选的宿主细胞更加相容。例如，可以除去典型天然FcN端附近的PA序列，该序列可以被大肠杆菌内的消化酶，如脯氨酸亚氨基肽酶识别。在其他实施方案中，Fc结构域内的一个或多个糖基化位点可以被除去。通常被糖基化的残基(例如天冬酰胺)可能提供细胞裂解效应。可以将这样的残基删除或者用非糖基化的残基(例如丙氨酸)取代。在其他实施方案中，可以将参与补体相互作用的位点，例如C1q结合位点，从Fc结构域中除去。例如，可以删除或取代人IgG1的EKK序列。在某些实施方案中，可以除去影响Fc受体结合的位点，优选为救援受体结合位点之外的位点。在其他实施方案中，可以修饰Fc结构域以除去ADCC位点。ADCC位点是本领域已知的；关于IgG1中的ADCC位点参见例如Molec.Immunol.29(5):633-9(1992)。变体Fc结构域的特异性实施例在例如WO97/34631和WO96/32478中被公开。
在一个实施方案中，修饰CH1的铰链区而使得铰链区内的半胱氨酸残基数目改变，例如增加或降低。这个方法在授予Bodmer等人的美国专利No.5,677,425中有进一步的描述。改变CH1铰链区内的半胱氨酸残基数目是为了，例如，促进轻链和重链的组装或者增加或降低抗体的稳定性。
在另一个实施方案中，突变抗体的Fc-铰链区以降低抗体的生物半衰期。更具体地，在Fc-铰链片段的CH2-CH3结构域界面区内引入一个或多个氨基酸突变，使得相对于天然的Fc-铰链结构域与葡萄球菌蛋白A(SpA)的结合，该抗体与SpA结合受阻。这个方法在授予Ward等人的美国专利No.6,165,745中有更详细的描述。
在另一个实施方案中，修饰抗体以增加其生物半衰期。可能有不同的方法。例如，可以引入一个或多个如下的突变：T252L,T254S,T256F，如授予Ward的美国专利No.6,277,375所述。作为备选，为了增加生物半衰期，可以改变抗体的CH1或CL区，使之含有来自IgGFc区CH2结构域的两个环的补救受体结合表位，如Presta等人的美国专利Nos.5,869,046和6,121,022所述。
在某些实施方案中，Fc包括人IgG1的CH2和CH3区，如下所示：VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQIDNO:171)。应当理解，末端的甘氨酸和赖氨酸是任选的。在某些实施方案中，Fc包含与(SEQIDNO:171)至少50％,60％,75％,80％,85％,90％,95％,96％,97％,98％,或99％相同的氨基酸序列。在某些实施方案中，Fc包含具有(SEQIDNO:171)的至少50、100或150个连续氨基酸的氨基酸序列。在某些实施方案中，Fc包含具有(SEQIDNO:171)的50-100,50-150,或100-150个连续氨基酸的氨基酸序列。在某些实施方案中，Fc包含这样的氨基酸序列，其包含(SEQIDNO:171)，其中具有1-5,1-10,1-15,1-20,或1-25个取代或保守取代。人野生型1恒定区序列首先由LeroyHood课题组描述，见Ellison等人,Nucl.AcidsRes.10:4071(1982)。EU索引位置(Indexposition)356,358,和431限定了G1m1单倍型。
下面描述了额外的Fc变体。应当理解，本公开的Fc区包括根据Kabat等人(1991,NIHPublication91-3242,NationalTechnicalInformationService,Springfield,Va.)的EU索引的编号方案。
本公开包括Fc区被改变的肽，其中至少一个氨基酸残基被不同的氨基酸残基代替，以改变抗体的效应器功能。例如，选自下列氨基酸残基的一个或多个氨基酸可以被不同的氨基酸残基代替：234,235,236,237,297,318,320和322，使得抗体对效应物配体的亲和力改变，但是保留亲本抗体的抗原结合能力。亲和力被改变的效应器配体可以是，例如，Fc受体或补体的C1部分。这个方法在授予Winter等人的美国专利Nos.5,624,821和5,648,260中有更详细的描述。
在另一个实例中，选自下列氨基酸残基的一个或多个氨基酸可以被不同的氨基酸残基代替：329,331和322，使得抗体的C1q结合改变和/或细胞毒作用(CDC)降低或消除。这个方法在授予Idusogie等人的美国专利Nos.6,194,551中有更详细的描述。
在另一个实例中，氨基酸位置231和239内的一个或多个氨基酸残基被改变，从而改变抗体固定补体的能力。该方法在授予Bodmer等人的PCT专利公开WO94/29351中有描述。
在另外一个实例中，Fc区被从而增加抗体介导抗体依赖的细胞细胞毒作用(ADCC)的能力，和/或增加抗体对Fcγ受体的亲和力，修饰Fc区是通过修饰下列位置的一个或多个氨基酸：238,239,248,249,252,254,255,256,258,265,267,268,269,270,272,276,278,280,283,285,286,289,290,292,293,294,295,296,298,301,303,305,307,309,312,315,320,322,324,326,327,329,330,331,333,334,335,337,338,340,360,373,376,378,382,388,389,398,414,416,419,430,434,435,437,438或439。该方法在Presta的PCT公开WO00/42072中有进一步的描述。而且，人IgG1上对FcγR1,FcγRII,FcγRIII和FcRn的结合位点已经被定位，并且已有人描述了具有改良结合的变体(见Shields,R.L.等人(2001)J.Biol.Chem.276:6591-6604)。位置256,290,298,333,334和339的特定突变显示可增加对FcγRIII的结合。此外，下列组合突变显示可提高FcγRIII结合：T256A/S298A,S298A/E333A,S298A/K224A和S298A/E333A/K334A。示例性取代包括236A,239D,239E,268D,267E,268E,268F,324T,332D,和332E。示例性变体包括239D/332E,236A/332E,236A/239D/332E,268F/324T,267E/268F,267E/324T,和267E/268F/324T。其它用于增强FcyR和补体相互作用的修饰包括但不仅限于如下取代：298A,333A,334A,326A,2471,339D,339Q,280H,290S,298D,298V,243L,292P,300L,396L,3051,和396L。这样的和其它修饰在Strohl,2009,CurrentOpinioninBiotechnology20:685-691中有综述。
可增加与Fcγ受体结合的Fc修饰包括如下Fc区氨基酸位置中的一个或多个处的氨基酸修饰：238,239,248,249,252,254,255,256,258,265,267,268,269,270,272,279,280,283,285,298,289,290,292,293,294,295,296,298,301,303,305,307,312,315,324,327,329,330,335,337,3338,340,360,373,376,379,382,388,389,398,414,416,419,430,434,435,437,438或439，其中Fc区中残基的编号根据Kabat(WO00/42072)的EU索引。
可以对Fc进行的其它Fc修饰包括以减少或消减与FcyR和/或补体蛋白的结合、藉此减少或消减Fc介导的效应器功能如ADCC,ADCP,和CDC为目的的修饰。示例性修饰包括但不仅限于位置234,235,236,237,267,269,325,和328处的取代、插入和缺失，其中编号是根据EU索引。示例性取代包括但不仅限于234G,235G,236R,237K,267R,269R,325L,和328R，其中编号是根据EU索引。Fc变体可以包括236R/328R。其它以减少FcyR和补体相互作用为目的的修饰包括取代297A,234A,235A,237A,318A,228P,236E,268Q,309L,330S,331S,220S,226S,229S,238S,233P,和234V，以及通过突变或酶学手段或者通过在不会糖基化蛋白的生物体(如细菌)中生产，来除去位置297的糖基化。这些修饰和其它修饰在Strohl,2009,CurrentOpinioninBiotechnology20:685-691有综述。
任选地，Fc区可以在本领域技术人员已知的额外和/或替代位置处包括非天然发生的氨基酸残基(见，例如美国专利No.5,624,821；6,277,375；6,737,056；6,194,551；7,317,091；8,101,720；PCT专利公开WO00/42072；WO01/58957；WO02/06919；WO04/016750；WO04/029207；WO04/035752；WO04/074455；WO04/099249；WO04/063351；WO05/070963；WO05/040217,WO05/092925和WO06/020114)。
还可以使用可以强化对抑制剂受体FcyRllb的亲和力的Fc变体。这样的变体可以给Fc提供与FcyRllb+细胞(包括例如B细胞和单核细胞)相关的免疫调节活性。在一个实施方案中，与一种或多种活化受体相比，Fc变体提供选择性强化的对FcyRllb的亲和力。以改变对FcyRllb的结合为目的的修饰包括在选自下组位置中的一个位置处的一个或多个修饰：234,235,236,237,239,266,267,268,325,326,327,328,和332，其根据EU索引。用于提高FcyRllb亲和力的示例性取代包括但不仅限于：234D,234E,234W,235D,235F,235R,235Y,236D,236N,237D,237N,239D,239E,266M,267D,267E,268D,268E,327D,327E,328F,328W,328Y,和332E。示例性取代包括235Y,236D,239D,266M,267E,268D,268E,328F,328W,和328Y。其它以强化对FcyRllb的结合为目的的Fc变体包括235Y/267E,236D/267E,239D/268D,239D/267E,267E/268D,267E/268E,和267E/328F。
Fc区与其配体的亲和力和结合性质可以通过本领域已知的多种体外测定方法(基于生物化学或免疫学的测定)加以确定，包括但不仅限于，平衡法(例如酶联免疫测定(ELISA)，或放射免疫测定(RIA))，或动力学(例如BIACORE分析)，和其它方法如间接结合测定、竞争性抑制测定、荧光共振能量转移(FRET)、凝胶电泳和色谱(例如凝胶过滤)。这些方法和其它的方法可以使用位于一个或多个被考察的组分上的标记物，和/或采用多种检测方法，包括但不仅限于，生色、荧光、发光、或同位素标记物。关于结合亲和力和动力学的详细描述可以在Paul,W.E.编辑,FundamentalImmunology,第4版,Lippincott-Raven,Philadelphia(1999)中找到，该文聚焦于抗体-抗原相互作用。
Fc还可以增加抗体的血清半衰期。例如，这可以通过增加Fc区对FcRn的结合亲和力来实现。例如，下列残基中的一个或多个可以被突变：252,254,256,433,435,436，如美国专利No.6,277,375所述。
可增加对FcRn的结合和/或改善药代动力学性质的其它示例性Fc变体包括：在位置259,308,428,和434处的取代，包括例如259I,308F,428L,428M,434S,434H,434F,434Y,和434M。其它可增加Fc与FcRn结合的变体包括：250E,250Q,428L,428F,250Q/428L(Hinton等人,2004,J.Biol.Chem.279(8):6213-6216,Hinton等人2006JournalofImmunology176:346-356),256A,272A,286A,305A,307A,307Q,311A,312A,376A,378Q,380A,382A,434A(Shieldsetal,JournalofBiologicalChemistry,2001,276(9):6591-6604),252F,252T,252Y,252W,254T,256S,256R,256Q,256E,256D,256T,309P,311S,433R,433S,433I,433P,433Q,434H,434F,434Y,252Y/254T/256E,433K/434F/436H,308T/309P/311S(DallAcqua等人JournalofImmunology,2002,169:5171-5180,Dall'Acqua等人,2006,JournalofBiologicalChemistry281:23514-23524)。其它以调节FcRn结合为目的的修饰在Yeung等人,2010,JImmunol,182:7663-7671中有描述。
在某些实施方案中，可以使用具有特定生物学特征的杂合IgG同种型。例如，lgG1/lgG3杂合变体可以这样构建：将lgG1的CH2和/或CH3区中在这两种同种型之间有差异的位置替换为来自lgG3的氨基酸。因此，可以构建这样的杂合变体IgG抗体，其包含一个或多个取代，例如274Q,276K,300F,339T,356E,358M,384S,392N,397M,422I,435R,和436F。在本发明的其它实施方案中，lgG1/lgG2杂合变体可以这样构建：将lgG2的CH2和/或CH3区中在这两种同种型之间有差异的位置替换为来自lgG1的氨基酸。因此，可以构建这样的杂合变体IgG抗体，其包含一个或多个取代，例如一个或多个如下的氨基酸取代：233E,234L,235L,-236G(是指位置236处插入甘氨酸),和327A。
在另外的实施方案中，抗体的糖基化被修饰。例如，可以制作无糖基的抗体(即，缺乏糖基化的抗体)。改变糖基化的目的可以是，例如，增加抗体对抗原的亲和力。这样的糖修饰可以通过，例如，改变抗体序列内的一个或更多糖基化位点来实现。例如，可以进行一个或更多个氨基酸取代，其导致一个或更多个可变区框架糖基化位点的消除，藉此消除该位点的糖基化。这种无糖基化可以增加抗体对抗原的亲和力。这样的方法在Co等人的美国专利Nos.5,714,350和6,350,861中有更详细的描述。作为备选，可以改变共价附着于Fc区的寡糖，例如通过在各种工程化的或者其他处理的生物体或细胞系(例如Lec-13CHO细胞或大鼠杂合瘤YB2/0细胞)中表达IgG，通过调节参与糖基化途径的酶(例如FUT8[a1,6-岩藻糖转移酶]和/或β1-4-N-乙酰葡萄糖胺转移酶III[GnTIII])，通过在IgG被表达之后对糖进行修饰，或者通过在作为酶抑制剂的岩藻糖类似物的存在下表达Fc融合蛋白。其它用于修饰Fc糖型的方法包括使用酵母的糖基化改造株(Li等人,2006,NatureBiotechnology24(2):210-215)，苔藓的糖基化改造株(Nechansky等人,2007,MolImmunjol44(7):1826-8)，和植物的糖基化改造株(Cox等人,2006,NatBiotechnol24(12):1591-7)。
在一个实施方案中，Fc融合被糖工程化，以改变唾液酸化水平。Fc分子中高水平的唾液酸化Fc聚糖会不利地影响功能(Scallon等人,2007,MolImmunol.44(7):1524-34)，并且Fc唾液酸化水平的差异会导致抗炎活性的修饰(Kaneko等人,2006,Science313:670-673)。
Fc分子的糖基化水平还可以通过特异性突变进行修饰。例如，氨基酸位置297或299的突变会除去位置297的糖基化。其它可以使用的Fc修饰包括在下列文献中描述的那些：WO88/07054,WO88/07089,US6,277,375,WO99/051642,WO01/058957,WO2003/074679,WO2004/029207,US7,317,091和WO2004/099249。
此外或作为备选，可以制作具有改变的糖基化类型的抗体，例如具有更少量的岩藻糖基残基的低岩藻糖基化抗体或者具有更多的二分(bisecting)GlcNac结构的抗体。这种改变的糖基化模式已被证明可增加抗体的ADCC能力。这样的糖修饰可以通过例如在具有改变的糖基化机制的宿主细胞内表达抗体来实现。具有改变的糖基化机制的细胞在本领域已有描述，可以用作宿主细胞在其中表达本发明重组抗体，藉此产生具有改变的糖基化的抗体。例如，Hanai等人的EP1,176,195描述了一种细胞系，其具有功能破坏的FUT8基因(该基因编码岩藻糖基转移酶)的，使得在这种细胞系中表达的抗体表现出低岩藻糖化。Presta的PCT公开WO03/035835描述了一种变体CHO细胞系——Lec13细胞，其具有降低的将岩藻糖附着于Asn(297)-连接的糖上的能力，还导致在该宿主细胞内表达的抗体的低岩藻糖化(另见Shields,R.L.等人(2002)J.Biol.Chem.277:26733-26740)。Umana等人的PCT公开WO99/54342描述了这样的细胞系，其被工程化表达糖蛋白修饰性糖基转移酶(例如β(1,4)-N-乙酰葡萄糖胺转移酶III(GnTIII))，使得在该工程化细胞系中表达的抗体显示增加的二分GlcNac结构，导致抗体的ADCC活性提高(另见Umana等人(1999)Nat.Biotech.17:176-180)。
而且，特定的Fc变体包括Fc4变体，Fc4变体含有γ1铰链区，但是铰链区内引入了Arg218，从而包含Bg1II限制酶识别序列以方便克隆，并包含Ser对Cys的残基取代以防止由于潜在存在的非配对巯基导致的有害影响。Fc4的CH2区是基于γ1CH2，并且含有三个减少Fc受体I(FcRI)结合的氨基酸取代。它们是在EU索引位置234,235,和237的取代。这样的取代如GregWinter课题组的Duncan等人,Nature332:563(1988)所述，并且在论文中显示可降低与FcRI的结合。此外，在补体C1q结合位点内引入两个氨基酸取代以减少补体固定。它们是在EU索引位置330和331处的取代。SherieMorrison课题组在Taoetal,J.Exp.Med.178:661(1993)以及CanfieldandMorrison,J.Exp.Med.173:1483(1991)中描述了位置330和331在补体C1q结合(或者补体固定或活化的缺乏)中的重要性或相关性。Fc4变体中的CH3区仍然与野生型1Fc相同。
Fc5是Fc4的变体，其中铰链区内的Arg218取代被回复成野生型Lys218残基。Fc5也含有和Fc4相同的Cys220到Ser的取代以及相同的CH2取代，CH2区与野生型γ1Fc相同。Fc6变体含有与Fc5相同的铰链区取代，并含有和Fc4相同的CH2取代。Fc6CH3区不含有羧基端赖氨酸残基。这个Lys残基不具有指定的EU索引编号。这个Lys在成熟免疫球蛋白中被不同程度地除去，因此在血液循环抗体中大多不能找到。重组Fc上没有这个残基可导致更均一的产物。Fc7变体的铰链区与野生型γ1Fc相同。其CH2区是基于γ1CH2，但是残基Asn-297处的N连接糖附着位点被改变成Gln，从而产生去糖基化Fc(见例如TaoandMorrison(1989)J.Immunol.143:2595-2601)。CH3区与野生型γ1Fc相同。Fc8变体的铰链区和Fc4相同，且CH2区和CH3区均与相应的野生型γ1Fc区相同。Fc9变体含有截短的γ1铰链，其起始于Asp残基，该残基紧邻于参与和轻链形成二硫键的Cys残基的羧基端。其余的铰链序列与野生型γ1铰链相同。CH2区序列和CH3区序列均与野生型γ1Fc的相应区域相同。Fc10变体含有与Fc5相同的铰链区取代。CH2区序列和CH3区序列均与野生型γ1Fc的相应区域相同。Fc11变体含有与Fc5相同的铰链区取代。其CH2结构域是基于γ1CH2，但是含有取代从而降低Fcγ受体结合(取代位于EU索引位置234、235和237)。Fc11就C1q结合和补体固定而言是野生型的。Fc11的CH3结构域与野生型γ1CH3相同。Fc12变体含有具有Cys220Ser、Cys226Ser和Cys229Ser取代的γ1铰链，并且与Fc5的相同的CH2结构域，且具有野生型γ1CH3结构域。Fc13变体含有具有Cys220Ser,Cys226Ser,和Cys229Ser取代的γ1铰链，具有与Fc5的相同的CH2结构域，并具有携带Tyr407Gly取代的野生型γ1CH3。Fc14变体包含具有Cys220Ser,Cys226Ser,和Cys229Ser取代的γ1铰链，具有野生型γ1CH2，并具有携带Tyr407Gly取代的野生型γ1CH3。Fc15变体含有具有Ser228Pro取代以降低IgG4“Fab交换”的γ4铰链，并具有野生型γ4CH2和CH3结构域。Fc16变体含有具有Cys220Ser取代的γ1铰链，具有与γ1CH2相同的CH2结构域，并且具有与野生型γ4CH3相同的CH3结构域。Fc17变体含有具有Cys220Ser取代的γ1铰链，具有包含Phe243Ala取代的γ1CH2结构域，并且具有与野生型γ1CH3相同的CH3结构域。Fc18变体含有具有Cys220Ser取代的γ1铰链，具有与野生型γ1CH2相同的γ1CH2结构域，并且具有包含His435Ala取代的γ1CH3。Fc19变体含有与Fc5相同的铰链，具有与Fc5相同的CH2结构域，只是残基Asn-297处的N连接糖附着位点被变成了Gln以产生去糖基化Fc，并且具有与野生型γ1CH3相同的CH3结构域。Fc21变体包含具有Cys220Ser,Cys226Ser和Cys229Ser取代的γ1铰链，具有与Fc5相同的CH2结构域，并且具有包含Phe405Ala和Tyr407Gly取代的γ1CH3。Fc22变体包含携带Cys220Ser,Cys226Ser,和Cys229Ser取代的γ1铰链，具有与Fc1相同的CH2结构域，并且具有包含Phe405Ala和Tyr407Gly取代的γ1CH3。Fc23变体包含具有Cys220Ser取代的γ1铰链，具有包含Leu234Ala,Leu235Glu,Pro331Ser取代的γ1CH2结构域，以及与野生型γ1Fc相同的CH3结构域。
本发明构想的本文所述抗体的另一种修饰是PEG化。抗体的PEG化的目的可以是，例如，增加抗体的生物(例如血清)半衰期。为了PEG化抗体，通常将抗体或其片段在一个或多个PEG基团附着在抗体或抗体片段上的条件下与聚乙二醇(PEG)，例如PEG的反应性酯或醛衍生物反应。优选地，PEG化通过与活性PEG分子(或类似的活性水溶性聚合物)的酰化反应或烷基化反应实施。如本文所使用的，术语“聚乙二醇”意图包括任何形式的用于衍生化其它蛋白质的PEG，例如单(C1-C10)烷氧基-或芳氧基-聚乙二醇或聚乙二醇-马来酰亚胺。在某些实施方案中，要PEG化的抗体是无糖基化抗体。用于PEG化蛋白的方法是本领域已知的，并可用于本发明的抗体。参见例如Nishimura等人的EP0154316和Ishikawa等人的EP0401384。
使用方法
在一些情况下，本公开提供了治疗方法，其包括向受试者施用本文所公开的组合物。
本文提供了用于治疗和/或预防受试者体内癌症或癌症症状的方法，包括向受试者施用治疗有效量的组合物，其包括与MHCI类多肽相关序列A(MICA)免疫特异性结合的肽，其中该肽包括表1所示的抗体ID1,6,7,8,9或11的VH的互补决定区(CDR)3，其中具有5个或更少的保守氨基酸取代，和表1所示的抗体ID1,6,7,8,9或11的VL的CDR3，其中具有5个或更少的保守氨基酸取代。在一些实施方案中，癌症是与MICA过表达相关的癌症。在一些实施方案中，癌症是黑色素瘤、肺癌、乳腺癌、肾癌、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、胃癌和结肠癌、淋巴瘤或白血病。在一些实施方案中，癌症是黑色素瘤。在一些实施方案中，癌症是浆细胞恶性肿瘤，例如，多发性骨髓瘤(MM)或浆细胞的恶变前状态。在一些实施方案中，受试者已被诊断为患有癌症或易患癌症。
在一些情况下，本公开提供了用于治疗和/或预防受试者的癌症或癌症症状的方法，包括向受试者施用治疗有效量的组合物，所述组合物包含与MHCI类多肽相关序列A(MICA)特异性结合的分离抗体，其中抗体包括含有SEQIDNO:2,77,96,113,131或150的VH序列所示的VHCDR1,VHCDR2,和VHCDR3的重链可变区(VH)，和SEQIDNO:11,79,98,113,133或152的轻链可变区(VL)。
癌症的症状是本领域技术人员公知的，并且包括但不仅限于，不寻常的痣特征(unusualmolefeatures)，痣的外观变化，包括不对称、边界、颜色和/或直径，新着色的皮肤区域，异常的痣，指甲的变暗区，乳房肿块，乳头变化，乳腺囊肿，乳房疼痛，死亡，体重减轻，乏力，过度疲劳，进食困难，食欲不振，慢性咳嗽，呼吸困难加重，咳血，尿血，便血，恶心，呕吐，肝转移，肺转移，骨转移，腹部胀满，腹胀(bloating)，腹腔积液，阴道出血，便秘，腹胀(abdominaldistension)，结肠穿孔，急性腹膜炎(感染，发热，疼痛)，疼痛，吐血，大量出汗，发热，高血压，贫血，腹泻，黄疸，头晕，畏寒，肌肉痉挛，结肠转移，肺转移，膀胱转移，肝转移，骨转移，肾转移和胰腺转移，吞咽困难，等。
本文所述的方法可用于广泛的物种，例如人、非人灵长动物(例如猴子)、马、牛、猪、绵羊、鹿、麋鹿、山羊、狗、猫、鼬、兔、豚鼠、仓鼠、大鼠和小鼠。
如本文所使用的，术语“处理”或“治疗”是指部分或完全减轻、抑制、减弱和/或缓解受试者所罹患的疾病或病症的至少一种症状或生物学指征的出现、演进或复发。在一些情况下，治疗可以导致患者所罹患的疾病或病症持续不存在。
术语“有效剂量”的定义是足以实现或者至少部分实现期望效果的量。术语“治疗有效剂量”的定义是足以在已经罹患疾病的患者中治愈或者至少部分地阻止该疾病及其并发症的量。用于该用途的有效量取决于所治疗病症的严重程度和患者自身免疫系统的一般状态。
药物或治疗剂，如本发明Fc融合蛋白，的“治疗有效量”或“治疗有效剂量”是药物的任何在单独或与其它治疗剂组合使用时能够促进疾病消退的量，其中疾病消退的证据是疾病症状的严重程度降低、疾病无症状期的频率或持续时间增加、或防止由于疾病痛苦导致的障碍或失能。药物的治疗有效量或剂量包括“预防有效量”或“预防有效剂量”，这是该药物的任何在向具有疾病演进风险或正在罹受疾病复发的受试者单独或与其它治疗剂组合给药时能够抑制疾病演进或复发的量。治疗剂促进疾病消退或抑制疾病演进或复发的能力可以使用多种技术人员已知的方法进行评估，例如在临床试验期间的人类受试者中，在可预测在人体内效力的动物模型系统中，或者通过体外实验测定试剂的活性。
作为举例，抗癌剂促进受试者体内肿瘤的消退。在优选的实施方案中，药物的治疗有效量促进癌症消退直至癌症清除。“促进癌症消退”是指有效量的药物单独给药或与抗肿瘤剂组合给药导致肿瘤生长降低或大小减少、肿瘤坏死、至少一种疾病症状的严重程度降低、疾病无症状期的频率和持续时间增加、防止由于疾病痛苦导致的障碍或失能、或者以其他方式缓解患者体内的疾病症状。此外，对于治疗而言，术语“有效的”和“有效性”既包括药理有效性也包括生理安全性。药理有效性是指药物促进患者体内癌症消退的能力。生理安全性是指毒性或其他由于药物施用导致的细胞、器官和/或生物体水平上的不良生理效应(不良作用)的水平。
作为肿瘤治疗的实例，相对于未治疗的受试者，治疗有效量或治疗有效剂量的药物优选抑制细胞生长或肿瘤生长达至少约20％，更优选地至少约40％，甚至更优选地至少约60％，并且还更优选地至少约80％。在最优选的实施方案中，治疗有效量或剂量的药物完全抑制细胞生长或肿瘤生长，即，优选地抑制细胞生长或肿瘤生长达100％。化合物抑制肿瘤生长的能力可以使用下文描述的测定法进行评估。作为备选，组合物的这一特性可以通过检验该化合物抑制细胞生长的能力进行评估，这种抑制可以在体外通过本领域技术人员已知的测定法测定。在本发明的其他优选实施方案中，肿瘤消退可以观察到，并持续至少大约20天，更优选地至少大约40天，或甚至更优选地至少大约60天。
一般地，方法包括选择患有或者具有某种病症或疾病风险的受试者。在一些情况下，受试者的病症或疾病可以用本文所公开的药物组合物治疗。例如，在一些情况下，方法包括选择患有癌症的受试者，例如其中受试者的癌症可以通过靶向MICA和/或血管生成素-2中的一种或两种加以治疗。
在一些情况下，治疗方法可以包括单次给药、多次给药和重复给药，这是根据预防或治疗受试者所患疾病或病症的需要。在一些情况下，治疗方法可以包括在治疗之前、治疗期间和/或治疗之后对受试者体内的疾病水平进行评估。在一些情况下，治疗可以持续直至检测到受试者体内的疾病水平降低为止。
如本文所使用的，术语“施用者”、“施用”或“给药”是指植入、吸收、摄取、注射或吸入本发明的多肽，无论其形式如何。在一些情况下，可以向受试者局部(例如经鼻)和/或口服施用一种或多种本文公开的肽。例如，本文的方法包括施用有效量的化合物或化合物组合物，以达到期望的或规定的效果。对于任何特定患者的具体剂量和治疗方案将取决于多种因素，包括所用的具体化合物的活性，年龄，体重，一般健康状况，性别，饮食，给药时间，排泄速率，药物组合，疾病的严重程度和病程，病症或症状，患者对疾病的倾向，病症或症状，以及治疗医师的判断。
例如，可以调节剂量方案，以提供最佳的期望响应(例如治疗响应)。可以施用单次推注，可以在一段时间内施用多个分份剂量，或者可以根据治疗情况的紧急程度按比例减少或增加剂量。配制剂量单位形式的肠胃外组合物是特别有利的，以方便给药和剂量均一性。如本文所使用的，“剂量单位形式”是指适合作为单一剂量用于待治疗受试者的物理上离散的单位；每个单位含有计算可以与必需的药物载体联合产生期望的治疗效果的预定量的活性化合物。本发明剂量单位形式的规格由(a)活性化合物的独特特征和待实现的特定治疗效果，和(b)此类活性化合物用于个体敏感性治疗的配伍技术的固有限制所决定，并且直接依赖于上述(a)和(b)。
对于抗-MICA抗体或抗体片段的给药，剂量范围是大约0.0001-100mg/kg,更通常为0.01-5mg/kg宿主体重。例如，剂量可以是0.3mg/kg体重，1mg/kg体重，3mg/kg体重，5mg/kg体重，或10mg/kg体重，或在1-10mg/kg范围内。示例性治疗方案是每周给药1次，每2周给药1次，每3周给药1次，每4周给药1次，每月1次，每3月1次，或每3-6月1次。本发明抗-MICA抗体的优选剂量方案包括1mg/kg体重或3mg/kg体重，静脉内给药，其中抗体使用如下的给药日程之一给药：每4周给药，给6个剂量，然后每3个月给药；(ii)每3周给药；(iii)一次给药3mg/kg体重，随后每3周给药1mg/kg体重。
在一些方法中，同时施用两种或多种具有不同结合特异性的单克隆抗体，其中每个施用抗体的剂量在所指示的范围内。抗体通常多次施用。各个剂量之间的间隔可以是，例如，每周，每月，每三个月或每年。间隔也可以是不规则的，通过测量患者体内针对靶抗原的抗体的血液水平来指示。在一些方法中，调节剂量以实现大约1-1000μg/ml的血浆抗体浓度，在一些方法中是大约25-300μg/ml。
作为备选，药物组合物可以作为持续释放制剂给药，在这种情况下，要求较低频率的给药。剂量和频率根据患者体内抗体的半衰期而变化。一般而言，人源抗体显示的半衰期最长，其次是人源化抗体、嵌合抗体、和非人抗体。给药的剂量和频率可以根据治疗是预防性的还是治疗性而变化。在预防性应用中，在一段长时间内以相对低频的间隔给予相对低的剂量。一些患者在其余生中将持续接受治疗。在治疗性应用中，有时需要以相对短的时间间隔给予相对高的剂量，直到疾病的进展减轻或停止，优选地直至患者显示疾病症状的部分或完全改善。此后，可以对患者施用预防性方案。
本发明药物组合物中活性成分的实际剂量水平可以变化，以获得活性成分的能够为特定的患者、组合物和给药模式有效地实现期望的治疗响应、而不会对患者产生毒性的量。选定的剂量水平取决于多种药代动力学因素，包括所用本发明特定组合物或其酯、盐或酰胺的活性，给药途径，给药时间，所用特定化合物的排泄速率，治疗的持续时间，与所用特定组合物联合使用的其它药物、化合物和/或材料，被治疗患者的年龄、性别、体重、状况、一般健康和之前的医疗史，以及医学领域众所周知的类似因素。
给药之后，可以对受试者进行评估，检查、评估或确定其疾病水平。在一些情况下，治疗可以持续直至检测到受试者体内的疾病水平发生改变(例如降低)为止。
一旦患者的状况发生改善(例如受试者的疾病水平发生改变(例如降低))时，如果需要的话，可以施用维持剂量的本发明化合物、组合物或组合。随后，可以减小给药剂量和/或频率，依症状的变化而定，直至达到可以保持所改善病症的水平。然而，在疾病症状出现任何复发时，患者可能长期需要间歇式的治疗。
在一些情况下，本公开提供了用于从人类受试者检测免疫细胞，例如B细胞和/或记忆B细胞的方法。这样的方法可用于，例如，对人类受试者体内的免疫细胞(例如B细胞和/或记忆B细胞)的水平进行监测(例如在某个事件之后进行监测)。示例性的事件可以包括，但不仅限于，检测到疾病、感染；施用本文公开的治疗组合物，施用治疗剂或治疗方案，施用疫苗，诱导免疫响应。这样的方法可以在临床上使用和/或用于研究。
实施例
本发明进一步在下面的实施例中进行描述，这些实施例并不限制由权利要求所述的本发明的范围。
本文所述的方法允许从有限量的外周血中灵敏、特异性并且可靠地检测稀有的具有限定的抗原特异性的记忆B细胞。这样的方法允许在抗原被清除数月至数年之后对记忆B细胞进行可视化和分离。
对本文所公开方法的原理的证明使用破伤风毒素C-片段的四聚体(TTCF)确立，其细节如Franz等人(Blood,118(2):348-357(2011))所报告，本申请通过提述并入其全部内容。
选择TTCF(即TTCF的52kDa、无毒、C端片段)作为模式抗原，因为大部分个体均接种过破伤风类毒素疫苗，并且该疫苗诱发持久的IgG抗体滴度(Amanna等人,N.Engl.J.Med.,357:1903-1915,2007)。因此，使用TTCF提供了一个大的受试者池，可以在其中对本文所公开的方法进行验证。然而，本领域的技术人员会意识到，可以使用常规技术适应性修改本方法以包含任何疾病相关的抗原。如在下文实施例中所证明的，这样的适应性修改可以通过获得针对癌症相关抗原MICA和血管生成素-2的抗体来实现。
实施例1:抗原表达和四聚体形成
如下文将更详细描述的，在大肠杆菌中表达TTCF，并将BirA位点附着在N端，以便通过BirA酶进行位点特异性单生物素化。在蛋白质和生物素化位点之间设置一个柔性接头，以防止抗体结合的位阻。通过阴离子交换色谱纯化TTCF，用BirA生物素化，并通过凝胶过滤色谱将之与游离生物素和BirA分离。通过以1:4的摩尔比温育带荧光标签的链霉亲和素和生物素化的TTCF抗原来产生TTCF四聚体。然后将这些四聚体与一组mAb一起使用，用于鉴定破伤风类毒素特异性的记忆B细胞。
TTCF克隆在pET-15b(Novagen)中。在BL21(DE3)大肠杆菌中用1mM异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷(IPTG)28℃诱导蛋白表达4小时。清洗细胞，裂解，并收集所得的上清液。使用HIS-Select亲和柱(Sigma)纯化TTCF。通过蛋白水解除去His标签。使用相似的方法产生鼠CD80近膜结构域。蛋白质被单生物素化。对于某些实施方案，将Alexa-488染料分子(Molecularprobes)与生物素化TTCF或CD80的伯胺连接。
抗原四聚体的制备是通过将生物素化的抗原与优级PE标记的链霉亲和素(MolecularProbes)以4:1的摩尔比在冰上温育至少20分钟。在使用之前，将四聚物制备物离心以去除聚集体。在一些实验中，用带Alexa-氟-488标签的抗原和非荧光链霉亲和素以4:1的比例形成四聚体。
实施例2:鉴定方法
如Franz等人,Blood,118(2):348-357(2011)所述实施方法。在BDFACSAriaII细胞分选器上分选细胞。细胞被单细胞分选。首先以CD19+细胞对样品设门，它们对一组排除标志物(CD3,CD14,CD16,7AAD)而言是阴性的，然后以浆母细胞对细胞设门，该类细胞通过高水平的CD27和直接水平的CD19表达加以鉴定，最后以四聚体+CD19+细胞设门。
由于记忆B细胞的低频率，有必要仔细地尽可能减少背景。首先通过负选择(针对CD2,CD3,CD14,CD16,CD56和血型糖蛋白A的抗体的鸡尾酒)对B细胞进行富集，以除去大多数可能会非特异性结合四聚体的细胞。将富集的细胞均分，并用TTCF或对照四聚体染色，随后用CD19,CD27和IgM进行标记以特异性选择类型转换的记忆B细胞。该设门策略将CD19的表达、不被一组排除标志物(CD3,CD14,CD16,7AAD)所标记、记忆标志物CD27表达、和缺乏IgM表达作为类型转换的证据。将四聚体染色相对于CD27染色进行作图，以便将具有感兴趣的抗原特异性的记忆B细胞可视化。将四聚体阳性的B细胞直接分选到含有3μlmRNA提取缓冲液的PCR联排管中。
试管在分选期间保持低温，并且将分选的细胞冷冻并保存在-80℃。使用CD19+CD27+IgM-B细胞作为阳性对照。
使用先前报告的巢式PCR方案扩增重链和轻链可变节段(Wang等人,J.Immunol.Methods.,244:217-225,2000)。在适合于将污染最小化的条件下实施mRNA扩增。所用引物包括：
TAATACGACTCACTATAGGTTCGGGGAAGTAGTCCTTGACCAGG
(SEQIDNO:19)；
TAATACGACTCACTATAGGGATAGAAGTTATTCAGCAGGCACAC
(SEQIDNO:20)；
TAATACGACTCACTATAGGCGTCAGGCTCAGRTAGCTGCTGGCCGC
(SEQIDNO:21).
如Franz等人,Blood,118(2):348-357(2011)所述实施巢式RT-PCR。
加入阴性对照以监视和保证没有污染。从用TTCF四聚体标记的总共35个单细胞中，扩增了32个重链节段和30个轻链节段，并从凝胶纯化的PCR产物直接测序，其相应的总体PCR效率为89％。序列分析显示，TTCF四聚体+细胞采用了多种不同的VHD-JH基因节段，而没有一种特定的基因节段是占主导的。观察到的序列支持了如下结论：克隆代表了由于体细胞超变而多样化了的细胞。
抗体的产生和纯化包括：将重链和轻链可变区DNA克隆到分离的pcDNA3.3表达载体中，该载体含有牛催乳素信号肽序列以及全长IgG1重链和轻链恒定区。在补充有8mMGlutamax(Gibco)的CHO-S培养基(Invitrogen)中37℃，8％CO2下表达抗体，培养基置于100ml旋转瓶中。转染前一天，将细胞分成6x105细胞/ml。在转染当天，如果有必要的话，将细胞分为1x106细胞/ml。使用MAX转染试剂(Invitrogen)共转染25μg重链和轻链质粒DNA，并将经转染的细胞培养6-8天。使用蛋白G琼脂糖珠子获得蛋白质，并使用100mM甘氨酸pH2.5洗脱抗体，并用Spin-X离心管从珠子上分离。使用MicroBio-Spin柱(BioRad)将纯化的抗体交换到磷酸盐缓冲盐(PBS)中。蛋白浓度通过280nm吸光度进行评估。
对于饱和结合测定，将非生物素化的、MonoQ纯化的TTCF用铕标记，并除去游离的铕。用20ng抗体/孔在pH9.6的100mMNaHCO3中包被96孔平底培养板过夜。用补充有牛血清白蛋白(BSA)和牛γ球蛋白的测定缓冲液进行封闭。用测定缓冲液稀释TTCF-铕(从100nM到4pM)，每孔添加200μl，一式三份。平板在37℃温育2小时，用200μl清洗缓冲液(50mMTrispH8,150mMNaCl,20μMEDTA,0.05％吐温)清洗3次。向每个孔添加100μl增强溶液(enhancementsolution)，并使用Victor3酶标仪在615nm测量荧光计数。
使用IMGT/V-Quest和JIONSOLVER软件分析重链和轻链可变区序列。流式细胞术数据用FlowJo分析软件评估。统计分析用GraphPadPrism5软件使用非配对t-检验实施。为了确定抗体KD值，使用GraphPadPrism5软件分析拟合饱和结合数据，其中使用非线性回归分析。
实施例3:多聚体化强化记忆B细胞的识别
比较了四聚体和单体TTCF。TTCF用Alexa-488进行荧光标记，然后以单体形式使用、或者使用无标记的链霉亲和素将其转变成四聚体(见上文)。然后，用相同浓度的四聚体或单体TTCF-Alexa-488温育经富集的B细胞。对照蛋白(CD80近膜结构域)用相同方式标记，并且也作为四聚体使用。
如图6A和6B所示，使用来自三个供体的细胞，TTCF标记了一些记忆B细胞，但是用四聚体鉴定的频率要大得多(1.6-7.3倍)。在三个供体之一中，TTCF特异性记忆B细胞能够用四聚体检测但不能用单体检测。
这样的结果证明，抗原四聚体使得基于抗原对其BCR的特异性来灵敏地检测记忆B细胞成为可能，尽管这样的细胞在外周血中非常稀少。特异针对TTCF的类型转变的记忆B细胞被合适的四聚体TTCF抗原明亮地标记，而用对照四聚体的背景标记则一直很低。
实施例4:方法/抗体验证
通过重叠PCR将IgG重链和κ链的恒定区与分离的可变节段连接产生了全人抗体。使用CHO-S细胞在瞬时无血清哺乳动物表达系统中表达抗体6-8天。使用蛋白G和凝胶过滤色谱纯化抗体。
如图图7A-7B所示，从TTCF特异性浆母细胞分离的抗体对TTCF抗原显示高结合亲和力，KD为2.2nM(TTCFAb1)和323pM(TTCFAb2)(图7B)。从记忆B细胞分离的抗体也显示高结合亲和力，对于其它抗体(TTCFAbs3,4,和5)KD为382pM,228pM,和1.4nM(图7B)。
这样的数据支持了本文公开的方法的特异性。而且，本文方法的特异性被下面的事实所证明：从三个不同的供体构建了5种抗-TTCF抗体，它们全部以高亲和力与TTCF结合。
本文的数据还证明，抗原四聚体使得在抗原从宿主清除长时间之后仍然灵敏地检测到记忆B细胞成为可能。
实施例5：获得抗-MICA抗体
使用本文的方法开发了与MICA免疫特异性结合的抗体。
简而言之，表达C端带BirA标记物(GLNDIFEAQKIEWHE(SEQIDNO:148))的MICA抗原(UniGeneHs.130838)，该标记物使抗原能够被单生物素化。用R-藻红蛋白(Phycoerythrin)(PE)标记的链霉亲和素(SA)将抗原四聚体化，其用以4MICA:1SA的摩尔比进行标记。从接种过用GM-CSF表达载体(GVAX)(PNAS103:9190,2006)转导的自体肿瘤细胞的晚期黑色素瘤患者获得外周血单核细胞，随后用抗-CTLA-4单克隆抗体易普利姆玛(ipilimumab)(YERVOYTM(可以从BristolMyersSquib获得))处理。将外周血单核细胞快速解冻、清洗，并以5x106重悬浮在补充有2％胎牛血清的磷酸盐缓冲液(pH7.2)中，用大约0.1ug/ml四聚体在冰上染色30分钟。添加抗体以鉴定类型转换的记忆B细胞(CD19+,CD27+,和IgM-)。引入一组排除抗体，它们标记T细胞、自然杀伤细胞、巨噬细胞和死细胞，以减少四聚体染色背景(CD3,CD14,CD16,7-AAD)。使用BDFACSAriaII将与MICA四聚体结合的单个B细胞分选到8联管PCR管中。使用EpicentreBiotechnologies的商业试剂盒(目录号:MBCL90310)使用下面显示的基因特异性引物扩增B细胞受体(BCR)mRNA：
mRNA扩增
IgG-T7:AATACGACTCACTATAGGTTCGGGGAAGTAGTCCTTGACCAGG(SEQIDNO:22)
Kappa-T7:
TAATACGACTCACTATAGGGATAGAAGTTATTCAGCAGGCACAC
(SEQIDNO:23)
Lambda-T7:
TAATACGACTCACTATAGGCGTCAGGCTCAGRTAGCTGCTGGCCGC
(SEQIDNO:24)
PCR1
VHL-1:TCACCATGGACTG(C/G)ACCTGGA(SEQIDNO:25)
VHL-2:CCATGGACACACTTTG(C/T)TCCAC(SEQIDNO:26)
VHL-3:TCACCATGGAGTTTGGGCTGAGC(SEQIDNO:27)
VHL-4:AGAACATGAAACA(C/T)CTGTGGTTCTT(SEQIDNO:28)
VHL-5:ATGGGGTCAACCGCCATCCT(SEQIDNO:29)
VHL-6:ACAATGTCTGTCTCCTTCCTCAT(SEQIDNO:30)
VkL-1:GCTCAGCTCCTGGGGCTCCTG(SEQIDNO:31)
VkL-2:CTGGGGCTGCTAATGCTCTGG(SEQIDNO:32)
VkL-3:TTCCTCCTGCTACTCTGGCTC(SEQIDNO:33)
VkL-4:CAGACCCAGGTCTTCATTTCT(SEQIDNO:34)
VlL-1:CCTCTCCTCCTCACCCTCCT(SEQIDNO:35)
VlL-2:CTCCTCACTCAGGGCACA(SEQIDNO:36)
VlL-3:ATGGCCTGGA(T/C)C(C/G)CTCTCC(SEQIDNO:37)
CgII:GCCAGGGGGAAGAC(C/G)GATG(SEQIDNO:38)
CkII:TTTCAACTGCTCATCAGATGGCGG(SEQIDNO:39)
ClII:AGCTCCTCAGAGGAGGG(C/T)GG(SEQIDNO:40)
PCR2
VH-1:CAGGT(G/C)CAGCTGGT(G/A)CAGTC(SEQIDNO:41)
VH-2:CAG(A/G)TCACCTTGAAGGAGTC(SEQIDNO:42)
VH-3:(G/C)AGGTGCAGCTGGTGGAGTC(SEQIDNO:43)
VH-4:CAGGTGCAGCTGCAGGAGTC(SEQIDNO:44)
VH-5:GA(G/A)GTGCAGCTGGTGCAGTC(SEQIDNO:45)
VH-6:CAGGTACAGCTGCAGCAGTC(SEQIDNO:46)
Vk-1:CG(A/C)CATCC(A/G)G(A/T)TGACCCAGT(SEQIDNO:47)
Vk-2:CGAT(A/G)TTGTGATGAC(C/T)CAG(SEQIDNO:48)
Vk-3:CGAAAT(T/A)GTG(T/A)TGAC(G/A)CAGTCT(SEQIDNO:49)
Vk-4:CGACATCGTGATGACCCAGT(SEQIDNO:50)
Vl-1:CCAGTCTGTGCTGACTCAGC(SEQIDNO:51)
Vl-2:CCAGTCTGCCCTGACTCAGC(SEQIDNO:52)
Vl-3:CTCCTATGAGCTGAC(T/A)CAGC(SEQIDNO:53)
CgIII:GAC(C/G)GATGGGCCCTTGGTGGA(SEQIDNO:53)
CkIII:AAGATGAAGACAGATGGTGC(SEQIDNO:55)
ClIII:GGGAACAGAGTGACCG(SEQIDNO:56)
PCR1和PCR2中使用的引物和PCR循环条件从Wang和Stollar等人(journalofimmunologicalmethods,2000)适应性修改而来。
开发了一个替代的重链可变区正向引物组，以覆盖使用上述引物组可能未充分覆盖的重链可变区序列。产生了如下的替换引物：
PCR1
VHL1-58:TCACTATGGACTGGATTTGGA(SEQIDNO:57)
VHL2-5:CCATGGACA(C/T)ACTTTG(C/T)TCCAC(SEQIDNO:58)
VHL3-7:GTAGGAGACATGCAAATAGGGCC(SEQIDNO:59)
VHL3-11:AACAAAGCTATGACATATAGATC(SEQIDNO:60)
VHL3-13.1:ATGGAGTTGGGGCTGAGCTGGGTT(SEQIDNO:61)
VHL3-13.2:AGTTGTTAAATGTTTATCGCAGA(SEQIDNO:62)
VHL3-23:AGGTAATTCATGGAGAAATAGAA(SEQIDNO:63)
VHL4-39:AGAACATGAAGCA(C/T)CTGTGGTTCTT(SEQIDNO:64)
VHL4-61:ATGGACTGGACCTGGAGCATC(SEQIDNO:65)
VHL-9:CCTCTGCTGATGAAAACCAGCCC(SEQIDNO:66)
PCR2
VH1-3/18:CAGGT(C/T)CAGCT(T/G)GTGCAGTC(SEQIDNO:67)
VH1-45/58:CA(A/G)ATGCAGCTGGTGCAGTC(SEQIDNO:68)
VH2-5:CAG(A/G)TCACCTTGA(A/G)GGAGTCTGGT(SEQIDNO:69)
VH3-9/23/43:GA(A/G)GTGCAGCTG(T/G)TGGAGTC(SEQIDNO:70)
VH3-16:GAGGTACAACTGGTGGAGTC(SEQIDNO:71)
VH3-47:GAGGATCAGCTGGTGGAGTC(SEQIDNO:72)
V4-34:CAGGTGCAGCTACAGCAGTG(SEQIDNO:72)
V4-30-2/39:CAGCTGCAGCTGCAGGAGTC(SEQIDNO:74)
VH7-4-1:CAGGTGCAGCTGGTGCAATC(SEQIDNO:75)
简而言之，使用通过mRNA扩增产生的2ulcDNA作为第一轮PCR的模板，并使用如下的循环条件：3个循环的预扩增(94℃/45秒,45℃/45秒,72℃/105秒)；30个循环的扩增(94℃/45秒,50℃/45秒,72℃/105秒)；在72℃最终延伸10分钟。
使用3ul的第一轮PCR产物作为第二轮巢式PCR的模板。使用与第一轮PCR相同的循环条件，但是省略3个循环的预扩增。两个PCR步骤均使用克隆的Pfu聚合酶AD(AgilentTechnologies)实施。PCR产物在1％琼脂糖凝胶上分离，并使用ZymocleanDNA凝胶回收试剂盒(ZymoResearch)分离大小为300-400个核苷酸的产物。使用用于第二轮巢式PCR的正向和反向引物进行测序。使用两步巢式PCR扩增重链和轻链的BCR可变结构域(见上文)。从接种了用GM-CSF表达载体(GVAX)(PNAS103:9190,2006)转导的自体肿瘤细胞的晚期黑色素瘤患者获得外周血单核细胞。抗体在瞬时CHO-S表达系统中表达为全长IgG1抗体。
使用两个独立的基于珠子的测定验证抗-MICA抗体与MICA的结合。第一个测定使用市售的基于溶液的珠子测定试剂盒，其旨在检测与各种MICA等位基因反应的抗-MICA抗体(OneLamba，目录号LSMICA001)。将不同浓度的MICA抗体与珠子温育，然后清洗，并与偶联藻红蛋白的抗-人IgG抗体温育。第二个清洗步骤之后，将珠子在Luminex仪器上进行分析。阴性对照将珠子仅与藻红蛋白偶联的抗-人IgG抗体(无抗-MICA抗体)温育。阳性对照将珠子与直接偶联藻红蛋白偶联的市售抗-MICA/MICB单克隆抗体(克隆6D4)(BioLegend目录号#320906)温育。内部开发了第二种测定，其使用与链霉亲和素偶联的聚苯乙烯珠子。珠子包被有单生物素化的MICA蛋白，并与不同浓度的抗-MICA抗体、抗-TTCF抗体(同种型阴性对照)、或直接偶联藻红蛋白的BioLegend抗-MICA/MICB抗体(阳性对照)进行温育。对与抗-MICA抗体或抗-TTCF抗体温育过的珠子进行清洗，然后将其与偶联Alexa488的抗-人IgG抗体温育。为了确定与珠子的背景结合，使用没有包被MICA蛋白的链霉亲和素偶联的珠子进行同样的温育作为比较。在FACSCaliber流式细胞仪上分析珠子与抗体的结合。
如图8和9A-9O所示，抗-MICA抗体(MICA-Ab12和MICA-Ab20)以高亲和力与MICA结合。MICA-Ab20对应于表1所示的抗-MICA抗体ID-1。
实施例6:抗-MICA抗体
使用本文的方法开发了额外的具有临床相关生物学性质的抗-MICA抗体。在接受过细胞癌症疫苗(经GM-CSF转导的癌细胞，称作GVAX)和阻断T细胞上抑制性CTLA-4受体的抗体易普利姆玛(YERVOYTM(可以从BristolMyersSquib获得))的患者体内鉴定了与普通等位基因反应的MICA特异性抗体。然后，使用MICA四聚体从具有最高血清MICA反应性的患者的外周血单核细胞中分离B细胞。通过单细胞PCR从这样的B细胞确定重链和轻链序列，在实施例5中列出。这项工作鉴定了可识别北美人群中普通等位基因的抗体。
CM24002Ab2(表1所述的抗-MICA抗体ID-6)是一种从患有对GVAX+易普利姆玛组合疗法显示显著临床响应且血清与MICA强烈反应的急性骨髓性白血病(AML)患者分离的抗体。显示了CM24002Ab2轻链(图12和13)和重链(图10和11)的核苷酸和氨基酸序列，其中CDR1，CDR2和CDR3序列用下划线标记。从同一患者获得了另一种具有强结合的抗体，标记为CM24002Ab4(表1所述的抗-MICA抗体ID-7)。显示了CM24002Ab4轻链(图16和17)和重链(图15和14)的核苷酸和氨基酸序列，CDR1，CDR2和CDR3序列用下划线标记。
CM33322Ab11(表1所示的抗-MICA抗体ID-8),CM33322Ab29(表1所示的抗-MICA抗体ID-9),和CM33322Ab4(表1所示的抗-MICA抗体ID-11)是从对GVAX+易普利姆玛组合疗法具有长期响应的转移性黑色素瘤患者分离的抗体。显示了CM33322Ab11轻链(图20和21)和重链(图18和19)的核苷酸和氨基酸序列，CDR1，CDR2和CDR3序列用下划线标记。显示了CM33322Ab29轻链(图24和25)和重链(图22和23)的核苷酸和氨基酸序列，CDR1、CDR2和CDR3序列用下划线标示。显示了CM33322Ab4轻链(图37和38)和重链(图35和36)的核苷酸和氨基酸序列，CDR1、CDR2和CDR3序列用下划线标示。由于该患者的长期临床响应，这样的抗体特别令人感兴趣。
在初始鉴定、克隆和表达感兴趣的抗体之后，用细胞计数珠子测定(cytometricbeadassay)确定这些抗体对不同MICA等位基因的特异性。简而言之，表达、纯化、并在链霉亲和素珠子上捕获具有单BirA生物素化位点的可溶性重组MICA等位基因002，008，009和MICB。然后，将指示的抗-MICA抗体以不同浓度与包被有重组MICA的珠子温育1个小时，然后清洗，并与FITC标记的抗-人IgG第二抗体温育。第二次清洗步骤之后，通过流式细胞仪对珠子结合的FITC荧光进行定量。MICA等位基因002,008,009以及相关MICB蛋白的选择是根据它们在北美人群中的普遍性(图26A-G)。重要的是，CM24002Ab2和CM33322Ab29与所有MICA等位基因以及MICB强烈结合。另外两种抗体结合等位基因的一个子集：CM24002Ab4高度结合MICA*009和MICB，而CM33322Ab11高度结合MICA*002,MICA*008,和MICB(图26A-G)。使用相同技术产生的阴性人对照抗体(对破伤风类毒素的C-末端片段，TTCF特异)和MICA的阳性对照抗体(从BioLegend获得的针对MICA的商品化鼠抗体)证明了其特异性。这些研究确定了CM24002Ab2和CM33322Ab29是临床应用的潜在候选者。
实施例7:抗-MICA抗体与自体肿瘤细胞的结合
通过流式细胞术检查分离的抗-MICA抗体CM24002Ab2结合自身肿瘤细胞的能力(图27)。从患者CM24002获得骨髓，并测试CM24002Ab2与肿瘤细胞的结合。然后，从骨髓样品中鉴定CD33+CD34+细胞作为肿瘤细胞。然后，用10μg/ml的抗-MICA抗体CM24002Ab2、阳性对照商业MICA抗体(BioLegend)或阴性对照抗体(TTCF特异的)对肿瘤细胞进行染色。如图27所示，CM24002Ab2强烈结合这些细胞。CM24002Ab2显示不与非肿瘤细胞(CD16+和CD3+细胞)结合而与CD14+细胞仅有背景结合，证明了抗肿瘤特异性(数据未显示)。
实施例8.抗-MICA抗体抑制NK细胞上的NKG2D受体
检查分离的抗-MICA抗体CM24002Ab2防止可溶性MICA介导的关联受体NKG2D下调的能力。来自患者CM24002的血清以1:10稀释度使用，将其与人NK细胞温育48小时。向这些培养物中添加CM24002Ab2(浓度为10μg/ml)、阳性对照商业MICA抗体(BioLegend)或阴性对照抗体(TTCF特异的)。在48小时通过流式细胞术评估NKG2D的表达(图28)。来自患者CM24002的血清强烈下调NKG2D(因此破坏该受体的功能)。CM24002Ab2和阳性对照MICA抗体部分地恢复NK细胞的NKG2D表面表达。为了证明特异性，我们通过用2ng/ml的重组MICA代替患者血清温育细胞来重复上述实验(图29)。CM24002Ab2完全阻止MICA介导的NKG2D表达下调，而阴性对照抗体(TTCF特异的)没有作用(图29)。这些数据证明，人MICA抗体能够防止人NK细胞上关键NKG2D受体的抑制。
为了进一步检查分离的抗-MICA抗体防止可溶性MICA介导的NKG2D下调的能力，使用多个血清样品和其他的分离抗-MICA抗体重复上述实验。如图29所示，来自晚期黑色素瘤患者的20个血清样品中有15个含有显著水平的脱落MICA。将PBMC与对照血清或含有可溶性MICA的选定黑色素瘤患者样品单独或者在100ug/ml指示抗体的存在下温育48小时。48小时后，通过流式细胞术确定NK细胞(CD3-,CD8-,CD56+)上NKG2D的表达(图40；数据表示为％NKG2D阳性的NK细胞)。这些数据进一步证明，人MICA抗体阻断了血清样品中NKG2D的下调，在所有测试血清样品中恢复了NKG2D介导的细胞毒作用，并能够防止人NK细胞上关键NKG2D受体的抑制。
为了进一步检查分离的抗-MICA抗体阻止可溶性MICA介导的NKG2D的下调的能力，使用额外的分离抗-MICA抗体(例如CM24002Ab2,CM33322Ab4或CM33322Ab11)重复了上述实验。48小时后，清洗细胞，并通过流式细胞术确定NKG2D的表面表达。如图55所示，若干抗-MICA抗体可阻断rMICA介导的NKG2D下调。
为了进一步检查分离的抗-MICA抗体阻止黑色素瘤血清诱导的NKG2D下调的能力，使用多个血清样品和其他的分离抗-MICA抗体重复上述实验。将全PBMC与对照血清或黑色素瘤血清单独地或在指示抗体的存在下温育48小时。48小时后，清洗细胞，并通过流式细胞术确定NKG2D的表面表达。如图53所示，若干抗-MICA抗体可阻断黑色素瘤血清诱导的NKG2D下调。
实施例9:抗-MICA抗体细胞介导的细胞毒作用
为了确定CM24002Ab2是否促成细胞介导的细胞毒作用，将NK细胞(效应器细胞)与重组MICA(2ng/ml)在10μg/mlCM24002Ab2、阴性对照抗体(TTCF特异的)或阳性对照抗体(BioLegend)的存在下温育48小时。48小时后，清洗细胞并将它们与K562肿瘤细胞以20:1,10:1,和5:1的效应器:靶比例温育4小时。通过胞浆蛋白(LDH)从K562肿瘤细胞的释放来测定NK细胞对靶细胞的特异性裂解。在没有MICA抗体时，K562细胞不被NK细胞杀死。然而，CM24002Ab2大大强化了NK细胞介导的K562肿瘤细胞裂解，并且在所有效应器:靶比例下均比阳性对照鼠MICA抗体更有效(图30)。进一步证明，K562肿瘤细胞的杀灭确实是通过NKG2D途径(而不是Fc受体)介导的。用额外两个实验组：NKG2D的阻断抗体和人Fc阻断，重复了上面的实验。此外，也对CM33322Ab29进行了测试。数据显示，CM24002Ab2和CM33322Ab29的添加促成了NK细胞介导的细胞毒作用。当添加阻断性NKG2D抗体时，没有发生K562细胞杀灭，而Fc阻断剂几乎没有影响(图31)。这些数据显示，CM24002Ab2和CM33322Ab29可恢复NKG2D通路的抗肿瘤功能。
为了确定其他的分离抗-MICA是否促成细胞介导的细胞毒作用，用重组MICA(rMICA)在CM24002Ab2,CM33322Ab4,CM33322Ab11,阴性对照抗体(TTCF特异的)或阳性对照抗体(BioLegend)的存在下温育全PBMC48小时。48小时后，清洗细胞并将其有51Cr标记的K562靶细胞以20:1,10:1,和5:1的效应器:靶比例温育4小时。4小时后通过51Cr释放对特异性裂解进行评估。如图54所示，在重组sMICA存在下，NK细胞杀灭活性被抗-MICA抗体所强化。
为了进一步确定分离抗-MICA是否促成细胞介导的细胞毒作用，将人NK细胞(效应器细胞)与黑色素瘤患者血清温育48小时。将PBMC与对照血清或含有可溶性MICA的黑色素瘤患者样品单独地或在100ug/ml指示抗体的存在下温育48小时(阴性同种型对照抗体(TTCF特异性)或阳性对照血清(BioLegend))。48小时后，清洗细胞并将其与51Cr标记的K562靶细胞以20:1的效应器:靶进行温育。4小时后通过闪烁计数对特异性裂解进行评估(图41-43)。这些数据进一步显示，CM24002Ab2,CM33322Ab29和CM33322Ab4可恢复NKG2D通路的抗肿瘤功能。
将全PBMC与对照血清或黑色素瘤血清单独地或在CM24002Ab2,CM33322Ab4或CM33322Ab11的存在下温育48小时(图52)。48小时后，清洗细胞并将其与51Cr标记的K562靶细胞以指示的效应器:靶比例进行温育。4小时后通过51Cr释放对特异性裂解进行评估。如图56中所证明的，在黑色素瘤血清的存在下，NK细胞杀灭活性被抗-MICA抗体所强化。
在进一步的实例中，CM24002Ab2和CM33322大大强化了NK细胞介导的K562肿瘤细胞的裂解，并且在所有效应器:靶比例下均比阳性对照鼠MICA抗体更加有效(图50)。
实施例10:抗-MICA抗体与α3MICA结构域的结合
NKG2D受体结合MICA顶部的α1和α2结构域，而与相同位点结合的抗体可能与NKG2D受体竞争，从而阻断NK细胞对肿瘤细胞的杀灭。与α3结构域结合的抗体特别令人感兴趣，因为它们不能阻断NKG2D受体结合。同时，这样的抗体会干扰MICA从肿瘤细胞表面的蛋白水解切离。使用先前所述的细胞计数珠子测定对抗-MICA抗体结合MICAα3结构域的能力进行了评估。生物素化的重组蛋白被捕获在链霉亲和素珠子上。然后，将珠子与10μg/ml的抗体CM24002Ab2、CM24002Ab4、CM33322Ab11、CM33322AB29、阴性对照抗体(TTCF特异的)、或阳性对照抗体(BioLegend)温育，随后与FITC标记的抗-人IgG第二抗体进行温育，并通过流式细胞术对结合于珠子的FITC荧光进行定量(图32)。如图32所示，CM33322Ab29与MICAα3结构域结合，因此具有极大的治疗应用前景。
实施例11:抗-MICA抗体与肿瘤细胞的结合
评估CM24002Ab2和CM33322Ab29用于靶定多种癌症的潜力。对包括多发性骨髓瘤(RPMI8226和Xg-1)、卵巢癌(OVCAR3)、急性髓细胞样白血病(U937)、黑色素瘤(K028)、肺癌(1792和827)、和乳腺癌(MCF7)细胞的一个组进行测试，考察其是否被CM24002Ab2和CM33322Ab29标记。将肿瘤细胞以1x106细胞/ml悬浮在含1％BSA的PBS中，用CM24002Ab2和CM33322Ab29以及阳性和阴性对照(分别是鼠MICA抗体和TTCF特异性抗体)(直接偶联)以10μg/ml的浓度在4℃下染色1小时。通过流式细胞术评估标记(图33)。CM24002Ab2和CM33322Ab29均结合所测试的每一种肿瘤细胞，对大多数测试细胞系的标记多于商品化阳性对照。
实施例11:抗-MICA抗体的MICA等位基因特异性
使用市售的Luminex测定系统来评估CM33322Ab29的等位基因特异性。商品化测试试剂盒含有与Luminex珠子直接偶联的重组MICA等位基因(MICA*001,*002,*007,*012,*017,*018,*027,*004,*009,和*015)，它们中每一个均具有内在的荧光性质，从而能够在单个样品中评估结合。将包被有指示MICA等位基因的Luminex珠子与10μg/ml的CM33322Ab29、BioLegend阳性对照、和阴性对照(TTCF)温育达1小时，随后用PE-偶联的抗-人IgG第二抗体温育。在与指示抗体温育60分钟、再与抗人的PE偶联的第二抗体温育之后，使用Luminex200设备确定荧光(图34)。CM33322Ab29在该商品化测定系统中能够与所有等位基因结合，表明它可以在患者中使用而不必考虑MICA基因型。
这些数据证明了CM24002Ab2和CM33322Ab29的高生物学活性及它们恢复NK细胞介导的肿瘤细胞裂解的能力。这些数据证明对免疫治疗有响应的癌症患者产生了MICA抗体，这些MICA抗体恢复了NK细胞抗肿瘤活性。总之，这样的数据突出展示了抗-MICA抗体在癌症患者体内克服免疫抑制和促进肿瘤破坏的治疗潜力。
实施例12.抗-MICA抗体的体外和体内生物活性
为了检查抗-MICA抗体对肿瘤生长的直接影响，使用鼠B16评估抗-MICA抗体的体外和体内生物活性。对于这个研究，转导B16鼠黑色素瘤细胞使之表达人MICA。使用流式细胞术检测细胞B16表面表达的MICA(图44)。
图45提供的一系列图证明，B16-MICA肿瘤下调脾NK细胞和肿瘤浸润性NK细胞上NKG2D的表达。通过流式细胞术测定从无肿瘤小鼠的脾脏或荷瘤动物的脾脏和肿瘤分离的NK细胞(CD3-,CD8-,CD335+)上的NKG2D表达。
图46显示，抗-MICA抗体处理降低B16-MICA荷瘤小鼠中的血清MICA水平。B16-MICA荷瘤B6小鼠用100ug或200ug/剂的CM33322Ab29通过尾静脉注射每周处理3次。初始处理后1周时，收集血液，并通过ELISA测量血清MICA。图47显示，施用抗-MICA抗体没有干扰通过夹心式ELIS对MICA的检测。将重组MICA与100倍过量的抗体旋转温育18小时。MICA浓度通过夹心式ELISA测定。
为了直接检查抗-MICA抗体对肿瘤生长的影响，向B16-MICA荷瘤小鼠施用抗-MCIA抗体CM33322Ab29。从肿瘤直径达到5mm时开始，用200ug/剂的小鼠IgG2a/κ同种型对照或抗-MICA抗体CM33322Ab29静脉内处理小鼠。剂量每周施用3次，并每天记录肿瘤体积。如图48所示，用抗-MCIA抗体CM33322Ab29处理B16-MICA荷瘤小鼠停止了肿瘤生长。这些数据显示了黑色素瘤细胞的体外和体内生长抑制，并显示抗-MICA抗体可能作为修饰宿主抗肿瘤响应并直接杀死肿瘤细胞的结果构成潜在的治疗策略。
实施例13.抗-MICA抗体减少MICA从肿瘤细胞脱落
检查CM24002Ab2和CM33322Ab29减少MICA从肿瘤细胞脱落的潜力。将RPMI-8226细胞在10ug/ml同种型对照抗体(TTCF-S1C1),CM33322Ab29,或CM24002Ab2的存在下进行培养。48小时后，清洗细胞，并通过流式细胞术确定MICA的表面表达。如图49所证明的，CM24002Ab2和CM33322Ab29减少了MICA从RPMI-8226细胞脱落。
在另一个实例中，检查了CM24002Ab2,CM33322Ab4,和CM33322Ab11减少MICA从肿瘤细胞脱落的潜力。将RPMI-8226细胞在同种型对照抗体(TTCF-S1C1)和CM24002Ab2,CM33322Ab4或CM33322Ab11的存在下进行培养。48小时后，清洗细胞，并通过流式细胞术确定MICA的表面表达。如图51所证明的，CM24002Ab2,CM33322Ab4,和CM33322Ab11减少了MICA从RPMI-8226细胞脱落。
实施例14.抗MICA抗体的表位定位
进行实验确定CM33322mAb29,CM3332211和CM33322mAb4的表位序列。简而言之，借助肽阵列进行表位定位，这些肽阵列含有一系列跨越MICA*009细胞外结构域全长的重叠肽。阵列中的每个肽是来自MICA*009参考序列(SEQIDNO:167)的长度为20个氨基酸的线性序列，其中每个后续序列与前一序列重叠10个氨基酸(具有10aa偏移量的20aa肽)。通过使用柔性接头使这些肽与玻片结合。将抗体与玻片温育，用Cy5偶联的抗-人IgG抗体检测与肽片段结合的抗体。用GenePix微阵列扫描仪评估与阵列斑点的结合。结果表明，单抗CM33322Ab4和CM33322Ab29与人MICA或MICB的α-3区结合。
结果表明，所有三种抗体均与人MICA的α3区内的表位相互作用，这些表位包含截然不同的连续氨基酸序列。MICA*009中的CM33322mAb29,CM3332211和CM33322mAb4的表位的氨基酸序列如图56A-56C所示。CM33322mAb29和CM33322mAb4的表位在MICA三维结构内的位置也在图57中示出。
结果表明，抗体CM33322mAb29所识别的表位具有邻接的氨基酸序列：GDVLPDGNGTYQTWVATRIC(SEQIDNO:168)，其对应于人MICASEQIDNO:167的氨基酸残基229-248(图56A)。抗体CM33322mAb11所识别的表位具有邻接的氨基酸序列：NVETEEWTP(SEQIDNO:169)，其对应于人MICASEQIDNO:167的氨基酸残基119-128(图56B)。抗体CM33322mAb4所识别的表位具有邻接的氨基酸序列：TVPPMVNVTR(SEQIDNO:170)，其对应于人MICASEQIDNO:167的氨基酸残基179-188(图56C)。
还通过Western印迹确定了单抗CM24002Ab2和CM33322Ab29与天然和变性MICA或MICB的结合。简而言之，实施如下实验。对人MICA或MICB进行变性或非变性PAGE电泳。结果表明，mAbCM24002Ab2和CM33322Ab29与天然MICA或MICB以及变性的蛋白结合，表明抗体与至少部分邻接的表位结合。
其它实施方案
应当理解，尽管结合其详细说明对本发明进行了描述，但是前面的描述仅是为了举例说明，并不限制本发明的范围，本发明的范围由附加权利要求的范围限定。其它的方面、优点和变化也在下文权利要求的范围之内。

Claims (56)

1.一种组合物，其包含与MHCI类多肽相关序列A(MICA)免疫特异性结合的肽，其中该肽包含表1所示的抗体ID11的VH的互补决定区(CDR)3，其中具有5个或更少的保守氨基酸取代；和表1所示的抗体ID11的VL的CDR3，其中具有5个或更少的保守氨基酸取代。
2.权利要求1的组合物，其中该肽包含表1所示的抗体ID11的VH的互补决定区(CDR)3，和表1所示的抗体ID11的VL的CDR3。
3.权利要求1-2中任一项的组合物，其中该肽包含表1所示的抗体ID11的VH的CDR2，其中具有5个或更少的保守氨基酸取代；或表1所示的抗体ID11的VL的CDR2，其中具有5个或更少的保守氨基酸取代；或上述两者。
4.权利要求3的组合物，其中该肽包含表1所示的抗体ID11的VH的互补决定区CDR2；或表1所示的抗体ID11的VL的CDR2；或上述两者。
5.权利要求1-4中任一项的组合物，其中该肽包含表1所示的抗体ID11的VH的CDR1，其中具有5个或更少的保守氨基酸取代；或表1所示的抗体ID11的VL的CDR1，其中具有5个或更少的保守氨基酸取代；或上述两者。
6.权利要求5的组合物，其中该肽包含表1所示的抗体ID11的VH的互补决定区CDR1；或表1所示的抗体ID11的VL的CDR1；或上述两者。
7.权利要求1-6中任一项的组合物，其中该肽是抗体或抗体片段，其包含：
与SEQIDNO:150具有同一性的VH链，其中对应于CDR1,CDR2,和CDR3的区域包含表1所示的抗体ID11的VH的CDR1,CDR2,和CDR3，且在CDR1,CDR2,和CDR3区内具有5个或更少的保守氨基酸取代，并且SEQIDNO:150中对应于FR1,FR2,FR3,FR4的区域包含与表1所示的抗体ID11的VH的FR1,FR2,FR3,FR4具有至少80％,85％,90％,95％,96％,97％,98,99％,或100％同一性的氨基酸序列；和
与SEQIDNO:152具有同一性的VL链，其中对应于CDR1,CDR2,和CDR3的区域包含表1所示的抗体ID11的VL的CDR1,CDR2,和CDR3，且在CDR1,CDR2,和CDR3区内具有5个或更少的保守氨基酸取代，并且SEQIDNO:152中对应于FR1,FR2,FR3,FR4的区域包含与表1所示的抗体ID11的VL的FR1,FR2,FR3,FR4具有至少80％,85％,90％,95％,96％,97％,98,99％,或100％同一性的氨基酸序列。
8.权利要求7的组合物，其中该肽是抗体或抗体片段，其包含：含有SEQIDNO:150的VH链和含有SEQIDNO:152的VL链。
9.权利要求1-8中任一项的组合物，其还包含抗癌治疗剂。
10.权利要求1-9中任一项的组合物，其配制成药物组合物。
11.一种治疗受试者体内癌症的方法，该方法包括向受试者施用权利要求1-10中任一项的组合物。
12.权利要求1-8中任一项的组合物，进一步包括选自下组的组蛋白去乙酰酶抑制剂(HDAC)：异羟肟酸、伏立诺他、辛二酰苯胺异羟肟酸(SAHA)、曲古抑菌素A(TSA)、LAQ824、帕比司他(LBH589)、贝利司他(PXD101)、ITF2357italfarmacoSpA、环状四肽、缩酚酸肽(罗米地辛，FK228)、苯甲酰胺；恩替诺特(SNDX-275/MS-275)、MGCD0103、短链脂族酸、丙戊酸、丁酸苯酯、AN-9、pivanex、CHR-3996，和CHR-2845。
13.权利要求1-8中任一项的组合物，还包括选自下组的蛋白酶体抑制剂：硼替佐米(bortezomib)、NPI-0052、卡非佐米(PR-171)、CEP18770和
MLN9708。
14.权利要求1-8中任一项的组合物，还包括选自下组的一种或多种其他作用剂：抗CTLA-4抗体或肽、抗PD-1抗体或肽、抗PDL-1抗体或肽、抗OX40抗体或肽、抗GITR抗体或肽、抗LAG-3抗体或肽、和抗TIM-3抗体或肽。
15.权利要求1-8中任一项的组合物，还包括选自下组的一种或多种用于治疗癌症的其他作用剂：化疗，放疗，细胞因子，趋化因子和其他生物信号分子，肿瘤特异性疫苗，细胞癌症疫苗(例如，经GM-CSF转导的肿瘤细胞)，肿瘤特异性单克隆抗体，自体和同种异体干细胞救援(例如，以增大移植物抗肿瘤效果)，分子靶向疗法，抗血管生成疗法和基因疗法。
16.一种组合物，其包含编码与MHCI类多肽相关序列A(MICA)或其上的表位免疫特异性结合的肽的核酸，其中该肽是抗体或抗体片段，其包含：
与SEQIDNO:2,77,96,113,131或150具有同一性的VH链，其中对应于CDR1,CDR2,和CDR3的区域包含表1所示的抗体ID1,6,7,8,9或11的VH的CDR1,CDR2,和CDR3，且在CDR1,CDR2,和CDR3区内具有5个或更少的保守氨基酸取代，并且SEQIDNO:2,77,96,113,131或150中对应于FR1,FR2,FR3,FR4的区域包含与表1所示的抗体ID1,6,7,8,9或11的VH的FR1,FR2,FR3,FR4具有至少80％,85％,90％,95％,96％,97％,98,99％,或100％同一性的氨基酸序列；和
与SEQIDNO:11,79,98,115,133,152或170具有同一性的VL链，其中对应于CDR1,CDR2,和CDR3的区域包含表1所示的抗体ID1,6,7,8,9或11的VL的CDR1,CDR2,和CDR3，且在CDR1,CDR2,和CDR3区内具有5个或更少的保守氨基酸取代，并且SEQIDNO:11,79,98,115,133,152或170中对应于FR1,FR2,FR3,FR4的区域包含与表1所示的抗体ID1,6,7,8,9或11的VL的FR1,FR2,FR3,FR4具有至少80％,85％,90％,95％,96％,97％,98,99％,或100％同一性的氨基酸序列。
17.一种组合物，其包含编码与MHCI类多肽相关序列A(MICA)或其上的表位免疫特异性结合的肽的核酸，其中该核酸包含与SEQIDNO:149具有至少大约75％,80％,90％,95％,99％或更高，或者完全的(100％)序列同一性的核苷酸序列。
18.一种组合物，其包含编码与MHCI类多肽相关序列A(MICA)或其上的表位免疫特异性结合的肽的核酸，其中该核酸包含与SEQIDNO:151具有至少大约75％,80％,90％,95％,99％或更高，或者完全的(100％)序列同一性的核苷酸序列。
19.一种分离的核酸，其包含与SEQIDNO:149具有至少大约75％,80％,90％,95％,99％或更高，或者完全的(100％)序列同一性的核苷酸序列。
20.一种分离的核酸，其包含与SEQIDNO:151具有至少大约75％,80％,90％,95％,99％或更高，或者完全的(100％)序列同一性的核苷酸序列。
21.一种分离的核酸，其包含编码肽的核苷酸序列，所述肽具有与SEQIDNO:150有至少大约80％,85％,90％,95％,96％,97％,98,99％,或100％同一性的氨基酸序列。
22.一种分离的核酸，其包含编码肽的核苷酸序列，所述肽具有与SEQIDNO:152有至少大约80％,85％,90％,95％,96％,97％,98,99％,或100％序列同一性的氨基酸序列。
23.一种嵌合抗原受体(CAR)，其包含与MHCI类多肽相关序列A(MICA)免疫特异性结合的肽，其中该肽包含表1所示的抗体ID1,6,7,8,9或11的VH的CDR3，其中具有5个或更少的保守氨基酸取代；和表1所示的抗体ID1,6,7,8,9或11的VL的CDR3，其中具有5个或更少的保守氨基酸取代。
24.权利要求23的嵌合抗原受体(CAR)，其中该肽包含表1所示的抗体ID1,6,7,8,9或11的VH的CDR3，和表1所示的抗体ID1,6,7,8,9或11的VL的CDR3。
25.权利要求23-24中任一项的嵌合抗原受体(CAR)，其中该肽包含表1所示的抗体ID1,6,7,8,9或11的VH的CDR2，其中具有5个或更少的保守氨基酸取代，和表1所示的抗体ID1,6,7,8,9或11的VL的CDR2，其中具有5个或更少的保守氨基酸取代，或上述两者。
26.权利要求23的嵌合抗原受体(CAR)，其中该肽包含表1所示的抗体ID1,6,7,8,9或11的VH的CDR2，或表1所示的抗体ID1,6,7,8,9或11的VL的CDR2，或上述两者。
27.权利要求23-26中任一项的嵌合抗原受体(CAR)，其中该肽包含表1所示的抗体ID1,6,7,8,9或11的VH的CDR1，其中具有5个或更少的保守氨基酸取代，或表1所示的抗体ID1,6,7,8,9或11的VL的CDR1，其中具有5个或更少的保守氨基酸取代，或上述两者。
28.权利要求27的嵌合抗原受体(CAR)，其中该肽包含表1所示的抗体ID1,6,7,8,9或11的VH的CDR1，或表1所示的抗体ID1,6,7,8,9或11的VL的CDR1，或上述两者。
29.权利要求23-27中任一项的嵌合抗原受体(CAR)，其中该肽是抗体或抗体片段，该抗体或抗体片段包含：
与SEQIDNO:2,77,96,113,131或150具有同一性的VH链，其中对应于CDR1,CDR2,和CDR3的区域包含表1所示的抗体ID1,6,7,8,9或11的VH的CDR1,CDR2,和CDR3，且在CDR1,CDR2,和CDR3区内具有5个或更少的保守氨基酸取代，并且SEQIDNO:2,149,168,186,或204中对应于FR1,FR2,FR3,FR4的区域包含与表1所示的抗体ID1,6,7,8或9的VH的FR1,FR2,FR3,FR4具有至少80％,85％,90％,95％,96％,97％,98,99％,或100％同一性的氨基酸序列；和
与SEQIDNO:11,79,98,115,133,或152具有同一性的VL链，其中对应于CDR1,CDR2,和CDR3的区域包括表1所示的抗体1的VL的CDR1,CDR2,和CDR3，且在CDR1,CDR2,和CDR3区内具有5个或更少的保守氨基酸取代，并且SEQIDNO:11,151,170,189,或206中对应于FR1,FR2,FR3,FR4的区域包含与表1所示的抗体1的VL的FR1,FR2,FR3,FR4具有至少80％,85％,90％,95％,96％,97％,98,99％,或100％同一性的氨基酸序列。
30.权利要求29的嵌合抗原受体(CAR)，其中该肽是抗体或抗体片段，其包括：包含SEQIDNO:2,77,96,113,131或150的VH链，和包含SEQIDNO:11,79,98,115,133,或152的VL链。
31.权利要求23的嵌合抗原受体(CAR)，进一步包括细胞外铰链区、T细胞受体跨膜结构域、和细胞内T细胞受体信号传导结构域。
32.权利要求23的嵌合抗原受体(CAR)，其中该肽包括CD137(4-IBB)信号传导结构域和CD3-ζ链。
33.编码权利要求21-30中任一项的嵌合抗原受体(CAR)的核酸分子。
34.一种人T细胞，其携带权利要求33的核酸分子。
35.一种治疗受试者体内癌症的方法，该方法包括向受试者施用权利要求34的T细胞，其中该T细胞是被修饰从而表达嵌合抗原受体(CAR)的自体T细胞。
36.一种编码肽的载体，所述肽包括表1所示的抗体ID1,6,7,8,9或11的VH的互补决定区CDR3，其中具有5个或更少的保守氨基酸取代，和表1所示的抗体ID1,6,7,8,9或11的VL的互补决定区CDR3，其中具有5个或更少的保守氨基酸取代。
37.权利要求36的载体，其中该肽包含表1所示的抗体ID1,6,7,8,9或11的VH的互补决定区CDR3，和表1所示的抗体ID1,6,7,8,9或11的VL的互补决定区CDR3。
38.权利要求36-37中任一项的载体，其中该肽包括表1所示的抗体ID1,6,7,8,9或11的VH的CDR2，其中具有5个或更少的保守氨基酸取代，或表1所示的抗体ID1,6,7,8,9或11的VL的CDR2，其中具有5个或更少的保守氨基酸取代，或上述二者。
39.权利要求38的载体，其中该肽包含表1所示的抗体ID1,6,7,8,9或11的VH的CDR2，或表1所示的抗体ID1,6,7,8,9或11的VL的CDR2，或上述二者。
40.权利要求36-39中任一项的载体，其中该肽包括表1所示的抗体ID1,6,7,8,9或11的VH的CDR1，其中具有5个或更少的保守氨基酸取代，或表1所示的抗体ID1,6,7,8,9或11的VL的CDR1，其中具有5个或更少的保守氨基酸取代，或上述二者。
41.权利要求40的载体，其中该肽包含表1所示的抗体ID1,6,7,8,9或11的VH的CDR1，或表1所示的抗体ID1,6,7,8,9或11的VL的CDR1，或上述二者。
42.权利要求36-41中任一项的载体，其中该肽是抗体或抗体片段，该抗体或抗体片段包含：
与SEQIDNO:2,77,96,113,131或150具有同一性的VH链，其中对应于CDR1,CDR2,和CDR3的区域包括表1所示的抗体ID1,6,7,8或9的VH的CDR1,CDR2,和CDR3，且在CDR1,CDR2,和CDR3区内具有5个或更少的保守氨基酸取代，并且SEQIDNO:2,149,168,186,或204中对应于FR1,FR2,FR3,FR4的区域包含与表1所示的抗体ID1,6,7,8或9的VH的FR1,FR2,FR3,FR4具有至少80％,85％,90％,95％,96％,97％,98,99％,或100％同一性的氨基酸序列；和
与SEQIDNO:11,79,98,115,133或152具有同一性的VL链，其中对应于CDR1,CDR2,和CDR3的区域包括表1所示的抗体1的VL的CDR1,CDR2,和CDR3，且在CDR1,CDR2,和CDR3区内具有5个或更少的保守氨基酸取代，并且SEQIDNO:11151,170,189,或206中对应于FR1,FR2,FR3,FR4的区域包含与表1所示的抗体1的VL的FR1,FR2,FR3,FR4具有至少80％,85％,90％,95％,96％,97％,98,99％,或100％同一性的氨基酸序列。
43.权利要求42的载体，其中该肽是抗体或抗体片段，该抗体或抗体片段包括：包含SEQIDNO:2,77,96,113,131或150的VH链，和包含SEQIDNO:11,79,98,115,133,或152的VL链。
44.权利要求36-43中任一项的载体，其中该载体是腺病毒载体。
45.一种与MHCI类多肽相关序列A(MICA)免疫特异性结合的抗体或其片段，其中该抗体或其片段包括：
重链可变区(VH)，其包括如SEQIDNO:150的VH序列中所示的VHCDR1,VHCDR2,和VHCDR3；和
轻链可变区(VL)，其包括如SEQIDNO:152的VL序列中所示的VLCDR1,VLCDR2,和VLCDR3。
46.权利要求45的抗体或片段，其中该VH区包括：
VHCDR1，其包含SEQIDNO:154；
VHCDR2，其包含SEQIDNO:156；和
VHCDR3，其包含SEQIDNO:158，
或其在VHCDR1、CDR2和/或CDR3中具有5个或更少的保守氨基酸取代的变体；和
47.权利要求46的抗体或片段，其中该VL区包括：
VLCDR1，其包含SEQIDNO:161，
VLCDR2，其包含SEQIDNO:163，和
VLCDR3，其包含SEQIDNO:165，
或其在VLCDR1,CDR2,和/或CDR3中具有5个或更少的保守氨基酸取代的变体。
48.权利要求47的抗体或片段，其中所述VH区包含SEQIDNO:150所示的氨基酸序列或其在不位于CDR内的残基中具有5个或更少的保守氨基酸取代的变体，并且所述VL区包括SEQIDNO:152所示的氨基酸序列或其在不位于CDR内的残基中具有5个或更少的保守氨基酸取代的变体。
49.权利要求48的抗体或片段，其中所述抗体包含如SEQIDNO:150的VH序列中所示的VH；和如SEQIDNO:152的VL序列中所示的轻链可变区(VL)。
50.权利要求45-49中任一项的抗体或片段，其中该抗体是人源的、人源化的或嵌合的。
51.一种与MHCI类多肽相关序列A(MICA)免疫特异性结合的抗体或其片段，其中该抗体包含：
重链可变区(VH)CDR1，其包含SEQIDNO:154中所示的氨基酸序列，
VHCDR2，其包含SEQIDNO:156中所示的氨基酸序列，和
VHCDR3，其包含SEQIDNO:158中所示的氨基酸序列，或其中具有5个或更少的保守氨基酸取代的变体。
52.权利要求51的抗体或片段，其中该抗体包括：
轻链可变区(VL)CDR1，其包含SEQIDNO:161中所示的氨基酸序列，
VLCDR2，其包含SEQIDNO:163中所示的氨基酸序列，和
VLCDR3，其包含SEQIDNO:165中所示的氨基酸序列，或者其在VLCDR1,CDR2,和/或CDR3中具有5个或更少的保守氨基酸取代的变体。
53.一种分离的抗体或其片段，其包括重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中该VH区包含SEQIDNO:150的氨基酸序列，并且该VL区包含SEQIDNO:152的氨基酸序列。
54.权利要求36-43中任一项的载体，其中该载体是质粒或病毒载体。
55.权利要求54的载体，其中该病毒载体选自下组：痘病毒，腺病毒，逆转录病毒，疱疹病毒，和腺相关病毒。
56.权利要求36-43中任一项的载体，其中该载体是表达载体。
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