CN113637077B - 一种抗mica的抗体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种抗MICA的抗体及其应用，本发明的抗体具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的重链可变区。本发明还涉及编码抗体的核酸分子、载体、宿主细胞、衍生物与制备方法。本发明的抗体可用于制备MICA的检测试剂盒和治疗肿瘤的药物。

Description

一种抗MICA的抗体及其应用
技术领域
本发明属于细胞免疫学、分子生物学领域，涉及一种抗MICA的抗体及其应用。
背景技术
MHC I类多肽相关序列A（MICA）是一种高度多态性的细胞表面糖蛋白，由位于MHC基因座内的MICA基因编码。MICA有应激诱导自身抗原的作用，并作为KLRK1/NKG2D杀伤激活受体的配体。NKG2D-MICA的参与导致T细胞和NK细胞对在其表面表达MICA的上皮肿瘤细胞（或其他应激细胞）的效应细胞溶解反应的激活。作为一种防御机制，肿瘤细胞能够通过二硫键异构酶（ERp5）和ADAM（去整合素和金属蛋白酶）和靶向膜近端α3结构域的MMP（基质金属蛋白酶）蛋白酶的合作，水解脱落表面表达的蛋白质来避免免疫系统对MICA的识别。肿瘤患者血清中高水平的MICA与肿瘤大小和预后不良呈正相关。因此，开发抗MICA抗体，将其结合于MICA上接近ERp5结合位点的区域和/或将MICA保留在细胞表面处以使得该MICA可高效地接合NKG2D，从而引起患者中的抗肿瘤活性增强。
发明内容
本发明提供了一种抗MICA的抗体或其抗原结合部分，其包含含CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区，其中，重链可变区的CDR1包含SEQ ID NO.1所示的序列中的CDR1或其保守修饰形式的氨基酸序列；重链可变区的CDR2包含SEQ ID NO.1所示的序列中的CDR2或其保守修饰形式的氨基酸序列；重链可变区的CDR3包含SEQ ID NO.1所示的序列中的CDR3或其保守修饰形式的氨基酸序列。
具体地，重链可变区的CDR1序列如SEQ ID NO.2所示，重链可变区的CDR2序列如SEQ ID NO.3所示，重链可变区的CDR3序列如SEQ ID NO.4所示。
进一步，本发明的抗MICA的抗体或其抗原结合部分还包含SEQ ID NO.1所示的重链可变区中的框架区FR1-FR4。
进一步，本发明的抗MICA的抗体或其抗原结合部分包含SEQ ID NO.1所示的重链可变区或与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列具有至少80%同源性的氨基酸序列。
本发明的所述抗体选自下组：单克隆抗体、单链抗体、嵌合抗体、人源化抗体和全人源抗体。
在本发明的具体实施例中，所述抗体是纳米抗体。
本发明还提供了编码前面所述的抗MICA的抗体或其抗原结合部分的核酸分子。
可以使用标准分子生物学技术来获得本发明的核酸分子。一旦获得编码VH区段的DNA片段，进一步通过标准重组DNA技术操作这些DNA片段，以例如将可变区基因转变为全长抗体链基因、或抗原结合部分DNA片段。在这些操作中，将编码VH的DNA片段可操作的连接至编码另一蛋白质，诸如抗体恒定区或柔性接头的另一DNA片段。术语“可操作的连接”在用于本文时意图表示连接两DNA片段从而使得这两个DNA 片段所编码的氨基酸序列保持在同一读码框中(in-frame)。
通过将编码VH的DNA可操作的连接至编码重链恒定区(CH1、CH2和 CH3)的另一DNA分子可以将编码VH区的分离的DNA转变为全长重链基因。人重链恒定区基因的序列是本领域已知的。
本发明还提供了包含所述核酸分子的载体。
本发明还提供了包含前面所述的核酸分子或前面所述的载体的宿主细胞。
可用于本发明的载体包括质粒、表达载体、克隆载体、病毒载体等。可选用本领域已知的各种载体。比如，选用市售的载体，然后将编码本发明的抗体的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，可以形成表达载体。
可用于本发明的宿主细胞包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。用于表达抗体的宿主细胞包括大肠杆菌、酵母细胞、昆虫细胞、COS细胞、CHO细胞等。较佳地，该宿主细胞是原核细胞，更佳地是大肠杆菌细胞。
本发明还提供了一种制备抗MICA的抗体或其抗原结合部分的方法，所述方法包括以下步骤：在适合产生抗体的条件下，培养前面所述的宿主细胞，从而获得含所述抗MICA抗体的培养物；以及从所述培养物中分离或回收所述的抗MICA抗体。
本发明还提供了一种抗体噬菌体，所述噬菌体表面展示前面所述的抗MICA的抗体或其抗原结合部分。
所述的噬菌体是商业化噬菌体，即是常规用于进行蛋白展示的噬菌体。例如，所述的噬菌体是M13丝状噬菌体。
本发明还提供了一种双特异性抗体，其包含前面所述的抗MICA抗体或其抗原结合部分；以及与所述抗体或其抗原结合部分功能性连接的具有另一种抗原结合特性的抗体或抗原结合部分。
所述功能性连接包括例如通过化学偶联、基因融合、非共价结合或其它方式连接。
本发明还提供了一种偶联物或缀合物，其包含：
1）前面所述的抗体或其抗原结合部分；
2）与所述抗体或其抗原结合部分偶联或缀合的治疗剂或诊断剂。
所述治疗剂包括细胞毒素、药物、放射性毒素。
所述诊断剂包括放射性核素、造影剂、荧光剂、化学发光剂、生物发光剂、顺磁性离子、酶、光敏诊断剂。
细胞毒素或细胞毒剂包括对细胞有害(例如杀伤细胞)的任何试剂。实例包括紫杉醇、松胞菌素B、短杆菌肽D、溴化乙啶、依米丁、丝裂霉素, 依托泊苷、替尼泊苷、长春新碱、长春碱、秋水仙素、多柔比星、柔红霉素、二羟基炭疽菌素二酮、米托蒽醌、光神霉素、放线菌素D、1-去氢睾酮、糖皮质激素类、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔和嘌呤霉素，及其类似物或同系物。
治疗剂还包括例如抗代谢物类( 例如甲氨蝶呤、6 - 巯基嘌呤、6 - 硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、5 - 氟尿嘧啶、达卡巴嗪(decarbazine))、烷化剂类(例如双氯乙基甲胺、塞替哌(thioepa)、苯丁酸氮芥、美法仑、卡莫司汀(BSNU) 和洛莫司汀(CCNU)、环磷酰胺(cyclothosphamide)、白消安、二溴甘露醇、链唑霉素、丝裂霉素C、和顺式二氯二胺铂(II)(DDP)顺铂)、蒽环类抗生素 (例如柔红霉素(以前称为道诺霉素)和多柔比星)、抗生素类(例如放线菌素D(以前称为放线菌素)、博来霉素、光神霉素、和氨茴霉素(AMC))、和抗有丝分裂剂(例如长春新碱和长春碱)。duocarmycin、加利车霉素、美登素和auristatin，及其衍生物。
利用本领域现有的接头技术可以将细胞毒素偶联至本发明的抗体。已经用于将细胞毒素偶联至抗体的接头类型的实例包括但不限于腙、硫醚、酯、二硫化物和含肽的接头。
本发明的抗体还可以与放射性同位素偶联以生成细胞毒性放射性药物。可以与抗体偶联以用于诊断或治疗的放射性同位素的实例包括但不限于碘131、铟111、钇90和镥177。
可用于本发明的放射性核素包括110In、111In、177Lu、18F、52Fe、62Cu、64Cu、67Cu、67Ga、68Ga、86Y、90Y、89Zr、94mTc、94Tc、99mTc、120I、123I、124I、125I、131I、154-158Gd、32F、11C、13N、15O、186Re、188Re、51Mn、52mMn、55Co、72As、75Br、76Br、82mRb、83Sr或其它γ发射体、β发射体或正电子发射体。
可用于本发明的顺磁性离子包括：铬( III )、锰( II )、铁( III )、铁( II )、钴( II )、镍( II )、铜( II )、钕( III )、钐( III )、镱( III )、钆( III )、钒( II )、铽( III )、镝( III )、钬( III )和铒( III )。
可用于本发明的荧光标记化合物包括异硫氰酸荧光素、罗丹明、藻红蛋白、藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白、邻苯二甲醛和荧光胺。
可用于本发明的化学发光标记化合物包括鲁米诺、异鲁米诺、芳族吖啶酯、咪唑、吖啶盐和草酸酯。
可用于本发明的生物发光化合物包括荧光素、荧光素酶和水母发光蛋白。
可用于本发明的酶包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酯酶、葡萄糖氧化酶、β-D-半乳糖苷酶、脲酶、过氧化氢酶、或葡萄糖淀粉酶。
本发明还提供了一种检测MICA的产品，所述产品包括前面所述的抗体或其抗原结合部分、前面所述的抗体噬菌体、前面所述的双特异性抗体或前面所述的偶联物或缀合物。
所述产品包括利用酶联免疫吸附法、免疫荧光检测法、放射免疫法、发光免疫测定法、胶体金免疫层析法、凝集法、免疫比浊法检测抗原抗体结合的产品。
所述产品的具体实例包括试剂盒。所述试剂盒中还包括固相载体，所述抗体或抗体噬菌体被固定于固相载体(如多孔板、盖玻片、微珠)或游离存在。
进一步，所述试剂盒中还包括：
能与所述的抗体连接的可检测部分，可检测部分可分离地存在于试剂盒中；和/或与可检测部分相对应的底物；和/或酶联免疫反应试剂(包括但不限于：包被(缓冲)液，洗涤(缓冲)液，封闭液，固定液，终止液，显色液)；和/或说明检测MICA的方法的使用说明书。
本发明还提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括：前面所述的抗体或其抗原结合部分、前面所述的抗体噬菌体、前面所述的双特异性抗体或前面述的偶联物或缀合物；以及药学上可接受的载体。
在用于本文时，“药学上可接受的载体”包括任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂、等等生理学相容的载体。优选的是，载体适于静脉内、肌肉内、皮下、胃肠外、脊髓或表皮施用(例如通过注射或输注)。根据施用路径，活性成分（抗体或其抗原结合部分、偶联物/缀合物或双特异性分子），可以包被在一种物质中，以保护活性成分不受酸和可以使该活性成分失活的其它天然条件的作用。
药物组合物在生产和贮存条件下通常必须是无菌的和稳定的。可以将药物组合物配制成溶液、微乳液、脂质体、或适于高药物浓度的其它有序结构。载体可以是包含例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、和液体聚乙二醇等等)及其合适混合物的溶剂或分散介质。
例如通过使用涂层诸如卵磷脂，在分散体的情况中通过维持期望颗粒大小，及通过使用表面活性剂，可以保持适当的流动性。在许多情况中，优选在组合物中包含等渗剂，例如糖类、多元醇诸如甘露醇、山梨醇、或氯化钠。通过在组合物中包含延迟吸收的试剂，例如单硬脂酸盐和明胶，可以造成可注射组合物的延长吸收。
本发明的药物组合物可以包括但不限于液体、冷冻和冻干组合物。
本发明的药物组合物还可以以联合疗法施用，即联合其它药剂。
本发明还提供了一种用于非治疗目的的检测待测样品中MICA存在情况的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：以前面所述的抗体或其抗原结合部分、前面所述的双特异性抗体或前面所述的抗体噬菌体作为MICA的检测抗体，通过抗原抗体反应来检测待测样品中MICA的存在情况。
所述方法为非诊断性方法。较佳地，用于检测来自人体或动物体以外的样品(如水、药品、食品、农药、饲料、饮品、保健品等)中的MICA。
本发明还提供了前面所述的抗体或其抗原结合部分、前面所述的双特异性抗体、前面所述的偶联物或缀合物，或前面所述的抗体噬菌体在制备MICA检测产品中的应用。
本发明还提供了前面所述的抗体或其抗原结合部分、前面所述的抗体噬菌体、前面所述的双特异性抗体或前面所述的偶联物或缀合物在制备用于治疗MICA介导的疾病的药物中的用途；所述疾病包括肿瘤；所述肿瘤包括实体瘤或血液瘤。
本发明还提供了前面述的抗体噬菌体在筛选特异性结合MICA的抗体中的应用。
本发明还提供了前面所述的抗体噬菌体在筛选治疗MICA介导的疾病的药物中的应用，所述疾病包括肿瘤；所述肿瘤包括实体瘤或血液瘤。
在本申请中，术语“纳米抗体”是指缺失轻链的重链抗体(如：来源于骆驼体内)克隆其可变区得到的单域抗体，是最小的功能性抗原结合片段，相对分子质量(Mr)仅约为15000。纳米抗体具有分子质量小、稳定性强、可溶性好、易表达，免疫原性低等特点。
在本申请中，术语“抗原结合部分”通常是指一个与抗原结合或与抗原结合（即特异性结合）的完整抗体（即与它们所衍生的完整抗体）竞争的免疫球蛋白或抗体的多肽片段。所述抗原结合片段可以包括但不限于：Fab、Fab’、F(ab’)2和Fv片段，线性抗体，单链抗体，双体抗体，以及由抗体片段形成的多特异性抗体。
在本申请中，术语“保守序列修饰”意图指氨基酸修饰不会显著影响或改变含有该氨基酸序列的抗体的结合特征。此类保守修饰包括氨基酸的取代、添加和缺失。修饰可以通过本领域已知的标准技术，例如定点诱变和PCR 介导的优点引入到本发明的抗体中。保守氨基酸取代指氨基酸残基用具有类似侧链的氨基酸残基替换。本领域中对具有类似侧链的氨基酸残基家族已有详细说明。这些家族包括具有碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β-分支侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因此，可以用来自同一侧链家族的其它氨基酸残基替换本发明抗体CDR区中的一个或多个氨基酸残基。
本发明的抗体进一步可以使用具有一个或多个本文所公开的VH序列的抗体作为起始材料来工程改造修饰后的抗体进行制备，其中所述修饰后的抗体可以具有与起始抗体不同的特性。抗体可以通过修饰可变区，例如一个或多个CDR区中和/或一个或多个框架区中的一个或多个残基来进行工程改造。另外/或者，抗体可以通过修饰恒定区中的残基以例如改变抗体的效应器功能来进行工程改造。
可以去除本发明的抗体经工程改造后的修饰抗体的糖基化。例如可以制备无糖基化的(aglycoslated)抗体(即抗体缺少糖基化)。可以改变糖基化以例如提高抗体对抗原的亲和力。此类碳水化合物修饰可以通过例如改变抗体序列中的一个或多个糖基化位点来实现。例如，进行一个或多个氨基酸的取代以除去一个或多个可变区框架糖基化位点，进而除去该位点的糖基化。此类无糖基化可以提高抗体对抗原的亲和力。
本发明所设想的抗体的另一修饰是PEG化。抗体可以PEG化以例如延长抗体的生物学(例如血清)半衰期。为PEG化抗体，通常在使得一个或多个PEG基团附着于抗体或抗体片段的条件下将抗体或其片段与聚乙二醇 (PEG)，诸如PEG的反应性酯或醛衍生物进行反应。优选的是，PEG化可以通过与反应性PEG分子(或类似的反应性水溶性聚合物)的酰化反应或烷化反应进行。在用于本文时，术语“聚乙二醇”意图包括任何形式的已经用于衍生化其它蛋白质的PEG，诸如单(C1-C10)烷氧基-或芳氧基-聚乙二醇或聚乙二醇-马来酰亚胺。在某些实施方式中，待PEG化的抗体是无糖基化的抗体。PEG化蛋白质的方法是本领域已知的，可以用于本发明的抗体。参见例如 Nishimura等人的EP 0 154 316和Ishikawa等人的EP 0401 384。
在本申请中，术语“肿瘤”通常是指由异常细胞生长形成的赘生物或实体病变。在本申请中，肿瘤可以是实体瘤或血液瘤。
本发明的肿瘤的非限制性实例包括B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、骨髓瘤、白血病、造血系肿瘤、胸腺瘤、淋巴瘤、肉瘤、肺癌、肝癌、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、皮肤癌、子宫癌、子宫颈癌、子宫内膜癌、腺癌、乳腺癌、胰腺癌、结肠直肠癌、肛门癌、肺癌、肾癌、膀胱癌、肝癌、前列腺癌、卵巢癌、原发性或转移性黑色素瘤、鳞状细胞癌、基底细胞癌、脑癌、血管肉瘤、血管内皮瘤、头颈癌、甲状腺癌、软组织肉瘤、骨肉瘤、睾丸癌、胃肠道癌以及任何其他现在已知或以后发现的癌症(参见，例如Rosenberg(1996)《医学年鉴》47：481-491，其全部内容通过引用并入本文)。
在本申请中，术语“可变区”是指抗体重链的一部分，一般包括重链中的大约氨基末端的120-130个氨基酸。可变区一般在氨基酸序列中，甚至在相同物种的抗体中广泛不同。抗体的可变区一般决定其特定抗原的每种特定抗体的结合和特异性。序列的可变性集中在那些称作互补决定区（CDRs）的区域中，而可变区中保守性更高的区域称作构架区（FR）。重链的CDRs含有负责抗体与抗原的直接相互作用的氨基酸，而FRs中的氨基酸可以显著影响抗原结合/识别。
在本申请中，术语“MHC I类多肽相关序列A”或“MICA”是指非经典主要组织相容性复合体（MHC）I类分子。MICA可以为锚定于细胞膜上的天然表达的经糖基化且多态的蛋白质。MICA为NKG2D的配体，该NKG2D为在自然杀伤（NK）细胞、CD8 T细胞和/或γδT细胞的表面上表达的受体。在本申请中，术语“MICA”包括MICA的任何变体或同工型，其可以由包括但不限于肿瘤细胞的细胞天然表达。MICA或其任何变体及同工型可以自天然表达其的细胞或组织分离或可以使用本领域技术人员熟知的技术以重组方式产生。在本申请中，所述MICA为人MICA，在某些实施方式中，所述人MICA可以包括人MICAα3*001蛋白，其中MICAα3*001的序列信息参考AAB41060.1；在某些实施方式中，所述人MICA可以包括MICAα3*008蛋白，其中MICAα3*008的序列信息参考AAB41067.1。
在本申请中，术语“治疗”包括疾病治愈、抑制或延缓疾病的发展或进展，减轻和/或稳定疾病状态。
附图说明
图1显示的是本申请所述真核表达载体pCMV-163的物理图谱示意图；
图2显示的是本申请所述3E5抗体与靶抗原和的结合情况的结果图，其中，A：His-MICAα3*001；B：His-MICAα3*008；
图3显示的是本申请所述3E5抗体与U937细胞表面抗原的结合情况的结果图；
图4显示的是本申请所述3E5抗体对U937细胞的ADCC活性的结果图。
具体实施方式
下面通过实施例进一步说明本发明。应该理解的是，本发明的实施例是用于说明本发明而不是对本发明的限制。根据本发明的实质对本发明进行的简单改进都属于本发明要求保护的范围。
实施例1 抗MICA的纳米抗体制备
1、噬菌体技术筛选特异性结合MICA的纳米抗体
将用哺乳动物细胞-中国仓鼠卵巢细胞ExpiCHO-S（Thermo Fisher，货号：A29127）表达的人MICA*001蛋白（人MICA*001蛋白α3结构域-人IgG1 Fc段融合蛋白，命名为MICAα3*001，其中MICA*001的序列信息参考AAB41060.1，人IgG1 Fc片段的序列参考AEO21920.1）常规免疫羊驼（北京格根生物科技有限公司）。四轮免疫后检测血清效价，效价合格后，抽取外周血，分离PBMC进行RNA提取，逆转录为cDNA后通过引物扩增抗体基因，构建抗体文库，利用噬菌体展示技术进行抗体筛选。
2、纳米抗体的制备
将噬菌体展示库筛选得到阳性克隆进行密码子优化后，克隆到含有人IgG恒定区基因的真核表达载体pCMV-163中，构建全抗体表达载体，其物理图谱如图1所示（真核表达载体pCMV-163的各个组成成分均为本领域已知的成分，按照所示次序重组而成）。纳米抗体称为3E5（序列如SEQ ID NO.1所示）。将获得的3E5真核表达载体，使用GibcoExpiFectamine CHO Transfection kit 转染至CHO-S细胞中进行表达，收集含有目的蛋白的细胞培养上清，经过ELISA试验利用羊抗人IgG（Affinity Purified Antibody To HumanIgG(H+L)，KPL公司）以及辣根酶标记的羊抗人IgG（Goat Anti human IgG HRP，ThermoFisher Scientific）进行双夹心ELISA法检测上清中抗体的含量，利用常规的Protein A亲和纯化目标抗体。
实施例2 纳米抗体结合靶抗原
将靶抗原His-MICAα3*001（In-house）和His-MICAα3*008（系列信息参考 AAB41067.1） （In-house）分别包被ELISA板条，
Figure 410671DEST_PATH_IMAGE001
，37℃包被2小时；PBST洗涤后，加入 10%的胎牛血清，37℃封闭1小时；加入不同浓度的3E5嵌合抗体，37℃反应1小时；PBST洗涤 后，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗人Fc二抗（Goat anti-Human IgG Fc Cross-Adsorbed Secondary Antibody, HRP, Invitrogen），37℃反应30分钟；PBST重复洗板5遍，在吸水纸 上尽量拍干残留液滴；每孔加入
Figure 552940DEST_PATH_IMAGE002
，室温（20±5℃）避光放置2~3分钟； 每孔加入
Figure 703298DEST_PATH_IMAGE003
终止液终止底物反应，酶标仪450 nm处读取OD值，分析抗体与靶抗 原His-MICAα3*001和*008的结合能力。
结果如图2所示，3E5抗体能特异性识别靶抗原His-MICAα3*001和*008；该识别活性呈显著的剂量依赖性。
实施例3 纳米抗体特异性识别U937细胞表面抗原
利用流式分析技术检测U937细胞表面MICA与3E5的结合。收集对数生长期的U937细胞，按照每管5×105个细胞加至1.5 ml EP管中；加入不同浓度的嵌合抗体，冰上避光孵育30分钟；FACS洗液洗涤后，加入PE荧光标记的羊抗人IgG Fc二抗（Goat Anti-Human IgGFc Secondary Antibody，PE，Invitrogen），冰上避光孵育30分钟；FACS洗液洗涤2遍；每管加入400 μl 1%多聚甲醛固定液（Solarbio）固定细胞，混匀后上机检测PE荧光的相对荧光强度，分析抗体与U937细胞的结合能力。
结果如图3显示，3E5抗体能特异性识别U937细胞表面MICA，与阳性对照IPH4301（来源：专利号WO2013117647A1，重链可变区序列如SEQ ID NO.5，轻链可变区序列如SEQ IDNO.6）相比，3E5结合U937细胞表面MICA的能力更强。
实施例4 纳米抗体在U937细胞上的ADCC活性
收集对数生长期的U937靶细胞，按2×104个细胞/孔加入到白色透明底96孔板（96-well Black/Clear and White/Clear Bottom Polystyrene Microplates, Corning）中；向细胞中分别加入不同浓度的嵌合抗体；按效/靶比20:1加入Jurkat-hFcγRⅢa-NFAT效应细胞，将96孔板置于37℃ 5% CO2培养箱中培养6小时；每孔加入100 μl荧光素酶检测试剂（Bright-Lumi™萤火虫萤光素酶报告基因检测试剂盒，碧云天），室温避光孵育10 min后，多功能酶标仪检测化学发光的相对荧光强度值，分析3E5抗体在U937细胞上介导ADCC的活性。
结果如图4所示，图4显示3E5抗体能介导对U937细胞的ADCC；与阳性对照IPH4301相比，3E5抗体的ADCC活性更强。
虽然以上仅描述了本发明的具体实施方式范例，但是本领域的技术人员应当理解，这些仅是举例说明，本发明的保护范围是由所附权利要求书限定的。本领域的技术人员在不背离本发明的原理和实质的前提下，可以对这些实施方式做出多种变更或修改，但这些变更或修改均落入本发明的保护范围。
序列表
<110> 尚健单抗（北京）生物技术有限公司
<120> 一种抗MICA的抗体及其应用
<141> 2021-10-12
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Gln Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Asp Asp Tyr
20 25 30
Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Leu Gly Lys Glu Arg Glu Glu Arg
35 40 45
Glu Gly Val Ala Cys Ile Ser Ser Ser Asp Arg Ser Thr Tyr Tyr Ala
50 55 60
Asp Pro Val Lys Gly Arg Phe Ala Ile Ser Ser Asp Asn Ala Lys Ser
65 70 75 80
Thr Val Tyr Leu Gln Met Thr Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val
85 90 95
Tyr Tyr Cys Ala Arg Leu Ser Arg Cys Ser Gly Tyr Gly Pro Tyr Thr
100 105 110
Leu Trp Asn Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 2
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Phe Asp Asp Tyr Ala Ile Gly Trp
1 5
<210> 3
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Ile Ser Ser Ser Asp Arg Ser Thr
1 5
<210> 4
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Ala Arg Leu Ser Arg Cys Ser Gly Tyr Gly Pro Tyr Thr Leu Trp Asn
1 5 10 15
<210> 5
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp
20 25 30
Tyr Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Phe Val Ser Tyr Ser Gly Thr Thr Lys Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Ser Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe
65 70 75 80
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Gly Tyr Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 6
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Thr Ser Ser Ile Ser Ser Ile
20 25 30
Tyr Phe His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Arg Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Thr Thr Ile Pro
85 90 95
Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105

Claims (13)

1.一种抗MICA的纳米抗体或其重链可变区，其包含SEQ ID NO.1所示的重链可变区中的互补决定区CDR1-CDR3。
2.根据权利要求1所述的纳米抗体或其重链可变区，其特征在于，所述纳米抗体包含SEQ ID NO.1所示的重链可变区。
3.分离的核酸分子，其编码权利要求1或2所述的纳米抗体或其重链可变区。
4.包含权利要求3所述的核酸分子的载体。
5.包含权利要求3所述的核酸分子或权利要求4所述的载体的宿主细胞。
6.一种制备抗MICA的纳米抗体的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：在适合产生纳米抗体的条件下，培养权利要求5所述的宿主细胞，从而获得含所述抗MICA的纳米抗体的培养物；以及从所述培养物中分离或回收所述的抗MICA的纳米抗体。
7.一种双特异性抗体，其特征在于，所述双特异性抗体包括：
1）权利要求1或2所述的纳米抗体或其重链可变区；
2）与所述纳米抗体或其重链可变区功能性连接的具有另一种抗原结合特性的抗体或抗原结合部分。
8.一种偶联物或缀合物，其包含：
1）权利要求1或2所述的纳米抗体或其重链可变区；
2）与所述纳米抗体或其重链可变区偶联或缀合的治疗剂或诊断剂。
9.根据权利要求8所述的偶联物或缀合物，其特征在于，所述治疗剂包括细胞毒素、药物、放射性毒素；所述诊断剂包括放射性核素、造影剂、荧光剂、化学发光剂、生物发光剂、顺磁性离子、酶、光敏诊断剂。
10.一种检测MICA的产品，其特征在于，所述产品包括权利要求1或2所述的纳米抗体或其重链可变区、权利要求7所述的双特异性抗体或权利要求8所述的偶联物或缀合物。
11.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括：
1）权利要求1或2所述的纳米抗体或其重链可变区、权利要求7所述的双特异性抗体或权利要求8所述的偶联物或缀合物；
2）药学上可接受的载体。
12.一种用于非治疗目的的检测待测样品中MICA存在情况的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：以权利要求1或2所述的纳米抗体或其重链可变区、权利要求7所述的双特异性抗体作为MICA的检测抗体，通过抗原抗体反应来检测待测样品中MICA的存在情况。
13.一种应用，其包含以下任一项所述的应用：
1）权利要求1或2所述的纳米抗体或其重链可变区、权利要求7所述的双特异性抗体、权利要求8所述的偶联物或缀合物在制备MICA检测产品中的应用；
2）权利要求1或2所述的纳米抗体或其重链可变区、权利要求7所述的双特异性抗体或权利要求8所述的偶联物或缀合物在制备用于治疗MICA介导的疾病的药物中的用途；所述疾病包括肿瘤；所述肿瘤包括实体瘤或血液瘤。
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