JP2020504744A - 枯渇活性を有するヒト化cxcr3抗体およびその使用方法 - Google Patents
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Abstract
ヒト化CXCR3抗体、ならびにこの抗体を使用して、1型糖尿病(T1D)、特には初発T1D、および乾癬のようなCXCR3関連障害を治療する方法を提供する。特定の実施形態では、抗CXCR3抗体は、CXCR3をその表面に発現する細胞に対するエフェクター機能を強化したヒト化抗ヒトCXCR3抗体である。また、この抗体をコードする核酸配列、およびこの抗体を含む医薬組成物を提供する。
Description
関連出願
本出願は、2016年12月22日申請の米国仮特許出願第62/437,867号および2017年1月21日申請の欧州特許出願第17305042.8号の利点を主張し、この全内容を参照により本明細書に組み入れる。
本出願は、2016年12月22日申請の米国仮特許出願第62/437,867号および2017年1月21日申請の欧州特許出願第17305042.8号の利点を主張し、この全内容を参照により本明細書に組み入れる。
ヒト化抗CXCR3抗体、ならびに抗体を使用して、糖尿病の1型(1型糖尿病(type 1 diabetes mellitus);T1D)および乾癬のような、CXCR3のシグナル伝達と関連する障害を治療する方法を本明細書において提供する。
1型糖尿病は、十分なインスリンを産生してグルコース恒常性を維持できないことを特徴とする。この障害は、自己免疫による膵β細胞の破壊によって生じると考えられている。1型糖尿病と関連する自己免疫は、自己反応性BとTリンパ球の両方の関与を伴う。1型糖尿病の進行は、活性化T細胞が浸潤した膵島を明らかにする、T1D診断の前後に得られる組織生検から明らかとなるように、自己反応性T細胞により媒介されることがある(非特許文献1;非特許文献2;非特許文献3;非特許文献4;非特許文献5;非特許文献6;非特許文献7)。
1型糖尿病(T1D)は、小児における最も一般的な慢性疾患のうちの1つであり、<20歳の若年者における、すべての糖尿病症例の≧85%を占める(非特許文献8;非特許文献9)。懸念されることには、T1Dの発症において3%の年次増加が世界的に予想されており、毎年86,000人の若者が新規に診断されている(非特許文献10)。
乾癬は、厚く銀色の鱗屑およびそう痒性で乾燥した赤い斑点を特徴とする、一般的で慢性的な皮膚疾患である。乾癬は、関節炎(乾癬性関節炎)として、またはこれを伴って現れることもある。乾癬は、免疫系の過活性T細胞によって生じるとも考えられている。
C−X−Cモチーフケモカイン受容体3(CXCR3)は、抗原を経験した(メモリー)エフェクターおよび活性化T細胞上に主に発現するケモカイン受容体であり、その主なリガンド:CXCL9(MIG)、CXCL10(IP−10)、およびCXCL11(I−TAC)に反応して、このようなT細胞のサブセットを組織炎症部位に動員することに関与する。CXCR3およびCXCL10は、ヒトT1D患者において発現する(非特許文献11;非特許文献12;非特許文献13)。このような患者において、CXCL10は、膵島内の残存するインスリン産生ベータ細胞において発現する。CXCR3は、膵島を囲む、浸潤性のT細胞上に発現する。類似の発現パターンが、1型糖尿病マウスモデルである非肥満糖尿病(NOD)マウスにおいて再現されている(非特許文献14;非特許文献15;非特許文献16)。
CXCR3は、真皮CD3+リンパ球および形質細胞様樹状細胞により発現し、そのケモカインリガンドであるCXCL10およびCXCL9は、乾癬病変において上方制御される(非特許文献17;非特許文献18)。
CXCR3はまた、特定の種類の炎症組織に存在する浸潤性のT細胞上で発現するが、CXCL9、CXCL10およびCXCL11は、炎症病変の近くの細胞により産生されることが多い。
CXCR3の上方制御は、様々な自己免疫障害に関係づけられている。CXCR3発現は、ナイーブT細胞ではほとんどないが、抗原によって活性化されると上方制御される。CXCR3は、その主なリガンドに反応して、ヘルパー1T(Th1)細胞を含め、これらの細胞を組織炎症部位に動員する。ランゲルハンス島内のベータ細胞は、CXCL9およびCXCL10を発現し(非特許文献19)、膵臓に浸潤したT細胞は、CXCR3を発現する(非特許文献20;非特許文献21;非特許文献11;非特許文献12;非特許文献13;非特許文献16)。Youdらに対して与えられた特許文献1は、抗CXCR3抗体について述べている。
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現在、T1Dに対する非インスリン治療の認められた選択肢はない。作用薬については、疾患の経過を変化させる可能性のあるT1Dおよび乾癬の治療について研究中である。それにもかかわらず、T1Dは、慢性疾患の顕著な重荷を抱えており、世界的に、主要な公衆衛生上の懸念であり続けている。T1D、乾癬およびCXCR3関連障害の増悪を治療する、または減少させるための、さらなる作用薬の必要性が存在している。
ヒトCXCR3に特異的に結合するヒト化抗体またはその抗原結合フラグメントを本明細書において提供する。特定の実施形態では、本明細書において提供する抗CXCR3抗体は、CXCR3を発現する細胞の枯渇を導く能力を有するか、またはこれらの抗CXCR3抗体を、CXCR3を発現する細胞の枯渇を導く能力を強化するように改変して、CXCR3関連疾患および障害を治療することができる。CXCR3に特異的に結合するヒト化抗体またはその抗原結合フラグメントを投与することによりT1Dを治療する方法を本明細書において提供する。CXCR3に特異的に結合するヒト化抗体またはその抗原結合フラグメントを投与することを含む、乾癬を治療するための方法を本明細書において提供する。
いくつかの実施形態では、本明細書において提供するヒト化抗体またはその抗原結合フラグメントは、少なくとも0.885(VHのD領域の残基を除いたVHおよびVL鎖のすべての残基と比較した場合)または少なくとも0.950(IMTGにより特定されたものに限定したフレームワーク領域の残基と比較した場合)のジャーミナリティ(germinality)スコアを有する。いくつかの実施形態では、本明細書において提供するヒト化抗体またはその抗原結合フラグメントは、少なくとも1×10−9MのKDを有する。いくつかの実施形態では、本発明において提供するヒト化抗体またはその抗原結合フラグメントは、7×10−51/Ms未満のkdを有する。いくつかの実施形態では、本発明において提供するヒト化抗体またはその抗原結合フラグメントは、少なくとも0.885(VHのD領域の残基を除いたVHおよびVL鎖のすべての残基と比較した場合)または少なくとも0.950(IMTGにより特定されたものに限定したフレームワーク領域の残基と比較した場合)のジャーミナリティスコア、および少なくとも1×10−9MのKDを有する。いくつかの実施形態では、本発明において提供するヒト化抗体またはその抗原結合フラグメントは、少なくとも0.885(VHのD領域の残基を除いたVHおよびVL鎖のすべての残基と比較した場合)または少なくとも0.950(IMTGにより特定されたものに限定したフレームワーク領域の残基と比較した場合)のジャーミナリティスコア、少なくとも1×10−9MのKD、および7×10−51/Ms未満のkdを有する。
特定の実施形態では、特定の重鎖可変領域と対をなす特定の軽鎖可変領域を含むヒト化CXCR3抗体を提供する。特定の実施形態では、本明細書において提供するヒト化CXCR3抗体は、ヒトCXCR3をその表面に発現する細胞に対するエフェクター機能の強化を付与する変異ヒトIgG1 Fc領域を含む。
第1の態様では、重鎖可変領域(VH)を有する重鎖(HC)および軽鎖可変領域(VL)を有する軽鎖(LC)を含む、ヒト化抗ヒトC−X−Cモチーフケモカイン受容体3(CXCR3)抗体、またはその医薬製剤を本明細書において提供する。
第1の態様の一実施形態では、本明細書において提供するヒト化抗ヒトCXCR3抗体の、VHおよびVLは、表1に示す配列対のアミノ酸配列を含み、HCは、配列番号2、3、4、5、6、7、8、9、10または11のうちの任意の1つのアミノ酸配列を含むヒトIgG1 Fc領域をさらに含む。
第1の態様の別の実施形態では、本明細書において提供するヒト化抗ヒトCXCR3抗体のVHは、配列番号20のアミノ酸配列を含み、VLは、配列番号24のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ヒト化ヒトIgG1 Fc領域は、配列番号2または配列番号9または配列番号10または配列番号11のアミノ酸配列を含む。
第1の態様の別の実施形態では、本明細書において提供するヒト化抗ヒトCXCR3抗体のVHは、配列番号18のアミノ酸配列を含み、VLは、配列番号22のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、ヒトIgG1 Fc領域を含む。いくつかの実施形態では、ヒトIgG1 Fc領域は、配列番号2または配列番号9または配列番号10または配列番号11のアミノ酸配列を含む。
第1の態様の他の実施形態では、本明細書において提供するヒト化抗ヒトCXCR3抗体のHCおよびLCは、表2に示す配列番号対のアミノ酸配列を含む。
第1の態様の別の実施形態では、本明細書において提供するヒト化抗ヒトCXCR3抗体のHCは、フコース含量を減少させたヒトIgG1 Fc領域を含む。いくつかの実施形態では、提供するヒト化抗ヒトCXCR3抗体は、グリコシル化阻害物質を含む培地で培養した宿主細胞において産生される。一実施形態では、グリコシル化阻害物質は、キフネンシン(kifunensine)である。
第2の態様では、重鎖可変領域(VH)を有する重鎖(HC)および軽鎖可変領域(VL)を有する軽鎖(LC)を含むヒト化抗ヒトCXCR3抗体をコードする核酸を本明細書において提供する。
第3の態様では、CXCR3を発現する細胞を対象において枯渇させる方法における使用のための、ヒト化抗ヒトCXCR3抗体またはその医薬組成物であって、重鎖可変領域(VH)を有する重鎖(HC)および軽鎖可変領域(VL)を有する軽鎖(LC)を含む、ヒト化抗ヒトCXCR3抗体またはその医薬組成物を本明細書において提供する。いくつかの実施形態では、CD4+T細胞は、枯渇している。いくつかの実施形態では、CD8+T細胞は、枯渇している。いくつかの実施形態では、CD4+およびCD8+T細胞は、枯渇している。いくつかの実施形態では、CD4+メモリーT細胞は、枯渇している。いくつかの実施形態では、CD8+メモリーT細胞は、枯渇している。いくつかの実施形態では、CD4+メモリーT細胞およびCD8+メモリーT細胞は、枯渇している。一実施形態では、対象は、T細胞性自己免疫疾患を有する。別の実施形態では、対象は、初発1型糖尿病を有する。別の実施形態では、対象は、乾癬を有する。
第4の態様では、T細胞性自己免疫疾患を治療する方法における使用のための、ヒト化抗ヒトCXCR3抗体またはその医薬組成物であって、重鎖可変領域(VH)を有する重鎖(HC)および軽鎖可変領域(VL)を有する軽鎖(LC)を含む、ヒト化抗ヒトCXCR3抗体またはその医薬組成物を本明細書において提供する。一実施形態では、T細胞性疾患は、初発1型糖尿病である。別の実施形態では、T細胞性疾患は、乾癬である。
第5の態様では、重鎖可変領域(VH)を有する重鎖(HC)および軽鎖可変領域(VL)を有する軽鎖(LC)を含むヒト化抗ヒトCXCR3抗体を、それを必要とする対象に投与することを含む、T細胞性自己免疫疾患を治療する方法を本明細書において提供する。いくつかの実施形態では、T細胞性自己免疫疾患は、初発1型糖尿病である。いくつかの実施形態では、T細胞性自己免疫疾患は、乾癬である。
第6の態様では、重鎖可変領域(VH)を有する重鎖(HC)および軽鎖可変領域(VL)を有する軽鎖(LC)を含むヒト化抗ヒトCXCR3抗体を、それを必要とする対象に投与するための説明書を用意することを含む、T細胞性自己免疫疾患を治療する方法を本明細書において提供する。いくつかの実施形態では、T細胞性自己免疫疾患は、初発1型糖尿病である。いくつかの実施形態では、T細胞性自己免疫疾患は、乾癬である。
第7の態様では、重鎖可変領域(VH)を有する重鎖(HC)および軽鎖可変領域(VL)を有する軽鎖(LC)を含むヒト化抗ヒトCXCR3抗体、ならびにヒト化抗ヒトCXCR3を、それを必要とするヒト対象に投与するための説明書を含む、T細胞性自己免疫疾患を治療するためのキットを本明細書において提供する。
本明細書において提供する、第2、3、4、5、6および7の態様のいくつかの実施形態では、ヒト化抗ヒトCXCR3抗体のVHおよびVLは、表1に示す配列対のアミノ酸配列を含み、HCは、配列番号2、3、4、5、6、7、8、9、10または11のアミノ酸配列を含むヒトIgG1 Fc領域を含む。別の実施形態では、VHは、配列番号20のアミノ酸配列を含み、VLは、配列番号24のアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、VHは、配列番号20のアミノ酸配列を含み、VLは、配列番号24のアミノ酸配列を含み、ヒトIgG1 Fc領域は、配列番号2または配列番号9または配列番号10または配列番号11のアミノ酸配列を含む。
本明細書において提供する、第2、3、4、5、6および7の態様の他の実施形態では、VHは、配列番号18のアミノ酸配列を含み、VLは、配列番号22のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ヒト化ヒトIgG1 Fc領域は、配列番号2または配列番号9または配列番号10または配列番号11のアミノ酸配列を含む。
本明細書において提供する、第2、3、4、5、6および7の態様の他の実施形態では、抗体のHCおよびLCは、表2に示す配列対のアミノ酸配列を含む。
本明細書において提供する、第2、3、4、5、6および7の態様の他の実施形態では、本明細書において提供するヒト化抗ヒトCXCR3抗体のHCは、フコース含量を減少させたヒトIgG1 Fc領域を含む。いくつかの実施形態では、提供するヒト化抗ヒトCXCR3抗体は、グリコシル化阻害物質を含む培地で培養した宿主細胞において産生される。いくつかの実施形態では、グリコシル化阻害物質は、キフネンシンである。
これより、本開示により特定の例示的実施形態を詳細に参照し、その特定の実施例を添付の図面において示す。
ヒトCXCR3に特異的に結合するヒト化抗体またはその抗原結合フラグメントを本明細書において提供する。特定の実施形態では、本明細書において提供する抗CXCR3抗体は、CXCR3を発現する細胞の枯渇を導く能力を有するか、またはこれらの抗CXCR3抗体を、CXCR3を発現する細胞の枯渇を導く能力を強化するように改変して、CXCR3関連疾患および障害を治療する。いくつかの実施形態では、療法は、CXCR3を標的化してT1Dを治療するために開示し、いくつかの実施形態では、療法は、CXCR3を標的化して乾癬を治療するために開示する。
抗体
本明細書において使用する場合、用語「抗体」は、4つのポリペプチド鎖、ジスルフィド結合により相互連結する2つの重(H)鎖および2つの軽(L)鎖、ならびにそれらの多量体(例えば、IgM)を含む免疫グロブリン分子を指す。各重鎖は、重鎖可変領域(VHまたはVHと略す)および重鎖定常領域(CHまたはCH)を含む。重鎖定常領域は、3つのドメイン、CH1、CH2およびCH3を含む。重鎖のFc部分は、CH2およびCH3を含む。
本明細書において使用する場合、用語「抗体」は、4つのポリペプチド鎖、ジスルフィド結合により相互連結する2つの重(H)鎖および2つの軽(L)鎖、ならびにそれらの多量体(例えば、IgM)を含む免疫グロブリン分子を指す。各重鎖は、重鎖可変領域(VHまたはVHと略す)および重鎖定常領域(CHまたはCH)を含む。重鎖定常領域は、3つのドメイン、CH1、CH2およびCH3を含む。重鎖のFc部分は、CH2およびCH3を含む。
各軽鎖は、軽鎖可変領域(VLと略す)および軽鎖定常領域(CLまたはCL)を含む。軽鎖定常領域は、1つのドメイン(CL1)を含む。
VHおよびVL領域は、フレームワーク領域(FR)と呼ぶ、より保存された領域が散在した、相補性決定領域(CDR)と呼ぶ、超可変領域にさらに細分することができる。各VHおよびVLは、3つのCDRおよび4つのFRからなり、次の順序:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3およびFR4でアミノ末端からカルボキシ末端へ配置される。
本明細書において使用する場合、抗体の「抗原結合フラグメント」の用語は、抗原に特異的に結合して複合体を形成する、天然の、酵素的に入手可能な、合成の、または遺伝子改変の任意のポリペプチドまたは糖タンパク質を含む。抗体の抗原結合フラグメントは、タンパク質分解、または抗体の可変ドメインおよび場合により定常ドメインをコードするDNAの操作および発現を含む組換え遺伝子改変技術のような任意の適した標準技術を使用して、例えば、完全な抗体分子から得ることができる。抗原結合部分の非限定的な例としては、(i)Fabフラグメント;(ii)F(ab’)2フラグメント;(iii)Fdフラグメント;(iv)Fvフラグメント;(v)単鎖Fv(scFv)分子;(vi)dAbフラグメント;および(vii)抗体の超可変領域(例えば、単離した相補性決定領域(CDR))を模倣するアミノ酸残基を含む最小認識単位が挙げられる。二重、三重、四重特異性抗体のような他の改変分子、およびミニボディ(minibody)はまた、「抗原結合フラグメント」の語句に包含する。
特定の実施形態では、CXCR3抗体または抗原結合フラグメントは、少なくとも1つの抗原結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、抗体またはフラグメントは、多特異的であり、2つまたはそれ以上(例えば、2、3、4、5またはそれ以上)の抗原結合ドメインを含み、そのため、抗体またはフラグメントが、2つもしくはそれ以上のCXCR3分子に、同一もしくは異なるエピトープにおいて結合可能となるか、またはCXCR3および少なくとも1つの他の抗原に高い親和性で結合可能となる。抗原結合部分は、抗原に特異的に結合する能力を保持する抗体の1つまたはそれ以上のフラグメントを含むことができる。このようなフラグメントは、親抗体由来または親抗体の変異体由来の重鎖および/または軽鎖可変領域を含んでもよい。
本明細書において使用する場合、用語「抗原」は、抗体またはその抗原結合フラグメントにより認識される、結合部位またはエピトープを指す。
「エピトープ」または「抗原決定基」は、抗体の抗原結合ドメインとの特異的相互作用の原因となる抗原分子の部分である。
本明細書において使用する場合、抗体またはその抗原結合フラグメントに関する「結合する」は、抗体の抗体結合部位と抗原との間の非共有相互作用により、同種抗原との1つまたはそれ以上の非共有結合を形成する、抗体または抗原結合フラグメントの能力を指す。抗原は、単離した抗原であってもよく、または細胞表面上のポリペプチドに関連するような別の実体に付随して存在してもよい。
本明細書において使用する場合、用語「に特異的に結合する」は、少なくとも約1×10−6M、1×10−7M、1×10−8M、1×10−9M、1×10−10M、1×10−11M、1×10−12Mまたはそれ以上のKdを有する抗原に結合する、抗体またはその抗原結合フラグメントの能力を指す。特定の実施形態では、この用語は、非特異的抗原に対するその親和性よりも少なくとも2倍超高い親和性で抗原に結合する、抗体またはその抗原結合フラグメントの能力を指す。しかし、抗体またはその抗原結合フラグメントが、配列が関連する、2つまたはそれ以上の抗原に特異的に結合することが可能であることが理解される(例えば、ヒトまたはカニクイザルCXCR3)。非特異的結合は、通常、中等度から高度までの結合能力を有しながら親和性が低い。必要に応じて、非特異的結合は、結合条件を変えることによって特異的結合に実質的に影響させることなく減少することができる。このような条件は、当分野において既知であり、常用技術を使用する当業者は、適切な条件を選択することができる。条件は、通常、抗体濃度、溶液のイオン強度、温度、結合させる時間、ならびに血清アルブミンおよびミルクカゼインのようなブロッキング分子の濃度に関して定義される。
親和定数は、抗体反応について標準の動態学的方法、例えば、イムノアッセイ(例えば、ELISA)または表面プラズモン共鳴法(SPR)により決定することができる。結合率のリアルタイム検出およびモニタリングのための器具使用および方法は、既知であり、市販されている(例えば、Biacore 2000、Biacore AB社、ウプサラ、スウェーデンおよびGE Healthcare Life Sciences社)。
本明細書において使用する場合、「相補性決定領域」または「CDR」は、抗体の抗原結合部位をともに形成する、抗体または抗原結合フラグメントの各可変領域内の複数の部分のうちの1つを指す。各可変領域ドメインは、CDR1、CDR2およびCDR3と名付けられている3つのCDRを含む。したがって、重鎖可変ドメイン(VH)は、CDR−H1、CDR−H2およびCDR−H3を含み、軽鎖可変ドメイン(VL)は、CDR−L1、CDR−L2およびCDR−L3を含む。3つのCDRは、直鎖状のアミノ酸配列に沿って隣接はしていないが、折りたたまれたポリペプチド中で近接している。CDRは、可変ドメインのベータシートの平衡鎖を連結するループ内に位置している。
本明細書において使用する場合、用語「フレームワーク(FR)アミノ酸残基」は、Ig鎖のフレームワーク領域内のアミノ酸を指す。本明細書において使用する用語「フレームワーク領域」または「FR領域」は、可変領域の一部であるがCDRの一部ではないアミノ酸残基を含む。したがって、可変領域フレームワークは、長さが約100〜120個の間のアミノ酸ではあるが、CDR以外のアミノ酸のみを含む。
本明明細書において使用する場合、用語「%同一」または「パーセント同一」は、特定の領域間の2つの配列を比較した場合、2つの配列が、同じ位置において同一の残基を特定の数有することを意味する。用語「%類似」または「パーセント類似」は、類似の意味を有するが、2つの配列間のアミノ酸の数が同一であることに加えて、アミノ酸は同一ではないが、保存的置換であるともみなす。パーセント同一性は、BLASTP、BLASTNおよびFASTAプログラム(Altschul,SFら、J Mol Biol 215:403(1990年))のような既知のコンピュータアルゴリズムを使用して、例えば、Pearsonら、Proc Natl Acad Sci USA 85:2444(1988年)の場合のようにデフォルトのパラメータを使用して判定することができる。例えば、米国立バイオテクノロジー情報センター(National Center for Biotechnology Informtion)(NCBI)データベースのBLAST機能を使用して同一性を判定することができる。
特定の実施形態では、本明細書において提供する抗体は、ヒト化抗体である。「ヒト化抗体」は、所望の抗原に結合する抗体分子であり、非ヒト種(例えば、マウス抗体)由来の1つまたはそれ以上のCDRを有し、ヒト免疫グロブリン分子由来のフレームワーク領域および/または定常ドメインのうちの少なくともいくつかの部分を有する。既知のヒトIg配列は、例えば、ncbi.nlm.nih.gov/entrez−/query.fcgi;atcc.org/phage/hdb.html;sciquest.com;abcam.com;antibodyresource.com/onlinecomp.html;およびKabatら、Sequences of Proteins of Immunological Interest、U.S.Dept.Health(1983年)に開示されている。移入したヒト配列を使用して、当分野において既知のように、免疫原性を減少させるか、または結合、親和性、結合率、解離率、アビディティ、特異性、半減期、または他の任意の適した特性を減少、強化もしくは修飾することができる。抗体をヒト化するための当分野で認められた方法は、Jonesら、Nature 321:522(1986年);Verhoeyenら、Science 239:1534(1988年);Simsら、J Immunol 151:2296(1993年);ChothiaおよびLesk、J Mol Biol 196:901(1987年);Carterら、Proc Natl Acad Sci USA 89:4285(1992年);Prestaら、J Immunol 151:2623(1993年);米国特許第5,589,205号;第5,565,332号;第6,180,370号;第6,632,927号;第7,241,877号;第7,244,615号;第7,244,832号;第7,262,050号;および米国特許出願公開第2004/0236078号(2004年4月30日出願)に記載されており、この全体を参照により本明細書に組み入れる。
特定の実施形態では、本明細書において提供するヒト化抗体の特定のフレームワーク残基は、CDRドナー抗体由来の対応する残基で置換しており、例えば、マウス抗ヒトCXCR3抗体由来のフレームワーク残基で置換して、抗原結合を変化、例えば、向上させる。このようなフレームワーク置換は、CDRとフレームワーク残基の相互作用をモデル化して、抗原結合および特定の位置における異常なフレームワーク残基を同定するための配列比較に重要なフレームワーク残基を同定することにより同定されている。いくつかの実施形態では、4Dによるヒト化を使用して、本開示のヒト化抗体変異体を調製した。国際公開第2009/032661号(この全体を参照により本明細書に組み入れる)の例えば、4Dによるヒト化において使用する方法についての段落[0037]〜[0044]を参照されたい。簡潔には、4Dヒト化は:(a)ヒト化する可変ドメインの3Dモデルを構築すること;(b)ドメインの3Dモデルの分子動態シミュレーションを使用して、可変ドメイン内の可動性残基を同定すること;(c)49種のヒト生殖系列の分子動態の軌跡と3Dモデルの分子動態の軌跡とを比較することにより最も近いヒト生殖系列を同定すること;および(d)CDRの一部ではない可動性残基をそのヒト生殖系列の対応物(工程(c)において同定するような)に変異させることを含むことができる。
いくつかの実施形態では、表1に記載するVHおよびVL配列を含む、ヒト化CXCR3抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。
いくつかの実施形態では、表2に記載する重鎖(HC)および軽鎖(LC)配列を含む、ヒト化CXCR3抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。
抗体エフェクター機能/枯渇活性
特定の実施形態では、本明細書に開示の抗CXCR3抗体は、CXCR3を発現する細胞の枯渇を導く能力を有するか、またはこれらの抗CXCR3抗体を、CXCR3を発現する細胞の枯渇を導く能力を強化するように改変して、CXCR3関連疾患および障害を治療することができる。本明細書に開示の抗体により枯渇させることが可能なCXCR3を発現する細胞は、CD4+T細胞および/またはCD8+T細胞を含むことができる。本明細書において開示する抗体により枯渇させることが可能なCXCR3を発現する細胞は、CD4+メモリーT細胞および/またはCD8+メモリーT細胞を含むことができる。本明細書において使用する場合、CXCR3+細胞(すなわち、CXCR3をその細胞表面上に発現する細胞)に関する「枯渇」は、このような細胞を細胞集団から除去することを指す。枯渇について言及した場合は、完全または部分的な枯渇を含む。さらに、枯渇は、恒久的または一時的であってもよく、大きさおよび/または位置の程度が変化するものであってもよい。枯渇は、アポトーシスまたはネクローシスによるもののような細胞死の結果であってもよい。枯渇は、本明細書において提供する抗体または抗原結合フラグメントへの曝露前後に、または本明細書において提供する抗体または抗原結合フラグメントの非存在および存在下で、当分野において既知の任意の方法(例えば、フローサイトメトリー、免疫組織化学的検査等)を使用して、集団におけるCXCR3−細胞の数を測定することにより評価することができる。本明細書において提供する抗体または抗原結合フラグメントへの曝露後、CXCR3+細胞は、少なくともまたは約10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%またはそれ以上枯渇させることができる。
特定の実施形態では、本明細書に開示の抗CXCR3抗体は、CXCR3を発現する細胞の枯渇を導く能力を有するか、またはこれらの抗CXCR3抗体を、CXCR3を発現する細胞の枯渇を導く能力を強化するように改変して、CXCR3関連疾患および障害を治療することができる。本明細書に開示の抗体により枯渇させることが可能なCXCR3を発現する細胞は、CD4+T細胞および/またはCD8+T細胞を含むことができる。本明細書において開示する抗体により枯渇させることが可能なCXCR3を発現する細胞は、CD4+メモリーT細胞および/またはCD8+メモリーT細胞を含むことができる。本明細書において使用する場合、CXCR3+細胞(すなわち、CXCR3をその細胞表面上に発現する細胞)に関する「枯渇」は、このような細胞を細胞集団から除去することを指す。枯渇について言及した場合は、完全または部分的な枯渇を含む。さらに、枯渇は、恒久的または一時的であってもよく、大きさおよび/または位置の程度が変化するものであってもよい。枯渇は、アポトーシスまたはネクローシスによるもののような細胞死の結果であってもよい。枯渇は、本明細書において提供する抗体または抗原結合フラグメントへの曝露前後に、または本明細書において提供する抗体または抗原結合フラグメントの非存在および存在下で、当分野において既知の任意の方法(例えば、フローサイトメトリー、免疫組織化学的検査等)を使用して、集団におけるCXCR3−細胞の数を測定することにより評価することができる。本明細書において提供する抗体または抗原結合フラグメントへの曝露後、CXCR3+細胞は、少なくともまたは約10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%またはそれ以上枯渇させることができる。
特定の実施形態では、ヒト化抗ヒトCXCR3抗体は、野生型Fc領域、例えば、野生型ヒトIgG1 Fcを有する対応するヒト化抗ヒトCXCR3抗体と比較して、ヒトCXCR3をその表面上に発現する細胞に対するエフェクター機能が強化されることを示す。本明細書において使用する場合、「エフェクター機能の強化」は、適した標的細胞に対する、抗体依存性細胞傷害作用(ADCC)、補体性細胞傷害作用(CDC)、または抗体依存性細胞性食作用(ADCP)のうちの任意の1つまたはそれ以上を導く抗体の能力が、対照抗体と比較して、同じ抗原特異性および野生型ヒトIgG1 Fc領域を有する同じ条件下で、測定可能に増加することを指す。特定の実施形態では、対照抗体は、変異ヒトFc領域を含む。特定の実施形態では、エフェクター機能は、ADCC、ADCPもしくはCDC、またはこれらの任意の組合せである。特定の実施形態では、エフェクター機能は、ADCCもしくはCDC、またはADCCとCDCの両方である。特定の実施形態では、エフェクター機能は、ADCCである。特定の実施形態では、エフェクター機能は、CDCである。特定の実施形態では、エフェクター機能は、ADCCとCDCの両方である。特定の実施形態では、エフェクター機能は、ADCPである。
本明細書において使用する場合、「変異ヒトIgG1 Fc領域」は、野生型ヒトIgG1 Fcと比較して、1つまたはそれ以上のアミノ酸変異またはアミノ酸修飾を含むように改変または修飾したヒトIgG1 Fc領域を指す。特定の実施形態では、野生型ヒトIgG1 Fc領域は、アミノ酸配列
SLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(欧州番号192−446)(配列番号2)を含む。
SLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(欧州番号192−446)(配列番号2)を含む。
特定の実施形態では、変異ヒトIgG1 Fc領域は、次のアミノ酸置換:G236A、S239D、S267E、H268F、S324T、I332E(欧州番号)のうちの少なくとも1つ、またはこれらの任意の組合せを含む。特定の実施形態では、変異ヒトIgG1 Fc領域は、次のアミノ酸置換の組:S239D/I332E、G236A/S267E/H268F/S324T/I332E、およびS239D/H268F/S324T/I332E(欧州番号)のうちの少なくとも1つを含む。特定の実施形態では、変異ヒトIgG1 Fc領域は、アミノ酸置換S239D/I332Eを含む。他の実施形態では、変異ヒトIgG1 Fc領域は、アミノ酸置換G236A/S267E/H268F/S324T/I332Eを含む。さらに他の実施形態では、変異ヒトIgG1 Fc領域は、アミノ酸置換S239D/H268F/S324T/I332Eを含む。
例えば、特定の実施形態では、変異ヒトIgG1 Fc領域は、配列番号3、4、5、6、7または8のアミノ酸配列を含む。
特定の実施形態では、変異ヒトIgG1 Fc領域は、配列番号3〜8のうちの任意の1つまたはそれ以上と少なくとも90パーセント同一の配列を含むが、ただし、いかなる場合でも、特定のアミノ酸置換は、維持される。種々の実施形態では、変異ヒトIgG1 Fc領域は、配列番号3〜8のうちの任意の1つまたはそれ以上と少なくとも90パーセント同一、少なくとも91パーセント同一、少なくとも92パーセント同一、少なくとも93パーセント同一、少なくとも94パーセント同一、少なくとも95パーセント同一、少なくとも96パーセント同一、少なくとも97パーセント同一、少なくとも98パーセント同一、または少なくとも99パーセント同一の配列を含むが、ただし、いかなる場合でも、特定のアミノ酸置換は、維持される。
特定の実施形態では、変異ヒトIgG1 Fc領域は、次のアミノ酸置換の組:S239D/I332E、G236A/S267E/H268F/S324T/I332EおよびS239D/H268F/S324T/I332E(欧州番号)のうちの少なくとも1つを含む。例えば、特定の実施形態では、変異ヒトIgG1 Fc領域は、配列番号9、10または11のアミノ酸配列を含む。
特定の実施形態では、少なくとも1つのアミノ酸置換体は、S239D/I332E(欧州番号)である。他の実施形態では、少なくとも1つのアミノ酸置換は、G236A/S267E/H268F/S324T/I332E(欧州番号)である。特定の実施形態では、少なくとも1つのアミノ酸置換体は、S239D/H268F/S324T/I332E(欧州番号)である。
特定の実施形態では、本明細書において提供するヒト化抗CXCR3抗体の変異ヒトIgG1 Fc領域は、配列番号9〜11のうちの任意の1つと少なくとも90パーセント同一の配列を含むが、ただし、いかなる場合でも、特定のアミノ酸置換およびエフェクター機能の強化は、維持される。種々の実施形態では、変異ヒトIgG1 Fc領域は、配列番号9〜11のうちの任意の1つまたはそれ以上と少なくとも90パーセント同一、少なくとも91パーセント同一、少なくとも92パーセント同一、少なくとも93パーセント同一、少なくとも94パーセント同一、少なくとも95パーセント同一、少なくとも96パーセント同一、少なくとも97パーセント同一、少なくとも98パーセント同一、または少なくとも99パーセント同一の配列を含むが、ただし、いかなる場合でも、特定のアミノ酸置換体は、維持される。
CDR変異体:
前述の実施形態に加えて、6つのCDRを含む抗CXCR3抗体であって、VHが、アミノ酸配列:
(i) 配列番号12、配列番号35、および配列番号14;
(ii) 配列番号12、配列番号35、および配列番号45;
(iii) 配列番号12、配列番号36、および配列番号45;
(iv) 配列番号12、配列番号37、および配列番号14;
(v) 配列番号12、配列番号37、および配列番号45;
(vi) 配列番号12、配列番号37、および配列番号46
(vii) 配列番号12、配列番号38、および配列番号14;
(viii) 配列番号12、配列番号38、および配列番号45;
(ix) 配列番号12、配列番号39、および配列番号14;
(x) 配列番号12、配列番号39、および配列番号47;
(xi) 配列番号12、配列番号40、および配列番号14;
(xii) 配列番号12、配列番号13、および配列番号45
(xiii) 配列番号12、配列番号13、および配列番号46;
(xiv) 配列番号12、配列番号13、および配列番号48;
(xv) 配列番号12、配列番号13、および配列番号49;
(xvi) 配列番号12、配列番号13、および配列番号50;
(xvii) 配列番号12、配列番号13、および配列番号51;
(xviii) 配列番号12、配列番号13、および配列番号52;
(xix) 配列番号12、配列番号13、および配列番号53;
(xx) 配列番号12、配列番号13、および配列番号54;
(xxi) 配列番号12、配列番号13、および配列番号55;
(xxii) 配列番号12、配列番号13、および配列番号56;
(xxiii) 配列番号12、配列番号13、および配列番号57;
(xxiv) 配列番号12、配列番号13、および配列番号58;
(xxv) 配列番号12、配列番号13、および配列番号59;
(xxvi) 配列番号12、配列番号13、および配列番号60;
(xxvii) 配列番号12、配列番号13、および配列番号61;
(xxviii) 配列番号12、配列番号13、および配列番号62;
(xxix) 配列番号12、配列番号13、および配列番号63;
(xxx) 配列番号12、配列番号13、および配列番号64;
(xxxi) 配列番号12、配列番号13、および配列番号65;
(xxxii) 配列番号12、配列番号13、および配列番号66;
(xxxiii) 配列番号34、配列番号13、および配列番号14;
(xxxiv) 配列番号12、配列番号41、および配列番号14;
(xxxv) 配列番号12、配列番号41、および配列番号46;
(xxxvi) 配列番号12、配列番号42、および配列番号14;
(xxxvii) 配列番号12、配列番号42、および配列番号45;
(xxxviii) 配列番号12、配列番号43、および配列番号14;
(xxxix) 配列番号12、配列番号44、および配列番号14;
(xl) 配列番号12、配列番号41、および配列番号14;または
(xli) 配列番号12、配列番号13、および配列番号68;
を有するCDRを含み、VLが、アミノ酸配列:
(i) 配列番号69、配列番号16、および配列番号17;
(ii) 配列番号70、配列番号16、および配列番号17;
(iii) 配列番号71、配列番号16、および配列番号17;
(iv) 配列番号71、配列番号16、および配列番号75;
(v) 配列番号72、配列番号16、および配列番号17;
(vi) 配列番号73、配列番号16、および配列番号17;
(vii) 配列番号74、配列番号16、および配列番号17;
(viii) 配列番号15、配列番号16、および配列番号75;
(ix) 配列番号15、配列番号16、および配列番号76;
(x) 配列番号15、配列番号16、および配列番号77;
(xi) 配列番号15、配列番号16、および配列番号78;または
(xii) 配列番号15、配列番号16、および配列番号79
を有するCDRを含む、抗CXCR3抗体を本明細書において提供する。
前述の実施形態に加えて、6つのCDRを含む抗CXCR3抗体であって、VHが、アミノ酸配列:
(i) 配列番号12、配列番号35、および配列番号14;
(ii) 配列番号12、配列番号35、および配列番号45;
(iii) 配列番号12、配列番号36、および配列番号45;
(iv) 配列番号12、配列番号37、および配列番号14;
(v) 配列番号12、配列番号37、および配列番号45;
(vi) 配列番号12、配列番号37、および配列番号46
(vii) 配列番号12、配列番号38、および配列番号14;
(viii) 配列番号12、配列番号38、および配列番号45;
(ix) 配列番号12、配列番号39、および配列番号14;
(x) 配列番号12、配列番号39、および配列番号47;
(xi) 配列番号12、配列番号40、および配列番号14;
(xii) 配列番号12、配列番号13、および配列番号45
(xiii) 配列番号12、配列番号13、および配列番号46;
(xiv) 配列番号12、配列番号13、および配列番号48;
(xv) 配列番号12、配列番号13、および配列番号49;
(xvi) 配列番号12、配列番号13、および配列番号50;
(xvii) 配列番号12、配列番号13、および配列番号51;
(xviii) 配列番号12、配列番号13、および配列番号52;
(xix) 配列番号12、配列番号13、および配列番号53;
(xx) 配列番号12、配列番号13、および配列番号54;
(xxi) 配列番号12、配列番号13、および配列番号55;
(xxii) 配列番号12、配列番号13、および配列番号56;
(xxiii) 配列番号12、配列番号13、および配列番号57;
(xxiv) 配列番号12、配列番号13、および配列番号58;
(xxv) 配列番号12、配列番号13、および配列番号59;
(xxvi) 配列番号12、配列番号13、および配列番号60;
(xxvii) 配列番号12、配列番号13、および配列番号61;
(xxviii) 配列番号12、配列番号13、および配列番号62;
(xxix) 配列番号12、配列番号13、および配列番号63;
(xxx) 配列番号12、配列番号13、および配列番号64;
(xxxi) 配列番号12、配列番号13、および配列番号65;
(xxxii) 配列番号12、配列番号13、および配列番号66;
(xxxiii) 配列番号34、配列番号13、および配列番号14;
(xxxiv) 配列番号12、配列番号41、および配列番号14;
(xxxv) 配列番号12、配列番号41、および配列番号46;
(xxxvi) 配列番号12、配列番号42、および配列番号14;
(xxxvii) 配列番号12、配列番号42、および配列番号45;
(xxxviii) 配列番号12、配列番号43、および配列番号14;
(xxxix) 配列番号12、配列番号44、および配列番号14;
(xl) 配列番号12、配列番号41、および配列番号14;または
(xli) 配列番号12、配列番号13、および配列番号68;
を有するCDRを含み、VLが、アミノ酸配列:
(i) 配列番号69、配列番号16、および配列番号17;
(ii) 配列番号70、配列番号16、および配列番号17;
(iii) 配列番号71、配列番号16、および配列番号17;
(iv) 配列番号71、配列番号16、および配列番号75;
(v) 配列番号72、配列番号16、および配列番号17;
(vi) 配列番号73、配列番号16、および配列番号17;
(vii) 配列番号74、配列番号16、および配列番号17;
(viii) 配列番号15、配列番号16、および配列番号75;
(ix) 配列番号15、配列番号16、および配列番号76;
(x) 配列番号15、配列番号16、および配列番号77;
(xi) 配列番号15、配列番号16、および配列番号78;または
(xii) 配列番号15、配列番号16、および配列番号79
を有するCDRを含む、抗CXCR3抗体を本明細書において提供する。
前述の実施形態に加えて、6つのCDRを含む抗CXCR3抗体であって、VHが、アミノ酸配列:
(i) 配列番号12、配列番号35、および配列番号14;
(ii) 配列番号12、配列番号35、および配列番号45;
(iii) 配列番号12、配列番号36、および配列番号45;
(iv) 配列番号12、配列番号37、および配列番号14;
(v) 配列番号12、配列番号37、および配列番号45;
(vi) 配列番号12、配列番号37、および配列番号46;
(vii) 配列番号12、配列番号38、および配列番号14;
(viii) 配列番号12、配列番号38、および配列番号45;
(ix) 配列番号12、配列番号39、および配列番号14;
(x) 配列番号12、配列番号39、および配列番号47;または
(xi) 配列番号12、配列番号40、および配列番号14;
を有するCDRを含み、VLが、アミノ酸配列:
(i) 配列番号69、配列番号16、および配列番号17;
(ii) 配列番号70、配列番号16、および配列番号17;
(iii) 配列番号71、配列番号16、および配列番号17;
(iv) 配列番号71、配列番号16、および配列番号100;
(v) 配列番号72、配列番号16、および配列番号17;
(vi) 配列番号73、配列番号16、および配列番号17;
(vii) 配列番号74、配列番号16、および配列番号17;
(viii) 配列番号15、配列番号16、および配列番号75;
(ix) 配列番号15、配列番号16、および配列番号76;
(x) 配列番号15、配列番号16、および配列番号77;
(xi) 配列番号15、配列番号16、および配列番号78;または
(xii) 配列番号15、配列番号16、および配列番号79
を有するCDRを含む、抗CXCR3抗体を本明細書において提供する。
(i) 配列番号12、配列番号35、および配列番号14;
(ii) 配列番号12、配列番号35、および配列番号45;
(iii) 配列番号12、配列番号36、および配列番号45;
(iv) 配列番号12、配列番号37、および配列番号14;
(v) 配列番号12、配列番号37、および配列番号45;
(vi) 配列番号12、配列番号37、および配列番号46;
(vii) 配列番号12、配列番号38、および配列番号14;
(viii) 配列番号12、配列番号38、および配列番号45;
(ix) 配列番号12、配列番号39、および配列番号14;
(x) 配列番号12、配列番号39、および配列番号47;または
(xi) 配列番号12、配列番号40、および配列番号14;
を有するCDRを含み、VLが、アミノ酸配列:
(i) 配列番号69、配列番号16、および配列番号17;
(ii) 配列番号70、配列番号16、および配列番号17;
(iii) 配列番号71、配列番号16、および配列番号17;
(iv) 配列番号71、配列番号16、および配列番号100;
(v) 配列番号72、配列番号16、および配列番号17;
(vi) 配列番号73、配列番号16、および配列番号17;
(vii) 配列番号74、配列番号16、および配列番号17;
(viii) 配列番号15、配列番号16、および配列番号75;
(ix) 配列番号15、配列番号16、および配列番号76;
(x) 配列番号15、配列番号16、および配列番号77;
(xi) 配列番号15、配列番号16、および配列番号78;または
(xii) 配列番号15、配列番号16、および配列番号79
を有するCDRを含む、抗CXCR3抗体を本明細書において提供する。
前述の実施形態に加えて、6つのCDRを含む抗CXCR3抗体であって、VHが、アミノ酸配列:
(xii) 配列番号12、配列番号13、および配列番号45
(xiii) 配列番号12、配列番号13、および配列番号46;
(xiv) 配列番号12、配列番号13、および配列番号48;
(xv) 配列番号12、配列番号13、および配列番号49;
(xvi) 配列番号12、配列番号13、および配列番号50;
(xvii) 配列番号12、配列番号13、および配列番号51;
(xviii) 配列番号12、配列番号13、および配列番号52;
(xix) 配列番号12、配列番号13、および配列番号53;
(xx) 配列番号12、配列番号13、および配列番号54;
(xxi) 配列番号12、配列番号13、および配列番号55;または
(xxii) 配列番号12、配列番号13、および配列番号56;
を有するCDRを含み、VLが、アミノ酸配列:
(i) 配列番号69、配列番号16、および配列番号17;
(ii) 配列番号70、配列番号16、および配列番号17;
(iii) 配列番号71、配列番号16、および配列番号17;
(iv) 配列番号71、配列番号16、および配列番号75;
(v) 配列番号72、配列番号16、および配列番号17;
(vi) 配列番号73、配列番号16、および配列番号17;
(vii) 配列番号74、配列番号16、および配列番号17;
(viii) 配列番号15、配列番号16、および配列番号75;
(ix) 配列番号15、配列番号16、および配列番号76;
(x) 配列番号15、配列番号16、および配列番号77;
(xi) 配列番号15、配列番号16、および配列番号78;または
(xii) 配列番号15、配列番号16、および配列番号79
を有するCDRを含む、抗CXCR3抗体を本明細書において提供する。
(xii) 配列番号12、配列番号13、および配列番号45
(xiii) 配列番号12、配列番号13、および配列番号46;
(xiv) 配列番号12、配列番号13、および配列番号48;
(xv) 配列番号12、配列番号13、および配列番号49;
(xvi) 配列番号12、配列番号13、および配列番号50;
(xvii) 配列番号12、配列番号13、および配列番号51;
(xviii) 配列番号12、配列番号13、および配列番号52;
(xix) 配列番号12、配列番号13、および配列番号53;
(xx) 配列番号12、配列番号13、および配列番号54;
(xxi) 配列番号12、配列番号13、および配列番号55;または
(xxii) 配列番号12、配列番号13、および配列番号56;
を有するCDRを含み、VLが、アミノ酸配列:
(i) 配列番号69、配列番号16、および配列番号17;
(ii) 配列番号70、配列番号16、および配列番号17;
(iii) 配列番号71、配列番号16、および配列番号17;
(iv) 配列番号71、配列番号16、および配列番号75;
(v) 配列番号72、配列番号16、および配列番号17;
(vi) 配列番号73、配列番号16、および配列番号17;
(vii) 配列番号74、配列番号16、および配列番号17;
(viii) 配列番号15、配列番号16、および配列番号75;
(ix) 配列番号15、配列番号16、および配列番号76;
(x) 配列番号15、配列番号16、および配列番号77;
(xi) 配列番号15、配列番号16、および配列番号78;または
(xii) 配列番号15、配列番号16、および配列番号79
を有するCDRを含む、抗CXCR3抗体を本明細書において提供する。
前述の実施形態に加えて、6つのCDRを含む抗CXCR3抗体であって、VHが、アミノ酸配列:
(xxiii) 配列番号12、配列番号13、および配列番号57;
(xxiv) 配列番号12、配列番号13、および配列番号58;
(xxv) 配列番号12、配列番号13、および配列番号59;
(xxvi) 配列番号12、配列番号13、および配列番号60;
(xxvii) 配列番号12、配列番号13、および配列番号61;
(xxviii) 配列番号12、配列番号13、および配列番号62;
(xxix) 配列番号12、配列番号13、および配列番号63;
(xxx) 配列番号12、配列番号13、および配列番号64;
(xxxi) 配列番号12、配列番号13、および配列番号65;または
(xxxii) 配列番号12、配列番号13、および配列番号66
を有するCDRを含み、VLが、アミノ酸配列:
(i) 配列番号69、配列番号16、および配列番号17;
(ii) 配列番号70、配列番号16、および配列番号17;
(iii) 配列番号71、配列番号16、および配列番号17;
(iv) 配列番号71、配列番号16、および配列番号75;
(v) 配列番号72、配列番号16、および配列番号17;
(vi) 配列番号73、配列番号16、および配列番号17;
(vii) 配列番号74、配列番号16、および配列番号17;
(viii) 配列番号15、配列番号16、および配列番号75;
(ix) 配列番号15、配列番号16、および配列番号76;
(x) 配列番号15、配列番号16、および配列番号77;
(xi) 配列番号15、配列番号16、および配列番号78;または
(xii) 配列番号15、配列番号16、および配列番号79
を有するCDRを含む、抗CXCR3抗体を本明細書において提供する。
(xxiii) 配列番号12、配列番号13、および配列番号57;
(xxiv) 配列番号12、配列番号13、および配列番号58;
(xxv) 配列番号12、配列番号13、および配列番号59;
(xxvi) 配列番号12、配列番号13、および配列番号60;
(xxvii) 配列番号12、配列番号13、および配列番号61;
(xxviii) 配列番号12、配列番号13、および配列番号62;
(xxix) 配列番号12、配列番号13、および配列番号63;
(xxx) 配列番号12、配列番号13、および配列番号64;
(xxxi) 配列番号12、配列番号13、および配列番号65;または
(xxxii) 配列番号12、配列番号13、および配列番号66
を有するCDRを含み、VLが、アミノ酸配列:
(i) 配列番号69、配列番号16、および配列番号17;
(ii) 配列番号70、配列番号16、および配列番号17;
(iii) 配列番号71、配列番号16、および配列番号17;
(iv) 配列番号71、配列番号16、および配列番号75;
(v) 配列番号72、配列番号16、および配列番号17;
(vi) 配列番号73、配列番号16、および配列番号17;
(vii) 配列番号74、配列番号16、および配列番号17;
(viii) 配列番号15、配列番号16、および配列番号75;
(ix) 配列番号15、配列番号16、および配列番号76;
(x) 配列番号15、配列番号16、および配列番号77;
(xi) 配列番号15、配列番号16、および配列番号78;または
(xii) 配列番号15、配列番号16、および配列番号79
を有するCDRを含む、抗CXCR3抗体を本明細書において提供する。
前述の実施形態に加えて、6つのCDRを含む抗CXCR3抗体であって、VHが、アミノ酸配列:
(xxxiii) 配列番号34、配列番号13、および配列番号14;
(xxxiv) 配列番号12、配列番号41、および配列番号14;
(xxxv) 配列番号12、配列番号41、および配列番号71;
(xxxvi) 配列番号12、配列番号42、および配列番号14;
(xxxvii) 配列番号12、配列番号42、および配列番号70;
(xxxviii) 配列番号12、配列番号43、および配列番号14;
(xxxix) 配列番号12、配列番号44、および配列番号14;
(xl) 配列番号12、配列番号41、および配列番号14;または
(xli) 配列番号12、配列番号13、および配列番号68;
を有するCDRを含み、VLが、アミノ酸配列:
(i) 配列番号69、配列番号16、および配列番号17
(ii) 配列番号70、配列番号16、および配列番号17;
(iii) 配列番号71、配列番号16、および配列番号17;
(iv) 配列番号71、配列番号16、および配列番号75;
(v) 配列番号72、配列番号16、および配列番号17;
(vi) 配列番号73、配列番号16、および配列番号17;
(vii) 配列番号74、配列番号16、および配列番号17;
(viii) 配列番号15、配列番号16、および配列番号75;
(ix) 配列番号15、配列番号16、および配列番号76;
(x) 配列番号15、配列番号16、および配列番号77;
(xi) 配列番号15、配列番号16、および配列番号78;または
(xii) 配列番号15、配列番号16、および配列番号79
を有するCDRを含む、抗CXCR3抗体を本明細書において提供する。
(xxxiii) 配列番号34、配列番号13、および配列番号14;
(xxxiv) 配列番号12、配列番号41、および配列番号14;
(xxxv) 配列番号12、配列番号41、および配列番号71;
(xxxvi) 配列番号12、配列番号42、および配列番号14;
(xxxvii) 配列番号12、配列番号42、および配列番号70;
(xxxviii) 配列番号12、配列番号43、および配列番号14;
(xxxix) 配列番号12、配列番号44、および配列番号14;
(xl) 配列番号12、配列番号41、および配列番号14;または
(xli) 配列番号12、配列番号13、および配列番号68;
を有するCDRを含み、VLが、アミノ酸配列:
(i) 配列番号69、配列番号16、および配列番号17
(ii) 配列番号70、配列番号16、および配列番号17;
(iii) 配列番号71、配列番号16、および配列番号17;
(iv) 配列番号71、配列番号16、および配列番号75;
(v) 配列番号72、配列番号16、および配列番号17;
(vi) 配列番号73、配列番号16、および配列番号17;
(vii) 配列番号74、配列番号16、および配列番号17;
(viii) 配列番号15、配列番号16、および配列番号75;
(ix) 配列番号15、配列番号16、および配列番号76;
(x) 配列番号15、配列番号16、および配列番号77;
(xi) 配列番号15、配列番号16、および配列番号78;または
(xii) 配列番号15、配列番号16、および配列番号79
を有するCDRを含む、抗CXCR3抗体を本明細書において提供する。
前述の実施形態に加えて、配列番号80、配列番号81、配列番号82、配列番号83、配列番号84、配列番号85、配列番号86、配列番号87、配列番号88、配列番号89または配列番号90のアミノ酸配列を含むVHを含む抗CXCR3抗体を本明細書において提供する。
前述の実施形態に加えて、配列番号91、配列番号92、配列番号93、配列番号94、配列番号95、配列番号96、配列番号97、配列番号98、配列番号99、配列番号100または配列番号101のアミノ酸配列を含むVHを含む抗CXCR3抗体を本明細書において提供する。
前述の実施形態に加えて、配列番号102、配列番号103、配列番号104、配列番号105、配列番号106、配列番号107、配列番号108、配列番号109、配列番号110または配列番号111の選択されるアミノ酸配列を含むVHを含む抗CXCR3抗体を本明細書において提供する。
前述の実施形態に加えて、配列番号112、配列番号113、配列番号114、配列番号115、配列番号116、配列番号117、配列番号118、配列番号119、配列番号120、配列番号121または配列番号122のアミノ酸配列を含むVHを含む抗CXCR3抗体を本明細書において提供する。
前述の実施形態に加えて、配列番号123、配列番号124、配列番号125、配列番号126、配列番号127、配列番号128、配列番号129、配列番号130、配列番号131、配列番号132、配列番号133または配列番号134のアミノ酸配列を含むVLを含む抗CXCR3抗体を本明細書において提供する。
特定の実施形態では、抗ヒトCXCR3抗体は、表3に示すアミノ酸配列を含むVH/VLの対をそれぞれ含む。(指示する変異は、対応する53Hu37VHまたはVL配列(配列番号20および24)にそれぞれ関する。)
中和抗体
特定の実施形態では、本明細書において提供するヒト化抗ヒトCXCR3抗体は、CXCR3中和抗体である。特定の例示的実施形態では、CXCR3抗体は、エフェクター機能の強化に加えて中和活性を有する。CXCR3の中和とCXCR3+細胞の枯渇との複合効果は、CXCR3による効果、例えば、T細胞の動員を減少または除去することが望ましい場合はいつでも利点となり得る。
特定の実施形態では、本明細書において提供するヒト化抗ヒトCXCR3抗体は、CXCR3中和抗体である。特定の例示的実施形態では、CXCR3抗体は、エフェクター機能の強化に加えて中和活性を有する。CXCR3の中和とCXCR3+細胞の枯渇との複合効果は、CXCR3による効果、例えば、T細胞の動員を減少または除去することが望ましい場合はいつでも利点となり得る。
「CXCR3中和抗体」は、CXCR3に結合し、CXCR3に結合するCXCR3リガンドに起因する、典型的な生理的および遺伝的反応のような受容体の活性を遮断する。中和活性は、中和が完全(100%中和)であっても、または部分的、例えば、約10、20、30、40、50、60、70、80、90、95(またはその間の任意のパーセント)またはそれ以上の中和をもたらすものであってもよく、抗体の濃度、親和性、およびエピトープ、ならびに中和活性を評価するために使用する特定のアッセイのような当業者に既知の種々の要因に依存する。CXCR3中和抗体の中和活性は、例えば、リガンド結合、GTP結合、カルシウム動員、細胞走化性、および/または受容体内在化の阻害を測定するためのアッセイにより示すことができる。中和抗体、および特にはCXCR3中和抗体の活性を判定するための多数のアッセイは、当業者に既知であり、特定の抗体が中和していることを検証するように容易に構成することができる。
例えば、いくつかの実施形態では、抗CXCR3抗体の中和活性は、クローン49801により生成され、R&D Systems(登録商標)社により販売される抗体(Cat.No.MAB160)の添付文書に実質的に記載するように、走化性アッセイにより評価することができる。50%中和量(ND50)は、反応性細胞株における細胞表面CXCR3による組換えヒトCXCL11(rhCXCL11)反応の最大阻害の半値を特定のrhCXCL11濃度で得るのに必要とされる、抗体濃度として定義される。hCXCR3をトランスフェクトしたBaF/3細胞のrhCXCL11による走化性を遮断する抗体の能力を測定するために、rhCXCL11 7ng/mLを96ウェル走化性チャンバー(NeuroProbe社、キャビン・ジョン、Md.)の下部コンパートメントに加える。次いで、無PVPのポリカーボネートフィルター(孔径5μm)を使用して走化性チャンバーを構築する。抗体の段階希釈物(例えば、0.001〜10000μg/mL)および0.25×106細胞/ウェルをチャンバーの上部のウェルに加える。5%CO2の加湿したインキュベーター中、37℃で3時間インキュベーション後、チャンバーを解体し、下部チャンバーへ遊走した細胞を作業プレートに移し、例えば、レサズリン蛍光を使用して定量化する。
Colvinら、Mol Cell Biol 26:5838〜49(2006年)では、特定の実施形態において、中和抗CXCR3抗体の中和活性を判定するために使用することが可能な追加のアッセイについて記載している。簡潔には、CXCR4を機能的に発現するマウスプレB細胞白血病細胞株である300−19細胞を使用することができる。トランスフェクションの後、この株は、他のケモカイン受容体、例えば、ヒトCXCR3を機能的に発現し得る(例えば、参照により本明細書に組み入れる、米国特許出願公開第2010/0061983号の段落201〜209を参照)。ヒトCXCR3を発現する300−19細胞は、10%のウシ胎仔血清(FBS)を含む完全RPMI培地中で増殖させることができる。CXCR3リガンドのCXCR3への結合を候補中和CXCR3抗体の存在下で評価するために、400,000個のCXCR3/300−19細胞を96ウェル組織培養プレート内の総容量150μLの結合バッファー(0.5%のBSA、5mMのMgCl2、1mMのCaCl2、50mMのHEPES、pH7.4)中に置いた。合計0.04nMの125I標識CXCL10(New England Nuclear社、ボストン、Mass.)またはCXCL11(Amersham Biosciences社、ピスカタウェイ、N.J.)および5×106nM〜500nMの非標識CXCL10またはCXCL11(Peprotech社、ロッキーヒル、N.J.)を細胞に加え、室温、振盪下で90分間インキュベートすることができる。0.3%のポリエチレンイミン中に予浸し、0.5MのNaClを添加した結合バッファー200μLで3回洗浄した、96ウェルフィルタープレート(Millipore社、ビレリカ、Mass.)上に細胞を移す。プレートを乾燥させ、Wallac Microbetaシンチレーションカウンター(Perkin−Elmer Life Sciences社、ボストン、Mass.)内にシンチレーション液を追加した後に放射能を測定する。CXCL9の結合は、CXCL10およびCXCL11と類似的に評価することができる。
特定の実施形態では、本明細書に開示の抗体は、CXCR3を発現する細胞へのカルシウム流を防止または減少させることができる。いくつかの実施形態では、カルシウム流は、CXCR3/300−19細胞のような細胞内で検出することができる。1%のウシ血清アルブミン(BSA)を含むRPMI培地2mL中に約5×106細胞を懸濁させる。Fura−2(Molecular Probes社、ユージーン、OR)15μgを加え、細胞を37℃で20分間インキュベートする。細胞をPBS中で2回洗浄し、カルシウム流バッファー(145mMのNaCl、4mMのKCl、1mMのNaHPO4、1.8mMのCaCl2、25mMのHEPES、0.8mMのMgCl2および22mMのグルコース)2mL中に再懸濁する。蛍光の読取りは、DeltaRAM蛍光光度計(Photon Technology International社、ローレンスビル、N.J.)により37℃で測定する。細胞内カルシウム濃度は、ケモカイン(例えば、CXCL9、CXCL10またはCXCL11)追加前および後に、340nmおよび380nmでの連続励起に反応して510nmで発光する励起蛍光強度として記録し、340nmでの蛍光の380nmでの蛍光に対する相対比として示す。
特定の実施形態では、CXCR3中和は、受容体内在化の減少を測定することにより評価することができる。いくつかの実施形態では、受容体内在化アッセイは、CXCR3/300−19細胞のような細胞約2.5×105個を、1%のBSAを含むRPMI培地中で種々の濃度のCXCL10、CXCL11またはCXCL9とともに37℃で30分間インキュベートすることにより実行することができる。次いで、氷冷フローサイトメトリー染色バッファーで細胞を洗浄し、その後、PE結合CXCR3抗体を使用してCXCR3の表面発現について分析することができる。
任意の上記アッセイにより評価するように、中和抗CXCR3抗体は、特定の実施形態において、約0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、40、50または100μg/mLのND50を有し得る。特定の実施形態では、ND50は、0.5〜12μg/mL、より特定の実施形態では、1〜6μg/mLであり得る。
本明細書において提供する抗体または抗原結合フラグメントによる細胞の遊走、動員、または蓄積の阻害は、当業者に既知の任意の方法により評価することができる。このような方法は、例えば、免疫組織化学的検査、フローサイトメトリー、RT−PCR等による生検の分析を含み、1つもしくはそれ以上の細胞集団、または体内もしくは器官内の1つもしくはそれ以上の部位における、CXCR3+細胞のような細胞の数を評価することができる。細胞の遊走、動員、または蓄積は、本明細書において提供する抗体または抗原結合フラグメントの非存在下での遊走、動員、または蓄積と比較して、少なくとも、または約10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%もしくはそれ以上阻害することができる。
ヌクレオチド配列
本明明細書に開示のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列をまた、本明細書において提供する。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、in vitroおよび/またはin vivoでCXCR3+細胞を枯渇させることが可能な抗体またはフラグメントをコードする。特定の実施形態では、ヌクレオチド配列を使用して、細胞における抗CXCR3抗体またはその抗原結合フラグメントの発現(例えば、哺乳動物細胞における発現)のための発現ベクターを調製することができる。
本明明細書に開示のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列をまた、本明細書において提供する。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、in vitroおよび/またはin vivoでCXCR3+細胞を枯渇させることが可能な抗体またはフラグメントをコードする。特定の実施形態では、ヌクレオチド配列を使用して、細胞における抗CXCR3抗体またはその抗原結合フラグメントの発現(例えば、哺乳動物細胞における発現)のための発現ベクターを調製することができる。
特定の実施形態では、本明細書において開示するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドと実質的に同一のポリヌクレオチドをまた、本明細書において開示する。実質的に同一の配列は、多型配列、すなわち、集団における別の配列または対立遺伝子であってもよい。実質的に同一の配列はまた、サイレント変異を含む配列を有する、変異誘発した配列を含むことができる。変異は、1つまたはそれ以上のヌクレオチド残基の変異、1つまたはそれ以上のヌクレオチド残基の欠失、または1つまたはそれ以上の追加のヌクレオチド残基の挿入を含むことができる。実質的に同一の配列はまた、核酸コードの縮重のため、本明細書において開示するアミノ酸配列の任意の所与のアミノ酸の位置で同じアミノ酸をコードする種々のヌクレオチド配列を含むことができる。in vitroおよび/またはin vivoでCXCR3+細胞を枯渇させる能力を保持する抗体の鎖または複数の鎖をコードする配列をまた、実質的に同一の配列に含む。
特定の実施形態では、本明細書において提供する核酸は、本明細書において提供する、CXCR3を発現する細胞を枯渇させることが可能な抗体またはフラグメントの鎖または複数の鎖のアミノ酸配列をコードするか、または核酸は、抗体またはその抗原結合フラグメントの鎖または複数の鎖のアミノ酸配列をコードする核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる。
特定の実施形態では、抗CXCR3抗体またはその抗原結合フラグメントのVHドメインのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み、抗体の重鎖をコードするヌクレオチド配列と少なくとも約80〜100%(例えば、約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%または100%)(またはその間の任意のパーセント)同一である、ポリヌクレオチド配列を本明細書において開示する。特定の実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、抗体の重鎖をコードするヌクレオチド配列と比較して0、1、2、3、4、5、6、7、8、9または10個の変異(付加、欠失、および保存的置換のような置換を含む)を有するヌクレオチド配列を含むことができる。
特定の実施形態では、抗CXCR3抗体またはフラグメントのVLドメインのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み、抗体の軽鎖をコードするヌクレオチド配列と少なくとも約80〜100%(例えば、約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%または100%)(またはその間の任意のパーセント)同一である、ポリヌクレオチド配列を本明細書において開示する。特定の実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、抗体の軽鎖をコードするヌクレオチド配列と比較して0、1、2、3、4、5、6、7、8、9または10個の変異(付加、欠失、および保存的置換のような置換を含む)を有するヌクレオチド配列を含むことができる。
特定の実施形態では、VHアミノ酸配列と少なくとも約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%または100%(またはその間の任意のパーセント)同一であり、VLアミノ酸配列と少なくとも約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%または100%(またはその間の任意のパーセント)同一であるヌクレオチド配列を含み、本明細書において開示する任意の抗体の重鎖および軽鎖アミノ酸配列をコードする、ポリヌクレオチド配列を本明細書において開示する。
開示するポリヌクレオチドは、当分野において既知の任意の方法により得ることができる。例えば、抗体のヌクレオチド配列が既知である場合、抗体をコードするポリヌクレオチドは、化学的に合成したオリゴヌクレオチドから構築することができる。これは、例えば、抗体をコードする配列の部分を含む重複したオリゴヌクレオチドを合成し、そのオリゴヌクレオチドをアニーリングおよび連結反応させ、次いで、連結したオリゴヌクレオチドをPCRにより増幅することを必要とし得る。開示するポリヌクレオチドはまた、抗体cDNAライブラリー、または抗体を発現する任意の組織もしくは細胞から単離したcDNAライブラリーのような他の任意の適した核酸ソースから(例えば、抗体を発現するように選択されたハイブリドーマ細胞から)生成することができる。
抗CXCR3抗体またはその抗原結合フラグメントの発現
本明細書において提供するヒト化抗CXCR3抗体またはその抗原結合フラグメントをコードする核酸の操作の後、そのコードする核酸を発現ベクター中に一般的に挿入して宿主細胞中に導入し、この宿主細胞を使用して所望の量のコード化抗体またはその抗原結合フラグメントを生成する。発現に適したベクターは、当分野において既知である。適した宿主細胞は、例えば、CHO、COS、Sf9および/または他のヒトもしくは非ヒト細胞株を含む。いくつかの実施形態では、培養培地中で培養した場合、宿主細胞は、核酸をベクター上に一過性または安定性に発現し、これにより、本明細書において開示する抗体またはフラグメントを生成するための方法を提供する。
本明細書において提供するヒト化抗CXCR3抗体またはその抗原結合フラグメントをコードする核酸の操作の後、そのコードする核酸を発現ベクター中に一般的に挿入して宿主細胞中に導入し、この宿主細胞を使用して所望の量のコード化抗体またはその抗原結合フラグメントを生成する。発現に適したベクターは、当分野において既知である。適した宿主細胞は、例えば、CHO、COS、Sf9および/または他のヒトもしくは非ヒト細胞株を含む。いくつかの実施形態では、培養培地中で培養した場合、宿主細胞は、核酸をベクター上に一過性または安定性に発現し、これにより、本明細書において開示する抗体またはフラグメントを生成するための方法を提供する。
用語「ベクター」または「発現ベクター」は、所望の遺伝子を細胞内に導入および発現させるための媒体を説明するために本明細書において使用する。当業者に既知のこのようなベクターは、例えば、プラスミド、ファージ、ウイルスおよびレトロウイルスを含む。一般に、適したベクターは、選択マーカー、適切な制限部位を含み、所望の遺伝子のクローニング、ならびに真核または原核細胞に侵入および/または複製する能力を促進することができる。
本明細書において提供する抗CXCR3抗体を発現させることを目的として、多数の発現ベクター系を利用することができる。例えば、ある種のベクターは、ウシパピローマウイルス、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルス、レトロウイルス(RSV、MMTVまたはMOMLV)またはSV40ウイルスのような動物ウイルスから得たDNA要素を利用する。他は、内部リボソーム結合部位を有するポリシストロニック系の使用を必要とする。さらに、DNAをその染色体中に組み込んだ細胞は、トランスフェクトする宿主細胞の選択を可能とする、1つまたはそれ以上のマーカーを導入することにより選択することができる。マーカーは、栄養要求性宿主に対する原栄養性、殺傷物剤耐性(例えば、抗生物質)または銅のような重金属に対する耐性をもたらすことができる。選択マーカー遺伝子は、発現させるDNA配列に直接連鎖させるか、または同時形質転換により同じ細胞内に導入することができる。追加の要素をまた、mRNAの最適合成に必要としてもよい。このような要素は、シグナル配列、スプライス信号、ならびに転写プロモーター、エンハンサー、および終結シグナルを含むことができる。いくつかの実施形態では、クローン化可変領域遺伝子を発現ベクター中に上述の重鎖および軽鎖定常領域遺伝子とともに挿入する。いくつかの実施形態では、重鎖および軽鎖定常領域は、ヒト由来である。
他の実施形態では、本明細書において提供する抗CXCR3抗体またはその抗原結合フラグメントは、ポリシストロニック性構築物を使用して発現させることができる。このような発現系では、抗体の重鎖および軽鎖のような、目的の多遺伝子産物は、単一のポリシストロニック性構築物から生成することができる。このような系は、内部リボソーム侵入部位(IRES)を有利に使用して、本明細書において提供するポリペプチドを比較的高いレベルで真核宿主細胞内にもたらす。適合するIRES配列は、米国特許第6,193,980号に開示されており、これを参照により本明細書に組み入れる。当業者は、このような発現系を使用して、本出願に開示する、あらゆるポリペプチドを効率的に生成することができることを理解するであろう。
ベクターまたは抗体をコードするDNA配列もしくはその抗原結合フラグメントを調製した時点で、発現ベクターを適切な宿主細胞内に導入することができる。すなわち、宿主細胞を形質転換することができる。プラスミドの宿主細胞への導入は、当業者に公知の種々の技術により達成することができる。これらの技術は、トランスフェクション(電気泳動および電気穿孔を含む)、原形質融合、リン酸カルシウム沈殿、エンベロープを有するDNAによる細胞融合、マイクロインジェクションおよびインタクトなウイルスによる感染を含むが、これらに限定されない。Ridgway,A.A.G.「Mammalian Expression Vectors」Chapter24.2、pp.470〜472 Vectors、RodriguezおよびDenhardt,Eds.(Butterworths社、ボストン、Mass.1988年)を参照されたい。いくつかの実施形態では、電気穿孔によりプラスミドを宿主へ導入する。形質転換した細胞は、コードしたアミノ酸配列、例えば、抗体軽鎖および重鎖の生成に適切な条件下で増殖させ、コードしたアミノ酸配列の生成について評価する。アッセイ技術の例として、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)、ラジオイムノアッセイ(RIA)、フローサイトメトリー、免疫組織化学的検査等が挙げられる。
「宿主細胞」は、組換え核酸技術を使用して構築され、少なくとも1つの異種タンパク質をコードするベクターを導入した細胞を指す。ポリペプチドを組換え宿主から単離するための方法の記載において、用語「細胞」および「細胞培養物」は、他に明白に示さない限り、互換的に使用して、コードしたタンパク質、例えば、抗体またはその抗原結合フラグメントのソースを表す。言い換えると、ポリペプチドの「細胞」からの回収は、遠心沈殿した全細胞から、または培地と懸濁した細胞の両方を含む細胞培養物からの回収を意味することができる。
一実施形態では、抗体発現のために使用する宿主細胞株は、哺乳動物由来である;当業者は、そこで発現する所望の遺伝子産物に最適な、特定の宿主細胞株を決定することができる。宿主細胞株の例としては、DG44およびDUXB11(チャイニーズハムスター卵巣株、DHFRマイナス)、HELA(ヒト子宮頸癌)、CVI(サル腎臓株)、COS(SV40 T抗原を有するCVIの誘導体)、R1610(チャイニーズハムスター線維芽細胞)、BALBC/3T3(マウス線維芽細胞)、SP2/O(マウス骨髄腫)、BFA−1c1BPT(ウシ内皮細胞)、RAJI(ヒトリンパ球)、293(ヒト腎臓)が挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、NS0細胞を使用してもよい。いくつかの実施形態では、CHO細胞を使用する。宿主細胞株は、商用サービス、米国培養細胞系統保存機関(American Tissue Culture Collection)から、または既刊文献から一般的に入手可能である。
一実施形態では、細胞株は、そこから発現した抗体のグリコシル化、例えば、アフコシル化の変化をもたらす(例えば、PER.C6.RTM.(Crucell社)またはFUT8ノックアウトCHO細胞株(Potelligent.RTM.細胞)(Biowa社、プリンストン、N.J.))。あるいは、細胞は、N−グリカンの初期のプロセシングに必要とされる1つもしくはそれ以上のグリコシダーゼが欠損していてもよく、かつ/または培養条件が、このようなグリコシダーゼのうちの1つもしくはそれ以上の活性が阻害されているものであってもよい。例えば、細胞は、アルファ−グルコシダーゼI、アルファ−グルコシダーゼII、およびアルファ−マンノシダーゼIのような1つまたはそれ以上のグリコシダーゼが欠損していてもよい。さらに、または、あるいは、改変した細胞は、アルファ−グルコシダーゼI、アルファ−グルコシダーゼII、およびアルファ−マンノシダーゼIのような1つまたはそれ以上のグリコシダーゼの阻害物質と接触させてもよい。特定の実施形態では、阻害物質は、アルファ−マンノシダーゼIの阻害物質、例えば、アルファ−マンノシダーゼI特異的阻害物質であるキフネンシンである。宿主細胞をキフネンシンおよび他の阻害物質とともに培養するための例示的方法は、米国特許第8,071,336号に開示されており、この全体を参照により本明細書に組み入れる。特定の実施形態では、キフネンシンによる処理により、少なくとも50%のMan5−9(GlcNAc)2N−グリカンを有する抗体が生じ、この場合、Man8およびMan9含有N−グリカンはともに主要な種である。
in vitroでの生成により、所望のポリペプチドを大量生産するためのスケールアップが可能となる。組織培養条件下での哺乳動物細胞の培養技術は、当分野において既知であり、例えば、エアリフトリアクター内もしくは連続撹拌リアクター内での均一な懸濁培養、または例えば、中空糸、マイクロカプセル中、アガロースマイクロビーズもしくはセラミックカートリッジ上で固定もしくは封入する細胞培養を含む。必要である、かつ/または望ましい場合、ポリペプチドの溶液は、通例のクロマトグラフィー法、例えば、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、DEAEセルロース上でのクロマトグラフィーおよび/または(イムノ)アフィニティークロマトグラフィーにより精製することができる。
本明細書において提供する、抗CXCR3抗体またはそのフラグメントをコードする核酸はまた、細菌もしくは酵母のような非哺乳動物細胞、または植物細胞において発現させることができる。この点について、細菌のような、単細胞で非哺乳動物である種々の微生物をまた使用して、本明細書において提供する抗体およびその抗原結合フラグメントを発現させることが可能であることが理解される。すなわち、培地中で増殖または発酵させることが可能である単細胞で非哺乳動物である微生物のことである。適した細菌は、大腸菌(Escherichia coli)またはサルモネラ(Salmonella)菌株のような腸内細菌科(enterobacteriaceae);枯草菌(Bacillus subtilis)のようなバシラス科(Bacillaceae);肺炎球菌(Pneumococcus);連鎖球菌(Streptococcus)およびインフルエンザ菌(Haemophilus influenzae)の菌種を含む。細菌中で発現させる場合、ポリペプチドは、封入体の一部となり得ることがさらに理解される。ポリペプチドは、単離、精製し、次いで機能分子に構築しなければならない。
原核生物に加えて、真核微生物をまた使用することができる。出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)または通常のパン酵母は、真核微生物の中でも最も一般的に用いられるが、他の多数の菌株が、一般的に入手可能である。酵母類(Saccharomyces)における発現では、例えば、プラスミドYRp7(Stinchcombら、Nature、282:39(1979年);Kingsmanら、Gene、7:141(1979年);Tschemperら、Gene、10:157(1980年))が一般的に用いられる。このプラスミドは、トリプトファンで増殖する能力を欠く酵母の変異株、例えば、ATCC No.44076またはPEP4−1の選択マーカーをもたらすTRP1遺伝子を既に含む(Jones、Genetics、85:12(1977年))。酵母宿主細胞ゲノムの特性としてTrp1が破壊されていると、トリプトファンの非存在下での増殖による形質転換を検出するのに効果的な環境が生じる。
医薬製剤および投与方法
本明細書において開示するヒト化抗ヒトCXCR3抗体、および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を本明細書において提供する。
本明細書において開示するヒト化抗ヒトCXCR3抗体、および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を本明細書において提供する。
本明細書において提供する抗体またはその抗原結合フラグメントを調製および対象に投与する方法は、公知であるか、または当業者により容易に決定される。抗体またはそのフラグメントの投与経路は、経口、非経口(静脈内、筋肉内、腹腔内、または皮下等)、吸入または局所によるものである。いくつかの実施形態では、本明細書において提供する抗体は、静脈内投与用に製剤化される。いくつかの実施形態では、注射用に適した医薬組成物は、バッファー(例えば、酢酸、リン酸またはクエン酸緩衝液)、界面活性物質(例えば、ポリソルベート)、場合により安定剤(例えば、ヒトアルブミン)等を含む。
注射使用に適した医薬組成物は、無菌注射用溶液または分散液の即時調製用の、無菌水溶液(この場合は、水溶性)または分散液および無菌粉末を含む。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオールを含む、溶媒または分散媒(例えば、グリセリン、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール等)、およびこれらの適した混合物であってもよい。例えば、レシチンのようなコーティング剤を使用することにより、分散液の場合は必要とされる粒子サイズを維持することにより、および界面活性物質を使用することにより、適切な流動性を維持することができる。種々の抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサール等により、微生物活動の防止を達成することができる。多くの場合、組成物中に等張剤、例えば、糖、マンニトールやソルビトールのような多価アルコール、または塩化ナトリウムを含むことが好ましい。吸収を遅らせる物質、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物中に含むことにより、注射用組成物の持続的吸収をもたらすことができる。
いかなる場合も、無菌注射用溶液は、活性化合物(例えば、抗体それ自体または他の活性剤と組み合わせて)を必要量、本明細書において列挙する成分のうちの1つまたは組合せとともに適切な溶媒中に組み込み、必要に応じて、その後、濾過滅菌することにより調製することができる。一般に、分散液は、塩基性分散媒および上に列挙した成分のうちの必要とする他の成分を含む無菌媒体中に活性化合物を組み入れることにより調製することができる。無菌注射用溶液の調製用の無菌粉末の場合では、好ましい調製方法は、真空乾燥および凍結乾燥であり、これにより、これまでに濾過滅菌したその溶液から活性成分の粉末に加えて任意の追加の所望の成分を得る。注射剤の調製を実行し、アンプル、バッグ、ビン、シリンジまたはバイアルのような容器に充填し、当分野において既知の方法に従って無菌条件下で密封する。このような製品は、好ましくは、関連の組成物が、自己免疫性または腫瘍性の障害を患う、またはその素因を有する対象の治療に有用であることを示す表示または添付文書を有する。
上記症状の治療のための本明細書において提供する抗体またはその抗原結合フラグメントの用量は、投与方法、標的部位、患者の生理的状態、患者がヒトか動物か、投与される他の薬剤、および治療が予防的か治療的かを含む、多くの種々の要因に応じて変化する。通常、患者はヒトであるが、トランスジェニック哺乳動物を含むヒトでない哺乳動物も治療することができる。
いくつかの実施形態では、用量は、例えば、宿主体重の約0.0001〜100mg/kg、または0.01〜5mg/kgの範囲であり得る。
このような用量を毎日、隔日、毎週または実証的分析により決定した他の任意のスケジュールに従って対象に投与することができる。本明細書において提供する抗体またはその抗原結合フラグメントは、複数回投与することができる。単回投与間の間隔は、例えば、毎日、毎週、毎月または毎年であり得る。間隔はまた、患者におけるポリペプチドまたは標的分子の血中濃度の測定により示されるように不規則であり得る。
本明細書において提供する抗体またはその抗原結合フラグメントは、場合により、治療(例えば、予防的または治療的)を必要とする障害または症状の治療において使用する他の作用薬と組み合わせて投与することができる。好ましい追加の作用薬は、当分野で認められているものであり、特定の障害のために標準的に投与する。
CXCR3関連疾患または障害を治療する方法
本明細書において提供するCXCR3抗体またはその抗原結合フラグメントは、CXCR3活性に拮抗するのに有用である。いくつかの実施形態では、抗体および抗原結合フラグメントは、CXCL9、CXCL10および/もしくはCXCL11のような1つもしくはそれ以上のリガンドに結合するCXCR3を阻害し;CXCR3+細胞の例えば炎症部位への遊走、蓄積、動員、もしくは浸潤を阻害し;ならびに/またはCXCR3+細胞を枯渇させる方法において使用する。いくつかの実施形態では、抗体および抗原結合フラグメントは、CXCR3+細胞をin vivoで枯渇させる方法において使用する。CXCR3+細胞は、CXCR3+/CD4+T細胞、CXCR3+/CD8+T細胞、およびCXCR3+/CD19+B細胞のサブセットを含むが、これらに限定されない。
本明細書において提供するCXCR3抗体またはその抗原結合フラグメントは、CXCR3活性に拮抗するのに有用である。いくつかの実施形態では、抗体および抗原結合フラグメントは、CXCL9、CXCL10および/もしくはCXCL11のような1つもしくはそれ以上のリガンドに結合するCXCR3を阻害し;CXCR3+細胞の例えば炎症部位への遊走、蓄積、動員、もしくは浸潤を阻害し;ならびに/またはCXCR3+細胞を枯渇させる方法において使用する。いくつかの実施形態では、抗体および抗原結合フラグメントは、CXCR3+細胞をin vivoで枯渇させる方法において使用する。CXCR3+細胞は、CXCR3+/CD4+T細胞、CXCR3+/CD8+T細胞、およびCXCR3+/CD19+B細胞のサブセットを含むが、これらに限定されない。
特定の実施形態では、1つまたはそれ以上のCXCR3抗体またはその抗原結合フラグメントを含む医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することによりCXCR3関連疾患または障害を治療するための方法を提供する。一実施形態では、T細胞性自己免疫疾患の増悪を治療する、または減少させる方法を提供する。方法は、本明細書において開示するヒト化抗ヒトCXCR3抗体またはその抗原結合フラグメントを、それを必要とする対象に投与する工程を含み、これによりT細胞性自己免疫疾患の増悪を治療する、または減少させる。特定の実施形態では、T細胞性自己免疫疾患は、初発1型糖尿病である。他の実施形態では、T細胞性自己免疫疾患は、乾癬である。いくつかの実施形態では、それを必要とする対象は、本明細書に記載するように、CXCR3関連疾患もしくはT細胞性自己免疫疾患と診断されている対象を含む、またはCXCR3関連疾患もしくはT細胞性自己免疫疾患が進行する素因を有する。
本明細書において提供する方法により治療する対象は、ヒトまたは他の哺乳動物を含むことができる。一実施形態では、対象は、ヒトである。種々の実施形態では、対象は、予防的に、または異常なCXCR3活性に関連する任意の症状、もしくはCXCR3シグナル伝達の破壊が治療的に有益であり得る任意の症状の発症後に治療することができる。
いくつかの実施形態では、対象は、予防的に、またはT1Dの発症後に治療することができる。いくつかの実施形態では、対象は、本明細書において提供する方法を使用して、T1Dの発症前に予防的に治療することができる。いくつかの実施形態では、初発T1Dを有する対象は、本明細書において提供する方法を使用して治療することができる。
「初発T1Dを有する対象」は、糖尿病と臨床的に診断されたときの対象の年齢に関係なく(例えば、成人、若年者、胎児、または胎芽対象を含む)、膵臓のβ細胞からのインスリン産生能が減少したが、なお検出可能である任意の対象である。最も典型的には、ヒト対象は、対象が若年者、例えば、0〜18歳である場合に初発T1Dを有すると臨床的に診断される。特定の実施形態では、初発T1Dを有する対象は、好ましくは、T1Dの最も初期の臨床診断から約6ヶ月以内(例えば、約1日、1週間、2週間、3週間、1ヶ月、2ヶ月、3ヶ月、4ヶ月、5ヶ月、6ヶ月、またはその間の任意の期間内)に治療を受ける。他の実施形態では、対象は、T1Dの最も初期の臨床診断の後、6ヶ月より長く治療を受けてもよく、この場合、対象は、約0.2nmol/Lよりも高いか、または同等の(例えば、少なくとも約0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.8または1.0nmol/L)、最低限ではあるが測定可能な血清Cペプチドの基礎レベルを維持する。いくつかの実施形態では、治療は、本明細書において開示する抗体のうちの1つまたはそれ以上を含む、1回またはそれ以上の用量の投与を含む。
いくつかの実施形態では、対象は、予防的に、または乾癬の発症後に治療することができる。いくつかの実施形態では、対象は、乾癬の発症前に、または乾癬が広がる前に、本明細書において提供する方法を使用して予防的に治療することができる。いくつかの実施形態では、活動性乾癬を有する対象は、本明細書において提供する方法を使用して治療することができる。
「活動性乾癬を有する対象」は、臨床的に顕著な皮膚、爪、または関節の、乾癬に特徴的な病変を有する任意の対象である。特定の実施形態では、「活動性乾癬を有する対象」は、臨床的に顕著な皮膚の、乾癬に特徴的な病変を有する任意の対象である。特定の実施形態では、「活動性乾癬を有する対象」は、臨床的に顕著な爪の、乾癬に特徴的な病変を有する任意の対象である。特定の実施形態では、「活動性乾癬を有する対象」は、臨床的に顕著な、乾癬に起因し得る関節炎、すなわち、乾癬性関節炎を有する任意の対象である。
実施例
抗体、物質の組成物、および方法を、以下の実施例によりさらに示す。これらの実施例は、さらなる制限として解釈すべきではない。本出願を通じて引用する、配列表、図ならびにすべての参考文献、特許および公開された特許出願の内容は、参照により本明細書に明示的に組み入れる。
抗体、物質の組成物、および方法を、以下の実施例によりさらに示す。これらの実施例は、さらなる制限として解釈すべきではない。本出願を通じて引用する、配列表、図ならびにすべての参考文献、特許および公開された特許出願の内容は、参照により本明細書に明示的に組み入れる。
ヒト化抗CXCR3モノクローナル抗体の生成
抗CXCR3モノクローナル抗体を国際公開第2013/109974号に記載のように生成した。ヒト化クローン53モノクローナル抗体を以下に記載のように生成した。
抗CXCR3モノクローナル抗体を国際公開第2013/109974号に記載のように生成した。ヒト化クローン53モノクローナル抗体を以下に記載のように生成した。
CXCR3を発現する細胞の枯渇を導くことが可能である、クローン53のヒト化バージョンを生成した。表4に示すVHおよびVL配列を有するヒト化クローン53モノクローナル抗体を生成した。
各ヒト化変異体のジャーミナリティ指数スコアを表4に示す。重鎖をIGHV3−23*03/IGHJ4*03生殖系列配列と比較する;軽鎖をIGKV1−9*01/IGKJ2*01生殖系列配列と比較する。
本明細書において提供する各ヒト化モノクローナル抗体の結合特性を表5に示す。
表6は、クローン53(53)、キメラクローン53(Ch53)およびクローン53のヒト化バージョン(53Hu1−53Hu20)の結合特性およびジャーミナリティを示す。
上記データが示すように、本明細書において提供するヒト化抗体は、結合特性が顕著に向上し、その上、好ましいジャーミナリティ指数を有する。
CDR最適化
いくつかのVH CDRおよび/またはVL CDR変異体を生成した。組換えヒトCXCR3に対する結合アビディティを、Biacoreを使用して測定した。少なくとも53Hu37と同等に強力に結合する変異体を表3に示す。
いくつかのVH CDRおよび/またはVL CDR変異体を生成した。組換えヒトCXCR3に対する結合アビディティを、Biacoreを使用して測定した。少なくとも53Hu37と同等に強力に結合する変異体を表3に示す。
CXCR3−173は、枯渇性抗体である。
ハムスター抗マウスCXCR3モノクローナル抗体(クローンCXCR3−173)を前臨床試験において代替抗体として使用した。CXCR3−173は、in vivoでCD4+T細胞を枯渇させない遮断抗体としてこれまでに報告されている(Uppaluriら、Transplantation 86:137〜47(2008年)を参照)。
ハムスター抗マウスCXCR3モノクローナル抗体(クローンCXCR3−173)を前臨床試験において代替抗体として使用した。CXCR3−173は、in vivoでCD4+T細胞を枯渇させない遮断抗体としてこれまでに報告されている(Uppaluriら、Transplantation 86:137〜47(2008年)を参照)。
以下のハムスターCXCR3−173mAbのFc変異体を調製して、抗体のエフェクター機能を試験した:マウスIgG1のアグリコシル化N297G変異体(CXCR3 mIgG1 agly);野生型マウスIgG2aキメラ(CXCR3 mIgG2a WT);枯渇能を抑制するように修飾したマウスIgG2aキメラ(CXCR3 mIgG2a Dab);および野生型マウスIgG3(CXCR3 mIgG3)。
8〜10週齢のC57BL/6マウス(Jackson Laboratories社、1群当たりn=5)に抗体を単回5mg/kgの用量で静脈内投与し、次いで、24時間後に血液を採取して、次のマーカーを使用してフローサイトメトリー分析を行った:C4およびCD8T細胞は、TCRab、CD4およびCD8により;メモリーCD4およびCD8T細胞は、TCRab、CD4、CD8、CD62LおよびCD44による。製造者のプロトコルに従ってCount Brightビーズ(Invitrogen社)を使用して細胞を定量化し、血中の総細胞/マイクロリットルを判定した。
総Tリンパ球およびTリンパ球のサブセットに対するゲーティングによる結果を図1に示す。図に示すように、ハムスターCXCR3−173が、マウスに投与した場合、CD4+およびCD8+メモリーT細胞を枯渇させることが驚くべきことに初めて実証された。
CXCR3−173のFc変異体のエフェクター機能
Biacore3000装置を使用して、CXCR3−173のFc改変変異体のマウスFcγ受容体結合を、抗体捕捉法を使用して評価した。組換えタンパク質A/G(Pierce社)をアミンの化学的性質を利用してCM5センサーチップに共有結合的に固定した。CXCR3−173抗体をHBS−EPバッファー中に5μg/mLまで希釈し、タンパク質A/Gチップに流量10μL/分で30秒間注入した。R&D Systems社の組換えマウスFcγRI(CD64)、FcγRIIb(CD32)、FcγRIII(CD16)、およびFcγIV(CD16−2)をHBS−EPバッファー中に300〜3.7nMまで3倍希釈し、補足した抗体に流量30μL/分で2度毎注入した。表面をグリシン2.0(GE Healthcare社)で再生した。結合反応をタンパク質A/G捕捉のRU量に対して正規化した。結果を図2A〜2Dに示す。
Biacore3000装置を使用して、CXCR3−173のFc改変変異体のマウスFcγ受容体結合を、抗体捕捉法を使用して評価した。組換えタンパク質A/G(Pierce社)をアミンの化学的性質を利用してCM5センサーチップに共有結合的に固定した。CXCR3−173抗体をHBS−EPバッファー中に5μg/mLまで希釈し、タンパク質A/Gチップに流量10μL/分で30秒間注入した。R&D Systems社の組換えマウスFcγRI(CD64)、FcγRIIb(CD32)、FcγRIII(CD16)、およびFcγIV(CD16−2)をHBS−EPバッファー中に300〜3.7nMまで3倍希釈し、補足した抗体に流量30μL/分で2度毎注入した。表面をグリシン2.0(GE Healthcare社)で再生した。結合反応をタンパク質A/G捕捉のRU量に対して正規化した。結果を図2A〜2Dに示す。
図に示すように、野生型マウスIgG2aアイソタイプを有するように修飾したハムスターCXCR3−173は、4つのすべての組換えマウス(rm)Fcγ受容体に結合するが、dAB変異により、この結合が顕著に減少した。野生型マウスIgG3アイソタイプを有するように修飾したCXCR3−173はまた、4つのすべての組換えマウスFcγ受容体に結合する。オリジナルで未修飾のハムスターCXCR3−173は、IgG2aアイソタイプ変異体よりも良好にrmFcγRIIbおよびrmFcγRIIIに結合し、アグリコシル化mIgG1アイソタイプ変異体は、いかなるrmFcγRにも結合しない。
in vitroエフェクター機能
ヒト化抗CXCR3 mAbおよびそのFc改変バージョンを一連のADCCアッセイにおいて調査した。ヒト化抗CXCR3 mAbのFc改変バージョンを、標準的方法を使用して調製した。脱フコシル化バージョンは、キフネンシンの存在下でヒト化mAbを発現する細胞を培養することにより調製した。
ヒト化抗CXCR3 mAbおよびそのFc改変バージョンを一連のADCCアッセイにおいて調査した。ヒト化抗CXCR3 mAbのFc改変バージョンを、標準的方法を使用して調製した。脱フコシル化バージョンは、キフネンシンの存在下でヒト化mAbを発現する細胞を培養することにより調製した。
一次ヒトNK細胞またはバリン多型(Conkwest社)を有するCD16を過剰発現するNK9.2細胞株をエフェクター細胞として使用し、ヒトCXCR3(Aアイソフォーム)を過剰発現するCHOトランスフェクト細胞を標的細胞として使用してADCCアッセイを実行した。
一次NK細胞をエフェクターとして使用する場合のアッセイでは、健常ドナーのleukopakからNK細胞を精製し、IL−2により24時間培養し、次いで、5:1のE:T比で、クロムで一晩標識しておいたCHOヒトCXCR3標的細胞とともに播種した。培養物を組織培養インキュベーター内で3時間インキュベートし、その後、1%のTriton−Xで洗浄および溶解した後、上清をガンマカウンター上で読み取った。
NK9.2細胞をエフェクターとして使用した場合のアッセイでは、NK9.2細胞を製造者の推奨に従ってIL−2により2週間増殖させた。アッセイ当日に、NK9.2細胞(70,000細胞)をカルセインAM(Invitrogen社)で標識し、適切に希釈した抗体とともに30分間インキュベートして抗体を標的細胞上のCXCR3に結合させた。NK細胞を3:1のエフェクター対標的細胞比で播種し、培養物を組織培養インキュベーター内で1時間インキュベートした。培養期間の終わりに細胞をTritonX−100で溶解し、M5プレートリーダー(励起492nmおよび発光515nm)を使用してプレートを読み取った。
ヒトIgG1(Sigma社)を陰性対照として使用し、CD52を過剰発現するCHO細胞の溶解物を溶解物の陽性対照として作用するアレムツズマブ(モノクローナル抗CD52抗体)で処理した。シグナルは、任意蛍光単位(AFU)で表す。パーセント細胞傷害作用は、(実験溶解−自然溶解)/(最大溶解−自然溶解)×100%によって表す。
ヒトIgG1 Fcを有するヒト化抗CXCR3 mAb 53Hu37およびFc改変バージョンをADCCアッセイにおいて試験した。Fc改変バージョンM1(S239D/D332E(EU表記))、M2(G236A/S267E/H268F/S324T/I332E(EU表記)、「AEFTE」)、およびM3(S239D/H268F/S324T/I332E(EU表記)、「DETE」)は、ADCCまたはCDC活性の強化を可能とするアミノ酸の変異を含む。第4のFc改変バージョンは、野生型抗体を産生する細胞株をキフネンシンで処理することにより生成した。
抗ヒトCXCR3クローンであるクローン4(CXCR3 CL4)、クローン12(CXCR3 CL12)、クローン82(CXCR3 CL82)、クローン135(CXCR3 CL135)をまた試験した。独立した実験では、異なるエフェクター細胞、エフェクター:標的(E:T)比、および抗体濃度を用いてアッセイを実行した。代表的結果を図3Bおよび図3Cに示す。
図3Aでは、M1、M2、M3および53Hu37の脱フコシル化バージョンのエフェクター機能について集約する。図3Bは、一次NK細胞をエフェクターとして使用したアッセイの結果を示す。図3Cは、NK9.2細胞をエフェクターとして使用したアッセイの結果を示す。
Fcγ受容体結合
Biacore T200装置を使用して、ヒト化抗CXCR3 mAb 53Hu37および53Hu37のFc改変バージョンのヒトおよびマウスFcγ受容体結合親和性を評価した。Sigma社のタンパク質AをCM5シリーズSチップにアミンの化学的性質を利用して固定した。抗体をタンパク質Aチップ中に注入し、複数の濃度の組換えヒトおよびマウスFcγ受容体(R&D Systems社)を捕捉抗体中に注入した。広範な濃度の受容体を使用して低親和性結合物から高親和性結合物にまで(1.2nM〜最大5μM)及ぶようにした。各試料を2度毎注入した。結合センサーグラムは、1:1の動態結合モデルに適合させた。定量的結果を図4に集約する。
Biacore T200装置を使用して、ヒト化抗CXCR3 mAb 53Hu37および53Hu37のFc改変バージョンのヒトおよびマウスFcγ受容体結合親和性を評価した。Sigma社のタンパク質AをCM5シリーズSチップにアミンの化学的性質を利用して固定した。抗体をタンパク質Aチップ中に注入し、複数の濃度の組換えヒトおよびマウスFcγ受容体(R&D Systems社)を捕捉抗体中に注入した。広範な濃度の受容体を使用して低親和性結合物から高親和性結合物にまで(1.2nM〜最大5μM)及ぶようにした。各試料を2度毎注入した。結合センサーグラムは、1:1の動態結合モデルに適合させた。定量的結果を図4に集約する。
図4に示すように、M1およびM3のFc改変バージョンでは、hFcγRIIIとmFcγRIVの両方に対する親和性が向上し、M2では、hFcγRIIaに対する結合が増加し、キフネンシンで処理した53Hu37は、hFcγRIIIおよびmFcγRIVにおいて、Fc改変バージョンと比較して中程度の増加を示した。
カニクイザルに2mg/kg体重の53Hu37、M1変異体、キフネンシンで処理したバージョン(1抗体処置群当たりn=8)、または溶媒対照(n=6)の単回静脈内注入を行った。事前と、その後注入から1、3、7および14日後に血液試料を採取し、フローサイトメトリーにより総T細胞およびT細胞サブセットについて分析した。フローサイトメトリーでは、赤血球を溶解し、次のマーカーの抗体で細胞を染色して総T細胞ならびにメモリーCD4T細胞およびCD8T細胞を同定した:CD3(クローンSP34−2)、CD4(クローンOKT4)、CD8a(クローンRPA−T8)、CD45RA(クローン5H9)、CCR7(クローンG043H7)、およびCXCR3(クローン1C6)。Count Brightビーズ(Invitrogen社)を使用して細胞を定量して、細胞/マイクロリットル(細胞/μL)を測定した。データは、群の各細胞サブセットの出血前の値の平均パーセントとして経時的に表す。注入後14日目の各処置群のサブセットから得た脾臓試料の組織学的検査を、抗ヒトCXCR3クローン4抗体および適切な二次抗体を使用してCXCR3の固定した試料切片を染色することにより行った。結果を図5A〜5Cに示す。ペプチドELISAを使用して、血液試料由来の血清の薬物動態についてもまた、投与した抗体の血中濃度を測定して評価した。
図に示すように、53Hu37、53Hu37のM1バージョン、およびKif処理53Hu37により、エフェクターメモリーCD4T細胞が減少し、53Hu37、Hu37のM1バージョン、およびKif処理53Hu37により、エフェクターメモリーCD8+T細胞が減少した。さらに、53Hu37のM1バージョンおよびKif処理53Hu37により、抗体の単回静脈内注入から14日後に脾臓においてCXCR3染色が劇的に減少した。
生化学的分析
熱安定性、せん断応力およびウイルス不活化に対する安定性、凍結融解ストレスに対する安定性、撹拌ストレスに対する安定性、およびpH安定性を53Hu37、M1バージョン、およびキフネンシンで処理した53Hu37について測定した。
熱安定性、せん断応力およびウイルス不活化に対する安定性、凍結融解ストレスに対する安定性、撹拌ストレスに対する安定性、およびpH安定性を53Hu37、M1バージョン、およびキフネンシンで処理した53Hu37について測定した。
示差走査熱量測定(DSC)
試料をハイスループットVP−DSC(Microcal社)で分析した。試料を対応するバッファーを用いて約0.5mg/mLまで希釈し、96ウェルプレート上にロードした。スキャンパラメータは、25℃の開始温度および100℃の終了温度で構成した。200℃/hのスキャン速度を使用した。
試料をハイスループットVP−DSC(Microcal社)で分析した。試料を対応するバッファーを用いて約0.5mg/mLまで希釈し、96ウェルプレート上にロードした。スキャンパラメータは、25℃の開始温度および100℃の終了温度で構成した。200℃/hのスキャン速度を使用した。
濁度
340〜360nmにおける5nm刻みの試料吸光度をSpectramax Plus(Molecular Devices社)上で測定し、値を平均して最終濁度測定値を得た。96ウェルのUV平底プレートを物質150〜200μLに使用した。試料添加前にプレートをプレ読取りし、パスチェックを試料値に適用した。Brigitte Eckhardtによる「A Turbidimetric Method to Determine Visual Appearances of Protein Solutions」、Technology Applications Vol.48、No.2 1994年3月〜4月に基づいて、試料値を濁度基準のUV吸光度から得た値と比較して、濁度の程度を分類した。
340〜360nmにおける5nm刻みの試料吸光度をSpectramax Plus(Molecular Devices社)上で測定し、値を平均して最終濁度測定値を得た。96ウェルのUV平底プレートを物質150〜200μLに使用した。試料添加前にプレートをプレ読取りし、パスチェックを試料値に適用した。Brigitte Eckhardtによる「A Turbidimetric Method to Determine Visual Appearances of Protein Solutions」、Technology Applications Vol.48、No.2 1994年3月〜4月に基づいて、試料値を濁度基準のUV吸光度から得た値と比較して、濁度の程度を分類した。
サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)
HP1100または1200シリーズシステムには、TSK SWXLサイズ排除カラムに加えてSWXLガードカラムを装備していた。20mMのリン酸ナトリウム、500mMのNaCl、pH6.0の移動相を使用して試料を35分間実行した。流量は0.5mL/分を使用した。50μgの注入を実行し、UVシグナルを280nmでモニターした。
HP1100または1200シリーズシステムには、TSK SWXLサイズ排除カラムに加えてSWXLガードカラムを装備していた。20mMのリン酸ナトリウム、500mMのNaCl、pH6.0の移動相を使用して試料を35分間実行した。流量は0.5mL/分を使用した。50μgの注入を実行し、UVシグナルを280nmでモニターした。
熱による相対凝集傾向(TI−RAP)
抗ヒトCXCR3抗体(個別の抗体または混合物)0.2mg/mLをPBSバッファーおよび10mMのヒスチジンおよび9%のスクロースバッファー中、5℃(対照)、64℃、67℃、70℃または73℃で10分間インキュベートすることにより、温度による凝集を生じさせた。熱インキュベーションの後、試料を7000×g、5℃で2分間遠心分離して不溶性タンパク質の沈殿物を除去し、上清をカチオン交換クロマトグラフィー(CEX)により分析した。可溶性モノマーのパーセント(および相対凝集傾向)は、熱ストレスを与えた試料のクロマトグラフのピーク面積を対照(5℃)試料のピーク面積を使用して正規化することにより算出した。
抗ヒトCXCR3抗体(個別の抗体または混合物)0.2mg/mLをPBSバッファーおよび10mMのヒスチジンおよび9%のスクロースバッファー中、5℃(対照)、64℃、67℃、70℃または73℃で10分間インキュベートすることにより、温度による凝集を生じさせた。熱インキュベーションの後、試料を7000×g、5℃で2分間遠心分離して不溶性タンパク質の沈殿物を除去し、上清をカチオン交換クロマトグラフィー(CEX)により分析した。可溶性モノマーのパーセント(および相対凝集傾向)は、熱ストレスを与えた試料のクロマトグラフのピーク面積を対照(5℃)試料のピーク面積を使用して正規化することにより算出した。
撹拌による相対凝集傾向(AI−RAP)
撹拌による相対凝集傾向に関しては、最終タンパク質濃度の抗ヒトCXCR3抗体0.2mg/mLをPBSバッファーならびに10mMのヒスチジンならびに0%および0.01%のポリソルベート80を有する9%のスクロースバッファー中に含む5℃の溶液を厳しい撹拌ストレスに5℃で供した。抗ヒトCXCR3抗体の溶液を、VX−2500Multi−Tube Vortexer(VWR社、ウェストチェスター、PA)により最高速度で24時間の総持続時間、撹拌した。
撹拌による相対凝集傾向に関しては、最終タンパク質濃度の抗ヒトCXCR3抗体0.2mg/mLをPBSバッファーならびに10mMのヒスチジンならびに0%および0.01%のポリソルベート80を有する9%のスクロースバッファー中に含む5℃の溶液を厳しい撹拌ストレスに5℃で供した。抗ヒトCXCR3抗体の溶液を、VX−2500Multi−Tube Vortexer(VWR社、ウェストチェスター、PA)により最高速度で24時間の総持続時間、撹拌した。
CEX分析用に試料の小アリコートを取り出すことにより、種々の時点を試験期間中にわたって分析した。試料のアリコートを7000×g(5℃)で2分間遠心分離して不溶性タンパク質の沈殿物を除去し、上清をCEXにより分析した。可溶性モノマーのパーセント(および相対凝集傾向)は、凝集した試料のクロマトグラフのピーク面積を対照(0時間)試料のピーク面積を使用して正規化することにより算出した。
カチオン交換クロマトグラフィー(CEX)
CEX分析は、Agilent 1290 infinity HPLCシステム上でProPac WCX−10分析カラム(弱カチオン交換、4×250mm、Thermo Scientific社)を使用して、25℃で実行した。タンパク質試料20μgをカラム上にロードし、流量0.8mL/分で分析した。カラムは、バッファーA(20mMの酢酸ナトリウム、0.0025%のアジ化ナトリウム、pH5.2)で平衡化し、タンパク質をバッファーB(20mMの酢酸ナトリウム、1Mの塩化ナトリウム、0.0025%のアジ化ナトリウム、pH5.2)の直線勾配0〜100%により40分超溶出した。吸光度を280nmで測定し、280nmでの吸光度のピークを積分してタンパク質ピーク面積を判定した。
CEX分析は、Agilent 1290 infinity HPLCシステム上でProPac WCX−10分析カラム(弱カチオン交換、4×250mm、Thermo Scientific社)を使用して、25℃で実行した。タンパク質試料20μgをカラム上にロードし、流量0.8mL/分で分析した。カラムは、バッファーA(20mMの酢酸ナトリウム、0.0025%のアジ化ナトリウム、pH5.2)で平衡化し、タンパク質をバッファーB(20mMの酢酸ナトリウム、1Mの塩化ナトリウム、0.0025%のアジ化ナトリウム、pH5.2)の直線勾配0〜100%により40分超溶出した。吸光度を280nmで測定し、280nmでの吸光度のピークを積分してタンパク質ピーク面積を判定した。
実験計画
pH/温度ストレス
各クローン由来の物質の一部を20mMのリン酸ナトリウムpH5.0およびリン酸ナトリウムpH7.0中にSlide−A−Lyzer(Thermo Scientific社PN66810)を使用して透析した。対応するバッファーを使用して、この物質を希釈し、Millex GVフィルター(Millipore社PN SLGV033RB)を使用して約2mg/mLまで濾過した。両リン酸ナトリウムpH5およびpH7中の試料を試験の3および5週間前に37℃で保存した。
pH/温度ストレス
各クローン由来の物質の一部を20mMのリン酸ナトリウムpH5.0およびリン酸ナトリウムpH7.0中にSlide−A−Lyzer(Thermo Scientific社PN66810)を使用して透析した。対応するバッファーを使用して、この物質を希釈し、Millex GVフィルター(Millipore社PN SLGV033RB)を使用して約2mg/mLまで濾過した。両リン酸ナトリウムpH5およびpH7中の試料を試験の3および5週間前に37℃で保存した。
凍結融解ストレス
指示する抗ヒトCXCR3抗体を20mMのリン酸ナトリウムpH6.0中にSlide−A−Lyzer(Thermo Scientific社PN66810)を使用して透析した。対応するバッファーを使用して、この物質を希釈し、Millex GVフィルター(Millipore社PN SLGV033RB)を使用して約1mg/mLまで濾過した。凍結融解ストレス試料を−80℃で凍結し、室温で合計5回融解した。1ないし3凍結融解サイクルの後、物質を除去して選択したアッセイにより試験した。最後の凍結融解後に分析的な一連の試験を実行した。
指示する抗ヒトCXCR3抗体を20mMのリン酸ナトリウムpH6.0中にSlide−A−Lyzer(Thermo Scientific社PN66810)を使用して透析した。対応するバッファーを使用して、この物質を希釈し、Millex GVフィルター(Millipore社PN SLGV033RB)を使用して約1mg/mLまで濾過した。凍結融解ストレス試料を−80℃で凍結し、室温で合計5回融解した。1ないし3凍結融解サイクルの後、物質を除去して選択したアッセイにより試験した。最後の凍結融解後に分析的な一連の試験を実行した。
せん断応力
抗体試料を20mMのリン酸ナトリウムpH6.0中にSlide−A−Lyzer(Thermo Scientific社PN66810)を使用して透析した。対応するバッファーを使用して、この物質を希釈し、Millex GVフィルター(Millipore社PN SLGV033RB)を使用して約1mg/mLまで濾過した。せん断応力試料を200μLのピペットで合計50回繰り返し滴下した。
抗体試料を20mMのリン酸ナトリウムpH6.0中にSlide−A−Lyzer(Thermo Scientific社PN66810)を使用して透析した。対応するバッファーを使用して、この物質を希釈し、Millex GVフィルター(Millipore社PN SLGV033RB)を使用して約1mg/mLまで濾過した。せん断応力試料を200μLのピペットで合計50回繰り返し滴下した。
偽ウイルス不活化
抗体試料を20mMのリン酸ナトリウムpH6.0中にSlide−A−Lyzer(Thermo Scientific社PN66810)を使用して透析した。対応するバッファーを使用して、この物質を希釈し、Millex GVフィルター(Millipore社PN SLGV033RB)を使用して約1mg/mLまで濾過した。ウイルス不活化試料を1NのHClでpH3.5にし、室温で100分間そのpHに保持した。保持期間の後、1NのNaOHを使用して試料をpH7.2に戻し、100分間保持した。次いで、1NのNClを使用して試料をpH6.0にして試験した。
抗体試料を20mMのリン酸ナトリウムpH6.0中にSlide−A−Lyzer(Thermo Scientific社PN66810)を使用して透析した。対応するバッファーを使用して、この物質を希釈し、Millex GVフィルター(Millipore社PN SLGV033RB)を使用して約1mg/mLまで濾過した。ウイルス不活化試料を1NのHClでpH3.5にし、室温で100分間そのpHに保持した。保持期間の後、1NのNaOHを使用して試料をpH7.2に戻し、100分間保持した。次いで、1NのNClを使用して試料をpH6.0にして試験した。
結果
示差走査熱量測定:
M1バージョン(D/E変異体)は、Kifバージョンよりもわずかに不安定であり、次いでこのKifバージョンは、53Hu37よりもわずかに不安定であることが見出された。
示差走査熱量測定:
M1バージョン(D/E変異体)は、Kifバージョンよりもわずかに不安定であり、次いでこのKifバージョンは、53Hu37よりもわずかに不安定であることが見出された。
せん断応力:
M1バージョン(D/E変異体)は、53Hu37およびKifバージョンよりもわずかに不安定であり、後者の2つは、ほぼ等しく安定であることが見出された。
M1バージョン(D/E変異体)は、53Hu37およびKifバージョンよりもわずかに不安定であり、後者の2つは、ほぼ等しく安定であることが見出された。
ウイルス不活化ストレス:
M1バージョン(D/E変異体)は、Kifバージョンよりも安定であり、この両方は、53Hu37よりも不安定であることが見出された。
M1バージョン(D/E変異体)は、Kifバージョンよりも安定であり、この両方は、53Hu37よりも不安定であることが見出された。
凍結融解ストレス:
M1バージョン(D/E変異体)、Kifバージョン、および53Hu37は、ほぼ等価であることが見出された。
M1バージョン(D/E変異体)、Kifバージョン、および53Hu37は、ほぼ等価であることが見出された。
撹拌による相対凝集傾向:
抗体のすべてのバージョンの約80パーセントは、撹拌から2時間以内に沈殿し、pH5.5でではあるが、M1バージョン(D/E変異体)は、他の2つのバージョンよりも相対的に安定であった。
抗体のすべてのバージョンの約80パーセントは、撹拌から2時間以内に沈殿し、pH5.5でではあるが、M1バージョン(D/E変異体)は、他の2つのバージョンよりも相対的に安定であった。
凝集体の形成:
pH5.0の管理(非加速)条件下では、M1バージョン(D/E変異体)および53Hu37は、5週間にわたって本質的に安定であったが、Kifバージョンは、乳白光を発した;これと同じパターンは、加速条件下で見出された。pH7.0の管理(非加速)条件下では、抗体の3つのバージョンは、5週間にわたってほぼ同じであった。加速条件下では、DE変異体は、53Hu37よりもわずかに安定し、次いでこの53Hu37は、Kifバージョンよりも安定であった。
pH5.0の管理(非加速)条件下では、M1バージョン(D/E変異体)および53Hu37は、5週間にわたって本質的に安定であったが、Kifバージョンは、乳白光を発した;これと同じパターンは、加速条件下で見出された。pH7.0の管理(非加速)条件下では、抗体の3つのバージョンは、5週間にわたってほぼ同じであった。加速条件下では、DE変異体は、53Hu37よりもわずかに安定し、次いでこの53Hu37は、Kifバージョンよりも安定であった。
前述の実施例は、例示することを意図するものであり、決して本開示を制限するものではない。開示する化合物および方法の他の実施形態は、本明細書において開示する化合物および方法の仕様および実施を考慮すれば当業者に明らかとなろう。
Claims (19)
- T細胞性自己免疫疾患を有する対象において、CXCR3を発現する細胞を枯渇させる方法における使用のための、重鎖(HC)および軽鎖(LC)を含むヒト化抗ヒトCXCR3抗体であって、
a)該HCは、配列番号25のアミノ酸配列を含み、該LCは、配列番号135のアミノ酸配列を含み、
b)該HCは、配列番号26のアミノ酸配列を含み、該LCは、配列番号135のアミノ酸配列を含み、
c)該HCは、配列番号27のアミノ酸配列を含み、該LCは、配列番号135のアミノ酸配列を含み、
d)該HCは、配列番号139のアミノ酸配列を含み、該LCは、配列番号135のアミノ酸配列を含み、
e)該HCは、配列番号31のアミノ酸配列を含み、該LCは、配列番号137のアミノ酸配列を含み、
f)該HCは、配列番号32のアミノ酸配列を含み、該LCは、配列番号137のアミノ酸配列を含み、
g)該HCは、配列番号32のアミノ酸配列を含み、該LCは、配列番号137のアミノ酸配列を含み、または
h)該HCは、配列番号140のアミノ酸配列を含み、該HCは、配列番号137のアミノ酸配列を含む、
前記ヒト化抗ヒトCXCR3抗体。 - T細胞性自己免疫疾患が、初発1型糖尿病である、請求項1に記載の使用のためのヒト化抗ヒトCXCR3抗体。
- T細胞性自己免疫疾患が、乾癬である、請求項2に記載の使用のためのヒト化抗ヒトCXCR3抗体。
- 重鎖可変領域(VH)を有する重鎖(HC)および軽鎖可変領域(VL)を有する軽鎖(LC)を含むヒト化抗ヒトC−X−Cモチーフケモカイン受容体3(CXCR3)抗体であって、
a)該VHおよびVLは、配列番号20/24、18/22、80/130、81/24、82/130、82/24、83/126、83/130、83/24、84/126、84/24、85/24、86/126、87/126、87/133、87/24、88/24、89/24、90/126、91/126、91/130、92/130、92/24、93/126、94/126、95/126、96/126、97/126、98/126、99/126、100/126、101/126、102/126、103/126、104/126、105/126、106/126、107/126、108/126、109/126、110/126、111/126、121/24、113/130、113/24、114/130、115/126、115/130、115/24、116/126、116/130、116/24、117/126、118/126、20/123、20/124、20/125、20/126、20/127、20/128、20/129、20/130、20/131、20/132、20/133、20/134、119/126、122/126および120/130からなる群から選択される配列対のアミノ酸配列をそれぞれ含み、
b)該重鎖は、配列番号9、2、3、4、5、6、7、8、10および11からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むヒトIgG1 Fc領域を含む、前記ヒト化抗ヒトC−X−Cモチーフケモカイン受容体3(CXCR3)抗体。 - VHが、配列番号20のアミノ酸配列を含み、VLが、配列番号24のアミノ酸配列を含む、請求項4に記載のヒト化抗ヒトCXCR3抗体。
- VHが、配列番号18のアミノ酸配列を含み、VLが、配列番号22のアミノ酸配列を含む、請求項4に記載のヒト化抗ヒトCXCR3抗体。
- ヒトIgG1 Fc領域が、配列番号2、9、10および11からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項5または6に記載のヒト化抗ヒトCXCR3抗体。
- であって、
a)HCは、配列番号25のアミノ酸配列を含み、LCは、配列番号135のアミノ酸配列を含み、
b)HCは、配列番号26のアミノ酸配列を含み、LCは、配列番号135のアミノ酸配列を含み、
c)HCは、配列番号27のアミノ酸配列を含み、LCは、配列番号135のアミノ酸配列を含み、
d)HCは、配列番号139のアミノ酸配列を含み、LCは、配列番号135のアミノ酸配列を含み、
e)HCは、配列番号31のアミノ酸配列を含み、LCは、配列番号137のアミノ酸配列を含み、
f)HCは、配列番号32のアミノ酸配列を含み、LCは、配列番号137のアミノ酸配列を含み、
g)HCは、配列番号32のアミノ酸配列を含み、LCは、配列番号137のアミノ酸配列を含み、または
h)HCは、配列番号140のアミノ酸配列を含み、HCは、配列番号137のアミノ酸配列を含む、
請求項4〜7のいずれか1項に記載のヒト化抗ヒトCXCR3抗体。 - HCが、フコース含量を減少させたヒトIgG1 Fc領域を含む、請求項4〜8のいずれか1項に記載のヒト化抗ヒトCXCR3抗体。
- グリコシル化阻害物質の存在下で培養された宿主細胞において生成される、請求項4〜8のいずれか1項に記載のヒト化抗ヒトCXCR3抗体。
- グリコシル化阻害物質が、キフネンシンである、請求項10に記載のヒト化抗ヒトCXCR3抗体。
- 請求項4〜11のいずれか1項に記載のヒト化抗ヒトCXCR3抗体、および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
- T細胞性自己免疫疾患を治療する方法における使用のための、請求項4〜12のいずれか1項に記載のヒト化抗ヒトCXCR3抗体、または請求項15に記載の医薬組成物。
- T細胞性自己免疫疾患が、初発1型糖尿病である、請求項13に記載の使用のための、ヒト化抗ヒトCXCR3抗体またはその医薬組成物。
- T細胞性自己免疫疾患が、乾癬である、請求項13に記載の、ヒト化抗ヒトCXCR3抗体またはその医薬組成物。
- CXCR3を発現する細胞を対象において枯渇させる方法における使用のための、請求項4〜11のいずれか1項に記載のヒト化抗ヒトCXCR3抗体、または請求項15に記載の医薬組成物。
- 対象が、T細胞性自己免疫疾患を有する、請求項16に記載の使用のための、ヒト化抗ヒトCXCR3抗体またはその医薬組成物。
- T細胞性自己免疫疾患が、初発1型糖尿病である、請求項16に記載の使用のための、ヒト化抗ヒトCXCR3抗体またはその医薬組成物。
- T細胞による自己免疫疾患が、乾癬である、請求項16に記載の使用のための、ヒト化抗ヒトCXCR3抗体またはその医薬組成物。
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