TWI565713B - 蛋白基質疫苗以及該疫苗的製造與使用方法 - Google Patents

蛋白基質疫苗以及該疫苗的製造與使用方法 Download PDF

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Description

蛋白基質疫苗以及該疫苗的製造與使用方法 聯邦政府出資研究聲明
本發明榮獲美國國家衛生研究院(National Institutes of Health，NIH)之支持，編號U54AI057159。美國政府並擁有本發明特定權利。
本發明係有關於疫苗組成物，以及該疫苗的製造與使用方法
很多抗原，特別是那些與病原莢膜層有關的，因刺激少或無免疫反應，使製造抗這些抗原過於複雜。莢膜為微生物表面構成要素，一般由有機化合物之聚合物所組成，如碳水化合物、胺基酸或乙醇。莢膜在化學上是十分多變。製成莢膜之單體(如碳水化合物)可與各種分子構型連結一起，且尚可以磷、氮、硫及其它化學修飾取代。這些化學變異使得莢膜在微生物表面上呈現許多的抗原標的，因而可逃避針對這些標的之宿主免疫系統。莢膜亦可為毒性因子，以制止微生物不讓宿主巨噬細胞或多型核白血球(polymorphoneuclear leukocyte)吞噬或殺死。對抗莢膜之抗體具對抗莢膜型生物體強有力的防護，係藉補體附著於微生物表面，造成它們溶解或它們調理作用(Opsonization)、吸收，及為噬菌宿主免疫細胞所殺死。 對抗莢膜之大部份高效抗體為IgG抗體。無法誘導IgG顯著水準之莢膜稱之T-細胞依靠型抗原(T-dependent antigen)。蛋白質對莢膜之共價結合使得它們為“T-細胞依靠型”，而這抗原可引起IgG反應。
有鑑於此，亟需一種安全、合成可得、成本低並對莢膜及不引起強大免疫反應或IgG抗體之其它非T-細胞依靠型抗原(T-independent antigen)的疫苗。這疫苗須可保護對抗各種感染疾病，如炭疽菌(anthrax)、肺炎球菌(pneumococcus)、B型嗜血桿菌(influenzae Type B)、腦膜炎雙球菌(meningococcus)及鏈球菌(streptococcus)所感染。
本發明有關於疫苗組成物，該組成物包括在一複合物中載體蛋白包合所要之抗原，以及該疫苗的製造與使用方法。
在本發明第一形態中，該組成物包括所要之抗原及載體蛋白，其中(i)不超過50%所要抗原與該載體蛋白交聯，且(ii)該抗原為該載體蛋白所包合形成複合物。
本發明第一形態最佳實施例中，該複合物具有介於10nm及100μm間之直徑。更佳地，本發明第一形態最佳實施例中，該複合物具有約100nm至100μm之直徑。又更佳地，本發明第一形態最佳實施例中，該複合物具有約100nm至10μm之直徑。
在本發明第一形態另一最佳實施例中，投予哺乳動物時，該複合物引起哺乳動物T-細胞決定性免疫反應(T-cell dependent immune response)。
在本發明第一形態又一最佳實施例中，該抗原及該載體蛋白之摩耳數比介於1至10及10至1間。該載體蛋白最佳為多聚體(multimer)，如包括至少5個次單體(subunit)之多聚體。另一最佳實施例，該多聚體為同型多聚體(homomultimer)。
在本發明第一形態另一最佳實施例中，該載體蛋白共價鍵結至至少一另載體蛋白。較佳地，該共價鍵結包括含離胺酸(lysine)支鏈初級胺基及天冬胺酸(aspartate)或麩胺酸(glutamate)支鏈羧基間之胜肽鍵。另一最佳實施例 中，該共價鍵結包括化學式之化合物，其中Rn為1至12個碳原子之直鏈或支鏈烷基、1至12個原子之直鏈或支鏈雜烷基、2至12個碳原子之直鏈或支鏈烯、2至12個碳原子之直鏈或支鏈炔、5至10個碳原子之芳香殘基(aromatic residue)、3至10個原子之環狀系統、-(CH2CH2O)qCH2CH2-其中q為1至4或鍵結兩個醛基之化學鍵。又一最佳實施例中，該共價鍵結包括戊二醛(glutaraldehyde)、順丁烯酰胺苯甲酸-N-琥珀酸酯(m-maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester，MBS)、碳二亞胺(carbodiimide)或雙-二氮化聯苯胺(bis-biazotized benzidine)。又另一最佳實施例中，該共價鍵結包括雙功能交聯劑(bifunctional cross-linker)。較佳地，該雙功能交聯劑為戊二醛、辛二酸雙磺基琥珀醯亞胺酯(bis[sulfosuccinimidyl]suberate)或己二(亞胺)酸二甲酯(dimethyl adipimidate)。
在本發明第一形態另一最佳實施例中，該載體蛋白非共價鍵結。最佳實施例中，該非共價鍵結包括疏水性作用(hydrophobic interaction)、離子作用、凡得瓦耳力(van der Waals)或氫鍵。
在本發明第一形態又一最佳實施例中，該載體蛋白為白喉毒素(diphtheria toxin，DT)或其突變物、白喉類毒素(diphtheria toxoid)、破傷風毒素(tetanus toxin)或其突變物、破傷風桿菌類毒素、綠膿桿菌外毒素A(Pseudomonas aeruginosa exotoxin A)或其突變物、霍亂毒素次單元B(cholera toxin B subunit)、破傷風毒素C端片段(tetanus toxin fragment C，TTFC)、細菌鞭毛蛋白(bacterial flagellin)(如霍亂弧菌(Vibrio cholerae)鞭毛蛋白)、肺炎球菌溶血素(pneumolysin)、腦膜炎雙球菌(Neisseria meningitidis)外膜蛋白、綠膿桿菌Hcp1蛋白、大腸桿菌不耐熱腸毒素(Escherichia coli heat labile enterotoxin)、類志賀氏毒素(shiga-like toxin，SLT)(如志賀氏桿菌(Shigella)SltB2蛋白)、人類LTB蛋白、肺炎球菌溶血素(pneumolysin)、李斯特溶解素O(listeriolysin O)(或相關蛋白)、整個細菌細胞(如綠膿桿菌或鏈球菌細胞)萃取之蛋白、炭疽桿菌(Bacillus anthracis)顯著抑制型(dominant-negative mutant)(DNI)保護性抗原(Protective antigen，PA)或大腸桿菌β半乳糖苷酶(beta-galactosidase)。最佳實施例中，特別地，該載體蛋白為肺炎球菌溶血素、李斯特溶解素O、白喉毒素、白喉類毒素、破傷風毒素或破傷風類毒素。
在本發明第一形態另一最佳實施例中，該所要之抗原為多醣、多元醇或聚胺基酸。較佳地，該多醣包含至少18個殘基。另一最佳實施例中，該多醣為肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae，SP)多醣、土拉倫法式菌(Francisella tularensis)多醣、炭疽桿菌多醣、流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae)多醣、傷寒桿菌(Salmonella typhi)多醣、沙門氏桿菌屬(Salmonella)多醣、志賀氏桿菌多醣或腦膜炎雙球菌多醣。最佳實施例中，特別地，該肺炎鏈球菌多醣為第3、4、6B、7A、7B、7C、7F、9A、9L、9N、9V、12A、12B、12F、14、15A、15B、15C、15F、17、18B、18C、19F、23F、25A、25F、33F、35、37、38、44或46型莢膜。另一最佳實施例中，特別地，該土拉倫法式菌多醣為O抗原。
在本發明第一形態又一最佳實施例中，該所要抗原為微生物莢膜聚合。較佳地，該微生物莢膜聚合物為炭疽桿菌聚之γ-D-麩胺酸(poly-gamma-D-glutamic acid)。
在本發明第一形態另一最佳實施例中，該所要抗原為由具至少三個原子之單體所組成之有機聚合物，其中每一原子獨立地擇自於碳、氧、氫、磷、氮及硫。較佳地，該 有機聚合物衍生自微生物。另一最佳實施例中，該有機聚合物非自然界所存在。
又另一最佳實施例中，該疫苗組成物更包括一第二所要抗原。較佳地，該疫苗組成物更包括第三所要抗原。
在本發明第二形態特載製造疫苗組成物之方法。該方法包括(i)將所要抗原與載體蛋白混合以形成該抗原及該載體蛋白之混合物；以及(ii)以該載體蛋白包合該所要抗原，其中在該疫苗組成物中，該所要抗原不超過50%與該載體蛋白交聯。
在本發明第二形態最佳實施例中，該疫苗組成物更包括藥學上可接受之賦形劑。
在本發明第二形態另一最佳實施例中，該包合(entrapping)包括使該抗原及該載體蛋白從混合物沈澱。較佳地，該沈澱包括該混合物pH改變、添加三氯乙酸(trichloroacetic acid，TCA)或硫酸銨(ammonium sulfate)至該混合物、藉提升或降低該混合物無機鹽濃度改變該混合物離子強度、加熱該混合物引起該載體蛋白和/或該抗原共軛或以足夠通量之游離輻射照射處理該混合物引起交聯。
在本發明第二形態最佳實施例中，在該疫苗組成物中，該抗原及該載體蛋白之摩耳數比介於1至10及9至1間。
在本發明第二形態又一最佳實施例中，該載體蛋白為多聚體。較佳地，該多聚體包括至少5個次單體。另一最 佳實施例，該多聚體為同型多聚體。
在本發明第二形態又另一最佳實施例中，該載體蛋白非共價鍵結。較佳地，該非共價鍵結包括疏水性作用、離子作用、凡得瓦耳力或氫鍵。
在本發明第二形態又一最佳實施例中，該載體蛋白為白喉毒素或其突變物、白喉類毒素、破傷風毒素或其突變物、破傷風桿菌類毒素、綠膿桿菌外毒素A或其突變物、霍亂毒素次單元B、破傷風毒素C端片段、細菌鞭毛蛋白(如霍亂弧菌鞭毛蛋白)、肺炎球菌溶血素、李斯特溶解素O、腦膜炎雙球菌外膜蛋白、綠膿桿菌Hcp1蛋白、大腸桿菌不耐熱腸毒素、類志賀氏毒素(志賀氏桿菌SltB2蛋白)、人類LTB蛋白、整個細菌細胞(如綠膿桿菌或鏈球菌細胞)萃取之蛋白、炭疽桿菌顯著抑制型(DNI)保護性抗原或大腸桿菌β半乳糖苷酶。最佳實施例中，特別地，該載體蛋白為肺炎球菌溶血素、李斯特溶解素O、白喉毒素、白喉類毒素、破傷風毒素或破傷風類毒素。
在本發明第二形態另一最佳實施例中，該所要抗原為多醣、多元醇或聚胺基酸。較佳地，該多醣包含至少18個殘基。另一最佳實施例中，該多醣為肺炎鏈球菌多醣、土拉倫法式菌多醣、炭疽桿菌多醣、流感嗜血桿菌多醣、傷寒桿菌多醣、沙門氏桿菌屬多醣、志賀氏桿菌多醣或腦膜炎雙球菌多醣。最佳實施例中，特別地，該肺炎鏈球菌多醣為第3、4、6B、7A、7B、7C、7F、9A、9L、9N、9V、12A、12B、12F、14、15A、15B、15C、15F、17、18B、18C、19F、 23F、25A、25F、33F、35、37、38、44或46型莢膜。另一最佳實施例中，特別地，該土拉倫法式菌多醣為O抗原。
在本發明第二形態又另一最佳實施例中，該所要抗原為微生物莢膜聚合物。較佳地，該微生物莢膜聚合物為炭疽桿菌聚之γ-D-麩胺酸。
在本發明第二形態又另一最佳實施例中，該所要抗原為由具至少三個原子之單體所組成之有機聚合物，其中每一原子獨立地擇自於碳、氧、氫、磷、氮及硫。較佳地，該有機聚合物衍生自微生物。另一最佳實施例中，該有機聚合物非自然界所存在。
在本發明第二形態又另一最佳實施例中，步驟(i)混合包括第二所要抗原或甚至第三所要抗原。
在本發明第三形態特載製造疫苗組成物之另一方法。該方法包括(i)將所要抗原與載體蛋白混合；以及(ii)添加交聯該載體蛋白之連接劑(linker)，其中在該疫苗組成物中，該所要抗原不超過50%與該該載體蛋白交聯。
在本發明第三形態最佳實施例中，該疫苗組成物更包括藥學上可接受之賦形劑。本發明第三形態另一最佳實施例中，在該疫苗組成物中，該抗原及該載體蛋白摩耳數比介於1至10及10至1間。本發明第三形態又一最佳實施例中，該載體蛋白為多聚體。較佳地，該多聚體包括至少5個次單體。另一最佳實施例，該多聚體為同型多聚體。
在本發明第三形態又一最佳實施例中，該方法包括還原載體蛋白中的希夫鹼。在本發明第三形態再又一最佳實 施例中，該載體蛋白共價鍵結至至少一另載體蛋白。較佳地，該共價鍵結包括含離胺酸支鏈初級胺基及天冬胺酸或麩胺酸支鏈羧基間之胜肽鍵。另一最佳實施例中，包括雙功能交聯劑。較佳地，該雙功能交聯劑為戊二醛、辛二酸雙磺基琥珀醯亞胺酯或己二(亞胺)酸二甲酯。
本發明第三形態又一最佳實施例中，該連接劑為化學 式之化合物，其中Rn為1至12個碳原子之直鏈或支鏈烷基、1至12個原子之直鏈或支鏈雜烷基、2至12個碳原子之直鏈或支鏈烯、2至12個碳原子之直鏈或支鏈炔、5至10個碳原子之芳香殘基、3至10個原子之環狀系統、-(CH2CH2O)qCH2CH2-其中q為1至4或鍵結兩個醛基之化學鍵。
在本發明第三形態另一最佳實施例中，該連接劑為戊二醛、順丁烯酰胺苯甲酸-N-琥珀酸酯、碳二亞胺或雙-二氮化聯苯胺。
在本發明第三形態又一最佳實施例中，該載體蛋白為白喉毒素或其突變物、白喉類毒素、破傷風毒素或其突變物、破傷風桿菌類毒素、綠膿桿菌外毒素A或其突變物、霍亂毒素次單元B、破傷風毒素C端片段、細菌鞭毛蛋白(如霍亂弧菌鞭毛蛋白)、肺炎球菌溶血素、李斯特溶解素O、腦膜炎雙球菌外膜蛋白、綠膿桿菌Hcp1蛋白、大腸桿菌不耐熱腸毒素、類志賀氏毒素(志賀氏桿菌SltB2蛋白)、人類LTB蛋白、整個細菌細胞(如綠膿桿菌或鏈球菌細胞)萃取之蛋白、炭疽桿菌顯著抑制型(DNI)保護性抗原或大腸桿 菌β半乳糖苷酶。
本發明第三形態又一最佳實施例中，該所要抗原為多醣、多元醇或聚胺基酸。較佳地，該多醣包含至少18個殘基。另一最佳實施例中，該多醣為肺炎鏈球菌多醣、土拉倫法式菌多醣、炭疽桿菌多醣、流感嗜血桿菌多醣、傷寒桿菌多醣、沙門氏桿菌屬多醣、志賀氏桿菌多醣或腦膜炎雙球菌多醣。最佳實施例中，特別地，該肺炎鏈球菌多醣為第3、4、6B、7A、7B、7C、7F、9A、9L、9N、9V、12A、12B、12F、14、15A、15B、15C、15F、17、18B、18C、19F、23F、25A、25F、33F、35、37、38、44或46型莢膜。另一最佳實施例中，特別地，該土拉倫法式菌多醣為O抗原。
在本發明第三形態另一最佳實施例中，該所要抗原為微生物莢膜聚合。較佳地，該微生物莢膜聚合物為炭疽桿菌聚之γ-D-麩胺酸。
在本發明第二形態又另一最佳實施例中，該所要抗原為由具至少三個原子之單體所組成之有機聚合物，其中每一原子獨立地擇自於碳、氧、氫、磷、氮及硫。較佳地，該有機聚合物衍生自微生物。另一最佳實施例中，該有機聚合物非自然界所存在。
在本發明第二形態又另一最佳實施例中，步驟(i)混合包括第二所要抗原或甚至第三所要抗原。
在本發明第四形態特載受試者接種抗致病因子疫苗之方法。該方法包括投予受試者一足夠量之本發明第一形態疫苗組成物，以誘導受試者體內抗體產生。本發明第四形 態最佳實施例中，該方法包括第二投藥步驟，再投予受試者足夠量本發明第一形態之疫苗組成物，以補強(boost)受試者體內抗體產生。較佳地，本發明第四形態中，該抗體產生為T-細胞決定性。本發明第四形態另一最佳實施例中，該抗體產生足以預防或降低該受試者因致病因子感染。較佳地，該致病因子為肺炎球菌、腦膜炎雙球菌、B型流感嗜血桿菌、綠膿桿菌、土拉倫法式菌、志賀氏桿菌屬、沙門氏桿菌屬、不動桿菌屬(Acinetobacter species)、伯克氏菌屬(Burkholderia species)或大腸桿菌。
在本發明第四形態另一最佳實施例中，該方法包括第二投藥步驟，再投予受試者足夠量包含所要抗原第二疫苗組成物，以補強受試者體內抗體產生。較佳地，抗體產生足以預防或降低該受試者因第二致病因子感染。
在本發明第四形態最佳實施例中，該抗體為IgG抗體。本發明第四形態又一最佳實施例中，該受試者為人類。
定義
本處結合疫苗所用「投藥、給藥(administering)」意謂提供受試者一足以誘導受試者免疫反應之劑量的疫苗，其中該免疫反應導致抗體產生，該抗體專一鍵結該疫苗中抗原。較佳地，投藥包括肌肉(intramuscular injection)注射、皮內注射(intradermal injection)或經皮注射(transcutaneous injection)，較佳地，包括適當免疫佐劑(adjuvant)給藥。投藥可包括疫苗單一給藥或多劑疫苗 給藥。較佳地，第二給藥設計為補強受試者體內抗體產生，以避免因致病因子感染。疫苗劑量之頻率及數量取決於該疫苗之專一活性且可經由例行試驗判斷。
「交聯(cross-link)」意謂兩分子、大分子或分子組合，如載體蛋白間共價鍵形成。該鍵形成為直接、使用「零長度(zero-length)」連接劑或以第三分子，化學連接劑，其具有兩個官能基，每一個可與兩個個別分子之一形成共價鍵或在同一分子中兩個個別官能基間形成共價鍵(即這些將形成亦可包圍於該聚合物之圈環)。連接劑例子包括可交聯兩載體蛋白之雙功能交聯劑。交聯亦可發生於抗原與載體蛋白間。
本處所用「抗原(antigen)」意謂抗體或抗體片段專一結合之任何分子或分子組合。
本處所用「雙功能交聯劑(bifunctional linker)」意謂具兩官能基之化合物，每一官能基個別可於兩個別分子、原子或分子組合形成共價鍵。雙功能交聯劑例子如G.T.Hermanson(Bioconjugate Techniques,Academic Press,1996)及Dick與Beurret(Conjugate Vaccines.Contribu.Microbiol.Immunol.,Karger,Basal 10：48-114,1989)所述。較佳地，雙功能交聯劑為戊二醛、辛二酸雙磺基琥珀醯亞胺酯或己二(亞胺)酸二甲酯。
本處所用「連接劑(linker)」意謂共價結合兩或多分子之化合物或化學鍵。較佳地，連接劑為戊二醛或化學式 之化合物，其中Rn為1至12個碳原子之直鏈或支鏈 烷基、1至12個原子之直鏈或支鏈雜烷基、2至12個碳原子之直鏈或支鏈烯、2至12個碳原子之直鏈或支鏈炔、5至10個碳原子之芳香殘基(aromatic residue)、3至10個原子之環狀系統、-(CH2CH2O)qCH2CH2-其中q為1至4或鍵結兩個醛基之化學鍵。連接可直接無使用連接分子。舉例來說，蛋白質羧基可用碳二亞胺化學或用催化這種交聯之轉麩胺酸酶(transglutaminase)酵素性直接連接至它的胺基。
「補強抗體產生(boost the production of antibodies)」意謂第二次暴露抗原發生之記憶B-細胞活化，稱之增幅反應(booster response)，且表明長期存在次發性(second)記憶免疫反應抗原，導致抗體產生長期存在。
「載體蛋白(carrier protein)」意謂用於疫苗之蛋白質，該疫苗對它自己和/或具載體蛋白之抗原複合物引起免疫反應。較佳地，該抗原以載體蛋白包合成複合物，與非載體蛋白共價鍵結。但是，該抗原及該載體蛋白亦可彼此共價鍵結。較佳地，該載體蛋白包含T-辨識之抗原決定位(epitope)。載體蛋白定義亦包括分支肽之多抗原肽(MAP)。較佳地，MAP包括離胺酸。最好載體蛋白例子包括毒素及類毒素(化學或基因)，可為突變的。較佳地，載體蛋白為白喉毒素(diphtheria toxin，DT)或其突變物、白喉類毒素(diphtheria toxoid)、破傷風毒素(tetanus toxin)或其突變物、破傷風桿菌類毒素、綠膿桿菌外毒素 A(Pseudomonas aeruginosa exotoxin A)或其突變物、霍亂毒素次單元B(cholera toxin B subunit)、破傷風毒素C端片段(tetanus toxin fragment C，TTFC)、細菌鞭毛蛋白(bacterial flagellin)、肺炎球菌溶血素(pneumolysin，Pn)、李斯特溶解素O(listeriolysin O)(或相關分子)、腦膜炎雙球菌(Neisseria meningitidis)外膜蛋白、綠膿桿菌Hcp1蛋白、大腸桿菌不耐熱腸毒素(Escherichia coli heat labile enterotoxin)、類志賀氏毒素(shiga-like toxin，SLT)、人類LTB蛋白、整個細菌細胞萃取之蛋白、炭疽桿菌(Bacillus anthracis)顯著抑制型(dominant-negative mutant)(DNI)保護性抗原(protective antigen，PA)或大腸桿菌β半乳糖苷酶(beta-galactosidase)或任何可為連接劑所交聯之蛋白。
「DNI」意謂顯著抑制型突變(dominant negative mutant，DNI)蛋白，為炭疽桿菌保護性抗原(PA)突變型，如Benson et al.(Biochemistry 37：3941-3948,1998)所述。
參照抗原，本處所用「包合(entrapped)」意謂在生理條件下，將抗原以載體蛋白保持在複合物。較佳地，該抗原以載體蛋白於缺少該抗體及載體蛋白間顯著共價鍵結包合於複合物。本處所用缺少顯著共價鍵結意謂不超過50%抗原共價鍵結至載體蛋白。較佳地，不超過40%、30%、10%或5%抗原共價鍵結至載體蛋白。
「感染(infection)」意謂受試者遭微生物，如細菌、 真菌、寄生蟲或病毒入侵。該感染可包括，如正常存在受試者身體中或上之微生物過量增殖或非正常存在受試者身體中或上之微生物增殖。存在受試者身體中或上之微生物族群過量或微生物族群存在危害細胞或引起該受試者組織病症，則受試者罹患微生物感染。
「致病因子(infectious agent)」意謂引起感染之微生物。
「致免疫性(immunogenic)」意謂誘導受試者免疫反應之化合物。較佳地，該免疫反應為牽涉IgG抗體產生之T-細胞決定性免疫反應。
「微生物(microbe)」意謂可引起受試者感染之細菌、真菌、寄生蟲或病毒。
「微生物莢膜聚合物(microbial capsular polymer)」意謂微生物莢膜層中或上之聚合物。較佳地，微生物莢膜聚合物為有機聚合物，如多醣、磷酸化多醣、具N-乙醯取代之胺基糖的多醣、含磺醯化糖(sulfanylated sugar)、另一硫酸修飾糖或磷酸修飾糖、多元醇、聚胺基酸、磷壁酸(teichoic acid)、脂多醣之O支鏈的多醣。
「單體(monomer)」意謂與同樣單體可形成二或三鍵結之分子結構，為聚合體之部分時，通常產生重複單體次結構之鏈或一連串分支、連接鏈。
「有機聚合物(organic polymer)」意謂由共價鍵結之單體所組成之聚合物，其中每一單體具三或多個下列原子：碳、氧、氫、磷、氮及硫。較佳地，有機聚合物為多 醣、磷酸化多醣、具N-乙醯取代之胺基糖的多醣、含磺醯化糖(sulfanylated sugar)、另一硫酸修飾糖或磷酸修飾糖、糖、多元醇、聚胺基酸、磷壁酸(teichoic acid)、脂多醣之O支鏈的多醣。
「多元醇(polyalcohol)」意謂碳水化合氫化形式，其中羰基已還原一級或二級羥基。多元醇例子為聚亞烷基氧化物(polyalkylene oxide，PAO)，如聚烯烴基二醇(polyalkylene glycol，PAG)，包括聚甲二醇、聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)、甲氧基聚乙二醇(methoxypolyethylene glycol，mPEG)及聚丙二醇；聚乙烯醇(poly-vinyl alcohol，PVA)；聚乙二烯馬來酸酐共聚物(polyethylene-co-maleic acid anhydride)；聚苯乙烯馬來酸酐共聚物(polystyrene-co-malic acid anhydride)；葡聚醣(dextran)，包括羧甲基葡聚醣；纖維素，包括甲基纖維素、羧甲基纖維素、乙基纖維素、羥乙基纖維素、羧乙基纖維素及羥丙基纖維素；水解甲殼素；澱粉，如羥乙基澱粉及羥丙基澱粉；肝醣；洋菜(agarose)及其衍生物；瓜爾膠(guar gum)；普魯蘭多醣(pullulan)；菊糖(inulin)；黃原膠(xanthan gum)；鹿角菜膠(carrageenan)；果膠(pectin)；水解藻酸(alginic acid hydrolysate)；山梨糖醇(sorbitol)；葡萄糖、甘露糖、半乳糖、阿拉伯糖、古羅糖(gulose)、木糖、蘇丁糖(threose)、山梨糖、果糖、甘油、麥芽糖、纖維雙糖、蔗糖、直鏈澱粉、支鏈澱粉之酒精或單丙二醇(mono propylene glycol，MPG)。
「聚胺基酸(poly amino acid)」意謂至少兩個胺基酸以肽鍵(peptide bond)鍵結。較佳地，聚胺基酸為含重複胺基酸序列或相同胺基酸之鏈(即均聚物(homopolymer))的胜肽。
「還原希夫鹼(reducing a Schiff base)」意謂使甲亞胺或化學式R1R2C=N-R3(其中R1、R2及R3為化學次結構，一般含碳原子)之化合物暴露於還原劑，該還原劑使該希夫鹼雙鍵以氫原子飽和。還原方法為熟悉該項技術者所知悉。
參照抗體或其片段，本處所用「專一鍵結(specifically binds)」意謂對特定蛋白質，如抗原，之抗體或抗體片段增加之親和力，相對於其它任何蛋白質等量之親和力。較佳地，抗體或抗體片段具它的抗原親和力為至少2-倍、5-倍、10-倍、30-倍或100-倍超過其它任何蛋白質等量之親和力，包括相關抗原，該親和力以標準方法判斷，如酵素聯結免疫分析(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)。
「受試者(subject)」意謂可受微生物感染之動物。較佳地，受試者為哺乳動物，如人類、猴子、狗、貓、大鼠、小鼠、牛、綿羊、山羊或馬。最佳實施例中，該受試者為人類，如人類小孩。較佳地，該受試者為人類嬰充、學步的小孩或青春期前孩童。
「非T-細胞依靠型抗原(T-cell independent antigen)」意謂無需T淋巴細胞參與，就能產生抗體之抗原。較佳地，非T-細胞依靠型抗原無需T淋巴細胞參與，直接刺激B淋巴細胞。較佳地，非T-細胞依靠型抗原例子包括莢膜抗原聚γ-D-麩胺酸(poly-gamma-D-glutamic acid，PGA)、藻酸(alginic acid或algenate)、葡聚醣、多醣(polysaccharides，PS)、聚胺基酸、多元醇及核酸。
優勢
相較存在疫苗技術，本發明疫苗製造簡單、較少化學問題、較少免疫問題、不貴、更適合不同所要抗原及載體蛋白勝於共軛技術(conjugate technology)及更彈性創造多價疫苗(保護性抗多種抗原之疫苗)。
本發明疫苗於載體蛋白及預期引起免疫反應之抗體間不需共價鍵結，因此相較於共軛疫苗技術，簡化製造方法，並降低製備成本。多醣(PS)-蛋白共軛疫苗在開發中國家製造及銷售費用過分昂貴，而傳統共軛疫苗難以便宜製造，因為每一疫苗須高度專門化學及PS與載體蛋白兩者生產及純化成本。
本發明疫苗亦滿足可安全誘導抗先前頑強的抗原之免疫力的疫苗之需求。這疫苗可為單價(具誘導一免疫反應之單一抗原)或多價(具誘導多種免疫反應之多抗原)。包含類鐸受體(Toll-like receptor，TLR)配體(ligand)之疫苗已顯示對其它頑強的抗原引起免疫反應，但有不安全之疑慮，因TLR配體常易引起發炎、甚至少劑量就有毒性、不良反應，且相較於本發明疫苗可能引起不良症狀。
本發明其它特徵及優點由下列詳細說明、申請專利範圍及圖示即為明顯清楚。
本發明特載疫苗組成物及該組成物的製造與使用方法，以提供抗非T-細胞依靠型抗原或正常引起弱免疫反應之抗原，如多醣(PS)、多元醇、聚胺基酸及其它有機聚合物。本發明疫苗具典型PS-蛋白共軛疫苗之有效能免疫特性，但較佳地，不同於共軛疫苗，因為無顯著共價原子鍵結被需要去鍵結所要的抗原，如PS或莢膜有機聚合物，至該載體蛋白。更確切地說，所要的抗原，如PS或莢膜有機聚合物，為該載體蛋白所包合。舉例來說，蛋白基質可於可於可溶抗原，如PS或莢膜有機聚合物，以共價交聯載體蛋白分子至它們而形成：這些疫苗視作為蛋白基質疫苗。彼此高度交聯之載體蛋白可形成可捕捉抗原之基質且促進該抗原之吸收及刺激免疫細胞之抗體產生。該載體蛋白基質可為包圍該抗原之網狀物或連續串珠形式，其中連續串珠中，比擬該抗原為串線，而該蛋白或交聯蛋白複合物為珠。該抗原以該載體蛋白包合，假如該載體蛋白包圍該抗原，形成珠圍繞於該抗原或三維網狀物將該抗體纏結於中。此外，該載體及該抗原可為交聯，如以該抗原鏈及該載體蛋白鏈間交聯。最佳實施例中，該抗原及該載體蛋白為非共價鍵結。這非共價鍵結可包括疏水性作用、離子作用、凡得瓦耳作用或氫鍵。非共價鍵結可包括抗原與蛋白 複合物之非共價結合之物理幾何構型(參閱上述比擬之「串珠(bead on a string)」)。
該載體蛋白不需自我交聯以包合抗原。抗原亦可以下列包合，如將該載體蛋白及該抗原於液態溶液中混合，使該載體蛋白沉澱，俾使該抗原與該蛋白共沉澱。抗原亦可以載體蛋白包合，其藉由從抗原及載體蛋白混合物中，沈澱化合物(如六偏磷酸鈉(sodium hexametaphosphate)、聚磷腈(polyphosphazene)或對蛋白質藉疏水性作用或離子作用具親合力之其它聚合物)達成。沈澱蛋白質方法為該技術領域之標準，包括如(1)改變該混合物之pH；(2)藉增加或減少該混合物無機鹽濃度，改變該溶液之離子強度；或(3)添加三氯醋酸(trichloroacetic acid，TCA)或硫酸銨(ammonium sulfate)至該混合物；(4)加熱該混合物以引起蛋白質結合(即形成沉澱物或膠體)；(5)在某種程度上化學修飾該混合物中該蛋白質，使它成為不可溶；及(6)以足量游離輻射(紫外線輻射、伽瑪射線或貝它射線)照射該蛋白質，以便引起該蛋白質交聯和/或沉澱。
使用病原體莢膜蛋白時，這疫苗稱之為蛋白莢膜基質疫苗(protein capsular matrix vaccine，PCMV)。實施例中所述，生產PCMV，包括以典型非T-細胞依靠型莢膜抗原、聚γ-D-麩胺酸(PGA)、藻酸及葡聚醣以及示範的載體蛋白，DNI為基礎的那些。該PGA PCMV簡易量產製造，且發現誘導PGA-蛋白共軛疫苗代表性免疫反應。在任何所要抗原存在下，本發明疫苗可使用任何可能之連接劑與任何 可能之載體蛋白交聯而製備。案例及較佳連接劑、載體蛋白及所要抗原於此處討論。
多醣(PS)為醣(糖)之聚合物。衍生自莢膜之PS為初級抗原成分，參與抗莢膜細菌病原體之保護性免疫力(protective immunity)，該病原體如腦膜炎雙球菌、肺炎鏈球菌、傷寒桿菌及B型流感嗜血桿菌。青少年及成人接種以微生物PS為基礎的疫苗，已成功地減少疾病負擔，但對於嬰兒及幼童(即年齡低於24個月之孩童)較無有力提供保護性免疫力。幼童尚未發展出成熟的適應性免疫族群，在這年輕疫苗接受者，非T-細胞依靠型抗原，如莢膜PS，產生免疫性不足且不引起長期保護性免疫反應(即免疫記憶反應)。
非T-細胞依靠型抗原，如PS，可藉由PS對蛋白質化學耦合轉換成T-細胞依靠型抗原，這過程稱之「共軛(conjugation)」，牽涉PS結構中原子與載體蛋白中胺基酸支鏈原子間共價鍵形成。這樣「共軛疫苗(conjugate vaccines)」更有效促使誘導B-細胞成熟及同種型轉變(isotype switching)，產生更多具正確抗-PS保護性變化之抗體。保護性抗體對它們的PS抗原具高親和力，通常它們為免疫球蛋白G(IgG)亞群，具補體附著且調理作用細胞活性之長壽抗體。
第1圖顯示非限定途徑，PS及該載體蛋白破傷風桿菌類毒間產生共軛之共軛疫苗誘導抗-PS IgG免疫反應。在這模式中，只有B-細胞結合該PS-蛋白共軛物，而該B-細 胞顯露出辨識PS之抗體受體。因此，該載體蛋白結合至顯露出正確PS結合專一性之B-細胞表面。該蛋白-PS複合物被這些B-細胞吸收進胞內液泡隔間，該處該載體蛋白遭蛋白質水解。衍生自該載體蛋白之胜肽被轉送並進入該MHC II型受體(MHC-II)呈現結合槽(presentation groove)。這MHC-II-載體胜肽複合物展露在該B-細胞表面。一旦T-細胞受體(T-cell receptor，TCR)辨識MHC-II-胜肽複合物，T-細胞變為活化並分泌細胞激素(cytokine)，以協助誘導B-細胞分化。B-細胞拓殖並分化成「漿細胞(plasma cells)」，該漿細胞現分泌抗體。最初免疫球蛋白M(IgM)由漿細胞產生，但最終該T-細胞協助使該漿細胞成型轉換(class switch)並產生其它同種型抗體，如IgG。這過程持續使漿細胞變種導致對該PS-蛋白共軛物甚至還更高親合力之抗體產生。當抗原清除，只有較高親和力之漿細胞被繼續存在循環之殘留PS-蛋白共軛物活化。漿細胞之T-細胞依靠型成熟過程持續，導致產生高親合力IgG型抗體之漿細胞族群擴增。該擴增可輕易藉由測量免疫受試者，如人類，血清中抗-PS IgG抗體之含量所監控。
最後，該成熟及轉換過程導致壽命長且對該PS專一性的記憶B-細胞(memory B-cell)產生。記憶B-細胞具有獨特特性，暴露於PS它們可立即活化。活化使記憶B-細胞增殖並炔速產生抗-PS IgG。發生於第二次暴露於PS期間之記憶B-細胞活化稱之「增幅反應(booster response)」，表示壽命長「次發性(second)」記憶免疫反應。初級免疫 (primary immunization)可刺激IgM抗體及一些IgG抗體產生。一旦次發性免疫發生，即該「增幅反應」啟動，經第一免疫設定之記憶細胞被刺激產生大量IgG，記憶免疫反應。
非T-細胞依靠型抗原通常不刺激持久的免疫力，即產生IgG抗體，但可刺激較低效能及更短暫IgM抗體之產生。如此，PS抗原單獨通常不產生IgG增幅反應。然而，假如以PS-蛋白共軛物引起初級免疫，PS的確產生增幅反應，因為被該共軛物誘導之記憶細胞已被設定生產IgG。甚至，在接種動物或人類之增幅反應被認為為擬似由於暴露顯露出PS微生物引起保護性反應，這長期記憶對於疫苗執行保護接種共軛疫苗後多年之免疫受試者是重要的。因此，PS-蛋白共軛物對於(1)誘導高含量亢PS抗原之IgG的能力；以及(2)誘導對抗PS抗原之記憶免疫反應的能力是有價值的。PS抗原通常不顯露這些特質，因此為較差的抗原。合成共軛疫苗困難度及生產成本使得對於很多細菌性疾病之共軛疫苗發展緩慢，其中對於PS之免疫反應可為保護性的。
其它非T-細胞依靠型抗原包括胺基酸同聚物，如聚γ-D-麩胺酸(PGA)，及多元醇。大部份生物聚合物為非T-細胞依靠型抗原。聚合物可與B-細胞上免疫球蛋白(Ig)受體交聯，該受體因它們化學結構重複性質(及抗原決定位)而辨識。因此，聚合物可活化B-細胞，與多醣相同方式生產抗-聚合物IgM。舉例來說，胺基酸均聚物，炭疽桿菌聚 γ-D-麩胺酸(PGA)，為致免疫性不佳，且為非T-細胞依靠型抗原之莢膜聚合物。由與蛋白載體結合之PGA組成之疫苗為致免疫性高，可誘導抗-PGA IgG及對PGA免疫記憶。因此，在致免疫性方面而論，大部份聚合物反應像，因為在MHC-II下，它們不能被處理且表現，因此不能獲得T-細胞協助。例外為發現在一些天然存在之聚合物，該聚合物與其它類型名為類鐸受體(TLR)之受體交互作用。一旦活化，TLR可誘導宿主細胞產生細胞激素，且在適應性免疫反應中產生改變。一些PS為共價鍵結至TLR配體或含有這些配體。例如，脂多醣(lipopolysaccharides，LPS)為致免疫性高且誘導IgG及記憶反應之PS，；LPS之脂質A根為TLR配體且負責免疫特性。
另一實施例中，少數肺炎球菌PS已發現顯示一些共軛疫苗免疫特性，它們誘導同種型轉變成IgG，即使它們未鍵合至蛋白載體。最近，市售多醣疫苗，肺炎鏈球菌23價多醣體疫苗(Pneumovax-23)，及來自各種肺炎鏈球菌菌株之個別PS發現含有TLR配體(Sen et al.,J.Immunol.175：3084-3091,2005)。這發現可解釋為何這些PS製劑可在缺少蛋白共軛下誘導同種型轉變成IgG。這些肺炎球菌PS誘導巨噬細胞分泌IL-6及TNF-α。然而，以酚萃取進一步純化PS清除巨噬細胞分泌之細胞激素。在免疫研究中，酚萃取之PS致免疫性不佳，且不再誘導抗-PS IgG。因此，酚萃取移除不純分子，該不純分子負責這PS製劑的這些不尋常致免疫特性。該不純分子似乎為TLR配體，而 給予活化巨噬細胞中TLR-依賴型細胞激素反應之能力。以酚萃取進一步純化PS移除該不純之TLR配體，使PS成為完全非T-細胞依靠型。
該上述案例說明無蛋白對碳水化合物之共價鍵結下，PS抗原可作用如共軛PS-蛋白抗原。不幸地，TLR配體通常促使發炎(proinflammatory)。舉例來說，LPS甚至少量就有毒性。因此，當TLR配體與PS混合可加大對於該PS免疫反應，這方法亦可能產生起反應且可能引起疫苗接受者副症狀之疫苗。共軛疫苗技術提供生產具所要致免疫性及安全範圍之PS疫苗替代方法。
PS-蛋白共軛疫苗發展已大大降低細菌病原侵入引起孩童疾病負擔。少數這樣疫苗，包括抗B型流感嗜血桿菌及腦膜炎雙球菌與鏈球菌特定菌株之疫苗，在已開發國家為商業可獲得。這些PS-蛋白共軛疫苗在開發中國家生產及銷售是過份地昂貴。舉例來說，市售7-價肺炎球菌共軛疫苗每劑約58美金(2006年)，需注射四劑。這花費使這疫苗在開發中國家拿不到，該疾病造成負擔。
因為參與化學及製造成本及PS與載體蛋白純化造成傳統共軛疫苗便宜製造困難。共軛化學執行前，為獲得合理偶合效率(coupling efficiency)，通常兩者須十分純。一般來說，偶合化學必需對各種PS有好的結果，就是對於該PS與經篩選之載體蛋白之化學是獨特的。這偶合化學導入PS上官能基，然後可連接至載體蛋白，一般來說是透過離胺酸殘基之ε胺基支鏈。PS導入這樣偶合基團之化學 修飾可破壞該PS上抗原決定位，引出新的抗原決定位(如，使連接劑或修飾的醣基團結合)，這些重大事只可藉由小心免疫分析評估。再者，對於傳統PS-蛋白共軛疫苗，PS大小、結合至每一蛋白載體分子之PS分子數目、篩選之載體本質及連接化學之種類都可影響該共軛疫苗致免疫性。例如，每個肺炎球菌疾病90+已知血清型皆有不同的PS結構(Bentley et al.,PLOS Genetics 2(3)：e31 262-269,2006)，一個單一共軛方法不適用所有血清型。具可再現的免疫特性之可再現地合成共軛疫苗需要注意管控該PS大小、t結合至每一蛋白載體分子之PS分子數目、篩選之載體本質及連接化學之種類，而這依次劇幅增加共軛疫苗製造成本。
抗生素抗藥性之浮現突顯發展安全及有效疫苗之緊迫。製造大量疫苗，特別是在開發中國家，需要疫苗製造亦要符合成本效益。對抗來自一或多種菌種不同血清型之多種多醣抗原的聯合共軛疫苗導入孩童免疫策略(immunization regimen)將簡化在高風險族群中疫苗使用。然而，最近共軛疫苗技術並不符合成本效益，因此，聯合共軛疫苗實際上在開發中國家使用是不可能。甚至在有強大已建立市場之已開發國家，惠氏(Wyeth)7-價共軛肺炎球菌疫苗最近供應短缺顯示它是如何困難在於生產及儲備需要複合物共軛疫苗合成技術之疫苗。
最佳實施例中，本發明疫苗為多價莢膜基質疫苗(PCMV)，一或多種細菌莢膜成份包合在多價載體蛋白基質 內。PCMV可輕易製造，因為需作為起始物所要抗原，如莢膜，只需中度純淨。舉例來說，味丹(Vedan)聚γ-D-麩胺酸(PGA)並非不攙雜的(它帶有對DNI活性之蛋白酶)，如本發明所述，它正好地運作如期望之非T-細胞依賴型抗原(實施例1)。將PGA併入PCMV已成功在不同蛋白對PGA比例超過7倍範圍之三種PCMV製劑進行。
因為製造本發明疫苗之方法不需任何所要抗原，如莢膜多醣，之化學知識，所以該方法不需再發展所要抗原與載體蛋白化學相容之交聯化學。一些抗原可能仍然與該連接劑交互作用，這應該不會降低該疫苗之功效，因為該所要抗原及該載體蛋白非刻意之交聯期望具有致免疫性特質。本發明疫苗中，所要抗原對該載體蛋白之交聯對於該疫苗為有效是不需要。這跟傳統共軛疫苗是很明顯之對比，而這阻礙它們製造及發展。本發明疫苗較佳地至少，如1%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%或甚至100%之交聯的載體蛋白，以及不超過如1%、5%、10%、15%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%交聯至該載體蛋白之所要抗原。較佳地，不超過10%抗原交聯至該載體蛋白及至少50%載體蛋白經交聯。
製造本發明所述疫苗之方法並不引起所要抗原，如莢膜聚合物，之過度修飾。具可能之修飾，如對於PS莢膜攜帶該聚合物鏈末端之這樣基團之還原糖還的抗原通常維持在相同之狀態。這樣小修飾是不可能影響大部分膜莢PS之致免疫力，因為末端糖較聚合物中內部殘基不豐富 100-1000X。相對上，對於傳統共軛疫苗它通常需要引進連接劑基團至該抗原，如莢膜聚合物，作為該載體蛋白共價鍵結之點。需使用連接劑，因為很多抗原，如莢膜聚合物，不具有反應基團，如羧基或胺基基團作為它們結構之部分。舉例來說，導入連接劑化學至PS可引起莢膜抗原決定位之破壞，並產生新的抗原決定位，該新的抗原決定為可能在疫苗產品中不是最好，因為與宿主本身抗原決定位未知免疫交叉反應產生。
製造本發明所述疫苗之方法較共軛疫苗技術不複雜，因為它的化學僅依靠該載體蛋白(如，DNI、霍亂毒素次單元B、白喉毒素、破傷風毒素C端片段或大腸桿菌β半乳糖苷酶)交聯化學。舉例來說，混合DNI時，該莢膜聚合物影響交聯之比例，但它並不影響交聯之形態或程度，該交聯多受控於所用之蛋白、它的濃度及添加交聯劑(如，戊二醛)之濃度。這些參數可容易地調整，因此減少製造該疫苗之時間及努力，且省成本。
製造本發明所述PCMV疫苗之方法可用任何抗原，如任何莢膜聚合物或具少數任何胺基基團之任何聚合物及任何可交聯之載體蛋白，如不具有重要抗原決定位之載體蛋白，該抗原決定位可為氫硼化物還原破壞。用於本發明之方法的載體蛋白較佳地有至少2個離胺酸殘基或其他未被阻隔且可經化學修飾交聯之殘基。破傷風桿菌類毒素為可能之載體蛋白。這毒素以甲醛試劑與該蛋白胺基反應去除毒性。其它最好載體蛋白包括霍亂毒素次單元B(購自SBL Vaccin AB)、白喉毒素、破傷風毒素C端片段(購自Sigma Aldrich)、DNI或大腸桿菌β半乳糖苷酶(購自Sigma Aldrich).
最近多價共軛疫苗首先經由個別共軛疫苗合成，再混合成「雞尾酒」共軛疫苗(如，惠氏七價肺炎球菌疫苗，Prevnar®(Pneumococcal 7-Valent Conjugate Vaccine[Diphthteria CRM197 Protein],Wyeth Pharmaceuticals Inc.))製成。製造疫苗本發明之方法可藉由下列方式以製造多價疫苗：於該載體蛋白交聯前，與如戊二醛混合化學上不同抗原，如莢膜有機聚合物，一起；或混合特別本發明疫苗，而該疫苗為各自合成。這彈性對於製造多價疫苗本發明方法提供顯著好處。
實施例中討論之本發明疫苗例子，PCMV疫苗#1-3，表現像共軛疫苗，儘管這些疫苗經由非預料產生該PGA分子及DNI蛋白上原子間任何共價鍵之方法合成。戊二醛專門地與蛋白胺基支鏈反應，代表為離胺酸殘基ε胺基基團。該PGA聚合物不含自由胺基基團，只有不與戊二醛反應之羧基支鏈。因此，PCMV產生此類似共軛免疫反應，表示長PGA分子為分子上包合在DNI蛋白分子交聯基質內。
按非限定之模式，該包合可攜帶DNI蛋白及PGA至B-細胞中，該細胞以免疫辨識PGA之Ig受體結合此基質。一旦吸收進B細胞內，此基質與傳統共軛疫苗相似方式降解以產生DNI-衍生胜肽，顯露在相對應B-細胞之MHC-II分子上。輔助T-細胞誘導此B細胞增殖及成熟以形成對PGA 專一之t IgG生產漿及記憶細胞。因此，按非限定之模式，PCMV免疫上運作像蛋白-共軛莢膜疫苗但是有區別的，因為PCMV於該載體蛋白及莢膜聚合物間缺少顯著共價鍵結。
本發明疫苗，包括PCMV，可與如孩童疫苗併用。此外，本發明疫苗可用以接種對抗如，肺炎球菌感染、鏈球菌(A群及B群)感染、B型流感嗜血桿菌(“HiB”)感染、腦膜炎雙球菌(如腦膜炎雙球菌(Neisseria meningitidis))感染及可從革蘭陰性細菌用作為O抗原疫苗(如綠膿桿菌、土拉倫法式菌(Thirumalapura et al.,J.Med.Microbiol.54：693-695,2005；Vinogradov and Perry,Carbohydr.Res.339：1643-1648,2004；Vinogradov et al.,Carbohydr.Res.214：289-297,1991)、志賀氏桿菌屬、沙門氏桿菌屬、不動桿菌屬(Acinetobacter)、伯克氏菌屬及大腸桿菌)。
本發明疫苗可使用如本處所述那些的任何連接劑製造，在如本處所述那些的一或多個所要抗原存在下，連接劑與如本處所述那些的任何載體蛋白交聯。若採用一種所要抗原，本發明蛋白基質疫苗說為單價。若採用多於一種所要抗原，本發明蛋白基質疫苗說為多價。若微生物莢膜聚合物為所要抗原，本發明蛋白基質疫苗說為蛋白莢膜基質疫苗(PCMV)。
連接劑
交聯載體蛋白為熟悉該項技術者所熟知，包括戊二醛、順丁烯酰胺苯甲酸-N-琥珀酸酯 (m-maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester，MBS)、碳二亞胺(carbodiimide)及雙-二氮化聯苯胺(bis-biazotized benzidine)。
對於直接交聯載體蛋白一般方法及部份，使用同雙功能或異雙功能連接劑述說於如，G.T.Hermanson(Bioconjugate Techniques,Academic Press,1996)及Dick與Beurret(Conjugate Vaccines.Contribu.Microbiol.Immunol.,Karger,Basal 10：48-114,1989)。舉例來說，載體蛋白具有n個離胺酸根，理論上有n+1一級胺(包括該末端胺)可用以與例子相交-連接劑之羧基反應。因此，採用這直接共軛方法，該產品限制具有n+1醯胺鍵形成。
本發明最佳實施例中，該連接劑最簡單為連結兩個載體蛋白之化學鍵。該連接劑可為線性、環狀或分支分子骨架，具有共價鍵結兩載體蛋白(A)及(B)之懸掛基團(pendant group)。任何給定載體蛋白可連接至超過一個載體蛋白，以便創造交聯連接載體蛋白基質，而抗原可包合於內。
該術語「連接基團(linkage group)」指連接劑(L)與(A)或(B)官能基反應根產生結合之共價鍵。連接基團例子包括但不限定於酯、氨基甲酸鹽(carbamate)、硫酯、亞胺(imine)、二硫化物(disulfide)、醯胺(amide)、醚、硫醚、磺醯胺、異脲、異硫脲、醯亞胺酯(imidoester)、脒(amidine)、氨基磷酸酯(phosphoramidate)、磷酸雙酯、 硫醚(thioether)及腙(hydrazone)。
(A)與(B)連接藉由共價方式達成，包括一或多個(A)及(B)上官能基鍵(連接基團)形成。實施例可用於這目的之化學上反應官能基例子包括但不限定，胺基、羥基、硫氫基(sulfhydryl)、羧基、羰基(carbonyl)、硫醚、guanidinyl、咪唑基(imidazolyl)及酚基(phenolic group)，所有都出現在載體蛋白中自然存在之胺基酸。
因此，(A)與(B)共價連接可受到使用連接劑(L)影響，該連接劑含有能與(A)與(B)上這樣的官能基反應之反應根。這反應之產物為連接基團，該基團含有最新形成鍵結，連接(L)與(A)及(L)與(B)。舉例來說，(A)之羥基可與(L)羧酸基團或活化之其衍生物反應，引起酯連接基團形成。
能與硫氫基反應之化學根例子包括XCH2CO-(其中X=Br、Cl或I)類型之α-鹵代乙醯類化合物，其顯示對硫氫基有特殊之反應活性，但亦可用於修飾咪唑基、硫醚、酚及胺基基團，如文獻所述：如，Gurd,Methods Enzymol.11：532,1967。N-順丁烯二酰亞胺衍生物亦可視作對硫氫基有選擇性，但可另用於在特定條件下偶合至胺基基團。試劑，如2-巰醇亞胺(2-iminothiolane)(Traut et al.,Biochemistry 12：3266,1973)，透過胺基基團轉換導入硫基，假如經由雙硫鍵形成發生連接，該試劑可視作為硫氫基試劑。
能與胺基基團反應之反應根例子包括，如烷化劑(alkylating agent)及醯化劑。代表性烷化劑包括： (i)α-鹵代乙醯類化合物，在無反應硫基顯示對於胺基基團專一性，XCH2CO-(其中X=Cl、Br或I)類型，敘述如Wong(Biochemistry 24：5337,1979)；(ii)N-順丁烯二酰亞胺衍生物，不是透過萬可式(Michael-type)加成反應就是透過添加至環羰基之醯化與胺基基團反應，敘述如Smyth et al.(J.Am.Chem.Soc.82：4600,1960 and Biochem.J.91：589,1964)；(iii)芳香基鹵化物(aryl halide)，如反應性硝基鹵代芳香基(nitrohaloaromatic)化合；(iv)鹵烷類，敘述如McKenzie et al.(J.Protein Chem.7：581,1988)；(v)能與胺基基團形成希夫鹼之醛或酮，透過還原給定穩定的胺，加合物形成通常為穩定的；(vi)環氧化物衍生，如表氯醇(epichlorohydrin)及雙環氧乙烷(bisoxirane)，可與胺基、硫氫基或酚羥基反應；(vii)s-三嗪(s-triazine)之含氯衍生物，對於親核物，如胺基、硫氫基或羥基具非常反應性；(viii)上述所詳述以氮丙啶(aziridine)為基礎之s-三嗪化合物，敘述如Ross(J.Adv.Cancer Res.2：1,1954)，與親核物，如胺基基團藉由開環與之反應；(ix)方酸二乙酯(squaric acid diethyl ester)，敘述如Tietze(Chem.Ber.124：1215,1991)；以及(x)α-鹵烷醚(α-haloalkyl ether)，為更具反應性之烷化劑勝於一般之鹵烷類，此與醚氧原子引起之活化有 關，敘述如Benneche等(Eur.J.Med.Chem.28：463,1993)。
代表性胺基-反應烷化劑包括：(i)異氰酸(isocyanate)及異硫氰酸，特別地芳香基衍生物，各自形成穩定之脲及硫脲衍生物；(ii)苯磺醯氯(sulfonyl chloride)，已敘述如Herzig等(Biopolymers 2：349,1964)；(iii)醯鹵(acid halide)；(iv)活性酯，如硝基苯酯(nitrophenylester)或N-羥基琥珀醯亞胺酯(N-hydroxysuccinimidyl ester)；(v)酸酐，如混合、對稱的或N-羧酸酐(N-carboxyanhydride)；(vi)用以形成醯胺鍵之其它有用試劑，敘述如M.Bodansky(Principles of Peptide Synthesis,Springer-Verlag,1984)；(vii)疊氮(acylazide)，如其中疊氮基產生自使用亞硝酸鈉(sodium nitrite)完成醯肼(hydrazide)衍生物，可參照Wetz等(Anal.Biochem.58：347,1974)所述；以及(viii)醯亞胺酯(imidoester)，一旦與胺基基團反應形成穩定脒，敘述如Hunter及Ludwig(J.Am.Chem.Soc.84：3491,1962)。
醛，如戊二醛，及酮可與胺反應以形成希夫鹼，透過還原性胺化可有助穩定性。烷氧胺基根容易與酮及醛反應產生穩定之烷氧胺，敘述如Webb等(Bioconjugate Chem. 1：96,1990)。
能與羧基反應之反應根例包括重氮基(diazo)化合物，如重氮乙酸酯(diazoacetate ester)及重氮乙酸醯胺(diazoacetamide)，高度專一性反應以產生酯基團，敘述如Herriot(Adv.蛋白Chem.3：169,1947)。亦可用羧酸修飾劑，如碳二亞胺(carbodiimide)，透過形成O-醯基尿素(O-acylurea)而反應，再形成醯胺鍵。
(A)及/或(B)上官能基，如有需要，可於反應前轉換成其它官能基，以給予額外反應性或選擇性。用於本目的有用之方法例子包括用試劑如二羧酐將胺轉換成羧酸；用試劑如N-醯高半胱氨酸硫內酯(N-acetylhomocysteine thiolactone)、S-乙醯基巰基琥珀酸酐(S-acetylmercaptosuccinic anhydride)、2-巰醇亞胺或含硫醇琥珀亞胺衍生物將胺轉換成硫醇；用試劑如α-鹵醋酸將硫醇轉換成羧酸；用試劑如次乙亞胺(ethylenimine)或2-溴乙胺將硫醇轉換成胺；用試劑如碳二亞胺再以二胺將羧酸轉換成胺；以及用試劑如甲苯磺醯氯(tosyl chloride)再以硫代乙酸進行交酯化反應及以醋酸鈉水解成硫醇而將乙醇轉換成及硫醇。
所謂「零長度(zero-length)」連接劑，意謂(A)之反應化學基團與(B)之反應化學基團直接共價連接，無引入額外連接物，假如需要，可依照本發明使用。實例包括化合物，其中(L)表示(A)之氧原子連結至(B)上羰基或硫羰基根的化學鍵，而該連接基團為酯或硫酯。舉例來說，胺基基 團(A)可藉用碳二亞胺化學連接至羧基(B)b，產生A-L-B，其中L為醯胺鍵或連接至N-R之R-C=O，其中R為衍生自相同或兩種不同蛋白分子之胺基酸支鏈的碳鏈。
大部分，然而，該連接劑包括兩個或多個反應性根團，如上所述，透過間隙物(spacer)連接。這間隙物存在使雙功能連接劑與(A)及(B)內特殊官能基反應，於這兩個化合物間產生共價連結。於連接劑(L)之這反應根團可為相同(同雙功能連接劑)或不同(異雙功能連接劑，或其中幾個相異的反應根團存在，異多功能連接劑)，提供不同潛在試劑，可使(A)及(B)間共價結合。
間隙物通常由鏈組成，該鏈藉下列有效分隔(A)及(B)：直線或分支1至10個碳原子之烷基、直線或分支1至10個原子異烷基、直線或分支2至10個碳原子之烯基、直線或分支2至10個碳原子之炔基、5至10個碳原子之芳香殘基、3至10個原子之環狀系統或-(CH2CH2O)nCH2CH2-，其中n為1至4。
藉連接劑引入之外來物質本質可具有對該最終疫苗產物之藥物動力學及/或活性有影響。因此，它最好可引進可切割之連接劑，其含有生物可分解或化學敏感幸或結合酵素切割位置之間隙物。
這些可切割之連接劑，敘述如PCT公開號WO 92/17436(在此併入參考)，輕易於體內分解。在一些情況下，連接基團於酯酶存在下被切割，但在無這樣的酵素存在下是穩定的。因此，(A)及(B)可有利於連結並藉由近疾 病位置有活性之酵素而緩慢釋放。
連接劑可形成具化學式(I)之生物可分解二酯、二醯胺或二氨基甲酸基團的連接基團：--(Z1)o-(Y1)u-(Z2)s-(R11)-(Z3)t-(Y2)v-(Z4)p-I
其中，每一Z1、Z2、Z3及Z4獨自選自O、S及NR12(其中R12為氫或烷基)；每一Y1及Y2獨自選自羰基、硫羰基、磺醯基(sulphonyl)、磷醯基(phosphoryl)或相似酸形成基團(acid-forming group)；o、p、s、t、u及v每一獨自為0或1；以及R11為直線或分支1至10個碳原子之烷基、直線或分支1至10個原子異烷基、直線或分支2至10個碳原子之烯基、直線或分支2至10個碳原子之炔基、5至10個碳原子之芳香殘基、3至10個原子之環狀系統、-(CH2CH2O)qCH2CH2-，其中q為1至4、或連結-(Z1)o-(Y1)u-(Z2)s-至-(Z3)t-(Y2)v-(Z4)p-之化學鍵。
用於本發明之最好連接劑(L)例子可為化學式II-III任一者：
其中，該連接劑共價連接(A)之氧原子及(B)之氧原子兩者。據此，化學式II-III之連接劑(L)透過二吡喃(dipyran)、酯或氨基甲酸連接基團鍵結至載體蛋白(A)及(B)。這些實施例中，R13代表直線或分支1至10個碳原子之烷基、直線或分支1至10個原子異烷基、直線或分支 2至10個碳原子之烯基、直線或分支2至10個碳原子之炔基、5至10個碳原子之芳香殘基、3至10個原子之環狀系統、-(CH2CH2O)nCH2CH2-，其中n為1至4、或連結兩個氮或兩個羰基之化學鍵。
設計形成腙(hydrazone)連接之連接劑具有化學式IV：
其中，Z5選自O、S或NR16；R16為氫或烷基；R15選自氫、烷基或異烷基；Y3選自共價鍵結至(A)之氧原子的羰基、硫羰基、磺醯基、磷醯基(phosphoryl)或相似酸形成基團；w為0或1；R14為直線或分支1至10個碳原子之烷基、直線或分支1至10個原子異烷基、直線或分支2至10個碳原子之烯基、直線或分支2至10個碳原子之炔基、5至10個碳原子之芳香殘基、3至10個原子之環狀系統、-(CH2CH2O)nCH2CH2-，，其中n為1至4、或連接-(Y3)-(Z5)w- 至之化學鍵；且X4為含有醯肼基(hydrazide group)及連接劑II前趨物之(B)濃縮反應產生之腙(hydrazone)，其中X4為酮或醛基之氧原子。
載體蛋白
一般而言，於生理條件下，可包合抗原之任何載體蛋白可用於本發明。較佳地，該抗原包合於具載體蛋白之複合物中，而無顯著共價鍵結於該抗原與載體蛋白間。無顯著共價鍵結表示該抗原不超過50%共價鍵結於載體蛋白。最佳實施例中，該抗原不超過40%、30%、10%或5%共價鍵 結於載體蛋白。該抗原/載體蛋白複合物可含有另一化合物，如鋁(alum)，在最佳實施例中，這其它化合物可包合該抗原及載體蛋白。
用於本發明疫苗之載體蛋白較佳地為單獨或與抗原結合之蛋白，引起受試者免疫反應。較佳地，該載體蛋白含有至少一個T-細胞辨識之抗原決定位。較佳地，該抗原決定位可誘導受試者T-細胞反應及誘導B-細胞產生對抗整個所要之抗原的抗體。用作本發明所述之抗原決定位包括任何抗原決定基(determinant)，抗原分子中負責與抗體分子或其片段之特異性交互作用。表位決定基通常由分子，如胺基酸或糖支鏈之化學上活化表面群所組成並具有特異三維結構特性及特異電位特性。為具有致免疫特性，蛋白或多肽通常能刺激T-細胞。然而，缺少T-細胞辨識之抗原決定位的載體蛋白亦可具致免疫性。
藉篩選引起強大致免疫性反應之已知載體蛋白，各種族群受試者可以本發明所述之PCMV治療。對該疫苗，該載體蛋白較佳地是不足引起強大致免疫性反應。一般來說，該載體蛋白為可將致免疫性給予所要之抗原的分子。最佳實施例中，載體蛋白為天生高度致免疫性的一個。因此，具高程度之致免疫性且能使對該抗原之抗體生產最大化之載體蛋白最好。
本發明各種載體蛋白包括如毒素及類毒素(化學或基因)，可為突變的或非突變的，如炭疽桿菌毒素、PA及DNI(PharmAthene公司)、白喉類毒素(麻薩諸塞州生物實 驗室(Massachusetts State Biological Labs)；印度血清機構(Serum Institute of India))或CRM 197、破傷風毒素、破傷風桿菌類毒素(麻薩諸塞州生物實驗室；印度血清機構)、破傷風毒素Z端片段、綠膿桿菌外毒素A或外毒素A突變物、細菌鞭毛蛋白、肺炎球菌溶血素、腦膜炎雙球菌(美國菌種保藏中心((American Type Culture Collection，ATCC)Manassas,VA)可獲得之菌株)外膜蛋白、綠膿桿菌Hcp1蛋白、大腸桿菌不耐熱腸毒素、類志賀氏毒素、人類LTB蛋白、整個細菌細胞萃取之蛋白及可以連接劑交聯之任何其它蛋白。較佳地，該載體蛋白霍亂毒素次單元B(購自SBL Vaccin AB)、白喉毒素(Connaught公司)、破傷風毒素C端片段(購自Sigma Aldrich)、DNI或大腸桿菌β半乳糖苷酶(購自Sigma Aldrich)。其它最好載體蛋白包括牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)、P40及雞核黃素(chicken riboflavin)(除非另有所指，該載體蛋白購自Sigma Aldrich.)。其它載體蛋白例為多-抗原胜肽(multi-antigenic peptides，MAPs)，為分支之胜肽。藉由使用MAP，交聯密度最大化，因為有多倍分支之胺基酸殘基。用於形成MAP之胺基酸例為但非限定於離胺酸。
當以動物為實驗時，BSA鑰孔蟲戚血藍蛋白(keyhole limpet hemocyanin，KLH)兩者已常用做為疫苗開發之載體。用以製備治療疫苗之載體蛋白包括但不限定於一些病原細菌之毒素及其類毒素。例子包括白喉毒素及破傷風毒 素及其藥物可接受對應之類毒素。其它候選者為蛋白，抗原上相似於作為交互反應物(cross-reacting materials，CRMs)之細菌毒素。本發明載體蛋白亦可包括任何非衍生自人類或存在任何人類食物中之蛋白。
本發明最佳實施例中，形成類環結構之蛋白用於PCMV生產。這蛋白包括綠膿桿菌Hcp1蛋白、無毒性霍亂毒素次單元B、大腸桿菌不耐熱腸毒素及類志賀氏毒素。這類環蛋白複合物可形成串珠(bead on a string)，其中線性PS鏈穿透於這些環形蛋白複合物至之中心管道。蛋白交聯後，這複合物預期特別穩定。該蛋白結構資料意喻這些中心管道大到足以讓PS鏈輕易進入。舉例來說，該Hcp1六聚體環(hexameric ring)之中心管道為42埃，夠寬足以輕易容納幾條寬度為5.5埃之多醣鏈(Mougous et al.,Science 312(5779)：1526-1530,2006)。另外，蛋白環可圍繞該PS(如來自在特定物理化學條件下自然組裝成環狀之單體載體蛋白次單元)組裝。可組裝成環狀之單體蛋白為該項技術領域熟知，包括如，肺炎球菌溶血素(Walker等.,Infect.Immun.55(5)：1184-1189,1987；Kanclerski及Mollby,J.Clin.Microbiol.25(2)：222-225,1987)、菌溶菌素(listeriolysin O，LLO)(Kayal及Charbit,FEMS Microbiol.Rev.30：514-529,2006；Mengaud等.,Infect.Immun.55(12)：3225-3227,1987)、DNI、炭疽桿菌PA、Hcp1、霍亂毒素次單元B、志賀氏毒素次單元B(shiga toxin B subunit)、鞭毛蛋白及許多該項技術領域熟知並由各種 微生物製造之相關分子。
在另一最佳實施例中，類鐸受體(TLR)促進劑(agonist)用作為載體蛋白。類鐸受體(TLR)活化對發展適應性免疫反應是重要的且在抗體反應、同種型轉變及免疫記憶之親合成熟扮演角色。霍亂弧菌鞭毛蛋白(Flagellin，FLA)為TLR促進劑。超過20mg之FLA蛋白由重組大腸桿菌純化出來，在本發明IL-6巨噬細胞誘導分析中顯示為有效能的TLR活化劑。此外，高度保守肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)蛋白稱之「肺炎球菌溶血素(pneumolysin，Pn)」亦顯示活化TLR4，此外為保護性抗原。因此，這蛋白亦可作為PCMV載體蛋白。
再者，Merck製造之HIB共軛疫苗中，外膜蛋白(outer membrane protein，OMP)混合物(如腦膜炎雙球菌(Neisseria meningitidis)OMP)用作為載體蛋白，該蛋白萃取自整個肺炎雙球菌(Streptococcal pneumoniae)細菌細胞，在動物感染模型中顯示至少部分具保護性。本發明最佳實施例中，這些蛋白混合物為PCMV載體蛋白來源。
最佳實施例中，該PCMV方法採用具如至少2個離胺酸殘基或未被阻隔且可經化學修飾產生交聯之其它殘基的載體蛋白。另一最佳實施例中，該載體蛋白為多聚體(如含有至少5個次單元)。較佳地，該多聚體為同多聚體(homomultimer)。
另一最佳實施例中，DNI用作為載體蛋白，因為它無毒性遺留，不需使用前使該蛋白去除毒性。因此，最好使 用DNI，因為DNI除對所要抗原之保護性免疫反應外，亦可誘導對炭疽桿菌(B.anthracis)保護性免疫反應。此外，DNI無內部雙硫鍵。這化學鍵易受氫硼化物還原，而將使該蛋白變質，導致誘導炭疽桿菌毒素中和抗體(neutralizing antibody)之抗原決定位損失。
所要抗原
本發明疫苗組成物以及該疫苗的製造與使用方法可採用任何所要之抗原，如多醣、多元醇或聚胺基酸。較佳地，該所要抗原無攜帶因製造疫苗方法造成化學反應而破壞之一級基團(primary group)，如受氫硼化物還原破壞抗原雙硫鍵兒引起抗原變質。所要之抗原例包括有機聚合物，如多醣(如，具至少18個殘基之多醣)、磷酸化多醣(phosphopolysaccharide)、具N-乙醯取代之胺基糖的多醣、含磺醯化糖(sulfanylated sugar)、其它硫酸修飾之糖或磷酸修飾之糖、多元醇、聚胺基酸、磷壁酸(teichoic acid)、脂多醣之O支鏈的多醣。所要之抗原例亦包括莢膜有機聚合物，包括微生物所合成那些，微生物如細菌、真菌、寄生蟲及病毒，然後以標準方法從這樣生物資源純化。所要之抗原例包括微生物莢膜有機聚合物，包括由細菌微生物所純化那些，細菌微生物如桿菌屬(Bacillus species)(包括炭疽桿菌(B.anthracis))(Wang及Lucas,Infect.Immun.72(9)：5460-5463,2004)、肺炎雙球菌(Streptococcal pneumoniae)(Bentley等.,PLoS Genet.2(3)：e31,Epub 2006；及Kolkman等.,J.Biochemistry 123：937-945,1998)、志賀氏桿菌(Shigella)(Zhao等.,Carbohydr.Res.342(9)：1275-1279,Epub 2007)、流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae)、腦膜炎雙球菌(Neisseria meningitidis)、金黃色酿膿葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、傷寒桿菌(Salmonella typhi)、化膿性鏈球菌(Strep tococcus pyogenes)、大腸桿菌(Escherichia coli)(Zhao等.,Carbohydr.Res.342(9)：1275-1279,Epub 2007)及綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)，以及真菌，如隱球菌屬(Cryptococcus)及念珠菌屬(Candida)和很多其它微生物(參閱如Ovodov,Biochemistry(Mosc.)71(9)：937-954,2006；Lee et al.,Adv.Exp.Med.Biol.491：453-471,2001；and Lee,Mol.Immunol.24(10)：1005-1019,1987)。所要之抗原例亦包括不存在於自然且因此起源為非生物性之聚合物。
疫苗組成物
本發明疫苗，包括PCMV，可與如孩童疫苗併用。此外，本發明疫苗可用以接種對抗如，如肺炎球菌感染、鏈球菌(A群及B群)感染、B型流感嗜血桿菌(“HiB”)感染、腦膜炎雙球菌(如腦膜炎雙球菌(Neisseria meningitidis))感染及可從革蘭陰性細菌用作為O抗原疫苗(如綠膿桿菌、土拉倫法式菌、志賀氏桿菌屬、沙門氏桿菌屬、不動桿菌屬(Acinetobacter)、伯克氏菌屬及大腸桿菌)。
該疫苗配方較佳地包括至少一種載體蛋白、一或多種所要抗原及藥學上可接受載體或賦形劑(如磷酸鋁、氯化鈉 及無菌水)。疫苗組成物亦可包括用以增強該配方致免疫性之佐劑(adjuvant)系統，如油在水系統及其它該技術領域熟知之系統、或其它藥學上可接受賦形劑。生理條件下不溶之載體/抗原複合物最好給予受試者後，緩慢釋放該抗原。這樣的複合物較佳地以包含藥學上可接受賦形劑之懸浮液傳輸。然而，該載體/抗原複合物在生理條件下為可溶。
該疫苗通常皮下注射量約0.5mL；肌肉注射量約0.1mL或經皮給藥量0.002-0.02mL。0.5ml劑量之疫苗可含有約2-500μg以約2-500μg載體蛋白包合之抗原。最佳實施例中，0.5ml劑量中，約10μg之抗原以約10μg載體蛋白包合。抗原及載體蛋白摩耳數比介於1至10間(如，1份抗原對2份載體或1份抗原對3份載體)及介於10至1間(如，3份抗原對1份載體或2份抗原對1份載體)。最佳實施例中，抗原及載體蛋白摩耳數比為1：1。另外，抗原對載體蛋白乾重比較佳地介於1至10及10至1間(如乾重1：1)。
因為該胜肽或共軛物可於胃中被降解，該疫苗較佳地為非消化道給藥(parenteral)(如皮下注射(subcutaneous，sc)、肌肉注射(intramuscular，im)、靜脈注射(intravenous，iv)或皮內注射(intradermal，id))。給藥時最好為物理穿刺皮層傳輸(如針、氣槍或磨蝕)，而本發明疫苗亦可經皮吸收(transdermal absorption)給藥。
特別地，本發明疫苗投予受試者，如以適當免疫佐劑 肌肉注射、皮內注射或或經皮接種。本發明疫苗可給藥一或多次，通常包含第二次給藥，用以補強受試者抗體產生，以預防致病因子之感染。疫苗劑量之頻率及數量取決於該疫苗比活性(specific activity)及可輕易日常實驗判斷。
舉例來說，對嬰幼兒來說，疫苗療程可為約4至8週間隔3劑，每劑0.5ml(2個月大)，隨後約12至15個月大接種0.5ml第4劑。對一些疫苗來說，4及6歲間最好可接種第5劑。
接種第一劑之年紀一般為2個月，疫苗可投予六週大嬰幼充。對於例行的嬰幼兒接種療程年紀下之孩童，本發明疫苗可依照下列療程例接種。
對於成人，0.5ml二或多劑，2-8週內，通常足以提供長期保護。補強劑量最好每10年對於先前已免疫之成人及七歲以上之孩童接種一次。
該配方可放於單劑量或多劑量客器，如密封之安瓿及小瓶，可存放於冷凍乾燥(凍乾)條件下，使用前立即添加無菌液體載體即可。本發明疫苗可以藥學上可接受載具調製，如氫氧化鋁凝膠、佐劑製劑或鹽，然後投藥，如以適當免疫佐劑肌肉注射、皮內注射或或經皮接種。
本發明亦包括本處所述之疫苗(如，PCMV)的套組。本 發明套組亦可包括本處所述使用該套組接種分法之說明書。
免疫療程藥效可以標準方法測試受體者抗體效價判斷。一般來說，約1μg/ml之平均抗體效價(較佳地為IgG效價(titer))被認為表示長期保護。
用以本發明所述之該疫苗組成物中，抗原/載體蛋白複合物直徑較佳地介於10nm及100μm間。病毒直徑可為100nm，且具致免疫性。整個細菌直徑可為1-10μm，且亦具致免疫性。小叢之細菌直徑可約100μm。特別實施例中，疫苗組成物中，抗原/載體蛋白複合物直徑較佳地介於100nm及10μm。這複合物可為可溶或不溶。
本發明將進一步說明下列之具體實施例、實施例及圖式，但非用以侷限本發明如後附之申請專利範圍。
實施例 實施例1.疫苗及控制組製備
莢膜聚γ-D-麩胺酸(PGA)購自味丹公司(台灣)或以Rhie等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 100：10925-10930,2003)方法純化。顯著抑制型突變(DNI)蛋白為炭疽桿菌保護性抗原(PA)之突變型，以Benson等(Biochemistry 37：3941-3948,1998)方法從大腸桿菌製備。PGA及DNI蛋白使用前徹底地以0.05M磷酸鈉緩衝液pH7.4(SP7.4)透析。該DNI儲存液(stock solution)相當於30mg/ml。該PGA儲存液相當於134mg/ml。該連接劑戊二醛購買自Pierce作為25%儲存液。蛋白莢膜基質疫苗(protein capsular matrix vaccine，PCMV)及控制組依照表1反應組合。
這五種反應於無戊二醛室溫(22℃)。在T=0，將0.1ml之25%戊二醛(G25)添加至指示之反應。之後每30秒添加另一0.1ml之G25，並重複直到每一指示反應添加至總量0.8ml之G25。以該雙功能戊二醛分子交聯DNI分子情形可以於放大鏡下觀察產生之各種程度的濁度(turbidity)及像粒子之不可溶膠體，等級依序為：濁度及膠體產生最高，反應為1>2>3>4，反應5則維持完全清澈且溶的。一小時後，添加2ml之1M硼氫化鈉(於0.5M硼酸鈉緩衝液pH9.3(SBH))至所有六個反應以還原希夫鹼，此希夫鹼形成於該DNI分子胺基支鏈及雙功能戊二醛分子間。添加矽基消泡劑(0.01ml)至每一反應以控制這反應期間泡沫形成。該反應存放於4℃ 72小時。然後，所有反應徹底地以SP7.4透析48小時。最終產物以離心以去除不溶物質，並存放於4℃。
牛血清白蛋白(BSA)及PGA間之傳統共軛藉由將BSA胺基基團以水溶性碳二亞胺，1-乙基-3-(3-二甲胺基丙基)碳二亞胺(EDAC)(1-ethly-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide)，偶合至PGA羧基而合成，如下：5ml之30mg/ml BSA於水與1ml之134mg/ml PGA於NP7.5混合。添加50mg之EDAC，於室溫繼續進行3小時。此反應於4℃以含1mM甘胺酸(glycine)之SP7.4透析18小時，以阻隔活化基團，然後在於4℃以純SP7.4透析24小時。最終產物視為PGA-BSA共軛物。
在PCMV及控制組製劑合成及透析後，檢測DNI蛋白之分子狀態以確認在各種量之PGA存在與否，將戊二醛的確分子上交聯至該蛋白。PCMV及控制組製劑以十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulphate，SDS)聚丙烯醯胺(polyacryamide，PAM)膠體電泳及以抗-PA抗血清西方墨點分析監測交聯。參照第2圖，戊二醛交聯前，DNI蛋白移動至84kDa。PCVM1-PCMV3(第1-3欄)顯示該DNI蛋白大量交聯，由亮帶(band)移動至分子量超過220kDa可所說。無PGA下，單獨交聯之DNI蛋白亦顯示相同高分子量(第5欄)。相對地，以PGA混合但無以戊二醛處理之DNI顯示於DNI與共移動或較低分子量之亮帶(第4欄)。因此，購自味丹(台灣)之PGA製劑似乎混雜可分解DNI之蛋白酶。味丹PGA樣本跑第6行，然而未顯示高含量與抗-PA抗血清反應之混雜蛋白，意喻觀察到亮代為各種反應之DNI-衍生產物。
此外，在PCMV方面，PGA及作為抗原之一或多種肺炎球菌用以探討FLA(霍亂弧菌鞭毛蛋白，Vibrio cholerae flagellin)是否為較好之載體蛋白勝於DNI。該載體蛋白效果以測量直接抗PGA之IgG以這些各種含量PCMV接種產生PS含量，以及蛋白重量之效力。
PCMV亦可以下列方法製造，將胺基基團直接交聯至羧基，無須使用雙功能交聯-連接劑。特別地，PCMV可以碳二亞胺化學交聯載體蛋白胺基及羧基。這化學於離胺酸支鏈之一級胺基基團及天門冬胺酸(aspartate)及麩胺酸(glutamate)支鏈之羧基間形成胜肽鍵。當福馬林(formalin)處理類毒素，大部分胺基基團被阻隔，福馬林完全不與羧基反應。因此，碳二亞胺化學可用以製造以可對抗戊二醛交聯之福馬林類毒素之PCMV。交聯輕易以SDS-PAGE測得。視其添加交聯-連接劑像戊二醛之高分子量蛋白汙點(smear)存在表示交聯。
+符號表示經SDS-PAGE偵測到交聯；-符號表示蛋白移動未從無戊二醛控制組所見改變。n.d.-未判斷(未做分析)。
表二之實驗為將200μl於50mM HEPES pH7.5下，於室溫下反應2小時。該反應以120mM氫硼化鈉淬火。戊二醛添加至64mM；牛血清白蛋白(BSA)加入15mg/m；白喉毒 素、白喉類毒素及破傷風桿菌類毒素加入約5mg/ml；PGA加入13.4mg/ml；肺炎球菌PS 6B型及23F型加入4mg/ml。
如表2所示，一些福馬林處理之蛋白(如，白喉類毒素)無法與戊二醛很好交聯，因此需要其它交聯化學用以PCMV製劑。其它，如破傷風毒素可為戊二醛交聯，但交聯程度不同於未修飾之蛋白，如白喉毒素及牛血清白蛋白。
實施例2.接種抗-DNI及抗-PGA及免疫反應分析。
表一所述之5種反應可溶性產物調整成基於280nm吸收光譜之相同蛋白質濃度。Charles River繁殖地點所購買到大約5-7週大BALB/c用第2圖所述所有免疫研究。第0天，小鼠以劑量DNI蛋白20μg之PCMV疫苗1-3及抗原製劑控制組4及5腹腔注射。所有小鼠第7天抽血，然後第10天以相同劑量抗原製劑補強接種。小鼠第17天再次抽血，然後第20天以相同劑量抗原製劑補強接種。小鼠第30天再次抽血，同時犧牲。凝集發生後收集從血液樣本所得之血清，存於-20℃。酵素連結免疫吸附分析法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)用以分析抗-PGA及抗-DNI血清抗體含量。簡言之，Immulon 2HB ELISA(VWR)微量培養皿以於0.1M碳酸鈉緩衝液pH9.6之BSA-PGA或DNI塗覆於體積為100μl/穴加入0.5μg/穴。培育於4℃過夜後，塗覆抗原之穴盤以3% BSA(w/v)(於TBS-0.1% Tween(TBST)中)培育一個小時，室溫過夜。從補強接種後不同時間點之四種小鼠群匯集之血清樣本連續以TBST稀釋，將之添加至塗覆抗原之穴盤並培育至少一個小 時。抗-DNI及抗-PGA抗體反應以兔抗血清抗小鼠IgG或IgM共軛至鹼性磷酸酶(alkaline phosphatase)(Zymed)測試。受質p-硝基酚磷酸鹽(p-nitrophenyl phosphate，PNPP)添加至每穴，每一反應以分光光度計於吸收波長405nm測量。實驗數值以相對之端點效價表示，定義為最大稀釋而獲得OD405讀值，兩標準誤差在負控制組之以上。
以ELISA測量於三種PCMV製劑1-3及兩種抗原控制組製劑4及5接種之小鼠，其中IgM及IgG專一抗-DNI及抗-PGA的免疫反應(圖3-5)。參照第3圖，除未與戊二醛(無供應過多)交聯之控制組製劑4，在所有製劑，該DNI蛋白具高度致免疫性。然而，這些DNI-專一免疫反應專門以IgG為基礎。甚至接種第7天，無抗-DNI IgM被偵測到，而顯著抗--DNI IgG反應可於接種PCMV製劑之小鼠及接種只有交聯DNI(製劑5)那些第17天偵測到。於以所有製劑(包括製劑4)抗DNI第30天強增幅反應(booster response)被注意到。
抗-PGA IgM反應顯示典型莢膜聚合物(圖4)圖案。控制組製劑4第7天產生可偵測之抗-PGA IgM反應，但這反應第17天或第30天並無增強。所有PCMV製劑第17天誘導抗-PGA IgM反應，隨後第17天或第30天甚至專有產生較強抗-PGA IgM反應。如期望，控制組製劑5(只有交聯DNI)不產生IgM-或IgG-基礎抗-PGA反應。明顯對比中，PCMV1-3(製劑1-3)產生強IgG-基礎抗-PGA反應，該反應第17天出現，隨後第30天明顯增強(圖5)。對於PCMV1-3， IgG-基礎抗-PGA反應明顯相似與所報導傳統PGA-DNI共軛疫苗及PA-PGA共軛疫苗對PGA之反應，該報導分別為Aulinger等(Infect.Immun.73：3408-3414,2005)及Rhie等。(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 100：10925-10930,2003)所述。因此，PCMV疫苗#1、#2及#3所有表現和傳統共軛PGA疫苗誘導對莢膜PGA之IgG反應一樣好，為已知非T-依賴型、炭疽桿菌保護性抗原(Wang et al.,Infect.Immun.72：5460-5463,2004)。含與PGA混合之DNI(無交聯)之控制組製劑5無誘導可偵測之抗PGA之IgG表示DNI並不扮演TLR配體，在PCMV製劑1-3中刺激IgG抗-PGA反應。這結果亦確認文獻上之觀察，除非PGA透過共價鍵與蛋白偶合，否則PGA為低致免疫力之非T-細胞依靠型免疫抗原(immunogen)(Rhie et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 100：10925-10930,2003)。該PCMV方法明顯將PGA轉換成T-細胞依靠型免疫抗原，僅管該方法並不造成該DNI蛋白直接對PGA分子。
這些資料支持該PCMV方法可以產生與傳統共軛疫苗相似特性之免疫抗原。該PGA PCMV以本發明所述之方法輕易製得，且發現誘導典型PGA-蛋白共軛疫苗之免疫反應。表1所述小量反應產生足夠PCMV使1000隻小鼠按第3圖所述劑量給藥方案產生免疫。本發明資料支持從PGA及DNI製得之PCMV可用作預防抗炭疽桿菌(Bacillus anthracis)引起炭疽病之疫苗。
實施例3、額外PCMV產生及特性
該PCMV技術可應用於各種結構及離子電荷之莢膜抗原。肺炎鏈球菌PS 23種型購自美國菌種保藏中心(ATCC)且Merck公司製造。這些PS很大差異在於它們分子結構，包括強陰離子、部份陽離子、中性電荷、磷酸化、直線、有分支結過及各種其它方式修飾之PS。在初步實驗，分析對應於在惠氏產品Prevnar(4,6B,9V,14,18C,19F，及23F)七種莢膜型之這些PS子集對於誘導小鼠巨噬細胞產生IL-6之能力。PS 4型在這分析中具活性；脂多醣(LPS)為控制組作為TLR促進劑。亦分析其它PS(如，3型)、PGA及土拉倫法式菌O抗原PS及PGA-DNI製得之PCMV疫苗與無交聯之控制組。這實驗顯示肺炎鏈球菌PS3型及較小程度PGA亦混雜TLR促進劑。土拉倫法式菌PS及該PCMV於分析中同等地乾淨。酚萃取乙醇沉澱兩次連續不斷處理後的可清理(移除殘留不知TLR促進劑)肺炎鏈球菌PS3型。因此，六種肺炎鏈球菌PS及土拉倫法式菌O抗原PS發現為乾淨用以生產IL6，而這些已用於本發明所述之實驗探究。
發現乾淨用以生產IL6之7種PS的PCMV以類似實施例1所述之方法用DNI作為載體蛋白合成。初步致免疫力分析建議七種PCMV所有具不同程度之致免疫性。肺炎鏈球菌PS14(14-PCMV)之DNI-基礎“單價”PCMV(14-PCMV)發現誘導高效價抗-PPS14 IgG，第三次接種顯著增強。明顯地，當14-PCMV與其它六種PCMV混合成“雞尾酒”免疫抗原，發現有相同免疫反應。因為Prevnar®(Pneumococcal 7-Valent Conjugate Vaccine[Diphthteria CRM197 Protein],Wyeth Pharmaceuticals Inc.)為經鋁吸收之“佐劑”疫苗，是否檢測該六價PCMV雞尾酒亦可吸收至鋁佐劑。暴露於PCMV或與DNI蛋白混合但無戊二醛交聯之相同PS控制組混合物後，定性測量吸收至鋁佐劑之肺炎鏈球菌PS量，該免疫分析結果顯示在PCMV，更多PS吸收至鋁佐劑勝過控制組(PS+未交聯之DNI蛋白)(在免疫分析中，對進一步稀釋PCMV，顯示較高水準免疫反應性(immunoreactivity))。
小鼠接種免疫用以評估六價PCMV有無鋁佐劑吸收之致免疫力。鋁佐劑改善對PS14之免疫反應之動力學，第7天誘導IgG對抗這PS 7較無佐劑疫苗炔。然而，該六價PCMV在無鋁佐劑下較有鋁佐劑存在下無交聯PS+DNI組合控制組更具致免疫性。這結果確定該PCMV步驟使得PS小鼠較具致免疫性，並支持該PCMV步驟可用以製造免疫表現像雞尾酒共軛疫苗之雞尾酒抗原。
在額外實驗中，酚萃取乙醇沉澱用以移除23肺炎鏈球菌多醣市售製劑中混雜TLR促進劑。混雜物移除以經處理之PS經標準方法誘導腹膜巨噬細胞生產IL-6作測試。缺少IL-6誘導活性之PS用以生產PCMV。用以PCMV之其它多醣包括土拉倫法式菌O抗原PS及炭疽桿菌PGA莢膜。測試總計25種莢膜類型(23種肺炎球菌類型及兔熱病(tularemia)及炭疽熱(anthrax)類型各一)。25種莢膜類型每一種大體以實施例1所述方法用DNI蛋白製造PCMV。 採用PS對蛋白1：1比例(乾重約1：1)以製造這些最初PCMV製劑。每一製劑以SDS-PAGE為特徵，提供蛋白交聯證據，在初步實驗，交聯與各種PCMV製劑之致免疫力完全地相關。在一些莢膜類型(如，6B及23F)，用其它載體蛋白製造PCMV。在相同莢膜類型(如，6B及23F)可用替代交聯化學。所有顯示蛋白交聯(如，於SDS-PAGE)證據之PCMV製劑測試它們致免疫力。
舉例來說，使用5種不同基質蛋白及2種不同抗原製造10種不同PCMV如下。5種基質蛋白選擇係基於在FDA-許可疫苗它們最近的用途或允許它們作為追蹤者，用以測量PCMV製劑穩定性。使用下列基質蛋白：(1)霍亂毒素次單元B(購自SBL Vaccin AB)、(2)白喉毒素、(3)破傷風毒素C端片段(Frag C)(購自Sigma Aldrich)、(4)DNI及(5)大腸桿菌β半乳糖苷酶(購自Sigma Aldrich)。使用炭疽桿菌莢膜抗原聚γ-D-麩胺酸及肺炎雙球菌莢膜14型(Suarez et al.,Appl.Environ.Micobiol.67：969-971,2001)。在相對應之PCMV中，當用作為基質蛋白之DNI時，這莢膜抗原兩者具高度致免疫性。每一莢膜抗原與五種經選擇之基質蛋白結合以生產10種不同PCMV。
PCMV可測試誘導小鼠中如傳統共軛疫苗所觀察同種型抗體轉變成IgG之能力。所有抗原可吸收至鋁佐劑，然後每一PCMV製劑處理5隻小鼠一組。先測試小鼠餵食前的抗原基本免疫反應。然後，小鼠以標準IP注射說明接種三次(第0、7、14天)，於初級接種後第10、20、30及60天收 集血液。小鼠血清以標準ELISA分析抗所用之PS及載體蛋白之IgG。在這些實驗中，只接種PS之小鼠控制組分析各種PCMV製劑誘導抗-PS IgG之能力，並與應該具差或無致免疫力之非共軛比較。大有可為的PCMV(即誘導高含量抗PS之IgG)接受更仔細免疫分析，試圖建立小鼠中對於PCMV之免疫反應之動力學及劑量反應類型。
另外，大有可為的PCMV及它們相對應之控制組可送至商業賣主以生產兔抗血清。執行相似免疫分析以分析兔子中致免疫力、誘導抗體之種類及免疫反應動力學。這些實驗中，該控制組為市售產品Prevnar®(Pneumococcal 7-Valent Conjugate Vaccine[Diphthteria CRM197 Protein],Wyeth Pharmaceuticals Inc.)，為偶合CRM197(與白喉毒素相關無毒素突變蛋白)之7種不同傳統共軛PS疫苗的鋁吸收混合物。
可分析以PCMV誘導抗體反應之功能。舉例來說，功能可以測量該抗-PS抗體使莢膜肺炎鏈球菌受調理素作用而造成巨噬細胞吞噬作用(phagocytosis)後殺死細菌之能力。避免動物受肺炎鏈球菌致死攻擊為另一方法說明於PCMV接種動物之該疫苗藥效。
實施例4、PCMV與Prevnar®(Pneumococcal 7-Valent Conjugate Vaccine[Diphthteria CRM197 Protein],Wyeth Pharmaceuticals Inc.)之比較
測試透過Merck由ATCC獲得或直接由印度血清機構(SII)獲得之肺炎鏈球菌多醣(pps)6B、14及23F相對潔淨 度。IL-6表現用作pps之潔淨度(cleanliness)而LPS作為正“髒”控制組。如第9A圖所示，Merck pps6B、14及23F為潔淨，同時，如圖9B所示，SII之pps 6B為“髒”的。如第10圖所示，處理2(於1M NaOH中80℃培育一小時)清除SII pps 6B。潔淨之pps 6B用以比較共軛物及PCMV免疫特性。如表3所示，該混雜物非LPS。
圖11及13顯示Prevnar®(Pneumococcal 7-Valent Conjugate Vaccine[Diphthteria CRM197 Protein],Wyeth Pharmaceuticals Inc.)(為鋁佐劑吸收)誘導抗pps 6B之IgG抗體，鋁佐劑PCMV(BSA及pps 6B；白喉毒素及pps 6B；白喉類毒素及pps 6B；與破傷風毒素及pps 6B)較好過於Prevnar®(Pneumococcal 7-Valent Conjugate Vaccine[Diphthteria CRM197 Protein],Wyeth Pharmaceuticals Inc.)所觀察之反應。相似地，如第12圖所示，對鋁佐劑PCMV之IgM反應類似Prevnar®(Pneumococcal 7-Valent Conjugate Vaccine[Diphthteria CRM197 Protein],Wyeth Pharmaceuticals Inc.)。
此外，對於pps 14(Prevnar®(Pneumococcal 7-Valent Conjugate Vaccine[Diphthteria CRM197 Protein], Wyeth Pharmaceuticals Inc.)中，最具致免疫性pps)，如圖14-16所示，含白喉類毒素及pps 14或破傷風毒素及pps 14之鋁佐劑PCMV約相當於Prevnar®(Pneumococcal 7-Valent Conjugate Vaccine[Diphthteria CRM197 Protein],Wyeth Pharmaceuticals Inc.)誘導IgG反應。
實施例5、多價PCMV
多價免疫抗原採用PCMV方法製造，藉由在以戊二醛與DNI載體蛋白交聯前，混合化學上不同莢膜有機聚合物一起(一鍋法合成反應(one pot synthetic reaction))。這類三價免疫抗原由三種有機合物-PGA、藻酸(alginate)及葡聚醣(dextran)，使用DNI作為載體蛋白製造而成。這些三價疫苗具致免疫性並產生抗這三種莢膜有機聚合物免疫反應，如圖所示，接種前及30天後(圖6)、接種後60天抗原-專一性血清IgG抗體效價(圖7)及接種後128天抗-PS血清抗體效價(圖8)聚集血清IgM分析。亦如圖6-8所示，單價藻酸PCMV製劑於小鼠中亦產生免疫反應。多價PCMV免疫抗原亦可由混合專一性PCMV調製，該專一性PCMV個別合成，然後最後混合一起製造成“雞尾酒”疫苗。
此處所述或參考於本說明書之所有專利、專利申請案、專利申請公開案及其它公開資料之全部內容結合於此為參考。相同程度地，個別專利、專利申請案、專利申請公開案及其它公開資料特別地與個別地結合於此為參考。
第1圖為非限定途徑概要圖，PS及該載體蛋白破傷風桿菌類毒間產生共軛之共軛疫苗誘導抗-PS IgG免疫反應。只有B-細胞結合該PS-蛋白共軛物，而該B-細胞顯露出辨識該PS之抗體受體。因此，該載體蛋白結合至顯露出正確PS結合專一性之B-細胞表面。
第2圖顯示PCMV及控制組製劑以SDS聚丙烯醯胺膠體電泳及以抗-PA抗血清西方墨點分析監測交聯之西方墨點分析圖。戊二醛交聯前，DNI蛋白移動至84kDa。PCVM1-PCMV3(第1-3欄)顯示該DNI蛋白大量交聯，由亮帶(band)移動至分子量超過220kDa可所說。無PGA下，單獨交聯之DNI蛋白亦顯示相同高分子量(第5欄)。相對地，以PGA混合但無以戊二醛處理之DNI顯示於DNI與共移動或較低分子量之亮帶(第4欄)。
第3圖顯示用以測量以三種PCMV製劑(PCMV1-PCMV3；製劑1-3)及兩種抗原控制組製劑4及5接種小鼠中IgM及IgG專一性抗-DNI免疫反應之ELISA分析結果的圖表。除除未與戊二醛(無供應過多)交聯之控制組製劑4，在所有製劑，該DNI蛋白具高度致免疫性。然而，這些DNI-專一免疫反應專門以IgG為基礎。甚至接種第7天，無抗-DNIIgM被偵測到，而顯著抗--DNI IgG反應可於接種PCMV製劑之小鼠及接種只有交聯DNI(製劑5)那些第17天偵測到。於以所有製劑(包括製劑4)抗DNI第30天強增幅反應(booster response)被注意到。
第4圖顯示用以測量以三種PCMV製劑(PCMV1-PCMV3；製劑1-3)及兩種抗原控制組製劑4及5接種小鼠中IgM專一性抗-PGA免疫反應之ELISA分析結果的圖表。抗-PGA IgM反應顯示典型莢膜聚合物圖案。控制組製劑4第7天產生可偵測之抗-PGA IgM反應，但這反應第17天或第30天並無增強。所有PCMV製劑第17天誘導抗-PGA IgM反應，隨後第17天或第30天甚至專有產生較強抗-PGA IgM反應。如期望，控制組製劑5(只有交聯DNI)不產生IgM-或IgG-基礎抗-PGA反應。
第5圖顯示用以測量以三種PCMV製劑(PCMV1-PCMV3；製劑1-3)及兩種抗原控制組製劑4及5接種小鼠中IgG專一性抗-PGA免疫反應之ELISA分析結果的圖表。PCMV1-3(製劑1-3)產生強IgG-基礎抗-PGA反應，該反應第17天出現，隨後第30天明顯增強。
第6圖顯示接種前，以含DNI及藻酸(DNI-ALG C、DNI ALG A)及以藻酸(ALG)、葡聚醣(DEX)及PGA混合之DNI“一鍋(one pot)”三價PCMV接種後30天收集血清IgM抗體效價之圖表。
第7圖顯示以含DNI及藻酸(DNI-ALG C、DNI ALG A)及以藻酸(ALG)、葡聚醣(DEX)及PGA混合之DNI“一鍋(one pot)”三價PCMV接種後60天抗原-專一性血清IgM抗體效價之圖表。
第8圖顯示以含DNI及藻酸(DNI-ALG C、DNI ALG A)及以藻酸(ALG)、葡聚醣(DEX)及PGA混合之DNI“一鍋(one pot)”三價PCMV接種後128天抗原-專一性血清IgG抗體效價之圖表。
第9A及9B圖顯示使用自美國菌種保藏中心(ATCC)且Merck公司製造或自印度血清機構(SII)肺炎鏈球菌多醣(pss)之IL-6分析圖表。
第10圖顯示由SII獲得之pss 6B中混雜物可用處理2(trt 2；於1M NaOH中80℃培育一小時)移除之圖表。處理1(trt 1)為一系列五次酚萃取由該多醣移除蛋白。
第11圖顯示在誘導IgG產生有效上，含pss 6B之PCMV較Prevnar®(Pneumococcal 7-Valent Conjugate Vaccine[Diphthteria CRM197 Protein],Wyeth Pharmaceuticals Inc.)之圖表。BSA=牛血清白蛋白；DT=白喉毒素；DTx=白喉類毒素；及TTx=破傷風毒素。
第12圖顯示在誘導IgM產生上，含pss 6B之PCMV較Prevnar®(Pneumococcal 7-Valent Conjugate Vaccine[Diphthteria CRM197 Protein],Wyeth Pharmaceuticals Inc.)有效之圖表。
第13圖顯示含pss 6B之PCMV較Prevnar®(Pneumococcal 7-Valent Conjugate Vaccine[Diphthteria CRM197 Protein],Wyeth Pharmaceuticals Inc.)對誘導IgG產生有效之圖表。
第14-16圖顯示在誘導IgG產生上，含pss 14之PCMV約等與Prevnar®(Pneumococcal 7-Valent Conjugate Vaccine[Diphthteria CRM197 Protein],Wyeth Pharmaceuticals Inc.)相當(DTx=白喉類毒素；TTx=破傷風毒素)。

Claims (41)

  1. 一種疫苗組成物，包括一所要抗原及一載體蛋白基質，其中(i)該載體蛋白基質包括共價交聯之多個載體蛋白，(ii)不超過50%之該所要抗原與該些載體蛋白共價交聯，且(iii)該抗原被該載體蛋白基質包合形成一複合物。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之疫苗組成物，其中該複合物的直徑介於10nm及100μm之間。
  3. 如申請專利範圍第2項所述之疫苗組成物，其中該複合物的直徑介於100nm至100μm之間。
  4. 如申請專利範圍第2項所述之疫苗組成物，其中該複合物的直徑介於100nm至10μm之間。
  5. 如申請專利範圍第1項所述之疫苗組成物，其中該複合物投予哺乳動物時，該複合物引發該哺乳動物T-細胞決定性免疫反應(T-cell dependent immune response)。
  6. 如申請專利範圍第1項所述之疫苗組成物，其中該抗原與該些載體蛋白之摩耳數比介於1-10及10-1之間。
  7. 如申請專利範圍第1項所述之疫苗組成物，其中該些載體蛋白為一多聚體(multimer)。
  8. 如申請專利範圍第7項所述之疫苗組成物，其中該多聚體包括至少5個次單體。
  9. 如申請專利範圍第7項所述之疫苗組成物，其中該多聚體為同型多聚體(homomultimer)。
  10. 如申請專利範圍第1項所述之疫苗組成物，其中該共價交聯包括一離胺酸支鏈初級胺基及天冬胺酸或麩胺酸 支鏈羧基間之胜肽鍵。
  11. 如申請專利範圍第1項所述之疫苗組成物，其中該 共價交聯包括化學式之化合物，其中Rn為1至12個碳原子之直鏈或支鏈烷基、1至12個原子之直鏈或支鏈雜烷基、2至12個碳原子之直鏈或支鏈烯、2至12個碳原子之直鏈或支鏈炔、5至10個碳原子之芳香殘基(aromatic residue)、3至10個原子之環狀系統、-(CH2CH2O)qCH2CH2-其中q為1至4或鍵結兩個醛基之化學鍵。
  12. 如申請專利範圍第1項所述之疫苗組成物，其中該共價交聯包括戊二醛(glutaraldehyde)、順丁烯酰胺苯甲酸-N-琥珀酸酯(m-maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester，MBS)、碳二亞胺(carbodiimide)或雙-二氮化聯苯胺(bis-biazotized benzidine)。
  13. 如申請專利範圍第1項所述之疫苗組成物，其中該共價交聯包括雙功能交聯劑(bifunctional cross-linker)。
  14. 如申請專利範圍第13項所述之疫苗組成物，其中該雙功能交聯劑為戊二醛、辛二酸雙磺基琥珀醯亞胺酯(bis[sulfosuccinimidyl]suberate)或己二(亞胺)酸二甲酯(dimethyl adipimidate)。
  15. 如申請專利範圍第1項所述之疫苗組成物，其中該些載體蛋白為白喉毒素(diphtheria toxin，DT)、白喉類毒素(diphtheria toxoid)、破傷風毒素(tetanus toxin)、 破傷風桿菌類毒素、綠膿桿菌外毒素A(Pseudomonas aeruginosa exotoxin A)、霍亂毒素次單元B(cholera toxin B subunit)、破傷風毒素C端片段(tetanus toxin fragment C，TTFC)、細菌鞭毛蛋白(bacterial flagellin)、肺炎球菌溶血素(pneumolysin)、腦膜炎雙球菌(Neisseria meningitidis)外膜蛋白、綠膿桿菌Hcp1蛋白、大腸桿菌不耐熱腸毒素(Escherichia coli heat labile enterotoxin)、類志賀氏毒素(shiga-like toxin，SLT)、人類LTB蛋白、肺炎球菌溶血素(pneumolysin)、李斯特溶解素O(listeriolysin O)(或相關蛋白)、整個細菌細胞萃取之蛋白、炭疽桿菌(Bacillus anthracis)顯著抑制型(dominant-negative mutant)(DNI)保護性抗原(Protective antigen，PA)或大腸桿菌β半乳糖苷酶(beta-galactosidase)。
  16. 如申請專利範圍第15項所述之疫苗組成物，其中該整個細菌細胞為綠膿桿菌或鏈球菌細胞。
  17. 如申請專利範圍第15項所述之疫苗組成物，其中該細菌鞭毛蛋白為霍亂弧菌(Vibrio cholerae)鞭毛蛋白。
  18. 如申請專利範圍第15項所述之疫苗組成物，其中該類志賀氏毒素為志賀氏桿菌(Shigella)SltB2蛋白。
  19. 如申請專利範圍第1項所述之疫苗組成物，其中該所要抗原為一多醣、多元醇或聚胺基酸。
  20. 如申請專利範圍第19項所述之疫苗組成物，其中該多醣為一肺炎鏈球菌多醣、土拉倫法式菌多醣、炭疽桿 菌多醣、流感嗜血桿菌多醣、傷寒桿菌多醣、沙門氏桿菌屬多醣、志賀氏桿菌多醣或腦膜炎雙球菌多醣。
  21. 如申請專利範圍第20項所述之疫苗組成物，其中該肺炎鏈球菌多醣為第3、4、6B、7A、7B、7C、7F、9A、9L、9N、9V、12A、12B、12F、14、15A、15B、15C、15F、17、18B、18C、19F、23F、25A、25F、33F、35、37、38、44、或46型莢膜。
  22. 如申請專利範圍第1項所述之疫苗組成物，其中該所要抗原為一微生物莢膜聚合物。
  23. 如申請專利範圍第22項所述之疫苗組成物，其中該微生物莢膜聚合物為炭疽桿菌(Bacillus anthracis)之聚γ-D-麩胺酸(poly-gamma-D-glutamic acid)。
  24. 如申請專利範圍第1項所述之疫苗組成物，其中該疫苗組成物更包括一第二所要抗原。
  25. 如申請專利範圍第1項所述之疫苗組成物，其中該疫苗組成物包括多種所要抗原。
  26. 一種製造疫苗組成物之方法，包括(i)將一所要抗原與多個載體蛋白混合；(ii)加入一連接劑共價交聯該載體蛋白；以及(iii)交聯該些載體蛋白以形成一載體蛋白基質，其中該抗原被該載體蛋白基質包合，其中在該疫苗組成物中，不超過50%之該所要抗原與該些載體蛋白共價交聯。
  27. 如申請專利範圍第26項所述之方法，其中該疫苗組成物更包括一藥學上可接受之賦形劑。
  28. 如申請專利範圍第26項所述之方法，其中在該疫苗組成物中，該抗原及該載體蛋白之摩耳數比介於1-10及10-1之間。
  29. 如申請專利範圍第26項所述之方法，其中該載體蛋白為白喉毒素、白喉類毒素、破傷風毒素、破傷風桿菌類毒素、綠膿桿菌外毒素A、霍亂毒素次單元B、破傷風毒素C端片段、細菌鞭毛蛋白、肺炎球菌溶血素、李斯特溶解素O、腦膜炎雙球菌外膜蛋白、綠膿桿菌Hcp1蛋白、大腸桿菌不耐熱腸毒素、類志賀氏毒素、人類LTB蛋白、整個細菌細胞(萃取之蛋白、炭疽桿菌顯著抑制型(DNI)保護性抗原或大腸桿菌β半乳糖苷酶。
  30. 如申請專利範圍第26項所述之方法，其中該所要抗原為一多醣、多元醇或聚胺基酸。
  31. 如申請專利範圍第30項所述之方法，其中該多醣為一肺炎鏈球菌多醣、土拉倫法式菌多醣、炭疽桿菌多醣、流感嗜血桿菌多醣、傷寒桿菌多醣、志賀氏桿菌多醣、沙門氏桿菌屬多醣或腦膜炎雙球菌多醣。
  32. 如申請專利範圍第31項所述之方法，其中該肺炎鏈球菌多醣為第3、4、6B、7A、7B、7C、7F、9A、9L、9N、9V、12A、12B、12F、14、15A、15B、15C、15F、17、18B、18C、19F、23F、25A、25F、33F、35、37、38、44、或46型莢膜。
  33. 如申請專利範圍第26項所述之方法，其中該所要抗原為一微生物莢膜聚合物。
  34. 如申請專利範圍第33項所述之方法，其中該微生物莢膜聚合物為炭疽桿菌(Bacillus anthracis)之聚γ-D-麩胺酸(poly-gamma-D-glutamic acid)。
  35. 如申請專利範圍第26項所述之方法，更包括包合一第二所要抗原。
  36. 如申請專利範圍第35項所述之方法，其中該載體蛋白包合多種所要抗原。
  37. 如申請專利範圍第26項所述之方法，其中該共價交聯包括一雙功能交聯劑。
  38. 如申請專利範圍第37項所述之方法，其中該雙功能交聯劑為戊二醛、辛二酸雙磺基琥珀醯亞胺酯或己二(亞胺)酸二甲酯。
  39. 如申請專利範圍第26項所述之方法，其中該連接 劑為一化學式之化合物，其中Rn為1至12個碳原子之直鏈或支鏈烷基、1至12個原子之直鏈或支鏈雜烷基、2至12個碳原子之直鏈或支鏈烯、2至12個碳原子之直鏈或支鏈炔、5至10個碳原子之芳香殘基、3至10個原子之環狀系統、-(CH2CH2O)qCH2CH2-其中q為1至4或鍵結兩個醛基之化學鍵。
  40. 一種申請專利範圍第1項之疫苗組成物的用途，其係用於製備用以誘導受試者對抗該所要抗原的免疫反應之藥物。
  41. 如申請專利範圍第40項所述之用途，其中該免疫反應足以預防或降低該受試者因致病因子之感染。
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Families Citing this family (29)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MX2009001412A (es) * 2006-08-07 2009-04-24 Harvard College Vacunas de matriz de proteinas y metodos de hacer y administrar tales vacunas.
US8524394B2 (en) * 2007-11-22 2013-09-03 Samsung Sdi Co., Ltd. Negative electrode and negative active material for rechargeable lithium battery, and rechargeable lithium battery including same
US8728478B2 (en) 2008-09-03 2014-05-20 Board Of Trustees Of Michigan State University Immunogenic Escherichia coli heat stable enterotoxin
US8647621B2 (en) 2009-07-27 2014-02-11 Fina Biosolutions, Llc Method of producing protein-carbohydrate vaccines reduced in free carbohydrate
US20120231086A1 (en) * 2009-09-09 2012-09-13 Killen Kevin P Protein matrix vaccines of improved immunogenicity
US20110135689A1 (en) * 2009-11-30 2011-06-09 University Of Iowa Research Foundation Vaccine, therapeutic composition and methods for treating or inhibiting francisella tularenis
US9044517B2 (en) 2009-12-17 2015-06-02 Fina Biosolutions, Llc Activation of polysaccharides via the cyanylating agent, 1-cyano-4-pyrrolidinopyridinium tetrafluoroborate (CPPT), in the preparation of polysaccharide/protein conjugate vaccines
ES2743156T3 (es) 2010-04-23 2020-02-18 Serum Institute Of India Pvt Ltd Método simple para eliminación simultánea de múltiples impurezas a partir de sobrenadantes de cultivo a niveles ultrabajos
CN107261129A (zh) * 2010-05-03 2017-10-20 财团法人生物技术开发中心 用作疫苗的多糖与去毒大肠杆菌(e. coli)不耐热肠毒素(lt)的偶联
WO2012158701A1 (en) 2011-05-18 2012-11-22 Matrivax Research & Development Corporation Protein matrix vaccine compositions including polycations
PE20142361A1 (es) 2011-09-30 2015-01-16 Dana Farber Cancer Inst Inc Peptidos terapeuticos
US9931392B2 (en) 2013-01-18 2018-04-03 London School Of Hygiene And Tropical Medicine Glycosylation method
GB201301085D0 (en) * 2013-01-22 2013-03-06 London School Hygiene & Tropical Medicine Glycoconjugate Vaccine
BR112015021576A2 (pt) 2013-03-15 2017-10-10 Dana Farber Cancer Inst Inc peptídeos terapêuticos
WO2015073831A1 (en) * 2013-11-15 2015-05-21 Liquidia Technologies, Inc. Virtual conjugate particles
PL3096783T3 (pl) 2014-01-21 2021-12-13 Pfizer Inc. Polisacharydy otoczkowe streptococcus pneumoniae i ich koniugaty
EP3145953A1 (en) * 2014-05-21 2017-03-29 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Methods for treating cancer with anti bip or anti mica antibodies
US9107906B1 (en) 2014-10-28 2015-08-18 Adma Biologics, Inc. Compositions and methods for the treatment of immunodeficiency
WO2018009906A1 (en) * 2016-07-08 2018-01-11 President And Fellows Of Harvard College Whole cell-protein conjugates and methods of making the same
SG11201901394XA (en) 2016-09-02 2019-03-28 Sanofi Pasteur Inc Neisseria meningitidis vaccine
US11951165B2 (en) 2016-12-30 2024-04-09 Vaxcyte, Inc. Conjugated vaccine carrier proteins
US10259865B2 (en) 2017-03-15 2019-04-16 Adma Biologics, Inc. Anti-pneumococcal hyperimmune globulin for the treatment and prevention of pneumococcal infection
US10729763B2 (en) 2017-06-10 2020-08-04 Inventprise, Llc Mixtures of polysaccharide-protein pegylated compounds
CA3066911C (en) * 2017-06-10 2022-05-24 Inventprise, Llc Multivalent conjugate vaccines with bivalent or multivalent conjugate polysaccharides that provide improved immunogenicity and avidity
CN111479558A (zh) 2017-10-13 2020-07-31 纽约州立大学研究基金会 用于共生疾病进展的综合疫苗设计
PE20201338A1 (es) 2017-12-06 2020-11-25 Merck Sharp & Dohme Composiciones que comprenden conjugados de polisacarido de streptococcus pneumoniae con proteina y metodos de uso de estos
US20220016229A1 (en) * 2018-12-12 2022-01-20 Pfizer Inc. Immunogenic Multiple Hetero-Antigen Polysaccharide-Protein Conjugates and uses thereof
CN113453708A (zh) 2018-12-19 2021-09-28 默沙东公司 包含肺炎链球菌多糖-蛋白缀合物的组合物及其使用方法
CN114129719A (zh) * 2021-12-03 2022-03-04 张公义 广谱疫苗的制备方法

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4707543A (en) * 1985-09-17 1987-11-17 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army Process for the preparation of detoxified polysaccharide-outer membrane protein complexes, and their use as antibacterial vaccines
US4761470A (en) 1985-12-16 1988-08-02 Merck & Co., Inc. Immunogenic synthetic peptide capable of eliciting herpes simplex virus neutralizing antibody
US5153312A (en) * 1990-09-28 1992-10-06 American Cyanamid Company Oligosaccharide conjugate vaccines
EP0577659B1 (en) 1991-03-28 1996-01-17 Nycomed Imaging As Cross-linking agent
US5961970A (en) * 1993-10-29 1999-10-05 Pharmos Corporation Submicron emulsions as vaccine adjuvants
US5545669A (en) 1994-06-02 1996-08-13 Adams; Jerry L. Anti-inflammatory compounds
US5917017A (en) 1994-06-08 1999-06-29 President And Fellows Of Harvard College Diphtheria toxin vaccines bearing a mutated R domain
US5565204A (en) 1994-08-24 1996-10-15 American Cyanamid Company Pneumococcal polysaccharide-recombinant pneumolysin conjugate vaccines for immunization against pneumococcal infections
WO1997010844A1 (en) * 1995-09-18 1997-03-27 United States Army Medical Research Materiel Command (Usamrmc) Improved methods for the production of non-covalently complexed and multivalent proteosome sub-unit vaccines
US6821331B2 (en) * 2003-04-09 2004-11-23 Wisconsin Alumni Research Foundation Protein-polysaccharide hybrid hydrogels
EP1522585A1 (en) * 2003-10-09 2005-04-13 Plant Research International B.V. Chimeric carrier molecules for the production of mucosal vaccines
MX2009001412A (es) 2006-08-07 2009-04-24 Harvard College Vacunas de matriz de proteinas y metodos de hacer y administrar tales vacunas.

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Aulinger et al., "Combining Anthrax Vaccine and Therapy: a Dominant-Negative Inhibitor of Anthrax Toxin Is Also a Potent and Safe Immunogen for Vaccines." Infection and Immunity, Vol. 73, No. 6, pp. 3408-3414 (2005/06). Jakobsen et al., "Intranasal Immunization with Pneumococcal Polysaccharide Conjugate Vaccines with Nontoxic Mutants of Escherichia coli Heat-Labile Enterotoxins as Adjuvants Protects Mice against Invasive Pneumococcal Infections." Infection and Immunity, Vol. 67, No. 11, pp. 5892-5897 (1999/11). 余傳霖，肺炎鏈球菌結合疫苗的發展和評估，國外醫學：微生物學分册，2004年第2期，第37-38、48頁 *
Mladenovskat et al., "Crosslinked Gelatin Microspheres Containing BSA as a Vaccine Formulation: Biodegradation and Drug Release Control in the Presence of Trypsin." Bulletin of the Chemists and Technologists of Macedonia, Vol. 20, No. 2, pp. 151-156 (2001). *

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Publication number Publication date
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