BRPI0715396B1 - Método de produção de uma composição para vacina - Google Patents

Abstract

método de produção de uma composição para vacina. a presente invenção refere-se a composições para vacina que possuem uma proteína transportadora e um antígeno 5 de interesse capturados em um complexo, a processos de produção de tais vacinas e a processos de administração de vacina.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS DE PATENTES RELACIONADOS

Este pedido de patente reivindica o benefício do pedido de patente provisório U.S. N^o de série 60/835.944, depositado em 7 de agosto de 2006 e do pedido de patente provisório U.S. N^o de série 60/933.764, depositado em 8 de junho de 2007, cujos relatórios descritivos são incorporados aqui como referência.

DECLARAÇÃO COMO PESQUISA FINANCIADA PELO GOVERNO FEDERAL

Esta invenção foi realizada com apoio do Governo sob Privilégio N^o U54AI057159 outorgado pelos National Institutes of Health (NIH). O Governo possui certos direitos nesta invenção.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se a composições para vacina, métodos de produção de vacinas e métodos de administração de vacinas.

Muitos antígenos, particularmente os associados a uma camada de cápsula do agente patogênico estimulam pouca ou nenhuma resposta imunológica e complicam os esforços para criar vacinas eficientes contra tais antígenos. As cápsulas são componentes de superfície de micro-organismos que são tipicamente compostas de polímeros de compostos orgânicos tais como carboidratos, aminoácidos ou álcoois. As cápsulas são bastante distintas quimicamente. As unidades monoméricas que constituem as cápsulas (por exemplo, carboidratos) podem estar ligadas juntas em várias configurações moleculares e podem ser adicionalmente substituídas por fosfato, nitrogênio, sulfato e outras modificações químicas. Estas variações químicas permitem que as cápsulas apresentem vários alvos antigênicos na superfície microbiana permitindo assim fugir do sistema imunológico do hospedeiro direcionado para estes alvos. As cápsulas também podem ser fatores de virulência que previnem que os micro-organismos sejam fagocitados e mortos pelos macrófagos do hospedeiro e por linfócitos polimorfonucleares. Os

Petição 870180147694, de 05/11/2018, pág. 20/20 anticorpos contra as cápsulas fornecem uma defesa potente contra os organismos encapsulados através da fixação do complemento à superfície microbiana, que pode resultar em sua lise ou sua opsonização, captação e morte pelas células imunológicas fagocíticas do hospedeiro. Os anticorpos 5 mais potentes contra as cápsulas são anticorpos IgG. As cápsulas que falham em induzir níveis significativos de IgG são chamadas de antígenos independentes de T. O acoplamento covalente de uma proteína à cápsula a torna dependente de T” e tais antígenos podem ativar uma resposta de IgG.

Há uma necessidade de vacinas eficientes em relação ao custo 10 acessíveis sinteticamente seguras direcionadas para a cápsula e outros antígenos independentes de T que não ativam respostas imunológicas fortes ou anticorpo IgG. Tais vacinas são necessárias para proteger contra várias doenças infecciosas tal como infecção por antraz, pneumococos, influenza do Tipo B, meningococos e estreptococos.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se a composições para vacina que contêm um antígeno de interesse capturado por uma proteína transportadora em um complexo, métodos de produção de tais vacinas e métodos de administração de vacinas.

Consequentemente, no primeiro aspecto, a invenção descreve uma composição para vacina que contém um antígeno de interesse e uma proteína transportadora, em que (i) não mais de 50% do antígeno de interesse sofre ligação cruzada com a proteína transportadora e (ii) em que o antígeno é capturado pela proteína transportadora para formar um complexo.

Em modalidades desejáveis do primeiro aspecto da invenção, o complexo possui um diâmetro entre 10 nm e 100 pm. Em modalidades mais desejáveis do primeiro aspecto da invenção, o complexo possui um diâmetro de aproximadamente 100 nm até 100 pm. Ainda em modalidades mais desejáveis do primeiro aspecto da invenção, o complexo possui um diâmetro de 30 aproximadamente 100 nm até 10 pm.

Em outras modalidades desejáveis do primeiro aspecto da invenção, o complexo, quando administrado a um mamífero, ativa uma res posta imunológica dependente de células T no mamífero.

Em modalidades desejáveis adicionais do primeiro aspecto da invenção, a proporção molar do antígeno em relação à proteína transporta» * ’ dora fica entre 1 até 10 e 10 até 1. De forma desejável, a proteína transpor5 tadora é um multímero, por exemplo, um multímero que inclui pelo menos 5 subunidades. Em outras modalidades desejáveis, o multímero é um homomultímero.

Em modalidades adicionalmente desejáveis do primeiro aspecto da invenção, a proteína transportadora está covalentemente ligada a pelo 10 menos uma outra proteína transportadora. De forma desejável, a ligação covalente contém uma ligação peptídica entre um grupo amino primário de uma cadeia lateral de lisina e um grupo carbóxi de uma cadeia lateral de aspartato ou glutamato. Em outras modalidades desejáveis, a ligação covalenCHO te inclui um composto da fórmula Rn—CHO, _ern que R_n é um alquila linear ou : 15 ramificado de 1 até 12 átomos de carbono, um heteroalquila linear ou ramificado de 1 até 12 átomos, um alceno linear ou ramificado de 2 até 12 átomos de carbono, um alcino linear ou ramificado de 2 até 12 átomos de carbono, um resíduo aromático de 5 até 10 átomos de carbono, um sistema cíclico de 3 até 10 átomos, -(CH₂CH2O)_qCH2CH2- em que q é 1 até 4 ou uma ligação 20 química que liga dois grupos aldeído. Em modalidades desejáveis adicionais, a ligação covalente contém glutaraldeído, éster de m-maleimidobenzoilN-hidroxissuccinimida, carbodi-imida ou benzidina bis-biazotizada. Ainda em outras modalidades desejáveis, a ligação covalente contém um agente de reticulação bifuncional. De forma desejável, o agente de reticulação bifun25 cional é glutaraldeído, bis[sulfosuccinimidil]suberato ou adipimidato de dimetila.

Em outras modalidades desejáveis do primeiro aspecto da invenção, as proteínas transportadoras estão ligadas de forma não-covalente. Em modalidades desejáveis, a ligação não-covalente envolve uma interação 30 hidrofóbica, uma interação iônica, uma interação de van der Waals ou uma ponte de hidrogênio.

Em modalidades desejáveis adicionais do primeiro aspecto da invenção, a proteína transportadora é toxina da difteria ou um mutante da mesma, toxoide da difteria, toxina tetânica ou um mutante da mesma, toxoide tetânico, endotoxina A de Pseudomonas aeruginosa ou um mutante da mesma, subunidade B da toxina da cólera, fragmento C da toxina tetânica, 5 flagelina bacteriana (por exemplo, proteína flagelina de Vibrío cholerae), pneumolisina, uma proteína de membrana externa de Neissería menningitidis, proteína Hcp1 de Pseudomonas aeruginosa, enterotoxina termolábil de Escheríchia coli, toxina similar a shiga (por exemplo, proteína SltB2 de Shigella), proteína LTB humana, pneumolisina, listeriolisina O (ou proteínas re10 lacionadas), um extrato de proteínas de células bacterianas inteiras (por exemplo, células de Pseudomonas aeruginosa ou de Streptococcus), o mutante negativo dominante (DNI) do antígeno protetor de Bacillus anthracis ou beta-galactosidase de Escheríchia coli. Em modalidades particularmente desejáveis, a proteína transportadora é pneumolisina, listeriolisina O, toxina da 15 difteria, toxoide da difteria, toxina tetânica ou toxoide tetânico.

Em outras modalidades desejáveis do primeiro aspecto da invenção, o antígeno de interesse é um polissacarídeo, um poliálcool ou um poliaminoácido. De forma desejável, o polissacarídeo contém pelo menos 18 resíduos. Em outras modalidades desejáveis, o polissacarídeo é um polissa20 carídeo de Streptococcus pneumoniae, um polissacarídeo de Francisella tularensis, um polissacarídeo de Bacillus anthracis, um polissacarídeo de Haemophilus influenzae, um polissacarídeo de Salmonella typhi, um polissacarídeo de espécies de Salmonella, um polissacarídeo de Shigella ou um polissacarídeo de Neissería meningitidis. Em modalidades particularmente 25 desejáveis, o polissacarídeo de Streptococcus pneumoniae é qualquer um do tipo capsular 1-48, por exemplo, 3, 4, 6B, 7A, 7B, 7C, 7F, 9A, 9L, 9N, 9V, 12A, 12B, 12F, 14, 15A, 15B, 15C, 15F, 17, 18B, 18C, 19F, 23F, 25A, 25F, 33F, 35, 37, 38, 44 ou 46. Em outras modalidades particularmente desejáveis, o polissacarídeo de Francisella tularensis é o antígeno O.

Em modalidades adicionalmente desejáveis do primeiro aspecto da invenção, o antígeno de interesse é um polímero capsular microbiano. De forma desejável, o polímero capsular microbiano é o ácido poli-gama-D glutâmico de Bacillus anthracis.

Em outras modalidades desejáveis do primeiro aspecto da invenção, o antígeno de interesse é um polímero orgânico que consiste em < *’ monômeros que possuem pelo menos três átomos, em que cada um dos átomos é independentemente selecionado de carbono, oxigênio, hidrogênio, fosfato, nitrogênio e sulfato. De forma desejável, o polímero orgânico é derivado de um micro-organismo. Em outras modalidades desejáveis, o polímero orgânico não ocorre na natureza.

Em modalidades desejáveis adicionais, a composição para vaci10 na inclui ainda um segundo antígeno de interesse. De forma desejável, a composição para vacina inclui ainda um terceiro antígeno de interesse.

No segundo aspecto, a invenção descreve um método de produção de uma composição para vacina. Este método envolve (i) a mistura de , um antígeno de interesse com uma proteína transportadora para formar uma mistura do antígeno e a proteína transportadora e (ii) a captura do antígeno de interesse pela proteína transportadora, em que não mais de 50% do antígeno de interesse sofre ligação cruzada com a proteína transportadora na composição para vacina.

Em modalidades desejáveis do segundo aspecto da invenção, a 20 composição para vacina inclui ainda um excipiente farmaceuticamente aceitável.

Em outras modalidades desejáveis do segundo aspecto da invenção, a captura envolve a precipitação do antígeno e da proteína transportadora da mistura. De forma desejável, a precipitação envolve uma alteração 25 no pH da mistura, adicionando ácido tricloroacético (TCA) ou sulfato de amônio à mistura, alterando a força iônica da mistura através do aumento ou da diminuição da concentração de sais inorgânicos da mistura, do aquecimento da mistura para fazer com que a proteína transportadora e/ou o antígeno se coagule ou da irradiação da mistura com fluxo suficiente de radia30 ção ionizante para causar a ligação cruzada.

Em modalidades desejáveis do segundo aspecto da invenção, a proporção molar do antígeno em relação à proteína transportadora fica entre até 10 e 9 até 10 na composição para vacina.

Em modalidades desejáveis adicionais do segundo aspecto da invenção, a proteína transportadora é um multímero. De forma desejável, o multímero contém pelo menos 5 subunidades. Em outras modalidades dese5 jáveis, o multímero é um homomultímero.

Em modalidades adicionalmente desejáveis do segundo aspecto da invenção, as proteínas transportadoras não estão covalentemente ligadas. De forma desejável, a ligação não-covalente envolve uma interação hidrofóbica, uma interação iônica, uma interação de van der Waals ou uma 10 ponte de hidrogênio.

Em modalidades desejáveis adicionais do segundo aspecto da invenção, a proteína transportadora é toxina da difteria ou um mutante da mesma, toxoide da difteria, toxina tetânica ou um mutante da mesma, toxoide tetânico, exotoxina A de Pseudomonas aeruginosa ou um mutante da 15 mesma, subunidade B da toxina da cólera, fragmento C da toxina tetânica, flagelina bacteriana (por exemplo, proteína flagelina de Vibrío cholerae), pneumolisina, listeriolisina O, uma proteína de membrana externa de Neisseria menningitidis, proteína Hcp1 de Pseudomonas aeruginosa, enterotoxina termolábil de Escherichia coli, toxina similar a shiga (proteína SltB2 de Shi20 gella), proteína LTB humana, um extrato de proteínas de células bacterianas inteiras (por exemplo, células de Pseudomonas aeruginosa ou de Streptococcus), o mutante negativo dominante (DNI) do antígeno protetor de Bacillus anthracis ou beta-galactosidase de Escherichia coli. Em modalidades particularmente desejáveis, a proteína transportadora é pneumolisina, listeri25 olisina O, toxina da difteria, toxoide da difteria, toxina tetânica ou toxoide tetânico.

Em outras modalidades desejáveis do segundo aspecto da invenção, o antígeno de interesse é um polissacarídeo, um poliálcool ou um poliaminoácido. De forma desejável, o polissacarídeo contém pelo menos 18 30 resíduos. Em outras modalidades desejáveis, o polissacarídeo é um polissacarídeo de Streptococcus pneumoniae, um polissacarídeo de Francisella tularensis, um polissacarídeo de Bacillus anthracis, um polissacarídeo de

Haemophilus influenzae, um polissacarídeo de Salmonella typhi, polissacarídeos de espécies de Shigella, polissacarídeos de espécies de Salmonella ou um polissacarídeo de Neisseria meningitidis. Em modalidades particularmenλ te desejáveis, o polissacarídeo de Streptococcus pneumoniae é qualquer um do tipo capsular 1-48, por exemplo, 3, 4, 6B, 7A, 7B, 7C, 7F, 9A, 9L, 9N, 9V,

12A, 12B, 12F, 14, 15A, 15B, 15C, 15F, 17, 18B, 18C, 19F, 23F, 25A, 25F, 33F, 35, 37, 38, 44 ou 46. Em outras modalidades particularmente desejáveis, o polissacarídeo de Francisella tularensis é o antígeno O.

Em modalidades desejáveis adicionais do segundo aspecto da 10 invenção, o antígeno de interesse é um polímero capsular microbiano. De forma desejável, o polímero capsular microbiano é o ácido poli-gama-Dglutâmico de Bacillus anthracis.

Ainda em outras modalidades desejáveis do primeiro aspecto da invenção, o antígeno de interesse é um polímero orgânico que consiste em 15 monômeros que possuem pelo menos três átomos, em que cada um dos átomos é independentemente selecionado de carbono, oxigênio, hidrogênio, fosfato, nitrogênio e sulfato. De forma desejável, o polímero orgânico é derivado de um micro-organismo. Em outras modalidades desejáveis, o polímero orgânico não ocorre na natureza.

Em modalidades adicionalmente desejáveis do segundo aspecto da invenção, a mistura na etapa (i) envolve um segundo antígeno de interesse ou ainda um terceiro antígeno de interesse.

No terceiro aspecto, a invenção descreve um outro método de produção de uma composição para vacina. Este método envolve (i) a mistu25 ra de um antígeno de interesse com uma proteína transportadora e (ii) a adição de um ligante que faz ligação cruzada com a proteína transportadora, em que não mais de 50% do antígeno de interesse sofre ligação cruzada com a proteína transportadora na composição para vacina.

Em modalidades desejáveis do terceiro aspecto da invenção, a 30 composição para vacina inclui ainda um excipiente farmaceuticamente aceitável. Em outras modalidades desejáveis do terceiro aspecto da invenção, a proporção molar do antígeno em relação à proteína transportadora fica entre até 10 e 10 até 1 na composição para vacina. Em modalidades desejáveis adicionais do terceiro aspecto da invenção, a proteína transportadora é um multímero. De forma desejável, o multímero contém pelo menos 5 subunidades. Em outras modalidades desejáveis, o multímero é um homomultímero.

Em modalidades adicionalmente desejáveis do terceiro aspecto da invenção, o método envolve a redução de uma base de Schiff na proteína transportadora. Ainda em modalidades adicionalmente desejáveis do terceiro aspecto da invenção, a proteína transportadora está covalentemente ligada a pelo menos uma outra proteína transportadora. De forma desejável, a ligação covalente envolve uma ligação peptídica entre um grupo amino primário de uma cadeia lateral de lisina e um grupo carbóxi de uma cadeia lateral de aspartato ou de glutamato. Em outras modalidades desejáveis, a ligação covalente envolve um agente de reticulação bifuncional. De forma desejável, o agente de reticulação bifuncional é glutaraldeído, bis[sulfosuccinimidil]suberato ou adipimidato de dimetila.

Em modalidades desejáveis adicionais do terceiro aspecto da CHO invenção, o ligante é um composto da fórmula ^Rn^—CHO, em que R_n é um alquila linear ou ramificado de 1 até 12 átomos de carbono, um heteroalquila linear ou ramificado de 1 até 12 átomos, um alceno linear ou ramificado de 2 até 12 átomos de carbono, um alcino linear ou ramificado de 2 até 12 átomos de carbono, um resíduo aromático de 5 até 10 átomos de carbono, um sistema cíclico de 3 até 10 átomos, -(CH2CH₂O)_qCH2CH2- em que q é 1 até 4 ou uma ligação química que liga dois grupos aldeído.

Em outras modalidades desejáveis do terceiro aspecto da invenção, o ligante é glutaraldeído, éster de m-maleimidobenzoil-N-hidroxissuccinimida, carbodi-imida ou benzidina bis-biazotizada.

Em modalidades desejáveis adicionais do terceiro aspecto da invenção, a proteína transportadora é toxina da difteria ou um mutante da mesma, toxoide da difteria, toxina tetânica ou um mutante da mesma, toxoide tetânico, exotoxina A de Pseudomonas aeruginosa ou um mutante da mesma, subunidade B da toxina da cólera, fragmento C da toxina tetânica, flagelina bacteriana (proteína flagelina de Vibrio cholerae), pneumolisina, listeriolisina O, uma proteína de membrana externa de Neisseria menningitidis, proteína Hcp1 de Pseudomonas aeruginosa, enterotoxina termolábil de Escheríchia coli, toxina similar a shiga (proteína SltB2 de Shigella), proteína LTB humana, um extrato de proteínas de células bacterianas inteiras (célu5 Ias de Pseudomonas aeruginosa ou de Streptococcus), o mutante negativo dominante (DNI) do antígeno protetor de Bacillus anthracis ou betagalactosidase de Escheríchia coli.

Em modalidades adicionalmente desejáveis do terceiro aspecto da invenção, o antígeno de interesse é um polissacarídeo, um poliálcool ou 10 um poliaminoácido. De forma desejável, o polissacarídeo contém pelo menos 18 resíduos. Em outras modalidades desejáveis, o polissacarídeo é um polissacarídeo de Streptococcus pneumoniae, um polissacarídeo de Francisella tularensis, um polissacarídeo de Bacillus anthracis, um polissacarídeo » de Haemophilus influenzae, um polissacarídeo de Salmonella typhi, polissa15 carídeos de espécies de Shigella, polissacarídeos de espécies de Salmonella ou um polissacarídeo de Neisseria meningitidis. Em modalidades particularmente desejáveis, o polissacarídeo de Streptococcus pneumoniae é qualquer um do tipo capsular 1-48, por exemplo, 3, 4, 6B, 7A, 7B, 7C, 7F, 9A, 9L, 9N, 9V, 12A, 12B, 12F, 14, 15A, 15B, 15C, 15F, 17, 18B, 18C, 19F, 23F, 20 25A, 25F, 33F, 35, 37, 38, 44 ou 46. Em outras modalidades particularmente desejáveis, o polissacarídeo de Francisella tularensis é o antígeno O.

Em outras modalidades desejáveis do terceiro aspecto da invenção, o antígeno de interesse é um polímero capsular microbiano. De forma desejável, o polímero capsular microbiano é ácido poli-gama-D-glutâmico de 25 Bacillus anthracis.

Ainda em outras modalidades desejáveis do terceiro aspecto da invenção, o antígeno de interesse é um polímero orgânico que consiste em monômeros que possuem pelo menos três átomos, em que cada um dos átomos é independentemente selecionado de carbono, oxigênio, hidrogênio, 30 fosfato, nitrogênio e sulfato. De forma desejável, o polímero orgânico é derivado de um micro-organismo. Em modalidades desejáveis adicionais, o polímero orgânico não ocorre na natureza.

Em modalidades adicionalmente desejáveis do terceiro aspecto da invenção, a mistura na etapa (i) envolve um segundo antígeno de interesse ou ainda um terceiro antígeno de interesse.

No quarto aspecto, a invenção descreve um método de vacinação de um indivíduo contra um agente infeccioso. Este método envolve a administração de uma composição para vacina do primeiro aspecto da invenção a um indivíduo em uma quantidade suficiente para induzir a produção de anticorpos no indivíduo. Em modalidades desejáveis do quarto aspecto da invenção, o método envolve uma segunda etapa de administração em que a composição para vacina do primeiro aspecto da invenção é administrada ao indivíduo em uma quantidade suficiente para aumentar a produção de anticorpos no indivíduo. De forma desejável, no quarto aspecto da invenção, a produção de anticorpos é dependente de células T. Em outras modalidades desejáveis do quarto aspecto da invenção, a produção de anticorpos é suficiente para prevenir ou para reduzir a infecção do indivíduo por um agente infeccioso. De forma desejável, o agente infeccioso é pneumococos, meningococos, Haemophilus influenzae do tipo B, Pseudomonas aeruginosa, Francisella tularensis, espécies de Shigella, espécies de Salmonella, espécies de Acinetobacter, espécies de Burkholdería ou Escheríchia coli.

Em outras modalidades desejáveis do quarto aspecto da invenção, o método envolve uma segunda etapa de administração em que uma segunda composição para vacina que contém um antígeno de interesse é fornecida ao indivíduo em uma quantidade suficiente para aumentar a produção de anticorpos no indivíduo. De forma desejável, a produção de anticorpos é suficiente para previnir ou reduzir a infecção do indivíduo por um segundo agente infeccioso.

Em modalidades desejáveis do quarto aspecto da invenção, os anticorpos são anticorpos IgG. Em uma modalidade desejável adicional do quarto aspecto da invenção, o indivíduo é um ser humano.

Em modalidades desejáveis de qualquer um dos aspectos da invenção, o polissacarídeo de Streptococcus pneumoniae é um dos tipos capsulares descritos em Kong e outros (J. Med. Microbiol. 54:35-356, 2005).

Por exemplo, o tipo capsular do polissacarídeo de Streptococcus pneumoniae, de forma desejável, é 1 (por exemplo, 1-g ou 1-q), 2 (por exemplo, 2-g, 2-q ou 2-41 A), 3 (por exemplo, 3-g, 3-q, 3-c ou 3-nz), 4, 5 (por exemplo, 5-q, 5-c, 5-qap ou 5-g), 6A (por exemplo, 6A-g, 6A-c1, 6A-c2, 6A-n, 6A-qap, 6A6B-g, 6A-6B-q ou 6A-6B-S), 6B (por exemplo, 6B-c, 6A-6B-g, 6A-6B-q ou 6A6B-s), 7F (por exemplo, 7F-7A), 7A (por exemplo, 7A-cn ou 7F-7A), 7B (por exemplo, 7B-40), 7C (por exemplo, 7C-19C-24B), 8 (por exemplo, 8-g ou δε), 9A (por exemplo, 9A-9V), 9L, 9N, 9V (por exemplo, 9A-9V), 9V e 14, 10F (por exemplo, 10F-q, 10F-ca ou 10F-10C), 10A (por exemplo, 10A-17A ou 10A-23F), 10B (por exemplo, 10B-10C), 11F, 11A (por exemplo, 11A-nz ou 11A-11D-18F), 11B (por exemplo, 11B-11C), 11C (por exemplo, 11B-11C ou 11 C-cn), 11D (por exemplo, 11A-11D-18F), 12F (por exemplo, 12F-q ou 12F12A-12B), 12A (por exemplo, 12A-cn, 12A-46 ou 12F-12A-12B), 12B (por exemplo, 12F-12A-12B), 13 (por exemplo, 13-20), 14 (por exemplo, 14-g, 14q, 14-vou 14-c), 15F (por exemplo, 15F-cn1 ou 15F-cn2), 15A (por exemplo, 15A-ca1, 15A-ca2 ou 15A-chw), 15B (por exemplo, 15B-C, 15B-15C, 15B15C-22F-22A), 15C (por exemplo, 15C-ca, 15C-q1, 15C-q2, 15C-q3, 15C-s, 15B-15C ou 15B-15C-22F-22A), 16F (por exemplo, 16F-q ou 16F-nz), 16A, 17F (por exemplo, 17F-n e 17F-35B-35C-42), 17A (por exemplo, 17A-ca ou 10A-17A), 18F (por exemplo, 18F-ca, 18F-W ou 11A-11D-18F), 18A (por exemplo, 18A-nz ou 18A-q), 18B (por exemplo, 18B-18C), 18C (por exemplo, 18B-18C), 19F (por exemplo, 19F-g1, 19F-g2, 19F-g3, 19F-q, 19F-n ou 19Fc), 19A (por exemplo, 19A-g, 19A- ou 19A-ca), 19B, 19C (por exemplo, 19Ccn1, 19C-cn2 ou 7C-19C-24B), 20 (por exemplo, 13-20), 21 (por exemplo, 21-ca ou 21-cn), 22F (por exemplo, 15B-15C-22F-22A), 23F (por exemplo, 23F-c, 10A-23F ou 23F-23A), 23B (por exemplo, 23B-C ou 23B-q), 24F (por exemplo, 24F-cn1, 24F-cn2 ou 24F-cn3), 24A, 24B (por exemplo, 7C-19C24B), 25F (por exemplo, 25F-38), 25A, 27, 28F (por exemplo, 28F-28A ou 28F-cn), 28A (por exemplo, 28F-28A), 29 (por exemplo, 29-ca ou 29-q), 31, 32F (por exemplo, 32F-32A), 32A (por exemplo, 32A-cn ou 32F-32A), 33F (por exemplo, 33F-g, 33F-q, 33F-chw, 33F-33B ou 33F-33A-35A), 33A (por exemplo, 33F-33A-35A), 33B (por exemplo, 33B-q, 33B-S ou 33F-33B), 33D, (por exemplo, 34-ca ou 34s), 35F (por exemplo, 35F-47F), 35A (por exemplo, 33F-33A-35A), 35B (por exemplo, 17F-35B-35C-42), 36, 37 (por exemplo, 37-g ou 37-ca), 38 (por exemplo, 25F-38), 39 (por exemplo, 39-cn1 ou 39-cn2), 40 (por exemplo, 7B-40), 41F (por exemplo, 41F-cn ou 41F-s),

41A (por exemplo, 2-41 A), 42 (por exemplo, 17B-35B-35C-42), 43, 44, 45, (por exemplo, 46-s ou 12A-46), 47F (por exemplo, 35F-47F), 47A, 48 (por exemplo, 48-cn1 ou 48-cn2) ou o Número de Acesso do GenBank AF532714 ou AF532715.

Definições

Por administração como utilizado aqui em associação com uma vacina, entende-se o fornecimento a um indivíduo de uma vacina em uma dose suficiente para induzir uma resposta imunológica no indivíduo, em que a resposta imunológica resulta na produção de anticorpos que se ligam i especificamente a um antígeno contido na vacina. A administração inclui, de forma desejável, injeção intramuscular, injeção intradérmica ou injeção transcutânea e, de forma desejável, envolve a administração de adjuvantes imunológicos apropriados. A administração pode envolver uma única administração de uma vacina ou a administração de uma vacina em várias doses. De forma desejável, uma segunda administração é planejada para aumentar a produção de anticorpos em um indivíduo para prevenir a infecção por um agente infeccioso. A frequência e a quantidade de dosagem da vacina dependem da atividade específica da vacina e podem ser facilmente determinadas através de experimentos de rotina.

Por reticulação entende-se a formação de uma ligação cova25 lente entre duas moléculas, macromoléculas ou combinação de moléculas, por exemplo, proteínas transportadoras, diretamente, quando um ligante de comprimento zero é utilizado ou através do uso de uma terceira molécula, o ligante químico, que possui dois grupos funcionais cada um capaz de formar uma ligação covalente com uma de duas moléculas separadas ou entre dois grupos separados na mesma molécula (isto é, estes formariam alças que poderíam também ficar envoltos ao redor do polímero). Os exemplos de ligantes incluem ligantes bifuncionais que são capazes de fazer ligação cru zada com duas proteínas transportadoras. A reticulação também pode ocorrer entre um antígeno e uma proteína transportadora.

Por antígeno como utilizado aqui se entende qualquer molécula ou combinação de moléculas que fica especificamente ligada por um anticorpo ou um fragmento de anticorpo.

Por ligante bifuncional como utilizado aqui se entende um composto que possui dois grupos funcionais cada um capaz separadamente de formar uma ligação covalente com duas moléculas, átomos separados ou coleções de moléculas. Os exemplos de ligantes bifuncionais são descritos, por exemplo, por G. T. Hermanson (Bioconjugate Techniques, Academic Press, 1996) e Dick e Beurret (Conjugate Vaccines. Contribu. Microbiol. Immunol., Karger, Basal 10:48-114, 1989). De forma desejável, um ligante bifuncional é glutaraldeído, bis[sulfosuccinimidil]suberato ou adipimidato de dimetila.

Por um ligante como utilizado aqui se entende um composto ou uma ligação química que une covalentemente duas ou mais moléculas. De forma desejável, um ligante é glutaraldeído ou um composto da fórmula CHO

R_n—CHO em q_Ue R_n é um alquila linear ou ramificado de 1 até 12 átomos de carbono, um heteroalquila linear ou ramificado de 1 até 12 átomos, um alceno linear ou ramificado de 2 até 12 átomos de carbono, um alcino linear ou ramificado de 2 até 12 átomos de carbono, um resíduo aromático de 5 até 10 átomos de carbono, um sistema cíclico de 3 até 10 átomos, (CH2CH2O)_qCH2CH₂- em que q é 1 até 4 ou uma ligação química que liga dois grupos aldeído. A ligação pode ser direta sem o uso de uma molécula ligante. Por exemplo, o grupo carboxila de uma proteína pode ser ligado diretamente ao seu grupo amino utilizando química de carbodi-imida ou enzimaticamente utilizando transglutamidases que catalisam a reticulação deste tipo.

Por aumento da produção de anticorpos entende-se a ativação de células B de memória que ocorre durante uma segunda exposição a um antígeno, chamada de resposta de reforço e é indicativa de uma resposta imunológica de memória secundária de vida longa, resultando na produção de anticorpos de vida longa.

Por proteína transportadora entende-se uma proteína utilizada em uma vacina que invoca uma resposta imunológica para si mesma e/ou a um antígeno complexado com uma proteína transportadora. De forma desejável, o antígeno está associado de forma não-covalente com a proteína transportadora por estar capturado em um complexo com a proteína transportadora. Todavia, o antígeno e a proteína transportadora podem também estar ligados covalentemente um a cada outro. De forma desejável, a proteína transportadora contém um epítopo reconhecido por uma célula T. São também abrangidos pela definição de uma proteína transportadora os peptídeos multiantigênicos (MAPs), que são peptídeos ramificados. De forma desejável, um MAP inclui lisina. Os exemplos de proteínas transportadoras desejáveis incluem toxinas e toxoides (químicos ou genéticos), que podem ser mutantes. De forma desejável, uma proteína transportadora é toxina da difteria ou um mutante da mesma, toxoide da difteria, toxina tetânica ou um mutante da mesma, toxoide tetânico, exotoxina A de Pseudomonas aeruginosa ou um mutante da mesma, subunidade B da toxina da cólera, fragmento C da toxina tetânica, flagelina bacteriana, pneumolisina, listeriolisina O (e moléculas relacionadas), uma proteína de membrana externa de Neissería menningitidis, proteína Hcp1 de Pseudomonas aeruginosa, enterotoxina termolábil de Escherichia coli, toxina similar a shiga, proteína LTB humana, um extrato de proteínas de células bacterianas inteiras, o mutante negativo dominante (DNI) do antígeno protetor de Bacillus anthracis ou betagalactosidase de Escherichia coli ou qualquer outra proteína que possa sofrer ligação cruzada por um ligante.

Por DNI entende-se a proteína do mutante negativo dominante (DNI), que é uma forma mutada do antígeno protetor (PA) de B. anthracis, que é descrita por Benson e outros (Biochemistry 37:3941-3948,1998).

Por capturado como utilizado aqui em referência a um antígeno entende-se um antígeno que permanece em um complexo com proteínas transportadoras sob condições fisiológicas. De forma desejável, o antígeno fica capturado em um complexo com proteínas transportadoras na ausência de ligação covalente significativa entre o antígeno e uma proteína transportadora. A ausência de ligação covalente significativa, como utilizado aqui, refere-se a não mais de 50% do antígeno estando ligado de forma covalente a uma proteína transportadora. De forma desejável, não mais de 40%, 30%, 10% ou 5% do antígeno está covalentemente ligado a uma proteína transportadora.

Por infecção entende-se a invasão de um indivíduo por um micro-organismo, por exemplo, uma bactéria, um fungo, um parasita ou um vírus. A infecção pode incluir, por exemplo, a multiplicação excessiva de micro-organismos que estão normalmente presentes dentro ou na superfície do corpo de um indivíduo ou a multiplicação de micro-organismos que não estão normalmente presentes dentro ou na superfície de um indivíduo. Um indivíduo está sofrendo de uma infecção microbiana quando uma quantidade excessiva de uma população microbiana está presente dentro ou na superfície do corpo do indivíduo ou quando a presença de uma ou mais populações de micro-organismos está danificando as células ou causando sintomas patológicos a um tecido do indivíduo.

Por agente infeccioso entende-se um micro-organismo que causa uma infecção.

Por imunogênico entende-se um composto que induz uma resposta imunológica em um indivíduo. De forma desejável, a resposta imunológica é uma resposta imunológica dependente de células T que envolve a produção de anticorpos IgG.

Por micro-organismo entende-se uma bactéria, um fungo, um parasita ou um vírus que é capaz de causar uma infecção em um indivíduo.

Por polímero capsular microbiano entende-se um polímero presente dentro ou sobre o revestimento da cápsula de um micro-organismo. De forma desejável, um polímero capsular microbiano é um polímero orgânico tal como um polissacarídeo, um fosfopolissacarídeo, um polissacarídeo com um açúcar amino com uma substituição N-acetila, um polissacarídeo que contém um açúcar sulfanilado, um outro açúcar modificado com sulfato ou açúcar modificado com fosfato, um poliálcool, um poliaminoácido, ácido teicóico e uma cadeia lateral O de um lipopolissacarídeo.

Por monômero entende-se uma estrutura molecular capaz de formar duas ou mais ligações com monômeros similares, frequentemente produzindo uma cadeia ou uma série de cadeias conectadas ramificadas de subestruturas monoméricas repetidas, quando fazem parte de um polímero.

Por polímero orgânico entende-se um polímero composto de monômeros ligados covalentemente cada um possuindo três ou mais dos átomos a seguir: carbono, oxigênio, hidrogênio, fosfato, nitrogênio e sulfato. De forma desejável, um polímero orgânico é um polissacarídeo, um fosfopolissacarídeo, um polissacarídeo com um açúcar amino com uma substituição N-acetila, um polissacarídeo que contém um açúcar sulfanilado, um outro açúcar modificado com sulfato ou açúcar modificado com fosfato, um açúcar, um poliálcool, um poliaminoácido, ácido teicóico e uma cadeia lateral O de lipopolissacarídeo.

Por poliálcool entende-se uma forma hidrogenada de um carboidrato em que um grupo carbonila foi reduzido em um grupo hidroxila primário ou secundário. Os exemplos de polialcoois são um óxido de polialquileno (PAO), tal como polialquileno glicóis (PAG), incluindo polimetileno glicois, polietileno glicóis (PEG), metoxipolietileno glicóis (mPEG) e polipropileno glicóis; álcool polivinílico (PVA); anidrido do ácido polietileno-co-maleico; anidrido do ácido polistireno-co-málico; dextrans incluindo carboximetildextrans; celuloses, incluindo metilcelulose, carboximetilcelulose, etilcelulose, hidroxietilcelulose carboxietilcelulose e hidroxipropilcelulose; hidrolisados de quitosana; amidos tais como hidroxietil-amidos e hidróxi propil-amidos; glicogênio; agaroses e derivados das mesmas; goma guar; pululana; inulina; goma xantana; carragenana; pectina; hidrolisados do ácido algínico; sorbitol; um álcool de glicose, manose, galactose, arabinose, gulose, xilose, treose, sorbose, frutose, glicerol, maltose celobiose, sacarose, amilose, amilopectina; ou mono propileno glicol (MPG).

Por poliaminoácido entènde-se pelo menos dois aminoácidos ligados através de uma ligação peptídica. De forma desejável, um poliami noácido é um peptídeo que contém uma sequência de aminoácidos repetitiva ou uma cadeia do mesmo aminoácido (isto é, um homopolímero).

Por redução de uma base de Schiff entende-se a exposição de uma azometina ou de um composto da fórmula R-|R2C=N-R3 (em que Ri, R2 e R3 são subestruturas químicas, tipicamente contendo átomos de carbono) a um agente redutor que satura a ligação dupla da base de Schiff com átomos de hidrogênio. Os métodos de redução são conhecidos pelos versados na técnica.

Por se liga especificamente como utilizado aqui em referência a um anticorpo ou a um fragmento do mesmo, entende-se uma maior afinidade de um anticorpo ou de um fragmento de anticorpo em relação a uma proteína particular, por exemplo, um antígeno, relativa a uma quantidade equivalente de qualquer outra proteína. Um anticorpo ou um fragmento de anticorpo, de forma desejável, possui uma afinidade em relação a seu antígeno que é pelo menos 2 vezes, 5 vezes, 10 vezes, 30 vezes ou 100 vezes maior que em relação a uma quantidade equivalente de qualquer outro antígeno, incluindo antígenos relacionados, 0 que é determinado utilizando métodos padronizados tal como um ensaio imunoabsorvente ligado à enzima (ELISA).

Por indivíduo entende-se um animal que pode ser infectado por um micro-organismo. De forma desejável, um indivíduo é um mamífero tal como um ser humano, um macaco, um cachorro, um gato, um camundongo, um rato, uma vaca, uma ovelha, uma cabra ou um cavalo. Em uma modalidade desejável, 0 indivíduo é um ser humano, tal como uma criança humana. De forma desejável, o indivíduo é um bebê, uma criança de 1 até 3 anos ou uma criança pré-adolescente humana.

Por antígeno independente de células T entende-se um antígeno que resulta na geração de anticorpos sem a cooperação de linfócitos T. O antígeno independente de células T, de forma desejável, estimula diretamente os linfócitos B sem a cooperação dos linfócitos T. Os exemplos de antígenos independentes de células T desejáveis incluem ácido poli-gamaD-glutâmico (PGA), ácido algínico (algenato), dextran, polissacarídeos (PS), poliaminoácidos, polialcoois e ácidos nucléicos do antígeno capsular.

Vantagens

Comparadas com as tecnologias de vacinas existentes, as vacinas da presente invenção são simples de produzir, menos propensas a problemas químicos, menos propensas a problemas imunológicos, menos onerosas, mais capazes de se adaptar a antígenos de interesse e proteínas transportadoras diferentes que a tecnologia conjugada e mais flexíveis para a criação de vacinas multivalentes (vacinas protetoras contra vários antígenos).

As vacinas da presente invenção não requerem ligação covalente entre uma proteína transportadora e o antígeno pretendido que ative uma resposta imunológica, simplificando assim o método de produção das mesmas e reduzindo o custo de sua preparação comparada com a tecnologia de vacinas conjugadas. As vacinas conjugadas com polissacarídeo (PS)proteína tinham produção e venda proibitivamente caras no mundo em desenvolvimento; as vacinas conjugadas convencionais são difíceis de produzir de forma econômica por causa da química altamente especializada necessária para cada vacina e dos custos da produção e da purificação tanto do PS quanto da proteína transportadora.

As vacinas da presente invenção também se direcionam a uma necessidade de vacinas que podem induzir de forma segura imunidade contra antígenos intratáveis anteriormente. Tais vacinas podem ser monovalentes (possuindo antígenos isolados para a indução de uma resposta imunológica) ou multivalentes (possuindo vários antígenos para a indução de várias respostas imunológicas). Foi mostrado que as vacinas que contêm ligantes de TLR (receptor similar a Toll) ativam respostas imunológicas para antígenos de outra maneira intratáveis, mas tendem a não ser seguras porque os ligantes de TLR são frequentemente pró-inflamatórios, tóxicos mesmo em doses pequenas, reatogênicos e provavelmente devido a sintomas adversos comparados com as vacinas da invenção.

Outras características e vantagens da invenção serão evidentes partindo da Descrição Detalhada, das figuras e das reivindicações a seguir.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

A Figura 1 é um diagrama esquemático de uma via proposta não-limitante para a indução de uma resposta imunológica de IgG anti-PS por uma vacina conjugada para um conjugado feito entre um PS e a proteína transportadora toxoide tetânico. Neste modelo, apenas células B que exibem receptores de anticorpos que reconhecem o PS se ligam ao conjugado PSproteína. Assim, a proteína transportadora fica ligada à superfície da célula B que exibe a especificidade de ligação correta ao PS.

A Figura 2 é uma imagem da análise de Western blot de PCMV e preparações de controle monitoradas em relação à reticulação por eletroforese em gel de SDS poliacrilamida e Western blotting com antissoro anti-PA. A proteína DNI migra em 84 kDa antes da reticulação com glutaraldeído. PCVM1-PCMV3 (faixas 1-3) exibem reticulação extensiva da proteína DNI como é evidenciado pela migração de bandas em massas moleculares maiores que 220 kDa. A proteína DNI isoladamente reticulada na ausência de PGA também exibe a mesma espécie de peso molecular alto (faixa 5). Em contraste, a DNI misturada com PGA, mas não tratada com glutaraldeído exibe bandas que co-migram com DNI ou espécies de peso molecular inferior (faixa 4).

A Figura 3 é um gráfico que mostra os resultados dos ensaios de ELISA utilizados para medir as respostas imunológicas anti-DNI específicas a IgM e IgG em camundongos imunizados com três preparações de PCMV (PCMV1-PCMV3; preparações 1-3) e as duas preparações de controle de antígeno 4 e 5. A proteína DNI era altamente imunogênica em todas as preparações exceto na preparação de controle 4 que não estava reticulada com glutaraldeído (glut). Entretanto, estas respostas imunológicas específicas à DNI eram exclusivamente baseadas em IgG. Embora não fosse detectado qualquer IgM anti-DNI mesmo no 7² dia de imunização, uma resposta de IgG anti-DNI significativa podería ser detectada em camundongos imunizados com preparações de PCMV no 17^a dia e nos imunizados com apenas DNI reticulada (preparação 5). Uma resposta de reforço forte foi observada contra DNI no 30^a dia com todas as preparações incluindo a preparação 4.

A Figura 4 é um gráfico que mostra os resultados dos ensaios de ELISA utilizados para medir as respostas imunológicas anti-PGA específicas a IgM em camundongos imunizados com as três preparações de PCMV (PCMV1 - PCMV3; preparações 1-3) e as duas preparações de controle de 5 antígeno 4 e 5. As respostas de IgM anti-PGA exibiam um padrão que era típico de um polímero capsular. A preparação de controle 4 gerou uma resposta de IgM anti-PGA detectável no 7^a dia, mas esta resposta não foi aumentada no 17^a dia ou no 30^a dia. Todas as preparações de PCMV induziram uma resposta de IgM anti-PGA no 7^a dia e então geraram exclusivamen10 te respostas de IgM anti-PGA ainda mais fortes nos 17^a e 30^a dias. Como esperado, a preparação de controle 5 (somente DNI reticulada) não gerou uma resposta anti-PGA baseada em IgM ou em IgG.

A Figura 5 é um gráfico que mostra os resultados de um ensaio de ELISA utilizado para medir a resposta imunológica anti-PGA específica a 15 IgG em camundongos imunizados com as três preparações de PCMV (PCMV1 - PCMV3; preparações 1-3) e as duas preparações de controle de antígeno 4 e 5. As PCMV1-3 geraram fortes respostas anti-PGA baseada em IgG que eram evidentes no 17^a dia e então claramente aumentada no 30^a dia.

A Figura 6 é um gráfico que mostra o título de anticorpo IgM no soro agrupado pré-imunização e 30 dias após a imunização com PCMVs contendo DNI e alginato (DNI-ALG C, DNI ALG A) e uma preparação de PCMV trivalente em um único recipiente contendo DNI complexada com algenato (ALG), dextran (DEX) e PGA.

A Figura 7 é um gráfico que mostra o título de anticorpo IgG do soro específico ao antígeno 60 dias após a imunização com PCMVs contendo DNI e alginato (DNI-ALG C, DNI ALG A) e uma preparação de PCMV trivalente em um único recipiente contendo DNI complexada com algenato (ALG), dextran (DEX) e PGA.

A Figura 8 é um gráfico que mostra o título de anticorpo IgG antiPS 128 dias após a imunização com PCMVs contendo DNI e alginato (DNIALG C, DNI ALG A) e uma preparação de PCMV trivalente em um único recipiente contendo DNI complexada com algenato (ALG), dextran (DEX) e PGA.

As Figuras 9A e 9B são gráficos de ensaios de IL-6 utilizando polissacarídeos de S. pneumoniae (pss) obtidos na American Type Culture Collection e produzidos pela Merck ou no Serum Institute of India (Sll).

A Figura 10 é um gráfico que mostra que o contaminante em pss 6B obtido no Sll pode ser removido utilizando o tratamento 2 (trt 2; uma hora de incubação a 80°C em NaOH a 1 Μ). O tratamento 1 (trt 1) é uma série de cinco extrações com fenol para a remoção da proteína do polissacarídeo.

A Figura 11 é um gráfico que mostra que PCMVs contendo pss 6B são mais eficientes na indução da produção de IgG que Prevnar®. BSA = Albumina de Soro Bovino; DT = Toxina da difteria; DTx = Toxoide da difteria; e TTx = Toxoide tetânico.

A Figura 12 é um gráfico que mostra que PCMVs contendo pss 6B são tão eficientes quanto Prevnar® na indução da produção de IgM.

A Figura 13 é um gráfico que mostra que PCMVs contendo pss 6B são mais eficientes na indução da produção de IgG que Prevnar®.

As Figuras 14-16 são gráficos que mostram que PCMVs contendo pss 14 são aproximadamente equivalentes a Prevnar® na indução da produção de IgG (DTx = Toxoide da difteria; TTx = Toxoide tetânico). DESCRIÇÃO DETALHADA

A invenção descreve composições para vacina e métodos de produção e administração de tais composições para fornecer imunidade contra antígenos independentes de células T ou antígenos que normalmente ativam respostas imunológicas fracas, tais como, por exemplo, polissacarídeos (PS), polialcoois, poliaminoácidos e outros polímeros orgânicos. As vacinas da invenção possuem as propriedades imunológicas potentes de vacinas conjugadas de PS-proteína típicas, mas, de forma desejável, diferem das vacinas conjugadas no fato de que nenhuma ligação atômica covalente significativa é necessária para acoplar o antígeno de interesse, por exemplo, PS ou polímero orgânico capsular, à proteína transportadora. Ao invés disso, o antígeno de interesse, por exemplo, PS ou polímeros orgâni cos capsulares, é capturado pela proteína transportadora. Por exemplo, uma matriz protéica pode ser formada através da reticulação covalente das moléculas de proteína transportadora com elas mesmas na presença do antígeno solúvel, por exemplo, PS ou polímeros orgânicos capsulares: estas vacinas 5 são referidas como vacinas de matriz protéica. As proteínas transportadoras que são altamente reticuladas com cada outra podem formar uma matriz que pode capturar um antígeno e facilitar a captação de tal antígeno e o estímulo da produção de anticorpos nas células imunológicas. A matriz de proteínas transportadoras pode estar na forma de uma rede que envolve o antígeno 10 ou de uma série de contas em um colar” em que o antígeno é o colar, a proteína ou os complexos de proteínas reticuladas é o colar nesta analogia. O antígeno é capturado pela proteína transportadora se a proteína transportadora circundar o antígeno para formar um anel em torno do antígeno ou uma rede tridimensional dentro da qual o antígeno fica entrelaçado. Ainda, o 15 carreador e o antígeno podem sofrer ligação cruzada, por exemplo, através de ligações cruzadas intracadeia na cadeia do antígeno com a proteína transportadora. Em modalidades desejáveis, o antígeno e a proteína transportadora não estão ligados de forma covalente. Tal ligação não-covalente pode envolver uma interação hidrofóbica, uma interação iônica, uma intera20 ção de van der Waals ou uma ponte de hidrogênio. A ligação não-covalente pode incluir configurações geométricas físicas que associação de forma nãocovalente o antígeno com complexos de proteínas (vide: a analogia anterior de contas em um colar).

A proteína transportadora não precisa estar reticulada a si mes25 ma para capturar um antígeno. Um antígeno também pode ser capturado, por exemplo, através da mistura da proteína transportadora e o antígeno em uma solução aquosa e da precipitação da proteína transportadora, coprecipitando assim o antígeno com a proteína. Um antígeno pode ainda ser capturado por uma proteína transportadora através da precipitação de um 30 composto (por exemplo, alúmen, hexametafosfato de sódio, polifosfazeno ou outros polímeros com afinidade por proteínas controladas por interações hidrofóbicas ou iônicas) de uma mistura de antígeno e proteína transportado ra. Os métodos de precipitação de proteínas são padronizados na técnica e incluem, por exemplo, (1) a alteração do pH da mistura, (2) a alteração da força iônica da solução através do aumento ou da diminuição da concentração de sais inorgânicos da mistura (3) ou a adição de ácido tricloroacético (TCA) ou sulfato de amônio à mistura, (4) o aquecimento da mistura para fazer com que a proteína coagule (isto é, forme um precipitado ou gel), (5) a modificação química da proteína na mistura de uma maneira que a torna insolúvel e (6) a irradiação da solução de proteína com um fluxo suficiente de radiação ionizante (ultravioleta, raios gama ou beta) de forma a causar a reticulação e/ou a precipitação da proteína, entre outros.

Quando uma proteína capsular de um agente patogênico for utilizada, tais vacinas são chamadas de vacinas de matriz de proteína capsular (PCMV). Como descrito nos Exemplos, as PCMVs foram produzidas incluindo aquelas baseadas no antígeno capsular independente de T modelo, ácido poli-gama-D-glutâmico (PGA), assim como ácido algínico (algenato) e dextran e o exemplo de proteína transportadora, DNI. A PCMV com PGA era simples de fazer em grande quantidade e foi observado que induzia respostas imunológicas típicas de vacinas conjugadas de PGA-proteína. As vacinas da invenção podem ser preparadas utilizando qualquer um de muitos ligantes possíveis para a reticulação de qualquer uma de muitas proteínas transportadoras possíveis na presença de qualquer antígeno de interesse. Os exemplos de ligantes, proteínas transportadoras e antígenos de interesse preferidos são discutidos aqui.

Os polissacarídeos (PS) são polímeros de sacarídeos (açúcares). O PS derivados de cápsulas são os componentes antigênicos primários envolvidos na imunidade protetora contra agentes patogênicos bacterianos encapsulados tais como Neissería meningitidis, Streptococcus pneumoniae, Salmonella typhi e Haemophilus influenzae do Tipo B. A imunização de adolescentes e de adultos com vacinas baseadas nos PS microbianos foi bemsucedida na redução do fardo da doença, mas também provou sem menos eficiente no fornecimento de imunidade protetora a bebês e crianças jovens (isto é, crianças com menos de 24 meses de idade). As crianças jovens ain da não desenvolveram um repertório imunológico adaptativo maduro e os antígenos independentes de células T tal como PS capsular são fracamente imunogênicos e não levam a respostas imunológicas protetoras de longo período de tempo (isto é, uma resposta de memória imunológica) em tais receptores jovens da vacina.

Um antígeno independente de células T tal como PS pode ser convertido em um antígeno dependente de células T através do acoplamento químico do PS à proteína; este processo é chamado de conjugação e envolve a formação de ligações covalentes entre os átomos na estrutura do PS e os átomos da cadeia lateral dos aminoácidos presentes na proteína transportadora. Tais vacinas conjugadas promovem mais eficientemente a indução da maturação das células B e a alteração de isotipos levando a níveis muito maiores de anticorpo com o perfil protetor anti-PS correto. Os anticorpos protetores possuem alta afinidade em relação a seus antígenos de PS e tipicamente são da subclasse Imunoglobulina G (IgG), um anticorpo de vida longa com fixação do complemento e atividade efetora opsônica.

Um exemplo de via não-limitante para a indução de uma resposta imunológica de IgG anti-PS através de um conjugado produzido entre um PS e a proteína transportadora toxoide tetânico é mostrado na Figura 1. Neste modelo, apenas as células B que exibem receptores de anticorpos que reconhecem o PS se ligam ao conjugado de PS-proteína. Assim, a proteína transportadora fica ligada à superfície da célula B que exibe a especificidade de ligação correta ao PS. O complexo de proteína-PS é captado por estas células B dentro do compartimento vacuolar intracelular onde o carreador é processado através da degradação proteolítica. Os peptídeos derivados da proteína transportadora são transportados e carregados dentro do sulco de apresentação do receptor de MHC de Classe II (MHC-II). Este complexo de peptídeo carreador de MHC-II é exibido na superfície da célula B. Após o reconhecimento do complexo de MHC-ll-peptídeo pelo receptor de células T (TCR), as células T ficam ativadas e secretam citocinas que fornecem ajuda para a indução da diferenciação de células B. As células B se expandem em números e se diferenciam em células plasmáticas que agora secretam anticorpo. Inicialmente, a Imunoglobulina M (IgM) é produzida por células plasmáticas, mas eventualmente a célula T ajuda a fazer com que as células plasmáticas sofram alteração de classe e produzam outras classes de isotipos de anticorpo tal como IgG. Este processo continua com células plasmáticas sofrendo alterações mutacionais levando à produção de receptores de anticorpo que possuem afinidade ainda maior em relação a conjugados de PS-proteína. À medida que o antígeno é eliminado, apenas as células plasmáticas com maior afinidade são ativadas pelo conjugado de PSproteína residual que fica na circulação. O processo de maturação dependente de células T de células plasmáticas continua, levando à expansão de populações de células plasmáticas que produzem anticorpos de alta afinidade da classe IgG. A expansão pode ser facilmente monitorada através da medida dos níveis de anticorpos IgG anti-PS no soro de um indivíduo imunizado, por exemplo, um ser humano.

Eventualmente, a maturação e o processo de alteração levam à produção de células B de Memória que têm vida longa e são específicas em relação ao PS. As células B de Memória possuem uma propriedade exclusiva no fato de que podem ser imediatamente ativadas se expostas ao PS. A ativação faz com que as células B de Memória se multipliquem e produzam rapidamente IgG anti-PS. A ativação das células B de memória que ocorre durante uma segunda exposição ao antígeno PS é chamada de resposta de reforço e é indicativa de uma resposta imunológica de memória secundária de vida longa. A imunização primária pode estimular a produção de anticorpos IgM e alguns anticorpos IgG. Após a imunização secundária, isto é, a injeção de reforço, as células de memória já programadas pela primeira imunização são estimuladas para produzirem grandes quantidades de IgG, a resposta imunológica de memória.

Um antígeno independente de células T geralmente não estimula imunidade duradoura, isto é, a produção de anticorpos IgG, mas pode estimular a produção de anticorpos IgM menos potentes e mais temporários. Como tal, os antígenos PS isoladamente não produzem tipicamente respostas de reforço de IgG. Entretanto, os PS produzem respostas de reforço se a imunização primária for realizada com um conjugado de PS-proteína porque as células de memória induzidas pelo conjugado já foram programadas para produzirem IgG. Na verdade, acredita-se que a resposta de reforço em animais ou seres humanos vacinados imita a resposta protetora à exposição a um micro-organismo que exibe o PS; esta memória de longo período de tempo é crítica para que uma vacina funcione na proteção de indivíduos imunizados anos após sua imunização com vacinas conjugadas. Assim, os conjugados de PS-proteína são valiosos por (1) sua capacidade de induzir altos níveis de IgG contra antígenos PS e (2) sua capacidade de induzir respostas imunológicas de memória contra antígenos PS. Os antígenos PS tipicamente não exibem estas propriedades e assim são antígenos inferiores. A dificuldade de sintetizar vacinas conjugadas e o seu custo de produção retardaram o desenvolvimento de vacinas conjugadas para muitas doenças bacterianas em que uma resposta imunológica ao PS pode ser protetora.

Outros antígenos independentes de células T incluem homopolímeros de aminoácidos, tais como ácido poli-gama-D-glutâmico (PGA) e polialcoois. Na verdade, a maior parte dos polímeros biológicos é constituída de antígenos independentes de células T. Os polímeros podem sofrer ligação cruzada com receptores de Imunoglobulina (Ig) na superfície das células B que reconhecem os mesmos devido à natureza repetitiva de suas estruturas químicas (e assim os epítopos). Assim, os polímeros podem ativar as células B para a produção de IgM anti-polímero da mesma maneira que fazem os polissacarídeos. Por exemplo, um homopolímero de aminoácidos, ácido poli-gama-D-glutâmico (PGA) de Bacillus anthracis, é um polímero capsular que é fracamente imunogênico e também um antígeno independente de células T. As vacinas compostas de PGA conjugado com carreadores protéicos são altamente imunogênicas, capazes de induzir IgG anti-PGA e memória imunológica ao PGA. Consequentemente, a maior parte dos polímeros responde como o PS em termos de sua imunogenicidade porque não podem ser processados e exibidos no contexto de MHC-II e assim não podem recrutar o auxílio das células T. Uma exceção é observada em alguns polímeros que ocorrem naturalmente que interagem com uma outra classe de receptor denominada receptores similares a Toll (TLRs). Uma vez ativados, os TLRs podem induzir a produção de citocinas por células hospedeiras e produzir alterações na resposta imunológica adaptativa. Alguns PS estão covalentemente ligados a ligantes de TLR ou contaminados com tais ligantes. Por exemplo, os lipopolissacarídeos (LPS) são PS que são altamente imunogênicos e induzem IgG e respostas de memória; o grupamento lipídico A do LPS é um ligante de TLR e pode ser responsável pelas propriedades imunológicas.

Em um outro exemplo, foi observado que alguns PS de pneumococo exibem algumas das propriedades imunológicas das vacinas conjugadas no fato de que induzem a alteração de isotipo para IgG mesmo se não estiverem ligados a um carreador protéico. Recentemente, foi observado que a vacina de polissacarídeo comercial Pneumovax-23, assim como o PS individual de várias cepas de Streptococcus pneumoniae, estavam contaminados com ligantes de TLR (Sen e outros, J. Immunol. 175:3084-3091, 2005). Esta descoberta pode explicar porque estas preparações de PS podem induzir a alteração de isotipo para IgG na ausência de conjugação de proteínas. Estes PS de pneumococo induziam a secreção de IL-6 e TNF-α por macrófagos. Entretanto, a purificação adicional do PS através da extração com fenol anulou a secreção de citoninas dos macrófagos. Nos estudos de imunização, os PS extraídos com fenol eram fracamente imunogênicos e não induziam mais uma IgG anti-PS. Assim, a extração com fenol remove as moléculas contaminantes que eram responsáveis por estas propriedades imunogênicas não usuais desta preparação de PS. As moléculas contaminantes parecem ser ligantes de TLR dada a sua capacidade de ativar respostas de citocinas dependentes de TLR em macrófagos. A purificação adicional dos PS através da extração com fenol removeu os ligantes de TLR contaminantes e tornou os PS totalmente independentes de células T.

O exemplo anterior ilustra que o antígeno PS pode atuar como antígenos de PS-proteína conjugados sem o acoplamento covalente de proteína ao carboidrato. Infelizmente, os ligantes de TLR são geralmente próinflamatórios. Por exemplo, o LPS é tóxico mesmo em pequenas doses. As sim, embora a mistura de um ligante de TLR com um PS possa ampliar a resposta imunológica ao PS, é provável ainda que esta abordagem produza uma vacina que é reatogênica e provavelmente causará sintomas adversos nos receptores da vacina. A tecnologia de vacinas conjugadas permanece o método de escolha para a produção de vacina de PS com o espectro desejado de imunogenicidade e segurança.

O desenvolvimento de vacinas conjugadas de PS-proteína reduziu enormemente o fardo da doença na infância causado por agentes patogênicos bacterianos invasivos. Uma pequena quantidade de tais vacinas 10 incluindo aquelas contra Haemophilus influenzae do Tipo B e certas cepas de meningococos e estreptococos está disponível comercialmente no mundo desenvolvido. Estas vacinas conjugadas de PS-proteína têm produção e venda proibitivamente caras no mundo em desenvolvimento. Por exemplo, a vacina conjugada pneumocócica heptavalente disponível comercialmente 15 custa aproximadamente $58 (dólares americanos em 2006) por dose e requer um regime de quatro doses. Somente o custo coloca a vacina fora do alcance daqueles nos países em desenvolvimento que carregam o fardo da doença.

As vacinas conjugadas convencionais são difíceis de produzir de 20 forma econômica devido à química envolvida e aos custos de produção e de purificação tanto dos PS quando da proteína transportadora. Geralmente, ambos precisam estar bastante puros antes que a química de conjugação possa ser realizada com uma eficiência de acoplamento razoável. Tipicamente, a química de acoplamento tem que ser desenvolvida para vários PS 25 o que é exclusivo para a química dos PS e as proteínas transportadoras que foram selecionadas. Esta química de acoplamento introduz grupos funcionais no PS que então podem ser ligados à proteína transportadora tipicamente através das cadeias laterais de amino épsilon dos resíduos de lisina. A modificação química de PS para introduzir tais grupos de acoplamento 30 pode destruir os epítopos sobre o PS e introduzir novos epítopos (por exemplo, associados com o ligante ou os grupos de sacarídeos modificados) cuja significância pode ser avaliada apenas realizando análises imunológicas cui dadosas. Além disso, para as vacinas conjugadas de PS-proteína convencionais, o tamanho do PS, o número de moléculas de PS ligadas por molécula transportadora de proteína, a natureza do carreador selecionado e o tipo de química de ligação podem todos afetar a imunogenicidade da vacina conjugada. Como tal, por exemplo, no caso de doença pneumocócica em que cada um dos 90+ sorotipos conhecidos possui uma estrutura de PS diferente (Bentley e outros, PLOS Genetics 2(3):e31 262-269, 2006), um único método de conjugação pode não ser apropriado para todos os sorotipos. A síntese de forma que pode ser reproduzida de vacinas conjugadas com propriedades imunológicas que podem ser reproduzidas envolve o controle cuidadoso do tamanho do PS, do número de moléculas de PS ligadas por molécula transportadora de proteína, da natureza do carreador selecionado e do tipo de química de ligação e isto, por sua vez, aumenta drasticamente o custo da produção de vacinas conjugadas.

A emergência de resistência a antibióticos enfatiza a urgência pelo desenvolvimento de vacinas seguras e eficientes. O fato de tornar as vacinas amplamente disponíveis, especialmente para aqueles nos países em desenvolvimento, requer que a produção de vacinas também seja eficiente em relação ao custo. A incorporação de vacinas conjugadas combinadas contra muitos antígenos de polissacarídeos de sorotipos diferentes de uma ou mais espécies bacterianas no regime de imunização na infância simplificaria a administração da vacina em tal população de alto risco. Entretanto, a tecnologia de vacina conjugada atual não eficiente em relação ao custo e assim, as vacinas conjugadas de combinação são virtualmente impossíveis de fornecer ao mundo em desenvolvimento. Na verdade, mesmo no mundo desenvolvido com seus mercados estabelecidos fortes, a recente redução de estoque da vacina pneumocócica conjugada heptavalente da Wyeth ilustra o quão difícil é produzir e armazenar uma vacina que requer tecnologia de síntese de vacina conjugada complexa.

Em modalidades desejáveis, as vacinas da invenção são vacinas de matriz capsular polivalentes (PCMV) em que um ou mais componentes capsulares bacterianos ficam capturados dentro de uma matriz de prote ína transportadora polivalente. As PCMVs podem ser produzidas facilmente porque é necessário como o material de partida o antígeno de interesse, por exemplo, cápsulas, que são somente moderadamente puras. Por exemplo, o ácido poli-gama-D-glutâmico (PGA) da Vedan ainda não é puro (carregava uma protease ativa sobre a DNI), como descrito aqui, tem desempenho exatamente como esperado para um antígeno independente de células T (Exemplo 1). A incorporação de PGA em uma PCMV foi bem-sucedida em todas as três preparações de PCMV que variavam em suas proporções de proteína em relação ao PGA ao longo de uma faixa de 7 vezes.

Devido ao fato de que o método de produção vacinas da invenção não requer qualquer conhecimento da química do antígeno de interesse, por exemplo, do polissacarídeo da cápsula, o método não depende da necessidade do desenvolvimento da química de reticulação que é compatível com a química do antígeno de interesse e da proteína transportadora. Embora seja possível que alguns antígenos possam, todavia, interagir com o ligante, isto não deve diminuir a eficiência da vacina, porque seria esperado que a reticulação não pretendida do antígeno de interesse e a proteína transportadora tivesse propriedades imunogênicas de qualquer maneira. Nas vacinas da invenção, a reticulação do antígeno de interesse com a proteína transportadora não é um requerimento para que a vacina seja eficiente. Isto está em um contraste nítido com as vacinas conjugadas convencionais, que são assim dificultadas em relação a sua produção e desenvolvimento. As vacinas da invenção, de forma desejável, possuem pelo menos, por exemplo, 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% ou ainda 100% das proteínas transportadoras reticuladas e não mais de, por exemplo, 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% ou 90% do antígeno de interesse sofre ligação cruzada com a proteína transportadora. De forma desejável, não mais de 10% dos antígenos sofrem ligação cruzada com as proteínas transportadoras e pelo menos 50% das proteínas transportadoras sofrem ligação cruzada.

Os métodos de produção de vacinas descritos aqui não resultam na modificação extensiva do antígeno de interesse, por exemplo, um políme ro capsular. O antígeno geralmente permanece no mesmo estado com uma modificação possível sendo, por exemplo, a redução de açúcares redutores para as cápsulas de PS que carregam tais grupos na extremidade das cadeias poliméricas. É improvável que tais modificações menores afetem a imunogenicidade da maior parte dos PS capsulares porque os açúcares das extremidades são 100-1000X menos abundantes que os resíduos internos no polímero. Em contraste, para as vacinas conjugadas convencionais, é geralmente necessário introduzir grupos ligantes no antígeno, por exemplo, um polímero capsular, que servem como o ponto de ligação covalente da proteína transportadora. Os ligantes precisam ser utilizados porque muitos antígenos, por exemplo, polímeros capsulares, não possuem um grupo reativo tal como um grupo carboxila ou amino como parte de sua estrutura. Por exemplo, a introdução da química do ligante em um PS pode resultar na destruição de epítopos capsulares e na produção de novos epítopos que poderíam ser indesejáveis em um produto de vacina por causa de sua reatividade cruzada imunológica desconhecida com os epítopos próprios do hospedeiro.

Os métodos de produção de vacinas descritos aqui são menos complexos que a tecnologia de vacinas conjugadas porque sua química depende apenas da química de reticulação da proteína transportadora (por exemplo, DNI, subunidade B da toxina da cólera, toxina da difteria, Fragmento C da toxina tetânica ou beta-galactosidase de Escherichia çoii). Por exemplo, embora o polímero capsular afete a taxa de reticulação quando misturado com a DNI, não afeta o padrão ou a extensão da reticulação que é controlada mais pela proteína que está sendo utilizada, sua concentração e a concentração do agente de reticulação (por exemplo, glutaraldeído) adicionado. Estes parâmetros podem ser facilmente ajustados, reduzindo assim o tempo e o esforço necessário para produzir a vacina e reduzir os custos.

Os métodos de produção de vacinas PCMV descritos aqui podem ser utilizados com qualquer antígeno, por exemplo, qualquer polímero capsular ou qualquer polímero com poucos se quaisquer grupos amino e qualquer proteína transportadora que possa sofrer ligação cruzada, por e xemplo, proteínas transportadoras que não possuem epítopos críticos que podem ser destruídos que podem ser destruídos através da redução com boro-hidreto. As proteínas transportadoras que podem ser utilizadas nos métodos descritos aqui, de forma desejável, possuem pelo menos 2 resíduos de lisina ou outros resíduos que não estão bloqueados e que podem sofrer ligação cruzada através de modificação química. O toxoide tetânico é uma proteína transportadora possível. Esta toxina é detoxificada através do tratamento com formaldeído, um reagente que reage com grupos amino das proteínas. Outras proteínas transportadoras desejáveis incluem a subunidade B da toxina da cólera (disponível na SBL Vaccin AB), a toxina da difteria, o Fragmento C da toxina tetânica (disponível na Sigma Aldrich), a DNI ou a beta-galactosidase de Escherichia coli (disponível na Sigma Aldrich).

As vacinas conjugadas multivalentes atuais são produzidas através da síntese de vacinas conjugadas individuais primeiro, seguida por sua mistura para produzir uma vacina conjugada em coquetel (por exemplo, a vacina pneumocócica heptavalente da Wyeth, Prevnar®). Os métodos de produção vacinas da presente invenção podem ser utilizados para produzir vacinas multivalentes através da mistura de antígenos quimicamente diferentes, por exemplo, polímeros orgânicos capsulares, juntos antes da reticulação da proteína transportadora, por exemplo, com glutaraldeído ou através da mistura de vacinas específicas da invenção que foram sintetizadas separadamente. Esta flexibilidade fornece vantagens significativas em relação aos presentes métodos de produção de vacinas multivalentes.

Os exemplos de vacinas da invenção discutidas nos exemplos, vacinas PCMV #1-3, tiveram desempenho similar à vacina conjugada apesar do fato de que estas vacinas foram sintetizadas através de um método que não é previsto que produza quaisquer ligações covalentes entre os átomos que constituem a molécula de PGA e a proteína DNI. O glutaraldeído reage exclusivamente com as cadeias laterais amino das proteínas caracterizadas pelo grupo amino épsilon dos resíduos de lisina. O polímero de PGA não contém grupos amino livres e possui somente cadeias laterais carboxila que não reagem com o glutaraldeído. Assim, as respostas imunológicas similares às do conjugado geradas pelas PCMVs indicam que moléculas de PGA longas estavam molecularmente capturadas dentro de uma matriz reticulada de moléculas de proteína DNI.

De acordo com um modelo não-limitante, a captura atua para carregar a proteína DNI e o PGA para dentro das células B que ligam tais matrizes em virtude dos receptores de Ig que reconhecem o PGA de forma imunológica. Uma vez capturadas dentro destas células B, as matrizes são degradadas de uma maneira similar à das vacinas conjugadas convencionais e que isto resulta em peptídeos derivados da DNI que são exibidos nas moléculas de MHC-II das células B correspondentes. Isto, por sua vez, recruta o auxílio de células T e leva assim à expansão e à maturação de tais células B para se tornarem células plasmáticas e de memória produtoras de IgG específicas para o PGA. Assim, de acordo com o modelo não-limitante, as PCMVs funcionam como as vacinas capsulares conjugadas com proteína imunologicamente, mas são distintas porque as PCMVs não possuem ligação covalente significativa entre a proteína transportadora e os polímeros capsulares.

As vacinas da invenção, incluindo as PCMVs, podem ser utilizadas em combinação, por exemplo, em vacinas pediátricas. Em adição, as vacinas da invenção podem ser utilizadas para vacinar contra, por exemplo, infecção por Pneumococcus, infecção por Streptococcus (grupos A e B), infecção por Haemophilus influenzae do tipo B (HiB), infecção por meningococos (por exemplo, Neissería meningitides) e podem ser utilizadas como vacinas de antígeno O de bactérias Gram negativas (por exemplo, Pseudomonas aeruginosa, Francisella tularensis (Thirumalapura e outros, J. Med. Microbiol. 54:693-695, 2005; Vinogradov e Perry, Carbohydr. Res. 339:16431648, 2004; Vinogradov e outros, Carbohydr. Res. 214:289-297, 1991), espécies de Shigella, espécies de Salmonella, espécies de Acinetobacter, espécies de Burkholderia e Escherichia coli).

As vacinas da invenção podem ser produzidas utilizando quaisquer ligantes, tais como, por exemplo, os descritos aqui, para a reticulação de qualquer proteína transportadora, tal como, por exemplo, as descritas aqui, na presença de um ou mais antígenos de interesse, tais como, por exemplo, os descritos aqui. Se um antígeno de interesse for utilizado, é dito que a vacina de matriz protéica da invenção é monovalente. Se mais de um antígeno de interesse for utilizado, é dito que a vacina de matriz protéica da invenção é multivalente. Se um polímero capsular microbiano for o antígeno de interesse, é dito que a vacina de matriz protéica da invenção é uma vacina de matriz capsular protéica (PCMV).

Ligantes

As proteínas transportadoras de reticulação são bem-conhecidas na técnica e incluem glutaraldeído, éster de m-maleimidobenzoil-Nhidroxissuccinimida, carbodi-imida e benzidina bis-biazotizada.

Os métodos gerais e os grupamentos para a reticulação direta das proteínas transportadoras, utilizando ligantes homobifuncionais ou heterobifuncionais são descritos, por exemplo, por G. T. Hermanson em Bioconjugate Techniques, Academic Press, 1996 e Dick e Beurret em Conjugate Vaccines. Contribu. Microbiol. Immunol., Karger, Basal 10:48-114, 1989. Por exemplo, com uma proteína transportadora que possui um número n de grupamentos de lisina, há, teoricamente, n+1 aminas primárias (incluindo a amina terminal) disponíveis para a reação com um exemplo do grupo carboxílico do ligante cruzado. Assim, utilizando este procedimento de conjugação direta, o produto é limitado a possuir n+1 ligações amida formadas.

O ligante empregado em modalidades desejáveis da presente invenção é, na sua forma mais simples, uma ligação que conecta duas proteínas transportadoras. O ligante pode ser um esqueleto molecular linear, cíclico ou ramificado, com grupos pendentes que se ligam de forma covalente a duas proteínas transportadoras, (A) e (B). Qualquer certa proteína transportadora pode estar ligada a mais de uma proteína transportadora, de forma que é criada uma matriz de proteínas transportadoras interconectadas, dentro da qual um antígeno pode estar capturado.

O termo grupo de ligação refere-se à ligação covalente que resulta da combinação de grupamentos reativos do ligante (L) com grupos funcionais de (A) ou (B). Os exemplos de grupos de ligação incluem, sem limi tação, éster, carbamato, tioéster, imina, dissulfeto, amida, éter, tioéter, sulfonamida, isouréia, isotiouréia, imidoéster, amidina, fosforamidato, fosfodiéster, tioéter e hidrazona.

A ligação de (A) com (B) é conseguida através de meios covalentes, envolvendo a formação de ligação (grupo de ligação) com um ou mais grupos funcionais localizados em (A) e (B). Os exemplos de grupos funcionais quimicamente reativos que podem ser empregados para esta finalidade incluem, sem limitação, amino, hidroxila, sulfidrila, carboxila, carbonoíla, tioéteres, guanidinila, imidazolila e grupos fenólicos, dos quais todos estão presentes em aminoácidos que ocorrem naturalmente em muitas proteínas transportadoras.

A ligação covalente de (A) com (B) pode, portanto, ser realizada utilizando um ligante (L) que contém grupamentos reativos capazes de reagir com tais grupos funcionais presentes em (A) e (B). O produto desta reação é um grupo de ligação que contém as ligações recém-formadas que ligam (L) com (A) e (L) com (B). Por exemplo, um grupo hidroxila de (A) pode reagir com um grupo do ácido carboxílico de (L) ou um derivado ativado do mesmo, vide infra, resultando na formação de um grupo de ligação éster.

Os exemplos de grupamentos capazes de reagir com grupos sulfidrila incluem compostos α-haloacetila do tipo XCH2CO- (em que X=Br, Cl ou I), que exibem reatividade particular em relação aos grupos sulfidrila, mas que podem também ser utilizados para modificar grupos imidazolila, tioéter, fenol e amino como descrito, por exemplo, por Gurd, Methods Enzymol. 11:532, 1967. Os derivados de N-maleimida também são considerados seletivos em relação aos grupos sulfidrila, mas podem ser adicionalmente úteis no acoplamento com grupos amino sob certas condições. Os reagentes, tal como 2-iminotiofaixa (Traut e outros, Biochemistry 12:3266, 1973), que introduzem um grupo tiol através da conversão de um grupo amino, podem ser considerados como reagentes sulfidrila se a ligação ocorrer através da formação de pontes dissulfeto.

Os exemplos de grupamentos reativos capazes de reagir com grupos amino incluem, por exemplo, agentes de alquilação e de acilação. Os agentes de alquilação representativos incluem:

(i) compostos α-haloacetila, que exibem especificidade em relação aos grupos amino na ausência de grupos tiol reativos e são do tipo XCH₂CO- (em que X=CI, Br ou I) como descrito, por exemplo, por Wong (Bio- chemistry 24:5337,1979);

(ii) derivados de N-maleimida, que podem reagir com grupos amino através de uma reação do tipo Michael ou através de acilação pela adição ao grupo carbonila do anel como descrito, por exemplo, por Smyth e outros (J. Am. Chem. Soc. 82:4600, 1960 e Biochem. J. 91:589, 1964);

(iii) halogenetos de arila tais como compostos nitrohaloaromáticos reativos;

(iv) halogenetos de alquila, como descrito, por exemplo, por McKenzie e outros (J. Protein Chem. 7:581, 1988);

(v) aldeídos e cetonas capazes de formarem uma base de Schiff 15 com grupos amino, os adutos formados sendo geralmente estabilizados a- través da redução para fornecer uma amina estável;

(vi) derivados de epóxido tais como epiclorohidrina e bisoxiranos, que podem reagir com grupos amino, sulfidrila ou hidroxila fenólicos;

(vii) derivados contendo cloro de s-triazinas, que são muito reati20 vos em relação aos nucleófilos tais como grupos amino, sulfidrila e hidroxila;

(viii) aziridinas baseadas em compostos de s-triazina detalhadas anteriormente como descrito, por exemplo, por Ross (J. Adv. Câncer Res. 2:1, 1954), que reagem com nucleófilos tais como grupos amino através da abertura do anel;

(ix) ésteres dietílico do ácido quadrático como descrito, por exemplo, por Tietze (Chem. Ber. 124:1215,1991); e (x) α-haloalquil éteres, que são agentes de alquilação mais reativos que os halogenetos de alquila normais por causa da ativação causada pelo átomo de oxigênio do éter, como descrito, por exemplo, por Benneche e 30 outros (Eur. J. Med. Chem. 28:463, 1993).

Os agentes de acilação reativos a amino representativos incluem:

(i) isocianatos e isotiocianatos, particularmente derivados aromáticos, que formam derivados estáveis de uréia e tiouréia, respectivamente;

(ii) cloretos de sulfonila, que foram descritos, por exemplo, por Herzig e outros (Biopolymers 2:349, 1964);

(iii) halogenetos ácidos;

(iv) ésteres ativos tais como nitrofenilésteres ou ésteres de Nhidroxissuccinimidila;

(v) anidridos ácidos tais como mistos, simétricos ou Ncarboxianidridos;

(vi) outros reagentes úteis para a formação de ligação amida como descrito, por exemplo, por M. Bodansky (Principies of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, 1984);

(vii) acilazidas, por exemplo, em que o grupo azida é gerado partindo de um derivado de hidrazida pré-formado utilizando nitrito de sódio, 15 como descrito, por exemplo, por Wetz e outros (Anal. Biochem. 58:347, 1974); e (viii) imidoésteres, que formam amidinas estáveis na reação com grupos amino como descrito, por exemplo, por Hunter e Ludwig (J. Am. Chem. Soc. 84:3491, 1962).

Os aldeídos, tais como, por exemplo, glutaraldeído e cetonas podem ser reagidos com aminas para formar bases de Schiff, que podem ser vantajosamente estabilizadas através da aminação redutiva. Os grupamentos alcoxilamino reagem rapidamente com cetonas e aldeídos para produzir alcoxaminas estáveis como descrito, por exemplo, por Webb e outros 25 (Bioconjugate Chem. 1:96,1990).

Os exemplos de grupamentos reativos capazes de reagir com grupos carboxila incluem compostos diazo tais como ésteres de diazoacetato e diazoacetamidas, que reagem com alta especificidade para gerar grupos éster como descrito, por exemplo, por Herriot (Adv. Protein Chem. 3:169, 30 1947). Os reagentes que modificam o ácido carboxílico tais como carbodiimidas, que reagem através da formação de O-aciluréia seguida pela formação de ligação amida, também podem ser empregados.

Os grupos funcionais em (A) e/ou (B) podem, se desejado, ser convertidos em outros grupos funcionais antes da reação, por exemplo, para conferir reatividade ou seletividade adicional. Os exemplos de métodos úteis para esta finalidade incluem a conversão de aminas em ácidos carboxílicos utilizando reagentes tais como anidridos dicarboxílicos; a conversão de aminas em tiois utilizando reagentes tal como N-acetil-homocisteína tiolactona, anidrido S-acetilmercaptossuccínico, 2-iminotiolano ou derivados de succinimidila contendo tiol; a conversão de tiois em ácidos carboxílicos utilizando reagentes tais como α-haloacetatos; a conversão de tiois em aminas utilizando reagentes tal como etilenimina ou 2-bromoetilamina; a conversão de ácidos carboxílicos em aminas utilizando reagentes tais como carbodi-imidas seguidas por diaminas; e a conversão de álcoois em tiois utilizando reagentes tal como cloreto de tosila seguida pela transesterificação com tioacetato e a hidrólise no tiol com acetato de sódio.

Os assim chamados ligantes de comprimento zero, que envolvem a ligação covalente direta de um grupo químico reativo de (A) com um grupo químico reativo de (B) sem introduzir material de ligação adicional podem, se desejado, ser utilizados de acordo com a invenção. Os exemplos incluem compostos em que (L) representa uma ligação química que liga um átomo de oxigênio de (A) a um grupamento carbonoíla ou tiocarbonila presente em (B), de forma que o grupo de ligação seja um éster ou um tioéster. Por exemplo, um grupo amino (A) pode ser ligado a um grupo carboxila (B) através da utilização da química de carbodi-imida produzindo A-L-B em que L é uma ligação amida ou R-C=O ligado a N-R em que R é a cadeia de carbono derivada das cadeias laterais de aminoácidos da mesma ou de duas moléculas de proteínas diferentes.

Mais comumente, entretanto, o ligante inclui dois ou mais grupamentos reativos, como descrito anteriormente, conectados por um elemento espaçador. A presença de um espaçador permite que os ligantes bifuncionais reajam com grupos funcionais específicos dentro de (A) e (B), resultando em uma ligação covalente entre estes dois compostos. Os grupamentos reativos em um ligante (L) podem ser os mesmos (ligante homobi funcional) ou diferentes (ligante heterobifuncional ou, quando vários grupamentos reativos diferentes estão presentes, ligante heteromultifuncional), fornecendo uma diversidade de reagentes potenciais que podem realizar a ligação covalente entre (A) e (B).

Os elementos espaçadores consistem tipicamente de cadeias que separam eficientemente (A) e (B) através de um alquila linear ou ramificado de 1 até 10 átomos de carbono, um heteroalquila linear ou ramificado de 1 até 10 átomos, um alceno linear ou ramificado de 2 até 10 átomos de carbono, um alcino linear ou ramificado de 2 até 10 átomos de carbono, um 10 resíduo aromático de 5 até 10 átomos de carbono, um sistema cíclico de 3 até 10 átomos ou -(0Η₂0Η₂Ο)η0Η20Η2-, em que n é 1 até 4.

A natureza do material extrínseco introduzido pelo agente de ligação pode ter uma ligação com a farmacocinética e/ou com a atividade do produto de vacina final. Assim pode ser desejável introduzir ligantes que po15 dem ser clivados, contendo braços espaçadores que são biodegradáveis ou quimicamente sensíveis ou que incorporam sítios de divagem enzimática.

Estes ligantes que podem ser clivados, como descrito, por exemplo, na Publicação PCT WO 92/17436 (incorporada aqui como referência), são facilmente biodegradados in vivo. Em alguns casos, os grupos de 20 ligação são clivados na presença de esterases, mas são estáveis na ausência de tais enzimas. (A) e (B) podem, portanto, vantajosamente ser ligados para permitir sua liberação lenta pelas enzimas ativas próximas ao local da doença.

Os ligantes podem formar grupos de ligação com grupos diester, diamida ou dicarbamato biodegradáveis da fórmula I: -(Z¹)o-(Y¹)_u-(Z²)s-(Rn)-(Z³)r(Y²)v-(Z⁴)p I em que, cada um de Z¹, Ζ², Ζ³ e Z⁴ é independentemente selecionado de O,

S e NRi₂ (em que R12 é hidrogênio ou um grupo alquila); cada um de Y¹ e Y² é independentemente selecionado de um grupo carbonoíla, tiocarbonila, sulfonila, fosforila ou formador de ácido similar; o, p, s, t, u e v são cada um independentemente 0 ou 1; e Rn é um alquila linear ou ramificado de 1 até 10

átomos de carbono, um heteroalquila linear ou ramificado de 1 até 10 átomos, um alceno linear ou ramificado de 2 até 10 átomos de carbono, um alcino linear ou ramificado de 2 até 10 átomos de carbono, um resíduo aromático de 5 até 10 átomos de carbono, um sistema cíclico de 3 até 10 átomos, (CH₂CH₂O)_qCH2CH2- em que q é 1 até 4 ou uma ligação química que liga (Z’)o-(Y¹)u-(Z²)_s- a -(ZWWíp Os exemplos de ligantes desejáveis (L) utilizados na presente invenção podem ser descritos através de qualquer uma das fórmulas ll-lll:

Modalidades exemplares da fórmula I, ligantes e grupos de ligação são mostrados abaixo:

Η H

II III em que o ligante está covalentemente ligado tanto a um átomo de oxigênio (A) quanto a um átomo de oxigênio de (B). Consequentemente, o ligante (L) das fórmulas ll-lll está ligado às proteínas transportadoras (A) e (B) através dos grupos de ligação dipirano, éster ou carbamato. Nestas modalidades, R13 representa um alquila linear ou ramificado de 1 até 10 átomos de carbono, um heteroalquila linear ou ramificado de 1 até 10 átomos, um alceno linear ou ramificado de 2 até 10 átomos de carbono, um alcino linear ou ramificado de 2 até 10 átomos de carbono, um resíduo aromático de 5 até 10 átomos de carbono, um sistema cíclico de 3 até 10 átomos,

-(CH2CH₂O)nCH2CH₂- em que n é 1 até 4 ou uma ligação química que liga dois nitrogênios ou dois carbonoílas.

Os ligantes planejados para formar ligações hidrazona possuem a fórmula química IV:

X₄

-(Y³)-(Z⁵)_w-(R₁₄)—U-r₁₅

IV em que Z⁵ é selecionado de O, S ou NR16; Ri6 θ hidrogênio ou um grupo alquila; R-i₅ é selecionado de hidrogênio, um alquila ou um heteroalquila; Y³ é selecionado de um grupo carbonoíla, tiocarbonila, sulfonila, fosforila ou um formador de ácido similar ligado a um átomo de oxigênio de (A); w é 0 ou 1; R14 é um alquila linear ou ramificado de 1 até 10 átomos de carbono, um heteroalquila linear ou ramificado de 1 até 10 átomos, um alceno linear ou ramificado de 2 até 10 átomos de carbono, um alcino linear ou ramificado de 2 até 10 átomos de carbono, um resíduo aromático de 5 até 10 átomos de carbono, um sistema cíclico de 3 até 10 átomos, -(CH2CH2O)_nCH₂CH2-, em

X₄

II que n é 1 até 4 ou uma ligação química que liga -(Y³)-(Z⁵)w- a ^Ri5; e

X4 é uma hidrazona que resulta da reação de condensação de (B) contendo um grupo hidrazida e o precursor para o ligante II, em que X4 é o átomo de oxigênio de um grupo cetona ou aldeído.

Proteínas Transportadoras

Em geral, qualquer proteína transportadora que pode capturar um antígeno sob condições fisiológicas pode ser utilizada na presente invenção. De forma desejável, o antígeno é capturado em um complexo com proteínas transportadoras na ausência de ligação covalente significativa entre o antígeno e uma proteína transportadora. A ausência de ligação covalente significativa, refere-se a não mais de 50% do antígeno sendo covalentemente ligado a uma proteína transportadora. Em modalidades desejáveis, não mais de 40%, 30%, 10% ou 5% do antígeno está covalentemente ligado a uma proteína transportadora. O complexo de antígeno/proteína transportadora pode conter um outro composto, tal como alúmen e este outro composto, em modalidades desejáveis, pode capturar o antígeno e a proteína transportadora.

As proteínas transportadoras utilizadas nas vacinas da invenção, de forma desejável, são proteínas que, isoladamente ou em combinação com um antígeno, ativam uma resposta imunológica em um indivíduo. De forma desejável, a proteína transportadora contém pelo menos um epítopo reconhecido por uma célula T. De forma desejável, o epítopo é capaz de induzir uma resposta de células T em um indivíduo e de induzir as células B a produzirem anticorpos contra 0 antígeno de interesse inteiro. Os epítopos que são utilizados na descrição desta invenção, incluem qualquer determi nante em um antígeno que seja responsável por sua interação específica com uma molécula de anticorpo ou um fragmento da mesma. Os determinantes epitópicos consistem geralmente de agrupamentos de superfície quimicamente ativos de moléculas tais como aminoácidos ou cadeias laterais de açúcares e possuem características estruturais tridimensionais específicas assim como características de carga específicas. Para ter propriedades imunogênicas, uma proteína ou um polipeptídeo geralmente é capaz de estimular células T. Entretanto, uma proteína transportadora que não possui um epítopo reconhecido por uma célula T também pode ser imunogênica.

Através da seleção de uma proteína transportadora que é sabida que ativa uma forte resposta imunogênica, uma população distinta de indivíduos pode ser tratada através de um PCMV descrita aqui. A proteína transportadora, de forma desejável, é suficientemente estranha para ativar uma resposta imunológica forte para a vacina. Tipicamente, a proteína transportadora utilizada é uma molécula que é capaz de conferir imunogenicidade ao antígeno de interesse. Em uma modalidade desejável, uma proteína transportadora é uma que é inerentemente altamente imunogênica. Assim, uma proteína transportadora que possui um alto grau de imunogenicidade é também capaz de maximizar a produção de anticorpos para os antígenos complexados quando isto for desejável.

Várias proteínas transportadoras da invenção incluem, por exemplo, toxinas e toxoides (químicos ou genéticos), que podem ou não ser mutantes, tais como toxina de antraz, PA e DNI (PharmAthene, Inc.), toxoide da difteria (Massachusetts State Biological Labs; Serum Institute of India, Ltd.) ou CRM 197, toxina tetânica, toxoide tetânico (Massachusetts State Biological Labs; Serum Institute of India, Ltd.), fragmento Z da toxina tetânica, exotoxina A ou mutantes da exotoxina A de Pseudomonas aeruginosa, flagelina bacteriana, pneumolisina, uma proteína de membrana externa de Neissería meningitidis (cepa disponível na ATCC (American Type Culture Collection, Manassas, VA)), proteína Hcp1 de Pseudomonas aeruginosa, enterotoxina termolábil de Escherichia coli, toxina similar a shiga, proteína LTB humana, um extrato de proteínas de células bacterianas inteiras e qual quer outra proteína que possa sofrer ligação cruzada através de um ligante. De forma desejável, a proteína transportadora é a subunidade B da toxina da cólera (disponível na SBL Vaccin AB), toxina da difteria (Connaught, Inc.), fragmento C da toxina tetânica (disponível na Sigma Aldrich), DNI ou betagalactosidase de Escheríchia coli (disponível na Sigma Aldrich). Outras proteínas transportadoras desejáveis incluem albumina de soro bovino (BSA), P40 e riboflavina de frango. (A não ser que seja indicado de outra maneira, os exemplos de proteínas transportadoras estão disponíveis comercialmente na Sigma Aldrich.) Outros exemplos de proteínas transportadoras são MAPs (peptídeos multiantigênicos), que são peptídeos ramificados. Utilizando um MAP, a densidade de reticulação é maximizada por causa dos vários resíduos de aminoácidos ramificados. Um exemplo de aminoácido que pode ser utilizado para formar um MAP é, mas não está limitado à lisina.

Tanto a BSA quanto a hemocianina da lapa do buraco da fechadura (KLH) têm sido comumente utilizadas como carreadores no desenvolvimento de vacinas em experimentos com animais. As proteínas transportadoras que foram utilizadas na preparação de vacinas terapêuticas incluem, mas não estão limitadas a um número de toxinas de bactérias patogênicas e seus toxoides. Os exemplos incluem toxinas da difteria e do tétano e seus toxoides correspondentes aceitáveis na medicina. Outros candidatos são proteínas antigenicamente similares às toxinas bacterianas referidas como materiais de reação cruzada (CRMs). As proteínas transportadoras da invenção também podem incluir qualquer proteína não derivada de seres humanos e não presente em qualquer substância alimentícia para seres humanos.

Em modalidades desejáveis da invenção, as proteínas que formam estruturas similares a aneis são utilizadas para a produção de PCMVs. Tais proteínas incluem a proteína Hcp1 de Pseudomonas aeruginosa, as subunidades B não-tóxicas da toxina da cólera, a enterotoxina termolábil de Escheríchia coli e a toxina similar a shiga. Tais complexos de proteínas similares a aneis podem formar contas em um colar em que as cadeias de PS lineares penetram no canal central destes complexos de proteínas com formato de anel. Após a reticulação da proteína, é previsto que tais complexos sejam particularmente estáveis. Os dados estruturais das proteínas sugerem que estes canais centrais são grandes o suficiente para que as cadeias de PS entrem facilmente. Por exemplo, o canal central do anel hexa5 mérico de Hcp1 tem 42 Angstroms que é amplo o suficiente para acomodar facilmente várias cadeias de polissacarídeos de 5,5 Angstroms de largura (Mougous é outros, Science 312(5779):1526-1530, 2006). Alternativamente, os aneis de proteína podem ser montados ao redor do PS (por exemplo, partindo das subunidades de uma proteína transportadora monomérica que se 10 monta naturalmente em aneis sob condições físico-químicas particulares).

Tais proteínas monoméricas que podem se montar em aneis são conhecidas na técnica e incluem, por exemplo, pneumolisina (Walker e outros, Infect. Immun. 55(5):1184-1189, 1987; Kanclerski e Mollby, J. Clin. Microbiol. 25(2):222-225, 1987), listeriolisina O (Kayal e Charbit, FEMS Microbiol. Rev.

30:514-529, 2006; Mengaud e outros, Infect. Immun. 55(12):3225-3227,

1987), DNI, PA de antraz, Hcp1, subunidade B da toxina da cólera, subunidade B da toxina de shiga, Flagelina e várias moléculas relacionadas conhecidas na técnica e produzidas por vários micro-organismos.

Em uma outra modalidade desejável, os agonistas do receptor 20 similar a Toll (TLR) são utilizados como proteínas transportadoras. A ativação do receptor similar a Toll (TLR) é importante no desenvolvimento da resposta imunológica adaptativa e pode desempenhar uma função na maturação da afinidade da resposta de anticorpo, na alteração de isotipo e na memória imunológica. A flagelina (FLA) de Vibrío cholerae é um agonista de 25 TLR. Mais de 20 mg da proteína FLA foram purificados partindo de Escheríchia coli recombinante e foi mostrado que era um ativador potente de TLR no ensaio de indução de macrófagos com IL-6 descrito aqui. Em adição, também foi mostrado que uma proteína de Streptococcus pneumoniae bem conservada chamada de Pneumolisina ativa TLR4 e, adicionalmente, é um 30 antígeno protetor. Assim, esta proteína também pode ser utilizada como uma proteína transportadora para PCMVs.

Ainda, misturas de proteínas de membrana externa (OMP) (por exemplo, as OMPs de Neisseria meningitidis) são utilizadas como a proteína transportadora para produzir a vacina conjugada HIB da Merck e foi mostrado que os extratos de proteína de células bacterianas inteiras de Streptococcal pneumoniae eram pelo menos parcialmente protetores no modelo de infecção em animais. Em modalidades desejáveis da invenção, estas misturas de proteínas são a fonte de proteína transportadora para PCMVs.

Em uma modalidade desejável, o método de PCMV é utilizado com uma proteína transportadora que possui, por exemplo, pelo menos 2 resíduos de lisina ou outros resíduos que não estão bloqueados e que podem sofrer ligação cruzada através de modificação química. Em outras modalidades desejáveis, a proteína transportadora é um multímero (por exemplo, um que contém pelo menos 5 subunidades). De forma desejável, o multímero é um homomultímero.

Em uma outra modalidade, a DNI é utilizada como a proteína transportadora porque não é tóxica permitindo que não haja necessidade de purificação da proteína antes do uso. Além disso, o uso de DNI é desejável porque a DNI também pode induzir uma resposta imunológica protetora para B. anthracis, em adição à resposta imunológica protetora para o antígeno de interesse. Ainda, a DNI não possui pontes dissulfeto internas. Tais pontes são susceptíveis à redução com boro-hidreto, que poderia desnaturar a proteína e resultar na perda de epítopos que induzem os anticorpos que neutralizam a toxina de antraz.

Antígenos de Interesse

As composições para vacina da invenção e os métodos de produção e de administração de tais vacinas podem ser utilizados para qualquer antígeno de interesse, por exemplo, um polissacarídeo, um poliálcool ou um poliaminoácido. De forma desejável, o antígeno de interesse não carrega grupos primários que podem ser destruídos pelas reações químicas empregadas pelo método de produção vacinas, por exemplo, a desnaturação de um antígeno causada pela destruição das pontes dissulfeto do antígeno pela redução com boro-hidreto. Os exemplos de antígenos de interesse incluem polímeros orgânicos tais como polissacarídeos (por exemplo, polissacarí deos que possuem pelo menos 18 resíduos), fosfopolissacarídeos, polissacarídeos com açúcares amino com substituições N-acetila, polissacarídeos contendo açúcares sulfanilados, outros açúcares modificados com sulfato ou açúcares modificados com fosfato, polialcoois, poliaminoácidos, ácidos teicoicos, cadeias laterais O de lipopolissacarídeos. Os exemplos de antígenos de interesse incluem ainda polímeros orgânicos capsulares incluindo aqueles sintetizados por micro-organismos, por exemplo, bactérias, fungos, parasitas e vírus e então purificados de tal fonte biológica utilizando métodos padronizados. Os exemplos de antígenos de interesse incluem polímeros orgânicos capsulares microbianos incluindo os purificados de organismos bacterianos tais como espécies de Bacillus (incluindo B. anthracis) (Wang e Lucas, Infect. Immun. 72(9):5460-5463, 2004), Streptococcus pneumoniae (Bentley e outros, PLoS Genet. 2(3):e31, Epub 2006; Kolkman e outros, J. Biochemistry 123:937-945, 1998; e Kong e outros, J. Med. Micorbiol. 54:351356, 2005), Shigella (Zhao e outros, Carbohydr. Res. 342(9):1275-1279, Epub 2007), Haemophilus influenzae, Neisseria meningitidis, Staphylococcus aureus, Salmonella typhi, Streptococcus pyogenes, Escherichia coli (Zhao e outros, Carbohydr. Res. 342(9):1275-1279, Epub 2007) e Pseudomonas aeruginosa e organismos fúngicos tais como Cryptococcus e Candida, assim como muitos outros micro-organismos (vide, por exemplo, Ovodov, Biochemistry (Mosc.) 71(9):937-954, 2006; Lee e outros, Adv. Exp. Med. Biol. 491:453-471, 2001; e Lee, Mol. Immunol. 24(10):1005-1019, 1987). Os exemplos de antígenos de interesse incluem ainda polímeros que não ocorrem na natureza e assim não têm origem biológica.

Composições para Vacina

As vacinas da invenção, incluindo as PCMVs, podem ser utilizadas em combinação, por exemplo, em vacinas pediátricas. Em adição, as vacinas da invenção podem ser utilizadas para vacinar contra, por exemplo, infecção por Pneumococcus, infecção por Haemophilus influenzae do tipo B (HiB), infecção por Streptococcus (grupos A e B), infecção por meningococos (por exemplo, Neisseria meningitides) e podem ser utilizadas como vacinas de antígeno O de bactérias Gram negativas (por exemplo, Pseudomo nas aeruginosa, Francisella tularensis, espécies de Shigella, espécies de Salmonella, espécies de Acinetobacter, espécies de Burkholdería e Escherichia coli).

A formulação para vacina, de forma desejável, inclui pelo menos uma proteína transportadora, um ou mais antígenos de interesse e um carreador ou excipiente farmaceuticamente aceitável (por exemplo, fosfato de alumínio, cloreto de sódio e água esterilizada). Uma composição para vacina pode incluir ainda um sistema de adjuvantes para aumentar a imunogenicidade da formulação, tal como um sistema de óleo em água e outros sistemas conhecidos na técnica ou outros excipientes farmaceuticamente aceitáveis. Um complexo de carreador/antígeno que é insolúvel sob condições fisiológicas é desejável para retardar a liberação do antígeno após a administração a um indivíduo. Tal complexo, de forma desejável, é fornecido em uma suspensão contendo excipientes farmaceuticamente aceitáveis. Entretanto, o complexo de carreador/antígeno também pode ser solúvel sob condições fisiológicas.

Tipicamente a vacina está em um volume de aproximadamente 0,5 mL para injeção subcutânea, 0,1 mL para injeção intradérmica ou 0,0020,02 mL para administração percutânea. Uma dose de 0,5 mL da vacina pode conter aproximadamente 2-500 pg do antígeno capturado em aproximadamente 2-500 pg da proteína transportadora. Em uma modalidade desejável, em uma dose de 0,5 mL, aproximadamente 10 pg do antígeno estão capturados em aproximadamente 10 pg da proteína transportadora. A proporção molar de antígeno em relação à proteína transportadora, de forma desejável, fica entre 1 até 10 (por exemplo, 1 parte de antígeno para 2 partes de carreador ou 1 parte de antígeno para 3 partes de carreador) e 10 até 1 (por exemplo, 3 partes de antígeno para uma parte de carreador ou 2 partes de antígeno para 1 parte de carreador). Em uma modalidade desejável, a proporção molar de antígeno em relação ao carreador é de 1 para 1. Alternativamente, a proporção em peso seco de antígeno em relação à proteína transportadora, de forma desejável, fica entre 1 até 10 e 10 até 1 (por exemplo, 1 até 1 em peso seco).

Devido ao fato de que os peptídeos ou os conjugados podem ser degradados no estômago, a vacina é, de forma desejável, administrada de forma parenteral (por exemplo, através de injeção subcutânea, intramuscular, intravenosa ou intradérmica). Embora o fornecimento através de um meio que penetra fisicamente a camada dérmica seja desejável (por exemplo, uma agulha, uma pistola de ar ou abrasão), as vacinas da invenção também podem ser administradas através de absorção transdermal.

Em particular, as vacinas da invenção podem ser administradas a um indivíduo, por exemplo, através de injeção intramuscular, injeção intradérmica ou imunização transcutânea com ajuvantes imunológicos apropriados. As vacinas da invenção podem ser administradas, uma ou mais vezes, incluindo frequentemente uma segunda administração planejada para aumentar a produção de anticorpos em um indivíduo para prevenir a infecção por um agente infeccioso. A frequência e a quantidade da dosagem da vacina dependem da atividade específica da vacina e podem ser facilmente determinadas através de experimentos de rotina.

Por exemplo, para um bebê, um programa de vacinação pode ser de três doses de 0,5 mL cada em intervalos de aproximadamente quatro até oito semanas (começando aos dois meses de idade) seguidas por uma quarta dose de 0,5 mL aproximadamente aos doze até quinze meses de idade. Uma quinta dose entre quatro e seis anos de idade pode ser desejável para algumas vacinas.

Embora a idade em que a primeira dosagem é administrada seja geralmente de dois meses, uma vacina pode ser administrada a bebês tão jovens quanto 6 semanas de idade. Para crianças que estão acima da idade de um programa de vacinação para bebês de rotina, as vacinas da invenção podem ser administradas de acordo com o exemplo de programa a seguir.

Idade da primeira dosagem	Programa de dosagem
7-11 meses de idade	Total de três doses de 0,5 mL; as duas primeiras com um intervalo de pelo menos quatro semanas e a terceira pelo menos dois meses após a segunda dose
12-23 meses de idade	Total de duas doses de 0,5 mL com um intervalo de pelo menos dois meses
24 meses até 9 anos de idade	Uma dose de 0,5 mL

Para adultos, duas ou mais doses de 0,5 mL fornecidas em intervalos de 2-8 semanas são geralmente suficientes para fornecer proteção durante um longo período de tempo. Uma dose de reforço é, de forma desejável, fornecida a cada dez anos aos adultos e às crianças acima dos onze anos de idade imunizados anteriormente.

As formulações podem ser apresentadas em recipientes com uma única dose ou com várias doses, por exemplo, ampolas e frascos selados e podem ser armazenadas em uma condição seca por congelamento (liofilizada) requerendo apenas a adição do carreador líquido esterilizado imediatamente antes do uso. As vacinas da invenção podem ser formuladas em veículos farmacologicamente aceitáveis, por exemplo, gel de hidróxido de alúmen, preparação adjuvante ou solução salina e então administradas, por exemplo, através de injeção intramuscular, injeção intradérmica ou imunização transcutânea com adjuvantes imunológicos apropriados.

A invenção inclui ainda kits que incluem uma vacina descrita aqui (por exemplo, uma PCMV). Os kits da invenção também podem incluir instruções para a utilização dos kits nos métodos de vacinação descritos aqui.

A eficiência do programa de imunização pode ser determinada através da utilização de métodos padronizados para medir o título de anticorpos no indivíduo. Em geral, os títulos médios de anticorpos (de forma de sejável, os títulos de IgG) de aproximadamente 1 pg/mL são considerados indicativos de proteção de longo período de tempo.

Os complexos de antígeno/proteína transportadora para uso nas composições para vacina descritos aqui possuem, de forma desejável, entre 10 nm e 100 pm de diâmetro. Os víruss podem ter 100 nm de diâmetro e são imunogênicos. As bactérias inteiras possuem 1-10 pm de diâmetro e também são imunogênicas. Uma massa pequena de bactérias pode possuir aproximadamente 100 pm de diâmetro. Em modalidades particulares, um complexo de antígeno/proteína transportadora em uma composição para vacina, de forma desejável, possui entre 100 nm e 10 pm de diâmetro. Este complexo pode ser solúvel ou insolúvel.

A invenção é descrita aqui abaixo com referência aos exemplos específicos, às modalidades e às figuras, cuja finalidade é ilustrar a invenção ao invés de limitar seu âmbito. Os exemplos a seguir não devem ser interpretados como limitantes.

EXEMPLOS

Exemplo 1. Preparações para vacina e de controle.

O ácido poli-gama-D-glutâmico (PGA) capsular foi obtido na Vedan (Taiwan) ou purificado através do método de Rhie e outros (Proc. Natl. Acad. Sei. USA 100:10925-10930, 2003). O mutante negativo dominante (DNI) é uma forma mutada do antígeno protetor (PA) de B. anthracis e foi produzido partindo de Escheríchia coli através do método de Benson e outros (Biochemistry 37:3941-3948, 1998). O PGA e a proteína DNI foram submetidos exaustivamente à diálise contra tampão fosfato de sódio a 0,05 M pH 7,4 (SP7,4) antes do uso. A solução estoque de DNI continha 30 mg/mL. A solução estoque de PGA continha 134 mg/mL. O glutaraldeído ligante foi obtido na Pierce na forma de uma solução estoque a 25%. As vacinas de matriz de proteína capsular (PCMVs) e os controles foram montados em reações de acordo com a Tabela 1.

Tabela 1. Montagem das reações para a produção das preparações 1-3 de PCMV e os controles 4 e 5

Reação #	DNI	PGA	dH2O 25% de glutaraldeído
	mL	mL	mL	mL	Nome
1	20	1	3	0,8	PCMV1
2	12	4	8	0,8	PCMV2
5 3	16	2	6	0,8	PCMV3
4	16	2	6	0	controle de P+C
5	16	0	8	0,8	control de apenas P
	As	cinco reações	foram	montadas à temperatura ambiente

(22°C) sem glutaraldeído. Em T=0, 0,1 mL de 25% de glutaraldeído (G25) foram adicionados nas reações indicadas. A cada 30 segundos depois disso, mais 0,1 mL de G25 foi adicionado e isto foi repetido até que cada reação indicada recebesse 0,8 mL de G25 no total. A reticulação das moléculas de DNI pelas moléculas de glutaraldeído bifuncionais podia ser observada de forma macroscópica através da produção de graus variáveis de turvação e 15 partículas similares a gel insolúveis na ordem a seguir: maior turvação e formação de gel, reações 1>2>3>4, com a reação 5 permanecendo totalmente translúcida e solúvel. Após 1 hora, 2 mL de boro-hidreto de sódio a 1 M em tampão borato de sódio a 0,5 M pH 9,3 (SBH) foram adicionados em todas as seis reações para reduzir as bases de Schiff formadas entre as ca20 deias laterais de amino das moléculas de DNI e as moléculas de glutaraldeído bifuncionais. O agente antiespumante de silicone (0,01 mL) foi adicionado em cada reação para controlar a formação de espuma durante esta reação. As reações foram armazenadas a 4°C durante 72 horas. Todas as reações foram então exaustivamente submetidas à diálise contra SP7.4, durante 48 horas. O material insolúvel foi removido através da centrifugação dos produtos finais e armazenado a 4°C até o uso.

Um conjugado convencional entre a albumina de soro bovino (BSA) e o PGA foi sintetizado através do acoplamento dos grupos amino de BSA com os grupos carboxila de PGA utilizando a carbodi-imida solúvel em 30 água, EDAC (1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodi-imida), como a seguir: 5 mL de 30 mg/mL de BSA em água foram misturados com 1 mL de 134 mg/mL de PGA em NP7,5. 50 mg de EDAC foram adicionados e foi permiti do que a reação ocorresse à RT durante 3 horas. A reação foi submetida à diálise a 4°C durante 18 horas contra SP7,4 contendo glicina a 1 mM para bloquear os grupos ativados e então a 4°C durante 24 horas contra apenas

SP7,4. O produto final é referido como o conjugado PGA-BSA.

Após a síntese e a diálise das preparações de PCMV e de controle, a condição molecular da proteína DNI foi verificada para confirmar que o glutaraldeído realmente se ligou de forma cruzada molecularmente com a proteína na presença ou na ausência de várias quantidades de PGA. As preparações de PCMV e de controle foram monitoradas em relação à tal li10 gação cruzada através de eletroforese em gel de SDS (dodecil sulfato de sódio) poliacrilamida e Western blotting com antissoro anti-PA. Como mostrado na Figura 2, a proteína DNI migra em 84 kDa antes da ligação cruzada com o glutaraldeído. As PCVM1-PCMV3 (faixas 1-3) exibem reticulação extensiva da proteína DNI que é evidenciada pela migração de bandas em 15 massas moleculares maiores que 220 kDa. A proteína DNI isoladamente que sofreu ligação cruzada na ausência de PGA também exibe a mesma espécie de peso molecular alto (faixa 5). Em contraste, a DNI misturada com o PGA, mas não tratada com o glutaraldeído exibe bandas que co-migram com a DNI ou espécies de peso molecular menor (faixa 4). Assim, a preparação de 20 PGA da Vedan (Taiwan) parecia estar contaminada com uma protease ativa contra a DNI. As amostras de PGA da Vedan corridas na faixa 6, entretanto, não exibiam níveis altos de proteínas contaminantes que reagiram com o antissoro anti-PA, sugerindo que as bandas observadas eram produtos derivados da DNI das várias reações.

Em adição, o PGA e um ou mais PS de pneumococos como antígenos são utilizados para explorar o fato de que a FLA (flagelina de Vibrío cholerae) é uma proteína transportadora melhor que a DNI no contexto das PCMVs. O efeito da proteína transportadora é avaliado através da medida do nível de IgG direcionada contra PGA e PSs atingido pela imunização com 30 estas várias PCMVs assim como de sua potência com uma base no peso da proteína.

As PCMVs também podem ser produzidas através de um proce53 dimento que reticula os grupos amino com os grupos carbóxi diretamente sem o uso de um agente de reticulação bifuncional. Em particular, as PCMVs podem ser produzidas através da reticulação dos grupos amino e carboxila das proteínas transportadoras utilizando a química da carbodi5 imida. Esta química forma ligações peptídicas entre grupos amino primários das cadeias laterais de lisina e os grupos carboxila das cadeias laterais de aspartato e glutamato. Embora os grupos amino estejam em sua maior parte bloqueados nos toxoides tratados com formalina, a formalina não reage com os grupos carboxila de forma alguma. Assim, a química da carbodi-imida 10 pode ser útil na produção de PCMVs utilizando toxoides com formalina que podem resistir à reticulação com o glutaraldeído. A reticulação é facilmente detectada através de SDS-PAGE. A presença de manchas de proteínas de alto peso molecular que dependem da adição de um agente de reticulação como o glutaraldeído é indicativa da reticulação.

Tabela 2. Reticulação de proteínas transportadoras determinada através da análise de SDS-PAGE.

Glutaraldeído Não Sim Sim Sim Sim

Polímero Capsular- PGA - PGA+PGA +PS 6B +PS 23F

BSA		+	+	+	+
Toxina da Difteria		+	+	n.d.	n.d.
Toxoide da Difteria				n.d.	n.d.
Toxoide Tetânico		+	+	n.d.	n.d.

os sinais + indicam que a reticulação foi detectada por SDS-PAGE, os sinais

- indicam que a migração da proteína era inalterada daquela observada no controle sem glutaraldeído. n.d. - não determinado (ensaio não realizado).

Para os experimentos mostrados na Tabela 2, foram realizadas reações de 200 microlitros em HEPES a 50 mM pH 7,5 e incubadas à tem20 peratura ambiente durante 2 horas. As reações foram extinguidas com borohidreto de sódio a 120 mM. O glutaraldeído foi adicionado a 64 mM, a albumina de soro bovino (BSA) foi utilizada a 15 mg/mL, a toxina da difteria, o toxoide da difteria e o toxoide tetânico foram utilizados a aproximadamente 5 mg/mL, o PGA foi adicionado a 13,4 mg/mL, os pneumo PS dos tipos 6B e 23F foram adicionados a 4 mg/mL.

Como mostrado na Tabela 2, parte das proteínas tratadas com formalina (por exemplo, o toxoide da difteria) não sofreram boa reticulação com o glutaraldeído e, portanto, requerem outra química de reticulação para uso na preparação de PCMV. Outras, como o toxoide tetânico, podem sofrer reticulação com o glutaraldeído, mas não até a mesma extensão que as proteínas não modificadas tais como a toxina da difteria e a albumina de soro bovino.

Exemplo 2. Imunização e análise de respostas imunológicas anti-DNI e antiPGA.

Os produtos solúveis das 5 reações descritas na Tabela 1 foram ajustados na mesma concentração de proteína com base em sua absorbância em 280 nm. Camundongos BALB/c de aproximadamente 5-7 semanas de idade de Charles River foram utilizados em todos os estudos de imunização descritos na Figura 2. Os camundongos foram imunizados com as vacinas PCMV 1-3 e os controles de preparação de antígeno 4 e 5 em uma dose de 20 μg de proteína DNI através de injeção intraperitoneal no dia 0. Foi tirado o sangue de todos os camundongos no 7^S dia e então receberam reforço com as doses da mesma magnitude das preparações de antígeno no 10dia. Foi novamente tirado o sangue dos camundongos no 17^S dia e então receberam novamente reforço no 20^s dia. Foi tirado novamente o sangue dos camundongos no 30^s dia em cujo momento estes foram sacrificados. O soro das amostras de sangue foi coletado após ter ocorrido a coagulação e armazenado a -20°C. O ensaio imunoabsorvente ligado à enzima (ELISA) foi utilizado para analisar o nível de anticorpos no soro anti-PGA e anti-DNI. Sucintamente, placas para microtitulação Immulon 2HB ELISA (VWR) foram revestidas com BSA-PGA ou DNI em tampão carbonato de sódio a 0,1 M, pH 9,6 a 0,5 pg/poço em um volume de 100 pL/poço. Após a incubação durante a noite a 4°C, as placas revestidas com antígeno foram bloqueadas através da incubação com 3% de BSA (p/v) em TBS-0,1% de Tween (TBST) durante 1 hora à temperatura ambiente ou durante a noite a 4°C. As amos tras de soro agrupadas partindo dos grupos de quatro camundongos de cada ponto de tempo pós-reforço foram diluídas sucessivamente em TBST e adicionadas nas placas revestidas com antígeno e incubadas durante pelo menos 1 hora. As respostas de anticorpos anti-DNI e anti-PGA foram determinadas utilizando antissoro de coelho contra IgG ou IgM de camundongo conjugada com fosfatase alcalina (Zymed). O substrato fosfato de pnitrofenila (PNPP) foi adicionado em cada poço e a absorbância em 405 nm foi determinada espectrofotometricamente para cada reação. Os dados são relatados na forma do título de ponto final recíproco, definido como a diluição máxima para a obtenção de uma leitura de DO405 que é dois desvios padrões acima daquela do controle negativo.

Os ensaios de ELISA foram utilizados para medir as respostas imunológicas anti-DNI e anti-PGA específicas à IgM e à IgG em camundongos imunizados com as três preparações de PCMV 1-3 e as duas preparações de controle de antígeno 4 e 5 (Figuras 3-5). Como mostrado na Figura 3, a proteína DNI era altamente imunogênica em todas as preparações exceto na preparação de controle 4 que não sofria reticulação com o glutaraldeído (sem glut).

Entretanto, estas respostas imunológicas específicas à DNI eram exclusivamente baseadas na IgG. Embora nenhuma IgM anti-DNI fosse detectada mesmo no 7- dia da imunização, uma resposta de IgG anti-DNI significativa podia ser detectada nos camundongos imunizados com preparações de PCMV no 17^a dia e nos imunizados com apenas a DNI reticulada (preparação 5). Uma resposta de reforço forte foi observada contra DNI no 30^a dia com todas as preparações incluindo a preparação 4.

As respostas de IgM anti-PGA exibiram um padrão que era típico de um polímero capsular (Figura 4). A preparação de controle 4 gerou uma resposta de IgM anti-PGA detectável no 7^a dia, mas esta resposta não sofreu reforço no 17^a ou no 30^a dia. Todas as preparações de PCMV induziram uma resposta de IgM anti-PGA no 7^a dia e então geraram exclusivamente respostas de IgG anti-PGA ainda mais fortes nos 17^a e 30^a dias. Como esperado, a preparação de controle 5 (somente DNI reticulada) não gerou uma resposta anti-PGA baseada em IgM ou em IgG. Em contraste notável, as PCMV1-3 (preparações 1-3) geraram fortes respostas anti-PGA baseadas em IgG que eram evidentes no 17^a dia e então claramente reforçadas no 30^a dia (Figura 5). As respostas anti-PGA baseadas em IgG observadas para PCMV1-3 eram claramente similares às respostas relatadas para PGA observadas para uma vacina com conjugado PGA-DNI convencional como relatado por Aulinger e outros (Infect. Immun. 73:3408-3414, 2005) e para uma vacina com conjugado PA-PGA descrita por Rhie e outros (Proc. Natl. Acad. Sei. USA 100:10925-10930, 2003). Assim, todas as vacinas de PCMV #1, #2 e #3 tiveram um desempenho tão bom quanto as vacinas de PGA conjugado convencionais através da indução de respostas de IgG para PGA capsular, um antígeno protetor independente de T conhecido de B. anthracis (Wang e outros, Infect. Immun. 72:5460-5463, 2004). A preparação do controle 5 que continha DNI (não-reticulada) misturada com PGA não induziu IgG detectável contra PGA indicando que a DNI não atua como um ligante de TLR na estimulação de respostas anti-PGA de IgG nas preparações de PCMV 1-3. Este resultado também confirma as observações na literatura de que o PGA é um agente imunogênico independente de células T de baixa imunogenicidade a não ser que esteja acoplado à proteína através de ligações covalentes (Rhie e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 100:10925-10930, 2003). O método de PCMV aparentemente converte o PGA em um agente imunogênico dependente de células T apesar do fato de que o método não resulta na reticulação da proteína DNI diretamente com as moléculas de PGA.

Estes dados confirmam que o método de PCMV pode produzir agentes imunogênicos com propriedades similares às da vacina conjugada convencional. A PCMV com PGA foi facilmente produzida utilizando os métodos descritos aqui e foi observado que induz respostas imunológicas típicas de vacinas conjugadas PGA-proteína. As reações em pequena escala detalhadas na Tabela 1 produziram PCMV suficiente para imunizar 1000 camundongos com base no esquema de dosagem descrito na Figura 3. Os presentes dados confirmam que a PCMV produzida partindo de PGA e DNI pode ser utilizada como uma vacina para proteger contra antraz causado por

Bacillus anthracis.

Exemplo 3. Produção e Caracterização de PCMVs Adicionais.

A tecnologia de PCMV pode ser aplicada aos antígenos capsulares de várias estruturas e cargas iônicas. 23 tipos de PSs de Streptococcus pneumonia foram obtidos na American Type Culture Collection (ATCC) e são produzidos pela Merck, Inc. Estes PS variam amplamente em relação a sua estrutura molecular e incluem PSs que são fortemente aniônicos, parcialmente catiônicos, possuem carga neutra, fosforilados, lineares, possuem estruturas ramificadas e são modificados de várias outras maneiras. Em experimentos preliminares, um subconjunto destes PS que correspondem a sete tipos capsulares no produto Prevnar da Wyeth (4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F e 23F) foi analisado em relação a sua capacidade de induzir a produção de IL-6 por macrófagos de camundongo. O PS do tipo 4 era ativo neste ensaio; o lipopolissacarídeo (LPS) era o controle para um agonista de TLR. Outros PSs (por exemplo, do tipo 3), o PGA e o PS do antígeno O de F. tularensis assim como uma vacina de PCMV produzida partindo de PGA-DNI e um controle não-reticulado também foram analisados. Este experimento mostrou que o PS de pneumococos do Tipo 3 e até uma menor extensão o PGA, também estavam contaminados com um agonista de TLR. O PS de F. tularensis e a PCMV estavam comparativamente limpos no ensaio. A extração com fenol e a precipitação com etanol podiam limpar (remover os agonistas de TLR desconhecidos residuais) o PS do tipo 3 de S. pneumoniae após dois tratamentos consecutivos. Consequentemente, foi observado que seis PSs de S. pneumoniae e o PS do antígeno O de F. tularensis estavam limpos para a produção de IL6 e estes foram explorados nos experimentos descritos aqui.

As PCMVs para os sete PS observados como estando limpos para a produção de IL6 foram sintetizadas utilizando DNI como a proteína transportadora através de um método análogo ao descrito no Exemplo 1. Os ensaios de imunogenicidade preliminares sugerem que todas as sete PCMVs eram imunogênicas em graus variáveis. Foi observado que uma PCMV monovalente baseada na DNI para PS14 de S. pneumoniae (1458

PCMV) induzia altos títulos de IgG anti-PPS14 que aumentavam significativamente após a terceira imunização. De forma notável, a mesma resposta imunológica foi observada quando a 14-PCMV foi misturada com as outras seis PCMVs para produzir um agente imunogênico em coquetel. Uma vez 5 que a Prevnar® é uma vacina com adjuvante absorvida com alúmen, foi determinado se o coquetel de PCMV hexavalente também pode ser absorvido ao adjuvante de alúmen. Os resultados de um imunoensaio que mede qualitativamente a quantidade de PS de S. pneumoniae absorvida ao alúmen após a exposição à PCMV ou a uma mistura de controle dos mesmos 10 PSs misturados com a proteína DNI, mas não-reticulada ao glutaraldeído mostraram que muito mais PS se absorveram ao alúmen no contexto de uma PCMV que o controle (PS + proteína DNI não-reticulada) (como indicado pelo nível maior de imunorreatividade para a PCMV que é diluída adicionalmente no imunoensaio).

A imunização de camundongos foi utilizada para avaliar a imunogenicidade da PCMV heptavalente com ou sem absorção ao adjuvante alúmen. O adjuvante alúmen aumentou a cinética da resposta imunológica ao PS14, induzindo IgG contra este PS 7 dias mais cedo que a vacina sem adjuvante. Entretanto, a PCMV heptavalente era mais imunogênica na au20 sência de alúmen que a combinação de controle PS+DNI não-reticulada na presença de alúmen. Este resultado confirma que o procedimento de PCMV torna os PSs mais imunogênicos aos camundongos e confirma que o procedimento de PCMV pode ser utilizado para produzir coquetéis de antígenos que têm desempenho imunológico como os coquetéis de vacinas conjuga25 das.

Em experimentos adicionais a extração com fenol e a precipitação com etanol são utilizadas para remover os agonistas de TLR contaminantes das 23 preparações comerciais de polissacarídeo de pneumococos. A remoção dos contaminantes é confirmada através do teste dos PSs trata30 dos em relação à indução de IL-6 pelos macrófagos peritoneais através de métodos padronizados. Os PSs que são desprovidos de atividade de indução de IL-6 são utilizados para a produção de PCMV. Outros polissacarídeos que são utilizados nas PCMVs incluem um PS do antígeno O purificado de F. tularensis e a cápsula de PGA de B. anthracis. É verificado um total de 25 tipos capsulares (23 tipos de pneumococos e um cada dos tipos tularemia e antraz). Cada um dos 25 tipos capsulares é utilizado para produzir uma 5 PCMV utilizando a proteína DNI, essencialmente através do método descrito no Exemplo 1. Uma proporção de um para um de PS em relação à proteína é utilizada (aproximadamente 1:1 em peso seco) para estas preparações de PCMV iniciais. Cada preparação é caracterizada por SDS-PAGE em relação à evidência de reticulação de proteína que se correlacionou perfeitamente 10 com a imunogenicidade de várias preparações de PCMV nos experimentos preliminares. Para alguns tipos capsulares (por exemplo, 6B e 23F), outras proteínas transportadoras são utilizadas para produzir PCMVs. Para estes mesmos tipos capsulares (por exemplo, 6B e 23F), pode ser utilizada uma química de reticulação alternativa. Todas as preparações de PCMV que exi15 bem evidência de reticulação de proteína (por exemplo, em SDS-PAGE), são testadas em relação a sua imunogenicidade.

Por exemplo, dez PCMVs diferentes utilizando cinco proteínas de matriz diferentes e dois antígenos diferentes são produzidas como a seguir. A seleção das cinco proteínas de matriz se baseia no seu uso atual em 20 vacinas licenciadas pela FDA ou outras propriedades que as permitam servir como traçadores para medir a estabilidade das preparações de PCMV. São utilizadas as proteínas de matriz a seguir (1) subunidade B da toxina da cólera (disponível na SBL Vaccin AB), (2) toxina da difteria, (3) Fragmento C da toxina tetânica, Frag C (disponível na Sigma Aldrich), (4) DNI e (5) beta25 galactosidase de Escheríchia coli (disponível na Sigma Aldrich). Como antígenos capsulares são utilizados o ácido poli-D-glutâmico de Bacillus anthracis e a cápsula do tipo 14 de Streptococcus pneumoniae (Suarez e outros, Appl. Environ. Micobiol. 67:969-971, 2001). Ambos estes antígenos capsulares são altamente imunogênicos quando utilizados com a DNI como uma 30 proteína de matriz nas PCMVs correspondentes. Cada antígeno da cápsula é combinado com cada uma das cinco proteínas de matriz selecionadas para produzir 10 PCMVs distintas.

As PCMVs podem ser testadas em relação a sua capacidade de induzir, em camundongos, a alteração do isotipo de anticorpo para IgG como é observado nas vacinas conjugadas convencionais. Todos os antígenos podem ser absorvidos ao alúmen e então tipicamente grupos de 5 camundongos por preparação de PCMV são utilizados. Os camundongos sofrem um pré-sangramento para a obtenção de respostas imunológicas de linha de base para os antígenos de teste. Os camundongos são então imunizados três vezes (nos dias 0, 7, 14) através do protocolo padronizado de injeção IP e o sangue é coletado nos dias 10, 20, 30 e 60 após a imunização primária. Os soros dos camundongos são analisados através de ensaio de ELISA padronizado para IgG contra o PS e as proteínas transportadoras utilizados. Nestes experimentos, os grupos de controle de camundongos imunizados apenas com PS são incluídos para avaliar a capacidade de várias preparações de PCMV para induzir a IgG anti-PS comparadas com o PS nãoconjugado que deve ser fracamente ou não imunogênico. As PCMVs promissoras (isto é, as PCMVs que induzem altos níveis de IgG contra PSs) sofrem análise imunológica mais cuidadosa que busca estabelecer a cinética e os aspectos de resposta à dose da resposta imunológica à PCMV em camundongos.

Alternativamente, as PCMVs promissoras e seus controles correspondentes podem ser enviados para empresas comerciais para a produção de antissoro de coelho. Ensaios imunológicos similares são realizados para avaliar a imunogenicidade, a classe do anticorpo induzio e a cinética da resposta imunológica em coelhos. Nestes experimentos, o controle é o produto comercial Prevnar® que é uma mistura absorvida em alúmen de 7 vacinas de PS conjugadas convencionais diferentes acopladas à CRM197, a proteína mutante não-tóxica relacionada à toxina da difteria.

A funcionalidade das respostas de anticorpo induzidas com as PCMVs pode ser avaliada. Por exemplo, a funcionalidade pode ser avaliada através da medida da capacidade do anticorpo anti-PS de opsonizar S. pneumococcus encapsulado e levar à morte da bactéria após a fagocitose pelos macrófagos. A proteção de animais do desafio letal com S. pneumo coccus é uma outra maneira de demonstrar a eficiência da vacina em animais imunizados com PCMV.

Exemplo 4. Comparação das PCMVs à Prevnar®

A pureza relativa dos polissacarídeos (pps) de S. pneumoniae

6B, 14 e 23F obtidos na ATCC através da Merck ou diretamente no Serum

Institute of India (S11) foi determinada. A expressão de IL-6 foi utilizada como um indicador da pureza de um pps e o LPS foi utilizado como um controle sujo positivo. Como mostrado na Figura 9A, os pps 6B, 14 e 23F da Merck são limpos, embora, como mostrado na Figura 9B, o pps 6B do Sll é sujo.

Como mostrado na Figura 10, o tratamento 2 (incubação de uma hora a 80°C em NaOH a 1 M) limpa o pps 6B do Sll. O pps 6B limpo é utilizado para a comparação das propriedades imunológicas do conjugado e da PCMV. Como mostrado na Tabela 3, o contaminante não é o LPS.

Tabela 3. Ensaio para os Níveis de Endotoxina dos Polissacarídeos

Polissacarídeos	Unidades de Endotoxina/mg de Polissacarídeo
pps 6B do Sll - sem tratamento	0,75
pps 23F do Sll - sem tratamento	0,85
pps 23F do Sll - tratamento 2	0,24
vários pps da Merck - sem tratamento	0,1 -0,4

As Figuras 11 e 13 mostram que a Prevnar® (que contém o adjuvante alúmen) induz anticorpos IgG contra o pps 6B e que a resposta de IgG proveniente das PCMVs que contêm o adjuvante alúmen (BSA e pps 6B; Toxina da difteria e pps 6B; Toxoide da difteria e pps 6B; e Toxoide tetâ20 nico e pps 6B) é melhor que a observada com a Prevnar®. Similarmente, como mostrado na Figura 12, a resposta de IgM às PCMVs que contêm o adjuvante alúmen é similar à observada para a Prevnar®.

Em adição, para o pps 14 (o pps mais imunogênico na Prevnar®), como mostrado nas Figuras 14-16, as PCMVs que contêm o adjuvan25 te alúmen contendo o Toxoide da difteria e o pps 14 ou o Toxoide tetânico e o pps 14, são aproximadamente equivalentes à Prevnar® na indução de uma resposta de IgG.

Exemplo 5. PCMVs Multivalentes.

Os agentes imunogênicos multivalentes foram produzidos utilizando o método de PCMV através da mistura de polímeros orgânicos capsulares quimicamente diferentes juntos antes da reticulação da proteína DNI transportadora com o glutaraldeído (reação de síntese em um único recipiente). Os agentes imunogênicos trivalentes deste tipo foram produzidos partindo de três polímeros orgânicos - PGA, alginato e dextran - utilizando a DNI como o carreador. Estas vacinas trivalentes eram imunogênicas e geraram respostas imunológicas contra os três polímeros orgânicos capsulares como mostrado pela IgM do soro agrupado analisada antes da imunização e após 30 dias (Figura 6), pelo título de anticorpo IgG no soro específico ao antígeno 60 após a imunização (Figura 7) e pelo título de anticorpo no soro anti-PS 128 dias após a imunização (Figura 8). Como também é mostrado nas Figuras 6-8, as preparações de PCMV com alginato monovalentes também geraram uma resposta imunológica em camundongos. Os agentes imunogênicos da PCMV multivalente também podem ser formulados através da mistura de PCMVs específicas que são sintetizadas separadamente e então misturadas juntas no final para produzir uma vacina em coquetel.

Todas as patentes, os pedidos de patentes, as publicações de pedidos de patentes e outras publicações citados ou referidos neste relatório descritivo são incorporados aqui como referência até a mesma extensão como se cada patente, pedido de patente, publicação de pedido de patente ou publicação individual fosse especificamente e individualmente indicada como sendo incorporada aqui como referência.

Claims (12)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Método de produção de uma composição para vacina, caracterizado pelo fato de que compreende um antígeno que está aprisionado com uma proteína transportadora de matriz e está associado de forma não covalente com a dita proteína de matriz compreendendo (i) misturar um antígeno de interesse selecionado a partir do grupo consistindo em um polissacarídeo, um poliálcool, em que o poliálcool é uma forma hidrogenada de um carboidrato onde um grupo carbonila foi reduzido a um grupo hidroxila primário ou secundário, e um homopolímero de poli aminoácido com uma proteína transportadora e (ii) adição de um ligante que reticula a dita proteína transportadora via grupos sulfidrila, amino ou carboxila das moléculas de proteína transportadora e (iii) reticulação da dita proteína transportadora para formar uma matriz de proteína transportadora.
2. 2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a dita composição para vacina ainda compreende um excipiente farmaceuticamente aceitável.
3. 3. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a proporção molar do dito antígeno em relação à dita proteína transportadora fica entre 1 até 10 e 10 até 1 na dita composição para vacina.
4. 4. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a dita proteína transportadora é um multímero, em particular em que o dito multímero compreende pelo menos 5 subunidades, ou em que o dito multímero é um homomultímero.
5. 5. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende reduzir uma base de Schiff na dita proteína transportadora.
6. 6. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a dita proteína transportadora é reticulada covalentemente a pelo menos uma outra proteína transportadora, em particular em que a dita reticulação covalente compreende uma ligação peptídica entre um grupo amino primário de uma cadeia lateral de lisina e um grupo carbóxi de uma cadeia lateral de aspartato ou de glutamato, ou em que a dita reticulação

   Petição 870180147694, de 05/11/2018, pág. 12/20

   2 covalente compreende um agente de reticulação bifuncional, mais particularmente em que o dito agente de reticulação bifuncional é glutaraldeído, bis[sulfossuccinimidil]suberato ou adipimidato de dimetila.
7. 7. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo

   CHO p I __ Q|_| Q I fato de que o dito agente é um composto da fórmula ⁿ , em que R_n é uma alquila linear ou ramificada de 1 até 12 átomos de carbono, uma heteroalquila linear ou ramificada de 1 até 12 átomos, um alceno linear ou ramificado de 2 até 12 átomos de carbono, um alcino linear ou ramificado de 2 até 12 átomos de carbono, um resíduo aromático de 5 até 10 átomos de carbono, um sistema cíclico de 3 até 10 átomos, -(CH2CH2O)_qCH2CH2- em que q é 1 a 4, ou em que o dito agente é glutaraldeído, éster de mmaleimidobenzoil-N-hidroxissuccinimida, carbodi-imida ou benzidina bisbiazotizada.
8. 8. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a dita proteína transportadora é toxina da difteria ou um mutante da mesma, toxoide da difteria, toxina tetânica ou um mutante da mesma, toxoide tetânico, exotoxina A de Pseudomonas aeruginosa ou um mutante da mesma, subunidade B da toxina do cólera, fragmento C da toxina tetânica, flagelina bacteriana, pneumolisina, listeriolisina O, uma proteína de membrana externa de Neisseria menningitidis, proteína Hcp1 de Pseudomonas aeruginosa, enterotoxina termolábil de Escherichia coli, toxina similar de shiga, proteína LTB humana, um extrato de proteína de células bacterianas inteiras, o mutante negativo dominante (DNI) do antígeno protetor de Bacillus anthracis ou beta-galactosidase de Escherichia coli, particularmente em que as ditas células inteiras bacterianas são células de Pseudomonas aeruginosa ou de Streptococcus, ou em que a dita flagelina bacteriana é a proteína flagelina de Vibrio cholerae.
9. 9. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a dita toxina similar de shiga é a proteína SltB2 de Shigella.
10. 10. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o dito polissacarídeo compreende pelo menos 18 resíduos, ou

    Petição 870180147694, de 05/11/2018, pág. 13/20 em que o dito polissacarídeo é um polissacarídeo de Streptococcus pneumoniae, polissacarídeo de Francisella tularensis, polissacarídeo de Bacillus anthracis, polissacarídeo de Haemophilus influenzae, polissacarídeo de Salmonella typhi, polissacarídeos de espécies de Shigella, polissacarídeos de espécies de Salmonella ou polissacarídeo de Neisseria meningitidis, ainda mais particularmente em que o dito polissacarídeo de Streptococcus pneumoniae é do tipo capsular 3, 4, 6B, 7A, 7B, 7C, 7F, 9A, 9L, 9N, 9V, 12A, 12B, 12F, 14, 15A, 15B, 15C, 15F, 17, 18B, 18C, 19F, 23F, 25A, 25F, 33F, 35, 37, 38, 44 ou 46, ou em que o dito polissacarídeo de Francisella tularensis é o antígeno O.
11. 11. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o homopolímero de poli aminoácido é um polímero capsular microbiano, particularmente em que o dito polímero capsular microbiano é ácido poli-gama-D-glutâmico de Bacillus anthracis.
12. 12. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda um segundo antígeno de interesse, particularmente compreende ainda um terceiro antígeno de interesse.

    Petição 870180147694, de 05/11/2018, pág. 14/20

    1/16

    FIG. 1

    Antígenos Conjugados <

    á l

    | ligado à proteína do toxoide tetânico

    À céluía B se liga ao epítopo de polissacarídeo bacteriano

    Ce u a B

    2/16

    FIG. 2

    Análise de Western blot de anti-PA de Preparações de vacina

    MW DNI 1 2 3 4 5 6

    Amostras

    1. DNI+PGA (PCMV1)

    2. DNI+PGA (PCMV2)

    3. DNI+PGA (PCMV3)

    4. DNI + PGA sem controle de glutaraldeído

    5. DNI apenas com controle de glutaraldeído

    6. PGA

    3/16

    FIG. 3

    IgM e IgG do Soro anti-DNI Agrupado

    35000

    Título de Ponto Final

    5000 4

    30000 *

    Grupos

    25000

    20000

    15000

    10000

    IgG anti-DNI ern 30 dias

    IgM anti-DNI IgM anti-DNI IgM anti-DNI IgMantl-DNI IgG anti-DNI IgG anti-DNI igGantl-DNI pré-imunização em 7 dias em 20 dias em 30 dias pré-imunização em 7 dias _em 20 dias

    1. DNI+PGA (PCMV1) 9 2. DNI+PGA (PCMV2) B 3. DNI+PGA (PCMV3) 4. DNI + PGA sem controle de glutaraldeído B 5. DNI apenas com controle de glutaraldeído BI

    4/16

    FIG. 4

    IgM do Soro anti-PGA Agrupado

    Título de Ponto Final

    5/16

    FIG. 5

    IgG do Soro anti-PGA Agrupado

    Título de Ponto Final

    Grupos

    1. DNI+PGA (PCMV1)

    2. DNI+PGA (PCMV2)

    3. DNI+PGA (PCMV3)

    4. DNI + PGA sem controle de glutaraldeído®

    5. DNI apenas com controle de glutaraldeído anti-PGA IgG anti-PGA IgG anti-PGA IgG anti-PGA em 17 dias em 30 dias

    6/16

    Respostas imunológicas de preparações de PCMV Monovalentes alginato e Trivalentes “um único recipiente” (Alginato, Dextran, PGA) leuij oiuod ap oinjji <o

    O

    Li7/16

    Respostas imunológicas de preparações de PCMV Monovalentes alginato e Trivalentes “um único recipiente” (Alginato, Dextran, PGA)

    IgG anti-PGA IgG anti-ALG IgG anti-DEX

    8/16

    Respostas imunológicas de preparações de PCMV Monovalentes alginato e Trivalentes “um único recipiente” (Alginato, Dextran, PGA) z Q

    Z O leuy ojuod ep o|njii

    IgG anti-PGA em 128 dias IgG anti-ALG em 128 dias *9θ anti-DEX em 128 dias

    9/16

    PPS da Merck PPS do Sll