CN114129719A - 广谱疫苗的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种广谱疫苗的制备方法，包括以下步骤：将交联剂与病原体结合；或者将交联剂与来自病原体的重组蛋白接触，并让它们形成新的蛋白质内部共价键；若是采用的病原体，则需要进行灭活，再去除未与蛋白质结合的交联剂，若是采用的来自病原体的重组蛋白，则直接去除未与蛋白质结合的交联剂；分离交联剂修饰后的病原体或重组蛋白；并将交联剂修饰后的病原体或重组蛋白与佐剂结合即得到广谱疫苗。本发明在B细胞在生发中心的成熟和超突变期间，让滤泡树突细胞呈现稳定原生态结构的抗原给生发中心的B细胞。从而让生发中心的B细胞有充足的时间在生发中心里反复循环突变，最后产生与原始抗原有高亲和力的广谱免疫球蛋白G抗体。

Description

广谱疫苗的制备方法
技术领域
本发明属于生物药品技术领域，具体涉及一种广谱疫苗的制备方法。
背景技术
从最近两个世纪的记录来看，流感疫情给人类带来了灾难。1918年的流行病造成了约5亿人的感染，并在世界范围内造成了约5千万到1亿人的死亡。
在美国，现期的流感疫苗每年花费约25至30亿美元，预计在2025年将达到约50亿美元。虽然针对流感也研发了相应的流感疫苗，然而，由于这些疫苗的局限性，它们只有约50％的效力。在这方面，美国每年用于治疗流感感染者的直接医疗费用可达到约104亿美元，每年的间接费用约为870亿美元。世界范围内的成本可能高达这些数值的10倍。迫切需要开发一种普遍和持久的流感疫苗，以及针对其他病原体的疫苗。
流感疫苗的研发的一个主要的挑战是，流感病毒的快速变化使得在不同的流感病毒株之间很难找到一个共同的抗原(可用于广谱疫苗的抗原)。例如，甲(A)型流感病毒株有18个H亚型和11个N亚型，共有18x11种不同的组合。而即使是特定的组合，如H1N1，也会随着时间和地点的变化而迅速改变(或变异)。乙(B)型流感也有类似的问题，虽然没有甲型流感那么多。甲型和乙型流感菌株是每年在人类中引起流行的主要病原体，这一点已经非常明确。
现代RNA和DNA测序技术的使用导致了大量的病毒被测序，包括甲型流感病毒和乙型流感病毒。根据序列比较，这些病毒上的某些部分的抗原是相当保守的，并且随着时间的推移变化缓慢。例如，Peter Palese博士的研究小组发现，来自血凝素亚单位2蛋白(HA20)的一个片段在大多数常见的流感病毒中是保守的结构域，基于这个结构域可以在小鼠中引发广义中和抗体的产生，并对结构不同的H3N2、H1N1和H5N1亚型的流感病毒提供保护(Steel et al.,2010)。在某些情况下，从一些病人身上发现了广谱的中和抗体，如nAb12D1。这些结果表明，开发一种普遍和持久的流感疫苗既有理论基础也有实际基础。然而，至少还有两个问题。1)如何有效地发现和稳定地保存共同抗原；2)如何将这些共同抗原免疫宿主(哺乳动物，包括人、牛、猪、鸟等)。
制备疫苗的最传统方法主要包括三种：
第一种方法是使用被杀死的病毒(死病毒)。从理论上讲，这种方法应该保留所有病毒的抗原。
第二种方法是使用减弱的病毒作为疫苗，也应保留抗原。
第三种方法是使用在病毒表面表达的重组蛋白质或肽作为抗原。从理论上讲，当受试者被病毒感染时，受试者应该接触到所有病毒的抗原，并对其产生免疫力。
但是上述这三种方法所产生的保护(对随后的挑战)都是不完整的。具体来说，它们不能导致产生广泛的中和抗体。
树突状细胞(DC)、B细胞和巨噬细胞被称为抗原呈递细胞(APCs)。免疫球蛋白G(IgG)家族的蛋白质是最重要的中和抗体。根据现有理论，免疫球蛋白G的产生需要T细胞、B细胞和滤泡树突状细胞(FDC)的协调。树突状细胞(DC)首先将抗原(在树突状细胞内从病毒中消化的肽)呈现给T细胞区的原始T细胞，这些T细胞将移动到B细胞区成为滤泡T细胞(Tfh)。滤泡T辅助细胞(CD4细胞)与呈现病毒抗原的生发中心(Germinalcenter，GC)B细胞相互作用，触发Tfh细胞产生IL-21，这将刺激生发中心B细胞进行类别转换。同时，如果有一个滤泡树突状细胞呈现原生形式的抗原(来自病毒的蛋白质)，高亲和力的免疫球蛋白G B细胞(通过膜结合的免疫球蛋白G)与滤泡树突状细胞相互作用，从而触发B细胞转化为浆细胞和记忆B细胞。为了产生广义中和抗体，滤泡树突状细胞必须向生发中心的激活B细胞(通过Tfh)呈现原生形式的抗原。
有几个因素可能会妨碍高效果疫苗的生产，或抑制传染的病毒诱导产生广谱的中和抗体：
首先，由于流感病毒的高突变率，许多常见的病毒抗原由于突变而在新毒株中消失。
其次，由于蛋白质抗原在体内的不稳定性(蛋白质抗原在体外或体内都是不稳定的)，滤泡树突状细胞在需要时可能无法再呈现原生态形式的抗原(抗原在体内已经变性或被消化)。
最后，传统的疫苗制备工艺，尤其是使用福尔马林或丙内酯的地方，由于长时间的灭活过程，需要几天或更长时间，会使病毒抗原的原始结构变性。总的来说，滤泡树突状细胞很难将原生结构的抗原呈现给B细胞，以便进一步成熟突变而产生广谱的中和抗体。
为了克服这一障碍，本申请公开了一种新的广谱疫苗的制备方法。在B细胞在生发中心的成熟和超突变期间，让滤泡树突细胞(FDC)呈现稳定原生态结构的抗原给生发中心的B细胞。从而让生发中心的B细胞有充足的时间在生发中心里反复循环突变，最后产生与原始抗原有高亲和力的广谱免疫球蛋白G抗体。同时这产生高亲和抗体的B细胞，一部分变成大量生产高亲和抗体的浆B细胞、一部分变成记忆B细胞。在T细胞方面，在生发中心里面，T细胞陪同B细胞经过相似的成熟过程。最后形成记忆T细胞。记忆B细胞和记忆T细胞能在人体内长期生存，从而保护人类免受未来类似类型病原体的感染。
发明内容
发明目的：针对上述现有技术的不足，本发明的目的在于公开了广谱疫苗的制备方法。
技术方案：广谱疫苗的制备方法，包括以下步骤：
(1)、获得活的病原体；
(2)、将步骤(1)获取的活的病原体用低温缓冲液稀释，待其浓度在1.0mg/ml以下后进入步骤(3)；
(3)、将交联剂用低温缓冲液稀释，待交联剂的质量浓度小于0.005％后进入步骤(4)；
(4)、将步骤(2)得到的病原体稀释液用步骤(3)得到的交联剂稀释液进行二次稀释，待病原体浓度在0.01～0.001mg/ml后进入步骤(5)；
(5)、将经过步骤(4)稀释的病原体液放置于0℃～10℃的冷室中冷藏24～48小时后进入步骤(6)；
(6)、将经过步骤(5)冷藏的病原体液进行灭活，得到灭活后的病原体液；
(7)、向灭活后的病原体液中加入苷氨酸，然后在37℃放置至少2小时后进入步骤(8)，其中：
加入的所述苷氨酸与戊二醛的摩尔比为5～10:1；
(8)、将经过步骤(7)处理过的病原体液浓缩并收集,并用生理盐水或HEPES缓冲液清冼一到二次、过滤、浓缩并收集后进入步骤(9)；
(9)、将经过步骤(8)处理的病原体液与铝佐剂以10～25：200～800的质量比搭配混合即得到广谱疫苗。
进一步地，步骤(1)中的病原体为病毒、细菌、真菌中的一种，优选冠状病毒、流感病毒、逆转录病毒、犀牛病毒中的一种。
更进一步地，步骤(1)中的病原体为流感病毒或新型冠状病毒SARS-CoV-2。
进一步地，步骤(1)所述的病原体为纯度95％以上的病原体。
进一步地，步骤(2)和步骤(3)中的低温缓冲液中的低温是指缓冲液温度低于10℃，缓冲液为下面三种之一：
a、生理盐水；
b、PBS缓冲液；
c、50mMHEPES,50-150mM NaCl,pH7.0-7.2的缓冲液。
进一步地，步骤(3)中所述的交联剂为丁二醛、戊二醛、己二醛、庚二醛、辛二醛、壬二醛、癸二醛、双琥珀酰亚胺辛二酸酯、丁二酸二甲酯、戊二酸二甲酯、己二酸二甲酯、庚二酸二甲酯、辛二酸二甲酯、壬二酸二甲酯、癸二酸二甲酯中的一种，优选戊二醛。
进一步地，步骤(6)包括以下步骤：
向经过步骤(5)冷藏的病原体液中加入适量的质量浓度90％以上的β-丙内酯水溶液，待β-丙内酯的质量浓度为0.01％～0.5％后停止加入β-丙内酯；
将病原体液在0～10℃下放置至少72小时后即得到灭活后的病原体液；或者
将病原体液在18℃～37℃放置至少24小时后即得到灭活后的病原体液。
进一步地，步骤(6)包括以下步骤：
向经过步骤(5)冷藏的病原体液中加入适量的质量浓度为36-37％甲醛溶液，待甲醛的质量浓度为0.025～0.5％后停止加入甲醛；
将病原体液在0～10℃放置至少50天后即得到灭活后的病原体液；或者
将病原体液在37℃放置至少60小时后得到灭活后的病原体液。
进一步地，步骤(6)能够通过伽马射线进行灭活，具体包括以下步骤：
伽马射线灭活根据病毒基因组的大小而有所差异，针对新冠病毒SARS-CoV-2,需要辐射D10剂量为2.0-5.0kGy的国际标准；
针对甲型流感病毒,需要辐射D10剂量为1.60-3.0kGy的国际表准；
针对乙型流感病毒,需要辐射D10剂量为2.0-3.0kGy的国际表准。
进一步地，步骤(9)中的铝佐剂为氢氧化铝、磷酸铝、无定型羟基磷酸硫酸铝佐剂(AAHS)、硫酸铝钾中的一种。
广谱疫苗的制备方法，包括以下步骤：
S1、获取病原体的重组蛋白；
S2、将步骤S1得到的重组蛋白用低温缓冲液稀释，待重组蛋白的浓度在1.0mg/ml以下后进入步骤S3；
S3、将交联剂用低温缓冲液稀释，待交联剂的质量浓度在0.005％以下后进入步骤S4；
S4、将步骤S2得到的重组蛋白液用步骤S3得到的交联剂稀释液稀释，待重组蛋白的浓度至0.01-0.001mg/ml后进入步骤S5；
S5、将经过步骤S4处理过的重组蛋白液放置于0℃～10℃的冷室冷藏24-48小时后进入步骤S6；
S6、向经过步骤S5冷藏的重组蛋白液中加入苷氨酸，然后将在37℃放置至少2小时后进入S7，其中：
加入的苷氨酸与戊二醛的摩尔比为5-10:1；
S7、将经过步骤S6处理的重组蛋白液浓缩并收集,并用生理盐水或HEPES缓冲液清冼一到二次，过滤、浓缩并收集后进入步骤S8；
S8、将经过步骤S7处理的重组蛋白液与铝佐剂按照10-25：200～800的质量比搭配混合后得到的广谱疫苗。
进一步地，步骤S1中的病原体的重组蛋白来源于病毒、细菌、真菌中的一种，优选冠状病毒、流感病毒、逆转录病毒、犀牛病毒中的一种。
更进一步地，步骤S1中的病原体的重组蛋白可来源于流感病毒或新型冠状病毒SARS-CoV-2。
进一步地，步骤S1中的病原体的重组蛋白的纯度在95％以上。
进一步地，步骤S2和步骤S3中的低温缓冲液中的低温是指缓冲液温度低于10℃，缓冲液为下面三种之一：
a、生理盐水；
b、PBS缓冲液；
c、50mMHEPES,50-150mM NaCl,pH7.0-7.2的缓冲液。
进一步地，步骤S3中所述的交联剂为丁二醛、戊二醛、己二醛、庚二醛、辛二醛、壬二醛、癸二醛、双琥珀酰亚胺辛二酸酯、丁二酸二甲酯、戊二酸二甲酯、己二酸二甲酯、庚二酸二甲酯、辛二酸二甲酯、壬二酸二甲酯、癸二酸二甲酯中的一种，优选戊二醛。
进一步地，步骤S8中的铝佐剂为氢氧化铝、磷酸铝，无定型羟基磷酸磷酸铝佐剂(AAHS)，硫酸铝钾中的一种。
本文公开了广谱疫苗的制备方法，该方法将交联剂与病原体结合；或者
将交联剂与来自病原体的重组蛋白接触，并让它们形成新的蛋白质内部共价键；
去除未与蛋白质结合的交联剂；
分离交联剂修饰后的病原体或重组蛋白；
并将交联剂修饰后的病原体或重组蛋白与佐剂结合即得到广谱疫苗。
在许多实施方案中，交联剂是丁二醛、戊二醛(glutaraldehyde)，己二醛，庚二醛，辛二醛，壬二醛，癸二醛中的一种。
在另一些实施例中，交联剂是双琥珀酰亚胺辛二酸酯(BS3，bissulfosuccinimidyl suberate)、己二酸二甲酯(DMA，dimethyl adipimidate)、辛二酸二甲酯(DMS，dimethyl suberimidate)和庚二酸二甲酯(DMP，dimethyl pimelimidate)、丁二酸二甲酯、戊二酸二甲酯、壬二酸二甲酯中的一种。
还公开了免疫受试者的方法，该方法包括用交联剂修饰的病原体或蛋白注射受试者；以及
用联剂修饰的病原体或蛋白第二次注射受试者，其中受试者是哺乳动物或禽类，例如哺乳动物或禽类包括人、牛、猪、马、猫、狗、鸟或鸡。
在许多实施方案中，交联剂为丁二醛、戊二醛、己二醛、庚二醛、辛二醛、壬二醛、癸二醛、双琥珀酰亚胺辛二酸酯、丁二酸二甲酯、戊二酸二甲酯、己二酸二甲酯、庚二酸二甲酯、辛二酸二甲酯、壬二酸二甲酯、癸二酸二甲酯中的一种。
附图说明
图1为实施例2制备的甲流疫苗H1N1的效果示意图。
图2为实施例2制备的甲流疫苗H2N3的效果示意图。
图3为实施例3制备的乙型(B)株流感疫苗的效果对照示意图。
图4表示.RBD经戊二醛交联剂处理后与6His-tagged ACE2的结合示意图。
图5表示.用戊二醛处理后的疫苗新冠抗原R417-RBD在冰箱及室温下的稳定效果示意图。
图6表示用戊二醛处理后疫苗在老鼠模型中两个月之后的表现。
图7用戊二醛处理后疫苗在老鼠模型中三个月后的表现。
图8.用戊二醛交联处理过的K417R突变RBD产生的抗体对ACE的结合示意图。
具体实施方式：
下面对本发明的具体实施方式详细说明。
所公开的方法和化学试剂可用于生产针对各种病原体(包括病毒、真菌、细菌)的通用广谱长效疫苗。
在一些实施方案中，所公开的方法和化学试剂可用于制备对广谱流感、冠状病毒、鼻病毒、副流感病毒、甲型肺炎病毒、呼吸道合胞病毒、逆转录病毒、丙型肝炎、艾滋病毒和其他病毒具有中和能力的疫苗。
在许多实施方案中，所公开的方法和化学试剂有助于创造具有针对不同毒株的活性的流感疫苗。
在许多实施方案中，所公开的方法和化学试剂可用于制造具有针对不同毒株的活性的冠状病毒疫苗，包括引起COVID-19的SARS-CoV-2。所披露的方法和化学试剂也可用于制备重组蛋白疫苗和单克隆抗体，例如针对各种抗原(例如蛋白质)。
实施例1--产生能抵御极端恶劣条件的稳定的蛋白质抗原
申请人已经分析和阐明了蛋白质折叠和展开的许多基本机制。发现氢键的破坏是破坏蛋白质三维结构的驱动力(Wang et al.,2014)。后来又发现，氢键是蛋白质初始折叠的主要驱动力(Lee,2017)。然而，蛋白质的三维结构大多由弱的疏水作用(范德瓦尔斯力)保持。这些发现表明，蛋白质的三维结构是脆弱的，因此容易受到环境变化的影响而失去原始的常态结构。蛋白质环境的微小扰动可能导致蛋白质三维结构的变性。福尔马林(甲醛)、β-丙内酯(BPL)、极端的pH值、某些溶液成分、疫苗佐剂(铝)，提高温度等都会导致蛋白质的原始三维结构变化。为了保护蛋白质脆弱的三维结构，其他人试图引入内部二硫键(桥)来帮助维持蛋白质的原始结构。然而，二硫桥可能会被体内的还原环境破坏。另一种流行的用于维持蛋白质结构的交联剂是福尔马林/甲醛。然而，甲醛会导致抗原的急剧变性。另外，由于甲醛的分子小，它支持交联的能力仅限于那些彼此非常接近的氨基酸残基。
为了解决上面讨论的问题，申请人交联剂，包括丁二醛、戊二醛、己二醛、庚二醛、辛二醛、壬二醛、癸二醛、双琥珀酰亚胺辛二酸酯、丁二酸二甲酯、戊二酸二甲酯、己二酸二甲酯、庚二酸二甲酯、辛二酸二甲酯、壬二酸二甲酯、癸二酸二甲酯中的一种，它们可以保持病毒抗原的原始结构。戊二醛是一种带有末端活性氧分子的五碳线性分子。戊二醛将来自蛋白质不同部位(甚至不同结构域)的赖氨酸残基的侧链连接起来。在一些实施方案中，其它交联剂也可用于本方法(见下文)。戊二醛的结构式如下：
Figure BDA0003390620070000071
为了测试交联剂戊二醛的效率，申请人采用绿色荧光蛋白(GFP)作为测试模型。具体包括以下步骤：
(1)将浓度为1.0mg/ml GFP蛋白加入适量的pH7.2的缓冲液稀释至0.1mg/ml.其中：缓冲液中为HEPES、氯化钠的混合水溶液，其中，HEPES的浓度为50mmol/L、氯化钠的浓度为50mmol/L——pH7.2(生理pH值对目标蛋白质或抗原的稳定性最好)；
(2)将蛋白液/戊二醛溶液置于室温下24小时；
(3)向蛋白液/戊二醛溶液加入过量的氨基酸甘氨酸，甘氨酸与戊二醛的摩尔比为10:1，静置反应5小时得到待测试的GFP样品。
为了测试所制备的GFP样品，从所制备的GFP样品中取出适量的等量的六份，分成六组进行试验。具体如下表所示：
Figure BDA0003390620070000081
在80℃下，加0.01％的SDS中测试所制备的GFP样品的稳定性，大约30分钟。原生的GFP样品，未经任何处理，在80℃的0.01％SDS中仅30分钟后就会失去其结构和荧光的发光能力(见表)。然而，戊二醛处理GFP样品，并静置24小时。然后加0.1％SDS。在高温下的和0.1％SDS变性剂中的荧光保持很长一段时间(几周或更长)。这些结果表明，戊二醛是一种在苛刻的变性环境中保持蛋白质原始结构的有效试剂。
传统上认为福尔马林(甲醛)也有交联能力，因此，可能能够保护蛋白质不变性。为了证明其保护蛋白结构的特性，在上述GFP样品中，加0.5％甲醛，并静置24小时。在80-100℃的0.01％SDS中大约30分钟后，GFP的荧光就消失了(见表)。因此，甲醛不能保护原生态蛋白在苛刻条件下保持稳定。
实施例2—制备甲流感毒株稳定抗原的疫苗。
接下来，申请人研究用戊二醛处理甲流感病毒产生稳定抗原的疫苗。
具体步骤如下：
(1)、获得H1N1流感病毒，该H1N1流感病毒来自Charles River(产品编号：10100374，Influenza A/PR/8/34)；
(2)、将步骤(1)获取的H1N1流感病毒用低温缓冲液稀释，待其浓度在1.0mg/ml以下后进入步骤(3)；
(3)、将交联剂用低温缓冲液稀释，待交联剂的质量浓度为0.005％后进入步骤(4)；
(4)、将步骤(2)得到的H1N1流感病毒稀释液用步骤(3)得到的交联剂稀释液进行二次稀释，待H1N1流感病毒浓度在0.01mg/ml后进入步骤(5)；
(5)、将经过步骤(4)稀释的病原体液放置于0℃的冷室中冷藏48小时后进入步骤(6)；
(6)、将经过步骤(5)冷藏的病原体液进行灭活，得到灭活后的病原体液；
(7)、向灭活后的病原体液中加入苷氨酸，然后在37℃放置至少2小时后进入步骤(8)，其中：
加入的所述苷氨酸与戊二醛的摩尔比为5:1；
(8)、将经过步骤(7)处理过的病原体液浓缩并收集,并用生理盐水或HEPES缓冲液清冼一次、过滤、浓缩并收集后进入步骤(9)；
(9)、将经过步骤(8)处理的病原体液与铝佐剂以10：200的质量比搭配混合即得到广谱疫苗。
进一步地，步骤(1)所述的H1N1流感病毒的纯度在95％以上。
进一步地，步骤(2)和步骤(3)中的低温缓冲液中的低温是指缓冲液温度低于10℃，缓冲液为生理盐水。
进一步地，步骤(3)中所述的交联剂为戊二醛。
进一步地，步骤(6)包括以下步骤：
向经过步骤(5)冷藏的病原体液中加入适量的质量浓度为90％β-丙内酯水溶液，待β-丙内酯的质量浓度为0.1％后停止加入β-丙内酯；
将H1N1流感病毒液在0℃下放置72小时后即得到灭活后的病原体液。
在另一个实施例中，将H1N1流感病毒液在18℃放置24小时后即得到灭活后的病原体液。
在另一个实施例中，步骤(6)包括以下步骤：
向经过步骤(5)冷藏的H1N1流感病毒液中加入适量的质量浓度为36％甲醛溶液，待甲醛的质量浓度为0.5％后停止加入甲醛；
将H1N1流感病毒液在0℃放置50天后即得到灭活后的病原体液。
在另一个实施例中，将H1N1流感病毒液在37℃放置至少60小时后得到灭活后的病原体液。
在另一个实施例中，步骤(6)能够通过伽马射线进行灭活，具体包括以下步骤：伽马射线灭活根据病毒基因组的大小而有所差异，针对甲型流感病毒(InfluenzaA),需要辐射D10剂量为1.60-3.0kGy的国际表准。
进一步地，步骤(9)中的铝佐剂为氢氧化铝。
在另一些实施方案中，H1N1活流感病毒的浓度可低于0.1mg/ml，戊二醛可低于或高于0.005％。
在另一些实施方案中，H1N1活流感病毒可被稀释至低于1.0mg/ml，例如0.9mg/ml、0.8mg/ml、0.7mg/ml、0.6mg/ml、0.5mg/ml、0.4mg/ml、0.3mg/ml、0.2mg/ml、0.09mg/ml、0.08mg/ml、0.07mg/ml、0.06mg/ml、0.05mg/ml、0.04mg/ml、0.03mg/ml、0.02mg/ml、0.01mg/ml、0.001mg/ml、0.0001mg/ml。
在另一些实施方案中，H1N1活流感病毒可被稀释至大于0.00001mg/ml，例如0.0001mg/ml、0.001mg/ml、0.009mg/ml、0.01mg/ml、0.02mg/ml、0.03mg/ml、0.04mg/ml、0.05mg/ml、0.06mg/ml、0.07mg/ml、0.08mg/ml、0.09mg/ml、0.1mg/ml、0.2mg/ml、0.3mg/ml、0.4mg/ml、0.5mg/ml、0.6mg/ml、0.7mg/ml、0.8mg/ml、或0.9mg/ml。
在许多实施方案中，戊二醛的浓度可大于0.00001％，例如为0.0001％、0.0005％、0.001％、0.002％、0.003％、0.004％、0.005％、0.006％、0.007％、0.008％、0.009％、0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％或0.1％。
在许多实施方案中，戊二醛的浓度可低于0.5％,例如0.4％,0.3％,0.2％,0.1％,0.09％,0.08％,0.07％,0.06％,0.05％,0.04％,0.03％,0.02％,0.01％,0.009％,0.008％,0.007％,0.006％,0.005％,0.004％,0.003％,0.002％,0.001％,0.0009％,0.0008％,0.0007％,0.0006％,0.0005％,0.0004％,0.0003％,0.0002％,0.0001％。
申请人注意到，2～5％的戊二醛通常被用作高级消毒剂，这可能导致疫苗样品的沉淀。使用的戊二醛交联浓度为0.005％在某些情况下，这可能不足以杀死病毒和/或其他病原体。因此，在一些实施方案中，在0-10℃(冷室)用低浓度(0.005％)的戊二醛处理24至48小时后，可加入甲醛或β-丙内酯，例如，浓度约为0.025-2％。这可能有助于彻底消除活病毒，例如大于24h、48h、60h、72h、84h、96h、以及小于120h、108h、96h、84h、72h、60h、48h、24h、12h。
铝佐剂包括以下一种或多种：无定型羟基磷酸铝(AAHS)、氢氧化铝、磷酸铝、硫酸铝钾，由CDC(美国疾病控制中心)定义和推荐的常用铝佐剂。可从Millipore Sigma公司获得(产品编号。239186-氢氧化铝或255963-磷酸铝)，或Freund不完全佐剂，或Freund完全佐剂。其他药学上可接受的佐剂并已被批准使用的。
动物活体试验：
在100ul中给小鼠注射10-20ug戊二醛处理过的病毒样品+佐剂。第一次注射两周后进行第二次注射，第一次注射四周后进行第三次注射。
从第一次注射后6-8星期收集血清做HAI检测(抗凝血)--或从第三次注射后2周和4周的免疫小鼠收集血清。这里，样本是在注射后60天收集的。样本被送到VIRAPUR公司(SanDiego,USA)进行HAI检测。
如图1和图2显示，本实施例制备的疫苗血清在大约80至160倍稀释(远大于CDC标准要求40倍稀释)后仍然产生了抑制性活性。具体来说，大约80-160倍的稀释对H1N1(A/Cifornia/07/2009)(图1所示)有效。80倍稀释对H3N2(A/HongKong/4801/2014)有效(图2所示)。
从图1和图2可知，本发明可以提高甲流疫苗的效果，提升甲流疫苗中和力8-16倍。
有趣的是，传统的通过甲醛杀死病毒的方法并没有产生任何HAI活性(见图1和图2)。这些结果表明，我们的交联方法可以从1934年的波多黎各H1N1病毒制备的疫苗，有效地中和2009年加州毒株H1N1病毒(稀释约80-160倍后有效)，以及中和2014年香港毒株的H3N2病毒(稀释约80倍后有效)。因此，所公开的交联方法和制备过程可以有效地创造出，对来自不同地方、不同时间、甚至不同亚型的各种病毒具有广泛效力的疫苗。也就是说，所公开的方法在生产通用的和长期的疫苗方面是有效的。
实施例3—制备稳定抗原的乙型(B)流感菌株疫苗
使用实施例2类似的方法来制备乙型(B)株流感疫苗。此外，使用传统的方法(即使用甲醛杀死病毒并制备疫苗)来生产疫苗做为对照。乙型(B)株病毒也从CharlesRiver(USA)公司获得(产品编号：10100379，B/Lee/40)。
两个批次的病毒，制备如下：
第一批乙型流感病毒疫苗的制备——采用本发明公开的制备方法制备稳定抗原的乙型(B)流感菌株疫苗，包括以下步骤：
(1)、获得纯化的活乙型(B)株病毒(从Charles River公司购入)；
(2)、将步骤(1)获取的活病毒用低温缓冲液稀释，待其浓度在1.0mg/ml以下后进入步骤(3)；
(3)、将交联剂用低温缓冲液稀释，待交联剂的质量浓度0.005％后进入步骤(4)；
(4)、将步骤(2)得到的病毒稀释液用步骤(3)得到的交联剂稀释液进行二次稀释，待病毒浓度在0.01mg/ml后进入步骤(5)；
(5)、将经过步骤(4)稀释的病毒液放置于10℃的冷室中冷藏24小时后进入步骤(6)；
(6)、将经过步骤(5)冷藏的病毒液进行灭活，得到灭活后的病毒液；
(7)、向灭活后的病毒液中加入苷氨酸，然后在37℃放置至少2小时后进入步骤(8)，其中：
加入的所述苷氨酸与戊二醛的摩尔比为10:1；
(8)、将经过步骤(7)处理过的病毒液浓缩并收集,并用生理盐水或HEPES缓冲液清冼二次、过滤、浓缩并收集后进入步骤(9)；
(9)、将经过步骤(8)处理的病毒液与铝佐剂以25：200的质量比搭配混合即得到广谱疫苗。
进一步地，步骤(1)所述的病毒为纯度95％以上的病毒。
进一步地，步骤(2)和步骤(3)中的低温缓冲液中的低温是指缓冲液温度低于10℃，缓冲液为：
50mMHEPES,50-150mM NaCl,pH7.0-7.2的缓冲液。
进一步地，步骤(3)中所述的交联剂为戊二醛。
进一步地，步骤(6)包括以下步骤：
向经过步骤(5)冷藏的病毒液中加入适量的质量浓度为95％的β-丙内酯水溶液，待β-丙内酯的质量浓度为0.5％后停止加入β-丙内酯；
将病毒液在10℃下放置至少72小时后即得到灭活后的病毒液。
在另一个实施例中，将病毒液在37℃放置24小时后即得到灭活后的病毒液。
在另一个实施例中，步骤(6)包括以下步骤：
向经过步骤(5)冷藏的病毒液中加入适量的质量浓度为37％甲醛溶液，待甲醛的质量浓度为0.5％后停止加入甲醛；
将病毒液在10℃放置至少50天后即得到灭活后的病毒液。
在另一个实施例中，将病毒液在37℃放置至少60小时后得到灭活后的病毒液。
进一步地，步骤(6)能够通过伽马射线进行灭活，具体包括以下步骤：
伽马射线灭活根据病毒基因组的大小而有所差异，针对乙型流感病毒(InfluenzaB),需要辐射D10剂量为2.0-3.0kGy的国际表准。
进一步地，步骤(9)中的铝佐剂为磷酸铝。
第二批乙型流感病毒疫苗的制备——纯化的活病毒稀释到0.1mg/ml(共10ml)的50mM pH7.2 HEPES缓冲液中加入0.01-2％的甲醛，4-6℃下培养超过100小时或5-10天，并再次加入10倍摩尔过量的甘氨酸进行淬灭，进一步培养2小时。
这批病毒经过浓缩和清冼处理。处理后的病毒与或不与明矾佐剂混合。每次向每只小鼠注射10-30ug的样品。第一次注射后，两周后进行第二次注射，四周或一个月后进行第三次注射。在第一次注射后约两个月收集血清。四组小鼠按所述进行免疫。
第1组：用甲醛处理的病毒加佐剂(共5只小鼠)。
第2组：用甲醛处理的病毒，没有佐剂(共4只小鼠)。
第3组：用戊二醛处理的病毒加佐剂(共6只小鼠)。
第4组：用戊二醛处理的病毒，没有佐剂(共4只小鼠)。
收集血清并由IITRI(美国芝加哥伊利诺伊技术研究所)进行HAI检测。如图3所示，由B株病毒制备的疫苗对甲型(A)株病毒H1N1(A/密歇根/H1N1)或H3N2(A/新加坡/H3N2)都没有保护作用(如图3所示)。然而，用甲醛生产的乙型病毒疫苗，即用传统方法制备的疫苗(第1组)加佐剂后，确实对不同的乙型B株(B/科罗拉多州/2017)产生了微弱的保护作用，但HAI得分低于40(即低于标准水平的40倍稀释)(传统+佐剂，图3)。这种抑制水平对保护来说是无效的。没有佐剂(传统-佐剂，没佐剂，第2组)，传统疫苗的表现更差。然而，用戊二醛加佐剂制备的疫苗即使在80倍稀释后也有抑制作用(图3，HAI>>80)。同样，不采用佐剂(第4组)时，抑制作用下降(没佐剂，图3，20＜HAI＜40)。
这一数据表明，按所述方法制备的疫苗可提供广泛的免疫力。具体而言，所公开的交联方法被用于从1940年的乙型(B)病毒中生产乙型病毒的疫苗，该疫苗能够保护来自2017年科罗拉多州的另一种乙型的病毒。这些结果再次表明，我们的方法在生产流感乙型株疫苗时是有效的。这些疫苗可以保护来自不同亚型的各种乙型株，即使是在不同的时间和地点获得的毒株。这样，这样制造的疫苗有通用的、持久的特性。这方法具有通用性，可应用于其他难以产生疫苗的病毒。
如图3所描述的那样，目前公开的交联方法和制备过程可用于制造对各种病毒有效的通用疫苗，对不同的毒株有广谱的反应。目前公开的交联方法和制备过程方法可用于制备对各种病毒有效的通用疫苗，对来自不同地点和时间的可变毒株和亚毒株具有广泛的反应。这个方法应适合制备，包括流感、冠状病毒(包括SARS-CoV-1、SARS-CoV-2、MER等)、鼻病毒、逆转录病毒、副流感病毒、Metapneumovirus、呼吸道合胞病毒、丙肝、艾滋病毒和其他病毒等的疫苗。目前公开的交联方法和制备过程可用于制造针对其他各种病原体的疫苗，如细菌、真菌、寄生虫等。
免疫方法
所公开的免疫方法的一个实施方案如下。
将处理过的病毒0.1mg/ml经过浓缩管浓缩。
用冷的PBS清洗粒状病毒两次；
将病毒重新悬浮在200μl PBS中。
加入200μl明矾佐剂，用力搅拌1-2分钟。
在Eppendorf Thermomix中以1400rpm的转速乳化病毒/佐剂混合物，在室温下持续5小时。
对C57bl/6小鼠肌肉注射100微升/μl(含约10-20微克/μg病毒)病毒+铝佐剂进行免疫。(第一次免疫)。
第一次免疫两周后，用肌肉注射100微升μl(约10-20微克/μg病毒)病毒+铝佐剂，以同样方法进行免疫。(第二次免疫)。)
两周后，重复肌肉注射100微升μl(～10-20微克/μg病毒)病毒/铝佐剂。(第三次免疫)。
第三次免疫后，4-6周，从尾部收集血液。将血清储存在-20℃以备第二天使用。或者储存在-80℃，以便长期保存。
结论
对于人们来说，开发针对流感、新冠，HIV和其他病毒的通用和持久的疫苗一直是一个很大的挑战。众所周知，一种普遍而持久的疫苗应该引发宿主产生广泛的中和抗体，而这些抗体大多是免疫球蛋白G家族成员，通常由浆体B细胞产生。浆体B细胞是在滤泡树突状细胞(FDCs)和滤泡T细胞的帮助下，经过类别转换和超突变成熟的过程后，由淋巴生发中心的B细胞产生。该过程的一个步骤是依靠FDCs在整个过程中呈现原生形式的抗原，这可能持续数周和数月(2个月)。
免疫领域的一个挑战是在这么长的时间内呈现原生常态结构的抗原。这在一定程度上是由于原生抗原的不稳定性造成。在这方面，人们发现快速沉淀抗原的佐剂可能有助于保护抗原的原生三维结构--使抗原在体内更长时间地保持其原生结构。这就是为什么传统的疫苗依赖于辅助剂。然而，对于流感、HIV和其他病毒来说，由于各个毒株之间相同的原生，保守的抗原数量有限，这些传统方法并不奏效。原生共享抗原的数量有限，部分原因是许多这些病毒的高变异率造成的。因此，在注射后，能够将这些病毒中数量有限的原生共享的抗原以其原生状态形式保存下来是非常有用的。这将增加这些原生共享抗原可用于诱导复杂的生法中心B细胞成熟过程的时间。
传统的病毒灭活和交联剂，如甲醛或β-丙内酯(Beta-propiolactone)，并不能有效地发挥交联作用，加入人工二硫桥也是作用有限。相反，申请人出人意料地发现，用戊二醛交联剂及其它的交联剂，能给抗原提供更有效的交联，有助于保存抗原的原始结构。所披露的方法还能够提高GFP蛋白在变性环境中的稳定性，如SDS和高温。这些GFP实验表明，戊二醛和其它的交联剂在保持蛋白质稳定性方面是有效的。而GFP是测试这一有效交联特性的良好系统。
申请人注意到，高浓度的戊二醛(例如大约2％及以上)是一种常见的消毒剂。然而，这样高浓度的戊二醛可能导致分子之间的交联，这可能导致病毒颗粒或其他病原体的沉淀。这也可能导致蛋白质抗原内部交联的失败(内部交联，这可能有助于稳定抗原)。申请人发现，使用低浓度的戊二醛(0.005％或0.5mM或更低)可以解决这个问题。
申请人发现，使用低浓度的戊二醛(0.005％或0.5mM或更低)交联后的病毒还有部分活性。这样，进一部的灭活病毒是必需的。可以使用传统的灭活方法，如，加甲醛或丙内酯，或伽马射线。
申请人表明，所公开的交联方法和制备过程，对生产甲型流感病毒和乙型流感病毒的疫苗都是有效的。所披露的交联方法和制备过程也可用于生产其他病毒类型的有效疫苗，如冠状病毒、艾滋病毒以及各种病原体，如细菌和真菌，和重组蛋白疫苗。
实施例4--开发有效的新冠(SARS-COV-2)疫苗
在开发通用流感疫苗的过程中，COVID-19大流行(由SARS-CoV-2引起)于2019年底爆发，并在2020年初蔓延到世界各地。SARS-COV-2病毒现在已经感染了全世界近三亿人(COVID-19患者)，导致大约近500万人死亡(见worldometers.info/coronavirus)。目前，还没有治疗COVID-19患者的特效药物。因此，迫切需要开发疫苗来保护人们免受SARS-CoV-2的侵害。许多候选疫苗正在开发和使用中，包括几个使用的：1)SARS-COV-2的刺突蛋白(Spike)的mRNA；2)通过腺病毒载体的刺突蛋白的DNA；3)SARS-COV-2的灭活病毒；以及4)SARS-COV-2的重组蛋白。
然而，上述方法都有不同的缺点，这可能会妨碍开发出一种高效、安全、易操作、方便运送、价格合理的疫苗，供全世界人民使用。具体来说，1)作为疫苗的mRNA存在生产成本高、稳定性低、处理过程要求高(如低温储存以保证稳定性)等问题，此外，表达的刺突蛋白大部分在宿主体内也很容易变性，而仅有刺突蛋白的受体结合结构域由于有四对二硫键而比较稳定，造成新受体结合结构域突变毒株的跳逸，如新的德尔塔株(Delta)。2)作为载体的腺病毒可以在体内被曾经感染过这种病毒的人的免疫系统破坏，因为腺病毒是常见的感冒病毒，大多数人有感染史，有免疫记忆来破坏新的感染。3)灭活的病毒也有几个缺点--首先，蛋白质抗原，主要是SARS-COV-2表面的刺突蛋白是高度易变性和不稳定，容易被甲醛或Beta-proiolactone变性，传统的病毒杀死可能导致刺突蛋白的原生抗原的丢失。其次，有报道称，灭活的病毒疫苗可能会导致类似病毒的抗体依赖性增强(ADE)感染，一些稍有不同的病毒株，如登革热病毒中发现的抗体依赖性增强；4)重组蛋白也有类似的抗体依赖性增强感染问题，以及低稳定性问题。所有这些缺点导致了SARS-COV-2新出现的变种即使在接种了上述所有疫苗后仍能逃脱或突破。基于这些认识，我们正开始探索一种新的方法来开发针对SARS-COV-2的有效疫苗，并克服上述所有的缺点。
目前上述公开的交联方法技术及制备过程对于开发针对所有其他病毒或病原体的疫苗是通用的，也适合灭活SARS-CoV-2病毒的制备。由于很困难获的活的SARS-CoV-2病毒，我们仅利用刺突蛋白的受体结合结构域(RBD，残基319至残基541。其中残基387至残基502，P0DTC2，如下所示)，开发了针对SARS-COV-2的有效疫苗。如上所述，本疫苗是采用戊二醛交联的方法生产的。这种方法克服了目前开发的所有治疗SARS-COV-2感染的疫苗的上述缺点。
结果
如上所述，使用戊二醛交联可以稳定抗原，从而使它们在免疫后长时间保持体内的原始构象。交联过的抗原将帮助宿主维持长时间的免疫反应，如提供B细胞类别转换、B细胞超突变亲和力成熟、在生发中心产生持久的浆B细胞(通常产生高亲和力的广泛中和免疫球蛋白G抗体)、记忆B细胞和记忆T细胞等。经过长时间的免疫反应，人类宿主将形成免疫记忆，以抵御未来同一病毒或变异版本的感染，从而获得长时间的保护。
为了创造目前的疫苗，我们创造了一个K417R突变版本的受体结合域。这个版本的受体结合域在用0.005％戊二醛交联后仍然能够与ACE2结合。根据已公布的SARS-COV-2的刺突蛋白的受体结合域(RBD，残基319-至残基541，图4仅包括残基387至残基516)和人类宿主受体ACE2(PDB ID：6MOJ)之间的结构信息。
新冠(SARS-CoV-2)和非典(SARS-CoV)受体结合结构域(receptor bindingdomain，RBD)一级序列对齐重排。如下：*表示同受体ACE2相结合的氨基酸。#表示K417,417赖氨酸突变成R417精氨酸。
Figure BDA0003390620070000161
人们提出，一种与受体结合域表面结合并阻止ACE2结合的抗体将保护人类宿主，并防止SARS-CoV-2的感染。在这方面，单独的受体结合域结构域或整个刺突蛋白可被选为针对SARS-CoV-2的候选疫苗抗原。
从结构信息和序列比对中，我们发现一个赖氨酸残基(K417)参与了受体结合域和ACE2的相互作用。为了避免这个赖氨酸残基与交联剂戊二醛发生反应，从而导致交联后失去与ACE2的结合，如上所述，我们创造了一个赖氨酸到精氨酸(K417R)突变的受体结合域版本，以及一个类似的突变的全长刺突蛋白。这两种蛋白都在人类293T/F细胞中表达。蛋白质也在Hi5昆虫细胞、酵母中表达。突变版本的受体结合域(K417R)的蛋白质，无论是否有交联，都能在体外与ACE2结合(如图4所示)。然而，原生形式的受体结合域在交联后，不再与ACE2结合(图4所示)。从图4可以看出6His-tagged ACE2能拉出被戊二醛交联剂处理过的R471突变RBD，但没有拉出交联剂处理过的，被没突变的RBD。
417R受体结合域的交联版本在冰上或室温下可长期稳定。这是有益的，因为疫苗的稳定性是一个大问题，特别是在向世界各地的偏远地区或不发达地区提供疫苗时。如图5示，受体结合域的交联解决了这个问题。根据我们的实验，交联的K417R受体结合域在冰上和室温下一周后是稳定的(图5所示)。然而，没有交联的受体结合域的原生形式在一周后会被降解(图5所示)。
在一些实施方案中，交联的抗原可以从约0℃到约37℃，在较长的时间内稳定，例如从约1周到约10周。
在一些实施方案中，交联抗原在大于0℃、1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃、10℃、11℃、12℃、134℃、15℃、16℃、17℃、18℃、19℃、20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃。36℃、37℃、38℃或39℃，以及低于40℃、39℃、38℃、37℃、36℃、35℃、34℃、33℃、32℃、31℃、30℃、29℃、28℃、27℃、26℃、25℃。24℃、23℃、22℃、21℃、20℃、19℃、18℃、17℃、16℃、15℃、14℃、13℃、12℃、11℃、10℃、9℃、8℃、7℃、6℃、5℃、4℃、3℃、2℃、或1℃。
在许多实施方案中，所公开的交联抗原的稳定性大于1周、1.5周、2周、2.5周、3周、3。5周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周、15周、20周、25周、30周、35周、1年或更长时间，并且少于约2年、1年、50周、40周、30周、25周、20周、15周、10周、9周、8周、7周、6周、5周、4周、3周、2周或1周
与用原生形式的受体结合域免疫的小鼠的免疫球蛋白G滴度相比，K417R受体结合域的交联版本在小鼠体内产生的免疫球蛋白G分子滴度高得多(约3倍)。针对受体结合域的免疫球蛋白G滴度如上所述进行了测定。与原始形式的受体结合域免疫相比，交联的受体结合域免疫小鼠在免疫两个月后，无论是一次性免疫还是相隔两周的两次额外增强免疫(总共三次免疫，每次约10-20ug的受体结合域样品)，其滴度都更高(约3倍)(图6)。
三个月后仍然保持较高的免疫球蛋白G滴度(图7)。这一结果表明，交联版的K417R受体结合域比非交联版的受体结合域更有效地引发免疫反应。在许多实施方案中，与非交联抗原相比，交联抗原可使受试者的免疫球蛋白G滴度增加约3倍至更多倍。
与原生形式的受体结合域相比，交联版的K417R受体结合域能产生更广泛的中和抗体，从而阻断ACE2的结合。我们发现，用交联的K417R受体结合域免疫后的小鼠血清对ACE2的阻断能力远远高于原生形式的受体结合域(图8)。40μg/ml的原生的受体结合域被涂在ELISA板上过夜，并用30％FBS的PBS进行阻断。稀释缓冲液也单独用于信号的较正。小鼠血清在稀释缓冲液中稀释1000倍，在室温下在板上孵育1小时。然后洗板三次。加入50μg/mlACE2-6his-tagged并在室温下孵育1小时。然后洗板三次。然后加入生物素化的抗6His*组氨酸标签抗体(Biorad MCA1396B)并在室温下孵育1小时。然后洗板三次。然后加入链霉蛋白-AP并在室温下孵育1小时。板子洗了五次。加入AP底物。在底物后的不同时间点，读取405nM的吸光度。数据以小鼠血清的吸光度除以单独稀释缓冲液的吸光度的比率表示。最终结合的ACE2读数反映了抗体的阻断程度。在ELISA板上检测到的ACE2越少(读数)，抗体的阻断性就越高(图8)。
其他交联剂，如双硫代琥珀酰亚胺(BS3)、己二酸二甲酯(DMA)、亚铁酸二甲酯(DMS)和嘧啶二甲酯(DMP)等，在制造所公开的疫苗时同样有效。只要它们能在蛋白抗原内交联化学基团(内交联)并稳定蛋白抗原。在一个实施方案中，这样的交联剂是如下所示的双硫代琥珀酰亚胺酯(BS3),其结构是如下：
Figure BDA0003390620070000181
在一个实施方案中，这样的交联剂是如下所示的己二酸二甲酯(DMA)：
Figure BDA0003390620070000182
在许多实施方案中，公开的交联剂在制备上面的抗原和疫苗中有用，可以共价连接蛋白质的不同部分，同时保持蛋白质的三维结构。分析了BS3/DMA/DMS/DMP交联受体结合域的能力，与上述研究类似，BS3/DMA/DMS/DMP与戊二醛交联相比，在提供受体结合域抗原方面具有相似的稳定性和有效性。此外，共价连接游离胺及其它基团的交联剂在本方法中是有用的。所披露的试剂可以连接游离胺，及其它基团。以次来自选择作为抗原的蛋白质内不同残基的其他基团交联的基础。
这里描述的是用于创造针对各种目标的非常有效的疫苗的交联合制备过程，包括SARS-COV-2和流感。在许多实施方案中，所披露的疫苗可以使用目标的一个小区域，例如SARS-COV-2的受体结合域区域来制备。这可以极大地减少所披露的疫苗遭受抗体依赖性增强的可能性，正如在其他疫苗中所看到的那样。由于受体结合域的尺寸很小，而且冠状病毒之间受体结合域区域的序列差异很大，我们相信我们的疫苗也将克服由非活性病毒或整个刺突蛋白引起的疫苗的抗体依赖性增强问题。有趣的是，最近的两份报告发现，来自COVID-19患者或疫苗接种者的血清中，有90％以上的广谱中和抗体是针对刺突蛋白的受体结合域的(Greaney et al.,2021；Piccoli et al.,2020)，表明人类的免疫系统也使用受体结合域作为主要抗原来产生针对SARS-COV-2的广谱中和抗体。
申请人注意到大多数交联剂是通过赖氨酸残基上的游离氨基发挥作用，而赖氨酸残基可以参与宿主和病原体的识别。为了避免交联后表位的丢失，在单个重组蛋白抗原中有意用精氨酸替换赖氨酸残基可以避免这个问题，正如我们在SARS-COV-2的受体结合域中所做的那样。
实施例5
广谱疫苗的制备方法，包括以下步骤：
(1)、获得活的病原体；
(2)、将步骤(1)获取的活的病原体用低温缓冲液稀释，待其浓度在1.0mg/ml以下后进入步骤(3)；
(3)、将交联剂用低温缓冲液稀释，待交联剂的质量浓度小于0.005％后进入步骤(4)；
(4)、将步骤(2)得到的病原体稀释液用步骤(3)得到的交联剂稀释液进行二次稀释，待病原体浓度在0.01mg/ml后进入步骤(5)；
(5)、将经过步骤(4)稀释的病原体液放置于0℃的冷室中冷藏48小时后进入步骤(6)；
(6)、将经过步骤(5)冷藏的病原体液进行灭活，得到灭活后的病原体液；
(7)、向灭活后的病原体液中加入苷氨酸，然后在37℃放置至少2小时后进入步骤(8)，其中：
加入的所述苷氨酸与戊二醛的摩尔比为5:1；
(8)、将经过步骤(7)处理过的病原体液浓缩并收集,并用生理盐水或HEPES缓冲液清冼一、过滤、浓缩并收集后进入步骤(9)；
(9)、将经过步骤(8)处理的病原体液与铝佐剂以10：200的质量比搭配混合即得到广谱疫苗。
进一步地，步骤(1)中的病原体为病毒。在一个实施例中其为选冠状病毒。在另一个实施例中，其为流感病毒。在另一个实施例中，其为逆转录病毒。在另一个实施例中，其为犀牛病毒。
进一步地，步骤(1)所述的病原体为纯度95％以上的病原体。
进一步地，步骤(2)和步骤(3)中的低温缓冲液中的低温是指缓冲液温度低于10℃，缓冲液生理盐水。
进一步地，步骤(3)中所述的交联剂为丁二醛。
进一步地，步骤(6)包括以下步骤：
向经过步骤(5)冷藏的病原体液中加入适量的质量浓度90％以上的β-丙内酯水溶液，待β-丙内酯的质量浓度为0.01％后停止加入β-丙内酯；
将病原体液在0下放置至少72小时后即得到灭活后的病原体液；或者
将病原体液在18℃放置至少24小时后即得到灭活后的病原体液。
进一步地，步骤(6)包括以下步骤：
向经过步骤(5)冷藏的病原体液中加入适量的质量浓度为36％甲醛溶液，待甲醛的质量浓度为0.025％后停止加入甲醛；
将病原体液在0℃放置至少50天后即得到灭活后的病原体液；或者
将病原体液在37℃放置至少60小时后得到灭活后的病原体液。
进一步地，步骤(6)能够通过伽马射线进行灭活，具体包括以下步骤：
伽马射线灭活根据病毒基因组的大小而有所差异，针对新冠病毒SARS-CoV-2,需要辐射D10剂量为2.0-5.0kGy的国际标准；
针对甲型流感病毒,需要辐射D10剂量为1.60-3.0kGy的国际表准；
针对乙型流感病毒,需要辐射D10剂量为2.0-3.0kGy的国际表准。
进一步地，步骤(9)中的铝佐剂为氢氧化铝。
实施例6
广谱疫苗的制备方法，包括以下步骤：
(1)、获得活的病原体；
(2)、将步骤(1)获取的活的病原体用低温缓冲液稀释，待其浓度在1.0mg/ml以下后进入步骤(3)；
(3)、将交联剂用低温缓冲液稀释，待交联剂的质量浓度小于0.005％后进入步骤(4)；
(4)、将步骤(2)得到的病原体稀释液用步骤(3)得到的交联剂稀释液进行二次稀释，待病原体浓度在0.001mg/ml后进入步骤(5)；
(5)、将经过步骤(4)稀释的病原体液放置于10℃的冷室中冷藏24小时后进入步骤(6)；
(6)、将经过步骤(5)冷藏的病原体液进行灭活，得到灭活后的病原体液；
(7)、向灭活后的病原体液中加入苷氨酸，然后在37℃放置至少2小时后进入步骤(8)，其中：
加入的所述苷氨酸与戊二醛的摩尔比为10:1；
(8)、将经过步骤(7)处理过的病原体液浓缩并收集,并用生理盐水或HEPES缓冲液清冼二次、过滤、浓缩并收集后进入步骤(9)；
(9)、将经过步骤(8)处理的病原体液与铝佐剂以25：800的质量比搭配混合即得到广谱疫苗。
进一步地，步骤(1)中的病原体为细菌。
进一步地，步骤(1)所述的病原体为纯度95％以上的病原体。
进一步地，步骤(2)和步骤(3)中的低温缓冲液中的低温是指缓冲液温度低于10℃，缓冲液PBS缓冲液。
进一步地，步骤(3)中所述的交联剂为己二醛。
进一步地，步骤(6)包括以下步骤：
向经过步骤(5)冷藏的病原体液中加入适量的质量浓度90％以上的β-丙内酯水溶液，待β-丙内酯的质量浓度为0.5％后停止加入β-丙内酯；
将病原体液在10℃下放置至少72小时后即得到灭活后的病原体液；或者
将病原体液在37℃放置至少24小时后即得到灭活后的病原体液。
进一步地，步骤(6)包括以下步骤：
向经过步骤(5)冷藏的病原体液中加入适量的质量浓度为36-37％甲醛溶液，待甲醛的质量浓度为0.5％后停止加入甲醛；
将病原体液在10℃放置至少50天后即得到灭活后的病原体液；或者
将病原体液在37℃放置至少60小时后得到灭活后的病原体液。
进一步地，步骤(9)中的铝佐剂为无定型羟基磷酸硫酸铝佐剂(AAHS)。
实施例7
广谱疫苗的制备方法，包括以下步骤：
(1)、获得活的病原体；
(2)、将步骤(1)获取的活的病原体用低温缓冲液稀释，待其浓度在1.0mg/ml以下后进入步骤(3)；
(3)、将交联剂用低温缓冲液稀释，待交联剂的质量浓度小于0.005％后进入步骤(4)；
(4)、将步骤(2)得到的病原体稀释液用步骤(3)得到的交联剂稀释液进行二次稀释，待病原体浓度在0.005mg/ml后进入步骤(5)；
(5)、将经过步骤(4)稀释的病原体液放置于4℃的冷室中冷藏36小时后进入步骤(6)；
(6)、将经过步骤(5)冷藏的病原体液进行灭活，得到灭活后的病原体液；
(7)、向灭活后的病原体液中加入苷氨酸，然后在37℃放置至少2小时后进入步骤(8)，其中：
加入的所述苷氨酸与戊二醛的摩尔比为8:1；
(8)、将经过步骤(7)处理过的病原体液浓缩并收集,并用生理盐水或HEPES缓冲液清冼一到二次、过滤、浓缩并收集后进入步骤(9)；
(9)、将经过步骤(8)处理的病原体液与铝佐剂以15：600的质量比搭配混合即得到广谱疫苗。
进一步地，步骤(1)中的病原体为真菌。
进一步地，步骤(1)所述的病原体为纯度95％以上的病原体。
进一步地，步骤(2)和步骤(3)中的低温缓冲液中的低温是指缓冲液温度低于10℃，缓冲液为50mMHEPES,50-150mM NaCl,pH7.0的缓冲液。在另一个实施例中，缓冲液为50mMHEPES,50-150mM NaCl,pH7.2的缓冲液。在另一个实施例中，缓冲液为50mMHEPES,50-150mM NaCl,pH7.1的缓冲液。
进一步地，步骤(3)中所述的交联剂为庚二醛。
进一步地，步骤(6)包括以下步骤：
向经过步骤(5)冷藏的病原体液中加入适量的质量浓度90％以上的β-丙内酯水溶液，待β-丙内酯的质量浓度为0.1％后停止加入β-丙内酯；
将病原体液在4℃下放置至少72小时后即得到灭活后的病原体液；或者
将病原体液在30℃放置至少24小时后即得到灭活后的病原体液。
进一步地，步骤(6)包括以下步骤：
向经过步骤(5)冷藏的病原体液中加入适量的质量浓度为36.5％甲醛溶液，待甲醛的质量浓度为0.4％后停止加入甲醛；
将病原体液在4℃放置至少50天后即得到灭活后的病原体液；或者
将病原体液在30℃放置至少60小时后得到灭活后的病原体液。
进一步地，步骤(9)中的铝佐剂为硫酸铝钾中的一种。
实施例8-18
与实施例7大致相同，区别仅仅在于交联剂不同
交联剂
实施例8 辛二醛
实施例9 壬二醛
实施例10 癸二醛
实施例11 双琥珀酰亚胺辛二酸酯
实施例12 丁二酸二甲酯
实施例13 戊二酸二甲酯
实施例14 己二酸二甲酯
实施例15 庚二酸二甲酯
实施例16 辛二酸二甲酯
实施例17 壬二酸二甲酯
实施例18 癸二酸二甲酯
实施例19
广谱疫苗的制备方法，包括以下步骤：
S1、获取病原体的重组蛋白；
S2、将步骤S1得到的重组蛋白用低温缓冲液稀释，待重组蛋白的浓度在1.0mg/ml以下后进入步骤S3；
S3、将交联剂用低温缓冲液稀释，待交联剂的质量浓度在0.005％以下后进入步骤S4；
S4、将步骤S2得到的重组蛋白液用步骤S3得到的交联剂稀释液稀释，待重组蛋白的浓度至0.01mg/ml后进入步骤S5；
S5、将经过步骤S4处理过的重组蛋白液放置于0℃的冷室冷藏48小时后进入步骤S6；
S6、向经过步骤S5冷藏的重组蛋白液中加入苷氨酸，然后将在37℃放置至少2小时后进入S7，其中：
加入的苷氨酸与戊二醛的摩尔比为5:1；
S7、将经过步骤S6处理的重组蛋白液浓缩并收集,并用生理盐水清冼一次，过滤、浓缩并收集后进入步骤S8；
S8、将经过步骤S7处理的重组蛋白液与铝佐剂按照10：200的质量比搭配混合后得到的广谱疫苗。
进一步地，步骤S1中的病原体的重组蛋白来源于病毒。在一个实施例中，步骤S1中的病原体的重组蛋白来源于冠状病毒。在一个实施例中，步骤S1中的病原体的重组蛋白来源于流感病毒。在一个实施例中，步骤S1中的病原体的重组蛋白来源于逆转录病毒。在一个实施例中，步骤S1中的病原体的重组蛋白来源于犀牛病毒。
进一步地，步骤S1中的病原体的重组蛋白的纯度在95％以上。
进一步地，步骤S2和步骤S3中的低温缓冲液中的低温是指缓冲液温度低于10℃，缓冲液为生理盐水。
进一步地，步骤S3中所述的交联剂为丁二醛。
进一步地，步骤S8中的铝佐剂为氢氧化铝。
实施例20
广谱疫苗的制备方法，包括以下步骤：
S1、获取病原体的重组蛋白；
S2、将步骤S1得到的重组蛋白用低温缓冲液稀释，待重组蛋白的浓度在1.0mg/ml以下后进入步骤S3；
S3、将交联剂用低温缓冲液稀释，待交联剂的质量浓度在0.005％以下后进入步骤S4；
S4、将步骤S2得到的重组蛋白液用步骤S3得到的交联剂稀释液稀释，待重组蛋白的浓度至0.001mg/ml后进入步骤S5；
S5、将经过步骤S4处理过的重组蛋白液放置于10℃的冷室冷藏24小时后进入步骤S6；
S6、向经过步骤S5冷藏的重组蛋白液中加入苷氨酸，然后将在37℃放置至少2小时后进入S7，其中：
加入的苷氨酸与戊二醛的摩尔比为10:1；
S7、将经过步骤S6处理的重组蛋白液浓缩并收集,并用生理盐水或HEPES缓冲液清冼一到二次，过滤、浓缩并收集后进入步骤S8；
S8、将经过步骤S7处理的重组蛋白液与铝佐剂按照25：800的质量比搭配混合后得到的广谱疫苗。
进一步地，步骤S1中的病原体的重组蛋白来源于细菌。
进一步地，步骤S1中的病原体的重组蛋白的纯度在95％以上。
进一步地，步骤S2和步骤S3中的低温缓冲液中的低温是指缓冲液温度低于10℃，缓冲液为PBS缓冲液。
进一步地，步骤S3中所述的交联剂为戊二醛。
进一步地，步骤S8中的铝佐剂为磷酸铝。
实施例21
广谱疫苗的制备方法，包括以下步骤：
S1、获取病原体的重组蛋白；
S2、将步骤S1得到的重组蛋白用低温缓冲液稀释，待重组蛋白的浓度在1.0mg/ml以下后进入步骤S3；
S3、将交联剂用低温缓冲液稀释，待交联剂的质量浓度在0.005％以下后进入步骤S4；
S4、将步骤S2得到的重组蛋白液用步骤S3得到的交联剂稀释液稀释，待重组蛋白的浓度至0.003mg/ml后进入步骤S5；
S5、将经过步骤S4处理过的重组蛋白液放置于4℃的冷室冷藏36小时后进入步骤S6；
S6、向经过步骤S5冷藏的重组蛋白液中加入苷氨酸，然后将在37℃放置至少2小时后进入S7，其中：
加入的苷氨酸与戊二醛的摩尔比为8:1；
S7、将经过步骤S6处理的重组蛋白液浓缩并收集,并用生理盐水或HEPES缓冲液清冼一到二次，过滤、浓缩并收集后进入步骤S8；
S8、将经过步骤S7处理的重组蛋白液与铝佐剂按照15：450的质量比搭配混合后得到的广谱疫苗。
进一步地，步骤S1中的病原体的重组蛋白来源于真菌。
进一步地，步骤S1中的病原体的重组蛋白的纯度在95％以上。
进一步地，步骤S2和步骤S3中的低温缓冲液中的低温是指缓冲液温度低于10℃，缓冲液为50mMHEPES,50-150mM NaCl,pH7.0的缓冲液。在另一个实施例中，缓冲液为50mMHEPES,50-150mM NaCl,pH7.2的缓冲液。在另一个实施例中，缓冲液为50mMHEPES,50-150mM NaCl,pH7.1的缓冲液。
进一步地，步骤S3中所述的交联剂己二醛。
进一步地，步骤S8中的铝佐剂为无定型羟基磷酸磷酸铝佐剂(AAHS)。在另一个实施例中，铝佐剂为硫酸铝钾。
实施例22-33
与实施例21大致相同，区别仅仅在于交联剂不同：
交联剂
实施例22 庚二醛
实施例23 辛二醛
实施例24 壬二醛
实施例25 癸二醛
实施例26 双琥珀酰亚胺辛二酸酯
实施例27 丁二酸二甲酯
实施例28 戊二酸二甲酯
实施例29 己二酸二甲酯
实施例30 庚二酸二甲酯
实施例31 辛二酸二甲酯
实施例32 壬二酸二甲酯
实施例33 癸二酸二甲酯
上面对本发明的实施方式做了详细说明。但是本发明并不限于上述实施方式，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下做出各种变化。

Claims (17)

1.广谱疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)、获得活的病原体；
(2)、将步骤(1)获取的活的病原体用低温缓冲液稀释，待其浓度在1.0mg/ml以下后进入步骤(3)；
(3)、将交联剂用低温缓冲液稀释，待交联剂的质量浓度小于0.005％后进入步骤(4)；
(4)、将步骤(2)得到的病原体稀释液用步骤(3)得到的交联剂稀释液进行二次稀释，待病原体浓度在0.01～0.001mg/ml后进入步骤(5)；
(5)、将经过步骤(4)稀释的病原体液放置于0℃～10℃的冷室中冷藏24～48小时后进入步骤(6)；
(6)、将经过步骤(5)冷藏的病原体液进行灭活，得到灭活后的病原体液；
(7)、向灭活后的病原体液中加入苷氨酸，然后在37℃放置至少2小时后进入步骤(8)，其中：
加入的所述苷氨酸与戊二醛的摩尔比为5～10:1；
(8)、将经过步骤(7)处理过的病原体液浓缩并收集,并用生理盐水或HEPES缓冲液清冼一到二次、过滤、浓缩并收集后进入步骤(9)；
(9)、将经过步骤(8)处理的病原体液与铝佐剂以10～25：200～800的质量比搭配混合即得到广谱疫苗。
2.如权利要求1所述的广谱疫苗的制备方法，其特征在于，步骤(1)中的病原体为病毒、细菌、真菌中的一种，优选冠状病毒、流感病毒、逆转录病毒、犀牛病毒中的一种。
3.如权利要求2所述的广谱疫苗的制备方法，其特征在于，步骤(1)中的病原体为流感病毒或新型冠状病毒SARS-CoV-2。
4.如权利要求1所述的广谱疫苗的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述的病原体为纯度95％以上的病原体。
5.如权利要求1所述的广谱疫苗的制备方法，其特征在于，步骤(2)和步骤(3)中的低温缓冲液中的低温是指缓冲液温度低于10℃，缓冲液为下面三种之一：
a、生理盐水；
b、PBS缓冲液；
c、50mMHEPES,50-150mM NaCl,pH7.0-7.2的缓冲液。
6.如权利要求1所述的广谱疫苗的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述的交联剂为丁二醛、戊二醛、己二醛、庚二醛、辛二醛、壬二醛、癸二醛、双琥珀酰亚胺辛二酸酯、丁二酸二甲酯、戊二酸二甲酯、己二酸二甲酯、庚二酸二甲酯、辛二酸二甲酯、壬二酸二甲酯、癸二酸二甲酯中的一种，优选戊二醛。
7.如权利要求1所述的广谱疫苗的制备方法，其特征在于，步骤(6)包括以下步骤：
向经过步骤(5)冷藏的病原体液中加入适量的质量浓度90％以上的β-丙内酯水溶液，待β-丙内酯的质量浓度为0.01％～0.5％后停止加入β-丙内酯；
将病原体液在0～10℃下放置至少72小时后即得到灭活后的病原体液；或者
将病原体液在18℃～37℃放置至少24小时后即得到灭活后的病原体液。
8.如权利要求1所述的广谱疫苗的制备方法，其特征在于，步骤(6)包括以下步骤：
向经过步骤(5)冷藏的病原体液中加入适量的质量浓度为36-37％甲醛溶液，待甲醛的质量浓度为0.025～0.5％后停止加入甲醛；
将病原体液在0～10℃放置至少50天后即得到灭活后的病原体液；或者
将病原体液在37℃放置至少60小时后得到灭活后的病原体液。
9.如权利要求1所述的广谱疫苗的制备方法，其特征在于，步骤(6)能够通过伽马射线进行灭活，具体包括以下步骤：
伽马射线灭活根据病毒基因组的大小而有所差异，针对新冠病毒SARS-CoV-2,需要辐射D10剂量为2.0-5.0kGy的国际标准；
针对甲型流感病毒,需要辐射D10剂量为1.60-3.0kGy的国际表准；
针对乙型流感病毒,需要辐射D10剂量为2.0-3.0kGy的国际表准。
10.如权利要求1所述的广谱疫苗的制备方法，其特征在于，步骤(9)中的铝佐剂为氢氧化铝、磷酸铝、无定型羟基磷酸硫酸铝佐剂、硫酸铝钾中的一种。
11.广谱疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、获取病原体的重组蛋白；
S2、将步骤S1得到的重组蛋白用低温缓冲液稀释，待重组蛋白的浓度在1.0mg/ml以下后进入步骤S3；
S3、将交联剂用低温缓冲液稀释，待交联剂的质量浓度在0.005％以下后进入步骤S4；
S4、将步骤S2得到的重组蛋白液用步骤S3得到的交联剂稀释液稀释，待重组蛋白的浓度至0.01-0.001mg/ml后进入步骤S5；
S5、将经过步骤S4处理过的重组蛋白液放置于0℃～10℃的冷室冷藏24-48小时后进入步骤S6；
S6、向经过步骤S5冷藏的重组蛋白液中加入苷氨酸，然后将在37℃放置至少2小时后进入S7，其中：
加入的苷氨酸与戊二醛的摩尔比为5-10:1；
S7、将经过步骤S6处理的重组蛋白液浓缩并收集,并用生理盐水或HEPES缓冲液清冼一到二次，过滤、浓缩并收集后进入步骤S8；
S8、将经过步骤S7处理的重组蛋白液与铝佐剂按照10-25：200～800的质量比搭配混合后得到的广谱疫苗。
12.如权利要求11所述的广谱疫苗的制备方法，其特征在于，步骤S1中的病原体的重组蛋白来源于病毒、细菌、真菌中的一种，优选冠状病毒、流感病毒、逆转录病毒、犀牛病毒中的一种。
13.如权利要求12所述的广谱疫苗的制备方法，其特征在于，步骤S1中的病原体的重组蛋白可来源于流感病毒或新型冠状病毒SARS-CoV-2。
14.如权利要求11所述的广谱疫苗的制备方法，其特征在于，步骤S1中的病原体的重组蛋白的纯度在95％以上。
15.如权利要求11所述的广谱疫苗的制备方法，其特征在于，步骤S2和步骤S3中的低温缓冲液中的低温是指缓冲液温度低于10℃，缓冲液为下面三种之一：
a、生理盐水；
b、PBS缓冲液；
c、50mMHEPES,50-150mM NaCl,pH7.0-7.2的缓冲液。
16.如权利要求11所述的广谱疫苗的制备方法，其特征在于，步骤S3中所述的交联剂为丁二醛、戊二醛、己二醛、庚二醛、辛二醛、壬二醛、癸二醛、双琥珀酰亚胺辛二酸酯、丁二酸二甲酯、戊二酸二甲酯、己二酸二甲酯、庚二酸二甲酯、辛二酸二甲酯、壬二酸二甲酯、癸二酸二甲酯中的一种，优选戊二醛。
17.如权利要求11所述的广谱疫苗的制备方法，其特征在于，步骤S8中的铝佐剂为氢氧化铝、磷酸铝，无定型羟基磷酸磷酸铝佐剂(AAHS)，硫酸铝钾中的一种。
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