TW201733616A - 包含固定化病毒粒子之疫苗 - Google Patents

Abstract

本發明是關於一種疫苗，其包含固定化病毒粒子，其中，在放熱試驗中，以成為固定化病毒粒子的起源之病毒粒子或對應的去活化病毒粒子於3隻兔子中的放熱反應之和為基準計，固定化病毒粒子於3隻兔子中的放熱反應之和未達80%。

Description

包含固定化病毒粒子之疫苗

本發明是關於一種包含固定化病毒粒子之疫苗。更詳細而言，本發明是關於一種包含固定化病毒粒子之疫苗，其是藉由將病毒的粒子結構使用固定劑進行固定化，來抑制了副反應。

流行性感冒病毒及日本腦炎病毒等之病毒所導致的感染症，依照病毒的種類、感染的對象，而有重症化的情況。作為對抗這種病毒所導致的感染症之防禦、預防的方法，已知有疫苗的接種等。 [先前技術文獻] [專利文獻]

專利文獻1：國際公開第2016/010081號 [非專利文獻]

非專利文獻1：J.Infect.Dis.2009　200（6）841-848 非專利文獻2：Vaccine　2009　27（5）786-791

[發明所欲解決之問題] 對抗流行性感冒病毒及日本腦炎病毒等的病毒之疫苗，有去活化疫苗與活毒疫苗的二種類在製造、市售著。其中，去活化疫苗大致區分為：將精製過的病毒粒子用福馬林等的去活化劑處理而製備的全顆粒疫苗(whole particle vaccine)、與將精製過的病毒粒子用有機溶劑或界面活性劑破壞（裂解化）而製備的裂解疫苗(split vaccine)。全顆粒疫苗是免疫原性高，在預防感染的功效方面較為優異。但是，全顆粒疫苗，會有出現較強局部反應及放熱反應(exothermic reaction)等的副反應的傾向。另一方面，裂解疫苗，由於減低了局部反應，也幾乎沒有放熱反應所以安全性上較優異。但是，在基礎免疫尚未成立的兒童或免疫反應已經衰弱的高齡者中，裂解疫苗的免疫原性有較低的傾向。因此，期望著開發出顯示比裂解疫苗更優異的功效（免疫原性），且安全性高的疫苗。

本發明是鑑於上述事情而完成者，目的在於提供一種疫苗，其免疫原性高，且副反應受到抑制。 [解決問題之技術手段]

本案發明人為了解決上述問題而進行了深入研究的結果，令人驚訝的是發現到，藉由不破壞病毒粒子的粒子結構（裂解化）而利用固定化劑進行固定化的方式，來包含仍保有與本來的病毒粒子同等的成分及結構的病毒粒子（以下，有時稱為「固定化病毒粒子」）之疫苗，在免疫原性試驗中為同等，在放熱試驗等的副反應的成績中為優異，進而達到完成本發明。

亦即，本發明提供以下的1～15。 1一種疫苗，其包含固定化病毒粒子， 其中，在放熱試驗中，以成為上述固定化病毒粒子的起源之病毒粒子或對應的去活化病毒粒子於3隻兔子中的放熱反應之和為基準計，上述固定化病毒粒子於3隻兔子中的放熱反應之和未達80%。 2如1所述之疫苗，其中，在放熱試驗中，上述固定化病毒粒子於3隻兔子中的放熱反應之和在1.3℃以下。 3一種疫苗，其包含固定化病毒粒子， 其中，以藉由成為上述固定化病毒粒子的起源之病毒粒子或對應的去活化病毒粒子而受到刺激的人類周邊血液單核細胞所產生的發炎性細胞激素的量為基準計，藉由上述固定化病毒粒子而受到刺激的人類周邊血液單核細胞所產生的發炎性細胞激素的量未達80%。 4如1～3中任一項所述之疫苗，其中，成為上述固定化病毒粒子的起源之病毒粒子包含：正黏液病毒粒子、黃病毒粒子、或小核糖核酸病毒粒子。 5如4所述之疫苗，其中，上述病毒粒子包含：流行性感冒病毒粒子、日本腦炎病毒粒子、或A型肝炎病毒粒子。 6如5所述之疫苗，其中，上述病毒粒子包含流行性感冒病毒粒子。 7如6所述之疫苗，其中，上述流行性感冒病毒粒子包含：A型流行性感冒病毒粒子、或B型流行性感冒病毒粒子。 8如6或7所述之疫苗，其中，上述流行性感冒病毒粒子包含被分類為：H1N1亞型株、H2N2亞型株、H3N2亞型株、H3N8亞型株、H5N1亞型株、H5N2亞型株、H5N6亞型株、H6N1亞型株、H7N3亞型株、H7N7亞型株、H7N9亞型株、H9N2亞型株、或H10N8亞型株的流行性感冒病毒粒子。 9如5所述之疫苗，其中，上述病毒粒子包含日本腦炎病毒粒子。 10如9所述之疫苗，其中，上述日本腦炎病毒粒子包含：北京-1株、中山株、SA14-14-2株、或P3株。 11如1～10中任一項所述之疫苗，其中，上述固定化病毒粒子表面的0%～90%的蛋白質沒有固定化。 12如1～11中任一項所述之疫苗，其中，相對於成為上述固定化病毒粒子的起源之病毒粒子的比活性也就是抗原含量/蛋白質含量，上述固定化病毒粒子的比活性的相對值在0%～95%。 13如1～12中任一項所述之疫苗，其中，上述固定化病毒粒子所具有的平均粒徑，是成為上述固定化病毒粒子的起源之病毒粒子或對應的去活化病毒粒子的粒徑的80%～150%。 14如1～13中任一項所述之疫苗，其中，當利用蔗糖密度梯度離心法來測定上述固定化病毒粒子時，會在蔗糖濃度35%以上檢測出峰。 15如1～14中任一項所述之疫苗，其中，當利用高效液相層析法來測定上述固定化病毒粒子時，可確認到單峰性的峰。 16如1～15中任一項所述之疫苗，其中，當對小鼠進行了免疫時，比起對上述固定化病毒粒子具特異性的IgG1，上述疫苗誘導出更多的對上述固定化病毒粒子具特異性的IgG2a。

並且，本發明提供以下的17～31。 17一種固定化病毒粒子的製造方法，其包含一步驟，該步驟為在包含成為起源之病毒粒子或對應的去活化病毒粒子之懸浮液中添加固定劑。 18如17所述之製造方法，其中，上述固定劑包含醛類。 19如18所述之製造方法，其中，上述醛類選自由下列所組成之群組：甲醛、三聚甲醛、戊二醛、及該等之組合。 20如19所述之製造方法，其中，上述醛類包含甲醛。 21如20所述之製造方法，其中，以上述懸浮液和上述固定劑的總量為基準計，上述甲醛的濃度是0.005～0.5w/v%。 22如19所述之製造方法，其中，上述醛類包含戊二醛。 23如22所述之製造方法，其中，以上述懸浮液和上述固定劑的總量為基準計，上述戊二醛的濃度是0.001～0.06w/v%。 24如17所述之製造方法，其中，上述固定劑包含碳二醯亞胺類。 25如24所述之製造方法，其中，上述碳二醯亞胺類選自由下列所組成之群組：二環己基碳二醯亞胺、二異丙基碳二醯亞胺、1-乙基-3-（3-二甲胺丙基）碳二醯亞胺鹽酸鹽、該等之類似物、及該等之組合。 26如25所述之製造方法，其中，上述碳二醯亞胺類包含1-乙基-3-（3-二甲胺丙基）碳二醯亞胺鹽酸鹽。 27如26所述之製造方法，其中，以上述懸浮液和上述固定劑的總量為基準計，上述1-乙基-3-（3-二甲胺丙基）碳二醯亞胺鹽酸鹽的濃度是0.05～1500mM。 28如17～27中任一項所述之製造方法，其中，成為起源之上述病毒粒子，是使培養細胞、雞蛋或小鼠腦受到感染並回收而得的病毒粒子。 29如28所述之製造方法，其中，上述培養細胞包含：初代細胞、或株化細胞。 30如29所述之製造方法，其中，上述培養細胞包含：Vero細胞(非洲綠猴腎細胞)、或MDCK(Madin-Darby Canine Kidney)細胞。 31一種疫苗的製造方法，其包含一步驟，該步驟為添加固定化病毒粒子，該固定化病毒粒子是藉由如17～30中任一項所述之製造方法而獲得的固定化病毒粒子。 [發明之功效]

根據本發明，能夠提供一種疫苗，其免疫原性高，且副反應受到抑制。

以下，針對本發明之合適實施形態來詳細說明。但是，本發明並不限定於以下的實施形態。

包含固定化病毒粒子之疫苗 本實施形態之疫苗，為一種包含固定化病毒粒子之疫苗，在放熱試驗中，以成為上述固定化病毒粒子的起源之病毒粒子或對應的去活化病毒粒子於3隻兔子中的放熱反應之和為基準時，上述固定化病毒粒子於3隻兔子中的放熱反應之和（℃）是降低的。又，上述疫苗，以藉由成為上述固定化病毒粒子的起源之病毒粒子或對應的去活化病毒粒子而受到刺激的人類周邊血液單核細胞所產生的發炎性細胞激素的量為基準計，藉由固定化病毒粒子而受到刺激的人類周邊血液單核細胞所產生的發炎性細胞激素的量是降低的。亦即，包含固定化病毒粒子之疫苗的免疫原性，高於裂解疫苗的免疫原性，而局部反應及放熱反應等的副反應，則與裂解疫苗同等地受到抑制。在其他方面，與習知的包含去活化病毒粒子的全顆粒疫苗比較，固定化病毒粒子的穩定性較為優異。

所謂的「固定化病毒粒子」，是意味著沒有對宿主的感染能力，且藉由病毒粒子表面的蛋白質彼此交聯而使粒子結構被固定化的病毒粒子。固定化病毒粒子，由於維持著與原本的病毒粒子或對應的去活化病毒粒子同等的粒子性，故免疫原性高。固定化病毒粒子，是藉由利用固定劑處理成為起源之病毒粒子或對應的去活化病毒粒子而獲得。此處所謂的「固定劑」，是意味著藉由共價鍵將病毒粒子的蛋白質彼此交聯的藥劑。例如，固定劑是使表面抗原彼此、表面抗原與基質蛋白質或膜蛋白質，或者是基質蛋白質彼此或膜蛋白質彼此交聯，而保持病毒粒子的粒子結構的藥劑。

所謂的「去活化病毒粒子」，是意味著沒有對宿主的感染能力，且粒子結構沒有被固定化的病毒粒子。去活化病毒粒子，是藉由利用去活化劑處理成為起源之病毒粒子而獲得。流行性感冒病毒粒子的情況中，去活化病毒粒子，例如可以是藉由在包含流行性感冒病毒粒子的懸浮液中，以最終濃度成為0.02v/v%（以甲醛換算為0.0072～0.0076w/v%）的方式添加福馬林（36～38w/v%甲醛水溶液），並於4℃反應6週而獲得的去活化病毒粒子。日本腦炎病毒粒子的情況中，去活化病毒粒子，例如可以是市售的Vero細胞培養日本腦炎疫苗原料藥（化學及血清療法研究所製造，商品名「ENCEVAC」，包含利用0.08v/v%福馬林去活化完成的日本腦炎病毒粒子）。

放熱試驗，是遵照在生物學性製劑基準（日本國，厚生勞動省告示第192號）所示之放熱試驗法的方法來進行。所謂的「放熱反應」，是意味著將檢體注射到耳靜脈內之後所測定而得的兔子的體溫（有時稱為「測定値」），與在注射前所測定而得的兔子的體溫（有時稱為「對照體溫」）的差（有時稱為「差體溫」）的最大値。此處，當差體溫為負値的時候，放熱反應是解釋為0。

具體而言，是用以下的順序進行放熱試驗。首先，用生理食鹽水稀釋固定化病毒粒子，並將1mL中的蛋白質含量設成70μg（日本腦炎病毒粒子的情況）或設成240μg（流行性感冒病毒粒子的情況）的固定化病毒粒子當作試料。將上述試料，以每1kg體重為1～3mL的量接種到兔子，觀察發熱的上昇，直到6小時後為止。求出接種試料前的兔子的體溫（對照體溫）與接種後的兔子的體溫的差，將該差的最大値當作該兔子的放熱反應。對3隻兔子進行同樣的試驗，求出3隻兔子的放熱反應之和（℃）。

上述疫苗，在放熱試驗中，以成為固定化病毒粒子的起源之病毒粒子或對應的去活化病毒粒子於3隻兔子中的放熱反應之和為基準計，固定化病毒粒子於3隻兔子中的放熱反應之和，亦可未達80%，亦可未達60%，亦可未達40%，亦可未達20%，亦可未達10%。下限雖然沒有特別限制，以成為固定化病毒粒子的起源之病毒粒子或對應的去活化病毒粒子於3隻兔子中的放熱反應之和為基準計，亦可在0%以上，亦可在20%以上。藉由將放熱反應之和設定在上述範圍內，而能夠提供一種疫苗，其與習知的包含去活化病毒粒子的全顆粒疫苗相比，副反應受到抑制。

上述疫苗，在放熱試驗中，固定化病毒粒子於3隻兔子中的放熱反應之和，亦可在1.3℃以下，亦可在0.9℃以下，亦可在0.5℃以下。下限雖然沒有特別限制，亦可在0℃以上，亦可在0.6℃以上。藉由將放熱反應之和設定在上述範圍內，而能夠提供一種疫苗，其與習知的包含去活化病毒粒子的全顆粒疫苗相比，副反應受到抑制。

所謂的「發炎性細胞激素」，是伴隨發炎而產生的細胞激素的總稱，例如可舉出：IL-1β、IL-6、TNF-α、IFN-α、IFN-γ等。

所謂的「人類周邊血液單核細胞」（PBMC），是意味著由人類的周邊血液得到的淋巴球（包含T細胞、B細胞、NK細胞等）及單核球。

發炎性細胞激素的量，是以遵照歐洲藥典MONOCYTE-ACTIVATION TEST(單核球活化試驗法)的方法，利用將藉由病毒粒子刺激人類周邊血液單核細胞（PBMC）時的發炎性細胞激素的產量進行定量來求得。作為上述方法，亦可為在歐洲藥典MONOCYTE-ACTIVATION TEST中進行了變更後述的實施例所示的測定條件的方法。

上述疫苗，以藉由成為固定化病毒粒子的起源之病毒粒子或對應的去活化病毒粒子而受到刺激的人類周邊血液單核細胞所產生的發炎性細胞激素的量為基準計，藉由固定化病毒粒子而受到刺激的人類周邊血液單核細胞所產生的發炎性細胞激素的量亦可未達80%，亦可未達60%，亦可未達40%，亦可未達20%，亦可未達10%。下限雖然沒有特別限制，以藉由成為固定化病毒粒子的起源之病毒粒子或對應的去活化病毒粒子而受到刺激的人類周邊血液單核細胞所產生的發炎性細胞激素的量為基準計，亦可在0%以上，亦可在40%以上。透過將藉由固定化病毒粒子而受到刺激的人類周邊血液單核細胞所產生的發炎性細胞激素的量設定在上述範圍內，而能夠提供一種疫苗，其與習知的包含去活化病毒粒子的全顆粒疫苗相比，副反應受到抑制。

發炎性細胞激素為IL-1β的情況，藉由固定化病毒粒子而受到刺激的人類周邊血液單核細胞所產生的發炎性細胞激素之濃度，以包含上述人類周邊血液單核細胞的培養液為基準計，亦可在30pg/ml以下，亦可在20pg/ml以下。下限雖然沒有特別限制，但亦可在0pg/ml以上，亦可在5pg/ml以上。透過將藉由固定化病毒粒子而受到刺激的人類周邊血液單核細胞所產生的發炎性細胞激素之濃度設定在上述範圍內，而能夠提供一種疫苗，其與習知的包含去活化病毒粒子的全顆粒疫苗相比，副反應受到抑制。

發炎性細胞激素為IL-6的情況，藉由固定化病毒粒子而受到刺激的人類周邊血液單核細胞所產生的發炎性細胞激素之濃度，以包含上述人類周邊血液單核細胞的培養液為基準計，亦可在50pg/ml以下，亦可在40pg/ml以下。下限雖然沒有特別限制，但亦可在0pg/ml以上，亦可在5pg/ml以上。透過將藉由固定化病毒粒子而受到刺激的人類周邊血液單核細胞所產生的發炎性細胞激素之濃度設定在上述範圍內，而能夠提供一種疫苗，其與習知的包含去活化病毒粒子的全顆粒疫苗相比，副反應受到抑制。

作為成為固定化病毒粒子的起源之病毒粒子，例如可舉出：痘病毒粒子、皰疹病毒粒子、正黏液病毒粒子、副黏液病毒粒子、棒狀病毒粒子、冠狀病毒粒子、沙狀病毒粒子、披衣病毒粒子、黃病毒粒子、崩芽病毒粒子、反轉錄病毒粒子、嗜肝DNA病毒粒子、腺病毒粒子、乳突狀瘤病毒粒子、乳突多瘤空泡病毒粒子、絲狀病毒粒子、里奧病毒粒子、小核糖核酸病毒粒子及杯狀病毒粒子。上述正黏液病毒粒子，例如可舉出流行性感冒病毒粒子。上述黃病毒粒子，例如可舉出日本腦炎病毒粒子。上述小核糖核酸病毒粒子，例如可舉出A型肝炎病毒粒子。

作為流行性感冒病毒粒子，例如可舉出A型流行性感冒病毒粒子和B型流行性感冒病毒粒子。在A型流行性感冒病毒粒子的情況中，例如可舉出被分類成H1N1亞型株、H2N2亞型株、H3N2亞型株、H3N8亞型株、H5N1亞型株、H5N2亞型株、H5N6亞型株、H6N1亞型株、H7N3亞型株、H7N7亞型株、H7N9亞型株、H9N2亞型株、或H10N8亞型株的流行性感冒粒子。

作為日本腦炎病毒粒子，例如可舉出日本腦炎病毒粒子的北京-1株、中山株（中山-予研株）、或SA14-14-2株及P3株。

固定化病毒粒子，由於如同裂解疫苗般粒子結構並未被破壞，故包含源自病毒粒子的基因組核酸（DNA、RNA等）。源自病毒粒子的基因組核酸可作為佐劑來作用。例如，在去活化小兒麻痺病毒疫苗中，有包含病毒基因組RNA的D抗原、與不含病毒基因組RNA的C抗原。C抗原的免疫原性弱，不會顯示出作為疫苗抗原的功效。具有作為疫苗抗原功效的分子物種只有D抗原。這件事暗示著，內含在疫苗中的病毒基因組RNA對於展現其功效是很重要的。因此，本實施形態之疫苗，可誘導Th1型反應。這與裂解流行性感冒疫苗是誘導Th2型反應的情況為互相對照。在小鼠中，比起藉由Th2型反應所誘導的IgG1亞型的抗體，藉由Th1型反應所誘導的IgG2a亞型的抗體對流行性感冒病毒的感染防禦能力更為優異。由此可見，能夠期待更加提升藉由上述疫苗的有效性。亦即，當對小鼠進行了免疫時，比起對固定化病毒粒子具特異性的IgG1，上述疫苗誘導出更多的對固定化病毒粒子具特異性的IgG2a。

固定化病毒粒子，當藉由蔗糖密度梯度離心法、高效液相層析法、及/或動態光散射法進行了測定時，亦可與原本的病毒粒子或對應的去活化病毒粒子為實質上相同的參數（例如：分子量、平均粒徑、密度、血球凝集素（HA）含量等）。

例如，固定化病毒粒子，亦可具有原本的病毒粒子或對應的去活化病毒粒子的粒徑的80%～150%的平均粒徑，亦可具有90%～140%的平均粒徑。日本腦炎病毒粒子的情況，固定化病毒粒子，亦可具有原本的病毒粒子或對應的去活化病毒粒子的粒徑的90%～130%的平均粒徑，亦可具有100%～120%的平均粒徑。

當固定化病毒粒子以流行性感冒病毒粒子作為起源時，固定化病毒粒子的平均粒徑，在以動態光散射法測定時是在150nm左右，亦可在120nm～180nm，亦可在130nm～170nm。在其他方面中，固定化病毒粒子當以流行性感冒病毒粒子作為起源時，固定化病毒粒子的平均粒徑，在以動態光散射法測定時亦可在100nm以上，亦可在120nm以上，亦可在130nm以上，亦可在150nm以上，亦可在170nm以上。上述平均粒徑，亦可在180nm以下，亦可在175nm以下，亦可在170nm以下。當固定化病毒粒子以日本腦炎病毒粒子作為起源時，固定化病毒粒子的平均粒徑，在以動態光散射法測定時是在90nm左右，亦可在80nm～110nm。在其他方面中，當固定化病毒粒子以日本腦炎病毒粒子作為起源時，固定化病毒粒子的平均粒徑，在以動態光散射法測定時亦可在70nm以上，亦可在80nm以上，亦可在90nm以上。上述平均粒徑，亦可在110nm以下，亦可在100nm以下。

當固定化病毒粒子以具有外膜的病毒粒子作為起源時，上述固定化病毒粒子的脂質成分的含量，相對於上述病毒粒子的脂質成分的含量，亦可同等。

固定化病毒粒子，當藉由蔗糖密度梯度離心法進行測定時，亦可在蔗糖濃度35%以上檢測出峰，亦可在蔗糖濃度45%以上且55%以下檢測出峰。上述蔗糖濃度，可藉由公知的方法來求得。例如，將包含固定化病毒粒子的檢體疊置於15～60%的蔗糖密度梯度，藉由在4℃、18000rpm（RCF＝57500（×g））進行16小時的離心分離能夠求得上述蔗糖濃度。

固定化病毒粒子，當藉由高效液相層析（尺寸篩除層析（size exclusion chromatography；SEC））進行測定時，亦可確認到單峰性的峰。例如，使用尺寸篩除層析（商品名：TSKgel G6000PWXL（TOSOH公司製造）或Superose 6 10/300 GE（GE Healthcare公司製造））進行分子量測定時（溶析液：PBS，流速：0.5ml/min），亦可為溶出時間在14～15分鐘附近可確認單峰性的峰的日本腦炎病毒粒子的固定化病毒粒子，亦可為溶出時間在16～17分鐘附近可確認單峰性的峰的流行性感冒病毒粒子的固定化病毒粒子。

上述疫苗，其固定化病毒粒子表面的0%～90%的蛋白質，亦可沒有固定化，其固定化病毒粒子表面的5%～80%的蛋白質，亦可沒有固定化。

作為固定化病毒粒子表面的蛋白質，可舉出：表面抗原、基質蛋白質、膜蛋白質、及該等的組合。

當病毒粒子為流行性感冒病毒粒子的情況，作為上述表面抗原，例如可舉出：血球凝集素（HA）、神經胺酸酶（NA）。作為上述基質蛋白質，例如可舉出M1蛋白質。作為上述膜蛋白質，例如可舉出M2蛋白質。

當病毒粒子為日本腦炎病毒粒子的情況，作為上述表面抗原，例如可舉出：E蛋白質、M蛋白質。

作為算出沒有固定化之蛋白質的比例的方法，例如，可舉出成為對象的蛋白質其原本的分子量中，求出固定化前與固定化後的蛋白質的量的變化率（殘存率）的方法。例如，可舉出一種算出M1蛋白質的殘存率（%）的方法，其是當固定化病毒粒子是將流行性感冒病毒粒子作為起源時，在進行了還原條件下的SDS-PAGE（聚丙烯醯胺膠體電泳）後，藉由密度測定法求出病毒的構成蛋白質之一的M1蛋白質的泳帶濃度，來算出M1蛋白質的殘存率（%）。這種情況，隨著提高固定劑的濃度，M1蛋白質的殘存率有降低的傾向。藉由應用此方法，能夠進行透過固定劑實行的交聯度分析。

於本實施形態中，當固定化病毒粒子是將流行性感冒病毒粒子作為起源時，M1蛋白質的殘存率亦可在5%～90%，M1蛋白質的殘存率亦可在10%～80%。換言之，M1蛋白質的5%～90%亦可沒有固定化，其10%～80%亦可沒有固定化。

交聯度分析，亦能夠藉由求出固定化病毒粒子的比活性（抗原含量/蛋白質含量）來進行。使用於病毒粒子的抗原含量測定的單株抗體，會辨識中和抗原決定位，若中和抗原決定位的結構發生變化則比活性會降低。利用此性質，算出相對於沒有進行固定化的病毒粒子，固定化病毒粒子的比活性的相對値（%），評估交聯度。於本實施形態中，比活性的相對値在0～95%的範圍。當固定化病毒粒子是將日本腦炎病毒作為起源時，固定化日本腦炎病毒粒子的比活性的相對值亦可在90～95%，亦可在70～90%，亦可在50～70%。

疫苗所包含的固定化病毒粒子的量，亦可依照病毒的種類或投予對象來適當選擇。例如，流行性感冒疫苗所包含的固定化病毒粒子的量（濃度），作為血球凝集素濃度，每一病毒株亦可為1～40μgHA/mL。

疫苗亦可為單一疫苗，其包含源自相同種類的病毒或細菌的抗原。疫苗亦可為混合疫苗，其包含源自複數種類的病毒或細菌的抗原。疫苗亦可為多價疫苗，其包含為同屬的病毒或細菌，但源自複數種類類型的抗原。例如，當疫苗為流行性感冒病毒疫苗的情況，亦可包含固定化A型流行性感冒病毒粒子或固定化B型流行性感冒病毒粒子中任一種，亦可該等兩者都包含。當疫苗為日本腦炎病毒疫苗的情況，亦可包含源自細胞培養或源自小鼠腦的病毒中任一種。上述流行性感冒病毒疫苗或日本腦炎病毒疫苗，亦可包含源自其他病毒或細菌的抗原。例如，亦可混合在白喉、百日咳、破傷風、去活化小兒麻痺病毒混合疫苗（DPT-IPV疫苗）中。

疫苗的劑型，例如，亦可為液狀、粉末狀（冷凍乾燥粉末、乾燥粉末等）、膠囊狀、錠劑、冷凍狀態。

疫苗，亦可包含可容許作為醫藥品的載體。作為上述載體，能夠沒有限制地使用通常用於疫苗製造的載體。具體而言，上述載體可舉出：食鹽水、緩衝食鹽水、葡萄糖、水、甘油、等張水性緩衝液及該等的組合。疫苗亦可進一步適當調配乳化劑、保存劑（例如：硫柳汞）、等滲壓劑、pH調整劑、去活化劑（例如：福馬林）等。

疫苗的投予途徑，例如亦可為：經皮投予、舌下投予、點眼投予、皮內投予、肌肉內投予、經口投予、經腸投予、經鼻投予、靜脈內投予、皮下投予、腹腔內投予、經口到肺的吸入投予。

疫苗的投予方法，例如亦可為藉由注射器、經皮性貼劑、微針、可移植的緩釋性裝置、附有微針的注射器、無針裝置、或噴劑的投予方法。

為了進一步提高免疫原性，疫苗亦可包含佐劑。作為佐劑，例如可舉出：鋁佐劑或包含鯊烯的水中油型乳化佐劑（AS03、MF59等）；CpG和3-O-去醯基化-4’-單磷醯脂質A（3-O-desacyl-4'-monophosphoryl lipid A；MPL）等的類鐸受體(Toll-like receptor)的配位基；皂素系佐劑；聚γ-麩胺酸等的聚合物系佐劑；以及，幾丁聚糖和菊糖等的多醣類。

作為成為對象的哺乳動物，例如可舉出：小鼠、大鼠、天竺鼠、倉鼠、兔子、貓、狗、綿羊、豬、牛、馬、山羊、猴、人等。本實施形態之疫苗，亦可對人使用，亦可對未滿5歳的兒童、65歳以上的高齡者使用。

疫苗雖然依照投予的目的、投予方法、投予對象的狀態（性別、年齡、體重、病況等）而異，但在流行性感冒疫苗對人投予的情況，亦可以每1次投予3.8μgHA～30μgHA的有效成分（固定化病毒粒子）的方式來使用。

固定化病毒粒子的製造方法 本實施形態之固定化病毒粒子的製造方法，其包含一步驟，該步驟為對成為起源之病毒粒子或對應的去活化病毒粒子，將粒子結構進行固定化。

作為提高疫苗安全性的技術，從習知可知，使用界面活性劑或有機溶劑來破壞具有外膜的病毒粒子（裂解化）的方法。然而，在這些方法，隨著粒子的崩壞而疫苗的有效性（免疫原性）有降低的傾向。在上述製造方法，由於是將成為起源之病毒粒子或對應的去活化病毒粒子，利用會引起與病毒粒子蛋白質的共價鍵的固定劑來處理，故病毒粒子結構能夠維持，就結果而言，變得能維持疫苗的有效性，而且提高安全性。

上述製造方法中，亦可進一步包含下列步驟：培養宿主的步驟、使宿主感染病毒的步驟、使病毒在宿主內增殖的步驟、從宿主回收病毒粒子的步驟、或將回收後的病毒粒子進行去活化的步驟。

病毒粒子，亦可為於宿主感染病毒粒子，使之增殖後，從宿主回收後的病毒粒子。宿主亦可依照病毒粒子的種類來適當選擇。將病毒粒子進行去活化的方法，使用公知的方法即可，例如可舉出利用福馬林等的去活化劑來進行去活化的方法。當病毒粒子為流行性感冒病毒粒子的情況，作為宿主，例如可舉出：培養細胞、雞蛋及小鼠腦。作為培養細胞，可為初代細胞亦可為株化細胞。作為培養細胞，例如可舉出Vero細胞及MDCK細胞。

作為流行性感冒病毒的感染、增殖方法，對本發明所屬技術領域中具有通常知識者而言，有下述公知的方法：將雞蛋或Vero細胞作為宿主來使用的方法（Vaccine.1998May-Jun；16（9-10）：960-8.）、將Vero細胞作為宿主來使用的方法（Vaccine.2007August10；25（32）：6028-6036.）、將MDCK細胞作為宿主來使用的方法（JVirol.2012Nov；86（22）：12341-50）。

病毒粒子的固定化 上述進行固定化的步驟，可例示利用固定劑來處理成為起源之病毒粒子或對應的去活化病毒粒子的方法，例如可舉出在包含成為起源之病毒粒子或對應的去活化病毒粒子的懸浮液中添加固定劑的步驟。懸浮液中的病毒粒子的濃度，亦可依照病毒的種類、固定劑的種類及其濃度等來適當變更。例如，懸浮液中的病毒粒子的濃度，作為病毒粒子的蛋白質的濃度，亦可在60～90μg/mL，亦可在300～3000μg/mL，亦可在500～2500μg/mL。

固定劑的種類，能夠依照病毒的種類適當變更。例如，上述固定劑可舉出：有機溶劑、醛類、二亞胺酯、雙（3,5-二溴水楊基）延胡索酸酯（Bis(3,5-dibromosalicyl)fumarate；DBBF）、碳二醯亞胺類、及該等的組合。作為有機溶劑，例如可舉出：甲醇、乙醇、丙酮、及該等的組合。作為醛類，例如可舉出：甲醛（FA）（例如，福馬林）、三聚甲醛、戊二醛（GA）、及該等的組合。作為碳二醯亞胺類，例如可舉出：二環己基碳二醯亞胺（DCC）、二異丙基碳二醯亞胺（DIC）、1-乙基-3-（3-二甲胺丙基）碳二醯亞胺鹽酸鹽（EDC）、該等的類似物及該等的組合。

固定劑的濃度，亦可依照病毒的種類、固定劑的種類適當變更。當固定劑包含甲醛的情況，甲醛的濃度以包含病毒粒子的懸浮液及固定劑的總量為基準計，亦可在0.005～0.5w/v%。當上述甲醛的濃度未達0.005w/v%時，固定化會變弱，有著粒子結構難以保持的傾向。當上述甲醛的濃度超過0.5w/v%時，固定化強，有著藉由交聯的化學修飾過度進行的傾向。從要更加提升HA活性的觀點而言，以上述懸浮液及固定劑的總量為基準計，甲醛的濃度亦可在0.01～0.5w/v%，亦可在0.018～0.152w/v%，亦可在0.029～0.152w/v%，亦可在0.029～0.076w/v%。使用包含甲醛的固定劑的方法，亦可用在病毒粒子為流行性感冒病毒粒子、日本腦炎病毒粒子的情況。

當固定劑為福馬林（36～38w/v%甲醛水溶液）時，福馬林濃度以上述懸浮液及固定劑的總量為基準計，亦可在0.014～0.4v/v%，亦可在0.05～0.4v/v%，亦可在0.08～0.4v/v%，亦可在0.08～0.2v/v%。

當固定劑包含戊二醛時，以上述懸浮液及固定劑的總量為基準計，戊二醛的濃度亦可在0.001～0.06w/v%，亦可在0.002～0.05w/v%，亦可在0.004～0.02w/v%，亦可在0.005～0.01w/v%。當上述濃度未達0.001w/v%時，使用了日本腦炎病毒粒子作為病毒粒子時，粒子有凝集的傾向。當上述濃度超過0.06w/v%時，使用了日本腦炎病毒粒子作為病毒粒子時，主要結構蛋白質也就是E蛋白質的抗原決定位有失活的傾向。使用戊二醛作為固定劑的方法，亦可用在病毒粒子為流行性感冒病毒粒子、日本腦炎病毒粒子的情況。

當固定劑包含EDC時，以上述懸浮液及固定劑的總量為基準計，EDC的濃度亦可在0.05～1500mM，亦可在0.15～500mM，亦可在5～50mM。使用包含EDC的固定劑的方法，亦可用在病毒粒子為流行性感冒病毒粒子、日本腦炎病毒粒子的情況。

利用固定劑處理時的溫度，亦可依照病毒的種類、固定劑的種類、固定劑的濃度等來適當變更。上述溫度亦可在0℃（冰浴）～37℃，亦可在4℃～37℃，亦可在25℃～37℃。

利用固定劑處理時的期間（處理時間），亦可依照病毒的種類、固定劑的種類、固定劑的濃度、處理的溫度等來適當變更。上述期間亦可在1日到4週之間，亦可在3日到4週之間，亦可在1週到4週之間。當使用EDC作為固定劑的情況，上述期間亦可在5分鐘～24小時，亦可在0.5小時～24小時，亦可在2小時～20小時。

為了停止藉由固定劑的交聯的進行，亦可使用甘胺酸等的胺基酸來進行阻停處理(quenching treatment)。另外，阻停處理有著以疫苗的穩定性、免疫原性、及安全性的提升為目的而進行的情況。

視需要，亦可進一步包含將經回收的固定化病毒粒子進行精製的步驟。作為精製固定化病毒粒子的方法，雖然可藉由公知的方法適當進行，例如可舉出使用超過濾膜來過濾的方法。

本實施形態之疫苗的製造方法，包含一步驟，該步驟是添加藉由上述固定化病毒粒子的製造方法所獲得的固定化病毒粒子。在疫苗的製造方法中，亦可進一步包含一步驟，該步驟是添加可容許作為醫藥品的載體、乳化劑、保存劑、等滲壓劑、pH調整劑、去活化劑等。

在疫苗接種上，較佳是能夠給予對象與實際感染時同樣的免疫的質與量，相對於藉由實際感染所引起的免疫，藉由疫苗所誘導的免疫的仿效性來決定其功效。在疫苗中，亦可包含全部的作為用以防禦感染的抗原的病毒蛋白質。本案發明人認為，若是根據用以提高病毒蛋白質的免疫原性的源自病毒的基因組核酸的存在、病毒粒子的大小、形狀等，各自分別在免疫反應中起作用，則所謂最佳的疫苗就是與實際的病毒具有較為相近的成分及結構者。本實施形態之固定化病毒粒子，藉由僅利用固定劑進行固定化，除此以外由於具有與原本的病毒粒子同等的成分及結構，而能提供一種疫苗，其免疫原性高，且副反應受到抑制。 [實施例]

以下，藉由實施例來詳細說明本發明，但本發明並不限定於這些實施例。

實施例1 1.源自流行性感冒病毒粒子的抗原的製備 （1）FA固定化流行性感冒病毒粒子的製備 甲醛（FA）處理 將A型流行性感冒病毒H1N1亞型株（A/California/07/2009（X-179A）株，以下有時記載為「A/CA株」）接種到11日齡的發育雞蛋的絨毛膜尿囊腔內，於34℃培養了2日。將獲得的絨毛膜尿囊液經過澄清化後，藉由超離心分離使流行性感冒病毒粒子沈澱。將上述流行性感冒病毒粒子利用磷酸緩衝生理食鹽水（PBS）使之再次懸浮而獲得懸浮液。將獲得的懸浮液利用蔗糖密度梯度離心法（RCF＝57500（×g），16小時）進行離心分離，並藉由回收蔗糖濃度為33%～50%的級分(fraction)，精製成流行性感冒粒子。以精製後的流行性感冒病毒粒子的蛋白質最終濃度成為500μg/mL的方式，稀釋獲得的級分，獲得了懸浮液。之後，以最終濃度成為0.05～0.20v/v%（用甲醛換算為0.018～0.076w/v%）的方式添加福馬林（36～38w/v%甲醛水溶液）到上述懸浮液中，於25℃使之反應1週。反應結束後，利用PBS來透析反應液，藉由去除甲醛獲得了固定化流行性感冒病毒粒子（以下有時記載為「FA固定化流行性感冒病毒粒子」）。

（2）去活化流行性感冒病毒粒子的製備 上述懸浮液中，以最終濃度成為0.02v/v%（用甲醛換算為0.0072～0.0076w/v%）的方式添加福馬林（36～38w/v%甲醛水溶液），於4℃使之反應6週～8週。反應結束後，利用PBS來透析反應液，藉由去除甲醛獲得了去活化流行性感冒病毒粒子。利用同樣的方法，亦針對其他的流行性感冒病毒株（亞型株）製備去活化流行性感冒病毒粒子，在實施例1～6中作為比較對照來使用。

（3）裂解流行性感冒病毒抗原的製備 作為比較對照的裂解流行性感冒病毒抗原（以下有時記載為「裂解流感抗原」），是使用了流行性感冒HA疫苗（化學及血清療法研究所製造，商品名「流行性感冒HA疫苗“化血研”」）所包含的各株的原液。

2.放熱試驗 遵照生物學性製劑基準（日本國，厚生勞動省告示第192號），進行了放熱試驗。將去活化流行性感冒病毒粒子、FA固定化流行性感冒病毒粒子及裂解流感抗原利用生理食鹽水來稀釋，將1mL中的蛋白質含量達240μg者作為試料。將上述試料以每1kg體重為1～3mL的量接種到兔子，觀察發熱的上昇，直到6小時後為止。求出接種試料前的兔子體溫（對照體溫）與接種後的兔子體溫的差，將該差的最大値作為該兔子的放熱反應。對3隻兔子進行了同樣的試驗。3隻兔子的放熱反應之和（℃）顯示於表1。

[表1]

FA固定化流行性感冒病毒粒子，都沒有確認到1.3℃以上的放熱反應之和，與去活化流行性感冒病毒粒子相比，可見到3℃以上的放熱反應之和的減少。由結果可知，FA固定化流行性感冒病毒粒子與裂解流感抗原同樣，放熱反應之和相當低。由此亦教示了，FA固定化流行性感冒病毒粒子，與裂解流感抗原同樣地具有高安全性。

3.定量發炎性細胞激素的產量 以遵照歐洲藥典MONOCYTE-ACTIVATION TEST的方法，來定量發炎性細胞激素（IL-6）的產量，該發炎性細胞激素是藉由利用了濃度為0.05v/v%、0.08v/v%、0.11v/v%的福馬林固定而成的FA固定化流行性感冒病毒粒子或去活化流行性感冒病毒粒子來刺激人類周邊血液單核細胞（PBMC）時的發炎性細胞激素。具體而言，歐洲藥典MONOCYTE-ACTIVATION TEST中的將人類PBMC以最少4位供給者份作為混合池來使用的部份，變更成1位供給者份，而進行了測定。FA固定化流行性感冒病毒粒子及去活化流行性感冒病毒粒子的細胞激素的產量的結果顯示於表2。可知FA固定化流行性感冒病毒粒子中的IL-6的產量，與去活化流行性感冒病毒粒子相比相當低。由此教示了，FA固定化流行性感冒病毒粒子，與去活化流行性感冒病毒粒子相比具有高安全性。

[表2]

實施例2 物性評估 1.藉由蔗糖密度梯度離心法實行的分析 以遵照上述實施例1的方法，以流行性感冒病毒粒子（A/CA株）的蛋白質的最終濃度成為2500μg/mL的方式，稀釋獲得的級分而得到懸浮液。之後，以最終濃度成為0.12v/v%的方式添加福馬林到上述懸浮液，於25℃使之反應1週。藉由利用PBS來透析反應液，獲得了FA固定化流行性感冒病毒粒子。將獲得的FA固定化流行性感冒病毒粒子藉由蔗糖密度梯度離心法進行了分析。將檢體疊置於15～60%的蔗糖密度梯度，於4℃、18000rpm（57500（×g））進行了離心分離16小時。離心後，以每1級分0.6mL進行劃分，測定了各級分的蔗糖濃度、HA價及蛋白質濃度。A/CA株（H1N1亞型株）的結果顯示於表3。在裂解流感抗原，蛋白質廣泛分布於蔗糖濃度25～50%，顯示出病毒粒子正在分解。相對於此，在FA固定化流行性感冒病毒粒子，顯示出是在高蔗糖濃度（44.3%）以單一峰（粒子性）被劃分。關於HA活性是10240倍。

[表3]

2.藉由電子顯微鏡實行的解析 為了更詳細調查上述FA固定化流行性感冒病毒粒子（A/CA株）的形狀，實施了藉由電子顯微鏡的觀察。使用戊二醛將檢體於室溫固定20分鐘。之後，在觀察用的經離子塗覆的片狀網(sheet mesh)（日新EM公司製造）上，放上經固定的檢體，靜置約60秒，利用2%磷鎢酸水溶液進行了負染色。將染色後的檢體，使用穿透式電子顯微鏡（FEI Company公司製造的TecnaiG2：加速電壓120kV）進行了觀察、拍攝。

將FA固定化流行性感冒病毒粒子經以電子顯微鏡拍攝的相片顯示於第1圖。FA固定化流行性感冒病毒粒子，與去活化流行性感冒病毒粒子同樣地保有粒子結構。

3.動態光散射 遵照實施例1的方法製作將A型流行性感冒病毒H3N2亞型株（A/NewYork/39/2012（X-233A）株，以下有時記載為「A/NY株」）及B型流行性感冒病毒維多利亞系統株（B/Brisbane/60/2008株，以下有時記載為「B/BR株」）成為起源之FA固定化流行性感冒病毒粒子，使用Zetasizer Nano ZS（Malvern公司製造）進行解析各自的平均粒徑。藉由動態光散射法測得的液體中的平均粒徑顯示於表4。FA固定化流行性感冒病毒粒子，其平均粒徑在140～150nm左右且為單峰性。由此可知，FA固定化流行性感冒病毒粒子的平均粒徑，與去活化流行性感冒病毒粒子同等。又，FA固定化流行性感冒病毒粒子保有粒子結構，沒有確認到如凝集體般的雜質。

[表4]

4.分子量分布測定（SEC） 關於B型流行性感冒病毒的山形系統株（B/Massachusetts/02/2012（BX-51B）株（以下有時記載為「B/MA株」）），以遵照上述實施例1的方法製作了FA固定化流行性感冒病毒粒子（B/MA株）。關於A/CA株（H1N1亞型株）、A/NY株（H3N2亞型株）、及B/MA株（B型株），將裂解流感抗原、及FA固定化流行性感冒病毒粒子的分子量分布測定，使用尺寸篩除層析（商品名：TSKgel G6000PWXL（TOSOH公司製造））進行了分子量測定（溶析液中使用PBS，流速以0.5ml/min進行）。其溶出樣式顯示於表5。FA固定化流行性感冒病毒粒子在溶出時間16～17分鐘附近確認到單峰性的峰。另一方面，源自同一株的裂解流感抗原在溶出時間19～30分鐘附近確認到三峰性的峰。

[表5]

5.藉由交聯度的分析 針對在實施例1製備成的FA固定化流行性感冒病毒粒子（A/CA株），使用以下的順序，分析藉由固定劑的交聯度。首先，於檢體中添加SDS-Buffer(十二烷基磺酸鈉緩衝液)（終濃度：Tris(三羥甲基氨基甲烷)0.76w/v%，SDS(十二烷基磺酸鈉)1w/v%，Glycerol(甘油)10v/v%，BromophenolBlue（溴酚藍；BPB）0.01w/v%）與2-巰基乙醇（終濃度：0.8v/v%），煮沸6分鐘後，使用PAGEL NPU-12.5L（ATTO公司製造，商品名）或PAGEL NPU-R12.5L（ATTO公司製造，商品名），進行了SDS-PAGE(十二烷基磺酸鈉-聚丙烯醯胺膠體電泳)。電泳後，進行CBB（考馬斯亮藍；Coomassie Brilliant Blue）染色，於LAS3000（富士FILM股份有限公司製造，商品名）讀取影像。若藉由固定劑的交聯增進時，構成病毒的蛋白質之一的M1蛋白質，會從原本的泳帶的位置（25～37kDa）朝向高分子側位移。因此，教示了於原本的位置所檢測出的M1蛋白質的泳帶（M1泳帶）會變得稀薄，將此作為交聯度的指標。具體而言，算出了相對於沒有進行固定化的流行性感冒病毒粒子的M1泳帶的密度測定値而言，利用各福馬林濃度處理過的FA固定化流行性感冒病毒粒子於原本的位置所檢測出的M1泳帶的密度測定値的相對值（%）（以下亦有將此相對值記載為「M1蛋白質殘存率」（%）的情況）。結果顯示於表6。利用福馬林濃度0.05%、0.08%、0.11%、0.14%固定而成的FA固定化流行性感冒病毒粒子（A/CA株）的M1蛋白質殘存率，分別是35.7%、23.8%、11.0%、5.4%，教示了隨著福馬林濃度的提高，交聯受到促進，M1蛋白質殘存率會降低。

[表6]

6.免疫原性1（小鼠肌肉內接種） 使用小鼠來評估FA固定化流行性感冒病毒粒子（A/CA株）中的免疫原性。於ddY小鼠（雌性，8週齡）中，將裂解流感抗原、去活化流行性感冒病毒粒子、或FA固定化流行性感冒病毒粒子（A/CA株），以蛋白質量為0.8μg的接種量進行了肌肉內接種（每一群為13隻）。於免疫3週後對小鼠進行全採血，並使之安樂死。藉由離心分離獲得血清，依照「病原體檢驗手冊」（國立感染症研究所編），測定了HI抗體力價。於小鼠進行了肌肉內接種時的免疫原性（HI抗體力價（GMT））的結果顯示於表7。FA固定化流行性感冒病毒粒子（A/CA株），與裂解流感抗原相比免疫原性較高，且是與去活化流行性感冒病毒粒子同等的免疫原性。

[表7]

7.免疫原性2（小鼠皮內接種） 使用與上述「6.免疫原性1（小鼠肌肉內接種）」相同的順序，藉由小鼠皮內接種來評估FA固定化流行性感冒病毒粒子（A/CA株）中的免疫原性。於ddY小鼠（雌性，8週齡）中，將裂解流感抗原、去活化流行性感冒病毒粒子、或FA固定化流行性感冒病毒粒子，以0.2μg作為蛋白質量的接種量進行了皮內接種（每一群5隻）。於免疫3週後對小鼠進行全採血，並使之安樂死。藉由離心分離獲得血清，測定了HI抗體力價。於小鼠進行了皮內接種時的免疫原性（HI抗體力價（GMT））的結果顯示於表8。FA固定化流行性感冒病毒粒子，與裂解流感抗原相比為具顯著性差異地免疫原性較高，且與去活化流行性感冒病毒粒子同等的免疫原性。

[表8]

8.免疫原性3（食蟹獼猴皮下接種） 針對A/CA株（H1N1亞型株）、A/NY株（H3N2亞型株）、B/BR株及B/MA株（B型株），使用食蟹獼猴（雄性或雌性，17～25個月齡）來評估裂解流感抗原、去活化流行性感冒病毒粒子、及FA固定化流行性感冒病毒粒子的免疫原性。將裂解流感抗原、去活化流行性感冒病毒粒子、或FA固定化流行性感冒病毒粒子，於每1群為8或9隻以相當於7.5μgHA（相當於裂解流感抗原的HA量的蛋白質量）的接種量，在21日的間隔進行了兩次的皮下接種。於第2次免疫前、及第2次免疫後的第21日進行了部分採血。藉由離心分離獲得血清，依照「病原體檢驗手冊」（國立感染症研究所編），測定了HI抗體力價及中和抗體力價。將免疫原性的結果，顯示於表9（第2次免疫後第21日的HI抗體力價（GMT））、表10（第2次免疫後第21日的中和抗體力價（GMT））。在HI抗體力價，可知FA固定化流行性感冒病毒粒子與裂解流感抗原相比具有較高的免疫原性。尤其是，在B/MA株以外，與裂解流感抗原相比為具顯著性差異地免疫原性較高。即使在中和抗體力價中，與裂解流感抗原相比，FA固定化流行性感冒病毒粒子在全部的A型株及B型株中，皆為具顯著性差異地免疫原性較高。

[表9]

[表10]

9.抗體亞型解析 作為抗體亞型解析，針對在上述「6.免疫原性1（小鼠肌肉內接種）」所獲得的A/CA株（H1N1亞型株）、及B/MA株（B型株），藉由酵素免疫測定（ELISA）法來測定小鼠的血清中所包含的對病毒抗原具特異性的IgG1及IgG2a抗體力價。其結果，FA固定化流行性感冒病毒粒子，顯示了誘導出比具抗原特異性的IgG1更多的具抗原特異性的IgG2a（表11、表12）。這與去活化流行性感冒病毒粒子是同樣的結果，即使是與裂解流感抗原的比較中，亦可見到較強的IgG2a誘導傾向。由此結果來看，FA固定化流行性感冒病毒粒子，與會活化體液性免疫但幾乎無法活化細胞性免疫的裂解流感抗原相比，能夠期待疫苗有效性的更加提升。

[表11]將經裂解流感抗原免疫的小鼠血清，分別稀釋25600倍時的值當作1EU/mL。

[表12]將經裂解流感抗原免疫的小鼠血清，分別稀釋25600倍時的值當作1EU/mL。

10.RNA釋放量的評估 針對以遵照實施例1的方法所製備成的FA固定化流行性感冒病毒粒子（A/NY株），用以下的順序來評估蛋白分解酶處理中的經時性的RNA釋放量。首先，利用PBS來稀釋FA固定化流行性感冒病毒粒子，加入SDS與Proteinase K(蛋白酶K)於55℃使之反應，經時性地萃取出RNA。在萃取RNA中，使用了TRIzol LS Reagent與PureLink RNA Mini Kit、PureLink DNase（invitrogen公司製造，商品名）。萃取出的RNA的含量，是利用Quant-iT RiboGreen RNA Reagent and Kit（invitrogen公司製造，商品名）來測定。各FA濃度的經時性的RNA含量顯示於表13。其結果，顯示出FA濃度依存性的RNA釋放被緩釋化。結果教示了藉由FA固定之RNA釋放的緩釋化，使發炎性細胞激素的產生被緩釋化，而孕育出高安全性。

[表13]

實施例3 （1）GA固定化流行性感冒病毒粒子的製備 1.戊二醛（GA）處理 將A型流行性感冒病毒（H3N2亞型株（A/NY株））及B型流行性感冒病毒（B型維多利亞系統株（B/BR株））用與實施例1同樣的方法進行了培養、精製。以精製後的各流行性感冒病毒粒子的蛋白質的最終濃度成為1000μg/mL的方式，稀釋各流行性感冒病毒粒子，獲得懸浮液。其次，使用1w/v%GA溶液，以GA濃度成為0.016w/v%或成為0.008w/v%的方式稀釋。將上述懸浮液，與經稀釋的GA溶液（0.016w/v%或0.008w/v%）等量混合，於4℃使之反應3日。反應結束後，利用PBS來透析反應液，藉由除去GA，獲得固定化流行性感冒病毒粒子（以下有時記載為「GA固定化流行性感冒病毒粒子」）。藉由利用3隻兔子中的放熱反應之和所評估的放熱試驗、及刺激了人類PBMC時的發炎性細胞激素的產量的定量，評估了獲得的GA固定化流行性感冒病毒粒子（A/NY株及B/BR株）的放熱活性。

2.放熱試驗 藉由與實施例1同樣的方法，進行了放熱試驗。用生理食鹽水稀釋去活化流行性感冒病毒粒子及GA固定化流行性感冒病毒粒子（A/NY株及B/BR株），將1mL中的蛋白質含量設在240μg作為試料。將上述試料，以每1kg體重為1mL的量接種到兔子上，觀察發熱的上昇，直到6小時後為止。A/NY株的3隻兔子的放熱反應之和（℃）顯示於表14，B/BR株的3隻兔子的放熱反應之和（℃）顯示於表15。

GA固定化流行性感冒病毒粒子，都沒有確認到1.3℃以上的放熱反應之和，以去活化流行性感冒病毒粒子為基準計，可見到降低了2.5℃以上或3℃以上的放熱反應之和。可知GA固定化流行性感冒病毒粒子，放熱反應之和相當低。由此亦教示了，與去活化流行性感冒病毒粒子相比，GA固定化流行性感冒病毒粒子具有較高安全性。

[表14]

[表15]

3.發炎性細胞激素的產量的定量 以遵照歐洲藥典MONOCYTE-ACTIVATION TEST的方法，定量了利用GA固定化流行性感冒病毒粒子或去活化流行性感冒病毒粒子刺激了人類PBMC時的細胞激素（IL-1β）的產量。具體而言，歐洲藥典MONOCYTE-ACTIVATION TEST中的將人類PBMC以最少4位供給者份作為混合池來使用的部份，變更成1位供給者份，而進行了測定。GA固定化流行性感冒病毒粒子（A/NY株及B/BR株）的細胞激素的產量的結果顯示於表16、表17。可知與去活化流行性感冒病毒粒子相比，GA固定化流行性感冒病毒粒子的發炎性細胞激素的產量相當低。由此教示了，GA固定化流行性感冒病毒粒子，與裂解流感抗原同樣地具有高安全性。

[表16]

[表17]

實施例4 物性評估 用以下的方法評估了在上述實施例3所獲得的GA固定化流行性感冒病毒粒子的物性。

1.藉由電子顯微鏡實行的解析 為了進一步詳細調查GA固定化流行性感冒病毒粒子（A/NY株）的形狀，用與實施例2同樣的方法，實施了藉由電子顯微鏡的觀察。作為代表，是將以0.008w/v%的GA濃度於4℃使之反應3日後的GA固定化流行性感冒病毒粒子（A/NY株）所拍攝成的相片顯示於第2圖。GA固定化流行性感冒病毒粒子保有粒子結構，並沒有確認到粒子彼此結合而成的凝集體。

2.動態光散射 使用Zetasizer Nano ZS（Malvern公司製造）來解析GA固定化流行性感冒病毒粒子的平均粒徑。藉由動態光散射法測得的液體中的平均粒徑顯示於表18。GA固定化流行性感冒病毒粒子，是平均粒徑在130～160nm左右且為單峰性。由此確認到，GA固定化流行性感冒病毒粒子的平均粒徑，與成為起源之病毒粒子同等。亦即，可知GA固定化流行性感冒病毒粒子的平均粒徑為單一種沒有改變。又，GA固定化流行性感冒病毒粒子的粒子結構保持著，沒有確認到如凝集體般的雜質。

[表18]

3.分子量分布測定（SEC） 用與實施例2同樣的方法（SEC）測定了GA固定化流行性感冒病毒粒子的分子量分布。其溶出樣式顯示於表19。裂解流感抗原是在溶出時間16～30分鐘附近辨認到四峰性的峰。另一方面，GA固定化流行性感冒病毒粒子是在溶出時間16～17分鐘附近辨認到單峰性的峰。

[表19]

4.藉由交聯度的分析 用與實施例2同樣的方法分析了GA固定化流行性感冒病毒粒子之利用固定劑的交聯度。B/BR株（B型維多利亞系統株）的結果顯示於表20。使用戊二醛濃度0.004w/v%、0.008w/v%固定而成的GA固定化流行性感冒病毒粒子的M1蛋白質殘存率，分別是23.8%、10.8%，可知隨著戊二醛濃度的提高，交聯受到促進，M1蛋白質殘存率會降低。

[表20]

5.免疫原性（小鼠肌肉內接種） 使用以下的順序來評估GA固定化流行性感冒病毒粒子（B/BR株）中的免疫原性。首先，於ddY小鼠（雌性，8週齡）中，將裂解流感抗原、或GA固定化流行性感冒病毒粒子以蛋白質量為0.8μg的接種量進行了肌肉內接種（每一群為16隻）。於免疫3週後對小鼠進行全採血，並使之安樂死。藉由離心分離獲得血清，測定了中和抗體力價。作為代表，將B/BR株（B型維多利亞系統株）的免疫原性（中和抗體力價（GMT））的結果顯示於表21。B型株的情況，GA固定化流行性感冒病毒粒子，與裂解流感抗原相比免疫原性較高。

[表21]

6.抗體亞型解析 作為抗體亞型解析，是藉由ELISA法測定了在上述「5.免疫原性（小鼠肌肉內接種）」獲得的小鼠的血清中所包含的對流行性感冒病毒的抗原具特異性的IgG1及IgG2a抗體力價。其結果，與裂解流感抗原互相對照地，GA固定化流行性感冒病毒粒子顯示了誘導出比具抗原特異性的IgG1更多的具抗原特異性的IgG2a（表22）。這與去活化流行性感冒病毒粒子是同樣的結果。由此結果來看，GA固定化流行性感冒病毒粒子，與會活化體液性免疫但幾乎無法活化細胞性免疫的裂解流感抗原相比，能夠期待疫苗有效性的更加提升。

[表22]將經裂解流感抗原（IgG1）、類病毒粒子（IgG2a）免疫的小鼠血清，分別稀釋25600倍時的值當作1EU/mL。

實施例5 （1）EDC固定化流行性感冒病毒粒子的製備 1.1-乙基-3-（3-二甲胺丙基）碳二醯亞胺鹽酸鹽（EDC）處理 將A型流行性感冒病毒（H3N2亞型株（A/NY株））及B型流行性感冒病毒（維多利亞系統株B/BR株）與實施例1同樣地進行了培養、精製。以精製後的各流行性感冒病毒粒子的蛋白質的最終濃度是A/NY株成為2500μg/mL、B/BR株成為500μg/mL的方式，稀釋獲得的級分，獲得懸浮液。將EDC溶液以成為0.1～4M的方式使用PBS進行階段稀釋，以最終濃度成為50～500mM的方式添加到懸浮液，於冰鎮（0℃），使之反應2～20小時。反應結束後，利用PBS來透析反應液，藉由除去EDC，獲得固定化流行性感冒病毒粒子（以下有時記載為「EDC固定化流行性感冒病毒粒子」）。藉由利用3隻兔子中的放熱反應之和所評估的放熱試驗、及刺激了人類PBMC時的發炎性細胞激素的產量的定量，評估了獲得的EDC固定化流行性感冒病毒粒子（A/NY株、B/BR株）的放熱活性。

2.放熱試驗 藉由與實施例1同樣的方法，進行了放熱試驗。用生理食鹽水稀釋EDC固定化流行性感冒病毒粒子，將1mL中的蛋白質含量設在240μg作為試料。EDC固定化流行性感冒病毒粒子，是使用了以50mM或500mM的EDC濃度，於冰鎮使之反應2小時後，利用PBS將反應液經過透析處理後的檢體（關於A/NY株亦實施了5mM的EDC濃度）。又，關於A/NY株，亦使用了以5mM的EDC濃度，於4℃使之反應20小時後，利用PBS將反應液經過透析處理後的檢體。將上述試料，以每1kg體重為1mL的量接種到兔子上，觀察發熱的上昇，直到6小時後為止。3隻兔子的放熱反應之和（℃）顯示於表23、表24。

EDC固定化流行性感冒病毒粒子，在全部的EDC處理條件下，並沒有確認到1.3℃以上的放熱反應之和。由此亦教示了，EDC固定化流行性感冒病毒粒子，與裂解流感抗原同樣地具有高安全性。

[表23]

[表24]

3.定量發炎性細胞激素的產量 以遵照歐洲藥典MONOCYTE-ACTIVATION TEST的方法，定量了利用EDC固定化流行性感冒病毒粒子或去活化流行性感冒病毒粒子刺激人類PBMC時的細胞激素（IL-1β及IL-6）的產量。具體而言，歐洲藥典MONOCYTE-ACTIVATION TEST中的將人類PBMC以最少4位供給者份作為混合池來使用的部份，變更成1位供給者份，而進行了測定。A/NY株及B/BR株的EDC固定化流行性感冒病毒粒子及去活化流行性感冒病毒粒子的細胞激素的產量的結果顯示於表25、表26。可知EDC固定化流行性感冒病毒粒子，與去活化流行性感冒病毒粒子相比，發炎性細胞激素產量相當低。由此教示了，與去活化流行性感冒病毒粒子相比，EDC固定化流行性感冒病毒粒子較容易抑制副反應。

[表25]

[表26]

實施例6 物性評估 用以下的方法評估了在上述實施例5所獲得的EDC固定化流行性感冒病毒粒子的物性。

1.藉由蔗糖密度梯度離心法實行的分析 藉由與實施例2同樣的方法，將EDC固定化流行性感冒病毒粒子藉由蔗糖密度梯度離心法進行了分析。作為代表，將在50mM的EDC濃度，於冰鎮使之反應2小時後的EDC固定化流行性感冒病毒粒子（A/NY株（H3N2亞型株））的結果顯示於表27。在裂解流感抗原，蛋白質廣泛分布於蔗糖濃度25～50%，顯示出病毒粒子正在分解。相對於此，在EDC固定化流行性感冒病毒粒子，顯示出是在高蔗糖濃度（47.2%）以單一峰（粒子性）被劃分。關於HA活性是10240倍。

[表27]

2.藉由電子顯微鏡實行的解析 為了詳細調查EDC固定化流行性感冒病毒粒子的形狀，用與實施例2同樣的方法，實施了藉由電子顯微鏡的觀察。作為代表，將在500mM的EDC濃度，於冰鎮使之反應2小時後的EDC固定化流行性感冒病毒粒子所拍攝的相片顯示於第3圖。EDC固定化流行性感冒病毒粒子保有粒子結構，並沒有確認到抗原彼此所結合而成的凝集體。

3.動態光散射 使用Zetasizer Nano ZS（Malvern公司製造）來解析EDC固定化流行性感冒病毒粒子的平均粒徑。藉由動態光散射法測得的液體中的平均粒徑顯示於表28。EDC固定化流行性感冒病毒粒子（A/NY株（H3N2亞型株）、B/BR株（B型株）），是平均粒徑在130～160nm左右且為單峰性。由此確認到，EDC固定化流行性感冒病毒粒子的平均粒徑，與成為起源之病毒粒子同等。亦即，可知即使經過EDC處理，固定化流行性感冒病毒粒子的平均粒徑仍為單一種沒有改變。又，EDC固定化流行性感冒病毒粒子的粒子結構保持著，沒有確認到如凝集體般的雜質。

[表28]

4.分子量分布測定（SEC） 測定了以H3N2亞型株（A/NY株）作為起源的EDC固定化流行性感冒病毒粒子的分子量分布。測定是使用尺寸篩除層析（商品名：TSKgel G6000PWXL（TOSOH公司製造））來進行（溶析液是使用PBS，流速是以0.5ml/min進行）。其溶出樣式顯示於表29。裂解流感抗原是在溶出時間16～30分鐘附近確認到四峰性的峰。另一方面，EDC固定化流行性感冒病毒粒子是在溶出時間16～17分鐘附近確認到單峰性的峰。

[表29]

5.藉由交聯度的分析 用與實施例2同樣的方法分析了藉由實施例5製備而成的EDC固定化流行性感冒病毒粒子之利用固定劑的交聯度。A/NY株（H3N2亞型株）的結果顯示於表30。利用EDC濃度50mM、500mM固定而成的EDC固定化流行性感冒病毒粒子的M1蛋白質殘存率（%），分別是85.7%、53.4%，可知隨著EDC濃度的提高，交聯受到促進，M1蛋白質殘存率會降低。B/BR株（B型維多利亞系統株）的結果顯示於表31。利用EDC濃度5mM、50mM、500mM固定而成的EDC固定化流行性感冒病毒粒子的M1蛋白質殘存率（%），分別是85.1%、56.1%、27.2%。可知與A/NY株（H3N2亞型株）同樣地，隨著EDC濃度的提高，交聯受到促進，M1蛋白質殘存率會降低。

[表30]

[表31]

6.免疫原性（小鼠肌肉內接種） 使用小鼠來評估EDC固定化流行性感冒病毒粒子中的免疫原性。藉由與實施例4同樣的方法獲得血清，測定了HI抗體力價及中和抗體力價。作為代表，將以50mM及500mM的EDC濃度，於冰鎮使之反應2小時後的EDC固定化流行性感冒病毒粒子的免疫原性的結果，顯示於表32（A/NY株的HI抗體力價（GMT））、表33（A/NY株的中和抗體力價（GMT））及表34（B/BR株的中和抗體力價（GMT））。A/NY株（H3N2亞型株）、及B/BR株（B型維多利亞系統株）的情況，與裂解流感抗原相比，EDC固定化流行性感冒病毒粒子為具顯著性差異的高免疫原性。

[表32]

[表33]

[表34]

7.抗體亞型解析 作為抗體亞型解析，藉由ELISA法來測定在上述「6.免疫原性（小鼠肌肉內接種）」所獲得的小鼠的血清中所包含的對病毒抗原具特異性的IgG1及IgG2a抗體力價。其結果，與裂解流感抗原互相對照地，EDC固定化流行性感冒病毒粒子顯示了誘導出比具抗原特異性的IgG1更多的具抗原特異性的IgG2a（表35、表36）。由此結果來看，EDC固定化流行性感冒病毒粒子，與會活化體液性免疫但幾乎無法活化細胞性免疫的裂解流感抗原相比，能夠期待疫苗有效性的更加提升。

[表35]將經裂解流感抗原（IgG1）、類病毒粒子（IgG2a）免疫的小鼠血清，分別稀釋25600倍時的值當作1EU/mL。

[表36]將經裂解流感抗原（IgG1）、類病毒粒子（IgG2a）免疫的小鼠血清，分別稀釋25600倍時的值當作1EU/mL。

8.免疫原性（食蟹獼猴皮下接種） 使用食蟹獼猴並用以下的順序來評估EDC固定化流行性感冒病毒粒子中的免疫原性。首先，對食蟹獼猴（雄性或雌性，29～35個月齡），將裂解流感抗原、或EDC固定化流行性感冒病毒粒子以HA含量為15μg的接種量進行了皮下接種（每一群為8隻）。間隔3週進行2次皮下接種，於第2次免疫後第4週進行了採血。藉由與實施例2同樣的方法獲得血清，測定了HI抗體力價及中和抗體力價。作為代表，以5mM的EDC濃度，於4℃反應20小時後的EDC固定化流行性感冒病毒粒子的免疫原性的HI抗體力價（GMT）的結果顯示於表37、中和抗體力價（GMT）的結果顯示於表38。在A/CA株（H1N1亞型株）、及A/NY株（H3N2亞型株）、B/MA株（B型山形系統）、B/BR株（B型維多利亞系統株）中，與裂解流感抗原相比，EDC固定化流行性感冒病毒粒子為具顯著性差異性地免疫原性較高。

[表37]

[表38]

9.嚴格試驗前後的穩定性（藉由交聯度的分析） 將嚴格試驗前後的交聯度的變化作為指標，來評估藉由實施例5製備成的EDC固定化流行性感冒病毒粒子的穩定性。首先，藉由與實施例2同樣的方法算出M1蛋白質殘存率（%），然後，將嚴格試驗前的M1蛋白質殘存率當作100%的情況下，算出於37℃進行1週的嚴格試驗後的M1蛋白質殘存率的比例。A/NY株（H3N2亞型株）的結果顯示於表39。與嚴格試驗前相比，去活化流行性感冒病毒粒子的嚴格試驗後的M1蛋白質殘存率上昇了24%。另一方面，與嚴格試驗前相比，利用EDC濃度50、500mM固定而成的EDC固定化流行性感冒病毒粒子的嚴格試驗後的M1蛋白質殘存率分別減少18%，教示出比起去活化流行性感冒病毒粒子，變化率較小，且更穩定。

[表39]

10.在嚴格試驗下的穩定性（藉由單向輻射免疫擴散試驗實行的分析） 將嚴格試驗前後的HA含量的變化作為指標，來評估藉由實施例5製備成的EDC固定化流行性感冒病毒粒子的穩定性。首先，藉由單向輻射免疫擴散試驗（生物學性製劑基準（日本國，厚生勞動省告示第192號））算出HA含量，然後，將嚴格試驗前的HA含量當作100%的情況下，算出於37℃進行1週的嚴格試驗後的HA含量的變化率。A/CA株（H1N1亞型株）、及A/NY株（H3N2亞型株）、B/MA株（B型山形系統）、B/BR株（B型維多利亞系統株）的結果顯示於表40。結果教示出EDC固定化流行性感冒病毒粒子的嚴格試驗後的HA含量的變化率較小，且穩定。

[表40]

11.於5℃保存11個月下的穩定性（藉由交聯度的分析） 將於5℃保存11個月的前後的交聯度的變化作為指標來評估藉由實施例5製備成的EDC固定化流行性感冒病毒粒子的穩定性。首先，藉由與實施例2同樣的方法算出M1蛋白質殘存率（%），然後，將於5℃保存11個月前的M1蛋白質殘存率當作100%的情況下，算出於5℃保存11個月下的M1蛋白質殘存率的比例。A/CA株（H1N1亞型株）、及A/NY株（H3N2亞型株）、B/MA株（B型山形系統）、B/BR株（B型維多利亞系統株）的結果顯示於表41。結果教示出EDC固定化流行性感冒病毒粒子在於5℃保存11個月下的M1蛋白質殘存率的變化率小，且穩定。

[表41]

12.於5℃保存11個月下的穩定性（藉由單向輻射免疫擴散試驗實行的分析） 將於5℃保存11個月前後的HA含量的變化作為指標，來評估藉由實施例5製備成的EDC固定化流行性感冒病毒粒子的穩定性。首先，藉由單向輻射免疫擴散試驗（生物學性製劑基準（日本國，厚生勞動省告示第192號））算出HA含量，然後，將於5℃保存11個月前的HA含量當作100%的情況下，算出於5℃保存11個月下的HA含量的變化率。A/CA株（H1N1亞型株）、及A/NY株（H3N2亞型株）、B/MA株（B型山形系統）、B/BR株（B型維多利亞系統株）的結果顯示於表42。結果教示出EDC固定化流行性感冒病毒粒子於5℃保存11個月下的HA含量的變化率小，且穩定。

[表42]

13.於5℃保存9個月下的穩定性（小鼠免疫原性（肌肉內接種）） 使用小鼠免疫原性（肌肉內接種）來評估藉由實施例5製備成的EDC固定化流行性感冒病毒粒子於5℃保存9個月下的穩定性。藉由與實施例4同樣的方法獲得血清，並測定HI抗體力價及中和抗體力價。作為代表，以5mM的EDC濃度，並於4℃反應20小時後的EDC固定化流行性感冒病毒粒子的免疫原性的HI抗體力價（GMT）的結果顯示於表43，中和抗體力價（GMT）的結果顯示於表44。在A/CA株（H1N1亞型株）、及A/NY株（H3N2亞型株）、B/MA株（B型山形系統）、B/BR株（B型維多利亞系統株）中，與裂解流感抗原相比，EDC固定化流行性感冒病毒粒子的免疫原性較高。

[表43]

[表44]

14.於5℃保存9個月下的穩定性（抗體亞型） 作為抗體亞型解析，藉由ELISA法來測定在上述「13.於5℃保存9個月下的穩定性（小鼠免疫原性（肌肉內接種））」所獲得的小鼠的血清中所包含的對病毒抗原具特異性的IgG1及IgG2a抗體力價。其結果，即使是於5℃保存9個月後，與裂解流感抗原互相對照地，EDC固定化流行性感冒病毒粒子顯示了誘導出比具抗原特異性的IgG1更多的具抗原特異性的IgG2a（表45）。由此結果來看，能夠期待EDC固定化流行性感冒病毒粒子所活化的細胞性免疫，於5℃保存9個月後亦維持著。

[表45]

15.於5℃保存10個月下的穩定性（食蟹獼猴免疫原性（皮下接種）） 使用食蟹獼猴免疫原性（皮下接種）來評估藉由實施例5製備成的EDC固定化流行性感冒病毒粒子於5℃保存10個月下的穩定性。首先，對食蟹獼猴（雄性或雌性，29～35個月齡），將裂解流感抗原、EDC固定化流行性感冒病毒粒子、及去活化流行性感冒病毒粒子以HA含量為15μg的接種量進行了皮下接種（每一群為8隻）。間隔3週進行2次皮下接種，於第2次免疫後第4週進行了採血。藉由與實施例2同樣的方法獲得血清，測定了HI抗體力價及中和抗體力價。作為代表，以5mM的EDC濃度，於4℃反應20小時後的EDC固定化流行性感冒病毒粒子於5℃保存10個月下的HI抗體力價（GMT）的結果顯示於表46，中和抗體力價（GMT）的結果顯示於表47（表46、表47分別為表37、表38的再次揭示）。在A/CA株（H1N1亞型株）、及A/NY株（H3N2亞型株）、B/MA株（B型山形系統）、B/BR株（B型維多利亞系統株）中，與裂解流感抗原相比，EDC固定化流行性感冒病毒粒子為具顯著性差異性地免疫原性較高。

[表46]

[表47]

16.RNA釋放量的評估 評估了藉由實施例5製備成的EDC固定化流行性感冒病毒粒子的蛋白分解酶處理中的經時性RNA釋放量。首先，利用PBS來稀釋去活化流行性感冒病毒粒子及EDC固定化流行性感冒病毒粒子，加入SDS與Proteinase K於55℃使之反應，經時性地萃取出RNA。在萃取RNA中，使用了TRIzol LS Reagent與PureLink RNA Mini Kit、PureLink DNase（invitrogen公司製造，商品名）。萃取出的RNA的含量，是利用Quant-iT RiboGreen RNA Reagent and Kit（invitrogen公司製造，商品名）來測定。作為代表，A/NY株（H3N2亞型株）的結果顯示於表48。其結果，與去活化流行性感冒病毒粒子相比，顯示出EDC固定化流行性感冒病毒粒子的RNA釋放正被緩釋化。

[表48]

17.發炎性細胞激素產量的評估 評估了藉由實施例5製備成的EDC固定化流行性感冒病毒粒子的發炎性細胞激素的經時性產量。方法是遵照歐洲藥典MONOCYTE-ACTIVATION TEST。具體而言，歐洲藥典MONOCYTE-ACTIVATION TEST中的將人類PBMC以最少4位供給者份作為混合池來使用的部份，變更成1位供給者進行了測定。A/NY株（H3N2亞型株）中的去活化流行性感冒病毒粒子及EDC固定化流行性感冒病毒粒子的IL-1β產量的經時性變化顯示於表49，IL-6產量的經時性變化顯示於表50。又，B/BR株（B型維多利亞系統株）中的去活化流行性感冒病毒粒子及EDC固定化流行性感冒病毒粒子的IL-1β產量的經時性變化顯示於表51，IL-6產量的經時性變化顯示於表52。其結果，與去活化流行性感冒病毒粒子相比，顯示出EDC固定化流行性感冒病毒粒子的發炎性細胞激素的產生正被緩釋化。換句話說，藉由EDC固定，在體內的RNA釋放被緩釋化，使得發炎性細胞激素的產生延遲，故教示了EDC固定化流行性感冒病毒粒子具有高安全性。

[表49]

[表50]

[表51]

[表52]

實施例7 GA固定化日本腦炎病毒粒子的製備 1.戊二醛處理（對病毒粒子進行固定化粒子結構的步驟） 對Vero細胞培養日本腦炎疫苗原料藥（化學及血清療法研究所製造，商品名「ENCEVAC」，包含蛋白質濃度為60～90μg/ml的經利用0.08v/v%福馬林去活化完成的日本腦炎病毒粒子。以下有時記載為「去活化日本腦炎病毒粒子」），以最終濃度成為0.005～0.02w/v%的方式添加戊二醛，於4℃使之反應3日。反應結束後，利用類PBS溶液（添加了活化劑也就是乳糖（終濃度5w/v%）的PBS）來透析獲得的反應液。藉由透析，去除戊二醛，藉此獲得了固定化日本腦炎病毒粒子（以下有時記載為「GA固定化日本腦炎病毒粒子」）。藉由利用3隻兔子中的放熱反應之和所評估的放熱試驗、刺激了人類PBMC時的發炎性細胞激素的產量的定量，評估了獲得的GA固定化日本腦炎病毒粒子的放熱活性。

2.放熱試驗 藉由與實施例1同樣的方法，進行了放熱試驗。用生理食鹽水稀釋GA固定化日本腦炎病毒粒子或去活化日本腦炎病毒粒子，將1mL中的蛋白質含量設在70μg作為試料。將上述試料，以每1kg體重為3mL的量接種到兔子，觀察發熱的上昇，直到6小時後為止。3隻兔子的放熱反應之和（℃）顯示於表53。作為代表，評估了以0.01w/v%的戊二醛濃度於4℃反應3日後的GA固定化日本腦炎病毒粒子。

GA固定化日本腦炎病毒粒子，沒有確認到1.3℃以上的放熱反應之和，與去活化日本腦炎病毒粒子相比，可見到降低了1.6℃以上的放熱反應之和。由此亦教示了，GA固定化日本腦炎病毒粒子具有高安全性。

[表53]

3.定量發炎性細胞激素的產量 以遵照歐洲藥典MONOCYTE-ACTIVATION TEST的方法，定量了利用GA固定化日本腦炎病毒粒子或去活化日本腦炎病毒粒子刺激了人類PBMC時的細胞激素（IL-1β及IL-6）的產量。具體而言，歐洲藥典MONOCYTE-ACTIVATION TEST中的將人類PBMC以最少4位供給者份作為混合池來使用的部份，變更成1位供給者份，而進行了測定。其結果顯示於表54。結果可知，與去活化日本腦炎病毒粒子相比，GA固定化日本腦炎病毒粒子的發炎性細胞激素的產量相當低。由此教示了，與去活化日本腦炎病毒粒子相比，GA固定化日本腦炎病毒粒子具有較高安全性。

[表54]

實施例8 物性評估 用以下的方法評估了在上述實施例7所獲得的GA固定化日本腦炎病毒粒子的物性。

1.藉由電子顯微鏡實行的解析 為了詳細調查GA固定化日本腦炎病毒粒子的形狀，用與實施例2同樣的方法，實施了藉由電子顯微鏡的觀察。作為代表，是將以0.01w/v%的戊二醛濃度於4℃反應3日後的GA固定化日本腦炎病毒粒子所拍攝成的相片顯示於第4圖。GA固定化日本腦炎病毒粒子，因為利用戊二醛固定，所以與去活化日本腦炎病毒粒子同樣地保有粒子結構。

2.動態光散射 使用Zetasizer Nano ZS（Malvern公司製造）來解析GA固定化日本腦炎病毒粒子的平均粒徑。藉由動態光散射法測得的液體中的平均粒徑顯示於表55。GA固定化日本腦炎病毒粒子，是平均粒徑為約90nm且為單峰性。另一方面，去活化日本腦炎病毒粒子，是約80nm且為單峰性。又，GA固定化日本腦炎病毒粒子的粒子結構保持著，沒有確認到如凝集體般的雜質。

[表55]

3.分子量分布測定（SEC） 測定了GA固定化日本腦炎病毒粒子的分子量分布。測定是使用尺寸篩除層析（商品名：Superose 6 10/300 GE（GE Healthcare公司製造））來進行（溶析液是使用PBS，流速是以0.5ml/min進行）。其溶出樣式顯示於表56。GA固定化日本腦炎病毒粒子是在溶出時間14～15分鐘附近確認到單峰性的主峰。又，去活化日本腦炎病毒粒子亦在溶出時間14～15分鐘附近確認到單峰性的主峰。

[表56]

4.抗原的含量 藉由使用了抗日本腦炎病毒抗體的三明治ELISA法（三明治酵素免疫測定法），使用以下的順序來測定抗原的含量（抗原含量）。檢體中所包含的E抗原，會被結合有抗日本腦炎病毒兔子IgG（一次抗體；多株抗體）的微量盤捕捉。之後，藉由使結合了源自辣根之過氧化酶（HRP）的抗日本腦炎病毒E蛋白質單株抗體（二次抗體；單株抗體）反應，形成結合在微量盤的抗E抗原抗體/E抗原/二次抗體的複合體。藉由洗淨來除去未反應而殘留的試劑及檢體，使之與酵素基質液（鄰苯二胺溶液：OPD溶液）反應後，E抗原複合體上的HRP產生反應，引起發色。利用OPD的發色強度是與複合體的量（反映E抗原量）成比例的現象，測定出E抗原含量（抗原含量）。

GA固定化日本腦炎病毒粒子及去活化日本腦炎病毒粒子各自的抗原含量顯示於表57。作為代表，將以0.01w/v%的戊二醛濃度於4℃反應3日後的GA固定化日本腦炎病毒粒子進行評估後，其是與去活化日本腦炎病毒粒子包含了同等的抗原。

[表57]

5.藉由比活性實行的分析 針對在實施例7製備成的GA固定化日本腦炎病毒粒子，藉由比活性（抗原含量/蛋白質含量），評估了利用固定劑的交聯度。具體而言，使用於抗原含量的測定的單株抗體（503），會辨識中和抗原決定位，中和抗原決定位的結構如果變化，比活性就會下降。算出相對於沒有進行固定化的去活化日本腦炎病毒粒子的比活性而言，經各戊二醛濃度處理後的GA固定化日本腦炎病毒粒子的比活性的相對值（%）（以下有時將此相對值記載為「503抗體反應率」（%））。結果顯示於表58。利用戊二醛濃度0.005w/v%、0.01w/v%、0.02w/v%固定而成的GA固定化日本腦炎病毒粒子的503抗體反應率，分別為95.1%、74.7%、55.2%，教示出隨著戊二醛濃度升高，交聯受到促進，因503抗體抗原決定位的結構變化導致反應率的下降。

[表58]

6.免疫原性（小鼠腹腔內接種） 作為代表，是對ddY小鼠（雌性，4週齡），將利用0.005或者0.01w/v%的戊二醛濃度於4℃反應3日後的GA固定化日本腦炎病毒粒子或去活化日本腦炎病毒粒子以1μg或0.25μg的接種量進行了腹腔內接種（每一群為10隻）。免疫1週間後再次進行免疫，在該1週後將小鼠進行全採血，並使之安樂死。藉由離心分離獲得血清，每群等量作為混合池，依照「病原體檢驗手冊」（國立感染症研究所編）測定了中和抗體力價。由50%溶斑減少率算出的結果顯示於表59。與去活化日本腦炎病毒粒子相比，GA固定化日本腦炎病毒粒子為同等或在其以上的中和抗體力價。

[表59]

7.在加速試驗下的穩定性（抗原含量） 以最終蛋白質濃度成為8μg/mL的方式，利用類PBS溶液來稀釋GA固定化日本腦炎病毒粒子及去活化日本腦炎病毒粒子。以抗原含量為指標，評估了於25℃的保存穩定性。作為代表，利用0.01w/v%的戊二醛濃度於4℃反應3日後的GA固定化日本腦炎病毒粒子或去活化日本腦炎病毒粒子的結果顯示於表60。GA固定化日本腦炎病毒粒子，在25℃保存下維持了1個月。另一方面，去活化日本腦炎病毒粒子，在25℃保存下顯示穩定性降低。結果顯示，與去活化日本腦炎病毒粒子相比，GA固定化日本腦炎病毒粒子的穩定性有提升。

[表60]括弧內是將第0日的抗原含量當作100％時，抗原含量變化的比例（％）

8.在加速試驗下的穩定性（動態光散射） 以最終蛋白質濃度成為8μg/mL的方式，利用類PBS溶液來稀釋GA固定化日本腦炎病毒粒子及去活化日本腦炎病毒粒子。以藉由使用了Zetasizer Nano ZS的動態光散射法測得的液體中的平均粒徑為指標，評估了於25℃的保存穩定性。作為代表，利用0.01w/v%的戊二醛濃度於4℃反應3日後的GA固定化日本腦炎病毒粒子或去活化日本腦炎病毒粒子的結果顯示於表61。GA固定化日本腦炎病毒粒子，在25℃保存下維持了1個月。另一方面，去活化日本腦炎病毒粒子，在25℃保存下顯示出粒徑增加。由此結果顯示，與去活化日本腦炎病毒粒子相比，GA固定化日本腦炎病毒粒子的穩定性有提升。

[表61]括弧內是將第0日的平均粒徑當作100％時，平均粒徑變化的比例（％）

9.在4℃保存下的穩定性（免疫原性） 以最終蛋白質濃度成為8μg/mL的方式，利用類PBS溶液來稀釋GA固定化日本腦炎病毒粒子及去活化日本腦炎病毒粒子。以在小鼠的免疫原性（中和抗體力價）為指標，評估了在4℃的保存穩定性。作為代表，利用0.01w/v%的戊二醛濃度於4℃反應15個月後的GA固定化日本腦炎病毒粒子或去活化日本腦炎病毒粒子的結果顯示於表62。雖然在0個月與15個月後投予量並不同，但推測出GA固定化日本腦炎病毒粒子，在4℃保存下維持15個月。另一方面，推測出去活化日本腦炎病毒粒子，在4℃保存下保存穩定性降低。並且可推測出，與去活化日本腦炎病毒粒子相比，GA固定化日本腦炎病毒粒子的穩定性有提升。

[表62]

實施例9 FA固定化日本腦炎病毒粒子的製備 1.福馬林處理（對病毒粒子進行固定化粒子結構的步驟） 對去活化日本腦炎病毒粒子，以最終濃度成為0.014～0.04v/v%（以甲醛換算為0.005～0.015w/v%）的方式添加福馬林（36～38w/v%甲醛水溶液），於25℃使之反應1週。反應結束後，利用類PBS溶液來透析反應液，藉由除去福馬林，獲得了固定化日本腦炎病毒粒子（以下有時記載為「FA固定化日本腦炎病毒粒子」）。獲得的FA固定化日本腦炎病毒粒子的放熱活性，是藉由刺激了人類PBMC時的發炎性細胞激素的產量的定量來評估。

2.定量發炎性細胞激素的產量 以遵照歐洲藥典MONOCYTE-ACTIVATION TEST的方法，定量了利用FA固定化日本腦炎病毒粒子或去活化日本腦炎病毒粒子刺激了人類PBMC時的細胞激素（IL-1β及IL-6）的產量。具體而言，歐洲藥典MONOCYTE-ACTIVATION TEST中的將人類PBMC以最少4位供給者份作為混合池來使用的部份，變更成1位供給者份，而進行了測定。其結果顯示於表63。結果可知，與去活化日本腦炎病毒粒子相比，FA固定化日本腦炎病毒粒子的發炎性細胞激素的產量相當低。由此亦教示了，與去活化日本腦炎病毒粒子相比，FA固定化日本腦炎病毒粒子具有較高安全性。

[表63]

實施例10 物性評估 用以下的方法評估了在上述實施例9所獲得的FA固定化日本腦炎病毒粒子的物性。

1.藉由電子顯微鏡實行的解析 為了詳細調查FA固定化日本腦炎病毒粒子的形狀，用與實施例2同樣的方法，實施了藉由電子顯微鏡的觀察。作為代表，是顯示以0.014v/v%的福馬林濃度於25℃反應1週後的FA固定化日本腦炎病毒粒子所拍攝成的相片（第5圖）。FA固定化日本腦炎病毒粒子，因為利用福馬林固定，所以與去活化日本腦炎病毒粒子同樣地保有粒子結構。

2.動態光散射 使用Zetasizer Nano ZS（Malvern公司製造）來解析FA固定化日本腦炎病毒粒子的平均粒徑。藉由動態光散射法測得的液體中的平均粒徑顯示於表64。FA固定化日本腦炎病毒粒子，是平均粒徑為約90nm且為單峰性。另一方面，去活化日本腦炎病毒粒子，是約80nm且為單峰性。又，FA固定化日本腦炎病毒粒子的粒子結構保持著，沒有確認到如凝集體般的雜質。

[表64]

3.分子量分布測定（SEC） 用與實施例8同樣的方法（SEC）測定了FA固定化日本腦炎病毒粒子的分子量分布。溶出樣式顯示於表65。FA固定化日本腦炎病毒粒子是在溶出時間14～15分鐘附近確認到單峰性的主峰。又，去活化日本腦炎病毒粒子亦在溶出時間14～15分鐘附近確認到單峰性的主峰。

[表65]

4.抗原的含量 用與實施例8同樣的方法，藉由使用了抗日本腦炎病毒抗體的三明治ELISA法測定了抗原的含量（抗原含量）。

FA固定化日本腦炎病毒粒子及去活化日本腦炎病毒粒子各自的抗原含量顯示於表66。作為代表，將以0.014v/v%及0.02v/v%的福馬林濃度於25℃反應1週後的FA固定化日本腦炎病毒粒子進行評估後，其是與去活化日本腦炎病毒粒子包含了同等的抗原。

[表66]

5.免疫原性（小鼠腹腔內接種） 用與實施例8同樣的方法，作為代表，測定了以0.02v/v%的福馬林濃度於25℃反應1週後的FA固定化日本腦炎病毒粒子的中和抗體力價。由50%溶斑減少率算出的結果顯示於表67。與去活化日本腦炎病毒粒子相比，FA固定化日本腦炎病毒粒子為同等或在其以上的中和抗體力價。

[表67]

6.在嚴格試驗下的穩定性（抗原含量） 以最終蛋白質濃度成為8μg/mL的方式，利用類PBS溶液來稀釋FA固定化日本腦炎病毒粒子及去活化日本腦炎病毒粒子。以抗原含量為指標，評估了於37℃的保存穩定性。作為代表，以0.014v/v%的福馬林濃度於25℃反應1週後的結果顯示於表68。FA固定化日本腦炎病毒粒子，在37℃保存下維持了1週。另一方面，去活化日本腦炎病毒粒子，在37℃保存下顯示穩定性降低。結果顯示出，與去活化日本腦炎病毒粒子相比，FA固定化日本腦炎病毒粒子的穩定性有提升。

[表68]括弧內是將第0日的抗原含量當作100％時，抗原含量變化的比例（％）

實施例11 EDC固定化日本腦炎病毒粒子的製備 1.1-乙基-3-（3-二甲胺丙基）碳二醯亞胺鹽酸鹽（EDC）處理 對去活化日本腦炎病毒粒子，以最終濃度成為0.15～15mM的方式添加EDC，於4℃使之反應2～20小時。當進行阻停處理時，進一步將甘胺酸作為阻停劑，以EDC的8倍量（莫耳質量比）添加到反應液。反應結束後，利用類PBS溶液來透析反應液，藉由去除EDC及甘胺酸，獲得了固定化日本腦炎病毒粒子（以下有時記載為「EDC固定化日本腦炎病毒粒子」）。藉由刺激了人類PBMC時的發炎性細胞激素的產量的定量，評估了獲得的EDC固定化日本腦炎病毒粒子的放熱活性。

2.定量發炎性細胞激素的產量 以遵照歐洲藥典MONOCYTE-ACTIVATION TEST的方法，作為代表，定量了細胞激素（IL-1β及IL-6）的產量，該細胞激素是藉由以0.15mM或1.5mM的EDC濃度於4℃反應20小時後的EDC固定化日本腦炎病毒粒子或去活化日本腦炎病毒粒子刺激了人類PBMC時的細胞激素。具體而言，歐洲藥典MONOCYTE-ACTIVATION TEST中的將人類PBMC以最少4位供給者份作為混合池來使用的部份，變更成1位供給者份，而進行了測定。其結果顯示於表69。結果可知，與去活化日本腦炎病毒粒子相比，EDC固定化日本腦炎病毒粒子的發炎性細胞激素產量相當低。由此亦教示了，與去活化日本腦炎病毒粒子相比，EDC固定化日本腦炎病毒粒子具有高安全性。

[表69]

實施例12 物性評估 用以下的方法評估了在上述實施例11所獲得的EDC固定化日本腦炎病毒粒子的物性。

1.藉由電子顯微鏡實行的解析 為了詳細調查EDC固定化日本腦炎病毒粒子的形狀，用與實施例2同樣的方法，實施了藉由電子顯微鏡的觀察。作為代表，以1.5mM的EDC濃度於4℃反應20小時後的EDC固定化日本腦炎病毒粒子所拍攝成的相片顯示於第6圖。EDC固定化日本腦炎病毒粒子，因為利用EDC固定，所以與去活化日本腦炎病毒粒子同樣地保有粒子結構。

2.動態光散射 使用Zetasizer Nano ZS（Malvern公司製造）來解析EDC固定化日本腦炎病毒粒子的平均粒徑。藉由動態光散射法測得的液體中的平均粒徑顯示於表70。EDC固定化日本腦炎病毒粒子，平均粒徑為約90nm且為單峰性。另一方面，去活化日本腦炎病毒粒子，為約80nm且為單峰性。又，EDC固定化日本腦炎病毒粒子的粒子結構保持著，沒有確認到如凝集體般的雜質。

[表70]

3.分子量測定（SEC） 　用與實施例8同樣的方法測定了EDC固定化日本腦炎病毒粒子的分子量分布。溶出樣式顯示於表71。EDC固定化日本腦炎病毒粒子是在溶出時間14～15分鐘附近確認到單峰性的主峰。又，去活化日本腦炎病毒粒子亦在溶出時間14～15分鐘附近確認到單峰性的主峰。

[表71]

4.抗原的含量 用與實施例8同樣的方法，藉由使用了抗日本腦炎病毒抗體的三明治ELISA法測定了抗原的含量（抗原含量）。作為代表，將以1.5mM的EDC濃度於4℃反應20小時後的EDC固定化日本腦炎病毒粒子及去活化日本腦炎病毒粒子各自的抗原含量顯示於表72。EDC固定化日本腦炎病毒粒子，包含了與去活化日本腦炎病毒粒子同等的抗原。

[表72]

5.免疫原性（小鼠腹腔內接種） 用與實施例8同樣的方法，測定了EDC固定化日本腦炎病毒粒子的中和抗體力價。由50%溶斑減少率算出的結果顯示於表73。作為代表，以1.5mM的EDC濃度於4℃反應2小時後，將甘胺酸作為阻停劑，以EDC的8倍量（莫耳質量比）添加到反應液，將如此處理而成的EDC固定化日本腦炎病毒粒子進行評估後，其是與去活化日本腦炎病毒粒子相比為同等或在其以上的中和抗體力價。

[表73]

6.穩定性（抗原含量） 以最終蛋白質濃度成為8μg/mL的方式，利用類PBS溶液來稀釋EDC固定化日本腦炎病毒粒子及去活化日本腦炎病毒粒子。以抗原含量為指標，評估了於25℃、37℃的保存穩定性。結果顯示於表74、表75。EDC固定化日本腦炎病毒粒子，在25℃保存下維持了1個月及在37℃保存下維持了1週。另一方面，去活化日本腦炎病毒粒子，無論是在25℃保存下、37℃保存下的任一者，均顯示出抗原含量的降低。結果顯示出，與去活化日本腦炎病毒粒子相比，EDC固定化日本腦炎病毒粒子的穩定性有提升。

[表74]括弧內是將第0日的抗原含量當作100％時，抗原含量變化的比例（％）

[表75]括弧內是將第0日的抗原含量當作100％時，抗原含量變化的比例（％） [產業利用性]

本發明在醫藥品的領域，尤其是疫苗的領域中為有用的。

無

第1圖是利用電子顯微鏡將固定化流行性感冒病毒粒子拍攝而成的相片（福馬林處理）。 　　第2圖是利用電子顯微鏡將固定化流行性感冒病毒粒子拍攝而成的相片（戊二醛處理）。 　　第3圖是利用電子顯微鏡將固定化流行性感冒病毒粒子拍攝而成的相片（EDC處理）。 　　第4圖是利用電子顯微鏡將固定化日本腦炎病毒粒子拍攝而成的相片（戊二醛處理）。 　　第5圖是利用電子顯微鏡將固定化日本腦炎病毒粒子拍攝而成的相片（福馬林處理）。 　　第6圖是利用電子顯微鏡將固定化日本腦炎病毒粒子拍攝而成的相片（EDC處理）。

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Claims (31)

1. 一種疫苗，其包含固定化病毒粒子，其中，在放熱試驗中，以成為前述固定化病毒粒子的起源之病毒粒子或對應的去活化病毒粒子於3隻兔子中的放熱反應之和為基準計，前述固定化病毒粒子於3隻兔子中的放熱反應之和未達80%。
2. 如請求項1所述之疫苗，其中，在放熱試驗中，前述固定化病毒粒子於3隻兔子中的放熱反應之和在1.3℃以下。
3. 一種疫苗，其包含固定化病毒粒子，其中，以藉由成為前述固定化病毒粒子的起源之病毒粒子或對應的去活化病毒粒子而受到刺激的人類周邊血液單核細胞所產生的發炎性細胞激素的量為基準計，藉由前述固定化病毒粒子而受到刺激的人類周邊血液單核細胞所產生的發炎性細胞激素的量未達80%。
4. 如請求項1～3中任一項所述之疫苗，其中，成為前述固定化病毒粒子的起源之病毒粒子包含：正黏液病毒粒子、黃病毒粒子、或小核糖核酸病毒粒子。
5. 如請求項4所述之疫苗，其中，前述病毒粒子包含：流行性感冒病毒粒子、日本腦炎病毒粒子、或A型肝炎病毒粒子。
6. 如請求項5所述之疫苗，其中，前述病毒粒子包含流行性感冒病毒粒子。
7. 如請求項6所述之疫苗，其中，前述流行性感冒病毒粒子包含：A型流行性感冒病毒粒子、或B型流行性感冒病毒粒子。
8. 如請求項6或7所述之疫苗，其中，前述流行性感冒病毒粒子包含被分類為：H1N1亞型株、H2N2亞型株、H3N2亞型株、H3N8亞型株、H5N1亞型株、H5N2亞型株、H5N6亞型株、H6N1亞型株、H7N3亞型株、H7N7亞型株、H7N9亞型株、H9N2亞型株、或H10N8亞型株的流行性感冒病毒粒子。
9. 如請求項5所述之疫苗，其中，前述病毒粒子包含日本腦炎病毒粒子。
10. 如請求項9所述之疫苗，其中，前述日本腦炎病毒粒子包含：北京-1株、中山株、SA14-14-2株、或P3株。
11. 如請求項1～10中任一項所述之疫苗，其中，前述固定化病毒粒子表面的0%～90%的蛋白質沒有固定化。
12. 如請求項1～11中任一項所述之疫苗，其中，相對於成為前述固定化病毒粒子的起源之病毒粒子的比活性也就是抗原含量/蛋白質含量，前述固定化病毒粒子的比活性的相對值在0～95%。
13. 如請求項1～12中任一項所述之疫苗，其中，前述固定化病毒粒子所具有的平均粒徑，是成為前述固定化病毒粒子的起源之病毒粒子或對應的去活化病毒粒子的粒徑的80%～150%。
14. 如請求項1～13中任一項所述之疫苗，其中，當利用蔗糖密度梯度離心法來測定前述固定化病毒粒子時，會在蔗糖濃度35%以上檢測出峰。
15. 如請求項1～14中任一項所述之疫苗，其中，當利用高效液相層析法來測定前述固定化病毒粒子時，可確認到單峰性的峰。
16. 如請求項1～15中任一項所述之疫苗，其中，當對小鼠進行了免疫時，比起對前述固定化病毒粒子具特異性的IgG1，前述疫苗誘導出更多的對前述固定化病毒粒子具特異性的IgG2a。
17. 一種固定化病毒粒子的製造方法，其包含一步驟，該步驟為在包含成為起源之病毒粒子或對應的去活化病毒粒子之懸浮液中添加固定劑。
18. 如請求項17所述之製造方法，其中，前述固定劑包含醛類。
19. 如請求項18所述之製造方法，其中，前述醛類選自由下列所組成之群組：甲醛、三聚甲醛、戊二醛、及該等之組合。
20. 如請求項19所述之製造方法，其中，前述醛類包含甲醛。
21. 如請求項20所述之製造方法，其中，以前述懸浮液和前述固定劑的總量為基準計，前述甲醛的濃度是0.005～0.5w/v%。
22. 如請求項19所述之製造方法，其中，前述醛類包含戊二醛。
23. 如請求項22所述之製造方法，其中，以前述懸浮液和前述固定劑的總量為基準計，前述戊二醛的濃度是0.001～0.06w/v%。
24. 如請求項19所述之製造方法，其中，前述固定劑包含碳二醯亞胺類。
25. 如請求項24所述之製造方法，其中，前述碳二醯亞胺類選自由下列所組成之群組：二環己基碳二醯亞胺、二異丙基碳二醯亞胺、1-乙基-3-（3-二甲胺丙基）碳二醯亞胺鹽酸鹽、該等之類似物、及該等之組合。
26. 如請求項25所述之製造方法，其中，前述碳二醯亞胺類包含1-乙基-3-（3-二甲胺丙基）碳二醯亞胺鹽酸鹽。
27. 如請求項26所述之製造方法，其中，以前述懸浮液和前述固定劑的總量為基準計，前述1-乙基-3-（3-二甲胺丙基）碳二醯亞胺鹽酸鹽的濃度是0.05～1500mM。
28. 如請求項17～27中任一項所述之製造方法，其中，成為起源之前述病毒粒子，是使培養細胞、雞蛋或小鼠腦受到感染並回收而得的病毒粒子。
29. 如請求項28所述之製造方法，其中，前述培養細胞包含：初代細胞、或株化細胞。
30. 如請求項29所述之製造方法，其中，前述培養細胞包含：Vero細胞、或MDCK細胞。
31. 一種疫苗的製造方法，其包含一步驟，該步驟為添加固定化病毒粒子，該固定化病毒粒子是藉由如請求項17～30中任一項所述之製造方法而獲得的固定化病毒粒子。