JP7233880B2 - ウイルスrna単離方法及びウイルス定量方法 - Google Patents
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Description
図1は、実施形態のウイルスRNA単離方法の一例を示すフローチャートである。当該方法は、(S1)試料中のRNAウイルスから内包物を放出させること、(S2)試料にプロテイナーゼKを添加すること、及び(S3)得られた混合液からRNAを回収することを含む。
図3は、実施形態のウイルス定量方法を示すフローチャートである。当該方法は、上記ウイルスRNA単離方法において単離されたRNAを定量することによって試料中のウイルスを定量する方法である。
[例1]
ホルマリンで不活性化処理されたインフルエンザA型ウイルス(H3/N2)溶液(ロットA1及びA2)から、実施形態の単離方法(実施例1)及びQiagenviralRNAminikit(比較例1)を用いてRNAの抽出を行なった。
RT-PCRの結果を図4に示す。実施例1(プロテイナーゼK処理あり)では、ロットA1が1.89×106コピー、ロットA2が1.24×106コピーであった。対して、比較例1(プロテイナーゼK処理無し)では、ロットA1が2.7×104コピー、ロットA2が4.2×104であった。この結果から明らかであるように、実施例1の方が、比較例1よりも検出されたウイルスコピー数が多くなった。したがって、実施形態の単離方法を用いた場合、より高感度にウイルスを定量できることが示唆された。
ホルマリンで不活性化処理を行なったインフルエンザA型ウイルス(H3/N2)溶液を用いて実施例1と同じ方法によりRNA抽出を行なった(実施例2)。また、対照サンプルとしてホルマリン未処理のインフルエンザA型ウイルス(H3/N2)溶液を用いて、実施例1と同じ方法によりRNA抽出を行なった(実施例3)。各々のRNAを用いて、RT-PCR法によるインフルエンザA型(H3/N2)ウイルスのコピー数評価を行なった。
RT-PCRの結果を図6に示す。実施例2(ホルマリン処理)のコピー数は1.24×107コピーであった。対して、実施例3(ホルマリン未処理)では、1.5×107コピーであった。ホルマリン未処理/ホルマリン不活性化処理のコピー数比率は1.2であった。
ホルマリンで不活性化処理を行なったインフルエンザA型(H1N1)ウイルス溶液を、各々1/10、1/100、1/200の希釈率で段階希釈を行い実施例1と同じ方法によりRNA抽出を行った(実施例4)。また、対照サンプルとして不活性化処理を行なっていないインフルエンザA型(H1N1)ウイルス溶液を、各々1/10、1/100、1/200の希釈率で段階希釈を行い実施例1と同じ方法によりRNA抽出を行った(実施例5)。
βプロピオラクトンで不活性化処理を行なったRSウイルスA型溶液を段階希釈したウイルス溶液から実施例1と同じ方法によりRNA抽出を行った(実施例6)。
以下に、本願発明の実施態様を付記する。
[1] (S1)試料中のRNAウイルスから内包物を放出させること、
(S2)前記試料にプロテイナーゼKを添加すること、及び
(S3)得られた混合液からRNAを回収すること
を含むウイルスRNA単離方法。
[2] 前記RNAウイルスは、不活性化されたRNAウイルスである[1]に記載の方法。
[3] 前記不活性化されたRNAウイルスは、ホルマリン処理、UV照射処理、液状過熱処理、乾燥過熱処理、界面活性剤処理、酸処理、アルカリ処理及び/又はアルキル化剤処理により不活性化されたRNAウイルスである[2]に記載の方法。
[4] 前記RNAウイルスは、エンテロウイルス、カルディオウイルス、ライノウイルス、アフトウイルス、カリシウイルス、ヘパトウイルス、オルビウイルス、レオウイルス、ロタウイルス、アビビルナウイルス、ピスチビルナウイルス、エントモビルナウイルス、ルビウイルス、ペスティウイルス、フラヴィウイルス、C型肝炎ウイルス、インフルエンザウイルス、ニューモウイルス、パラミクソウイルス、モルビリウイルス、ベシクロウイルス、リッサウイルス、コロナウイルス、ブンヤウイルス、アレナウイルス又はレンチウイルスに属するRNAウイルスである[1]~[3]の何れか1項に記載の方法。
[5] 前記工程(S1)は、RNAウイルスの電気的処理又は化学的処理により行われる[1]~[4]の何れか1項に記載の方法。
[6] 前記電気的処理は、RNAウイルスに電圧を印加することである[5]に記載の方法。
[7] 前記化学的処理は、酵素、界面活性剤、カオトロピック試薬、金属器レート剤、還元剤、有機溶媒又はその組合せからなる群から選択される変性試薬をRNAウイルスに接触させることである[5]に記載の方法。
[8] 前記工程(S3)の後、回収した前記RNAにプロテアーゼを接触させることを更に含む[1]~[7]の何れか1項に記載の方法。
[9] 前記プロテアーゼは、プロテイナーゼKである[8]に記載の方法。
[10] (S11)試料中のRNAウイルスから内包物を放出させること、
(S12)前記試料にプロテイナーゼKを添加すること、
(S13)得られた混合液からRNAを回収すること、及び
(S14)前記工程(S13)によって得られたRNA溶液に含まれる前記RNAの存在量から、前記試料中の前記RNAウイルスのコピー数を決定すること
を含むウイルス定量方法。
[11] 前記RNAウイルスは、不活性化されたRNAウイルスである[10]に記載の方法。
[12] 前記不活性化されたRNAウイルスは、液状過熱処理、乾燥過熱処理、界面活性剤処理、酸処理、アルカリ処理及び/又はアルキル化剤処理により不活性化されたRNAウイルスである[11]に記載の方法。
[13] 前記RNAウイルスは、エンテロウイルス、カルディオウイルス、ライノウイルス、アフトウイルス、カリシウイルス、ヘパトウイルス、オルビウイルス、レオウイルス、ロタウイルス、アビビルナウイルス、ピスチビルナウイルス、エントモビルナウイルス、ルビウイルス、ペスティウイルス、フラヴィウイルス、C型肝炎ウイルス、インフルエンザウイルス、ニューモウイルス、パラミクソウイルス、モルビリウイルス、ベシクロウイルス、リッサウイルス、コロナウイルス、ブンヤウイルス、アレナウイルス又はレンチウイルスに属するRNAウイルスである[10]~[12]の何れか1項に記載の方法。
[14] 前記工程(S11)は、RNAウイルスの電気的処理又は化学的処理により行われる[10]~[13]の何れか1項に記載の方法。
[15] 前記電気的処理は、RNAウイルスに電圧を印加することである[14]に記載の方法。
[16] 前記化学的処理は、酵素、界面活性剤、カオトロピック試薬、金属器レート剤、還元剤、有機溶媒又はその組合せからなる群から選択される変性試薬をRNAウイルスに接触させることである[14]に記載の方法。
[17] 前記工程(S13)の後、回収した前記RNAにプロテアーゼを接触させることを更に含む[10]~[16]の何れか1項に記載の方法。
[18] 前記プロテアーゼは、プロテイナーゼKである[17]に記載の方法。
[19] 前記工程(S11)~(S14)が1つの装置上で行われる[10]~[18]の何れか1項に記載の方法。
3…RNA
4…タンパク質
5…液体試料
Claims (12)
- (S1)試料中の不活性化されたRNAウイルスから内包物を放出させること、
(S2)前記試料にプロテイナーゼKを添加すること、
(S3)得られた混合液からRNAを回収すること、
(S4)回収された前記RNAにプロテアーゼKを接触させること
を含み、ウイルス定量装置の校正用抗原を提供するために、前記工程(S1)~(S4)が1つの当該装置上で行われる不活化RNAウイルスのコピー数の評価する方法。 - 前記不活性化されたRNAウイルスは、ホルマリン処理、UV照射処理、液状過熱処理、乾燥過熱処理、界面活性剤処理、酸処理、アルカリ処理及び/又はアルキル化剤処理により不活性化されたRNAウイルスである請求項1に記載の方法。
- 前記RNAウイルスは、エンテロウイルス、カルディオウイルス、ライノウイルス、アフトウイルス、カリシウイルス、ヘパトウイルス、オルビウイルス、レオウイルス、ロタウイルス、アビビルナウイルス、ピスチビルナウイルス、エントモビルナウイルス、ルビウイルス、ペスティウイルス、フラヴィウイルス、C型肝炎ウイルス、インフルエンザウイルス、ニューモウイルス、パラミクソウイルス、モルビリウイルス、ベシクロウイルス、リッサウイルス、コロナウイルス、ブンヤウイルス、アレナウイルス又はレンチウイルスに属するRNAウイルスである請求項1又は2に記載の方法。
- 前記工程(S1)は、RNAウイルスの電気的処理又は化学的処理により行われる請求項1~3の何れか1項に記載の方法。
- 前記電気的処理は、RNAウイルスに電圧を印加することである請求項4に記載の方法。
- 前記化学的処理は、酵素、界面活性剤、カオトロピック試薬、金属器レート剤、還元剤、有機溶媒又はその組合せからなる群から選択される変性試薬をRNAウイルスに接触させることである請求項4に記載の方法。
- (S11)試料中の不活性化されたRNAウイルスから内包物を放出させること、
(S12)前記試料にプロテイナーゼKを添加すること、
(S13)得られた混合液からRNAを回収すること、
(S14)前記工程(S13)によって得られたRNA溶液に含まれる前記RNAの存在量から、前記試料中の前記RNAウイルスのコピー数を決定すること、及び
(S15)回収された前記RNAにプロテアーゼKを接触させること
を含み、ウイルス定量装置の校正用抗原を提供するために、前記工程(S11)~(S14)が1つの当該装置上で行われる不活化RNAウイルスのコピー数を評価する方法。 - 前記不活性化されたRNAウイルスは、液状過熱処理、乾燥過熱処理、界面活性剤処理、酸処理、アルカリ処理及び/又はアルキル化剤処理により不活性化されたRNAウイルスである請求項7に記載の方法。
- 前記RNAウイルスは、エンテロウイルス、カルディオウイルス、ライノウイルス、アフトウイルス、カリシウイルス、ヘパトウイルス、オルビウイルス、レオウイルス、ロタウイルス、アビビルナウイルス、ピスチビルナウイルス、エントモビルナウイルス、ルビウイルス、ペスティウイルス、フラヴィウイルス、C型肝炎ウイルス、インフルエンザウイルス、ニューモウイルス、パラミクソウイルス、モルビリウイルス、ベシクロウイルス、リッサウイルス、コロナウイルス、ブンヤウイルス、アレナウイルス又はレンチウイルスに属するRNAウイルスである請求項7又は8に記載の方法。
- 前記工程(S11)は、RNAウイルスの電気的処理又は化学的処理により行われる請求項7~9の何れか1項に記載の方法。
- 前記電気的処理は、RNAウイルスに電圧を印加することである請求項10に記載の方法。
- 前記化学的処理は、酵素、界面活性剤、カオトロピック試薬、金属器レート剤、還元剤、有機溶媒又はその組合せからなる群から選択される変性試薬をRNAウイルスに接触させることである請求項10に記載の方法。
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