JP2014176303A

JP2014176303A - ｃＤＮＡの合成方法

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Publication number: JP2014176303A
Application number: JP2013050659A
Authority: JP
Inventors: Yuji Saito; 祐司斉藤; 富美男 ▲高▼城; Fumio Takagi
Original assignee: Seiko Epson Corp
Current assignee: Seiko Epson Corp
Priority date: 2013-03-13
Filing date: 2013-03-13
Publication date: 2014-09-25
Also published as: EP2778226B1; EP2778226A3; EP2778226A2; US20140273100A1; CN104046613A; US9416386B2

Abstract

【課題】効率よく利用できるｃＤＮＡの合成方法を提供すること。
【解決手段】
リボ核酸（ＲＮＡ）を含む試料に、カオトロピック物質を含有する溶解液および核酸結合性固相担体を混合して、ＲＮＡを担体上に吸着させる吸着工程と、担体に吸着したＲＮＡを、逆転写反応液中で担体に吸着させたまま逆転写し、ｃＤＮＡを合成する逆転写工程と、合成したｃＤＮＡを溶出液中に溶出させる溶出工程と、を含むｃＤＮＡ合成方法とする。
【選択図】図１

Description

本発明は、ｃＤＮＡの合成方法に関する。

シリカ粒子等の核酸結合性固相担体とカオトロピック剤を用いて、生体材料からより簡便に核酸を抽出する方法が、Boomらにより報告された（非特許文献１参照）。このBoomらの方法を含め、シリカ等の核酸結合性固相担体とカオトロピック剤を用いて核酸を担体に吸着させ、抽出する方法は、主に、（１）カオトロピック剤存在下、核酸結合性固相担体に核酸を吸着させる工程（吸着工程）、（２）非特異的に結合した夾雑物及びカオトロピック剤を除くため、洗浄液にて核酸の吸着した担体を洗浄する工程（洗浄工程）、および（３）水または低塩濃度緩衝液にて核酸を担体から溶出させる工程（溶出工程）の３工程からなる。ここで（２）の洗浄液としては、カオトロピック剤を溶かし込み、さらに、核酸の担体からの溶出を防ぐため、従来から、水溶性有機溶媒、特にエタノールを５０〜８０％程度の割合で含有する水または低塩濃度緩衝液が用いられている。

しかしながら、この水溶性有機溶媒が（３）の工程に残留した場合、抽出液を酵素処理する際に酵素反応が阻害されるため、通常、エタノールを含む水溶液での洗浄後は、必要に応じて１００％エタノール、あるいは、さらに揮発性の高いアセトン等で洗浄し、その後、乾燥させて有機溶媒を系から完全に取り除く操作が行われている。この乾燥は時間を要するのみでなく、乾燥時間が不十分であればエタノールの残留につながり、過度の場合には、核酸が乾燥しすぎて固化するため、溶出が困難になり、結果的に核酸回収量の低下や再現性の低下に繋がることが知られている。このように有機溶媒の使用は、その乾燥の程度を見極めにくいのみならず、エタノールやアセトンといった有機溶媒は引火性及び揮発性を有するため、特に操作の自動化を考えた場合には、出火等の危険性も考えられる。

そこで、核酸を担体に吸着させた後、（２）の洗浄工程で、エタノール等の有機溶媒を全く含まない水または低塩濃度緩衝液で担体を洗浄し、（３）の溶出工程で、５０〜７０℃で、水または低塩濃度緩衝液で核酸を溶出することによって、リボ核酸（ＲＮＡ）を抽出する方法が開発された（特許文献１参照）。

特開平１１−１４６７８３号公開公報

J.Clin.Microbiol.,vol.28 No.3, p.495-503 (1990)

本発明は、効率よく利用できるｃＤＮＡの合成方法を提供することを目的とする。

これまで、Boom法において、核酸を担体に吸着させ、（２）の洗浄工程で、エタノール等の有機溶媒を事実上含まない水または低塩濃度緩衝液で担体を洗浄した後、（３）の溶出工程では、５０〜７０℃で、水または低塩濃度水溶液で核酸を溶出することによって、リボ核酸（ＲＮＡ）が単離されていた（特開平１１−１４６７８３号公開公報）。しかしながら、本発明者は、Boom法で単離したＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲに用いる場合、担体に吸着したＲＮＡを、担体から遊離させないで逆転写反応をすることにより、合成したｃＤＮＡを直接ＰＣＲ反応液に溶出できるようになり、効率よくその後のＰＣＲ反応ができることを見出し、本発明の完成に至った。

本発明の一実施態様は、リボ核酸（ＲＮＡ）を含む試料に、カオトロピック物質を含有する溶解液および核酸結合性固相担体を混合して、ＲＮＡを前記担体上に吸着させる吸着工程と、前記担体に吸着したＲＮＡを、逆転写反応液中で前記担体に吸着させたまま逆転写し、ｃＤＮＡを合成する逆転写工程と、合成した前記ｃＤＮＡを溶出液中に溶出させる溶出工程と、を含むｃＤＮＡ合成方法である。逆転写工程の前または後に、前記ＲＮＡを吸着させた前記担体を、有機溶媒を含まない洗浄液で洗浄する工程をさらに含んでもよい。前記逆転写反応液が、逆転写酵素、ｄＮＴＰ、逆転写用プライマーを含んでもよい。前記溶出液が、ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、及びＤＮＡ増幅用プライマーを含んでもよい。前記逆転写反応液及び／又は溶出液が、ＢＳＡを含んでもよい。また、前記逆転写工程において、５０℃未満で、前記ＲＮＡが逆転写されることが好ましい。前記担体が、磁性粒子であることが好ましい。

本発明の他の一実施態様は、４〜７Ｍのグアニジン塩、０〜５％の非イオン性界面活性剤、０〜０．２Ｍの還元剤を含有する中性溶解液と、核酸結合性固相担体と、４〜７Ｍのグアニジン塩、０〜５％の非イオン性界面活性剤を含有する第１の洗浄液と、水または低塩濃度水溶液からなる第２の洗浄液と、逆転写酵素、ｄＮＴＰ、及び逆転写用プライマーを含む逆転写反応液と、ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、及びＤＮＡ増幅用プライマーを含むＤＮＡ増幅液と、を含むｃＤＮＡ合成キットである。

本発明によって、効率よく利用できるｃＤＮＡの合成方法を提供することが可能になった。

本発明の一実施例において、担体上で逆転写反応を行うことによって合成したｃＤＮＡを用いてＰＣＲ反応を行った結果を示すグラフである。本発明の一実施例において、担体上で逆転写反応を行った後、洗浄工程を省略してＰＣＲ反応を行った結果を示すグラフである。

実施の形態及び実施例に特に説明がない場合には、M. R. Green & J. Sambrook (Ed.), Molecular cloning, a laboratory manual (4th edition), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (2012); F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J.G. Seidman, J. A. Smith, K. Struhl (Ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Ltd.などの標準的なプロトコール集に記載の方法、あるいはそれを修飾したり、改変した方法を用いる。また、市販の試薬キットや測定装置を用いる場合には、特に説明が無い場合、それらに添付のプロトコールを用いる。

なお、本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態及び具体的に実施例などは、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図並びに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々な改変並びに修飾ができることは、当業者にとって明らかである。

＝＝ｃＤＮＡ合成用試薬＝＝
本発明にかかるｃＤＮＡ合成方法は、ＲＮＡを含む試料に、カオトロピック物質を含有する溶解液および核酸結合性固相担体を混合して、ＲＮＡを担体に吸着させる吸着工程と、担体に吸着したＲＮＡを、逆転写反応液中で担体に吸着させたまま逆転写し、ｃＤＮＡを合成する逆転写工程と、合成したｃＤＮＡを溶出液中に溶出させる溶出工程と、を含む。逆転写工程の前に、前記ＲＮＡを吸着させた前記担体を洗浄液で洗浄する工程をさらに含んでもよい。

ＲＮＡを抽出する試料は、ＲＮＡを含んでいれば特に限定されず、細胞や、組織などの細胞塊などの生体試料、ウイルス、合成ＲＮＡ、一旦単離したＲＮＡに不純物や夾雑物が混入した試料などであってもよい。

カオトロピック物質は、水溶液中でカオトロピックイオン（イオン半径の大きな１価の陰イオン）を生じ、疎水性分子の水溶性を増加させる作用を有しており、ＲＮＡの固相担体への吸着に寄与するものであれば、特に限定されない。具体的には、グアニジンチオシアン酸塩、グアニジン塩酸塩、ヨウ化ナトリウム、ヨウ化カリウム、過塩素酸ナトリウム等が挙げられるが、これらのうち、タンパク質変成作用の強いグアニジンチオシアン酸塩またはグアニジン塩酸塩が好ましい。これらのカオトロピック物質の使用濃度は特に限定されず、各物質により異なり、例えば、グアニジンチオシアン酸塩を使用する場合には、３〜５．５Ｍの範囲で、グアニジン塩酸塩を使用する場合は、５Ｍ以上で使用するのが好ましい。

溶解液は、このようなカオトロピック物質を含有すれば特に限定されないが、細胞膜の破壊あるいは細胞中に含まれるタンパク質を変性させる目的で界面活性剤を含有させてもよい。この界面活性剤としては、一般に細胞等からの核酸抽出に使用されるものであれば特に限定されないが、具体的には、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘなどのトリトン系界面活性剤やＴｗｅｅｎ２０などのツイーン系界面活性剤のような非イオン性界面活性剤、Ｎ‐ラウロイルサルコシンナトリウム（ＳＤＳ）等の陰イオン性界面活性剤が挙げられるが、特に非イオン性界面活性剤を、０．１〜２％の範囲となるように使用するのが好ましい。さらに、溶解液には、２−メルカプトエタノールあるいはジチオスレイトール等の還元剤を含有させることが好ましい。溶解液は、緩衝液であってもよいが、ｐＨ６〜８の中性であることが好ましい。これらのことを考慮し、具体的には、４〜７Ｍのグアニジン塩、０〜５％の非イオン性界面活性剤、０〜０．２Ｍの還元剤などを含有することが好ましい。

核酸結合性固相担体は、カオトロピックイオンの存在下で、核酸を吸着すなわち可逆的な物理的結合により保持することができる親水性表面を有する固体であれば、特に限定されない。具体的には、二酸化珪素を含有する物質、例えば、シリカ、ガラス、珪藻土、あるいはこれらを化学的修飾により表面処理を施したものが好ましく、磁性体や超常磁性金属酸化物等との複合体がより好ましい。化学的修飾により表面処理を施す場合は、核酸との可逆的な結合を妨げない程度に、適度な陽性電荷を帯びさせてもよい。

また、これらの核酸結合性固相担体の形態としては、粒子、フィルター、バッグ、ディッシュ、反応容器等が具体的に挙げられるが、特に限定されない。これらのうち、吸着と溶出の効率を考慮すると粒子の形態がより好ましい。その場合の粒径は特に限定されないが、０．０５〜５００μｍであってもよく、好ましくは１〜１００μｍであり、特に好ましくは１〜１０μｍである。

洗浄液は、エタノールやイソプロピルアルコール等の有機溶媒およびカオトロピック物質を事実上含まないものが好ましい。この洗浄液は、水または低塩濃度水溶液であることが好ましく、低塩濃度水溶液の場合、緩衝液であることが好ましい。低塩濃度水溶液の塩濃度は、１００ｍＭ以下が好ましく、５０ｍＭ以下がより好ましく、１５ｍＭ以下が最も好ましい。また、低塩濃度水溶液の下限は特に無いが、０．１ｍＭ以上であることが好ましく、１ｍＭ以上であることがさらに好ましく、１０ｍＭ以上であることが最も好ましい。また、この溶液はＴｒｉｔｏｎ、Ｔｗｅｅｎ、ＳＤＳなどの界面活性剤を含有しても良く、ｐＨは特に限定されない。緩衝液にするための塩は特に限定されないが、トリス、ヘペス、ピペス、リン酸などの塩が好ましく用いられる。

複数回洗浄する場合、同じ成分の洗浄液を用いてもよいが、異なる成分の洗浄液を用いてもよい。例えば、溶解した直後に用いる洗浄液として、グアニジン塩を含有する溶液を用いてもよいが、この洗浄液は、特に、４〜７Ｍのグアニジン塩や、０〜５％の非イオン性界面活性剤を含有することが好ましい。

逆転写反応液も、逆転写酵素、ｄＮＴＰ、及び逆転写酵素用プライマー（オリゴヌクレオチド）を含んでいれば、特に限定されない。逆転写反応液には、反応阻害防止剤として、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）またはゼラチンを含有することが好ましい。溶媒は、水であることが好ましく、エタノールやイソプロピルアルコール等の有機溶媒およびカオトロピック物質を事実上含まないものがより好ましい。また、逆転写酵素用緩衝液となるように、適当な濃度の塩を含有することが好ましい。緩衝液にするための塩は、酵素反応を阻害しない限り、特に限定されないが、トリス、ヘペス、ピペス、リン酸などの塩が好ましく用いられる。逆転写酵素は特に限定されず、例えば、アビアンミエロブラストウイルス（ＡｖｉａｎＭｙｅｌｏｂｌａｓｔＶｉｒｕｓ）、ラスアソシエーテッドウイルス２型（ＲａｓＡｓｓｏｃｉａｔｅｄＶｉｒｕｓ２型）、マウスモロニーミュリーンリューケミアウイルス（ＭｏｕｓｅＭｏｌｏｎｙＭｕｒｉｎｅＬｅｕｋｅｍｉａＶｉｒｕｓ）、ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨｕｍａｎＩｍｍｕｎｏｄｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙＶｉｒｕｓ１型）由来の逆転写酵素などが使用できる。

溶出液は、逆転写して合成したｃＤＮＡを引き続き処理するための、酵素や基質や塩などの溶質を含んでいる。溶出液には、反応阻害防止剤として、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）またはゼラチンを含有することが好ましい。溶媒は、水であることが好ましく、エタノールやイソプロピルアルコール等の有機溶媒およびカオトロピック物質を事実上含まないものがより好ましい。

例えば、逆転写反応の後、ｃＤＮＡを引き続きＰＣＲで増幅する場合、溶出液は、ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、及びＤＮＡポリメラーゼ用プライマー（オリゴヌクレオチド）を含んでいれば、特に限定されない。その他に、ＴａｑＭａｎプローブや、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｅａｃｏｎ、サイクリングプローブなどのリアルタイムＰＣＲ用プローブやＳＹＢＲグリーンなどのインターカレーター用蛍光色素を含んでいてもよい。また、ＤＮＡポリメラーゼ用緩衝液となるように、適当な濃度の塩を含有することが好ましい。緩衝液にするための塩は、酵素反応を阻害しない限り、特に限定されないが、トリス、ヘペス、ピペス、リン酸などの塩が好ましく用いられる。ＤＮＡポリメラーゼは特に限定されず、例えば、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｔｆｉポリメラーゼ、Ｔｔｈポリメラーゼ、あるいはそれらの改良型など、非常に多数の市販品がある。

逆転写反応液や溶出液に含まれるｄＮＴＰや塩の濃度は、用いる反応について適した濃度にすればよいが、通常、ｄＮＴＰを１０〜１０００μＭ、好ましくは１００〜５００μＭ、Ｍｇ^２＋を１〜１００ｍＭ、好ましくは５〜１０ｍＭ、Ｃｌ⁻を１〜２０００ｍＭ、好ましくは２００〜７００ｍＭ、とすれば良く、総イオン濃度は、特に限定されないが、５０ｍＭより高い濃度であってもよく、１００ｍＭより高い濃度が好ましく、１２０ｍＭより高い濃度がより好ましく、１５０ｍＭより高い濃度がさらに好ましく、２００ｍＭより高い濃度がさらに好ましい。上限は、５００ｍＭ以下が好ましく、３００ｍＭ以下がより好ましく、２００ｍＭ以下がさらに好ましい。プライマー用オリゴヌクレオチドは、それぞれ０．１〜１０μＭ、好ましくは０．１〜１μＭが用いられる。ＢＳＡまたはゼラチンの濃度は、１ｍｇ／ｍＬ以下では、反応阻害防止効果が少なく、１０ｍｇ／ｍＬ以上だと、逆転写反応やその後の酵素反応を阻害する可能性があるため、１〜１０ｍｇ／ｍＬが好ましい。ゼラチンを用いる場合、その由来は、牛皮、豚皮、牛骨が例示できるが、特に限定されない。ゼラチンが溶解にしくいときは、加温して溶解させてもよい。

＝＝ｃＤＮＡ合成方法＝＝
具体的には、以下の様にしてｃＤＮＡを合成すればよい。

（吸着工程）
まず、適量の溶解液を、エッペンドルフ・マイクロチューブやプラスティック・チューブなどの目的に合ったチューブに入れ、ＲＮＡを抽出する試料及び核酸結合性固相担体を混合し、ホモジェナイザーやボルテックス・ミキサーなどによって試料を破砕し、ＲＮＡを担体に吸着させる。

（洗浄工程）
次に、チューブから溶解液を除去し、ＲＮＡが吸着した担体に、逆転写反応液を直接添加してもよいが、非特異的に担体に吸着した夾雑物を除去し、溶液を置換することによって前工程からの溶質の持ち込みを減らし、塩濃度を正確に調整するため、ＲＮＡが吸着した担体を、適量の洗浄液で洗浄することが好ましい。洗浄回数は特に限定されないが、１回〜数回洗浄すればよい。複数回洗浄する時は、最初にグアニジン塩を含有する洗浄液を用い、最後はグアニジン塩を含有しない洗浄液を用いることが好ましい。例えば、グアニジン塩を含有する洗浄液として、４〜７Ｍのグアニジン塩、０〜５％の非イオン性界面活性剤を含有する洗浄液を例示することができ、グアニジン塩を含有しない洗浄液として、水または低塩濃度水溶液からなる洗浄液を例示することができる。

本発明のｃＤＮＡ合成方法において、洗浄とは、ＲＮＡの結合した担体を洗浄液と接触させ、再び分離することにより、担体から、ＲＮＡ以外の非特異的に結合した物質を除去する操作である。具体的な分離方法は、使用する担体の形態により異なるが、担体がビーズなどの粒子形態である場合には、遠心分離、ろ過分離及びカラム操作等を用いることができる。

（逆転写工程）
次に、チューブから洗浄液を除去し、ＲＮＡが吸着した担体に、逆転写反応液を添加し、逆転写反応を行ってｃＤＮＡを合成する。逆転写反応液には、逆転写酵素、ｄＮＴＰ、及び逆転写酵素用プライマーが含まれているので、ＲＮＡを担体に吸着させたまま、そのまま逆転写反応に用いることができる。逆転写反応には、ＲＮＡが吸着した担体を含む逆転写反応液の一部または全部を用いてもよく、一部を用いる場合は、逆転写酵素用に調節したバッファーで希釈するのが好ましい。逆転写酵素用に調節したバッファーは、逆転写反応液と同じ成分の溶液を用いてもよいが、塩濃度が適正に調節されていれば、特に限定されず、逆転写酵素、ｄＮＴＰ、及び逆転写酵素用プライマーは、それぞれ添加されていてもいなくても構わない。本発明の方法では、この逆転写工程において、担体を除去する工程が含まれない。つまり、担体に吸着したＲＮＡを、担体から遊離させないで逆転写反応をすることにより、効率よくその後の反応に用いることができるｃＤＮＡを合成することができる。従って、例えば、逆転写反応は低温で行われることが好ましく、５０℃未満であればよいが、４５℃未満であることが好ましく、４０℃未満であることがより好ましく、３５℃未満であることがさらに好ましい。また、温度の下限は、２０℃以上であることが好ましく、２５℃以上であることがより好ましく、３０℃以上であることがさらに好ましい。

（洗浄工程）
この工程の後、チューブから逆転写反応液を除去し、ＲＮＡが吸着した担体に、溶出液を直接添加してもよいが、非特異的に担体に吸着した夾雑物を除去し、溶液を置換することによって前工程からの溶質の持ち込みを減らし、塩濃度を正確に調整するため、ＲＮＡが吸着した担体を、適量の洗浄液で洗浄することが好ましい。洗浄回数は特に限定されないが、１回〜数回洗浄すればよい。洗浄液は、水または低塩濃度水溶液からなる洗浄液が好ましい。

（溶出工程）
洗浄後、洗浄液を除去し、適量の溶出液を加え、ボルテックス・ミキサーなどによって混合し、担体に結合しているｃＤＮＡを担体から遊離させる。この際、ｃＤＮＡ溶出を促進するため、溶出液を加熱してもよい。加熱温度は特に限定されないが、４０℃より高ければ良く、５０℃以上が好ましく、６０℃以上がより好ましい。加熱温度の上限は特に限定されないが、７０℃以下であることが好ましく、６５℃以下であることがより好ましく、６０℃以下であることがさらに好ましく、６０℃であることが最も好ましい。加熱方法として、予め加熱した溶出液を加えても良く、担体に溶出液を加えた後で加熱してもよい。加熱時間は特に限定されないが、３０秒〜１０分間程度が好ましい。溶出後、担体を除去することにより、上清が単離できる。こうして合成したｃＤＮＡは、ＰＣＲを含むポリメラーゼ反応など、様々な用途に効率よく用いることができる。

なお、洗浄工程などで、担体と上清を分離する場合は、遠心などによって、担体を沈降させて分離させればよいが、担体が磁性体を含む場合は、磁石等を用いて、簡便に分離させることができる。

＝＝合成したｃＤＮＡの利用＝＝
例えば、溶出液に、１０分の１量のＤＮＡポリメラーゼ反応用緩衝液（１０倍溶液）などを添加することによってＰＣＲ反応を行うことができるが、溶出液の塩濃度が予め酵素反応に最適化され、ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、及びＤＮＡポリメラーゼ用プライマーを含んでいることが好ましい。その場合、溶出液を、そのままＤＮＡポリメラーゼ反応に用いることができる。この際、ＤＮＡポリメラーゼ反応には、反応液の一部または全部を用いても良く、一部を用いる場合は、ＤＮＡポリメラーゼ用に調節したバッファーで希釈してもよい。ＤＮＡポリメラーゼ用に調節したバッファーは、溶出液と同じ成分の溶液を用いてもよいが、塩濃度が適正に調節されていれば特に限定されず、ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、及びＤＮＡポリメラーゼ用プライマーは、それぞれ添加されていてもいなくても構わない。

ＤＮＡポリメラーゼ反応は、用いるＤＮＡポリメラーゼに適した条件で行えばよい。そして、ＤＮＡポリメラーゼ反応の後、増幅したｃＤＮＡは、ライブラリー作製など様々な用途に用いることができる。

＝＝ｃＤＮＡ合成キット＝＝
本発明のｃＤＮＡ合成キットは、（１）４〜７Ｍのグアニジン塩、０〜５％の非イオン性界面活性剤、及び０〜０．２Ｍの還元剤を含有する中性溶解液、（２）核酸結合性固相担体、（３）４〜７Ｍのグアニジン塩、及び０〜５％の非イオン性界面活性剤を含有する第１の洗浄液、（４）水または低塩濃度水溶液からなる第２の洗浄液、（５）逆転写酵素、及びｄＮＴＰを含む逆転写反応液、（６）ＤＮＡポリメラーゼ、及びｄＮＴＰを含むＤＮＡ増幅液、を含む。本キットによって、逆転写反応液に目的の遺伝子に対応する逆転写用プライマーを、ＤＮＡ増幅液にＤＮＡ増幅用プライマーを添加するだけで、容易に、効率よく、本発明にかかるｃＤＮＡ合成と、それに引き続くｃＤＮＡ増幅を行うことができる。

また、このキットは、逆転写用プライマー及び／又はＤＮＡ増幅用プライマーを含有してもよい。これによって、特定の遺伝子に対するｃＤＮＡ合成キットとすることができる。

なお、本キットの溶解液、洗浄液、溶出液などの構成要素は、ｃＤＮＡ合成用試薬に記載のものに準ずるものとする。

＝＝実験方法＝＝
（１）吸着工程
１．５ｍＬエッペンドルフ・マイクロチューブ（Eppendorf microcentrifuge tube）に入った血清サンプル（インフルエンザＡ型に罹患した患者から採取）１５０μＬに、３５０μＬの溶解液（５．５Ｍグアニジンチオシアン酸塩、２％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００、０．１５Ｍ２−メルカプトエタノール）を加えて、十分に混合し、血液細胞を溶解した。この溶解液に、磁性シリカ粒子（ＮＰＫ−４０１、東洋紡績社製）を２０μＬ添加し、室温で５分間、ボルテックス・ミキサー（Vortex mixer）で撹拌した。その後、マイクロチューブを磁気スタンド（ＭＧＳ−１０１、東洋紡績社）に設置して磁気シリカ粒子を集め、上清を除去した。

（２）洗浄工程
次に、マイクロチューブを磁気スタンドから外し、３５０μＬの洗浄液Ｉ（７Ｍグアニジン塩酸塩）を加えて、十分混合した後、再度磁気スタンドに設置して、磁性シリカ粒子を集め、上清を除去することにより、磁気ビーズを洗浄した。次に、同様にして４５０μＬの洗浄液ＩＩ（５ｍＭトリス塩酸緩衝液）で粒子を洗浄し、最後に上清を除去した。

（３）逆転写工程
上清を除去して集めた粒子に２０μＬの逆転写反応液を添加し、粒子を懸濁した。そして、マイクロチューブをチューブヒーターで４０℃で１０分間加熱し、逆転写反応を行った。その後、マイクロチューブを磁気スタンドに設置して磁性シリカ粒子を集め、上清を除去した。

（４）洗浄工程
このサンプルに４５０μＬの洗浄液ＩＩを添加し、室温で１０秒間ボルテックス・ミキサーにて撹拌した後、磁気スタンドに設置して磁性シリカ粒子を集め、上清を除去することにより粒子を洗浄した。

（５）実施例１：水への溶出とＰＣＲ反応
（４）で上清を除去して集めた粒子に２０μＬの水を添加し、粒子を懸濁し、２分間、６５℃に加熱し、室温で５秒間ボルテックス・ミキサーにて撹拌した後、マイクロチューブを磁気スタンドに設置して磁性シリカ粒子を集め、上清を回収した。
上清から４μＬをＰＣＲ反応調製液１６μＬへ添加し、計２０μＬの反応液を作製した。この反応液をＰＣＲ装置（ロシュ製ライトサイクラー４８０）にセットし、リアルタイムＰＣＲ反応を行い、サイクルごとに輝度を測定した。

（６）実施例２：ＰＣＲ反応液への溶出とＰＣＲ反応
（４）で上清を除去して集めた粒子に２０μＬのＰＣＲ反応液を添加し、粒子を懸濁し、２分間、６５℃に加熱し、室温で５秒間ボルテックス・ミキサーにて撹拌した後、マイクロチューブを磁気スタンドに設置して、上清を回収した。
こうして得られた２０μＬのＰＣＲ反応液を、そのままＰＣＲ装置にセットし、リアルタイムＰＣＲ反応を行い、サイクルごとに輝度を測定した。

（７）実施例３：従来法
（２）で上清を除去して集めた粒子に２０μＬの水を添加し、粒子を懸濁し、５分間、６０℃に加熱し、マイクロチューブを磁気スタンドに設置して磁性シリカ粒子を集め、上清を回収した。
上清から４μＬを取り出して逆転写反応調整液１６μＬへ添加し、計２０μＬの反応液を作製した。チューブヒーターにて４０℃で１０分間加熱し逆転写反応を行った。
反応後の溶液から４μＬを取り出してＰＣＲ反応調製液１６μＬへ添加し、計２０μＬの反応液を作製した。この反応液をＰＣＲ装置にセットし、リアルタイムＰＣＲ反応を行い、サイクルごとに輝度を測定した。

（８）実施例４：逆転写工程後の洗浄工程を省略した場合
実施例１及び２において、逆転写工程後の洗浄工程（４）を省略する以外は、上述した方法と同様の方法で、ｃＤＮＡを合成し、ＰＣＲを行った。

＝＝結果＝＝
実施例１〜３において、同条件でリアルタイムＰＣＲ反応を行った結果を図１に示す。
実施例１（逆転写反応→洗浄→水への溶出）の増幅曲線の立ち上がりサイクル数（Ｃｔ値）は、実施例３（従来法）のＣｔ値よりも約２サイクル分、小さかった。また、実施例２（逆転写反応→洗浄→ＰＣＲ反応液への溶出）のＣｔ値は、実施例１のＣｔ値よりも約２小さく、実施例３のＣｔ値よりも約４小さかった。

次に、（８）によって、（４）の洗浄を省略してサンプルを処理した結果を図２に示す。
従来法よりも高い検出感度が得られているものの、洗浄を行った場合（図１）よりもＣｔ値が大きくなっていた。この原因は、洗浄を省くことにより上清除去で取り切れなかった逆転写反応液がＰＣＲ反応を阻害したためであると考えられる。

＝＝まとめ＝＝
このように、PCR検出感度が最も高いのは実施例２であり、従来法より高感度で検出するために有効な方法である。それに次いで検出感度が高いのは実施例１であり、実施例２には劣るものの、従来法より高感度で検出できる。

また、実施例１や実施例３では、得られたｃＤＮＡの全量を、一旦水に溶解するため、得られた全量を反応に使用できないが、実施例２では、直接ＰＣＲ反応液に溶出できるため、ＰＣＲ反応液量をごく少量にすることが可能であり、反応の効率化を図ることができる。また、実施例１や実施例２ではＲＮＡが逆転写されたｃＤＮＡの状態で抽出できるため、ＲＮＡで保存しなければならない実施例３（従来法）よりも長期間安定して保存可能である。さらにＲＮＡよりもＤＮＡのほうが安定で、高い温度で保存できるため（ＲＮＡ：−８０℃，ＤＮＡ：−２０℃）、従来よりも保管コストが安くなる。

Claims

リボ核酸（ＲＮＡ）を含む試料に、カオトロピック物質を含有する溶解液および核酸結合性固相担体を混合して、ＲＮＡを前記担体上に吸着させる吸着工程と、
前記担体に吸着したＲＮＡを、逆転写反応液中で前記担体に吸着させたまま逆転写し、ｃＤＮＡを合成する逆転写工程と、
合成した前記ｃＤＮＡを溶出液中に溶出させる溶出工程と、
を含むｃＤＮＡ合成方法。
逆転写工程の前に、前記ＲＮＡを吸着させた前記担体を、洗浄液で洗浄する工程をさらに含む、請求項１に記載のｃＤＮＡ合成方法。
逆転写工程の後に、前記ＲＮＡを吸着させた前記担体を、有機溶媒を含まない洗浄液で洗浄する工程をさらに含む、請求項１または２に記載のｃＤＮＡ合成方法。
前記逆転写反応液が、逆転写酵素、ｄＮＴＰ、逆転写用プライマーを含むことを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の抽出方法。
前記溶出液が、ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、及びＤＮＡ増幅用プライマーを含むことを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の抽出方法。
前記逆転写反応液及び／又は溶出液が、ＢＳＡを含むことを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の抽出方法。
前記逆転写工程において、５０℃未満で、前記ＲＮＡが逆転写されることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
前記担体が、磁性粒子であることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
４〜７Ｍのグアニジン塩、０〜５％の非イオン性界面活性剤、０〜０．２Ｍの還元剤を含有する中性溶解液と、
核酸結合性固相担体と、
４〜７Ｍのグアニジン塩、０〜５％の非イオン性界面活性剤を含有する第１の洗浄液と、
水または低塩濃度水溶液からなる第２の洗浄液と、
逆転写酵素、ｄＮＴＰ、及び逆転写用プライマーを含む逆転写反応液と、
ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、及びＤＮＡ増幅用プライマーを含むＤＮＡ増幅液と、
を含むｃＤＮＡ合成キット。