JP4831725B2 - 簡易的核酸抽出法 - Google Patents
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Description
本発明は、核酸を含有する試料から、迅速かつ簡単に核酸を抽出する方法に関する。
核酸は、例えば細菌、細胞、ウイルス粒子中等に存在し、蛋白質、脂質および糖から成る細胞膜あるいは細胞壁で覆われた蛋白質複合体として形成されており、このような状態で存在する核酸を抽出するためには、核酸を覆う細胞壁、細胞膜を破壊し、さらに前記複合体の蛋白質から除去し、核酸を遊離させる操作が必要である。
核酸を含む試料には、例えば、全血、血漿、尿、糞便、組織、唾液、精液、細胞培養物等の生物学的試料、またその他の試料として、微生物等で汚染された食品あるいは飲料水、遺伝子操作されたいわゆる遺伝子組換え植物等が挙げられ、試料本来の構成成分も十分に考慮した抽出操作が必要となる。
核酸を含む試料から核酸を抽出する代表的な方法として、古くから、１）フェノールにより蛋白質、脂肪等の水不溶性夾雑物を変性させて沈殿させた後、水相中の核酸を回収するフェノール／クロロホルム抽出法、２）イオン交換水で希釈した試料を凍結融解を繰り返し、アルカリ溶液を添加後、油液分離、加熱処理を行うアルカリ溶解法、さらには、３）試料に塩酸グアニジン等を細胞壁や細胞壁を破壊し、複合体の蛋白質を可溶化して核酸を遊離させ、エタノール等を添加して遊離した核酸を不溶化させる、いわゆるグアニジン法等が知られているが、前記の方法には、人体に有害な化学物質を使用する、抽出および洗浄工程故の操作の煩雑性等様々な問題がある。
近年、核酸を回収する方法が絶えず探求され、核酸を含む試料中の夾雑物を所望の方法で除去し、核酸を固相担体に吸着させ回収した後、担体を洗浄し、担体から核酸を液相に回収するという、いわゆる固相に核酸を吸着、固定化等の手段によって核酸を抽出・精製する技術が提案されている。
核酸を含む試料を、グアニジニウム塩等のカオトロピック剤の存在下で、シリカ粒子いわゆる核酸結合性固相に懸濁させ、核酸をシリカ粒子に吸着させた後、試料の夾雑物を除去するためにシリカ粒子を洗浄後、溶出液にて核酸を水層に移行させて核酸を回収する方法がある。しかし、この方法では、使用されるカオトロピック剤が高濃度であるが故に、その後の実験系に影響を及ぼす可能性があり、また、カオトロピックイオンの腐食性、毒性について注意が必要である。さらに、核酸含有量の高い試料や核酸分子が長い場合、シリカ粒子の粒径の使い分けが必要となってくる（例えば、特許文献１参照）。
試料中の細胞を固体支持体に結合させて細胞を試料から分離した後、支持体に結合した細胞を溶解し、前記溶解した細胞から放出した核酸を再度同じ固体支持体に結合させて、核酸を単離する技術が提案されている。本技術は、細胞吸着と核酸精製の両方に同じ固体相を用いることにより、核酸を単離する時間が短縮できることを特徴としている。しかし、使用する固体支持体は磁性を有するため、磁気による支持体の分離操作が必須となる（例えば、特許文献２参照）
核酸と特異的に結合しない磁気吸引可能なビーズの使用により、核酸を回収する方法が提案されている。これは、核酸を含む試料溶液に前記ビーズを懸濁させ、塩およびアルコールを加えて急冷すると核酸はビーズの周囲に凝集するため、磁気によってビーズ・核酸凝集物を沈殿させ上清を除去し、さらに溶解液を加えて核酸を溶解した後、再度、磁気によってビーズを沈殿させ、核酸を含む上清を回収するものである。しかし、この方法も、核酸の溶解→凝集→磁気分離→核酸の再溶解→再磁気分離等操作の煩雑性が否めない（例えば、特許文献３参照）。
核酸を結合させる担体として、以上のように粒子状担体を使用する技術が多く開示されているが、平板状担体の表面に核酸を固体化させて、核酸を単離する技術も提案されている。まず、容器内部に配置された平面膜に、アンモニウム塩等を含む固定化バッファーと試料の混合液を供給する。次に平面膜表面に固定化された核酸以外の成分を、試料供給口と反対口から吸引除去する。最後に、固定化された核酸を洗浄後、供給口から水等により平面膜表面から核酸を溶出させ、反対口から溶出した核酸を取り出す方法を利用した核酸抽出用キットが市販されている（例えば、特許文献４参照）。
最近、核酸を含有する試料に、デキストラン等のキャリアーを混合し、その後グアニジン等とプロピルアルコールを含む試薬を添加して、核酸とキャリアーの大きな不溶化物を形成させて、核酸を分離する技術が開発された。キャリアーは、不溶化物形成により核酸の抽出効率を向上させる効果を有している。しかし、この不溶化物は、蛋白質等を含む液相から分離する工程、すなわち遠心分離やろ過等の分離操作が必要とされる（例えば、特許文献５参照）。
本発明は、核酸を含む試料から核酸を精製するために、従来の複雑な操作や大型または特殊な装置を必要とせずに、簡便かつ迅速に核酸を抽出する方法を提供することを目的とする。また、本発明により、精製した核酸を瞬時に核酸増幅等の核酸分析に供することができる。
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を行った結果、試料に含まれる核酸を、予め不溶化した核酸を担体表面に付着、または担体表面に分散した核酸を不溶化することによって核酸を担体に付着させ、付着した核酸以外の成分を除去した後、核酸が付着した担体を核酸増幅用試薬の入った反応容器に添加するか、または核酸増幅用試薬を反応容器内の核酸の付着した担体に添加することで核酸を抽出させる簡易的核酸抽出法と、前記抽出法を利用した核酸増幅法を見出し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は、以下の構成からなる。
（１）核酸を含有する試料について、以下の工程を含むことを特徴とする核酸抽出法。
（ａ）予め不溶化した核酸を担体に付着させる工程、
および（ｂ）核酸が付着した担体と核酸増幅用試薬とを接触させる工程。
（２）核酸を含有する試料について、以下の工程を含むことを特徴とする核酸抽出法。
（ａ）担体上の核酸を不溶化することによって核酸を担体に付着させる工程、
および（ｂ）核酸が付着した担体と核酸増幅用試薬とを接触させる工程。
（３）担体に付着した核酸以外の成分を除去する（１）〜（２）記載の方法。
（４）担体に付着した核酸を、担体からの分離操作なしに、核酸増幅用試薬と接触させる（１）〜（３）記載の方法。
（５）担体が、ろ紙、メンブレンフィルター、綿、糸、不織布およびプラスチック焼結体から成る群から選ばれる少なくとも１種である（１）〜（４）記載の方法。
（６）核酸を含有する試料について、以下の工程を含むことを特徴とする核酸増幅法。
（ａ）予め不溶化した核酸を担体に付着させる工程、
（ｂ）核酸が付着した担体と核酸増幅用試薬とを接触させる工程、
および（ｃ）前記担体に付着した核酸を増幅させる工程。
（７）核酸を含有する試料について、以下の工程を含むことを特徴とする核酸増幅法。
（ａ）担体上の核酸を不溶化することによって核酸を担体に付着させる工程、
（ｂ）核酸が付着した担体と核酸増幅用試薬とを接触させる工程、
および（ｃ）前記担体に付着した核酸を増幅させる工程。
（８）付着した核酸以外の成分を除去する（６）〜（７）記載の方法。
（９）担体に付着した核酸を、担体からの分離操作なしに、核酸増幅用試薬と接触させる（６）〜（８）記載の方法。
（１０）担体が、ろ紙、メンブレンフィルター、綿、糸、不織布およびプラスチック焼結体から成る群から選ばれる少なくとも１種である（６）〜（９）記載の方法。
（１１）核酸増幅法が、ＬＡＭＰ法である（６）〜（１０）記載の方法。
（１）核酸を含有する試料について、以下の工程を含むことを特徴とする核酸抽出法。
（ａ）予め不溶化した核酸を担体に付着させる工程、
および（ｂ）核酸が付着した担体と核酸増幅用試薬とを接触させる工程。
（２）核酸を含有する試料について、以下の工程を含むことを特徴とする核酸抽出法。
（ａ）担体上の核酸を不溶化することによって核酸を担体に付着させる工程、
および（ｂ）核酸が付着した担体と核酸増幅用試薬とを接触させる工程。
（３）担体に付着した核酸以外の成分を除去する（１）〜（２）記載の方法。
（４）担体に付着した核酸を、担体からの分離操作なしに、核酸増幅用試薬と接触させる（１）〜（３）記載の方法。
（５）担体が、ろ紙、メンブレンフィルター、綿、糸、不織布およびプラスチック焼結体から成る群から選ばれる少なくとも１種である（１）〜（４）記載の方法。
（６）核酸を含有する試料について、以下の工程を含むことを特徴とする核酸増幅法。
（ａ）予め不溶化した核酸を担体に付着させる工程、
（ｂ）核酸が付着した担体と核酸増幅用試薬とを接触させる工程、
および（ｃ）前記担体に付着した核酸を増幅させる工程。
（７）核酸を含有する試料について、以下の工程を含むことを特徴とする核酸増幅法。
（ａ）担体上の核酸を不溶化することによって核酸を担体に付着させる工程、
（ｂ）核酸が付着した担体と核酸増幅用試薬とを接触させる工程、
および（ｃ）前記担体に付着した核酸を増幅させる工程。
（８）付着した核酸以外の成分を除去する（６）〜（７）記載の方法。
（９）担体に付着した核酸を、担体からの分離操作なしに、核酸増幅用試薬と接触させる（６）〜（８）記載の方法。
（１０）担体が、ろ紙、メンブレンフィルター、綿、糸、不織布およびプラスチック焼結体から成る群から選ばれる少なくとも１種である（６）〜（９）記載の方法。
（１１）核酸増幅法が、ＬＡＭＰ法である（６）〜（１０）記載の方法。
本発明の方法により、試料中に存在する核酸を簡単に抽出し、該核酸を核酸増幅等の核酸分析に共することができる。
以下、本発明について更に詳細に説明する。
本発明は、一本鎖または二本鎖のＤＮＡ、ＲＮＡ等の核酸の抽出法であって、このような核酸を含む試料、例えば、全血、血清もしくは血漿、尿、糞便、組織、唾液または精液等の内在性の核酸、寄生虫、細菌またはウイルスを含む微生物等の外来性の核酸、細胞培養物、微生物等で汚染された食品もしくは飲料水または遺伝子組換え植物等に含まれる核酸の抽出に適用できる。本発明の実施には、不溶化した核酸を担体に付着させる必要があるため、核酸を含む試料が塊または乾固状態になっている場合等は、ホモジナイズ等で細かく粉砕することで、核酸の不溶化が容易になり、効率よく担体に付着させることができる。
本発明は、具体的には以下の操作により実施できる。
核酸を含む試料に核酸共沈剤と不溶化剤を添加し混合後、この混合液をろ紙等の担体表面に供給する（以下「前処理法」）か、核酸を含む試料、核酸共沈剤および不溶化剤を順次ろ紙等の担体表面に供給し蛋白質を不溶化（以下「直接法」）させる。ここで、核酸共沈剤は、不溶化された核酸を凝集させることによって大きな不溶化物を生成させ、担体表面に担持させることで、その後の洗浄工程において、ろ紙のような目の粗い担体では、不溶化物に存在する核酸がろ紙を通過させることを防ぐ役割を果たす。
次いで、前処理法または直接法により担体表面に付着した不溶化核酸を洗浄する。このとき担体の下に、前記担体より大きい吸水性のろ紙等を敷いておく。洗浄工程によって、除去された不溶化核酸以外の成分は、その吸収性のろ紙等に吸われることになる。ここで、本発明の「付着」とは、核酸と核酸共沈剤の不溶化が、担体に単に保持されている状態を示し、核酸と担体の結合による化学的相互作用を積極的に利用したものではない。
前記洗浄工程を施された不溶性核酸を付着した担体を、すでに核酸増幅用試薬の入った反応容器に投入するか、または先に前記担体を反応容器に投入した後、核酸増幅用試薬を添加することで、担体に付着した不溶化核酸は、核酸増幅反応で使用される緩衝液に溶出することになり、その後直ちに核酸増幅反応に供することができる。
したがって、本発明は、担体に付着した核酸を、担体ごと直接核酸増幅用の緩衝液に接触させて増幅させるため、従来の溶出工程や担体からの核酸の分離という操作を省くことができる。また、本発明は、特に微量にしか採取できない試料では全量の核酸を回収することができる、さらに核酸含有量が低い試料でも担体に濃縮させて回収することができるため、少量の核酸をロスなく増幅反応に供することができるという特徴も有している。
本発明では、不溶化核酸を付着させる担体として、ろ紙、メンブレンフィルター、綿、糸、不織布およびプラスチック焼結体等が挙げられ、核酸共沈体と核酸の巨大不溶化物を担体表面で保持できれば特に限定しないが、取扱い易さからろ紙やプラスチック焼結体が好ましい。
本発明で使用される核酸共沈剤とは、核酸と親和性が高く、不溶化された核酸を大きく包み込むことができるもので、アミロペクチン、グリコーゲン等のデンプン類が好ましい。また、不溶化剤としては、エタノール、イソプロピルアルコール、ブチルアルコール等の低級アルコールが挙げられるが、核酸の分解酵素であるヌクレアーゼ活性を抑制できるクエン酸ナトリウム等の活性抑制剤、さらには、細胞膜等を破壊し、複合体中の蛋白質を変性させるグアニジン等の蛋白変性剤を併用することによって、核酸の回収効率を向上させることができる。さらに、洗浄工程に用いられる試薬は、不溶化した核酸を担持させたまま、変性した蛋白質を溶解して洗い流すためのもので、不溶化剤として使用した濃度より低濃度のアルコール類が使用される。
本発明で使用される核酸増幅試薬は、例えば、in vitroにおける核酸の増幅技術として現在最も一般的な方法であるＰＣＲ（ Polymerase Chain Reaction ）法の他、ＬＡＭＰ（ Loop-Mediated Isothermal Amplification ）法と呼ばれる増幅法（特許第３３１３３５８号等）、ＳＤＡ（ Strand Displacement Amplification ）法（特公平７−１１４７１８号公報等)、ＮＡＳＢＡ( Nucleic Acid Sequence Based Amplification ）法（特許第２６５０１５９号）等で使用する増幅試薬が挙げられるが、核酸増幅から増幅産物の検出をまで簡単に実施できるＬＡＭＰ用試薬が好ましい。
ＬＡＭＰ法はループ媒介等温増幅法と呼ばれ、鋳型となるヌクレオチドに自身の３'末端をアニールさせて相補鎖合成の起点とするとともに、このとき形成されるループにアニールするプライマーを組み合わせることにより、等温での相補鎖合成反応を可能とした核酸増幅法である。
ＬＡＭＰ法は、標的核酸の計６領域の塩基配列を認識する４種類のオリゴヌクレオチドプライマー、すなわちインナープライマー２種類（ＦＩプライマーとＲＩプライマー）とアウタープライマー２種類（Ｆ３プライマーとＲ３プライマー）、鎖置換合成活性を有する核酸合成酵素、及び基質を用い、熱変性工程を必要とせずに、終始等温で速やかに特異性の高い遺伝子増幅反応が進行することを特徴とする。さらに、増幅反応途中に形成されるダンベル型構造の５’末端側のループ１本鎖の塩基配列に相補的なプライマー（ループプライマー）を使用することにより、核酸合成の起点を増やし、反応時間の短縮と検出感度の向上を図ることも可能である（ＷＯ０２／２４９０２）。
ＬＡＭＰ法での核酸増幅産物の検出は、ＰＣＲ法同様、電気泳動法や蛍光性インターカレーター法を用いて検出できる（特開２００１−２４２１６９）。しかし、本発明者らは、ＬＡＭＰ法の特徴を生かした増幅副生成物である不溶性のピロリン酸マグネシウムによる反応液の濁度や沈殿の生成を指標とした検出法（ＷＯ０１／８３８１７）や、金属イオンと金属指示薬とのキレート化に伴う呈色や蛍光を指標とした検出法（特願２００３−５７３４２）を開発した。前記濁度や沈殿、または蛍光を指標とした検出法では、増幅の有無を、反応容器の外側からでも目視で確認できるため、緩衝液に核酸が溶出した後の不要の担体は、特段除去しなくても、そのまま反応液中に放置しておくことができる。
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。ただし、本発明は、これら実施例において、その技術的範囲が限定されるものではない。
実施例１：牛胚培養細胞からの核酸抽出
Ａ．前処理法
１）試薬調製
核酸共沈剤として４０ｍｇ／ｍＬアミロペクチン溶液（以下「共沈剤Ａ」）、蛋白質変性剤として０．０６ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液（以下「変性剤」）、不溶化剤として６０％イソプロパノールおよび３４ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸ナトリウムを含む混合液（以下「不溶化剤Ａ」）、および７０％エタノール（以下「洗浄液Ａ」）を用意した。また、担体としては、定性ろ紙Ｎｏ．１（ ADVANTEC社製 ）を用いた。
Ａ．前処理法
１）試薬調製
核酸共沈剤として４０ｍｇ／ｍＬアミロペクチン溶液（以下「共沈剤Ａ」）、蛋白質変性剤として０．０６ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液（以下「変性剤」）、不溶化剤として６０％イソプロパノールおよび３４ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸ナトリウムを含む混合液（以下「不溶化剤Ａ」）、および７０％エタノール（以下「洗浄液Ａ」）を用意した。また、担体としては、定性ろ紙Ｎｏ．１（ ADVANTEC社製 ）を用いた。
２）核酸抽出
牛胚培養細胞懸濁液１００μＬ（１細胞／μＬ）と変性剤１００μＬを混合し、次いで、共沈剤Ａ１μＬおよび不溶化剤Ａ２５０μＬを添加し、よく混合した。この混合液全量を、ピペット（またはマイクロシリンジ）を用いて、２ｍｍ角ろ紙上に少しずつ滴下した。このとき２ｍｍ角ろ紙の下に吸水用の大型のろ紙を配置した。大型のろ紙を新しいものに替え、さらに洗浄液Ａ（１００μＬ）を滴下しながら、２ｍｍ角ろ紙を洗浄した。（不溶化した核酸以外の成分が）十分に大型のろ紙に吸水したことを確認後、ピンセット等で２ｍｍ角ろ紙を取り出した。また、細胞懸濁液の代わりに、蒸留水を使用して、同様の操作を行ったものを陰性対照とした。
牛胚培養細胞懸濁液１００μＬ（１細胞／μＬ）と変性剤１００μＬを混合し、次いで、共沈剤Ａ１μＬおよび不溶化剤Ａ２５０μＬを添加し、よく混合した。この混合液全量を、ピペット（またはマイクロシリンジ）を用いて、２ｍｍ角ろ紙上に少しずつ滴下した。このとき２ｍｍ角ろ紙の下に吸水用の大型のろ紙を配置した。大型のろ紙を新しいものに替え、さらに洗浄液Ａ（１００μＬ）を滴下しながら、２ｍｍ角ろ紙を洗浄した。（不溶化した核酸以外の成分が）十分に大型のろ紙に吸水したことを確認後、ピンセット等で２ｍｍ角ろ紙を取り出した。また、細胞懸濁液の代わりに、蒸留水を使用して、同様の操作を行ったものを陰性対照とした。
Ｂ．直接法
１）試薬調製
不溶化剤として６０％イソプロパノール、２．４ｍｏｌ／Ｌグアニジン、０．５％ Ｎ−ラウロイルサルコシンナトリウムおよび１５ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸ナトリウムを含む混合液（以下「不溶化剤Ｂ」）、および４０％イソプロパノールと塩化カリウム２００ｍｍｏｌ／Ｌの混合液（以下「洗浄液Ｂ」）を用意した。共沈剤および担体は、Ａ法で使用したものと同じものを使用した。
１）試薬調製
不溶化剤として６０％イソプロパノール、２．４ｍｏｌ／Ｌグアニジン、０．５％ Ｎ−ラウロイルサルコシンナトリウムおよび１５ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸ナトリウムを含む混合液（以下「不溶化剤Ｂ」）、および４０％イソプロパノールと塩化カリウム２００ｍｍｏｌ／Ｌの混合液（以下「洗浄液Ｂ」）を用意した。共沈剤および担体は、Ａ法で使用したものと同じものを使用した。
２）核酸抽出
ピペットを用いて牛胚培養細胞懸濁液１μＬ（１００細胞／μＬ）および共沈剤Ａ１μＬを順次２ｍｍ角ろ紙上に滴下し、次いでろ紙の下に大型ろ紙を敷き、さらに不溶化剤Ｂ５００μＬを２ｍｍ角ろ紙上に滴下した。それ以降の操作は、洗浄液Ｂを用いて前記前処理法と同様に行った。また、陰性対照も、同様に蒸留水を使用した。
ピペットを用いて牛胚培養細胞懸濁液１μＬ（１００細胞／μＬ）および共沈剤Ａ１μＬを順次２ｍｍ角ろ紙上に滴下し、次いでろ紙の下に大型ろ紙を敷き、さらに不溶化剤Ｂ５００μＬを２ｍｍ角ろ紙上に滴下した。それ以降の操作は、洗浄液Ｂを用いて前記前処理法と同様に行った。また、陰性対照も、同様に蒸留水を使用した。
Ｃ．アルカリ処理法
本発明の回収効率を調べるために、０．０１ｍｏｌ／Ｌ ＮａＯＨ水溶液４μＬと牛胚培養細胞懸濁液１μＬ（１００細胞／μＬ）を混合したものを用意し、これを比較対照とした。
本発明の回収効率を調べるために、０．０１ｍｏｌ／Ｌ ＮａＯＨ水溶液４μＬと牛胚培養細胞懸濁液１μＬ（１００細胞／μＬ）を混合したものを用意し、これを比較対照とした。
Ｄ．未処理法
牛胚培養細胞懸濁液（１００細胞／μＬ）そのままを用い、未処理法とした。
牛胚培養細胞懸濁液（１００細胞／μＬ）そのままを用い、未処理法とした。
実施例２：ＬＡＭＰ反応による核酸増幅
〔反応液組成〕
ＬＡＭＰ用反応液組成(２５μＬ中)
２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）
１０ｍＭ ＫＣｌ
１０ｍＭ （ＮＨ4）2ＳＯ4
８ｍＭ ＭgＳＯ4
８０ｎＭ オキサゾールイエロー
０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０
０．８Ｍ Ｂｅｔａｉｎｅ
１．４ｍＭ ｄＮＴＰｓ
８Ｕ ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ( New England Biolab社製 )
１．６μＭ ＦＩプライマー
１．６μＭ ＲＩプライマー
０．２μＭ Ｆ３プライマー
０．２μＭ Ｒ３プライマー
０．８μＭ ループプライマーＦ
０．８μＭ ループプライマーＲ
〔反応液組成〕
ＬＡＭＰ用反応液組成(２５μＬ中)
２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）
１０ｍＭ ＫＣｌ
１０ｍＭ （ＮＨ4）2ＳＯ4
８ｍＭ ＭgＳＯ4
８０ｎＭ オキサゾールイエロー
０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０
０．８Ｍ Ｂｅｔａｉｎｅ
１．４ｍＭ ｄＮＴＰｓ
８Ｕ ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ( New England Biolab社製 )
１．６μＭ ＦＩプライマー
１．６μＭ ＲＩプライマー
０．２μＭ Ｆ３プライマー
０．２μＭ Ｒ３プライマー
０．８μＭ ループプライマーＦ
０．８μＭ ループプライマーＲ
なお、前記反応液組成中の６種類のプライマーは、雄牛の特異的塩基配列プラスミドＳ４の塩基配列に基づいて以下のように設計されたものである。
・ＦＩプライマー
5'-AGCTATGTGG CATGTGGGAT CCTTCCCTGG AAATGTTTAA GTG-3'(配列番号１)
・ＲＩプライマー
5'-TAAAGCCAGA CACAGAGGTC ACTTTTGCTT CTCTTTCCTG CTTC-3'(配列番号２)
・Ｆ３プライマー
5'-AGCCAAGAAG TGGATGAATC-3'(配列番号３)
・Ｒ３プライマー
5'-GCAGTGCATT TCCTCCTC-3'(配列番号４)
・ループプライマーＦ
5'-GGGATGGAAA CTGTGCAT-3'(配列番号５)
・ループプライマーＲ
5'-ATTGCATGTG GAAGAACTGT AG-3'(配列番号６)
・ＦＩプライマー
5'-AGCTATGTGG CATGTGGGAT CCTTCCCTGG AAATGTTTAA GTG-3'(配列番号１)
・ＲＩプライマー
5'-TAAAGCCAGA CACAGAGGTC ACTTTTGCTT CTCTTTCCTG CTTC-3'(配列番号２)
・Ｆ３プライマー
5'-AGCCAAGAAG TGGATGAATC-3'(配列番号３)
・Ｒ３プライマー
5'-GCAGTGCATT TCCTCCTC-3'(配列番号４)
・ループプライマーＦ
5'-GGGATGGAAA CTGTGCAT-3'(配列番号５)
・ループプライマーＲ
5'-ATTGCATGTG GAAGAACTGT AG-3'(配列番号６)
前記ＬＡＭＰ用反応液に、ＬＡＭＰ反応の鋳型としてウシゲノムＤＮＡを６×１０-20ｍｏｌを添加し、ＬＡＭＰ法による増幅反応を６３℃で３０分を行った。
反応容器に前処理法と直接法によって得られた２ｍｍ角ろ紙を入れ、さらにこのろ紙をＬＡＭＰ用反応液に添加しＬＡＭＰ反応を行った。また、比較対照のアルカリ処理法で得られ試料はその１μＬを、さらに無処理法の試料はその１μＬをそのままＬＡＭＰ反応に付した。増幅反応は、蛍光装置ｉCycler（ Biorad社製 ）を用いて、蛍光の変化を指標とした検出法により確認した。
その結果を図１〜４に示す。前処理法（図１）および直接法（図２）は、抽出操作を行わなかった未処理法（図４）と比較し、増幅反応が起きていることから、両法共、同じように核酸が抽出されていることが確認された。また、現在使用されているアルカリ処理法（図３）との増幅反応曲線の結果から、アルカリ処理法とほぼ同程度の回収効果であることが確認された。また、陰性対照（図１および図２の細胞数０の反応曲線）においては、増幅が見られないことから、一連の処理を経たろ紙担体は、非特異的な増幅反応を誘起しないことを確認した。
実施例３：プラスミドＨＢＶ溶液からの核酸抽出
実施例１のＡ．前処理法に準じて実施した。担体としては、プラスチック（ポリエチレン製）焼結体（フィルタレン社製）（以下「焼結体」）を用いた。すなわち、プラスミドＨＢＶ溶液５μＬ（１×１０6copy／５μＬ）に、変性剤４０μＬおよび３４ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸ナトリウム１２μＬを加え蒸留水で４００μＬとし、さらに１００％イソプロパノールを４００μＬ添加し、よく混合した。この混合液全量を、ピペット（またはマイクロシリンジ）を用いて、大型のろ紙の上に配置した焼結体（３ｍｍφ×１ｍｍ、孔径１０μｍ）上に少しずつ滴下した。この後、実施例１．のＡ法２）同様に、焼結体を洗浄した。また、このような前処理を行わなかったプラスミドＨＢＶ溶液そのものを、陽性対照とした。
実施例１のＡ．前処理法に準じて実施した。担体としては、プラスチック（ポリエチレン製）焼結体（フィルタレン社製）（以下「焼結体」）を用いた。すなわち、プラスミドＨＢＶ溶液５μＬ（１×１０6copy／５μＬ）に、変性剤４０μＬおよび３４ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸ナトリウム１２μＬを加え蒸留水で４００μＬとし、さらに１００％イソプロパノールを４００μＬ添加し、よく混合した。この混合液全量を、ピペット（またはマイクロシリンジ）を用いて、大型のろ紙の上に配置した焼結体（３ｍｍφ×１ｍｍ、孔径１０μｍ）上に少しずつ滴下した。この後、実施例１．のＡ法２）同様に、焼結体を洗浄した。また、このような前処理を行わなかったプラスミドＨＢＶ溶液そのものを、陽性対照とした。
実施例４：ＬＡＭＰ反応による核酸増幅
〔反応液組成〕
ＬＡＭＰ用反応液組成(２５μＬ中)
ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼおよびプライマーの濃度を以下に変更し、そしてオキザソールイエローを除いた以外、他の成分および濃度は、実施例２．と同様の組成とした。
１２Ｕ ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ( New England Biolab社製 )
１．６μＭ ＦＩプライマー
１．６μＭ ＲＩプライマー
０．４μＭ Ｆ３プライマー
０．４μＭ Ｒ３プライマー
〔反応液組成〕
ＬＡＭＰ用反応液組成(２５μＬ中)
ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼおよびプライマーの濃度を以下に変更し、そしてオキザソールイエローを除いた以外、他の成分および濃度は、実施例２．と同様の組成とした。
１２Ｕ ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ( New England Biolab社製 )
１．６μＭ ＦＩプライマー
１．６μＭ ＲＩプライマー
０．４μＭ Ｆ３プライマー
０．４μＭ Ｒ３プライマー
なお、前記反応液組成中の４種類のプライマーは、ＨＢＶの塩基配列に基づいて以下のように設計されたものである。
・ＦＩプライマー
5'-GATAAAACGC CGCAGACACA TCCTTCCAAC CTCTTGTCCT CCAA-3'(配列番号７)
・ＲＩプライマー
5'-CCTGCTGCTA TGCCTCATCT TCTTTGACAA ACGGGCAACA TACCTT-3'(配列番号８)
・Ｆ３プライマー
5'-CAAAATTCGC AGTCCCCAAC-3'(配列番号９)
・Ｒ３プライマー
5'-CGTGCTGGTG GTTGATGTTC-3'(配列番号１０)
・ＦＩプライマー
5'-GATAAAACGC CGCAGACACA TCCTTCCAAC CTCTTGTCCT CCAA-3'(配列番号７)
・ＲＩプライマー
5'-CCTGCTGCTA TGCCTCATCT TCTTTGACAA ACGGGCAACA TACCTT-3'(配列番号８)
・Ｆ３プライマー
5'-CAAAATTCGC AGTCCCCAAC-3'(配列番号９)
・Ｒ３プライマー
5'-CGTGCTGGTG GTTGATGTTC-3'(配列番号１０)
反応容器に、実施例３．の前処理法によって得られた焼結体を入れ、さらに前記ＬＡＭＰ用反応液を添加し、６３℃で６０分間ＬＡＭＰ反応を行った。また、陽性対照のプラスミドＨＢＶはその５μＬをそのままＬＡＭＰ反応に付した。増幅反応は、測定装置 LA-200（ テラメックス製 ）を用いて、濁度（吸光度）変化を指標とした検出法により確認した。
その結果を図５に示す。前処理法は、抽出操作を行わなかった未処理法と比較し、若干抽出ロスは生じたが、増幅反応が起きていることから、担体として焼結体を用いた場合でも、核酸が抽出されることを確認した。
実施例５：血液成分からの核酸抽出
１）試薬調製
核酸共沈剤として１０ｍｇ／ｍＬアミロペクチン溶液（以下「共沈剤Ｂ」）、不溶化剤として６０％イソプロパノール、２．４ｍｏｌ／Ｌグアニジンおよび１５ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸ナトリウムを含む混合液（以下「不溶化剤Ｃ」）、および洗浄液Ａを用意した。また、担体としては、実施例．１で使用したろ紙と同様のものを用いた。
１）試薬調製
核酸共沈剤として１０ｍｇ／ｍＬアミロペクチン溶液（以下「共沈剤Ｂ」）、不溶化剤として６０％イソプロパノール、２．４ｍｏｌ／Ｌグアニジンおよび１５ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸ナトリウムを含む混合液（以下「不溶化剤Ｃ」）、および洗浄液Ａを用意した。また、担体としては、実施例．１で使用したろ紙と同様のものを用いた。
２）核酸抽出
実施例１．のＡ．前処理法に準じて実施した。ＨＣＶ陽性血漿（１×１０6copy／１００μＬ）を、ＰＢＳで各々１０3、１０4および１０5倍に希釈した試料１００μＬと、共沈剤Ｂ４μＬおよび不溶化剤Ｃ５００μＬ混合し、室温で１０分間放置した。この混合物全量をシリンジを用いて、大型ろ紙の上に配置いた２．５ｍｍ角ろ紙上に滴下した。次いで、大型ろ紙を交換し、さらに洗浄液Ａを２．５ｍｍ角ろ紙上に滴下した。再度、大型ろ紙を交換し、２．５ｍｍ角ろ紙の洗浄液を除去後、５分間乾燥させた。また、市販の Xtragen Kit および QIAamp viral RNA Mini Kitを使用して、核酸抽出を行ったものを、比較対照とした。
実施例１．のＡ．前処理法に準じて実施した。ＨＣＶ陽性血漿（１×１０6copy／１００μＬ）を、ＰＢＳで各々１０3、１０4および１０5倍に希釈した試料１００μＬと、共沈剤Ｂ４μＬおよび不溶化剤Ｃ５００μＬ混合し、室温で１０分間放置した。この混合物全量をシリンジを用いて、大型ろ紙の上に配置いた２．５ｍｍ角ろ紙上に滴下した。次いで、大型ろ紙を交換し、さらに洗浄液Ａを２．５ｍｍ角ろ紙上に滴下した。再度、大型ろ紙を交換し、２．５ｍｍ角ろ紙の洗浄液を除去後、５分間乾燥させた。また、市販の Xtragen Kit および QIAamp viral RNA Mini Kitを使用して、核酸抽出を行ったものを、比較対照とした。
実施例６：ＬＡＭＰ反応による核酸増幅
〔反応液組成〕
ＬＡＭＰ用反応液組成(２５μＬ中)
２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）
１０ｍＭ ＫＣｌ
１０ｍＭ （ＮＨ4）2ＳＯ4
８ｍＭ ＭgＳＯ4
８０ｎＭ オキサゾールイエロー
０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０
０．６Ｍ Ｂｅｔａｉｎｅ
１．９ｍＭ ｄＮＴＰｓ
８Ｕ ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ( New England Biolab社製 )
３．２μＭ ＦＩプライマー
３．２μＭ ＲＩプライマー
０．８μＭ Ｆ３プライマー
０．８μＭ Ｒ３プライマー
１．６μＭ ループプライマーＲ
〔反応液組成〕
ＬＡＭＰ用反応液組成(２５μＬ中)
２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）
１０ｍＭ ＫＣｌ
１０ｍＭ （ＮＨ4）2ＳＯ4
８ｍＭ ＭgＳＯ4
８０ｎＭ オキサゾールイエロー
０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０
０．６Ｍ Ｂｅｔａｉｎｅ
１．９ｍＭ ｄＮＴＰｓ
８Ｕ ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ( New England Biolab社製 )
３．２μＭ ＦＩプライマー
３．２μＭ ＲＩプライマー
０．８μＭ Ｆ３プライマー
０．８μＭ Ｒ３プライマー
１．６μＭ ループプライマーＲ
なお、前記反応液組成中の５種類のプライマーは、ＨＣＶの塩基配列に基づいて以下のように設計されたものである。
・ＦＩプライマー
5'-GGTTKATCCA AGAAAGGACC CAGTCGCCAT AGTGGTCTGC GGA-3'(配列番号１１)
・ＲＩプライマー
5'-CCGCAAGACT GCTAGCCGAG GCAAGCACCC TATCAGGC-3'(配列番号１２)
・Ｆ３プライマー
5'-GGCGTTAGTA TGAGTGTCGT AC-3'(配列番号１３)
・Ｒ３プライマー
5'-CATGGTGCAC GGTCTACG-3'(配列番号１４)
・ループプライマーＲ
5'-TTGGGTTGCG AAAGG-3'(配列番号１５）
・ＦＩプライマー
5'-GGTTKATCCA AGAAAGGACC CAGTCGCCAT AGTGGTCTGC GGA-3'(配列番号１１)
・ＲＩプライマー
5'-CCGCAAGACT GCTAGCCGAG GCAAGCACCC TATCAGGC-3'(配列番号１２)
・Ｆ３プライマー
5'-GGCGTTAGTA TGAGTGTCGT AC-3'(配列番号１３)
・Ｒ３プライマー
5'-CATGGTGCAC GGTCTACG-3'(配列番号１４)
・ループプライマーＲ
5'-TTGGGTTGCG AAAGG-3'(配列番号１５）
反応容器に前記前処理法によって得られた２．５ｍｍ角ろ紙を入れ、さらに前記ＬＡＭＰ用反応液を添加し、６３℃で５０分間ＬＡＭＰ反応を行った。また、比較対照として、市販の Xtragen Kit （比較例１）および QIAamp viral RNA Mini Kit（比較例２）を使用して、ＨＣＶ陽性血漿より得られた核酸抽出物について、ＬＡＭＰ反応を行った。増幅反応は、測定装置７７００（ ＡＢＩ社製 ）を用いた蛍光検出により確認を行った。
その結果を図６〜８に示す。比較例１（図７）では、ＨＣＶ陽性血漿の１０4倍希釈まで、増幅反応が観察された。また、比較例２（図８）では、１０3倍希釈でも、増幅反応が観察されなかった。一方、前処理法（図６）では、１０3倍希釈まで、増幅反応が観察された。このことより、前処理法は、抽出効率に関しては、若干比較例１に劣るものの、抽出操作の簡便性、迅速性、さらには自動化への応用が期待できると推察される。
実施例７：担体の種類の検討
各種担体を用い核酸抽出結果を表１に示す。ろ紙やプラスチック焼結体以外に、不織布、メンブレンフィルター類、その他紙類が使用可能であることがわかった。材質から考えて、脱脂綿等も利用可能であると推測される。しかし、核酸との吸着性が高いシリカ性フィルターを用いた場合は、増幅反応が不調であった。したがって、担体としては、核酸との吸着性が低いものが好ましいと考えられる。
各種担体を用い核酸抽出結果を表１に示す。ろ紙やプラスチック焼結体以外に、不織布、メンブレンフィルター類、その他紙類が使用可能であることがわかった。材質から考えて、脱脂綿等も利用可能であると推測される。しかし、核酸との吸着性が高いシリカ性フィルターを用いた場合は、増幅反応が不調であった。したがって、担体としては、核酸との吸着性が低いものが好ましいと考えられる。
Claims (7)
- 核酸を含有する試料について、以下の工程を含むことを特徴とする核酸抽出法。
（ａ）予め不溶化した核酸をろ紙および／またはプラスチック焼結体の担体に付着させる工程、
（ｂ）前記担体に付着した核酸以外の成分を除去する工程、
および（ｃ）核酸が付着した前記担体と核酸増幅用試薬とを接触させる工程。 - 核酸を含有する試料について、以下の工程を含むことを特徴とする核酸抽出法。
（ａ）試料中の核酸を不溶化することによって核酸をろ紙および／またはプラスチック焼結体の担体に付着させる工程、
（ｂ）前記担体に付着した核酸以外の成分を除去する工程、
および（ｃ）核酸が付着した前記担体と核酸増幅用試薬とを接触させる工程。 - 前記担体に付着した核酸を、前記担体からの分離操作なしに、核酸増幅用試薬と接触させる請求項１〜２記載の方法。
- 核酸を含有する試料について、以下の工程を含むことを特徴とする核酸増幅法。
（ａ）予め不溶化した核酸をろ紙および／またはプラスチック焼結体の担体に付着させる工程、
（ｂ）前記担体に付着した核酸以外の成分を除去する工程、
（ｃ）核酸が付着した前記担体と核酸増幅用試薬とを接触させる工程、
および（ｄ）前記担体に付着した核酸を増幅させる工程。 - 核酸を含有する試料について、以下の工程を含むことを特徴とする核酸増幅法。
（ａ）試料中の核酸を不溶化することによって核酸をろ紙および／またはプラスチック焼結体の担体に付着させる工程、
（ｂ）前記担体に付着した核酸以外の成分を除去する工程、
（ｃ）核酸が付着した前記担体と核酸増幅用試薬とを接触させる工程、
および（ｄ）前記担体に付着した核酸を増幅させる工程。 - 前記担体に付着した核酸を、前記担体からの分離操作なしに、核酸増幅用試薬と接触させる請求項４〜５記載の方法。
- 核酸増幅法が、ＬＡＭＰ法である請求項４〜６記載の方法。
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