CN1617938A

CN1617938A - 从单个样品中分离核酸和蛋白质的方法

Info

Publication number: CN1617938A
Application number: CNA038023733A
Authority: CN
Inventors: M·博斯尼斯
Original assignee: Dynal Biotech ASA
Current assignee: Life Technologies AS
Priority date: 2002-01-16
Filing date: 2003-01-16
Publication date: 2005-05-18
Also published as: WO2003062462A2; EP1468116A2; US20050239068A1; JP2005538929A; US8110351B2; CA2473376A1; WO2003062462A3; US20120178090A1; AU2003202026A1

Abstract

本发明包括一种使用固体载体从同一样品中分离核酸和蛋白质的方法，其中该样品所含的核酸和蛋白质成分与不同的固体载体结合。本发明还涉及从同一样品中分离核酸和蛋白质的试剂盒，以及该分离核酸和蛋白质的方法在mRNA和/或蛋白质表达和/或其与基因组信息相关性的分析和/或对比中的应用。

Description

从单个样品中分离核酸和蛋白质的方法

本发明涉及分析单个样品中DNA、mRNA和蛋白质表达的一种方法。该方法有利于使关于mRNA和蛋白质表达的信息与基因组信息相关联。

人类基因组现在已经或多或少地被绘制出来，发现基因数量大大低于原来的估计。这表明人类的复杂性并非在于基因数量，而是在于基因如何被利用，基因产物如何组合和修饰。因此，集中于研究基因产物及其相互作用变得更加重要。

已知在单个细胞或细胞型中只有一部分基因转录，一种基因可能产生多种不同的蛋白质。这部分是由于阅读框的不同、翻译起始/终止密码子的不同和mRNA剪接的不同。还已知，mRNA与蛋白质的相对数量水平不总是一致或者很少一致。由于翻译后修饰，一种mRNA也能产生不同的蛋白质。

因此，个体的基因组(所有基因的集合)可以被看作代表个体的遗传“可能性”，而转录组(transcriptome，由基因组转录的mRNA的集合)代表可能发生的。然而，蛋白质组(即由转录组翻译并经翻译后修饰的所有蛋白质的集合)代表现实，即实际发生的。

因此，所有三个水平—DNA、RNA和蛋白质都可以从不同的方面给出有价值的信息。DNA或基因型给出关于遗传素质(pre-dispositions)和获得性突变/局部重排的重要信息。mRNA和蛋白质谱(profile)都产生生物状态/阶段或疾病的“分子肖像(portraits)”，也可以用来对疾病的发展和治疗进行分期和监视。与DNA不同，mRNA和蛋白质谱都是细胞生物学的“快照(snap shot)”，因为它们由于周围的环境不断改变。由于在转录、翻译和翻译后水平上起作用的调节机制，mRNA和蛋白质水平不总是相关。因此，研究来自同一样品的mRNA和蛋白质是非常重要的。

如上所述，mRNA与蛋白质水平之间不一定是1∶1相关联。如果比较蛋白质水平和相应的mRNA水平，则对于mRNA与蛋白质之比不是1∶1的每种蛋白质，该蛋白质要进行某种形式的转录后和/或翻译后调节。在疾病过程中，特定基因的mRNA/蛋白质比常常改变。为了能够研究调节机制，并阐明mRNA/蛋白质比的这种改变的原因，从同一样品中分离mRNA和蛋白质是非常重要的。本发明提出了一种进行这种分离的新型、有利的方法。

个体之间，例如在与“正常”患者相比具有疾病状态的个体中，蛋白质或mRNA水平的变化，通常是由于他们的基因(即DNA)或调节区中的单核苷酸多态性(SNPs)或其它形式的突变或遗传素质引起的。因此，最好能够从同一样品中分离DNA和蛋白质，优选地DNA、RNA和蛋白质，特别是DNA、mRNA和蛋白质，以便能够直接对比。本发明也提供了这样的方法。

具体而言，现发现通过一种简单且易于实施的方法，能够以适于下游操作和分析的方式，从单个样品中分离核酸和蛋白质，特别是DNA、RNA和蛋白质。这种分离方法包括使来自同一样品的核酸和蛋白质，或优选地DNA、RNA和蛋白质，结合到不同的固体载体或不同的固体载体区域上，以便能够分别分析分离的成分。这些方法可以有利地与另一个起始步骤组合，该步骤包括在进行核酸和蛋白质分离之前从样品中特异地分离一种或多种具体细胞类型或群体(例如B细胞、T细胞、单核细胞)。具体而言，已经显示可以从单个样品中分离具有证实的高纯度的DNA(例如基因组DNA)、RNA(例如mRNA)和蛋白质。也可以从同一样品中相继分离不同的细胞群，然后对其中每一个进行DNA、RNA和蛋白质分离。

本发明的一个方面是提供一种从同一样品中分离核酸和蛋白质的方法，该方法包括使该样品与固体载体接触，从而使该样品中的核酸和蛋白质成分与不同的固体载体结合。

待分离的核酸可以是DNA、RNA或其自然存在的任何修饰形式，及其组合。因此，本发明的方法中可以分离样品的全部核酸成分。然而，在本发明的一个优选实施方案中，从同一样品中将DNA和/或RNA分别分离到不同的固体载体上。

因此，在优选实施方案中，本发明提供了一种从同一样品中分离RNA和蛋白质或DNA和蛋白质的方法。在特别优选的实施方案中，本发明提供一种从同一样品中分离DNA、RNA和蛋白质的方法。

在本发明的方法的实施方案和步骤中，如果要从样品中分离的核酸是DNA，优选该DNA是基因组DNA(gDNA)，可以是单链或双链或其它任何形式。在某些实施方案中，可以分离特定的DNA分子，例如含有编码特定蛋白质的基因。

在本发明的方法的实施方案和步骤中，如果要从样品中分离的核酸是RNA，可以分离总RNA，或者可以分离RNA的一种具体形式或亚组。在本发明的优选实施方案中，从样品中分离mRNA。在某些实施方案中，可以分离特定的RNA分子，例如编码特定蛋白质的特定mRNA。

在此处所述的本发明的方法中，可以顺序或同时进行将核酸和蛋白质分离到不同固体载体上的步骤，包括样品与这些固相接触。类似地，在希望作为单独成分分离蛋白质、DNA和RNA的实施方案中，这些分离可以在同一步骤中进行或者在分开的相继步骤中进行。如下文进一步描述的，在某些情况下，可能希望对同一样品的不同等份(或级分)(即对分开的或等分的样品)进行蛋白质和核酸(例如DNA和/或RNA)的分离。在这些情况下，分离可以在平行的步骤中进行，例如同时平行地进行。

优选地，需要的分离在分开的相继步骤中进行，这些步骤可以以任何顺序依次进行。因此，尽管在本发明的优选实施方案中，第一步分离DNA，随后第二步分离RNA，第三步分离蛋白质，但是这些不同的成分可以以任何顺序分离。

如此处所用的术语“不同的固相”包括：在本发明的方法的不同步骤中使用不同的固体载体(即具有不同结合和表面性质的载体)(例如用相继步骤结合希望的核酸成分和蛋白质的实施方案)，在同一步骤中添加不同的载体(例如希望的核酸成分和蛋白质的分离在同一步骤中进行的实施方案)，以及使用在不同步骤中加入的具有相同表面性质的载体，其中由于不同的温育条件，特定的核酸或蛋白质成分能够结合。此外，在某些情况下，当置于不同条件下，例如不同温育条件、试剂、环境等时，一种特定的固体载体可以结合不同的成分(例如蛋白质和核酸，或细胞和蛋白质或核酸等)。这些差别也可用来使不同的成分结合同一固体载体，但是在不同的步骤中，例如在该程序的不同阶段结合，使得希望的成分可以分别分离。该术语也包括一种固体载体的不同区域，例如可以设计为具有不同的表面性质，使得特定的核酸和蛋白质成分与同一载体的不同区域或不同配体结合。

如上所述，分析来自同一样品的核酸和蛋白质是本发明的一个重要方面。

如此处所用的“同一样品”是指从单个(即未分开的)样品中分离适当的核酸和蛋白质成分。这样，本发明的方法不同于现有技术方法，后者可包括获得多个样品或类似的程序，例如，获得最初的一个样品，并且在开始时立即将其分成等份，例如获得一个样品，并将其分成等份，对这些等份分别进行DNA、RNA和蛋白质分析(每个等份分析一种)，并比较结果。因此，“未分开的样品”可以被看作在采样后或进行任何分离步骤之前，没有马上(例如立即或最初)分开的样品。因此，不排除随后样品的分开，但是开始时或者作为样品处理方法的第一步并不分开。如下文进一步描述的，在进行核酸和/或蛋白质分离程序之前，首先从样品中分离希望的特定细胞群体或亚群，或者实际上分离全部(或者几乎全部)细胞或希望的任何级分，和/或裂解样品中或任何分离的群体或级分中的细胞，可能是有利的或所希望的。在这种情况下，在进行细胞分离或细胞裂解步骤之后，分开单个(即同一)样品可能是希望的或方便的。

因此，可以在最初或首先的分离步骤之后，或者在两个或更多分离步骤之后分开样品。例如，如果希望改变条件(例如离子强度、盐浓度等)，例如为了分离不同的成分，这可能是希望的。因此，例如可以在这种样品分裂或分开步骤之后，从样品的不同等份中分离蛋白质和核酸成分(即DNA和/或RNA)。然而，在本发明的一个有利的实施方案中，使用在任何阶段或任何时间均未分开的单个样品实施该方法。利用本发明的方法能够对未分开的单个样品进行DNA、RNA和蛋白质多重分析的事实显然是有利的，这将允许样品各种核酸和蛋白质成分之间的更直接、更精确的比较。

适于本发明方法中使用的样品可以是含有核酸和蛋白质的任何物质，包括例如：食品和同类产品、临床和环境样品。然而，该样品通常是生物样品，其中可含有任何病毒或细胞材料，包括所有原核或真核细胞、病毒、噬菌体、支原体、原生质体和细胞器。这些生物材料可含有所有类型的哺乳动物和非哺乳动物细胞、植物细胞、藻类(包括蓝藻)、真菌、细菌、原生动物等。代表性样品包括全血和血液衍生的产物，如血浆、血清和棕黄层，骨髓和从其它造血组织获得的样品，尿，排泄物，脑脊液或其它任何体液、组织(例如实体组织)、细胞培养物、细胞悬液等。优选地，该样品是活的(例如未固定的样品)，即含有活细胞，或者至少含有未用任何方法处理的细胞。

样品可以是新鲜获得的，或贮存的，或以任何希望的或方便的方法处理的，例如稀释，或者加入缓冲液或其它溶液或溶剂、含酶溶液等，只要最初样品内核酸和蛋白质或者含有这些核酸和蛋白质的细胞或其它实体的完整性得以保持，即基本上不降解。核酸和蛋白质可以变性，但是不能降解。

更加有利的是，粗样品可以从其来源中直接获得，例如从患者或环境中直接获得(例如临床或环境的直接样品)，并且利用本发明的方法分析其蛋白质和核酸。

一般来说，可以将含核酸和蛋白质的样品简单地与适当的固体载体接触，适当的核酸或蛋白质会与固体载体结合。如必要，例如，如果待分离的核酸和蛋白质在最初的样品内不能用于结合，例如包含于如上所述的生物颗粒(例如病毒外壳或细胞膜或细胞壁)内，则最初的结合步骤之前可以有一个或多个不同的步骤，例如通过破坏结构成分如细胞壁，释放核酸和蛋白质成分，或者实现裂解。实现这一目的的方法在本领域中公知。例如，尽管某些细胞，例如血细胞，可以单独用试剂(如去污剂)裂解，但是其它细胞，例如植物或真菌细胞或实体动物组织，可能需要更剧烈的处理，例如在液氨中研磨，在去污剂存在下加热，在去污剂存在下碱性裂解。主要的要求是，选择释放核酸和蛋白质的方法，使得打算用本发明的方法分离的特定核酸和蛋白质种类充分保持完整，例如基本不降解。

优选地，样品量为10μl-100ml，优选地200μl-10ml。本发明的方法可以用于小样品，例如不到1ml，或者用于较大样品，例如至少2ml，例如超过5ml或10ml或50ml。本发明的一个主要优点是可以使用小体积样品，特别是可以在DNA和/或RNA分离之后或同时从这种小体积样品中分离蛋白质。这一特征使得本发明的方法特别适于自动化。有利地，实施核酸/蛋白质分离方法的样品体积是1ml或者更少，例如10-800μl，例如20-500μl，或50-200μl。例如，可以对含有1×10⁴-1×10⁶个细胞、优选地1-10×10⁵个细胞的样品实施本方法。所述的方法可以高度缩放(highly scalable)，能够用来检测1、5、10、20、200或2000个或更多细胞中的DNA/RNA/蛋白质。

如上所述，一旦获得样品，一个任选的且优选的初始步骤是富集样品中的特定群体，例如待分析其核酸和蛋白质的特定细胞群或细胞器。

富集方法在本领域公知并文献记载。优选的方法包括使用固相，即所述群体与一种固相结合，代表性方法将在下文中更详细地描述。在这些方法中，适当时可以使用一个或多个正和/或负固相选择步骤，这取决于所需要亚群的希望的纯度。这些技术在本领域公知并有记载。简言之，在负选择步骤中，从待分析的样品中除去与固相结合的细胞/群体，而在正选择步骤中，与固相结合的细胞/群体保留在待分析的样品中。

用于分离特定细胞群体的优选的抗体例子有：CD15和CD45抗体(白细胞特异的)，CD14抗体(单核细胞特异的)，CD2、CD3、CD4和CD8抗体(T细胞特异的)，CD19抗体(B细胞特异的)，和抗Ber EP4抗体(上皮细胞特异的，特别是循环癌细胞特异的)。其它抗原也可以通过与特异性抗体(或抗体片段、衍生物等)结合作为检测的基础，实际上可以是可与结合配偶体或配体特异性结合的其它任何细胞表面分子。

希望时，在细胞裂解之前，细胞表面蛋白质可以进行体外修饰，例如化学修饰，例如生物素化或放射性标记，例如在核酸和蛋白质分离步骤之前引入一个标记、或报道或标记基团等。这些修饰的表面蛋白质然后可以通过一种具体的或适当的分离方法分离。例如，通过与携带链霉亲和素或亲和素的固体载体结合，可以分离生物素化的表面(例如膜)蛋白质。

需要时，也可以使用分离希望的细胞群体的其它方法，例如激光捕获显微解剖(Laser Capture Microdissection)。

当本发明的方法包括这种细胞/细胞器等的预分离步骤时，应当理解，可以使用较大的样品体积，例如1-50ml，例如2-20ml或5-10ml，例如血样或其它临床标本。

样品制备是蛋白质组学的瓶颈之一，因为由于丰度的变化和蛋白质特异扩增技术的缺乏，希望降低样品的复杂性以提高分辨率。因此，能够处理特定样品以特异性地富集特定细胞群、细胞器等、从而富集蛋白质的本发明的任选步骤是非常有利的。因此，本发明的方法允许使用同一个单个样品富集一种特定细胞群并分析它们的DNA、RNA和蛋白质。该样品能够直接取自患者的事实是另外一个优点。

特异性或选择性分离所希望群体的特征可有利地应用于比较来自同一样品的多个(例如2个或更多，例如2-10或2-6个)群体。例如，使用对于所希望的多个特定群体特异的且与不同固体载体偶联的不同的适当配偶体，可以从同一样品中分离或分开不同的群体。

因此，本发明的一个优选实施方案提供一种从同一样品中分离DNA、RNA和蛋白质的方法，该方法包括下列步骤：

a)从该样品中分离待从中分离核酸和蛋白质的群体，优选地分离一个或多个特定群体；

b)将该群体(例如细胞群体)裂解，以获得含有可用于结合固体载体的游离形式核酸和蛋白质的样品；

c)在DNA(优选地基因组DNA)与固体载体结合的条件下，使样品与一种合适的固相接触；

d)将该固相与样品的其余部分分离；

e)在RNA(优选地mRNA)与固体载体结合的条件下，将所述样品其余部分与一种合适的固相接触；

f)将该固相与样品的其余部分分离；

g)在特定蛋白质或蛋白质群与固体载体结合的条件下，将所述样品其余部分与一种合适的固相接触；

h)将该固相与样品的其余部分分离。

上述方法是本发明的一个优选实施方案，显然根据希望实现的总体分析可以改变这些具体步骤，从而形成本发明的其它实施方案。具体而言，上述步骤中的一些是任选的，不需要包括在内。例如，步骤a)和b)是任选的，是否实施这些步骤取决于最初获得的样品的性质。如果该样品不含希望分析的游离和释放形式的核酸和蛋白质，例如如果核酸和蛋白质包含于细胞或组织或其它生物包装内，则通常实施步骤a)和b)。

另外，上述方法描述了在不同步骤中相继分离DNA、RNA和蛋白质。分离蛋白质和作为一个级分的总核酸成分，以及分离DNA和蛋白质及RNA和蛋白质，也在本发明的范围之内，为了实现此目的，必要时可以修改该方法的步骤。例如，如果希望分离总核酸和蛋白质，可以将步骤c)替换为这样一个步骤：包括在总核酸成分(例如DNA和RNA)与固体载体结合的条件下使样品与一种合适的固相接触。步骤e)因而可以省略。如果希望分离DNA和蛋白质，则RNA步骤e)和f)可以省略。反之，如果希望分离RNA和蛋白质，则DNA步骤c)和d)可以省略。

另外，上述方法的核酸和蛋白质分离步骤可以以任何顺序实施。因此，尽管在一个优选实施方案中，顺序是DNA然后RNA然后蛋白质(如果所有三种成分都要分析)，但是这些步骤可以以任何顺序进行，例如，可以首先分离RNA或蛋白质。在要分离RNA或蛋白质，或者分离DNA和蛋白质或RNA和蛋白质的方法中，尽管在优选实施方案中首先分离核酸成分，但是也可以首先分离蛋白质成分。

另外，在本发明的另一个实施方案中，希望的核酸和蛋白质成分可以在同一步骤内从同一样品中同时分离。这可以用任何合适的方法实现，但是通常如下进行：使样品同时接触不同的固体载体，这些载体具有不同的表面性质，适当地能够特异性结合DNA(例如基因组DNA)、RNA(例如mRNA)、所有核酸种类或蛋白质。本申请描述了合适的固体载体，它们对于希望从特定样品中分离的不同核酸和蛋白质成分具有特异性，所有这些载体都可以使用。这些具有不同表面性质的不同固体载体可以在同一固体载体的不同区域上提供，或者可以作为分开的固体载体，在同一步骤中接触样品。这些分开的固体载体例如可以方便地作为具有不同适当表面性质的分开的量杆(dipsticks)。一旦希望的核酸和蛋白质成分用这样一个步骤分离，则它们的使用及分析方法可以与在分开的步骤中分离的相同。

一旦希望的核酸和蛋白质成分分离到固相上，即能进行进一步的分析，例如使用常规方法。进一步分析的适当方法将在下文更详细地描述。

核酸与固体载体的结合通常不依赖其序列，通过改变固体载体的性质和诱导核酸结合的条件控制结合的特异性。如上所述，可以诱导样品的所有核酸成分与固相结合，或者可以实现结合条件和/或固体载体性质的适当选择，使得DNA或RNA能够与固相选择性结合，从而能够实施选择性DNA或RNA分离程序，它们可以同时进行或者优选地相继进行。使得所有核酸都可以与固相结合或者DNA和RNA与固相选择性结合的适当方法在本领域公知且有文献记载，所有这些方法都能够在本发明的方法中使用。这里简单描述了一些合适的且优选的方法，在下文将详细描述这些方法，下文也描述了一些替代方法。

当DNA和RNA在两个不同步骤中分离时，方便地可以使用两种不同的固相，例如使用能够区别DNA和RNA的固体载体，进行相继分离。因此，这些实施方案可包括实施第一个分离步骤，分离DNA。然后向样品中加入另一种固体载体，捕获样品中剩余的RNA，其中使用能够结合RNA的固体载体，例如硅基载体(下文更详细地描述)，或者能够捕获特定的RNA分子的固体载体(例如携带互补核酸探针)，或者能够捕获RNA分子亚组(例如聚腺苷酸化RNA)的固体载体，其中使用例如基于poly-dT或poly-dU的寡核苷酸捕获探针。这样，能够从同一样品中快速分离及分开DNA和RNA或它们的亚组。

在一个代表性方法中，在去污剂存在下裂解样品，使DNA与一种固体载体结合，通过取出载体可以容易地将DNA从样品中分离。这些方法在WO96/18731(具体见实施例12)中更详细地描述，其公开内容在此引用作为参考。WO96/18731描述的特定DNA捕获方法也被称为DNA DIRECT法，可以是基因组DNA选择性的。进行这种分离的适当条件和方法也在Dynabeads DNA DIRECT试剂盒(可购自Dynal Biotech AS，Oslo，Norway)中有描述。在希望分离DNA(特别是基因组DNA)的本发明的方法中，DNA DIRECT分离法是一个优选实施方案。此外，也可以使用具有支持DNA结合的表面化学或表面性质的其它固体载体，例如携带表面羧基的载体(优选磁珠)。

然后可以从剩余的样品中分离RNA。这可以使用如上所述的基于固相的系统，其中向样品中加入不同的固相，RNA与之特异性结合。此外，也可以使用同一固相，通过诱导样品条件的适当改变使RNA与之结合。

优选地，在通过与固相结合分离RNA的实施方案中，以及在如此处所述的代表性方法中，RNA是mRNA，使用的固相表面经过改造携带一种mRNA特异的捕获探针，例如该载体在其表面附着dT寡核苷酸或dU寡核苷酸，例如Dynabeads oligo(dT)、Dynabeads cDNArelease(可获自Dynal Biotech ASA)或Dynabeads T₇-oligo(dT)(一种修饰的构建体，其中根据Eberwine等人，Biotechniques(1996)，20(4)584-91和US-A-5,514,575所述的原则，包含T7启动子)。与“T7珠”附着的寡核苷酸是组合的oligo dT和T7启动子序列，结构为5′AAAAAA-T7序列(39nt)-dT(20-25)′。对于Dynabeads T₇-oligo(dT)，向寡核苷酸的3’端添加了VN。

进行这些RNA分离的适当条件和方法也在Dynabeads商品提供的产品说明书中有描述。具体而言，Dynabeads oligo(dT)(可购自DynalBiotech AS，Oslo，Norway)的销售带有mRNA DIRECT试剂盒操作方案，描述了如何进行mRNA分离。在希望分离RNA(特别是mRNA)的本发明的方法中，mRNA DIRECT分离法是优选的。

所用oligo dT或dU珠的选择取决于分离的mRNA的下游用途(见下文进一步描述)。

与载体结合的oligo dU可以用于mRNA的分离，如Dynal BiotechASA的WO00/58329所述。这类似于oligo dT的应用，但是还有另一个优点：“U′s”提供一个糖基化酶酶切位点。

在优选实施方案中，oligo dT/dU(包括T7修饰)构建体还包含另一个核苷酸序列(命名为“VN”，其中“V”可以是T以外的任何核苷酸(例如A、G或C)，“N”可以是包括T在内的任何核苷酸)。这个另外的“VN”序列起辅助oligo dU/dT探针序列与核酸结合的靶向或定位的有利作用；探针结合定位于poly A尾与mRNA编码序列之间的边界处是有利的。

在分离蛋白质的方法的步骤中，方便地使用具有适当表面性质的固相，通过任何合适的方法进行。合适的方法取决于希望分析的蛋白质类型。在一个实施方案中，可以使用一种固体载体分离特定的蛋白质，该载体含有与其表面附着的合适的结合配偶体/配体，例如针对希望分离的特定蛋白质的抗体。就此而言，可以使用的一个特别优选的抗体是抗CK19(载体如小珠可以用抗CK19包被，并且可以用来分离特定蛋白质。抗CK19抗体可以从商业途径获得)。因此，这是利用众所周知的蛋白质亲和分离的原理，如现有技术所广泛描述的。所有这些标准的和众所周知的方法都可用于或经改造用于本发明。

或者，也可以选择具有更通用的表面结合性质的固相，例如一种固相，其表面化学可导致经典的层析相互作用，如离子交换(包括阴离子交换和阳离子交换)、反向相互作用或疏水相互作用。这些表面方便地提供在磁珠上。使用这些更通用的表面方便地允许根据所含蛋白质的结构和性质(电荷、疏水性)等，将样品中的蛋白质分级分离成亚组。这些通用的固相表面能够用柱层析领域标准的且有大量文献记载的常规技术制备。此外，用于流化床分离技术的载体(例如颗粒或珠)已经在本领域中广泛描述，具有例如用于蛋白质分离的离子交换的特性(例如，US-A-5,084,169，US-A-5,079,155和US-A-473,231)。本领域不知道具有这种表面化学的磁性颗粒固体载体，因此构成本发明的另一个实施方案。适用于蛋白质分离的一种固体载体在其表面上含有带正电的胺基，它们被认为结合带负电的蛋白质。结合的蛋白质可以在高盐、低pH条件下洗脱。胺珠可获自Dynal Biotech AS，例如Dynabeads M-270胺。

在多个核酸分离步骤之后实施蛋白质分离步骤的本发明的实施方案中，剩余的样品可以进行任何适当的处理，之后利用适当的固体载体分离蛋白质。例如，如果希望分级分离样品中存在的蛋白质，例如使用如上所述具有更通用的表面结合性质的固体载体，该步骤之前可以是将蛋白质样品再分为不同级分，例如再分为一个或多个膜级分、胞质级分和核级分的步骤。进行这种再分的方法在蛋白质分析领域是标准的且有大量文献记载。

在此处描述的本发明的所有实施方案中，如本领域公知的和文献中广泛描述的，可以使用任何固体载体形式，优选的固体载体是颗粒，更优选的是磁性颗粒。磁性颗粒(珠)在本领域公知，有广泛的商业供应。可以获得不同大小的珠，或者可以制备，并且可以为不同的应用(例如不同DNA、mRNA、蛋白质等的分离)优选不同大小的珠，例如直径4.5μm、2.8μm、2.7μm、1.0μm。

本发明的方法有利地适于自动化，特别是在使用颗粒(尤其是磁性颗粒)作为载体时。在本发明的一个特别有利的实施方案中，使用一种自动化系统实施核酸和蛋白质分离方法，该系统用于在细胞裂解、核酸结合、蛋白质结合和(任选地)洗涤步骤过程中处理固体载体。例如，与载体结合的分离的细胞可以转移到这样一种装置中，希望时洗涤，裂解；适当地根据该方法的具体步骤和所用的具体载体和条件，核酸(即全部核酸成分，DNA或RNA)或蛋白质可以与载体结合，使用这种装置可以容易地洗下结合的核酸或蛋白质。此外，这种装置也可以用来在细胞/群体分离阶段处理载体。因此，可以看出，希望的话可以选择将该方法的所有步骤自动化。

在这点上特别可以提到获自Dynal Biotech ASA，Norway的BeadRetriever^TM。该装置具有一个用于有效地将载体(携带细胞或核酸或蛋白质)从一个孔转移到另一个孔的系统。可以使用的其它自动化机器人工作站(robotic workstations)包括具有Dynal MPC-auto96磁站(magnet station)的BioMek 2000和具有内置磁站的TECAN GENESISRSP。BioMek和TECAN GENESIS RSP都是处理液体的机器人。

本发明第一次描述了能够以自动化方式从同一样品中分离特定细胞群、DNA、mRNA和蛋白质的技术，例如使用固相(特别是磁性固相)实施所有步骤。其它方法如激光显微解剖，比此处所述的方法慢得多，不可自动化，需要固定化、切片的材料。

实施本发明的方法所需的各种反应物和成分可以以试剂盒的形式方便地提供。这些试剂盒是本发明的另一个方面。

最简单的是，本发明该方面提供一种试剂盒，用于从同一样品中分离核酸和蛋白质，该试剂盒包含：

(a)适于结合核酸成分的固体载体；和

(b)适于结合蛋白质的固体载体。

在优选实施方案中，(a)的载体包括与DNA结合的选择性载体，或者与RNA结合的选择性载体，或者这两种类型的载体。

该试剂盒的其它任选成分包括(c)适于分离特定细胞群的固体载体，(d)裂解该细胞的工具。

各种成分(a)、(b)、(c)和(d)可以是如以上关于本发明的方法所述的那些。

另一种任选成分是(e)，检测核酸和/或蛋白质的工具。如上所述，对于检测核酸，这些工具可包括合适的探针或引物寡核苷酸序列，用于以杂交和/或扩增为基础的技术。对于检测蛋白质，这些工具包括合适的抗体。

任选地，这种试剂盒中还可包含缓冲液、盐、聚合物、酶等。

一旦一种或多种核酸和蛋白质成分被分离到固相上，即可用任何适当的方法分析或使用。例如，本发明的方法可用于任何涉及基因组(DNA)、转录组(RNA)和蛋白质组(表达的蛋白质)分析或比较的应用，或者用于希望比较特定DNA和/或RNA和表达的蛋白质、或者更优选地特定DNA、RNA和蛋白质的任何分析。这些方法在基因表达研究中非常有用，因为它们允许mRNA水平与蛋白质水平的分析和比较。另外，分析和比较样品(例如来自不同细胞和组织)的mRNA与蛋白质水平和分布的能力也产生细胞生物学的快照。此外，研究mRNA/蛋白质比也表明哪种基因经历转录后调节。在疾病过程中这些比例经常变化，从而表明哪些基因可能与疾病有关，并且允许研究这种mRNA/蛋白质比变化的可能的调节机制。

例如，本发明的方法也可用于测定与疾病有关的分子改变和机制，例如测定哪种基因突变，或者哪种蛋白质表达过量或不足或者不正确地加工。研究样品的DNA组成能够提供关于遗传素质和获得性突变的信息，而mRNA和蛋白质谱产生细胞生物学状态或疾病阶段的“分子肖像”，也可用于对疾病的发展和治疗进行分期和监视。如上所述，所述方法对于这种分析特别有利，因为它们允许比较来自同一样品的DNA、RNA和蛋白质，这对于更精确、更直接的比较是重要的。

本发明的方法也可以用作从单个样品中分离核酸和蛋白质级分的方法。

更具体而言，对于DNA，一旦分离，即能用于基于核酸的检测方法，例如基因分型、SNP分析、测序反应等。

有利的是，在实施该检测步骤之前，结合的核酸不需要从载体上洗脱或取出，尽管在希望时可以进行这种操作。是否洗脱核酸也可取决于核酸结合步骤中使用的具体方法。例如，某些核酸结合方法将比其它方法更紧密地结合核酸。例如在使用去污剂(例如使用DNADirect)的DNA结合时，当加入洗脱缓冲液或其它适当的介质时，核酸将从固体载体上洗脱下来。利用沉淀剂(如乙醇)或离液剂结合的核酸将会更紧密地结合，当置于缓冲介质中时可能不会洗脱，可能需要加热才能洗脱。DNA的一种优选用途是用于固相SNP分析，该分析任选地可以完全自动化。这种SNP分析可以用任何合适的技术进行。例如，可以使用一种生物素化的引物进行PCR，然后在链霉亲和素珠上产生单链DNA模板，然后是探针退火、ddN掺入和标记反应。

因此，通过简单地将载体重悬浮于或者加入适用于检测步骤的介质，这种载体结合的核酸可以直接用于基于核酸的检测方法，特别是载体为颗粒时。核酸可以洗脱到该介质中，或者如上所述，不必洗脱。

检测核酸的一些不同技术众所周知，并且在文献中有描述，可以使用其中任何一种。方便地，可以用光学方法检测核酸，例如测量或检测光密度(OD)。此外，也可以通过与探针(可以是用于检测的标记探针)杂交检测核酸，已经描述了很多这样的杂交方案(参见，例如：Sambrook等人1989，《分子克隆：实验室手册》，第二版，ColdSpring Harbor Press，Cold Spring Harbor，NY)。最普通的是，这种检测包括原位杂交步骤，和/或使用文献所述任何方法的体外扩增步骤，例如探针退火/杂交，随后是ddN掺入(为了检测可标记)。因此，可以使用如LAR、3SR和Q-β-复制酶系统等技术。然而，一般选择PCR及其不同的变形，例如使用嵌套引物，或者使用一种或多种生物素化的引物(关于核酸扩增技术的综述，参见，例如：Abramson和Myers，1993，Current Opinion in Biotechnology，4：41-47)。

其它检测方法可以是以测序方法为基础，例如，如Syvnen和Sderlund，1990，Genomics，8：684-692所述的微量测序法。

在扩增技术如PCR中，第一步需要加热来融解DNA双链体，这可从载体上释放结合的DNA。因此，对于随后的检测步骤，如PCR，载体结合的核酸可以直接加入反应混合物中，在检测方法的第一步中核酸被洗脱。根据本发明获得的全部分离的载体结合核酸样品可以在检测步骤中使用，或者使用一个等份。

PCR或其它检测步骤的结果可以用本领域所述的多种方法检测或显示。例如，PCR或其它扩增的产物可以使用已知技术在电泳凝胶如溴化乙锭染色的琼脂糖凝胶上电泳。

扩增的核酸也可以通过测序检测或验证结果，其中使用目前可用的多种不同的测序技术，例如标准测序、固相测序、循环测序、自动测序和微量测序。

如果使用例如oligo(dT)珠或oligo(dU)珠(例如使用如此处所述的Dynabeads oligo(dT)、Dynabeads cDNA release或Dynabeads T7oligo(dT))分离mRNA，该mRNA可以以任何合适的方法使用或分析。例如，mRNA可以用适当的常规技术分析，例如Northern印迹法，或者可以用来产生cDNA，然后可以进行任何适当的基于DNA的分析，如上所述。

可见，可以用本发明的方法产生来自特定样品(例如细胞、病毒等的特定群体或亚群)的mRNA和cDNA文库。这种应用可以在mRNA仍在固相上时进行，即产生固相cDNA文库，或者可以在mRNA洗脱后进行。mRNA也可以作为RT-PCR的底物。固相cDNA文库可以用于任何合适的用途，并且可以再利用，例如作为不同PCR(或其它扩增)的模板，从而能够PCR(或其它)分析例如来自分离的单一细胞的多种转录物。例如，从图2可见，固相cDNA文库已经在多重PCR实验中再使用，以检测培养的癌细胞中的不同转录物。

如果如上所述利用Dynabeads cDNA release珠(或者商业上可获得的仿制等同物)分离mRNA，这些珠含有与其表面偶联的oligo(dU)VN。这些oligo(dU)VN分子与mRNA结合，能够用来引发固相cDNA合成的一条链。然后通过UNG处理可以酶促释放固相cDNA，例如进行探针制备，用于基因表达分析(profiling)。

如果如上所述利用Dynabeads T7 oligo(dT)珠(或商业上可获得的仿制等同物)分离mRNA，这些珠含有与其表面偶联的T7启动子，其与oligo(dT)VN 5’端(5-prime)连接。在双链固相cDNA合成后(第一链合成用oligo(dT)作为引物，第二链合成用随机六聚体启动)，可以利用T7启动子(是T7聚合酶特异的39个核苷酸的序列，识别双链DNA中的该序列)体外转录反义RNA，从而从小样品中扩增mRNA，用于进一步分析，或者例如用于基因表达分析(profiling)的探针制备，例如用于微阵列分析。可方便地按如下制备探针：通过反义RNA的逆转录(使用随机六聚体)，获得cDNA，可以对其标记并用来杂交微阵列。这些cDNA也可以在使用T7珠的第二轮扩增中使用。

尽管微阵列是一种有效的高通量工具，但是它们不是非常灵敏—每个阵列至少需要1-2μg mRNA。这通常不可能通过例如单细胞分析实现。因此，需要体外转录法扩增RNA。为此，使用Dynabeads T7oligo(dT)珠扩增RNA的能力有利于微阵列应用和其他需要mRNA扩增的任何应用。

一旦使用本发明的方法通过与固相结合被分离，蛋白质亚组(例如使用具有更加通用化的层析型表面的载体分离的)或各种蛋白质(例如使用携带特异配体的载体分离的)即可以在仍存在于珠上时直接分析(例如珠ELISA)，或者可以从固体载体上洗脱，随后用任何合适的常规技术分析，如SDSPAGE/Western印迹法、免疫沉淀等。

如上所述，本发明的方法的主要优点之一是，能够从准备分析的同一样品中分离DNA、RNA和蛋白质中的一种或多种。因此，通过使用上述任何技术分析来自同一样品的DNA、RNA和蛋白质获得的结果，必要时可以根据分析目的进行比较。

如果最初的样品中含有包含待分析核酸和蛋白质的细胞或其它生物颗粒，则这些待分析的细胞/颗粒通常需要与样品的其余部分分离。这种分离可以用本领域标准和常规的任何方法进行，如沉淀或离心或细胞分选法。此外也可以使用基于亲和力的分离系统，这在下文中更加详细地描述。如果希望分析来自初始样品中所含细胞亚群或颗粒的核酸和蛋白质，这些基于亲和力的系统是特别优选的。当使用这些基于亲和力的系统时，通常通过使细胞或颗粒与携带适当结合配偶体的固体载体结合进行分离。

用于所希望靶细胞的基于亲和力的分离系统在本领域中公知，实现细胞的选择性分离依赖于结合配偶体的特异性，即对于靶细胞是特异性或选择性的。这种系统用作本发明的一个任选步骤，以在处理样品以释放核酸和蛋白质、提供含有核酸和蛋白质的样品之前，从样品中选择性分离一种或多种特定的细胞群或其它生物“颗粒”。因此，用于此方面的一种合适的结合配偶体可以是对希望的细胞或其它群体具有结合亲和性的一个或多个部分。

结合配偶体可以是能够结合需要的细胞群体或其它颗粒的任何分子或部分，但是方便的是一种蛋白质、多肽或肽。然而也可以使用具有不同化学性质的其它部分或分子，例如碳水化合物或有机小分子。也可以使用核酸结合配偶体，例如适合体(aptamer)。

结合配偶体可以结合细胞或其它颗粒表面存在的分子或结构，例如结合在表面上(例如特异性)表达的细胞表面抗原(例如细胞特异的Dynabeads，如Dynabeads Epithelial Enrich，抗CD14，抗CD3，抗CD4，抗CD8，抗CD19)。此外，结合配偶体也可以是结合细胞表面表达的蛋白质(例如细胞表面受体)的任何部分。

例如，结合配偶体可以方便地为特定表面抗原特异的抗体。根据本领域公知的技术，也可以使用抗体片段和衍生物。制备这些片段或衍生物的方法在本领域公知，在文献中有广泛描述。

因此，利用对目标群体表面上存在的分子或其它实体的了解，可以选择一种结合配偶体或结合配偶体的组合或混合物，实现从样品中分离或分开目标细胞或其它群体。有利的是，可以分离样品中存在的全部或基本上全部(即接近全部)目标细胞或其它颗粒。可以实现的分离不仅取决于选择的结合配偶体，而且取决于样品的性质、结合条件等。另外，生物系统的性质是可变的，不总是能够达到100％的分离，实际上根据本发明这也不是必需的；在任何生物系统中，必须允许一定的容许度(tolerance)。然而，在本发明的优选实施方案中，可以分离样品中存在的至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的目标群体。

当使用一种以上的不同类型的结合配偶体时，它们可以附着于相同或不同的固体载体上。使用不同固体载体的这种系统特别适用于颗粒性载体(如珠)的情况。因此，不同的结合配偶体可以附着于不同的珠。

在使用一种以上的不同类型的结合配偶体的实施方案中，本领域技术人员将容易确定可以使用的不同类型结合配偶体的适当含量或比例。

如上所述，以固相亲和性结合为基础的细胞分离技术(例如免疫磁性分离(IMS))在本领域公知，本领域技术人员可以容易地确定其实现条件。IMS是一种优选的且有利的细胞分离方法，因为它能够从全血中高纯度地分离特定的细胞群，例如，通过流式细胞术和分子技术分析，纯度达99％以上。因此，在使用单独的亲和分离步骤的实施方案中，例如携带适当结合配偶体的固体载体可以与样品接触。例如，可以向适当介质(例如缓冲液)中包含(例如悬浮)的样品中加入一种颗粒性固体载体。该载体然后可以与样品接触(例如温育)一段时间，使得与细胞或其它颗粒的结合能够发生。该步骤中的时间/温度条件并不重要，样品-载体混合物可以在例如4-20℃下温育10分钟-2小时，例如20-45分钟。至于其它条件，可以根据本领域公知的原则和方法，考虑研究的细胞和使用的分离方法，适当地确定。然而，细胞分离方法集中于使影响细胞生理状态的可能性最小，从而能够进行下游分子表征和分析。对于所述的下游应用，也能利用激光捕获显微解剖分离细胞群体。

在细胞结合后，或者在实施其它任何步骤分离待分析其核酸和蛋白质的目的细胞群之后，裂解分离的或与载体结合的细胞，释放其核酸和蛋白质。细胞裂解方法在本领域公知，在文献中有广泛描述，可以使用任何已知的方法。例如，可以使用下列任何一种方法：使用例如适当缓冲液中的SDS、LiDS、Triton-X100、尿素或sarkosyl的去污剂裂解；使用离液剂，如盐酸胍(GHCl)、硫氰酸胍(GTC)、碘化钠(NaI)、高氯酸盐等；机械破坏，如通过弗氏压碎器、超声处理、用玻璃珠、氧化铝或在液氨中研磨；酶裂解，例如使用溶菌酶、链霉蛋白酶或纤维素酶或者可以购得的其它任何裂解酶；通过噬菌体或病毒感染的细胞裂解；冷冻干燥；渗透休克(osmotic shock)；微波处理；温度处理，例如加热或煮沸，或冷冻，例如在干冰或液氨中冷冻，和融化；碱性裂解。如上所述，所有这些方法都是标准裂解技术，在本领域中公知，可以使用任何这类方法或方法组合。唯一的要求是选择一种适当的方法，使得在随后的程序中待分析的核酸和蛋白质种类基本保持完整，即基本不降解。

在分离方法中使用试剂，如溶剂、醇和离液剂，有时是不利的。本发明具有可以避免使用这些试剂的优点。因此，虽然可以使用如上所述使用这些试剂的裂解方法，但在本发明的有利实施方案中，不使用这些试剂。

方便地，使用去污剂实现本发明的裂解。因此，一种合适的典型裂解剂包括一种去污剂，如SDS或另一种碱金属烷基硫酸盐，例如LiDS，或Sarkosyl或其组合。裂解剂可以在简单的水溶液中提供，或者可以包含于缓冲液中，形成所谓的“裂解缓冲液”。可以使用任何合适的缓冲液，包括例如Tris、Bicine、Tricine和磷酸缓冲液。此外，也可以分别添加裂解剂。裂解缓冲液中也可以包含(或者向其中加入)盐，例如LiCl和NaCl。具体而言，当使用LiDS时LiCl是优选的，当使用SDS时NaCl是优选的。

裂解剂的适当浓度和量根据具体系统等而不同，可以适当地确定，但是可以使用例如浓度为2M-7M的离液剂，如GTC、GHCl、NaI或高氯酸盐，0.1M-1M碱性试剂，如NaOH，和0.1-50％(w/v)例如0.5-15％去污剂。

为了实施本发明的方法，可以将与载体结合的或以其它方式分离的细胞方便地移出或与样品的其余部分分离，从而浓缩或富集细胞。为了利于随后的步骤，在裂解步骤之前，希望用例如适当缓冲液或其它介质稀释分离的细胞。如果需要，可以进一步处理细胞，例如加热或混合(例如涡旋)。稀释步骤可以有利地防止颗粒性载体(如珠)的团聚/聚集。然后通过加入含有希望的裂解剂的适当裂解缓冲液，或者使分离的细胞经受希望的裂解条件，可以方便地实现裂解。例如，在只是加入含有适当裂解剂的裂解缓冲液的情况下，分离的细胞可以仅在裂解缓冲液存在下温育适当的时间，以便发生裂解。不同的温育条件可能适于不同的裂解系统，这在本领域是公知的。例如，对于含有去污剂的裂解缓冲液，可以在室温或更高的温度(例如37℃、50℃或65℃)下发生温育。同样，温育时间可以是几分钟(例如5-10分钟)到几小时，例如20-40分钟或1-2小时。对于酶促裂解，可能需要更长的处理时间，例如过夜。

在获得含有游离或释放的核酸和蛋白质的样品后(例如需要时在裂解后)，采用的步骤将取决于希望进行的具体分析类型。例如，在本发明的方法中，可以利用固相从同一样品中分离核酸和蛋白质、DNA和蛋白质、RNA和蛋白质，或者最优选地DNA、RNA和蛋白质。分离何种取决于加入的固体载体的性质和/或样品和核酸暴露的条件。

核酸与固体载体结合的适当条件和固体载体在本领域中公知并有文献报道，在本发明的实施方案和步骤中可以使用这些方法中的任何一种，其中希望样品中所有释放的所有核酸(即DNA和RNA)与固体载体结合。方便地，核酸与载体非特异性结合，即不依赖于序列。例如，使用任何已知的核酸沉淀剂，例如醇、醇/盐组合、聚乙二醇(PEG)等，释放的核酸可以沉淀到载体上。例如WO91/12079描述了核酸以这种方式沉淀于珠上。因此，可以向载体上添加盐，并在溶液中释放核酸，随后加入可使核酸沉淀的醇。此外，盐和醇也可以一起加入，或者可以省略盐。如上对于细胞结合步骤所述，可以使用任何合适的醇或盐，适当的量或浓度可容易地确定。然而，如上所述，优选地避免使用溶剂、醇和类似的试剂。因此，避免使用这些试剂的替代技术是优选的。

在本发明的优选方法中，DNA和RNA在不同步骤中与不同的固体载体结合。允许DNA或RNA选择性结合的适当条件和固体载体在本领域中公知，可以使用这些技术中的任何一种。例如，WO96/18731描述了可以从同一样品中相继分离DNA和RNA的优选技术，其内容在此引用作为参考。

例如就此而言，通过选择适当的“核酸结合”条件(例如适当的缓冲液或裂解/结合介质组合物)，可以选择是将从细胞中释放的DNA还是从细胞中释放的RNA与固体载体结合。例如，可以选择有利于DNA(或者更具体而言，基因组DNA)与固体载体结合的“结合介质”组合物。这些结合介质组合物包括以上所述的那些、以下实施例所述的那些和WO96/18731的组合物。例如，一种典型DNA结合介质可包含GuHCl和任选的EDTA。

简言之，在如Dynal AS的WO96/18731中所述不同去污剂存在下，使DNA与适当的非特异性固体载体结合(所谓的“DNA Direct”法)。该公开文献描述了用于核酸与固体载体结合的基于去污剂的多种系统，它们可以用于本发明。然后，例如利用磁场，将固体载体与样品的其余部分分离。

对于RNA的结合，适当的介质组合物或条件在本领域中公知，或者可以从本领域公知的RNA分离方法容易地确定，例如可以包括Akzo Nobel NV的EP-A-0389063和US-A-5,234,809所述的缓冲液和程序。

典型的RNA结合组合物例如可包含硫氰酸胍(GTC)及EDTA。

对于RNA结合，固体载体的性质可能是重要的，特别是应当使用“二氧化硅(silica)”(即包括二氧化硅本身或基于二氧化硅或二氧化硅衍生物)固体表面(见下文)。

有利地，当利用本发明的方法分离DNA时，可以与另一个从样品中分离RNA的独立步骤组合。

因此，根据上述程序，并选择核酸结合步骤中的DNA结合条件(例如有利于DNA结合的裂解/结合或结合介质)，从载体结合的细胞上释放的DNA可以与载体结合，并从样品中取出。从细胞释放的RNA，最特别的是mRNA，保留在样品中(更准确的说是上清液中)。使用标准程序，例如通过与由oligo dT组成的方便地固定化(例如与固体载体结合)的捕获探针结合，可以从样品中容易地分离这种RNA。

然后可以在样品中的RNA被捕获的条件下，向样品中添加另一种固体载体。这例如可以如下实现：使用一种能够结合RNA的固体载体，或者能够捕获特定RNA分子的固体载体(例如携带互补的核酸探针)，或者能够捕获一个亚组RNA分子的固体载体(例如携带用于聚腺苷酸化RNA的捕获探针，即mRNA特异的)。

方便地，核酸或DNA结合步骤可以与细胞裂解步骤同时或伴随发生。这可以用WO96/18731的基于去污剂的方法方便地实现。例如，用于裂解和核酸结合的试剂可方便地包含于适当介质(例如缓冲液或其它水溶液)中，并加入到与载体结合的细胞中。然后可以使这些细胞与所述介质保持接触，例如温育(如上所述)，以便发生裂解和核酸结合。这种介质可以被称为“裂解/结合”介质。去污剂既可以作为裂解剂，又可以帮助核酸与载体结合。

该去污剂可以是任何去污剂，其中许多已知并且在文献中有描述。例如，该去污剂可以是离子性的(包括阴离子和阳离子的)、非离子性的或两性离子的。此处所用的术语“离子性去污剂”包括当溶解于水时部分或全部为离子形式的任何去污剂。阴离子去污剂特别有效，因此是优选的。合适的阴离子去污剂包括，例如，十二烷基硫酸钠(SDS)或其它碱金属烷基硫酸盐或类似的去污剂、sarkosyl或其组合。

方便地，可以使用如下浓度的去污剂：0.2-30％(w/v)，例如0.5-30％，优选地0.5-15％，更优选地1-10％。对于阴离子去污剂，1.0-5％，例如0.5-5％的浓度显示有效。

去污剂可以以简单的水溶液(可以是碱性或酸性的)形式提供，或者更优选地在缓冲液中提供。可以使用任何合适的缓冲液，包括例如Tris、Bicine、Tricine和磷酸缓冲液。为了提高核酸捕获，可以方便地包含单价阳离子的来源，例如一种盐，尽管这不是必需的。合适的盐包括盐酸盐，例如氯化钠、氯化锂等，浓度为0.1-1M，例如250-500mM。如上所述，也可包含其它成分，如酶。

去污剂组合物中的其它任选成分包括适当浓度为1-50mM等的螯合剂，例如EDTA、EGTA和其它聚氨基羧酸，浓度为例如1-10mM的还原剂，如二硫苏糖醇(DTT)或β-巯基乙醇。

优选的去污剂组合物例如可包含：

100mM Tris-HCl pH7.5

10mM EDTA

2％SDS

或：

100mM TrisCl pH7.5

10mM EDTA

5％SDS

10mM NaCl

或：

100mM TrisCl pH7.5

500mM LiCl

10mM EDTA

1％LiDS

进一步的细节、典型反应条件等参照WO96/18731。

为了完成将释放的核酸与固体载体结合的步骤，也可以使用其它核酸结合技术。例如，一种这样的方法可以利用众所周知的核酸与二氧化硅表面结合的原理。

例如，在这个实施方案中，固体载体可包含或者由二氧化硅或以二氧化硅为基础的或二氧化硅衍生的材料组成。许多这样的材料在本领域中公知并且已经被描述，所述文献包括描述通过与二氧化硅表面结合分离核酸的参考文献(参见，例如：AKZO N.V.的EP-A-0389063，Becton Dickinson的US-A-5,342,931，US-A-5,503,816和US-A-5,625,054，Hahnemann University的US-A-5,155,018，PromegaCorp.的US-A-6,027,945和Toyo Boseki KK的US-A-5,945,525)。

核酸与载体的离子性结合可以使用具有带电表面的固体载体(例如用聚胺包被的载体)实现。

本发明的方法使用的载体也可以携带有助于核酸特异性或非特异性结合的功能基团，例如DNA结合性蛋白质，例如可以包被到载体上的亮氨酸拉链或组蛋白或嵌合染料(例如溴化乙锭或Hoechst42945)。

同样，载体可以具有有助于选择性捕获核酸的结合配偶体。例如，可以使用互补DNA或RNA序列或DNA结合性蛋白质。这些蛋白质与固体载体的附着可以用本领域公知的技术实现。这些核酸结合性配偶体可以方便地在固体载体上与抗白细胞结合配偶体混合。

此处所述方法的任何步骤使用的固体载体可以是目前广泛使用或建议使用的用于固定、分离等的众所周知的任何载体或基质。它们可以采用颗粒、片、凝胶、滤纸、膜(例如尼龙膜)、纤维、毛细管、针头或微量滴定条(microtitre strip)、试管、平板或孔等、梳子、移液器头(pipette tip)、微阵列、芯片的形式，或者实际上任何固体表面材料。

该载体可方便地由玻璃、二氧化硅、乳胶、塑料或任何聚合材料制成。一般来说，对于核酸的分离，载体的性质并不重要，可以使用多种表面材料。固体载体的表面可以是疏水的或亲水的。优选的是呈现可结合细胞(随后核酸)的大表面面积的材料。这些载体通常有一个不规则的表面，例如可以是多孔的或颗粒性的，例如颗粒、纤维、织物、溶渣(sinters)或筛子。由于具有较大的结合能力，颗粒性材料(例如珠)通常是优选的，特别是聚合物珠/颗粒。

本发明使用的颗粒性固体载体方便地包括球形珠。珠的大小并不重要，但是直径的数量级例如为至少1μm、优选地至少2μm，最大直径优选地不超过10μm，更优选地不超过6μm。例如，直径2.8μm、2.7μm和4.5μm的珠显示有效。

大小基本均一的单分散颗粒(例如直径标准差小于5％的大小)具有提供非常均匀的反应可重复性的优点。利用US-A-4336173所述的技术生产的单分散聚合物颗粒特别适用。

适于本发明方法使用的非磁性聚合珠可获自Dynal Biotech AS以及Qiagen、Amersham Pharmacia Biotech、Serotec、Seradyne、Merck、Nippon Paint、Chemagen、Promega、Prolabo、Polysciences、Agowa、Bangs Laboratories和Dyno Particles或Dyno SpecialityPolymers。

然而，为了帮助操作和分离，磁珠是优选的。如此处所用的术语“磁性”是指当置于磁场中时，该载体能够被赋予磁矩，因此在磁场作用下是可移动的。换句话说，含有磁性颗粒的载体通过磁性聚集可以容易地取出，因而提供了在全部细胞、核酸和蛋白质结合步骤之后分离颗粒的一种快速、简单、有效的方法，它大大降低了传统技术的剧烈性，传统技术如离心，产生可破坏细胞或降解蛋白质或核酸的剪切力。

因此，使用本发明的方法，通过施加磁场，例如使用永久磁铁，可以使附着有细胞、核酸或蛋白质的磁性颗粒移至合适的表面上。将一块磁铁置于含有样品混合物的试管旁通常就足以使颗粒聚集在管壁上，取出样品的其余部分进行其它步骤。

特别优选的是超顺磁颗粒，例如Sintef在EP-A-106873中所述，因为可以避免反应过程中颗粒的磁性聚集，从而确保均匀的细胞、核酸和蛋白质提取。Dynal Biotech ASA(Oslo，Norway，以前是Dynal AS)所售的称为DYNABEADS的众所周知的磁性颗粒特别适用于本发明。珠也是适于自动化的，并且允许在不同盐浓度和/或pH下结合。利用珠还可以操作单个样品的结合和洗脱条件。

本发明使用的功能化的包被颗粒可以按照美国专利4,336,173、4,459,378和4,654,267所述，通过珠的修饰制备。因此，可以制备具有不同类型的功能化表面的珠或其它载体，例如带正电或负电，亲水或疏水。

在使用基于亲和力的细胞或其它颗粒分离的实施方案中，使用本领域公知的和文献中描述的技术，可使结合配偶体在与细胞/颗粒结合之前或之后以任何适当的方式与固体载体附着。例如，结合配偶体可以直接或间接附着于固体载体上。

在一个方便的实施方案中，结合配偶体在与样品接触之前可以附着于载体上。这种附着可以用本领域公知的技术(例如偶联化学)容易地实现，结合配偶体例如方便地通过包被直接与固体载体结合。然而，也可以通过间隔区或接头部分附着。可选择将结合配偶体共价或可逆地附着。

或者如上所述，结合配偶体在与固体载体附着之前也可以首先接触样品，以便结合细胞/颗粒。在此情况下，固体载体可以适当地携带或含有一个结合部分，该部分能够结合所用的特定结合配偶体。这些结合系统在本领域公知。例如，固体表面可携带一种能够与特定结合配偶体(例如多克隆抗体)结合的(第二)抗体。

在本发明的一个有利的实施方案中，该方法的裂解步骤(和使用固体载体的该方法的其它步骤)可包括另一个步骤，涉及向反应混合物中加入另外或额外量的固体载体(在此也被称为“第二种”固体载体)。

发现使用第二种固体载体在样品收集方面具有优点，例如改善了沉淀形成，因而改善了第一种固体载体的分离。改善沉淀形成也可降低沉淀中底物或物质的非特异性结合，或者换句话说，降低了沉淀的污染。虽不希望拘束于理论，但相信当仅使用第一种固体载体时，分离的核酸与第一种固体载体结合成为疏松的、不紧密的网孔，从而产生相对疏松的、不紧密的沉淀。然而，当使用第二种载体时，特别是当第二种固体载体包含小于或大于第一种固体载体的颗粒时，第二种固体载体填充疏松的网孔中的间隙(或者相反)，从而使得沉淀更加紧密，从而降低了捕获污染的材料的倾向。

WO01/94572描述了本发明的方法使用的适当的第二种固体载体的性质和特征的细节，其公开内容在此引用作为参考。

简言之，第二种固体载体可以具有类似于第一种固体载体的大小和密度。然而，优选第二种固体载体的大小小于第一种固体载体。例如，当载体是颗粒时，第二种固体载体包含的颗粒的直径小于第一种固体载体包含的颗粒(例如约为其直径的一半)。在特别优选的实施方案中，第一种固体载体包含直径为4.5μm的颗粒(例如此处所述的M450珠)，而第二种固体载体包含直径为2.8μm的颗粒(例如此处所述的M280和M270珠)。或者，第一种载体也可以小于第二种载体，上述尺寸可以颠倒过来。

特别优选地，第二种固体载体可能在核酸分离中具有更积极的作用，在这种情况下，第二种固相能够结合核酸，即具有核酸结合性质。因此优选地，第二种固体载体可以由能够结合核酸的玻璃、二氧化硅、乳胶、塑料或任何聚合材料制成(即未包被的表面)，例如为了帮助或提高核酸结合，这种固体载体任选地可以被功能化。在这点上特别优选的是带有表面电荷、优选地表面负电荷的功能化固体载体。最优选的是用羧酸功能基团包被的固体载体。这些固体载体可以从商业途径获得，例如Dynal Biotech ASA生产的M-270羧酸珠或M-280羟基珠。优选地，第二种固体载体是颗粒，例如珠，特别优选的是具有磁性的。

在细胞分离步骤后提供另外或额外量的固体载体导致核酸产量提高，也使得从固体载体上洗脱核酸更加容易，特别是在使用带负电的固体载体时。虽不希望被理论束缚，如上所述，认为加入额外量的“第二种”固体载体提高了珠和核酸沉淀的紧密程度，特别是在DNA能够结合第二种固体载体时，使得核酸分子更加有效且完全地结合，这些核酸分子不是只在一端与珠附着或者与珠松散附着。

术语“另外的”或“额外的”量，当在此用于表述第二种固相的添加时，表示加入任何量(重量)的第二种固相，使得核酸的分离改善，例如分离的核酸的产量提高。例如，加入的第二种固相的量可以与使用的第一种固相的量相同，或者可高达所用第一种固相的量的大约3-5倍。或者，加入的第二种固相的量可以低于第一种固相的量，只要核酸的分离改善。优选地，所用的第二种固相的量是第一种固相的量的0.5-3倍。

固相的“量”是指固相的重量，在本发明的优选实施方案中，其中第一种和第二种固相是颗粒，并且组成第二种固相的颗粒小于(或大于)组成第一种固相的颗粒，第一种和第二种固相使用的颗粒的数量通常不同。

现在将参照下列附图，以下列非限制性实施例更详细地描述本发明：

图1a是显示本发明的一个模型系统概况的示意图。通过正选择分离白细胞，与携带抗CD45的珠结合。从捕获的白细胞中分离DNA，结合于DNA结合性珠上，可以从珠上洗脱纯化的DNA，例如用于随后的分析。或者，可以通过对循环癌细胞(SW480细胞；Ber EP4+细胞)的选择，使用携带对于这些细胞而言特异的结合配偶体的珠(Dynabeads Epthelial Enrich)，将分离的白细胞群进一步分级分离。分级分离的群体也可以如前所述进行基因组DNA分离，从而可以比较总的(例如白细胞)和进一步分级分离的(例如SW480)细胞群。对分离的细胞群可以进行mRNA和蛋白质(特异的或总的级分)的分离。

图1b是显示本发明一个模型系统的概况的示意图。通过正选择分离掺入血样中的癌细胞(SW480)，与携带抗Ber EP4的珠(DynabeadsEpithelial enrich)结合。从捕获的癌细胞中分离DNA，例如用于随后的分析，分离方法包括裂解细胞、加入DNA结合的Dynabeads，可以从珠上洗脱纯化的DNA。随后可以将不同的血细胞群(例如B细胞、T细胞、单核细胞)与血样的其余部分分离，如上所述进行DNA分离。可对分离的细胞群进行mRNA和蛋白质分离。

图2是显示如实施例1所述的相继PCR实验结果的凝胶照片，其中使用由分离的mRNA(从培养的掺入血样中的癌细胞中分离)获得的固相cDNA，以检测不同的转录物：1道-ESX(第一轮PCR)；2道-粘蛋白1；3道-CK19(第三轮PCR)；4道-CK19(第一轮(嵌套式)PCR)；4道-ESX(第二轮(嵌套式)PCR)。

图3是显示如实施例1所述的PCR和RT-PCR实验结果的凝胶照片，显示从同一样品中顺序分离编码CK19的基因组DNA(gDNA)和mRNA：1道-100bp DNA阶梯标记(ladder)1μg；2道-cDNA CK19(mRNA分离)a；3道-gDNA CK19(g-DNA分离)a；4道-cDNA CK19(mRNA分离)b；5道-gDNA CK19(gDNA分离)b；6道-阳性对照；7道-阴性对照。

图4显示如实施例1所述培养的癌细胞样品的蛋白质分级分离的结果。图4A显示使用抗CK19进行特异蛋白质分离后Bead-DELFIA的结果。图4B显示比较细胞裂解液与分级分离的细胞裂解液(通过与Dynabeads M270-胺结合进行分级分离)的SDS-PAGE结果。

图5a显示利用CD19-IMS对B细胞和利用CD3-IMS、CD8-IMS和CD4-IMS对T细胞进行IMS分离的结果，其中对来自提取gDNA后分离的每个细胞群体的mRNA如实施例2所述进行CD19的RT-PCR。通过凝胶比较每个样品中存在的CD19(因而B细胞)的量，以研究IMS中的非特异性结合。

图5b显示如实施例2所述利用Dynabeads CD14对单核细胞进行IMS分离的结果。该图显示，对CD14的RT-PCR产生阳性结果，但是对CD19或CD4的RT-PCR只检测到低水平，从而证明了IMS的低水平非特异性结合。

图6显示从全血中IMS分离癌细胞(已掺入全血中)的结果，其中对CK19的RT-PCR产生阳性结果，表明癌细胞分离。对CD4和CD14的RT-PCR未检测到，CD19只在阴性对照(未掺加癌细胞的血样，3道和4道)中微弱检测到，这再次证明了IMS只产生低水平的非特异性结合。

图7是实施例3中DNA分离方案的示意图。

图8显示从IMS分离的细胞中获得的DNA未被降解。

图9a显示使用离子交换珠从细胞裂解液中分离的蛋白质的结果，比较Dynabeads离子交换剂原型与AP-Biotechs 15 Q/S离子交换树脂。

图9b显示使用阳离子交换剂原型珠从不同数量的癌细胞中分离的蛋白质的结果。

图10a显示IMS分离的癌细胞的CK19、CD14、CD4和CD19的PCR结果，其中在全血中掺入2000、200或20个细胞。在只代表来自20、2或0.2个细胞的mRNA的样品中检测到CK19。

图10b显示IMS分离的癌细胞的CK19的PCR结果，其中在全血中掺入1、5或10个细胞。在一个细胞的两个平行样品之一中检测到CK19。

图11显示由低至一个细胞经PCR产生的固相cDNA文库的再使用，检测来自同一样品的第二转录物，证实该方法的灵活性和可缩放性。

实施例1

从单个样品中组合分离核酸和蛋白质

实验步骤：

将含有2×10⁵个培养的癌细胞(SW480)的细胞沉淀在200μl裂解-结合缓冲液(100mM Tris-HCl pH7.5，500mM LiCl，10mM EDTA pH8.0，5mM DTT，1％LiDS)中裂解，该缓冲液中含有可提高沉淀形成的Dynabeads Epithelial Enrich(200μg)和结合DNA的Dynabeads M270羧酸(300μg)。将该混合物在摇床上室温温育5分钟来分离DNA。将珠-DNA复合物与裂解液其余部分分离，用1×洗涤缓冲液(10mMTris-HCl pH7.5，150mM LiCl，1.0mM EDTA)每次500μl洗涤3次，随后用100μl洗脱缓冲液(10mM Tris-HCl pH8.0，0.01％Tween 20)在80℃下洗脱5-10分钟。该DNA可用于例如PCR(1μl足够)。参照图3，该图显示由分离的基因组DNA获得的PCR产物的凝胶分析。

向剩余的裂解液中加入20μl oligo(dT)珠(可使用Dynabeads Oligo(dT)25)，使mRNA在摇床上室温退火5分钟。将珠-mRNA复合物与裂解液其余部分分离，洗涤(如标准Dynal程序，如厂商所述)并重悬浮于100μl冰冷的10mM Tris-HCl中，准备用于RT-PCR。结果示于图2和图3中。

稀释剩余的裂解液(200μl裂解液+800μl 10mM Tris-HCl pH8.0)，加入到1.5mg Dynabeads M270-胺中，后者已经用10mM Tris-HCl pH8.0预洗。将该悬液在摇床上室温温育1小时。珠-蛋白质复合物然后用10mM Tris-HCl pH8.0洗涤3次，每次100μl，并通过在10μl SDS-PAGE样品缓冲液(20mM Tris-HCl pH8.0，1mM EDTA，2.5％SDS，5％β-巯基乙醇，0.01％BPB)中煮沸所有珠2-5分钟进行洗脱，将1μl加样到10-15％SDS-PAGE Phast凝胶上。结果示于图4(特别是图4B)中。

对于特定的蛋白质分离，在珠-DELFIA(即使用抗CK19珠分离特定的CK19蛋白)之前稀释裂解液：用100μl含0.1％BSA的PBS稀释5μl、10μl和20μl裂解液。结果在图4A中显示。

图4B中分离的低分子量标准涉及以下实验：我们用裂解/结合缓冲液溶解低分子量标准(分子量蛋白质，来自Amersham Pharmacia)至浓度为1μg/μl，将20μl此溶液与80μl 10mM Tris-HCl混合，加入1.5mg胺珠，如对于裂解液所述进行温育、洗涤、洗脱和分析。结果表明珠结合了蛋白质。

实施例2

通过IMS(免疫磁性分离)分离细胞群

研究通过IMS分离的不同T细胞群中B细胞的存在/共分离。通过IMS选择CD19、CD3、CD8和CD4阳性的细胞，除去gDNA，然后从分离的细胞群中提取mRNA，合成cDNA。然后使用CD19引物，对每个样品的稀释系列(代表40 000-75个细胞)进行PCR。实验结果可参见图5a，其中CD19 RT-PCR的灵敏度在第一个凝胶图中标出。其余的凝胶证实IMS中低水平的非特异性结合，因为T细胞群的CD19 PCR证明有弱的条带，因此只发生极低水平的非特异性B细胞结合。

进行一个类似的实验，当使用IMS及CD14分离单核细胞时，证实了低水平的非特异性B细胞结合或T_H细胞(T辅助细胞)结合(非特异＜0.2％)(图5b)。

实施例3

癌细胞向血样中的掺入(spiking)以及癌细胞通过IMS的分离

将培养的结肠癌细胞(SW480)重悬浮于培养基中，稀释，用Coulter计数器计数。将不同数量的癌细胞(1×10⁶-1个细胞)掺入稀释的血样中(1ml全血+1ml DPBS)，或者直接用作阳性对照。未掺入癌细胞的血样做同样处理，用作阴性对照。样品在4℃保存。

向每个掺入癌细胞的及未掺入癌细胞的血样中加入到预先洗涤的Dynabeads Epithelial Enrich(4×10⁷个珠)中，将样品在摇床上4℃温育15分钟。

利用磁铁捕获细胞-珠复合物，用冷DPBS/0.1％BSA洗涤一次，转移到一个新试管中。将细胞-珠复合物用1ml冷DPBS洗涤三次。在最后一次洗涤中，通过将500μl重悬浮的珠-细胞复合物转移到一个新试管中分开样品(样品a/b)。

样品a(5×10⁵个细胞)

DNA分离

除去洗涤缓冲液，加入含有DNA结合性Dynabeads的裂解-结合缓冲液裂解形成玫瑰花结的细胞。将细胞裂解液在摇床上室温温育5分钟。

利用磁铁捕获DNA-珠复合物。将含有mRNA和蛋白质的上清液转移到一个新试管中。颠倒试管3-5次，用1×洗涤缓冲液(10mMTris-HCl pH7.5，150mM LiCl，1.0mM EDTA)洗涤DNA-珠复合物三次。第三次洗涤后，将DNA-珠复合物重悬浮于洗脱缓冲液(10mMTris HCl pH8.0，0.01％Tween 20)中，将试管在80℃下温育10分钟。将洗脱的DNA转移到一个新试管中，准备用于例如PCR(1μl即足够)。如从图8所见，DNA没有降解。

随后的mRNA分离

加入预先洗涤的Dynabeads oligo(dT)25并在摇床上室温温育5分钟，对剩余的裂解液进行mRNA分离。

利用磁铁捕获mRNA-珠复合物，用含有LiDS的洗涤缓冲液洗涤2次，用不含LiDS的洗涤缓冲液洗涤2次，用10mM Tris HCl pH7.5洗涤一次(标准Dynal程序)，然后用于cDNA合成或RT-PCR。cDNA合成按如下进行：

使用珠上的oligo(dT)序列作为lst链cDNA合成的引物合成固相cDNA。除了温育步骤外，按照厂商推荐方案用Thermoscript合成cDNA。在恒速混合下，将样品在50℃下温育30分钟，随后在65℃下温育30分钟。固相cDNA作为PCR的模板。

然后使用CK19引物进行PCR，扩增血液中不含的转录物。从CK19 PCR的结果可见癌细胞的分离。然后进行CD14、CD4和CD19PCR，显示IMS法在该实验中分离癌细胞而不分离血细胞的特异性(图6a)。

实施例4

应用阴离子和阳离子交换珠的蛋白质分离

每个样品使用50μl(1.5mg)离子交换珠进行癌细胞的蛋白质分级分离。阳离子交换珠在100μl 1M NaCl，20mM柠檬酸，pH3.5中预处理15分钟。然后用100μl洗涤缓冲液(50mM NaCl，20mM柠檬酸，0.5％Tween 20，pH3.5)洗珠2次。阴离子交换珠在100μl 1M NaCl，20mM Tris-HCl pH10.0中预处理15分钟。然后用100μl洗涤缓冲液(50mM NaCl，20mM Tris-HCl，0.5％Tween 20，pH3.5)洗珠2次。

细胞裂解和离子交换

阴离子/阳离子交换(图9a)：

细胞沉淀在500μl裂解缓冲液(20mM Tris，1％Triton-x-100，150mM NaCl，5mM EDTA，pH8)中裂解，在摇床上4℃温育10分钟。将裂解液转移到含有预处理的离子交换珠的试管中，在摇床上4℃温育15分钟。珠-蛋白质复合物用20mM Tris-HCl，50mM NaCl，pH8.0洗涤3次。加入1M NaCl，20mM柠檬酸，pH3.5并在摇床上温育15分钟，从阴离子交换珠上洗脱下蛋白质。加入1M NaCl，20mM TrisHCl pH10.0从阳离子交换珠上洗脱下蛋白质，在摇床上温育15分钟。通过SDS-PAGE分析。

样品b(来自实施例3，即5×10⁵个细胞)：

从细胞中除去洗涤缓冲液。形成玫瑰花结的细胞在300μl裂解缓冲液(20mM柠檬酸，50mM NaCl，20mM Tris，1％Triton-x-100，5mM EDTA，pH3.5)中裂解。在摇床上4℃温育15分钟。将裂解液转移到一个含有预处理的阳离子交换珠的新试管中。在摇床上4℃温育15分钟。用300μl洗涤缓冲液(20mM柠檬酸，50mM NaCl，0.5％Tween 20，pH3.5)洗珠3次。

将珠重悬浮于100μl洗脱缓冲液(20mM Tris HCl，1M NaCl，pH10.0)中，在摇床上温育15分钟。将冼脱的蛋白质转移到一个新试管中，通过SDS-PAGE进行分析。

离子交换型Dynabeads产生与Amersham Pharmacia Biotech的离子交换剂相似的蛋白质分离结果(图9a)。也用阳离子交换珠从掺入的癌细胞中分级分离蛋白质，并且直接与细胞裂解液对比。图9b显示其结果，其中阴性对照显示未掺入癌细胞的血液的非特异性背景。

实施例5

缩小该技术的规模以分离少量的细胞

将2000、200和20个癌细胞掺入1ml全血中。如实施例3所述进行细胞分离，获得mRNA(使用500μg oligo(dT)珠)。使用与以前的实验相同数量的珠，在oligo(dT)珠上合成cDNA。对于这些样品，使用CK19、CD14、CD4和CD19引物进行PCR。对代表来自20、2和0.2个细胞的mRNA的样品进行分析(图10a)。结果发现所有样品都产生CK19阳性结果，表明存在癌细胞。CD14和CD4的结果是阴性的，检测到低水平的CD19，表明IMS的极低水平非特异性结合。因此，利用该方法能够容易地分离并检测20个细胞。

然后用掺入1、5、10个癌细胞的全血重复该实验，其中用显微操作器挑取单细胞。如上所述分离细胞，用较少的oligo(dT)珠(100μg)分离mRNA，如前所述产生固相cDNA文库。然后使用每次分离的整个文库，用CK19引物一次反应进行PCR。

图10b显示这些实验的结果，其中前7道显示分子量标记物，然后是未掺入的细胞的结果(阳性对照)。其余的道显示分离的掺入细胞的结果。可以看到，在两个平行反应之一中，能够从掺入的血样中回收单细胞，并利用CK19PCR检测到。

这表明，此处所述的方法是可以高度缩放的。图11显示来自图10b的cDNA文库在第二次PCR中的再使用，用来检测另一种转录物。该技术也是灵活的，允许对单个小样品进行多重mRNA分析。

Claims

1.一种从同一样品中分离核酸和蛋白质的方法，该方法包括使该样品接触固体载体，其中该样品中所含的核酸和蛋白质成分与不同的固体载体结合。

2.权利要求1的方法，其中DNA和RNA都与同一固体载体结合。

3.权利要求1的方法，其中DNA和RNA与不同的固体载体结合。

4.权利要求3的方法，其中DNA和RNA在不同的步骤中与不同的固体载体结合。

5.权利要求1-4中任一项的方法，其中RNA和蛋白质、或DNA和蛋白质、或DNA、RNA和蛋白质从同一样品中被分离。

6.权利要求5的方法，其中所述RNA是mRNA。

7.权利要求1-6中任一项的方法，其中所述样品是食品或同类产品，或是临床、环境或生物样品。

8.权利要求1-7中任一项的方法，其中在所述样品接触固体载体之前，对样品实施预处理步骤，以从含有核酸和/或蛋白质成分的结构或实体中释放这些成分。

9.权利要求1-8中任一项的方法，其中在所述样品接触固体载体之前，对样品实施细胞分离程序。

10.权利要求1-9中任一项的方法，其中特异分离一种或多种特定的细胞群。

11.权利要求1-10中任一项的方法，其中在样品与固体载体接触之前，对样品或从中分离的细胞群实施细胞裂解步骤。

12.权利要求11的方法，其中在细胞裂解步骤之前，对样品内所含的或从样品中分离的细胞的细胞表面蛋白实施体外修饰程序。

13.权利要求1-12中任一项的方法，其中在该方法的任何阶段样品均不分开。

14.权利要求8-12中任一项的方法，其中在细胞分离和/或裂解之后，或在预处理步骤之后，将样品分开。

15.权利要求1-14中任一项的方法，其中所述样品与多个固体载体相继或同时或平行地接触。

16.权利要求15的方法，其中第一步从所述样品中分离DNA，第二步从该样品中分离RNA，第三步从该样品中分离蛋白质，其中这些步骤可以以任何顺序进行。

17.权利要求1-16中任一项的方法，其中在携带表面羧基的载体上分离DNA。

18.权利要求1-17中任一项的方法，其中在一种去污剂的存在下，通过与一种固体载体结合分离DNA。

19.权利要求9-18中任一项的方法，其中细胞裂解和核酸或DNA与固体载体的结合同时或伴随发生。

20.权利要求1-19中任一项的方法，其中利用一种RNA特异的捕获探针分离RNA，该探针由所述固体载体携带或与之附着或者能够与之结合。

21.权利要求20的方法，其中所述捕获探针是或者含有dT寡核苷酸或dU寡核苷酸。

22.权利要求1-21中任一项的方法，其中利用所述固体载体携带的或附着的或者能够与之结合的一种适当结合配偶体/配体分离蛋白质。

23.权利要求1-21中任一项的方法，其中利用一种固体载体分离蛋白质，该载体具有能够进行层析相互作用的表面。

24.权利要求1-23中任一项的方法，其中所述固体载体含有颗粒。

25.权利要求24的方法，其中所述颗粒是磁性颗粒。

26.一种用于从同一样品中分离核酸和蛋白质的试剂盒，其包含：

(a)一种适于结合核酸成分的固体载体；

(b)一种适于结合蛋白质的固体载体，

其中a)和b)的所述载体是不同的固体载体。

27.权利要求26的试剂盒，其中(a)的固体载体包含一种选择性结合DNA或RNA或这两种类型的核酸的载体。

28.权利要求26或27的试剂盒，其中该试剂盒还包含：(c)一种适于分离特定细胞群的固体载体，和/或(d)裂解该细胞的工具，和/或(e)一种检测核酸和/或蛋白质的工具。

29.权利要求1-28中任一项的方法在mRNA和/或蛋白质表达和/或其与基因组信息的相关性的分析和/或对比中的应用。