KR20010032806A - 핵산 분리방법 - Google Patents

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KR20010032806A
KR20010032806A KR1020007006123A KR20007006123A KR20010032806A KR 20010032806 A KR20010032806 A KR 20010032806A KR 1020007006123 A KR1020007006123 A KR 1020007006123A KR 20007006123 A KR20007006123 A KR 20007006123A KR 20010032806 A KR20010032806 A KR 20010032806A
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매튜 존 베이커
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Abstract

본발명의 혈액으로 부터 핵산을 추출하는 방법은 혈액 세포를 접촉하는 단계, 바람직하게는 제1 pH에서 활성돠된 고체 상으로 용해하여 핵산을 고정화시키고, 이후 전하가 반대로 바뀌거나 또는 중성화되었을 때 결합된 핵산을 이보다 더 높은 pH에서 제거하는 방법이다. 이 고체상은 결합제로서 히스티딘에 의해 활성화된 유리 비드일 수있으며, 비드를 함유하는 칼럼을 통하여 혈액을 공기로 흡입시키므로써 비드를 유체화할 수있다.

Description

핵산 분리방법{ISOLATION OF NUCLEIC ACIDS}
DNA를 추출하는 기존의 방법은 페놀/클로로포름을 사용하는 방법, 염석하는 방법, 카오트로픽 염 및 실리카 수지를 사용하는 방법, 친화성 수지를 사용하는 방법, 이온 교환 수지 크로마토그래피법 및 자기성 비드를 사용하는 방법을 포함한다. 이 방법은 미국 특허 제5057426호, 제4923978호, EP 특허 제0512767 A1호, 및 EP 제0515484B호, WO 제95/13368호, WO 제97/10331호, 및 WO 제96/18731호등에 기술되어 있다. 이들 특허 및 특허출원들은 고체 지지체상에서 핵산을 흡착한 후 이를 분리(isolation)하는 방법에 관하여 기재하고 있다. 이전에 사용되는 방법들은 핵산을 분리하기 위해서 일정 종류의 용매를 사용하는 데, 그러한 용매들은 가연성, 연소성 또는 독성을 가진 용매들이었다.
혈액 시료는 여러가지 이유에서 볼때 통상적으로 채취할 수있다는 점에서 DNA 분석용으로 사용되는 가장 풍부한 자원의 공급원이다. 그러나, 공지된 DNA 추출방법을 사용하는 경우 혈액 자체의 점성 및 혈액의 단백질 특성으로 인해 자동화 공정을 수행하기가 어려운데, 그것은 비교적 소량의 DNA를 함유하는 큰 용적의 물질을 취급해야만 하기 때문이다. 지금까지 핵산 추출은 위험한 시약과 느린 공정 시간을 사용하여서만이 부분적으로서만 자동화되어 왔을 뿐이다.
본발명은 생물학적 시료, 특히 혈액으로 부터 핵산 및 기타 다른 생물학적 분자를 추출하는 방법에 관한 것이다.
현재 여러가지 목적상 DNA 분석을 원하는 많은 수요가 분출되면서 DNA 및 기타 핵산을 분리 및 정제하는 데 있어서 빠르고, 안전하며, 원료 처리능력이 높은 분리방법에 대한 요구가 있어왔다.
DNA 동정 또는 이의 분석에 사용되는 시료들은 동물 세포 및 식물세포, 대변, 조직등의 생물학적 시료 또는 토양, 식품, 물등의 재료같은 광범위한 공급원으로 부터 얻을 수있다.
혈액 및 기타 다른 생물학적 시료로부터 핵산 및 기타 다른 생물학적 분자를 추출하는 개선된 방법이 본발명에 의해 개발되었다.
본발명에 따르면, 생물학적 시료를 제1 pH 하에서 고체상과 접촉시켜 생물학적 분자가 고체상에 결합하도록 하는 단계, 제2 pH하에서 용출 용매를 사용하는 용출에 의해 고체상에 결합된 생물학적 분자를 추출하는 단계를 포함하는 방법에 의해 생물학적 시료로부터 생물학적 분자를 추출하는 방법이 제공된다.
생물학적 시료가 혈액인 경우에 본발명의 방법이 특히 유용하게 사용될 수있지만, 본 방법은 플라스미드 및 벡터의 분리, 그리고 식물 DNA 추출과 같은 용도에도 사용가능하다.
혈액중의 세포들을 용해하여 핵산을 방출하는 것이 바람직하며, 이를 위해 공지된 용해제 및 통상의 방법, 예컨대 pH 변화 또는 열과 함께 이온성 세정제 또는 비이온성 세정제, 염, 프로테아제, 카로트로픽제, 용매등의 원형질 분리제와 접촉시키는 방법을 사용할 수있다. 핵산을 분리하기 위해 세포를 용해하는 방법은 WO 제96/00228호에 기재되어 있다.
생물학적 시료가 혈액인 경우, 시료를 임의적으로 물 또는 다른 희석제로 희석하므로써 이것을 좀 더 쉽게 조작하게 하거나 공정을 용이하게 처리하도록 할 수있다.
10배 이하의 희석율이 사용될 수있으나, 일반적으로 이보다 더 높은 희석율이 바람직하며, 본발명은 가능한 혈액의 낮은 희석을 가능하게 하는 것을 특징으로 한다.
혈액이 접촉되는 고체상의 경우, 이 상은 핵산에 대해 자연적으로 친화도를 가진 재료로 형성되거나 또는 핵산이 고체상에 결합하도록 하거나 또는 핵산에 대한 친화도를 증가시키는 반응제로 표면을 처리한 물질로 형성될 수있다. 이러한 적합한 재료로는 조절된 공극 유리, 폴리사카라이드(아가로즈 또는 셀룰로오스), 기타 다른 타입의 실리카/유리, 세라믹 재료, 다공성 플라스틱 재료, 예컨대, 단일 성형 부품이거나 또는 표준 튜브내에서의 삽입물인 다공성 플라스틱 플러그, 폴리스티렌 자성 비드등이 있다. 여기서 크기 및 다공도는 중요한 것이 아니며 특정 용도에 따라 선택할 수있다.
고체상 표면을 처리하거나 또는 이것을 유도화(derivatise) 시키는 데 사용가능한 적합한 수단으로는 고체상위의 상기 표면 또는 고체 상위의 소수성 또는 친수성 표면상에 전하, 예컨대 양전하를 도입할 수있는 성분, 예를 들면 히드록실기, 니트레이트 기, 자동반응성 기, 염료 및 다른 자동성 화합물로 표면을 처리하는 것을 포함한다.
본발명의 바람직한 구체화에 있어서, 고체상은 DNA를 제1 pH에서 혈액시료중의 오염물보다는 고체상에 우선적으로 결합한 후 제1 pH와는 다른 제2 pH에서 용출제와 접촉시 핵산을 방출시킨다. 이러한 시스템은 고체상과 함께 사용될 수있다. 이 고체상은 히스티딘 또는 폴리히스티딘이 혼입되어 있으므로써 낮은 pH, 6미만의 pH에서는 핵산을 결합시키고, pH가 증가되면, 즉 8보다 커지면 결합된 핵산을 배출한다. 대안적으로 핵산은 실질적으로 중성의 pH에서 아민화된 표면에 결합한 후 매우 높은 pH에서 방출한다.
본발명의 다른 구체화에 있어서, 플라스틱 성형은 결합제, 예를 들면 플레이트 중의 웰에 결합제를 혼입하므로써 결합제가 고체상 표면에 혼입되도록 하고, 이후 혈액 시료는 그 표면과 접촉한 후 핵산을 표면에 결합시킨다. 혈액 시료를 제거하고 용출제로 표면을 처리하면 결합된 핵산이 분리된다. 상기 표면이 멀티-웰 플레이트에서 웰의 일부를 구성하는 경우에, 전체 시스템은 급속하면서도 대규모의 스케일 샘플링 및 추출 기법에 쉽게 적용가능하다.
사용가능한 결합제는 pH를 이의 pKa보다 높게 변화시켜 중성 전하로 하거나 또는 반대로 전하를 전환시킬 수있는 양전하 하전의 고체상을 사용하는 전하 전환가능한 이온 교환 수지로서, 예를 들면 뉴클레오티드, 폴리아민, 이미다졸 기 및 적합한 pKa 값을 갖는 다른 비슷한 시약을 말한다.
또한, 핵산은 고체상, 예컨대, 악티노마이신 D, 에티디움 브로마이드 등과 같은 고체상내로 혼합된 다양한 삽입 화합물을 사용하는 삽입법에 의해 결합될 수있다.
본발명의 바람직한 구체화에 있어서, 플라스틱 표면은 작용기를 함유하도록 개질될 수있다. 이 플라스틱은 폴리프로필렌등과 같이, 시료를 함유하는 목적의 플라스틱이라면 어떤 것이라도 가능하다. 작용기는 양전하 또는 음전하가 하전되어 핵산이 정확한 버퍼 용액중에서 결합되도록 한다.
선택적으로, 작용기는 다른 리간드 또는 중합체에 공유 결합할 수있는 화학적 기일 수있다.
플라스틱을 플라스틱 성형에 사용시, 예를 들면, 플레이트 중의 웰에서 또는 중합 사슬 반응(PCR) 튜브로서 사용할 때, 이것의 표면 특성은 성형 화합물, 예를 들면 주입 성형 화합물중에 적합한 화학 약품을 포함 또는 첨가하므로써 본발명에 사용가능하도록 적절히 개질될 수있다.
플라스틱이 PCR 튜브에 사용되거나 또는 깊은 웰 플레이트에서 사용되는 경우 이 튜브나 또는 웰을 사용하면 이후의 PCR 또는 다른 유전 분석 및 조작공정에서 사용가능한 순수한 템플레이트를 생성하는 DNA 또는 RNA의 소량을 분리하여 고정화시킬 수있다.
플라스틱이 프로필렌인 경우, 예컨대, 이것이 얇은 벽의 PCR 튜브로 구성된 형태인 경우, 폴리프로필렌 표면은 과망간산 칼륨 및 황산과 같은 산화제로 표면을 산화시키므로써 카르복실화된 표면(COOH기)을 생성하도록 표면을 개질할 수있다. 이러한 튜브는 이후 용액 또는 정제하지 않은 재료, 예를 들면 혈액으로 부터 DNA 를 분리하는 것을 개선시키는 데 사용될 수있다. pH, 유전상수, 또는 이온 강도를 조정하므로써 DNA 또는 RNA는 튜브벽상에 고정화된 후 오염물이 없도록 세척되기 때문에, PCR 또는 다른 분석 기술에 사용하기 알맞다.
이미다졸 또는 폴리히스티딘같은 음이온성 기를 공유결합시키거나 또는 임의의 강력한 이온 교환 수지 또는 약한 이온 교환 수지를 사용하여 전하 상호반응에 의해 핵산을 결합하므로써 상기 카르복실기를 더 개질시킬 수있다. 이후 이 튜브는 용액 또는 정제하지 않은 시료, 예컨대, 혈액으로부터 DNA를 분리하는 것을 개선하는 데 사용할 수있다. 다시 pH, 유전상수, 또는 이온 강도를 조정하므로써 DNA 또는 RNA는 튜브벽상에 고정한 후, 오염물을 세척해내면 PCR 또는 다른 분석 기술에 알맞도록 사용가능하다.
핵산은 저염 버퍼로 용출되므로써 PCR 또는 기타 다른 분석에 사용가능하다. 고체상을 혼합/교반 장치중에서 혼합시키거나, 혈액시료를 고체상에 통과시켜 고체상을 혈액시료로 접촉시키거나, 또는 자기장에 의해 고체상을 자성으로 조작처리할 수 있다. 본발명이 혈액으로부터 핵산을 분리(separation or isolation)하는 데 특히 적합하지만, 세포벽 파편 또는 불용성 입자를 제거하는 데 특히 필요한 광범위한 생물학적 분자도 사용가능하다.
본발명의 바람직한 구체화에 있어서, 고체상은 칼럼내에서 입자형으로 존재하며, 혈액 시료는 칼럼에 적용된 압력차 수단에 의해 컬럼으로부터 끌어 올려진다. 또 이 혈액시료는 공기에 의해서도 끌어올려지고, 입자형 고체상 물질은 유체화되므로써 혼합 속도 및 접촉 속도를 증가시키는 한편 막히는 현상을 최소화 한다.
본발명의 방법은 다양한 시료로부터 일련의 연속적인 추출이 거의 실질적으로 동시에 이루어지는 멀티-웰 형태에 적합하게 사용되는 것으로서, 이것은 추출공정의 자동화를 손쉽게 진행하므로써 급속하고 높은 고수율의 추출이 일어나게 하여 조합된 화학반응이 수행되도록 한다. 또한 이것은 표준 웰 어레이중에서 높은 원료 처리능을 나타내며, 예를 들면 8 ×12 어레이를 나타내어 많은 수의 시료 타입이 동시에 자동적으로 처리될 수있다.
본발명은 실시예를 통해 기술한다.
전혈로부터 핵산의 추출
전하 전환가능한 이온 교환기를 제조하는 데, 그 방식은 pH8하에 20mg의 폴리히스티딘을 함유하는 중탄산 나트륨 0.1 M중에 글루타르알데하이드 0.01%(v/v)와 1g의 아민화 유리 비드를 혼합하므로써 100cm의 유리 비드에 폴리히스티딘을 공유적으로 결합시켜 제조하는 것이다. 밤새 항온 배양한 후, 비드를 철저히 세척하여 비 공유결합 물질을 제거한 후 0.1%(v/v) Tween 20을 함유하는 pH 5의 10mM의 MES를 보관하였다.
100cm의 유도화된 유리 비드 약 300mg을 양단부가 막힌 가진 1ml의 플라스틱 칼럼에 첨가하였다.
1%의 Tween 20을 함유하는 10mM의 MES pH5, 프로테아제(200g/ml), 및 1mM의 EDTA을 혈액과 동량으로 혈액시료와 함께 항온 배양하였다. 분해한 후, 혈액을 유리비드를 함유하고 있는 칼럼내로 흡입시켰다. 그러면 DNA가 고정화되고, 오염성 단백질은 빠져나간다.
고정화 DNA를 함유하는 유리 비드를 1%의 Tween 20을 함유하는 10mM MES pH5, 및 1mM 의 EDTA를 함유하는 버퍼로 세척하였다. 세척 용액이 무색이 될 때까지 이 작업을 반복하였다.
세척후, 비드를 공기로 건조하고, 소량의 10mM의 트리스 HCL(pH8.5도)로 DNA를 용출하고, 분석을 위해 멸균 튜브내에서 수거하였다. 이후, DNA를 혈액으로 부터 분리하였다.
기타 다른 생물학적 분자인 버퍼의 경우, 적당히 개질될 수있다.
실시예 2
카르복실화된 자성 비드 1g을 50mM의 이미다졸 버퍼(pH6)로 세척한 후, 50ml 중의 50mM의 이미다졸 버퍼(pH6)중에서 폴리히스티딘 100mg과 혼합하였다. 화학 커플링제를 1ml당 5mg의 최종 농도하에서 EDC에 가하고, 밤새도록 혼합하였다. 비드를 물중에서 세척하고, 0.5M 염화 나트륨, 1% Tween 20, 100mM의 트리스 HCl(pH 8)에서 세척하고 10mM의 MES, 0.1% Tween 20 pH 5중에서 보관하였다.
혈액으로 부터 DNA를 추출하기 위해서, 10%의 Tween 20를 함유하는 25mM의 MES, 1mN의 EDTA(pH 5)중에 희석되어 있는 1mg의 비드를 혈액과 혼합하였다. 비드를 자석과 분리한 후, 1mM의 MES, 0.1%의 Tween 20중에 재현탁하여 세척하였다. DNA를 용출하기 위해서, 비드를 10mM Tris HCl pH 8.5중에 현탁하고, 용액중의 DNA를 유리하여 자석과 분리하였다.

Claims (35)

  1. 고체상과 생물학적 시료를 접촉하여 제1pH에서 생물학적 분자를 고체상에 결합시키는 단계, 및 제2 pH에서 용출 용매를 사용하여 고체상에 결합된 생물학적 분자를 용출에 의해 추출하는 단계를 포함하는 생물학적 시료로부터 생물학적 분자를 추출하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 생물학적 분자는 핵산을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 생물학적 시료는 혈액인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제1항 내지 제3항중 어느 하나의 항에 있어서, 생물학적 분자는 6미만의 pH에서 고체상과 접촉하여 DNA를 고체상과 결합시키고, 8보다 높은 pH에서 DNA를 고체상으로 부터 배출하는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제1항 내지 제3항중 어느 하나의 항에 있어서, 생물학적 분자는 실질적으로 중성의 pH하에서 고체상과 접촉시켜 DNA를 고체상과 결합하고, 이 DNA는 10 미만의 pH에서 고체상으로 부터 배출하는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제3항 내지 제5항중 어느 하나의 항에 있어서, 혈액중의 세포는 용해(lyse)되어 핵산을 배출하는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제6항에 있어서, 세포는 이온성 세정제 또는 비이온성 세정제, 염, 프로테아제, 카오트로픽 반응제들의 저장액, 또는 pH 변화 또는 열과의 접촉에 의해 용해되는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제3항 내지 제7항중 어느 하나의 항에 있어서, 혈액은 물 또는 다른 희석제로 희석되어 조작 및 붓기가 더 용이하게 되는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제8항에 있어서, 10배이하의 희석률이 사용되는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제1항 내지 제9항중 어느 하나의 항에 있어서, 생물학적 재료와 접촉되는 고체상은 핵산에 대해 자연적인 친화도를 갖는 재료로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제1항내지 제10항중 어느 하나의 항에 있어서, 생물학적 재료와 접촉되는 고체상은 핵산을 고체상에 결합시키거나 또는 핵산에 대한 친화도를 증가시키는 반응제로 그 표면이 처리된 물질로 형성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제11항에 있어서, 고체 물질의 표면은 고체상위의 양성 전하 또는 소수성 표면 또는 친수성 표면을 도입하는 성분으로 처리되는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제11항에 있어서, 사용된 결합제는 pH를 pKa 보다 높거나 낮게 변화시켜 반대 전하 또는 중성 전하로의 전환을 가능케 하는 양성 전하가 하전된 고체상을 사용하는 전하 전환가능한 이온 교환수지인 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제13항에 있어서, 결합제는 뉴클레오티드, 폴리아민, 이미다졸 부분을 함유하는 화합물인 것을 특징으로 하는 하는 방법.
  15. 제11항에 있어서, 핵산은 고체상내로 혼합된 삽입 화합물을 사용하여 삽입반응에 의해 결합되는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제15항에 있어서, 염료는 악티노마이신 D 또는 에티디늄 브로마이드인 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제11항에 있어서, 고체 물질의 표면은 히스티딘 또는 폴리히스티딘인 것임을 특징으로 하는 방법.
  18. 제1항내지 제17항중 어느 하나의 항에 있어서, 고체상은 조절된 공극 유리, 다당류, 세라믹 재료 또는 다공성 플라스틱 재료인 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제1항 내지 제18항중 어느 하나의 항에 있어서, 고체상은 자성 재료의 폴리에스테르 비드를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제1항 내지 제19항중 어느 하나의 항에 있어서, 고체상은 작용성 기를 포함하기 위해 개질된 플라스틱 표면을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제20항에 있어서, 플라스틱은 폴리프로필렌인 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제21항에 있어서, 폴리프로필렌 표면은 산화제의 산화에 의해 개질되어 카르복실화 표면을 생성하는 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제22항에 있어서, 카르복실기는 이미다졸 또는 폴리히스티딘 또는 임의의 강력한 이온 교환제 또는 약한 이온 교환제같은 음이온성 기를 공유결합시켜 핵산이 전하의 상호작용에 의해 결합되므로써 더 개질되는 것임을 특징으로 하는 방법.
  24. 제11항 내지 제23항중 어느 하나의 항에 있어서, 작용성 기는 양성 전하 또는 음성으로 하전되어 핵산을 결합시키는 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 제11항 내지 제23항중 어느 하나의 항에 있어서, 작용성 기는 다른 리간드 또는 중합체에 공유결합할 수있는 화학기인 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 제20항 내지 제25항 중 어느 하나의 항에 있어서, 고체상은 단일 성형의 부품이거나 또는 용기내에 있는 삽입물인 다공성 플라스틱 플러그인 것을 특징으로 하는 방법.
  27. 제20항 내지 제25항중 어느 하나의 항에 있어서, 플라스틱은 플라스틱 성형물내에 존재하는 것임을 특징으로 하는 방법.
  28. 제27항에 있어서, 고체 물질은 중합 사슬 반응(PCR) 튜브인 것을 특징으로 하는 방법.
  29. 제27항에 있어서, 고체 물질은 딥 웰 플레이트인 것을 특징으로 하는 방법.
  30. 제26항 내지 제29항중 어느 하나의 항에 있어서, 튜브 또는 웰을 사용하여 이후의 PCR 또는 기타 다른 유전 분석 및 조작과정에 사용가능하도록 순수한 템플레이트를 생성하는 DNA 또는 RNA 소량을 분리하여 고정화하는 것을 특징으로 하는 방법.
  31. 제1항 내지 제30항 중 어느 하나의 항에 있어서, 고체상은 혼합/교반 장치내에서 고체 물질과 혼합, 그 혈액 시료를 고체상에 통과시켜 혈액 시료와 접촉하거나 고체상이 자기성 지지체상에서 조작되는 과립성의 고체 재료인 것을 특징으로 하는 방법.
  32. 제1항 내지 제31항중 어느 하나의 항에 있어서, 용기는 멀티-웰 플레이트내에 존재하는 웰이며, 다른 시료로부터 DNA를 연속적으로 추출하는 과정은 실질적으로 동시에 일어나는 것을 특징으로 하는 방법.
  33. 제1항 내지 제32항중 어느 하나의 항에 있어서, 고체상은 컬럼중에서 과립형으로 존재하며, 혈액시료는 그 컬럼내에 가해지는 압력차에 의해 칼럼을 통하여 끌어 올려지는 것을 특징으로 하는 방법.
  34. 제33항에 있어서, 혈액시료는 공기에 의해 끌어 올려지며, 과립성 고체 물질은 유체화되는 것을 특징으로 하는 방법.
  35. 제1항 내지 제34항중 어느 하나의 항에 있어서, 생물학적 분자는 저염 버퍼 용액 또는 물에 의한 용출에 의해 제거되는 것을 특징으로 하는 방법.
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