KR100647315B1 - 실란화된 고상 물질을 이용한 핵산의 분리 및 증폭 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은, 핵산을 포함하는 시료로부터 핵산을 분리 및 증폭하는 방법에 관한 것이다.

본 발명은, 실란화된 고상 물질에 시료를 접촉시켜서 핵산을 캡쳐하는 단계; 및 핵산이 캡쳐된 상기 고상 물질을 pH 9 내지 pH 14의 염기성 용액으로 처리하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산의 분리 방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 실란화된 고상 물질에 시료를 접촉시켜서 핵산을 캡쳐하는 단계; 핵산이 캡쳐된 상기 고상 물질을 pH 9 내지 pH 14의 염기성 용액으로 처리하는 단계; 및, 상기 처리 결과물에 핵산증폭용액을 가하여 핵산 증폭반응을 수행하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산의 증폭방법을 제공한다.

실란화, 핵산, 분리, 정제

Description

실란화된 고상 물질을 이용한 핵산의 분리 및 증폭 방법{Method for amplifying nucleic acids using a silanized solid support}

도 1은, 본 발명의 방법의 일실시예에 따라 핵산이 분리되는 과정을 대략적으로 나타낸 도면이고,

도 2는, 본 발명의 방법의 일실시예에 따라, 아미노실란화된 실리카 비드와 음이온 교환체인 베타인의 반응 과정을 나타낸 도면이고,

도 3은, 본 발명의 방법의 일실시예에 따라 제조된 실란화 비드와 DNA의 결합 후 남은 잔류 DNA양을 형광법을 이용하여 정량한 결과를 나타낸 그래프이고,

도 4는, 실란화 비드의 알칼리 처리 전과 후를 비교한 SEM 사진이고, 도 5는, 본 발명의 방법에 따라 분리된 DNA에 대하여 PCR을 수행한 결과를 대조구와 비교하여 나타낸 그래프이고,

도 6은, 실란 농도의 변화에 따른 PCR 수율의 차이를 나타낸 그래프이고,

도 7은, 베타인 농도의 변화에 따른 PCR 수율의 차이를 나타낸 그래프이고,

도 8은, EcoRI로 λDNA를 처리했을 때의 아가로스 겔 상의 전기영동 사진이다.

도 9는, 본 발명의 방법에 따라 얻어진, DNA가 결합된 비드를 각각 pH가 상이한 알칼리 용액으로 처리한 후의 아가로스 겔 사진이다.

본 발명은, 실란이 코팅된 고상 물질을 이용한 핵산의 분리 및 증폭 방법에 관한 것이다.

세포 용해 후, 원하는 타겟의 증폭을 수행하기 위해서는 용해된 세포 샘플 내에 포함된 단백질 등의 기타 물질들로부터 핵산만을 분리하는 과정이 필요하다.

알려진 대표적인 DNA 정제 방법으로는 다음과 같은 방법들이 있다.

예를 들면, 가장 널리 쓰이는 방법이, 실리카 고체 표면에 핵산을 결합시켰다가 세척 후 결합된 핵산을 버퍼 용액으로 녹여 내는 방법(Boom 외, 미국 특허 제5,234,809호, 1993, Boom 외, J. Clin. Micrbiol. 28(3), 495-503, 1990)이었다. 이 방법은, 핵산이 포함된 용액을 고농도의 카오트로픽 염(chaotropic salt), 예를 들면, GuHCl, NaI, BuSCN 등과 함게 실리카 표면에 접촉시키면 핵산과 실리카 표면이 결합을 하고 카오트로픽 염이 없거나 농도가 낮은 저염농도 조건에서 결합이 분리되는 원리를 이용한 것이다. 전기적으로 음성을 띄는 두 가지 물질(실리카 및 핵산)에서 일어나는 이러한 현상에 대한 정확한 원리는 규명되지 않았지만 가장 널리 받아들여지고 있는 원리는 탈수 현상에 의한 반응으로 인한 실리카와 핵산의 결합으로 설명한다(Melzak, K. A.; Sherwood, C. S.; Turner, R. F. B.; Haynes, C. A. Journal of Colloid and Interface Science 1996, 181, 635-644.).이 설명에 따르면, 실리카와 핵산 모두 전기적 음성을 가지고 있으며 친수성의 성질을 갖고 있 다. 이로 인해 일반적인 용액 내에서 실리카와 핵산은 물분자에 둘려싸여 있게 되지만, 카오트로픽 염이 매우 높은 농도로 존재하게 되면, 카오트로픽 염이 실리카나 핵산보다 더 강한 친수성 성질을 나타내게 되어 실리카 표면과 핵산 주변에 있던 물분자를 줄이는 효과를 나타내게 되어 결과적으로 실리카와 핵산이 결합하게 된다. 이러한 반응은 염의 농도를 변화시킴으로써, 즉, 다시 카오트로픽 염의 농도를 낮게 하거나 아예 카오트로픽 염이 없는 용액을 접촉시킴으로써 핵산이 용출되는 가역적인 반응을 나타내게 하여 핵산의 정제 및 분리 과정에 유용하게 쓸 수 있다. 그러나, 이러한 방법은 독성이 강한 카오트로픽 염을 써야 하며, 이 염이 PCR(polymerase chain reaction) 같은 후속 공정에 방해물질(inhibitor)로 작용하므로 제거를 해야 하는 단계가 필요하게 되며, 상기 방법은 DNA 농도가 높은 경우에만 적용이 가능하다는 한계가 있다.

또 다른 DNA 정제 방법으로는, 폴리에틸렌글리콜(이하, PEG 라 함)과 핵산의 가역적인 결합을 이용한 핵산의 분리 및 정제 방법(Hawkins, 외, Nucleic Acids Res. 1995(23):4742-4743}이 있다. 이 방법은, 카르복실기로 코팅된 고체 표면, 예를 들면 자성 비드를 고염농도의 PEG와 접촉시켜서 PEG로 코팅되게 한 후, 여기에 핵산을 결합시켜서, 상기 핵산이 결합된 비드를 분리하고, 저염농도 조건으로 만들어 다시 핵산을 용출시키는, 고상 가역 고정화(Solid Phase Reversible Immobilization, SPRI)의 방법을 이용한다. 이 방법 역시 염농도를 조절함으로써, 즉, 고염농도 조건에서 핵산의 결합이 일어나도록 하고 저염농도에서 다시 핵산을 분리하는 방법을 이용한다.

또 다른 방법으로는, 전기적으로 양성을 띠는 부분을 포함하는 물질, 즉 알루미나를 이용하여 고상 물질에 핵산을 결합시키는 방법(Xtrana의 미국 특허 제6,291,166호)이 알려져 있다. 이 방법은, 마이크로튜브 내벽에 알루미나를 코팅하여 핵산을 캡쳐하는 방법을 이용하는데, 이러한 핵산 결합은 매우 강력하며 비가역적이기 때문에, 핵산을 다시 분리하기가 어렵고, 따라서 핵산이 캡쳐된 상태에서 증폭을 수행한다. 이와 같은 방법은 하나의 용기 내에서 핵산 추출, 정제, 및 증폭 과정이 모두 일어나므로 사용이 용이하지만, 고상 PCR(solid phase PCR) 결과 PCR 수율이 매우 낮아진다는 문제점이 있다.

그 외, Qiagen 사의 미국 특허 제 5,990,301호에 의하면, 음이온 교환 반응에 의해 DNA를 분리하는 방법을 개시하고 있으나, 원하는 DNA를 얻기 위한 용출 과정이 까다롭다는 문제점이 있다. 즉, 이온교환 물질에 캡쳐된 핵산을 분리하는 것이 쉽지 않으므로, 용출 과정에서 [염의 농도를 세심하게 맞춰 주어야 하며]고농도의 염을 사용하여야 하며, 그 후 염의 여과를 위해 알콜 침전 과정이 별도로 요구된다.

상술한 바와 같이, 종래의 방법들은 핵산의 전하를 이용하여 핵산을 캡쳐하거나, 핵산 결합 과정을 위해 추가의 화학물질(카오트로픽 염, PEG 등) 등을 사용해야 하는데, 이러한 경우, DNA 용출이 잘 되지 않는다는 어려움이 있으며, 또한 DNA 분리 및 정제를 위해 여러 가지 조성의 버퍼를 사용하여 여러 단계를 거쳐야 하므로 LOC(Lab-on-a-chip) 또는 LIP(lab-in-package) 형태의 구현에 어려움이 있다.

상기 문제를 해결하기 위하여, 본 발명은 핵산 분리 효율이 높으면서, 과정이 간단하고, 후속하는 PCR 과정의 수율을 높일 수 있는 핵산의 분리 및 증폭 방법을 제공한다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은,

핵산을 포함하는 시료로부터 핵산을 분리하는 방법으로서,

실란화된 고상 물질에 시료를 접촉시켜서 핵산을 캡쳐하는 단계; 및

핵산이 캡쳐된 상기 고상 물질을 pH 9 내지 pH 14의 염기성 용액으로 처리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산의 분리 방법을 제공한다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 본 발명의 상기 방법은, 염기성 용액으로 처리한 후, 40 ℃ 내지 100 ℃의 온도로 가열하는 단계를 더 포함한다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 더 나아가, 핵산을 포함하는 시료로부터 핵산을 증폭하는 방법으로서,

실란화된 고상 물질에 시료를 접촉시켜서 핵산을 캡쳐하는 단계; 핵산이 캡쳐된 상기 고상 물질을 pH 9 내지 pH 14의 염기성 용액으로 처리하는 단계; 및,

상기 처리 결과물에 핵산증폭용액을 가하여 핵산 증폭반응을 수행하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산의 증폭 방법을 제공한다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 본 발명의 상기 증폭 방법은, 염기성 용액으로 처리한 후, 40 ℃ 내지 100 ℃의 온도로 가열하는 단계를 더 포함한 다.

상기 증폭 방법에 있어서, 상기 염기성 용액 처리 후, 핵산증폭은 고상 물질의 제거 단계 없이 수행할 수 있다.

바람직하게는, 상기 염기성 용액 처리 후의 용액부피에 대해 실란은 0.0001%(v/v) 이상 내지 1%(v/v) 미만으로 함유되어 있다.

또한, 상기 핵산을 포함하는 시료는, 이중가닥 DNA, 단일가닥 DNA, 플라스미드 DNA, 및 RNA로 구성된 군으로부터 선택된 한 가지 이상을 포함할 수 있다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 고상 물질은, 실란화될 수 있는 고체 표면을 갖는 것이면 특별히 제한되지는 않지만, 실리카, 글래스, 플라스틱, 실리콘, 산화 철, 산화 알루미늄, 산화 티탄, 또는 산화 지르코늄일 수 있다. 또한 상기 고상 물질의 형태 또한 실란화될 수 있는 것이면 특별히 제한되지는 않으며, 비드, 필라, 또는 평판 형태일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 실란화된 고상 물질에 시료를 접촉시켜서 핵산을 캡쳐하는 단계는, 음이온 교환 물질에 의해 수행될 수 있다.

따라서, 바람직하게는, 상기 실란화된 고상 물질은, 그 표면에 음이온 교환체를 포함할 수 있다.상기 음이온 교환체는, 모노알킬아미노, 디알킬아미노, 4차 알킬아미노기를 갖는 물질이며, 더욱 바람직하게는, 상기 실란화된 고상 물질의 표면에 아미드 결합으로 연결된 4차 아민인 베타인일 수 있다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 고상 물질은, 자성을 띠는 것이 바람직하다.

또한 본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 염기성 용액은, NaOH 용액, Tris 버퍼 용액, 보레이트 버퍼 용액, 또는 카보네이트 버퍼 용액일 수 있다.이하, 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

본 발명의 방법에 의하면, 종래 기술에서처럼, 카오트로픽 염 및 EtBr과 같은 유독성 물질을 사용하지 않고도 핵산의 분리 및 정제가 가능하다. 또한 종래 기술에서처럼, 전하를 이용하여 핵산을 캡쳐하는 경우 핵산의 용출이 용이하지 않았던 점을 해결하기 위하여, 용출 과정을 거치지 않고도 핵산을 효과적으로 분리하여, 후속하는 PCR 과정에 바로 이용할 수 있도록 한다. 또한, 본 발명의 핵산 분리 방법은, PCR 방해 물질을 포함하지 않음으로써, 후속하는 PCR의 효율을 저하시키지 않는다.상기와 같은 효과를 얻기 위하여, 본 발명은, 실란화된 고상 물질에 핵산을 캡쳐한 후, 알칼리 처리함으로써, 고상물질로부터 핵산이 결합된 실란층을 분리해 내고, 이것을 이용하여 바로 증폭 반응을 수행한다. 상기 핵산 정제 과정 및 PCR 과정을 동일한 기판 상에서 수행할 수 있는 것 또한 본 발명의 이점이다.

종래 방법에서는 염농도의 조절을 통하여, 핵산의 결합과 분리를 수행하였지만, 본 발명에서는, 염농도를 조절하여 핵산을 분리하지 않고도, 효율적인 PCR 과정의 수행을 가능하게 한다.

상기와 같은 효과를 얻기 위한 본 발명의 구성은,

핵산을 포함하는 시료로부터 핵산을 분리하는 방법으로서,

실란화된 고상 물질에 시료를 접촉시켜서 핵산을 캡쳐하는 단계; 및

핵산이 캡쳐된 상기 고상 물질을 pH 9 내지 pH 14의 염기성 용액으로 처리 하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 상기 과정의 일실시예를 도 1에 모식적으로 나타내었다. 도 1을 참조하여 본 발명의 방법을 대략적으로 설명하면 다음과 같다. 즉, 고상 물질, 예를 들면 비드의 표면을 실란화시키고, 실란화된 표면에 핵산을 캡쳐할 수 있는 화합물, 예를 들면 음이온 교환체를 결합시킨다. 여기에 DNA를 포함하는 시료를 가하면, 음이온 교환체에 핵산이 결합되어, 도 1과 같은 형태로 된다. 이렇게 핵산이 결합된 고상 물질에 알칼리 및/또는 열을 가하면, 비드 표면의 실란층이 음이온교환체 및 DNA와 함께 비드로부터 떨어지게 되고, 도 1의 형태처럼 실란-음이온교환체-DNA로 이루어진 파편들이 생기게 된다. 이 파편들을 분리하여 바로 PCR에 이용할 수 있다.

종래의 핵산 정제 방법에서, 음이온 교환체를 이용하는 방법들은, 핵산을 음이온 교환체를 이용하여 캡쳐한 후, 용출 과정에 의해 다시 결합된 핵산을 분리해야 하는데 그 과정이 용이하지 않고, 별도의 버퍼 및 고농도의 염 용액을 이용해야만 했다. 그러나, 본 발명의 방법은, 그러한 DNA 용출 과정을 요구하지 않고, 대신 실란 코팅을 벗겨내는 방법으로 간단하게 DNA를 분리해내므로, 방법이 훨씬 간편하고, 버퍼 용액 등이 후속하는 PCR 과정을 방해하거나 하는 일이 없다.

본 발명의 방법을 적용할 수 있는 시료는, 이중가닥 DNA, 단일가닥 DNA, 플라스미드 DNA 및 RNA 중 어떠한 것이라도 포함할 수 있다.

본 발명의 방법에 있어서, 상기 염기성 용액으로 처리하는 과정 중에 또는 그 후에 가열하는 과정을 더 포함하는 것이 바람직하다. 40 ℃ 내지 100 ℃의 온 도로 가열하는 경우, 실란 코팅의 박리를 더욱 촉진할 수 있다.

본 발명의 상기 방법에 있어서, 상기 고상 물질은, 그 표면이 실란화될 수 있는 것이면 어떠한 것이라도 가능하다. 예를 들면, 실리콘, 유리, 실리카, 다이아몬드, 석영, 알루미나, 백금, 알루미늄, 지르코늄 및 텅스텐 등의 금속 산화물 등이 가능하다. 고상 물질의 형태 및 크기 또한 특별히 제한되지 않으며, 평판, 웨이퍼, 화이버, 비드, 입자, 사슬, 겔, 시트, 구, 패드, 필라, 슬라이드, 박막, 플레이트 등 어떠한 형태라도 가능하며, 모세관, 채널, 멤브레인, 테스트 튜브, 칼럼, 핀, 비드, 유리 섬유 등의 형태도 가능하다. 바람직하게는, 실리카 비드를 편리하게 사용할 수 있다.

본 발명의 방법에 있어서, 상기 고상 물질을 실란화시킨다. 실란화 방법은 공지된 방법을 이용할 수 있으며, 예를 들면, 다음의 문헌을 참조로 한다. C line Adessi et al. (2000) Solid phase DNA amplification: characterisation of primer attachment and amplification, Nucleic Acids Res., 28, e87. Martin Huber et al. (2001) Detection of single base alterations in genomic DNA by solid phase polymerase chain reaction on oligonucleotide microarrays, Anal. Biochem., 299, 24. Georg Mitterer et al. (2004) Microarray-based identification of bacteria in clinical samples by solid-phase PCR amplification of 23S ribosomal DNA sequences, J. Clin. Microbiol. 42, 1048. 도 2와 같이, 상기 실란 코팅은 필요에 따라 아미노기 등의 작용기를 가질 수 있다. 실란화된 고상 물질은, 이 작용기를 통하여, 핵산을 직접 캡쳐하거나 또는 핵 산을 캡쳐할 수 있는 화합물과 결합할 수 있다.

실란 층에 결합되고 핵산을 캡쳐할 수 있는 화합물은, 핵산과 결합 가능한 작용기 또는 화합물이면 특별히 제한되지는 않지만, 바람직하게는 음이온 교환체이다. 본 발명에서 사용가능한 바람직한 음이온 교환체는 모노알킬아미노, 디알킬아미노, 4차 알킬아미노기를 갖는 물질이며, 바람직하게는 베타인이다. 베타인은, 후속하는 PCR 과정에서 핵산의 2차 구조 형성을 억제함으로써, DNA 증폭을 안정화시키는 역할을 하므로, 본 발명의 방법에 있어서 특히 바람직하다.

본 발명의 일실시예로서, 도 2를 보면, 아미노실란화된 실리카 비드와 베타인의 결합과정이 나타나 있다. 즉, 크로스 링커인 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드(이하, EDC라 함)의 존재 하에, 실란화 실리카 비드의 아미노기와 베타인의 카르복실기가 반응하여, 아미드 결합을 형성함으로써, 베타인이 실리카 비드에 연결된다. 크로스 링커인 EDC의 작용 기작은 하기 반응식 1에 나타내었다.

상기와 같이 형성된 음이온 교환체가 결합된 실란화 실리카 비드로 시료를 처리함으로써, 핵산을 분리한 후, 이것을 다시 알칼리 처리함으로써, 실란 코팅층을 벗겨낸다. 실란 코팅층은 알칼리 처리 및/또는 열 처리로써 벗겨내는데, 알칼리 처리는 pH 9 내지 pH 14의 조건으로 할 수 있다. 이와 같이, 본 발명은, 별도의 용출 과정 없이, 알칼리 처리로 실란 코팅층을 간단히 벗겨냄으로써, 핵산을 분리할 수 있다.

비드로부터 떨어져 나온 실란 코팅층에는, 음이온 교환체와 핵산이 같이 붙어 있게 된다. 만약, 자성 비드를 사용한다면, 자성을 이용해 비드만을 분리해 낼 수 있다. 이와 같이 얻어진, 음이온 교환체-핵산 복합체에 대하여 통상의 방법으로 직접 PCR를 수행할 수 있다. 이와 같이 본 발명의 방법에 의하면, 비드가 용액내에 존재하는 상태에서도 PCR을 수행할 수 있다.

상기 형태는 같은 원리로 변형되어 응용이 가능하다.

이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명한다.

실시예

실시예 1

- 음이온 교환체가 결합된 실리카 비드의 제조

실리카 비드(3 μm 지름, Bangs Laboratories, Inc., Fishers, IN, US)를 아미노프로필트리에톡시 실란으로 다음과 같이 실란화하였다.

즉, 실리카 비드를 아세톤으로 3번 세척한 후 아세톤 내 10% 아미노프로필트리에톡시 실란 용액으로 상온에서 2시간 처리한 후 다시 아세톤과 PBS 버퍼로 세척하였다.

그리고 난 후, 상기와 같이 실란화된 실리카 비드와 베타인을 링커인 0.4M EDC의 존재 하에서 상온에서, 0.05 M MES 버퍼 내에서 3시간 반응시켜서 베타인이 결합된 실리카 비드를 얻었다.(도 2 참조)

- 실리카 비드와 DNA의 결합

50 kb 크기의 λDNA(Promega 사로부터 입수) (539 ng/L) 2 ㎕를 마이크로 튜브에 넣고 58 ㎕ PBS 용액을 가한 후, 상기에서 얻어진 실란화된 실리카 비드 2.9 mg과 혼합하고, 상온에서 15 분간 교반하면서 반응시켰다.

그리고 난 후, DNA의 결합 정도를 알아보기 위하여, 실리카 비드 첨가 전과 후 각각에, DNA 정량 시약인 PicoGreen (Molecular Probes, Inc.) 가하여, Microplate Fluorometer(Molecular Devices)을 이용하여 형광을 측정하였다.

결과는 도 3에 나타내었다. 도 3의 그래프에 나타낸 바와 같이, 실리카 비드에 DNA 용액을 반응시킨 후 다시 이 용액을 취하여 정량한 결과 DNA가 남아있지 않음을 확인할 수 있었다

- 실란 코팅의 제거

상기와 같이 DNA가 결합된 비드를 원심분리의 방법으로 분리하여, 95℃의 Tris 버퍼(pH 8, 바이오니아, 대전, 한국) 60㎕로 15분간 처리하였다.

또 다른 실험으로, 상기와 같이 DNA가 결합된 비드를 원심분리의 방법으로 분리하여, 95℃의 0.1 N NaOH 용액 60㎕로 15분간 처리하였다. 상기와 같이 각각 처리한 후 각각 원심분리하여 비드를 분리하고, 이 비드를 아가로스 겔의 웰에 넣고 EtBr로 염색한 후 UV에 노출시켜 사진을 찍었다. 그 결과를 도 9에 나타내었다. 도 9에서 보듯이, pH 8의 버퍼에서는 실란코팅 벗겨지지 않아, 비드에 DNA가 부착되어 있음을 알 수 있었다.

이에 관하여, 발명을 더욱 상세히 설명하기 위하여, 알칼리 처리 전과 후의 비드의 표면에 관한 SEM 사진을 도 4에 나타내었다. 도 4의 두 사진의 비교로부터 알 수 있는 바와 같이, 알칼리 처리 후, 비드의 실란 코팅이 제거되었음을 육안으로 확인할 수 있다.

실시예 2

상기 실시예 1의 방법과 동일한 방법으로, 2.9 mg의 실란화 비드와 400 ng의 HBV 플라스미드 DNA를 반응시킨 후 PBS 버퍼로 세척하고 원심분리하여 비드를 모았다. 이를 39 μL의 0.1 N NaOH 용액에 넣고 가열하여 실란 코팅을 제거하였다. 다시 원심분리하여 상층액을 취하고 여기에 1 μL의 1 M Tri-HCl (pH7)을 넣어 중성화시킨 후 이 용액 1 μL를 취하여 다음과 같이 PCR을 수행하였다.

사용한 PCR 프라이머는 다음과 같다:

프라이머 A ( 5-AGTGTGGATTCGCACTCCT-3); 및

프라이머 B ( 5-GAGTTCTTCTTCTAGGGGACCTG-3).

PCR 증폭은 Taq 중합효소 (Solgent, 한국)를 이용하여 95℃에서 5분 동안 예비변성, 25 사이클의 증폭과정(95℃에서 30초 동안 변성, 62℃에서 15초 동안 어닐링 및 72℃에서 30초 동안 신장), 72℃에서 3분 동안 추가적인 신장을 통하여 수행하였다.

상기 실험을 3회 수행한 후, DNA 농도를 측정함으로써 PCR 수율을 확인하였다. 결과는 도 5에 나타내었다. 도 5에서, 대조구는, 아무런 처리도 하지 않은 동량의 DNA에 대하여 PCR을 수행한 결과이다. 도 5에서 알 수 있는 바와 같이, 실란화 비드를 이용하여 캡쳐한 DNA를 알칼리처리 한 후 PCR을 행한 결과는, 아무런 처리를 하지 않은 동량의 DNA를 이용하여 PCR을 수행한 결과와, 수율면에서 거의 차이가 없는 것으로 나타났다. 도 6은 실란화 비드를 이용하여 캡쳐한 DNA를 알칼리 처리한 후 용액 내 존재하는 실란 농도가 PCR 수율(yield)에 미치는 영향을 나타낸 그래프인데, 실란이 1%(알칼리 처리 후의 용액부피에 대해 실란이 차지하는 부피의 백분율) 이하로 존재하는 경우에는 PCR에 저해 영향이 없음을 알 수 있었다.

도 7은 실란화 비드를 이용하여 캡쳐한 DNA를 알칼리 처리한 후 용액 내 존 재하는 베타인 농도가 PCR 수율에 미치는 영향을 나타낸 그래프인데, 용액 내 베타인의 농도 크기는 PCR 수율에 크게 영향을 미치지 않음을 알 수 있었다.

상기 도 6 및 도 7의 결과로부터, DNA의 분리에 사용되는 물질이 후속하는 PCR에 저해 작용을 하지 않으며, 따라서, DNA 분리와 PCR을 하나의 용기 내에서 수행할 수 있음을 알 수 있었다.

실시예 3

EcoRI 처리

상기의 실시예 1에서 얻은 λDNA 1 g을 샘플로 하여 5 유닛 EcoRI (NEN Life Science Products, Boston, MA)로 37℃에서 1시간 제한효소처리를 한 후, 1% 아가로스 겔에 올려 도 8의 사진을 얻었다(레인 2 및 3). 도 8에서, 레인 1은 아무런 처리도 하지 않은 λDNA 1 g에 5 유닛에 EcoRI을 처리하여 얻은 결과이고, 레인 4는 λDNA를 처리하지 않은 결과이다. 도 8에서 보듯이, 본 발명의 방법으로 얻은 λDNA에 제한효소를 처리(레인 2 및 3)하여도 레인 1과 동일하며, 유해 효과가 없음을 알 수 있었다.

본 발명의 방법에 의하면, 종래 기술에서처럼, 카오트로픽 염 및 EtBr과 같은 유독성 물질을 사용하지 않고도 핵산의 분리 및 정제가 가능하다. 또한 종래 기술에서처럼, 전하를 이용하여 핵산을 캡쳐하는 경우 핵산의 용출이 용이하지 않았던 점을 해결하기 위하여, 용출 과정을 거치지 않고도 핵산을 효과적으로 분리하여, 후속하는 PCR 과정에 바로 이용할 수 있도록 한다. 또한, 본 발명의 핵산 분 리 방법은, PCR 방해 물질을 포함하지 않음으로써, 후속하는 PCR의 효율을 저하시키지 않는다.

Claims (14)

1. 핵산을 포함하는 시료로부터 핵산을 분리하는 방법으로서,

   실란화된 고상 물질에 시료를 접촉시켜서 핵산을 캡쳐하는 단계; 및

   핵산이 캡쳐된 상기 고상 물질을 pH 9 내지 pH 14의 염기성 용액으로 처리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산의 분리 방법.
2. 제 1 항에 있어서, 염기성 용액으로 처리한 후, 40 ℃ 내지 100 ℃의 온도로 가열하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산의 분리 방법.
3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 핵산을 포함하는 시료가, 이중가닥 DNA, 단일가닥 DNA, 플라스미드 DNA, 및 RNA로 구성된 군으로부터 선택된 한 가지 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산의 분리 방법.
4. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 고상 물질이, 실리카, 글래스, 플라스틱, 실리콘, 산화 철, 산화 알루미늄, 산화 티탄, 또는 산화 지르코늄인 것을 특징으로 하는 핵산의 분리 방법.
5. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 고상 물질이, 비드, 필라, 또는 평판 형태인 것을 특징으로 하는 핵산의 분리 방법.
6. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 실란화된 고상 물질이, 그 표면에 음이온 교환체를 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산의 분리 방법.
7. 제 6 항에 있어서, 상기 음이온 교환체가, 모노알킬아미노, 디알킬아미노, 4차 알킬아미노기를 갖는 것을 특징으로 하는 핵산의 분리 방법.
8. 제 6 항에 있어서, 상기 음이온 교환체가, 상기 실란화된 고상 물질의 표면에 아미드 결합으로 연결된 베타인인 것을 특징으로 하는 핵산의 분리 방법.
9. 핵산을 포함하는 시료로부터 핵산을 증폭하는 방법으로서,

   실란화된 고상 물질에 시료를 접촉시켜서 핵산을 캡쳐하는 단계;

   핵산이 캡쳐된 상기 고상 물질을 pH 9 내지 pH 14의 염기성 용액으로 처리하는 단계; 및,

   상기 처리 결과물에 핵산증폭용액을 가하여 핵산 증폭반응을 수행하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산의 증폭 방법.
10. 제 9 항에 있어서, 염기성 용액으로 처리한 후, 40 ℃ 내지 100 ℃의 온도로 가열하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산의 증폭 방법.
11. 제 9 항 또는 제 10 항에 있어서, 상기 염기성 용액 처리 후의 용액부피에 대해 실란은 0.0001%(v/v) 이상 내지 1%(v/v) 미만으로 함유되어 있는 것을 특징으로 하는 핵산의 증폭 방법.
12. 제 9 항 또는 제 10 항에 있어서, 상기 실란화된 고상 물질이, 그 표면에 음이온 교환체를 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산의 증폭 방법.
13. 제 12 항에 있어서, 상기 음이온 교환체가, 모노알킬아미노, 디알킬아미노, 4차 알킬아미노기를 갖는 것을 특징으로 하는 핵산의 증폭 방법.
14. 제 12 항에 있어서, 상기 음이온 교환체가, 상기 실란화된 고상 물질의 표면에 아미드 결합으로 연결된 베타인인 것을 특징으로 하는 핵산의 증폭 방법.

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