JP3666604B2 - 核酸アーカイビング - Google Patents
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Description
発明の分野
本発明は、一般的には分子生物学、生化学、遺伝学、および生物学的研究の分野に関し、具体的には、結合核酸を固相から溶出することなく水性緩衝液で広範に洗浄することができるように、生物試料から核酸を捕捉し固相マトリックス上に不可逆的に結合させる方法に関する。さらに固相結合核酸は、酵素反応、ハイブリダイゼーションプライマーもしくはプローブ相補的塩基対合、および以後の検出のための利用可能な基質として、増幅有りまたは無しで、直接利用することができる。固相結合核酸は、１回のみでなく複数回、ハイブリダイゼーションまたは増幅反応に導入することができる。すなわちこの方法はさらに、核酸捕捉を核酸ハイブリダイゼーションおよび／または増幅と連結する商業的応用に関する。
先行技術の背景
核酸の分子構造は、特定の標的生物または組織にユニークな配列へのオリゴヌクレオチドプローブまたはプライマーの相補的塩基対合による特異的検出を提供する。すべての生物または生物試料は特定の明確な配列の核酸を含有するため、核酸検出のための普遍的な方策は、多くの多様な研究開発分野ならびに産業において極めて広い応用を有する。核酸検出の実用の可能性は、低濃度で存在する核酸の正確な配列をはるかに高いコピー数まで忠実に増幅するかまたはコピーする方法を記載することにより大幅に増強され、その結果核酸が検出方法によりいっそう容易に観察される。
元々の増幅法は、ムリス（Mullis）らが記載したポリメラーゼチェイン反応である（米国特許第4,683,195号、米国特許第4,683,202号、および米国特許第4,965,188号があり、これらすべては参照することにより本明細書の一部とする）。PCRの導入後、増幅のための広範囲の方策が記載されている。例えばマレク（Malek）の米国特許第5,130,238号、核酸配列ベースの増幅（NASBA）；アウアーバッハ（Auerbach）の米国特許第5,354,668号、等温法；バーケンマイアー（Buirkenmeyer）の米国特許第5,427,930号、リガーゼチェイン反応；およびウォーカー（Walker）の米国特許第5,455,166号、鎖置換増幅（SDA）を参照されたい（これらは参照することにより本明細書の一部とする）。これらの増幅法のあるもの（例えばSDAまたはNASBA）は、１本鎖核酸標的を必要とする。標的は一般に、増幅前に高温を使用する溶融法により１本鎖にされる。本発明は、この従来の溶融工程無しで２本鎖核酸を１本鎖核酸に変換する新規機序を提供する。
核酸増幅および検出の前に、増幅反応酵素のインヒビターが除去されるように標的核酸は生物試料から抽出され精製される。さらにプライマーアニーリングのために自由にかつ一貫して入手できる核酸標的が提供されなければならない。核酸精製のための広範囲の方策が知られている。これらには、例えばフェノール−クロロホルムおよび／またはエタノール沈殿（サムブルック（Sambrook）ら、（1989）モレキュラークローニング：実験室マニュアル（Molecular Cloning:A Laboratory Manual）、第２版、コールドスプリングハーバーラボラトリー（Cold Spring Harbor Laboratory）、コールドスプリングハーバー（Cold Spring Harbor）、ニューヨーク州）、高塩沈殿（ダイクス（Dykes）（1988）Electrophoresis 9:359−368）、プロテイナーゼＫ消化（グリンバーグ（Grimberg）ら、（1989）Nucleic Acids Res 22:8390）、ケレックス（chelex）と他の沸騰法（ワルシュ（Walsh）ら、（1991）Bio/techniques 10:506−513）および固相結合と溶出（フォーゲルスタイン（Vogelstein）とギレスピー（Gillespie）（1979）Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76:615−619、があり、これらは参照することにより本明細書の一部とする。
従って核酸標的の分析は３つの工程から構成される：生物試料からの核酸抽出／精製、特異的標的配列の直接プローブハイブリダイゼーションまたは増幅、およびその特異的検出。現在使用されている従来法のプロトコールにおいて、これらの３つの工程はそれぞれ別々に行われ、核酸分析を面倒なものにしている。さらに分析の各工程を実施するのに、多くの操作、装置および試薬が必要である。
現在の方法の別の問題は、その時測定されている試料の間の交差汚染または以前に増幅した試料からの交差汚染の可能性が高いことである。プローブハイブリダイゼーションまたは増幅プライマーアニーリングのために１本鎖核酸を作成するのに必要な溶融工程を排除し、核酸分析工程を直接組み込んで分析操作および方法を簡便化し、交差汚染のリスクを低減および／または除去することは、有利であろう。本明細書に記載の方法は、上記の抽出とハイブリダイゼーションまたは増幅工程の直接の連結方法を提供する。
分析目的に核酸はしばしば、極度に少ない試料から抽出する必要があり、その場合二次的確認試料を得ることが不可能ではないにしても困難である。例としては、犯罪現場の証拠の分析または臨床的試験のための細い針の生検試料の分析がある。従ってこのような場合、複製試験による遺伝的試験と確認の程度は、核酸試料のサイズにより限定される。これらの少ない試料について従来の抽出法を使用すると、しばしば核酸が失われるか、または収率は、一回または数回の増幅分析のみが可能なものとなる。本発明は、試料から核酸を不可逆的に結合し、従って永続的にアーカイブ（archive）する方法を提供する。すなわち核酸は分析中改変も枯渇もされず、従って無限回数再分析することができる。本発明は、当業者に公知ではあるが核酸分析には適合しないと考えられている固相DNA結合性を利用する。さらにRNA分析に有用な結合性が性状解析される。
高レベルの内因性またはバックグランド核酸を含有する試料（例えば、血液）は、低レベルの特異的標的の存在について分析することは極めて困難である。高い核酸結合力（avidity）を有する固相は、オリゴヌクレオチドまたはプローブ配列を不可逆的に捕捉するのに使用することができる。緩衝液の条件を変化させることにより、これらの材料は、高レベルのバックグランド核酸の存在下でも標的配列を選択的に捕捉するのに使用することができる。
固相にDNAが結合し次にそこからDNAを溶出することができるための要件がブーム（Boom）（米国特許第5,234,809号、これは参照することにより本明細書の一部とする）とウッダード（Woodard）（米国特許第5,405,951号、米国特許第5,438,129号、米国特許第5,438,127号、これらは参照することにより本明細書の一部とする）により記載されている。具体的には、DNAは電気的に陽性で親水性である固相に結合する。原子であるケイ素（Si）、ホウ素（Ｂ）、またはアルミニウム（Al）からなる固相材料は、ヒドロキシル（−OH）または他の基により充分に親水性にして、DNAを不可逆的に結合するがタンパク質またはインヒビターは結合しない表面とすることができる。RNAの結合は従来性状解析されておらず、本発明で明らかにされる。従来の精製法は結合核酸の溶出を必要とするため、これらの固相材料はDNA精製には役に立たないとされている。実際、核酸を充分に結合しかつその溶出を可能にするように、固相材料を充分に電気的に陽性かつ親水性にするために大きな努力が払われている。（例えば、すべてのウッダード（Woodard）の米国特許第5,523,392号、5,525,319号および5,503,816号を参照されたい。これらは参照することにより本明細書の一部とする）。本発明は、核酸を不可逆的に結合する固相マトリックスを使用し、直接的な固相核酸操作、ハイブリダイゼーション、および／または増幅の方法を教示する。すなわち、固相から核酸を溶出することなく分析が行われる。
ブーム（Boom）（前述）は、シリカに可逆的に結合するために高カオトロピック塩を使用する固相DNA増幅を記載している。この固相を増幅反応緩衝液中に入れると、拡散は実際溶出される。従って増幅は、固相上ではなく、実際には溶液中で起こる。さらに結合は不可逆的ではないため、増幅は１回しか実施できない。デル・リオ（Del Rio）ら（（1996）Bio/techniques 20:970−974）は、繰り返し増幅を可能にする方法で核酸のフィルター捕捉を記載している。しかし彼らは、不可逆的な結合機序を記載せず、従ってその方法はより高濃度の核酸の分析についてのみ推奨され、従って非常に限定された数のアナライトのみに推奨される。
本発明は、溶融工程無しで２本鎖核酸を１本鎖核酸に変換する新規方法に関し、抽出と精製をハイブリダイゼーションと増幅に直接連結する迅速DNAおよびRNA捕捉法を提供する。本発明はさらに不可逆的結合の方法を提供し、従って試料から核酸を永続的にアーカイブする方法を提供する。本発明は不可逆的に核酸を結合する固相マトリックスを使用し、酵素認識、ハイブリダイゼーション、およびプライマー依存性増幅を含む真の直接固相操作と分析を教示する。真の固相分析は、結合核酸の厳密度の高い水性洗浄、迅速な自動核酸捕捉と精製、選択的核酸検出、繰り返しおよび／または拡大分析、そして核酸の長期保存を提供する。これらの開示された方法のそれぞれは、先行技術の欠点を克服している。
発明の要約
本発明は、操作中の水性洗浄，緩衝液交換および容量低減；抽出を自動化する方法としての核酸の迅速かつ即時的捕捉;1本鎖または２本鎖として固相に結合した核酸の直接分析のために、核酸捕捉と精製の、オリゴヌクレオチドもしくはプローブハイブリダイゼーションまたは標的もしくはシグナル増幅への組み込み；固相マトリックスへの捕捉後の結合核酸の繰り返しおよび／または拡大分析（拡散アーカイビング）；および大量の試料からの核酸の濃縮手段または水性緩衝液もしくは溶液からの混入核酸の除去手段としての重力もしくは高流速固相クロマトグラフィー、の手段としてRNA、DNAまたは他の核酸を不可逆的に捕捉する固相の新規使用法に基づく。
さらに詳しくは本発明は、核酸を不可逆的に捕捉する表面を得るために、−OHまたは他の基により親水性にされる電気的陽性度の高い固相材料（一般的にはSi、ＢまたはAl原子）の使用法を含む。これらの高親和性材料を使用することにより、核酸は水性生物試料または緩衝液から直接２本鎖核酸として捕捉される。試料をアルカリ性pHまたは高カオトロピック塩濃度に調整することにより、核酸は１本鎖核酸として固相に結合する。１本鎖として核酸を結合するのに、ハイブリダイゼーションまたは等温増幅法と連結するのに必要である。固相結合核酸は水性緩衝液で容易に洗浄することができ、こうして緩衝液交換と容量低減のための便利な機構を提供する。好適な実施態様においてこれは重力流を使用して行われる。固相結合核酸は、核酸ハイブリダイゼーション、シグナルまたは標的増幅を提供する反応混合物と直接接触させることができる。複数回の緩衝液洗浄、ハイブリダイゼーション、または増幅反応後でも、核酸は固相に結合したままである。同じ核酸試料を再分析できることは、試料の利用できる量が限定されている時または代替できない時の特に有用な、結果の確認および／または拡大分析の手段を提供する。不可逆的に結合した核酸は室温で安定であり、核酸保存の有用な方法をさらに提供する。
本発明は、結合核酸を固相から溶出することなく水性緩衝液で広範に洗浄することができるように、任意の生物試料から低濃度および高流速の核酸を捕捉し固相マトリックス上に不可逆的に結合させる方法を提供する。この結合は、高感度を達成するために低バックグランドを必要とするマイクロアレイハイブリダイゼーションのような商業的応用のための高厳密度を提供する。すなわちこの方法はさらに、核酸抽出の自動化、高容量試料からの低コピー核酸の濃縮、および抽出と精製を増幅またはハイブリダイゼーション核酸捕捉と連結するための、商業的応用に関する。商業的応用には、ロボットを用いる自動化により有益となる高処理量核酸試験、またはプールした試料の試験による存在量の少ない標的の経済的スクリーニングを含む。さらに固相結合核酸は、酵素反応、ハイブリダイゼーション反応、または増幅反応により、一回のみでなく複数回直接操作することができる。従って本発明は、生物試料の量が限定されている時および／または代替できない時、および即時のまたは元々の試料の保存後の再分析が有益である時に応用される。これが発生する領域は、例えば法医学、医学的および生物学的研究、獣医的またはヒトの臨床的診断、歯科、環境、食物、または水の微生物学、および農業もしくは産業的応用である。
本発明の他の特徴と利点は、本発明の原理を例示する添付の図とともに考慮して以下の説明から明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
図１は、水、0.1N 水酸化ナトリウム（NaOH）、または4M グアニジンチオシアネート（GuSCN）結合緩衝液中で回転させながら室温で１時間インキュベートした後の、１ナノグラムの32P放射能標識DNAの、198mgの酸化アルミニウムまたは水酸化アルミニウムへの結合パーセントを示すグラフである。
図２は、水、0.1N NaOH、または4M グアニジンチオシアネート結合緩衝液中で回転させながら室温で１時間インキュベートした後の、32P放射能標識DNAの198mgの酸化アルミニウムへの結合効率に及ぼすDNA濃度の増加の影響を示す。
図３は、酸化アルミニウムに結合したDNAは、70％ETOH、水、またはPCR緩衝液で95℃で10回洗浄した後も、90％を超える量が不可逆的に結合していることを証明する。
図４は、二酸化ケイ素または酸化アルミニウムへのDNAの結合に及ぼす流速と濃度の影響を比較する。
図5aと5bは、水中の酸化アルミニウムに106コピーのHIV DNAとマイコバクテリウムDNAの１μｌのプラスミドプレップが同時結合し、次に２つの標的が連続して直接固相増幅されることを示す。HIVは、まず35サイクルのポリメラーゼチェイン反応（PCR）により増幅し、次に鎖置換増幅法（SDA）を使用してマイコバクテリウム標的の増幅を行なった。5aは、HIV増幅産物のアガロースゲルを臭化エチジウム染色したものを示す。ウェル１は分子量ラダーであり、ウェル２、３は陽性の水性1000コピー増幅物、ウェル４、５、６および７はアルミニウム固相PCR増幅物、ウェル８、９、10および11は、陰性のアルミニウム固相対照、ウェル12、13は水性陰性対照である。図5bは、SDA増幅産物のアガロースゲルの臭化エチジウム染色したものを示す。ウェル１、２は水性陽性対照、ウェル３、４、５および６はアルミニウム固相SDA増幅物、ウェル７、８、９および10は陰性のアルミニウム対照、そして11、12は水性陰性対照である。
図６は、AIDS患者の0.5mlの血漿からグアニジン抽出したHIV RNAから得られたrtTH PCR産物のアガロースゲルを臭化エチジウム染色後の、アルミニウム結合RNAの優れた増幅を示す。ウェル１＝分子量ラダー、ウェル２＝1000コピーの陽性水性対照であるHIV DNA、ウェル３、４および５＝３回の別個のグアニジン酸化アルミニウム抽出後のrtTH PCR産物、ウェル６、７＝酸化アルミニウム陰性対照、ウェル８＝水性陰性対照。
図７は、増幅した第４の遺伝子セットであるプロメガ（Promega）STR CTTマルチプレックス、および増幅した第５の遺伝子セットであるプロメガ（Promega）FFVマルチプレックスについての銀染色パターンを示す。レーン１、８、９、16はアレリック（allelic）ラダーであり、レーン17はヒトゲノミック水性陽性対照、レーン２、３、４は、酸化アルミニウム結合DNA上の第４増幅（CTTマルチプレックス）、レーン５、６、７はアルミニウムCTT陰性対照、レーン10、11、12は第５の酸化アルミニウムFFVマルチプレックス増幅産物、レーン13、14、15はアルミニウムFFV陰性対照である。
図８は、種々の出発容量と異なる流速についての酸化アルミニウムまたは二酸化シリカに結合した放射能標識DNAのパーセントである。
図９は、0.1N NaOHと酸化アルミニウムの存在下で50μｌのACD抗凝固処理した血液の添加後の異なる時点の不可逆的捕捉後に、HLA DRbctaプライマーを使用してEtBrアガロースゲルにより確認した固相PCR増幅を示す。
図10は、自動核酸抽出のための固相結合材料を取り込むPCR増幅チューブである。
図11は、酸化アルミニウム上への直接結合後、または酸化アルミニウムに不可逆的に結合したオリゴヌクレオチド捕捉プローブへのハイブリダイゼーション後の、純粋なRNA標的（pAW109）のPCR増幅検出の限界を示す。
図12は、グアニジウム抽出と最終ハイブリダイゼーション反応容量28mlで酸化アルミニウムHIV捕捉ビーズにハイブリダイゼーション捕捉した後の、5.5ml血漿に添加したHIVの低コピー検出を示す。
好適な実施態様の詳細な説明
前記一般的説明と以下の詳細な説明は、例示および説明を目的とするのみで決して本発明の請求の範囲を限定するものではないことを理解されたい。
操作の一般的原理と条件（ハイブリダイゼーションや増幅を含む）は当該分野で公知である。本発明は、即時的かつ高流速で固相マトリックス上で核酸を捕捉し不可逆的に結合する方法を記載する。結合は大量かつ低濃度でもDNAとRNAの両方に起きる。不可逆的に結合した核酸を、厳密度の高い水性洗浄に付し、後の分析のために保存し、そして溶出することなくかつ結合核酸が大幅に失われることなく繰り返し増幅するかまたは分析する。本発明により達成される繰り返し固相操作は、任意の核酸の固相操作である。
当業者は、本明細書に開示の不可逆的な核酸結合は広範囲の生物試料で行われることを認識するであろう。そのような試料には例えば、農業起源、細菌およびウイルス起源、およびヒトまたは他の動物起源の生物試料、ならびに廃液または飲料水、農産物、加工食品そして空気などの他の試料がある。さらに詳しくは試料には、例えば血液、便、喀痰、粘液、子宮頸部または膣試料、脳脊髄液、血清、尿、唾液、涙、生検試料、組織学的試料、組織培養産物、農産物、廃液または飲料水、加工食品そして空気がある。本発明は、天然に存在するかまたは汚染物質として核酸を含有する任意の試料から固相マトリックスに核酸を不可逆的に結合するのに有用である。
本明細書では種々の用語が使用され、これらを定義することが有用であろう。これらは本明細書で提供され、これらの用語が以下の説明および本明細書を通して使用される時、覚えているべきである。
本明細書で使用される用語「アーカイビング（archiving）」とは、手順に従って操作して固相マトリックスに不可逆的に結合した核酸を分析後、結合した核酸を保存することを意味する。保存とは、以後の分析の能力、および同じ核酸の繰り返し分析ならびに同時または連続的な複数の核酸標的の拡大分析を包含する。このために手順に従った操作は、例えば固相核酸酵素反応、オリゴヌクレオチドまたはプローブハイブリダイゼーション、および／またはシグナルまたは標的増幅反応を含む。
本明細書で使用される「鋳型（template）依存性プロセス」とは、特異的プローブを介する鋳型依存性認識、シグナル増幅反応を介するコピー操作、またはプライマー分子の鋳型依存性伸長を介する標的の拡大を伴うプロセスとして定義される。鋳型依存性伸長とは、新たに合成された核酸鎖の配列は標的核酸とプライマーの相補的塩基対合の規則により指令される、RNAまたはDNA標的配列の核酸合成とコピー伸長を意味する。特異的配列のオリゴヌクレオチドまたはプローブを特異的に使用する相補的塩基対合に基づく鋳型依存性プロセスは、「ハイブリダイゼーション」検出として知られている。
「プライマー」分子とは、DNAまたは他のポリメラーゼにより合成を開始するのに必要な、標的配列／対照配列の既知の部分に相補的な核酸配列を意味する。
「標的核酸配列」とは、検出または増幅されるべき核酸分子を意味する。標的分子は、試料中で精製された、部分的に精製されたまたは精製されていない状態で存在することができる。
「捕捉」とは、固相マトリックスへの核酸の結合を意味する。結合は、核酸の化学的／物理的性質に基づき適当な緩衝液中で直接的でもよい。あるいは捕捉は、固相マトリックスへプローブを不可逆的に結合させ次に特異的ハイブリダイゼーションを行うことにより、標的特異的でもよい。
本発明は、固相への核酸の捕捉と不可逆的結合、および以後の固相の操作の方法に例示される。本発明の具体的な応用にかかわらず、方法の詳細は当該分野で公知のプロトコールならびに本明細書に開示のプロトコールに従って計画される。さらにこの必要な計画は、当業者により日常的に行われ、過度の実験をすることなく当業者により日常的に行われる業務の範囲内にある。
本出願は、固相マトリックスへの核酸の不可逆的結合の具体的な応用を教示する。既知の特異的結合材料は、親水性にされた電気的陽性度の高い原子構造を特徴とする。核酸は溶出できないため、これらの材料は当業者には核酸分析には役に立たないと考えられていた。逆に本発明は、具体的な応用のためにこの不可逆的結合を利用する。
本発明が核酸抽出、精製および検出に広く応用できることを当業者は容易に理解するであろう。以下の例は本発明を説明し例示するものである。これらの例は決して本発明を限定するものではない。本発明の範囲内において種々の変更が可能である。
例1:方法と材料
DNA結合は32P放射能標識を使用して測定する。ニューイングランドバイオラボズ（New England Biolabs）から得られた4361塩基対のpBR322プラスミド、プライムイットII・ストラタジーン（Prime−It Stratagene）キットを使用してランダムプライム標識する。プラスミドをHind IIIで切断し、標識されないヌクレオチドをバイオラッド・バイオスピン６（Bio−Rad Biospin6）を使用して除去し、１ナノグラム／マイクロリットル（ng/μｌ）の濃度に調整する。より高いDNA濃度は、サケ精子DNAを添加して調整する。放射能標識実験のデータは、５個の繰り返しのデータ点の平均値である。
アルドリッチ（Aldrich）から得られる酸化アルミニウム（サイズ74〜149μｍ）（カタログNo.34,265−３）を、0.1N NaOHで室温で１時間処理して水酸化アルミニウムを作成する。水（２回蒸留水）、0.1N NaOH、または4Mグアニジンチオシアネート緩衝液（12g GuSCN、277μｌトリトン（登録商標）Ｘ−100、2.2mlの0.2M EDTA、pH8.0、および10mlの0.1Mトリス−塩酸、pH6.4）からなるDNA結合緩衝液を使用する。結合は、閉じたマイクロフュージ管中の回転または重力流ろ過により行う。大きいビーズは遠心分離することなく管の底に容易に沈殿し、従って洗浄を促進する。重力流実験のためにスペクトラム・スペクトラメッシュ（Spectrum SpectraMesh）43μｍフィルター（スペクトラム（Spectrum）、カタログNo.146530）を圧力でアンシス（ANSYS）4mMクロマトグラフィーカラムに適合させる。アルミニウムビーズを液体スラリーとしてこのカラムに充填し、排水させ、ブロットして乾燥させ、1mlの70％ETOHで１回洗浄し、乾燥してから種々の結合緩衝液中のDNAを加える。
固相増幅を例示するために、充分に性状解析されている遺伝子座の公表されている配列と方法を使用する。さらに本実験法で使用するすべての配列を表１に記載する（配列番号１〜10）。具体的にはHIVのPCRのためにSK38/SK39プライマーセット（ケログ（Kellog）とクォク（Kwok）（1990）、「PCRプロトコール：方法と応用への指針（PCR Protocols:A guide to Medhods and Applications）」中、イニス・エム・エー（Innis MA）ら編、アカデミックプレス社（Academic Press Inc.）、pp.337−347、参照することにより本明細書の一部とする、配列番号８〜９、表１を参照されたい）、パーキン・エルマー（Perkin−Elmer）から得られた対照HIV DNAプラスミド（カタログNo.N808−0016）、およびrtTH逆転写酵素増幅を使用する。鎖置換増幅は、ウォーカー（Walker）ら（1996）Clinical Chemistry 42:9−13（参照することにより本明細書の一部とする）が記載したプライマーセットを使用する（配列番号４〜７、表１を参照されたい）。ヒトショートタンデムリピート（STR）プライマーセットとプロトコールは、プロメガ（Promega）から販売されている、CTTとFFVマルチプレックスである。
例2:DNAの不可逆的固相結合の確認
放射能標識DNA（1ng）を、水（２回蒸留水）、0.1N NaOH、または4M グアニジン緩衝液中で室温で１時間回転しながら、酸化アルミニウムまたは水酸化アルミニウムに結合させる。DNAは水またはグアニジン中で酸化アルミニウムに結合する。結合緩衝液としてNaOHまたは水酸化アルミニウムビーズを使用することにより、結合が大幅に増強される（図１）。198mgの酸化アルミニウムの結合能力を推定するために、種々の濃度のサケの精子DNAに1ngの放射能標識DNAを加える。さらに詳しくはこの方法は、アルミニウムが飽和されて放射能標識DNAの結合が阻止される点を推定する（図２）。水の結合は50ngで飽和され、グアニジンの結合は50ng〜5000ngの範囲で飽和される。水酸化ナトリウムの結合は100,000ngまで飽和されない。従ってNaOHでアルミニウムを親水性にすることは、その結合効率と総能力を大幅に増強させる。10回の連続的洗浄後に除去される放射能標識を計測することによりDNA結合の不可逆性が証明される（図３）。図３に示すように、95℃のPCR緩衝液による10回の洗浄後も、92％を超えるDNAが保持され堅く結合している。溶出した計数（６％）の大部分は、最初の４回の洗浄液中に存在しわずかに２％のみが最後の６回の洗浄液に存在する。従ってアルミニウムに結合したDNAは、遠心分離やDNAを喪失する危険無しで水性洗浄や緩衝液交換がし易い。大量の試料から選択された固相結合核酸は、所望の容量で洗浄し再懸濁することができる。例えばグアニジンを含有する３ミリリットル（ml）の試料からDNAを吸収し、リン酸またはトリス緩衝液で洗浄し、次にビーズを少量の増幅反応混合物（50μｌ）に再懸濁することができる。これらの性質は、DNA精製と増幅の連結の簡便化する法を提供する。
例3:重力流クロマトグラフィー
容量が多く濃度が低い試料からのDNA検出の感度の大きな改良は、クロマトグラフィーにより高流速でDNAを効率的に吸収するアルミニウムの能力に基づいて得られる。74〜149μｍの酸化アルミニウムビーズまたは150〜212μｍの二酸化シリカビーズ（シグマ（Sigma）、カタログNo.G1145）の重力ろ過の間に、放射能標識DNAを吸収させる（図４）。シリカとアルミニウムの量は、いずれもDNA結合のために等しい表面積を有するように調整される。DNA（50ng）は、1ml（流れる時間1.5〜２分、約0.5ml/分）または10ml（流れる時間５〜８分、約2ml/分）に希釈すると、重力ろ過の間に結合する。1ml容量の重力流クロマトグラフィーの間、アルミニウムははるかに効率的にDNAを結合する（SiO2＝６％対AlOX＝52％、いずれも4Mグアニジン結合緩衝液中）。SiO2とAlOXの両方について結合効率は、1mlのNaOH結合緩衝液により改善される（SiO2＝12.4％対AlOX＝60％）。10ml容量を使用し同じ50ngのDNA（すなわち、1ml試料より10倍低いml当たりの濃度）を使用して流速を４倍上昇させると、二酸化シリカの結合効率が２％未満に急激に低下する。これに対してアルミニウムは、総計数回収率でわずかに10％低下するのみである。さらなる実験操作は、第２または第３の高容量試料を通してクロマトグラフィーを繰り返すと、酸化アルミニウムについて最大80％の結合効率が得られることを示している。固相DNA結合についてアルミニウムはシリカよりはるかに優れており、高流速と低濃速でDNAをクロマトグラフィー捕捉することができる。この性質のために、酸化アルミニウムはプールした大量の試料からDNAを濃縮することができ、DNA検出の1ml当たりの感度を大きく上昇させる。アルミニウムのDNAに対する高結合力はまた、水、緩衝液、または他の試薬からの低レベルのDNA汚染物質の除去にも有用である。
例4:固相増幅
この核酸結合は不可逆的であるため、アルミニウムは、結合したDNAが固相上で直接増幅されるときのみ有効である。異なる増幅法との適合性を示すために、106コピーのHIV DNAとマイコバクテリウムDNAの１μｌのプラスミドプレップを同時に水中の酸化アルミニウムに結合させる。これらの結合DNA標的を次に、順にHIVで増幅し、まず35サイクルのポリメラーゼチェイン反応（PCR）を使用して増幅し、次に鎖置換増幅（SDA）によりマイコバクテリウム標的を増幅させる。図5aに示すHIV PCRのアガロースゲルの臭化エチジウム（EtBr）染色したものは優れた増幅産物を示す。HIV PCR増幅後に、アルミニウムを70％ETOHで４回洗浄し、55℃で10分乾燥し、次にマイコバクテリウム標的についてSDA増幅を行う。SDA増幅のEtBr染色アガロースゲルはまた、水性対照で観察されたものと等しいレベルの増幅産物を示す（図5b）。さらなる実験操作は、4Mグアニジンまたは0.1N NaOH結合緩衝液を使用することによりマイコバクテリウムプラスミドDNAはアルミニウムに結合し、これらの固相上で増幅が起きることを示す。
アルカリ性条件が１本鎖を産生することは一般に知られている。DNAはまた4Mグアニジン中で１本鎖である（トンプソン（Thompson）とギレスピー（Gillespie）（1987）Analytical Biochemistry 163:281−291、参照することにより本明細書の一部とする）。NaOHまたはグアニジン緩衝液中の酸化アルミニウムに結合したDNAのSDA増幅は、融解工程無しで進行する。これらのデータは、DNAがこれらの結合緩衝液中で１本鎖として結合し、１本鎖標的核酸を必要とする酸化アルミニウムによるDNA精製と等温増幅法の間の連結を提供することを確認する。
酸化アルミニウムはまたRNAの効率的結合が可能であることを示すために、4Mグアニジン結合緩衝液を使用してAIDS患者のACD血漿試料から直接HIVを酸化アルミニウムで精製する。この試料はあらかじめウイルス負荷定量的PCRにより、２×104RNAコピー/mlを有することが測定されている。アルミニウム抽出のために0.5mlの血漿を4Mグアニジンチオシアネート緩衝液で5mlに希釈したものを使用し、次に40mgの酸化アルミニウム上に重力ろ過する。図６は、rtTH逆転写酵素増幅後にEtBr染色アガロースゲル上で検出される優れたPCR産物生成を示す。4Mグアニジンプロトコールは、血漿中に存在するHIVビリオンからRNAを放出することができ、これらは高容量（5ml）重力ろ過により増幅可能な状態で酸化アルミニウム上に捕捉される。酸化アルミニウムは一般に核酸を結合する。
例5:DNAアーカイビング
不可逆的に結合した核酸と直接固相増幅を組合せると、同じDNA試料を無限回繰り返して分析することができる。この点を例示するために10μｌのACD血液を、4Mグアニジン緩衝液中でアルミニウムに結合させる。結合したDNAを次に、プロメガ（Promega）からの連続的ショートタンデムリピート（STR）マーカーを使用して５回（各30サイクル）PCR増幅を行う。増幅の順序は:1）F13B、２）FESFPS、３）VWA、４）CTTマルチプレックス、および５）FFVマルチプレックスである。最後の増幅セット後DNA試料をまとめて150サイクルのPCRにかける。図７の銀染色ゲルに示す結果は、すべての５つのPCRで増幅が起き、結合DNAのDNAアーカイビングまたは繰り返し固相アルミニウム増幅を確認している。
要約すると、DNAは酸化アルミニウム上にアーカイブされ、その結果さらなる増幅分析に利用できる。これは、同じ遺伝子の繰り返し分析、例えば異なる感染性物質を検出するための異なる遺伝子の連続的増幅、例えばヒト同定分析のための高度に鑑別能力のある拡大分析を含む。
例6:酸化アルミニウムへの核酸の不可逆的結合を促進ま たは阻止する緩衝液
198mgの酸化アルミニウムの存在下で、表１に記載の種々の物質の500μｌの水溶液に放射能標識DNA（50ng）を加える。放射能標識DNAのみの結合をより正確に測定するために、バイオスピン６（Biospein6）精製後に残存する取り込まれなかったヌクレオチドをTCA沈殿により測定する。表１に示すようにこの補正法を使用すると、4Mグアニジンまたは水酸化ナトリウムの存在下で100％の効率でDNAは酸化アルミニウムに結合する。いくつかの他の物質および／または条件は総合的にDNAの結合を阻止する。例えば表１では、これらには10％ウシ血清アルブミンまたはK2HPO4ある。結合と阻止の条件のいずれも規定されているため、特異的オリゴヌクレオチドまたはプローブを便利にかつ特異的に不可逆的に結合し、次にブロッキング緩衝液条件に変更してハイブリダイゼーションにより標的特異的捕捉をさせることが可能である。すなわち酸化アルミニウムへの核酸の結合を完全に阻害するリン酸塩または他の緩衝液は、不可逆的に結合した核酸に対するバックグランドシグナルの低いハイブリダイゼーション緩衝液の基礎を提供する。ハイブリダイズした標的は除去され、固相結合捕捉プローブは複数回再使用される。RNAが0.1N NaOH中で破壊されることは公知である。従ってこの結合緩衝液を使用してDNAのみが捕捉される。水酸化グアニジウムとナトリウム緩衝液を用いる効率的な細胞破砕と迅速な核酸結合は、血液、頬のスワブ、尿、および血漿または血清中に添加されたHIVビリオンについて有効である。しかしいくつかの感染性生物（例えば、クリプトスポリジウム・パルブム（Cryptosporidium parvum）については、効率的に細胞を破砕するために、試料を95℃で加熱しジチオスレイトール（DTT）のようなタンパク質還元剤を含めることが必要である（配列番号１〜３、表IIを参照されたい）。
例7:高流速での即時結合とPCRチューブへの酸化アルミ ニウムの取り込み
高流速でDNAを結合する酸化アルミニウムの能力は、1ml、5ml、または10mlの4Mグアニジウム緩衝液中に懸濁した放射能標識DNAの同じ総cpmを使用して、これらを測定された流速で酸化アルミニウムまたは二酸化ケイ素に通過させることにより測定される。図８に示す結果は、酸化アルミニウムが二酸化ケイ素よりはるかに優れていることを確認している。酸化アルミニウムは、流れ濃度の高容量（10ml）試料を、1ml当たり10倍高い濃度と10倍少ない容量で1mlの試料に核酸を効率的に結合する。図９の実験結果が示すようにDNA結合は即時的である。ここでは50μｌのACD抗凝固化した血液を、0.1N NaOH結合緩衝液中の酸化アルミニウムに加え、直後にまたは種々のインキュベーション時間DNAを結合させた後に、固相結合DNAからHLA DRベータ遺伝子をPCR増幅する。増幅の効率により示される結合は、即時、１分または２分の時点について同一である。これらの実験結果は、PCR増幅と直接連結される自動化核酸抽出のための非常に便利でかつ迅速なプロトコールの基礎である。このために酸化アルミニウムは、PCRを阻害しないことが証明されているケイ素または他の接着物質を介して、図10に示すようにPCRチューブに接着させられる。あるいはこれは、高処理能力のために96PCRチューブプレート中に取り込まれる。これらの代替法のいずれも、以下の工程からなるプロトコールにより簡便な核酸抽出を提供する:1）結合緩衝液を酸化アルミニウムPCRチューブに加える、２）各チューブに試料を加え、混合し、次に液体を吸引して廃棄する、３）洗浄緩衝液を繰り返し（３回）ピペッティングして洗浄し、次に緩衝液を吸引して廃棄する、４）PCR増幅マスターミックスを加える、そして５）サーマルサイクラー中で増幅する。このプロトコールのピペッティング工程は、高処理能力のためにロボットシステムを使用して容易に自動化することができる。
例8:酸化アルミニウムへの純粋RNAの結合の確認
例４は、患者血漿試料からのHIVの検出に基づき、RNAは不可逆的に酸化アルミニウムに結合し増幅可能であることを示唆した。この結果は血清中の混入しているプロウイルスDNAによる可能性がある。純粋なRNA標的を使用するRNA結合は、不可逆的結合と固相増幅を確認している。図11は、4Mグアニジウム緩衝液中で結合したpAW109純粋RNA標的の増幅と酸化アルミニウム固相上で増幅したrtPCRの結果を示す。IL−２ mRNAとクリプトスポリジウム（Cryptosporidium）dsRNAの結合と増幅は、同様にして証明される。
例9:ハイブリダイゼーションによる特異的標的捕捉のた めの不可逆的に結合した核酸の利用
検出限界の実験は、酸化アルミニウム結合DNAのPCR増幅後の検出は1000コピーを必要とし、結合RNAは103コピーを必要とすることを示す（図11）。固相プローブ捕捉と次にハイブリダイゼーションを使用することにより、RNAまたはDNAの検出感度は、100コピー未満まで大幅に改善される。所望の増幅標的に隣接する配列に相補的な20〜100塩基対長の高コピー捕捉オリゴヌクレオチドは、0.1N NaOH緩衝液中の酸化アルミニウムに不可逆的に結合する。洗浄後この捕捉ビーズを使用すると、高いバックグランドレベルの核酸を含有する試料中でも、標的にハイブリダイズする。この操作のために試料を4Mグアニジウム緩衝液で破砕し、捕捉プローブを含有する固相マトリックスの存在下で３倍希釈する。ハイブリダイゼーションを起こさせ、洗浄工程後、ハイブリダイズした標的を含有する捕捉ビーズを直接PCR増幅する。図11に示すように、これにより、10〜100コピーの標的の検出限界が得られる。
例10:高容量またはプールした試料中の低コピー標的の 捕捉
初期試料容量が多い場合でも標的配列の特異的選択について、固相プローブへのハイブリダイゼーション捕捉は効率的である。図12に示すようにAIDS患者の血漿試料からの1000コピーのHIVが、前記ハイブリダイゼーション固相捕捉法により検出可能である（血漿により5.5mlの初期容量まで希釈しても検出可能である）。希釈を最小にするために、血漿を直接、抽出用乾燥グアニジウム粉末に加える。この調整により捕捉ビーズへのハイブリダイゼーションのための最終容量は30mlとなる。さらに100μｌ容量の陽性HIV血漿を、さらに24個の陰性の100μｌの血漿試料でプールしても検出される。このようなプールすることを行う実験は、１ミリリットル当たり48HIVビリオンコピーの検出感度を確認している。さらなる方法は、30mlの水中にプールしたクリプトスポリジウム（Cryptosporidium）100コピーの検出を確認している。従ってハイブリダイゼーション捕捉ビーズプロトコールは、個々の試料についての感度とほとんど等しい感度でプールした試料をスクリーニングするのに使用することができ、これは高感度のプールした試料の試験を可能にした大幅なコスト削減を可能にするため、大きな商業的可能性を有している。
例11:いったん酸化アルミニウムに不可逆的に結合した 核酸の保存
4Mグアニジウム緩衝液または0.1N NaOH緩衝液を使用して酸化アルミニウム上に50μｌのACD血液からの核酸を結合させた。次に結合核酸を、乾燥、70％ETOH中、またはトリスEDTA緩衝液中で室温で４℃もしくは−20℃で保存した。核酸は一般にこれらのすべての条件で３ヶ月安定であり、本発明を使用するとさらに長い可能性がある（おそらく無期限）。
本発明は、酸化アルミニウムへのRNAの結合に関し、および固相結合DNAおよび／またはRNAの種々の使用に関する。本発明は、固相捕捉のために核酸に不可逆的に結合し種々の操作を直接連結する酸化アルミニウムまたは他の物質の使用法を提供し、該方法は水性緩衝液ならびに一回のおよび連続的に複数回の増幅またはハイブリダイゼーションベースの反応を使用する。さらに核酸捕捉は、混入している核酸の除去のために、または、高容量またはプールした試料の分析の検出のために、低コピー核酸を濃縮するのに有用である。酸化アルミニウムは核酸に対して充分な結合力を示し、低濃度でも高流速（例えば、5ml/分）でも核酸に結合する。従って本発明は、大容量、重力ベースのまたは高流速捕捉に有用であり、さらに広範な水性洗浄に適合する方法で核酸の捕捉に有用であり、増幅反応を妨害するかも知れないインヒビターの無い非常にきれいな核酸を生成する。
本明細書に開示されるハイブリダイゼーション反応は、ビーズや平らな表面（例えば、ブロットまたはマイクロアレイチップ）の形で捕捉された核酸への直接ハイブリダイゼーションを含む。ハイブリダイゼーションはまた、捕捉プローブ（例えば、オリゴヌクレオチド、cDNA、クローン化プラスミド、転写もしくは合成RNA、またはRNA）に不可逆的に結合して、高いバックグランドレベルの非特異的核酸を有する複雑な試料から相補的配列を選択することによる、特異的配列の特異的捕捉を含んでもよい。捕捉ビーズ法は、ポリＡメッセンジャーRNAを精製するために酸化アルミニウムに結合したポリ−Ｔオリゴヌクレオチドを使用する特異的配列捕捉に有用である。適当な捕捉オリゴヌクレオチドを使用することにより、任意の特異的核酸標的が選択的に取り出され、種々のタイプの試料から濃縮される。
また本発明と一致するのは、固相に不可逆的に結合した核酸からの、酵素認識、特異的操作または増幅である。これは、標的増幅反応（例えば、PCR、SDA、NASBA、IsoCRまたはCRCA）ならびにシグナル増幅反応（例えば、Ｑベータレプリカーゼまたは分岐鎖DNA）を含む。標準的PCRチューブの反応表面積に接着した結合物質としての酸化アルミニウムの取り込みおよび同じチューブを使用してPCRサーマルサイクリング反応を直接かつ便利に使用する迅速核酸抽出プロトコールも、本明細書で教示される。チューブまたは容器は、高処理量ロボットを使用する自動化のための基盤を提供する。
代替核酸応用のための酸化アルミニウムの利用を可能にする緩衝液系をすべて考察する。これらには、例えば、極端に硬い試料（例えばクリプトスポリジウム（Cryptosporidium））を破砕する特異的還元剤を含むグアニジウムベースの緩衝液を含む。この緩衝液では、DNAとRNAの両方が、100％に近い効率で酸化アルミニウムに効率的に結合する。別の緩衝液系は、迅速かつ経済的なDNA結合緩衝液を提供するNaOHのようなアルカリ性緩衝液に関する。この緩衝液では、RNAが破壊され、その結果DNAのみを選択的に結合する手段を提供する。さらに別の系は、酸化アルミニウムへの核酸の結合を完全に妨害する緩衝液（例えば、リン酸緩衝液）がある。この緩衝液系は、高感度で効率的なマイクロアレイ、ビーズおよびブロットハイブリダイゼーションのためのバックグランドシグナル対ノイズ比が低いハイブリダイゼーション緩衝液の基礎を提供する。
例えば酸化アルミニウムの不可逆的結合特性は、同じかまたは異なる遺伝子の連続的な繰り返し分析を提供する。これには、DNAとRNAの同時分析、またはDNAとRNAの独立した連続的分析がある。複数のプローブを結合することにより、ハイブリダイゼーション捕捉もまた特異的標的についてマルチプレックス化することができる。すなわち本発明は、ハイブリダイゼーションまたは増幅反応のいずれかにより、任意の核酸を繰り返しまたは連続的に分析するのに有用である。いったん不可逆的に結合すると、核酸は安定であり、室温で長期間保存することができる。
上記説明は多くの具体的事項を含むが、これらの具体的事項は決して本発明の範囲を限定するものではなく、その好適な実施態様を例示するのみであることを理解されたい。すなわち本発明の前記説明は、例示と説明のためである。本発明の精神と範囲を逸脱することなく、当業者は多くの変更および修飾を行って本発明を種々の用途や条件に適合させることができる。従ってこれらの変更や修飾は、正しく公平に、以下の請求の範囲と等価の全範囲内にある。すなわち本発明の範囲は本明細書に提供した例により決定されるのではなく、添付の請求の範囲およびその法的同等物により決定される。
配列表
（１）一般情報：
（ｉ）出願人：
ジョン・シー・ゲルデス（John C.Gerdes）
ジェフリー・エム・マルマロ（Jeffrey M.Marmaro）
クロストファー・エー・レール（Christopher A.Roehl）
（ii）発明の名称：核酸アーカイビング
（iii）配列の数:10
（iv）連絡住所：
（Ａ）宛先：ジュリー・エル・バーナード・ピー・シー（Julie L.Bernard,P.C.）
（Ｂ）通り:9000 イー・インスピレーション・ドライブ（9000 E.Inspiration Drive）
（Ｃ）市：パーカー（Parker）
（Ｄ）州：コロラド
（Ｅ）国：アメリカ合衆国
（Ｆ）郵便番号:80138−8535
（ｖ）コンピューターで読める形式：
（Ａ）媒体の型：ディスケット、3.5インチ
（Ｂ）コンピューター:IBM PCコンパチブル
（Ｃ）オペレーティング・システム:MS−DOS
（Ｄ）ソフトウェア：ワードパーフェクト（WordPerfect）6.0
（vi）現行出願のデータ：
（Ａ）出願番号：
（Ｂ）出願日:1998年４月16日
（Ｃ）分類：
（vii）先行出願のデータ
（Ａ）出願番号:60/046,999
（Ｂ）出願日:1997年４月16日
（viii）弁理士／代理人情報：
（Ａ）氏名：ジュリー・エル・バーナード（Julie L.Bernard）
（Ｂ）登録番号:36,450
（Ｃ）参照／整理番号:IAD−４
（ix）電話連絡先情報：
（Ａ）電話:303 841 7472
（Ｂ）ファックス:303 840 1567
（２）配列番号:1の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ:21塩基
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数:1本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号:1:
（２）配列番号:2の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ:20塩基
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数:1本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号:2:
（２）配列番号:3の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ:100塩基
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数:1本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号:3:
（２）配列番号:4の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ:15塩基
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数:1本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号:4:
（２）配列番号:5の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ:15塩基
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数:1本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号:5:
（２）配列番号:6の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ:40塩基
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数:1本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号:6:
（２）配列番号:7の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ:40塩基
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数:1本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号:7:
（２）配列番号:8の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ:28塩基
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数:1本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号:8:
（２）配列番号:9の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ:28塩基
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数:1本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号:9:
（２）配列番号:10の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ:100塩基
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数:1本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号:10:
本発明は、一般的には分子生物学、生化学、遺伝学、および生物学的研究の分野に関し、具体的には、結合核酸を固相から溶出することなく水性緩衝液で広範に洗浄することができるように、生物試料から核酸を捕捉し固相マトリックス上に不可逆的に結合させる方法に関する。さらに固相結合核酸は、酵素反応、ハイブリダイゼーションプライマーもしくはプローブ相補的塩基対合、および以後の検出のための利用可能な基質として、増幅有りまたは無しで、直接利用することができる。固相結合核酸は、１回のみでなく複数回、ハイブリダイゼーションまたは増幅反応に導入することができる。すなわちこの方法はさらに、核酸捕捉を核酸ハイブリダイゼーションおよび／または増幅と連結する商業的応用に関する。
先行技術の背景
核酸の分子構造は、特定の標的生物または組織にユニークな配列へのオリゴヌクレオチドプローブまたはプライマーの相補的塩基対合による特異的検出を提供する。すべての生物または生物試料は特定の明確な配列の核酸を含有するため、核酸検出のための普遍的な方策は、多くの多様な研究開発分野ならびに産業において極めて広い応用を有する。核酸検出の実用の可能性は、低濃度で存在する核酸の正確な配列をはるかに高いコピー数まで忠実に増幅するかまたはコピーする方法を記載することにより大幅に増強され、その結果核酸が検出方法によりいっそう容易に観察される。
元々の増幅法は、ムリス（Mullis）らが記載したポリメラーゼチェイン反応である（米国特許第4,683,195号、米国特許第4,683,202号、および米国特許第4,965,188号があり、これらすべては参照することにより本明細書の一部とする）。PCRの導入後、増幅のための広範囲の方策が記載されている。例えばマレク（Malek）の米国特許第5,130,238号、核酸配列ベースの増幅（NASBA）；アウアーバッハ（Auerbach）の米国特許第5,354,668号、等温法；バーケンマイアー（Buirkenmeyer）の米国特許第5,427,930号、リガーゼチェイン反応；およびウォーカー（Walker）の米国特許第5,455,166号、鎖置換増幅（SDA）を参照されたい（これらは参照することにより本明細書の一部とする）。これらの増幅法のあるもの（例えばSDAまたはNASBA）は、１本鎖核酸標的を必要とする。標的は一般に、増幅前に高温を使用する溶融法により１本鎖にされる。本発明は、この従来の溶融工程無しで２本鎖核酸を１本鎖核酸に変換する新規機序を提供する。
核酸増幅および検出の前に、増幅反応酵素のインヒビターが除去されるように標的核酸は生物試料から抽出され精製される。さらにプライマーアニーリングのために自由にかつ一貫して入手できる核酸標的が提供されなければならない。核酸精製のための広範囲の方策が知られている。これらには、例えばフェノール−クロロホルムおよび／またはエタノール沈殿（サムブルック（Sambrook）ら、（1989）モレキュラークローニング：実験室マニュアル（Molecular Cloning:A Laboratory Manual）、第２版、コールドスプリングハーバーラボラトリー（Cold Spring Harbor Laboratory）、コールドスプリングハーバー（Cold Spring Harbor）、ニューヨーク州）、高塩沈殿（ダイクス（Dykes）（1988）Electrophoresis 9:359−368）、プロテイナーゼＫ消化（グリンバーグ（Grimberg）ら、（1989）Nucleic Acids Res 22:8390）、ケレックス（chelex）と他の沸騰法（ワルシュ（Walsh）ら、（1991）Bio/techniques 10:506−513）および固相結合と溶出（フォーゲルスタイン（Vogelstein）とギレスピー（Gillespie）（1979）Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76:615−619、があり、これらは参照することにより本明細書の一部とする。
従って核酸標的の分析は３つの工程から構成される：生物試料からの核酸抽出／精製、特異的標的配列の直接プローブハイブリダイゼーションまたは増幅、およびその特異的検出。現在使用されている従来法のプロトコールにおいて、これらの３つの工程はそれぞれ別々に行われ、核酸分析を面倒なものにしている。さらに分析の各工程を実施するのに、多くの操作、装置および試薬が必要である。
現在の方法の別の問題は、その時測定されている試料の間の交差汚染または以前に増幅した試料からの交差汚染の可能性が高いことである。プローブハイブリダイゼーションまたは増幅プライマーアニーリングのために１本鎖核酸を作成するのに必要な溶融工程を排除し、核酸分析工程を直接組み込んで分析操作および方法を簡便化し、交差汚染のリスクを低減および／または除去することは、有利であろう。本明細書に記載の方法は、上記の抽出とハイブリダイゼーションまたは増幅工程の直接の連結方法を提供する。
分析目的に核酸はしばしば、極度に少ない試料から抽出する必要があり、その場合二次的確認試料を得ることが不可能ではないにしても困難である。例としては、犯罪現場の証拠の分析または臨床的試験のための細い針の生検試料の分析がある。従ってこのような場合、複製試験による遺伝的試験と確認の程度は、核酸試料のサイズにより限定される。これらの少ない試料について従来の抽出法を使用すると、しばしば核酸が失われるか、または収率は、一回または数回の増幅分析のみが可能なものとなる。本発明は、試料から核酸を不可逆的に結合し、従って永続的にアーカイブ（archive）する方法を提供する。すなわち核酸は分析中改変も枯渇もされず、従って無限回数再分析することができる。本発明は、当業者に公知ではあるが核酸分析には適合しないと考えられている固相DNA結合性を利用する。さらにRNA分析に有用な結合性が性状解析される。
高レベルの内因性またはバックグランド核酸を含有する試料（例えば、血液）は、低レベルの特異的標的の存在について分析することは極めて困難である。高い核酸結合力（avidity）を有する固相は、オリゴヌクレオチドまたはプローブ配列を不可逆的に捕捉するのに使用することができる。緩衝液の条件を変化させることにより、これらの材料は、高レベルのバックグランド核酸の存在下でも標的配列を選択的に捕捉するのに使用することができる。
固相にDNAが結合し次にそこからDNAを溶出することができるための要件がブーム（Boom）（米国特許第5,234,809号、これは参照することにより本明細書の一部とする）とウッダード（Woodard）（米国特許第5,405,951号、米国特許第5,438,129号、米国特許第5,438,127号、これらは参照することにより本明細書の一部とする）により記載されている。具体的には、DNAは電気的に陽性で親水性である固相に結合する。原子であるケイ素（Si）、ホウ素（Ｂ）、またはアルミニウム（Al）からなる固相材料は、ヒドロキシル（−OH）または他の基により充分に親水性にして、DNAを不可逆的に結合するがタンパク質またはインヒビターは結合しない表面とすることができる。RNAの結合は従来性状解析されておらず、本発明で明らかにされる。従来の精製法は結合核酸の溶出を必要とするため、これらの固相材料はDNA精製には役に立たないとされている。実際、核酸を充分に結合しかつその溶出を可能にするように、固相材料を充分に電気的に陽性かつ親水性にするために大きな努力が払われている。（例えば、すべてのウッダード（Woodard）の米国特許第5,523,392号、5,525,319号および5,503,816号を参照されたい。これらは参照することにより本明細書の一部とする）。本発明は、核酸を不可逆的に結合する固相マトリックスを使用し、直接的な固相核酸操作、ハイブリダイゼーション、および／または増幅の方法を教示する。すなわち、固相から核酸を溶出することなく分析が行われる。
ブーム（Boom）（前述）は、シリカに可逆的に結合するために高カオトロピック塩を使用する固相DNA増幅を記載している。この固相を増幅反応緩衝液中に入れると、拡散は実際溶出される。従って増幅は、固相上ではなく、実際には溶液中で起こる。さらに結合は不可逆的ではないため、増幅は１回しか実施できない。デル・リオ（Del Rio）ら（（1996）Bio/techniques 20:970−974）は、繰り返し増幅を可能にする方法で核酸のフィルター捕捉を記載している。しかし彼らは、不可逆的な結合機序を記載せず、従ってその方法はより高濃度の核酸の分析についてのみ推奨され、従って非常に限定された数のアナライトのみに推奨される。
本発明は、溶融工程無しで２本鎖核酸を１本鎖核酸に変換する新規方法に関し、抽出と精製をハイブリダイゼーションと増幅に直接連結する迅速DNAおよびRNA捕捉法を提供する。本発明はさらに不可逆的結合の方法を提供し、従って試料から核酸を永続的にアーカイブする方法を提供する。本発明は不可逆的に核酸を結合する固相マトリックスを使用し、酵素認識、ハイブリダイゼーション、およびプライマー依存性増幅を含む真の直接固相操作と分析を教示する。真の固相分析は、結合核酸の厳密度の高い水性洗浄、迅速な自動核酸捕捉と精製、選択的核酸検出、繰り返しおよび／または拡大分析、そして核酸の長期保存を提供する。これらの開示された方法のそれぞれは、先行技術の欠点を克服している。
発明の要約
本発明は、操作中の水性洗浄，緩衝液交換および容量低減；抽出を自動化する方法としての核酸の迅速かつ即時的捕捉;1本鎖または２本鎖として固相に結合した核酸の直接分析のために、核酸捕捉と精製の、オリゴヌクレオチドもしくはプローブハイブリダイゼーションまたは標的もしくはシグナル増幅への組み込み；固相マトリックスへの捕捉後の結合核酸の繰り返しおよび／または拡大分析（拡散アーカイビング）；および大量の試料からの核酸の濃縮手段または水性緩衝液もしくは溶液からの混入核酸の除去手段としての重力もしくは高流速固相クロマトグラフィー、の手段としてRNA、DNAまたは他の核酸を不可逆的に捕捉する固相の新規使用法に基づく。
さらに詳しくは本発明は、核酸を不可逆的に捕捉する表面を得るために、−OHまたは他の基により親水性にされる電気的陽性度の高い固相材料（一般的にはSi、ＢまたはAl原子）の使用法を含む。これらの高親和性材料を使用することにより、核酸は水性生物試料または緩衝液から直接２本鎖核酸として捕捉される。試料をアルカリ性pHまたは高カオトロピック塩濃度に調整することにより、核酸は１本鎖核酸として固相に結合する。１本鎖として核酸を結合するのに、ハイブリダイゼーションまたは等温増幅法と連結するのに必要である。固相結合核酸は水性緩衝液で容易に洗浄することができ、こうして緩衝液交換と容量低減のための便利な機構を提供する。好適な実施態様においてこれは重力流を使用して行われる。固相結合核酸は、核酸ハイブリダイゼーション、シグナルまたは標的増幅を提供する反応混合物と直接接触させることができる。複数回の緩衝液洗浄、ハイブリダイゼーション、または増幅反応後でも、核酸は固相に結合したままである。同じ核酸試料を再分析できることは、試料の利用できる量が限定されている時または代替できない時の特に有用な、結果の確認および／または拡大分析の手段を提供する。不可逆的に結合した核酸は室温で安定であり、核酸保存の有用な方法をさらに提供する。
本発明は、結合核酸を固相から溶出することなく水性緩衝液で広範に洗浄することができるように、任意の生物試料から低濃度および高流速の核酸を捕捉し固相マトリックス上に不可逆的に結合させる方法を提供する。この結合は、高感度を達成するために低バックグランドを必要とするマイクロアレイハイブリダイゼーションのような商業的応用のための高厳密度を提供する。すなわちこの方法はさらに、核酸抽出の自動化、高容量試料からの低コピー核酸の濃縮、および抽出と精製を増幅またはハイブリダイゼーション核酸捕捉と連結するための、商業的応用に関する。商業的応用には、ロボットを用いる自動化により有益となる高処理量核酸試験、またはプールした試料の試験による存在量の少ない標的の経済的スクリーニングを含む。さらに固相結合核酸は、酵素反応、ハイブリダイゼーション反応、または増幅反応により、一回のみでなく複数回直接操作することができる。従って本発明は、生物試料の量が限定されている時および／または代替できない時、および即時のまたは元々の試料の保存後の再分析が有益である時に応用される。これが発生する領域は、例えば法医学、医学的および生物学的研究、獣医的またはヒトの臨床的診断、歯科、環境、食物、または水の微生物学、および農業もしくは産業的応用である。
本発明の他の特徴と利点は、本発明の原理を例示する添付の図とともに考慮して以下の説明から明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
図１は、水、0.1N 水酸化ナトリウム（NaOH）、または4M グアニジンチオシアネート（GuSCN）結合緩衝液中で回転させながら室温で１時間インキュベートした後の、１ナノグラムの32P放射能標識DNAの、198mgの酸化アルミニウムまたは水酸化アルミニウムへの結合パーセントを示すグラフである。
図２は、水、0.1N NaOH、または4M グアニジンチオシアネート結合緩衝液中で回転させながら室温で１時間インキュベートした後の、32P放射能標識DNAの198mgの酸化アルミニウムへの結合効率に及ぼすDNA濃度の増加の影響を示す。
図３は、酸化アルミニウムに結合したDNAは、70％ETOH、水、またはPCR緩衝液で95℃で10回洗浄した後も、90％を超える量が不可逆的に結合していることを証明する。
図４は、二酸化ケイ素または酸化アルミニウムへのDNAの結合に及ぼす流速と濃度の影響を比較する。
図5aと5bは、水中の酸化アルミニウムに106コピーのHIV DNAとマイコバクテリウムDNAの１μｌのプラスミドプレップが同時結合し、次に２つの標的が連続して直接固相増幅されることを示す。HIVは、まず35サイクルのポリメラーゼチェイン反応（PCR）により増幅し、次に鎖置換増幅法（SDA）を使用してマイコバクテリウム標的の増幅を行なった。5aは、HIV増幅産物のアガロースゲルを臭化エチジウム染色したものを示す。ウェル１は分子量ラダーであり、ウェル２、３は陽性の水性1000コピー増幅物、ウェル４、５、６および７はアルミニウム固相PCR増幅物、ウェル８、９、10および11は、陰性のアルミニウム固相対照、ウェル12、13は水性陰性対照である。図5bは、SDA増幅産物のアガロースゲルの臭化エチジウム染色したものを示す。ウェル１、２は水性陽性対照、ウェル３、４、５および６はアルミニウム固相SDA増幅物、ウェル７、８、９および10は陰性のアルミニウム対照、そして11、12は水性陰性対照である。
図６は、AIDS患者の0.5mlの血漿からグアニジン抽出したHIV RNAから得られたrtTH PCR産物のアガロースゲルを臭化エチジウム染色後の、アルミニウム結合RNAの優れた増幅を示す。ウェル１＝分子量ラダー、ウェル２＝1000コピーの陽性水性対照であるHIV DNA、ウェル３、４および５＝３回の別個のグアニジン酸化アルミニウム抽出後のrtTH PCR産物、ウェル６、７＝酸化アルミニウム陰性対照、ウェル８＝水性陰性対照。
図７は、増幅した第４の遺伝子セットであるプロメガ（Promega）STR CTTマルチプレックス、および増幅した第５の遺伝子セットであるプロメガ（Promega）FFVマルチプレックスについての銀染色パターンを示す。レーン１、８、９、16はアレリック（allelic）ラダーであり、レーン17はヒトゲノミック水性陽性対照、レーン２、３、４は、酸化アルミニウム結合DNA上の第４増幅（CTTマルチプレックス）、レーン５、６、７はアルミニウムCTT陰性対照、レーン10、11、12は第５の酸化アルミニウムFFVマルチプレックス増幅産物、レーン13、14、15はアルミニウムFFV陰性対照である。
図８は、種々の出発容量と異なる流速についての酸化アルミニウムまたは二酸化シリカに結合した放射能標識DNAのパーセントである。
図９は、0.1N NaOHと酸化アルミニウムの存在下で50μｌのACD抗凝固処理した血液の添加後の異なる時点の不可逆的捕捉後に、HLA DRbctaプライマーを使用してEtBrアガロースゲルにより確認した固相PCR増幅を示す。
図10は、自動核酸抽出のための固相結合材料を取り込むPCR増幅チューブである。
図11は、酸化アルミニウム上への直接結合後、または酸化アルミニウムに不可逆的に結合したオリゴヌクレオチド捕捉プローブへのハイブリダイゼーション後の、純粋なRNA標的（pAW109）のPCR増幅検出の限界を示す。
図12は、グアニジウム抽出と最終ハイブリダイゼーション反応容量28mlで酸化アルミニウムHIV捕捉ビーズにハイブリダイゼーション捕捉した後の、5.5ml血漿に添加したHIVの低コピー検出を示す。
好適な実施態様の詳細な説明
前記一般的説明と以下の詳細な説明は、例示および説明を目的とするのみで決して本発明の請求の範囲を限定するものではないことを理解されたい。
操作の一般的原理と条件（ハイブリダイゼーションや増幅を含む）は当該分野で公知である。本発明は、即時的かつ高流速で固相マトリックス上で核酸を捕捉し不可逆的に結合する方法を記載する。結合は大量かつ低濃度でもDNAとRNAの両方に起きる。不可逆的に結合した核酸を、厳密度の高い水性洗浄に付し、後の分析のために保存し、そして溶出することなくかつ結合核酸が大幅に失われることなく繰り返し増幅するかまたは分析する。本発明により達成される繰り返し固相操作は、任意の核酸の固相操作である。
当業者は、本明細書に開示の不可逆的な核酸結合は広範囲の生物試料で行われることを認識するであろう。そのような試料には例えば、農業起源、細菌およびウイルス起源、およびヒトまたは他の動物起源の生物試料、ならびに廃液または飲料水、農産物、加工食品そして空気などの他の試料がある。さらに詳しくは試料には、例えば血液、便、喀痰、粘液、子宮頸部または膣試料、脳脊髄液、血清、尿、唾液、涙、生検試料、組織学的試料、組織培養産物、農産物、廃液または飲料水、加工食品そして空気がある。本発明は、天然に存在するかまたは汚染物質として核酸を含有する任意の試料から固相マトリックスに核酸を不可逆的に結合するのに有用である。
本明細書では種々の用語が使用され、これらを定義することが有用であろう。これらは本明細書で提供され、これらの用語が以下の説明および本明細書を通して使用される時、覚えているべきである。
本明細書で使用される用語「アーカイビング（archiving）」とは、手順に従って操作して固相マトリックスに不可逆的に結合した核酸を分析後、結合した核酸を保存することを意味する。保存とは、以後の分析の能力、および同じ核酸の繰り返し分析ならびに同時または連続的な複数の核酸標的の拡大分析を包含する。このために手順に従った操作は、例えば固相核酸酵素反応、オリゴヌクレオチドまたはプローブハイブリダイゼーション、および／またはシグナルまたは標的増幅反応を含む。
本明細書で使用される「鋳型（template）依存性プロセス」とは、特異的プローブを介する鋳型依存性認識、シグナル増幅反応を介するコピー操作、またはプライマー分子の鋳型依存性伸長を介する標的の拡大を伴うプロセスとして定義される。鋳型依存性伸長とは、新たに合成された核酸鎖の配列は標的核酸とプライマーの相補的塩基対合の規則により指令される、RNAまたはDNA標的配列の核酸合成とコピー伸長を意味する。特異的配列のオリゴヌクレオチドまたはプローブを特異的に使用する相補的塩基対合に基づく鋳型依存性プロセスは、「ハイブリダイゼーション」検出として知られている。
「プライマー」分子とは、DNAまたは他のポリメラーゼにより合成を開始するのに必要な、標的配列／対照配列の既知の部分に相補的な核酸配列を意味する。
「標的核酸配列」とは、検出または増幅されるべき核酸分子を意味する。標的分子は、試料中で精製された、部分的に精製されたまたは精製されていない状態で存在することができる。
「捕捉」とは、固相マトリックスへの核酸の結合を意味する。結合は、核酸の化学的／物理的性質に基づき適当な緩衝液中で直接的でもよい。あるいは捕捉は、固相マトリックスへプローブを不可逆的に結合させ次に特異的ハイブリダイゼーションを行うことにより、標的特異的でもよい。
本発明は、固相への核酸の捕捉と不可逆的結合、および以後の固相の操作の方法に例示される。本発明の具体的な応用にかかわらず、方法の詳細は当該分野で公知のプロトコールならびに本明細書に開示のプロトコールに従って計画される。さらにこの必要な計画は、当業者により日常的に行われ、過度の実験をすることなく当業者により日常的に行われる業務の範囲内にある。
本出願は、固相マトリックスへの核酸の不可逆的結合の具体的な応用を教示する。既知の特異的結合材料は、親水性にされた電気的陽性度の高い原子構造を特徴とする。核酸は溶出できないため、これらの材料は当業者には核酸分析には役に立たないと考えられていた。逆に本発明は、具体的な応用のためにこの不可逆的結合を利用する。
本発明が核酸抽出、精製および検出に広く応用できることを当業者は容易に理解するであろう。以下の例は本発明を説明し例示するものである。これらの例は決して本発明を限定するものではない。本発明の範囲内において種々の変更が可能である。
例1:方法と材料
DNA結合は32P放射能標識を使用して測定する。ニューイングランドバイオラボズ（New England Biolabs）から得られた4361塩基対のpBR322プラスミド、プライムイットII・ストラタジーン（Prime−It Stratagene）キットを使用してランダムプライム標識する。プラスミドをHind IIIで切断し、標識されないヌクレオチドをバイオラッド・バイオスピン６（Bio−Rad Biospin6）を使用して除去し、１ナノグラム／マイクロリットル（ng/μｌ）の濃度に調整する。より高いDNA濃度は、サケ精子DNAを添加して調整する。放射能標識実験のデータは、５個の繰り返しのデータ点の平均値である。
アルドリッチ（Aldrich）から得られる酸化アルミニウム（サイズ74〜149μｍ）（カタログNo.34,265−３）を、0.1N NaOHで室温で１時間処理して水酸化アルミニウムを作成する。水（２回蒸留水）、0.1N NaOH、または4Mグアニジンチオシアネート緩衝液（12g GuSCN、277μｌトリトン（登録商標）Ｘ−100、2.2mlの0.2M EDTA、pH8.0、および10mlの0.1Mトリス−塩酸、pH6.4）からなるDNA結合緩衝液を使用する。結合は、閉じたマイクロフュージ管中の回転または重力流ろ過により行う。大きいビーズは遠心分離することなく管の底に容易に沈殿し、従って洗浄を促進する。重力流実験のためにスペクトラム・スペクトラメッシュ（Spectrum SpectraMesh）43μｍフィルター（スペクトラム（Spectrum）、カタログNo.146530）を圧力でアンシス（ANSYS）4mMクロマトグラフィーカラムに適合させる。アルミニウムビーズを液体スラリーとしてこのカラムに充填し、排水させ、ブロットして乾燥させ、1mlの70％ETOHで１回洗浄し、乾燥してから種々の結合緩衝液中のDNAを加える。
固相増幅を例示するために、充分に性状解析されている遺伝子座の公表されている配列と方法を使用する。さらに本実験法で使用するすべての配列を表１に記載する（配列番号１〜10）。具体的にはHIVのPCRのためにSK38/SK39プライマーセット（ケログ（Kellog）とクォク（Kwok）（1990）、「PCRプロトコール：方法と応用への指針（PCR Protocols:A guide to Medhods and Applications）」中、イニス・エム・エー（Innis MA）ら編、アカデミックプレス社（Academic Press Inc.）、pp.337−347、参照することにより本明細書の一部とする、配列番号８〜９、表１を参照されたい）、パーキン・エルマー（Perkin−Elmer）から得られた対照HIV DNAプラスミド（カタログNo.N808−0016）、およびrtTH逆転写酵素増幅を使用する。鎖置換増幅は、ウォーカー（Walker）ら（1996）Clinical Chemistry 42:9−13（参照することにより本明細書の一部とする）が記載したプライマーセットを使用する（配列番号４〜７、表１を参照されたい）。ヒトショートタンデムリピート（STR）プライマーセットとプロトコールは、プロメガ（Promega）から販売されている、CTTとFFVマルチプレックスである。
例2:DNAの不可逆的固相結合の確認
放射能標識DNA（1ng）を、水（２回蒸留水）、0.1N NaOH、または4M グアニジン緩衝液中で室温で１時間回転しながら、酸化アルミニウムまたは水酸化アルミニウムに結合させる。DNAは水またはグアニジン中で酸化アルミニウムに結合する。結合緩衝液としてNaOHまたは水酸化アルミニウムビーズを使用することにより、結合が大幅に増強される（図１）。198mgの酸化アルミニウムの結合能力を推定するために、種々の濃度のサケの精子DNAに1ngの放射能標識DNAを加える。さらに詳しくはこの方法は、アルミニウムが飽和されて放射能標識DNAの結合が阻止される点を推定する（図２）。水の結合は50ngで飽和され、グアニジンの結合は50ng〜5000ngの範囲で飽和される。水酸化ナトリウムの結合は100,000ngまで飽和されない。従ってNaOHでアルミニウムを親水性にすることは、その結合効率と総能力を大幅に増強させる。10回の連続的洗浄後に除去される放射能標識を計測することによりDNA結合の不可逆性が証明される（図３）。図３に示すように、95℃のPCR緩衝液による10回の洗浄後も、92％を超えるDNAが保持され堅く結合している。溶出した計数（６％）の大部分は、最初の４回の洗浄液中に存在しわずかに２％のみが最後の６回の洗浄液に存在する。従ってアルミニウムに結合したDNAは、遠心分離やDNAを喪失する危険無しで水性洗浄や緩衝液交換がし易い。大量の試料から選択された固相結合核酸は、所望の容量で洗浄し再懸濁することができる。例えばグアニジンを含有する３ミリリットル（ml）の試料からDNAを吸収し、リン酸またはトリス緩衝液で洗浄し、次にビーズを少量の増幅反応混合物（50μｌ）に再懸濁することができる。これらの性質は、DNA精製と増幅の連結の簡便化する法を提供する。
例3:重力流クロマトグラフィー
容量が多く濃度が低い試料からのDNA検出の感度の大きな改良は、クロマトグラフィーにより高流速でDNAを効率的に吸収するアルミニウムの能力に基づいて得られる。74〜149μｍの酸化アルミニウムビーズまたは150〜212μｍの二酸化シリカビーズ（シグマ（Sigma）、カタログNo.G1145）の重力ろ過の間に、放射能標識DNAを吸収させる（図４）。シリカとアルミニウムの量は、いずれもDNA結合のために等しい表面積を有するように調整される。DNA（50ng）は、1ml（流れる時間1.5〜２分、約0.5ml/分）または10ml（流れる時間５〜８分、約2ml/分）に希釈すると、重力ろ過の間に結合する。1ml容量の重力流クロマトグラフィーの間、アルミニウムははるかに効率的にDNAを結合する（SiO2＝６％対AlOX＝52％、いずれも4Mグアニジン結合緩衝液中）。SiO2とAlOXの両方について結合効率は、1mlのNaOH結合緩衝液により改善される（SiO2＝12.4％対AlOX＝60％）。10ml容量を使用し同じ50ngのDNA（すなわち、1ml試料より10倍低いml当たりの濃度）を使用して流速を４倍上昇させると、二酸化シリカの結合効率が２％未満に急激に低下する。これに対してアルミニウムは、総計数回収率でわずかに10％低下するのみである。さらなる実験操作は、第２または第３の高容量試料を通してクロマトグラフィーを繰り返すと、酸化アルミニウムについて最大80％の結合効率が得られることを示している。固相DNA結合についてアルミニウムはシリカよりはるかに優れており、高流速と低濃速でDNAをクロマトグラフィー捕捉することができる。この性質のために、酸化アルミニウムはプールした大量の試料からDNAを濃縮することができ、DNA検出の1ml当たりの感度を大きく上昇させる。アルミニウムのDNAに対する高結合力はまた、水、緩衝液、または他の試薬からの低レベルのDNA汚染物質の除去にも有用である。
例4:固相増幅
この核酸結合は不可逆的であるため、アルミニウムは、結合したDNAが固相上で直接増幅されるときのみ有効である。異なる増幅法との適合性を示すために、106コピーのHIV DNAとマイコバクテリウムDNAの１μｌのプラスミドプレップを同時に水中の酸化アルミニウムに結合させる。これらの結合DNA標的を次に、順にHIVで増幅し、まず35サイクルのポリメラーゼチェイン反応（PCR）を使用して増幅し、次に鎖置換増幅（SDA）によりマイコバクテリウム標的を増幅させる。図5aに示すHIV PCRのアガロースゲルの臭化エチジウム（EtBr）染色したものは優れた増幅産物を示す。HIV PCR増幅後に、アルミニウムを70％ETOHで４回洗浄し、55℃で10分乾燥し、次にマイコバクテリウム標的についてSDA増幅を行う。SDA増幅のEtBr染色アガロースゲルはまた、水性対照で観察されたものと等しいレベルの増幅産物を示す（図5b）。さらなる実験操作は、4Mグアニジンまたは0.1N NaOH結合緩衝液を使用することによりマイコバクテリウムプラスミドDNAはアルミニウムに結合し、これらの固相上で増幅が起きることを示す。
アルカリ性条件が１本鎖を産生することは一般に知られている。DNAはまた4Mグアニジン中で１本鎖である（トンプソン（Thompson）とギレスピー（Gillespie）（1987）Analytical Biochemistry 163:281−291、参照することにより本明細書の一部とする）。NaOHまたはグアニジン緩衝液中の酸化アルミニウムに結合したDNAのSDA増幅は、融解工程無しで進行する。これらのデータは、DNAがこれらの結合緩衝液中で１本鎖として結合し、１本鎖標的核酸を必要とする酸化アルミニウムによるDNA精製と等温増幅法の間の連結を提供することを確認する。
酸化アルミニウムはまたRNAの効率的結合が可能であることを示すために、4Mグアニジン結合緩衝液を使用してAIDS患者のACD血漿試料から直接HIVを酸化アルミニウムで精製する。この試料はあらかじめウイルス負荷定量的PCRにより、２×104RNAコピー/mlを有することが測定されている。アルミニウム抽出のために0.5mlの血漿を4Mグアニジンチオシアネート緩衝液で5mlに希釈したものを使用し、次に40mgの酸化アルミニウム上に重力ろ過する。図６は、rtTH逆転写酵素増幅後にEtBr染色アガロースゲル上で検出される優れたPCR産物生成を示す。4Mグアニジンプロトコールは、血漿中に存在するHIVビリオンからRNAを放出することができ、これらは高容量（5ml）重力ろ過により増幅可能な状態で酸化アルミニウム上に捕捉される。酸化アルミニウムは一般に核酸を結合する。
例5:DNAアーカイビング
不可逆的に結合した核酸と直接固相増幅を組合せると、同じDNA試料を無限回繰り返して分析することができる。この点を例示するために10μｌのACD血液を、4Mグアニジン緩衝液中でアルミニウムに結合させる。結合したDNAを次に、プロメガ（Promega）からの連続的ショートタンデムリピート（STR）マーカーを使用して５回（各30サイクル）PCR増幅を行う。増幅の順序は:1）F13B、２）FESFPS、３）VWA、４）CTTマルチプレックス、および５）FFVマルチプレックスである。最後の増幅セット後DNA試料をまとめて150サイクルのPCRにかける。図７の銀染色ゲルに示す結果は、すべての５つのPCRで増幅が起き、結合DNAのDNAアーカイビングまたは繰り返し固相アルミニウム増幅を確認している。
要約すると、DNAは酸化アルミニウム上にアーカイブされ、その結果さらなる増幅分析に利用できる。これは、同じ遺伝子の繰り返し分析、例えば異なる感染性物質を検出するための異なる遺伝子の連続的増幅、例えばヒト同定分析のための高度に鑑別能力のある拡大分析を含む。
例6:酸化アルミニウムへの核酸の不可逆的結合を促進ま たは阻止する緩衝液
198mgの酸化アルミニウムの存在下で、表１に記載の種々の物質の500μｌの水溶液に放射能標識DNA（50ng）を加える。放射能標識DNAのみの結合をより正確に測定するために、バイオスピン６（Biospein6）精製後に残存する取り込まれなかったヌクレオチドをTCA沈殿により測定する。表１に示すようにこの補正法を使用すると、4Mグアニジンまたは水酸化ナトリウムの存在下で100％の効率でDNAは酸化アルミニウムに結合する。いくつかの他の物質および／または条件は総合的にDNAの結合を阻止する。例えば表１では、これらには10％ウシ血清アルブミンまたはK2HPO4ある。結合と阻止の条件のいずれも規定されているため、特異的オリゴヌクレオチドまたはプローブを便利にかつ特異的に不可逆的に結合し、次にブロッキング緩衝液条件に変更してハイブリダイゼーションにより標的特異的捕捉をさせることが可能である。すなわち酸化アルミニウムへの核酸の結合を完全に阻害するリン酸塩または他の緩衝液は、不可逆的に結合した核酸に対するバックグランドシグナルの低いハイブリダイゼーション緩衝液の基礎を提供する。ハイブリダイズした標的は除去され、固相結合捕捉プローブは複数回再使用される。RNAが0.1N NaOH中で破壊されることは公知である。従ってこの結合緩衝液を使用してDNAのみが捕捉される。水酸化グアニジウムとナトリウム緩衝液を用いる効率的な細胞破砕と迅速な核酸結合は、血液、頬のスワブ、尿、および血漿または血清中に添加されたHIVビリオンについて有効である。しかしいくつかの感染性生物（例えば、クリプトスポリジウム・パルブム（Cryptosporidium parvum）については、効率的に細胞を破砕するために、試料を95℃で加熱しジチオスレイトール（DTT）のようなタンパク質還元剤を含めることが必要である（配列番号１〜３、表IIを参照されたい）。
例7:高流速での即時結合とPCRチューブへの酸化アルミ ニウムの取り込み
高流速でDNAを結合する酸化アルミニウムの能力は、1ml、5ml、または10mlの4Mグアニジウム緩衝液中に懸濁した放射能標識DNAの同じ総cpmを使用して、これらを測定された流速で酸化アルミニウムまたは二酸化ケイ素に通過させることにより測定される。図８に示す結果は、酸化アルミニウムが二酸化ケイ素よりはるかに優れていることを確認している。酸化アルミニウムは、流れ濃度の高容量（10ml）試料を、1ml当たり10倍高い濃度と10倍少ない容量で1mlの試料に核酸を効率的に結合する。図９の実験結果が示すようにDNA結合は即時的である。ここでは50μｌのACD抗凝固化した血液を、0.1N NaOH結合緩衝液中の酸化アルミニウムに加え、直後にまたは種々のインキュベーション時間DNAを結合させた後に、固相結合DNAからHLA DRベータ遺伝子をPCR増幅する。増幅の効率により示される結合は、即時、１分または２分の時点について同一である。これらの実験結果は、PCR増幅と直接連結される自動化核酸抽出のための非常に便利でかつ迅速なプロトコールの基礎である。このために酸化アルミニウムは、PCRを阻害しないことが証明されているケイ素または他の接着物質を介して、図10に示すようにPCRチューブに接着させられる。あるいはこれは、高処理能力のために96PCRチューブプレート中に取り込まれる。これらの代替法のいずれも、以下の工程からなるプロトコールにより簡便な核酸抽出を提供する:1）結合緩衝液を酸化アルミニウムPCRチューブに加える、２）各チューブに試料を加え、混合し、次に液体を吸引して廃棄する、３）洗浄緩衝液を繰り返し（３回）ピペッティングして洗浄し、次に緩衝液を吸引して廃棄する、４）PCR増幅マスターミックスを加える、そして５）サーマルサイクラー中で増幅する。このプロトコールのピペッティング工程は、高処理能力のためにロボットシステムを使用して容易に自動化することができる。
例8:酸化アルミニウムへの純粋RNAの結合の確認
例４は、患者血漿試料からのHIVの検出に基づき、RNAは不可逆的に酸化アルミニウムに結合し増幅可能であることを示唆した。この結果は血清中の混入しているプロウイルスDNAによる可能性がある。純粋なRNA標的を使用するRNA結合は、不可逆的結合と固相増幅を確認している。図11は、4Mグアニジウム緩衝液中で結合したpAW109純粋RNA標的の増幅と酸化アルミニウム固相上で増幅したrtPCRの結果を示す。IL−２ mRNAとクリプトスポリジウム（Cryptosporidium）dsRNAの結合と増幅は、同様にして証明される。
例9:ハイブリダイゼーションによる特異的標的捕捉のた めの不可逆的に結合した核酸の利用
検出限界の実験は、酸化アルミニウム結合DNAのPCR増幅後の検出は1000コピーを必要とし、結合RNAは103コピーを必要とすることを示す（図11）。固相プローブ捕捉と次にハイブリダイゼーションを使用することにより、RNAまたはDNAの検出感度は、100コピー未満まで大幅に改善される。所望の増幅標的に隣接する配列に相補的な20〜100塩基対長の高コピー捕捉オリゴヌクレオチドは、0.1N NaOH緩衝液中の酸化アルミニウムに不可逆的に結合する。洗浄後この捕捉ビーズを使用すると、高いバックグランドレベルの核酸を含有する試料中でも、標的にハイブリダイズする。この操作のために試料を4Mグアニジウム緩衝液で破砕し、捕捉プローブを含有する固相マトリックスの存在下で３倍希釈する。ハイブリダイゼーションを起こさせ、洗浄工程後、ハイブリダイズした標的を含有する捕捉ビーズを直接PCR増幅する。図11に示すように、これにより、10〜100コピーの標的の検出限界が得られる。
例10:高容量またはプールした試料中の低コピー標的の 捕捉
初期試料容量が多い場合でも標的配列の特異的選択について、固相プローブへのハイブリダイゼーション捕捉は効率的である。図12に示すようにAIDS患者の血漿試料からの1000コピーのHIVが、前記ハイブリダイゼーション固相捕捉法により検出可能である（血漿により5.5mlの初期容量まで希釈しても検出可能である）。希釈を最小にするために、血漿を直接、抽出用乾燥グアニジウム粉末に加える。この調整により捕捉ビーズへのハイブリダイゼーションのための最終容量は30mlとなる。さらに100μｌ容量の陽性HIV血漿を、さらに24個の陰性の100μｌの血漿試料でプールしても検出される。このようなプールすることを行う実験は、１ミリリットル当たり48HIVビリオンコピーの検出感度を確認している。さらなる方法は、30mlの水中にプールしたクリプトスポリジウム（Cryptosporidium）100コピーの検出を確認している。従ってハイブリダイゼーション捕捉ビーズプロトコールは、個々の試料についての感度とほとんど等しい感度でプールした試料をスクリーニングするのに使用することができ、これは高感度のプールした試料の試験を可能にした大幅なコスト削減を可能にするため、大きな商業的可能性を有している。
例11:いったん酸化アルミニウムに不可逆的に結合した 核酸の保存
4Mグアニジウム緩衝液または0.1N NaOH緩衝液を使用して酸化アルミニウム上に50μｌのACD血液からの核酸を結合させた。次に結合核酸を、乾燥、70％ETOH中、またはトリスEDTA緩衝液中で室温で４℃もしくは−20℃で保存した。核酸は一般にこれらのすべての条件で３ヶ月安定であり、本発明を使用するとさらに長い可能性がある（おそらく無期限）。
本発明は、酸化アルミニウムへのRNAの結合に関し、および固相結合DNAおよび／またはRNAの種々の使用に関する。本発明は、固相捕捉のために核酸に不可逆的に結合し種々の操作を直接連結する酸化アルミニウムまたは他の物質の使用法を提供し、該方法は水性緩衝液ならびに一回のおよび連続的に複数回の増幅またはハイブリダイゼーションベースの反応を使用する。さらに核酸捕捉は、混入している核酸の除去のために、または、高容量またはプールした試料の分析の検出のために、低コピー核酸を濃縮するのに有用である。酸化アルミニウムは核酸に対して充分な結合力を示し、低濃度でも高流速（例えば、5ml/分）でも核酸に結合する。従って本発明は、大容量、重力ベースのまたは高流速捕捉に有用であり、さらに広範な水性洗浄に適合する方法で核酸の捕捉に有用であり、増幅反応を妨害するかも知れないインヒビターの無い非常にきれいな核酸を生成する。
本明細書に開示されるハイブリダイゼーション反応は、ビーズや平らな表面（例えば、ブロットまたはマイクロアレイチップ）の形で捕捉された核酸への直接ハイブリダイゼーションを含む。ハイブリダイゼーションはまた、捕捉プローブ（例えば、オリゴヌクレオチド、cDNA、クローン化プラスミド、転写もしくは合成RNA、またはRNA）に不可逆的に結合して、高いバックグランドレベルの非特異的核酸を有する複雑な試料から相補的配列を選択することによる、特異的配列の特異的捕捉を含んでもよい。捕捉ビーズ法は、ポリＡメッセンジャーRNAを精製するために酸化アルミニウムに結合したポリ−Ｔオリゴヌクレオチドを使用する特異的配列捕捉に有用である。適当な捕捉オリゴヌクレオチドを使用することにより、任意の特異的核酸標的が選択的に取り出され、種々のタイプの試料から濃縮される。
また本発明と一致するのは、固相に不可逆的に結合した核酸からの、酵素認識、特異的操作または増幅である。これは、標的増幅反応（例えば、PCR、SDA、NASBA、IsoCRまたはCRCA）ならびにシグナル増幅反応（例えば、Ｑベータレプリカーゼまたは分岐鎖DNA）を含む。標準的PCRチューブの反応表面積に接着した結合物質としての酸化アルミニウムの取り込みおよび同じチューブを使用してPCRサーマルサイクリング反応を直接かつ便利に使用する迅速核酸抽出プロトコールも、本明細書で教示される。チューブまたは容器は、高処理量ロボットを使用する自動化のための基盤を提供する。
代替核酸応用のための酸化アルミニウムの利用を可能にする緩衝液系をすべて考察する。これらには、例えば、極端に硬い試料（例えばクリプトスポリジウム（Cryptosporidium））を破砕する特異的還元剤を含むグアニジウムベースの緩衝液を含む。この緩衝液では、DNAとRNAの両方が、100％に近い効率で酸化アルミニウムに効率的に結合する。別の緩衝液系は、迅速かつ経済的なDNA結合緩衝液を提供するNaOHのようなアルカリ性緩衝液に関する。この緩衝液では、RNAが破壊され、その結果DNAのみを選択的に結合する手段を提供する。さらに別の系は、酸化アルミニウムへの核酸の結合を完全に妨害する緩衝液（例えば、リン酸緩衝液）がある。この緩衝液系は、高感度で効率的なマイクロアレイ、ビーズおよびブロットハイブリダイゼーションのためのバックグランドシグナル対ノイズ比が低いハイブリダイゼーション緩衝液の基礎を提供する。
例えば酸化アルミニウムの不可逆的結合特性は、同じかまたは異なる遺伝子の連続的な繰り返し分析を提供する。これには、DNAとRNAの同時分析、またはDNAとRNAの独立した連続的分析がある。複数のプローブを結合することにより、ハイブリダイゼーション捕捉もまた特異的標的についてマルチプレックス化することができる。すなわち本発明は、ハイブリダイゼーションまたは増幅反応のいずれかにより、任意の核酸を繰り返しまたは連続的に分析するのに有用である。いったん不可逆的に結合すると、核酸は安定であり、室温で長期間保存することができる。
上記説明は多くの具体的事項を含むが、これらの具体的事項は決して本発明の範囲を限定するものではなく、その好適な実施態様を例示するのみであることを理解されたい。すなわち本発明の前記説明は、例示と説明のためである。本発明の精神と範囲を逸脱することなく、当業者は多くの変更および修飾を行って本発明を種々の用途や条件に適合させることができる。従ってこれらの変更や修飾は、正しく公平に、以下の請求の範囲と等価の全範囲内にある。すなわち本発明の範囲は本明細書に提供した例により決定されるのではなく、添付の請求の範囲およびその法的同等物により決定される。
配列表
（１）一般情報：
（ｉ）出願人：
ジョン・シー・ゲルデス（John C.Gerdes）
ジェフリー・エム・マルマロ（Jeffrey M.Marmaro）
クロストファー・エー・レール（Christopher A.Roehl）
（ii）発明の名称：核酸アーカイビング
（iii）配列の数:10
（iv）連絡住所：
（Ａ）宛先：ジュリー・エル・バーナード・ピー・シー（Julie L.Bernard,P.C.）
（Ｂ）通り:9000 イー・インスピレーション・ドライブ（9000 E.Inspiration Drive）
（Ｃ）市：パーカー（Parker）
（Ｄ）州：コロラド
（Ｅ）国：アメリカ合衆国
（Ｆ）郵便番号:80138−8535
（ｖ）コンピューターで読める形式：
（Ａ）媒体の型：ディスケット、3.5インチ
（Ｂ）コンピューター:IBM PCコンパチブル
（Ｃ）オペレーティング・システム:MS−DOS
（Ｄ）ソフトウェア：ワードパーフェクト（WordPerfect）6.0
（vi）現行出願のデータ：
（Ａ）出願番号：
（Ｂ）出願日:1998年４月16日
（Ｃ）分類：
（vii）先行出願のデータ
（Ａ）出願番号:60/046,999
（Ｂ）出願日:1997年４月16日
（viii）弁理士／代理人情報：
（Ａ）氏名：ジュリー・エル・バーナード（Julie L.Bernard）
（Ｂ）登録番号:36,450
（Ｃ）参照／整理番号:IAD−４
（ix）電話連絡先情報：
（Ａ）電話:303 841 7472
（Ｂ）ファックス:303 840 1567
（２）配列番号:1の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ:21塩基
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数:1本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号:1:
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ:20塩基
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数:1本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号:2:
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ:100塩基
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数:1本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号:3:
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ:15塩基
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数:1本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号:4:
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ:15塩基
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数:1本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号:5:
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ:40塩基
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数:1本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号:6:
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ:40塩基
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数:1本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号:7:
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ:28塩基
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数:1本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号:8:
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ:28塩基
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数:1本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号:9:
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ:100塩基
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数:1本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号:10:
Claims (12)
- 核酸のアーカイビング法であって、
ａ）水性試料中に含有される１本鎖または複数鎖の核酸を、固相マトリックスに不可逆的に結合させ、該マトリックスは、アルミニウム（Al）原子を含有する電気的陽性の材料であって試料をアルカリ性pHまたは高カオトロピック塩濃度に調整することによって親水性にされた電気的陽性の材料であることを特徴とする特異的な結合材料によって定義づけられるものであり；
ｂ）固相に結合した核酸を操作し、該操作方法は、シグ ナル増幅および標的増幅よりなる群から選択されるものであり；そして
ｃ）固相マトリックス上の結合した核酸を保存する、
ことを含んでなる上記方法。 - 保存前に、固相マトリックスへの核酸の不可逆的な結合を、大容量の重力ベースのまたは高流速の固相クロマトグラフィーによって行う、請求の範囲第１項記載の方法。
- 固相マトリックスはビーズおよび平らな表面よりなる群から選択される、請求の範囲第１項記載の方法。
- 平らな表面に結合する核酸は、ブロットまたはマイクロアレイの形である、請求の範囲第３項記載の方法。
- 試料は基本的に核酸と緩衝液を含んでなる、請求の範囲第１項記載の方法。
- 緩衝液はグアニジウムチオシアネートを基礎とする緩衝液を含んでなる、請求の範囲第５項記載の方法。
- 緩衝液はアルカリ性緩衝液を含んでなる、請求の範囲第５項記載の方法。
- アルカリ性緩衝液は水酸化ナトリウムである、請求の範囲第７項記載の方法。
- 増幅方法は、PCR、SDA、NASBA、IsoCR、CRCA、Ｑベータレプリカーゼおよび分岐鎖DNAよりなる群から選択される、請求の範囲第１項記載の方法。
- 核酸は天然に存在する、請求の範囲第１項記載の方法。
- 核酸は天然に存在しない、請求の範囲第１項記載の方法。
- 固相マトリックスは、ポリメラーゼチェイン反応標準チューブにその一部分として結合する、請求の範囲第１項記載の方法。
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