KR0148693B1

KR0148693B1 - 핵산 분리방법

Info

Publication number: KR0148693B1
Application number: KR1019900004012A
Authority: KR
Inventors: 마리아 알레이다 헨리에트; 레느 부움 빌렘; 키에비츠 팀; 프랭클린 렌스 피터
Original assignee: 에프.쥐.엠.헤르단스, 에이.쥐.제이.베르메렌; 악조 엔.브이.
Priority date: 1989-03-23
Filing date: 1990-03-22
Publication date: 1998-08-01
Also published as: AU5215390A; DE389063T1; ZA902190B; DE69031237T3; ES2085245T5; ES2085245T3; GR3025351T3; CA2012777C; JPH02289596A; JPH1072485A; EP0389063A2; EP0389063B1; CA2271603A1; JP2680462B2; ATE156830T1; EP0389063A3; AU641641B2; EP0819696A3; EP0389063B2; DK0389063T4

Abstract

내용없음.

Description

핵산 분리 방법

본 발명은 핵산-함유 출발물질로부터 핵산을 분리하는 방법 및 복합 수단, 뿐만 아니라 상기 방법에 의해 수득된 핵산을 증폭시키기 위한 테스트 키트에 관한 것이다.. 보다 상세하게는, 본 발명은 전혈액, 혈청, 연막(혈액담황층, 또는 혈액의 백혈구 분획), 요, 분변, 뇌척수액, 정자, 타액, 조직, 세포 배양물 등과 같은 핵산-함유 생물학적 물질로부터 핵산을 분리하기 위한 방법 및 키트에 관한 것이다. 상술한 생물학적 물질로부터 분리된 핵산은 또한 시료를 채취한 생물체로부터 유래되는 내인성 핵산 및 임의의 이종(비루스성, 진균류성, 세균성 또는 기생체성)핵산을 포함할 수도 있다.

전혈액, 혈청, 요 또는 분변과 같은 복합적인 출발물질로부터 핵산(NA)을 분리하는 공지의 방법들은 단백질 분해효소 존재하에 계면활성제를 사용하여 생물학적 물질을 용해시킨 후, 유기 용매, 예컨대 페놀 및/또는 클로로포름으로 수회 추출하고, 에탄올 침전시킨 다음 핵산을 투석하는 단계들을 포함한다. 이들 공지의 방법들, 예컨대, 임상물질로부터 (이중-가닥) DNA를 분리하는 것은 힘들고 시간이 소모되는 작업이다. 상기 예시한 출발물질들로부터 NA를 정제하는데 거쳐야될 단계들이 상대적으로 많을수록 각종 임상시료들을 동시에 처리하는 경우에 있어서 시료들 상호간에 NA가 전이될 위험성이 배가된다. 핵산 분리후, 핵산 증폭 방법, 예를들면 최고 감응성 폴리머라제-사슬반응[PCR, 사이키(Sakik)등, 사이언스(Science) 230, 1985, 1350]을 이용하여 또 다른 NA, 예컨대 병원체(예, 비루스 또는 세균)의 NA를 검출하고자 하는 경우에 있어서, 그릇된 양성 결과를 야기할 우려가 있는, 전술한 서로 다른 시료들간의 NA 전이 위험성 증가는 매우 심각한 문제점이다.

위와 같은 혼입 현상이 일어나기 쉬운 공지 방법의 예로서 어낼리티컬 바이오케미스트리(Analytical Biochemistry 162권, 1987, 156)에 발표된 이 방법에 따르면, 생물학적 출발물질을 산 구아니디늄 티오시아네이트-페놀-클로로포름 혼합물로 일회 추출하여 RNA를 수득한다. 상 분리후, 수성상을 추가 처리하여 4시간 이내에 유효 조건하에 RNA를 회수할 수 있다.

어낼리티컬 바이오케미스트리 162권(1987년) 463 페이지에는 조직과 세포주들로부터 DNA를 분리하는 절차가 기술되어 있고, 여기에서, 세포들은 구아니딘 염산염-함유 완충액중에 분산되고, 이어서 에탄올 침전된다. 이와같은 혼입 위험성이 큰 공지의 방법에 의해서도 분리된 DNA를 보다 더 적절하게 처리함으로써 수시간내에 유용한 NA 생성물을 분리할 수도 있다.

그러나 상술한 공지의 방법들은 복합적인 출발물질, 예컨대 전혈액과 혈청에 대해서는 성공적인 이용이 불가능하다.

따라서, 본 발명의 목적은 상술한 공지의 방법들이 갖는 결점들이 제거된 방법을 제공하는 것이다.

보다 상세하게는, 본 발명의 목적은 서로 다른 유형의 생물학적 물질들과 같은 복합적인 출발물질로부터 예기치 못하던 정도로 빠르고 간편하며 재현성있는 방식으로 분자 생물학적 반응에서 시약으로 사용될 수 있을 정도로 손상되지 않은 상태 및 높은 순도로 즉각적으로(예비처리를 하지 않고) 핵산 (즉, DNA 및/또는 RNA)을 분리하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 다른 시료들 및 사람들과 비교할 때에도 혼입 위험성이 적다는 측면에서 공지의 방법들과는 다른 방법, 즉 서로 다른 시료들간의 NA 전이 위험성을 최소한으로 줄이면서 여러 임상 시료들을 동시에 처리할 수 있도록 하며, 아울러 처리하고자 하는 시료내에 존재할 수도 있는 비루스 또는 세균에 의해 사람들이 접촉 전염될 위험성을 가장 적게하는 방법을 제공하는 것이다.

상술한 목적들이 본 발명에 의해 성취되는 바, 그에 따르면, 출발물질과 카오트로픽(chaotropic) 물질, 및 핵산 결합 고상(고체상)을 혼합하고, 이 혼합액으로부터 핵산이 결합된 고상을 분리한 후, 수득된 고상-핵산 복합제를 세정하고, 필요하다면 이어서 상기 복합체로부터 핵산을 용리시키는 것을 특징으로 하는, 핵산-함유 출발물질로부터 핵산을 분리하는 방법을 제공한다.

광범위하게는 본 발명은 식품 및 관련 제품, 백신, 및 비루스 또는 세균 감염된 우유를 비롯한 임의의 핵산-함유 출발물질들에 대하여 적용할 수 있으며, 특히 본 발명은 사용하는 출발물질이 전혈액, 혈청, 연막, 요, 분변, 뇌척수액, 정자, 타액, 조직 및 세포 배양물(예, 포유류 세포 배양물 및 세균 배양물)과 같은 핵산-함유 생물학적 물질인 방법에 이용될 수 있다. 물론, 본 발명에 따른 방법은 PCR 생성물 또는 핵산 회수목적의 또 다른 방법으로 더 정제하고자 하는 생성물과 같은 비교적 순수한 도입 물질에 있어서도 또한 적용될 수 있다. 그러나, 식물성 물질, 일부 그람-양성균 및 일부 효모 및 곰팡이와 같은 일부 핵산-함유 생물학적 물질들은 본 발명에 따른 방법에 곧 바로 투입물질로 사용될 수 없으며, 이는 그들의 특이한 세포벽 구조로 인해 카오트로픽 물질에 의해 용해되지 못하기 때문에, 따라서, 그와 같은 출발물질들은 세포들을 접근 가능한 상태로 만드는 예비 처리, 예컨대 사전 세포 용해처리를 필요로 하며, 그후 산출되는 용해물에 대하여 본 발명에 따른 방법을 수행할 수 있다.

핵산(NA)은 DNA 및 RNA 둘다의 의미하여, 이들은 임의의 가능한 결합, 즉 이중-가닥(DS) 핵산, 또는 단일-가닥(ss)핵산, 또는 이들의 조합체(부분적으로 ds 또는 ss)형태를 취할 수 있다.

본 발명에 있어서 기본이 되는 것은 핵산과 결합하는 고상, 예를들면 카오트로픽 물질의 존재하에 NA와 결합할수 있는 실리카 입자를 사용하는 것이다. 상기 실리카란 SiO₂결정체 및 다른 형태의 산화 규소, 즉 SiO2, 무정형 산화 규소 및 유리분말로부터 구성된 2원자 골격을 지칭한다. 또한, 알킬실리카, 알루미늄 실리케이트(제올라이트), -NH₂를 지닌 활성화된 실리카, 라텍스 입자, 큐벳 또는 미량역가 평판의 내벽을 형성하는 특정한 중합체 물질, 또는 예컨대 니트로셀룰로오스를 포함하는 필터 재료도 본 발명에 따른 핵산-결합 고상으로서 적합하다.

실리카 입자들을 사용하는 예가 문헌[PNAS, 76권, 1979, 615]에 발표되어 있으며그에 따르면 카오트로픽염 NaI(요오드화나트륨) 고농축 용액중의 dsDNA는 아가로스로부터 해리된 후 유리에 결합될 수 있다. 상기 문헌에는 아가로스겔로부터 DNA를 분리하는 2가지 방법이 기술되어 있으며, 이들 2가지 방법 모두에서는 제1단계로서 아가로스를 용해시키기 위한 목적으로 NaI 용액을 사용한다. 제2단계로서 한가지 방법은 아세톤을 사용하여 DNA를 침전기키는 것에 반면에, 다른 한가지 방법은 DNA를 유리 입자들에 결합시킨 후 수성 완충액내로 용출시키는 것이다. 그러나, 이러한 방법은 체액 및 기타 다른 생물학적 출발물질들과 같은 보다 복합적인 출발물질들에 있어서는 소용이 없다. 상기 문헌에는 또한 본 발명에 따른 1-단계 절차에 관하여서는 전혀 언급된 바 없다.

본 발명에 따르면, 순수하지 못한 출발물질로부터 고순도로 결합되고 이어서 용출되는 핵산을 즉시 얻기 위하여 적절하게 선택된 입자 크기를 갖는 실리카 입자들을 사용하는 방법을 제시하고 있다.

본 발명의 바람직한 태양은 주로 0.05 내지 500㎛ 범위의 실제 크기를 갖는 실리카 입자들을 사용하는 것을 특징으로 한다. 상기 주로란 용어는 80%이상, 바람직하게는 90%이상의 실리카 입자들이 앞서 정의한 범위내의 입자크기를 갖는다는 것을 의미한다. 결합된 NA를 용이하게 처리하기 위해서는 사용되는 실리카 입자들이 주로 0.1 내지 200㎛ 범위내의 입자 크기를 갖는 것이 바람직하고, 또한 사용되는 실리카 입자들이 주로 1 내지 200㎛ 범위내의 입자 크기를 갖는 방법이 가장 바람직하다. 입자들의 크기가 작을수록 실리카 입자들의 NA-결합능이 보다 높아지는 것은 사실이나, 특히 NA-풍부한 투입물질 및 비교적 긴 NA 분자를 대상을 하는 경우에 있어서 극히 작은 실리카 입자들을 사용하는 것은 형성된 NA-실리카 복합체가 더 이상 효율적으로 재분산되지 못하도록 하는 결과를 초래한다. 이는 결합된 NA를 복합체로부터 순수한 형태로 회수할 수 없다는 것을 의미한다. 인체 혈액을 투입물질로 사용하고 0.2-10㎛ 범위내의 입자 크기를 갖는 분별처리되지 않은 실리카를 사용하는 경우에 있어서 위와 같은 문제점이 자주 발생한다. 따라서, 분별 처리한 실리카를 사용함으로써 더 이상 재분산될 수 없는 응집물의 형성을 방지할 수도 있으며, 이 경우 상기 실리카의 입자 크기는 1 내지 10㎛ 범위 이내이다. 그러나 세균 배양물과 같이 세포가 풍부한 투입물질을 사용하는 경우에 있어서는, 상술한 조립 실리카 분획을 사용하여도 재분산성이 불충분한 응집물질의 형성을 방지하기가 곤란하며, 2내지 200㎛ 범위내의 입자 크기를 갖는 규조토와 같은 훨씬 더 조립의 실리카를 사용할 때 최적 결과가 얻어진다.

또 다른 바람직한 태양에 있어서, NA 결합 고상은 필터 형태이거나 또는 카오트로픽 물질을 지닌 시료가 함유되어 있는 용기(vessel)의 일부로 형성되기도 한다. 후자의 형태를 취하는 NA 결합 고상은 시료를 더 처리하고 NA를 분리하기 위한 목적의 원심분리 또는 여과 공정이 필요하지 않게 된다.

본 발명에 따르면, 실리카 입자들과 같은 상술한 핵산 결합용 고상외에도, 카오트로픽 물질의 사용을 필요로 한다. 카오트로픽 물질이란 단백질과 핵산의 2차, 3차 및/또는 4차 구조를 변경시킬 수 있으며, 최소한 일차적인 구조는 본래 상태로 유지 시킬 수 있는 임의의 물질을 의미하며, 그의 예로서는 구아니디늄 (이소)티오시나네이트 및 구아니딘 염산염을 들 수 있다. 또한, 요오드화나트룸, 요오드화칼륨. (이소)티오시안산 나트륨, 우레아 또는 이들의 조합물들로 핵산-함유 출발물질로부터 NA를 분리하기 위한 핵산 결합 고상과 병용하기에 매우 적합하다. 본 발명에 사용되는 카오트로픽 구아니디늄염으로서 구아니디늄 티오시아네이트(GusSCN)가 바람직하다.

본 발명에 따른 방법은 통상적으로 출발물질을 충분히 다량의 카오트로픽 물질 예컨대, 구아니디늄염과, 실리카 입자 등을 혼합하여 출발물질내에 존재하는 거의 모든 핵산이 해리되어 상기 실리카 입자들에 결합되게 하므로써 수행된다. 알맞은 프로토콜은, 예컨대 실리카 입자들의 현탁액을 반응 용기내에 존재하는 GuSCN 완충용액에 가하고, 이어서 시료를 가한 후 충분히 혼합하는 것이다. 그러면 세포 및 임의로 존재하는 비루스들의 용해가 일어나게 되고, 해리되는 NA가 거의 즉각적으로 실리카 입자들에 결합되게 된다. 이어서 생성된 실리카-핵산 복합체들을 상기 혼합액으로부터, 예를들면 신속한 침강처리(원심 분리) 및 상충액의 제거(예, 흡인 처리)에 의해 분리한 뒤, 복합체(예를들면, 실리카-핵산 펠릿 형태)를 예컨대 카오트로픽 구아니디늄염-함유세정 완충액으로, 예컨대 볼텍스 믹서를 사용하여 세정(재분산 또는 균질화처리)한 후, 다시 침강시킨다. 이때, 세정 완충액으로 세정한 실리카-핵산 복합체를 다시 알코올-수용액(가장 바람직하게는, 수율 손실을 축소시키기 위해서 약 70%의 에탄올 사용) 및 아세톤으로 연속적으로 세정한 후, 건조(예를들면, 가열처리)시켜 아세톤을 제거하는 것이 바람직하다. 이어서, 세정 및 건조시킨 실리카-핵산 복합체내에 존재하는 NA를 수정 용출 완충액을 사용하여 용리시킨다. 적당한 용출 완충액의 선택은 분리된 NA의 사용 목적에 따라서 공동으로 결정한다. 적당한 용출 완충액으로서는 TE 완충액, 아쿠아 비데스트(aqua bidest) 및 PCR 완충액(재료 및 방법 단락 참조)을 예로 들 수 있다. 상술한 모든 단계들은 단일 반응 용기(예, 1.5ml의 폴리프로필렌 에펜도르프관)내에서 수행하고, 정제된 NA는 비교적 작은 부피로, 예를들면 100μl 미만의 부피로 회수하는 것이 바람직하다. 이와같이 분리된 NA는 핵산-분리 효소가 없고 DNA 폴리머라제(예, Taq-DNA 폴리머라제,) DNA 제한요소, DNA 리가아제 및 역전사 효소(예, AMV역전사 효소)와 같은 상이한 효소들의 기질로서 곧 바로 이용될 수 있을 정도의 높은 순도를 갖는다.

본 발명에 따른 방법에서는, 예를들면, 충분량의 DNA를 혈장 및 세포들을 사전 분리함이 없이 50μl의 전혈액으로부터 약 45분이내에 분리하여 EP 0329822에 기술된 바와같은, 소위 NASBA법(NASBA=핵산 서열을 기초로 한 증폭) 또는 PCR 법과 같은 증폭 방법을 이용하여 NA 서열을 구명할 수 있다. 또한, 본 발명은 혈청, 분변 요 등과 같은 NA를 함유하는 각종 다른 생물학적 물질들에 대하여서도 또한 적용될 수 있다. 이러한 이유로 인해서 본 발명은 세균 및 비루스 감염 질환의 진단, 뿐만아니라 태아진단 및 유전성 종양의 소인 진단과 같은 범주에 속하는 유전자 다형성 연구에 있어서도 유용한다.

본 발명에 따른 NA 분리 방법에 있어서는 전체 공정이 단일 반응 용기내에서 수행되며 또한 공정의 제1단계에서 미정제 출발 물질로부터 해리된 NA가 이후의 모든 정제 공정중에 적어도 대부분 고상에 결합되기 때문에 혼입 위험성이 매우 적다. 단지 비루스 또는 세균에 감염되었을지도 모르는 물질을 처리하는 것으로부터 초래되는 직원들에 대한 위험성은 시료를 반응 용기내에 집어넣는 분리 공정의 제1단계로만 거의 제한된다. 이러한 제1처리에서는 존재 가능성이 있는 병원체들을 효과적으로 불활성화시킨다. 이 공정에는 특별한 주변 장치(표준 실험실 설비에 속하는 볼텍스 믹서, 12,000g 에펜도르프형 원심 분리판, 및 수조 또는 에펜도르프 가열 블록)와 전문가의 생화학적 지식이 필요치 않으므로, 이 공장은 다수의 시료들로부터 통상적으로 NA를 분리하는데, 즉 자동화에 매우 적합하다. 본 발명에 따른 방법으로 10종 이상 및 심지어 24종 이상의 상이한 시료들도 약 1시간 이내에 처리할 수 있다.

본 발명은 헥산-함유 출발물질로부터 핵산을 분리하는 방법, 뿐만아니라 복합 수단, 및 상기 방법에 의해 수득된 핵산을 증폭시키기 위한 시험키트에 관한 것이다.

하나의 태양으로서, 본 발명에 따른 복합 수단은 (a) 구아니디윰 (이소)티오시아네이트-함유 분해 완충액, (b) 주로 0.05 내지 500μm, 바람직하기로는 0.1 내지 200μm, 가장 바람직하기로는 1 내지 200μm 범위내의 입자 크기를 갖는 실리카 입자들의 수성 현탁액, (c) 구아니디늄 (이소)티오시아네이트-함유 세정 완충액, 및 필요에 따라서는 (d) 용출 완충액을 포함한다.

따라서, 본 발명에 따른 복합수단은 예컨대, 다음과 같은 4가지 성분들을 포함할 수 있다:

성분(1): 구아니디늄 (이소)티오시아세네이트 완충용액;

성분(2): 실리카 입자들의 현탁액;

성분(3): 세정 완충액; 및 (선택적으로)

성분(4): 용출 완충액.

필요에 따라 성분(1)과 (2)는 합할 수도 있으나, 그러할 경우, 저장수명이 제한된다.

에탄올 및 아세톤과 같은, 본 발명에 따른 NA 분리 방법에 사용하기에 바람직한 기타 다른 시약들도 표준 실험 준비물에 속한다.

이하에는 다양한 실시예들을 기술하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 하며, 먼저 사용하는 재료들 및 방법들에 관하여 기술하면 다음과 같다.

[재료 및 방법]

A) 조립 실리카(SC) 현탁액

0.5-10μm의 입자 크기 분포를 가지며, 입자의 80%가 1 내지 5μm 범위내지 시그마(Sigma)사제 이산화 규소(SiO2)를 사용한다.

60g의 실리카를 직경 5cm, 수성 칼럼의 높이 27.5cm인 실린더에 주입된 아쿠아 비데스트(500ml 부피 이하)중에 현탁시킨다. 실온에서 1×g 침강 처리후(25시간 동안), 70ml가 남을 때까지 상충액을 흡인 제거하였다. 아쿠아 비데스트를 500ml 이하로 가하고, 실린더를 진탕하여 입자들을 재현탁시킨다. 5시간 동안 1×g로 침강 처리한 후, 상충액이 60ml가 남을 때까지 흡인 제거한다. 32%(w/v) HCl 600μl를 가한후, 볼텍스로 처리하여 입자들을 재현탁시킨다. 현탁액을 6ml 병에 4ml 씩의 분취량을 넣고, 단단히 밀봉한 후, 오토클레이브내에서 121℃로 20분간 가열한다. 전자현미경 조사에 의해 확인되는 바와같이 이러한 침강 프로토콜을 보다 큰 실리카 입자들, 즉 입자 크기가 1μm 이상인 입자들을 집적시킨다. 또한, 산(pH 약 2)실리카 현탁액을 오토클레이브 처리하면 임의의존재가능한 핵산은 완전히 분해되는 결과가 얻어진다. 이와 같이 수득된 조립 실리카 현탁액을 이하에서는 SC로 기재하기로 한다.

[실리카 유도체 현탁액]

탄소 원자가 2내지 18개 길이의 알킬-꼬리를 갖는 메틸아크릴아미드 이산화규소를 사용하여 실리카 유도체를 얻는다. 유도체화된 실리카 입자들의 크기는 63 내지 200μm 범위내에서 다양하다. 사용하는 입자들의 기공 크기는 500Å이다. 이들 실리카 유도체들(12 MAAM C₂₀C₁₈)은 네덜란드 오스(Oss) 소재의 디오신쓰(Disoynth)로부터 입수한 것이다.

NA 분리 목적으로(실시예 Hl), 0.5g의 유도체화된 실리카 입자들을 1ml 아쿠아 비데스트중에 현탁시키고, 실리카 현탁액을 120μl의 32%(w/v) HCl로 90℃에서 30분간 예비 처리한다.

폴리스티렌 라텍스 입자들의 현탁액

두가지 종류의 폴리스티렌 라텍스 입자들을 사용한다.

그 1종류는 소듐-도데실숙시네이트 술페이트기들이 흡착되고 있으며, 424nm의 입자크기를 갖는 폴리스티렌 라텍스 VQ69(적색)이고, 다른 1종류는 보다 작은 크기(328nm)를 가지며, 술페이트기들이 외면상에 흡착되어 있지 않은 폴리스티렌 라텍스 VQ58B이다.

또한, 3종류의 친수성 글리시딜 메타크릴레이트 폴리스티렌 라텍스 입자 -AGF 27G; ACN3 (적색) 및 AGY 1515를 사용하며, 이들의 크기는 각각 933nm, 206nm 및 846nm이다. 상술한 모든 폴리스티렌 입자들은 ARLA-Arnhem 으로부터 입수한 것들이다.

[시판 필터]

다음과 같은 것들을 사용한다.

1. PVDF 임모빌론 트랜스퍼 멤브레인(소수성): 밀리포어(Millipore) 제품.

2. 니트로셀룰로오스: 쉴라이헤르 앤드 슈엘(Schleicher and Schuell) 제품 (0.2μm 참고 번호 401.396).

3. 하드본드-N 나일론 하이브리드화 멤브레인(0.45 미크론, 품목번호: 16872): 아머샴(Amersham) 제품.

B) L2 완충액

L2 완충액(0.1M 트리스.Cl pH 6.4)은 12.1g의 트리스(TRIS, 베링거)를 아쿠아 비데스트 800ml에 용해시키고, 37%(w/v) HCl 8.1ml를 가한후, 아쿠아 비데스트로 총부피를 1리터로 만들므로써 제조된다.

C) 세정액 L2

세정액 L2는 120g의 GuSCN(구아니딘 티오시아네이트, Fluka)을 L2 완충액 100ml에 용해시킴으로써 제조된다.

세정액 L2

세정액 L2는 12.45g의 KI(요오드화칼륨, Merck)를 L2 완충액 25ml에 용해시키므로써 제조하였다.

NaI 계 카오트로픽 물질을 제조하기 위해서는 11.25g의 NaI(요오드화 나트륨, Merck)를 L2 완충액 25ml에 용해시켰다. 티오시안산 나트륨계 카오트로픽 물질을 제조하기 위해서는 6.1g의 NaSCN(Baker)을 L2-완충액 25ml에 용해시켰다.

KI와 우레아(8M)를 포함한 카오트로픽 물질을 제조하기 위해서는 12.45g의 KI와 12.0g의 우레아를 L2-완충액(25ml) 중에 용해시켰다. 또한, 우레아와 NaI를 혼합하고, 우레아와 NaSCN을 혼합시킨 유사한 카오트로픽물질도 제조하였다.

D) 분해 완충액 L5

분해 완충액 L5는 100ml의 L2 완충액에 120g의 GuSCN을 용해시킨후(약 60℃의 가온 수조중에서 천천히 교반함). 40$(w/v) 덱스트란 술페이트(파마시아 LKB)용액 26.0g, 0.2M EDTA(pH 8) 22ml, 및 2.6g의 Triton X-100(Packard)를 첨가하고 나서 그 용액을 균질화시킴으로써 제조하였다. 0.2M EDTA(pH 8)용액은 500ml 물중에 37.2g EDTA(Titriplex Merck)와 4.4g NaOH(Merck)를 용해시킴으로써 제조하였다.

E) 분해 완충액 L6

분해 완충액 L6는 100ml의 L2 완충액중에 120g의 GuSCN을 용해시킨 후(60℃의 수조중에서 천천히 진탕해 줌).0.12M EDTA(pH 8) 22ml, 및 2.6g Triton X-100(Packard)를 첨가하고 나서 그 용액을 균질화시키므로써 제조하였다.

분해 완충액 L6

분해 완충액 L6는 25ml의 L2 완충액중에 12.45g KI(요오드화 칼륨, Merck)를 용해시킨 후(40℃ 수조중에서 천천히 진탕해줌). 5.5ml의 0.2 M EDTA(pH 8.0)와 0.65g의 Triton X-100(Boehringer 789704)을 첨가한 후 그 용액을 균질화함으로써 제조하였다. 동일한 방법을 NaI(요오드화 나트륨, Merck)를 갖는 분해 완충액 L6 및 NaSCN(티오시안산 나트륨, Baker)을 갖는 분해 완충액 L6에 적용한다.

KI와 우레아가 배합된 분해 완충액 L6은 25ml의 L2-완충액중에 12.45g KI(요오드화 칼륨, Merck)와 12.0g 우레아(Gibco BRL)를 용해시킨 후 5.5ml의 0.2M EDTA(pH 8.0) 및 0.65g 트리톤 X-100(베링거)를 첨가한 후 혼합물을 균질화시킴으로써 제조한다. 동일한 방법으로 NaI/우레아 및 NaSCN/우레아를 제조하였다.

F) 분해 완충액 GEDTA

GEDTA는 0.2M EDTA(pH 8) 100ml중에 120g GuSCN을 용해시킨 용액을 의미한다.

G)TE 완충액

용출에 적당한 완충액은 pH 7.5의 10mM Tris.Cl, 1mM EDTA 용액(TE 완충액)이며, 필요하다면 0.5U/μl RNAsin(Promega)을 포함할 수 있다.

H) 시험관

시험관은 에펜도르프(Eppendorff) 원심분리용 관(type 3810, 1.5ml)에 900μl 분해 완충액과 40μl의 NA 담체(라넥스 비드(bead)또는 실리카, 예, SC 또는 규조토)를 첨가한 것으로, 추출 절차를 실시하는 날에 준비한다.

I) 세척 방법

펠릿에 1ml 세척액을 첨가하고, 펠릿이 재현탁될 때까지 볼텍싱하며, 12000×g에서 15초간 원심분리한 후 흡입법으로 상충액을 버림으로써 세척한다.

J) 용출 방법

25μl 이상, 바람직하게는 40μl 이상의 용출 완충액을 첨가하고, 잠깐(2초) 볼텍싱한 후 56℃에서 10분간 항온 처리함으로써 용출시킨다.

K) 프로토콜 B

이 프로토콜은 인체 혈청, 전혈액, 설사 또는 요와 같은 복합 출발물질로부터 ds DNA를 분리하는데 적당하며 900μl GEDTA와 40μl SC를 넣은 에펜도르프 시험관을 이용한다.

1. 펠릿이 재현탁될 때까지 시험관을 진탕시킨다.

2. 50μl의 출발물질(예, 혈청, 전혈액, 변 또는 요)를 첨가하고, 그 즉시 균질화될 때까지(5-10초) 진탕한다.

3. 실온에 10분 놓았다가 5초간 볼텍싱한다.

4. 15초간 12000×g에서 원심분리하고 흡입법으로 상충액을 버린다.

5. GEDTA로 1회 펠릿을 세척한다.

6. 70% 에탄올로 2회 펠릿을 세척한다.

7. 아세톤으로 1회 펠릿을 세척한다.

8. 뚜껑을 열어 놓고 56℃에서 10분동안 펠릿을 건조시킨다.

9. RNAsin 없는 50μl TE 완충액으로 DNA를 용출시킨다.

10. 2분간 12000×g에서 원심분리한다; 상충액에 DNA가 포함되어있다.

L) 프로토콜 Y

이 프로토콜은 인체 혈청, 전혈액, 설사 또는 요와같은 복합성 출발물질로부터 NA(ds DNA, ss DNA, ds RNA 및 ss RNA의 동시 정제)를 분리 하는데 적당하며 900μl L6과 40μl SC를 포함하는 에펜도르프시험관을 이용한다.

1. 펠릿이 재현탁될 때까지 시험관을 볼텍싱한다.

2. 50μl의 출발물질(혈청, 전혈액, 변 또는 요)를 첨가하고, 균질화될 때까지(약5초) 즉시 볼텍싱한다.

3. 실온에 10분 놓았다가 5초가 진탕한다.

4. 12000×g에 15초간 원심 분리하고 흡입법으로 상충액을 버린다.

5. 펠릿을 L2로 2회 세척한다.

6. 70% 에탄올로 펠릿을 2회 세척한다.

7. 아세톤으로 펠릿을 1회 세척한다.

8. 뚜껑을 열어 놓고 56℃에서 10분동안 펠릿을 건조시킨다.

9. 선택적으로 RNAsin 존재하에서, 50μl TE 완충액으로 NA를 용출시킨다.

10. 12000×g에서 2분간 원심분리한다; 상충액에 NA가 포함되어있다.

프로토콜 Y*

이 프로토콜은 인체 혈청, 요 또는 박테리아 배양물과 같은 복합성 출발물질로부터 NA를 분리하는데 적당하다.

방법:

900μl L6와 40μl SC를 담은 에펜도르프 관을 사용했다.

1. 펠릿이 재현탁될 때까지 시험관을 진탕한다.

2. 50μl의 출발물질(혈청-플라스미드, 요-플라스미드 혼합물 또는 박테리아 하룻밤 배양물)을 첨가하고, 그 즉시 균질화될 때까지(약 5초) 볼텍싱한다.

3. 혼합하는 동안 실온에 10분 동안 방치하였다.

4. 14000×g에서 15초간 원심분리하고, 흡입법으로 상충액을 제건한다.

5. 펠릿을 L2 세척액으로 2회 세척한다.

6. 70% 에탄올로 펠릿을 2회 세척한다.

7. 아세톤으로 펠릿을 1회 세척한다.

8. 뚜껑을 열어 놓고 56℃에서 10분동안 펠릿을 건조시킨다.

9. 50μl TE 완충액(10mM Tris-1mM EDTA, pH 8.0)으로 선택적으로 RNAsin 존재하에서 NA를 용출시킨다.

10. 14000×g에서 2분간 원심분리한다; 상충액에 NA가 포함되어있다.

프로토콜 Y**

이 프로토콜은 카오트로픽 물질로서 GuSCN, 및 NA가 결합할 수 있는 필터의 존재하에 NA를 분리하는데 적당하다(참고. Materials Methods). NA 검출은 폴리머라제 사슬 반응 혼합물에 상기 필터를 직접 첨가시킴으로써, 필터로부터 NA를 미리 용출시키지 않고, 폴리머라제 사슬 반응으로 실시하였다.

방법:

900μl L6 분해 완충액과 필터(크기 1cm/1cm)을 넣은 에펜도르프관을 사용하였다.

1. 핵산 함유 용액 50㎕를 첨가하고 시험관을 잠깐 동안 볼텍싱했다.

2. 혼합하면서 10분 동안 실온에 방치하였다.

3. 상층액을 버린다.

4. L2 세척액으로 필터를 2회 세척한다.

5. 70% 에탄올로 필터를 2회 세척한다.

6. 뚜껑을 열어 놓고 56℃에서 10분 동안 필터를 건조시킨다.

7. 작은 필터 조각을 폴리머라제 사슬 반응 용액에 직접 첨가한다.

M) 프로토콜 Z

이 프로토콜은 인체 혈청, 전혈액, 설사 또는 요와 같은 복합 출발물질로부터 NA를 분리하는데 적당하며, 900μl L5와 40μl SC를 넣은 에펜도르프 시험관을 사용한다. 분리된 NA는 하이브리드화(hybridisation) 반응에 사용할 수 있으나 제한 효소의 기질로는 저당치 않다. 그러나, T4 DNA 리가아제는 활성적이다. 프로토콜 Y와비교하여 이 프로토콜 Z는 NA 수율을 증기시킨다.

1. 펠릿이 재현탁될 때까지 시험관을 볼텍싱한다.

2. 50μl의 출발물질(혈청, 전혈액, 변 또는 요)를 첨가하고, 그 즉시 균질화될 때까지(5초) 진탕한다.

3. 실온에 10분 놓았다가 5초가 볼텍싱한다.

4. 12000×g에서 15초간 원심 분리하고 흡입법으로 상충액을 제거한다.

5. 펠릿을 L2로 2회 세척한다.

6. 70% 에탄올로 펠릿을 2회 세척한다.

7. 아세톤으로 펠릿을 1회 세척한다.

8. 뚜껑을 열어 놓고 56℃에서 10분동안 펠릿을 건조시킨다.

9. 50μl TE 완충액으로, 선택적으로 RNAsin 존재하에 NA를 용출시킨다.

10. 12000×g에서 2분동안 원심 분리한다; 상충액에 NA가 포함되어 있다.

N) 출발 물질

본 실시예는 출발물질에 따라 하기의 섹션(특히, 섹션 A-D)으로 분류한다:

섹션 A: 인체 혈청

섹션 B: 인체 전혈액

섹션 C: 인체 요

상기의 섹션 A, B와 C는 특히 ds DNA와 ss RNA 둘다를 순수 형태로 분리한 수 있음을 나타내기 위한 것이다.

섹션 D: 인체 변

섹션 D는 무엇보다도 ds RNA가 분리될 수 있다는 것을 나타낸 것이다.

섹션 E 일본쇄 DNA

이 섹션 E는 본 발명이 ss DNA를 분리하는데 사용될 수 있음을 나타내는 실험을 포함한다.

섹션 F: 규조토

이 섹션 F는 규조토가 본 발명에 사용되는 실리카 입자로서 매우 유용함을 나타내고 있다. 또한, 본 발명이 여러 그람-음성 박테리아로부터 NA를 정제할 수 있음을 나타내고 있다.

섹션 G는 여러 가지 카오트로픽 물질을 사용하여 박테리아 세포로부터 NA를 정제할 수 있음을 나타내고 있다.

섹션 H와 I는 대체 고상물질을 이용하여 DNA를 분리하는 것을 나타낸다.

양은 언제나 50μl를 사용한다. 섹션 B와 F에 사용되는 혈액은 항상 응고를 방지하기 위한 EDTA 존재하에 채취된 신선한 혈액이(VT-574 TKZ형의 수집관인 테루코 엔.브이.(벨기에 루베인 소재)의 Venoject 시스템 사용). 다른 섹션에 사용되는 출발물질(혈청, 요 및 변)은 냉동시켰다. 실시예 A1, A2, A3, B1, B2, B5, B7 및 F1에서의 혈청이나 혈액은 동일한 점제로부터 수득한 것이다.

O) 부가 방법

겔-전기 영동 실험을 위하여, 용출된 NA양 일부를 에이지와 보스트(Aaij and Borst, Biochim, Biophys, Acta 269, 1972, 192)에 의해 기술된 완충계중에 1㏊/ml 에티듐 브로마이드를 함유한 중성 아가로스-겔상에 로딩(loading)했다. 겔을 UV 투광기하에서 촬영하였다.

몇몇 시험에서는, 공지된 양의 정제 DNA(투입 DNA)를 임상용 시료에 첨가했다. 이 경우 추출 효율 100%에 해당하는 투입 DNA의 양을 동일한 겔에 로딩했다.

박테리아 플라스미드 DNA는 이쉬-호로비츠 및 버크(Nucleic Acids Res. 9. 1981. 2989)에 의해 기술된 바대로 에스케리키아 콜리(Escherichia coli) HB 101로부터 정제한 후, 세파로즈 CL 2B(Pharmacia, Inc)로 칼럼크로마토그래피한 다음, 에탄올로 침전시켰다. 박테리아 플라스미드 DNA는 비른보임과 돌리(Maniatis, T. 등, Molecular Cloning, CSH, New York)에 의해 기술된 바대로 이. 콜리 JM 101(J. Messing, Rec. DNA Techn. Bull. 2:43-48(1979))로부터 정제했다.

pCMV-E는 벡터 pHC624내에 클로닝된 0.4kb의 인체 시토메가로 비루스 DNA 단편물을 포함하며(보로스, Gene 30, 1984, 257): pEBV-10은 동일한 벡터내에 클로팅된 0.9kb의 엡스타인 바르 비루스(Epstein Barr virus) DNA 단편물을 포함한다. 풀린 환상(CII) 분자가 풍부한 플라스미드르 제조하기 위하여, pEBV-10 DNa(2.9kb)를 DNAse I로 처리했다. 성분 II 분자는 3.2kb의 풀린 환상 DNA 분자로서 비리온(Virion)내에 존재하는 B형 간염 비루스 DNA를 정제하는 방법의 모델로서 제공한다.

pGem3p24는 1.45kb의 HIV 서열을 포함하며 그 구조는 이하 기술하는 바와 같다.

HIV HxB2 DNA 서열을 몇몇 저자에 의해 개시된 바 있다(J. Virol. 61, 633-637(1987): Nature 326, 711-713(1987); Aids Res. Hum. Retrovirus 3, 41-55(1987); Aids Res. Hum. Retrovirus 3, 33-39(1987) 및 Science 237, 888-893(1987)).

HIV HxB2 DNA를 원서열 HIV HxB2 서열의 1189와 2613 부위를 FokI로 부분 절단한 것이다. 이 뉴클레오티드의 번호는 유전자 뱅크의 명명에 따른 것이다.

이 단편의 FolI 부위는 클레노우 DNA 폴리머라제(Maniatis, 상기 참조)를 사용하여 평활 밀단화하고 플라스미드 pUC-19의 폴리링커 SmaI-부위에 클로닝시켰다(Maniatis, 상기 참조). 산출되는 HIV HxB2 DNA 단편을 운반하는 플라스미드를 pUC 19-p24n로 명명하였다.

플라스미드 pGem3p24를 수득하기 위하여, pUC19-p24의 EcoRI-Bam HI 단편 1450bp를 EcoRI-Bam HI으로 절단된 벡터 pGem3(2867bp: Promega Corporation, 미국 매디슨 소재)에 클로닝시켰다.

PCR 법에 사용된 프라이머는 올리고 합성기기(Applied Biosystem제공)로 합성하였다. 프라이머 ES47(25mer) 및 ES75 (47mer) 의 뉴클레오티드 서열은 다음과 같다.

대부분의 RNA 분리 실험에 있어서 (실시예 A3, B5, B6, B7 C2, D1, E1, F1 및 F2). 정제 과정중 RNA 분해를 방지하기 위해 용출 완충액중에 RNAsin을 임의로 사용하는 점이외에는 특별히 주의할 점은 없다. 임상시료를 시험관에 첨가하는 동안만은 장갑을 끼며; 시약 제조시 RNAse 억제제는 사용하지 않았으며; 멸균 처리되지 않은 에펜도르프 시험관과 피펫 팁(tip)을 사용하였다. 여러 실시예들중에서도, 실시예 F1과 F2는 용출시 RNAsin이 엄격하게 필요하지 않은 것으로 나타났다.

사용하는 효소는 시판용이며 제조업자의 설명서를 따라 사용했다. RNAse A, T4 리가아제 및 AMV 역전사 효소 뿐만아니라 모든 제한 효소는 베링거(맨하임) 제품이며, Tag-DNA 폴리머라제는 세투스 인코오포레이티드 제품이다. 폴리머라제 사슬 반응(PCR)은 페르킨 엘머 세투스 DNA-열순환기(Perkin Elmer Cetus DNA-thermal cycler)로 실시한다.

여러 가지 용도들에 있어서, 본 발명의 방법에 사용되는 시약, 특히 NA 담체(이 경우, 실리카 입자)와 카오트로픽 물질을 함유하는 분해 및 세척 완충액은 핵산(예, NA를 함유하는 박테리아 또는 비루스)에 의해 오염되지 않아야 한다는 점이 중요하다. 따라서, NA 담체는 121℃에서 20분동안 오토클레이브내에서 가열시켜야 한다. 그러나, 이 방법은 GuSCN-함유 분해 및 세척 완충액(GEDTA. L5, L6 및 L2)의 경우, 활성의 소실 가능성 및 환경에 미치는 위험성 때문에 유용하지 않다. 핵산이 없는(가능한 한도까지) 상기 시약을 제조하기 위하여, 본 발명에 따라 실리카 입자의 칼럼을 통해 통과시킨다. GuSCN-함유 완충액의 분해 특성과 카오트로픽 물질 GuSCN의 존재하에 NA가 결합되는 실리카의 특성 때문에 상기 방법은 NA가 없는 완충액을 산출한다. 칼럼 자체는 한시간 이상 동안 500℃이상의 온도로 가열함으로써 핵산이 없도록 할 수 있다.

P) DNA 유형

CI : 공유 결합된 폐환상 DNA(플라스미드)

CII : 풀린[(nick)을 지닌] 환상 DNA(플라스미드)

CIII : 선형 DNA(선형 플라스미드)

LMW : 저분자량 DNA(0.5kb); pHC 624의 Hpa II 절단물, 471bp, 404bp, 242bp(2 단편물), 190bp, 147bp, 110bp, 67bp의 단편물 및 미정된 길이의 소단편물.

MMW: 중간 분자량 DNA(0.5-29kb); λ파지 DNA의 Hind III 절단물, 23kb, 9.4kb, 6.7kb, 4.4kb, 2.3kb, 2.0kb 및 0.56kb의 단편물.

HMW: 고분자량 DNA(29kb).

SS DNA: M13mp9 파지 일본쇄 DNA(베링거).

섹션 A: 인체 혈청으로부터 DNA/RNA 정제

인체 혈청내에는 NA가 예컨대, 비루스 또는 박테리아 내에 존재할 수 있다. 이 유기체는 유리 형태 및 면역 복합체에 결합된 형태로 나타낼 수 있다. 그러나, 이 NA의 양은 대개 매우 소량이어서, 에티듐 브로마이드/NA 복합체의 아가로스 겔 전기영동과 UV 조사에 의한 검출이 불가능하다. 인체 혈청 유래의 NDA를 정제할 수 있음을 보여주기 위하여, 혈청에 정제된 DNA의 마이크로그램양을 첨가한 후, DNA를 프로토콜 B(실시예 A1과 A2)에 따라 분리하였다. 인체 혈청으로부터 DNA와 RNA를 동시에 정제할 수 있음을 보여주기 위하여, 배양한 포유류 세포나 박테리아(작은 플라스미드 운반)를 혈청에 넣은 후, 프로토콜 Y(실시예 A3)에 따라 NA를 분리했다. 마지막으로, 프로토콜 Y에 의해 인체 혈청에 존재하는 RNA가 HIV(인체 면역결핍 비루스)로부터 정제될 수 있으며 PCR 방법으로 검출될 수 있음을 실시예 A4에서 제시하고 있다. 실시예 A5는 프로토콜 Y*에 의해, 핵산 결합 고상으로서 실리카를 병용한 여러 카로트로픽 물질을 사용하여 인체 혈청중의 DNA를 정제할 수 있음을 타나내고 있다.

실시예 A1: 인체 혈청으로부터 DNA 정제

인체 혈청(500μl)을 공지된 양의 정제 DNA[100μl LMW(45μg), 20μl MMW(20μg), 40μl CI/II(20μg)]와 혼합하고 66μl의 시료 10개를 프로토콜 B에 의한 10개의 DNA 추출물에 대한 투입 물질로 사용한다. 시험관에 존재하는 SC(조립 실리카 현탁액)의 양은 이 실험에서 2.5 내지 40μl로 다양했다. 추출을 2회 실시하였으며 각 시료로부터 용출된 DNA의 절반(30μl)은 1% 아가로스 겔을 통해 전기 영동시켰다. 비교군으로서, 투입 DNA의 1/2양을 동일한 겔상의 대조군 레인에 로딩하였다.

둘다 선형인 일본쇄 DNA (23kb 내지 약 60bp의 범위), 공유 결합 폐쇄 환상 DNA(CI)와 풀린 환상 DNA(CII)는 SC 양이 10μl가 넘는 경우 효과적으로 분리된다. 가장 큰 ,MMW 단편(약 23kb)의 수율은 소 단편에 비해 비교적 낮았는데, 이것은 다른 실험을 통해 감안해 볼 때 고 분자량의 단편이 절단된 것에 기인하는 것일 수 있다.

대조군 레인은 추출 효능 100%에서 관찰될 수 있는 LMW, CII/CI 및 MMW DNA의 양을 각각 나타내고 있다. 전술한 바와 같이, CII가 풍부한(DNAse I-처리) 3kb 플라스미드(pEBV-10)를 투입 물질로 사용하였다.

실시예 A2: 제한 효소와 T4 DNA 리가아제에 대해 우수한 기질인 인체 혈청으로부터 분리한 DNA

실시예 A1에서 얻은 정제 DNA체제를 12개의 인체 혈청 시료 50μl에 각각 첨가했다. 이 12개의 혼합물로부터 DNA를 프로토콜 B에 따라 분리하였으며; 50μl TE로 용출시켰다. 용출된 DNA의 절반은 3가지 제한효소, 즉, EcoRI, BamHI 및 BglII(이것은 각각 저염, 중염, 및 고염 완충액에서 활성적임)중 어느 하나로 처리(2회 반복)하거나; T4 DNA 리가아제로 처리하거나, 또는 처리하지 않았다. 이 DNA 시료를 1% 아가로스 겔을 통해 전기 영동시키고 UV 조사로 가시화하였다.

T4 리가아제 처리(37℃에서 1시간 동안 30μl 반응액 중에 첨가된 T4 리아가제 3유니트로 처리) 결과로 DNA 단편들의 분자량이 변화하였으며 이것은 인체 혈청으로부터 분리된 DNA가 엑소뉴클레아제성 분해 작용에 크게 영향 받지 않음을 나타낸다.

정제 플라스미드(pCMV-E; 3.3μg; 1.5μl)를 첨가한 8개 혈청 시료에 대한 시험 결과, EcoRI, BamHI 및 BglII 분해시 이들 제한 효소가 모두 상기 플라스미드를 선형화시키는 것으로 나타났다. 모든 제한 효소의 항온 처리는 30μl의 반응액중에 9유니트의 효소를 첨가하여 37℃, 1시간 동안 처리하므로써 실시하였다.

실시예 A3: 인체 혈청으로부터 DNA와 ssRNA의 동시 분리

인체 혈청 중에는 에티듐-브로마이드 염색 겔의 UV조사로도 검출할 수 없는 극소량의 RNA가 존재하기 때문에(예, 비루스, 박테리아, 또는 세포내 존재), 이종 RNA 원을 인체 혈청 시료에 첨가했다. 이종 RNA원으로서 포유류 세포나 박테리아를 사용했다. 프로토콜 Y에 따라 시료로부터 NA를 분리하고 RNAse A의 존재(용출 완충액 1μl 당 40ng) 또는 부재하에 1μl 당 0.5 U RNAsin이 첨가된 50μl TE로 용출시켰다. 이어서, 1% 아가로스 겔을 통해 전기 영동시킨 결과 RNA와 DNA가 검출된다는 것이 밝혀졌다. 첨가된 포유류 세포는 50μl 혈청 시료당 5×10⁵개의 쥐 10B 세포(Boom et al., J. Gen. Virol. 69, 1988, 1179)인 반면, 첨가된 박테리아는 50μl 혈청 시료당 플라스미드 pCMV-E를 함유하는 이. 콜리 균주 HB101의 하룻밤 배양물 100μl의 세포 펠릿이었다.

실시예 A4: 인체 혈청으로부터 분리한 인체 면역 결핍 비루스 RNA의 검출용 폴리머라제 사슬 반응

프포토콜 Y에 따라 2명의 인체 혈청 시료(환자 F와 H) 각각 50μl로부터 NA(75μl)를 분리하였다. 환자 F의 혈청은 다량(2700pg/ml)의 HIV 황을 함유하지만, HIV 항체와의 반응성은 음성이었고 (Abbott Lboratories의 HIV 항체 ELISA 법에 따름). 환자 H의 혈청은 두 시험 모두에 대해서 음성이었다.

분리된 NA(43μl)의 일부를 37℃에서 90분동안 RNAse-유리 DNAse (Boehringer; IU DNAse/μl)로 처리했다. 이것을 에탄올 침전과 68℃에서 15분동안 열 불활성화 후, 얻어지는 RNA를 15μl TE 완충액 중에 현탁시켰다. 이 RNA 제조물 5μl부를 HIV 특이성 프라이머 존재하에 0.4U/μl AMV 역전사 효소로 처리(42℃에서 30분 동안, 반응 부피 20μl)하거나 또는 처리하지 않았다. 그후 dNTP를 함유하는 1.25×농축 PCR 완충액 80μl를 첨가하여 반응 부피를 100μl로 채우고, 여기에 1U의 Taq-DNA 폴리머라제를 첨가한 뒤, 증폭을 개시했다(1 사이클은 95℃에서 1분, 55℃에서 1분, 72℃에서 2분으로 구성된). 20, 25, 30 및 35 사이클에서 반응 혼합물로부터 10μl를 취하여, 2% 아가로스 겔에 로딩했다. 예상되는 330bp의 HIV 증폭 단편물은 사전에 역전사 효소로 처리했던 환자 F의 RNA에 대한 25사이클 반응처리 이후에 이미 관찰되었으며, 이 관찰로부터 HIV RNA가 그 환자의 혈청에 존재함을 알 수 있다.

실시예 A5: 여러 가지 카오트로픽 물질을 이용한 DNA의 정제

인체 혈청 시료 50μl 10개와, CI 및 CII형(방법 단락 참조)을 포함하는 정제된 pGem3p24 DNA 10μg을 각각 혼합하였다. 이런 10개의 플라스미드/혈청 혼합물을 프로토콜 Y*에 따른 추출법에 투입 물질로 사용하였다. 사용된 카오트로픽 물질의 농도는 표 A5.1 에 제시하였다.

추출 이후, 각 시료로부터 용출된 DNA의 25%를 0.8% 아가로스 겔로 분석하였다. 플라스미드 DNA 회수율을 정량하기 위하여, 투입 DNA를 직접 동일 겔에 로딩했다.

전기 영동 이후, 캡을 UV 조사하에 촬영하고 DNA 회수 효율을 플라스미드 밴드의 강도를 근거로 가시적으로 판단하였다(표 A5.1 참조)

이와 유사한 실험을 카오트로픽 물질로서 NaI 와 NaSCN을 사용하여 실시하였다(이하 시료 설명 참조).

주: 표1에 제시한 카오트로픽 물질을 사용하여 전술한 바와 같이 제조한 10개의 검측 시료를 분석했다.

-: 회수 안됨 ±: 약간 회수

+: 육간관찰가능한 정도로 회수 ++: 다량회수

표 1에 요약한 결과는 8M우레아와 3M KI, 3M NaI 또는 3M NaSCN을 함께 카오트포픽 물질로서 사용한 경우 공유 결합 폐쇄 환상(CI) 및 풀린 환상(CII)의 pGem3p24 DNA를 효과적으로 분리할 수 있다는 것을 나타내고 있다. CII의 수율은 CI에 비해 비교적 높게 나타났다.

섹션 B: 인체 전혈액으로부터 DNA/RNA 정제

1ml의 인체 혈액은, 무핵성으로 혈액의 NA 양에 영향을 미치지 않는 약 5×10⁹의 적혈구를 포함한다. 혈액의 NA 양은 대부분 백혈구 세포(약 4 내지 10×10⁶/ml)로 결정된다. 이 세포들은 다량의 단백질(약 70mg/ml 혈액)을 함유하는 수성 매질(혈장)중에 매리되어 있다. 따라서, 전혈액은 NA 정제에 있어서 극히 순수하지 않은 원료이다. 그럼에도 불구하고, 섹션 B의 실시예는 NA가 프로토콜 B와 Y에 의해 전혈액으로 분리될 수 있음을 보여주고 있다.

실시예 B1: 인체 전혈액으로부터 DNA의 분리

인체 혈액(500μl)을 공지된 양의 정제 DNA 즉, 100μl의 LMW(45μg), 80μl의 CI/II(40μg)와 혼합하고 68μl의 10개의 시표를 프로토콜 B에 따라 10개의 DNA 추출물에 대한 투입 물질로서 사용하였다. 이 실험에서, 시험관에 존재하는 SC(조립 실리카 현탁액)의 양은 2.5내지 40μl로 다양하다. 2회 추출하고 각 시료부터 용출된 DNA의 절반(30μl)을 1% 아가로스 겔을 통해 전기 영동시켰다. 비교하기 위하여, 투입 DNA의 1/2 양을 동일한 겔에 로딩시켰다.

10μl이상의 SC를 사용하는 경우 인체 전혈액으로부터 선형인 이본쇄 DNA 및 공유 결합 폐쇄 환상(CI) 형태와 풀린 환상(CII) DNA 형태의 이본쇄 DNA가 모두 효과적으로 분리되었다. 전혈액으로부터 회수한 DNA의 양은 약 10μl 이하의 SC 양에 비례했다. 이보다 높은 양은 포화성인 것으로 나타났다.

실시예 B2: 제한 효소와 T4 DNA 리아가제에 대해 우수한 기절인 인체 전혈액으로부터 분리한 DNA

정제된 DNA 제조물을 12명의 인체 혈액 시료 50μl에 첨가했다. 프로토콜 B에 따라 상기 12개의 혼합물로부터 DNA를 분리하고; 50μl TE로 용출시켰다. 용출된 DNA의 절반은 3가지 제한 효소, 즉, EcoRI, BamHI 및 BglII(이들은 각각 저염, 중염 및 고염 완충액에서 활성적임)중 어느 하나로 처리하거나, 또는 T4 DNA 리아가제로 처리하거나, 처리하지 않았다. 이 DNA 시료를 1% 아가로스 겔을 통해 전기 영동시키고 UV 조사로 가시화하였다.

T4 리아가제 처리(37℃에서 1시간, 30μl 반응 부피중에서 T4 리아가제 3유니트로 처리) 결과, DNA 단편의 고분자량으로의 이동이 나타났으며, 이것은 인체 혈액에서 분리된 DNA가 엑소뉴클레아제 분해 작용에 의해 크게 영향을 받지 않았다는 것을 나타내는 것이다.

정제된 플라스미드(pCMV-E; 3.3μg; 1.5μl)를 첨가한 8가지 혈액 시료에 대한 결과는 EcoRI, BamHI 및 BglII의 분해물에 있어서 모든 제한 효소들이 상기 플라스미드를 선형화시키는 것을 보여준다. 제한 효소의 항온처리는 모두 30μl 반응액 중에 9유니트의 효소를 첨가하여 37℃에서 1시간 동안 실시하였다.

실시예 B3: 10종의 혈액시료로부터 DMA의 분리

이 실시예에는, 혈액 은행에서 무작위적으로 취한 10종의 인체 혈액 시료를 출발물질로서 사용한다. 이들 각 시료는 백혈구 세포(WBC)의 수는 밝혀져있다. DNA는 프로토콜 B에 따라 50μl의 시료로부터 정제하고, 75μl의 TE로 용출시켰다. 분리된 DNA중 1/3은 1%의 아가로스겔에 직접 첨가하고 나머지 2/3(2μl)은 PCR에 사용하였다.

동일 시료를 시료 각 50μl에 3μl의 LMW-DNA(6μg)를 첨가한 후 동일한 DNA 분리 절차로 처리하였다. 이 경우에도 용출물(75μl)중 25μl는 겔에 직접 로딩하고; 나머지 용출물 중 25μl는 우선 T4 DNA 리아가제(30μl의 반응 부피중의 2유니트를 37℃에서 1시간 동안 처리)로 처리한 후 동일 겔에 주입하였다.

혈액시료 1-10중에 백혈구 세포(WBC) 함량은 다음과 같다.

실시예 B4: 인체 백혈구 세포중의 인체 베타-글로빈 유전자의 검출을 위한 폴리머라제 사슬 반응

프로토콜 B에 따라 인체 전혈액으로부터 분리한 DNA가 Taq-DNA 폴리머라제의 우수한 기질임을 확인하게 위해서, 실시예 B3에 따라 10종의 혈액시료로부터 분리된 DNA 2μl를, 베타-글로빈 특이적인 프라이머를 사용하여 PCR 처리하였다. PCR은 32사이클로 실시하였고, 각 사이클은 94℃에서 1분간, 이어서 65℃에서 3분간으로 이루어진다. 증폭체 일부(50%)를 2% 아가로스 겔을 통해 전기 영동시켰다. 120bp 증폭체와 프라이머 밴드를 확인할 수 있었다.

실시예 B5 인체 혈액으로부터 DNA와 ssRNA의 동시 정제(재현성)

DNA 및 RNA가 재현방식으로 인체 혈액으로부터 정제 가능함을 확인 하기 위해서, 한 사람으로부터 각 50μl씩 채취한 6개의 혈액 시료를 프로토콜 Y에 따라 처리하고, NA를 RNAsin(0.5 유니트/μl)을 함유한 75μl의 TE중에서 용출시켰다. 용출물중의 25μl부를 중성의 1% 아가로스 겔에 첨가하여 전기 영동시켰다. 그 결과, DNA 및 RNA 검출되는 것으로 나타났다.

실시예 B6: 인체 혈액으로부터 DNA와 ssRNA의 동시 정제(20종의 시료)

10명의 사람으로부터 채취한 50μl의 혈액 시료(실시예 B3 참조)를 프로토콜 Y에 따라 처리하고, NA를 0.5 유니트/㎕의 RNAsin을 함유한 40㎕의 TE로 용출시켰다. 용출물중 30㎕를 중성의 1% 아가로스 겔을 통해 전기 영동시켰다. 그 결과, DNA 및 RNA가 검출되는 것을 나타났다.

실시예 B7: 인체 혈액으로부터 DNA와 ssRNA의 동시 정제

인체 혈액시료에 이종 RNA원을 첨가하였다. 포유 동물 세포 또는 박테리아를 이종 RNA 원으로서 사용하였다. 프로토콜 Y에 따라 시료로부터 NA를 분리하고 RNAssA의 부재 또는 존재(용출 완충액 1μl 당 40ng)하에 50μl의 TE+0.5 유니트/μl의 RNAsin으로 용출시켰다. 혈액시료 50μl당 5×10개의 쥐 10B 세포[Boom등, J. Gen, Virol. 69. 1988, 1179]를 포유동물 세포로서 첨가하고, 혈액 시료 50μl당 플라스미드 pCMV-E를 함유하는 이. 콜리 균주 HB 101의 하룻밤 배양물 100μl의 세포 펠릿을 박테리아로서 첨가하였다.

그 결과, 포유 동물 ssRNA(18S 및 28S 리보솜 RNA)와 박테리아 ssRNA(16S 및 23S 리보솜 RNA)가 인체 전혈액으로부터 정제 가능한 것으로 나타났다.

또한, 게놈성 DNA와 플라스미드(I 형)DNA도 효율적으로 회수되었다.

섹션 C; 인뇨로부터 DNA/RNA의 정제

인뇨중에 NA는 예컨대 비루스 또는 박테리아 및 요로의 세포중에 존재 할 수 있다. 그 분량은 통상적으로 에티듐 브로마이드/NA 복합체의 아가로스 겔 전기 영동 및 UV 조사를 통한 검출이 불가능할 정도로 적다. DNA가 인뇨로부터 정제 가능함을 확인하기 위해서, 정제 DNA 몇 ㎍을 요에 첨가한후, 연속적으로 DNA를 프로토콜 B에 따라 분리하였다(실시예 C1). DNA와 RNA가 인뇨로부터 동시 정제 가능함을 확인하기 위해서, 배양 박테리아(작은 플라스미드 함유)를 요에 첨가한 후, 프로토콜 Y에 따라 NA를 분리하였다(실시예 C2).

실시예 C3은 핵산 결합고상으로서 실리카와 함께 GuSCN 대신에 KI, NaI 및 NaSCN과 같은 대안적인 카오트로픽 물질을 사용함으로써 프로토콜 Y에 따라 인뇨로부터 DNA를 정제할 수 있음을 나타낸다.

실시예 C1: 인뇨로부터 DNA의 정제

다른 혼탁도를 가진 무작위적으로 채택된 10종의 인뇨 시료 50μl에 3μl의 LMW DNA(6㎍)를 첨가하였다(시료 4, 5, 6 및 7은 투명하고, 시료 1, 2, 3 및 8은 약간 혼탁했으며, 시료 9 및 10은 매우 혼탁하였다). 프로토콜 B에 따라 DNA를 분리하고 75μl의 TE 완충액으로 용출시켰다. 각 용출액중 1/3을 1% 아가로스겔에 로딩하였다. 나머지 용출액중 25μl를 1.8U의 T4 DNA 리가아제로 처리(반응 부피 30μl중에서, 37℃에서 1시간 동안 처리)한 후 동일 겔에 로딩하였다. 마커 레인은 각각 LMW DNA 와 MMW DNA를 함유한다. 마커 레인중의 LMW DNA의 분량(2㎍)은 100%의 추출 효율로 관찰되는 분량을 나타낸다.

그 결과, DNA는 프로토콜 B에 의해 인뇨로부터 효율적으로 정제 가능하여 T4 DNA 리가아제의 우수한 기질인 것으로 나타났다.

요 시료 10에서 분리된 LMW DNA는 명확하게 분해되었다. 그러나, 본 시험에서 사용한 것과 같은 순수 DNA는 요 시료에 뉴클레아제가 풍부한 경우 분해되는 것으로 예상되었다. 따라서, 분해는 정제중 보다는 요/DNA 혼합물의 분해가 먼저 일어나가 쉽다. 다음 실시예(C2)는 세포 중에 존재하는 DNA 와 ssRNA(순수하지 않은 것)조차도 요시료 10으로부터 효율적으로 회수 가능함을 나타낸다.

실시예 C2: 인뇨로부터 DNA와 ssRNA의 동시 정제

본 시험에서는, 실시예 C1에서 사용한 것과 동일한 10종의 요시료를 2.4kb 플라스미드(pCMV-E)를 함유하는 박테리아와 혼합하였다. 프로토콜 YD에 따라 상기 혼합물들로부터 NA를 분리하고 0.5 유니트/μl의 RNAsin을 함유하는 75μl의 TE 완충액으로 용출시켰다. 용출물중의 1/3은 1% 아가로스겔을 통해 전기 영동시켰다. 나머지 용출물중 25μl는 pCMV-E를 선형화시키는 10U의 제한효소 EcoRI로 처리하였다(30μl의 반응 부피중에서, 37℃에서 1시간 동안 처리). 이 처리 공정은 40㎍/μl의 RNAsE A의 존재하에 실시하였다. 전기 영동 결과, 23S 및 16S 리보솜 RNA는 물론 공유 결합 폐쇄 환상(CI) 및 선형(CIII)의 플라스미드 DNA가 나타났다.

실시예 C3: 다른 카오트로픽 물질에 대한 DNA 정제

인뇨(50μl)를 400μl의 카오트로픽 물질, 용균 완충액 L6 및 1㎍의 pGem3p24 DNA와 혼합하였다. 이 현탁액을 혼합하고 프로토콜 Y에 따라 DNA의 정제를 위해 500μl의 카오프로픽 물질(표 3참조) 및 40μl의 SiO에 첨가하였다. 요로부터 분리된 DNA의 분량은 아가로스 겔 전기 영동법을 이용하여 분석하였다. DNA 회수 효율은 실시예 A5에서 설명한 바와같이 측정하였으며, 그 결과는 표 C3.1에 요약한다.

표 3은 DNA 밴드에 대한 수율이 CI-형 및 CII-형 플라스미드 DNA가 동일함을 나타낸다.

실시예 D1:인분으로부터 로타비루스 dsRNA의 정제

레오비르다에(Reovirdae)과 비루스의 구성원들은 이본쇄 RNA로 구성되는 게놈을 함유한다. 이 과에 속하는 주요 병균원으로는 각종 설사병을 발병시킨 후에 분변시료중에 다량으로 존재하는 로바비루스를 들 수 있다. 로타비루스 게놈은 프로토콜 B에 따라 분변의 상층액으로부터 분리할 수 있는 11개의 dsRNA 단편[Hishino의 문헌(J. Clin. Microbiol. 21, 1985, 425)참조]으로 구성된다. 설사변 시료를 12000×g로 2분간 원심분리하여 수득한 상층액 100μl를 로타비루스 분리에 사용하였다.

로타비루스 감염이 판명된(웰컴 로타비루스 라텍스 시험법 및 칼레스타드 패쓰파인더 로타비루스 직접 항원 검출계에 의해 판명) 6명의 환자들로부터 채취한 시료를 사용한 결과, dsRNA가 추출 가능한 것으로 판명되었다.

제 1원심 분리 단계를 생략하고 분변시료를 프로토콜 B 또는 Y의 투입물질로서 지접 사용한 경우에도 유사한 결과(통상적으로 로타비루스 dsRNA의 수율이 더 높아짐)가 얻어졌다.

실시예 E1: 인체 혈액, 및 요로부터 ssDNA의 정제

일본쇄 DNA도 임상시료로부터 분리 가능함을 확인하기 위해서, 50μl의 인체 혈청, 인체 혈액 또는 인뇨에 1㎍(4μl)의 정제 파아지 M13 DNA(M13mp9DNA, 뵈링거)를 첨가하고 프로토콜 B 또는 프로토콜 Y에 따라 정제하였다. 추출은 모두 4회 반복 실시하였다. 50μl의 TE 완충액으로 DNA를 용출시키고, 이중 25μl를 1% 아가로스 겔을 통해 전기 영동시켰다. 마커 레인은 500ng의 M13 ssDNA를 함유한다.

그 결과, 일본쇄 DNA는 프로토콜 Y에 의해서 인체 혈액, 혈청 또는 요로부터 분리 가능하며 프로토콜 B에 의해서도 보다 적은 양으로 분리 가능한 것으로 나타났다.

섹션 F: 규조토에 대한 NA의 결합

규조토의 골격은 거의 완전히, SiO₂로 구성되기 때문에, 이 규조토를 실리카로서 사용할 수 있는지를 시험하였다. 5종의 시판 규조토 제품[젠센 바이오키미카(Belgium Louvain 소재) 제품인 Celatom FW 14, Celatom FW50, Celatom FW 60, Celite(AK) 및 Celite 521] 각 10g을 50ml의 아쿠아 비데스트 및 500μl의 37% HCl과 혼합한 후, 생성된 현탁액을 오토클레이브네에서 121℃로 20분동안 가열하였다. 실시예 F1 및 F2에서는, 이렇게 얻어진 현탁액을 프로토콜 Y에 따라 NA를 추출하는데에 사용하였다.

실시예 F1: 인체 혈액으로부터 NA의 분리

인체 혈액을 플라스미드 pCMV-E를 함유하는 이. 콜리 HB101 박테리아와 혼합하고, 하룻밤 배양물 100μl의 박테리아 펠릿을 혈액 50μl에 첨가하였다. 프로토콜 Y에 의거한 NA 추출물의 투입 물질로서 50μl의 시료를 사용하였다. 40μl의 SC 대신에, 40μl의 상기 규조토 현탁액을 사용하였다. NA는 RNAse 억제제를 사용하지 않고 75μl의 TE 완충액으로 용출시킨 후, 용출물중 RNAse A(40㎍/μl)로 반응 부피 25μl중에서, 37℃에서 1시간 동안 처리한 후 겔에 로딩하였다.

마커 레인은 1㎍의 MMW DNA를 함유한다.

그 결과, 규조토 현탁액은 SC와 유사한 NA 결합 특성을 갖는 것으로 나타났다. dsDNA(성분 I분자) 및 ssRNA(23S 및 16S rRNA) 모두 결합하였다. 플라스미드 DNA는 BamHI에 의해 완전 선형화(성분 III)될 정도로 충분히 순수했다.

실시예 F2: 그람-음성 박테리아로부터 NA의 정제

인체에 질병을 발병시키는 것으로 알려진 9종의 그람-음성 박테리아를 고체 아가 평판상에서 배양시켰다. 이들 각 박테리아종 5 내지 10μl를 플레이트로부터 긁어내어 프로토콜 Y에 따른 NA추출을 위한 투입물질로서 사용하고, 40μl의 SC 또는 40μl의 셀라이트 521 현탁액을 NA 담체로서 사용하였다.

SC를 사용한 추출은 제1세정중에 중지되어야 하는데, 이것은 NA실리카 복합체가 더 이상 균질화 상태일 수 없기 때문이며, 장시간(3분 이상) 동안 볼텍스한 후에도 마찬가지이다. 한편, 셀라이트 521을 사용한 추출은 아무문제없이 진행되었는데, 이것은 SC 입자에 비해 규조토의 입경이 더 크기 때문인 것으로 추정된다. NAn를 RNAsin을 사용하지 않고 70μl의 TE 완충액으로 용출시킨 후, 용출물중의 일부(20μl)를 1% 아가로스 겔을 통해 전기 영동시켰다.

마커 레인은 1㎍의 MMW DNA를 함유한다. 하기 종류의 박테리아에 대한 결과가 얻어졌다.

1. 캄필로박터 필로리(Campylobacter pylori)

2. 예르시니아 엔테로리티가 3형(Yersinia enterolytica type 3)

3. 수막염균(Neisseria meningitidis)

4. 임균(Neisseria gonorrhoeae)

5. 인플루엔자균 b형(Haemophilus influenzae type b)

6. 폐염간균(Klebsiella pneumoniae)

7. 쥐티푸스균(Salmonella typhimurium)

8. 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)

9 대장균 KI-083(Escherichia coli KI-083)

HMW 박테리아 DNA 및 rRNA는 본 공정을 이용하여 검출할 수 있다.

섹션 G: 대장균 JM 101의 DNA/RNA 정제

본 발명에 의하면 그람 음성 박테리아로부터 NA를 분리할 수 있다. 박테리아 세포에는 다량의 고분자량 DNA(HMW DNA)와 리보솜 RNA가 존재한다. 실시예 G1은 NA 결합 고상으로서 실리카와 함께 각종 카오트로픽 물질을 사용함으로써 NA가 박테리아 정제 가능함을 보여주다.

실시예 G1: NA 결합고상으로서 실리카와 함께 각종 카오트로픽 물질의 사용에 의한 박테리아 세포로부터 NA의 분리/정제(내인성)

900μl의 카오트로픽 물질과 40μl의 SiO₂의 존재하에서 50μl의 하룻밤 박테리아 배양물 JM101로부터 NA를 분리하였다. 다량의 HWM-DNA와 내인성 리보솜 RNA(16S 및 23S)로 말미암아 분리된 NA의 에티듐 브로마이드 염색겔의 UV조사에 의한 검출이 가능해진다. 분리를 프로토콜 Y*에 의거하여 실시하였으며, 용출 NA의 25% (40μl)를 아가로스겔로 분석하였다.

부호 설명:

표 4는 아가로스겔 분석 결과를 요약한 것이다. HWM-DNA 와 rRNA 회수율을, 실리카와 함께 GuSCN을 카오트로픽 물질로서 사용한 공정과 비교하였다: 표 4에서 1은 DNA 또는 RNA 회수효율이 동일함을 나타낸다. 표 4에서 1은 회수율이 우수함을 나타낸다.

대장균 rRNA 마커(베링거)는 박테리아 세포로부터 내인성 RNA를 분리하는데 기준물질로서 사용하였다.

섹션 H: 카로트포픽 물질로서 구아니디늄 티오시아네이트와 NA를 결합시킬 수 있는 대체 고상 물질에 의한 DNA의 정제

NA 분리/정제가 GuSCN 및 각종 실리카 유도체 또는 라텍스 입자(재료 및 방법 참조)에 의해 실시 가능함을 확인하기 위해서, 순수한 플라스미드를 저염 완충액(트리스 10mM-EDTA 1mM pH8.0)에 첨가한 후 프로토콜 Y에 따라 분리하였으며, 단, 단계 7 및 9는 생략하였다(TE에 의한 용출은 실시하지 않았다). NA가 결합된 실리카/라텍스 입자를 PCR 반응 혼합물에 첨가하였다. 분리된 DNA는 PCR-법에 의해 검출할 수 있다. 실시예 H1은 대체 고상 물질과 카오트로픽 물질로서 GuSCN을 병용함으로써 NA를 정제할 수 있으며 PCR법에 의해 검출 가능함을 보여주는 것이다.

실시예 H1: 대체 고상 물질과 GuSCN에 의한 DNA 정제

50μl의 트리스 10mM/EDTA 1mM(pH 8.0) 중에 존재하는 0.5㎍ pGem3p24를 80μl의 실리카 현탁액 또는 80μl의 라텍스 현탁액(재료 및 방법 참조)과 900μl의 분해 완충액 L6과 함께 혼합하였다.

프로토콜 Y에 따라 56℃에서 세정 및 건조시킨 후(용출단계는 생략), 펠릿을 50μl의 물에 재현탁시킨다. 플라스미드-실리카 현탁액 20μl를 HIV 특이적인 프라이머(재료 및 방법 참조)의 존재하에 PCR 혼합물에 사용하였으며, 5μl의 10×농축 PCR-완충액, 1μl의 10mM dTPs, 2유니트의 Taq DNA폴리머라제, 및 최종 부피가 50μl가 되도록 물을 첨가한 후, 증폭 반응을 개시하였다(1사이클은 95℃에서 1분, 37℃에서 1분 및 72℃에서 3분으로 구성된다).

30 사이클 후에 반응 혼합물로부터 10μl 분량을 취하여 2% 아가로스겔로 분석하였다. 라텍스 입자를 사용한 NA의 분리는 실리카를 사용한 NA의 분리에서와 같은 펠릿을 얻지 못하였다.

1ml의 세정액 L2를 300μl의 70% EtOH와 혼합하였을 때, 두 액체상에서의 라텍스를 함유하는 밴드가 나타났다. 라텍스 입자는 이들의 색깔에 의해 검출 가능하다. 펜도르프 튜브내에 작은 펠릿으로 얻었다.

부호설명:

결과는 표 5에 요약하였다. 모든 경우에 30 사이클 후 예상된 290bp HIV 증폭체 단편이 관찰되었다. 이 단편의 크기는 겔상에 함께 로딩된 마커 Φx 174 RF DNA Hae III 분해물(파마시아)과 비교하였다.

++: 고상으로서 조립 실리카(대조용)를 사용한 경우와 동일한 양으로 검출되는 아가로스 겔상의 HIV 특이적인 290bp 단편의 검출을 표시한다.

+: 대조용 조립 실리카보다 낮은 양으로 검출되는 290bp 단편의 검출량을 표시한다.

섹션 I: NA-결합 필터 및 GuSCN에 의한 정세

NA-결합 필터(재료 및 방법 참조)는 프로토콜 Y**에 의거한 핵산의 분리시에 SiO₂대신 사용할 수 있다.

DNA의 해리는 일반적으로 저염 완충액(트리스 10mM-EDTA 1mM pH8.0)에서 전혀 일어나지 않는다고 하더라도, 이러한 임의의 문제는 필터로부터 DNA를 용출시키는 대신에 PCR-반응 혼합물에 DNA 결합된 필터를 삽입시킴으로써 해결될 수 있다. 실시예 I1은 PCR-법에 의해 분석된 카오트로픽 물질로서 GuSCN과 NA-결합 필터를 사용하여 NA를 정제할 수 있음을 보여준다.

실시예 I1: DNA-결합 필터에 의한 DNA 분리/정제 및 PCR-증폭에 의한 검출

50μl의 트리스 10mM/EDTA 1mM pH8.0중에 혼합된 순수한 pGem3p24 DNA(농도 1㎍; 0.01μl 및 0.005㎍)을 1cm×1cm의 크기를 가진 3종의 DNA-결합 필터(PVDF, Hybond N 및 니트로셀룰로오스) 및 900μl 의 GuSCN(용해 완충액 L6)에 첨가하였다.

세정(원심 분리 단계는 생략) 및 56℃에서 건조(프로토콜 Y **에 의거)시킨 후, DNA가 결합된 필터를 PCR-혼합물에 직접 첨가하였다. HIV 특이적인 프라이머의 존재하에서, PCR-순환기로 증폭을 실시하였다.

반응 혼합물은 5μl의 10×농축 PCR-완충액, 1μl의 10mM 유니트의 Taq DNA 폴리머라제와 최종 부피 50μl까지의 물을 함유한다.

30 사이클후에 반응 혼합물로부터 10μl 분량의 분취하여 (실시예 H1 참조) 2% 아가로스겔로 분석하였다.

결과는 표6에 요약하였다. 예산된 290bp HIV 증폭체 단편이 관찰되었다. 단편을 시판 Φx Hae II와 비교하였다.

++: 아가로스 겔상에서 에티듐 브로마이드 염색된 290bp 단편이 진하게 검출됨.

+: 290bp 단편이 검출됨.

○: 290bp 단편이 검출되지 않음.

비교군으로 사요된 7ng의 정제된 pGem3p24 DNA를 첨가한 PCR 증폭 혼합물은 290bp 단편이 ++로서 정량되었다.

Claims

핵산-함유 복합 생물학적 출발 물질, 카오트로픽(chaotropic) 물질 및 실리카 또는 그 유도체 함유 핵산 결합성 고상을 혼합하고, 그 혼합액으로부터 핵산이 결합되어 있는 고상을 분리한 후, 수득된 고상-핵산 복합체를 세정하는 것을 특징으로 하여 핵산-함유 생물학적 출발물질로부터 핵산을 분리하는 방법.
제1항에 있어서, 사용된 복합 생물학적 출발 물질이 전혈액, 혈청, 연막, 요, 분변, 뇌척수액, 정자, 타액, 조직 및 세포 배양물인 것을 특징으로 하는 핵산 분리 방법.
제1항에 있어서, 사용된 카로트로픽 물질이 구아니디늄염, 요오드화 나트륨, 요오드화 칼륨, (이소)티오시안산 나트륨, 우레아 및 이들 상호간의 조합물들로 구성된 군중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 핵산 분리 방법.
제3항에 있어서, 사용된 구아니디늄염 (이소)티오시안산 구아니디늄인 것을 특징으로 하는 핵산 분리 방법
제1항에 있어서, 사용된 핵산 결합성 고상이 실리카 입자를 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 분리 방법.
제1항에 있어서, 상기 고상-핵산 복합체를 세척한 후, 그 복합체로부터 핵산을 용출시키는 것을 특징으로 하는 핵산 분리 방법.
제5항에 있어서, 상기 실리카 입자가 0.1μl 내지 500㎛ 범위내의 입자 크기를 갖는 것을 특징으로 하는 핵산 분리 방법.
제7항에 있어서, 상기 실리카 입자가 1 내지 200㎛ 범위내의 입자 크기를 갖는 특징으로 하는 핵산 분리 방법.
제1항 내지 제7항 및 제8항중 어느 한 항에 있어서, 수득된 고상-핵산 복합체를 혼합액으로부터 침강시키고, 그 상층액은 제거하여 분리한 후, 복합체를 카오트로픽 물질-함유 세정 완충액으로 세정하는 것을 특징으로 하는 핵산 분리 방법.
제9항에 있어서, 세정 완충액으로 세정한 고상-핵산 복합체를 연속적으로 1종 또는 그 이상의 유기 용매로 더 세정한 후, 건조시키는 것을 특징으로 핵산 분리 방법.
제10항에 있어서, 세정 및 건조시킨 고상-핵산 복합체내에 존재하는 핵산을 용출 완충액을 사용하여 용리시키는 것을 특징으로 하는 핵산 분리 방법.
제1항에 있어서, 수득된 고상-핵산 복합체를, 그 고상에 결합되어 있거나 또는 그 고상으로부터 용리된 핵산을 증폭시키기 위한 목적으로 제공된 성분들의 혼합물과 접촉시키는 것을 특징으로 하는 핵산 분리 방법.